JP2736821B2 - マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド：診断および治療における役割 - Google Patents

マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド：診断および治療における役割

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、メタロプロテイナーゼの検出および阻害に
有効なペプチドに関する。特に、本発明は酵素活性およ
び酵素とその基質との相互作用に関わる酵素のドメイン
に相当する、IV型コラーゲナーゼの配列から得られるペ
プチドに関する。ペプチドに認知される抗体は酵素の検
出に有効である。機能研究により確認された、特定のペ
プチドはメタロプロテイナーゼ阻害剤の新しい種類を構
成する。
発明の背景 間質および基底膜コラーゲンの減成は特定の種類のメ
タロプロテイナーゼ（そのマトリックスメタロプロテイ
ナーゼは酵素前駆体型として細胞外マトリックスの中に
潜んでいるコラーゲナーゼ（EC 3.4.24.7）としても公
知である）によって、開始される。このコラーゲナーゼ
遺伝子ファミリーの構成物は次のものを含んでいる。
コラーゲンI,IIおよびIII型を減成し、基質特異性と
活性の必要条件によって特徴づけられている間質コラー
ゲナーゼ（ストリックリン,G.P,ジェフリィ,J.J,ローズ
ウィット,W.T.およびアイゼン,A.Z.,1983,バイオケミス
トリィ（Biochemistry）22,61−68;ゴールドバーグ,G.
I.,ウィルヘルム,S.,クーロンバーガー,A.,バゥアー,E.
A.,グラント,G.A.,およびアイゼン,A.Z.,1986,ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Che
m.）261,6600−6605;ハスティ,K.A.,ジェフリィ,J.J.,
ヒップス,M.S.,およびウェルガス,H.G.,1987,ジャーナ
ル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Che
m.）262,10048−10052;フィールズ,G.B.,ファン ワル
ト,H.E.,およびビルケダル−ハンセン,H.,1987,ジャー
ナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.C
hem.）262,6221−6226;グラント,G.A.,およびアイゼン,
A.Z.,マーマー,B.L.,ローズウィット,W.T.,およびゴー
ルドバーグ,G.I.,1987,ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（J.Biol.Chem.）262,5886−588
9）； プロテオグリカン、グリコプロテインおよびコラーゲ
ン分子の非ラセン部位を減成するストロメリジン（ウィ
ルヘルム,S.M.,コリャーム,I.E.,クーロンバーガー,A.,
アイゼン,A.Z.,マーマー,B.L.,グラント,G.A.,バゥア
ー,E.A.およびゴールドバーグ,G.I.,1987,ブロシーディ
ング ナチュラル アガデミィ オブ サイエンス U.
S.A.版（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A）84,6725−6729;ホ
ァィトマン,S.E.,マーフィー,G.,エンジェル,P.,ラーム
スフォルフ,H.J.,スミス,B.J.,ライオンズ,A.,ハリス,
T.J.T.,レイノルズ,J.J.,ヘルリッヒ,P.,およびドチュ
ーティ,A.J.P.,1986,バイオケミカル ジャーナル（Bio
cem.J.）240,913−916）； およびペプシン抵抗性−三重ラセンIV型コラーゲンおよ
び間質コラーゲン（ゼラチン）を減成するIV型コラーゲ
ナーゼ。
IV型コラーゲナーゼはヒト腫瘍細胞（リオッタ,L.A.,
クライナーマン,J.,カタンザロ,P.,およびリンブラン
ド,D.,1977,ジャーナル オブ ナチュラル キャンサ
ー インスティテュート（J.Natl.Cancer Inst.） 58,14
27−1439;チューペーニーミ−ヒュジャンエン,T.,およ
びトリグヴェイソン,K.,1982,インターナショナル ジ
ャーナル オブ キャンサー（Int.J.Cancer）30p,669
−673;リオッタ,L.A.,エイブ,S.,ジェーロン−ロビィ,
P.,およびマーティン,G.R.,1979,プロシーディング ナ
チュラル アカデミィ オブ サイエンス U.S.A.版
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.） 76,2268−2272;リオッ
タ,L.A.,トリグヴェイソン,K.,ガルビサ,S.,ハート,I.,
フォルツ,C.M.,およびシャーフィ,S.,1980,ネイチャー
（Nature），ロンドン，284,67−68;コリアー,I.E.,ウ
ィルヘルム,S.M.,アイゼン,A.Z.,マーマー,B.L.,グラン
ト,G.A.,シェルツァー,J.L.,クーロンバーガー,A.,ヒ
ー.,C,バゥアー,E.A.およびゴールドバーグ,G.I.,1988,
ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.
Biol.Chem.）263,6579−6587）； 内皮細胞（カレビック,T.,バービサ,S.,グレーサー,
B.およびリオッタ,L.A.,1983,サイエンス（Science） 22
1,281−283）；骨（マーフィー,G.,マックアルピン,C.
G.,ポール,C.T.,およびレイノルズ,J.J.,1985,バイオケ
ミカ バイオフィジカ エト アクタ（Biochem.Biophy
s.Acta）831,49−58）； 繊維芽細胞（コリアー,I.E.,ウィルヘルム,S.M.,アイ
ゼン,A.Z.,マーマー,B.L.,グラント,G.A.,ツェルツァ
ー,J.L.,クーロンバーガー,A.,ヒー.,C.,バゥアー,E.
A.,およびゴールドーバーグ,G.I.,1988,ジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）26
3,6579−6587）； 多形核白血球（ウィット,V.J.,シュワルツックス,D.,
およびヴェイス,A.,1980,ヨーロピアン ジャーナル
オブ バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）105,409
−417）； およびマクロファージ（ガルビザ,S.,バリン,M.,ダガ−
ジオルディニ,D.,ファステリ,G.,ナチュレイル,M.,ネグ
ロ,A.,セメンザト,G.,およびリオッタ,L.A.,1986,ジャ
ーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Bio
l.Chem.）261,2369−2375）；から確認されている。
この酵素は68ないし72キロダルトンの中性メタロプロ
テイナーゼであり、それは酵素前駆体型として潜んでい
る（リオッタ,L.A.,エイブ,S.,ジェーロン−ロビィ,P.,
およびマーティン,G.R.,1979,プロシーディング ナチ
ュラル アカデミィ オブ サイエンス U.S.A.版（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.） 76,2268−2272;リオッタ,L.
A.,トリグヴェイソン,K.,ガルビザ,S.,ジェーロン−ロ
ビィ,P.エイブ,S.,1981,バイオケミストリー（Biochemi
stry）20,100−104;サロ,T.,リオッタ,L.A.,トリグヴサ
ッソン,K.1983,ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）258,3058−3063）。
加えて、幾つかの他のこのコラーゲナーゼ遺伝子ファ
ミリーのメンバーは近年、ストロメリジンンの第二型
（ストロメリジン−２）、92キロダルトン型のIV型コラ
ーゲナーゼおよびピュータティヴ ユータライン メタ
ロプロテイナーゼ（Putative Uterine Metallo−protei
nase）：（PUMP）−１、低分子量のユータラインコラー
ゲナーゼ（ウィルヘルム,S.M.,コリアー,I.E.,マーマ
ー,B.L.,アイゼン,A.Z.,グラント,G.A.およびゴールド
バーグ,G.I.,1989,ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（J.Biol.Chem.）264,17213−17221;ウ
ォエスナー,J.F.およびタルピン,C.J.,1988,ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Che
m.）263,16918−16925）を含めて開示されている。
70キロダルトンIV型コラーゲナーゼは、マウス腫瘍型
での腫瘍の転移潜在性に密接に関係しており、（リオッ
タ,L.A.,トリグヴェイソン,K.,ガルビサ,S.,ハート,I.,
フォルツ,C.M.,およびシャーフィ,S.,1980,ネイチャー
（Nature），ロンドン，284,67−68）および、それに伴
い転移表現型の遺伝子誘導が誘発するＨ−ras癌遺伝子
を増加させる（マッシェル,R.,ウィリアムズ,J.E.,ロゥ
イー,D.R.およびリオッタ,L.A.,1985,アメリカン ジャ
ーナル オブ パソロジー（Amer.J.Pathol.）121,1−
8;ガルビザ,S.,ポッザッティ.R.,マッシェル,R.J.,サッ
フィオッティ,U.,バリン,M.,ゴールドファーブ,R.H.,ホ
ゥリー,G.およびリオッタ,L.A.,1987,キャンサー（Canc
er Res.）47,1523−1528）。
トリプシン処理の結果、潜在酵素の活性化とそれに伴
う分子量の減少が起こる（リオッタ,L.A.,トリグヴェイ
ソン,K.,ガルビザ,S.,ジェーロン−ロビィ,P.エイブ,
S.,1981,バイオケミストリー（Biochemistry）20,100−
104）。
有機水銀化合物もまたこの酵素の活性化を提示し、こ
のことも分子量の減少に関連づけられる（コリアー,I.
E.,ウィルヘルム,S.M.,アイゼン,A.Z.,マーマー,B.L.,
グラント,G.A.,シェルツァー,J.L.,クーロンバーガー,
A.,ヒー.,C.,バゥアー,E.A.,およびゴールドーバーグ,
G.I.,1988,ジャーナル オブ バイオロジカル ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）263,6579−6587;マーフィー,
G.,マックアルピン,C.G.,ポール,C.T.,およびレイノル
ズ,J.J.,1985,バイオケミカ バイオフィジカ エト
アクタ（Biochem.Biophys.Acta 831,49−58）。
活性化された酵素はIV型コラーゲンを分裂させ、特徴
的な1/4アミノ−末端および3/4カルボキシ−末端のフラ
グメントを生成させる（リオッタ,L.A.,トリグウェイソ
ン,K.,ガルビザ,S.,ジェーロン−ロビィ,P.エイブ,S.,1
981,バイオケミストリー（Biochemistry）20,100−104;
コリアー,I.E.,ウィルヘルム,S.M.,アイゼン,A.Z.,マー
マー,B.L.,グラント,G.A.,シェルツァー,J.L.,クーロン
バーガー,A.,ヒー.,C.,バゥアー,E.A.,およびゴールド
ーバーグ,G.I.,1988,ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリー（J.Biol.Chem.）263,6579−6587;フ
ェスラー,L.I.,ダンカン,K.G.,フェスラー,J.H.,サロ,
T.およびトリグベイソン,K.,1984,ジャーナル オブ
バイオロジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）259,97
83−9789）。
ゼラチン分解活性がこの酵素に関連することも示され
ている（コリアー,I.E.,ウィルヘルム,S.M.,アイゼン,
A.Z.,マーマー,B.L.,グラント,G.A.,ツェルツァー,J.
L.,クーロンバーガー,A.,ヒー.,C.,バゥアー,E.A.,およ
びゴールドーバーグ,G.I.,1988,ジャーナル オブ バ
イロオジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）263,6579
−6587;ホィヤ,M.チューペーニーミ−ヒュジャンエン,
T.,ステットラー−スティーヴンソン,W.,クルツツェ,
H.,トリグヴェイソン,K.およびリオッタ.L.A.,1988,フ
ェダレイション オブ ヨーロピィアン バイオケミカ
ル ソサイエティ レターズ（FEBS Letters）233,109
−113;マーフィー,G.,マックアルピン,C.G.,ポール,C.
T.,およびレイノルズ,J.J.,1985,バイオケミカ バイオ
フィジカ エト アクタ（Biochem.Biophys.Acta）831,
49−58）。
同様に、Ｖ型コラーゲン分解活性も示されている（コ
リアー,I.E.,ウィルヘルム,S.M.,アイゼン,A.Z.,マーマ
ー,B.L.,グランド,G.A.,シェルツァー,J.L.,クーロンバ
ーガー,A.,ヒー.,C.,バゥアー,E.A.,およびゴールドー
バーグ,G.I.,1988,ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（J.Biol.Chem.）263,6579−6587;マー
フィー,G.,マックアルピン,C.G.,ボール,C.T.,およびレ
イノズル,J.J.,1985,バイオケミカ バイオフィジカ
エト アクタ（Biochem.Biophys.Acta）831,49−58）。
IV型コラーゲナーゼはヒトメラノーマ細胞から精製さ
れており、そして全タンパク質アミノ末端における配列
情報はトリプシン作用のおよび臭化シアンのペプチドフ
ラグメントと同様に得られる（ホィヤ,M.チューペーニ
ーミ−ヒュジャンエン,T.,ステットラー−スティーヴン
ソン,W.,クルツシェ,H.,トリグヴェイソン,K.およびリ
オッタ.L.A.,1988,フェダレイション オブ ヨーロピ
ィアン バイオケミカル ソサイエティ レターズ（FE
BS Letters）233,109−113）。
配列情報はIV型コラーゲナーゼが間質コラーゲナーゼ
とストーメリジンの相同の限界配列を示すことによって
説明される。最近の報告ではＨ−ras変性ヒト気管上皮
細胞によって隠されたメタロプロテイナーゼによって特
徴付けられた部分的なcDNAクローンがある（コリアー,
I.E.,ウィルヘルム,S.M.,アイゼン,A.Z.,マーマー,B.
L.,グラント,G.A.,シェルツァー,J.L.,クーロンバーガ
ー,A.,ヒー.,C.,バゥアー,E.A.,およびゴールドーバー
グ,G.I.,1988,ジャーナル オブ バイオロジカル ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）263,6579−6587）。
変性気管上皮酵素は特にIV型コラーゲンの減成に有効
で、そして推定されたアミノ酸配列は報告されているト
リプシン性および臭化シアンのヒト腫瘍IVコラーゲナー
ゼのフラグメントとの一致を提示する（ホィヤ,M.チュ
ーペーニーミ−ヒュジャンエン,T.,ステットラー−ステ
ィーヴンソン,W.,クルツシェ,H.,トリグヴェイソン,K.
およびリオッタ.L.A.,1988,フェダレイション オブ
ヨーロピィアン バイオケミカル ソサイエティ レタ
ーズ（FEBS Letters）233,109−113）。
このように、ヒトメラノーマ細胞のIV型コラーゲナー
ゼはＨ−ras変性気管上細胞の酵素と一致すると考えら
れ、それは繊維芽細胞（コリアー,I.E.,ウィルヘルム,
S.M.,アイゼン,A.Z.,マーマー,B.L.,グラント,G.A.,ツ
ェルツァー,J.L.,クーロンバーガー,A.,ヒー.,C.,バゥ
アー,E.A.,およびゴールドーバーグ,G.I.,1988,ジャー
ナル オブ バイロオジカル ケミストリー（J.Biol.C
hem.）263,6579−6587）および骨細胞外植体（マーフィ
ー,G.,マックアルピン,C.G.,ポール,C.T.,およびレイノ
ルズ,J.J.,1985,バイオケミカ バイオフィジカ エト
アクタ（Biochem.Biophys.Acta）831,49−58）からも
発見されている。
発明の要約 ヒト黒色腫細胞から精製されたIV型コラーゲナーゼの
酵素前駆体の全アミノ酸配列が今分析され、そして該酵
素の種々のドメインに相当する一連の阻害性合成ペプチ
ドが調製された。これらのドメインは活性化の間にプロ
酵素から切断される80残基のアミノ末端；システインに
富む（システインリッチ）内部ドメイン；ヒスチジン含
有領域；およびカルボキシ末端から領域159残基を包含
する。これらのドメインからのペプチドはIV型コラーゲ
ナーゼ分子内の特定のドメインに対する抗体を生成する
ために使用された。本発明において、抗体、直接アミノ
酸配列分析、およびペプチドはａ）基質との結合および
相互作用に関与する酵素の領域、およびｂ）有機水銀化
合物ｐ−アミノフェニル水銀アセテートでの酵素前駆体
活性化の間に生成される主なIV型コラーゲナーゼ変換体
の構造を決定するために使用された。
有機水銀化合物、pAPMAによるIV型コラーゲナーゼプ
ロ酵素活性化は、結果として62kDaの安定な活性酵素種
を生じるアミノ酸80個のアミノ末端断片の自触的除去を
伴うことが発見された。さらに、これらのデータはIV型
コラーゲナーゼがその他の細胞外マトリックス分解性メ
タロプロテイナーゼのアミノ末端領域と配列相同性だけ
でなく機能的ドメイン同一性を有することを示す。
下の図８および９に示されるように、アミノ末端ペプ
チド（残基１−80）はIV型コラーゲナーゼ活性化の間に
切除される。この発見により、このペプチドが、活性部
位をブロックしそして酵素を不活性にする内在酵素阻害
剤を含むという可能性が高まった。従って、活性化の間
の上記アミノ末端セグメントの除去はこの阻害剤を除去
するであろうし、そして活性部位を露出する。この阻害
に関与する重要な領域は対になっていないシステイン残
基を含む図10においてボックスで囲まれた領域である。
この領域はその他のマトリックスメタロプロテイナーゼ
において保存された性質を示し、そしてChou−Fassman
による分析法によりベータターンコンホメーションの高
い可能性を有する。さらに、この配列内の対になってい
ないシステイン残基が酵素の活性部位においてメタロイ
オンと非共有結合的に相互作用すると仮定することは正
当だった。従って、有機水銀活性化（APMAがスルフヒド
リル残基に結合することは知られている）がこの相互作
用を乱し、そして阻害剤セグメントを活性部位への接近
から分離するであろうコンホメーション変化を引き起こ
すであろう。この全く新しい仮説を試験するために、ア
ミノ末端残基１−87における一連の重複領域に相当する
合成ペプチドが調製された。下の図11および12ならびに
表４に示されるように、対になっていないシステインを
含む保存領域を含有するそれらのペプチドだけが0.1mM
未満の濃度で強く阻害性だった。システインは活性のた
めに必要だった。それ故に、これらのペプチドはメタロ
プロテイナーゼのための阻害剤の全く新しいクラスを構
成する。
要するに、この分析に基づく発見はａ）酵素が潜在状
態にあるとき該酵素の活性部位をブロックし得る内在性
酵素阻害剤を構成するIV型プロコラーゲナーゼのアミノ
末端近傍の領域、およびｂ）基質との結合および相互作
用に関与する酵素の中央近傍の領域の確認を導いた。こ
れらの領域に相同なペプチドは新規マトリックスメタロ
プロテイナーゼ阻害剤を構成する。
図面の簡単な説明 図１は腫瘍細胞により分泌されたヒトIV型プロコラー
ゲナーゼの全アミノ酸配列を示す。
図２はドメインにまとめられたIV型プロコラーゲナー
ゼとプロストロメリシンとプロコラーゲナーゼＩとのア
ミノ酸相同性の比較を示す。
図３ （Ａ）抗ペプチド抗体A1−17のエリザ確認。IV
型プロコラーゲナーゼのアミノ末端残基１ないし17に相
当する合成ペプチドが合成され、そして抗原として使用
された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体はこのエ
リザにおいて被覆抗原として使用された。
（Ｂ）抗ペプチド抗体A472−490のエリザ確認。IV型プ
ロコラーゲナーゼの内部残基472−490に相当する合成ペ
プチドが合成され、そして抗原として使用された。ペプ
チド−ウシ血清アルブミン複合体はこのエリザにおいて
被覆抗原として使用された。
（Ｃ）競合エリザアッセイは各々の抗体に対して適当な
ペプチドを用いて行われた。ペプチド−ウシ血清アルブ
ミンは被覆抗原として使用され、そして遊離ペプチドは
競合抗原として使用された。
（Ｄ）粗製およびゼラチンアフィニティ精製IV型プロコ
ラーゲナーゼのウエスタンプロット。A1−17とイムノブ
ロットされた粗製IV型プロコラーゲナーゼ（A2058黒色
腫細胞調整培地20μ、列Ａ）、A472−490とイムノブ
ロットされた精製IV型コラーゲナーゼ（30ng、列Ｃ）が
示されている。
図４はIV型コラーゲナーゼの基質IV型コラーゲンに結
合する該コラーゲナーゼに対するアッセイを示す。精製
IV型コラーゲナーゼは、微量滴定ウエルに被覆されたペ
プシン消化IV型コラーゲンへの標識されたIV型コラーゲ
ナーゼの結合を競合させるために用いられた（平均値±
S.D.）。結合の飽和は増加する量の基質を用いる下側の
曲線に示されている。
図５は示された合成ペプチドによるIV型コラーゲナー
ゼ阻害のゼラチンチモグラムを示す。ゼラチナーゼ活性
は約70kDaの位置に白色の明瞭なバンドとして可視化さ
れている。この白色の明瞭なバンドは阻害剤の存在下で
消失している。３重の試験が示されている。
図６は示されたペプチドによるIV型コラーゲンへの標
識IV型コラーゲナーゼの結合の阻害の例を示す。ヒスチ
ジン含有ペプチドは図２および５に示されたIV型コラー
ゲナーゼのヒスチジン含有ドメインに相同なフィブロネ
クチン中の領域から誘導される。ヒスチジン残基は結合
性競合に必要とされる。
図７はゼラチンチモグラムおよびウエスタンブロッテ
ィングにより続けられたIV型プロコラーゲナーゼのpAPM
A活性化に対する時間経過を示す。A2058黒色腫細胞調整
培地の一部20μは示された時間（分）1.0mM pAPMAの
存在下で活性化された。反応はEDTAを10mMまで添加して
停止され、そして試料はゼラチンを含むか、または含ま
ない９％アクリルアミドゲル上で電気泳動された。ゼラ
チンを含むゲルは電気泳動後チモグラムとして現像され
た。ゼラチンを含まないゲルは電気泳動でニトロセルロ
ースに移され、そして次に示されたアフィニティー精製
抗体（１μg/ml）で免疫染色された。アミノ末端抗原ド
メインの損失は70kDa体から62kDa体へのpAPMA誘導変換
の間に起こる。MWM,前染色された分子量マーカー。
図８はIV型コラーゲン減成アッセイにより続けられた
精製IV型コラーゲナーゼのpAPMA活性化の時間経過を示
す。精製IV型コラーゲナーゼ（23μg/ml）の一部10μ
はpAPMA中に1mMとされ、そして示された時間37℃で予備
保温された。試料を次に50mM トリスHCl、0.15M NaC
l、5mM CaCl2、pH7.6の添加により最終容量60μまで
希釈し、3H−IV型コラーゲン（ニュー・イングランド・
ヌクレアー）を添加し、そして反応混合物を37℃で30分
間保温した。試料は次に３重にアッセイされた。最大活
性は37℃での2.8μｇ減成IV型コラーゲン/h/精製酵素μ
ｇに相当する。
図９は精製酵素の直接アミノ酸配列決定法により決定
されるIV型プロコラーゲナーゼの潜在および活性体のア
ミノ酸配列を示す。pAPMA活性化の際の自触作用の切断
部位も示してある。書込みは精製潜在酵素（20ng,列
Ａ）および活性酵素（20ng,列Ｂ）の銀染色NaDodSO4−P
AGEゲルでの明らかな分子量を示す。
図10はIV型プロコラーゲナーゼのアミノ末端（残基１
−110）（上段）、間質プロコラーゲナーゼのアミノ末
端（中段）およびプロストロメリシンのアミノ末端（下
段）を示す。切断部位からわずかに上流の相同領域はボ
ックスＡで示されており、pAPMA活性化に続く切断部位
はボックスＢで示されており、そしてシステイン残基に
は下線を付してある。間質コラーゲナーゼおよびストロ
メリシンのpAPMA活性化に続く切断のその他の報告され
た部位は星印により示されている。
図11はペプシン消化IV型コラーゲンの精製活性化IV型
コラーゲナーゼによる切断の示された合成ペプチドによ
る投与量依存阻害を示す。ペプチドTMRKPRCGNPDVANは0.
1mMの濃度で酵素活性の80％を阻害する。より高い濃度
は全ての酵素活性を消失させる。
図12は酵素阻害活性が試験されたペプチドの比較を示
す。ペプチドは図10に示されたアミノ末端配列から誘導
された。コア配列PRCGは、この配列のないペプチドが顕
著な阻害活性を欠くという事実に基づいて阻害活性に必
要である。最少の配列必要条件のさらなる精選は表２に
列挙したペプチドを用いて行われた。
図13は、活性化に際してヒトIV型プロコラーゲナーゼ
から切断されるアミノ末端ペプチドの80個のアミノ酸配
列をコード化するヒトIV型プロコラーゲナーゼのための
ヒトcDNAクローンの部分のヌクレオチド配列を示す。
発明の詳細な説明 マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する能力を
有するペプチド配列を提供することが本発明の目的であ
る。
マトリックスメタロプロテイナーゼの存在の同定に使
用するための抗体を提供することが本発明の別の目的で
ある。
活性化マトリックスメタロプロテイナーゼにより引き
起こされる組織破壊から生じる組織損傷に罹患した患者
を治療する方法を提供することが本発明の別の目的であ
る。
本発明は、式aa1−aa2−aa3−aa4−Ｃ （式中、aa1はＲおよびＫからなる群から選択される塩
基性アミノ酸;aa2はＫおよびＱからなる群から選択され
る極性アミノ酸;aa3はＰ、ＡおよびＬからなる群から選
択される無極性アミノ酸;aa4はＲおよびＫからなる群か
ら選択される塩基性アミノ酸；そしてＣは遊離スルフヒ
ドリル基を有するシステインである）を有するアミノ酸
配列から本質的になり、かつマトリックスメタロプロテ
イナーゼを阻害する能力をさらに有する実質的に純粋な
ペプチドを提供する。
本発明において、上記の「アミノ酸配列から本質的に
なり」という文言は、本発明のペプチドが、上記式aa1
−aa2−aa3−aa4−Ｃのアミノ酸配列を少なくとも有す
るものであり、かつそのマトリックスメタロプロテイナ
ーゼ阻害活性が当該アミノ酸配列に基づくものであるこ
とを意味する。
がRKPRCである請求項１記載のペプチド。
本発明において、上記アミノ酸配列がRKPRCである
か、RQPRC、RKARC、KKPRC、RKPKCおよびRKLRCからなる
群から選択されるものであるか、TMRKPRCGNPDVANおよび
MRKPRCGからなる群から選択されるものであるが、APSPI
IKFPGDVAPKTDKELAVQYLNTFYGCPKESCNLFVLKDTLKKMQKFFGLP
QTGDLDQNTIEIMRKPRCGNPDVANであるペプチドが好まし
い。
本発明はまた、本発明の上記ペプチドのマトリックス
メタロプロテイナーゼ阻害量からなる哺乳動物のための
マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、および本発
明の上記ペプチドのマトリックスメタロプロテイナーゼ
阻害量からなるマトリックスメタロプロテイナーゼの活
性に起因する変性過程に対する哺乳動物処置剤を提供す
る。
上記阻害剤または処置剤において、舌下投与のための
製剤の形態、吸入のための製剤の形態、または静脈注射
のための製剤にあるものが好ましい。
ヒトIV型コラーゲナーゼの全アミノ酸配列は図１に示
されている。この配列はこのタンパク質が図２に示され
る一連のドメインに分割され得ることを示す。約1kbの
セグメントによりコード化されるシステインリッチ（12
システイン残基）ドメインはその他の配列決定されたメ
タロプロテイナーゼ例えばＩ型コラーゲナーゼおよびス
トロメリシンと顕著な相同性がない。しかしながら、こ
のシステインリッチ領域はフィブロネクチンと顕著な相
同性を示す。システインリッチ配列がメタロプロテイナ
ーゼ活性においてその機能的役割を直接試験されたこと
はこれまで決してなかった。システインに富む領域（残
基200−370）から誘導されたペプチドは酵素基質結合を
阻害し、そして本発明の実施態様と見なされる。IV型コ
ラーゲナーゼの他の３つのドメインはその他のマトリッ
クスメタロプロテイナーゼと顕著な相同性を示す（図
２）。特に、「MBD」と表記され、そして図２に示され
ている残基371ないし386の領域はサーモリシンを含む３
種全てのマトリックスメタロプロテイナーゼ中に密接な
相同配列を有する。実際の結晶化されたサーモリシンに
おいて、この領域は酵素の推定上のZn結合ドメインに関
連する。しかしながら、MBD配列はメタロプロテイナー
ゼ活性においてその機能的役割を直接試験されたことは
これまで決してなかった。本発明において、（ａ）これ
らの領域から誘導された合成ペプチドおよび（ｂ）これ
らの領域に対して指示されたアフィニティー精製抗体は
ゼラチナーゼおよびIV型コラーゲナーゼ活性をブロック
する阻害剤を構成する。さらに、概説したIV型コラーゲ
ナーゼドメインに相同なフィブロネクチンから誘導され
たペプチドはまた、その基質へのIV型コラーゲナーゼの
結合を阻害する。
本発明のマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は
不適当な血管形成、関節炎、腫瘍増殖、侵入および転
移、および肉芽腫性炎症状態例えばサルコイドーシスの
治療に使用され得る。これらの状態において、産生さた
酵素の量および図11に示されるような活性酵素を90％以
上阻害するのに必要なペプチド阻害剤の量を見積もるこ
とは可能である。阻害性ペプチドの治療的投与量は10−
250mg/kg/dの許容できる薬学的範囲であり、より好まし
くは25−100mg/kg/dの範囲である。投薬される患者の投
与量は該患者において産生される酵素の量、該患者の状
態および体格に依存するであろう。阻害剤は注射とし
て、または血流中に速やかに移行するあらゆる手段によ
り投与され得る。凍結乾燥粉末は「飲み込まれ」てもよ
い。経頬または舌下投与のための調剤も与えられ得る。
呼吸器に欠陥を有する患者のために、ペプチドは吸入に
より投与され得る。エアロゾルがこの目的のために特に
有用である。目の異常に対して、ペプチドは点眼薬とし
て投与されてもよい。
実施例１ ヒスチジン含有ペプチド阻害剤 タイプIVコラゲナーゼの残基371−386（MBD領域）に
相当する合成ペプチドは、ゼラチナーゼおよびコラゲナ
ーゼタイプIV活性を廃止する。これはゼラチン酵素電気
永動像を使用した第５図に示されている。さらに、これ
らのドメインを認識する親和力精製抗体もまたゼラチナ
ーゼおよびコラゲナーゼタイプIV活性を阻害する。これ
らのペプチドの作用メカニズムは、少なくとも一部分、
タイプIVコラーゲンへのタイプIVコラゲナーゼの結合を
完成させるそれらの能力に帰している（第６図）。
メタロプロテイナーゼペプチド阻害剤は、タイプIVコ
ラゲナーゼの残基371−386でのヒスチジン含有ドメイン
と実質的な相同関係を持つタンパク質ペプチドを有して
いる。該タンパク質ペプチドは、メタロプロテイナーゼ
のゼラチン分解およびコラーゲン分解活性を阻害する。
メタロプロテイナーゼ阻害剤のタンパク質ペプチドは好
ましくは活性のための少なくとも１種のヒスチジン残基
を含有する。メタロプロテイナーゼ阻害剤のタンパク質
ペプチドの一つの望ましい具体例は，ヒスチジン含有配
列を持ち、該配列は、VAAHEFGHAMGLEHSQ,VAAHEFGAAMGLE
HSQ,VAAHELGHSLGLSHST,VAAHELGHSLGLSHST,VAAHEIGHSLGL
FHSA,VAHELTHAVTDYTAGおよびフィブロネクチンペプチド
AAHEEICTTNEGVMよりなる群から選択されたメンバーであ
る。後者のペプチドが有効でヒスチジン残基を必要とし
たので、コア配列AHEは本発明の一主要具体例の最小抗
原決定基（minimum determi−nant）であることが決定
された。
保存された残基領域中にアミノ酸を置換することによ
り、第５図および第６図に示すように、ペプチドの阻害
活性のためにヒスチジン残基が幾分必要であることが判
明した。全３個のヒスチジンがアラニンで置換された場
合、ペプチドは完全に不活性となった。しかしながら、
中央のヒスチジンのみがアラニンで置換された場合、阻
害活性は残された。さらに、２個のグルタミン酸（Ｅ）
残基をグルタミン（Ｑ）で置換することは、ペプチドの
阻害活性を改変した。これらの阻害性ペプチドは、タイ
プIVコラーゲン基質またはゼラチン基質における解裂部
位と相同関係を持たない。それらの作用メカニズムに
は、金属イオンと相互作用できるプロテイナーゼの領域
内の酵素−基質相互作用の干渉が含まれ、そのような相
互作用は基質解裂にとって必要である。その活性ペプチ
ドは、タイプIVコラゲナーゼ活性を廃止するペプチド濃
度下で、サーモリシンのゼラチン分解活性を部分的に抑
制する。活性ペプチドは、プラスミンおよびトリプシン
を含めて試験された多様なセリンおよびチオールプロテ
アーゼ類または“非メタロプロテイナーゼ類”を阻害す
るのに失敗した。
表１は、発明者らによる機能的研究に基づいてまた他
のメタロプロテイナーゼとの相同比較に基づいて図１中
の配列から選択された、マトリックスメタロプロテイナ
ーゼの阻害候補として試験されたアミノ酸置換を含む合
成ヒスチジン含有ペプチドのリストである。
方法 ゼラチン酵素電気泳動像 ストック溶液および下記混合操作を用いて、ゼラチナ
ーゼ活性の目視のためのゼラチン酵素電気泳動像が作成
された。
手順 この実施例のために使用するゼラチンのザイモグラム
調製の手順は，下記の段階と試薬を利用した。
１）ゲルを形成する装置を集める。
２）重合のためにゲル溶液を解膠して準備する： 最終容積40mlの９％アクリルアミド： 50mlのファルコン管に， 12mlの30％アクリルアミド,0.8％ビスアクリルアミド 0.4mlの10％SDS 7.5mlの2MTrisHCl,pH8.8 4mlの１％ゼラチン 16mlのdH2Oを入れる。
３）混合後,0.4mlの10％過硫酸アンモニウムを添加し，
再度混合する。
４）40μｌのTEMEDで重合を開始し，混合しそして32ml
のゲル溶液をゲル型の中に注ぐ。
５）ブタノールで飽和した水で溶液の上を覆い,30−45
分間重合させる。
６）重合の後，ゲルの表面をdH2Oで洗浄し，乾燥する。
７）重合のために，ゲルの溶液を積層して準備する： 最終容積10mlの３％アクリルアミド： 15mlのファルコン管に， 2.5mlの0.5MTrisHCl,pH6.8 0.1mlの10％SDS 1.0mlの30％アクリルアミド,0.8％ビスアクリルアミ
ド 0.1mlの10％過硫酸アンモニウム 5.3mlのdH2O を添加する。
８）積層してある（stacking）ゲルの重合を,40μｌのT
EMEDで，開始しそして混合する。
９）約6mlをゲル型中の重合した流動性のゲルの上に注
ぎ，井戸櫛（well comb）を挿入する。
10）櫛歯の底部から空気泡を除き，必要ならば追加のゲ
ル液を添加する。
11）積み重ねてあるゲルを15−20分間重合させる。
12）重合の後，積層してあるゲルから櫛を取り除き,1x
電極緩衝液を両方の電極室に入れる。
13）空気を，試料井戸（well）とゲルの底部から取り除
く。
14）試料を添加,30ミリアンペア／ゲルで電気泳動す
る。
15）電気泳動の終了後，ゲルを，室温でゆっくり撹拌し
ながら2.5％Triton Ｘ−100を２回換えて,60分間にわ
たり洗浄する。
16）TritonX−100の溶液を捨て，ゲルを1xコラーゲン緩
衝液中に置き,37℃で２−４時間にわたりまたは室温で
一夜にわたり保温する。
17）保温期間後,0.1％のアミドブラック中で30分間汚染
し，次いで約90分間にわたり脱汚染する。
18）清浄になっている範囲は，ゼラチン分解活性に該当
する。
いろいろな濃度の分離ゲルの調製を下記する。
溶解性のコラゲナーゼの検定 この実施例の溶解性コラゲナーゼの検定のための手順
には下記の調製物を利用した。
0.5MTris,2.0M NaCl,0.05M CaCl2,2％Brij 35の最
終濃度を得るように10xコラゲナーゼ緩衝液を調製す
る。
１を調製するために， 60.55gのTris 116.88gのNaCl 7.35gのCaCl2 20 gのBrij35 を合わせる。次いで800mlのdH2O中に溶解し，濃度塩酸
を添加してpHを7.6に調製する。最終体積を１にし，
ろ過して殺菌する。
10x細菌性コラゲナーゼ（陽性対照）を調製して，最
終濃度0.5％（w/v）を得る。これは,10mgの細菌性のコ
ラゲナーゼ（シグマ社製＃Ｃ−5138）を2mlの1xコラゲ
ナーゼ緩衝液に溶解し,100mlのアリコート（aliquote）
にして−20℃で貯蔵することを包含する。
ウシの血清アルブミン（輸送タンパク質）溶液を調製
して1xコラーゲナーゼ緩衝液中で0.5％（w/v）の最終濃
度にする。これは100mgのウシ血清アルブミンを20mlの1
xコラゲナーゼ緩衝液に溶解し,1mlの分割したアリコー
トにして，−20℃で保管する。
トリクロロ酢酸−タンニン酸−プロリン溶液（TCATA
P）を調製して,10％TCA,0.5％タンニン酸,2mMプロリン
の最終濃度にする。これは,10mlの100％トリクロロ酢酸
溶液,10mlの５％タンニン酸溶液そして1mlの200mMのプ
ロリン液を合わせ,100mlの最終容積に希釈し,4℃で保管
し，そしてこの溶液を４週毎に取り替えることを包含す
る。
手順 1.酵素試料活性化剤（通常は1mMのpAPMA）と試験液を1.
5mlのエッペンドルフ管に入れる。合わせた容積は60μ
ｌでなければならない。必要ならば1xコラゲナーゼの緩
衝液を添加する。必要ならば，前保温する。
2.3H−IV型コラーゲン（NEN＃NET−931ロッド＃2511−0
18）の貯蔵品をコラゲナーゼ緩衝液で1:120に希釈する
ことによりIV型のコラーゲン基質を製造する。55℃に10
分間加熱し，氷上冷却する。
3.希釈した3H−IV型コラーゲンの溶液の５μｌを，各々
の検定管に入れる。混合するために渦巻き,28℃で４時
間にわたり保温する。
4.保温の終了時点で，輸送BSAの溶液の２μｌとTCATAP
の溶液を添加する。渦巻きにして混合し，少なくとも10
分間氷上に置く。
5.速度を６に設定して,10分間にわたりミクロフーゲ（m
icrofuge）中で遠心分離することにより沈澱をペレット
状にする。ペレットが位置がわかるように，試験管をミ
クロフーゲ（microfuge）に入れるときに方向付けす
る。
6.遠心分離の直後に，上澄み液の55μｌを吸い取り，シ
ンチレーション瓶中に入れる。5mlのシンチレーション
混合液（cocktail）を添加し，よく振りそして計数す
る。
実施例 ２ ペプチド阻害剤を含有するシステイン 単一特異性の抗体を製造において使用するために,A20
58メラノーマ細胞IV型プロコラゲナーゼのアミノ末端配
列（残基１−17,APSPIIKFPGDVAPKTD）並びに内部領域
（残基472−490,DKPMGPLLVATFWPELPEK）のそれを合成し
た。
これらは下記の理由で選択された。
酵素の直接の配列で得られる（コリール,I.E.,ウィル
ヘルム,S.M.,アイゼン,A.Z.,マーマー,B.L.,グラント,
G.A.,ゼルツァー,J.L.,クローンバーガー,A.,He.,C.,バ
ウエル,E.A.,およびゴールドバーグ,G.I.,1988,J.Biol.
Chem 263,6579−6587; ホウチャ,M.,ターピンニーミ−フジャネン,T.,ステツ
ラー−スチーブンソン,W.,クルーツシュ,H.,トルグベイ
ソン,K.,およびリオッタ,L.A.,1988,FEBS Letters 23
3,109−113）， cDNAクローンから予測される配列で確認された（コリ
ール,I.E.,ウィルヘルム,S.M.,アイゼン,A.Z.,マーマ
ー,B.L.,グラント,G.A.,ゼルツァー,J.L.,クローンバー
ガー,A.,He.,C.,バウエル,E.A.,およびゴールドバーグ,
G.I.,1988,J.Biol.Chem 263,6579−6587），そして他
のメタロプロテイナーゼと相同性を示さない領域から誘
導されている。
アフィニティー精製抗体（affinity purified antibo
dies）は，直接のELIZA並びに競合実験を使用して特徴
付けられる。この抗体は，ウシ血清アルプミンまたは無
関係のペプチドとの交叉反応性は示さなかった。アフィ
ニティー精製抗体（affinity purified antibodies）
は,IV型プロコラゲナーゼを免疫沈澱する能力がある
（ホウチャ,M.,ターピンニーミ−フジャネン,T.,ステツ
ラー−スチーブンソン,W.,クルーツシュ,H.,トルグベイ
ソン,K.,およびリオッタ,L.A.,1988,FEBS Letters 233,
109−113）。
ウエスタンブロット法は，精製IV型コラゲナーゼとの
ウエスタンブロッテイングと同じく，両方の抗体が,IV
型プロコラゲナーゼを,A2058で調製した媒体において単
一のバンドとして認識したということを示した。
pAPMA活性化の時間経過を，ゼラチンザイモグラム分
析,IV型コラゲナーゼ検定およびイミュノブロット上の
両方のアフィニテー精製抗体（affinity purified anti
bodies）（図７）を使用して追跡した。
A2058メラノーマ細胞IV型コラゲナーゼのゼラチンザ
イモグラム（図７）分析は,70kDダルトンの分子量を持
つゼラチン分解活性の単一バンドを示した。1mMのpAPMA
の存在下における37℃での保温は，ゼラチン分解活性の
このバンドのより低い分子量の62kDへの漸進的な変換を
もたらした。この変換は10mMのEDTAの存在下では完全に
阻害され，添加するpAPMAの不在下では起きなかった
（図示なし。）。
精製したIV型プロコラゲナーゼのIV型コラゲナーゼ検
定は，保温期間における有機水銀化合物pAPMAの不在下
ではコラーゲン分解の活性を示さなかった。pAPMAを使
用する保温により，酵素は活性化できた。コラゲナーゼ
検定により測定されたようにpAPMAを使用する前保温に
おける活性化の時間経過は，完全なコラーゲン分解活性
が得られることを示している（図８）。
抗体A472−490は，保温により，ゼラチンザイモグラ
ム（図７）に示されたものに該当する時間依存の分子量
減少を示した。この変換は,60分迄に50％完了し,90分迄
に実質的に完了するように見える。
アミノ末端エピトープに該当する抗体A1−17は,pAPMA
活性化の間のイミュノステイニング（immuno−stainin
g）に於ける直接の減少を示した。これらの結果は，有
機水銀化合物を使用することによる潜在型から安定な，
活性のコラゲナーゼへの変換に従う明白な分子量の減少
は，アミノ末端ペプチド配列の欠失の結果であることを
示している。
ゼラチン−アフィニティ精製IV型プロコラケナーゼ
を,pAPMA活性化の前後両方の逆相HPLCにより更に精製し
た。クロマトグラムは，潜在型または活性型保持時間に
顕著な変化のないことを示した。ピークを集め,NaDodSO
4−PAGEにより分析した時に,pAPMA活性化に先立つプロ
コラゲナーゼのピークは，非還元条件下では約70kDaダ
ルトンに単一バンドを示した（図9,挿入）。pAPMA活性
化（16時間,37℃）の後のコラゲナーゼのピークは，非
還元条件下で62kDaに単一のバンドを示した（図3A）。
pAPMA活性化の前のHPLC上のプロコラゲナーゼのピー
クから得られる物質を，直接のアミノ酸列分析に処し
た。この物質はこの酵素のために前に決めたものとは同
一であるアミノ末端配列を与える（図９）。
HPLC精製後のpAPMA活性化物質の直接の配列分析は，
単一の新規のアミノ末端配列を示している（図９）。
これは,pAPMA活性化が約8kDの分子量低下と共に起こ
る潜在的酵素からのアミノ末端ペプチド断片の自触媒的
脱離を伴うことを決定的に示している。
この切断は単一の部位においてだけ起こる。というの
は，精製，活性化した酵素多数の試料の配列を分析して
も，如何なる他のアミノ末端アミノ酸の証拠が見出され
ず，そしてウエスタンブロッテイングまたはゼラチンザ
イモグラム分析によって中間体の痕跡が見出されないか
らである。
この研究の結果は,IV型コラゲナーゼは，コラーゲン
分解活性を得る前に活性化を必要とする潜在的酵素前駆
体の型で分泌されることを示している。有機水銀化合物
pAPMAにはこの活性化の能力がある。IV型プロコラゲナ
ーゼの有機水銀活性化は，酵素前駆体型の，アミノ末端
からの80個のアミノ酸残基ペプチド断片の除去によるよ
り低い分子量の活性化型への変換を伴う。
pAPMAに曝した後，最大のコラーゲン分解活性が速や
かに得られる。安定なより低分子量型への完全な変換に
先立つこの活性への到達は，活性であるが不安定種であ
る酵素前駆体における構造転位と一致しており，これは
間質コラゲナーゼとストロンラメシン（stromelysin）
で報告されている通りである（ストリクリン,G.P.,ジェ
フリー,J.J.,ロスウィット,W.T.,およびアイゼン,A.Z.,
1983,Biochemistry 22,61−68;マーフィ,G.,コクェッ
ト,M.I.,ステフェンス,P.E.,スミス,B.J.,およびドチャ
ーチ,A.J.P.,1987,Biochem.J.248,265−268）。
活性化は高度に精製したIV型コラゲナーゼ酵素前駆体
に起こる。かくして，有機水銀化合物の存在下における
活性化は,pAPMAそのものがペプチド結合を切断する能力
に欠けるので自己分解的である。
有機水銀化合物による活性化のこの自己触媒的機構
は，間質コラゲナーゼ（グラント,G.A.,アイゼン,A.Z.,
マーマー,B.L.,ロスヴァイト,W.T.,およびゴールドバー
グ,G.I.,1987,J.Biol.Chem.262,5886−5889）； ウィットマン,S.E.,マーフィ,G.,アンゲル,P.,ラーム
スフォルフ,H.,−J.,スミス,B.J.,リオンス,A.,ハリス,
T.J.T.,レイノルズ.J.J.,ヘルリッヒ,P.およびドチャー
チ,A.J.P.,1986,Biochem.J.240,913−916），および ストロメライシン（stromelysin）（ウィルヘルム,S.
M.,コリエルム,I.E.,クロンバーガー,A.,アイゼン,A.
Z.,マーマー,B.L.,グラント,G.A.,バイエル,E.,および
ゴルドバーグ,G.I.,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8
4,6725−6729; ウィットマン,S.E.,マーフィー,G.,アンゲル,P.,ラー
ムスフォルフ,H.−J.,スミス,B.J.,リオンス,A.,ハリ
ス,T.J.T.,レイノルズ.J.J.,ヘルリッヒ,P.,およびドチ
ャーチ,A.J.P.,1986,Biochem.J.240,913−916; マーフィ,G.,コケット,M.I.,ステフェンス,P.E.,スミ
ス,B.J.,およびドチャーチ,A.J.P.,1987,Biochem.J.24
8,265−268; サンチェス−ロペツ,R.,ゲンセル,M.C.,マトリジア
ン,L.,およびブリートナッハ,J.ブリートナッハ,R.,198
8,J.Biol.Chem. 263,11892−11899）．のような他の細胞
外マトリックスを分解するメタロプロテイナーゼで示さ
れている。
これらの３種のメタロプロテイナーゼ,IV型プロコラ
ゲナーゼ，間質プロコラゲナーゼおよびプロストロメラ
イシンは，アミノ酸レベルで顕著な相同性を示す（グラ
ント,G.A.,アイゼン,A.Z.,マーマー,B.L.,ロスヴァイ
ト,W.T.,およびゴールドバーグ,G.I.,1987,J.Biol.Che
m.262,5886−5889; コリール,I.E.,ウィルヘルム,S.M.,アイゼン,A.Z.,マ
ーマー,B.L.,グラント,G.A.,ゼルツァー,J.L.,クローン
バーガー,A.,He.,C.,バウエル,E.A.,およびゴールドバ
ーグ,G.I.,1988,J.Biol.Chem 263,6579−6587; ウィルヘルム,S.M.,コリエルム,I.E.,クロンバーガ
ー,A.,アイゼン,A.Z.,マーマー,B.L.,グラント,G.A.,バ
イエル,E.,およびゴルドバーグ,G.I.,1987,Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A. 84,6725−6729; サウア,J.,キノネス,S.,オタニ,Y.,ナガセ,H.,ハリ
ス,E.D.Jr.,およびクルキネン,M.,1988,J.Biol.Chem 26
3,6742−6745; ウィットマン,S.E.,マーフィ,G.,アンゲル,P.,ラーム
スフォルフ,H.,−J.,スミス,B.J.,リオンス,A.,ハリス,
T.J.T.,レイノルズ.J.J.,ヘルリッヒ,P.およびドチャー
チ,A.J.P.,1986,Biochem.J.240,913−916; サンチェス−ロペツ,R.,ゲンセル,M.C.,マトリジア
ン,L.,およびブリートナッハ,J.ブリートナッハ,R.,198
8,J.Biol.Chem. 263,11892−11899;）。
これら酵素のアミノ末端のアミノ酸配列が最大の相同
のために一直線になっている場合（図10）、二つの相関
性が観察された。第一に、タイプIVコラーゲナーゼにお
いてpAPMA（結果として安定な活性酵素となる。）によ
る活性化の際のタンパク質自動分解の部位は、プロスト
ロメリシン活性化および間質プロコラーゲナーゼ活性化
の主産生物について以前に報告されたのと同一の遺伝子
座にて発生する（ホィットマン エス．イー．、マーフ
ィー ジー．、エンジェル ピー．、ラーンスホルフ
エィチ．ジェイ．、スミス ビー．ジェイ．、ライアン
ス エイ．、ハリス ティ．ジェイ．ティ．、レイノル
ズ ジェイ．ジェイ．、ヘルリッヒ ピー．およびドチ
ェリティ エイ．ジェイ．ピー．、1986、Biochem.J.24
0、913−916;マーフィー ジー．、コッケット エム．
アイ．、ステフェン ピー．イー．、スミス ビー．ジ
ェイ．およびドチェリティ エイ．ジェイ．ピー．、19
87、Biochem.J.248、265−268）。pAPMA処理に続くタン
パク質自動分解の同様な部位はプロストロメリシンにつ
いて（ウィルムヘルム エス．エム．、コリエルム ア
イ．イー．、クロンバーガー エイ．、アイゼン エ
イ．ズィ．、マーマー ビー．エル．、グラント ジ
ー．エイ．、バウアー イー．およびゴールドバーグ
ジー．アイ．、1987、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84.67
25−6729）および間質プロコラーゲナーゼについて（グ
ラント ジー．エイ．、アイゼン エイ．ズィ．、マー
マー ビー．エル．、ロズヴァイト ダブリュ．ティ．
およびゴールドバーグ ジー．アイ．、1987、J.Biol.C
hem.262、5886−5889）の他文献により報告されてい
る。第二に、すべて三つの酵素の活性化の間に除かれる
アミノ末端ペプチド断片は奇数個のシステイン残基を含
む。タイプIVプロコラーゲナーゼにおいて、三種のシス
テイン残基が除去されたペプチド断片の中に存在する;C
ys−31、Cys−36およびCys−73。間質プロコラーゲナー
ゼおよびプロストロメリシンにおいては、タイプIVプロ
コラーゲナーゼにおけるCys−73に相当する一個のシス
テイン残基が除去されたペプチド断片の中に存在する。
従って、潜伏メタロプロティナーゼにおける奇数個のシ
ステイン残基からpAPMA活性化形態における偶数個のシ
ステイン残基への変換はすべて三つの酵素において共通
の特徴であると思われる。不対システインの除去は機能
的に重大なものであろう。最後に、すべて三つの酵素は
高度保存領域をアミノ酸配列PRCGVPDVよりなる活性化座
の直上流に含む。この配列は、間質コラーゲナーゼおよ
びストロメリシンのプロペプチドにおいて不対システイ
ン残基（ホィットマン エス．イー．、マーフィー ジ
ー．、エンジェル ピー．、ラーンスホルフ エィチ．
ジェイ．、スミス ビー．ジェイ．、ライアンス エ
イ．、ハリス ティ．ジェイ．ティ．、レイノルズ ジ
ェイ．ジェイ．、ヘルリッヒ ピー．およびドチェリテ
ィ エイ．ジェイ．ピー．、1986、Biochem.J.240、913
−916）そして相同によりタイプIVコラーゲナーゼプロ
ペプチドにおいて不対システイン（存在する三種以外の
もの）を含む。最近の報告は、ラット トランシン（ra
t transin）の部位特異的突然変異誘発研究（ヒト ス
トロメリシンの相同）により、このメタロプロティナー
ゼ族の自動活性化におけるこの保存領域の重要性を示し
ている。この配列において突然変異を含む組換えトラン
シン形態は本来の配列と比較した場合より高速度の自発
活性化を示した（サンチェズ−ロペズ アール．、ニコ
ルソン アール．、ゲンセル エム．シー．、マトリシ
アン エル．およびブリートナッハ アール．、1988、
ブリードナッハ アール．、1988、J.Biol.Chem.263、1
1892−11899）。
そこで、本発明者はタイプIVプロコラーゲナーゼ活性
化遺伝子座に関連した多くの小ペプチドをタイプIVコラ
ーゲナーゼ酵素活性を阻害する能力について試験するた
めにゼラチンザイモグラム技術を使用した。図11および
図12に示されるように、不対システインを含む保存領域
（PRCGVPDV）を組み入れたペプチドのみが0.1mM未満の
濃度にて強く抑制性であった。システインは活性を必要
とした。表２は、インヒビター活性を保持する最小のペ
プチド配列は現実にはペンタペプチド配列RKPRCであっ
たことを示す。
さらに表２におけるデータは、ペプチドインヒビター
活性は臨界のシスティニル残基をフランキングする特定
の荷電配列要素を必要とすることを示す。明確には、保
存領域の二つのアルギニル残基は阻害活性について重大
であると思われた。これらの位置での極性不荷電残基と
の置換（ＲからＱ）は活性の損失の結果となった。しか
しながら、これら二個のアルギニル残基の間のプロリル
残基およびリシル残基はグリシル残基と置き換わること
ができそしてこれらペプチドは阻害活性を保持したであ
ろう。このことは、この領域の局所配座にとって重要で
あり得る（サンチェズ−ロペズ等、1988）ところのリシ
ル残基およびプロイル残基は阻害相互作用に直接には関
与しないことを示唆する。
従ってタイプIVコラーゲナーゼのプロ酵素断片は、マ
トリックスメタロプロティナーゼ族の他のメンバーによ
り分けられた保存領域を含む。この配列は活性化された
タイプIVコラーゲナーゼを阻害することが可能である。
このインヒビター配列は、必須システィニル残基に関し
て位置−１および−４にて荷電された二個の陽性残基を
含むところの特定のフランキングペプチド配列の中に不
対システィニル残基の存在を必要とする。このインヒビ
ターによる酵素活性の阻害は、酵素活性のための二つの
要素、定まったペプチド配列の中に不対システィニル残
基を必要とする点において特異的であると思われる。
これらのデータは、プロ酵素断片の中に存在するとこ
ろのRKPRC配列はシスティニル残基と活性部位にて配位
した金属原子との相互作用を通して酵素の内因性インヒ
ビターとして振舞うという新規な仮説を支持する。さら
に、システィニル残基に隣接した位置でのアミノ酸置換
はペプチドのタイプIVコラーゲナーゼ活性を妨げる能力
を廃止することができるので、不対システィニル残基を
囲繞する配列は、この阻害相互作用を促進すると思われ
る。
これらの結果は潜伏コラーゲナーゼ遺伝子族酵素の構
造およびそれらの活性について統一する仮説に統合する
ことができる。ザイモゲン形態は酵素活性部位との相互
作用をして触媒的活性を阻止する保存配列MRKPRCGN
（Ｖ）PDVを含むプロ酵素セグメントの結果である。こ
の相互作用は亜鉛原子の配位を通してシスティニル残基
の不対スルフヒドリル側鎖により安定化される。従っ
て、システィニル残基−金属原子配位を妨げるところの
すべての因子は結果としてプロ酵素断片の酵素活性およ
びこれに続く自動触媒的除去に帰する。これは、金属原
子−スルフヒドリル配位のために直接競争する試薬、例
えば有機水銀試薬により成し遂げられる。また金属原子
配位の崩壊に帰する臨界のシスティニル残基を囲繞する
プロ酵素断片の立体配座を妨げるところのカオトロピッ
ク因子によっても成し遂げられよう。また非タンパク質
分解組織活性物質例えばタイリー等、1981（Archiv.Bio
chem.Biophys.208、440−443）により記載されたもの
は、これらの酵素を、申し述べたのとに同様の誘発配座
転位の機構により活性化する。
本発明の別の好ましい態様は、タイプIVプロコラーゲ
ナーゼ酵素のプロペプチド配列１−80により具体化され
る。これは不対システイン残基を組み入れた内因性イン
ヒビター配列RKPRCを含む。加えて、この80アミノ酸ペ
プチドのアミノ末端は内部ジスルフィド結合を含み、そ
してこのペプチドはまた腫瘍細胞表面結合部位を含む。
80merペプチドは、例えば、合成化学によりまたは組換
え手段により作られるが、従って少なくとも三つの理由
のためにインヒビターとしての利点を有する。第一に、
その阻害活性は、阻害配列の二次構造が正確に再生され
るので、モルベースでペプチドよりも高くあり得る。第
二に組換え80merタンパク質はアミノ末端でのジスルフ
ィド結合の存在によりより大きいインビボ安定性（より
長い半減期）を有する。第三に、80merは細胞結合部位
を含むので、有害なタンパク質分解の出来事が起きる腫
瘍細胞の表面を標的とすることができる。図13は、活性
化の際ヒトタイプIVプロコラーゲナーゼから開裂すると
ころのアミノ末端ペプチドの80アミノ酸配列をエンコー
ドするところのヒトタイプIVプロコラーゲナーゼについ
てヒトcDNAクローンの部分のヌクレオチド配列を図示す
る。このヌクレオチド配列（または普遍的遺伝子コード
に従い同一のアミノ酸配列を特定するすべての他の配
列）を有するDNAセグメントは種々の組換えタンパク質
産生システムにおいてマトリックスメタロプロティナー
ゼのインヒビターとしての用途のために80merを産生す
るために使用することができる。あるいは、このヌクレ
オチド配列を有するDNAセグメントは、ヒトゲノムに由
来するが、哺乳動物の中に組換え表現ベクターの部分と
してマトリックスメタロプロティナーゼの80merインヒ
ビターの産生の内部遺伝子源を産生するために配するこ
とができる。
方法 培養方法 ヒトA2058黒色腫細胞を、10％ウシ胎児血清を入れたD
MEM中において80％集密にまで増殖した。その後培地を
血清の含まないDMEMと置き換えそして培養を24時間続行
した。血清の含まないならし培地を集めそして、−20℃
での貯蔵の前に限外濾過（Amicon YM 30 membrane）に
より濃縮した。
タイプIVプロコラーゲナーゼの精製 タイプIVプロコラーゲナーゼをヒトA2058黒色腫細胞
濃縮ならし培地から直接、0.05M Tris HCl、0.005M CaC
l2、0.5M NaCl、0.02％、Brij35（Sigma）を含むpH7.6
緩衝液（TCS buffer）中のゼラチン−セファロース（Si
gma）アフィニティクロマトグラフィにより精製した。
0.02％Brijと７％ジメチルスルホキシドとを含むTCS緩
衝液を使用して酵素を溶離した。その後試料を濃縮しそ
して同じ緩衝液中で−70℃にて使用するまで保存した。
さらにタイプIVプロコラーゲナーゼをアミノ酸配列分析
の前に、0.1％トリフルオロ酢酸中で平衡にされた0.46x
10cm RP 300カラム（Pierce Co.製）を備えたDionex A
1400 systemで逆相HPLCにより精製した。カラムは60％
アセトニトリルに対して線形勾配となるように溶離し
た。
合成ペプチドに対する抗体の製造 免疫感作において使用されたペプチドをBiosearch 96
00 peptide synthesizerにより合成した。抗体を実施例
３に記載したように製造しそして精製した。抗体製剤は
図３に示すように市販のELISAキット（Kirkegaard and
Perry Laboratories）Immulon 2プレート（Dynatech,In
c.）を使用して、ELISAにより特徴付けた。
有機水銀によるタイプIVプロコラーゲナーゼの活性化 0.05M NaOH中の0.01M p−APMAの貯蔵溶液を毎日新た
に製造した。プロ酵素試料を最終濃度0.5または1.0mM p
−APMAで時間を変えて（０−16時間）37℃にてインッキ
ュベートした。インキュベーションに続いて、試料を直
接、0.1％ゼラチンを含む９％アクリルアミドゲル上でN
aDodSO4−PAGEにより分析した（ゼラチンザイモグラ
ム）。あるいは、試料を９％NaDodSO4−PAGE上で走査し
そしてImmobilon P membranes（Millipore）の上に電気
的に斑点付けした。
タイプIVコラーゲン分解活性の分析 タイプIVコラーゲナーゼ活性を実施例１に記載されて
いるように阻害ペプチドの存在下で分析した。使用した
基質は3H−プロピニル化ヒトタイプIVコラーゲン（New
England Nuclear）である。反応は28℃にて４ないし16
時間の間行なった。
実施例３ 抗体認識メタロプロテイナーゼペプチド アミノ末端（残部１−17）からカルボキシ末端（残部
472−490）近傍の内部領域に伸びるタイプIVプロコラー
ゲナーゼの連続領域に相当する合成ペプチド（図1,表
３）は、本来のタイプIVプロコラーゲナーゼに対してそ
れらの個々の領域を認識した親和性精製ポリクローナル
抗体を生ずる抗原として使用された。
間相合成ペプチドに結合した抗体は液相ペプチドによ
り競合される可能性があるということを示すために酵素
結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）が使用され、
そして各々の親和性精製抗体は単一特異性であった（図
３）。有機水銀活性法の経時的なウェスターンイムノブ
ロッティング研究は、抗体は精製形態における、又は培
養液中で腫瘍細胞により隠された蛋白質の複合混合物中
の、固相酵素を認識したということを示した（図３）。
ウェスターンブロッティングは、低分子量形態への変換
中のアミノ末端領域（残部１−80）の直接的損失も示し
た（図７）。それ故、最初の１−80アミノ末端残部中の
ペプチド領域を認識する抗体は、酵素の活性形態から潜
伏体を区別するために使用することができる。表３中の
ペプチドを認識する抗体は、ヒト血清及びヒト尿中のタ
イプIVコラーゲナーゼ抗体を検出するための固相又は液
相直接又は競合イムノアッセイにおいて有用であること
が示された。その様な抗体アッセイは、局部又は転移癌
の診断のために有用である。抗−ペプチド抗体は、免疫
組織学によるヒト結腸癌の診断のために有用であること
も示された（表４）。
表４は、表３のペプチドを指示する抗体は悪性腫瘍細
胞に結合した酵素抗原を同定するために使用することが
できるということを示すヒト結腸癌例における免疫組織
学例の要約である。
方法 蛋白質ペプチド 蛋白質ペプチドの合成は、標準メリフィールド固相ペ
プチド合成書を使用して、バイオサーチモデル9600ペプ
チド合成装置により行った。合成された最初の配列は、
図１に示す様にヒトタイプIVコラーゲナーゼにおける残
部371−386に正確に相当するVAAHEFGHAMGLEHSQであっ
た。３個のHis残部及び２個のGlu残部はAla残部を用い
た種々の組み合わせで置換され、そしてタイプIVコラー
ゲナーゼに関することの置換の効果及びザイモグラムゲ
ラチナーゼ活性が検討された。
抗ペプチド抗体の調製 抗ペプチド抗体の調製は、下記工程を用いた。
BSAに対するペプチドの結合：ペプチド抗原性を形成
するために、BSA又は他の抗原性蛋白質に共有結合的に
結合させなければならない。ペプチド2mgにPBS1mlを加
え、次いでBSA6mgにPBS4mlを加える。これらの溶液を混
合し、次いで0.25％グルタルアルデヒド溶液5mlをこの
混合物に加える。この結果得られた溶液を室温で４時間
撹拌し、次いで室温で一晩PBS1リットルにより透析し
た。翌日、この溶液を6mlに濃縮し、次いで免疫化のた
めに1mlアリコットに分けた。
ラビットの免疫化：可能な限りの抗体の高力価を確保
するため、全ての免疫化は完全フロイントアジュバント
を使用して行うべきである。最初の２回の注射のため
に、BSA−ペプチド抱合体1ml及びCFA1mlを乳化し、次い
で２匹のラビットの背中の約30箇所に乳化剤1mlを用い
て皮下注射する。第二の注射後、抱合体溶液0.5mlをPBS
0.5mlを用いて希釈して乳化剤を調製する。免疫化は２
週間ごとに行う；採血は免疫化の前、及び第三又は第四
の注射を始めるまでの注射の間の週に行う。
ペプチド抗体親和性樹脂の調製：一度抗ペプチド抗体
血清が使用可能となれば、次工程は親和性精製工程を行
うためのものである。第一工程において、ペプチド抗体
親和性樹脂を調製する。アフィ−ゲル10（バイオラッド
株式会社）約10−12mlを、冷PBS40mlを用いて３回素早
く洗浄し、次いで冷PBSに再懸濁して全容量約20mlを得
る。同時に、ペプチド2mgをPBS1mlに溶解し、次いで中
程度に撹拌しながらアフィ−ゲル懸濁液に加える。この
結果得られた混合物を冷却状態で一晩穏やかに撹拌す
る。翌日、0.2M溶液を調製するために充分な1MトリスHC
l（pH8.0）を加え、次いでこのゲルを冷却状態で更に４
時間撹拌する。このゲルは、PBS40mlを用いて３回洗浄
後は抗体吸着が容易である。
担体の親和性精製：担体含有血清を30分間56℃に加熱
し、冷却し、次いでペプチド樹脂（これは、予め準備さ
れ、且つ注入された過剰のPBSを含んでいた）と混合す
る。冷却状態で一晩穏やかに撹拌後、ゲル懸濁液をカラ
ムに注入し、次いで冷1M酢酸をゲル容積の２倍用い、続
いてPBSをゲル容積の１倍用いて洗浄する。抗体溶出液
を6NNaOHを用いて約pH7.0に調整し、次いでこの結果得
られた溶液を約5mlにダイアフロ（YM−30）濃縮し、緩
衝液をPBSに変える。
樹脂への抗体のカップリング:1時間前にのみトリスを
反応を停止させるために加え、次いで未使用の活性サイ
トを封止することにより抗体のカップリングを進めるこ
と以外は、手順は上記と全く同一である。
イムノアッセイ：酵素結合イムノソルベントアッセ
イ、ウェスターンブロッティング研究、及び免疫組織学
は、標準的な慣用法を使用して行った。
上記の如く選択され次いで精製されたペプチドに対す
るポリクローナル又はモノクローナル抗体は、慣用の方
法により適する放射性酵素又は蛍光標識を用いて標識化
することが可能であり、これは当業者には明らかであろ
う。本文中に記載されたペプチド及び抗体を用いる免疫
学的分析は、慣用の免疫学的方法を使用し且つ非標識
化、結合性又は非結合性抗体又はペプチドの手段を用い
ることにより、体液、組織抽出物又は組織部分を包含す
る何れかのタイプの生物学的試料に対して適用すること
ができる。抗体又はペプチドは、適する固相例えば支持
体例えばミクロ滴定ウェルに結合させることができる。
タイプIVコラーゲナーゼのための前記抗ペプチド抗体
は、自然の全酵素に対して作られた抗体を上回る充分な
利点を有する（トリッグヴァソン，ケイ．及びリオッ
タ，エル．エイ．アメリカ合衆国特許第4677058号）。
第一に、それらはタイプIVコラーゲナーゼ（これは、他
の広く用いられているメタロプロテイナーゼと同族では
ない）に特有の特定領域を認識する。これは非自明のこ
とであり、そしてタイプIVコラーゲナーゼのアミノ酸配
列の大部分が図２に示されるように他のメタロプロテイ
ナーゼと非常に相同であるか、または同一でさえあると
いうことに関する重大な問題を克服する。表３のペプチ
ドに対して調製された抗体は他のメタロプロテイナーゼ
からの異なるタイプIVコラーゲナーゼを区別し、さらに
活性化酵素を潜酵素と区別し得る。この後者の特徴は、
活性化酵素に対する潜伏体の比率が病気の診断又は予後
における決定因子である場合に病的状態が存在し得るの
で非常に重要である。
前述の発明において、明確性及び理解の目的のために
幾つかの細部が述べられた。形態及び細部についての種
々の変化及び組み合わせが、本発明の範囲から離れるこ
となく成し得るということも当業者には自明であろう。
特に、本文中に記載されたペプチド抑制剤の側面配列に
おける変性はメタロプロテイナーゼ類の個々の構成員に
対する安定性、活性又は特異性を変え得るということは
当業者には自明である。例えば、図10に示される活性化
結合開裂サイトの左側に対する特定配列の選択は、タイ
プIVコラーゲナーゼに比べてストロメリシン又はタイプ
Ｉコラーゲナーゼを好ましく抑制するための抑制剤を生
じさせ得る。これは、前記配列のこの領域は異なるマト
リックスメタロプロテイナーゼタイプの間で幾つかの変
異性を示すからである。非臨界領域におけるアミノ酸の
一定置換基の選択は、ペプチドの抑制性を充分には変え
ないであろうということも更に明らかである。マトリッ
クスメタロプロテイナーゼに対して特異的な抗体のため
の免疫原又は抗原として使用すべき合成ペプチドの場合
において、当業者は抗体結合サイトによる認識表現にお
ける特異的アミノ酸配列は、４ないし６個のアミノ酸
〔これは、抗体を使用すべき環境（例えば、人間の生物
学的検体）において他の蛋白質中に存在することは知ら
れていない〕の配列からなるということを理解するであ
ろう。最後に、組み換え蛋白質ペプチドは自然のペプチ
ド又は合成ペプチドに比べて活性を有し得るということ
は従来技術において知られている。本発明の態様は、そ
れ故明らかな如く、合成ペプチド化学により適する発現
ベクター中に具合良く挿入された適するDNAセグメント
又は利用し得る自然源からの単離物を使用して調製され
た。幾つかの場合には、本発明のペプチドは、従来技術
において良く知られている標準法の変法に基づいて精製
し得る。
＊ ＊ ＊ 背景の記載及び本開示を完全にする目的で、本明細書
において今までに確認した出版物、特許及び特許願の各
々は、それ故参考文献として本明細書に加入されてい
る。
フロントページの続き (72)発明者 ステットラー―スティーブンソン，ウィ リアム アメリカ合衆国，メリーランド 20879, ゲイザースバーグ，ホワイト バーン コート 11227 (72)発明者 クルッシュ，ヘンリー アメリカ合衆国，メリーランド 20817, ベテスダ，デポール ドライブ 9704

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式aa1−aa2−aa3−aa4−Ｃ （式中、aa1はＲおよびＫからなる群から選択される塩
    基性アミノ酸;aa2はＫおよびＱからなる群から選択され
    る極性アミノ酸;aa3はＰ、ＡおよびＬからなる群から選
    択される無極性アミノ酸;aa4はＲおよびＫからなる群か
    ら選択される塩基性アミノ酸；そしてＣは遊離スルフヒ
    ドリル基を有するシステインである）を有するアミノ酸
    配列から本質的になり、かつマトリックスメタロプロテ
    イナーゼを阻害する能力をさらに有する実質的に純粋な
    ペプチド。
  2. 【請求項２】アミノ酸配列がRKPRCである請求項１記載
    のペプチド。
  3. 【請求項３】アミノ酸配列がRQPRC、RKARC、KKPRC、RKP
    KCおよびRKLRCからなる群から選択される請求項１記載
    のペプチド。
  4. 【請求項４】アミノ酸配列がTMRKPRCGNPDVANおよびMRKP
    RCGからなる群から選択される請求項１記載のペプチ
    ド。
  5. 【請求項５】アミノ酸配列がAPSPIIKFPGDVAPKTDKELAVQY
    LNTFYGCPKESCNLFVLKDTLKKMQKFFGLPQTGDLDQNTIEIMRKPRCG
    NPDVANである請求項１記載のペプチド。
  6. 【請求項６】請求項１ないし５のいずれか１項に記載の
    ペプチドのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害量か
    らなる哺乳動物のためのマトリックスメタロプロテイナ
    ーゼ阻害剤。
  7. 【請求項７】舌下投与のための製剤の形態にある請求項
    ６記載の阻害剤。
  8. 【請求項８】吸入のための製剤の形態にある請求項６記
    載の阻害剤。
  9. 【請求項９】静脈注射のための製剤にある請求項６記載
    の阻害剤。
  10. 【請求項１０】請求項１ないし５のいずれか１項に記載
    のペプチドのマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害量
    からなるマトリックスメタロプロテイナーゼの活性に起
    因する変性過程に対する哺乳動物処置剤。
  11. 【請求項１１】舌下投与のための製剤の形態にある請求
    項10記載の処置剤。
  12. 【請求項１２】吸入のための製剤の形態にある請求項10
    記載の処置剤。
  13. 【請求項１３】静脈注射のための製剤にある請求項10の
    処置剤。
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