JP2001011093A - マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド - Google Patents
マトリックスメタロプロテイナーゼペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤とし
て有用な特定のアミノ酸配列を有するペプチドの提供。 【解決手段】以下の配列：ＶＡＡＨＥＦＧＨＡＭＧＬＥ
ＨＳＱ、ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥＨＳＱ、ＶＡＡＨ
ＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ、ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬＧＬ
ＦＨＳＡ、ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよびＡ
ＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭからなる群から選択される
ゼラチナーゼまたはコラーゲナーゼを阻害する精製およ
び合成ペプチド。ゼラチナーゼまたはコラーゲナーゼを
阻害する配列ＡＡＨＥまたはＶＡＨＥを含む上記合成ペ
プチドの断片。担体中の上記ペプチドである物質の組成
物。
て有用な特定のアミノ酸配列を有するペプチドの提供。 【解決手段】以下の配列：ＶＡＡＨＥＦＧＨＡＭＧＬＥ
ＨＳＱ、ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥＨＳＱ、ＶＡＡＨ
ＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ、ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬＧＬ
ＦＨＳＡ、ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよびＡ
ＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭからなる群から選択される
ゼラチナーゼまたはコラーゲナーゼを阻害する精製およ
び合成ペプチド。ゼラチナーゼまたはコラーゲナーゼを
阻害する配列ＡＡＨＥまたはＶＡＨＥを含む上記合成ペ
プチドの断片。担体中の上記ペプチドである物質の組成
物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、メタロプロティナ
ーゼの検出および阻害に有効なペプチドに関する。特
に、本発明は酵素活性および酵素とその基質との相互作
用に関わる酵素のドメインに相当する、ＩＶ型コラーゲ
ナーゼの配列から得られるペプチドに関する。ペプチド
に認知される抗体は酵素の検出に有効である。機能研究
により確認された、特定のペプチドはメタロプロテイナ
ーゼ阻害剤の新しい種類を構成する。
ーゼの検出および阻害に有効なペプチドに関する。特
に、本発明は酵素活性および酵素とその基質との相互作
用に関わる酵素のドメインに相当する、ＩＶ型コラーゲ
ナーゼの配列から得られるペプチドに関する。ペプチド
に認知される抗体は酵素の検出に有効である。機能研究
により確認された、特定のペプチドはメタロプロテイナ
ーゼ阻害剤の新しい種類を構成する。
【０００２】
【従来の技術】間質および基底膜コラーゲンの減成は特
定の種類のメタロプロテイナーゼ（そのマトリックスメ
タロプロテイナーゼは酵素前駆体型として細胞外マトリ
ックス中に分泌されるコラーゲナーゼ（ＢＣ３．４．２
４．７）としても公知である）によって開始される。こ
のコラーゲナーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは次のも
のを含んでいる。コラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型を
減成し、基質特異性と活性の必要条件によって特徴づけ
られている間質コラーゲナーゼ（Stricklin, G.P., Jef
frey, J.J., Rosewit, W.T.,およびEisen, A.Z., 1983,
Biochemistry 22, 61-68; Goldberg, G.I., Wilhlem,
S., Kronberger, A., Bauer, E.A., Grant, G.A., およ
びEisen, A.Z., 1986, J. Biol. Chem. 261, 6600-660
5; Hasty, K.A., Jeffrey, J.J., Hibbs, M.S.,およびW
elgus, H.G., 1987, J. Biol. Chem.262, 10048-10052;
Fields, G.B., Van Wart, H.E.,およびBirkedal-Hanse
n, H., 1987, J. Biol. Chem. 262, 6221-6226; Grant,
G.A., Eisen, A.Z., Marmer, B.L. Rosweit, W.T., お
よびGoldberg, G.I., 1987, J. Biol. Chem. 262, 5886
-5889 ）；プロテオグリカン、グリコプロテインおよび
コラーゲン分子の非らせん部位を減成するストロメリジ
ン（Wilhlem, S.M., Collierm, I.E., Kronberger, A.,
Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., Bauer, E.
A., およびGoldberg, G.I., 1987, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 84, 6725-6729; Whitman,S.E., Murphy,
G., Angel, P., Rahmsforf, H.-J., Smith, B.J., Lyon
s, A., Harris, T.J.T., Reynolds, J.J., Herrlich,
P. およびDocherty, A.J.P., 1986, Biochem. J. 240,
913-916）；およびペプシン抵抗性三重らせんＩＶ型コ
ラーゲンおよび間質コラーゲン（ゼラチン）を減成する
ＩＶ型コラーゲナーゼ。ＩＶ型コラーゲナーゼはヒト腫
瘍細胞（Liotta, L.A., Kleinerman, J., Catanzaro,
P.,およびRynbrandt, D., 1977, J. Natl. Cancer Ins
t. 58, 1427-1439; Turpeenniemi-Hujanen, T., および
Tryggvason, K., 1982, Int. J. Cancer 30p, 669-673;
Liotta, L.A., Abe, S., Gehron-Robey, P., およびMa
rtin, G.R., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 7
6, 2268-2272; Liotta, L.A., Tryggvason,K., Garbis
a, S., Hart, I., Foltz, C.M.,およびShafie, S., 198
0, Nature,Lond., 284, 67-68; Collier, I.E., Wilhel
m, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., S
eltzer, J.L., Kronberger, A., He., C., Bauer, E.
A., およびGoldberg, G.I., 1988, J. Biol. Chem. 26
3, 6579-6587 ）；内皮細胞（Kalebic, T., Barbisa,
S., Glaser, B., およびLiotta, L.A., 1983, Science
221, 281-283）；骨（Murphy, G., McAlpine, C.G., Po
ll, C.T., およびReynolds, J.J., 1985, Biochem. Bio
phys. Acta 831, 49-58 ）；繊維芽細胞（Collier,I.
E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Gran
t, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He., C., B
auer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J.Biol. Che
m. 263, 6579-6587 ）；多形核白血球（Uitto, V.J., S
chwartx, D.,およびVeis, A., 1980, Eur. J. Biochem.
105, 409-417 ）およびマクロファージ（Garbidsa,
S., Ballin, M., Daga-Giordini, D., Fastelli, G., N
aturale,M., Negro, A., Semenzato, G.,およびLiotta,
L.A., 1986, J. Biol. Chem. 261, 2369-2375 ）から
確認されている。この酵素は６８ないし７２キロダルト
ンの中性メタロプロテイナーゼであり、それは酵素前駆
体型で分泌される（Liotta, L.A., Abe, S., Gehron-Ro
bey, P.,およびMartin, G.R., 1979, Proc. Natl.Acad.
Sci. U.S.A. 76, 2268-2272; Liotta, L.A., Tryggvas
on, K., Garbisa,S., Gehron-Robey, P., およびAbe,
S., 1981, Biochemistry 20, 100-104; Salo, T., Liot
ta, L.A.,およびTryggvason, K., 1983, J. Biol. Che
m. 258, 3058-3063 ）。さらに、いくつかの他のコラー
ゲナーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは近年、ストロメ
リジンの第２型（ストロメリジン−２）、９２キロダル
トン型のＩＶ型コラーゲナーゼおよびピュータティブ・
ウテリンメタロプロテイナーゼ（ＰＵＭＰ）−１、低分
子量ウテリンコラーゲナーゼ（Wilhlem, S.M., Collie
r, I.E., Kronberger, A., Marmer, B.L., Eisen, A.
Z., Grant, G.A., およびGoldberg, G.I., 1989, J. Bi
ol. Chem. 264, 17213-17221; Woessner, J.F. およびT
alpin, C. J., 1988, J. Biol. Chem. 263, 16918-1692
5）を含めて開示されている。７０キロダルトンＩＶ型
コラーゲナーゼは、マウス腫瘍型での腫瘍の転移潜在性
に密接に関係しており（Liotta, L.A., Tryggvason,
K., Garbisa, S., Hart,I., Foltz, C.M., およびShafi
e, S., 1980, Nature, Lond., 284, 67-68 ）、そして
それに伴い転移表現型の遺伝子誘導が誘発するＨ−ｒａ
ｓ癌遺伝子を増加させる（Muschel, R., Williams, J.
E., Lowy, D.R.,およびLiotta, L.A.,1985,Amer. J. Pa
thol. 121, 1-8; Garbisa, S., Pozzatti, R., Musche
l, R.J., Saffiotti, U., Ballin, M., Goldfarb, R.
H., Khoury, G.,およびLiotta, L.A.,1987, Cancer Re
s. 47, 1523-1528 ）。トリプシン処理の結果、潜在酵
素の活性化とそれに伴う分子量の減少が起こる（Liott
a, L.A., Tryggvason, K., Garbisa, S., Gehron-Robe
y, P.,およびAbe, S., 1981, Biochemistry 20, 100-10
4 ）。有機水銀化合物もまたこの酵素の活性化を提示
し、このことも分子量の減少に関連づけられる（Collie
r, I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L.,
Grant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He.,
C., Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J. Bio
l. Chem. 263, 6579-6587; Murphy, G., McAlpine, C.
G., Poll, C.T.,およびReynolds, J.J., 1985, Bioche
m. Biophys. Acta 831, 49-58 ）。活性化された酵素は
ＩＶ型コラーゲンを分解させ、特徴的な１／４アミノ末
端および３／４カルボキシ末端の断片を生成させる（Li
otta, L.A.,Tryggvason, K., Garbisa, S., Gehron-Rob
ey, P.,およびAbe, S., 1981, Biochemistry 20, 100-1
04; Collier, I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Mar
mer,B.L., Grant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger,
A., He., C., Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 198
8, J. Biol. Chem. 263, 6579-6587; Fessler, L.I., D
uncan, K.G., Fessler, J.H., Salo, T.,およびTryggva
son, K., 1984, J. Biol. Chem. 259, 9783-9789 ）。
ゼラチン分解活性がこの酵素に関連することも示されて
いる（Collier, I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., M
armer, B.L., Grant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberge
r, A., He., C., Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I.,
1988, J. Biol. Chem. 263, 6579-6587; Hoyhtya, M.,
Turpeenniemi-Hujanen, T., Stetler-Stevenson, W., K
urtzsch, H., Tryggvason, K.,およびLiotta, L.A., 19
88, FEBS Letters 233, 109-113; Murphy, G., McAlpin
e,C.G., Poll, C.T.,およびReynolds, J.J., 1985, Bio
chem. Biophys. Acta 831, 49-58 ）。同様に、Ｖ型コ
ラーゲン分解活性も示されている（Collier, I.E.,Wilh
elm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A.,
Seltzer, J.L., Kronberger, A., He., C., Bauer, E.
A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J. Biol.Chem. 263,
6579-6587; Murphy, G., McAlpine, C.G., Poll, C.T.,
およびReynolds, J.J., 1985, Biochem. Biophys. Acta
831, 49-58 ）。ＩＶ型コラーゲナーゼはヒトメラノー
マ（黒色腫）細胞から精製されており、そして全タンパ
ク質アミノ末端における配列情報はトリプシンおよび臭
化シアンのペプチド断片と同様に得られる（Hoyhtya,
M., Turpeenniemi-Hujanen, T., Stetler-Stevenson,
W., Kurtzsch, H., Tryggvason, K., およびLiotta, L.
A.,1988, FEBS Letters 233, 109-113 ）。配列情報は
ＩＶ型コラーゲナーゼが間質コラーゲナーゼおよびスト
ロメリシンに対する限定された配列相同性を示すことを
明らかにする。最近の報告はＨ−ｒａｓ変性ヒト気管上
皮細胞により分泌されたメタロプロテイナーゼに対して
部分的なｃＤＮＡクローンを特徴づけた（Collier, I.
E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Gran
t, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He., C., B
auer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J. Biol. Ch
em. 263, 6579-6587 ）。変性気管上皮酵素は特にＩＶ
型コラーゲンの減成に有効で、そして推定されたアミノ
酸配列はヒト腫瘍ＩＶ型コラーゲナーゼのトリプシンお
よび臭化シアン断片に対して報告されたものと一致して
いることを示す（Hoyhtya, M., Turpeenniemi-Hujanen,
T., Stetler-Stevenson, W., Kurtzsch, H., Tryggvas
on, K., およびLiotta, L.A., 1988, FEBS Letters 23,
109-113）。このように、ヒトメラノーマ細胞のＩＶ型
コラーゲナーゼはＨ−ｒａｓ変性ヒト気管上皮細胞の酵
素と一致すると考えられ、それは繊維芽細胞（Collier,
I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., G
rant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He.,
C., Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I.,1988, J. Bio
l. Chem. 263, 6579-6587 ）および骨細胞外植体（Murp
hy, G., McAlpine, C.G., Poll, C.T., およびReynold
s, J.J., 1985, Biochem. Biophys.Acta 831, 49-58 ）
からも発見されている。
定の種類のメタロプロテイナーゼ（そのマトリックスメ
タロプロテイナーゼは酵素前駆体型として細胞外マトリ
ックス中に分泌されるコラーゲナーゼ（ＢＣ３．４．２
４．７）としても公知である）によって開始される。こ
のコラーゲナーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは次のも
のを含んでいる。コラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型を
減成し、基質特異性と活性の必要条件によって特徴づけ
られている間質コラーゲナーゼ（Stricklin, G.P., Jef
frey, J.J., Rosewit, W.T.,およびEisen, A.Z., 1983,
Biochemistry 22, 61-68; Goldberg, G.I., Wilhlem,
S., Kronberger, A., Bauer, E.A., Grant, G.A., およ
びEisen, A.Z., 1986, J. Biol. Chem. 261, 6600-660
5; Hasty, K.A., Jeffrey, J.J., Hibbs, M.S.,およびW
elgus, H.G., 1987, J. Biol. Chem.262, 10048-10052;
Fields, G.B., Van Wart, H.E.,およびBirkedal-Hanse
n, H., 1987, J. Biol. Chem. 262, 6221-6226; Grant,
G.A., Eisen, A.Z., Marmer, B.L. Rosweit, W.T., お
よびGoldberg, G.I., 1987, J. Biol. Chem. 262, 5886
-5889 ）；プロテオグリカン、グリコプロテインおよび
コラーゲン分子の非らせん部位を減成するストロメリジ
ン（Wilhlem, S.M., Collierm, I.E., Kronberger, A.,
Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., Bauer, E.
A., およびGoldberg, G.I., 1987, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 84, 6725-6729; Whitman,S.E., Murphy,
G., Angel, P., Rahmsforf, H.-J., Smith, B.J., Lyon
s, A., Harris, T.J.T., Reynolds, J.J., Herrlich,
P. およびDocherty, A.J.P., 1986, Biochem. J. 240,
913-916）；およびペプシン抵抗性三重らせんＩＶ型コ
ラーゲンおよび間質コラーゲン（ゼラチン）を減成する
ＩＶ型コラーゲナーゼ。ＩＶ型コラーゲナーゼはヒト腫
瘍細胞（Liotta, L.A., Kleinerman, J., Catanzaro,
P.,およびRynbrandt, D., 1977, J. Natl. Cancer Ins
t. 58, 1427-1439; Turpeenniemi-Hujanen, T., および
Tryggvason, K., 1982, Int. J. Cancer 30p, 669-673;
Liotta, L.A., Abe, S., Gehron-Robey, P., およびMa
rtin, G.R., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 7
6, 2268-2272; Liotta, L.A., Tryggvason,K., Garbis
a, S., Hart, I., Foltz, C.M.,およびShafie, S., 198
0, Nature,Lond., 284, 67-68; Collier, I.E., Wilhel
m, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., S
eltzer, J.L., Kronberger, A., He., C., Bauer, E.
A., およびGoldberg, G.I., 1988, J. Biol. Chem. 26
3, 6579-6587 ）；内皮細胞（Kalebic, T., Barbisa,
S., Glaser, B., およびLiotta, L.A., 1983, Science
221, 281-283）；骨（Murphy, G., McAlpine, C.G., Po
ll, C.T., およびReynolds, J.J., 1985, Biochem. Bio
phys. Acta 831, 49-58 ）；繊維芽細胞（Collier,I.
E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Gran
t, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He., C., B
auer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J.Biol. Che
m. 263, 6579-6587 ）；多形核白血球（Uitto, V.J., S
chwartx, D.,およびVeis, A., 1980, Eur. J. Biochem.
105, 409-417 ）およびマクロファージ（Garbidsa,
S., Ballin, M., Daga-Giordini, D., Fastelli, G., N
aturale,M., Negro, A., Semenzato, G.,およびLiotta,
L.A., 1986, J. Biol. Chem. 261, 2369-2375 ）から
確認されている。この酵素は６８ないし７２キロダルト
ンの中性メタロプロテイナーゼであり、それは酵素前駆
体型で分泌される（Liotta, L.A., Abe, S., Gehron-Ro
bey, P.,およびMartin, G.R., 1979, Proc. Natl.Acad.
Sci. U.S.A. 76, 2268-2272; Liotta, L.A., Tryggvas
on, K., Garbisa,S., Gehron-Robey, P., およびAbe,
S., 1981, Biochemistry 20, 100-104; Salo, T., Liot
ta, L.A.,およびTryggvason, K., 1983, J. Biol. Che
m. 258, 3058-3063 ）。さらに、いくつかの他のコラー
ゲナーゼ遺伝子ファミリーのメンバーは近年、ストロメ
リジンの第２型（ストロメリジン−２）、９２キロダル
トン型のＩＶ型コラーゲナーゼおよびピュータティブ・
ウテリンメタロプロテイナーゼ（ＰＵＭＰ）−１、低分
子量ウテリンコラーゲナーゼ（Wilhlem, S.M., Collie
r, I.E., Kronberger, A., Marmer, B.L., Eisen, A.
Z., Grant, G.A., およびGoldberg, G.I., 1989, J. Bi
ol. Chem. 264, 17213-17221; Woessner, J.F. およびT
alpin, C. J., 1988, J. Biol. Chem. 263, 16918-1692
5）を含めて開示されている。７０キロダルトンＩＶ型
コラーゲナーゼは、マウス腫瘍型での腫瘍の転移潜在性
に密接に関係しており（Liotta, L.A., Tryggvason,
K., Garbisa, S., Hart,I., Foltz, C.M., およびShafi
e, S., 1980, Nature, Lond., 284, 67-68 ）、そして
それに伴い転移表現型の遺伝子誘導が誘発するＨ−ｒａ
ｓ癌遺伝子を増加させる（Muschel, R., Williams, J.
E., Lowy, D.R.,およびLiotta, L.A.,1985,Amer. J. Pa
thol. 121, 1-8; Garbisa, S., Pozzatti, R., Musche
l, R.J., Saffiotti, U., Ballin, M., Goldfarb, R.
H., Khoury, G.,およびLiotta, L.A.,1987, Cancer Re
s. 47, 1523-1528 ）。トリプシン処理の結果、潜在酵
素の活性化とそれに伴う分子量の減少が起こる（Liott
a, L.A., Tryggvason, K., Garbisa, S., Gehron-Robe
y, P.,およびAbe, S., 1981, Biochemistry 20, 100-10
4 ）。有機水銀化合物もまたこの酵素の活性化を提示
し、このことも分子量の減少に関連づけられる（Collie
r, I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L.,
Grant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He.,
C., Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J. Bio
l. Chem. 263, 6579-6587; Murphy, G., McAlpine, C.
G., Poll, C.T.,およびReynolds, J.J., 1985, Bioche
m. Biophys. Acta 831, 49-58 ）。活性化された酵素は
ＩＶ型コラーゲンを分解させ、特徴的な１／４アミノ末
端および３／４カルボキシ末端の断片を生成させる（Li
otta, L.A.,Tryggvason, K., Garbisa, S., Gehron-Rob
ey, P.,およびAbe, S., 1981, Biochemistry 20, 100-1
04; Collier, I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Mar
mer,B.L., Grant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger,
A., He., C., Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 198
8, J. Biol. Chem. 263, 6579-6587; Fessler, L.I., D
uncan, K.G., Fessler, J.H., Salo, T.,およびTryggva
son, K., 1984, J. Biol. Chem. 259, 9783-9789 ）。
ゼラチン分解活性がこの酵素に関連することも示されて
いる（Collier, I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., M
armer, B.L., Grant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberge
r, A., He., C., Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I.,
1988, J. Biol. Chem. 263, 6579-6587; Hoyhtya, M.,
Turpeenniemi-Hujanen, T., Stetler-Stevenson, W., K
urtzsch, H., Tryggvason, K.,およびLiotta, L.A., 19
88, FEBS Letters 233, 109-113; Murphy, G., McAlpin
e,C.G., Poll, C.T.,およびReynolds, J.J., 1985, Bio
chem. Biophys. Acta 831, 49-58 ）。同様に、Ｖ型コ
ラーゲン分解活性も示されている（Collier, I.E.,Wilh
elm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A.,
Seltzer, J.L., Kronberger, A., He., C., Bauer, E.
A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J. Biol.Chem. 263,
6579-6587; Murphy, G., McAlpine, C.G., Poll, C.T.,
およびReynolds, J.J., 1985, Biochem. Biophys. Acta
831, 49-58 ）。ＩＶ型コラーゲナーゼはヒトメラノー
マ（黒色腫）細胞から精製されており、そして全タンパ
ク質アミノ末端における配列情報はトリプシンおよび臭
化シアンのペプチド断片と同様に得られる（Hoyhtya,
M., Turpeenniemi-Hujanen, T., Stetler-Stevenson,
W., Kurtzsch, H., Tryggvason, K., およびLiotta, L.
A.,1988, FEBS Letters 233, 109-113 ）。配列情報は
ＩＶ型コラーゲナーゼが間質コラーゲナーゼおよびスト
ロメリシンに対する限定された配列相同性を示すことを
明らかにする。最近の報告はＨ−ｒａｓ変性ヒト気管上
皮細胞により分泌されたメタロプロテイナーゼに対して
部分的なｃＤＮＡクローンを特徴づけた（Collier, I.
E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Gran
t, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He., C., B
auer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J. Biol. Ch
em. 263, 6579-6587 ）。変性気管上皮酵素は特にＩＶ
型コラーゲンの減成に有効で、そして推定されたアミノ
酸配列はヒト腫瘍ＩＶ型コラーゲナーゼのトリプシンお
よび臭化シアン断片に対して報告されたものと一致して
いることを示す（Hoyhtya, M., Turpeenniemi-Hujanen,
T., Stetler-Stevenson, W., Kurtzsch, H., Tryggvas
on, K., およびLiotta, L.A., 1988, FEBS Letters 23,
109-113）。このように、ヒトメラノーマ細胞のＩＶ型
コラーゲナーゼはＨ−ｒａｓ変性ヒト気管上皮細胞の酵
素と一致すると考えられ、それは繊維芽細胞（Collier,
I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., G
rant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He.,
C., Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I.,1988, J. Bio
l. Chem. 263, 6579-6587 ）および骨細胞外植体（Murp
hy, G., McAlpine, C.G., Poll, C.T., およびReynold
s, J.J., 1985, Biochem. Biophys.Acta 831, 49-58 ）
からも発見されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明はマトリックス
メタロプロテイナーゼ阻害剤として有用な特定のアミノ
酸配列を有するペプチドの提供を課題とする。
メタロプロテイナーゼ阻害剤として有用な特定のアミノ
酸配列を有するペプチドの提供を課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】発明の要約 ヒト黒色腫細胞から精製されたＩＶ型コラーゲナーゼの
酵素前駆体の全アミノ酸配列が今分析され、そして該酵
素の種々のドメインに相当する一連の阻害性合成ペプチ
ドが調製された。これらのドメインは活性化の間にプロ
酵素から切断される８０残基のアミノ末端；システイン
に富む（システインリッチ）内部ドメイン；ヒスチジン
含有領域；およびカルボキシ末端から領域１５９残基を
包含する。これらのドメインからのペプチドはＩＶ型コ
ラーゲナーゼ分子内の特定のドメインに対する抗体を生
成するために使用された。本発明において、抗体、直接
アミノ酸配列分析、およびペプチドはａ）基質との結合
および相互作用に関与する酵素の領域、およびｂ）有機
水銀化合物ｐ−アミノフェニル水銀アセテートでの酵素
前駆体活性化の間に生成される主なＩＶ型コラーゲナー
ゼ変換体の構造を決定するために使用された。
酵素前駆体の全アミノ酸配列が今分析され、そして該酵
素の種々のドメインに相当する一連の阻害性合成ペプチ
ドが調製された。これらのドメインは活性化の間にプロ
酵素から切断される８０残基のアミノ末端；システイン
に富む（システインリッチ）内部ドメイン；ヒスチジン
含有領域；およびカルボキシ末端から領域１５９残基を
包含する。これらのドメインからのペプチドはＩＶ型コ
ラーゲナーゼ分子内の特定のドメインに対する抗体を生
成するために使用された。本発明において、抗体、直接
アミノ酸配列分析、およびペプチドはａ）基質との結合
および相互作用に関与する酵素の領域、およびｂ）有機
水銀化合物ｐ−アミノフェニル水銀アセテートでの酵素
前駆体活性化の間に生成される主なＩＶ型コラーゲナー
ゼ変換体の構造を決定するために使用された。
【０００５】有機水銀化合物、ｐＡＰＭＡによるＩＶ型
コラーゲナーゼプロ酵素活性化は、結果として６２ｋＤ
ａの安定な活性酵素種を生じるアミノ酸８０個のアミノ
末端断片の自触的除去を伴うことが発見された。さら
に、これらのデータはＩＶ型コラーゲナーゼがその他の
細胞外マトリックス分解性メタロプロテイナーゼのアミ
ノ末端領域と配列相同性だけでなく機能的ドメイン同一
性を有することを示す。
コラーゲナーゼプロ酵素活性化は、結果として６２ｋＤ
ａの安定な活性酵素種を生じるアミノ酸８０個のアミノ
末端断片の自触的除去を伴うことが発見された。さら
に、これらのデータはＩＶ型コラーゲナーゼがその他の
細胞外マトリックス分解性メタロプロテイナーゼのアミ
ノ末端領域と配列相同性だけでなく機能的ドメイン同一
性を有することを示す。
【０００６】下の図８および９に示されるように、アミ
ノ末端ペプチド（残基１−８０）はＩＶ型コラーゲナー
ゼ活性化の間に切除される。この発見により、このペプ
チドが、活性部位をブロックしそして酵素を不活性にす
る内在酵素阻害剤を含むという可能性が高まった。従っ
て、活性化の間の上記アミノ末端断片の除去はこの阻害
剤を除去するであろうし、そして活性部位を露出する。
この阻害に関与する重要な領域は対になっていないシス
テイン残基を含む図１０においてボックスで囲まれた領
域である。この領域はその他のマトリックスメタロプロ
テイナーゼにおいて保存された性質を示し、そしてＣｈ
ｏｕ−Ｆａｓｓｍａｎによる分析法によりベータターン
コンホメーションの高い可能性を有する。さらに、この
配列内の対になっていないシステイン残基が酵素の活性
部位においてメタロイオンと非共有結合的に相互作用す
ると仮定することは正当だった。従って、有機水銀活性
化（ＡＰＭＡがスルフヒドリル残基に結合することは知
られている）がこの相互作用を乱し、そして阻害剤断片
が活性部位に接近しないようにするコンホメーション変
化を引き起こすであろう。この全く新しい仮説を試験す
るために、アミノ末端残基１−８７における一連の重複
領域に相当する合成ペプチドが調製された。下の図１１
および１２ならびに表４に示されるように、対になって
いないシステインを含む保存領域を含有するそれらのペ
プチドだけが０．１ｍＭ未満の濃度で強く阻害性だっ
た。システインは活性のために必要だった。それ故に、
これらのペプチドはメタロプロティナーゼのための阻害
剤の全く新しいクラスを構成する。
ノ末端ペプチド（残基１−８０）はＩＶ型コラーゲナー
ゼ活性化の間に切除される。この発見により、このペプ
チドが、活性部位をブロックしそして酵素を不活性にす
る内在酵素阻害剤を含むという可能性が高まった。従っ
て、活性化の間の上記アミノ末端断片の除去はこの阻害
剤を除去するであろうし、そして活性部位を露出する。
この阻害に関与する重要な領域は対になっていないシス
テイン残基を含む図１０においてボックスで囲まれた領
域である。この領域はその他のマトリックスメタロプロ
テイナーゼにおいて保存された性質を示し、そしてＣｈ
ｏｕ−Ｆａｓｓｍａｎによる分析法によりベータターン
コンホメーションの高い可能性を有する。さらに、この
配列内の対になっていないシステイン残基が酵素の活性
部位においてメタロイオンと非共有結合的に相互作用す
ると仮定することは正当だった。従って、有機水銀活性
化（ＡＰＭＡがスルフヒドリル残基に結合することは知
られている）がこの相互作用を乱し、そして阻害剤断片
が活性部位に接近しないようにするコンホメーション変
化を引き起こすであろう。この全く新しい仮説を試験す
るために、アミノ末端残基１−８７における一連の重複
領域に相当する合成ペプチドが調製された。下の図１１
および１２ならびに表４に示されるように、対になって
いないシステインを含む保存領域を含有するそれらのペ
プチドだけが０．１ｍＭ未満の濃度で強く阻害性だっ
た。システインは活性のために必要だった。それ故に、
これらのペプチドはメタロプロティナーゼのための阻害
剤の全く新しいクラスを構成する。
【０００７】要するに、この分析に基づく発見はａ）酵
素が潜在状態にあるとき該酵素の活性部位をブロックし
得る内在性酵素阻害剤を構成する型プロコラーゲナーゼ
のアミノ末端近傍の領域、およびｂ）基質との結合およ
び相互作用に関与する酵素の中央近傍の領域の確認を導
いた。これらの領域に相同なペプチドは新規マトリック
スメタロブロティナーゼ阻害剤を構成する。具体的に本
発明は以下のとおりのものである： （１）以下の配列からなる群：ＶＡＡＨＥＦＧＨＡＭＧ
ＬＥＨＳＱ、ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥＨＳＱ、ＶＡ
ＡＨＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ、ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬ
ＧＬＦＨＳＡ、ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよ
びＡＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭから選択されるゼラチ
ナーゼまたはコラーゲナーゼを阻害する精製および合成
ペプチド。 （２）ゼラチナーゼまたはコラーゲナーゼを阻害する配
列ＡＡＨＥまたはＶＡＨＥを含む上記（１）記載の精製
および合成ペプチドの断片。 （３）担体中の上記（１）または（２）記載のペプチド
である物質の組成物。
素が潜在状態にあるとき該酵素の活性部位をブロックし
得る内在性酵素阻害剤を構成する型プロコラーゲナーゼ
のアミノ末端近傍の領域、およびｂ）基質との結合およ
び相互作用に関与する酵素の中央近傍の領域の確認を導
いた。これらの領域に相同なペプチドは新規マトリック
スメタロブロティナーゼ阻害剤を構成する。具体的に本
発明は以下のとおりのものである： （１）以下の配列からなる群：ＶＡＡＨＥＦＧＨＡＭＧ
ＬＥＨＳＱ、ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥＨＳＱ、ＶＡ
ＡＨＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ、ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬ
ＧＬＦＨＳＡ、ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよ
びＡＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭから選択されるゼラチ
ナーゼまたはコラーゲナーゼを阻害する精製および合成
ペプチド。 （２）ゼラチナーゼまたはコラーゲナーゼを阻害する配
列ＡＡＨＥまたはＶＡＨＥを含む上記（１）記載の精製
および合成ペプチドの断片。 （３）担体中の上記（１）または（２）記載のペプチド
である物質の組成物。
【０００８】図面の簡単な説明 図１は腫瘍細胞により分泌されたヒトＩＶ型プロコラー
ゲナーゼの全アミノ酸配列を示す。図２はドメインにま
とめられたＩＶ型プロコラーゲナーゼとプロストロメリ
シンとプロコラーゲナーゼＩとのアミノ酸相同性の比較
を示す。 図３ （Ａ）抗ペプチド抗体Ａｌ−１７のエリザ確認。
ＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ末端残基１ないし１
７に相当する合成ペプチドが合成され、そして抗原とし
て使用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体は
このエリザにおいて被覆抗原として使用された。 （Ｂ）抗ペプチド抗体Ａ４７２−４９０のエリザ確認。
ＩＶ型プロコラーゲナーゼの内部残基４７２−４９０に
相当する合成ペプチドが合成され、そして抗原として使
用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体はこの
エリザにおいて被覆抗原として使用された。 （Ｃ）競合エリザアッセイは各々の抗体に対して適当な
ペプチドを用いて行われた。ペプチド−ウシ血清アルブ
ミンは被覆抗原として使用され、そして遊離ペプチドは
競合抗原として使用された。 （Ｄ）粗製およびゼラチンアフイニティ精製ＩＶ型プロ
コラーゲナーゼのウエスタンブロット。Ａｌ−１７とイ
ムノブロットされた粗製ＩＶ型プロコラーゲナーゼ（Ａ
２０５８黒色腫細胞調整培地２０μｌ，列Ａ）、Ａ４７
２−４９０とイムノブロットされた精製ＩＶ型コラーゲ
ナーゼ（３０ｎｇ，列Ｃ）が示されている。 図４はＩＶ型コラーゲナーゼの基質ＩＶ型コラーゲンに
結合する該コラーゲナーゼに対するアッセイを示す。精
製ＩＶ型コラーゲナーゼは、微量滴定ウエルに被覆され
たペプシン消化ＩＶ型コラーゲンへの標識されたＩＶ型
コラーゲナーゼの結合を競合させるために用いられた
（平均値±Ｓ．Ｄ．）。結合の飽和は増加する量の基質
を用いる下側の曲線に示されている。図５は示された合
成ペプチドによるＩＶ型コラーゲナーゼ阻害のゼラチン
チモグラムを示す。ゼラチナーゼ活性は約７０ｋＤａの
位置に白色の明瞭なバンドとして可視化されている。こ
の白色の明瞭なバンドは阻害剤の存在下で消失してい
る。３重の試験が示されている。図６は示されたペプチ
ドによるＩＶ型コラーゲンヘの標識ＩＶ型コラーゲナー
ゼの結合の阻害の例を示す。ヒスチジン含有ペプチドは
図２およぴ５に示されたＩＶ型コラーゲナーゼのヒスチ
ジン含有ドメインに相同なフイブロネクチン中の領域か
ら誘導される。ヒスチジン残基は結合性競合に必要とさ
れる。図７はゼラチンチモグラムおよびウエスタンブロ
ッティングにより続けられたＩＶ型プロコラーゲナーゼ
のｐＡＰＭＡ活性化に対する時間経過を示す。Ａ２０５
８黒色腫細胞調整培地の一部２０μｌは示された時間
（分）１．０ｍＭ ｐＡＰＭＡの存在下で活性化され
た。反応はＥＤＴＡを１０ｍＭまで添加して停止され、
そして試料はゼラチンを含むか、または含まない９％ア
クリルアミドゲル上で電気泳動された。ゼラチンを含む
ゲルは電気泳動後チモグラムとして現像された。ゼラチ
ンを含まないゲルは電気泳動でニトロセルロースに移さ
れ、そして次に示されたアフィニティー（親和性）精製
抗体（１μｇ／ｍｌ）で免疫染色された。アミノ末端抗
原ドメインの損失は７０ｋＤａ体から６２ｋＤａ体への
ｐＡＰＭＡ誘導変換の間に起こる。ＭＷＭ，前染色され
た分子量マーカー。図８はＩＶ型コラーゲン減成アッセ
イにより続けられた精製ＩＶ型コラーゲナーゼのｐＡＰ
ＭＡ活性化の時間経過を示す。精製ＩＶ型コラーゲナー
ゼ（２３μｇ／ｍｌ）の一部１０μｌはｐＡＰＭＡ中に
１ｍＭとされ、そして示された時間３７℃で予備保温さ
れた。試料を次に５０ｍＭトリスＨＣｌ、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７．６の添加により
最終容量６０μｌまで希釈し、3 Ｈ−ＩＶ型コラーゲン
（ニュー・イングランド・ヌクレアー）を添加し、そし
て反応混合物を３７℃で３０分間保温した。試料は次に
３重にアッセイされた。最大活性は３７℃での２．８μ
ｇ減成ＩＶ型コラーゲン／ｈ／精製酵素μｇに相当す
る。図９は精製酵素の直接アミノ酸配列決定法により決
定されるＩＶ型プロコラーゲナーゼの潜在および活性体
のアミノ酸配列を示す。ｐＡＰＭＡ活性化の際の自触作
用の切断部位も示してある。書込みは精製潜在酵素（２
０ｎｇ，列Ａ）および活性酵素（２０ｎｇ，列Ｂ）の銀
染色ＮａＤｏｄＳＯ4 −ＰＡＧＥゲルでの明らかな分子
量を示す。図１０はＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ
末端（残基１−１１０）（上段）、間質プロコラーゲナ
ーゼのアミノ末端（中段）およびプロストロメリシンの
アミノ末端（下段）を示す。切断部位からわずかに上流
の相同領域はボックスＡで示されており、ｐＡＰＭＡ活
性化に続く切断部位はボックスＢで示されており、そし
てシステイン残基には下線を付してある。間質コラーゲ
ナーゼおよびストロメリシンのｐＡＰＭＡ活性化に続く
切断のその他の報告された部位は星印により示されてい
る。図１１はペプシン消化ＩＶ型コラーゲンの精製活性
化ＩＶ型コラーゲナーゼによる切断の示された合成ペプ
チドによる投与量依存阻害を示す。ペプチドＴＭＲＫＰ
ＲＣＧＮＰＤＶＡＮは０．１ｍＭの濃度で酵素活性の８
０％を阻害する。より高い濃度は全ての酵素活性を消失
させる。図１２は酵素阻害活性が試験されたペプチドの
比較を示す。ペプチドは図１０に示されたアミノ末端配
列から誘導された。コア配列ＰＲＣＧは、この配列のな
いベプチドが顕著な阻害活性を欠くという事実に基づい
て阻害活性に必要である。最少の配列必要条件のさらな
る精選は表２に列挙したペプチドを用いて行われた。図
１３は、活性化に際してヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼ
から切断されるアミノ末端ペプチドの８０個のアミノ酸
配列をコード化するヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼのた
めのヒトｃＤＮＡクローンの部分のヌクレオチド配列を
示す。
ゲナーゼの全アミノ酸配列を示す。図２はドメインにま
とめられたＩＶ型プロコラーゲナーゼとプロストロメリ
シンとプロコラーゲナーゼＩとのアミノ酸相同性の比較
を示す。 図３ （Ａ）抗ペプチド抗体Ａｌ−１７のエリザ確認。
ＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ末端残基１ないし１
７に相当する合成ペプチドが合成され、そして抗原とし
て使用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体は
このエリザにおいて被覆抗原として使用された。 （Ｂ）抗ペプチド抗体Ａ４７２−４９０のエリザ確認。
ＩＶ型プロコラーゲナーゼの内部残基４７２−４９０に
相当する合成ペプチドが合成され、そして抗原として使
用された。ペプチド−ウシ血清アルブミン複合体はこの
エリザにおいて被覆抗原として使用された。 （Ｃ）競合エリザアッセイは各々の抗体に対して適当な
ペプチドを用いて行われた。ペプチド−ウシ血清アルブ
ミンは被覆抗原として使用され、そして遊離ペプチドは
競合抗原として使用された。 （Ｄ）粗製およびゼラチンアフイニティ精製ＩＶ型プロ
コラーゲナーゼのウエスタンブロット。Ａｌ−１７とイ
ムノブロットされた粗製ＩＶ型プロコラーゲナーゼ（Ａ
２０５８黒色腫細胞調整培地２０μｌ，列Ａ）、Ａ４７
２−４９０とイムノブロットされた精製ＩＶ型コラーゲ
ナーゼ（３０ｎｇ，列Ｃ）が示されている。 図４はＩＶ型コラーゲナーゼの基質ＩＶ型コラーゲンに
結合する該コラーゲナーゼに対するアッセイを示す。精
製ＩＶ型コラーゲナーゼは、微量滴定ウエルに被覆され
たペプシン消化ＩＶ型コラーゲンへの標識されたＩＶ型
コラーゲナーゼの結合を競合させるために用いられた
（平均値±Ｓ．Ｄ．）。結合の飽和は増加する量の基質
を用いる下側の曲線に示されている。図５は示された合
成ペプチドによるＩＶ型コラーゲナーゼ阻害のゼラチン
チモグラムを示す。ゼラチナーゼ活性は約７０ｋＤａの
位置に白色の明瞭なバンドとして可視化されている。こ
の白色の明瞭なバンドは阻害剤の存在下で消失してい
る。３重の試験が示されている。図６は示されたペプチ
ドによるＩＶ型コラーゲンヘの標識ＩＶ型コラーゲナー
ゼの結合の阻害の例を示す。ヒスチジン含有ペプチドは
図２およぴ５に示されたＩＶ型コラーゲナーゼのヒスチ
ジン含有ドメインに相同なフイブロネクチン中の領域か
ら誘導される。ヒスチジン残基は結合性競合に必要とさ
れる。図７はゼラチンチモグラムおよびウエスタンブロ
ッティングにより続けられたＩＶ型プロコラーゲナーゼ
のｐＡＰＭＡ活性化に対する時間経過を示す。Ａ２０５
８黒色腫細胞調整培地の一部２０μｌは示された時間
（分）１．０ｍＭ ｐＡＰＭＡの存在下で活性化され
た。反応はＥＤＴＡを１０ｍＭまで添加して停止され、
そして試料はゼラチンを含むか、または含まない９％ア
クリルアミドゲル上で電気泳動された。ゼラチンを含む
ゲルは電気泳動後チモグラムとして現像された。ゼラチ
ンを含まないゲルは電気泳動でニトロセルロースに移さ
れ、そして次に示されたアフィニティー（親和性）精製
抗体（１μｇ／ｍｌ）で免疫染色された。アミノ末端抗
原ドメインの損失は７０ｋＤａ体から６２ｋＤａ体への
ｐＡＰＭＡ誘導変換の間に起こる。ＭＷＭ，前染色され
た分子量マーカー。図８はＩＶ型コラーゲン減成アッセ
イにより続けられた精製ＩＶ型コラーゲナーゼのｐＡＰ
ＭＡ活性化の時間経過を示す。精製ＩＶ型コラーゲナー
ゼ（２３μｇ／ｍｌ）の一部１０μｌはｐＡＰＭＡ中に
１ｍＭとされ、そして示された時間３７℃で予備保温さ
れた。試料を次に５０ｍＭトリスＨＣｌ、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、ｐＨ７．６の添加により
最終容量６０μｌまで希釈し、3 Ｈ−ＩＶ型コラーゲン
（ニュー・イングランド・ヌクレアー）を添加し、そし
て反応混合物を３７℃で３０分間保温した。試料は次に
３重にアッセイされた。最大活性は３７℃での２．８μ
ｇ減成ＩＶ型コラーゲン／ｈ／精製酵素μｇに相当す
る。図９は精製酵素の直接アミノ酸配列決定法により決
定されるＩＶ型プロコラーゲナーゼの潜在および活性体
のアミノ酸配列を示す。ｐＡＰＭＡ活性化の際の自触作
用の切断部位も示してある。書込みは精製潜在酵素（２
０ｎｇ，列Ａ）および活性酵素（２０ｎｇ，列Ｂ）の銀
染色ＮａＤｏｄＳＯ4 −ＰＡＧＥゲルでの明らかな分子
量を示す。図１０はＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ
末端（残基１−１１０）（上段）、間質プロコラーゲナ
ーゼのアミノ末端（中段）およびプロストロメリシンの
アミノ末端（下段）を示す。切断部位からわずかに上流
の相同領域はボックスＡで示されており、ｐＡＰＭＡ活
性化に続く切断部位はボックスＢで示されており、そし
てシステイン残基には下線を付してある。間質コラーゲ
ナーゼおよびストロメリシンのｐＡＰＭＡ活性化に続く
切断のその他の報告された部位は星印により示されてい
る。図１１はペプシン消化ＩＶ型コラーゲンの精製活性
化ＩＶ型コラーゲナーゼによる切断の示された合成ペプ
チドによる投与量依存阻害を示す。ペプチドＴＭＲＫＰ
ＲＣＧＮＰＤＶＡＮは０．１ｍＭの濃度で酵素活性の８
０％を阻害する。より高い濃度は全ての酵素活性を消失
させる。図１２は酵素阻害活性が試験されたペプチドの
比較を示す。ペプチドは図１０に示されたアミノ末端配
列から誘導された。コア配列ＰＲＣＧは、この配列のな
いベプチドが顕著な阻害活性を欠くという事実に基づい
て阻害活性に必要である。最少の配列必要条件のさらな
る精選は表２に列挙したペプチドを用いて行われた。図
１３は、活性化に際してヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼ
から切断されるアミノ末端ペプチドの８０個のアミノ酸
配列をコード化するヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼのた
めのヒトｃＤＮＡクローンの部分のヌクレオチド配列を
示す。
【０００９】発明の詳細な説明 マトリックスメタロプロテイナーゼを阻害する能力を有
するペプチド配列を提供することが本発明の目的であ
る。マトリックスメタロプロテイナーゼの存在の同定に
使用するための抗体を提供することが本発明の別の目的
である。活性化マトリックスメタロプロテイナーゼによ
り引き起こされる組織破壊から生じる組織損傷に罹患し
た患者を治療する方法を提供することが本発明の別の目
的である。
するペプチド配列を提供することが本発明の目的であ
る。マトリックスメタロプロテイナーゼの存在の同定に
使用するための抗体を提供することが本発明の別の目的
である。活性化マトリックスメタロプロテイナーゼによ
り引き起こされる組織破壊から生じる組織損傷に罹患し
た患者を治療する方法を提供することが本発明の別の目
的である。
【００１０】ヒトＩＶ型コラーゲナーゼの全アミノ酸配
列は図１に示されている。この配列はこのタンパク質が
図２に示される一連のドメインに分割され得ることを示
す。約１ｋｂの断片によりコード化されるシステインリ
ッチ（１２システイン残基）ドメインはその他の配列決
定されたメタロプロテイナーゼ例えばＩ型コラーゲナー
ゼおよびストロメリシンと願著な相同性がない。しかし
なから、このシステインリッチ領域はフィブロネクチン
と顕著な相同性を示す。システインリッチ配列がメタロ
プロテイナーゼ活性においてその機能的役割を直接試験
されたことはこれまで決してなかった。システインに富
む領域（残基２００−３７０）から誘導されたペプチド
は酵素基質結合を阻害し、そして本発明の実施態様と見
なされる。ＩＶ型コラーゲナーゼの他の３つのドメイン
はその他のマトリックスメタロプロテイナーゼと顕著な
相同牲を示す（図２）。特に、「ＭＢＤ」と表記され、
そして図２に示されている残基３７１ないし３８６の領
域はサーモリシンを含む３種全てのマトリックスメタロ
プロテイナーゼ中に密接な相同配列を有する。実際の結
晶化されたサーモリシンにおいて、この領域は酵素の推
定上のＺｎ結合ドメインに関連する。しかしながら、Ｍ
ＢＤ配列はメタロプロテイナーゼ活性においてその機能
的役割を直接試験されたことはこれまで決してなかっ
た。本発明において、（ａ）これらの領域から誘導され
た合成ペプチドおよび（ｂ）これらの領域に対して指示
されたアフイニティー精製抗体はゼラチナ−ゼおよびＩ
Ｖ型コラーゲナーゼ活性をブロックする阻害剤を構成す
る。さらに、概説したＩＶ型コラーゲナーゼドメインに
相同なフィブロネクチンから誘導されたペプチドはま
た、その基質へのＩＶ型コラーゲナーゼの結合を阻害す
る。
列は図１に示されている。この配列はこのタンパク質が
図２に示される一連のドメインに分割され得ることを示
す。約１ｋｂの断片によりコード化されるシステインリ
ッチ（１２システイン残基）ドメインはその他の配列決
定されたメタロプロテイナーゼ例えばＩ型コラーゲナー
ゼおよびストロメリシンと願著な相同性がない。しかし
なから、このシステインリッチ領域はフィブロネクチン
と顕著な相同性を示す。システインリッチ配列がメタロ
プロテイナーゼ活性においてその機能的役割を直接試験
されたことはこれまで決してなかった。システインに富
む領域（残基２００−３７０）から誘導されたペプチド
は酵素基質結合を阻害し、そして本発明の実施態様と見
なされる。ＩＶ型コラーゲナーゼの他の３つのドメイン
はその他のマトリックスメタロプロテイナーゼと顕著な
相同牲を示す（図２）。特に、「ＭＢＤ」と表記され、
そして図２に示されている残基３７１ないし３８６の領
域はサーモリシンを含む３種全てのマトリックスメタロ
プロテイナーゼ中に密接な相同配列を有する。実際の結
晶化されたサーモリシンにおいて、この領域は酵素の推
定上のＺｎ結合ドメインに関連する。しかしながら、Ｍ
ＢＤ配列はメタロプロテイナーゼ活性においてその機能
的役割を直接試験されたことはこれまで決してなかっ
た。本発明において、（ａ）これらの領域から誘導され
た合成ペプチドおよび（ｂ）これらの領域に対して指示
されたアフイニティー精製抗体はゼラチナ−ゼおよびＩ
Ｖ型コラーゲナーゼ活性をブロックする阻害剤を構成す
る。さらに、概説したＩＶ型コラーゲナーゼドメインに
相同なフィブロネクチンから誘導されたペプチドはま
た、その基質へのＩＶ型コラーゲナーゼの結合を阻害す
る。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のマトリックスメタロプロ
テイナーゼ阻害剤は不適当な血管形成、関節炎、腫瘍増
殖、侵入および転移、および肉芽腫性炎症状態例えばサ
ルコイドーシスの治療に使用され得る。これらの状態に
おいて、産生された酵素の量および図１１に示されるよ
うな活性酵素を９０％以上阻害するのに必要なペプチド
阻害剤の量を見積もることは可能である。阻害性ペプチ
ドの治療的投与量は１０−２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄの許容
できる薬学的範囲であり、より好ましくは２５−１００
ｍｇ／ｋｇ／ｄの範囲である。投薬される患者の投与量
は該患者において産生される酵素の量、該患者の状態お
よび体格に依存するであろう。阻害剤は注射として、ま
たは血流中に速やかに移行するあらゆる手段により投与
され得る。凍結乾燥粉末は「飲み込まれ」てもよい。経
頬または舌下投与のための調剤も与えられ得る。呼吸器
に欠陥を有する患者のために、ペプチドは吸入により投
与され得る。エアロゾルがこの目的のために特に有用で
ある。目の異常に対して、ペプチドは点眼薬として投与
されてもよい。
テイナーゼ阻害剤は不適当な血管形成、関節炎、腫瘍増
殖、侵入および転移、および肉芽腫性炎症状態例えばサ
ルコイドーシスの治療に使用され得る。これらの状態に
おいて、産生された酵素の量および図１１に示されるよ
うな活性酵素を９０％以上阻害するのに必要なペプチド
阻害剤の量を見積もることは可能である。阻害性ペプチ
ドの治療的投与量は１０−２５０ｍｇ／ｋｇ／ｄの許容
できる薬学的範囲であり、より好ましくは２５−１００
ｍｇ／ｋｇ／ｄの範囲である。投薬される患者の投与量
は該患者において産生される酵素の量、該患者の状態お
よび体格に依存するであろう。阻害剤は注射として、ま
たは血流中に速やかに移行するあらゆる手段により投与
され得る。凍結乾燥粉末は「飲み込まれ」てもよい。経
頬または舌下投与のための調剤も与えられ得る。呼吸器
に欠陥を有する患者のために、ペプチドは吸入により投
与され得る。エアロゾルがこの目的のために特に有用で
ある。目の異常に対して、ペプチドは点眼薬として投与
されてもよい。
【００１２】
【実施例】実施例１ ヒスチジン含有ペプチド阻害剤 ＩＶ型コラーゲナーゼの残基３７１−３８６（ＭＢＤ領
域）に相当する合成ペプチドは、ゼラチナーゼおよびコ
ラーゲナーゼＩＶ型活性を消失させる。これはゼラチン
酵素電気泳動像（チモグラム）を使用した図５に示され
ている。さらに、これらのドメインを認識するアフィニ
ティ精製抗体もまたゼラチナーゼおよびコラーゲナーゼ
ＩＶ型活性を阻害する。これらのペプチドの作用メカニ
ズムは、少なくとも一部分、ＩＶ型コラーゲンヘのＩＶ
型コラーゲナーゼの結合を完成させるそれらの能力に帰
している（図６）。メタロプロテイナーゼペプチド阻害
剤は、ＩＶ型コラーゲナーゼの残基３７１−３８６での
ヒスチジン含有ドメインと実質的な相同関係を持つタン
パク質ペプチドを有している。該クンパク質ペプチドは
メタロプロテイナーゼのゼラチン分解およびコラーゲン
分解活性を阻害する。メタロプロテイナーゼ阻害剤のク
ンパク質ペプチドは好ましくは活性のための少なくとも
ヒスチジン残基を含有する。メタロプロテイナーゼ阻害
剤のタンパク質ペプチドの一つの望ましい具体例は、ヒ
スチジン含有配列を持ち、該配列は、ＶＡＡＨＥＦＧＨ
ＡＭＧＬＥＨＳＱ，ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥＨＳ
Ｑ，ＶＡＡＨＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ，ＶＡＡＨＥＬ
ＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ，ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬＧＬＦＨ
ＳＡ，ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよびフィブ
ロネクチンペプチドＡＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭより
なる群から選択されたメンバーである。後者のペプチド
が有効でヒスチジン残基を必要としたので、コア配列Ａ
ＨＥは本発明の一主要具体例の最小抗原決定基であるこ
とが決定された。保存残基領域中のアミノ酸を置換する
ことにより、図５および図６に示すように、ペプチドの
阻害活性のためにヒスチジン残基が幾分必要であること
が判明した。全３個のヒスチジンがアラニンで置換され
た場合、ペプチドは完全に不活性となった。しかしなが
ら、中央のヒスチジンのみがアラニンで置換された場
合、阻害活性は残された。さらに、２個のグルタミン酸
（Ｅ）残基をグルタミン（Ｑ）で置換することは、ペプ
チドの阻害活性を改変した。これらの阻害性ペプチド
は、ＩＶ型コラーゲン基質またはゼラチン基質における
解裂部位と相同関係を持たない。それらの作用メカニズ
ムには、金属イオンと相互作用できるプロテイナーゼの
領域内の酵素−基質相互作用の干渉が含まれ、そのよう
な相互作用は基質解裂にとって必要である。その活性ペ
プチドはＩＶ型コラーゲナーゼ活性を消失させるペプチ
ド濃度下で、サーモリシンのゼラチン分解活性を部分的
に阻害した。活性ペプチドは、プラスミンおよびトリプ
シンを含めて試験された多様なセリンおよびチオールプ
ロテアーゼ類または「非メタロプロテイナーゼ類」を阻
害しなかった。表１は、発明者らによる機能的研究に基
づいて、また他のメタロプロテイナーゼとの相同性比較
に基づいて図１中の配列から選択された、マトリックス
メタロプロテイナーゼの阻害剤の候補として試験された
アミノ酸置換を含む合成ヒスチジン含有ペプチドのリス
トである。
域）に相当する合成ペプチドは、ゼラチナーゼおよびコ
ラーゲナーゼＩＶ型活性を消失させる。これはゼラチン
酵素電気泳動像（チモグラム）を使用した図５に示され
ている。さらに、これらのドメインを認識するアフィニ
ティ精製抗体もまたゼラチナーゼおよびコラーゲナーゼ
ＩＶ型活性を阻害する。これらのペプチドの作用メカニ
ズムは、少なくとも一部分、ＩＶ型コラーゲンヘのＩＶ
型コラーゲナーゼの結合を完成させるそれらの能力に帰
している（図６）。メタロプロテイナーゼペプチド阻害
剤は、ＩＶ型コラーゲナーゼの残基３７１−３８６での
ヒスチジン含有ドメインと実質的な相同関係を持つタン
パク質ペプチドを有している。該クンパク質ペプチドは
メタロプロテイナーゼのゼラチン分解およびコラーゲン
分解活性を阻害する。メタロプロテイナーゼ阻害剤のク
ンパク質ペプチドは好ましくは活性のための少なくとも
ヒスチジン残基を含有する。メタロプロテイナーゼ阻害
剤のタンパク質ペプチドの一つの望ましい具体例は、ヒ
スチジン含有配列を持ち、該配列は、ＶＡＡＨＥＦＧＨ
ＡＭＧＬＥＨＳＱ，ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥＨＳ
Ｑ，ＶＡＡＨＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ，ＶＡＡＨＥＬ
ＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ，ＶＡＡＨＥＩＧＨＳＬＧＬＦＨ
ＳＡ，ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴＡＧおよびフィブ
ロネクチンペプチドＡＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭより
なる群から選択されたメンバーである。後者のペプチド
が有効でヒスチジン残基を必要としたので、コア配列Ａ
ＨＥは本発明の一主要具体例の最小抗原決定基であるこ
とが決定された。保存残基領域中のアミノ酸を置換する
ことにより、図５および図６に示すように、ペプチドの
阻害活性のためにヒスチジン残基が幾分必要であること
が判明した。全３個のヒスチジンがアラニンで置換され
た場合、ペプチドは完全に不活性となった。しかしなが
ら、中央のヒスチジンのみがアラニンで置換された場
合、阻害活性は残された。さらに、２個のグルタミン酸
（Ｅ）残基をグルタミン（Ｑ）で置換することは、ペプ
チドの阻害活性を改変した。これらの阻害性ペプチド
は、ＩＶ型コラーゲン基質またはゼラチン基質における
解裂部位と相同関係を持たない。それらの作用メカニズ
ムには、金属イオンと相互作用できるプロテイナーゼの
領域内の酵素−基質相互作用の干渉が含まれ、そのよう
な相互作用は基質解裂にとって必要である。その活性ペ
プチドはＩＶ型コラーゲナーゼ活性を消失させるペプチ
ド濃度下で、サーモリシンのゼラチン分解活性を部分的
に阻害した。活性ペプチドは、プラスミンおよびトリプ
シンを含めて試験された多様なセリンおよびチオールプ
ロテアーゼ類または「非メタロプロテイナーゼ類」を阻
害しなかった。表１は、発明者らによる機能的研究に基
づいて、また他のメタロプロテイナーゼとの相同性比較
に基づいて図１中の配列から選択された、マトリックス
メタロプロテイナーゼの阻害剤の候補として試験された
アミノ酸置換を含む合成ヒスチジン含有ペプチドのリス
トである。
【００１３】
【００１４】方法 ゼラチン酵素電気泳動像 ストック溶液および下記混合操作を用いて、ゼラチナー
ゼ活性の目視のためのゼラチン酵素電気泳動像が作成さ
れた。
ゼ活性の目視のためのゼラチン酵素電気泳動像が作成さ
れた。
【００１５】ストック溶液 混合操作 ａ）２ＭトリスＨＣｌ ｄＨ2 Ｏ８００ｍｌ中にトリス塩基２４２ｇを入れ ｐＨ８．８ 濃塩酸でｐＨ８．８に調整し、１ｌに稀釈する。 ｂ）０．５Ｍトリス ｄＨ2 Ｏ８０ｍｌ中にトリス塩基６．０５ｇを入れ ｐＨ６．８ 濃塩酸でｐＨ６．８に調整し、１００ｍｌに稀釈す る。 ｃ）３０％アクリルアミド アクリルアミド１００ｇにビスアクリルアアミド ＋０．８％ビスアクリ ２．４ｇを加え、水を充分に加えてアクリルアミド ルアミド を溶解する。３３３ｍｌに稀釈し、アルミホイル被 覆ボトル中４℃で貯蔵する。 ｄ）１０％ＳＤＳ ＳＤＳ１００ｇをｄＨ2 Ｏに溶解し、最終容量１ｌ に稀釈する。 ｅ）１０％過硫酸アンモニ 過硫酸アンモニウム１ｇにｄＨ2 Ｏを加えて最終容 ウム 量１０ｍｌにする。４℃で貯蔵。 ｆ）１０×電極緩衝液 ｄＨ2 Ｏ６００ｍｌにグリシン１４４ｇを溶解し、 ２ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．８，１２５ｍｌおよび １０％ＳＤＳ１００ｍｌを加える。最終容量１ｌに 稀釈する。 ｇ）５×試料緩衝液 ０．５ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ６．８，２．５ｍｌに ブロモフェノールブルー５０ｍｇを溶解し、１０％ ＳＤＳ４ｍｌ，グリセロール２．５ｍｌを加え，４ ℃で貯蔵する。 ｈ）ＴＥＭＥＤ ｉ）１％ゼラチン 蛇口から熱水流下で懸濁液を温めることによりｄＨ 2 Ｏ１００ｍｌにゼラチン１ｇを溶解する。 ｊ）ゲル染色溶液 ３０％メタノール，１０％酢酸，０．１％アミドブ ラック１０ ｋ）脱染色溶液 ３０％メタノール，１０％酢酸
【００１６】操作 この実施例のために使用するゼラチンのチモグラム調製
の操作は下記の段階と試薬を利用した。 １）ゲルを形成する装置を集める。 ２）重合のためにゲル溶液を解膠して準備する： 最終容量４０ｍｌの９％アクリルアミド：５０ｍｌのフ
ァルコン管に、 ３０％アクリルアミド，０．８％ビスアクリルアミド
１２ｍｌ １０％ＳＤＳ ０．４ｍｌ ２ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．８ ７．５ｍｌ １％ゼラチン ４ｍｌ ｄＨ2 Ｏ １６ｍｌを入れる。 ３）混合後、１０％過硫酸アンモニウム０．４ｍｌを添
加し、再び混合する。 ４）ＴＥＭＥＤ４０μｌで重合を開始し、混合し、そし
てゲル溶液３２ｍｌをゲル型中に注ぐ。 ５）ブタノールで飽和した水で溶液上を覆い、３０〜４
５分間重合させる。 ６）重合の後、ゲル表面をｄＨ2 Ｏで洗浄し、乾燥させ
る。 ７）重合のための積層ゲル溶液を準備する：最終容量１
０ｍｌの３％アクリルアミド：１５ｍｌのファルコン管
に、 ０．５ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ６．８ ２．５ｍｌ １０％ＳＤＳ ０．１ｍｌ ３０％アクリルアミド，０．８％ビスアクリルアミド
１．０ｍｌ １０％過硫酸アンモニウム ０．１ｍｌ ｄＨ2 Ｏ ５．３ｍｌを添加する。 ８）積層ゲルの重合をＴＥＭＥＤ４０μｌで開始し、そ
して混合する。 ９）約６ｍｌをゲル型中にの重合した流動性ゲルの上に
注ぎ、ウエルコームを挿入する。 １０）コーム歯の底部から空気泡を除き、必要ならば追
加のゲル液を添加する。 １１）積層ゲルを１５〜２０分間重合させる。 １２）重合の後、積層ゲルからコームを取り除き、１×
電極緩衝液を両方の電極室に入れる。 １３）空気をウエルとゲルの底部から取り除く。 １４）試料を添加し、３０ミリアンペア／ゲルで電気泳
動する。 １５）電気泳動の終了後、ゲルを室温でゆっくり揺動し
ながら、２．５％トリトンＸ−１００を２回交換して６
０分間にわたり洗浄する。 １６）トリトンＸ−１００の溶液を捨て、ゲルを１×コ
ラーゲン緩衝液中に置き、３７℃で２〜４時間または室
温で一晩保温する。 １７）保温期間後、０．１％のアミドブラック中で３０
分間染色し、次に約９０分間脱色する。 １８）清浄になっている範囲は、ゼラチン分解活性に該
当する。種々の濃度の分離ゲルの調製を下に記載する。 最終容量４０ｍｌ ６％ ８％ ９％ １０％ 30％アクリルアミド， ８ｍｌ １０．６ｍｌ １２ｍｌ １３．３ｍｌ 0.8 ％ビスアクリルアミド ｄＨ2 Ｏ ２０ｍｌ １７．４ｍｌ １６ｍｌ １４．７ｍｌ
の操作は下記の段階と試薬を利用した。 １）ゲルを形成する装置を集める。 ２）重合のためにゲル溶液を解膠して準備する： 最終容量４０ｍｌの９％アクリルアミド：５０ｍｌのフ
ァルコン管に、 ３０％アクリルアミド，０．８％ビスアクリルアミド
１２ｍｌ １０％ＳＤＳ ０．４ｍｌ ２ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ８．８ ７．５ｍｌ １％ゼラチン ４ｍｌ ｄＨ2 Ｏ １６ｍｌを入れる。 ３）混合後、１０％過硫酸アンモニウム０．４ｍｌを添
加し、再び混合する。 ４）ＴＥＭＥＤ４０μｌで重合を開始し、混合し、そし
てゲル溶液３２ｍｌをゲル型中に注ぐ。 ５）ブタノールで飽和した水で溶液上を覆い、３０〜４
５分間重合させる。 ６）重合の後、ゲル表面をｄＨ2 Ｏで洗浄し、乾燥させ
る。 ７）重合のための積層ゲル溶液を準備する：最終容量１
０ｍｌの３％アクリルアミド：１５ｍｌのファルコン管
に、 ０．５ＭトリスＨＣｌ，ｐＨ６．８ ２．５ｍｌ １０％ＳＤＳ ０．１ｍｌ ３０％アクリルアミド，０．８％ビスアクリルアミド
１．０ｍｌ １０％過硫酸アンモニウム ０．１ｍｌ ｄＨ2 Ｏ ５．３ｍｌを添加する。 ８）積層ゲルの重合をＴＥＭＥＤ４０μｌで開始し、そ
して混合する。 ９）約６ｍｌをゲル型中にの重合した流動性ゲルの上に
注ぎ、ウエルコームを挿入する。 １０）コーム歯の底部から空気泡を除き、必要ならば追
加のゲル液を添加する。 １１）積層ゲルを１５〜２０分間重合させる。 １２）重合の後、積層ゲルからコームを取り除き、１×
電極緩衝液を両方の電極室に入れる。 １３）空気をウエルとゲルの底部から取り除く。 １４）試料を添加し、３０ミリアンペア／ゲルで電気泳
動する。 １５）電気泳動の終了後、ゲルを室温でゆっくり揺動し
ながら、２．５％トリトンＸ−１００を２回交換して６
０分間にわたり洗浄する。 １６）トリトンＸ−１００の溶液を捨て、ゲルを１×コ
ラーゲン緩衝液中に置き、３７℃で２〜４時間または室
温で一晩保温する。 １７）保温期間後、０．１％のアミドブラック中で３０
分間染色し、次に約９０分間脱色する。 １８）清浄になっている範囲は、ゼラチン分解活性に該
当する。種々の濃度の分離ゲルの調製を下に記載する。 最終容量４０ｍｌ ６％ ８％ ９％ １０％ 30％アクリルアミド， ８ｍｌ １０．６ｍｌ １２ｍｌ １３．３ｍｌ 0.8 ％ビスアクリルアミド ｄＨ2 Ｏ ２０ｍｌ １７．４ｍｌ １６ｍｌ １４．７ｍｌ
【００１７】溶解性コラーゲナーゼ検定 この実施例の溶解性コラーゲナーゼの検定のための操作
には下記の調製物を利用した。０．５Ｍトリス，２．０
Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 ，２％Ｂｒｉｊ
３５の最終濃度を得るように１０×コラーゲナーゼ緩衝
液を調製する。１ｌを調製するために、 トリス ６０．５５ｇ ＮａＣｌ １１６．８８ｇ ＣａＣｌ2 ７．３５ｇ Ｂｒｉｊ３５ ２０ｇ を一緒にする。次いで、ｄＨ2 Ｏ８００ｍｌ中に溶解
し、濃塩酸を添加してｐＨを７．６に調整する。最終容
量を１ｌにし、濾過して殺菌する。１０×細菌性コラー
ゲナーゼ（陽性対照）を調製して、最終濃度０．５％
（ｗ／ｖ）を得る。これは、細菌性コラーゲナーゼ（シ
グマ社製♯Ｃ−５１３８）１０ｍｇを１×コラーゲナー
ゼ緩衝液２ｍｌに溶解し、１００ｍｌずつにして−２０
℃で貯蔵することにより得られる。ウシ血清アルブミン
（輸送タンパク質）溶液を調製して、１×コラーゲナー
ゼ緩衝液中で０．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度にする。こ
れは、ウシ血清アルブミン１００ｍｇを１×コラーゲナ
ーゼ緩衝液２０ｍｌに溶解し、１ｍｌずに分けて−２０
℃で貯蔵することにより得られる。トリクロロ酢酸−タ
ンニン酸−プロリン溶液（ＴＣＡＴＡＰ）を調製して、
１０％ＴＣＡ、０．５％タンニン酸、２ｍＭプロリンの
最終濃度にする。これは、１００％トリクロロ酢酸溶液
１０ｍｌ、５％タンニン酸溶液１０ｍｌおよび２００ｍ
Ｍプロリン液１ｍｌを一緒にし、１００ｍｌの最終容量
に稀釈し、４℃で貯蔵し、そしてこの溶液を４週毎に取
り替えることにより得られる。
には下記の調製物を利用した。０．５Ｍトリス，２．０
Ｍ ＮａＣｌ，０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 ，２％Ｂｒｉｊ
３５の最終濃度を得るように１０×コラーゲナーゼ緩衝
液を調製する。１ｌを調製するために、 トリス ６０．５５ｇ ＮａＣｌ １１６．８８ｇ ＣａＣｌ2 ７．３５ｇ Ｂｒｉｊ３５ ２０ｇ を一緒にする。次いで、ｄＨ2 Ｏ８００ｍｌ中に溶解
し、濃塩酸を添加してｐＨを７．６に調整する。最終容
量を１ｌにし、濾過して殺菌する。１０×細菌性コラー
ゲナーゼ（陽性対照）を調製して、最終濃度０．５％
（ｗ／ｖ）を得る。これは、細菌性コラーゲナーゼ（シ
グマ社製♯Ｃ−５１３８）１０ｍｇを１×コラーゲナー
ゼ緩衝液２ｍｌに溶解し、１００ｍｌずつにして−２０
℃で貯蔵することにより得られる。ウシ血清アルブミン
（輸送タンパク質）溶液を調製して、１×コラーゲナー
ゼ緩衝液中で０．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度にする。こ
れは、ウシ血清アルブミン１００ｍｇを１×コラーゲナ
ーゼ緩衝液２０ｍｌに溶解し、１ｍｌずに分けて−２０
℃で貯蔵することにより得られる。トリクロロ酢酸−タ
ンニン酸−プロリン溶液（ＴＣＡＴＡＰ）を調製して、
１０％ＴＣＡ、０．５％タンニン酸、２ｍＭプロリンの
最終濃度にする。これは、１００％トリクロロ酢酸溶液
１０ｍｌ、５％タンニン酸溶液１０ｍｌおよび２００ｍ
Ｍプロリン液１ｍｌを一緒にし、１００ｍｌの最終容量
に稀釈し、４℃で貯蔵し、そしてこの溶液を４週毎に取
り替えることにより得られる。
【００１８】操作 １．酵素試料活性化剤（通常は１ｍＭのｐＡＰＭＡ）と
試験液を１．５ｍｌのエッペンドルフ管に入れる。一緒
にした容量は６０μｌでなければならない。必要ならば
１×コラーゲナーゼ緩衝液を添加する。必要ならば前保
温する。 ２． 3Ｈ−ＩＶ型コラーゲン（ＮＥＮ♯ＮＥＴ−９３１
ロット♯２５１１−０１８）の貯蔵品をコラーゲナーゼ
緩衝液で１：１２０に稀釈することによりＩＶ型コラー
ゲン基質を製造する。５５℃で１０分間加熱し、氷上冷
却する。 ３．稀釈した 3Ｈ−ＩＶ型コラーゲンの溶液５μｌを、
各々の検定管に入れる。攪拌して混合し、２８℃で４時
間保温する。 ４．保温の終了時点で、輸送ＢＳＡの溶液２μｌとＴＣ
ＡＴＡＰの溶液を添加する。攪拌して混合し、少なくと
も１０分間氷上に置く。 ５．速度を６に設定して、マイクロフュージ中１０分間
遠心分離することにより沈殿をペレット状にする。ペレ
ットの位置がわかるように、試験管をマイクロフュージ
に入れるときに方向づけをする。 ６．遠心分離の直後に、上澄み液５５μｌを吸い取り、
シンチレーション瓶中に入れる。シンチレーション混合
液５７ｍｌを添加し、十分に震盪し、そして計数する。
試験液を１．５ｍｌのエッペンドルフ管に入れる。一緒
にした容量は６０μｌでなければならない。必要ならば
１×コラーゲナーゼ緩衝液を添加する。必要ならば前保
温する。 ２． 3Ｈ−ＩＶ型コラーゲン（ＮＥＮ♯ＮＥＴ−９３１
ロット♯２５１１−０１８）の貯蔵品をコラーゲナーゼ
緩衝液で１：１２０に稀釈することによりＩＶ型コラー
ゲン基質を製造する。５５℃で１０分間加熱し、氷上冷
却する。 ３．稀釈した 3Ｈ−ＩＶ型コラーゲンの溶液５μｌを、
各々の検定管に入れる。攪拌して混合し、２８℃で４時
間保温する。 ４．保温の終了時点で、輸送ＢＳＡの溶液２μｌとＴＣ
ＡＴＡＰの溶液を添加する。攪拌して混合し、少なくと
も１０分間氷上に置く。 ５．速度を６に設定して、マイクロフュージ中１０分間
遠心分離することにより沈殿をペレット状にする。ペレ
ットの位置がわかるように、試験管をマイクロフュージ
に入れるときに方向づけをする。 ６．遠心分離の直後に、上澄み液５５μｌを吸い取り、
シンチレーション瓶中に入れる。シンチレーション混合
液５７ｍｌを添加し、十分に震盪し、そして計数する。
【００１９】実施例２ システインを含有するペプチド阻害剤 単一特異性抗体の製造に使用するために、Ａ２０５８メ
ラノーマ細胞ＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ末端配
列（残基１−１７，ＡＰＳＩＩＫＦＰＧＤＶＡＰＫＴ
Ｄ）ならびに内部ドメインの配列（残基４７２−４９
０，ＤＫＰＭＧＰＬＬＶＡＴＦＮＰＥＬＰＥＫ）を合成
した。これらは下記の理由で選択された。酵素の直接配
列決定で得られ（Collier, I.E., Wilhelm, S.M., Eise
n, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., Seltzer, J.L.,
Kronberger, A., He., C., Bauer, E.A.,およびGoldbe
rg, G.I., 1988, J. Biol. Chem. 263, 6579-6587; Hoy
htya,M., Turpeenniemi-Hujanen, T., Stetler-Stevens
on, W., Kurtzsch, H., Tryggvason, K.,およびLiotta,
L.A., 1988, FEBS Letters 233, 109-113 ）、ｃＤＮ
Ａクローンから予測される配列に確認され（Collier,
I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Gr
ant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He., C.,
Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J. Biol.
Chem. 263, 6579-6587 ）、そして他のメタロプロテイ
ナーゼと相同性を示さない領域から誘導されている。ア
フィニティ精製抗体は、直接エリザならびに競合実験を
使用して特徴づけられる。この抗体は、ウシ血清アルブ
ミンまたは無関係のペプチドとの交叉反応性は示さなか
った。アフィニティ精製抗体はＩＶ型プロコラーゲナー
ゼを免疫沈殿する能力がある（Hoyhtya, M., Turpeenni
emi-Hujanen, T., Stetler-Stevenson, W., Kurtzsch,
H., Tryggvason, K., およびLiotta, L.A., 1988, FEBS
Letters 233, 109-113 ）。ウエスタンブロット法は、
精製ＩＶ型コラーゲナーゼとのウエスタンブロッティン
グと同じく、両方の抗体がＩＶ型プロコラーゲナーゼを
Ａ２０５８で調製した媒体において単一のバンドとして
認識したということを示した。ｐＡＰＭＡ活性化の時間
経過を、ゼラチンチモグラム分析、ＩＶ型コラーゲナー
ゼ検定およびイムノブロット上の両方のアフィニティ精
製抗体を使用して追跡した（図７）。Ａ２０５８メラノ
ーマ細胞ＩＶ型コラーゲナーゼのゼラチンチモグラム
（図７）分析は、７０ｋＤダルトンの分子量を持つゼラ
チン分解活性の単一バンドを示した。１ｍＭのｐＡＰＭ
Ａの存在下における３７℃での保温は、ゼラチン分解活
性のこのバンドのより低い分子量の６２ｋＤへの漸進的
な変換をもたらした。この変換は１０ｍＭのＥＤＴＡの
存在下では完全に阻害され、添加するｐＡＰＭＡの不在
下では起きなかった（図示せず）。精製したＩＶ型プロ
コラーゲナーゼのＩＶ型コラーゲナーゼ検定は、保温期
間における有機水銀化合物ｐＡＰＭＡの不在下ではコラ
ーゲン分解の活性を示さなかった。ｐＡＰＭＡを使用す
る保温により、酵素は活性化できた。コラーゲナーゼ検
定により測定されたように、ｐＡＰＭＡを使用する前保
温における活性化の時間経過は、完全なコラーゲン分解
活性が得られることを示している（図８）。抗体Ａ４７
２−４９０は、保温により、ゼラチンチモグラム（図
７）に示されたものに該当する時間依存の分子量減少を
示した。この変換は、６０分迄に５０％完了し、９０分
迄に実質的に完了するように見える。アミノ末端エピト
ープに該当する抗体Ａ１−１７は、ｐＡＰＭＡ活性化の
間の免疫染色における直接の減少を示した。これらの結
果は、有機水銀化合物を使用することによる潜在型から
安定な、活性コラーゲナーゼへの変換に従う明白な分子
量の減少がアミノ末端ペプチド配列の欠失の結果である
ことを示している。ゼラチン−アフィニティ精製ＩＶ型
プロコラーゲナーゼを、ｐＡＰＭＡ活性化の前後両方の
逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。クロマトグラム
は、潜在型または活性型保持時間に顕著な変化のないこ
とを示した。ピークを集め、ＮａＤｏｄＳＯ4 −ＰＡＧ
Ｅにより分析した時に、ｐＡＰＭＡ活性化に先立つプロ
コラーゲナーゼのピークは、非還元条件下では約７０ｋ
Ｄａの単一バンドを示した（図９，挿入）。ｐＡＰＭＡ
活性化（１６時間，３７℃）の後のコラーゲナーゼのピ
ークは、非還元条件下で６２ｋＤａに単一バンドを示し
た（図３Ａ）。ｐＡＰＭＡ活性化の前のＨＰＬＣ上のプ
ロコラーゲナーゼのピークから得られる物質を、直接ア
ミノ酸配列分析に供した。この物質はこの酵素のための
前に決めたものと同一であるアミノ末端配列を与えた
（図９）。ＨＰＬＣ精製後のｐＡＰＭＡ活性化物質の直
接配列分析は、単一の新規アミノ末端配列を示している
（図９）。これは、ｐＡＰＭＡ活性化が約８ｋＤａの分
子量低下と共に起こる潜在的酵素からのアミノ末端ペプ
チド断片の自触媒的脱離を伴うことを決定的に示してい
る。この切断は単一部位においてだけ起こる。なぜなら
ば、精製、活性化した酵素の多くの試料の配列を分析し
ても、他のアミノ末端アミノ酸の証拠が見いだされず、
そしてウエスタンブロッティングまたはゼラチンチモグ
ラム分析によって中間体の痕跡が見いだされないからで
ある。この研究の結果は、ＩＶ型コラーゲナーゼがコラ
ーゲン分解活性を得る前に活性化を必要とする潜在的酵
素前駆体の型で分泌されることを示している。有機水銀
化合物ｐＡＰＭＡにはこの活性化の能力がある。ＩＶ型
プロコラーゲナーゼの有機水銀活性化は、酵素前駆体型
のアミノ末端から８０個のアミノ酸残基ペプチド断片の
除去による、より低い分子量の活性化型への変換を伴
う。ｐＡＰＭＡに晒した後、最大のコラーゲン分解活性
が速やかに得られる。安定なより低分子量型への完全な
変換に先立つこの活性への到達は、活性であるが不安定
種である酵素前駆体における構造転位と一致しており、
これは間質コラーゲナーゼとストロメリシンで報告され
ているとおりである（Stricklin, G.P., Jeffrey, J.
J., Rosewit, W.T.,およびEisen, A.Z., 1983, Biochem
istry 22, 61-68; Murphy, G.,Cockett, M.I., Stephen
s, P.E., Smith, B.J., およびDocherty, A.J.P., 198
7, Biochem. J. 248, 265-268）。活性化は高度に精製
したＩＶ型コラーゲナーゼ酵素前駆体に起こる。かくし
て、有機水銀化合物の存在下における活性化は、ｐＡＰ
ＭＡそのものがペプチド結合を切断する能力に欠けるの
で自己分解的である有機水銀化合物による活性化のこの
自己触媒的機構は、間質コラーゲナーゼ（Grant, G.A.,
Eisen, A.Z., Marmer, B.L. Rosweit, W.T., およびGo
ldberg, G.I., 1987, J. Biol. Chem. 262, 5886-5889;
Whitman, S.E., Murphy, G., Angel, P., Rahmsforf,
H.-J., Smith, B.J., Lyons, A., Harris, T.J.T., Rey
nolds, J.J., Herrlich, P. およびDocherty, A.J.P.,
1986, Biochem. J. 240, 913-916）、およびストロメリ
シン（Wilhlem, S.M., Collier, I.E., Kronberger,A.,
Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., Bauer, E.
A.,およびGoldberg,G.I., 1987, Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 84, 6725-6729; Whitman, S.E.,Murphy, G.,
Angel, P., Rahmsforf, H.-J., Smith, B.J., Lyons,
A., Harris,T.J.T., Reynolds, J.J., Herrlich, P. お
よびDocherty, A.J.P., 1986, Biochem. J. 240, 913-9
16; Murphy, G., Cockett, M.I., Stephens, P.E., Sm
ith,B.J.,およびDocherty, A.J.P., 1987, Biochem. J.
248, 265-268; Sanchez-Lopez, R., Nicholson, R., G
ensel, M.C., Matrisian, L.,およびBreatnach, R.,198
8, J. Biol. Chem. 263, 11892-11899）のような他の細
胞外マトリックスを分解するメタロプロテイナーゼで示
されている。これら３種のメタロプロテイナーゼ、ＩＶ
型コラーゲナーゼ、間質プロコラーゲナーゼおよびプロ
ストロメリシンはアミノ酸レベルで顕著な相同性を示す
（Grant, G.A., Eisen, A.Z., Marmer, B.L. Rosweit,
W.T., およびGoldberg, G.I., 1987, J. Biol. Chem. 2
62, 5886-5889; Collier, I.E., Wilhelm, S.M., Eise
n, A.Z., Marmer, B.L., Grant,G.A., Seltzer, J.L.,
Kronberger, A., He., C., Bauer, E., およびGoldber
g, G.I., 1988, J. Biol. Chem. 263, 6579-6587; Wilh
lem, S.M., Collier, I.E., Kronberger, A., Eisen,
A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., Bauer, E., および
Goldberg, G.I., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 84, 6725-6729; Saua, J., Quinones, S., Otani,
Y., Nagase, H., Harris, E.D., Jr.,およびKurkinen,
M., 1988, J. Biol. Chem. 263, 6742-6745; Whitman,
S.E., Murphy,G., Angel, P., Rahmsforf, H.-J., Smit
h, B.J., Lyons, A., Harris, T.J.T.,Reynolds, J.J.,
Herrlich, P. およびDocherty, A.J.P., 1986, Bioche
m. J.240, 913-916; Sanchez-Lopez, R., Nicholson,
R., Gensel, M.C., Matrisian,L.,およびBreatnach,
R., 1988, J. Biol. Chem. 263, 11892-11899）。これ
ら酵素のアミノ末端のアミノ酸配列が最大の相同のため
に一直線になっている場合（図１０）、２つの相関性が
観察された。第一に、ＩＶ型コラーゲナーゼにおいて、
ｐＡＰＭＡ（結果として安定な活性酵素となる）による
活性化の際のタンパク質自動分解の部位は、プロストロ
メリシン活性化および間質プロコラーゲナーゼ活性化の
主産生物について以前に報告されたものと同一の遺伝子
座にて発生する（Whitman, S.E., Murphy, G., Angel,
P., Rahmsforf, H.-J., Smith, B.J., Lyons, A., Harr
is, T.J.T., Reynolds, J.J., Herrlich, P.およびDoch
erty, A.J.P., 1986, Biochem. J. 240, 913-916; Murp
hy, G., Cockett, M.I., Stephens, P.E., Smith, B.
J.,およびDocherty, A.J.P., 1987, Biochem. J. 248,
265-268）。ｐＡＰＭＡ処理に続くタンパク質自動分解
の同様な部位はプロストロメリシンについて（Wilhlem,
S.M., Collier, I.E., Kronberger, A.,Eisen, A.Z.,
Marmer, B.L., Grant, G.A., Bauer, E.A.,およびGoldb
erg, G.I., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,
6725-6729 ）および間質プロコラーゲナーゼについて
（Grant, G.A., Eisen, A.Z., Marmer, B.L. Rosweit,
W.T., およびGoldberg, G.I., 1987, J. Biol. Chem. 2
62, 5886-5889 ）の他の文献により報告されている。第
二に、全ての３つの酵素の活性化の間に除かれるアミノ
末端ペプチド断片は奇数個のシステイン残基を含む。Ｉ
Ｖ型プロコラーゲナーゼにおいて、３種のシステイン残
基が除去されたペプチド断片の中に存在する；Ｃｙｓ−
３１，Ｃｙｓ−３６およびＣｙｓ−７３。間質プロコラ
ーゲナーゼおよびプロストロメリシンにおいては、ＩＶ
型プロコラーゲナーゼにおけるＣｙｓ−７３に相当する
１個のシステイン残基が除去されたペプチド断片の中に
存在する。従って、潜伏メタロプロテイナーゼにおける
奇数個のシステイン残基からｐＡＰＭＡ活性化形態にお
ける偶数個のシステイン残基への変換は全て３つの酵素
において共通の特徴であると思われる。不対システイン
の除去は機能的に重大なものであろう。最後に、３つの
全ての酵素は高度保存領域をアミノ酸配列ＰＲＣＧＶＰ
ＤＶよりなる活性化座の直上流に含む。この配列は間質
コラーゲナーゼおよびストロメリシンのプロペプチドに
おいて不対システイン残基（Whitman, S.E.,Murphy,
G., Angel, P., Rahmsforf, H.-J., Smith, B.J., Lyon
s, A., Harris, T.J.T., Reynolds, J.J., Herrlich,
P.およびDocherty, A.J.P., 1986, Biochem. J. 240, 9
13-916）、そして相同によりＩＶ型コラーゲナーゼプロ
ペプチドにおいて不対システイン（存在する３種以外の
もの）を含む。最近の報告はラット・トランシンの部位
特異的突然変異誘発研究（ヒトストロメリシンの相同）
により、このメタロプロテイナーゼ族の自動活性化にお
けるこの保存領域の重要性を示している。この配列にお
いて突然変異を含む組換えトランシン形態は本来の配列
と比較した場合、より高速度の自発活性化を示した（Sa
nchez-Lopez, R., Nicholson, R., Gensel, M.C., Matr
isian, L.,およびBreatnach, R., 1988, J.Biol. Chem.
263, 11892-11899）。そこで、本発明者はＩＶ型プロ
コラーゲナーゼ活性化遺伝子座に関連した多くの小ペプ
チドをＩＶ型コラーゲナーゼ酵素活性を阻害する能力に
ついて試験するためにゼラチンチモグラム技術を使用し
た。図１１および図１２に示されるように、不対システ
インを含む保存領域（ＰＲＣＧＶＰＤＶ）を組み入れた
ペプチドのみが０．１ｍＭ未満の濃度にて強く抑制性で
あった。システインは活性のために必要とされた。表２
は、阻害活性を保持する最小のペプチド配列が実際には
ペンタペプチドＲＫＰＲＣであることを示した。
ラノーマ細胞ＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ末端配
列（残基１−１７，ＡＰＳＩＩＫＦＰＧＤＶＡＰＫＴ
Ｄ）ならびに内部ドメインの配列（残基４７２−４９
０，ＤＫＰＭＧＰＬＬＶＡＴＦＮＰＥＬＰＥＫ）を合成
した。これらは下記の理由で選択された。酵素の直接配
列決定で得られ（Collier, I.E., Wilhelm, S.M., Eise
n, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., Seltzer, J.L.,
Kronberger, A., He., C., Bauer, E.A.,およびGoldbe
rg, G.I., 1988, J. Biol. Chem. 263, 6579-6587; Hoy
htya,M., Turpeenniemi-Hujanen, T., Stetler-Stevens
on, W., Kurtzsch, H., Tryggvason, K.,およびLiotta,
L.A., 1988, FEBS Letters 233, 109-113 ）、ｃＤＮ
Ａクローンから予測される配列に確認され（Collier,
I.E., Wilhelm, S.M., Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Gr
ant, G.A., Seltzer, J.L., Kronberger, A., He., C.,
Bauer, E.A.,およびGoldberg, G.I., 1988, J. Biol.
Chem. 263, 6579-6587 ）、そして他のメタロプロテイ
ナーゼと相同性を示さない領域から誘導されている。ア
フィニティ精製抗体は、直接エリザならびに競合実験を
使用して特徴づけられる。この抗体は、ウシ血清アルブ
ミンまたは無関係のペプチドとの交叉反応性は示さなか
った。アフィニティ精製抗体はＩＶ型プロコラーゲナー
ゼを免疫沈殿する能力がある（Hoyhtya, M., Turpeenni
emi-Hujanen, T., Stetler-Stevenson, W., Kurtzsch,
H., Tryggvason, K., およびLiotta, L.A., 1988, FEBS
Letters 233, 109-113 ）。ウエスタンブロット法は、
精製ＩＶ型コラーゲナーゼとのウエスタンブロッティン
グと同じく、両方の抗体がＩＶ型プロコラーゲナーゼを
Ａ２０５８で調製した媒体において単一のバンドとして
認識したということを示した。ｐＡＰＭＡ活性化の時間
経過を、ゼラチンチモグラム分析、ＩＶ型コラーゲナー
ゼ検定およびイムノブロット上の両方のアフィニティ精
製抗体を使用して追跡した（図７）。Ａ２０５８メラノ
ーマ細胞ＩＶ型コラーゲナーゼのゼラチンチモグラム
（図７）分析は、７０ｋＤダルトンの分子量を持つゼラ
チン分解活性の単一バンドを示した。１ｍＭのｐＡＰＭ
Ａの存在下における３７℃での保温は、ゼラチン分解活
性のこのバンドのより低い分子量の６２ｋＤへの漸進的
な変換をもたらした。この変換は１０ｍＭのＥＤＴＡの
存在下では完全に阻害され、添加するｐＡＰＭＡの不在
下では起きなかった（図示せず）。精製したＩＶ型プロ
コラーゲナーゼのＩＶ型コラーゲナーゼ検定は、保温期
間における有機水銀化合物ｐＡＰＭＡの不在下ではコラ
ーゲン分解の活性を示さなかった。ｐＡＰＭＡを使用す
る保温により、酵素は活性化できた。コラーゲナーゼ検
定により測定されたように、ｐＡＰＭＡを使用する前保
温における活性化の時間経過は、完全なコラーゲン分解
活性が得られることを示している（図８）。抗体Ａ４７
２−４９０は、保温により、ゼラチンチモグラム（図
７）に示されたものに該当する時間依存の分子量減少を
示した。この変換は、６０分迄に５０％完了し、９０分
迄に実質的に完了するように見える。アミノ末端エピト
ープに該当する抗体Ａ１−１７は、ｐＡＰＭＡ活性化の
間の免疫染色における直接の減少を示した。これらの結
果は、有機水銀化合物を使用することによる潜在型から
安定な、活性コラーゲナーゼへの変換に従う明白な分子
量の減少がアミノ末端ペプチド配列の欠失の結果である
ことを示している。ゼラチン−アフィニティ精製ＩＶ型
プロコラーゲナーゼを、ｐＡＰＭＡ活性化の前後両方の
逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。クロマトグラム
は、潜在型または活性型保持時間に顕著な変化のないこ
とを示した。ピークを集め、ＮａＤｏｄＳＯ4 −ＰＡＧ
Ｅにより分析した時に、ｐＡＰＭＡ活性化に先立つプロ
コラーゲナーゼのピークは、非還元条件下では約７０ｋ
Ｄａの単一バンドを示した（図９，挿入）。ｐＡＰＭＡ
活性化（１６時間，３７℃）の後のコラーゲナーゼのピ
ークは、非還元条件下で６２ｋＤａに単一バンドを示し
た（図３Ａ）。ｐＡＰＭＡ活性化の前のＨＰＬＣ上のプ
ロコラーゲナーゼのピークから得られる物質を、直接ア
ミノ酸配列分析に供した。この物質はこの酵素のための
前に決めたものと同一であるアミノ末端配列を与えた
（図９）。ＨＰＬＣ精製後のｐＡＰＭＡ活性化物質の直
接配列分析は、単一の新規アミノ末端配列を示している
（図９）。これは、ｐＡＰＭＡ活性化が約８ｋＤａの分
子量低下と共に起こる潜在的酵素からのアミノ末端ペプ
チド断片の自触媒的脱離を伴うことを決定的に示してい
る。この切断は単一部位においてだけ起こる。なぜなら
ば、精製、活性化した酵素の多くの試料の配列を分析し
ても、他のアミノ末端アミノ酸の証拠が見いだされず、
そしてウエスタンブロッティングまたはゼラチンチモグ
ラム分析によって中間体の痕跡が見いだされないからで
ある。この研究の結果は、ＩＶ型コラーゲナーゼがコラ
ーゲン分解活性を得る前に活性化を必要とする潜在的酵
素前駆体の型で分泌されることを示している。有機水銀
化合物ｐＡＰＭＡにはこの活性化の能力がある。ＩＶ型
プロコラーゲナーゼの有機水銀活性化は、酵素前駆体型
のアミノ末端から８０個のアミノ酸残基ペプチド断片の
除去による、より低い分子量の活性化型への変換を伴
う。ｐＡＰＭＡに晒した後、最大のコラーゲン分解活性
が速やかに得られる。安定なより低分子量型への完全な
変換に先立つこの活性への到達は、活性であるが不安定
種である酵素前駆体における構造転位と一致しており、
これは間質コラーゲナーゼとストロメリシンで報告され
ているとおりである（Stricklin, G.P., Jeffrey, J.
J., Rosewit, W.T.,およびEisen, A.Z., 1983, Biochem
istry 22, 61-68; Murphy, G.,Cockett, M.I., Stephen
s, P.E., Smith, B.J., およびDocherty, A.J.P., 198
7, Biochem. J. 248, 265-268）。活性化は高度に精製
したＩＶ型コラーゲナーゼ酵素前駆体に起こる。かくし
て、有機水銀化合物の存在下における活性化は、ｐＡＰ
ＭＡそのものがペプチド結合を切断する能力に欠けるの
で自己分解的である有機水銀化合物による活性化のこの
自己触媒的機構は、間質コラーゲナーゼ（Grant, G.A.,
Eisen, A.Z., Marmer, B.L. Rosweit, W.T., およびGo
ldberg, G.I., 1987, J. Biol. Chem. 262, 5886-5889;
Whitman, S.E., Murphy, G., Angel, P., Rahmsforf,
H.-J., Smith, B.J., Lyons, A., Harris, T.J.T., Rey
nolds, J.J., Herrlich, P. およびDocherty, A.J.P.,
1986, Biochem. J. 240, 913-916）、およびストロメリ
シン（Wilhlem, S.M., Collier, I.E., Kronberger,A.,
Eisen, A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., Bauer, E.
A.,およびGoldberg,G.I., 1987, Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A. 84, 6725-6729; Whitman, S.E.,Murphy, G.,
Angel, P., Rahmsforf, H.-J., Smith, B.J., Lyons,
A., Harris,T.J.T., Reynolds, J.J., Herrlich, P. お
よびDocherty, A.J.P., 1986, Biochem. J. 240, 913-9
16; Murphy, G., Cockett, M.I., Stephens, P.E., Sm
ith,B.J.,およびDocherty, A.J.P., 1987, Biochem. J.
248, 265-268; Sanchez-Lopez, R., Nicholson, R., G
ensel, M.C., Matrisian, L.,およびBreatnach, R.,198
8, J. Biol. Chem. 263, 11892-11899）のような他の細
胞外マトリックスを分解するメタロプロテイナーゼで示
されている。これら３種のメタロプロテイナーゼ、ＩＶ
型コラーゲナーゼ、間質プロコラーゲナーゼおよびプロ
ストロメリシンはアミノ酸レベルで顕著な相同性を示す
（Grant, G.A., Eisen, A.Z., Marmer, B.L. Rosweit,
W.T., およびGoldberg, G.I., 1987, J. Biol. Chem. 2
62, 5886-5889; Collier, I.E., Wilhelm, S.M., Eise
n, A.Z., Marmer, B.L., Grant,G.A., Seltzer, J.L.,
Kronberger, A., He., C., Bauer, E., およびGoldber
g, G.I., 1988, J. Biol. Chem. 263, 6579-6587; Wilh
lem, S.M., Collier, I.E., Kronberger, A., Eisen,
A.Z., Marmer, B.L., Grant, G.A., Bauer, E., および
Goldberg, G.I., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A. 84, 6725-6729; Saua, J., Quinones, S., Otani,
Y., Nagase, H., Harris, E.D., Jr.,およびKurkinen,
M., 1988, J. Biol. Chem. 263, 6742-6745; Whitman,
S.E., Murphy,G., Angel, P., Rahmsforf, H.-J., Smit
h, B.J., Lyons, A., Harris, T.J.T.,Reynolds, J.J.,
Herrlich, P. およびDocherty, A.J.P., 1986, Bioche
m. J.240, 913-916; Sanchez-Lopez, R., Nicholson,
R., Gensel, M.C., Matrisian,L.,およびBreatnach,
R., 1988, J. Biol. Chem. 263, 11892-11899）。これ
ら酵素のアミノ末端のアミノ酸配列が最大の相同のため
に一直線になっている場合（図１０）、２つの相関性が
観察された。第一に、ＩＶ型コラーゲナーゼにおいて、
ｐＡＰＭＡ（結果として安定な活性酵素となる）による
活性化の際のタンパク質自動分解の部位は、プロストロ
メリシン活性化および間質プロコラーゲナーゼ活性化の
主産生物について以前に報告されたものと同一の遺伝子
座にて発生する（Whitman, S.E., Murphy, G., Angel,
P., Rahmsforf, H.-J., Smith, B.J., Lyons, A., Harr
is, T.J.T., Reynolds, J.J., Herrlich, P.およびDoch
erty, A.J.P., 1986, Biochem. J. 240, 913-916; Murp
hy, G., Cockett, M.I., Stephens, P.E., Smith, B.
J.,およびDocherty, A.J.P., 1987, Biochem. J. 248,
265-268）。ｐＡＰＭＡ処理に続くタンパク質自動分解
の同様な部位はプロストロメリシンについて（Wilhlem,
S.M., Collier, I.E., Kronberger, A.,Eisen, A.Z.,
Marmer, B.L., Grant, G.A., Bauer, E.A.,およびGoldb
erg, G.I., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84,
6725-6729 ）および間質プロコラーゲナーゼについて
（Grant, G.A., Eisen, A.Z., Marmer, B.L. Rosweit,
W.T., およびGoldberg, G.I., 1987, J. Biol. Chem. 2
62, 5886-5889 ）の他の文献により報告されている。第
二に、全ての３つの酵素の活性化の間に除かれるアミノ
末端ペプチド断片は奇数個のシステイン残基を含む。Ｉ
Ｖ型プロコラーゲナーゼにおいて、３種のシステイン残
基が除去されたペプチド断片の中に存在する；Ｃｙｓ−
３１，Ｃｙｓ−３６およびＣｙｓ−７３。間質プロコラ
ーゲナーゼおよびプロストロメリシンにおいては、ＩＶ
型プロコラーゲナーゼにおけるＣｙｓ−７３に相当する
１個のシステイン残基が除去されたペプチド断片の中に
存在する。従って、潜伏メタロプロテイナーゼにおける
奇数個のシステイン残基からｐＡＰＭＡ活性化形態にお
ける偶数個のシステイン残基への変換は全て３つの酵素
において共通の特徴であると思われる。不対システイン
の除去は機能的に重大なものであろう。最後に、３つの
全ての酵素は高度保存領域をアミノ酸配列ＰＲＣＧＶＰ
ＤＶよりなる活性化座の直上流に含む。この配列は間質
コラーゲナーゼおよびストロメリシンのプロペプチドに
おいて不対システイン残基（Whitman, S.E.,Murphy,
G., Angel, P., Rahmsforf, H.-J., Smith, B.J., Lyon
s, A., Harris, T.J.T., Reynolds, J.J., Herrlich,
P.およびDocherty, A.J.P., 1986, Biochem. J. 240, 9
13-916）、そして相同によりＩＶ型コラーゲナーゼプロ
ペプチドにおいて不対システイン（存在する３種以外の
もの）を含む。最近の報告はラット・トランシンの部位
特異的突然変異誘発研究（ヒトストロメリシンの相同）
により、このメタロプロテイナーゼ族の自動活性化にお
けるこの保存領域の重要性を示している。この配列にお
いて突然変異を含む組換えトランシン形態は本来の配列
と比較した場合、より高速度の自発活性化を示した（Sa
nchez-Lopez, R., Nicholson, R., Gensel, M.C., Matr
isian, L.,およびBreatnach, R., 1988, J.Biol. Chem.
263, 11892-11899）。そこで、本発明者はＩＶ型プロ
コラーゲナーゼ活性化遺伝子座に関連した多くの小ペプ
チドをＩＶ型コラーゲナーゼ酵素活性を阻害する能力に
ついて試験するためにゼラチンチモグラム技術を使用し
た。図１１および図１２に示されるように、不対システ
インを含む保存領域（ＰＲＣＧＶＰＤＶ）を組み入れた
ペプチドのみが０．１ｍＭ未満の濃度にて強く抑制性で
あった。システインは活性のために必要とされた。表２
は、阻害活性を保持する最小のペプチド配列が実際には
ペンタペプチドＲＫＰＲＣであることを示した。
【００２０】 ────────────────────────────── 表 ２ ＩＶ型コラーゲナーゼの阻害のための最小ペプチド配列 および必須配列 ペプチド♯ 配列 阻害(a) ────────────────────────────── ７４ TMRKPRCGNPDVAN ＋ ７８ TMRKPRSGNPDVAN − ８２ KPRCG- ８５ MRKPRCG+ ８６ KPRCGNP- ８８ RKPRC+ ９３ RQPRC+ ９４ RKARC+ ９５ QKPRC- １０１ RKPQC- １０６ KKPRC+ １０７ RKPKC+ １０８ RKLRC+ ──────────────────────────────(a) 阻害活性は、実施例１に記載したゼラチンチモグラム法の変 法を用いて評価した。全てのペプチドは１ｍｇ／ｍｌの最終濃度 にて試験した。 ──────────────────────────────
【００２１】さらに表２におけるデータは、ペプチド阻
害剤活性は臨界のシスティニル残基をフランキングする
特定の荷電配列要素を必要とすることを示す。明確に
は、保存領域の２つのアルギニル残基は阻害活性のため
に重要であると考えられた。これらの位置での極性不荷
電残基との置換（ＲからＱ）は活性の損失の結果となっ
た。しかしながら、これら２つのアルギニル残基の間の
プロリル残基およびリシル残基はグリシル残基と置き換
わることができ、そしてこれらペプチドは阻害活性を保
持したであろう。このことは、この領域の局所配座にと
って重要であり得るリシル残基およびプロリル残基（Sa
nchez-Lopez 等， 1988 ）は阻害相互作用に直接には関
与しないことを示唆する。従って、ＩＶ型コラーゲナー
ゼのプロ酵素断片は、マトリックスメタロプロテイナー
ゼ族の他のメンバーと共有する保存領域を含む。この配
列は活性化されたＩＶ型コラーゲナーゼを阻害すること
が可能である。この阻害剤配列は、必須システィニル残
基に関して位置−１および−４に荷電された２個の陽性
残基を含む特定のフランキングペプチド配列中に不対シ
スティニル残基の存在を必要とする。この阻害剤による
酵素活性の阻害は、酵素活性のための２つの要素、定ま
ったペプチド配列中の不対システィニル残基を必要とす
る点において特異的であると考えられる。これらのデー
タは、プロ酵素断片中に存在するＲＫＰＲＣ配列がシス
ティニル残基と活性部位にて配位した金属原子との相互
作用を通して酵素の内因性阻害剤として振る舞うという
新規な仮説を支持する。さらに、システィニル残基に隣
接した位置でのアミノ酸置換はペプチドのＩＶ型コラー
ゲナーゼ活性を妨げる能力を消失させることができるの
で、不対システィニル残基を囲む配列は、この阻害相互
作用を促進すると考えられる。これらの結果は潜伏コラ
ーゲナーゼ遺伝子族酵素の構造およびそれらの活性につ
いて統一する仮説に統合することができる。酵素前駆体
形態は酵素活性部位との相互作用をして触媒活性を阻止
する保存配列ＭＲＫＰＲＣＧＮ（Ｖ）ＰＤＶを含むプロ
酵素断片の結果である。この相互作用は亜鉛原子の配位
を通してシスティニル残基の不対スルフヒドリル側鎖に
より安定化される。従って、システィニル残基−金属原
子配位を妨げる全ての因子は結果としてプロ酵素断片の
酵素活性およびこれに続く自動触媒的除去に帰する。こ
れは、金属原子−スルフヒドリル配位のために直接競合
する試薬、例えば有機水銀試薬により達成される。ま
た、金属原子配位の崩壊に帰する臨界システィニル残基
を囲むプロ酵素断片の立体配座を妨げるカオトロピック
因子によっても達成され得る。また、非タンパク質分解
組織活性物質、例えばTyree 等, 1981（Archiv. Bioche
m, Biophys. 208, 440-443）により記載されたものは、
これらの酵素を、提示されたように、誘発配座転位の機
構により活性化する。本発明の別の好ましい態様は、Ｉ
Ｖ型プロコラーゲナーゼ酵素のプロペプチド配列１−８
０により具体化される。これは不対システイン残基を組
み入れた内因性阻害剤配列ＲＫＰＲＣを含む。加えて、
この８０アミノ酸ペプチドのアミノ末端は内部ジスルフ
ィド結合を含み、そしてこのペプチドはまた腫瘍細胞表
面結合部位を含む。８０ｍｅｒペプチドは、例えば合成
化学によるか、または組換え手段により製造されるが、
従って少なくとも３つの理由のために阻害剤としての利
点を有する。第一に、阻害配列の二次構造が正確に再生
されるので、その阻害活性はモルベースでペプチドに比
べ高い。第二に、組換え８０ｍｅｒペプチドタンパク質
はアミノ末端でのジスルフィド結合の存在により、より
大きいインビボ安定性（より長い半減期）を有する。第
三に、８０ｍｅｒは細胞結合部位を含むので、有害なタ
ンパク質分解が起きる腫瘍細胞の表面を標的とすること
ができる。図１３は、活性化の際、ヒトＩＶ型プロコラ
ーゲナーゼから開裂するアミノ末端ペプチドの８０アミ
ノ酸配列をコードするヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼに
ついてヒトｃＤＮＡクローンの部分のヌクレオチド配列
を示す。このヌクレオチド配列（または普遍的遺伝子コ
ードに従い同一のアミノ酸配列を特定する全ての他の配
列）を有するＤＮＡ断片は種々の組換えタンパク質産生
システムにおいてマトリックスメタロプロテイナーゼの
阻害剤としての用途のための８０ｍｅｒを産生するため
に使用することができる。また、このヌクレオチド配列
を有するＤＮＡ断片はヒトゲノムに由来するが、哺乳動
物の中に組換え表現ベクターの部分としてマトリックス
メタロプロテイナーゼの８０ｍｅｒ阻害剤の産生の内部
遺伝子源を産生するために配することができる。
害剤活性は臨界のシスティニル残基をフランキングする
特定の荷電配列要素を必要とすることを示す。明確に
は、保存領域の２つのアルギニル残基は阻害活性のため
に重要であると考えられた。これらの位置での極性不荷
電残基との置換（ＲからＱ）は活性の損失の結果となっ
た。しかしながら、これら２つのアルギニル残基の間の
プロリル残基およびリシル残基はグリシル残基と置き換
わることができ、そしてこれらペプチドは阻害活性を保
持したであろう。このことは、この領域の局所配座にと
って重要であり得るリシル残基およびプロリル残基（Sa
nchez-Lopez 等， 1988 ）は阻害相互作用に直接には関
与しないことを示唆する。従って、ＩＶ型コラーゲナー
ゼのプロ酵素断片は、マトリックスメタロプロテイナー
ゼ族の他のメンバーと共有する保存領域を含む。この配
列は活性化されたＩＶ型コラーゲナーゼを阻害すること
が可能である。この阻害剤配列は、必須システィニル残
基に関して位置−１および−４に荷電された２個の陽性
残基を含む特定のフランキングペプチド配列中に不対シ
スティニル残基の存在を必要とする。この阻害剤による
酵素活性の阻害は、酵素活性のための２つの要素、定ま
ったペプチド配列中の不対システィニル残基を必要とす
る点において特異的であると考えられる。これらのデー
タは、プロ酵素断片中に存在するＲＫＰＲＣ配列がシス
ティニル残基と活性部位にて配位した金属原子との相互
作用を通して酵素の内因性阻害剤として振る舞うという
新規な仮説を支持する。さらに、システィニル残基に隣
接した位置でのアミノ酸置換はペプチドのＩＶ型コラー
ゲナーゼ活性を妨げる能力を消失させることができるの
で、不対システィニル残基を囲む配列は、この阻害相互
作用を促進すると考えられる。これらの結果は潜伏コラ
ーゲナーゼ遺伝子族酵素の構造およびそれらの活性につ
いて統一する仮説に統合することができる。酵素前駆体
形態は酵素活性部位との相互作用をして触媒活性を阻止
する保存配列ＭＲＫＰＲＣＧＮ（Ｖ）ＰＤＶを含むプロ
酵素断片の結果である。この相互作用は亜鉛原子の配位
を通してシスティニル残基の不対スルフヒドリル側鎖に
より安定化される。従って、システィニル残基−金属原
子配位を妨げる全ての因子は結果としてプロ酵素断片の
酵素活性およびこれに続く自動触媒的除去に帰する。こ
れは、金属原子−スルフヒドリル配位のために直接競合
する試薬、例えば有機水銀試薬により達成される。ま
た、金属原子配位の崩壊に帰する臨界システィニル残基
を囲むプロ酵素断片の立体配座を妨げるカオトロピック
因子によっても達成され得る。また、非タンパク質分解
組織活性物質、例えばTyree 等, 1981（Archiv. Bioche
m, Biophys. 208, 440-443）により記載されたものは、
これらの酵素を、提示されたように、誘発配座転位の機
構により活性化する。本発明の別の好ましい態様は、Ｉ
Ｖ型プロコラーゲナーゼ酵素のプロペプチド配列１−８
０により具体化される。これは不対システイン残基を組
み入れた内因性阻害剤配列ＲＫＰＲＣを含む。加えて、
この８０アミノ酸ペプチドのアミノ末端は内部ジスルフ
ィド結合を含み、そしてこのペプチドはまた腫瘍細胞表
面結合部位を含む。８０ｍｅｒペプチドは、例えば合成
化学によるか、または組換え手段により製造されるが、
従って少なくとも３つの理由のために阻害剤としての利
点を有する。第一に、阻害配列の二次構造が正確に再生
されるので、その阻害活性はモルベースでペプチドに比
べ高い。第二に、組換え８０ｍｅｒペプチドタンパク質
はアミノ末端でのジスルフィド結合の存在により、より
大きいインビボ安定性（より長い半減期）を有する。第
三に、８０ｍｅｒは細胞結合部位を含むので、有害なタ
ンパク質分解が起きる腫瘍細胞の表面を標的とすること
ができる。図１３は、活性化の際、ヒトＩＶ型プロコラ
ーゲナーゼから開裂するアミノ末端ペプチドの８０アミ
ノ酸配列をコードするヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼに
ついてヒトｃＤＮＡクローンの部分のヌクレオチド配列
を示す。このヌクレオチド配列（または普遍的遺伝子コ
ードに従い同一のアミノ酸配列を特定する全ての他の配
列）を有するＤＮＡ断片は種々の組換えタンパク質産生
システムにおいてマトリックスメタロプロテイナーゼの
阻害剤としての用途のための８０ｍｅｒを産生するため
に使用することができる。また、このヌクレオチド配列
を有するＤＮＡ断片はヒトゲノムに由来するが、哺乳動
物の中に組換え表現ベクターの部分としてマトリックス
メタロプロテイナーゼの８０ｍｅｒ阻害剤の産生の内部
遺伝子源を産生するために配することができる。
【００２２】方法 培養方法 ヒトＡ２０５８黒色腫細胞を、１０％ウシ胎児血清を入
れたＤＭＥＭ中において８０％集密にまで増殖した。そ
の後、培地を無血清ＤＭＥＭと置き換え、そして培養を
２４時間続行した。無血清ならし培地を集め、そして−
２０℃での貯蔵の前に限外濾過（アミコンＹＭ３０メン
ブラン）により濃縮した。 ＩＶ型プロコラーゲナーゼの精製 ＩＶ型プロコラーゲナーゼをヒトＡ２０５８黒色腫細胞
濃縮ならし培地から直接、０．０５ＭトリスＨＣｌ、
０．００５Ｍ ＣａＣｌ2 、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０２％Ｂｒｉｊ３５（シグマ）を含むｐＨ７．６の緩衝
液（ＴＣＳ緩衝液）中のゼラチン−セファロース（シグ
マ）アフィニティクロマトグラフィにより精製した。
０．０２％Ｂｒｉｊと７％ジメチルスルホキシドとを含
むＴＣＳ緩衝液を使用して酵素を溶離した。その後、試
料を濃縮し、そして同じ緩衝液中で−７０℃にて使用す
るまで保存した。さらにＩＶ型プロコラーゲナーゼをア
ミノ酸配列分析の前に、０．１％トリフルオロ酢酸中で
平衡化され、０．４６×１０ｃｍ ＲＰ３００カラム
（ピース社製）を備えたＤｉｏｎｅｘ Ａ１４００シス
テムで逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムは６０％ア
セトニトリルに対して線形勾配となるように溶離した。 合成ペプチドに対する抗体の製造 免疫感作において使用されたペプチドをバイオサーチ９
６００ペプチドシンセサイザーにより合成した。抗体を
実施例３に記載したように製造し、そして精製した。抗
体製剤は図３に示すように市販のエリザ（ＥＬＩＳＡ）
キット（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリー
ズ）イムロン２プレート（ダイナテック社）を使用して
エリザによる特徴づけた。 有機水銀によるＩＶ型プロコラーゲナーゼの活性化 ０．０５Ｎ ＮａＯＨ中の０．０１Ｍ ｐ−ＡＰＭＡの
貯蔵溶液を毎日新たに製造した。プロ酵素試料を最終濃
度０．５または１．０ｍＭ ｐ−ＡＰＭＡで時間を変え
て（０−１６時間）３７℃にて保温した。保温に続い
て、試料を直接、０．１％ゼラチンを含む９％アクリル
アミドゲル上でＮａＤｏｄＳＯ4 −ＰＡＧＥにより分析
した（ゼラチンチモグラム）。あるいは、試料を９％Ｎ
ａＤｏｄＳＯ4 −ＰＡＧＥ上で走査し、そしてイモビロ
ンＰメンブラン（ミリポア）の上に電気的に斑点づけを
行った。 ＩＶ型コラーゲン分解活性の分析 ＩＶ型コラーゲナーゼ活性を実施例１に記載されている
ように、阻害ペプチドの存在下で分析した。使用した基
質は 3Ｈ−プロペニル化ヒトＩＶ型コラーゲン（ニュー
イングランド・ヌクレア）である。反応は２８℃にて４
ないし１６時間行った。
れたＤＭＥＭ中において８０％集密にまで増殖した。そ
の後、培地を無血清ＤＭＥＭと置き換え、そして培養を
２４時間続行した。無血清ならし培地を集め、そして−
２０℃での貯蔵の前に限外濾過（アミコンＹＭ３０メン
ブラン）により濃縮した。 ＩＶ型プロコラーゲナーゼの精製 ＩＶ型プロコラーゲナーゼをヒトＡ２０５８黒色腫細胞
濃縮ならし培地から直接、０．０５ＭトリスＨＣｌ、
０．００５Ｍ ＣａＣｌ2 、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０２％Ｂｒｉｊ３５（シグマ）を含むｐＨ７．６の緩衝
液（ＴＣＳ緩衝液）中のゼラチン−セファロース（シグ
マ）アフィニティクロマトグラフィにより精製した。
０．０２％Ｂｒｉｊと７％ジメチルスルホキシドとを含
むＴＣＳ緩衝液を使用して酵素を溶離した。その後、試
料を濃縮し、そして同じ緩衝液中で−７０℃にて使用す
るまで保存した。さらにＩＶ型プロコラーゲナーゼをア
ミノ酸配列分析の前に、０．１％トリフルオロ酢酸中で
平衡化され、０．４６×１０ｃｍ ＲＰ３００カラム
（ピース社製）を備えたＤｉｏｎｅｘ Ａ１４００シス
テムで逆相ＨＰＬＣにより精製した。カラムは６０％ア
セトニトリルに対して線形勾配となるように溶離した。 合成ペプチドに対する抗体の製造 免疫感作において使用されたペプチドをバイオサーチ９
６００ペプチドシンセサイザーにより合成した。抗体を
実施例３に記載したように製造し、そして精製した。抗
体製剤は図３に示すように市販のエリザ（ＥＬＩＳＡ）
キット（キルケガード・アンド・ペリー・ラボラトリー
ズ）イムロン２プレート（ダイナテック社）を使用して
エリザによる特徴づけた。 有機水銀によるＩＶ型プロコラーゲナーゼの活性化 ０．０５Ｎ ＮａＯＨ中の０．０１Ｍ ｐ−ＡＰＭＡの
貯蔵溶液を毎日新たに製造した。プロ酵素試料を最終濃
度０．５または１．０ｍＭ ｐ−ＡＰＭＡで時間を変え
て（０−１６時間）３７℃にて保温した。保温に続い
て、試料を直接、０．１％ゼラチンを含む９％アクリル
アミドゲル上でＮａＤｏｄＳＯ4 −ＰＡＧＥにより分析
した（ゼラチンチモグラム）。あるいは、試料を９％Ｎ
ａＤｏｄＳＯ4 −ＰＡＧＥ上で走査し、そしてイモビロ
ンＰメンブラン（ミリポア）の上に電気的に斑点づけを
行った。 ＩＶ型コラーゲン分解活性の分析 ＩＶ型コラーゲナーゼ活性を実施例１に記載されている
ように、阻害ペプチドの存在下で分析した。使用した基
質は 3Ｈ−プロペニル化ヒトＩＶ型コラーゲン（ニュー
イングランド・ヌクレア）である。反応は２８℃にて４
ないし１６時間行った。
【００２３】実施例３ 抗体認識メタロプロテイナーゼペプチド アミノ末端（残基１−１７）からカルボキシ末端（残基
４７２−４９０）近傍の内部領域に伸びるＩＶ型プロコ
ラーゲナーゼの連続領域に相当する合成ペプチド（図
１，表３）は、本来のＩＶ型プロコラーゲナーゼに対し
てそれらの個々の領域を認識したアフィニティ精製ポリ
クローナル抗体を生じる抗原として使用された。
４７２−４９０）近傍の内部領域に伸びるＩＶ型プロコ
ラーゲナーゼの連続領域に相当する合成ペプチド（図
１，表３）は、本来のＩＶ型プロコラーゲナーゼに対し
てそれらの個々の領域を認識したアフィニティ精製ポリ
クローナル抗体を生じる抗原として使用された。
【００２４】
【００２５】固相合成ペプチドに結合した抗体は液相ペ
プチドにより競合される可能性があるということを示す
ために酵素結合イムノソルベントアッセイ（エリザ）が
使用され、そして各々のアフィニティ精製抗体は単一特
異性であった（図３）。有機水銀活性化法の経時的なウ
エスタンイムノブロッティング研究は、抗体が精製形態
における、または培養液中で腫瘍細胞により分泌された
タンパク質の複合混合物中の、固相酵素を認識したとい
うことを示した（図３）。ウエスタンイムノブロッティ
ングは、低分子量形態への変換中のアミノ末端領域（残
基１−８０）の直接的損失も示した（図７）。それ故
に、最初の１−８０アミノ末端残基中のペプチド領域を
認識する抗体は、酵素の活性形態から潜伏体を区別する
ために使用することができる。表３中のペプチドを認識
する抗体は、ヒト血清およびヒト尿中のＩＶ型コラーゲ
ナーゼ抗体を検出するための固相または液相の直接また
は競合イムノアッセイにおいて有用であることが示され
た。そのような抗体アッセイは局部または転移癌の診断
に有用である。抗体−ペプチド抗体は、免疫組織学によ
るヒト結腸癌の診断のために有用であることも示された
（表４）。表４は、表３のペプチドに対して導かれる抗
体が悪性腫瘍細胞に結合した酵素抗原を同定するために
使用することができるということを示すヒト結腸癌症例
における免疫組織学例の要約である。
プチドにより競合される可能性があるということを示す
ために酵素結合イムノソルベントアッセイ（エリザ）が
使用され、そして各々のアフィニティ精製抗体は単一特
異性であった（図３）。有機水銀活性化法の経時的なウ
エスタンイムノブロッティング研究は、抗体が精製形態
における、または培養液中で腫瘍細胞により分泌された
タンパク質の複合混合物中の、固相酵素を認識したとい
うことを示した（図３）。ウエスタンイムノブロッティ
ングは、低分子量形態への変換中のアミノ末端領域（残
基１−８０）の直接的損失も示した（図７）。それ故
に、最初の１−８０アミノ末端残基中のペプチド領域を
認識する抗体は、酵素の活性形態から潜伏体を区別する
ために使用することができる。表３中のペプチドを認識
する抗体は、ヒト血清およびヒト尿中のＩＶ型コラーゲ
ナーゼ抗体を検出するための固相または液相の直接また
は競合イムノアッセイにおいて有用であることが示され
た。そのような抗体アッセイは局部または転移癌の診断
に有用である。抗体−ペプチド抗体は、免疫組織学によ
るヒト結腸癌の診断のために有用であることも示された
（表４）。表４は、表３のペプチドに対して導かれる抗
体が悪性腫瘍細胞に結合した酵素抗原を同定するために
使用することができるということを示すヒト結腸癌症例
における免疫組織学例の要約である。
【００２６】 ────────────────────────────── 表 ４ ＩＶ型コラーゲナーゼの免疫学的活性 抗ペプチド抗体 組織 陽性／全体 ────────────────────────────── 正常胃粘膜 ０／２０ 胃癌 粘膜に限定 １８／２０* 粘膜下に侵入 ２０／２０** 全厚に侵入 ２０／２０** 正常結腸直腸粘膜 ０／１０ 腫瘍正の結腸ポリプ １／１０ 結腸直腸癌 粘膜に限定 １／１０* 粘膜下に侵入 ８／１０** 全厚に侵入 １８／２０** ──────────────────────────────* １０−３０％腫瘍細胞活性** ５０−８０％腫瘍細胞活性 ──────────────────────────────
【００２７】方法 タンパク質ペプチド タンパク質ペプチドの合成は、標準メリフィールド固相
ペプチド合成プロトコルを使用して、バイオサーチモデ
ル９６００ペプチド合成装置により行った。合成された
最初の配列は、図１に示すようにヒトＩＶ型コラーゲナ
ーゼにおける残基３７１−３８６に正確に相当するＶＡ
ＡＨＥＦＧＨＡＭＧＬＥＨＳＱであった。３個のＨｉｓ
残基および２個のＧｌｕ残基はＡｌａ残基を用いた種々
の組合せで置換され、そしてＩＶ型コラーゲナーゼに関
するこの置換の効果およびチモグラムゼラチナーゼ活性
が検討された。
ペプチド合成プロトコルを使用して、バイオサーチモデ
ル９６００ペプチド合成装置により行った。合成された
最初の配列は、図１に示すようにヒトＩＶ型コラーゲナ
ーゼにおける残基３７１−３８６に正確に相当するＶＡ
ＡＨＥＦＧＨＡＭＧＬＥＨＳＱであった。３個のＨｉｓ
残基および２個のＧｌｕ残基はＡｌａ残基を用いた種々
の組合せで置換され、そしてＩＶ型コラーゲナーゼに関
するこの置換の効果およびチモグラムゼラチナーゼ活性
が検討された。
【００２８】抗ペプチド抗体の調製 抗ペプチド抗体は下記工程に従って調製された。ＢＳＡ
に対するペプチドの結合：ペプチド抗原性を形成するた
めに、ＢＳＡまたは他の抗原性タンパク質に共有結合的
に結合させなければならない。ペプチド２ｍｇにＰＢＳ
１ｍｌを加え、次いでＢＳＡ６ｍｇにＰＢＳ４ｍｌを加
える。これらの溶液を混合し、次いで０．２５％グルタ
ルアルデヒド溶液５ｍｌをこの混合物に加える。この結
果得られた溶液を室温で４時間攪拌し、次いで室温で一
晩ＰＢＳ１ｌにより透析した。翌日、この溶液を６ｍｌ
に濃縮し、次いで免疫化のために１ｍｌずつに分けた。 ウサギの免疫化：可能な限りの抗体の高力価を確保する
ため、全ての免疫化は完全フロイントアジュバントを使
用して行うべきである。最初の２回の注射のために、Ｂ
ＳＡ−ペプチド抱合体１ｍｌおよびＣＦＡ１ｍｌを乳化
し、次いで２匹のウサギの背中の約３０箇所に乳化剤１
ｍｌを用いて皮下注射する。第２の注射後、抱合体溶液
０．５ｍｌをＰＢＳ０．５ｍｌを用いて稀釈して乳化剤
を調製する。免疫化は２週間毎に行う。採血は免疫化の
前、および第３または第４の注射を始めるまでの注射の
間の週に行う。 ペプチド抗体親和性樹脂の調製：一旦、抗ペプチド抗体
血清が使用可能となれば、次工程は親和性精製工程を行
うことである。第１工程において、ペプチド抗体親和性
樹脂を調製する。アフィーゲル１０（バイオラド社）約
１０−１２ｍｌを、冷ＰＢＳ４０ｍｌを用いて３回素早
く洗浄し、次いで冷ＰＢＳに再懸濁して全容量約２０ｍ
ｌを得る。同時に、ペプチド２ｍｇをＰＢＳ１ｍｌに溶
解し、次いで中程度に攪拌しながらアフィーゲル懸濁液
に加える。この結果得られた混合物を冷却状態で一晩穏
やかに攪拌する。翌日、０．２Ｍ溶液を調製するために
十分な１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、次いで
このゲルを冷却状態でさらに４時間攪拌する。このゲル
はＰＢＳ４０ｍｌを用いて３回洗浄後は抗体吸着が容易
である。 抗体の親和性精製：担体含有血清を３０分間５６℃で加
熱し、冷却し、次いでペプチド樹脂（これは予め準備さ
れ、かつ注入された過剰のＰＢＳを含んでいた）と混合
する。冷却状態で一晩穏やかに攪拌後、ゲル懸濁液をカ
ラムに注入し、次いで冷１Ｍ酢酸をゲル容量の２倍用
い、続いてＰＢＳをゲル容量の１倍用いて洗浄する。抗
体溶出液を６Ｎ ＮａＯＨで約ｐＨ７．０に調整し、次
いでこの結果得られた溶液を約５ｍｌにダイアフロ（Ｙ
Ｍ−３０）濃縮し、緩衝液をＰＢＳに変える。 樹脂への抗体カップリング：わずか１時間前に反応を停
止させるためにトリスを加え、次いで未使用の活性部位
を封止することにより抗体のカップリングを進めること
以外、操作は上記全く同一である。 イムノアッセイ：酵素結合イムノソルベントアッセイ、
ウエスタンブロッティング研究および免疫組織学は標準
的な慣用法を使用して行った。 上記のように選択され、次いで精製されたペプチドに対
するポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、慣用
の方法により適する放射性酵素または蛍光標識を用いて
標識化することが可能であるが、これは当業者には明ら
かであろう。本文中に記載されたペプチド及び抗体を用
いる免疫学的分析は、慣用の免疫学的方法を使用し、か
つ非標識化、結合性または非結合性抗体またはペプチド
の手段を用いることにより、体液、組織抽出物または組
織部分を包含するいずれかのタイプの生物学的試料に対
して適用するができる。抗体またはペプチドは、適する
固相、例えば支持体、例としてミクロ滴定ウエルに結合
させることができる。ＩＶ型コラーゲナーゼのための前
記抗ペプチド抗体は、自然の全酵素に対して作成された
抗体を上回る十分な利点を有する（Tryggvason, K.およ
びLiotta, L.A., 米国特許第４６７７０５８号）。第一
に、それらはＩＶ型コラーゲナーゼ（これは他の広く用
いられているメタロプロテイナーゼと同族ではない）に
特有の特定領域を認識する。これは非自明のことであ
り、かつＩＶ型コラーゲナーゼのアミノ酸配列の大部分
は図２に示されるように他のメタロプロテイナーゼと非
常に同族的であるか、または同一でさえあるということ
に関する多くの問題を克服する。表３のペプチドに対し
て作られた抗体は他のメタロプロテイナーゼとＩＶ型コ
ラーゲナーゼとを区別し、かつさらに活性化体を潜酵素
と区別し得る。この後者の特徴は、活性化酵素に対する
潜伏体の比率が病気の診断または予後における決定因子
である病的状態が存在し得るので非常に重要である。上
記の発明は、明確性および理解の目的のためにある程度
詳細に記載された。形態および細部についての種々の変
化および組合せが、本発明の範囲から逸脱することなく
なし得るということも当業者には自明であろう。特に、
本文中に記載されたペプチド阻害剤の側面（フランキン
グ）配列における変性がメタロプロテイナーゼ類の個々
のメンバーに対する安定性、活性または特異性を変え得
るということは当業者には自明である。例えば、図１０
に示される活性化結合開裂部位の左側に対する特定配列
の選択は、ＩＶ型コラーゲナーゼに比べてストロメリシ
ンまたはＩ型コラーゲナーゼを好ましく阻害するための
阻害剤を生じさせ得る。これは、前記配列のこの領域は
異なるマトリックスメタロプロテイナーゼタイプ間でい
くつかの変異性を示すからである。非臨界領域における
アミノ酸のある種の置換の選択は、ペプチドの阻害性を
十分には変えないであろうということもさらに明らかで
ある。マトリックスメタロプロテイナーゼに対して特異
的な抗体のための免疫原または抗原として使用すべき合
成ペプチドの場合において、当業者は抗体結合部位によ
る認識に関する特異的アミノ酸配列が、４ないし６個の
アミノ酸の配列［これは抗体が使用されるべき環境（例
えば人間の生物学的検体）において他のタンパク質中に
存在することは知られていない］からなるということを
理解するであろう。最後に、組換えタンパク質ペプチド
は自然にペプチドまたは合成ペプチドに比べて活性を有
し得るということは従来技術において知られている。本
発明の態様は、それ故に明らかなごとく、合成ペプチド
化学により適する発現ベクター中に具合よく挿入された
適当なＤＮＡ断片または利用し得る自然源からの単離物
を使用して調製された。いくつかの場合には、本発明の
ペプチドは従来技術においてよく知られている標準法の
変法に基づいて精製し得る。
に対するペプチドの結合：ペプチド抗原性を形成するた
めに、ＢＳＡまたは他の抗原性タンパク質に共有結合的
に結合させなければならない。ペプチド２ｍｇにＰＢＳ
１ｍｌを加え、次いでＢＳＡ６ｍｇにＰＢＳ４ｍｌを加
える。これらの溶液を混合し、次いで０．２５％グルタ
ルアルデヒド溶液５ｍｌをこの混合物に加える。この結
果得られた溶液を室温で４時間攪拌し、次いで室温で一
晩ＰＢＳ１ｌにより透析した。翌日、この溶液を６ｍｌ
に濃縮し、次いで免疫化のために１ｍｌずつに分けた。 ウサギの免疫化：可能な限りの抗体の高力価を確保する
ため、全ての免疫化は完全フロイントアジュバントを使
用して行うべきである。最初の２回の注射のために、Ｂ
ＳＡ−ペプチド抱合体１ｍｌおよびＣＦＡ１ｍｌを乳化
し、次いで２匹のウサギの背中の約３０箇所に乳化剤１
ｍｌを用いて皮下注射する。第２の注射後、抱合体溶液
０．５ｍｌをＰＢＳ０．５ｍｌを用いて稀釈して乳化剤
を調製する。免疫化は２週間毎に行う。採血は免疫化の
前、および第３または第４の注射を始めるまでの注射の
間の週に行う。 ペプチド抗体親和性樹脂の調製：一旦、抗ペプチド抗体
血清が使用可能となれば、次工程は親和性精製工程を行
うことである。第１工程において、ペプチド抗体親和性
樹脂を調製する。アフィーゲル１０（バイオラド社）約
１０−１２ｍｌを、冷ＰＢＳ４０ｍｌを用いて３回素早
く洗浄し、次いで冷ＰＢＳに再懸濁して全容量約２０ｍ
ｌを得る。同時に、ペプチド２ｍｇをＰＢＳ１ｍｌに溶
解し、次いで中程度に攪拌しながらアフィーゲル懸濁液
に加える。この結果得られた混合物を冷却状態で一晩穏
やかに攪拌する。翌日、０．２Ｍ溶液を調製するために
十分な１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、次いで
このゲルを冷却状態でさらに４時間攪拌する。このゲル
はＰＢＳ４０ｍｌを用いて３回洗浄後は抗体吸着が容易
である。 抗体の親和性精製：担体含有血清を３０分間５６℃で加
熱し、冷却し、次いでペプチド樹脂（これは予め準備さ
れ、かつ注入された過剰のＰＢＳを含んでいた）と混合
する。冷却状態で一晩穏やかに攪拌後、ゲル懸濁液をカ
ラムに注入し、次いで冷１Ｍ酢酸をゲル容量の２倍用
い、続いてＰＢＳをゲル容量の１倍用いて洗浄する。抗
体溶出液を６Ｎ ＮａＯＨで約ｐＨ７．０に調整し、次
いでこの結果得られた溶液を約５ｍｌにダイアフロ（Ｙ
Ｍ−３０）濃縮し、緩衝液をＰＢＳに変える。 樹脂への抗体カップリング：わずか１時間前に反応を停
止させるためにトリスを加え、次いで未使用の活性部位
を封止することにより抗体のカップリングを進めること
以外、操作は上記全く同一である。 イムノアッセイ：酵素結合イムノソルベントアッセイ、
ウエスタンブロッティング研究および免疫組織学は標準
的な慣用法を使用して行った。 上記のように選択され、次いで精製されたペプチドに対
するポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、慣用
の方法により適する放射性酵素または蛍光標識を用いて
標識化することが可能であるが、これは当業者には明ら
かであろう。本文中に記載されたペプチド及び抗体を用
いる免疫学的分析は、慣用の免疫学的方法を使用し、か
つ非標識化、結合性または非結合性抗体またはペプチド
の手段を用いることにより、体液、組織抽出物または組
織部分を包含するいずれかのタイプの生物学的試料に対
して適用するができる。抗体またはペプチドは、適する
固相、例えば支持体、例としてミクロ滴定ウエルに結合
させることができる。ＩＶ型コラーゲナーゼのための前
記抗ペプチド抗体は、自然の全酵素に対して作成された
抗体を上回る十分な利点を有する（Tryggvason, K.およ
びLiotta, L.A., 米国特許第４６７７０５８号）。第一
に、それらはＩＶ型コラーゲナーゼ（これは他の広く用
いられているメタロプロテイナーゼと同族ではない）に
特有の特定領域を認識する。これは非自明のことであ
り、かつＩＶ型コラーゲナーゼのアミノ酸配列の大部分
は図２に示されるように他のメタロプロテイナーゼと非
常に同族的であるか、または同一でさえあるということ
に関する多くの問題を克服する。表３のペプチドに対し
て作られた抗体は他のメタロプロテイナーゼとＩＶ型コ
ラーゲナーゼとを区別し、かつさらに活性化体を潜酵素
と区別し得る。この後者の特徴は、活性化酵素に対する
潜伏体の比率が病気の診断または予後における決定因子
である病的状態が存在し得るので非常に重要である。上
記の発明は、明確性および理解の目的のためにある程度
詳細に記載された。形態および細部についての種々の変
化および組合せが、本発明の範囲から逸脱することなく
なし得るということも当業者には自明であろう。特に、
本文中に記載されたペプチド阻害剤の側面（フランキン
グ）配列における変性がメタロプロテイナーゼ類の個々
のメンバーに対する安定性、活性または特異性を変え得
るということは当業者には自明である。例えば、図１０
に示される活性化結合開裂部位の左側に対する特定配列
の選択は、ＩＶ型コラーゲナーゼに比べてストロメリシ
ンまたはＩ型コラーゲナーゼを好ましく阻害するための
阻害剤を生じさせ得る。これは、前記配列のこの領域は
異なるマトリックスメタロプロテイナーゼタイプ間でい
くつかの変異性を示すからである。非臨界領域における
アミノ酸のある種の置換の選択は、ペプチドの阻害性を
十分には変えないであろうということもさらに明らかで
ある。マトリックスメタロプロテイナーゼに対して特異
的な抗体のための免疫原または抗原として使用すべき合
成ペプチドの場合において、当業者は抗体結合部位によ
る認識に関する特異的アミノ酸配列が、４ないし６個の
アミノ酸の配列［これは抗体が使用されるべき環境（例
えば人間の生物学的検体）において他のタンパク質中に
存在することは知られていない］からなるということを
理解するであろう。最後に、組換えタンパク質ペプチド
は自然にペプチドまたは合成ペプチドに比べて活性を有
し得るということは従来技術において知られている。本
発明の態様は、それ故に明らかなごとく、合成ペプチド
化学により適する発現ベクター中に具合よく挿入された
適当なＤＮＡ断片または利用し得る自然源からの単離物
を使用して調製された。いくつかの場合には、本発明の
ペプチドは従来技術においてよく知られている標準法の
変法に基づいて精製し得る。
【００２９】従来技術の記載および本開示を完全にする
目的で、本明細書においてこれまでに示した刊行物、特
許および特許願の各々は、それ故に、参照により本明細
書に編入される。
目的で、本明細書においてこれまでに示した刊行物、特
許および特許願の各々は、それ故に、参照により本明細
書に編入される。
【図１】腫瘍細胞により分泌されたヒトＩＶ型プロコラ
ーゲナーゼの全アミノ酸配列を示す。
ーゲナーゼの全アミノ酸配列を示す。
【図２】ドメインにまとめられたＩＶ型プロコラーゲナ
ーゼとプロストロメリシンとプロコラーゲナーゼＩとの
アミノ酸相同性の比較を示す。
ーゼとプロストロメリシンとプロコラーゲナーゼＩとの
アミノ酸相同性の比較を示す。
【図３】（Ａ）抗ペプチド抗体Ａ１−１７のエリザ確認
を示すグラフ。（Ｂ）抗ペプチド抗体Ａ４７２−４９０
のエリザ確認を示すグラフ。（Ｃ）競合エリザアッセイ
の結果を示すグラフ。（Ｄ）粗製およびゼラチンアフイ
ニティ精製ＩＶ型プロコラーゲナーゼのウェスタンブロ
ット。
を示すグラフ。（Ｂ）抗ペプチド抗体Ａ４７２−４９０
のエリザ確認を示すグラフ。（Ｃ）競合エリザアッセイ
の結果を示すグラフ。（Ｄ）粗製およびゼラチンアフイ
ニティ精製ＩＶ型プロコラーゲナーゼのウェスタンブロ
ット。
【図４】ＩＶ型コラーゲナーゼの基質ＩＶ型コラーゲン
に結合する該コラーゲナーゼに対するアッセイの結果を
示す。
に結合する該コラーゲナーゼに対するアッセイの結果を
示す。
【図５】合成ペプチドによるＩＶ型コラーゲナーゼ阻害
のゼラチンチモグラムを示す。
のゼラチンチモグラムを示す。
【図６】ベプチドによるＩＶ型コラーゲンへの標識ＩＶ
型コラーゲナーゼ結合の阻害の例を示す。
型コラーゲナーゼ結合の阻害の例を示す。
【図７】ゼラチンチモグラムおよびウエスタンブロッテ
ィングにより続けられたＩＶ型プロコラーゲナーゼのｐ
ＡＰＭＡ活性化に対する時間経過を示す。
ィングにより続けられたＩＶ型プロコラーゲナーゼのｐ
ＡＰＭＡ活性化に対する時間経過を示す。
【図８】ＩＶ型コラーゲン減成アッセイにより続けられ
た精製ＩＶ型コラーゲナーゼのｐＡＰＭＡ活性化に対す
る時間経過を示す。
た精製ＩＶ型コラーゲナーゼのｐＡＰＭＡ活性化に対す
る時間経過を示す。
【図９】精製酵素の直接アミノ酸配列決定法により決定
されるＩＶ型プロコラーゲナーゼの潜在および活性体の
アミノ酸配列を示す。
されるＩＶ型プロコラーゲナーゼの潜在および活性体の
アミノ酸配列を示す。
【図１０】ＩＶ型プロコラーゲナーゼのアミノ末端（残
基１−１１０）（上段）、問質プロコラーゲナーゼのア
ミノ末喘（中段）およびプロストロメリシンのアミノ末
端（下段）を示す。
基１−１１０）（上段）、問質プロコラーゲナーゼのア
ミノ末喘（中段）およびプロストロメリシンのアミノ末
端（下段）を示す。
【図１１】ペプシン消化ＩＶ型コラーゲンの精製活性化
ＩＶ型コラーゲナーゼによる切断の示された合成ペプチ
ドによる投与量依存阻害を示す。
ＩＶ型コラーゲナーゼによる切断の示された合成ペプチ
ドによる投与量依存阻害を示す。
【図１２】酵素阻害活性が試験されたペプチドを対比し
て示す。
て示す。
【図１３】活性化に際しヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼ
から切断されるアミノ末端ペプチドの８０個のアミノ酸
配列をコード化するヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼのた
めのヒトｃＤＮＡクローンの一部のヌクレオチド配列を
示す。
から切断されるアミノ末端ペプチドの８０個のアミノ酸
配列をコード化するヒトＩＶ型プロコラーゲナーゼのた
めのヒトｃＤＮＡクローンの一部のヌクレオチド配列を
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 17/00 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/64 (72)発明者 ステットラー−スティーブンソン，ウィリ アム アメリカ合衆国，メリーランド 20879, ゲイザースバーグ，ホワイト バーン コ ート 11227 (72)発明者 クルッシュ，ヘンリー アメリカ合衆国，メリーランド 20817, ベテスダ，デポール ドライブ 9704
Claims (3)
- 【請求項１】 以下の配列からなる群：ＶＡＡＨＥＦＧ
ＨＡＭＧＬＥＨＳＱ、ＶＡＡＨＥＦＧＡＡＭＧＬＥＨＳ
Ｑ、ＶＡＡＨＥＬＧＨＳＬＧＬＳＨＳＴ、ＶＡＡＨＥＩ
ＧＨＳＬＧＬＦＨＳＡ、ＶＶＡＨＥＬＴＨＡＶＴＤＹＴ
ＡＧおよびＡＡＨＥＥＩＣＴＴＮＥＧＶＭから選択され
るゼラチナーゼまたはコラーゲナーゼを阻害する精製お
よび合成ペプチド。 - 【請求項２】 ゼラチナーゼまたはコラーゲナーゼを阻
害する配列ＡＡＨＥまたはＶＡＨＥを含む請求項１記載
の精製および合成ペプチドの断片。 - 【請求項３】 担体中の請求項１または２記載のペプチ
ドである物質の組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/317,407 US5270447A (en) | 1988-05-20 | 1989-03-01 | Metalloproteinase peptides: role in diagnosis and therapy |
| US317407 | 1989-03-01 | ||
| US07/488,460 US5280106A (en) | 1988-05-20 | 1990-02-26 | Matrix metalloproteinase peptides: role in diagnosis and therapy |
| US488460 | 1990-02-26 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8240917A Division JPH09249700A (ja) | 1989-03-01 | 1996-07-24 | マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001011093A true JP2001011093A (ja) | 2001-01-16 |
| JP3252283B2 JP3252283B2 (ja) | 2002-02-04 |
Family
ID=26980933
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2504447A Expired - Fee Related JP2736821B2 (ja) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド：診断および治療における役割 |
| JP8240917A Pending JPH09249700A (ja) | 1989-03-01 | 1996-07-24 | マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド |
| JP2000132398A Expired - Fee Related JP3252283B2 (ja) | 1989-03-01 | 2000-05-01 | マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2504447A Expired - Fee Related JP2736821B2 (ja) | 1989-03-01 | 1990-03-01 | マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド：診断および治療における役割 |
| JP8240917A Pending JPH09249700A (ja) | 1989-03-01 | 1996-07-24 | マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド |
Country Status (9)
| Country | Link |
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| EP (1) | EP0462182B1 (ja) |
| JP (3) | JP2736821B2 (ja) |
| AT (1) | ATE138076T1 (ja) |
| AU (1) | AU635007B2 (ja) |
| DE (1) | DE69027024T2 (ja) |
| DK (1) | DK0462182T3 (ja) |
| ES (1) | ES2088426T3 (ja) |
| WO (1) | WO1990010228A1 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6906036B2 (en) | 2001-08-16 | 2005-06-14 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7071164B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-07-04 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-cancer and wound healing compounds |
| US7094754B2 (en) | 2001-08-16 | 2006-08-22 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-aging and wound healing compounds |
| US7148194B2 (en) | 2002-12-30 | 2006-12-12 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Method to increase fibronectin |
| US7186693B2 (en) | 2001-08-16 | 2007-03-06 | Kimberly - Clark Worldwide, Inc. | Metalloproteinase inhibitors for wound healing |
| US7189700B2 (en) | 2003-06-20 | 2007-03-13 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Anti-chrondrosarcoma compounds |
| KR101166387B1 (ko) | 2007-03-17 | 2012-07-23 | 삼성전자주식회사 | 공기조화기의 실외기 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5280106A (en) * | 1988-05-20 | 1994-01-18 | Liotta Lance A | Matrix metalloproteinase peptides: role in diagnosis and therapy |
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| US5837686A (en) * | 1991-11-25 | 1998-11-17 | Peptide Therapeutics Limited | Peptides and antibodies for treatment of rheumatoid arthritis |
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| AU5542794A (en) * | 1992-10-29 | 1994-05-24 | Miles Inc. | Diagnostic assay for latent matrix metalloproteinase no. 9 |
| US5829174A (en) * | 1994-04-08 | 1998-11-03 | Sno-Way International, Inc. | Articulated snowplow system |
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| US5759864A (en) * | 1995-06-23 | 1998-06-02 | Cedars Sinai Medical Center | Methods for reducing background binding in antibody preparations |
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