JPH11508442A

JPH11508442A - ヒト腺性カリクレイン−１（ｈＫ２）

Info

Publication number: JPH11508442A
Application number: JP9504194A
Authority: JP
Inventors: ヴィヒコ，ピルッコ
Original assignee: オリオン−ユヒテュマ・ユルキネン・オサケ・ユキテュア
Priority date: 1995-06-29
Filing date: 1996-06-28
Publication date: 1999-07-27
Also published as: GB2302874A; US6303361B1; EP0837930A1; NO976061L; GB9513281D0; AU712917B2; DE69634153D1; EP0837930B1; CA2224319A1; PL324179A1; GB2302874B; CZ417897A3; NO976061D0; WO1997001630A1; AU6227396A; PL184557B1; ATE286533T1

Abstract

(57)【要約】ヒト腺性カリクレイン−１（ｈＫ２）の新規な型がヒト前立腺癌組織ｃＤＮＡライブラリーからプレプロｈＫ２ｃＤＮＡをクローニングすることによりつくられた。このｈＫ２型はｈＫ２について前に推論された配列と、Ａｒｇ²²⁶がＴｒｐで置き換わっている点が相違している。バキュロウイルス発現ベクターを使用して、Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２を含むｈＫ２タンパク質を活性成熟タンパク質として培養基から直接的に得ることについて記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト腺性カリクレイン−１（ｈＫ２）本発明は、新規なタンパク質に関する。特に、新たに同定されたｈＫ２遺伝子によりコードされたヒト腺性カリクレイン（ｈＫ２）の新規な型およびｈＫ２によりコードされたタンパク質を活性タンパク質として得るための組換えＤＮＡ技法の使用に関する。このタンパク質には、以前から認識されているｈＫ２遺伝子であるＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２でコードされる成熟タンパク質を含む。ヒト腺性カリクレイン遺伝子類は、３種の異なるタンパク質：前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、腺性カリクレイン−１（ｈＫ２）および膵臓／腎性カリクレイン（ＫＬＫ１）をコードする遺伝子からなる。これらの遺伝子は、１９番染色体上に位置し、ＰＳＡおよびｈＫ２遺伝子は１２ｋｂの距離で1列に並んでいる（１）。ヒトＫＬＫ１のコード領域の、ヒトＰＳＡおよびＫ２遺伝子との相同性は、それぞれ７４％と７５％である。ｈＰＳＡとｈＫ２遺伝子とのコード領域は８５％の相同性を有し、同じ遺伝子のプロモーター領域は９１％の相同性を有する。ＫＬＫ１遺伝子は真のカリクレインをコードする。ＫＬＫ１はキニノゲナーゼ活性を有し、腎臓、膵臓および唾液腺において発現される（２）。Ｉｎｓｉｔｕハイブリゼイションにより、ｈＰＳＡおよびｈＫ２遺伝子は、前立腺上皮細胞中でのみ発現することが知られている。ｈＫ２とｈＰＳＡ遺伝子との類似性にかかわらず、ｍＲＮＡレベルでのｈＫ２の発現レベルは前立腺におけるｈＫ２遺伝子のそれの約１０−３０％に過ぎない（３）。ＬＮＣａｐ細胞で試験すると、ｈＫ２およびｈＰＳＡの両方についてｍＲＮＡレベルの明らかな上昇調節がアンドロゲンの存在で見られた（４）。最近の別の結果では、ｈＫ２およびｈＰＳＡの発現が以前考えられていたように前立腺特異的でないことが指摘されている。ＲＴ−ＰＣＲ後の遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・プローブでのサザンブロット分析により、前から同定されている全３種のヒトカリクレイン遺伝子がヒト子宮内膜において検知されている（５）。ｈＰＳＡは授乳期の母乳中にもイムノアッセイにより検出されている（６）。ステロイドホルモン刺激乳房組織と同様に乳房腫瘍の３０−４０％がｈＫ２を含むことがさらに見いだされている（７）。ｈＫ２遺伝子は、ヒトゲノム胎児肝ライブラリーから単離され、配列決定されている（８ａ）。このｈＫ２遺伝子の５コードエキソンのヌクレオチド配列は、ＰＳＡのような、１７アミノ酸のシグナルペプチドと７アミノ酸の活性化ペプチドを有する２６１アミノ酸プレプロタンパク質をコードことが見いだされた。ｈＫ２は、セリンプロテアーゼの典型的触媒トリアド（Ｈｉｓ４１−Ａｓｐ９６− Ｓｅｒ１８９）を有していることが知られている。ｈＫ２中のアミノ酸１８３位にアスパルテート残基が存在することは、このタンパク質のトリプシン様基質活性に適合する。ＰＳＡにおいて、キモトリプシン様活性を発揮する基となる同じ位置でのセリン残基が存在する（８）。ＰＳＡの機能はセメノゲリン血餅の解裂であるが、ｈＫ２の機能は分かっていない。血清中のＰＳＡの集中は前立腺の癌および過形成において増加するので、ＰＳＡは前立腺癌の発見および監視にマーカーとして広く用いられている（１０）。しかし、ｈＰＳＡとｈＫ２遺伝子との大きい相同性からして、ｈＫ２は精製されるに止まっている。しかも、ＰＳＡの純度は必ずしも常にはっきりしていない。このことは、ｈＰＳＡに対するポリクローナルまたモノクローナル抗体に基ずくｈＰＳＡアッセイに問題を起こす。ｈＫ２タンパク質は、ヒト前立腺癌組織ｃＤＮＡライブラリーからのｈＫ２ｃＤＮＡを発現ベクター中でクローン化し、適当な宿主細胞中でｃＤＮＡを発現することにより、ｈＰＳＡの混入なしに、現在得られている。さらに具体的には、ｈＫ２は、プレプロｈＫ２タンパク質をコードするバキュロウイルス発現ベクターを昆虫細胞で用いて、生産される（参照、実施例４および５）。そこにはｈＫ２タンパク質産生のためのバキュロウイルス発現ベクター系の使用のみが記載されているが、ポリヘドリンプロモーターの調節下での組換えオウトグラファ・カリフォルニア・ヌクレアル・ポリヘドロシス・ウイルス（ＡｃＮＰＶ）や、ヒトタンパク質の産生に普通に用いられる他の発現ベクター系も使用することができる。しかし、例えば、大腸菌細胞などの細菌細胞を形質転換するのにプレプロタンパク質をコードする発現ベクターを用いるときは、上記のバキュロウイルス発現ベクター系とは異なり、プレプロ配列が翻訳後プロセシングにより除去されないで、対応する成熟タンパク質、例えば活性成熟Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２が直接的に得られることが十分理解されるであろう。ヒト前立腺ｃＤＮＡライブラリーからのｈＫ２ｃＤＮＡのクローニングにより、ｈＫ２ｃＤＮＡは現在、以前に報告されたｈＫ２のコード配列と１塩基の相違があると同定されている。塩基７９２位でのこの相違（ＣからＴへ）はアミノ酸２２６位でのＡｒｇからＴｒｐへの変化に等しい。この観察された相違は、ｃＤＮＡクローニングおよび配列決定の過程で起きたものでなく、前に同定されていなかったｈＫ２の存在からきている。このｈＫ２の存在は、ＰＣＲを用いて、多数のヒト前立腺および白血球サンプルのゲノムＤＮＡからｈＫ２遺伝子を増幅して、確認された（実施例２）。ひとつの観点において、本発明は、Ａｒｇ²²⁶のＴｒｐへの変換によるＡｒｇ² ²⁶ −ｈＫ２と同様の配列を有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２であるタンパク質、またはＮ末および／またはＣ末の伸展を有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２であって、Ｔｒｐ²²⁶ −ｈＫ２抗体またはｈＰＳＡ抗体を結合する能力を保持するタンパク質を提供する。ただし、該タンパク質が天然発生のタンパク質であるときは、それが元から関係している他のタンパク質を実質的に含まない。これらのタンパク質は、実質的に純粋な形でのＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２に加えて、例えば実質的に純粋な形でのプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２またはプレプロＴｒｐ²²⁶− ｈＫ２を含む。この中で、Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２は、前にＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２と同定されたプロおよびプレプロ配列にＮ末で接合している。本発明の実施態様を形成する更に新規なタンパク質は、Ｎ末のジペプチド伸展Ｓｅｒ−Ａｒｇを有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２である。昆虫細胞におけるプレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２をコードするｃＤＮＡの発現によって、このＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２誘導体がＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２自体よりも得られることが分かった。これは、臨床試験の使用のために市販されている通常のｈＰＳＡイムノアッセイを用い、既知のアンチｈＰＳＡ抗体との交差活性を見ることにより検出し得るが、不活性である（実施例３参照）。本発明は、下記するような、抗原性とＴｒｐ²²⁶アミノ酸残基を保持するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２のフラグメントにさらに広がる。すべてこれらのフラグメントおよびＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２配列を有するタンパク質は、以下で使用する用語Ｔｒｐ² ²⁶ −ｈＫ２タンパク質の範囲に含まれる。別の観点において、本発明は、本発明のＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２をコードする単離ＤＮＡまたは組換えＤＮＡを提供する。好ましくは、このＤＮＡはＴｒｐ²²⁶− ｈＫ２の天然コード配列を含み、さらに好ましくは、プレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２の完全な天然コード配列を含む。この組換えＤＮＡはベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターの形で存在し得る。望ましくは、このベクターは、宿主細胞中に存在するときに、その細胞または培養基での本発明のＴｒｐ²²⁶− ｈＫ２タンパク質の産生を指向し得る発現ベクターである。上記において特に好ましい例は、バキュロウイルス発現ベクターであり、これは宿主細胞中に存在し、その細胞または培養基での本発明のＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質の産生を指向する。別の観点において、本発明は、上記の本発明のベクターを含む宿主細胞および本発明のＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質を製造する方法を提供する。この方法は、発現ベクターを含有する本発明の宿主細胞を該タンパク質が宿主細胞または培養基中で産生される条件で培養し、該タンパク質を該細胞または培養基から単離する。例えば、該細胞がプレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２の細胞における発現のためのバキュロウイルス発現ベクターを含む昆虫細胞である場合、上記のＮ末ジペプチド伸展Ｓｅｒ−Ａｒｇを有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２が培養基から精製される。この目的のための精製法には、例えばイオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過クロマトグラフィーの併用がある（実施例５参照）。このようにして得たＴｒｐ²²⁶ −ｈＫ２誘導体は、タンパク質工学の当業者によく知られた技術を用いて、続いて容易にＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２に変換し得る。もし、上記のバキュロウイルス発現系において、プレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２配列が、分泌成熟Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２をもたらすために昆虫細胞においてプログレシング可能な代用のＮ末配列に接合したプレプロＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２またはＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２をコードする配列によって置換されると、活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２は、例えばイオン交換クロマトグラフィーとゲル濾過クロマトグラフィーの併用を含む精製法により宿主昆虫細胞の培養基から単離され得る（実施例５参照）。このように、元から関係する他のタンパク質を実質的に含有しない活性Ａｒｇ²²⁶ −ｈＫ２、および実質的に純粋な形における特に活性のＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２が提供される。活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２とは、成熟Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２配列を有し、合成色素産生性ポリペプチド基質Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｌを加水分解し得るタンパク質を意味する。下記の実施例５のアッセイ法ではｐＮＡがパラニトロアニリンである。このように最初に得た活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２は続いて抗原性フラグメントに消化される。Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２またはその抗原性フラグメントの単離はタンパク質を標識してなされる。イムノアッセイなどの利用において、本明細書のタンパク質は標識タンパク質に通常的に用いられている標識で処置し得る。例えば、放射標識、酵素標識（例えば、アルカリポスファターゼ）、蛍光標識（例えば、フルオレセンまたはローダミン）、ランタニドまたはビオチン（ペルオキシダオーゼに結合するアヴィジンまたはストレプタヴィジンにより検出され得る）により標識される。本発明のタンパク質が、標準対照として用いられ、あるいは適当なイムノアッセイまたはイムノ組織化学アッセイにおけるタンパク質に対する抗体活性の試験に用いられることは、十分理解されるであろう。このような試験は、例えばｈＰＳＡ、Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２またはＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２に対する抗体の交差活性の試験を含む。非標識型の本発明のタンパク質は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生のための免疫原としての用途がある。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の産生の方法は抗体産生に通常知られている方法と同じである。この目的のために、タンパク質は、好ましくは免疫組成物においてフロインドの完全アジュバントなどのアジュバントと結合される。Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２またはＡｒｇ²²⁶ − ｈＫ２に対するモノクローナル抗体産生の適当な方法は、例えば、ヒト前立腺酸ホスファターゼに対するモノクローナル抗体を得るためのClinical Chemistry(1 987)33、103-107記載の方法と同じであり、またはヒト前立腺特異抗原に対するモノクローナル抗体を得るためのClinical Chemistry(1990)26,92-95記載の方法と同様である。このようにして得た抗体は、通常の方法、例えば放射標識、酵素標識、蛍光標識ランタニドまたはビオチンで標識され得る。モノクローナル抗体産生の免疫原としてＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２を用い、ついで精製Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２と市販の精製ｈＰＳＡによるハイブリドーマをスクリーニングして、モノクローナル抗体を選別できる。これは、ヒト体液サンプルにおいてＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２と結合するが、ｈＰＳＡとは結合できないので、診断目的のために特に価値がある。このような方法においてＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２の使用またはＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２とＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２との併用も免疫原になし得ることは、十分に理解されるであろう。スクリーニング法において、Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２に加えて、または代わりに、Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２を使用できる。Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２とＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２の両者を用いる抗体スクリーニング法は、Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２とＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２とを識別し得る非ｈＰＳＡ結合抗体を選択するように設計され得る。他の観点において、本発明は、Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２および／またはＡｒｇ²²⁶− ｈＫ２に結合し得るが、ｈＰＳＡとは結合し得ない抗体を標識または非標識型で提供する。さらにこのような抗体を産生し得るハイブリドーマを提供する。本発明の抗体の使用によって、Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２および／またはＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２が体液などのサンプル中に特異的に検出され得る。このような抗体は、前立腺疾患を診断するのに用いる新しい重要な手段を提供する。本明細書での用語“抗体”は、完全な抗体分子およびその抗原結合フラグメント、例えばＦａｂやＦ（ａｂ'）₂フラグメントなどを含むと理解されるべきである。ヒト抗体およびそのフラグメントも用語“抗体”に含まれる。新たに同定されたＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２遺伝子について同型接合または異型接合の患者において、Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質が前立腺の癌や過形成などの前立腺疾患のマーカーとして使用されることは、十分に理解されるであろう。さらに、本発明は、Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２遺伝子について同型接合または異型接合の患者について前立腺疾患を診断する方法を提供する。それは、前立腺組織またはヒト体液サンプル中の該遺伝子によりコードされるタンパク質の発現または濃度に関する変化を測定することを含む。以下の実施例は、下記の図１および２と共に本発明を説明する。図１ａ−１ｄ：組換えｈＫ２タンパク質の銀ステイン・ポリアクリルアミドゲル電気泳動および免疫ブロット法。純粋の組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質（欄１）および市販のｈＰＳＡ（欄２）を天然（１ａ）および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１ｂ）において銀着色した。精液から精製したｈＰＳＡに対する家兎ポリクローナル抗体を、天然ＰＡＧＥ（１ｃ）および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１ｄ）上に、組換えＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２（欄１）、組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２（欄２）および市販のｈＰＳＡ（欄３）を検出するために、使用した。図２Ａおよび２Ｂ：時間分解蛍光イムノアッセイ（１Ａ）およびＩＲＭＡ（１Ｂ）による組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２および市販のｈＰＳＡの定量的回収。純粋のＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２および市販ｈＰＳＡを、キットのウシ血清アルブミン含有ゼロ緩衝液に１、１０、２５、５０、１００および５００μｌの濃度で溶解した。これらの濃度でｈＰＳＡについて時間分解蛍光イムノアッセイおよびＩＲＭＡキットにより検定した。データは３−５回の測定からの平均値±ＳＤである。実施例１：ヒト前立腺癌組織ｃＤＮＡライブラリーからのｈＫ２−ｃＤＮＡのクローニングｈＫ２ｃＤＮＡをヒト前立腺含有組織ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。このＰＣＲ増幅においてＮ末オリゴマーは５'−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＧＡＣＣＴＧＧＴＴＣＴＣ−３'であり、これはＳｍａＩおよびＢｇｌＩＩ制限部位を含んでいた。Ｃ末オリゴマーは５'−ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＧＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＧＡＴＧＧＴ−３'であり、部分的ｈＫ２配列に加えてＸｂａｌ制限部位を含んでいた。ジデオキシ法（Sanger et al .Proc.Natl.Acad．Sci USA(1977)74,5463）によるベクター（Ｉnvitrogen）中のｈＫ２配列の確認後、プレプロｈＫ２ｃＤＮＡを転移ベクターｐＶＬ１３９２（Ｉnvitrogen）のＢｇｌＩＩ／ＸｂａＩ部位に挿入した。このｃＤＮＡのコード配列は、Ｓchedlichら（８ａ）により前に報告されていたｈＫ２についてのヒトＤＮＡコード配列と異なる。そのコード位置792はＣよりもむしろＴであった。実施例２：ヒト前立腺組織および白血球サンプル中のｈＫ２遺伝子の配列解析−Ａｒｇ２２６Ｔｒｐ−多形性の検定ゲノムＤＮＡは、前立腺切開、生検または尿道移転切除により得た前立腺組織から、およびヒト白血球から分離した。女性および若い男性の白血球を対照物として用いた。特殊なオリゴヌクレオチドをｈＫ２遺伝子のＰＣＲ増幅および配列決定に使用した。増幅において、Ｎ末オリゴマーは５'−ＴＴＣＴＣＡＣＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＣＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＴＣＡ−３'であり、ビオチン標識Ｃ末オリゴマーは５'−ＧＴＧＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣＡＣＴＣＡ−３'であった。ＰＣＲ直接配列決定において、フルオレセイン・アミジト標識オリゴマーは５'−ＡＴＣＡＴＧＧＧＧＣＣＣＴＧＡＧＣＣ−３'であった。塩基位置７９２（ＣまたはＴ）に変化がみられた。前立腺疾患の３６人の患者の組織および白血球標本からの配列決定されたＤＮＡサンプルは、この塩基位置で多形性が起きていることを示した（表１ａ）。この限定された標本において、前立腺癌患者２４人中１３人が異型接合体ＣＴ、１０人が同型接合体ＣＣ、および１人が同型接合体であった。良性前立腺過形成標本１２中８が異型接合体ＣＴ、および４が同型接合体ＣＣであった。同じ変化が組織および白血球標本で検知された。対照において、女性白血球ＤＮＡ標本１０中５が異型接合体ＣＴ,４が同型接合体ＣＣ、および１が同型接合体ＴＴであり、若い男性白血球ＤＮＡ標本６中４が異型接合体ＣＴおよび２が同型接合体ＣＣであった。Ａｒｇ²²⁶対立遺伝子の頻度は、前立腺癌患者で６９％（Ｎ＝２４）,良性前立腺過形成患者で６７％（Ｎ＝１２）、および対照で６６％（Ｎ＝１６）であり、Ｔｒｐ²²⁶対立遺伝子の頻度は、それぞれ３１％、３３％および３４％であった（表１ｂ）。実施例３：組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２の定量的回収精製組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２のタンパク質濃度をＬowryらの方法（J.Biol.Ch em.1951;193:265）により標準としてウシ血清アルブミン（Ｂio−Ｒad,Ｒichmon d,ＣＡ）で調べた。組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２の回収を時間分割蛍光イムノアッセイ（ＤＥＬＦＩＡＰＳＡキット、Ｗallac、フインランド）およびＩＲＭＡ（Ｔandem（商標）−ＲＰＳＡキット、Ｈybritech、ベルギー）でさらに測定した。この検定において、組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２および市販ＰＳＡをウシ血清アルブミン含有イムノアッセイキットのゼロ標準液で希釈した。ｈＰＳＡ検出の蛍光イムノアッセイにおけるＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２および市販ｈＰＳＡの回収は、蛍光イムノアッセイの検量体に比較すると、それぞれ１２８± １３％（平均±ＳＤ,Ｎ＝２０）および１０７±２０％（平均±ＳＤ,ｎ＝２０）であった。ｈＰＳＡ検出ＩＲＭＡにおいて調べたときの回収は、ＩＲＭＡキットの検量体に比較すると、それぞれ１１０±１４％（平均±ＳＤ,ｎ＝１５）および９８±６％（平均±ＳＤ,ｎ＝１５）であった。血清ｈＰＳＡ濃度の測定を意図する検定は、ｈＰＳＡに特異的でなく、加えた不活性ｈＫ２の１００％を検出した。活性組換えｈＫ２がｈＰＳＡについての市販蛍光イムノアッセイおよびＩＲＭＡにおいて等しく検出可能であった。実施例４：バキュロウイルス発現ベクターにおけるプレプロｈＫ２ｃＤＮＡのクローニングおよび昆虫細胞における発現同じクローニング法が、Vihko et al．Proc.Natl.Acad.Sci USA(1993)90,799- 803に記載のように、ＡｃＮＰＶＤＮＡ（Ｉnvitrogen）および実施例１のように得たプレプロｈＫ２ｃＤＮＡ含有ＰＶＬ１３９２転移ベクターの共トランスフェクションで出発して、Ｓpodoptera frugiperda（Ｓｆ９）細胞（Ｉnvitroge n）になされる。組換えＡｃＮＰＶＤＮＡ含有昆虫細胞の培養物は、ｈＰＳＡ蛍光イムノアッセイキット（ＤＥＬＦＩＡ,Ｗallac）を用いてｈＰＳＡモノクローナル抗体に結合し得る分泌タンパク質について検定した。プレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２またはプレプロＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２のいずれかのコード配列を含有する昆虫細胞は、プレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２コード配列により高い発現が見られたが、ｈＰＳＡアッセイにより検出可能な培養タンパク質中に分泌するのが認められた。実施例５：組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質および活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２の精製組換えウイルス感染からの収穫培地をペリコン・カセット系（切除、１０ｋＤａ,ミリポア）で濃縮し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５.５）中に透析した。濃縮物をカチオン交換カラム（Ｓ−Ｓepharose ＨＰ３５／１００,Ｐh armacia）に充填した。水洗後、ｈＫ２タンパク質をカラムから０.１−０.２５ＭのＮａＣｌの直線塩勾配液で溶出した。ポリクローナルｈＰＳＡ抗体（細長い染み）と免疫活性であるこれらのフラクションを、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｓephacryl Ｓ−７５,Ｐharmacia）のために濃縮し（Ａmicon），１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７.０の１０ｍＭトリス−ＨＣｌで溶出した。ｈＫ２含有フラクションを集め、カチオン交換クロマトグラフィー（Ｍono−Ｓ,Ｐharmacia ）のために２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中で透析した。ｈＫ２タンパク質をカラムから直線ＮａＣｌ勾配液（０−６０ｍＭ）で溶出した。Ｓ−セファロースおよびセファクリルＳ−７５カラムをＢｉｏＰｉｌｏｔに、モノ−ＳカラムをＦＰＬＣ自動クロマトグラフィー系（Ｐharmacia）に接続した。得た組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質の純度は、ＳＯＳ−ＰＡＧＥ、天然ＰＡＧＥおよび銀ステインまたはイムノステイン法による等電点収束により調べた（１２）。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１ｂおよび１ｄ）により、組換えＴｒｐ²²⁶ −ｈＫ２タンパク質の分子量（Ｍｒ）が約３３ｋＤａ（１２）であり、市販ｈＰＳＡが３４ｋＤａであることが分かった。組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質をイオン・スプレイ・マススペクトロメトリーで分析すると、測定された平均Ｍｒは２７．４ｋＤａであった。銀ステイン天然ＰＡＧＥの場合（図１ａ、１ｃ）、組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質は３７０ｋＤａに１バンドを示し、市販ｈＰＳＡは７０と１４０ｋＤＡの間に４バンドを示した。ｈＰＳＡに見られる多相性は、ジスルフィド橋で結びつけられている２または４のポリペプチド鎖へのタンパク質の内部タンパク質分解性開裂によると思われた（１３）。Ｎ末アミノ酸解析は、翻訳後プロセシングが昆虫細胞においてプレプロＴｒｐ²²⁶ −ｈＫ２のプレプロ配列を完全に除去しなかったことを示した。開裂はＡｒｇ−１とＩｌｅ−１との間よりもむしろＧｌｎとＳｅｒ−２との間に起きた。組換えｈＫ２のこの型は、下記のアッセイ法を用いて合成ポリペプチドで検定すると、不活性であることが分かった。ｈＫ２加水分解アッセイ法Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ｐＮＡ・２ＨＣｌおよびＭｅＯ−Ｓｕｃ− Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−ｐＮＡ−ＨＣｌの加水分解（Ｃhromogenix ＡＢ）を最終濃度１ｍＭで４０５ｎｍで測定した。反応は３７０℃で行われ、ｈＫ２タンパク質含有の１００ｍＭＮａＣｌでの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７.８）２００ｍｌに色素産生性基質を加えることで始めた。１時間後に０．６Ｍ酢酸８００ｍｌを加えて反応を停止し、反応速度（ｍｌにつき形成したｎｍｏｌｐＮＡ）をｐＮＡの標準曲線から計算した。血清中において、ＰＳＡがα１−アンチキモトリプシンとの複合体として圧倒的多数で存在する（１５）。α１−アンチキモトリプシンおよびα１−アンチトリプシンなどのセリンプロテアーゼ阻害剤は、プロテイナーゼの活性部位と常に反応する（１６）。しかし、上記のように得られた組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質はこれらのセルピン類のいずれとも複合しないことが分かった。上記の精製法は培養基からＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２を回収するのにも適用される。この手段により、ポリヘドリンプロモータと操作可能的に結合したＡｃＮＰＶベクター中のプレプロＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２コード配列を含む昆虫細胞が、トリプシン様活性を有する活性ｈＫ２タンパク質を産生することが示された。回収Ａｒｇ²²⁶ −ｈＫ２タンパク質の免疫ステイン天然ＰＡＧＥは、組換えＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２タンパク質に比較すると、異なる形態を示した（図１ｂおよび１ｃ）。以上に説明したように、上記方法で得た精製組換えｈＫ２タンパク質および精製成熟Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２、例えば上記タイプのＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２誘導体をさらにプロセシングして得た成熟Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２は、モノクローナル抗体産生ための抗原として使用することができる。例えば、Hoyhtya et al in Clin．Chem. (1987)33,103-107に記載の方法に従い、モノクローナル抗体産生のために成熟Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２または成熟Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２を用い、市販の精製ｈＰＳＡを加えてＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２およびＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２の一方または両方とのハイブリドーマを選別して、人体サンプルを含むサンプル、例えばヒト前立腺組織からのサンプル中のｈＫ２をｈＰＳＡと識別し得るモノクローナル抗体を得ることができる。この抗体はVihko et al.Clinical Chemistry(1990)26,92-95に記載のように、望ましくはＥｕ原子で標識され得る。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年９月２５日【補正内容】請求の範囲１．Ａｒｇ²²⁶のＴｒｐへの変換によるＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２と同様の配列を有するヒト腺性カリクレイン−１（Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２）であるタンパク質、またはＮ末および／またはＣ末の伸展を有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２であって、Ｔｒｐ²²⁶ −ｈＫ２抗体またはヒト前立腺特異抗原抗体を結合する能力を保持するタンパク質（ただし、該タンパク質が天然発生のタンパク質であるときは、それが元から関係している他のタンパク質を実質的に含まない）。２．Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２がＮ末においてプレプロＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２のプローまたはプレプロー配列に結合している、プロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２またはプレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２から選択される、請求項１のタンパク質。３．Ｎ末ジペプチド伸展Ｓｅｒ−Ａｒｇを有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２である、請求項１のタンパク質。４．純粋な形であるＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２。５．Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２のＴｒｐ²²⁶アミノ酸残基を保持する請求項１から４のいずれかのタンパク質（ただし、該タンパク質が天然発生のタンパク質であるときは、それが元から関係している他のタンパク質を実質的に含まない）の抗原性フラグメント。６．請求項１から５のいずれかのタンパク質をコードする単離ＤＮＡ。７．請求項１から５のいずれかのタンパク質をコードする組換えＤＮＡ。８．ベクターの形態中にある、請求項７の組換えＤＮＡ。９．請求項１から５のいずれかのタンパク質のコード配列が昆虫細胞において該コード配列の発現を指向し得るプロモーター配列と操作可能的に連結している発現ベクターである、請求項８のベクター。１０．請求項１から５のいずれかのタンパク質のコード配列が昆虫細胞において該コード配列の発現を指向し得るプロモーター配列と操作可能的に連結しているバキュロウイルス発現ベクターである、請求項９の発現ベクター。１１．昆虫細胞においてプレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２の発現を指向し得るプロモーターの調節下にプレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２のコード配列を含む、請求項１０のバキュロウイルス発現ベクター。１２．プレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２のコード配列がポリヘドリンプロモーターの調節下にある組換えＡｃＮＰＶである、請求項１１のバキュロウイルス発現ベクター。１３．請求項８から１２のいずれかのベクターを含む宿主細胞。１４．請求項９から１２のいずれかの発現ベクターを含有する培養宿主細胞を該タンパク質が宿主細胞または培養基中で産生される条件下に培養し、次いで該タンパク質を該細胞または培養基から単離することを含む、請求項１から５のタンパク質を調製する方法。１５．請求項１１または請求項１２のバキュロウイルス発現ベクター含有の昆虫細胞を用い、Ｎ末ジペプチド伸展Ｓｅｒ−Ａｒｇを有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２を培養基から単離する、請求項１４の方法。１６．該単離法がイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む、請求項１５の方法。１７．請求項１５または請求項１６の方法を実施し、次いで該Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２誘導体をＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２に転換することを含む、Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２を調製する方法。１８．該タンパク質と結合し得る抗体を取得するための免疫原としての請求項１から５のいずれかのタンパク質の使用。１９．タンパク質と結合し得るモノクローナル抗体を取得するための免疫原としての請求項１から５のいずれかのタンパク質の使用。２０．該抗体を標識することをさらに含む、請求項１８または請求項１９のタンパク質の使用。２１．標識されている請求項１から５のいずれかのタンパク質。２２．イムノアッセイまたはイムノ組織化学アッセイにおいて、標準参照物としての、または該タンパク質に対する抗体活性を調べるための、請求項１から５または２１のいずれかのタンパク質の使用。２３．前立腺組織またはヒト体液においてＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２遺伝子によりコードされたタンパク質の発現変化または濃度変化を測定することを含む、患者における前立腺疾患を診断する方法。２４．Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２と結合するが、ｈＰＳＡと結合し得ない抗体。２５．標識された請求項２４の抗体。２６．サンプル中のＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２を検出するための請求項２４または請求項２５の抗体の使用。２７．請求項２４のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．Ａｒｇ²²⁶のＴｒｐへの変換によるＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２と同様の配列を有するヒト腺性カリクレイン−１（Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２）であるタンパク質、またはＮ末および／またはＣ末の伸展を有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２であって、Ｔｒｐ²²⁶ −ｈＫ２抗体またはヒト前立腺特異抗原抗体を結合する能力を保持するタンパク質（ただし、該タンパク質が天然発生のタンパク質であるときは、それが元から関係している他のタンパク質を実質的に含まない）。２．Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２がＮ末においてプレプロＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２のプロ−またはプレプロ−配列に結合している、プロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２またはプレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２から選択される、請求項１のタンパク質。３．Ｎ末ジペプチド伸展Ｓｅｒ−Ａｒｇを有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２である請求項１のタンパク質。４．実質的に純粋な形であるＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２。５．Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２のＴｒｐ²²⁶アミノ酸残基を保持する請求項１から４のいずれかのタンパク質（ただし、該タンパク質が天然発生のタンパク質であるときは、それが元から関係している他のタンパク質を実質的に含まない）の抗原性フラグメント。６．請求項１から５のいずれかのタンパク質をコードする単離ＤＮＡ。７．請求項１から５のいずれかのタンパク質をコードする組換えＤＮＡ。８．ベクターの形態中にある、請求項７の組換えＤＮＡ。９．請求項１から５のいずれかのタンパク質のコード配列が昆虫細胞において該コード配列の発現を指向し得るプロモーター配列と操作可能的に連結している発現ベクターである、請求項８のベクター。１０．請求項１から５のいずれかのタンパク質のコード配列が昆虫細胞において該コード配列の発現を指向し得るプロモーター配列と操作可能的に連結しているバキュロウイルス発現ベクターである、請求項９の発現ベクター。１１．昆虫細胞においてプレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２の発現を指向し得るプロモーターの調節下にプレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２のコード配列を含む、請求項１０のバキュロウイルス発現ベクター。１２．プレプロＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２のコード配列がポリヘドリンプロモーターの調節下にある組換えＡｃＮＰＶである、請求項１１のバキュロウイルス発現ベクター。１３．請求項８から１２のいずれかのベクターを含む宿主細胞。１４．請求項９から１２のいずれかの発現ベクターを含有する培養宿主細胞を、該タンパク質が宿主細胞または培養基中で産生される条件下に培養し、次いで該タンパク質を該細胞または培養基から単離することを含む、請求項１から５のタンパク質を調製する方法。１５．請求項１１または請求項１２のバキュロウイルス発現ベクター含有の昆虫細胞を用い、Ｎ末ジペプチド伸展Ｓｅｒ−Ａｒｇを有するＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２を培養基から単離する、請求項１４の方法。１６．該単離法がイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む、請求項１５の方法。１７．請求項１５または請求項１６の方法を実施し、次いで該Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２誘導体をＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２に転換することを含む、Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２を調製する方法。１８．該タンパク質と結合し得る抗体を取得するための免疫原としての請求項１から５のいずれかのタンパク質の使用。１９．タンパク質と結合し得るモノクローナル抗体を取得するための免疫原としての請求項１から５のいずれかのタンパク質の使用。２０．該抗体を標識することをさらに含む、請求項１８または請求項１９のタンパク質の使用。２１．標識されている請求項１から５のいずれかのタンパク質。２２．イムノアッセイまたはイムノ組織化学アッセイにおいて、標準参照物としての、または該タンパク質に対する抗体活性を調べるための、請求項１から５または２１のいずれかのタンパク質の使用。２３．前立腺組織またはヒト体液においてＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２遺伝子によりコードされたタンパク質の発現変化または濃度変化を測定することを含む、該遺伝子の同型接合または異型接合の患者における前立腺疾患を診断する方法。２４．分泌された活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２を得るために、プレプロＴｒｐ²²⁶− ｈＫ２をコードする配列が、昆虫細胞中でプロセシングし得る代替Ｎ末配列と連結しているプレプロＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２またはＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２をコードする配列により置換されている、請求項１１または請求項１２のバキュロウイルス発現ベクター。２５．請求項２４のバキュロウイルス発現ベクターを含む昆虫細胞。２６．活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２が培養基中に産生される条件下に請求項２５の昆虫細胞を培養し、次いで該培養基から活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２を単離することを含む、活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２を調製する方法。２７．該単離法がイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む、請求項２５の方法。２８．Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２の抗原性フラグメントを形成し、次いで単離することをさらに含む、請求項２６または２７の方法。２９．Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２またはその抗原性フラグメントを標識することをさらに含む、請求項２６から２８のいずれかの方法。３０．元から関係している他のタンパク質を実質的に含まない請求項２６の方法により取得され得る活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２。３１．実質的に純粋な形の活性Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２。３２．標識された請求項３０または請求項３１のＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２。３３．該タンパク質と結合し得る抗体を取得するため免疫原としての請求項３０または請求項３１のＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２の使用。３４．該タンパク質と結合し得るモノクローナル抗体を取得するための免疫原としての請求項３０または請求項３１のＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２の使用。３５．該抗体を標識することをさらに含む、請求項３３または請求項３４のＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２の使用。３６．イムノアッセイまたはイムノ組織化学アッセイにおいて、標準参照物としての、または該タンパク質に対する抗体活性を調べるための、請求項３０から３２のいずれかのＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２の使用。３７．Ｔｒｐ²²⁶−ｈＫ２と結合するが、ｈＰＳＡと結合し得ない抗体。３８．標識された請求項３７の抗体。３９．サンプル中のＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２を検出するための請求項３７または請求項３８の抗体の使用。４０．請求項３７のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ。４１．Ａｒｇ²²⁶−ｈＫ２および／またはＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２と結合するが、ｈＰＳＡと結合し得ない抗体。４２．標識された請求項４１の抗体。４３．サンプル中のＡｒｇ²²⁶−ｈＫ２および／またはＴｒｐ²²⁶−ｈＫ２を検出するための、請求項４１または請求項４２の抗体の使用。４４．請求項４１のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマ。