JP4205738B2 - 安定hk2ポリペプチド変異体 - Google Patents
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Description
腺系カリクレインはセリンプロテアーゼのサブグループであって、特異的なポリペプチド前駆体のその生物活性形態に至る後翻訳プロセシングに関与するサブグループである。ヒトにおいて、このファミリーのうちの3つの構成員が同定され、そしてその特性の一部が特性決定されている(Clements, Endoc. Rev., 10, 343 (1989) ; Clements, Mol. Cell Endo., 99, 1 (1994) ; Jones らActa Endoc., 127, 481 (1992)) 。hKLK1遺伝子は組織カリクレインタンパク質hK1をコードし、hKLK2遺伝子は前立腺特異的腺系カリクレインタンパク質をコードし、そしてhKLK3遺伝子は前立腺特異的抗原タンパク質hK3(PSA) をコードする。mRNAのノーザンブロット分析はhK2及びPSA の双方がヒト前立腺において主として発現されることを示し、一方hK1の発現は膵臓、顎下腺、腎臓及びその他の非前立腺組織において見い出されている(Chapdelineら、FEBS Lett. 236, 205 (1988) ; YoungらBiochem. 31, 818 (1992))。
発明の概要
本発明は単離精製されたプレ−プロ又はプロhK2ポリペプチド変異体を提供する。「精製」なる語は以下に記載の手順を参照することにより理解される。本発明のプレ−プロ又はプロhK2ポリペプチド変異体は対応の野生型hK2ポリペプチドと比較して、少なくとも1個のアミノ酸置換を有する。更に、プレ−プロ又はプロhK2ポリペプチド変異体は対応の野生型hK2ポリペプチドよりも精製に対して安定である。本発明の好適な態様はSEQ ID NO : 3又はSEQ ID NO : 5を有する単離された均質hK2ポリペプチド変異体を含む。
発明の詳細な説明
PSA に対するhK2の高度なアミノ酸配列同一性、並びにhK2及びPSA の双方の発現が本質的に前立腺に制約されるという事実は、双方のタンパク質の血清濃度の測定が前立腺癌(pCa)の診断及びモニターにおいて有用でありうることを示唆する。最近、pphK2が細菌において発現されている(Saediら、Mol. Cell. Endoc., 109, 237(1995))。細菌由来のpphK2はhK2上の非コンホメーション依存性エピトープに対する抗体を作製するのに利用できうる。しかしながら、hK2の生合成に関与する工程を見きわめるため、及びhK2の完全にプロセシングされ、且つ分泌された形態に対して特異的な抗体を得るためには、哺乳動物細胞におけるhK2の発現が必須である。
(a)固体表層に付加できる一定量の抗−hK2抗体を用意する;
(b)hK2を含んで成る生理学的流体サンプルを検出可能なラベルを含んで成る既知量のhK2ポリペプチドと混合し、混合サンプルを作る;
(c)前記抗体を前記混合サンプルと、前記抗体と前記hK2との間で抗体−hK2複合体が形成し、且つ前記抗体と前記ラベル化ポリペプチドとの間で抗体−ラベル化ポリペプチド複合体が形成されるよう、免疫学的反応が起きるのに十分な時間接触させる;
(d)hK2に結合した抗体及びラベル化ポリペプチドに結合した抗体を前記混合サンプルから分離させる;
(e)前記固体表層上の抗体に結合した又は前記複合サンプルの中に残っているラベル化ポリペプチドのいづれかの存在又は量を検出又は測定する;そして
(f)工程(e)における結果から、前記サンプル中の前記hK2の存在又は量を決定する。
実施例1
材料及び方法
哺乳動物hK2発現ベクターの構築
図2に示す全プレプロ−hK2(pphK2)をコードするcDNA(長さ約820bp)(pphK2転写体の開始部位に対し、ヌクレオチド#40〜#858)を、hK2特異性オリゴヌクレオチドプライマーの対
(5'ACGCGGATCCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCT3'SEQ ID NO : 8及び
5'ACAGCTGCAGTTTACTAGAGGTAGGGGTGGGAC3' SEQ ID NO : 9)
による逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)を利用してヒトBPH組織のRNA から合成した。このcDNAは5’及び3’末端(pphK2センス配列に対し)がBamHI及び PstI配列のそれぞれで包囲されるように作製した。次にこのcDNAをアガロースゲル電気泳動により精製し、そしてBamHI及び PstI制限酵素で消化した。制限処理したcDNAをBamHI− PstI消化pVL1393 プラスミドベクターとライゲーションし、そしてE.コリHB101 株に形質転換した。pphK2cDNA/pVL1393 プラスミドベクターを有するE.コリを選定した。pphK2含有インサートを配列決定した。プラスミドpphK2cDNA/pVL1393をE.コリの中で大量生産し、そしてCsCl勾配超遠心分離により精製した。
A(5'ATATGGATCCATATGTCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCTCCA3') (SEQ ID NO : 10)及び
B(5'ATATGGATCCTCAGGGGTTGGCTGCGATGGT3')(SEQ ID NO : 11)
並びにpphK2含有プラスミドpVL1393 (Dr. Young, Mayo Clinic より贈程)を鋳型として用いるPCR により作製した。PCR 生成物をTA−クローニングベクター(Invitrogen Corp., San Diego, CA)に挿入し、そして全インサートのDNA を配列決定した。
組換クローンの作製
AV12−664(ATCC CRL−9595) 、シリアンハムスターにおけるアデノウィルス誘導腫瘍に由来する細胞系及びDU145 細胞を10%の胎児血清(D10F) の添加したダルベッコ改良イーグル培地(高グルコース)の中で培養した。PC3細胞を10%の胎児牛血清を含む最少イーグル培地の中で培養した。AV12細胞をリン酸カルシウム法(Maniatisら前掲(1989))を利用し、hK2発現ベクターでトランスフェクションした。3日後、トランスフェクション細胞をD10F+200nM のメトトレキセート(MTX) の中に懸濁した。薬剤耐性クローン細胞を2〜3週間後に単離し、そしてその使用培地をウェスタンブロットにより分析した。PC3及びDU145 細胞をリポフェクタミン(Gibco−BRL, Gaithersburg, MD)を用いるhK2哺乳類発現ベクターによりトランスフェクションし、そしてクローン(PC3−hK2及び DU145−hK2)を 400μg/mlのG418を含む培地で選別した。
タンパク質の精製及び配列決定
AV12−hK2クローンをD10F+200nM のMTX の中で増殖させた。約60%の集密度において、細胞をハンクバランス塩溶液で洗い、そして無血清HH4培地に再懸濁した。無血清培地を添加して7日後に消費培地を回収し、そして−20℃で保存した。タンパク質を精製するため、無血清消費培地を濃縮し、そして50mMの炭酸水素ナトリウムpH8と交換した。サンプルを 0.2μのフィルターで濾過し、そしてTSK DEAE−5PW HPLC カラム21mm×150mm に5ml/分の流速で直接汲み入れた。バッファーAは50mMの炭酸水素ナトリウム pH7.9を含み、そしてバッファーBは50mMの炭酸水素ナトリウムと 0.5MのNaCl pH7.6を含んだ。溶出プロフィールは35分にわたる0〜50%のバッファーBの勾配;35〜40分にわたる50〜100 %のバッファーBの勾配;及び5分間の 100%のBでのインクラチック溶出、それに次ぐバッファーAでの再平衡化により展開させた。流速は全体を通じて5ml/分とした。上記手順において、硼酸バッファーが有意差を伴うことなく炭酸水素バッファーを代用しうる。
モノクローナル抗体の製造
A/Jマウスに、1日目に完全フロインドアジュバント(CFA) 中の50μlの phK2を腹腔内注射し、14日目に不完全フロインドアジュバント(IFA) 中の25μgの phK2を腹腔内注射し、そして28日目にPBS 中の25μgの phK2を腹腔内注射した。融合の3日前にマウスをPBV 中の10μgの phK2の静脈内注射でブースティングした。マウスを殺し、そして単一細胞懸濁物を脾臓から調製した。免疫B細胞を当業界周知の技術を利用してP3.653ミエローマ細胞と融合させた。クローンをELISA によりスクリーニングし、そしてhK2v217及び phK2v217に対する上清液の反応性及びPSA との最少限の反応性に基づき選別した。このような基準により選定した2種のクローン、即ちクローンHK1G464 及びHK1G586 をFACStar plusセルソーターを用いてサブクローニングし、単一細胞をマウスの脾臓支持細胞層の上に載せた。サブクローンHK1G464.3 及びHK1G586.1 を更なる研究のために用いた。
ELISA アッセイ
乾燥式ELISA 方式を、クローンの無血清消費培地中及びhK2精製の際に集めた画分中のhK2を測定するために用いた。マイクロタイタープレート(Becton Dickinson Labware, NJ) に50μlの消費培地又はカラム画分を37℃で一夜かけてコーティングした。そのウェルを PBS+0.1 %のTween 20 (PBST) で洗い、そして50μlの第一抗体と1時間インキュベーションした。そのウェルを再び PBS+Tで洗い、そして37℃で1時間西洋ワサビペルオキシダーゼにカップリングした50μlのヤギ抗マウス−IgG 又はヤギ抗ウサギ−IgG Fc抗体(1:500, Jackson Immunosearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) とインキュベーションした。ウェルをPBSTで洗い、O−フェニレンジアミン二塩酸塩(OPD, Sigma, MO) と5分間インキュベーションし、そして比色反応をELISA リーダー(Biotek Instruments, Inc., モデルEL310, VT)でA490 にて測定した。サンプルは全て二重測定でアッセイした。ベクターのみでトランスフェクションしたAV12細胞由来の無血清消費培地をネガティブコントロールとして使用した。
ウェスタンブロットアッセイ
ウェスタンブロットアッセイは標準の手順を利用して実施した。無血清消費培地をCentricon 10 (Amicon, Inc., Bevely, MA) を用いて10倍濃縮し、そして12%のゲル(Bio−Rad, Inc., Melville, NY)を用いて SDS/PAGEにかけた。分析目的のため、 SDS/PAGEは8〜25%勾配ゲルを用いてPharmacia PhastSystem で実施した。電気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、そしてPBS 中の2%の脱脂粉乳で4℃にて一夜ブロッキングした。ブロットをすすぎ、次いで第一抗体(腹水の1:1000希釈物又は1μg/mlの精製mAb もしくはポリクローナルAb)と22℃で1時間インキュベーションした。次いでブロットを洗い、そして第二抗体(ヤギ抗−マウス−HRP 又はヤギ抗−ウサギ−HRP,1:500 ; Jacksow Immunosearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)と45分インキュベーションした。免疫反応バンドをDAB (Sigma, St. Louis, MO)とH2O2を利用してブロットを発色させることにより、又はECL (Amersham, Buckinghamshire, England)システムを製造者の仕様に従って利用することにより検出した。
共有複合体形成
共有複合体形成について試験するため、 0.175μMのhK2を20μMのインヒビターとpH8で 100mMの硼酸バッファー中でインキュベーションした。試験したインヒビターは1−アンチキモトリプシン、1−アンチトリプシン、1−アンチプラスミン、アンチトロンビン及び2−マクログロブリンとした。5μlのhK2(10μg/ml)に 100mMの硼酸バッファーの中に調製した計算μgのインヒビターを加え、そして必要なら、各サンプルを10μlの総容量にした。サンプルを37℃で3時間インキュベーションし、その後35%の2−メルカプトエタノールを含む 1.5μlの7× PhastSystem SDSサンプルバッファーを加え、そしてこのサンプルを湯浴の中で3分煮沸した。サンプルを SDS/PAGE及びウェスタン分析に適用する前にSDSサンプルバッファーの化に1/4に希釈した。
ペプチド基質のタンパク質分解
hK2のペプチド基質を切断する能力を決定するため、ペプチドを10mg/mlにおいてDMSOの中に溶かし、次いで PSA, hK2又はトリプシンを含む 100mMの硼酸バッファーpH8の中に1:10に希釈した。典型的な実験は下記の通りに実施した:1μlのペプチドを7μlの 100mMの硼酸バッファーに加え、次いで2μlのhK2(10μg/ml)、PSA (500μg/ml)又はトリプシン(0.5μg/ml)を加えた。一般にサンプルを37℃で16時間インキュベーションした。サンプルを 100μlの 0.2%の TFA/水でクエンチングし、そしてそのクエンチングしたサンプルをAS100 オートサンプラー、デュアル1350ポンプ及びBiodimensionスキャニングUV−VIS 検出器の備ったBioRadモデル800 HPLCに取り付けたVydac C−18逆相カラムに直接載せた。溶媒Aは 0.1%の TFA/水であり、そして溶媒Bは 0.1%のTFA を含むアセトニトリルとした。サンプルを90%の溶媒Aの中に入れ、そして勾配を10分かけて60%の溶媒Bに至るまで展開させた。吸収を 220nm及び 280nmで同時にモニターした。HPLCで集めたピークを真空遠心分離又は凍結乾燥により濃縮し、次いでアミノ酸シーケンサーに入れて個々のフラグメントを同定した。あるケースにおいては10μlのクエンチング済みサンプル混合物を配列決定膜に直接載せ、そしてその配列がわかっているため、各サイクルに存在するアミノ酸分布から切断部位を決定した。
発色原基質を用いるプロテアーゼアッセイ
パラ−ニトロアナリド誘導化基質の加水分解を測定するアッセイはプログラム式恒温型7−ポジションセルホルダーの備ったHP8452A UV−VIS 光度計を用いて実施した。アッセイは37℃にインキュベーションした 100mMの硼酸ナトリウムpH8の中で実施し、吸収上昇を 405nmでモニターした。メトキシスクシニル−Arg −Pro −Tyr−パラニトロアニリド(Meo−Suc −R−P−Y−pNA)及びH−D−プロ−phe −arg −パラ−ニトロアニリド(P−F−R−pNa)はアッセイにおいて1mMとした。
phK2 v217 からhK2 v217 への変換
50mMの硼酸ナトリウム中の 100〜400 μg/mlの phK2v217のサンプルを1% w/wのトリプシン又はhK2と37℃でインキュベーションした。プロから成熟体に至る変換は1〜2μgのhK2v217出発材料を 100μlのHIC バッファーAに希釈し、そして二形態を上記の通りにして HIC−HPLCにより分解することによりモニターした。hK2v217と phK2v217とのインキュベーションは同じようにして行ったが、但し、同等量の二形態を図17Bに示すように一緒にインキュベーションした。
実施例2
哺乳動物細胞中のhK2 v217 の発現及び精製
哺乳動物細胞系においてhK2を発現させるため、hK2の全コード配列(pphK2)(図2)をコードする 0.8kbのフラグメントをPCRを用いて増幅し、ベクターPCR II(TA)にサブクローニングし、そしていくつかのクローンを単離した。これらのクローンのうちのいくつかにおける全pphK2インサートのヌクレオチド配列を、PCR 増幅により生じうる任意の突然変異を検定するために決定した。一方の野生型hK2インサートを有するクローンTA−hK2、及び他方の突然変異hK2インサートを有するクローンTA−hK2v217の2つのクローンを更なる分析のために選別した。TA−hK2v217はhK2のコドン650 にCのTによる置換を含み、hK2のアミノ酸残基217 でのバリン(GTT) によるアラニン(GCT) の保存的置換がもたらされている(図2)。哺乳動物発現ベクターを得るため、TA−hK2及びTA−hK2v217のpphK2インサートをGBMTプロモーターのコントロール下でプラスミド PGT−dにサブクローニングし、プラスミド pGThK2及び pGThK2v217をもたらした。GBMTプロモーターはいくつかの調節配列より成り、そしてアデノウィルスE1a タンパク質により活性化される(Bergら、前掲(1992))。
実施例3
phK2 v217 の特性決定及びhK2 v217 の作製
実施例2において採用した精製スキームの効率を調べるため、 1.5μgの精製 phK2v217をベーターメルカプトエタノール(BME) の存在下又は非存在下で SDS/PAGEにかけ、そしてそのゲルを銀染色した。サンプル中の phK2v217を約95%の純度であることを結果は示した(図5)。 phK2v217はBME の非存在下で約30kDにて泳動し、そしてBME の存在下では約34kDにて泳動することも示された。このパターンは精液から精製したPSA について観察されたものと類似である(図5)。
実施例4
hK2−特異的Abs の作製
phK2v217及びhK2v217をhK2に対するmAb を作製するための免疫原として用いた。ハイブリドーマをhK2v217又は phK2v217との高度な反応性及びPSA との最低限の反応性に基づきスクリーニングした。ハイブリドーマから獲得したmAb の代表例を表1に示す。 phK2v217による免疫はmAb HK1G586.1 及びHK1G464.3 をもたらした。HK1G586.1 はhK2−特異性であり、なぜならそれは phK2v217及びhK2v217の双方は認識するが、PSA は認識しないからである。他方、HK1G464 は phK2−特異性であり、なぜならそれは phK2v217のみを認識し、そしてhK2v217又はPSA は認識しないからである。
実施例5
哺乳動物細胞におけるhK2の発現
哺乳動物細胞において野生型hK2(hK2)を発現させるため、 pGThK2(図3)をAV12細胞でトランスフェクションした。hK2ポリペプチドを発現するいくつかのクローンを HK1D106.4(hK2のアミノ酸残基17〜71に対応するポリペプチドに対して生起させたhK2−特異的mAb)を用いるウェスタン分析により同定した。クローンAV12−hK2#27(AV12−hK2)をその高度なhK2発現レベルに基づき更なる分析のために選別した。ベクターのみでトランスフェクションした細胞(pGTD)はHK1D106.4 との反応性を示さなかった。
実施例6
hK2の生合成
哺乳動物細胞におけるhK2の生合成を更に研究するため、経時的試験を行い、それではAV12−hK2クローン#27由来の無血清消費培地を8日間連続して毎日集め、濃縮し、そして SDS−PAGEにかけた。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、そしてHK1D106.4 又はHK1G464.3 mAb のいづれかでプロービングした(図9)。図9に示す通り、HK1D106.4 は phK2及びhK2を共に認識し、一方HK1G464.3 は phK2のみを認識し、なぜならそのエピトープはhK2の−7〜+7領域にあるからである。hK2ポリペプチド(約34kD)の発現はHK1D106.43 mAbによる検出に従い、3日目にピークとなり、そしてその後プラトーとなった。約70kD〜約90kDで泳動する2本のその他の免疫反応性バンドも4日目以降に検出された。
実施例7
hK2及びhK2 v217 の酵素活性及び特異性
少量のhK2を、その酵素活性及び基質特異性を確立するために十分な純度にまで精製した。hK2の一般活性をペプチドのp−ニトロアニリド誘導体に対する発色原的なそのアミド分解活性を決定することにより測定した(表2)。このような基質のタンパク質分解により遊離されるp−ニトリアニリドを吸収A405 で測定する。キモトリプシン様プロテアーゼを測定するために基質メトキシスクシニル−Arg −Pro −Tyr −パラ−ニトロアニリド(MeO−Suc −R−P−Y−pNA)を使用し、それはフェニルアラニンで切断する。この基質はPSA の活性を測定するために既に使用されている(Christenssonら、Eur. J. Biochem., 194, 755 (1990))。基質H−D−Pro−Phe −Arg −パラ−ニトロアニリド(P−F−R−pNA)はトリプシン様プロテアーゼに特異的であり、それはアルギニン(R)において切断される。
実施例8
hK2による phK2 v217 の活性化
図16におけるペプチド#3の配列は phK2のアミノ酸残基−7〜+7に相当する。この領域はプロペプチドVPLIQSR を含み、それは phK2v217のN末端リーダーペプチドとして見い出された。上述の通り、hK2はこのペプチドを切断してプロペプチド領域を遊離させることができるが、hK2v217はできなかった。hK2が天然基質上のこのプロ配列を切断し得るかを調べるため、 phK2v217及びhK2v217を変換するその能力をモニターした。 phK2v217を1%のhK2とインキュベーションし、そしてその変換を HIC−HPLC法によりモニターした(図17A)。結果は、hK2が phK2v217をhK2v217に変換することを示したが、速度はトリプシンの30分の1であった。 phK2v217を40%のhK2v217とインキュベーションすると、2種のhK2形態の比の相違は6時間でさえも認められなかった(図17B)。このことはペプチド基質についての前記の所見を確証せしめ、そして天然基質に対してさえも、hK2v217ではなく、hK2のみがhK2のプロ領域を切断した。
実施例9
hK2とのインヒビター複合体の形成
PSA はα2マクログロブリン(MG)及びセリンプロテアーゼインヒビターのアンチキモトリプシン(ACT) と複合体を形成することが示された。その複合体形成を開拓するため、hK2をヒト血漿の中に存在する一連の一般的なプロテアーゼ(ACT,α2−アンチプラスミン、アンチトロンビンIII 、及びα1−アンチトリプシン)(Travis and Salvesen, Ann. Rev. Biochem., 52, 655 (1983))とインキュベーションし、そしてその混合物をウェスタンブロットにより分析した(図18)。hK2とこのようなセルビンとの任意の共有複合体は還元条件下での SDS/PAGEで約80〜100kD のバンドをもたらすであろう。
実施例10
前立腺組織とのモノクローナル抗体586 の免疫反応性
hK2が前立腺において発現され、そしてもしそうなら前立腺癌と相関するかを調べるため、264 の根治的(radical) 前立腺切除検体(そのうちの257 は未処置患者に由来し(図20)、そして7はアンドロゲン枯渇治療処置患者に由来する(図21))を対比試験において分析した。各検体を、良性上皮、高度前立腺内皮新形成(PIN) 及びアデノ癌腫を有する領域におけるhK2の細胞質発現について分析した。
考 察
PSA 又はhK2についてのin vivo タンパク質プロセジング及び分泌メカニズムはわかっていない。ここに示す結果は phK2がAV12−hK2, DU145−hK2及びPC3−hK2細胞により分泌されることを示し、hK2が phK2として通常分泌され、そしてこのプロペプチドが細胞外で切断されることを示唆する。このことは phK2が生物流体の中に存在し、そしてpCa 又はBPH についての有用な診断マーカーでありうることを示唆する。
Claims (13)
- 野生型hK2ポリペプチドと比べて217位のアラニンにおいてアミノ酸置換を有し、そしてこの置換がそのポリペプチド変異体を対応の野生型成熟hK2ポリペプチドよりも精製に対してより安定なものにする、hK2ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK3には結合しない抗体。
- hK2ポリペプチド変異体の成熟形態にも結合する、請求項1記載の抗体。
- 野生型hK2ポリペプチド変異体の成熟形態にも結合する、請求項1記載の抗体。
- 前記野生型hK2ポリペプチドのプレ−プロ又はプロ形態にも結合する、請求項1記載の抗体。
- hK2ポリペプチド変異体の成熟形態には結合しない、請求項1記載の抗体。
- 217位のアラニンの代わりにバリンを有し、ここでこの置換はこのポリペプチド変異体を野生型成熟hK2ポリペプチドよりも精製に対して安定なものにする、hK2ポリペプチド変異体に特異的に結合し、そしてhK3には結合しない抗体。
- 野生型hK2ポリペプチドの成熟形態に結合しない、請求項1記載の抗体。
- hK2ポリペプチド変異体のプロ形態又は野生型hK2ポリペプチドのプロ形態には結合しない、請求項1記載の抗体。
- hK2ポリペプチド変異体のプレ−プロ形態又は野生型hK2ポリペプチドのプレ−プロ形態には結合しない、請求項1記載の抗体。
- モノクローナル抗体である請求項1〜9のいずれか1項記載の抗体。
- 請求項1〜9のいずれか1項記載の抗体を含んで成るポリクローナル抗体調製品。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載の抗体を含んでなるモノクローナル抗体調製品。
- 請求項1〜9のいずれか1項記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
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