MXPA99000659A - Metodos para detectar polipeptidos de hk2 - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos diagnósticos que emplean anticuerpo, los cuales se ligan a antígeno de próstata phK2 o hK2 y los cuales no reaccionan significativamente con antígeno específico de próstata hK3. También se proporcionan métodos para detectar la formación de complejo de hK2. Los métodos sonútiles en el diagnóstico de cáncer de próstata.

Description

MÉTODOS PARA DETECTAR POLIPEPTIDOS DE HK2 Antecedentes de la invención Las calicreínas glandulares son un subgrupo de proteasas de serina las cuales están involucradas en el procesamiento post-traslacional de precursores de polipéptidos específicos para sus formas biológicamente activas. En los humanos, se han identificado tres miembros de esta familia, y algunas de sus propiedades se han caracterizado (Clements, Endoc. Rev.. 10. 343 (1989); Clements, Mol. Cell Endo.. 99. 1 (1994); Jones et al. , Acta Endoc. , 127, 481 (1992)). El gene hKLK1 codifica la proteína calicreína de tejido, hK1 , el gene hKLK2 codifica la proteína calicreína glandular específica de la próstata, hK2, y el gene hKLK3 codifica la proteína de antígeno específica de la próstata, hK3 (PSA). El análisis de "Nothern blot" de mRNA muestra que tanto hK2 como PSA son expresados principalmente en la próstata humana, mientras que la expresión de hK1 es encontrada en ei páncreas, glándula submandibular, riñon, y otros tejidos no prostéticos (Chapdelaine et al., FEBS Lett.. 236, 205 (1988); Young et al. , Biochem. 31 . 818 (1992)). La homología de secuencias de nucleótidos entre los exones de hKLK2 y hKLK3 es 80%, mientras que la homología de secuencias de nucleótidos entre los exones de hKLK2 y hKLK1 es 65%. La homología de secuencia de aminoácidos deducida de hK2 para PSA es 78%, mientras que ia homología de secuencia de aminoácidos deducida de hK2 para hK1 es 57%. Más aún, la secuencia de aminoácidos deducida de hK2 sugiere que hK2 puede ser una proteasa similar a tripsina, mientras que PSA es una proteasa similar a quimotripsina. Los niveles de PSA son ampliamente usados como un indicador pronóstico de carcinoma de próstata. Sin embargo, ya que la concentración de PSA en el suero es elevada en pacientes ya sea con cáncer prostético (PCa) o hiperplasia prostática benigna (BPH), la detección de niveles elevados de PSA no distingue entre estas enfermedades. Más aún, el alto grado de homología de hK2 para PSA surge como interrogante conforme a la especificidad de anticuerpos actualmente usados para detectar los niveles de PSA. Si los niveles de hK2 circulante no están relacionados con pCa o BPH, entonces los anticuerpos sobresalientes en las preparaciones de PSA, las cuales están contaminadas con hK2, o para las regiones de PSA con homología para hK2, pueden resultar en falsos resultados positivos. Sin embargo, la determinación de los niveles de hK2 en suero, y la correlación de esos niveles en pacientes con pCa o BPH , no se han logrado. De esta manera, existe una necesidad de métodos mejorados y reactivos para el diagnóstico de pCa, BHP o condiciones relacionadas.

Breve descripción de la invención La invención proporciona un método diagnóstico que comprende poner en contacto una cantidad de anticuerpos purificados, los cuales se ligan específicamente a phK2 o hK2 con una muestra de fluido fisiológico obtenido a partir de un humano. El fluido fisiológico comprende hK2 o phK2. Los anticuerpos se ponen en contacto con la muestra durante un tiempo suficiente para permitir la formación de complejos binarios entre al menos una porción de dichos anticuerpos y una porción de phK2 o hK2, en donde dichos anticuerpos no reaccionan de manera significativa con hK3. La presencia de uno o ambos de dichos complejos en dicha muestra es detectada entonces, y la cantidad de los mismos es correlacionada con la presencia o ausencia de cáncer de próstata. La cantidad de4 uno o ambos de dichos complejos puede compararse con una cantidad estándar que es representativa, por ejemplo, de la cantidad de uno o ambos complejos en una muestra de control del mismo fluido a partir de un humano sin riesgo de, o afligido con, cáncer de próstata. De la misma manera, la cantidad puede ser comparada con una cantidad estándar que representa un corte, por encima del cual o por debajo del cual, se realiza evaluación adicional del cáncer de próstata, y por debajo del cual o por encima del cual, respectivamente, el humano está probablemente libre de cáncer. Este ensayo se basa en el descubrimiento de que phK2 es detectado en el sobrenadante de una línea de células de carcinoma de próstata y que hK2 está presente en fluido fisiológico humano a partir de pacientes de cáncer de próstata. De esta manera, este método es útil para monitorear el tratamiento y/o progresión de cáncer de próstata, o para la detección temprana del cáncer de próstata. Como se usa en la presente, un humano "con riesgo de" cáncer de próstata " es un hombre que tiene hiperplasia prostática benigna (BPH) o neoplasia epitelial prostática de grado alto, o un hombre cuyos miembros familiares masculinos, por ejemplo, un hermano, padre, tío o abuelo, tienen o tuvieron hiperplasia prostática benigna, neopiasia intraepitelial prostática de grado alto o cáncer de próstata (Pea). PSA (hK3) forma complejos covalentemente enlazados con anti-quimotripsina (ACT) y alfa 2-macroglobulina (MG) en suero humano (Leinonen et al. , Clin. Chem.. 34. 2098 (1993)). Ha sido útil monitorear las proporciones de diferentes formas de PSÁ (en complejo versus sin complejo) en suero para diferenciar entre BPH y pCa (Christensson et al., J. Urol.. 150. 100 (1993)). Los resultados presentados en la presente más adelante muestra que los polipéptidos hK2 también forman complejos con ACT y MG. La formación de complejo de hK2 con ACT fue inesperada ya que hK2 es una proteasa similar a tripsina y ACT normalmente es un inhibidor de proteasas similares a quimotripsina. Sin embargo, sugiere que hK2 tiene similitudes conformacionales/estructurales con PSA (hK3), las cuales dictan su reactividad con inhibidores. De esta manera, se esperaría que el hK2 en complejo con ACT y MG junto con hK2 libre (sin ligar) representara los componentes principales inmunológicamente detectables o medibies de hK2 en el suero humano. Los resultados presentados en la presente más adelante, también muestran que los complejos de hK2 pueden ser detectados en los sueros de pacientes de cáncer prostético. Por lo tanto, también puede ser importante monitorear la presencia y/o cantidad de complejos de hK2 para distinguir entre PCa y BPH. Así, la invención también proporciona un método diagnóstico comprendiendo determinar la cantidad de polipéptido de hK2, la cual está ligada a la proteína del plasma de una muestra de fluido fisiológico humano y correlacionar la cantidad de dicho polipéptido de hK2 ligado .a la presencia o ausencia de cáncer de próstata en dicho humano. Una modalidad preferida de la invención es un método diagnóstico en el cual la cantidad de polipéptido de hK2 ligado es determinada con relación a un valor representativo de dicha cantidad de hK2 ligado en un humano sin riesgo de, o afligido con, cáncer de próstata. Otra modalidad preferida de la invención es un método diagnóstico que comprende separar de una muestra de fluido fisiológico humano polipéptido de hK2, el cual está ligado a la proteína de plasma de polipéptido de hK2 el cual no está ligado a la proteína de plasma antes de determinar la cantidad de polipéptido de hK2 ligado. Las metodologías para la separación de proteínas de pesos moleculares y/o conformaciones diferentes son bien conocidas en la técnica. Además se proporciona un método para detectar la formación de complejo de hK2 con proteínas de plasma. El método comprende además determinar la cantidad de polipéptido de hK2, el cual está ligado a la proteína de plasma con relación a la cantidad de polipéptido de hK2 que no está ligado a la proteína de plasma. De manera alternativa, se determina la cantidad de polipéptido de hK2, que está ligado a la proteína de plasma con relación al polipéptido de hK2 total (ligado más no ligado).

La invención proporciona además un método para detectar o determinar polipéptido de hK2 no ligado en una muestra de un fluido fisiológico humano que contiene hK2. El método comprende poner en contacto una cantidad de anticuerpos purificados, los cuales se ligan específicamente a hK2 con la muestra a ser probada durante un tiempo suficiente para permitir la formación de complejos binarios entre al menos una porción de dichos anticuerpos y una porción de dicho hK2. Los anticuerpos no reaccionan significativamente con hK3 y no reaccionan significativamente con hK2, el cual está ligado a una proteína de plasma. Una modalidad preferida de la invención incluye unir dichos anticuerpos a una superficie sólida antes de poner en contacto los anticuerpos con la muestra a ser probada. También se proporciona un anticuerpo purificado que liga específicamente un polipéptido de hK2 y no liga hK3, en donde el anticuerpo también se liga a hK2 el cual está ligado a una proteína de plasma. La invención proporciona además un conjunto diagnóstico para detectar o determinar phK2 o hK2. El conjunto comprende empacar, contener, empacar por separado (a) una fase sólida, la cual liga un anticuerpo de captura; y (b) una cantidad conocida de un anticuerpo de detección, en donde el anticuerpo de detección liga específicamente a phK2 o a hK2 y no a hK3. Otra modalidad de la invención es un conjunto diagnóstico para detectar o determinar phK2. El conjunto comprende empacar, contener, empacado por separado (a) una fase sólida la cual liga un anticuerpo de captura; y (b) una cantidad conocido de un anticuerpo de detección, en donde el anticuerpo de detección liga específicamente la forma pro de hK2 y no hK3 o hK2. Todavía otra modalidad de la invención es un conjunto diagnóstico para detectar o determinar phK2 o hK2. El conjunto comprende empacar, contener, empacado por separado (a) una fase sólida la cual liga un anticuerpo de captura; y (b) una cantidad conocida del anticuerpo de captura, en donde el anticuerpo de captura liga específicamente a phK2 o a hK2 y no a hK3. También se proporciona un método para detectar hK2 in vitro. El método comprende poner en contacto una muestra, tal como una muestra de fluido, comprendiendo una cantidad de un polipéptido de hK2 con una cantidad de un substrato de péptido durante un tiempo suficiente para permitir el corte del substrato de péptido por el polipéptido de hK2 para producir subunidades del péptido, en donde el substrato de péptido comprende residuos de aminoácidos contiguos, los cuales forman un sitio al cual se liga un polipéptido de hK2. Entonces se determina la presencia o cantidad de las subunidades del substrato de péptido. De preferencia, el substrato de péptido es un péptido sintético.

Breve descripción de las Figuras La Figura 1 muestra las secuencias de aminoácidos de hK2 madura de tipo natural (SEQ ID NO: 1 ) y hK3 (SEQ ID NO:7). La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos, y secuencia de ácidos nucleicos correspondientes, de pphK2 tipo natural (SEQ ID NO:5 y SEQ I D NO:6, respectivamente), phK2 (SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4) y hK2 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2). El codón 217 (GCT, Ala) es mostrado en negritas y subrayado. La Figura 3 es un diagrama esquemático de los vectores de expresión de pGT pGThK2 y pGThK2v217.

La Figura 4 muestra perfiles cromatográficos de la purificación de ?hK2 v217 (A) Un cromatograma de DEAE de medio empleado 7 días de células AV12 transfectadas con un vector que codifica pphK2 V217 Una muestra del medio empleado fue aplicada en amortiguador de bicarbonato, pH 8 y se levigó con un gradiente de sal. El perfil de levigación A2ßo es representado por una línea sólida. La línea punteada representa los resultados de un ensayo de ELISA de una porción de fracciones de columna individual, el cual fue secado sobre placas de microtítulo y desarrollados con un anticuerpo de anti-pphK2 de conejo. (B) El perfil de interacción hidrofóbica de fracciones de DEAE depositadas. Las fracciones 24 a 30 de los levigados cromatográficos de DEAE de (A) fueron depositadas, concentradas y aplicadas a una columna de HIC (columna de interacción hidrofóbica) en sulfato de sodio 1 .2 M, y levigado con un gradiente de sal decreciente. El perfil de levigación (A2ßo) es representado por una línea sólida. La línea punteada representa los resultados de un ensayo de ELISA de una porción de fracciones de columna individual el cual se secó sobre placas de microtítulo y se desarrolló con un anticuerpo anti-hK2 de conejo. (C) fracciones conteniendo hK2 del pico de 22 minutos de (B) fueron concentradas y aplicadas a una columna de exclusión de tamaño Pharmacia S12. Las fracciones fueron recolectadas y analizadas por SDS/PAGE. Ei pico de 19.4 minutos pareció homogéneo por SDS-PAGE. La Figura 5 representa un análisis de SDS/PAGE de PSA y hK2 purificados. Una muestra de 1 .5 mg de phK2v217 o PSA purificado se hirvió en amortiguador de muestra con (R) o sin (N) 1 % de beta-mercaptoetanol.

Las muestras fueron sometidas a SDS/PAGE sobre un 4-20% gel. Las bandas de proteína fueron visualizadas al manchar el gel con plata. La Figura 6 muestra manchado de Conconavalin A de phK2v217. La posición predicha de phK2 es designada mediante una flecha. Se incluyeron ZCE (un mAb anti-CEA) y BSA como ejemplos de proteínas glicosiladas y no glicosiladas, respectivamente. La presencia de una banda en la posición predicha en el sendero de phK2 demuestra que esta proteína es glicosilada. La Figura 7 representa la conversión de hK2v217 pro a maduro mediante corte de tripsina. La tripsina (1 % p/p) se incubó con phK2 217 durante 10 minutos a 37°C en amortiguador de borato 100 mM pH 8, y entonces se sometió a HIC-HPLC. La línea de rayas representa el perfil de phK2v217 antes de la incubación con tripsina. La línea sólida representa ei perfil de phK2 después de la digestión de tripsina. Los perfiles han sido superimpuestos para comparación. La identidad de las dos formas fue confirmada mediante secuenciación N-terminal de la proteína. La Figura 8 muestra un análisis "Western blot" de fluido seminal usando anticuerpo monoclonal (mAb) hK1 G 586.1 . El fluido seminal procesado se diluyó 1 : 1 en PBS y se centrifugó a 10,000 X g durante 20 minutos. El sobrenadante fue sometido a SDS/PAGE en un 8-25% gel usando el PhastSystem (Pharmacia). La proteína fue transferida a nitrocelulosa y se incubó con HK1 G 586.1 purificado de proteína G (1 µg/ml) seguido por IgF-HRP anti-ratón de cabra (1 : 1000). La mancha fue desarrollada usando el sistema de detección ECL (Amersham).

La Figura 9 representa un estudio de transcurso de tiempo de expresión de hK2 en células AV12. El clon #27 de AV12-hK2 se hizo crecer a ~60-70% de confluencia, las células se lavaron entonces con HBSS y se adicionó medio HH4 libre de suero. El medio empleado se retiró cada día, se concentró y sometió a SDS/PAGE en un gel al 12%. Las proteínas fueron "electromanchadas" y probadas con anticuerpo monoclonal HK1 D 106.4, el cual detecta tanto phK2 como hK2 (1 : 1000) o HK1 G 464.3, el cual detecta phK2 (1 : 1000), seguido por IgG-HRP antiratón de cabra (1 :500). La mancha fue desarrollada con ECL (Amersham) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. phK2 217 y hK2v217 purificados fueron usados como controles. La posición de hK2 está indicada por la flecha. La Figura 10 representa un estudio de transcurso de tiempo de la expresión de la forma variante de hK2 en células AV12 transfectadas. A -60-70% de confluencia, las células AV12-hK2v217 se lavaron con H BSS y se adicionó medio HH4 libre de suero. El medio empleado se retiró cada día, se concentró y sometió a SDS/PAGE en un gel al 12%. Las proteínas fueron electromanchadas y probadas con anticuerpos monoclonales HK1 D 106.4 y KH 1 G 464.3. Se usó IgG-H RP anti-ratón de cabra (1 :500) como un anticuerpo secundario y la mancha se desarrolló con ECL (Amersham) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. phK2v217 y hK2v217 purificados se usaron como controles. La posición de hK2 está indicada por la flecha.

La Figura 1 1 es una gráfica de expresión de hK2 y viabilidad celular sobre el tiempo. El clon #27 de AV12-hK2 se hizo crecer a 60-70% de confluencia, se lavó con H BSS y se adicionó medio HH4 libre de suero. El medio empleado se retiró cada día y la concentración de hK2 se midió mediante ELISA usando HK1 D 106.4 o HK1 G 464.3 como un anticuerpo primario, e IgG-HRP anti-ratón de cabra como un anticuerpo secundario. La reacción se desarrolló con OPD (Sigma, St. Louis, MO). Las células viables fueron enumeradas diariamente usando exclusión de colorante azul tripano. La Figura 12 muestra la expresión de hK2 en células PC3 y DU 145.

Las células PC3 y DU145 transfectadas con pGThK2 se hicieron crecer a -60-70% de confluencia, se lavaron y volvieron a suspender en medio HH4 libre de suero. El medio empleado de células DU 145 transfectadas con pGThK2 se recolectó 3 días después de la re-suspensión y el medio empleado de células PC3 transfectadas con pGThK2 se recolectó 5 días después de la re-suspensión. Los medios empleados fueron concentrados y sometidos a SDS/PAGE en geles al 12%. Las proteínas se electromanchadas y probadas con HK1 D 106.4 o HK1 G 464.3 como se describió antes. phK2v217 y hK2v21? fueron usados como controles. La posición de hK2 está indicado con una flecha. La Figura 13 muestra la expresión de hK2 por clones AV12 conteniendo hK2 seleccionados. Las células de los números de clones de AV12 que contienen hK2 10, 27, 31 y 32 se hicieron crecer a -60-70% de confluencia y se lavaron con HBSS, entonces se adicionó medio HH4 libre de suero. El medio empleado se retiró 7 días después de la adición del medio libre de suero, se concentró y sometió a SDS/PAGE en un gel al 12%. Las proteínas se electromancharon y probaron con HK1 D 106.4 o HK1 G 464.3. La IgG-H RP anti-ratón de cabra (1 :500) se usó como un anticuerpo secundario y la mancha se desarrolló con ECL (Amersham) de acuerdo a instrucciones del fabricante. phK2v217 y hK2v217 purificados se usaron como controles. La posición de hK2 está indicada por una flecha. La Figura 14 muestra la expresión de phK2v217 en clones de AV12-hK2 v217 seleccionados. Las células de números de clones de AV12 2, 3, 4, 45 y 48 se hicieron crecer a aproximadamente 60-70% de confluencia y se lavaron con HBSS, y se adicionó medio HH4 libre de suero. El medio empleado se retiró 7 días después de la adición de medio libre de suero, se concentró y sometió a SDS/PAGE en un gel al 12%. Las proteínas se electromancharon y probaron con HK1 D 106.4 o HK1 G 464.3. Se usó IgG-HRP anti-ratón de cabra (1 :500) como un anticuerpo secundario y la mancha se desarrolló con ECL (Amersham) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. phK2v217 y hK2v217 purificados se usaron como controles. La posición de hK2 está indicada or una flecha. La Figura 15 muestra la especificidad anidolítica de hK2v217, hK2, y PSA para los residuos 210-236 de hK2. El péptido sintético (0.63 mM) se digirió durante la noche a 37°C con 1 µg/mi de hK2, 40 µg/ml de hK2v217 o 100 µg/ml de PSA, y los productos de digestión se separaron mediante RP-HPLC. Los picos se normalizaron para comparar los aspectos cualitativos del corte.

La Figura 16 muestra la especificidad de hK2 y PSA para diferentes substratos de péptidos. Las flechas abiertas denotan ligaduras de péptido cortadas por PSA; las flechas sólidas denotan ligaduras cortadas por hK2. El péptido #1 (SEQ ID NO: 16) representa residuos de aminoácidos 210-236 de hK2. El péptido #2 (SEQ ID NO: 18) representa residuos de aminoácidos 1 -14 de angiotensinógeno, es decir, el tetradecapéptido de substrato de renina. El péptido #3 (SEQ ID NO: 19) representa residuos de aminoácidos -7 a +7 de phK2. El péptido #4 (SEQ ID NO:20) representa residuos de aminoácidos 41 -56 de hK2. El péptido #5 (SEQ ID NO:21 ) representa la secuencia de aminoácidos de la cadena beta oxidada de insulina. El péptido #6 (SEQ ID NO:22) representa residuos de aminoácidos 196-213 de PMSA. La Figura 17 muestra ia activación de phK2v217 por hK2 pero no hK2 217. phK2v217 contiene la secuencia de péptido pro líder VPLIQSR (SEQ ID NO: 12), una secuencia que no está presente en hK2v217. El panel A muestra phK2v217 incubado con 1 % p/p de hK2. El panel B es un control con 40% p/p de hK2v217 incubado con phK2v217 durante 6 horas. La Figura 18 muestra ei análisis Western blot de hK2 incubado con inhibidores de proteasa. Cada muestra se separó en un SDS-PAGE de gradiente de 8-25%, se manchó y probó con HK1 G586.1 . hK2 se incubó durante 4 horas a 37°C con los siguientes inhibidores: Sendero 1 , antiquimotripsina (ACT); sendero 2, alfa 2-antiplasmina; sendero 3, antitrombina lll; sendero 4, inhibidor de alfa 1 -proteasa (anti-tripsina); sendero 5, alfa 2-macroglobulina; los senderos 1 y 2 muestran un complejo covalente del Mr predicho de 90-100 kD. Los inhibidores de serpina fueron empleados a 20 µM, macroglobulina a 2.8 µM y hK2 a 0.175 uM. El sendero 5 muestra los complejos de Mr mayores representando formación de complejo covalente de hK2 con alfa 2-macroglobulina. La Figura 19 muestra la formación de complejos de hK2 en suero humano. Se incubaron Western blots de hK2 y PSA con suero humano. Las muestras hK2 fueron probadas con muestras de HK1 G586.1 y PSA con mAb anti-PSA PSM773. Los senderos 1 -6 contienen muestras de hK2 y los senderos 7 y 8 son muestras de PSA. El sendero 1 representa un control de hK2. El sendero 2 contiene hK2 incubado con ACT durante 4 horas. El sendero 3 representa un control de suero sin proteasa adicionada. El sendero 4 contiene hK2 incubó durante 15 minutos con suero. El sendero 5 contiene hK2 incubado con suero durante 4 horas. El sendero 6 contiene hK2 incubado con alfa-2macroglobulina purificada druante 4 horas. El sendero 7 contiene PSA incubado con suero durante 4 horas. El sendero 8 contiene PSA incubado con alfa-2 macroglobulina purificada durante 4 horas. La Figura 20 muestra una curva dosis respuesta para phK2v217 que empleó anticuerpo monoclonal HK1 G586 -©- o HK1 G464 -•- como el reactivo de captura y H K1 H449 como el reactivo de detección. La Figura 21 muestra una gráfica de la concentración de hK2 o phK2 en el medio de células LNCaP estimuladas con mibolerone. El anticuerpo monoclonal HK1 G586 -D- o HK1 G464 -0- se empleó para medir niveles de phK2 y hK2, o niveles de phK2, respectivamente. La inserción muestra actividad enzimática de hK2 en el sobrenadante de células LNCaP estimuladas con mibolerone. La Figura 22 muestra el análisis Western blot de sobrenadante de células LNCaP con anticuerpo monoclonal HK1 G464. El sendero 1 contiene 75 ng de hK2 purificado. El sendero 2 contiene 75 ng de phK2 purificado. El sendero 3 contiene 200 ng de PSA purificado aislado de fluido seminal. El sendero 4 contiene 5 µg de pphK2. El sendero 5 contiene 5 µg de ppPSA. Los senderos 6-9 contienen medios empleados de células LNCaP de los días 1 -4 post-estimulación con mibolerone. La Figura 24 muestra la detección de hK2 en un panel de sueros de carcinoma de próstata. Las muestras de suero de 10 pacientes fueron sometidas a electroforesis en geles de poliacrilamida al 4-20% y manchados con nitrocelulosa. Cada sendero contiene 10 µg de suero humano enriquecido con hK2 de pacientes de cáncer de próstata. Sendero 1 : mab anti-hK2, HK1 G587.1 . Sendero 2: mab anti-hK2 H K1 B104.1 . Sendero 3: mab anti-PSA, PSM773. Sendero 4: mab de control negativo. La Figura 25 muestra la detección de complejos hK2-ACT en suero de un paciente de carcinoma de próstata mediante anticuerpo monoclonal HK1 G586.1 . Sendero 1 : mab HK1 G586.1 . Sendero 2: mab de control negativo. Sendero 3: mab anti-ACT, AC1A086. Sendero 4: marcadores de peso molecular.

Descripción detallada de la invención El alto grado de homología de secuencia de aminoácidos de hK2 a PSA, y el hecho de que la expresión tanto de hK2 como PSA está limitada esencialmente a la próstata, sugiere que medir las concentraciones de suero de ambas proteínas puede ser útil en el diagnóstico y monitoreo de cáncer prostético (pCa). Recientemente, pphK2 se expresó en bacterias (Saedi et al., Mol. Cell. Endoc.. 109. 237 (1995)). Puede usarse pphK2 derivado de manera bacteriana para generar anticuerpos para los epitopes no dependientes de manera conformacional sobre hK2. Sin embargo, para discernir los pasos involucrados en la biosíntesis de hK2 y para obtener anticuerpos específicos para la forma completamente procesada y secretada de hK2, es necesaria la expresión de hK2 en células de mamíferos. Como se usa en la presente, el término "polipéptido de hK2" incluye polipéptidos de hK2 maduros, pro, y pre-pro recombinantes. Un polipéptido de hK2 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1 ), así como polipéptidos "variantes" los cuales comparten al menos 90% de homología con SEQ ID NO: 1 en las regiones que son substancialmente homologas a hK3, es decir, las regiones que no están identificadas por barras como se muestra en la Figura 1 . Tales polipéptidos de hK2 también poseen función antigénica en común con la molécula de hK2 maduro de la Figura 1 , ya que dichos polipéptidos también son definibles por anticuerpos los cuales se ligan específicamente a ellos, pero los cuales no tienen reacción cruzada con hK3 (o hK1 ). De preferencia, dichos anticuerpos reaccionan con sitios antigénicos o epitopes que también están presentes en la molécula de hK2 maduro de la Figura 1 . Los anticuerpos útiles para definir la función antigénica común son descritos con detalle en la Serial No. 08/096,946, es decir, antisueros policlonales preparados in vivo contra la subunidad de hK2 41 -56. Un "ácido nucleico de hK2 aislado" es RNA o DNA conteniendo más de 15, de preferencia 20 o más, bases de nucleótidos secuenciales que codifican un polipéptido de hK2 biológicamente activo o un fragmento variante del mismo, que es complementario ai filamento no codificante del RNA o DNA del polipéptido de hK2 natural, o híbrida a dicho RNA o DNA y permanece ligado de manera estable bajo condiciones severas. De esta manera, el RNA o DNA es aislado de manera que está libre de al menos un ácido nucleico contaminante con el cual está asociado normalmente en la fuente natural del ácido nucleico y de preferencia substancialmente libre de cualquier otro RNA o DNA de mamífero. La frase "libre de al menos un ácido nucleico de fuente contaminante con el cual está asociado normalmente" incluye el caso donde el ácido nucleico es reintroducido en la fuente o célula natural pero está en una ubicación cromosómica diferente o está flanqueado de otra manera por secuencias de ácidos nucleicos no encontradas normalmente en la célula fuente. Un ejemplo de ácido nucleico de hK2 aislado es RNA o DNA que codifica un polipéptido de hK2 biológicamente activo que comparte al menos 90% de la identidad de secuencia con las regiones homologas de hK3 del péptido de hK2 de la Figura 1 , como se describió antes. El término "substancialmente homogéneo, aislado" como se usa con respecto a un polipéptido de hK2 está definido en términos de las metodologías discutidas en la presente más adelante. Como se usa en la presente, el término "ácido nucleico recombinante", es decir, "DNA recombinante" se refiere a un ácido nucleico, es decir, a DNA que ha sido derivado o aislado de cualquier fuente de tejido apropiada, que pueda ser químicamente alterada de manera subsecuente in vitro, e introducida posteriormente en células huésped objetivo, tales como células derivadas de fuentes de animales, plantas, insectos, levaduras, fúngales o bacterianas. Un ejemplo de DNA recombinante "derivado" de una fuente, sería una secuencia de DNA que es identificada como un fragmento útil que codifica hK2, o un fragmento o variante del mismo, y el cual es sintetizado químicamente en forma esencialmente pura. Un ejemplo de tal DNA "aislado" de una fuente sería una secuencia de DNA útil que es cortada o removida de dicha fuente por medios químicos, por ejemplo, mediante el uso de endonucleasas de restricción, de manera que se puede manipular adicionalmente, por ejemplo, amplificarse, para usarse en la invención, mediante la metodología de ingeniería genética. En consecuencia, "DNA recombinante" incluye secuencias de DNA completamente sintéticas, secuencias de DNA semi-sintéticas, secuencias de DNA aisladas de fuentes biológicas, y secuencias de DNA derivadas de RNA introducido, así como mezclas de los mismos. De manera general, la secuencia de DNA recombinante no es residente originalmente en el genoma de la célula objetivo huésped, la cual es la receptora del DNA, o es residente en el genoma pero no está expresada, o no altamente expresada. Como se usa en la presente, "quimérico" significa que un vector comprende DNA de al menos dos especies diferentes, o comprende DNA de la misma especie, el cual está enlazado o asociado en una manera la cual no ocurre en el tipo "natural" o silvestre de las especies. La secuencia de DNA recombinante, usada para la transformación en la presente, puede ser circular o lineal, de filamento doble o simple. Generalmente, la secuencia de DNA está en la forma de DNA quimérico, tai como DNA de plásmido, que también puede contener regiones de codificación flanqueadas por secuencias de control, las cuales promueven la expresión del DNA recombinante presente en la línea de célula resultante. Por ejemplo, el DNA recombinante puede comprender por sí mismo un promotor que es activo en células mamíferas, o puede utilizar un promotor ya presente en el genoma que es el objetivo de transformación. Tales promotores incluyen el promotor de CMV, así como el promotor tardío de SV40 y LTRs retrovirales (elementos de repetición terminal larga). A parte de las secuencias de DNA recombinante que sirven como unidades de transcripción para hK2 o porciones de las mismas, una porción del DNA recombinante puede ser no transcrito, sirviendo una función reguladora o estructural. Las "secuencias de control" significan secuencias de DNA necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo de huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para células procarióticas, por ejemplo, incluyen un promotor, y opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de ligadura de ribosoma. Las células eucarióticas son conocidas para utilizar promotores, señales de poliadenilación, e intensificadores. "Operablemente enlazado" es definido como que los ácidos nucleicos son colocados en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el DNA para una presecuencia o líder secretor es operablemente enlazada a DNA a un polipéptido si es expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador es operablemente enlazado a una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de ligadura de ribosoma es operablemente enlazado a una secuencia de codificación si está colocada con el fin de facilitar la traducción. Generalmente, "operablemente enlazado" significa que las secuencias de DNA siendo enlazadas son contiguas y, en el caso de un líder secretor, contiguo y en fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que ser contiguos. El enlace es logrado mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos son usados de acuerdo con la práctica convencional. Aparte de las secuencias de DNA recombinante que sirven como unidades de transcripción para hK2 o porciones del mismo, una porción del DNA recombinante puede ser no transcrito, sirviendo una función reguladora o estructural.

El DNA recombinante a ser introducido en las células generalmente contienen además ya sea un gene marcador seleccionable o un gene reportador o ambos para facilitar la identificación y selección de células transformadas de la población de células que se pretende transformar. De manera alternativa, ei marcador seleccionable puede ser transportado en una pieza separada de DNA y usado en un procedimiento de co-transformación. Ambos marcadores seleccionables y genes reportadores pueden ser flanqueados con secuencias reguladoras apropiadas para habilitar la expresión en las células huésped. Los marcadores seleccionables útiles son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a herbicidas y antibióticos, tales como neo, hpt, dhfr, bar, aroA, dapA y similares. Los genes reportadores son usados para identificar células potencialmente transformadas y para evaluar la funcionalidad de secuencias reguladoras. Los genes reportadores los cuales codifican proteínas fácilmente ensayables son bien conocidos en la técnica. En general, un gene reportador es un gene el cual no está presente en o expresado por el tejido u organismo receptor, y el cual codifica una proteína cuya expresión es manifestada por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. Los genes preferidos incluyen el gene de cloranfenicol acetil transferasa (cat) de Tn9 de E. coli, el gene de beta-glucuronidasa (gus) de la ubicación uidA de E. coli, y el gene de iuciferasa de la luciérnaga Photinus pyralis. La expresión del gene reportador es ensayada en un tiempo adecuado después de que el DNA ha sido introducido en las células receptoras. Otros elementos funcionales en las células huésped, tales como intrones, intensificadores, secuencias de poliadenilación y similares, también pueden ser una parte del DNA recombinante. Tales elementos pueden o no ser necesarios para la función del DNA, pero pueden proporcionar expresión mejorada del DNA al afectar la transcripción, estabilidad del mRNA, o similares. Tales elementos pueden ser incluidos en el DNA según se desee para obtener el desempeño óptimo del DNA transformante en la célula. Los métodos generales para construir DNA recombinante, los cuales transforman células objetivo son bien conocidos por aquéllos expertos en la técnica, y las mismas composiciones y métodos de construcción pueden ser utilizados para producir el DNA útil en la presente. Por ejemplo, J . Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2a ed., 1989), proporciona métodos adecuados de construcción. El DNA recombinante puede ser introducido fácilmente en las células objetivo mediante transfección con un vector de expresión comprendiendo cDNA que codifica hK2, por ejemplo, mediante ei procedimiento de precipitación de fosfato de calcio modificado de C. Chen et al. , Mol. Cell. Biol.. 7, 2745 (1987). La transfección también puede lograrse mediante lipofectina, usando conjuntos comercialmente disponibles, por ejemplo, proporcionados por BRL.

Las células huésped adecuadas para la expresión de polipéptido de hK2 son derivadas de organismos multicelulares. Tales células huésped son capaces de actividades de glicosilación y procesamiento de complejos. En principio, cualquier cultivo de células eucarióticas mayores pueden emplearse en la práctica de la invención, ya sea de cultivo de vertebrado o invertebrado. Ejemplos de células de invertebrado incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas especies baculovirales y variantes y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de las frutas), y Bombyx morí. Ver, por ejemplo, Luckow et al., Bio/Technology. 6. 47 (1988); Miller et al. , en Genetic Engineering. J. K. Setlow et al., eds. , Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda et al. , Nature, 315. 592 (1985). Una variedad de especies virales para transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y la especie Bm-5 de Bombyx morí NPV, y tales virus pueden usarse, de preferencia, para transfección de células de Spodoptera frugiperda. La recuperación o aislamiento de un fragmento dado de DNA de una digestión de restricción puede emplear la separación de la digestión en gel de poliacrilamida o agarosa mediante electroforesis, identificación del fragmento de interés mediante comparación de su movilidad versus la de fragmentos de DNA marcador de peso molecular conocido, remoción de la sección de gel conteniendo el fragmento deseado, y separación del gel del DNA. Por ejemplo, ver Lawn et al. , Nucleic Acids Res.. 9. 6103 (1981 ), y Goeddel et al. , Nucleic Acids Res.. 8. 4057 (1980). Un "análisis Southern" o "Southern blotting" es un método mediante el cual la presencia de secuencias de DNA en una digestión de endonucleasa de restricción de DNA o composición conteniendo DNA es confirmada mediante hibridación a un oligonucléotido marcado, conocido o fragmento de DNA. El análisis Southern involucra normalmente la separación electroforética de digestiones de DNA en geles de agarosa, desnaturalización del DNA después de la separación electroforética, y transferencia del DNA a nitrocelulosa, nylon, u otro soporte de membrana adecuado para análisis con una sonda radiomarcada, biotinilada, o marcada con enzima, como se describe en las secciones 9.37-9.52 de Sambrook et al. , supra. Un "análisis Northern" o "Northern blotting" usado para identificar las secuencias de RNA que hibridan a una sonda conocida tal como un oligonucleótido, fragmento de DNA, cDNA o fragmento del mismo, o fragmento de RNA. La sonda es marcada con un radioisótopo tal como 32P, mediante biotinilación o con una enzima. El RNA a ser analizado pueden ser separado usualmente por electroforesis en un gel de agarosa o poliacrilamida, transferido a nitrocelulosa, nylon, u otra membrana adecuada, e hibridado con la sonda, usando técnicas estándares bien conocidas en la técnica, tal como aquéllas descritas en las secciones 7.39-7.52 de Sambrook et al. , supra. La "reacción de cadena de polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en las cuales se amplifican cantidades de un fragmento preseleccionado de ácido nucleico, RNA y/o DNA, como se describe en la patente estadounidense No. 4,683, 195. Generalmente, la información de la secuencia de los extremos de la región de interés o más allá es empleada para diseñar primarios de oligonucleótidos. Estos primarios serán idénticos o similares en la secuencias a filamentos opuestos de la plantilla a ser amplificada. La PCR puede usarse para amplificar secuencias de RNA específicas, secuencias de DNA específicas a partir de DNA genómico total, y cDNA transcrito de RNA, secuencias de plásmido o bacteriófago, y similares. Ver de manera general Mullís et al. , Cold Spring Harbor Svmp. Quant. Biol.. 51 . 263 (1987); Eriich, ed. , PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989). Las "condiciones severas" son aquéllas que (1 ) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo, NaCl 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M (SSC); lauril sulfato de sodio al 0.1 % a 50°C, o (2) emplean un agente desnaturalizante tal como formamida durante la hibridación, por ejemplo formamida al 50% con albúmina de suero bovino al 0.1 %/Ficoll al 0.1 %/polivinilpirrolidona ai 0.1 %/amortiguador de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con NaCI 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C. Otro ejemplo hace uso de formamida al 50%, 5 x SSC (NaCI 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M), fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1 %, 5 x solución de Denhardt, DNA de esperma de salmón sonicado (50 µg/ml), SDS 0.1 %, y sulfato de dextrano 10% a 42°C, con lavados a 42°C en 0.2 x SSC y SDS 0.1 %.

Cuando el polipéptido hK2 es expresado en una célula recombinante diferente a una de origen humano, el polipéptido hK2 está completamente libre de proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar el polipéptido hK2 de los polipéptidos o proteínas de células recombinantes para obtener preparaciones que son substancialmente homogéneas como para el polipéptido de hK2. Por ejemplo, el medio de cultivo o lisado puede ser centrifugado para remover desechos celulares particulados. Las fracciones de proteína soluble y membrana son separadas entonces. El polipéptido de hK2 puede ser purificado entonces a partir de la fracción de proteína soluble y, si es necesario, a partir de la fracción de membrana del lisado de cultivo. El polipéptido de hK2 puede ser purificado entonces a partir de polipéptidos y proteínas solubles contaminantes mediante fraccionamiento sobre columnas de intercambio de iones o inmunoafinidad; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o sobre una resina de intercambio aniónico tal como DEAE; cromatoenfocado; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; o cromatografía de afinidad de ligando. Una vez aislados de las células de huésped transgénicas resultantes, pueden prepararse fácilmente derivados y variantes del polipéptido de hK2. Por ejemplo, las amidas de los polipéptidos de hK2 de la presente invención también pueden prepararse mediante técnicas bien conocidas en la técnica para convertir un grupo o precursor de ácido carboxílico a una amida. Un método preferido para la formación de amida en el grupo carboxilo C-terminal es cortar el polipéptido de un soporte sólido con una amina apropiada, o para cortar en la presencia de un alcohol, produciendo un éster, seguido por aminólisis con la amina deseada. Las sales de grupos carboxilo del polipéptido de hK2 pueden prepararse en la manera usual al poner en contacto el péptido con uno o más equivalentes de una base deseada tal como, por ejemplo, una base de hidróxido metálico, por ejemplo, hidróxido de sodio; una base de carbonato o bicarbonato de metal, al como, por ejemplo, carbonato de sodio o bicarbonato de sodio; o una base de amina tal como, por ejemplo, trietilamina, trietanolamina, y similares. Los derivados de N-acilo de un grupo amino de los presentes polipéptidos pueden prepararse al utilizar un aminoácido N-acil protegido para la condensación final o al acilar un péptido protegido o no protegido. Los derivados de O-acilo pueden ser preparados, por ejemplo, mediante acilación de un péptido libre de hidroxi o resina de péptido. Cualquier acilación puede ser realizada usando reactivos acilantes estándares, tales como haluros de acilo, anhídridos, acil imidazoles, y similares. Tanto la N-como la O-acilación pueden ser realizadas juntas, si se desea. Además, la secuencia de aminoácidos de hK2 interna de la Figura 1 puede ser modificada al substituir una o dos substituciones de aminoácidos conservadoras para las posiciones especificadas, incluyendo substituciones las cuales utilizan la forma D en lugar de la L. La invención también está dirigida a variantes o formas modificadas del polipéptido de hK2. Uno o más de los residuos de este polipéptido puede ser alterado, siempre que se retenga la función antigénica. Se prefieren las substituciones conservadoras de aminoácidos — esto es, por ejemplo, aspártico-glutámico como aminoácidos ácidos; lisina/arginina/histidina como aminoácidos básicos; leucina/isoleucina, metionina/valina, alanina/valina como aminoácidos hidrofóbicos; serina/glicina/alanina/treonina como aminoácidos hidrofílicos. Las sales de adición acidas de los polipéptidos pueden prepararse al poner en contacto el polipéptido con uno o más equivalentes del ácido inorgánico u orgánico deseado, tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico. Los esteres de grupos carboxilo de los polipéptidos también pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos usuales conocidos en la técnica. Una vez aislado, el polipéptido de hK2 y sus variantes antigénicamente activas, derivados y fragmentos de los mismos pueden ser usados en ensayos para hK2 en muestras derivadas de materiales biológicos que se sospecha que contienen anticuerpos anti-hK2 o hK2, como se describe con detalle en la Serial No. 08/096,946. Por ejemplo, el polipéptido de hK2 puede ser marcado con una etiqueta detectable, tal como vía uno o más residuos peptidilo radiomarcados, y puede usarse para competir con hK2 endógenos para ligar los anticuerpos anti-hK2, és decir, como un "antígeno de captura" para ligarse a anticuerpos anti-hK2 en una muestra de un fluido fisiológico, vía varios formatos de inmunoensayo competitivos para hK2, los cuales usan anticuerpos anti- hK2, los cuales son capaces de inmovilización, se realiza al: (a) proporcionar una cantidad de anticuerpos anti-hK2, los cuales son capaces de unión a una superficie sólida; (b) mezclar una muestra de fluido fisiológico, el cual comprende hK2, con una cantidad conocida de polipéptido de hK2, el cual comprende un marcador detectable, para producir una muestra mezclada; (c) poner en contacto dichos anticuerpos con dicha muestra mezclada durante un tiempo suficiente para permitir que ocurran las reacciones inmunológicas entre dichos anticuerpos y dicho hK2 para formar un complejo anticuerpo-hK2, y entre dichos anticuerpos y dicho polipéptido marcado para formar un complejo de polipéptido marcado con anticuerpo; (d) separar los anticuerpos los cuales están ligados a hK2 y anticuerpos ligados al polipéptido marcado de la muestra mezclada; (e) detectar o determinar la presencia o cantidad de polipéptido marcado, ya sea ligado a los anticuerpos en la superficie sólida o permaneciendo en la muestra mezclada; y (f) determinar del resultado en el paso (e) la presencia o cantidad de dicho hK2 en dicha muestra. En otro formato, el cual puede detectar hK2 endógeno en una muestra mediante un inmunoensayo de inhibición competitiva, se adiciona una cantidad conocida de anticuerpo anti-hK2 a una muestra que contiene una cantidad desconocida de hK2 endógeno. La cantidad conocida es seleccionada por ser menos de la cantidad requerida para formar complejo con todo el hK2 que se sospecha que está presente, por ejemplo, que estaría presente en una muestra de la misma cantidad de fluido fisiológico obtenido de un paciente conocido por tener cáncer de próstata. A continuación, se adiciona una cantidad conocida del polipéptido de hK2 de la invención o una subunidad del mismo, comprendiendo un marcador detectable. Si está presente hK2 endógeno en la muestra, estarán disponibles menos anticuerpos para ligar el polipéptido hK2 marcado, y permanecerá libre en la solución. Si no está presente hK2 endógeno, el polipéptido marcado adicionado formará complejo con ios anticuerpos anti-hK2 adicionados para formar complejos binarios. A continuación, los complejos binarios anticuerpo-antígeno son precipitados mediante un anticuerpo de IgG anti-mamífero (borrego, cabra, ratón, etc.). La cantidad de radioactividad u otra marca en el precipitado (un complejo ternario) es inversamente proporcional a la cantidad de hK2 endógeno que está presente en la muestra, por ejemplo, una pella conteniendo cantidades reducidas de radioactividad es indicativa de la presencia de hK2 endógeno. De manera alternativa, las técnicas convencionales para preparar antisueros o anticuerpos policlonales en laboratorio y animales de granja, pueden prepararse anticuerpos monoclonales contra polipéptido de hK2 usando técnicas de cultivo de células de hibridoma conocidas. En general, este método involucra preparar una línea de células fusionadas productoras de anticuerpos, por ejemplo, de células primarias de bazo fusionadas con una línea continua compatible de células de mieloma, y hacer crecer las células fusionadas ya sea en cultivo de masa o en una especie animal a partir de la cual la línea de células de mieloma se derivó o es compatible. Tales anticuerpos ofrecen muchas ventajas en comparación con aquéllos producidos por inoculación de animales, ya que son altamente específicos y sensibles y relativamente "puros" de manera inmunoquímica. Los fragmentos inmunológicamente activos de los presentes anticuerpos también están dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo, el fragmento f(ab), como son anticuerpos monoclonales parcialmente humanizados. La invención se describirá adicionalmente por referencia a los siguientes ejemplos detallados.

Ejemplo 1. Materiales y métodos Construcción de vectores de expresión de hK2 de mamífero Se sintetizó un cDNA (aproximadamente de 820 bp (pares de bases) de largo) codificando el prepro-hK2 completo (pphK2) (a partir del nucleótido #40 a #858 con relación al sitio de inicio del transcripto de pphK2), como se muestra en la Figura 2, a partir de RNA de tejido de BPH humano usando tecnología de reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR), con un par de iniciadores de oligonucleótidos específicos de hK2 (5*ACGCGGATCCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCT3' SEQ ID NO:8 y 5?CAGCTGCAGTTTACTAGAGGTAGGGGTGGGAC3' SEQ ID NO:9). Este cDNA se generó de manera que los extremos 5' y 3' (con respecto a la secuencia de sentido de pphK2) fueron agrupados con las secuencias de BamH l y Pst1 , respectivamente. El cDNa se purificó entonces mediante electroforesis de gel de agarosa, y se digirió con enzimas de restricción BamH l y Pst1 . El cDNA restringido se ligó con vector de plásmido pVL1393 digerido con BamH 1 -Pst1 y se transformó a la especie H B101 de E. coli. Se seleccionaron las E. coli cosechando el vector de plásmido cDNA de pphK2/pVL1393. Se secuenció la inserción conteniendo pphK2. El plásmido cDNA de pphK2/pVL1393 fue producido en masa en E. coli y se purificó mediante ultra-centrifugación de grandiente de CsCl. El plásmido pphK2/pVL1393 en E. coli HB101 ha sido depositado en the American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA el 2 de mayo de 1994 bajo las condiciones del Tratado de Budapest y se le ha asignado el número de acceso ATCC 69614. Se generó un fragmento de 0.8 kb representando la secuencia de codificación de pphK2 completa (Figura 2) mediante PCR usando los iniciadores A (5?TATGGATCCATATGTCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCTCCA3') (SEQ I D NO: 10) y B (5?TATGGATCCTCAGGGGTTGGCTGCGATGGT3') (SEQ ID NO: 1 1 ) y el plásmido pVL1393 conteniendo pphK2 (regalo del Dr. Young, Mayo Clinic) como la plantilla. Los productos de PCR fueron insertados en el vector de clonación TA (Invitrogen Corp. , San Diego, CA) y se secuenció el DNA de la inserción completa. Para obtener los vectores de expresión de hK2 de mamífero, se aislaron las inserciones conteniendo hK2 a partir de los clones TA correspondientes y se insertaron en el sitio Bc1 1 del plásmido pGT-d (Berg et al. , Nucí. Acids Res.. 20. 54-85 (1992)) (regalo del Dr. Brian Grinnell, Lilly) bajo el control del promotor GBMT. Los vectores de expresión de mamífero, PLNS-hK2 y PLNC-hK2 fueron obtenidos al clonar la inserción de hK2 tipo natural de 0.8 kg del vector TA correspondiente en los plásmidos, pLNSX y pLNCX (Miller et al. , Biotech.. 9, 980 (1989)), respectivamente. La orientación de la inserción en todos los vectores de expresión de mamífero se confirmó mediante secuenciación de DNA.

Generación de clones recombinantes AV12-664 (ATCC CRL-9595), una línea de células derivada de tumores inducidos por adenovirus en hámster sirio, y células DU 145 fueron cultivadas en medio Eagle modificado de Dulbecco (alta glucosa) complementado con suero bovino fetal al 10% (D10F). Las células PC3 fueron cultivadas en Medio Eagle Mínimo conteniendo suero bovino fetal al 10%. Las células AV12 fueron transfectadas con los vectores de expresión de hK2 usando el método de fosfato de calcio (Maniatis et al., supra (1989)). Tres días después de células de transfección fueron resuspendidas en D10F + metotrexato 200 nM (MTX). Se aislaron líneas de células clónales resistentes a medicamento después de 2-3 semanas y su medio empleado fue analizado por Western blots. Se transfectaron células PC3 y DU 145 con vectores de expresión de mamífero de hK2 usando lipofectamina (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) y se seleccionaron clones (PC3-hK2 y DU145-hK2) en medios conteniendo 400 µg/ml G418.

Purificación y secuenciación de la proteína Se hicieron crecer clones AV12-hK2 en D10F + MTX 200 nM. A aproximadamente 60% de confluencia, las células se lavaron con solución de sal balanceada de Hank y se resuspendieron en medio HH4 libre de suero. El medio empleado se recolectó 7 días después de la adición de medio empleado libre de suero y se almacenó a -20°C. Para purificar la proteína, el medio empleado libre de suero se concentró e intercambió en bicarbonato de sodio 50 mM pH 8. Las muestras se filtraron con filtros de 0.2 µ y se bombearon directamente sobre una columna de H PLC TSK DEAE-5PX, 21 mm X 150 mm, a una velocidad de flujo de 5 ml/minuto. El Amortiguador A contenía bicarbonato de Na 50 mM, pH 7.9 y el Amortiguador B contenía bicarbonato de Na 50 mM más NaCI 0.5 M, pH 7.6. El perfil de levigación se desarrolló con un gradiente de 0-50% de Amortiguador B sobre 35 minutos; 50-100% B de 35-40 minutos y levigación isocrática a 100% B durante 5 minutos antes del re-equilibrio en Amortiguador A. La velocidad de flujo fue 5 ml/minuto a lo largo. En el procedimiento anterior, amortiguador de borato podría reemplazar amortiguador de bicarbonato sin una diferencia notable. Las fracciones de DEAE fueron ensayadas por la presencia de hK2 mediante el método de ELISA secado (ver más adelante) usando anti-pphK2 de conejo (Saedi et al. , Mol. Cell. Endoc. , 109, 237 (1995)). Las fracciones con actividad de hK2 se depositaron y concentraron mediante ultrafiltración con membranas (corte de 10 kD) a aproximadamente 5-8 ml. El sulfato de amonio sólido se adicionó entonces a una concentración final de 1 .2 M. Esta muestra se inyectó entonces sobre una columna de polipropilaspartamida, PoliLC, tamaño de poro 1000Á, 4.6 mm X 200 mm, para resolver proteínas mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (H IC). El Amortiguador A fue fosfato de Na 20 mM, sulfato de Na 1 .2 M pH 6.3 y el Amortiguador B fue fosfato de Na 50 mM, 2-propanol 5%, pH 7.4. El gradiente de levigación fue 0-20% de B sobre 5 minutos; 20-55% de B sobre 5-20 minutos, ¡socrático a 55% de B de 20-23 minutos, 55-100% de B de 23-25 minutos; ¡socrático a 100% de B durante 2 minutos antes del re-equilibrio con Amortiguador A. La velocidad de flujo fue 1 ml/minuto. El pico de HIC conteniendo hK2, el cual levigó a aproximadamente 50% de B se intercambió en amortiguador de borato 50 mM pH 8 mediante concentración repetida con ultrafiltración de corte Centricon-10 (Amicon) 10 K MW. La pureza se valoró tanto por SDS-PAGE como por análisis Western blot. El coeficiente de extinción usado para estimar concentraciones de hK2v217 fue A2ßo de 1 .84 = 1 mg/ml. En algunos casos, el pico de HIC conteniendo hK2 se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en una columna 10/30 Pharmacia S12. En este caso, el pico de HIC conteniendo hK2 se concentró mediante ultracentrifugación como antes a menos de 1 ml y entonces se aplicó a la columna de exclusión por tamaño equilibrada en acetato de amonio 100 mM pH 7 o borato de sodio pH8. La velocidad de flujo fue 0.7 ml/minuto. El pico de hK2 se concentró entonces mediante ultrafiltración. El pico recolectado en SEC en acetato de amonio se liofilizó para remover el amortiguador y entonces se reconstituyó en agua. Se hidrolizó una alícuota de esta muestra en HCl 6 N gaseoso bajo vacío durante 20 horas a 1 12°C, entonces se reconstituyó en HCl 0.1 N y se analizó en un analizador de aminoácidos Aminoquant de Hewlett Packard utilizando una derivación de pre-columna de aminoácidos con OPA para aminas primarias y FMOC para aminas secundarias. Se usó una resina de afinidad H K1 G 586.1 para purificar hK2 mediante cromatografía de afinidad. Se acopló el anticuerpo monoclonal de HK1 G 586.1 (mAb) con Pharmacia GammaBind más Sepharose (cat. no. 17-0886) de acuerdo a Schneider (J. Biol. Chem.. 257. 10766 (1982)). Brevemente, se incubaron resina y mAb HK1 G 586.1 durante la noche a 4°C con rotación. La resina se centrifugó (500 X g durante 5 minutos) y se lavó dos veces con trietanolmaina 0.2 M, pH 8.2. Los grupos amina fueron reticulados en solución de reticulador fresca (dihidrocloruro de pimelimidato de dimetilo 25 mM en trietanolamina 0.2 M, pH 8.2) durante 45 minutos a temperatura ambiente (22°C). La resina se extinguió con etanolamina 20 mM, pH 8.2, durante 5 minutos a temperatura ambiente y se lavó dos veces con NaCI 1 M, P0 0.1 M, pH 7.0. La resina se lavó dos veces más con PBS y se almacenó a 4°C con NaN3 0.05% hasta usarse. Se usó un secuenciador de fase líquida pulsada de Applied Biosystems Modelo 477a, para secuenciar las proteínas y los péptidos. El Modelo 477a emplea la química de degradación de Edman automatizada para liberar secuencialmente aminoácidos del extremo N seguido por la derivación de PTH y cromatografía mediante HPLC de fase inversa. Las muestras de péptido fueron aplicadas al secuenciador sobre soportes de filtro de fibra de vidrio tratadas en biobreno y se aplicaron proteínas completas ya sea a filtros tratados con biobreno o a filtros Portón pre-activados (Beckman, Fullerton, CA). Las manchas secuenciadas de las muestras fueron corridas primero como mini-geles en el sistema Novex (Novex, San Diego, CA), y transferidas entonces a la membrana PVDF Problot, se visualizaron con azul Commassie, se cortó la banda apropiada y se secuenció directamente de la membrana PVDF.

Producción de anticuerpo monoclonal Se inyectaron ratones A/J con 50 µl de phK2 en auxiliar de Freund completo (CFA) i.p. en el día 1 , 25 µg de phK2 en auxiliar de Freund incompleto (IFA) i.p. en el día 14 y 25 µg de phK2 en PBS i. p. en el día 28. Tres días antes de la fusión, los ratones fueron reforzados con 10 µg de phK2 en PBS i.v. Los ratones fueron sacrificados y se preparó una suspensión de células simple a partir de los bazos. Las células B inmunes se fusionaron con células de mieloma P3.653 usando técnicas bien conocidas para la técnica. Los clones se clasificaron mediante ELISA y se seleccionaron basados en la reactividad de sobrenadantes a hk2v217 y phK2v217 y reactividad mínima con PSA. Dos clones se seleccionaron por estos criterios, los clones HK1 G464 y HK1 G586, se subclonaron usando FACStar más clasificador de células para depositar células simples en capas alimentadoras de bazo de ratón. Los subclones H K1 G464.3 y HK1 G586.1 se usaron para estudios adicionales. Otra fusión, la cual empleó el mismo protocolo descrito antes excepto que el inmunógeno fue hK2v217, se usó alumbre en lugar de CFA e IFA, se usaron ratones BALB/c en lugar de ratones A/J, produjo el clon HK1 H247.

Ensayos ELISA Un formato ELISA secado se usó para medir hK2 en el medio empleado libre de suero de los clones y en las fracciones recolectadas durante la purificación de hK2. Se recubrieron placas de microtítulo (Becton Dickinson Labware, NJ) con 50 µl de medio empleado o fracciones de columna durante la noche a 37°C. Los pozos se lavaron con PBS + 0.1 % Tween 20 (PBST) y se incubaron durante una hora con 50 µl de anticuerpos primarios. Los pozos se lavaron nuevamente con PBS+T y se incubaron durante una hora a 37°C con 50 µl de anticuerpos IgG anti-ratón de cabra o IgG Fc anti-conejo de cabra acoplados con peroxidasa de rábano picante (1 :500, Jackson Immunosearch Laboratories, Inc. , West Grove, PA). Los pozos se lavaron con PBST, se incubaron con dihidrocloruro de o-fenilendiamina (OPD, Sigma, MO) durante 5 minutos, y la reacción colorimétrica se midió a A49o con un lector de ELISA (Biotek Instruments, Inc., modelo EL310, VT). Todas las muestras se ensayaron por duplicado. El medio empleado libre de suero de células AV12 transfectadas con vector solo se usó como control negativo. Los anticuerpos se probaron en una forma de ELISA basado en solución usando phK2v217, hK2v217, y PSA biotinilados. PSA se purificó mediante el método de Sensabaugh y Blanke (J . Urology, 144. 1523 (1990)). Veinte ng de hK2v217 o phK2v217 biotinilados diluidos en 50 µl de Amortiguador A (ácido cítrico 8.82 mM, fosfato de sodio (dibásico) 82.1 mM, BSA 10%, manitol 0.1 %, Nonidet P-40 0.1 %, pH 7.0) o 0.25 ng de PSA biotinilado diluido en suero de caballo 10% (HS) en PBS se incubaron con 50 µl de sobrenadantes de hibridoma, sobrenadantes de control negativo (es decir, sobrenadante de hibridoma irrelevante para phK2v217 y hK2v217, o 20 µg/ml mAb purificado irrelevante en HS para PSA), o sobrenadantes de control positivo (es decir, 20 µg/ml de mAb purificado PSM773 (anti-PSA) en HS para PSA, o sobrenadante de hibridoma HK1 D 104 (anti "hK2") para phK2v217 y hK2v217). HCO514, un mAb contra hCG, se usó como un control negativo en ensayos de PSA, y ZTG085, un mAb contra el tau, se usó como un control negativo en ensayos de hK2. Se permitió que estas mezclas de anticuerpos y antígenos se incubaran durante 1 hora con agitación en una plata de microtítulo recubierta con estreptavidina (Labsystems, Helsinki, Finlandia). La placa se lavó e veces con 300 µl de PBS, Tween-20 0.1 % (PBST), y se incubó con 100 µl de conjugado de IgG anti-ratón de cabra gamma especificáperoxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Westgrove, PA), se diluyó 1 : 10,000 e HS, con agitación durante 1 hora. Después de un segundo lavado de PBST, el color se desarrolló durante 30 minutos, con agitación, siguiendo la adición de 100 µl de 1 mg/ml de o-fenilendiamina en amortiguador de fosfato-citrato 50 mM, perborato de sodio 0.03%, pH 5.0 (Sigma Chemical, St. Louis, MO). La reacción se extinguió mediante la adición de 50 µl de H2S04 4 N. La intensidad de color se determinó al medir la absorbancia a 490 nm y 540 nm usando un lector de placa de microtítulo. Las absorbancias por encima de 2.6 a 490 nm fueron corregidas con lectura de 540 nm. Los valores de las muestras son promedios ± desviación estándar de triplicados. Los valores de control son promedios de duplicados.

Ensayos Western blot Los análisis Western blot se realizaron usando procedimientos estándares. Los medios empleados libres de suero fueron concentrados diez veces usando Centricon 10 (Amicon, Inc. , Beverly, MA) y se sometieron a SDS/PAGE usando un gel al 12% (Bio-Rad, Inc. , Melvilie, NY). Para fines analíticos, se realizó SDS/PAGE en un Pharmacia PhastSystem usando geles de gradiente 8-25%. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron sobre membrana de nitrocelulosa y se bloquearon durante la noche a 4°C con 2% de leche descremada deshidratada en PBS. Las manchas se enjuagaron y luego incubadas con anticuerpo primario (1 : 1000 dilución de ascitis, o 1 µg/ml de mAbs purificados o Abs policlonales) durante 1 hora a 22°C. Las manchas se lavaron entonces y se incubaron durante 45 minutos con anticuerpo secundario (HRP anti-ratón de cabra o HRP anti-conejo de cabra, 1 :500, Jackson Immunosearch Laboratories, Inc. , West Grove, PA). Las bandas inmunoreactivas fueron detectadas al desarrollar la mancha usando DAB (Sigma, St. Louis, MO) más H2O2 o al usar el sistema ECL (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Formación de complejo covalente Para probar la formación de complejo covalente, se incubó 0.175 µM de hK2 con 20 µM de inhibidor a pH 8 en amortiguador de borato 100 mM. Los inhibidores probados fueron 1 -antiquimotripsina (ACT), 1 -antitripsina, 1 -antiplasmina, antitrombina y 2-macroglobulina (MG). A 5 µl de hK2 (10 µg/ml) se adicionaron los µg calculados de inhibidor preparado en amortiguador de borato 100 mM y, si fue necesario, cada muestra se llevó a un volumen total de 10 µl. Las muestras se incubaron durante 3 horas a 37°C sobre lo cual se adicionó 1 .5 µl de amortiguador de muestra 7 X PhastSystem SDS conteniendo 35% de 2-mercaptoetanol y la muestra se hirvió durante 3 minutos en un baño de agua. Las muestras se diluyeron 1/4 en amortiguador de muestra SDS antes de la aplicación a los análisis Western y SDS/PAGE.

Proteólisis de substratos de péptido Para determinar la capacidad de hK2 para cortar los substratos de péptido, los péptidos se disolvieron en DMSO a 10 mg/ml, entonces se diluyó 1 : 10 en amortiguador de borato 100 mM pH 8 conteniendo PSA, hK2 o tripsina. Los experimentos típicos se realizaron como sigue: 1 µl de péptido se adicionó a 7 µl de amortiguador de borato 100 mM y entonces se adicionaron 2 µl de hK2 (10 µg/ml), PSA (500 µg/ml) o tripsina (0.5 µg/ml). En general, las muestras fueron incubadas durante 16 horas a 37°C. Las muestras se extinguieron con 100 µl de TFA 0.21 %/agua y la muestra extinguida se aplicó directamente a una columna de fase inversa Vydac C-18 unida a una HPLC BioRad Modelo 800 equipada con un automuestreador AS100, bombas duales 1350 y detector de UV-VIS de rastreo Biodimension. El Solvente A fue TFA 0.1 %/agua y el Solvente B fue acetonitrilo conteniendo TFA 0.1 %. La muestra se aplicó en 90% de solvente A y el gradiente se desarrolló a 60% de solvente B en 10 minutos. La absorbancia se monitoreó simultáneamente a 220 nm y 280 nm. Los picos recolectados de HPLC se concentraron mediante centrifugación a vacío o liofilización, y entonces se aplicaron al secuenciador de aminoácidos para identificar los fragmentos individuales. En algunos casos, 10 µl de la mezcla de muestra extinguida se aplicó directamente a la membrana de secuenciación y, ya que la secuencia era conocida, los sitios de corte fueron determinados a partir de la distribución de aminoácidos presentes en cada ciclo.

Ensayos de proteasa usando substratos cromogénicos Los ensayos para medir ia hidrólisis de substratos derivados de para-nitroanilida se realizaron usando un espectrofotómetro UV-VIS HP 8452A con un sustentador de celda de 7 posiciones, con termostato, programable. Los ensayos se realizaron en borato de sodio 100 mM pH 8 incubado a 37°C, el incremento de absorbancia se monitoreó a 405 nm. Metoxisucciníl-Arg-Pro-Tyr-para-nitroanilida (MeO-Suc-R-P-Y-pNA) y H-D-pro-phe-arg-para-nitroanilida (P-F-R-pNA) fueron 1 mM en el ensayo. Se empleó un sintetizador de péptido ABI modelo 431A usando química FastMoc estándar para sintetizar todos los péptidos listados en la Figura 16 excepto #2, angiotensinógeno y #5, beta-cadena oxidada de insulina, los cuales fueron obtenidos de Sigma. La masa de cada péptido sintetizado se confirmó mediante espectrometría de masa (University of Michigan, Core Facility) usando ES/MS. Se empleó un secuenciador ABI Modelo 477a descrito antes para confirmar la secuencia de péptido.

Conversión de phK2v217 a hk2v217 Se incubaron muestras de phK2 ,vv2¡í117' a 100-400 µg/mi en borato de sodio 50 mM con 1 % p/p de tripsina o hK2 a 37°C. La conversión de pro a maduro se monitoreó mediante dilución de 1 -2 µg de material de inicio de hK2v217 en 100 µl de Amortiguador A de HIC y resolución de las dos formas mediante HIC-HPLC como se describió antes. La incubación de hK2v217 con phK2v217 se condujo en la misma manera excepto que cantidades comparables de las dos formas se incubaron juntas como se ve en la Figura 17B.

Ejemplo 2. Expresión y purificación de hK2v217 en células de mamífero Para expresar hK2 en líneas de células de mamífero, un fragmento de 0.8 kb que codifica la secuencia de codificación completa de hK2 (pphK2) (Figura 2) se amplificó usando PC R, se subclonó en el vector PCR II (TA) y se aislaron varios clones. La secuencia de nucleótidos de la inserción de pphK2 completa en unos cuantos de estos clones se determinó para detectar cualquier mutación que pudiera haber sido causada por la amplificación de PCR. Dos clones, uno teniendo una inserción de hK2 tipo natural, TA-hK2, y uno teniendo una inserción de hK2 mutante, TA-hK2 217, se seleccionaron para análisis adicional. TA-hK2v217 (SEQ ID NO: 14) contiene una substitución de T por C en el codón 650 de hK2, resultando en una substitución conservadora de valina (GTT) por alanina (GCT) en el residuo de aminoácidos 217 de hK2 (Figura 2). Para obtener vectores de expresión de mamífero, las inserciones de pphK2 de TA-hK2 y TA-hK2v217 se subclonaron en plásmido PGT-d bajo el control del promotor GBMT resultando en plásmidos pGThK2 y pGThK2v217 (Figura 3). El promotor GBMT está compuesto de varias secuencias reguladoras y es activado por la proteína(s) E1 A de adenovirus (Berg et al. , supra (1992)). Para determinar si el producto del gene pphK2v217 hubiera sido expresado en células de mamífero, el plásmido pGThK2v217 se transfectó en células AV12-664. Esta línea de células es derivada de un tumor inducido en hámster sirio por adenovirus tipo 12 y expresa la proteína E1 a de adenovirus. La proteína E1 a activa el promotor GBMT lo cual resulta en la expresión del producto de gene bajo el control de este promotor. Después de 2-3 semanas, las células clónales resistentes a MTX fueron aisladas y sus medios empleados fueron analizados mediante Western blots. Los diversos clones fueron identificados, los cuales secretaron en el medio un polipéptido inmunoreactivo a antisuero anti-pphK2. Un clon (AV12-pGThK2v217 #2) se seleccionó para caracterización adicional y purificación de proteína. Para purificar los polipéptidos hK2, el medio empleado libre de suero del clon AV12-pGThK2v217 #2 se recolectó después de 7 días, se concentró y sometió a cromatografía de intercambio de aniones (Figura 4A). El pico de actividad de hK2 se levigó a aproximadamente NaCI 0.2 M como se determinó mediante ensayos ELISA (línea punteada). El ensayo ELISA se correlacionó bien con la aparición de una banda de -34 kD de proteína vista mediante SDS/PAGE en las mismas fracciones. Las fracciones positivas de hK2 de la columna de intercambio de aniones fueron recolectadas y sometidas a cromatografía de interacción hidrofóbica (H IC) (Figura 4B). Una porción principal de A2ßo no fue retenida en la columna HIC. El pico principal retenido en HIC, el cual se levigó a 22 minutos, también mostró el pico más alto de actividad mediante ensayo ELISA (línea punteada, Figura 4C). Una banda de proteína principal a -34 kD también se observó mediante SDS-PAGE. Cuando se resolvió el pico de 22 minutos de HIC mediante SEC, normalmente aproximadamente 80-90% de la proteína A2ßo se levigó a 19.4 minutos, un tiempo de retención consistente con una proteína de aproximadamente 34 kD (Figura 4C). El único pico de proteína diferente en SEC, levigando a 16.7 minutos, correspondió a una proteína de -70 kD observada en pasos de purificación previos. Para identificar la proteína purificada, aproximadamente 2.5 µg de la proteína se sometieron a análisis N-terminal automatizado, el cual produjo la siguiente secuencia: Val-Pro-Leu-Ile-GIn-Ser-Arg-lleu-Val-Gly-Gly-Trp-Glu- (SEQ ID NO: 15). Ninguna secuencia competitiva fue evidente a partir del perfil de aminoácidos liberado secuencialmente mediante el procedimiento de degradación de Edman. Por analogía a PSA esta proteína es phK2 217, ya que la secuencia conocida de PSA maduro (aislado de fluido seminal) empieza con lleu-Val-Gly- y pPSA y phK2 han sido postulados por tener 7 aminoácidos extra en el extremo N (Figura 2). El análisis de aminoácidos produjo una composición de aminoácidos consistente con la secuencia predicha de phK2v217. Este polipéptido phK2 fue purificado en cantidades en mg.

Ejemplo 3. Caracterización de phK2v217 y generación de hK2v217 Para examinar la eficiencia del esquema de purificación empleado en el Ejemplo 2, 1 .5 µg de phK2v217 se sometió a SDS/PAGE en la presencia o ausencia de beta-mercaptoetanol (BME), y el gel se manchó con plata. Los resultados mostraron que el phK2 217 en la muestra fue aproximadamente 95% (Figura 5). También se mostró que phK2v217 migró a -30 kD en la ausencia de BME, y a -34 kD en la presencia de BME. Este patrón es similar al observado para el PSA purificado del fluido seminal (Figura 5). La secuencia de aminoácidos de hK2, deducida a partir de la secuencia de cDNA, muestra la presencia de un sitio de glicosilación N-enlazado potencial en el residuo 78 (N-M-S). Para determinar si este sitio es glicosilado, se sometió phK2v217 a SDS/PAGE, se transfirió a papel de nitrocelulosa, se hizo reaccionar con lecitinas acopladas con digoxigenina (DIG), seguido por anti-DIG marcada de peroxidasa de rábano picante.

En la Figura 6 (sendero 1 ), 2 µg de phK2 se manchó con concanavalina A (Con A) sugiriendo la presencia de dos residuos de cc-manosil 2-O-substituido o no substituido en ia proteína. El sendero 2 muestra manchado de Con A de la glicoproteína de control positivo, mAB ZCE025. Se sabe que tanto las cadenas pesadas (50 kD) y las cadenas ligeras (25 kD) de este mAb contienen oligosacáridos N-enlazados con núcleos de mañosa. El sendero 3 muestra que una proteína no glicosilada (BSA) falla en reaccionar con la lecitina Con A. También se hizo reaccionar phK2v217 con RCA (especificidad de Gal b1 -4GlcNAc) y AAA, (especificidad de fucosa a(1 -6)enlazada). Este patrón de reactividad de lecitina es consistente con la presencia de oligosacáridos N-enlazados complejos. Los oligosacáridos en phK2v217 también contiene ácido siálico ya que tanto SNA (ácido siálico enlazado a(2-6) a galactosa) y MAA (ácido siálico enlazado a(2-6) a galactosa) fueron reactivos con phK2v217. La secuencia de la región pro es VPLIASR (SEQ ID NO: 12). Un corte enzimático en el extremo carboxi-terminal de la arginina en esta secuencia pro convertiría phK2 a hK2. Una digestión de tripsina suave se desarrolló para hidrolizar la ligadura de péptido de phK2 217 purificado en esta posición. phK2v217 se incubó con tripsina 1 % y la conversión se monitoreó mediante HIC-HPLC (Figura 7). Este procedimiento resultó en una conversión completa de phK2 217 a hK2v217. El pico designado hK2v217 se secuenció de manera N-terminal y se mostró que empieza con la secuencia, IVGGWE, la cual es el extremo N para la forma madura de hK2. Ninguna otra secuencia aparte de ia anterior fue detectada, demostrando que este tratamiento de tripsina suave no resulta en ningún nivel significativo de corte no específico. SDS/PAGE de muestras tratadas con tripsina mostraron un pequeño pero discernible aumento en movilidad, generalmente consistente con una reducción menor en masa de 826 daltones, la masa del pro péptido.

Ejemplo 4. Generación de Abs específicos de hK2 Se usaron phK2v217 y hK2v217 como inmunógenos para generar anticuerpos monoclonales (mabs) contra hK2. Los hibridomas fueron clasificados basados en la alta reactividad con hK2v217 o phK2v217 y reactividad mínima con PSA. Los representativos de mAbs obtenidos de los hibridomas se muestran en la Tabla 1 . La inmunización con phK2v217 resultó en mAb HK1 G586.1 y HK1 G 464.3. HK1 G586.1 fue hK2-específico, ya que reconoció tanto phK2v217 como hK2v217 pero no PSA. Por otra parte, HK1 G464 fue phK2-específico, ya que solo reconoció phK2v217 y no hK2v217 o PSA.

Tabla 1 Especificidad de varios mAbs cultivados para hK2 V217 y phK2 ,V217 A. mAbs cultivados para phK2 V217 B. mAbs cultivados para hK2 V217 La inmunización con hK2v217 resultó en mAb HK1 H247. Este mAb fue hK2-específico ya que solo reconoció hK2 217 pero no phK2v217 o PSA. Estos resultados muestran que phK2v217 y hK2 217 son útiles como inmunógenos para generar mAbs específicos para diferentes formas de hK2.

Se usó un análisis Western blot para examinar si HK1 G586 reconoce hK2 en fluido seminal (Figura 8). Las bandas hK2-inmunoreactivas a -22 kD, -33 kD, y -85 kD fueron reconocidas por este mAb. También fue reportado recientemente un patrón hK2-inmunoreactivo similar en fluido seminal por Deperthes et al., Biochem. Biophv. Acta. 1245, 31 1 (1995). Este resultado indica que un mAb cultivado para hK2 217 reconoce hK2 natural en fluido seminal. Todos los anticuerpos cultivados para hK2v217 o phK2v217 también reconocieron la forma correspondiente de hK2 y phK2 indicando que hK2 y phK2 son inmunológicamente similares a hK2 V21 7 phK2v217, respectivamente (ver más adelante).

Ejemplo 5. Expresión de hK2 en células de mamífero Para expresar hK2 de tipo natural (hK2) en células de mamífero pGThk2 (Figura 3) se transfectó en células AV12. Varios clones expresando un polipéptido de hK2 fueron identificados mediante análisis Western usando HK1 D 106.4 (un mAb hK2-específico cultivado para un polipéptido correspondiente a residuos de aminoácidos 17-71 de hK2). El clon AV12-hK2#27 (AV12-hK2) se seleccionó para análisis adicional basado en su nivel de expresión de hK2 mayor. Las células transfectadas con vector solo (pGTD) no mostraron reactividad con HK1 D 106.4. Un ELISA usando mAb HK1 D 106.4 indicó la presencia de -0.5-1 µg/ml de un polipéptido de hK2 en el medio empleado libre de suero de AV12-hK2 en el día 7. El mismo método usado en la purificación de phK2v217 a partir de AV12-hK2v217 se usó para purificar polipéptido hK2 desde el medio empleado del día 7 de AV12-hK2. Esto resultó en bajos rendimientos de polipéptidos de hK2, los cuales fueron altamente inestables a los procedimientos de purificación y de esta manera imprácticos para usarse como un inmunógeno. Los polipéptido de hK2 fueron purificados parcialmente usando el método anterior, sometidos a SDS/PAGE, electromanchados y sometidos a secuenciación de aminoácidos N-terminal Este análisis indicó que el polipéptido de hK2 en el medio empleado de AV12-hK2 en el día 7 tiene la secuencia, IVGGWECEK (SEQ ID NO: 17) en el extremo N. Ninguna secuencia competitiva fue evidente del perfil de aminoácidos liberados secuencialmente mediante el procedimiento de degradación de Edman. Por comparación a PSA, esta secuencia corresponde a hK2 maduro (hK2). El análisis de aminoácidos de esta proteína también fue consistente con el de hK2. Este hallazgo fue fascinante ya que mostró que predominantemente phK2v217 estuvo presente en el medio empleado libre de suero de AV12-hK2v217 en el día 7, mientras que predominantemente hK2 estuvo presente en el medio empleado libre de suero de AV12-hK2 en el día 7. Para examinar la forma de hK2 presente en el medio libre de suero de AV12-hK2 en el día 1 , este material se purificó parcialmente mediante purificación por afinidad usando mAbs HK1 G 586.1 . La proteína de -34 kD se transfirió sobre PVDF y se sometió a análisis N-terminal revelando una secuencia, VPLIQSRIVGG. Ninguna secuencia competitiva fue evidente del perfil de aminoácidos liberado secuencialmente mediante el procedimiento de degradación de Edman. Comparado con PSA, esta secuencia corresponde a phK2. Esto sugiere que el polipéptido de hK2 es secretado como la forma pro tanto por células AV12-hK2 como AV12-hK2v217. Sin embargo, mientras que phK2v217 es estable y no es convertido a hK2v217, phK2 es inestable y se convierte fácilmente a hK2 de manera extracelular.

Ejemplo 6. Biosíntesis de hK2 Para estudiar adicionalmente la biosíntesis de hK2 en células de mamífero, se condujo un estudio de transcurso de tiempo donde el medio empleado libre de suero del clon AV12-hK2 #27, se recolectó cada día durante 8 días consecutivos, se concentró y se sometió a SDS/PAGE. Las proteínas fueron transferidas a membrana de nitrocelulosa y se probaron ya sea con mAbs HK1 D 106.4 o HK1 G 464.3 (Figura 9). También como se mostró en la Figura 9, HK1 D 106.4 reconoce tanto phK2 y hK2 mientras que H K1 G 464.3 solo reconoce phK2 ya que su epitope se encuentra en a región -7 a +7 de hK2. La expresión de polipéptidos de hK2 (-34 kD) tuvo su pico por el día 3 y se niveló posteriormente, como se detectó mediante mAbs HK1 D 106.4. Otras dos bandas inmunoreactivas que migran a -70 kD y -90 kD también se detectaron desde el día 4 en adelante. Por otra parte, cuando las mismas muestras fueron manchadas y probadas con HK1 G 464.3, se detectó una reducción gradual en el nivel de hK2 por el día 4. Por el día 8, se encontraron niveles muy bajos de hK2 en el medio empleado. Este resultado muestra que phK2 está siendo secretado en el medio mediante células AV12-hK2 y es convertida gradualmente a hK2 de manera extracelular. Curiosamente, las bandas -70 kD y -90 kD no se observaron con mAbs HK1 G 464.3 indicando que estas bandas son ya sea homo-oligómeros de hK2 o son hK2 covalentemente acomplejado todavía con una proteína(s) desconocida. Aún cuando la identidad de estas bandas no es conocida en este momento, sirven como marcadores para la presencia de hK2 en el medio empleado. En la Figura 9, las proteínas phK2v217 y hK2 217 purificadas se usaron como controles. Para estudiar la biosíntesis de hK2v217 en células AV12, se condujo un estudio de transcurso de tiempo similar en el clon AV12-hK2v217 #2. Como se muestra en la Figura 10, la expresión de polipéptidos de hK2v217 tuvo su pico por ei día 3 y no varió mucho desde el día 4 hacia adelante como se detectó mediante mAbs HK1 D 106.4. Se obtuvieron resultados similares cuando se probó la mancha con mAbs HK1 G 464.3 (Figura 10). Esto indicó que las células de clon AV12-pGThK2v217 #2 están expresando phK2v217 desde el día 1 hacia adelante y que durante al menos 8 días posteriormente, esta proteína no es convertida a la forma madura. Estos resultados están en contraste con aquéllos de phK2, el cual se convierte a hK2 si es dejado en el medio durante 8 días, indicando que phK2v217 es estable en el medio a 37°C durante 8 días.

Para estudiar si la conversión extracelular de phK2 a hK2 se correlaciona con la viabilidad de células de clon AV12-hK2 #27 en cultivo, las células de clon #27 fueron contadas usando exclusión de azul tripano. La expresión de hK2 en el medio empleado se midió mediante ELIS usando tanto mAbs HK1 D 106.4 como HK1 G 464.3. Como se muestra en la Figura 1 1 , el número de células viables tuvieron un pico en 38 millones en cultivo por el día 3 y disminuyeron gradualmente después. Por el día 8, el número de células viables fue reducido a menos de 10 millones. La expresión de phK2 (medida por HK1 G 464.3) también tuvo pico por el día 3 y declinó gradualmente después. Por otra parte, la expresión de hK2 (medida por HK1 D 106.4) tuvo pico por el día 3 pero se niveló posteriormente. Este resultado indica que phK2 es secretado por células AV12-hK2 y una fracción de él se convierte gradualmente de manera extracelular a hK2 por el día 4. Más aún, muestra que la conversión de phK2 para hK2 claramente se correlaciona con una disminución en la viabilidad de células, indicando que las proteasas extracelulares liberadas mediante las células moribundas puede ser uno de los factores responsable de esta conversión. La expresión de hK2 fue más alta en el punto en las cuales las células fueron más viables. Una disminución en hK2 fue paralela a una disminución en la viabilidad celular, sugiriendo que el hK2 es secretado por estas células, como se opone a ser liberado siguiendo la muerte y lisis celular. Además, un aumento en hK2 correspondió a una gota en phK2, indicando que ia forma pro de hK2 fue convertida automáticamente a la forma madura sobre el tiempo.

Para examinar la biosíntesis de hK2 en células de carcinoma de próstata hK2 se expresó en líneas de células DU 145 y PC3. pphK2 se clonó en plásmidos pLNCX y pLNSX (Miller y Rosman, BioTechniques. 7, 980 (1989)), bajo el control de los promotores de CMV y SV40, respectivamente. Los plásmidos resultantes, pLNC-hK2 y pLNS-hK2, respectivamente, se transfectaron en células PC3 y DU145, respectivamente, y los clones se seleccionaron en medios conteniendo G418. Los clones expresando altos niveles de hK2 fueron seleccionados (PC3-hK2 y DU 145-hK2) mediante ELISA y Western blots. Para valorar el nivel de hK2 y phK2 en los medios, medio libre de suero de células PC3-hK2 y DU 145-hK2 se sometieron a análisis Western blot usando mAbs HK1 D 106.4 (hK2-específ¡co) y HK1 G 464.3 (phK2-específico) (Figura 12). Los resultados mostraron que phK2 está presente en el medio empleado tanto de DU 145-hK2 y PC3-hK2. Esto indica que en células de carcinoma de próstata hK2 se secreta como phK2 y se convierte a la forma madura extracelularmente. Este hallazgo confirma los resultados previamente obtenidos con células AV12. Predominantemente phK2 se detectó en el medio empleado de células PC3-hK2 aún después de 7 días, sin embargo, predominantemente hK2 estuvo presente en el medio libre de suero de DU 145-hK2 iniciando desde el día 1 . Esto probablemente se debe a la abundancia de proteasas extracelulares en el medio empleado de DU 145. Para examinar si los resultados anteriores fueron limitados solo a un clon, se probaron otros 3 clones aislados independientemente de AV12-hK2 y otros 4 clones aislados independientemente de AV12-hK2 para la expresión de polipéptidos de hK2. El medio empleado libre de suero de los clones fue recolectado en el día 7 y se probó para la expresión de hK2 mediante Western blots usando mAbs HK1 D 106.4 (hK2-específico) y HK1 G 464 (phK2-específico) (Figuras 13 y 14). En todos los clones AVa12-hK2, mAb HK1 D 106.4 detectó no solo la banda -37 kD principal ("hK2"), sino también las bandas -70 kD y -90 kD, que son indicativas de la presencia de hK2 (Figura 13). HK1 G 464.3 detectó niveles muy bajos de phK2 en todos los clones AV12-hK2 (Figura 14). Este resultado indica que predominantemente hK2 está presente en el medio empleado de todos los clones AV12-hK2, verificando el mecanismo biosintético establecido para el clon AV12-hK2 #27. Se usaron los mismos análisis en los clones AV12-hK2v217 (Figura 14). Los resultados indicaron que solo phK2v217 estuvo presente en el medio empleado de estos clones en el día 7, verificando nuestros hallazgos con el clon AV12-hK2v217. Los resultados anteriores sugieren colectivamente que hK2 es expresado como la forma pro en células de mamífero y se convierte a la forma madura extracelularmente mediante proteasas todavía desconocidas. Estos resultados también sugieren que phK2 está presente en fluidos biológicos y por lo tanto pueden ser un marcador diagnóstico útil para pCa y BPH.

Ejemplo 7. Actividad enzimática y especificidad de hK2 y hK2 V21 7 Una pequeña cantidad de hK2 se purificó a suficiente pureza para establecer su actividad enzimática y especificidad de substrato. La actividad general de hK2 fue medida al determinar su actividad amidolítica cromogénicamente en derivados de p-nitroanilida de péptidos (Tabla 2). La p-nitroanilida liberada por digestión proteolítica de estos substratos se mide a absorbancia A 0s- La metoxisuccinil-Arg-Pro-Tyr-para-nitroanílida de substrato (MeO-Suc-R-P-Y-pNa) es usada para medir proteasas similares a quimotripsina, las cuales cortan en la fenilalanina. Este substrato ha sido usado previamente para medir la actividad de pSA (Christensson et al. , Eur. J. Biochem.. 194. 755 (1990)). El substrato H-D-Pro-Phe-Arg-para-nitroanalida (P-F-R-pNa) es específica para proteasas silmilares a tripsina, las cuales cortan en la arginina (R). Se encontró que hK2 tenía actividad global más de 10 veces mayor que hK2v217 en P-F-R-pNA, y ninguna proteína mostró una capacidad para hidrolizar MeO-Suc-R-P-Y-pNA, el substrato de quimotripsina. Otros substratos comparables conteniendo sitios similares a tripsina para corte (lisina, arginina) también fueron probados y se encontró que hK2 hidroliza el substrato P-F-R-pNA con la velocidad más alta. Estos hallazgos indican que hK2 tiene actividad similar a tripsina.

Tabla 2 Actividad amidolítica en substratos cromogénicos Tabla 2: Actividad amidolítica de hK2, hK2v217, PSA y tripsina en substratos cromogénicos. La especificidad de hK2 y hK2v217 se examinó con más detalle mediante el uso de substratos de péptido junto con análisis de secuencia de aminoácidos N-terminal para determinar cuales ligaduras de péptido habían sido hidrolizadas. La Figura 15 muestra la actividad amidolítica en el polipéptido CALPEKPAVAYAATKVVHYRKWKDTIAAN (SEQ ID NO: 16), el cual tiene ambos sitios de corte de quimotripsina y tripsina potenciales. hK2v217 cortó tanto en un sitio de tripsina (R-K) como de quimotripsina (Y- R) con el corte similar a tripsina en una proporción 2: 1 sobre el corte similar a quimotripsina. Como un control en estos experimentos, también se incubó phK2v217 con este péptido y no mostró actividad amidolítica. hK2 mostró especificidad diferente a hK2v217 hacia este substrato de péptido. No se vio ninguna especificidad similar a quimotripsina para hK2 en este substrato y su actividad fue exclusiva para el sitio similar a tripsina (R-K). Ninguno de los otros residuos de lisina (K) en este polipéptido fue hidrolizado, indicando que la especificidad de hK2 fue exclusiva para el residuo de arginina (R). Como un control, también se estudió tripsina en este substrato. La tripsina cortó todos ios sitios de lisina (K) y arginina (R), excepto la ligadura K-P, ia cual se sabe que no es un sitio adecuado para corte de tripsina. La tripsina cortó el sitio R-K del substrato 210-236 (péptido #1 , Figura 16) a velocidades de aproximadamente 2X más rápido que hK2 y -4000X más rápido que hK2v217. Ninguna ligadura similar a quimotripsina se cortó mediante tripsina. PSA cortó la ligadura Y-R principalmente. También se vio una actividad similar a tripsina menor en la ligadura R-K para PSA (Figura 15). Esto fue consistente con la actividad similar a tripsina menor previamente vista para PSA en el substrato cromogénico (Tabla 2). Otros diversos substratos de péptido también fueron incubados con hK2 y PSA (Figura 16). En todos los péptidos probados, hK2 tuvo especificidad sólo para argininas seleccionadas, y PSA principalmente para residuos de tirosina (Y), fenilalanina (F) y leucina (L) seleccionados. Solo el péptido #1 en la Figura 16 se cortó por hK2 217 como detallado mediante los cromatogramas en la Figura 15.

Ejemplo 8. Activación de phK2 Vv2¿117' por hK2 La secuencia de péptido #3 en la Figura 16 corresponde a residuos de aminoácidos -7 a +7 de phK2. Esta región contiene el pro péptido, VPLIQSR, el cual es encontrado como un péptido líder N-terminal en phK2v217. Como se mencionó antes, hK2 fue capaz de cortar este péptido liberando la región de pro péptido, pero hK2v217 no fue. Para delinear si hK2 puede cortar esta secuencia pro en un substrato natural, su capacidad para convertir phK2 217 a hK2v217 se monitoreó. phK2v217 se incubó con hK2 1 % y la conversión se monitoreó mediante el método de HIC-HPLC (Figura 17A). Los resultados mostraron que hK2 fue capaz de convertir phK2v217 a hK2v217, aunque a una velocidad -30X menor que la tripsina. Cuando phK2v217 se incubó con 40% de hK2v217, no se detectó ninguna diferencia en las proporciones de las dos formas hK2 aún después de 6 horas (Figura 17B). Esto corroboró las observaciones previas con el substrato de péptido y mostró que, aún en un substrato natural solo hK2, y no hK2v217, cortó la región pro de hK2. Estos resultados demuestran colectivamente la estabilidad de phK2v217 y hK2v217 sobre incubación prolongada. Cuando se comparó con hK2 217, hK2 mostró tener una actividad proteolítica mayor, mayor grado de especificidad y, en particular, tener una especificidad para la forma pro de hK2 como se demuestra mediante la actividad en el pro péptido en la Figura 15 y por su actividad hacia phK2v217, como se muestra en la Figura 17. Estos resultados demuestran una diferencia significativa en la actividad enzimática entre hK2 y hK2v217 y puede ayudar a explicar los bajos rendimientos obtenidos siguiendo intentos para purificar hK2 del medio, comparado con rendimientos de phK2v217. Las preparaciones altamente purificadas de hK2 no pueden ser estables debido a la autólisis, como se ve para otras proteasas activas. Estos resultados sugieren adicionalmente que, además de pruebas inmunológicas, podrían usarse pruebas para determinar su actividad enzimática en substratos hK2-específicos para monitorear el nivel de hK2 en fluidos corporales.

Ejemplo 9. Formación de complejos de inhibidor con hK2 Se ha mostrado que PSA forma complejos con a.2 macroglobulina (MG) y el inhibidor de proteasa de serína, antiquimotripsina (ACT). Para explorar su formación de complejo, se incubó hK2 con una serie de proteasas comunes presentes en plasma humano (ACT, a2-antiplasmina, antitrombina lll, y a1 -antitripsina (Travis y Salvesen, Ann. Rev. Biochem. , 52, 655 (1983)) y las mezclas se analizaron mediante Western blot (Figura 18). Cualquier complejo covalente de hK2 con estas serpinas resultaría en una banda -80-100 kD en SDS/PAGE bajo condiciones reductoras. ACT y a2-antiplasmina formaron significativamente complejos con hK2 (Figura 18, sendero 1 y 2). La antitrombina ll l (sendero 3) y a1 -antitripsina (inhibidor de a1 proteasa, sendero 4) no formaron ningún complejo detectable con hK2. MG, un componente principal de plasma sanguíneo, también formó complejo rápidamente con hK2 (sendero 5). Este complejo corresponde a Mr de -200 kD y 120 kD, los cuales también se formaron cuando PSA se incubó con MG purificado (Figura 18, sendero 8, ver más adelante). Fue particularmente interesante que hK2 no formó complejos con a1 -antitripsina, aún cuando esta proteína inhibe un amplio rango de proteasas similares a tripsina (Loebermann et al. , J. Mol. Biol.. 177. 531 (1984); Carrell y Travis, TIBS. 10. 20 (1985)). No fue sorprendente que hK2 formó un complejo con a2-antiplasmina, ya que esta proteína tiene residuos de arginina en su sitio activo de inhibidor (Hunt y Dayhoff, Biochem. Biophy. Res. Comm.. 95. 864 (1980); Chandra et al. , Biochemistrv. 22. 5055 (1983); Potempa, et al. , Science. 241 . 699 (1985); Shieh et al. , J. Biol. Chem.. 264. 13420 (1989); Mast et al. , Biochemistrv, 30, 1723 (1991 )). No se esperó que hK2 formaría un complejo con ACT, ya que ACT tiene una leucina en su sitio activo de inhibidor. Claramente, las similitudes estructurales entre pSA y hK2 tienen influencia sobre su formación de complejo con un inhibidor común, aún cuando su especificidad proteolítica es completamente diferente como se demuestra en la Figura 16 y Tabla 2. Cuando se clava en suero humano femenino, hK2 formó rápidamente un complejo con MG como se detectó mediante Western blot (Figura 18). El sendero 1 y el sendero 3 son controles solos de hK2 y suero, respectivamente, El sendero 2 es hK2 incubado con ACT, mostrando el complejo hK2-ACT de 90 kD y hK2 residual. Los senderos 4 y 5 son hK2 clavados en suero durante 15 minutos y 1 hora, respectivamente. El sendero 6 es hK2 incubado con MG purificado durante 4 horas. El sendero 7 es PSA clavado en suero durante 15 minutos y el Sendero 8 es PSA incubado con MG purificado durante 4 horas. Estos resultados muestran que MG forma el principal complejo cuando hK2 o PSA son clavados en suero humano en experimentos in vitro. Ya que se sabe que ocurre un complejo de PSA con ACT en el suero sanguíneo de pacientes con enfermedad de próstata, es probable que hK2 presente en el suero también forme algún nivel de un complejo con ACT.

Discusión No se conocen los mecanismos de secreción y procesamiento de proteína in vivo para PSA o hK2. Los resultados presentados aquí muestra que phK2 es secretado por células AV12-hK2, DU 145-hK2, y PC3-hK2, indicando que hK2 normalmente es secretado como phK2 y el propéptido es cortado extracelularmente. Esto sugiere que phK2 existe en fluidos biológicos y de esa manera puede ser un útil marcador diagnóstico para pCa o BPH. Tanto la forma mutante de hK2 (hK2v217) y la forma tipo natural de hK2 se purificaron a partir de células AV12. hK2 fue muy inestable para los procedimientos de purificación empleados lo cual, como se encontraban con otras proteasas, puede deberse a su propiedad autocatalítica, y hace muy difícil purificar hK2 o phK2 en cantidades suficientes para usarse como inmunógenos y calibradores. En contraste, phK2v217 es altamente estable y se convierte a hK2v217, el cual también fue estable, mediante digestión de tripsina. phK2 217 y hK2v217 purificados proporcionaron inmunógenos para generar mAbs específicos para hK2 y phK2.

Ejemplo 10. Detección de polipéptidos de hK2 en sobrenadante de línea de células de cáncer de próstata Aunque PSA es un marcador diagnóstico ampliamente usado para cáncer de próstata (PCa), la detección de PSA no puede distinguirse entre PCa e hiperplasia prostática benigna. Para determinar si phK2 podría ser detectado en ei sobrenadante de una línea de células de carcinoma de próstata, se incubaron sobrenadantes de células LNCaP, las cuales secretan de manera natural tanto hK2 como PSA, con antisueros hK2-específicos. Se empleó un ensayo de "sandwich" secuencial que usa placas de microtítulo de estreptavidina para medir phK2. mab pro hK2-específico HK1 G464 se biotiniló y se usó como el reactivo de captura. Mab H K1 H449, el cual detecta tanto phK2 como hK2, fue marcado con europio y se usó como el reactivo detector. La inmunofluoresencia resuelta con tiempo se midió usando un fluorómetro Delfia. Se logró la calibración del ensayo al diluir phK2v217 purificado para variar niveles de 0 a 100 ng/ml (Figura 20). El ensayo se probó por reactividad cruzada para PSA usando PSA purificada de fluido seminal. PSA a 10 µg/ml rindió una reactividad cruzada de 0.1 %. Además, un ensayo que detecta tanto phK2 como hK2 se estableció en una manera análoga usando mab biotinilado HK1 G586 como el reactivo de captura. La reactividad cruzada de PSA para este ensayo fue 0.3%. Las células LNCaP fueron cultivadas a 80% de confluencia en RPMI + suero de ternera fetal 10%. El medio de crecimiento fue aspirado, y las placas se lavaron con 1 X PBS. Se adicionó HH4 + mibolerone 10 nM, y el medio empleado se recolectó durante 4 días. Las células viables se enumeraron mediante manchado de azul tripano. Las muestras se concentraron 4 veces y se ensayo para PSA (Tandem®-R, Hybritech, Inc. , San Diego, CA), phK2 (captura de HK1 G464) y phK2 + hK2 (captura de HK1 G586). Además, la actividad enzimática de hK2 se midió usando un substrato cromogénico hK2-específico (Figura 21 ). Los resultados de este ensayo mostraron que tanto phK2 como hK2 fueron expresados por células de carcinoma prostático. Los niveles de phK2 y hK2 alcanzaron un máximo por el día 2, mientras que los niveles de PSA continuaron aumentando. La actividad enzimática de hK2 aumentó a lo largo del transcurso de tiempo, io cual sugiere que phK2 se convierte a hK2 sobre el tiempo. Se aplicaron alícuotas de las muestras de LNCaP, las cuales fueron normalizadas para inmunoreactividad de hK2 HK1 G586, así como muestras de hK2, phK2, PSA, pphK2, y ppPSA como controles, a 4-20% Novex Tris/Giy SDS PAGE y entonces se electromancharon a nitrocelulosa. Las manchas se probaron usando ya sea HK1 G464 (20 µg/ml) o HK1 G586 (2 µg/ml) como un anticuerpo primario. Después de una incubación de 2 horas con anticuerpo primario a temperatura ambiente, las manchas se lavaron y probaron entonces con un anticuerpo secundario de HRP antiratón de cabra. Después de una hora de incubación con el anticuerpo secundario a temperatura ambiente, las manchas se lavaron antes del desarrollo con ECL. Los resultados mostraron que ni HK1 G464 ni HK1 G586 reconocieron PSA o ppPSA (Figuras 22 y 23, senderos 3 y 5, respectivamente). Más aún, HK1 G464 es phK2 específico, ya que solo reconoció phK2 (Figura 22, sendero 2) y no hK2 (Figura 22, sendero 1 ), mientras que HK1 G586 reconoció tanto phK2 como hK2 (Figura 23, senderos 1 y 2, respectivamente). Además, la Figura 22 (senderos 6-9) mostraron que H K1 G464 detecta phK2 (banda de 33 kD) en todas las muestras de LNCaP indicando que phK2 es secretado a partir de células LNCap. Hubo aproximadamente 15 ng de inmunoreactividad de HK1G586 en cada sendero de senderos 6-9 en las Figuras 22 y 23. Estos resultados indican que en células de carcinoma prostático, hK2 se secreta como phK2. Los resultados también sugieren que phK2 pueden existir en fluidos biológicos y de esta manera podría ser un marcador diagnóstico útil para Pea y BPH.

Ejemplo 1 1. Detección de complejos de hK2 en sueros de pacientes de cáncer de próstata Para determinar si los polipéptidos de hK2 existen en fluidos biológicos, se evaluaron diez muestras de suero de pacientes con carcinoma de próstata mediante Western blot con el mab anti-hK2, HK1 G586.1 . Los niveles de PSA en cada uno de los especímenes de suero se determinó mediante ensayo inmunoradiométrico (Tandem-R PSA, Hybritech, San Diego, California). Cada suero fue enriquecido por hK2 mediante absorción y levigación de una columna de inmunoafinidad anti-hK2 (H K1 G586.1 ). Los sueros enriquecidos se prepararon al incubar 200 µl de suero con 75 µl de AminoLink Gel (Pierce, Rockford, IL), el cual había sido acoplado previamente con el mab anti-hK2, HK1 G586.1 de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La incubación se realizó durante 4.5 horas a temperatura ambiente en un agitador. Las perlas se lavaron cuatro veces en 5 mi de solución salina amortiguada de fostato conteniendo Tween 20 0.1 %. El hK2 se levigó de las perlas mediante incubación con un volumen mínimo de SDS 2.0% en Tris-HCl 0.5M, pH 8.0. Las proteínas reducidas y desnaturalizadas fueron sometidas a electroforesis en geles de poliacrilamida 4-20% y manchadas sobre nitrocelulosa. La transferencia exitosa mediante manchado con mancha de proteína Ponceau S. Las manchas se bloquearon en leche deshidratada descremada 5% en PBS y entonces se incubó con anticuerpos (10 µg/ml) a 4CC durante la noche. Después de los lavados, los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (dilución 1 :2000) se incubaron con las manchas durante 1 hora, seguido por lavados con PBS. La reactividad de anticuerpos se detectó mediante la adición de 10 mg/ml de diaminobencidina, peróxido de hidrógeno 0.1 % en PBS o usando el sistema ECL (Amersham, Arlington Heights, Illinois).

En experimentos donde se usó detección de ECL, las manchas se incubaron con anticuerpos durante 1 hora a temperatura ambiente y se expusieron a película de rayos X, normalmente durante 30 segundos. La mayoría de las muestras de suero enriquecidas (7/10) contenía una especie 33 kD así como una especie de 90 kD siguiendo la detección con el mab anti-hK2, HK1 G586.1 (Figura 24, Sendero 1 ). Los tres sueros los cuales no reaccionaron con HK1 G586.1 contenieron bajos niveles de PSA (Tabla 3). Los depósitos de sueros femeninos normales y sueros masculinos normales también fueron negativos en manchas Western con HK1 G586.1 . Este dato sugiere que los niveles de bK2 en sueros parecen correlacionar con niveles de PSA. Se detectaron hK2 libre y en complejo por análisis Western blot de suero de carcinoma de próstata con mab anti-hK2, H K1 G586.1 . El suero de paciente con carcinoma de próstata se enriqueció por hK2 mediante absorción y levigación de una columna de inmunoafinidad anti-hK2 (H K1 G586.1 ). El material levigado se examinó en Western blot con mab anti-hK2, HK1 G586.1 (Figura 25). En el sendero 1 , HK1 G586.1 se hizo reaccionar con hK2 libre a aproximadamente 33 kD. También se detectó una especie molecular mayor a aproximadamente 90 kD con el mab anti-ACT, AC1 A086 (sendero 3). La detección de la misma banda en el hK2 inmunopurificado por el mab anti-hK2 específico así como ei mab anti-ACT identificó esta especie de 90 kD como hK2-ACT. Sondear una mancha similar con un anticuerpo policlonal anti-PCl (inhibidor de proteína C) no produjo ninguna señal, indicando que un complejo hK2-PCI podría no ser detectado en una preparación enriquecida de suero de cáncer de próstata. La banda a 50 kD vista consistentemente a través de la mancha representa ia detección de inmunogiobulina, la cual es liberada de la resina de inmunoafinidad durante el proceso de levigación y entonces se detectó mediante el anticuerpo secundario, HRP anti-ratón de cabra en el procedimiento de Western blot. La banda grande a aproximadamente 66 kD, la cual solo se detecta con el mab anti-ACT, representa ACT libre. De esta manera, los polipéptidos hK2 están presentes en fluidos biológicos de pacientes con cáncer de próstata. Por lo tanto, la detección de estos polipéptidos podría ser un marcador diagnóstico útil para Pea o BPH .

Tabla 3 Detección de hK2 en suero de paciente con cáncer de próstata mediante análisis Western blot con HK1 G586.1 Muestra # PSA Formas hK2 ng/ml 33 kD 90 kD 1 1482 2 1894 3 5330 4 5 5 2938 6 4662 7 180 8 1478 9 16 10 80 Todas las publicaciones y patentes son incorporadas por referencia en la presente, como si se incorporaran individualmente por referencia. La invención no está limitada a los detalles exactos mostrados y descritos, ya que debe entenderse que pueden hacerse muchas variaciones y modificaciones aunque permanecen dentro del espíritu y alcance de la invención definidos por las reivindicaciones.

LISTADO DE SECUENCIAS (1 ) I NFORMACIÓN GEN ERAL: (i) SOLICITANTE: Mayo Foundation for Medical Education and Research, e Hybritech, Incorporated (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Métodos para detectar polipéptidos de hK2 (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 22 (¡v) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINARIO: Schwegman, Lundberg & Woessner, P.A. (B) CALLE: P.O. Box 2938 (C) CIUDAD: Minneapolis (D) ESTADO: MN (D) PAÍS: EU (E) CÓDIGO POSTAL: 55402 (v) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: DISCO FLEXIBLE (B) COMPUTADORA: I BM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PAQUETERÍA: Patente en liberación #1 .0, Versión #1 .25 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: Desconocida (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: Con la presente (C) CLASIFICACIÓN: (viii) IN FORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: 08/680, 868 (B) NUMERO DE REGISTRO: 15 de julio de 1996 (C) N UMERO DE REFERENCIA/CASO: 545.003US 1 (ix) IN FORMACIÓN DE TELECOMUNICACION ES: (A) TELEFONO: 612-339-0331 (B) TELEFAX: 612-339-3061 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECU ENCIA: (A) LONGITUD: 237 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TI PO DE MOLÉCU LA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 lie Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His 20 25 30 Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln 35 40 45 Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln 50 55 60 Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Mee Ser 65 70 75 80 Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp 85 90 95 Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys lie Thr Asp Val Val 100 105 110 Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys 115 120 125 Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser lie Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro 130 135 140 Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys 145 150 155 160 Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly 165 170 175 Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro 180 185 190 Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly lie Thr Ser Trp Gly Pro Glu 195 200 205 Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His 210 215 220 Tyr Arg Lys Trp lie Lys Asp Thr lie Ala Ala Asn Pro 225 230 235 (2) IN FORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITU D: 71 1 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCU LA: cDNA (xi) DESCRIPCIÓN DE SECU ENCIA: SEQ ID NO:2 ATT GTG GGA GGC TGG GAG TGT GAG AAG CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG 48 lie Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 GCT GTG TAC AGT CAT GGA TGG GCA CAC TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC 96 Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His 20 25 30 CCC CAG TGG GTG CTC ACA GCT GCC CAT TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG 144 Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln 35 40 45 GTC TGG CTG GGT CGG CAC AAC CTG TTT GAG CCT GAA GAC ACA GGC CAG 192 Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln 50 55 60 AGG G*TC CCT GTC AGC CAC AGC TTC CCA CAC CCG CTC TAC AAT ATG AGC 240 Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser 65 70 75 80 CTT CTG AAG CAT CAA AGC CTT AGA CCA GAT GAA GAC TCC AGC CAT GAC 288 Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp 85 90 95 CTC ATG CTG CTC CGC CTG TCA GAG CCT GCC AAG ATC ACA GAT GTT GTG 336 Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys He Thr Asp Val Val 100 105 110 AAG GTC CTG GGC CTG CCC ACC CAG GAG CCA GCA CTG GGG ACC ACC TGC 384 Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys 115 120 125 TAC GCC TCA GGC TGG GGC AGC ATC GAA CCA GAG GAG TTC TTG CGC CCC 432 Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser He Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro 130 135 140 AGG AGT CTT CAG TGT GTG AGC CTC CAT CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT 480 Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys 145 150 155 160 GCT AGA GCT TAC TCT GAG AAG GTG ACA GAG TTC ATG TTG TGT GCT GGG 528 Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly 165 170 175 CTC TGG ACA GGT GGT AAA GAC ACT TGT GGG GGT GAT TCT GGG GGT CCA 576 Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro 180 185 190 CTT GTC TGT AAT GGT GTG CTT CAA GGT ATC ACA TCA TGG GGC CCT GAG 624 Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly He Thr Ser Trp Gly Pro Glu 195 200 205 CCA TGT GCC CTG CCT GAA AAG CCT GCT GTG TAC ACC AAG GTG GTG CAT 672 Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His 210 215 220 TAC CGG AAG TGG ATC AAG GAC ACC ATC GCA GCC AAC CCC 711 Tyr Arg Lys Trp He Lys Asp Thr He Ala Ala Asn Pro 225 230 235 lü (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 244 aminoácidos 15 (B) TI PO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3 Val Pro Leu He Gln Ser Arg He Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys 1 ^ 5 10 15 His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His 20 25 30 Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His 35 40 45 Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe 50 55 60 Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro 65 70 75 80 is Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro 85 90 95 Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro 100 105 110 Ala Lys He Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu 115 120 125 Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser He Glu 130 135 140 Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His 145 150 155 160 Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr 165 170 175 Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys 180 185 190 Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly 195 200 205 He Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala 210 215 220 Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp He Lys Asp Thr He 225 230 235 240 Ala Ala Asn Pro (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 0 (A) LONGITUD: 766 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCU LA: cDNA 5 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1 ..732 (x) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4 GTG CCC CTC ATC CAG TCT CGG ATT GTG GGA GGC TGG GAG TGT GAG AAG 48 Val Pro Leu He Gln Ser Arg He Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys 1 5 10 15 CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG GCT GTG TAC AGT CAT GGA TGG GCA CAC 96 His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His 20 25 30 TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC CCC CAG TGG GTG CTC ACA GCT GCC CAT 144 Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His 35 40 45 TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG GTC TGG CTG GGT CGG CAC AAC CTG TTT 192 Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe 50 55 60 GAG CCT GAA GAC ACA GGC CAG AGG GTC CCT GTC AGC CAC AGC TTC CCA 240 Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro 65 70 75 80 CAC CCG CTC TAC AAT ATG AGC CTT CTG AAG CAT CAA AGC CTT AGA CCA 288 His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro 85 90 95 GAT GAA GAC TCC AGC CAT GAC CTC ATG CTG CTC CGC CTG TCA GAG CCT 336 Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro 100 105 110 GCC AAG ATC ACA GAT GTT GTG AAG GTC CTG GGC CTG CCC ACC CAG GAG 384 Ala Lys He Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu 115 120 125 CCA GCA CTG GGG ACC ACC TGC TAC GCC TCA GGC TGG GGC AGC ATC GAA 432 Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser He Glu 130 135 140 CCA GAG GAG TTC TTG CGC CCC AGG AGT CTT CAG TGT GTG AGC CTC CAT 480 Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His 145 150 155 160 CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT GCT AGA GCT TAC TCT GAG AAG GTG ACA 528 Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr 165 170 175 GAG TTC ATG TTG TGT GCT GGG CTC TGG ACA GGT GGT AAA GAC ACT TGT 576 Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys 180 185 190 GGG GGT GAT TCT GGG GGT CCA CTT GTC TGT AAT GGT GTG CTT CAA GGT 624 Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly 195 200 205 ATC ACA TCA TGG GGC CCT GAG CCA TGT GCC CTG CCT GAA AAG CCT GCT 672 He Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala 210 215 220 GTG TAC ACC AAG GTG GTG CAT TAC CGG AAG TGG ATC AAG GAC ACC ATC -'20 Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp He Lys Asp Thr He 225 230 235 240 GCA GCC AAC CCC TGAGTGCCCC TGTCCCACCC CTACCTCTAG TAAA 766 Ala Ala Asn Pro (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 261 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCU LA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5 Met Trp Asp Leu Val Leu Ser He Ala Leu Ser Val Gly Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ala Val Pro Leu He Gln Ser Arg He Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30 Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala 35 40 45 His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60 His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu 65 70 75 80 Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe 85 90 95 Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu 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(B) UBICACIÓN : 10..792 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ I D NO:6 GGATCCAGC ATG TGG GAC CTG GTT CTC TCC ATC GCC TTG TCT GTG GGG 48 Met Trp Asp Leu Val Leu Ser He Ala Leu Ser Val Gly 1 5 10 TGC ACT GGT GCC GTG CCC CTC ATC CAG TCT CGG ATT GTG GGA GGC TGG 96 Cys Thr Gly Ala Val Pro Leu He Gln Ser Arg He Val Gly Gly Trp 15 20 25 GAG TGT GAG AAG CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG GCT GTG TAC AGT CAT 144 Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His 30 35 40 45 GGA TGG GCA CAC TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC CCC CAG TGG GTG CTC 192 Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu 50 55 60 ACA GCT GCC CAT TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG GTC TGG CTG GGT CGG 240 Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg J* 65 70 75 CAC AAC CTG TTT GAG CCT GAA GAC ACA GGC CAG AGG GTC CCT GTC AGC 288 His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser 80 85 90 CAC AGC TTC CCA CAC CCG CTC TAC AAT ATG AGC CTT CTG AAG CAT CAA 336 His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln 95 100 105 AGC CTT AGA CCA GAT GAA GAC TCC AGC CAT GAC CTC ATG CTG CTC CGC 384 Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg 110 115 120 125 CTG TCA GAG CCT GCC AAG ATC ACA GAT GTT GTG AAG GTC CTG GGC CTG 432 Leu Ser Glu Pro Ala Lys He Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu 130 135 140 CCC ACC CAG GAG CCA GCA CTG GGG ACC ACC TGC TAC GCC TCA GGC TGG 480 Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp 145 150 155 GGC AGC ATC GAA CCA GAG GAG TTC TTG CGC CCC AGG AGT CTT CAG TGT 528 Gly Ser He Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys 160 165 170 GTG AGC CTC CAT CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT GCT AGA GCT TAC TCT 576 Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser 175 180 185 GAG AAG GTG ACA GAG TTC ATG TTG TGT GCT GGG CTC TGG ACA GGT GGT 624 Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly 190 195 200 205 AAA GAC ACT TGT GGG GGT GAT TCT GGG GGT CCA CTT GTC TGT AAT GGT 672 Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly 210 215 220 GTG CTT CAA GGT ATC ACA TCA TGG GGC CCT GAG CCA TGT GCC CTG CCT 720 Val Leu Gln Gly He Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro 225 230 235 GAA AAf"! CCT GCT GTG TAC ACC AAG GTG GTG CAT TAC CGG AAG TGG ATC 768 Glu Lys Pro Alá Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp He 240 245 250 AAG GAC ACC ATC GCA GCC AAC CCC TGAGTGCCCC TGTCCCACCC CTACCTCTAG 822 Lys Asp Thr He Ala Alá Asn Pro 255 260 TAAACTGCAG 832 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 237 aminoácidos 0 (B) TI PO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (x) DESCRI PCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7 He Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val 1 5 10 15 Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His 20 25 30 Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys He Arg Asn Lys Ser Val 35 40 45 He Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln 50 55 60 Val Phe Gln Val Ser Thr Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser 65 70 75 80 Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp 85 90 95 Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val 100 105 lio Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys 115 120 125 Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser He Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro 130 135 140 Lys Lys Leu Gln Cys Val Gln Leu His Val He Ser Asn Asp Val Cys 145 150 155 160 Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly 165 170 ? 5 Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro 180 185 190 Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly He Thr Ser Trp Gly Ser Glu 195 200 205 Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His 210 215 220 Tyr Arg Lys Trp He Lys Asp Thr He Val Ala Asn Pro 225 230 235 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico L5 (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8 ACGCGGATCC AGCATGTGGG ACCTGGTTCT CT 32 0 (2) IN FORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xii) DESCRI PCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9 ACAGCTGCAG TTTACTAGAG GTAGGGGTGG GAC 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 5 (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xií) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10 ATATGGATCC ATATGTCAGC ATGTGGGACC TGGTTCTCTC CA 42 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple 15 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11 ATATGGATCC TCAGGGGTTG GCTGCGATGG T 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: 20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal 25 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12 Val Pro Leu He Gln Ser Arg 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 30 (A) LONGITUD: 832 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 10..792 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13 GGATCCAGC ATG TGG GAC CTG GTT CTC TCC ATC GCC TTG TCT GTG GGG 48 Met Trp Asp Leu Val Leu Ser He Ala Leu Ser Val Gly i * 5 10 TGC ACT GGT GCC GTG CCC CTC ATC CAG TCT CGG ATT GTG GGA GGC TGG 96 Cys Thr Gly Ala Val Pro Leu He Gln Ser Arg He Val Gly Gly Trp 15 ~ ' 20 25 GAG TGT GAG AAG CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG GCT GTG TAC AGT CAT 144 Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His 30 35 40 45 GGA TGG GCA CAC TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC CCC CAG TGG GTG CTC 192 Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu ^ 50 55 60 ACA GCT GCC CAT TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG GTC TGG CTG GGT CGG 240 Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg 65 70 75 CAC AAC CTG TTT GAG CCT GAA GAC ACA GGC CAG AGG GTC CCT GTC AGC 288 His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser 80 85 90 CAC AGC TTC CCA CAC CCG CTC TAC AAT ATG AGC CTT CTG AAG CAT CAA 336 His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln 95 100 105 AGC CTT AGA CCA GAT GAA GAC TCC AGC CAT GAC CTC ATG CTG CTC CGC 384 Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg 110 115 120 ' 125 CTG TCA GAG CCT GCC AAG ATC ACA GAT GTT GTG AAG GTC CTG GGC CTG 432 Leu Ser Glu Pro Ala Lys He Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu 130 135 140 CCC ACC CAG GAG CCA GCA CTG GGG ACC ACC TGC TAC GCC TCA GGC TGG 480 Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp 145 150 155 GGC AGC ATC GAA CCA GAG GAG TTC TTG CGC CCC AGG AGT CTT CAG TGT 528 Gly Ser He Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys 160 165 170 GTG AGC CTC CAT CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT GCT AGA GCT TAC TCT 576 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NO: 14: Met Trp Asp Leu Val Leu Ser He Ala Leu Ser Val Gly Cys Thr Gly 1 5 10 15 Ala Val Pro Leu He Gln Ser Arg He Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30 Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala 35 40 45 His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60 His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu 65 70 75 80 Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe 85 90 95 Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg 100 105 110 Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125 Pro Ala Lys He Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln 130 135 140 Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser He 145 150 155 160 Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu 165 170 175 His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val 180 185 190 Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr 195 200 205 Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln 210 215 220 Gly He Thr Ser Trp Giy Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro 225 230 235 240 Val V i Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp He Lys Asp Thr 245 250 255 He Ala Ala Asn Pro 260 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 25 (A) LONGITUD: 13 de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (x) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15 Val Pro Leu He Gln Ser Arg He Val Gly Gly Trp Glu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ I D NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 aminoácidos (B) TI PO: aminoácidos (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ I D NO: 16 Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys 1 5 10 15 Trp He Lys Asp Thr He Ala Ala Asn 20 25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECU ENCIA: (A) LONGITU D: 9 aminoácidos (B) TI PO: aminoácido (C) FI LAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TI PO DE MOLÉCU LA: péptido (xii) DESCRI PCIÓN DE SECU ENCIA: SEQ I D NO: 1 7 He Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys 1 ^ 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (¡) CARACTERÍSTICAS DE LA SECU ENCIA: (A) LONGITUD: 14 de aminoácidos (B) TIPO: aminácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18 Asp Arg Val Tyr He His Pro Phe His Leu Leu Val Tyr Ser 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECU ENCIA: SEQ ID NO: 19 Val ro Leu He Gln Ser Arg lie Val Gly Gly Trp Glu Cys 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos (B) TI PO: aminoácido (C) FI LAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TI PO DE MOLÉCU LA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECU ENCIA: SEQ ID NO:20 His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ I D NO: 21 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECU ENCIA: (A) LONGITUD: 30 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21 Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ I D NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITU D: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCU LA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECU ENCIA: SEQ ID NO:22 Cys Ser Gly Lys He Val He Ala Arg Tyr Gly Lys Val Phe Arg Gly Asn Lys 1 5 ?o 15

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un método diagnóstico comprendiendo: (a) poner en contacto una cantidad de anticuerpos purificados los cuales se ligan específicamente a phK2 con una muestra de fluido fisiológico obtenida de un humano, en donde dicho fluido comprende phK2, durante un tiempo suficiente para permitir la formación de complejos binarios entre al menos una porción de dichos anticuerpos y una porción de dicho phK2, en donde dichos anticuerpos no reaccionan de manera significativa con hK3; y (b) determinar la cantidad de dichos complejos en dicha muestra y correlacionar la cantidad de dichos complejos a la presencia o ausencia de cáncer de próstata en dicho humano.
2. 2. El método de la reivindicación 1 , en donde la cantidad relativa de dichos complejos se compara con un valor representativo de la cantidad de dichos complejos de un humano sin riesgo de, o afligido con, cáncer de próstata.
3. 3. El método de la reivindicación 1 , en donde los pasos (a) y (b) se repiten a intervalos para monitorear la progresión del cáncer de próstata en dicho humano.
4. 4. El método de la reivindicación 1 , en donde en el paso (a) los anticuerpos se ligan específicamente a phK2 y no se ligan a hK3 o hK2.
5. 5. El método de la reivindicación 1 , en donde en el paso (a) ios anticuerpos se ligan específicamente a phK2 y a hK2 pero no a hK3.
6. 6. El método de la reivindicación 1 , en donde en el paso (b) los complejos se hacen reaccionar con una cantidad de anticuerpos los cuales se ligan específicamente a phK2 o a hK2, pero no a hK3, en donde dichos anticuerpos comprenden una marca detectable o se ligan a una marca detectable, para formar un complejo ternario detectable.
7. 7. Un método diagnóstico que comprende: determinar la cantidad de polipéptido de hK2 el cual está ligado a proteínas de plasma en una muestra de fluido fisiológico humano y correlacionar la cantidad de dicho polipéptido ligado a la presencia o ausencia de cáncer de próstata en dicho humano.
8. 8. El método de la reivindicación 7, en donde la cantidad relativa de dicho polipéptido de hK2 es comparada con un valor representativo de una cantidad de hK2 ligado de un humano sin riesgo de, o afligido con, cáncer de próstata.
9. 9. El método de la reivindicación 7, en donde el polipéptido de hK2 ligado está separado del polipéptido hK2 sin ligar antes de determinar la cantidad de polipéptido de hK2 ligado.
10. 10. Un método para detectar la formación de complejo de hK2 con proteínas de plasma, comprendiendo: determinar en una muestra la cantidad de polipéptido de hK2 el cual está ligado a proteína de plasma con relación a la cantidad total de polipéptido de hK2.
11. 1 1 . Un método para detectar la formación de complejo de hK2 con proteínas de plasma, comprendiendo: determinar en una muestra la cantidad de polipéptido de hK2 el cual está ligado a proteína de plasma con relación a la cantidad de polipéptido de hK2, el cual no está ligado a la proteína de plasma.
12. 12. El método de la reivindicación 10 u 1 1 , en donde el polipéptido de hK2 ligado se separa del polipéptido de hK2 no ligado antes de determinar la cantidad de polipéptido de hK2 ligado.
13. 13. El método de ia reivindicación 7, 10 u 1 1 , en donde el polipéptido de hK2 ligado se hace reaccionar con una cantidad de anticuerpos, los cuales se ligan específicamente a polipéptidos de hK2 pero no a polipéptidos de hK3.
14. 14. El método de la reivindicación 7, 10 u 1 1 en donde la muestra se hace reaccionar con una cantidad de anticuerpos los cuales se ligan específicamente a polipéptidos de hK2 pero no a polipéptídos de hK3.
15. 15. El método de la reivindicación 13, en donde los anticuerpos comprenden una marca detectable o se ligan a una marca detectable, para formar un complejo ternario detectable.
16. 16. El método de la reivindicación 14, en donde los anticuerpos comprende una marca detectablo o se ligan a una marca detectable, para formar un complejo ternario detectable.
17. 17. El método de la reivindicación 7, 10 u 1 1 , en donde la proteína de plasma es anti-quimotripsina.
18. 18. El método de la reivindicación 7, 10 u 1 1 , en donde la proteína de plasma es a2-macroglobuiina.
19. 19. El método de la reivindicación 7, 10 u 1 1 , en donde la muestra se hace reaccionar con una cantidad de anticuerpos purificados, los cuales se ligan específicamente a hK2, el cual está ligado a anti-quimotripsina.
20. 20. El método de la reivindicación 19, en donde los anticuerpos comprenden una marca detectable o ligan a una marca detectable, para formar un complejo ternario detectable.
21. 21 . El método de la reivindicación 7, 10 o 1 1 , en donde la muestra se hace reaccionar con una cantidad de anticuerpos purificados, los cuales se ligan específicamente a anti-quimotripsina.
22. 22. El método de la reivindicación 21 , en donde los anticuerpos comprenden una marca detectable o se ligan a una marca detectable, para formar un complejo ternario detectable.
23. 23. El método de la reivindicación 10 u 1 1 , en donde la muestra es una muestra fisiológica humana.
24. 24. El método de la reivindicación 1 1 , en donde una cantidad de anticuerpos purificados es empleada para detectar hK2, el cual no está ligado a una proteína de plasma.
25. 25. El método de la reivindicación 24, en donde los anticuerpos están unidos a una superficie sólida antes de ponerse en contacto con la muestra.
26. 26. El método de la reivindicación 24, en donde la proteína de plasma es anti-quimotripsina.