MXPA96005473A - Polipeptido hk2 recombinante - Google Patents

Abstract

Se proporciona un polipéptido hK2 sustancialmente homogéneo, aislado, asícomo moléculas deácido nucléico aisladas que codifican el polipéptido hK2, incluyendo:(a) una molécula de cADN que comprende la secuencia de nucleótido de la región de codificación del gen hK2 humano;(b) una molécula de ADN capaz de hidrizarse bajo condiciones estrictas en una molécula de (a);y (c) una variante genética de cualquiera de las moléculas de ADN de (a) y (b) que codifica el polipéptido que procesa una función antigénica de polipéptido que se presenta naturalmente.

Description

POLIPEPTIDO HK2 RECOMBINANTE Antecedentes de la Invención Las calicreínas glandulares son subgrupo de proteasas de serina que están involucradas en el procesamiento post-traslacional de precursores de polipéptido específicos para sus formas biológicamente activas. La familia del gen de calicreína humana consiste en tres -.miembros: antígeno específico de próstata, calicreína glandular humana, y calicreína pancreática/renal. Ver J.?. elements, Endocr. Rev. 10, 393 (1989) y T.M. Chu y colaboradores (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,446,122). Una nomenclatura común para estos miembros de familias genéticas de calicreína de tejido (glandular) fue adoptado recientemente por T. Berg y colaboradores, en Recent Pro ress on Kinins; Biochemistry and Molecular Biology of the Kallikrein-Kinin System. Agentes and Actions Supplements Volumen I, H. Fritz y colaboradores, eds., Brikkauser Verlag, Basilea (1992), y se define en la siguiente Tabla I.

TABLA I La Familia Genética de Calicreína de Tejido Humano (designación de especie aprobada: HSA) La homología de secuencia de ADN entre hKLK2 y hKLK3 (regiones de exón) es del 80 por ciento, mientras que la homología entre hKLK2 y hKLKl es del 65 por ciento. La homología de la secuencia de aminoácidos deducida de hK2 con hKl es del 57 por ciento. Las secuencias de aminoácidos deducidas por L.J. Schedlich y colaboradores, DNA, 6, 429 (1987) y B.J. Morris, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 16, 345 (1989) , indican que hK2 puede ser una proteasa de serina en forma de tripsina, mientras que hK3 (PSA) es una proteasa de serina en forma de quimiotripsina. Por consiguiente, si la hK2 es realmente secretora, puede tener una función fisiológica diferente de la hK3. El gen hKLK2 se localiza a aproximadamente 12 kbp corriente abajo desde el gel hKLK3 en una forma de cabeza con cola sobre el cromosoma 19. (P.H. Riegman y colaboradores, FEBS Lett.. 247, 123 (1989)). Las similitudes de la estructura genética y las secuencias de aminoácidos deducidas de estas calicreínas humanas sugieren que su evolución puede involucrar el mismo gen ancestral. Más interesante, como es reportado por Morris, citado supra ; P. Chapdelaine, FEBS Lett. , 236, 205 (1988); y Young, Biochemistry. 31. 1952 (1992), tanto la hK2 como la hK3 pueden expresarse solamente en la próstata humana, mientras que la expresión de hKl está limitada al páncreas, a la glándula sub andibular , al riñon, y a otros tejidos que no son de próstata. Se ha generado un tremendo interés en la hK3 (PS?) , debido al importante papel que tiene como un marcador para detectar y para supervisar el progreso del carcinoma de próstata. Su utilidad como un marcador se basa en la concentración elevada en suero de proteínas hK3 circulantes, que están asociadas con frecuencia con el cáncer prostático.

Se ha descubierto que la concentración en suero de hK3 es proporcional a la masa de cáncer en los pacientes no tratados, pero también es proporcional al volumen de tejido hiperplástico en los pacientes con hiperplasia prostática benigna (BPH) . Los niveles en suero de hK3 llegan a reducirse en seguida de la terapia de cáncer de próstata. A pesar de la información que se puede aseverar acerca de la hK2 a partir de la secuencia, del ADN genómico, se sabe muy poco acerca del polipéptido hK2 mismo. La razón para esto es que la proteína no se ha purificado y caracterizado. Por consiguiente, existe una necesidad para obtener el polipéptido hK2 y los polipéptidos relacionados en una cantidad y pureza suficientes para la caracterización y para utilizarse como agentes o reactivos terapéuticos/de diagnóstico.

Compendio de la Invención La presente invención proporciona un polipéptido hK2 • sustancialmente homogéneo aislado. Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido hK2" incluye polipéptidos pre-pro hK2, prohK2, y hK2 maduros. El pre-pro hK2 es secretado por la célula en vivo, y se disocia durante la secreción para dar prohK2 , que entonces se disocia enzimáticamente en el medio ambiente extracelular para dar hK2 "maduro". Más preferiblemente, el polipéptido hK2 es contiguo en la secuencia de aminoácidos con las SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 19, ó SEQ ID NO: 10. La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el polipéptido hK2 , incluyendo: (a) una molécula de cADN que comprende la secuencia de nucleótido de la región de codificación del gen hK2 ; (b) una molécula de ADN capaz de hibridizarse bajo condiciones estrictas en una secuencia de nucleótido complementaria a la secuencia de nucleótido de (a) ; y (c) una variante genética de cualquiera de las moléculas de ADN de (a) y (b) que codifica el polipéptido que procesa una función antigénica de polipéptido hK2 que se presenta naturalmente. De preferencia, el ácido nucleico comprende una molécula de ADN o de ARN aislada y separada que codifica el polipéptido hK2 completo, que puede incluir las formas pre-pro, pro, o madura.

( Más preferiblemente, el ácido nucleico es una secuencia de ADN contigua con las SEQ ID NO: 5, 7, 20, ó 9, por ejemplo, ver Figuras 5, 6, ó 7. Estas secuencias de ADN se pueden producir utilizando la reacción de cadena de polimerasa (PCR) , y cebadores de oligonucleótido novedosos empleados en la síntesis que también son una modalidad de la invención. La secuencia de ácido nucleico también puede comprender un promotor operablemente enlazado con la secuencia de ácido nucleico. Por consiguiente, la invención también comprende un vector de expresión quimérico que comprende a la secuencia de ácido nucleico anteriormente descrita, operacionalmente enlazada con secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector, así como la célula huésped transformada, y métodos para su preparación y uso, para producir hK2 recombinante. Por consiguiente, la presente invención también proporciona un método para utilizar una molécula de ácido nucleico, tal como un clon de cADN que codifica el polipéptido hK2 , el cual comprende expresar la molécula de ácido nucleico en una célula huésped cultivada transformada, de preferencia establemente transformada, con un vector de expresión quimérico que comprende a la molécula de ácido nucleico operablemente enlazada con las secuencias de control reconocidas por la célula huésped transformada con el vector; y recuperar el polipéptido hK2 a partir de la célula huésped transgénica, es decir, a partir del medio de cultivo. Como se utiliza en la presente, el término "quimérico" significa que el vector comprende ADN a partir de cuando menos dos especies diferentes, o comprende ADN de la misma especie, que se enlaza o se asocia de una manera que no se presenta en la forma "nativa" de esa especie. De una manera más específica, se han empleado sistemas de células de insectos de E. coli y baculovirus para producir polipéptidos hK2 en dos formas, es decir, pre-pro hK2 (pphK2) y hK2 maduro (mhK2) . Por consiguiente, la presente invención proporciona un primer ejemplo de la sobreexpresión de hK2 en sistemas heterólogos. Sin embargo, aunque el pphK2 producido en E. coli ha probado ser un recurso invaluable para generar anticuerpos para la forma desnaturalizada de la proteína, es deseable tanto discernir los pasos involucrados en la biosíntesis de hK2 , como obtener antibióticos específicos para la forma completamente procesada y secretada de la proteína. Por consiguiente, se han. empleado sistemas de células de mamífero para producir polipéptidos hK2. Por consiguiente, la presente invención también proporciona el primer ejemplo de la expresión de hK2 en células de mamífero, y la purificación y caracterización de la proteína secretada. El alto grado de homología de secuencia de aminoácidos de hK2 con hK3 , indica que puede ser útil medir las concentraciones en suero de ambas proteínas en el diagnóstico y la supervisión del cáncer de próstata. Por ejemplo, los anticuerpos desarrollados contra hK3 utilizados ahora en estos ensayos, podrían reconocer también teóricamente' el hK2, debido a la contaminación mutua en las preparaciones antigénicas utilizadas para desarrollar los anticuerpos anti-hK3 , o debido a la reactividad cruzada del anticuerpo entre estas dos proteínas. Esto podría contar para el porcentaje sustancial de resultados positivos falsos que ee observan en los ensayos de hK3 actuales. Por otra parte, si también se elevan los niveles de hK2 circulante arriba de los niveles de la línea base en los pacientes de cáncer de próstata, la detección de hK2 mediante anticuerpos específicos de hK2 podría proporcionar un ensayo confirmatorio alternativo para el cáncer de próstata. Por consiguiente, el polipéptido hK2 , así como las variantes y las subunidades del mismo, producidos mediante el presente método, se pueden utilizar para producir poblaciones de anticuerpos que, a su vez, se pueden utilizar como la base para ensayos para detectar y cuantificar el polipéptido hK2 (o la "proteína") en muestras derivadas a partir de tejidos, tales como carcinoma de próstata, células, tales como líneas celulares de próstata, o de fluidos tales como fluido seminal o sangre. Por lo tanto, la presente invención también proporciona poblaciones de anticuerpos monoclonales. o policlonales que se enlazan específicamente con el polipéptido hK2 , aunque no se enlazan significativamente con hK3. El término "significativamente" se define haciendo referencia a los ensayos comparativos discutidos anteriormente. Estos anticuerpos también se pueden utilizar en la cromatografía por afinidad, para purificar el hK2 de mamíferos a partir de fuentes naturales. El hK2 sustancialmente homogéneo aislado también se puede emplear como un componente en ensayos de diagnóstico para hK2 "nativo" en muestras derivadas a partir de tejidos humanos o fluidos fisiológicos. Por ejemplo, el hK2 recombinante se puede enlazar con una etiqueta detectable, y se puede emplear en inmunoensayos competitivos para hK2 , como se describe en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 08/096,946, presentada el 22 de julio de 1993. Como se utiliza en la presente con respecto a la presente invención, los términos "polipéptido hK2", "proteína hK2", y "hK2", se considera que se refieren a materiales humanos idénticos, a menos que se indique de otra manera.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra un estudio del curso del tiempo de pphK2 recombinante en células S/9 infectadas con virus de pphK2 recombinante. En cada uno de los puntos del tiempo, las células se agotaron de metionina y cisteína durante 1 hora en medio deficiente, y luego se complementaron con [35S]~ metionina y [35S] -cisteína. La proteína se determinó mediante ensayo de Bradford. Se cargaron alícuotas de proteína (20 microgramos) sobre un gel SDS de tris-glicina al 12 por ciento. Se expuso un cásete Phosphorimager durante la noche. La banda de interés se indica con una flecha, .t. = tipo silvestre. La Figura 2 ilustra la detección de mhK2 recombinante en fracciones de lisato celular. Las células S/9 se infectaron ya eea con mhK2 recombinante, de tipo silvestre, o se dejaron sin infectar durante 48 horas. Los grupos de metionina y cisteína se agotaron durante 1 hora en medio deficiente. Las células se complementaron con [35S] -metionina Y [35S] -cisteína durante 6 horas. Las células se separaron en fracciones soluble e insoluble utilizando H 0, y condiciones de congelación/descongelación repetidas. Se cargaron alícuotas de proteína (50 microgramos por pista) sobre un gel SDS de tris-glicina al 10 por ciento, y se pasaron por electroforesis. El gel se secó y se expuso a película de rayos X durante 2 días. La banda de interés se indica con una flecha. La Figura 3 ilustra la expresión de pphK2 recombinante en E. coli. Se cultivó E. coli cepa BL21 (DE3) LysS que aloja pBppHK2 en medio LB hasta O.D.60u 0.2, y se incubó sin (pista 2, (N) no inducido) o con (pista 3, (I) inducido) 0.4 mM de IPTG durante 2 horas. Las células se lisaron en el regulador del pH de la muestra, y se sometieron a SDS/PAGE sobre un gel de gradiente del 4 al 20 por ciento. Las bandas de proteína se visualizaron manchando el gel con azul Coomassie. La Figura 4 ilustra las secuencias de aminoácidos hK2 maduro (deducido a partir de la secuencia de cADN, SEQ ID NO: 16) y hK3 (SEQ ID NO:l) . Las secuencias subrayadas denotan regiones no homologas que se pueden utilizar para la preparación de anticuerpos específicos para hK2. La Figura 5 ilustra cADN de pphK2 que contiene un sitio BamHl en el extremo 5', y un sitio PstI en el extremo 3' (SEQ ID NO: 5) (la cadena de codificación está numerada) , así como la secuencia de aminoácidos de 'pre-pro hK2 codificado por la misma (SEQ ID NO: 6) . Las secuencias de aminoácidos de prohK2 y hK2 maduro también se muestran en la Figura. La Figura 6 ilustra cADN de mhK2 que contiene un sitio EcoRI en el extremo 5', y un sitio PstI en el extremo 31 (SEQ ID NO: 7), así como la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 8) que abarca la secuencia de aminoácidos del polipéptido mhK . La Figura 7 ilustra ADN de prohK2 (SEQ ID NO: 9) (la cadena de codificación está numerada) , y la secuencia de aminoácidos de prohK2 (SEQ ID NO: 10) . La Figura 8 ilustra un gel que confirma la expresión de pphK2 recombinante en una línea celular de mamífero. Se cultivaron las líneas celulares clónales AV12-pGThK2 (Pistas 4-6) y AV12-pGT-d (Pista 3) en medio D10F. Se concentraron aproximadamente 300 microlitros del medio gastado de los clones anteriores, y se sometieron a SDS/PAGE junto con marcador Sec Blue MW (pista 1) y lisato pphK2 a partir de células E. coli (pista 2) . El gel se manchó sobre papel de nitrocelulosa y se inmunomanchó utilizando un dilución de 1/1000 de antisuero de conejo anti-pphK2. Se utilizó suero anti-conejo de HRP-cabra como la sonda secundaria, y la mancha se desarrolló mediante DAB más H202. La pista 3 (AV12-pGT-d) es AV12 transfectado con el vector sin inserto. La Figura 9 ilustra la cromatografía DEAE de medio AV12. La muestra se aplicó en un regulador de bicarbonato, con un pH de 8, y se eluyó con un gradiente de sal. La línea sólida es el perfil de elución A280. La línea del triángulo representa el ensayo ELISA de las muestras individuales que se habían secado sobre placas de microtitulación, y se desarrollaron con anticuerpo de conejo anti-hK2. La Figura 10 ilustra el perfil de interacción hidrofóbica de las fracciones de DEAE. Las fracciones se agruparon, se concentraron, y se aplicaron a una columna HIC en sulfato de sodio 1.2M, y se eluyeron con un gradiente de sal decreciente. La línea sólida es A280, y la línea del triángulo muestra el perfil del ensayo ELISA de las fracciones utilizando anticuerpo de conejo anti-hK2. La Figura 11 ilustra la Cromatografía por Exclusión de Tamaños de prohK2 purificado con HIC, en particular, el perfil A280 del pico de 22 minutos eluido de la columna de HIC. El pico de 19.4 minutos aparece homogéneo mediante SDS-PAGE. Después de que se liofilizó este pico, la eecuencia N-terminal y la composición de aminoácidos confirmaron su identidad como la forma pro de hK2. La Figura 12 ilustra el análisis SDS/PAGE de prohK2 y PSA. 1.5 microgramos de phK2 purificado o PSA, se hirvieron en un regulador de muestra que contenía (R) o que no contenía (N) 1 por ciento BME. Las muestras se sometieron a SDS/P?GE sobre un gel del 4 al 20 por ciento. Las bandas de proteína se visualizaron manchando el gel con plata.

Descripción Detallada de la Invención Como se utiliza en la presente, el término "polipéptido hK2" de preferencia abarca los polipéptidos pre-pro, pro, y hK2 maduro recombinantes. Cpmo se propone en la presente, un polipéptido hK2 maduro que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 4 (SEQ ID NO: 16) , así como los polipéptidos "variantes" que comparten cuando menos una homología del 90 por ciento con la SEQ ID NO: 16 en las regiones que son sustancial ente homologas al hK3 , es decir, cuyas regiones no están identificadas por barras como se muestra en la Figura 4. Estos polipéptidos hK2 también poseen una función antigénica en común con la molécula hK2 madura de la Figura 4, en que estos polipéptidos también se pueden definir mediante anticuerpos que se enlacen específicamente con los mismos, pero que no reaccionen con hK3 (ó hKl). De preferencia, estos anticuerpos reaccionan con los sitios antigénicos o epítopes que también están presentes sobre la molécula hK2 madura de la Figura 4. Los anticuerpos útiles para definir la función antigénica común se describen con detalle en la Número de Serie 08/096,946, es decir, antisueros policlonales preparados en vivo contra hK2 , presentación 41-56, El "ácido nucleico de hK2 aislado" es ARN ó ADN que contiene más de 15, de preferencia 20 o más bases de nucleótidos en secuencia que codifican un polipéptido hK2 biológicamente activo o un fragmento variante del mismo, que es complementario a la cadena no codificadora del ARN o del ADN del polipéptido hK2 nativo, o que se hibridiza en ese ADN ó ARN, y permanece establemente enlazado bajo condiciones estrictas. Por consiguiente, el ADN o el ARN esta aislado, porque está libre de cuando menos un ácido nucleico contaminante con el cual está normalmente asociado con la fuente natural, y de preferencia está sustancialmente libre de cualquier otro ADN ó ARN de mamífero. La frase "libre de cuando menos un ácido nucleico de una fuente contaminante con el cual está normalmente asociado" incluye el caso en donde el ácido nucleico se vuelve a introducir en la fuente o en la célula natural, pero está en una localización cromosomal diferente, o está flanqueado de otra manera por secuencias de ácido nucleico que normalmente no se encuentran en la célula fuente. Un ejemplo de ácido nucleico de hK2 aislado es ARN ó ADN que codifica un polipéptido hK2 biológicamente activo que comparte cuando menos el 90 por ciento de identidad de secuencia con las regiones homologas al hK3 del péptido hK2 de la Figura 4, como se describió anteriormente. El término "sustancialmente homogéneo, aislado" como se utiliza con respecto a un polipéptido hK2 , se define en términos de las s- metodologías discutidas en la presente más adelante. Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico recombinante", es decir, "ADN recombinante" se refiere a un ácido nucleico, es decir, al ADN que se ha 5 derivado o aislado a partir de cualquier fuente de tejido apropiada, que subsecuentemente se puede alterar químicamente in vitro , y posteriormente se puede introducir en células huéspedes objetivas, tales como las células derivadas a partir de fuentes de animales, plantas, insectos, levadura, fúngales, o bacterianas. Un ejemplo de ADN recombinante "derivado" a partir de una fuente, sería una secuencia de ADN que se identifique como un fragmento útil que codifique hK2 , o un fragmento o variante del mismo, y que entonces se sintetice químicamente en una forma esencialmente pura. Un ejemplo de este ADN "aislado" a partir de una fuente sería una secuencia de ADN útil que se separe o se remueva de dicha fuente mediante elementos químicos, por ejemplo, mediante la utilización de endonucleasas de restricción, de tal manera que se pueda manipular adicionalmente, por ejemplo, ' amplificar, para utilizaree en la invención, mediante la metodología de ingeniería genética. Por consiguiente, "ADN recombinante" incluye secuencias de ADN completamente sintéticas, secuencias de ADN semisintéticas, secuencias de ADN semisintéticas, secuencias de ADN aisladas a partir de fuentes biológicas, y secuencias de ADN derivadas a partir de ARN introducido, así como mezclas de las mismas. En general, la secuencia de ADN recombinante no reside originalmente en el genoma de la célula huésped objetiva que es la receptora del ADN, o reside en el genoma pero no se expresa. La secuencia de ADN recombinante, utilizada para la transformación de la presente, puede ser circular o lineal, de doble cadena o de una sola cadena. En general, la secuencia de ADN está en la forma de ADN quimérico, tal como ADN de plásmido, que también puede contener regiones de codificación flanqueadas por secuencias de control que promuevan la expresión del ADN recombinante presente en la línea celular resultante. Por ejemplo, el ADN recombinante puede él mismo comprende un promotor que sea activo en células de mamífero, o puede utilizar un promotor ya presente en el genoma que sea el objetivo de transformación. Estos promotores incluyen el promotor CMV, así como el promotor tardío SV 40, y los LTRs (elementos de repetición terminal larga) retrovirales. Aparte de las secuencias de ADN recombinante que sirven como unidades de transcripción para hK2 o porciones de las mismas, uña porción del ADN recombinante puede no ser transcripta, sirviendo para una función reguladora o estructural. "Secuencias de control" se define para significar las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente enlazada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son adecuadas para las células procarióticas, por ejemplo, incluyen un promotor, y opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de enlace de ribosoma. Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación, y mejoradores. "Operablemente enlazado" se define para significar que los ácidos nucleicos se colocan en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o líder secretor se enlaza operablemente con el ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participe en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador se enlaza operablemente con una secuencia de codificación si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se enlaza operablemente con una secuencia de codificación si se coloca de tal manera que facilite la traslación. En general, "operablemente enlazado" significa que las secuencias de ADN que ee están enlazando están contiguas, y en el caso de un líder secretor, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que estar contiguos. El enlace se realiza mediante ligación en los sitios de restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se utilizan los adaptadores de oligonucleótido sintéticos o los enlazadores de acuerdo con la práctica convencional.

Aparte de las secuencias de ADN recombinante que sirven como unidades de transcripción para hK2 o porciones del mismo, una porción del ADN recombinante puede no transcribirse, sirviendo para una función reguladora o estructural. El ADN recombinante que se va a introducir en las células, contendrá además en general ya sea un gen marcador seleccionable o un gen reportero, o ambos, para facilitar la identificación y la selección de las células transformadas a partir de la población de células que se busque transformar. De una manera alternativa, el marcador seleccionable se puede llevar sobre una pieza separable de ADN, y se puede utilizar en un procedimiento de co-transformación. Tanto los genes marcadores seleccionables como los genes reporteros se pueden flanquear con secuencias reguladoras apropiadas para hacer posible la expresión en las células huéspedes. Los marcadores seleccionables útiles son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, genes resistentes a antibióticos y a herbicidas, tales como neo, hpt, dhfr, bar aroA, dapA, y similares. Los genes reporteros se utilizan para identificar las células potencialmente transformadas, y para evaluar la funcionalidad de las secuencias reguladoras. Los genes reporteros que codifican para proteínas fácilmente ensayables, son bien conocidos en este campo. En general, un gen reportero es un gen que no está presente en, o no es expresado por, el organismo o tejido receptor, y que codifica una proteína cuya expresión se manifiesta por alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, una actividad enzimática. Los genes preferidos incluyen el gen de acetiltransferasa de clora fenicol (cat) a partir de Tn9 de E. coli. el gen de ß-glucuronidasa (gus) del lugar uidA de E. coli. y el gen de luciferasa a partir da Photinus pyralis de luciérnaga. La expresión del gen reportero se ensaya en un tiempo adecuado después de que se haya introducido el ADN en las células receptoras. Otros elementos funcionales en las células huéspedes, tales como intrones, mejoradores, secuencias de poliadenilación, y similares, también pueden ser una parte del ADN recombinante. Estos elementos pueden o no ser necesarios para la función del ADN, pero pueden proporcionar una mejor expresión del ADN por la transcripción que afecte, la estabilidad del mARN, o similares. Estos elementos se pueden incluir en el ADN según se desee, para obtener el funcionamiento óptico del ADN transformante en la célula. Los métodos generales para construir ADN recombinante que pueda transformar células objetivas, son bien conocidos por los expertos en este campo, y se pueden utilizar las mismas composiciones y métodos de construcción para producir el ADN útil en la presente. Por ejemplo, J. Sambrook y colaboradores, Molecular Cloninq; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2a edición, 1989) , proporciona métodos adecuados de construcción. El ADN recombinante se puede introducir fácilmente en las células objetivas mediante transfección con un vector de expresión que comprenda cADN que codifique hK2, por ejemplo, mediante el procedimiento de precipitación de fosfato de calcio modificado de C. Chen y colab.oradores, Mol. Cell. Biol. 7, 2745 (1987). La transfección también se puede realizar mediante lipofectina, utilizando estuches comercialmente disponibles, por ejemplo, proporcionados por BRL. Las células huéspedes adecuadas para la expresión del polipéptido hK2 se derivan a partir de organismos multicelulares. Estas células huéspedes son capaces de procesar complejos y de tener actividades de glucosilación. En principio, se puede trabajar con cualquier cultivo celular eucariótico superior, ya sea de un cultivo de vertebrado o invertebrado. Los ejemplos de las células de invertebrado incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes, y las células huéspedes de insectos permisivas correspondientes a partir de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori . Ver, por ejemplo, Luckow y colaboradores Bio/Technology 6 ; 47 (1988) ; Miller y colaboradores, en Genetic Engineering, J.K. Setlow y colaboradores, eds., Volumen 8 (Plenum Publishing 1986), páginas 277-279; y Maeda y colaboradores, Nature 315:592 (1985) . Una variedad de cepas virales para transfección están públicamente disponibles, por ejemplo, la variante Ll de Autographa californica NPV, y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NVP, y se pueden utilizar estos virus, de ..preferencia para la transfección de células de Spodoptera frugiperda . La recuperación o el aislamiento de un fragmento dado de ADN a partir de una digestión de restricción, puede emplear separación de la digestión sobre amida poliacrílica o gel de agarosa mediante electroforesis, identificación del fragmento de interés mediante comparación de su movilidad contra aquella de los fragmentos de ADN marcadores de un peso molecular conocido, remoción de la sección de gel que contiene al fragmento deseado, y separación del gel a partir del ADN. Por ejemplo, ver Lawn y colaboradores Nucleic Acids Res. , 9, 6103-6114 (1981) , y Goeddel y colaboradores, Nucleic Acids Res.. 8, 4057 (1980) . El "análisis Southern" o el "manchado Southern", es un método mediante el cual se confirma la presencia de secuencia de ADN en una digestión de endonucleasa de restricción de ADN o de una composición que contiene ADN, mediante hibridización en un oligonucleótido etiquetado conocido o un fragmento de ADN. El análisis Southern típicamente involucra separación electroforética de las digestiones de ADN sobre geles de agarosa, desnaturalización del ADN deepuée de la separación electroforética, y transferencia del ADN a un soporte de nitrocelulosa, nylon, u otro soporte de membrana adecuado para el análisis con una sonda radioetiquetada, bioestanilada, o etiquetada con enzimas, como se describe en las Secciones 9.37-9.52 de Sambrook y colaboradores, supra . El "análisis Northern" o el "manchado Northern", es un método utilizado para identificar secuencias de ARN que se hibridizan en una sonda conocida tal como un oligonucleótido, un fragmento de ADN, cADN, o un fragmento del mismo, o un fragmento de ARN. Las sonda se etiqueta con un radioisótopo, tal como 32-P, mediante bioestanilación o con una enzima. El ARN que se va a analizar, normalmente puede separarse electroforéticamente sobre un gel de agarosa o de amida poliacrílica, se transfiere a nitrocelulosa, nylon, u otro membrana adecuada, y se hibridiza con la sonda, utilizando técnicas convencionales bien conocidas en este campo, tales como las descritas en las Secciones 7.39-7.52 de Sambrook y colaboradores, supra . La "reacción de cadena de polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento o técnica en donde se amplifican las cantidades de una pieza previamente seleccionada de ácido nucleico, ARN y/o ADN, como se describe en la Patente de los Estadoe Unidoe de Norteamérica Número 4,683,195. En general, ee emplea la información de eecuencia deede los extremoe de la región de interés o más allá, para diseñar los cebadores de oligonucleótido. Estos cebadores serán idénticos o similares en su secuencia a las cadenas opuestae de la plantilla que ee va a amplificar. La reacción de cadena de polimeraea ee puede utilizar para amplificar eecuenciae específicas de ARN, secuencias específicae de ADN a partir del ADN genómico total, y cADN transcrito deede el ARN celular total, eecuenciae de bacteriófagoe o pláemidos, y eimilaree. Ver en general Mullís y colaboradores, Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol . , 51, 263 (1987); Erlich, ed. , PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989) . Las "condicionee eetrictas" son aquellas que: (1) emplean una baja concentración iónica y una alta temperatura para el lavado, por ejemplo, 0.015 M NaCl/0.0015 M citrato de sodio (SSC); sulfato laurílico de sodio al 0.1 por ciento (SDS) a 50°C, o (2) emplean, durante la hibridización, un agente desnaturalizante tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50 por ciento (volumen/volumen) con albúmina de suero bovino al 0.1 por ciento/Ficoll al 0.1 por ciento/pirrolidona polivinílica al 0.1 por ciento/regulador de fosfato de sodio 50 mM a un pH de 6.5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42°C. Otro ejemplo es el uso de formamida al 50 por ciento, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 M (pH de 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1 por ciento, 5 x solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonificado (50 microgramos/mililitro) , SDS al 0.1 por ciento, y eulfato de dextrano al 10 por ciento a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0.2 x SSC y SDS al 0.1 por ciento. Cuando se expresa el polipéptido hK2 en una célula recombinante diferente de una de origen hµmano, el polipéptido hK2 está completamente exento de proteínae o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar el polipéptido hK2 de las proteínae o polipéptidoe de la célula recombinante para obtener preparaciones que sean euetancialmente homogéneas al polipéptido hK2. Por ejemplo, el medio de cultivo o el lisato se puede-centrifugar para remover el desecho celular en partículas. Entonces se separan la membrana y las fracciones de proteína solubles. Luego se puede purificar el polipéptido hK2 a partir de la fracción de proteína soluble, y ei es necesario, a partir de la fracción de membrana del lisato del cultivo. Entonces se puede purificar el polipéptido hK2 de las proteínas solubles contaminantes y los polipéptidos, mediante fraccionamiento sobre columnas de inmunoafinidad o de intercambio de iones; precipitación en etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio de cationes tales como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración de gel utilizando, por ejemplo, Sephadex G-75; o cromatografía por afinidad de ligando. Una vez aisladoe de lae célulae huéepedes transgénicas resultantes, los derivados y las variantes del polipéptido hK2 se pueden preparar fácilmente. Por ejemplo, las amidas de los polipéptidos hK2 de la presente invención también ee pueden preparar mediante técnicae bien conocidas en este campo para convertir un grupo de -ácido carboxílico o precureor, en una amida. Un método preferido para la formación de amida en el grupo carboxilo C-terminal es disociar el polipéptido de un soporte sólido con una amina apropiada, o disociar en la presencia de un alcohol, produciendo un éeter, seguido por aminólieie con la amina deseada. Las sales de los grupos carboxilo del polipéptido hK2 se pueden preparar de la manera usual poniendo en contacto el péptido con uno o más equivalentes de una base deseada, tal como, por ejemplo, una base de hidróxido metálico, por ejemplo, hidróxido de sodio; una base de carbonato o bicarbonato de metal, tal como, por ejemplo, carbonato de sodio o bicarbonato de sodio; una base de amina tal como, por ejemplo, amina trietílica, amina trietanólica, y similaree. Loe derivados de N-acilo de un grupo amino de los presentee polipéptidos se pueden preparar mediante la utilización de un aminoácido protegido con N-acilo para la condensación final, o mediante la acilación de un péptido protegido o no protegido. Los derivados de O-acilo se pueden preparar, por ejemplo, mediante la acilación de un péptido de hidroxi libre o una resina de péptido. La acilación se puede realizar empleando reactivos de acilación convencionales tales como haluros de acilo, anhídridoe, imidazoles de acilo, y similares. Tanto la N-acilación como la O-acilación se pueden realizar juntas, si se desea. En adición, la secuencia de aminoácidos de hK2 interna de la Figura -.4 se puede modificar utilizando una o doe sustituciones de aminoácidos conservadoras para sustituir las posiciones especificadas, incluyendo sustituciones que utilicen la forma D más bien que la forma L. La invención también se refiere a formas variantes o modificadas del polipéptido hK2 de la Figura 4. Se puede alterar uno o máe de los residuoe de eete polipéptido, eiempre que se retenga la función antigénica. Se prefieren las sustituciones de aminoácidos conservadoras - es decir, por ejemplo, aspártico-glutámico como los aminoácidos ácidoe; lisina-arginina-histidina como loe aminoácidos básicos; leucina-isoleucina, metionina/valina como los aminoácidos hidrofóbicos; serina/glicina/alanina/treonina como los aminoácidos hidrofílicos. Las sales de adición de ácido de los polipéptidos se pueden preparar poniendo en contacto el polipéptido con uno o más equivalentes del ácido inorgánico u orgánico deseado, tal como, por ejemplo, ácido clorhídrico. También se pueden preparar esteres de los grupos carboxilo de los polipéptidos mediante cualquiera de los métodos usuales conocidos en este campo. Una vez aislado, el polipéptido hK2 y sue variantes antigénicamente activas, derivados, y fragmentos del mismo, se pueden utilizar en ensayos para hK2 en muestras derivadas a partir de materiales biológicos de los que se soepeche que contienen hK2 o anticuerpos anti-hK2, como se describe con detalle en la Número de Serie 08/096,946. Por ejemplo, el polipéptido hK2 se puede etiquetar con una etiqueta detectable, tal como por medio de uno o más residuos de peptidilo radioetiquetados, y se puede utilizar para competir con el hK2 endógeno por el enlace con los anticuerpos anti-hK2 , es decir, como un "antígeno de captura" para enlazarse con los anticuerpos anti-hK2 en una muestra de un fluido fisiológico, por medio de diferentes formatos de inmunoensayo competitivo para hK2 que utilicen anticuerpos anti-hK2 inmovilizados, y se realiza mediante: (a) proporcionar una cantidad de anticuerpos anti-hK2 unidos a una superficie sólida; (b) mezclar la muestra del fluido fisiológico que se va a probar, con una cantidad conocida de polipéptido hK2 que comprenda una etiqueta detectable, para producir una muestra mixta; (c) poner en contacto los anticuerpos sobre la superficie sólida con la muestra mixta durante un tiempo suficiente para permitir que se presenten reacciones inmunológicas entre los anticuerpos y el hK2, y entre los anticuerpos y el polipéptido etiquetado; (d) eeparar la euperficie eólida de la muestra mixta ; (e) detectar o determinar la presencia o la cantidad de polipéptido etiquetado, ya sea enlazado con los anticuerpos eobre la euperficie eólida, o restante en la muestra mixta; y (f) determinar, a partir del resultado del paso (c) , la presencia o la cantidad del hK2 en dicha muestra.

En otro formato que puede detectar hK2 endógeno en una muestra mediante un inmunoensayo de inhibición competitiva, se agrega una cantidad conocida de anticuerpo anti-hK2 a una muestra que contenga una cantidad desconocida de hK2 endógeno. La cantidad conocida se selecciona para ser menor que la cantidad requerida para complejar todo el hK2 que se sospeche que está presente, por ejemplo, que estaría presente en una muestra de la misma cantidad de fluido fisiológico obtenido a partir de un paciente que se sepa que tiene cáncer de próstata. En seguida, se agrega una cantidad conocida del polipéptido hK2 de la invención o una eubunidad del mismo, que comprenda una etiqueta detectable. Si está presente el hK2 endógeno en la muestra, habrá menos anticuerpos disponibles para enlazarse con el anticuerpo hK2 etiquetado, y permanecerá libre en la eolución. Si no hay hK2 endógeno, el polipéptido etiquetado agregado se complejará con los anticuerpos anti-hK2 agregados para formar complejos binarios. En seguida, los complejos de anticuerpo-antigeno binarios se precipitan mediante un anticuerpo IgG antimamífero, oveja, cabra, ratón, etcétera). La cantidad de radioactividad u otra etiqueta en el precipitado (un complejo ternario) es inversamente proporcional a la cantidad de hK2 endógeno que está preeente en la muestra, por ejemplo, un granulo que contenga cantidades reducidas de radioactividad indica la presencia de hK2 endógeno. Alternativamente a las técnicas convencionales para la preparación de anticuerpos o antisueros policlonales en el laboratorio y en los animales de granja, se pueden preparar anticuerpoe monoclonalee contra el anticuerpo hK2 utilizando técnicas de cultivo celular de hibridoma conocidas. En general, este método involucra preparar una línea celular fundida productora de anticuerpo, por ejemplo, de células de bazo primarias fundidas con una línea continua compatible de células de mieloma, y cultivar las células fundidas ya sea en cultivo en masa o en una especie animal a partir del cual se derivó o sea compatible la línea celular de mieloma utilizada. Estos anticuerpos ofrecen muchas ventajas en comparación con los producidos mediante la inoculación de animales, ya que son altamente específicos, y sensibles, y son relativamente "puros" inmunoquímicamente. Loe fragmentoe inmunológicamente activoe de loe presentes anticuerpos también están dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo, el fragmento f(ab), aeí como los anticuerpos monoclonales parcialmente humanizados. La invención se describirá adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos detallados.

Ejemplo 1 Construcción de Vectores de Expresión hK2 (A) Generación de baculovirus recombinantes que contienen secuencias de codificación de pphK2 y mhK2 Se sintetizó un cADN (de aproximadamente 820 bp de largo) que codifica todo el prepro-hK2 (pphK2) (desde el nucleótido #40 al #858 en relación con el sitio de inicio de la transcripción de pphK2) , como se muestra en la Figura 5, a partir de ARN de tejido de hiperplasia prostática benigna humano, utilizando tecnología de reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) con un par de cebadores de oligonucleótido específicoe de hK2 (5»ACGCGGATCCAGC?TGTGGGACCTGGTTCTCT3 • SEQ ID NO: 2, y 5 • ACAGCTGCAGTTTACTAGAGGTAGGGGTGGGAC3 ' SEQ ID NO: 3). Eete cADN se generó de tal manera que los extremos 5' y 3' (con respecto a la secuencia en sentido de pphK2) se encuadraron con las secuencias BamHl y Pst I, respectivamente. Luego se purificó el cADN mediante electroforesie de gel de agarosa, y se 5 digirió con las enzimas de restricción BamHl y PstI. El cADN restringido se ligó con el vector del plásmido pVL1391 digerido con BamHI-PstI,. y ee traneformó en E. coli cepa HB101. Se eeleccionó la El coli que ..alojaba al cADN de '"" pphK2/vector del plásmido pVL1393, y se verificó mediante mapeo de enzima de restricción y secuenciamiento de ADN. El plásmido de cADN de pphK2/pVL1393 se produjo en masa en E. coli, y se purificó mediante ultracentrifugación de gradiente de CeCl. El cADN que codifica el hK2 maduro se sintetizó utilizando reacción de cadena de polimerasa con el cADN de pphK2 anteriormente mencionado como la plantilla, más un par de oligonucleótidos de hK2 (S'ACGCGGATCCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCTS' SEQ ID NO: 2, y 5 ' ACCGGAATTCATGATTGTGGGAGGCTGGGAGTGT3 ' SEQ ID NO: 4). Como se notó, el oligonucleótido del extremo 3' fue el mismo oligonucleótido del extremo 3' utilizado para sintetizar el cADN de pphK2. Sin embargo, el oligonucleótido del extremo 5' fue diferente del oligonucleótido del extremo 5' utilizado para el cADN de pphK2 , y por consiguiente, genera un cADN que codifica para la forma madura de hK2 (mhK2) , como se muestra en la Figura 6. El cADN de mhK2 se encuadró con las eecuenciae de EcoRI y PstI en los extremoe 5' y 3', reepectivamente. La proteína producida a partir del cADN de mhK2 ganará una metionina exógena en su término N. Se generó el vector de mhK2/pVL1393 y se purificó como se describe para pphK2/pVL1393. El análisis de secuencia del ADN para pphK2 y mhK2 en pVL1393 mostró que se alteró un nucleótido (#805) de (G a T) en una mutación silencioea. Loe ADN de pphK2/pVL1393 o mhK2/pVL1393 (2 microgramos) se cotransfectaron con un ADN de Baculogold linealizado (0.5 microgramos; Pharmingen, San Diego, CA) en células de insecto S/9 de acuerdo con las instrucciones de Pharmingen (S. Gruenwold y colaboradores, Baculovirus Expression Vector System: Prceedures and Methode Manual, Pharmingen, San Diego, CA (1993)). De cuatro a eeie díae después de la transfección, se cosechó el medio gastado de células S/9 que contenía partículas viralee, y ee utilizó para infectar célulae S/9 frescas para amplificar titulaciones virales. Se aisló el ARN total para análisis de mancha Northern de la transcripción auténtica de pphK2 o mhK2 utilizando cADN de hK2 como una sonda. Se obtuvo otra prueba de la transcripción de pphK2 o mhK2 expresada en células S/9 infectadas con virus recombinante mediante reacción de cadena de polimerasa de transcripción inversa y secuenciamiento de ADN. El baculovirus recombinante puro que contenia pphK2 ó mhK2 se obtuvo mediante el protocolo de purificación de placa secundaria o terciaria de acuerdo con las inetrucciones de Pharmingen (S. Gruenwold y colaboradores, citado anteriormente) .

Ejemplo 2 Generación de Vector de Expresión Procariótico Se generó un fragmento de 0.8. kb que representaba toda la secuencia de codificación de prepro-hK2 (pphK2) , mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando los cebadores A ( 5 • TATACATATGTGGGACCTGGTTCTCTCC3 • SEQ ID NO: 11), y B (5-ATATGGATCCTCAGGGGTTGGCTGCGATGGT3' SEQ ID NO: 12), y el plásmido pVL1393 que contenía pphK2 como la plantilla. El vector de expresión bacteriana de pphK2 (pBPPHK2) se preparó mediante tecnología de clonación de ADN convencional (Sambrook, citado anteriormente) , para subclonar eete fragmento de 0.8 kb en el sitio Ndel/BamHI del plásmido pPHS579 (un obsequio del Dr. H. Hsiung, Eli Lilly Co. Inc.) bajo el control del promotor T7. El ADN de todo el inserto más los sitios de clonación, se secuenció para confirmar que no se hubieran presentado artificios de clonación, y para asegurar que no se hubieran generado anomalías en la secuencia por la reacción de cadena de polimerasa. El pBPPHK2 se transformó en E. coli BL21 (DE3)Lys S (Novagen, Inc. Madison, Wl).

Ejemplo 3 Generación de un Vector de Expresión de Mamífero Para expresar hK2 en líneas celulares de mamífero, se generó un fragmento de 0.8 kb que representaba toda la eecuencia de codificación de preprohk2 (pphK2) mediante t reacción de cadena de polimeraea, utilizando loe cebadores A(5'ATATGGATCCATATGTCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCTCCA3') SEQ ID NO: 17) , y B (5 'ATATGGATCCTCAGGGGTTGGCTGCGATGGT3 • ) (SEQ ID NO: 12) , y el plásmido pVL1393 que contenía pphK2 como la plantilla. El vector de expresión de mamífero (pGThK2) ee preparó empleando tecnología de clonación de ADN convencional (Sambrook, 1989) , para clonar este fragmento de 0.8 kb en el eitio BcII del pláemido pGT-d (un obsequio del Dr. Brian Grinnell, Eli Lilly, Inc.) bajo el control del promotor GBMT. El ADN de todo el inserto más los sitioe de clonación, ee eecuenció, y ee notó un solo cambio del par de bases en la posición 650 (T por C) . Este cambio da como resultado una sustitución de aminoácido de valina por alanina en la posición 217 en hK2. Se cultivó AV12- 664 (ATCC CRL-9595) , una línea celular derivada a partir de tumores inducidos por adenovirus en hámster Sirio, en medio de Eagle modificado con Dubelcco complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (D10F) , y transfectado con el plásmido pGThK2 utilizando el método de fosfato de calcio.

Ejemplo 4 Identificación de pphK2 y mhK2 Recombinantes A. Sistema de célula de insecto-baculovirue Se sembraron célulae S/9 (7 x 106/plato) sobre platos Corning de 10 milímetros con suero de becerro fetal al 10 por ciento - medio Graces a la temperatura ambiente durante 1 hora. Después de unirse sobre los platoe de cultivo, lae célulae ee infectaron con baculovirus de tipo silvestre o recombinante en medio Excell-400 exento de suero, y se incubaron a 27°C. Se cultivaron células de control en ausencia del virus. En los tiempos designados (24-96 horas) las células se colocaron en medio S/9-II00 fresco deficiente en metionina, o en metionina y cisteína, durante 45 a 60 minutos a 27 °C, y luego se incubaron con Promix (0.143 mCi/plato, una mezcla de [35S] -metionina y [35S] -cisteína; 1,000-1,400 Ci/milimol; Amersham) en medio S/9II00 exento de euero y deficiente en metionina/cisteína (Biofluide) , durante 5 a 8 horas o durante horas. Después del final de cada tiempo de incubación, se separaron las células y el medio gastado mediante centrifugación (1,000 rpm; Beckman J-6B; Beckman, Fullerton, CA) . Las células se lavaron y se centrifugaron (13,000 rpm; Biofuge 13, Baxter) dos veces. Las células lavadas se lisaron mediante congelación/descongelación en un regulador del pH detergente (10 mM de Tris, pH de 7.5; 130 mM de NaCl, Tritón X-100 al 1 por ciento, 10 M de NaF; 10 mM de NaPi, 10 M de Nappi, pH de 7.5), ó H20, y se centrifugaron para obtener citosol y fraccionee celularee ineolubles. Se determinó el contenido de proteína de las muestras anteriores ya sea mediante el método de Bradford o de Lowry (BioRad, Inc., Melville, N.Y.). El medio gastado anterior, el citoeol, y la fracción celular insoluble, se congelaron y se almacenaron por separado hasta usarse. Se preparó un conjunto duplicado de muestrae ein etiquetación con 35S. Para el análisis de SDS-electroforesis de gel de gel de amida poliacrílica (PAGE) de la expresión de la proteína hK2 en células S/9, se agregaron muestras al regulador de muestra (U.K. Laemmli, Nature, 227 , 680 (1970)), se calentaron a 95 °C durante 5 minutos, y se sometieron a SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. Se utilizó rutinariamente el análisie de mancha Northern para seleccionar y aielar los baculovirus recombinantes clónales que expresaban mARN de pphK2 ó mhK2. Una comparación de las pistas correspondientee de ambas autorradiografías de la mancha Northern, y fotografías de manchado con bromuro de etidio de ARN, muestra que estaba presente el ARN para pphK2 ó mhK2 en las célulae S/9 infectadas con virus recombinante, pero no en las células infectadas con virus de tipo silvestre. Más aún, cada una de las pistae positivae del mARN de pphK2 ó mhK2 representa el ARN aislado de las células S/9 infectadas con virus recombinantes derivados a partir de una sola placa viral. Por consiguiente, los resultadoe eugieren que la alta frecuencia (100 por ciento) del baculovirus recombinante que contiene ya sea pphK2 ó mhK2 se obtuvo a partir de la transfección anterior. Además, las secuencias de pphK2 ó mhK2 expresadas en células S/9 infectadas con virus, se confirmaron mediante una combinación de reacción de cadena ... de polimerasa de tranecripción inverea, clonación, y secuenciamiento de ADN. Para determinar si se expresa la proteína pphK2 en la célula de insecto S/9, se realizaron estudioe del curso del tiempo utilizando etiquetación con 35S de la sínteeie de novo de la proteína, y se detectó mediante electroforesis de gel de amida poliacrílica (PAGE) con SDS desnaturalizante. Como se ve en la autorradiografía (Figura 1) , se encontró una proteina única (de aproximadamente 28 KDa) en las células S/9 infectadas con virus recombinante de pphK2 a las 35-74 horas después de la infección. Esta banda faltaba en las células no infectadas, en las células infectadas con virus de tipo silvestre. La proteína de polihedro viral (de aprox adamente 32 KDa) se encontró (Figura 1) como se esperaba, en las células S/9 infectadas con virue de tipo eilveetre, mientras que no fue expresada por el virue recombinante (Figura 1) . La proteína ee detectó en citosol cuando se prepararon fracciones subcelulares (citosol contra fracción insoluble) lisando lae célulae con H20 y con congelación-descongelación, mientras que esta proteína de 28 kb se detectó en la fracción insoluble cuando se preparó mediante un regulador del pH detergente, y con congelación-descongelación (no se muestran los datos) . La proteína mhK2 también se expresó en la célula de insecto S/9, etiquetando con 35S la proteína sintetizada de novo . Como se ve en la autorradiografía (Figura 2) , se encontró una proteína única (de aproximadamente 28 KDa) en la fracción ineoluble de las células S/9 infectadas con virue recombinante de mhK2 a las 48 horas deepués de la infección. Esta banda faltaba en lae célulae no infectadas, o en las células infectadas con el virue de tipo silvestre. Se descubrió la proteína de polihedro viral (de aproximadamente 32 KDa) en las células infectadas con-virus de tipo silvestre, mientras que no se expresó en las células infectadas con virus recombinante (Figura 1) . Cuando se examinó la fracción de citosol, no se obeervó ninguna banda de 28 KDa.

B. Sistema de E. coli. El plásmido pBPPHK2 se transformó E. coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen, Inc., Madison, Wl) . Esta cepa contiene una copia cromosomal de polimerasa de ARN de T7 bajo el control del promotor LacUVS inducible. Sobre la adición de IPTG (ß-D-tiogalactopiranoeida de i^opropilo) , ee induce la expresión de la polimerasa de ARN de T7 , que a su vez activa el promotor TI , dando como resultado una sobreproducción del producto genético bajo el control de este promotor. Para determinar si se expresaría el producto del gen ppHk2 a partir de pBPPHK2 , se cultivaron colonias sencillas de E. coli de BL21 transformadas con pBPPHK2 para O.D.600 = 0.2 en 10 mililitros de medio LB más ampicilina (100 microgramos/mililitro) , y ee indujeron con 0.4 mM de IPTG (Sigma, Inc.). Las células se cosecharon dos horas después de la ... inducción mediante centrifugación, y se volvieron a suspender en 1.5 mililitros de regulador de muestra SDS/PAGE (U.K. Laemmli, Nature 227, 680 1970) antes del análisis SDS/PAGE. El granulo celular a partir del cultivo inducido con IPTG se volvió a suspender en 0.05 M de Tris, pH de 8.0 (en 9 mililitros/gramo de granulo celular), y ee agitó a la temperatura ambiente (25°C, r.t.) durante 1 hora. Se agregó lieozima (4 miligramoe/mililitro) a eeta euspeneión (en 1 mililitro/gramo de granulo celular) , y la euspensión ee agitó a la temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido por incubación sobre hielo durante 30 minutos. La suspensión se sonifico durante 2 minutos a 150 watts, y ee centrifugó a 3,000xg para aielar loe cuerpos de inclusión. Los cuerpoe de inclueión ee volvieron a suspender en regulador corriente (25 mM de Tris, 192 mM de glicina, SDS al 0.1 por ciento), y después de la centrifugación, se analizaron tanto el granulo como el sobrenadante mediante SDS/PAGE.

Se descubrió que aproximadamente el 90 por ciento del pphK2 eetaba en la fracción eobrenadante, lo cual indicó que el pphK2 ee soluble en SDS al 0.1 por ciento. Para preparar muestras del análisie de eecuencia de aminoácidos, se eometieron 20 microlitros de lisato de cuerpo del cuerpo de inclusión a SDS/PAGE sobre un gel de gradiente del 4 al 20 por ciento (BIO-RAD, Inc., Melville, N.Y.). La proteína se manchó a partir del gel sobre papel PVDF de 0.2^ mieras (BIO-RAD), y se manchó con azul Coomassie. La banda de interés de la proteína se cortó a partir de la mancha, y se sometió a secuenciamiento de aminoácidos utilizando un modelo secuenciador de proteína 477A (Applied Biosyste , Inc. , Foster City, CA) . Las célulae inducidae sobreprodujeron grandes cantidades de un polipéptido con una masa molecular aparente de aproximadamente 28kd (Figura 3) . El análisis densitométrico indicó que esta proteína comprendía aproximadamente el 40 por ciento de la proteína celular total. El tamaño de esta proteína, determinado mediante un gel de SDS-PAGE, fue comparable con el predicho a partir de la secuencia de codificación para pphK2. Para confirmar que esta proteína es pphK2, se determinó la secuencia de los primeros 10 aminoácidos (MWDLVLSIAL) (SEQ ID NO: 13) desde el término N. Esta secuencia concuerda perfectamente con la deducida a partir de la secuencia de ADN del cADN de pphK2. Como se notó, tiene diferente identidad de los primeros 10 aminoácidos tanto de pphK2 (MWFLVLCLAL) (SEQ ID NO: 14) como de pphK3 (MWVPWFLTL) (SEQ ID NO: 15) . También muestra que esta proteína no se modifica ni se procesa en el término N, ya sea durante o después de la expresión en E. coli. Estos resultadoe demueetran que pode oe expreear precieamente pphK2 en E. coli a partir de pBPPHK2.

C. Sietema de Mamífero I. Aislamiento y Purificación de Proteína. El pláemido pGThK2 se transformó en la línea celular de hámster AV12-664 (ATCC-CRL-9595) . Para determinar si el producto del gen pphK2 se expresaría a partir de pGThK2 , se cultivó AV12-pGThK2 #2 en D10F + 200nM MTX. En una confluencia de aproximadamente el 60 por ciento, las células se lavaron con solución de sal balanceada de Hank, y se volvieron a suepender en medio HH4 exento de suero. El medio gastado se recolectó deepuée de 7 días (medio gastado exento de suero) , y se almacenó a -20°C. La Figura 8 ilustra un SDS-PAGE que confirma la expresión de pphK2 recombinante en una línea celular de mamífero. Se cultivaron las líneae celularee clónales AV12-pGThK2 (Pistas 4 a 6) y AV12-pGT-d (Pista 3) en medio D10F. Aproximadamente 300 mililitros del medio gastado de loe clones anteriores se concentraron y se sometieron a SDS/PAGE, junto con el marcador See Blue MW (pieta 1) y el lisato de pphK2 a partir de células de E. coli (pista 2) . El gel se manchó sobre papel de nitrocelulosa, y se inmunomanchó utilizando una dilución de 1/1000 de antisuero de conejo anti-pphK2. Se utilizó HRP de cabra contra conejo como la sonda secundaria, y la mancha ee deearrolló mediante DAB más H202. La pista 3 (AV12-pGT-d) es AV12 tranefectado con el vector sin inserto. Para purificar la proteína, el-medio gastado exento de suero se concentró de 5 a 10 veces mediante ultrafiltración con una membrana de corte de peso molecular de 10 kDa, y luego ee dializó durante la noche a 4°C contra bicarbonato de eodio 50 M, pH de 8. Las muestras se filtraron con filtros de 0.2 mieras, y luego se bombearon directamente sobre la columna de HPLC de TSK DEAE-5PW (21 milímetros. x 150 milímetros) a una velocidad de flujo de 5 mililitros/minuto. El regulador A contuvo bicarbonato de eodio 50 mM, pH de 7.9. El regulador B contuvo bicarbonato de eodio 50 Mm máe cloruro de eodio 0.5 M, pH de 7.6. El perfil de elución mostrado en la Figura 9, se reveló con un gradiente del 0 al 50 por ciento de regulador B durante 35 minutos; del 50 al 100 por ciento de B de 35 a 40 minutos, y una elución isocrática al 100 por ciento de B durante 5 minutos, antes del reequilibrio en el Regulador A. La velocidad de flujo fue de 5 mililitros/minuto todo el tiempo. Las fracciones de DEAE se ensayaron por la presencia de hK2 mediante ELISA utilizando anti-pphK2 de conejo como anticuerpos primarios. El ensayo ELISA mostró un pico de actividad de hK2 que se eluyó en aproximadamente 0-2M de NaCl (mostrado como la linea del triángulo de la Figura 9) , que se correlacionó bien con la aparición de una banda de 34 kDa de proteína que se ve mediante SDS-PAGE en las mismas fracciones (no se muestran los datos) . Las fracciones con actividad d hK2 se agruparon y se concentraron mediante ultrafiltración con membranas de 10 kDa hasta aproximadamente 5 a 8 mililitros, eobre lo cual, se agregó sulfato de amonio sólido para hacer una concentración final de 1 M. Luego esta muestra se inyectó sobre una columna de aspartamida de polipropilo PolyLC, con un tamaño de poros de 1000 Angstroms, de 4.6 milímetros x 200 milímetros, para resolver la proteína mediante cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC, ver la Figura 10) . El regulador A fue fosfato de Na 20 mM, sulfato de Na 1.2 M, pH de 6.3, y el regulador B fue de fosfato de Na 50 mM, 2-propanol al 5 por ciento, pH de 7.4. El gradiente de elución fue del 0 al 20 por ciento de B durante 5 minutos; del 20 al 55 por ciento de B de 5 a 20 minutos, ieocrático al 55 por ciento de B de 20 a 23 minutos, del 55 al 100 por ciento de B de 23 a 25 minutoe; ieocrático al 100 por ciento de B durante 2 minutos antee del reequilibrio del regulador A. La velocidad de flujo fue de 0.7 mililitroe/minuto. No ee retuvo más del 90 por ciento del A280 sobre la columna de la cromatografía de interacción hidrofóbica. El pico principal retenido sobre la cromatografía de interacción hidrofóbica, que se eluyó a los 22 minutos, también mostró el pico más alto de actividad mediante el ensayo ELISA (línea del triángulo, Figura 10) . Las fracciones de la cromatografía de interacción hidrofóbica que se probaron positivas para hK2 en ELISA, se agruparon, se concentraron con ultrafiltro como anteriormente hasta un volumen menor de 1 mililitro, y luego se inyectaron sobre una columna de exclusión de tamaños Pharmacia S12 10/30, equilibrada en acetato de amonio 100 mM. La velocidad de flujo fue de 0.7 mililitroe/minuto. Cuando se resolvió el pico de 22 minutos a partir de la cromatografía de interacción hidrofóbica mediante cromatografía de exclusión de tamaños, se eluyó típicamente de aproximadamente el 80 al 90 por ciento de la proteina A280 a los 19.4 minutos, un tiempo de retención consistente con una proteína de aproximadamente 34 kDa (Figura 11) . El otro único pico de proteína sobre SEC, que se eluyó a los 16.7 minutos, correspondió a una proteína de aproximadamente 70 kDa vista también en los pasos de purificación anteriores. Para examinar la eficiencia de nuestro esquema de purificación, se sometieron 1.5 microgramos de phK2 purificado a SDS/PAGE en la presencia o en ausencia de ß-mercaptoetanol (BME) , y el gel se manchó con plata. Los resultados mostraron que el phK2 de nuestra muestra fue aproximadamente 95 por ciento puro (Figura 12) . También mostró que el pro-hK2 emigró a aproximadamente 30 KD en ausencia de ß-mercaptoetanol, y emigró a aproximadamente 34 kDa en la presencia de ß-mercaptoetanol. Este patrón es similar al observado para el PSA purificado a partir de fluido seminal (Figura 12) . El phK2 recombinante se reconoce mediante anti-pphK2 de conejo, anti-PSA de conejo, y un anticuerpo monoclonal de murino dirigido contra un polipéptido que cubre los aminoácidos 45-56 de hK2 , al analizarse en manchas WESTERN, o al secarse sobre placae de microtitulación. Sin embargo, el phK2 no se puede detectar mediante estos anticuerpos en los ensayos de emparedado. Eetoe reeultadoe demuestran además que el phK2 y el PSA son confor acionalmente diferentes, y los anticuerpos actualmente disponibles para PSA ó hK2 no pueden detectar el phK2 en su forma nativa. Además, el phK2 no fue detectable mediante los eneayoe Tándem R o de PSA libre (ensayos inmunológicos para la detección de PSA en suero) . Se ha depositado una muestra de hibridoma (HK1A 523.5) que secreta el anticuerpo monoclonal de murino en la American Type Culture Colletion, Rockville, MD, y se le asignó el ATCC HB-11876. 2. Análisis de Aminoácidos y Secuenciamiento de Proteína de phK2. El pico recolectado de la cromatografía por exclusión de tamaños (SEC) en acetato de amonio, se liofilizó para remover el regulador, y luego se reconstituyó en agua. Se cargó una alícuota (2.5 microgramos) de esta muestra sobre una membrana Portón (Beckman Instruments) , y se sometió a análisis de secuencia N-terminal automatizado en un secuenciador de proteína Applied Biosysteme modelo 477A, que produjo la siguiente eecuencia: Val-Pro-Leu-Ile-Gln-Ser-Arg-Ile-Val-Gly-Gly-Trp-Glu- (SEQ ID NO: 18) . También ee hidrolizó una alícuota de la miema muestra en agua en HCl 6 N gaseoso al vacio durante 20 horas a 112 °C, y luego se reconstituyó en HCl 0.1 N, y se analizó en un analizador de aminoácidoe Hewlett Packard Aminoquant, utilizando derivación de pre-columna de aminoácidos con OPA para aminas primarias y FMOC para aminas secundarias. No fue evidente una secuencia competidora a partir del perfil de aminoácidos liberados en secuencia mediante el procedimiento de degradación de Edman. Por analogía con PS?, esta proteína es pro hK2, ya que la secuencia conocida de PSA maduro se ha mostrado que empieza con Ileu-Val-Gly-etcétera, y el pro PSA ee ha postulado que tiene 7 aminoácidos extra en el término N. El análisis de aminoácidos de eeta proteína produjo una composición de aminoácidos consistente con la secuencia recombinante de prohK2. Estoe reeultadoe demuestran que el pphK2 , que tiene la SEQ ID NO: 19, se expresó precisamente en la línea celular de mamífero AV12-664 a partir de pGThK2.

Ejemplo 5 Producción de Anticuerpos para pphK2 Recombinante A. Sistema de E. coli Para preparar pphK2 para inmunización de conejo, los cuerpos de exclusión obtenidoe a partir de loe cultivos bacterianos de B121 (pBpphK2) después de la inducción de IPTG como en el Ejemplo 4B, se suependieron en 100 microlitros de regulador de mueetra SDS/PAGE/mililitro de cultivo bacteriano, y se paearon por electroforesis sobre SDS/PAGE de preparación. La banda de pphK2 se separó y se electroeluyó a partir del gel en el regulador corriente (25mM de Tris, 192 mM de glicina, SDS al 0.1%), y se utilizó como el inmunógeno. Se inmunizaron dos conejos, cada uno con 100 microgramos de inmunógeno en auxiliar de Freund completo, y se reforzaron dos veces en intervalos de tres semanas con 100 microgramos del inmunógeno en auxiliar de Freund incompleto y PBS, respectivamente. Los sueros de anti-pphK2 de conejo se obtuvieron una semana en seguida del segundo refuerzo. La presencia de anti-pphK2 en el antisuero de conejo, se mostró mediante ELISA (no se muestran los datos) . Una vez confirmado mediante este método, se probó el antisuero de titulación más alta sobre manchas WESTERN utilizando lisatos a partir de cultivoe inducidoe por IPTG y no inducidos de BI.21 (pBpphK2) . Fue evidente que el antisuero contenía anticuerpos altamente específicos para la proteína pphK2 , ya que se reconoció una banda de proteína en aproximadamente 28kd correspondiente a pphK2 solamente en el lisato inducido. El antisuero también-. reconoció el pphK2 purificado, moetrando ademáe la eepecificidad de loe anticuerpos para pphK2. Los datos anteriores demuestran que los anticuerpos reconocen la forma prepro de hK2. Para delinear si el antisuero reconoce la forma madura de hK2 (mhk2) , el mhK2 se expreeó en E. coli como una proteína de fueión de S-traneferaea de glutationa (GST-mhK2), y el lisato celular se inmuno anchó utilizando antisuero de conejo anti-pphK2. Fue evidente que el antisuero anti-pphK2 reconoció el GST-mhK2 , demostrando que los anticuerpos estaban cuando menos en parte contra la región madura de pphK2. Para examinar el patrón reconocido en fluido seminal por los anticuerpos anti-pphK2, se preparó fluido seminal a partir de semen agrupado como es descrito por Sensabaugh y Blake, J. Urology, 149, 1523 (1990) , y se inmunomanchó con antisuero de conejo anti-pphK2. El antisuero reconoció una banda mayor en aproximadamente 34kd, más varias bandas menores en un peso molecular más bajo. El suero preinmune no reconoció bandas en ninguno de los experimentos anteriores, mostrando que se generaron anticuerpos mediante la inmunización. Para determinar ei hay anticuerpoe específicos de pphK2 en el antisuero de conejo anti-pphK2, se absorbieron los anticuerpos que reaccionaban cruzados con PSA hacia afuera del antisuero mediante una resina de afinidad de PSA. Específicamente, se diluyó 1 mililitro del suero con 1 mililitro de 100 mM de HEPES, pH de 7^5, y se incubó con Affigel-10 enlazado con PSA nativo durante 3.5 horas a 4°C. La mezcla se utilizó vertida en una columna, se recolectó el flujo atravesado, y la columna se lavó con 30 mililitros de regulador HEPES. Loe anticuerpos enlazados con la columna (eluato) se eluyeron con ácido acético (ÍN, pH 4.0), y se neutralizaron hasta un pH de 6.6 con- NH40H. El PSA nativo se aieló a partir del fluido eeminal como es deecrito por Sensabaugh y Blake, citadoe anteriormente. El ppPSA ee purificó a partir de E. coli transformado con el plásmido pPHS579 (que contiene ppPSA bajo el control del promotor T7) , empleando un procedimiento análogo a la purificación de pphK2. El flujo atravesado y el eluato de la columna se probaron por Abs que reconociera pphK2, ppPSA, y PSA nativo (PSA aislado de fluido seminal) utilizando análisis de mancha Western. Fue evidente que loe anticuerpoe en el antieuero de conejo anti-pphK2 no tratado, reconocieron las tres proteínas, indicando que el pphK2 , el ppPSA, y el PSA de fluido seminal, comparten algunos epítopes similares. Sin embargo, aunque el eluato de la columna contenía anticuerpos que reconocieron las tres proteínas, el flujo atravesado contenía anticuerpos que reconocieron solamente pphK2. Esto indica que el antisuero anti-pphK2 contiene anticuerpos específicos de pphK2 , y estos anticuerpos se pueden aielar mediante absorción por afinidad de PSA. Eete eietema noe hizo poeible generar anticuerpos anti-pphK2 que reconocen pphK2 como mhK2. Por consiguiente, utilizando la proteína hK2 inmunogénica y recombinante pura, ee generó un antisuero de conejo que contiene anticuerpos específicoe de pphK2 , proporcionando una valioea fuente para generar y eeleccionar loe anticuerpoe monoclonalee eepecíficoe de hK2. Eetoe ejemploe deecriben el ueo de tres sistemae de expreeión heterólogos (es decir, tanto procariótico como eucariótico) para la expresión con éxito del polipéptido hK2. Por consiguiente, el método de la invención hace posible la producción de grandes cantidades de polipéptido hK2 sustancialmente puro. El polipéptido se puede utilizar tanto para estudiar sue funciones biológicas como para producir reactivos de inmunodetección, tales como el polipéptido hK2 etiquetado, fragmentos etiquetados del mismo, y anticuerpos para el mismo. Los inmunorreactivos pueden proporcionar un método para purificar el hK2 nativo, y para estudiar las propiedades del polipéptido hK2 nativo purificado.

El pphK2 sobreproducido en E. coli se puede solubilizar fácilmente en SDS al 0.1 por ciento, y por consiguiente, la solubilidad no es un problema. Esto contrasta con la expresión de la proteína de calicreína salival humana, hKl, en E. coli, que se encontró en cuerpos de inclusión insolublee (J. Wang y colaboradores, Biochem. J. , 276, 63 (1991)). En contraste, la presente invención produce proteína casi pura que se puede purificar hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE de preparación. Este pphK2 recombinante purificado se puede utilizar para la generación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Como se demostró anteriormente, se puede utilizar el ADN viral Baculogold para generar un baculovirus recombinante que contiene pphK2 ó mhK2. El uso de ADN viral baculogold proporciona una alta selección de baculovirus recombinantes positivoe. Realmente, el análieis de mancha Northern mostró una alta frecuencia de virus recombinante que expresaba el mARN de pphK2 ó mhK2. Máe aún, el análisis SDS-PAGE mostró que amboe virue recombinantee pphK2 y mhK2 producían proteínas únicas con tamaños similares a los pesoe moleculares calculados para pphK2 ó mhK2. Aunque los niveles del hK2 recombinante expresado en el sistema de insecto pueden no ser tan altos como en E. coli, la proteína hK2 producida en el sistema de insecto-baculovirus, puede contener la forma secretada que sería más parecida a la forma natural de la proteína. Los plásmidos pphK2/pVL1393 en E. coli H13101, se han depositado en la American Type Culture Colletion, Rockville, MD, EUA, el 2 de mayo de 1994, bajo las disposicionee del Tratado de Budapest, y se les ha aeignado el número de acceeo ATCC 69614.

La invención se ha descrito con referencia a diferentes modalidades y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, se debe entender que se pueden hacer muchas variaciones y modificaciones mientras que permanezcan dentro del espíritu y alcance de la invención.

LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Mayo Foundation for Medical Education and Research Hybritech Incorporated Tindall, Donald J. Young, Charles Y.F. Saedi, Moha med S. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Polipéptido HK2 Recombinante (üi) NUMERO DE SECUENCIAS: 20 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Schwegman, Lundberg, Woessner & Klut , P.A. (B) CALLE: 3500 IDS Center ( (CC)) C CIIUUDDAADD:: Minneapolis (D) ESTADO: MN (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 55402 (V) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (VÜi) INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Woesener, Warren D. (B) NUMERO DE REGISTRO: 30,440 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO: 150.148W01 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 612-339-0331 (B) TELEFAX: 612-339-3061 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (í) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 237 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:l: Jla Val Oly Gly Trp Clu Cyß Glu Lyß Hlß Ser ßln Pro Trp Olo Val 1 5 10 ÍE te Val Ala eßr Arg Gly ?rg Ala Val Cyß Gly Gly Val Leu Val Hiß 25 10 Pro Gln Trp Val Leu Thx Ala Ala Hlß cyß Il« Arg ?ß& L e ser val 35 40 «5 lie Leu Leu Oly Arg Hiß Ser Leu Phe Hiß Pro Glu Aßp Thr Gly Oln BO 55 fiO Val Phe Glp Val Ser Thr ßer Phe Pro Hiß Pro Leu Tyr Aßp Met Ser £5 7D 75 BD Leu Leu Lyß Aßp Arg Phß Leu Arg Pro Gly Asp A_*p Ber Ser Riß Asp 65 9Ú 55 Leu Het Leu Leu Arg Leu Ger Glu Pro Ala d u Leu Thr Asp Ala Vol 100 105 110 Lyß Val Ket ?ßp Leu Pro Thr Cita Glu Pro Ala Leu Cly Thr Thr Cyu 115 120 125 Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ber llß Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro 130 135 140 Lyß Lyß Leu Gln Cyß Val Gln Leu Kiß Val llß Ber Aßn Aßp val Cya 145 150 155 160 Ala Gln Val Hiß "Pro Gln Lyß Val Thr Lyß Phe Met Leu Cyß Ala Oly 165 1"»0 175 Arg Trp Thr Gly Cly Lyß Ber Thr Cyß ßcx Gly ?ßp Ser Gly Gly Pro 1B0 IBS 190 eu val Cya Aßn oly Val Leu sln Cly lie Thr ßer Trp Oly Ser Glu 195 200 205 Pro Cyß Al» Leu Pro Olu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lyß Val Val Hiß 210 215 220 Tyr Arg Lyß Trp llß Lyß Aßp Thr lie Val ?la Aßn Pro 225 230 235 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ,JD NO: 2: ACGCGGATCC AGCATGTGGG ACCTGGTTCT CT 32 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: ACAGCTGCAG TTTACTAGAG GTAGGGGTG GAC 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: ACCGGAATTC ATGATTGTGG GAGGCTGGGA GTGT 34 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 832 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 10..792 ( i) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: COATCCAOC ATO TOG OAC CTO OTT CTC TCC ATC scc TTO CT GTG ooa 46 Mßt Trp ?ßp Leu Val Leu Ser He Ala Leu Hßr Val Oly 1 6 10 TGC ACT ost scc GTG ecc CTC ATC CAO TCT coa ATT ota GGA GGC TGG 96 cyß Thx aiy ?la Val P o Leu He Gln Ser Arg He Val oly oly Trp 1S 20 25 O?O TGT QAG AAG CAT TCC CAÁ CCC* TCß CAO OTO OC?" GTG TAC ACT CKT 144 Glu Cyi Glu Lyß Hlß Ser sln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr ßer Hiß 30 35 40 45 aa? TOO OCA CAC TC 192 Gly Trp Ala Kiß Leu ACÁ sc occ CAT -roe CTA AAG AAC AAT ?cc CAO CTC TOC CTC GOT CGG 2*0 Thr ?la Ala Hlß Cyß Leu Lyß Lyß ?ßn Snt 01n Val Trp Leu Gly Arg 65 7o 75 CAC AAC CTG TTT O?G CCT GAA GAC ACÁ OOC CAG AGG OTC CCT CTC ACC 28B Hiß ?ßn Leu Phß Glu Pro Giu ?sp Thr Gly Oln Arg Val Pro Val Ser BO 85 SO CAC AGC TTC CCA C?C CCG CTC TAC AAT ATG AOC CTT CTG AAG CAT CA? ?3« Hl» Ser Phe Pro Hiß Pro Leu Tyr Aan Met Ser Lau Leu Lya Kiß Gln 95 100 IOS ?CC CTT AGA CCA OAT GAA G?C TCC AGC CAT OAC CTC ATG CTG CTC CCC ?B4 Ser Leu Arg Pro Aßp Olu Aap Ber Ser Kiß Aßp Lau Met Leu Le Arg 110 115 120 125 CTG TC? GAG CCT OCC AAG ATC ACÁ OAT GTT GTC A?G GTC CTG OQC CTG 432 Leu Ser Glu Pro Ala Lyß He Thr Aßp val Val Lyß Val Leu Gly Leu 130 135 1*0 CCC ?CC CAO GAO CCA OCA CTG OOG ACC ACC TGC TAC GCC TCA OOC TGG 480 Pro Thr Gln Olu Pro Ala Leu Gly Thr Thr cyß Tyr Ala Bßr Gly Trp 14S 150 155 aOC AGC ATC OAA CCA G?G OAG TTC TTG C0C CCC AQG ACT CTT C?G TGT 528 Oly Ser llß Glu Pro Glu Olu Phß Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cye 160 1Í5 170 GTG ?DC CTC CAT CTC CTO TCC ?AT GAC Ts't? GCT AGA GCT TAC TCT 576 Val Ser Leu Kiß Leu Leu ßer Aan Aßp Met Cyß Ala Arg Ala Tyx Ser 175 1B0 185 GAG A?O GTG AC? GAO TTC ATO TTO TGT GCT GGG CTC TGG ACÁ OGT OGT 624 Glu Lyß al Thr Glu Phe Met Leu Cyß Ala Oly Leu Trp Thr Gly Gly SO 195 200 20S ??A GAC ACT TOT GOG GGT GAT TCT OOO OGT CCA CTT OTC TGT AAT GCT 672 Lya Aßp Thr Cyß Gly Oly Aßp Ber Oly Cly Pro Leu Val Cyß Aen Gly 210 215 22? OTO CTT CAA ßGT ATC ACÁ TCA TOO OOC CCT GAG CCA TGT OCC CTG CCT 720 Val Leu Oln Qly Xle 1ht Ser Trp Gly Pro Olu Pro Cyß Ala Leu Pro 225 230 235 GAA A?O CCT GCT GTG TAC ACC AAQ CTß GTG CAT T?C COG ??G TGG ATC 76B Olu y* Pro Ala vß.1 Tyr Thr Lyß Val Val Hiß Tyr Arg Lyß Trp He 240 245 250 AAG GAC ACC ATC OCA OCC AAC CCC TGAGTOCCCC TOTCCCACCC CTACCTCT? B21 Lyß Aßp Thx Xle Ala Ale Aßn Pro 255 260 GTAAACisCAG 132 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 6 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA : (A) LONGITUD : 261 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido ( D) TOPOLOGÍA : lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEQ ID NO : 6 : Het Txp Aßp Leu Val Leu Ser lie Ala Leu Ser Val Gly Cyß Thr Oly 1 5 10 15 Ala Val Pro Leu He Oin 3er Arg He Val O y Gly Trp Glu Cyß Olu. 20 25 30 Lyß Hiß Ser Gln Pro Trp Gin Val Ala Val Tyr Ser Hiß ßly Trp Ala 35 40 45 Kiß Cyß Gly Gly Vßl Leu Val Klß Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60 Ule Cyß Leu Lyß Lye Aßn Ser sln Val Trp Leu Gly Arg Hia Aan Leu «5 70 75 80 Phe G?u Pro slu Aßp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser Hia Ser Phß BS 90 98 Pro Kiß Pro Leu Tyr Aßa Met ßer Leu Leu Lye Hle Gln Ser Leu Arg 100 105 _ 110 Pro Aßp Glu Aßp Ser ßer Hlß ?ßp Leu Mee Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125 Pro Ala Lyß llß Thr Aap Val Val Lyß Val Leu Gly Leu Pro Thr Gin 130 135 140 Olu Pro AlA Leu Gly Thr Thr Cyß Tyr Ala ßer Gly Trp Gly Ser lia 145 150 155 160 aiu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cyß Val Ser Leu ßS 170 17S Hlß Leu Leu Ser Aan Aßp Met Cyß Ala ?r-g Ala Tyr Ser Olu Lyß val íao BS eo Thr ßlu Phe Het Leu cyß Ala Gly Leu Trp Thr aly Gly Lyß Aap rhr 195 200 205 Cyß Cly Gly Aßp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cyß Aßn Gly Val Leu Gln 210 215 220 ßly llß Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro cyß Ala Leu Pro Glu Lyß Pro 225 230 235 240 Ala Vßl Tyr Thr Lyß Val Val Hiß Tyr Arg Lyß Trp 3lß Lyß Aßp tfer 345 250 255 260 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 760 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 7..720 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7 GAATTC ATG ATT GTG OOA GOC TOG GAO TGT GAG A?C CAT TCC C?? CCC B Met He Val Giy Gly Trp Qlu Cyß Glu Lyß Hlß ßer Gln Pro 1 5 10 TGG CAO OTO GCT GTG TAC ?GT C?T OCA TOO OCA C?C TOT GGß CGT GTC SC Trp Oln val Ala Val Tyr Ser Hiß Gly Trp ?la Kiß yß Gly Gly Val 15 20 2S 30 CTG GTG CAC CCC C?G TGG GTG CTC ACÁ OCT ,GCC CAT TGC CTA AAG AAG 144 Leu Val Hiß Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala Hlß Cyß Leu Lyß Lyß 35 40 45 AAT AGC C?G GTC TOG CTO GGT COG CAC A?C CTO TTT GAO CCT OAA GAC 192 Aan Ber Gln Val Trp Leu Gly Arg Hlß ?ßn I?U phe aiu P o aiu Aßp 50 55 60 ACÁ GGC CAO AGG GTC CCT GTC AGC CAC AGC TTC CCA CAC CCG CTC TAC 240 Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser ttiß ßer Pha Pro Hlß "- ro Leu Tyr 65 70 75 AAT ATO AQC CTT CTG ??G CAT CAA KOC CTT AGA CC? GAT GA? OAC TCC 2Bß ?ßn Het Ser Leu Leu Lyß Kiß Oln Ser Leu Arg Pro Aßp ßlu Aßp Ser ACC C?T GAC CTC ATG CTO CTC CGC CTG TC? G?C OCT GCC ??O ATC ACÁ 336 Ser Hlß Aßp Leu Met "Leu Leu Arg Leu Ser Olu Pro Ala Lyß Xle Tbr 95 100 105 110 GAT GTT OTO AAQ CTC CTG «JC CTO CCC ACC CAG GAG CCA OCA CTO 000 3B4 Aßp Val val Lyß Val Leu Gly Leu pro Thr sln Olu pro Ala Leu Gly lis 120 " las ACC ACC TGC TAC GCC TCA GGC TOO GßC ?GC ?TC OAA CCA GAG ßAC TTC 433 Tfar Thr Cyß Tyr ?la Ser Gly Trp Gly Ser lie Glu Pro Glu Olu Phe 130 135 140 TTG COC CCC ACÓ AGT CTT CAG TCT CTG AGC CTC CAT CTC CTG TCC AAT 4BO Leu Arg Pro Arg Ser Leu Oln Cyß Val Ser Leu Hiß Leu Leu Ser ?an 145 150 155 G?C ATG TOT GCT AGA GCT TAC TCT GAO AAG OTO AC? GAO TTC ATO TTG 528 ?ßp Mßt Cyß Ala Arg Ala Tyr Sor Olu Lyß Val Thr Glu Phe Het Lau ICO 1SS 170 tor GCT aaß CTC TGG ACÁ GGT oat AAA axc ACT TCT GOG scrr GAT TCT 5 G Cya Ale Gly Leu Trp Thr aly ßly Lyß Aßp Thr Cya Gly Gly ?ap Ber 175 180 185 190 GGQ GOT CCA CTT GTC TOT AAT OGT OTC CTT CAÁ GGT ATC ACÁ TCA TGG 624 Oly Gly Pro Leu val Cyß Aßn Gly Val Leu Ola Gly "lie Thr Ser Trp 195 200 205 GCC CCT GAG CCA TGT GCC CTG CCT GAA AAG CCT GCT GTO TAC ACC AAC 672 Gly Pro Glu Pro Oye Ala Leu Pro ßlu Lyn Pro Ala Val Tyr Thr Lyß 210 215 220 GTG GTO CAT TAC CßC A?C TOG ?TC ??O G?C ?CC ATC GCA GCC A?C CCC 720 Val Val Hiß Tyr ?r- Lyß Trp llß Lyß Aap Thr lie ?la Ala Aßn. Pro 225 230 2ÍS TGAGTCCCCC TGTCCCACCC CTACCTCTAG TAAACTGCAO 7«0 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 8 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA : (A) LONGITUD : 238 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 : Hiß Pro Gln Trp Val Lau Thr ?la Ala Hiß Cyß Leu Lyß Lyß Aßn ßer 36 40. 45 Q n Val Trp Leu Gly Arg Hiß Aßn Leu Phe Glu Pro Glu Aßp Thr Gly 50 55 SO Qln ?ra Val Pro Val Ser Hia Ser Phe Pro Hiß Pro Leu Tyr ?ßn Het *5 70 75 80 6er Leu Leu Lyß Hiß Gln Ser Leu ?rg Pro ?ßp Clu Aep Ser Ser Hiß BS 90 95 ?ßp Leu Mßt Lau Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lyß llß Thr Aßp Val 100 105 110 Val Lyß Val Leu aly Leu Pro Thr Gln. Olu Pro Ala Leu aly Thr Thr US 120 125 Cyß Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser lie Glu Pro ßlu ßlu Phe Leu Arg 130 135 140 Pro ?rg Ser Leu Gla Cyß Val Ser Leu Hiß Leu Leu Ser Aßn Aßp Met 145 150 155 . 160 Cyß Ala Arg Ala Tyr Sar Oiu Lyß Val Thr Glu Phß Mee Leu Cys Ala 165 170 175 Gly Leu Trp Thr aly Gly Lyß Aßp Thr yß Cly Oly Aßp Ser Gly ßly 1B0 185 ISO Pro Leu Val Cya Aßn Gly Val Lett Cln Gly tle Thr Ser Trp Gly Pro 195 200 205 Glu Pro Cyß A-la Leu Pro Glu Lyß Pro Ala Val Tyr Thr Lyß Val Val 210 315 220 Hiß Tyr Arg Lyß Trp lie Lyß Aßp Thr llß Ala ?la ?ßn Pro 225 330 235 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 766 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..732 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: ora ecc CTC ATC CAO TCT COO AGT GTO GCA asc TOO OAS TOT OAG AAO «B V?l Pro Leu llß e n Ser Arg llß Val Oly Gly Trp Glu Cyß Glu Lyß 1 5 10 15 CAT TCC CAA CCC TGC CAG GTG OCT OTO TAC AGT CAT OGA Tßß OCA CAO 96 Hiß Sar Oln Pro Trp Gln Val ?la Val Tyr Ser Hiß oly Trp Ala Hia 30 35 30 TGT CCO GCT OTC CTG CTG CAC CCC CAG TOO GTG CTC ACÁ OCT CCC CAT 144 Cyß Qly Oly Val Leu Val Hia Pro Oln Trp al Leu Thr Ale Ala Hiß 35 40 45 TGC CT? AAG AAO A T ?GC CAG GTC TOO CTß COT COG C?C AAC CTO TTT 192 Cyß Leu Lyß Lyß Aßn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg Kiß Aan Leu Phß SD 55 60 * GAO CCT G?? GAC ACÁ OOC CAC ?OO OTC CCT GTC AOC C?C AGC TTC CC? 240 Olu Pro Glu ?ßp Thr Qly Oln ?rg Val Pro Val ßer Hiß Ser Phe Pro 65 70 75 80 CAC CCO CTC TAC AAT ATO AGC CTT CTO ??G CAT C?? A3C CTT ?GA CCA 2BB Hiß Pro Leu Tyr Aßn Mßt ßer Leu Leu Lyß Hiß Cln Ser Leu Arg Pro 85 90 95 0AT GAA O?C TCC ABC C?T GAC CTC ATG CTG CTC CGC CTG TCA GAG CCT 336 ?ßp ßlu ?ßp Ser Ber Hiß Aßp Leu Het Leu Leu Arg Leu se.t Glu Pro 100 105 110 OCC ??G ?TC ACÁ OAT GTT OTO ??O GTC CTG GGC CTO CCC ACC CAG OAG 3B4 Ala Lyß lie Thr Aap Val Val Lyß Val Leu Gly Leu Pro Thr Gl Glu 115 120 125 cc? GCA CTO aaß ACC ACC TOC TAC GCC tc? sac TGG GGC AGC ATC GAA 432 Pro ?la Leu Gly Thr Thr Cyß Tyr ?la Ser Gly Trp Gly Ser lie ßlu 130 135 140 CC? GAO G?G TTC TTG CCC CCC ?GG ?GT CTT C?G TOT GTG AGC CTC C?T 480 Pta Glu Clu Phe Leu ?rg Pro ?rg Ser Leu Gln Cyß Val Ser Leu Hiß 145 150 1S5 160 Crc CTO TCC ?AT GAC ATO TsT ?T G? ßCT T?C TCT GAG AAs GTs ACÁ S2B Leu Lau Bar ?ßn Aßp Met Cyß Ala Arg Ala Tyr Ser Clu Lyß Val Thr 16S 170 175 G?? TTC ?tc tto sr oct GGO CTC TCG ?C? ost ßar ?A CAC ACT TGT 576 Olu Phß Met Leu Cyß Ala Gly Leu Trp Thr,.aly Oly Lyß Aßp Thr Cyß 180 1*5 1»0 OGG GGT O?T TCT GGO GGT CCA CTT GTC TGT AAT GGT OTG CTT CAA GGT 624 Gly Oly Aap Ber Cly Cly Pro ?*u Val Cyß Aßn Gly Val *be Gln Gly 195 200 205 ATC ACÁ TCA TGG OGC CCT CAG CCA TGT CCC CTG CCT GAA AAG CCT GCT 672 lie Tbr Ser Trp Gly Pro Clu Pro cyß Ala Leu Pro ßlu Lya Pro Ala 210 21S 220 GTC TAC ACC AAQ OTO GTG CAT TAC COß AAß TGG ATC AAG GAC ACC ?TC 720 Val Tyr Tbr Lyß Vel Val Kifl Tyr ?rg Lyß Trp llß Lyß Aßp Thr lie 225 230 235 240 I-GAGTOCCCC TGTCCCACCC CTACCTCTAG TA ? 7 ce ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 10 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD : 244 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido ( D) TOPOLOGÍA : lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA : SEQ ID NO : 10 : Val Pro Leu Zle ßln ßer Arg lie Vel Oly Cly Txp Glu Cyß ßlu Lya 1 5 10 16 Hiß Ser Gln Pro Trp GLa Val Ala Val Tyr Sttr Hiß Gly Trp Ala Hlß 20 25 30 Cyß Cly Gly Val Leu Val Hiß Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala Hiß 35 40 45 Cyß Leu Lys Lyß ?an Ser Glu Val Trp Leu Gly ?rg. Hiß ?ßn Leu Phe 50 55 €0 Glu Pro Glu ?ßp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val ßer Hiß Ser Phe Pro 65 70 75 SO Hlß Pro Leu Tyr ?ßn Het. Ser Leu Leu Lyß Hiß Gin Ser Leu ?rg Pro 65 90 95 ?ßp Glu Aßp ßer Ser Hia Aßp Leu Met Leu Leu ?rg Leu Ser Glu Pro 100 105 110 Ala Lyß lie Thr ?ßp val Val Lya Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu 115 120 12S Pro Ala Leu aly Thr Ttir Cyß Tyr Ala Ser Cly Trp Gly Ser He Glu 130 135 1*0 Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Ar? Ser Leu ßln Cya Val Ser Leu Hiß 14S 1S0 155 160 Leu Leu Ser ?ßn Aap Met Cyß Ala Arg Ale Tyr ser Glu Lyß Val Thr 165 170 175 Glu Phe Met Leu Cya Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lyß Aap Thr Cye 180 1B5 190 ßly Gly Aßp Ser Gly Oly Pro Leu Val Cyß Aßn Gly val l_ßu sln Gly 195 200 205 lie Thr Ser Trp ßly ro Olu Pro Cyß ?la Leu Pro Glu Lya Pro Ala 210 215 220 Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp lie Lys Asp Thr lie 225 230 235 240 Ala Ala Asn Pro (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: TATACATATG TGGGACCTGG TTCTCTCC 28 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12-: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: CADN (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: ATATGGATCC TCAGGGGTTG GCTGCGATGG T 31 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: Met Trp Asp Leu Val Leu Ser lie Ala Leu 1 5 10 T. (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: Met Trp Phe Leu Val Leu Cys Leu Ala Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: ,, (A) LONGITUD: 237 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: lie Val Oly Gly Trp Olu Cyn Glu Ly» Hiß B«r Gln Pro Trp aln Val 1 5 ?o ?S ?la Val Tyr Ser Hiß Gly Trp Ala Hiß Cyß Oly cly Val Leu Val Hiß 20 2S 3o Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala Kiß cyß Leu Lyß Lyß Aßn ßer Gln 3S 4D 45 Val Trp Leu aly ?rg Hia Aßn Leu Phe Olu Pro Clu Asp Thr Oly aln SO 55 so r Leu fcßu Lyß Hiß Gln Ser Leu Arg Pro Aßp Glu Aßp Ser Ser Hiß Asp ß5 9o 9S Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser ßlu Pro Ala Lyß He Thr ?ßp Val Val 100 105 110 Lye Val Leu ßly Leu Pro Thr Cln Glu Pro Ala Leu sly Thr Thr Cyß 115 120 las Tyr Ala Ser sly Trp aly Sar Ha Glu Pro Glu ßlu Phe Leu Arg Pro 130 136 140 Arg ßer Leu Gln Cyß Val Ser Leu Hiß Leu Leu Ser Aan Aßp Mßt Cyß a« «ß 155 60 ?la Arg Ala Tyr Ser Glu Lyß Val Thr Olu Phß Het Leu Cyß Ala OÍy 165 170 17S Leu Trp Thr ßly Gly Lyß Aßp Thr Cyß ßly Gly Aßp Ser Gly Gly Pro leo 185 IBo Leu Val Cyß Aßn aly Val Leu Oln oly He Thr Ser Trp Gly Pro Glu 195 300 205 Pro Cyß Ala Leu Pro ßlu Lye Pro Ala Val Tyr Thr Lyß Val Val Hiß 2J-0 215 220 Tyr Arg Lyß Trp He Lyß Aßp Thr He Ala Ala ?ßn Pro 225 230 235 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DÉ SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO,DE MOLÉCULA: CADN (XÍ) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: ATATGGATCC ATATGTCAGC ATGTGGGACC TGGTTCTCTC CA 12 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: Val Pro Leu lie Gln Ser Arg lie Val Gly Gly Trp Glu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 261 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: Met Trp Aßp Leu Val Leu Ser He ?la Leu Ser Val Gly Cyß Thr ßly 1 5 10 5 ?la Val Pro Leu He Gln Ser ?rg He Val ßly Gly Trp aiu Cyß Glu 20 25 ao Lyß Hiß Ser ßln. Pro Trp aln Val ?la Val Tyr Ser Kiß Gly Trp ?la 35 40 45 Hiß l Leu Thr Ala Ala Hia cyß Leu Lyß Lyß ?ßn Ser Gln Val Trp Leu aly Arg Hic AB? Le 65 70 75 so Phe Glu Pro Glu Aßp Thx Gly Ola Arg Val Pro Val ser Hiß Ser Phß 85 90 55 Pro Hiß Pro Leu Tyr ?ßp Met Ser Leu Leu Lya Hiß aln Ser Leu Arg 100 105 io Pro Aep Glu Aßp Ser Ser Kiß Aep Leu Met Leu Leu Arg Leu ßer ßlu 115 120 125 Pro Ala Lyß He Thr Aßp Val Val Lyß Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln 130 135 140 Olu Pro Ala "Oeu Cly Thr Thr Cyß Tyr Ala Sar Gly Trp Oly ßer He 1«S 150 155 ICO Glu Pro aiu ßlu Pha Lau Arg Pro Arg Ser Leu Gln cyn Val ßer Leu 165 170 175 Hiß Leu Leu Ber Aen Aup Met cyß Ala Arg .Ala Tyr Ser Glu Lyß Val 1*0 1B5 1S0 Thr Glu Phß Met Leu Cyß ?la Gly Leu Trp Thr Gly Giy Lyß Aßp Thr 195 200 205 cya Gly aly Aep Ser Gly Gly Pro Leu Val Cyß Aßn aly Val Leu Gln 210 215 220 Gly He Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cyß Ala l«u Pro ßl Ly* Pro 22S 230 235 240 Val Val Tyr Thr Lyß Val Val Hlß Tyr Arg Lyß Trp He ü e Aßp Thr 345 250 ass Xle Ala ?la Asa Pro 2ß0 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 832 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 10..792 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: GGATCC?flC ?TG TOO OAC CTß OT*T CTC TCC ?TC CCC TTO TCT GTG GGG 46 Met Trp Aßp Leu Val Leu Sar He Ala Leu Stsr Val sly 1 5 10 TGC ACT GGT GCC CTG CCC CTC ATC CAG TCT COG ATT OTO GGA GGC TGO 96 Cyß Thr aly Ala Val Pro Leu He Gln Ser Arg He Val Gly aly Trp 15 20 25 GAß TGT ß?ß AAG CAT TCC CAA CCC TCG CAG OTO GCT GTO TAC AGT CAT 144 Glu Cyß Glu Lya Hiß ßer Oln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His 30 35 40 45 GGA TGG OCA C?C TGT GGG OGT OTC CTC GTO CAC CCC CAG TOG OTO CTC 192 Gly Trp Ala Hiß Cyß Gly Cly Val Leu Val Kiß Pro aln Trp Val Leu 50 55 CO AC? GCT GCC C?T TOC CTA AAO ??O ?AT ?OC C?G OTC TGO CTß OGT COC 240 Thr ?la ?la His Cyß Leu Lyß Lyß ?ßn Ser Gln al Trp "Leu Gly Arg 65 70 75 C?C A?C CTG TTT GAß CCT CAA GAC AC? GGC C?G ?QG GTC CCT GTC ?GC 2ßß Hiß ?ßn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr aly Glp Arg Val Pro Val Ser 80 65 90 CAC AGC TTC CCA CAC CCQ CTC TAC AAT ?Tß'?ßC CTT ero AAO CAT CAA 336 Hiß Ser Pbe Pro Hiß Pro Leu Tyr ?ßn Mßt Ser Leu Leu Lyß Itiß Gln SS 10D 105 AGC CT-r AGA CCA OAT GAA GAC TCC AGC C?T GAC CTC ATG CTG CTC CGC 384 ßer Leu ?rg Pro Aßp Glu Aap Ser Ser Hi? Aep Leu Met Leu Leu Arg 110 115 120 125 CTG TCA OAG CCT ßCC AAG ATC AC? G?T GTT GTG A?O OTC CTG GOC CTG 432 Leu Ser ßlu Pro Ala Lyß He Thr Aßp Val Val Ly*s val Leu ßly Leu 130 13S 140 CCC ACC CAO GAO CC? OCA CTG OOG ACC ACC TOC TAC GCC TCA COC Tßß 480 Pro Thr aln Glu Pro Ala Leu ßly Thr Thr Cyß Tyr Ala Ser ßly Trp 145 ISO 155 OGC AOC ?TC GAA CC? CAß GAO TTC TTO CGC CCC ?OG ?OT CTT CAO TOT 528 aly ßer He Olu Pro ßlu ßlu Phß leu ?rg Pro ?rg ßßr Leu ßln Cyß ICO 165 170 GTU AGC CTC CAT CTC CTß TCC ?AT GAC ATß TOT OCT ACÁ 6CT TAC TCT S7C Val ßer Leu Hiß Leu Leu Ber Aßn ?ap Met Cyß Ala. Arg Ala Tyr Ser GAO AAß OTO ACÁ GAG TTC ATO TTG TßT GCT ßßß CTC TOO AC? OGT OGT «"24 Glu Lyß Val Thr Glu Phß Het Leu Cyß ?la Oly Leu Trp Thr Gly Gly 190 195 200 205 A?? cave ?cr TGT ooG ssr G?T TC GOG aar CC? crr OTC TGT AAT GCT «73 Lyß Aßp Thr yß ßly Oiy Aßp Ser Oly ßly Pro Leu Val Cyß ?ßn Gly 210 215 220 GTG CTT CAÁ GGT ATC ACÁ TC? Tßß ?ßC CCT OAO CCA TßT OCC CTG CCT 720 Val Leu aln Gly He Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cyß Ala Leu Pro 225 3 0 335 GAA AAG CCT GTT OTO T?C ?CC A?G OTO OTC CAT TAC CGG AAC TOO ATC 7GB Glu Lyß Pro Val Vßl Tyr Thr Lyß Val Val Hiß Tyr Arg Lyß Trp He 240 24S 250 AAO OAC ACC ATC GCA OCC AAC CCC TG?GTOCCCC TOTCCC?CCC CTACCTCTA 822 Lyß Aßp Thr Xle Ala Ala Aon Pro 255 260 GTA??CTOC?O 832

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido pre-pro hK2 sustancialmente homogéneo, aislado.

2. Un polipéptido pro hK2 sustancialmente homogéneo, aislado.

3. Un polifpéptido hK2 maduro sustancialmente homogéneo, aislado.

4. Un anticuerpo que es capaz de enlazarse específicamente con el polipéptido hK2 de las reivindicaciones 1, 2, 3, ó 18, y que no se enlaza con hK3.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, el cual es un anticuerpo monoclonal.

6. Una línea celular de hibridoma que produce el anticuerpo de la reivindicación 5.

7. Un vector de expresión quimérico que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido hK2 que es el polipéptido pre-pro hK2 (SEQ ID NO: 6), el polipéptido pro hK2 (SEQ ID NO: 10) , el polipéptido hK2 maduro (SEQ ID NO: 16), un polipéptido hK2 prepro, pro, o maduro variante que comprende la SEQ ID NO: 19, o un polipéptido hK2 variante que tiene cuando menos el 90 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 16 en las regiones que son sustancialmente homologas con el polipéptido hK3 (SEQ ID N0:1), en donde el hK2 variante que tiene cuando menos el 90 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 16 no es la SEQ ID NO: 19, y en donde la molécula de ácido nucleico se enlaza operablemente con las secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector, para dar como resultado la expresión del polipéptido hK2.

8. El vector de la reivindicación 7, en donde la célula huésped es E. coli.

9. El vector de la reivindicación 7, en donde la célula huésped es una célula de mamífero.

10. Una célula huésped transformada con el vector de la reivindicación 7.

11. La célula huésped de la reivindicación 10, la cual es E. coli.

12. La célula huésped de la reivindicación 10, la cual es de mamífero.

13. Un método para utilizar una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido hK2 que es el polipéptido pre-pro hK2 (SEQ ID N0:6), el polipéptido pro hK2 (SEQ ID NO: 10), el polipéptido hK2 maduro (SEQ ID NO: 16), un polipéptido hK2 prepro, pro, o maduro variante que comprende la SEQ ID NO: 19, o un polipéptido hK2 variante que tiene cuando menos el 90 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 16 en las regiones que son sustancialmente homologas con el polipéptido hK3 (SEQ ID N0:1), en donde el hK2 variante que tiene cuando menos el 90 por ciento de homología con la SEQ ID NO: 16 no es la SEQ ID NO: 19, comprendiendo este método expresar la molécula de ácido nucleico en una célula huésped cultivada establemente transformada con un vector quimérico que comprende a la molécula de ácido nucleico operablemente enlazada con las secuencias de control reconocidas por la célula huésped transformada con el vector, y recuperar el polipéptido hK2 a partir de la célula huésped.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la célula huésped es E. coli.

15. El método de la reivindicación 13, en donde la célula huésped es de mamífero.

16. El método de la reivindicación 13, en donde la molécula de ácido nucleico es ADN.

17. El método de la reivindicación 13, en donde el polipéptido hK2 se recupera del medio de cultivo de la célula huésped.

18. Un polipéptido preprohK2 , prohK2 , ó hK2 sustancialmente homogéneo, aislado, que comprende la SEQ ID N0:

19. 19. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEQ ID NO:

20. 20. Un vector de expresión quimérico que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende a la SEQ ID NO: 20 operablemente enlazada con las secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.