JP2001503991A

JP2001503991A - 転移性前立腺癌の検出方法

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Publication number: JP2001503991A
Application number: JP52288898A
Authority: JP
Inventors: ジェイ．ティンダール，ドナルド; ワイ．エフ．ヤング，チャールズ; ジェイ．マコーミック，ダニエル; ジー．クリー，ジョージ; サイードサエディ，モハメイド; クマー，アブヘイ; ジー．リッテンハウス，ハリー; エル．ウォルファート，ロバート
Original assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 2001-03-27
Also published as: AU5260298A; CN1238013A; AU737659B2; CA2271770A1; WO1998021365A2; EP0941368A2; WO1998021365A3

Abstract

(57)【要約】前立腺癌は、生理学的サンプルにおける前立腺特異的粒状カリクレインhK２ポリペプチド又はhK２ RNAの存在を決定することによって検出される。

Description

【発明の詳細な説明】転移性前立腺癌の検出方法発明の背景腺性カリクレイン（glandular kallikrein）は、特定のポリペプチド前駆体からそれらの生物学的活性形への翻訳後プロセッシングに関与するセリンプロテアーゼのサブグループである。ヒトにおいては、このファミリーの３種のメンバーが同定されており、そしてそれらの性質のいくつかは特徴づけられている(Cleme nts，Endoc ．Rev.，10，343（1989）；Clements，Mol ．Cell Endo.，99，1（199 4）；Jonesなど.，Acta Endoc. ，127，481(1992))。hKLK１遺伝子は組織カリクレインタンパク質hK１をコードし、hKLK２遺伝子は前立腺−特異的腺性カリクレインタンパク質hK２をコードし、そしてhKLK３遺伝子は前立腺−特異的抗原タンパク質hK３（PSA）をコードする。mRNAのノザンブロット分析は、hK２及びPSAの両者が主にヒト前立腺において発現され、そしてhK１の発現は膵臓、顎下腺、腎臓及び他の非前立腺組織に見出されることを示す（Chapdelaineなど.，FEBS Let t.，236，205（1988）；Youngなど.，Biochem ．31，818(1992)）。 hKLK２及びhKLK３のエキソン間のヌクレオチド配列の相同性は80％であり、他方hKLK２及びhKLK１のエキソン間のヌクレオチド配列相同性は65％である。PSA に対するhK２の推定されるアミノ酸配列の相同性は78％であり、他方hK１に対するhK２の推定されるアミノ酸配列の相同性は57％である。さらに、hK２の推定されるアミノ酸配列が示すところによれば、hK２はトリプシン−様プロテアーゼであり、他方PSAはキモトリプシン−様プロテアーゼである。 PSAレベルは、前立腺癌の予後インジケーターとして広く使用される。しかしながら、血清中のPSAの濃度は前立腺癌(pCa)又は良性前立腺過形成(BPH)のいづれかを有する患者において高められるので、高レベルのPSAの検出ではそれらの疾病間の区別ができない。さらに、PSAに対するhK２の高度の相同性は、PSAのレベルを検出するために現在使用される抗体の特異性に関するいくらかの問題を生ぜしめる。循環hK２のレベルがpCa又はBPHに関係しない場合、hK２により汚染されたPSAの調製物に対して、又はhK２に対して相同性を有するPSAの領域に対して生じさせた抗体は誤った陽性結果をもたらす。デジタル直腸試験(DRE)と組合された血清PSA試験は臨床的に有意な及び器官− 制限(ogan-confined)された前立腺癌を検出するために最とも効果的な手段であることが現在、一般的に許容されているが、PSA，DRE及び超音波前立腺試験の組合せはいくつかの前立腺癌のみを検出することができる。たとえば、前立腺癌を有する40％までの外科的に治療された患者は、臨床的に不十分な段階である(und erstaged)ことが見出されている。さらに、臨床的に有意な前立腺癌の発生率に関する検死データに基づく組織的癌の実際の発生率は高い。さらに、真偽の疑わしい局在化された前立腺癌を有する約30％の患者は、隠れた（遠い）転移性疾病を有することがある(Morenoなど.，Cancer Res. ，52，6110(1992))。それらの患者のうち、80％は、治療の後、生化学的に、すなわち、高められたPSAレベルにより、又は局部的疾病の再発又は明らかな全身性疾病の発生により、再発を経験する。外科療法は、確立された転移を有する患者のための適切な治療様式ではない。初期転移を評価するためのスクリーニング様式は、しばしば、前立腺ノウ又は精ノウの侵入を包含する局部的侵襲性疾病を有する有意な患者群を同定できない。明白な転移性沈着物が従来手段により明らかにされない場合、免疫組織化学的技法が、微小転移性又は循環性前立腺腫瘍細胞を同定するために使用されて来たが、免疫組織化学方法は労力を要し、転移性又は局部的侵襲性前立腺癌の初期検出のために必要とされる感受性を欠いている。従って、転移可能性を有する前立腺癌細胞の初期検出のための必要性がある。さらに、患者を侵襲性過程にさらす前に、前立腺癌を正確に分類する必要がある。特に、PSAとは無関係に、又はPSAとの組合せで機能することができる、前立腺癌のためのマーカーの必要性がある。発明の要約本発明はhK２ DNAを検出するための診断方法を提供し、この方法においては、生理学的サンプル中の前立腺癌細胞の存在が前記サンプル中のhK２ RNAの検出と関連付けられる。hK２の発現は前立腺組織特異的であるので、局部的侵襲性又は転移性疾患が存在しない場合、又はすべての前立腺組織（良性及び悪性）が除去されているか又は破壊されている場合、hK２ RNAは、体液又は非前立腺組織に存在する細胞には理論的に検出できない。前記方法は、ヒト生理学的サンプルからのRNAの逆転写（RT）により得られる量のDNAと、多くのオリゴヌクレオチドプライマー、好ましくは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマー（その少なくとも１つはhK２−特異的オリゴヌクレオチドである）とを、増幅反応において接触せしめることにより多量の増幅されたhK２ DNAを生成することを含んで成る。好ましい増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)である。次に、増幅されたh K２ DNAの存在が検出される。下記に記載されるように、RT−PCRの後、血液細胞中の増幅されたhK２ DNAの存在は、前立腺癌と関連付けられる。すなわち前立腺癌患者の67％がhK２を発現し、17％がPSAを発現し、そして17％がhK２及びPSAの両者を発現する。好ましくは、試験されるサンプル源は、ヒト組織、たとえば前立腺、前立腺ノウ、精ノウ、骨髄又はリンパ節である。試験されるもう１つの好ましいサンプル源は、細胞、たとえば血液、血清、又は精液を含んで成るヒト生理学的流体である。本明細書において使用される場合、“増幅されたhK２ DNA”とは、増幅の前にサンプルに存在するhK２ DNAの量よりも10倍、好ましくは10⁴倍、そしてより好ましくは10⁶倍、多い量で存在する、増幅反応にゆだねられたサンプル中のhK２ DNAを意味する。本明細書において使用される場合、“hK２−特異的オリゴヌクレオチド”又は “hK２−特異的プライマー”とは、hK３をコードするヌクレオチド配列（配列番号23）からはずれる配列番号４の領域における配列番号４に対して少なくとも約 80％、より好ましくは少なくとも約90％そしてより好ましくは少なくとも約95％の配列同一性又は相同性を有するDNA配列を意味する。本発明のオリゴヌクレオチド又はプライマーは、少なくとも約７〜50個、好ましくは少なくとも約10〜40 個、そしてより好ましくは少なくとも約15〜35個のヌクレオチドを有する。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号２，４又は６に対して少なくとも約80％、より好ましくは少なくとも約85％、そしてより好ましくは少なくとも約90％の同一性を有する、少なくとも７個のヌクレオチドをオリゴヌクレオチドプライマーの３’側に含んで成る。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、hK２核酸配列に対して無関係である配列も含むことができ、たとえばそれらは制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードすることができる。本発明の好ましいhK２−特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号14を含んで成る。本発明のもう１つの好ましいhK２−特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号17を含んで成る。本発明のさらにもう１つの好ましいhK２−特異的オリゴヌクレオチドは、配列番号18を含んで成る。本発明の好ましい診断方法は、hK２転写体のRT−PCR検出と、前立腺癌に関連する他の遺伝子生成物の転写体のRT−PCR検出とを組合わせる。複数の遺伝子生成物の組合された検出は、より高い診断の確実性をもたらし、又はより有益な段階的情報(staging information)を提供することができる。組合された検出はまた、攻撃的な増殖能力を有する細胞と、より無活動である細胞とを区別することにおいて有益である。本発明により提供される方法の特に好ましい態様においては、hK２ RNAのRT−PCR検出が、PSA，RNAのRT−PCR検出と組合される。本発明はさらに、hK２ RNAを検出するための診断方法も提供する。この方法は、ヒトから得られた生理学的サンプルからRNAを抽出することを含んで成る。抽出されたRNAは、DNAを生成するために逆転写される。DNAが増幅された量のhK２ DNAを生成するためにDNAを増幅するのに有効な少なくとも２種のオリゴヌクレオチドと接触せしめられ、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはhK２−特異的オリゴヌクレオチドである。次に、増幅されたhK２ DNAの存在が検出される。増幅されたhK２ DNAの存在は、ヒトにおける転移性前立腺癌を示す。体液又は非前立腺組織におけるhK２ RNAの存在、又は時間と共に上昇するhK２ RNAのレベルは、これまで診断未確定の転移性疾病の存在を示すことが合理的に予測され得る。転移性疾病の初期検出は、“リードタイム”を提供し、この間、他の治療方法、たとえば手術の時には存在しないがしかし続いて発生する方法が評価され得る。従って、本発明は、前立腺癌の進行をモニターするための方法を提供する。前記方法は、増幅された量のhK２ DNAを得るために、DNAを増幅するのに有効な量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチド（その少なくとも１つはhK２−特異的オリゴヌクレオチドである）と、前立腺癌を有するヒトから得られた生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られた量のDNAとを接触せしめることを含んで成る。増幅されたhK２ DNAの存在又は量が検出され、又は測定される。時間的に後の少なくとも一点で、もう１つのサンプルが取られ、そして増幅されたhK２ DNAの量が検出され、又は測定される。次に、少なくとも２点の異なった時点で得られた、増幅されたhK２ DNAの量が比較される。また、ヒトにおける前立腺癌を病理学的に段階付けるための方法も提供される。前記方法は、増幅された量のhK２ DNAを得るために、DNAを増幅するのに効果的な量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチド（その少なくとも１つはhK２−特異的オリゴヌクレオチドである）と、前立腺癌を有するヒトから得られた生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られる量のDNAとを接触せしめることを含んで成る。次に、増幅されたhK２ DNAの存在又は量が検出され、又は測定される。増幅されたhK２ DNAの存在又は量は、前立腺癌の病理学的段階を示す。本発明のもう１つの態様は、ホルモン療法を包含する治療介入をモニターするための方法を提供する。たとえば、hK２発現はアンドロゲン−依存性であるので、末梢血液、又は他の体組織もしくは体液におけるhK２ RNAレベルは、断続的アンドロゲン治療の間、又はアンドロゲン刺激的試験の間、マーカーとして使用され得、ここで患者は前立腺癌細胞を検出可能にするのに十分ないづれかの永続性前立腺癌細胞によるhK２生成のレベルを刺激するために高男性化された状態に一時的に置かれる。T.K．Takayamaなど.，Sem ．in Oncol.，21，542- 553（1994）及びそこに引用される文献を参照のこと。hK２レベルは好ましくは、ホルモ療法の間、定期的にモニターされる。治療の開始の前、及び治療プログラムの終結の後、定期的に、hK２レベルをまた決定することは好都合である。また、hK２ RNAを含むと思われる生理学的サンプル中のhK２ RNAを検出するための診断キットが提供される。前記キットは、（ａ）既知量の第１のhK２−特異的オリゴヌクレオチド（ここで前記オリゴヌクレオチドは少なくとも約７〜50個のヌクレオチドから成り、そして配列番号４に対して少なくとも約80％の同一性を有する）；及び（ｂ）既知量の第２のhK２−特異的オリゴヌクレオチド（ここで前記オリゴヌクレオチドは少なくとも約７〜50個のヌクレオチドから成り、そして配列番号４に対して相補的であるヌクレオチド配列に対して少なくとも約80 ％の同一性を有する）を含むパッケージングを含んで成る。本発明はさらに、配列番号22を含んで成る単離され、精製されたペプチド、その生物学的活性サブユニット、又はその生物学的活性変異体を提供する。本発明はさらに、配列番号26を含んで成る単離され、精製されたペプチド、その生物学的活性サブユニット、又はその生物学的活性変異体を提供する。また、上記発明のペプチドを含んで成るタンパク質又はポリペプチドと特異的に反応する、単離され、精製された抗体又は抗体調製物が提供される。本明細書において使用される場合、用語、本発明のペプチドの“生物学的活性サブユニット”とは好ましくは、配列番号22を有するペプチドの活性の少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約50％、及びより好ましくは少なくとも約90％を有する、配列番号22を有するペプチドのサブユニットを意味する。本発明のペプチドの活性は、そのペプチドが生物、たとえばヤギ、ウサギ、羊又はマウスに投与される場合、配列−特異性免疫学的応答を誘発するそのペプチドの能力（但し、それだけには限定されない）を包含する当業界において良く知られている方法により測定され得る。本明細書において使用される場合、用語、本発明のペプチドの“生物学的活性変異体”は好ましくは、配列番号22に対して少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％、そしてより好ましくは少なくとも約95％の同一性又は相同性を有するペプチドを意味する。本発明のペプチドの生物学的活性変異体は、配列番号 22を有するペプチドの活性の少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約50％、そしてより好ましくは少なくとも約90％の活性を有する。本発明の変異体ペプチドの活性は、上記方法により測定され得る。本発明はさらに、ヒト非前立腺組織サンプル中の転移性前立腺癌の存在を検出し又は測定するための方法を提供する。前記方法は、hK２ポリペプチドに結合しそしてhK３に結合しない量の剤と、哺乳類組織サンプルの細胞とを混合することを含んで成り、その結果、前記剤及び細胞を含んで成る二元複合体が形成される。次に、サンプル中の複合体形成の存在もしくは量が検出され、又は測定される。複合体の存在又は量は、微小転移性前立腺癌の存在の表示を提供する。本明細書において使用される場合、“微小転移性”とは、前立腺ノウ又は精ノウの侵入を典型的には包含する局部的侵襲性疾病、又は潜在的疾病を意味する。この方法への使用のための好ましい剤は、抗体である。用語“抗体”は、ヒト及び動物mA b、及びポリクローナル抗体の調製物、並びに抗体フラグメント、合成抗体、たとえば組換え抗体、キメラ抗体、たとえばヒト化抗体、抗−イディオタイプ抗体及びそれらの誘導体を包含する。hK２に結合し、そしてhK３に結合しない抗体を調製するために、単離されたhK２ポリペプチド、単離されたhK２ペプチド、並びにそれらの変異体及びサブユニットが、抗体の集団を調製するために使用され得る。それらの抗体は、組織、たとえば骨髄及びリンパ節に由来するサンプル、及び細胞を含んで成る生理学的流体からの細胞のサンプルにおけるhK２ポリペプチド（又は“タンパク質”）を検出し、そして定量化するために直接的又は競争アッセイのための基材として使用され得る。図面の簡単な説明図１は、野生型成熟hK２（配列番号１）及びhK３（配列番号７）のアミノ酸配列を示す。図２は、野生型pphK２（それぞれ、配列番号３及び４）、phK２（配列番号５及び６）及びhK２（配列番号１及び２）のアミノ酸配列、及び対応する核酸配列を示す。コドン217(GCT，Ala)は、太字で示され、そして下線が引かれている。図３はpGT発現ベクターpGThK２及びpGThK２^V217の図解である。図４は、phK２^V217の精製からのクロマトグラフィープロフィールを示す。（Ａ）pphK２^V217をコードするベクターによりトランスフェクトされたAV12細胞からの７日間のスペント培地のDEAEクロマトグラム。そのスペント(spent)培地のサンプルが炭酸水素緩衝液（pH８）に適用され、そして塩グラジエントにより溶出された。Ａ₂₈₀溶出プロフィールが実線により示される。点線は、マイクロタイタープレート上に乾燥され、そしてウサギ抗−pphK２抗体により顕現された、個々のカラム画分の一部のELISAアッセイの結果を示す。（Ｂ）プールされたDEA E画分の疎水性相互作用プロフィール。（Ａ）のDEAEクロマトグラフィー溶出物からの画分24〜30がプールされ、濃縮され、そして1.2Ｍの硫酸ナトリウム中、HIC(疎水性相互作用カラム) に適用され、そして低下する塩グラジエントにより溶出された。その溶出プロフィール(Ａ₂₈₀)は、実線により示される。点線は、マイクロタイタープレート上に乾燥せしめられ、そしてウサギ抗−hK２抗体により展開された、個々のカラム画分の一部分のELISAアッセイの結果を示す。（Ｃ）（Ｂ）からの22分ピークからのhK２−含有画分が濃縮され、そしてPharmacia Ｓ12サイズ排除カラムに適用された。画分が集められ、そしてSDS／PAGEにより分析された。19.4分ピークは、SDS−PAGEにより均一に見えた。図５は、精製されたhK２及びPSAのSDS／PAGE分析を表わす。精製されたphK２^V ²¹⁷ 又はPSAの1.5mgサンプルが、１％ β−メルカプトエタノールと共に（Ｒ）又はそれを伴わないで（Ｎ）、サンプル緩衝液中で煮沸された。サンプルが、４〜20％ゲル上のSDS／PAGEにかけられた。タンパク質バンドが、銀によりゲルを染色することによって可視化された。図６は、phK２^V217のコンカナバリンＡ染色を示す。phK２の予測される位置は、矢印により示される。ZCE(抗−CEA mAb)及びBSAは、それぞれ、グリコシル化された及びグリコシル化されていないタンパク質の例として含められた。phK２レーンにおける予測される位置でのバンドの存在は、このタンパク質がグリコシル化されていることを示す。図７は、トリプシン分解によるプロhK２^V217から成熟hK２^V217への転換を示す。トリプシン（１％ｗ／ｗ）が、100mMの硼酸緩衝液（pH８）中で37℃で10分間、phK２^V217と共にインキュベートされ、そして次に、HIC−HPLCにかけられた。点線は、トリプシンと共にインキュベーションする前のphK２^V217のプロフィールを示す。実線は、トリプシン消化の後のphK２のプロフィールを示す。それらのプロフィールが、比較のために重ねられた。２つの形の同一性が、タンパク質のＮ−末端配列決定により確かめられた。図８は、モノクローナル抗体(mAb)hK1G586.1を用いての精液のウェスターンブロット分析を示す。処理された精液がPBSにより１：１に希釈され、そして10,00 0×ｇで20分間、遠心分離された。上清液が、Phast System(Pharmacia)を用いて、８〜25％ゲル上でのSDS／PAGEにかけられた。タンパク質がニトロセルロースに移され、そしてプロテイン−Ｇ精製されたhK1G586.1（１μｇ／ml）、続いてヤギ抗−マウスIgG−HRP（１：1000）と共にインキュベートされた。ブロットが、ECL検出システム（Amersham）を用いて展開された。図９は、AV12細胞におけるhK２発現の時間経過研究を示す。AV12−hK２クローン＃27が約60〜70％の集密性に増殖され、次に細胞がHBSSにより洗浄され、そして血清フリーHH４培地が添加された。スペント培地が個々の日、回収され、濃縮され、そして12％ゲル上でのSDS／PAGEにかけられた。タンパク質が電気ブロットされ、そしてphK２及びhK２の両者を検出するモノクローナル抗体HK1D106.4（１：1000）、phK２を検出するHK1G464.3（１：1000）、続いてヤギ抗−マウスIg G−HRP(１：500)によりプローブされた。製造業者の説明書に従って、ブロットがECL(Amersham)により展開された。精製されたphK２^V217及びhK２^V217が対照として使用された。hK２の位置は矢印により示される。図10は、トランスフェクトされたAV12細胞におけるhK２の変異体形の発現の時間経過研究を示す。約60〜70％の集密性において、AV12−hK２^V217細胞がHBSSにより洗浄され、血清フリーHH４培地が添加された。スペント培地が個々の日、回収され、濃縮され、そして12％ゲル上でのSDS／PAGEにかけられた。タンパク質が電気ブロットされ、そしてモノクローナル抗体HK1D106.4及びHK1G464.3によりプローブされた。ヤギ抗−マウスIgG−HRP(１：500)が、製造業者の説明書に従って、ECL(Ame rsham)により展開された。精製されたphK２^V217及びhK２^V217が対照として使用された。hK２の位置は矢印により示される。図11は、時間にわたってのhK２発現及び細胞生存性のブロットである。AV12− hK２クローン＃27が60〜70％集密性に増殖され、HBSSにより洗浄され、そして血清フリーHH４培地が添加された。スペント培地がそれぞれの日、回収され、そしてhK２濃度が、一次抗体としてHK1D106.4又はHK1G464.3及び二次抗体としてヤギ抗−マウスIgG−HRPを用いて、ELISAにより測定された。反応がOPD(Sigma，St． Louis，MO)により展開された。生存細胞が、トリパンブルー染料排除を用いて毎日、数えられた。図12は、PC３及びDU145細胞におけるhK２の発現を示す。pGThK２によりトランスフェクトされたPC３及びDU145細胞が、約60〜70％の集密性まで増殖され、洗浄され、そして血清フリーHH４培地に再懸濁された。pGThK２によりトランスフェクトされたDU145細胞のスペント培地が、再懸濁の３日後、集められ、そしてp GThK２によりトランスフェクトされたPC３細胞のスペント培地が、再懸濁の５日後、集められた。スペント培地が濃縮され、そして12％ゲル上でのSDS／PAGEにかけられた。タンパク質が電気ブロットされ、そして上記のようにして、HK1D10 6.4又はHK1G464.3によりプローブされた。精製されたphK２^V217及びphK２^V217が対照として使用された。hK２の位置は矢印により示される。。図13は、選択されたhK２−含有AV12クローンによるhK２の発現を示す。hK２含有AV12クローン番号10，27，31及び32からの細胞が約60〜70％の集密性まで増殖され、そしてHBSSにより洗浄され、次に血清フリーHH４培地が添加された。スペント培地が血清フリー培地の添加の７日後、回収され、濃縮され、そして12％ゲル上でのSDS／PAGEにかけられた。タンパク質が電気ブロットされ、そしてHK1D106.4又はHK1G464.3によりプローブされた。ヤギ抗−マウスIgG−HRP(１：500)が、二次抗体として使用され、そしてブロットが製造業者の説明書に従って、ECL(Amersham)により展開された。精製されたphK２^V217及びhK２^V217が対照として使用された。hK２の位置は矢印により示される。図14は、選択されたAV12−hK２^V217クローンにおけるphK２^V217の発現を示す。AV12クローン番号２，３，４，45及び48からの細胞が約60〜70％の集密性まで増殖され、そしてHBSSにより洗浄され、そして血清フリーHH４培地が添加された。スペント培地が、血清フリー培地の添加の７日後、回収され、濃縮され、そして12％ゲル上でSDS／PAGEにかけられた。タンパク質が電気ブロットされ、そしてHK1D106.4及びHK1G464.3によりプローブされた。ヤギ抗−マウスIgG−HRP(１：500)が二次抗体として使用され、そしてブロットが製造業者の説明書に従って、ECL(Amersham)により展開された。精製されたphK２^V217及びhK２^V217が対照として使用された。hK２の位置は矢印により示される。図15は、hK２の残基210〜236についてのhK２^V217，hK２及びPSAのアミド分解特異性を示す。合成ペプチド（0.63mM）が、１μｇ／mlのhK２，40μｇ／mlのhK ２^V217又は100μｇ／mlのPSAにより37℃で一晩、消化され、そして消化生成物が RP−HPLCにより分離された。ピークが、切断の定性的観点を比較するために標準化された。図16は、異なったペプチド基質についてのhK２及びPSAの特異性を示す。空白の矢印はPSAにより切断されるペプチド結合を示し；実線の矢印はhK２により切断される結合を示す。ペプチド＃１は、hK２のアミノ酸残基210〜236を示す。ペプチド＃２はアンギオテンシノーゲンのアミノ酸残基１〜14、すなわちレニン基質テトラデカペプチドを示す。ペプチド＃３は、phK ２のアミノ酸残基−７〜＋７を示す。ペプチド＃４は、hK２のアミノ酸残基41〜 56を示す。ペプチド＃５は、インシュリンの酸化されたβ鎖のアミノ酸配列を示す。ペプチド＃６は、PMSAのアミノ酸残基196〜213を示す。図17は、hK２^V217ではなく、hK２によるphK２^V217の活性化を示す。phK２^V217 は、プロリーダーペプチド配列VPLIQSR、すなわちhK２^V217に存在しない配列を含む。パネルＡは、１％（ｗ／ｗ）hK２と共にインキュベートされたphK２^V217 を示す。パネルＢは、phK２^V217と共に６時間インキュベートされた40％（ｗ／ｗ）hK２^V217を有する対照である。図18は、プロテアーゼインヒビターと共にインキュベートされたhK２のウェスターンブロット分析を示す。個々のサンプルが、８〜25％グラジエントSDS−PAG E上で分離され、ブロットされ、そしてHK1G586.1によりプローブされた。hK２が次のインヒビターと共に37℃で４時間インキュベートされた：レーン１、抗キモトリプシン（ACT）；レーン２、α２−抗プラスミン；レーン３、抗−トロンビンIII；レーン４、α１−プロテアーゼインヒビター（抗−トリプシン）；レーン５、α２−マクログロブリン；レーン１及び２は、90〜100KDの予測されるMr の共有結合複合体を示す。セルピンインヒビターが、20μＭで、マクログロブリンが2.8μＭで、そしてhK２が0.175μＭで使用された。レーン５は、α２−マクログロブリンとhK２との共有結合複合形成を示すより高いMrの複合体を示す。図19は、ヒト血清におけるhK２の複合体形成を示す。hK２及びPSAのウェスターンブロットがヒト血清と共にインキュベートされた。hK２サンプルがHK1G586.1によりプローブされ、そしてPSAサンプルがPSM773抗 −PSAmAbによりプローブされた。レーン１〜６はhK２サンプルを含み、そしてレーン７及び８はPSAサンプルである。レーン１はhK２対照を示す。レーン２は、A CTと共に４時間インキュベートされたhK２を含む。レーン３は添加されたプロテアーゼを含まない血清対照を示す。レーン４は血清と共に15分間インキュベートされたhK２を含む。レーン５は、血清と共に４時間インキュベートされたhK２を含む。レーン６は、精製されたα−２マクログロブリンと共に４時間インキュベートされたhK２を含む。レーン７は、血清と共に４時間インキュベートされたPS Aを含む。レーン８は、精製されたα−２マクログロブリンと共に４時間インキュベートされたPSAを含む。図20は、処理されていないヒト前立腺(ｎ＝257)におけるモノクローナル抗体H K1G586の免疫反応性を示す。図21は、アンドロゲン−剥奪療法−処理されたヒト前立腺（ｎ＝７）におけるモノクローナル抗体HK1G586の免疫反応性を示す。図22は、（Ａ）ヒト全血中に希釈されたLNCaP細胞から抽出されたRNA中のPSA 及びhK２のmRNAのRT−PCR検出、及び（Ｂ）次の患者のヒト全血から抽出されたR NAにおけるPSA及びhK２のmRNAのRT−PCR検出を示す：患者17、年齢31、男性の対照；患者21、年齢58、臨床段階Ｂ；患者24、年齢83、既知の転移性疾病（Ｄ２）；患者26、年齢75、病理学的段階Ｃ（＋縁）；患者28、年齢57、病理学的段階Ｃ（＋縁）；患者49、年齢64、病理学的段階Ｃ（＋精ノウ）；患者59、年齢31、男性の対照；患者60、年齢73、既知の転移性疾病。本発明の特定の記載 PSAに対するhK２の高度のアミノ酸配列相同性、及びhK２及びPSAの両者の発現が前立腺細胞に実質的に制限される事実は、組織サンプル中のhK２及びPSAの量もしくは存在の測定、又は細胞を含んで成る生理学的流体、たとえば血液もしくは組織サンプル、たとえばリンパ節におけるhK２転写体のレベルの測定は、前立腺癌(pCa)の診断及びモニターリングにおいて有用であることを示唆する。定義本明細書において使用される場合、“hK２ポリペプチド”は、組換えプレープロ、プロ及び成熟hK２ポリペプチドを包含する。図１に示されるアミノ酸配列（配列番号１）を有する成熟hK２ポリペプチド、及びhK３と実質的に相同である領域、すなわち図１に示されるような棒線により同定されない領域において配列番号１と少なくとも90％の相同性を共有する“変異体”ポリペプチドが存在する。本発明の変異体hK２ポリペプチドは、その対応する野生型hK２ポリペプチドに対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。好ましい変異体hK２ポリペプチドは、配列番号８、すなわちアミノ酸位置217でアラニンのバリンへの置換を有する成熟hK２ポリペプチドを含んで成る。hK２ポリペプチドは図１の成熟hK２分子と同じように抗原性機能を有し、ここで前記ポリペプチドはまた、それに対して特異的に結合するが、しかしhK３（又はhK１）と交差反応しない抗体によっても定義できる。好ましくは、前記抗体は、図１の成熟hK２分子上に存在する抗原性部位又はエピトープとも反応する。共有する抗原性機能を定義するのに有用な抗体、すなわちhK２サブユニット41 〜56に対してインビボで調製されたポリクローナル抗血清は、出願番号08/096,9 46、現在アメリカ特許第5,516,639号に詳細に記載されている。 “単離されたhK２核酸”は、生来のポリペプチドRNA又はDNAの非コード又はコード鎖に対して相補的である、７個以上、好ましくは15個、そしてより好ましくは20個又はそれ以上の連続したヌクレオチド塩基を含むRNAもしくはDNAであり、又は前記RNAもしくはDNAに対してハイブリダイズし、そして緊縮条件下で安定して結合されたまま存続する。好ましくは、単離された核酸は、生物学的活性hK２ポリペプチド、その変異体又はそのサブユニットをコードする。hK２ポリペプチドの生物学的活性は、hK２ポリペプチドに対して特異的な抗体と反応する能力、hK２−特異的基質を分解する能力（例７を参照のこと）、又は血清タンパク質に対して結合する能力（例９を参照のこと）を包含する（但し、それらだけには限定されない）当業界においてよく知られている方法により検出され得る。変異体hK２ポリペプチドもしくはそのサブユニット、又はhK２ポリペプチドのサブユニットは、配列番号１のアミノ酸配列を含んで成るhK２ポリペプチドの生物学的活性の少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約50％、そしてより好ましくは少なくとも約90％を有する。従って、RNA又はDNAは、それが核酸の天然源に通常関係する少なくとも１つの汚染性核酸を有さず、そして好ましくは、いづれか他の哺乳類RNA又はDNAを実質的に有さないことにおいて単離される。用語“通常関係する少なくとも１つの汚染性核酸源を有さない”とは、核酸が前記源又は天然細胞中に再導入されるが、しかし異なった染色体位置に存在し、又は他方では、前記細胞源に通常見出されない核酸配列を端に有する場合を包含する。単離されたhK２核酸の例は、上記のように、図１のhK２ペプチドのhK３−相同領域と少なくとも90％の配列同一性を共有する生理学的活性hK２ポリペプチドをコードするRNA又はDNAである。用語“ 単離され、精製された”とは、hK２ポリペプチドに関して使用される場合、この後に論じられる方法により定義される。本明細書において使用される場合、用語“組換え核酸”、すなわち“組換えDN A”とは、核酸、すなわち続いて、インビトロにおいて化学的に変更され、そして後で、標的宿主細胞、たとえば動物、植物、昆虫、菌類、細菌源に由来する細胞中に導入され得る、いづれか適切な組織源から誘導され又は単離されたDNAを意味する。源から“誘導された”組換えDNAの例は、hK２をコードする有用なフラグメントとして同定されるDNA配列、又はそのフラグメントもしくは変異体、及び次に実質的に純粋な形で化学的に合成されるDNA配列、又はそのフラグメントもしくは変異体であろう。源から“単離された”そのようなDNAの例は、本発明への使用のために、遺伝子工学の方法によりさらに操作され、たとえば増幅され得るように、化学的手段、たとえば制限エンドヌクレアーゼの使用により前記源から切除され又は除去された有用なDNA配列であろう。従って、“組換えDNA”は、完全に合成のDNA配列、半合成DNA配列、生物学的源から単離されたDNA配列、及び導入されたRNAに由来するDNA配列、並びにそれらの混合物を包含する。一般的に、組換えDNA配列は、DNAの受容体である宿主標的細胞のゲノムに本来存在しないか、又はそれは前記ゲノムに存在するが、しかし発現されないか又は高く発現されない。本明細書において使用される場合、“キメラ”とは、ベクターが、“天然”又は野生型の種に存在しない態様で連結されているか又は関連している、少なくとも２種の異なった種からのDNAを含んで成るか、又は同じ種からのDNAを含んで成ることを意味する。 “制御配列”とは、特定の宿主生物において作用可能に連結されたコード配列の発現のために必要なDNA配列を意味するよう定義される。たとえば、原核細胞のために適切である制御配列は、プロモーター、及び任意には、オペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。 “作用可能に連結される”とは、核酸が他の核酸配列と機能的関係に置かれることを意味するよう定義される。たとえば、プレ配列又は分泌リーダーのための DNAは、それがポリペプチドの分泌に関係するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのためのDNAに作用可能に連結され；プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結され；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するために位置決定される場合、コード配列に作用可能に連結される。一般的に、“作用可能に連結される”とは、連結されるDNA配列が隣接し、そして分泌リーダーの場合、隣接し、そして読取り枠を整合して存在することを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接して存在すべきではない。結合は、便利な制限部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の実施に従って使用される。 “サザン分析”又は“サザンブロット”は、DNA又はDNA−含有組成物の制限エンドヌクレアーゼ消化物中のDNA配列の存在を既知のラベルされたオリゴヌクレオチド又はDNAフラグメントに対するハイブリダイゼーションにより確かめる方法である。サザン分析は典型的には、アガロースゲル上でのDNA消化物の電気泳動分離、電気泳動分離後のDNAの変性、及びSambrookなど．、前記のセクション9 .37〜9.52に記載のような、放射性ラベルされ、ビオチニル化され又は酵素−ラベルされたプローブによる分析のためのDNAのニトロセルロース、ナイロン又は他の適切な膜支持体への移行を包含する。 “ノザン分析”又は“ノザンブロット”は、既知のプローブ、たとえばオリゴヌクレオチド、DNAフラグメント、cDNAもしくはそのフラグメント、又はRNAフラグメントに対してハイブリダイズするRNA配列を同定するために使用される方法である。前記プローブは、放射性同位体、たとえば³²Ｐにより、ビオチニル化により又は酵素によりラベルされる。分析されるRNAは通常、アガロース又はポリアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離され、ニトロセルロース、ナイロン、又は他の適切な膜に移行され、そして当業界において良く知られている標準の技法、たとえばSambrookなど．、前記のセクション7.39〜7.52に記載されるそれらの技法を用いて、プローブによりハイブリダイズされ得る。 “緊縮条件”とは、（１）洗浄のために低いイオン強度及び高い温度、たとえば0.015ＭのNaCl／0.0015Ｍのクエン酸ナトリウム(SSC)；0.1％のラウリル硫酸ナトリウム(SDS)を50℃で使用し、又は（２）ハイブリダイゼーションの間、変性剤、たとえばホルムアミド、たとえば50％ホルムアミド、及び0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％ Ficoll／0.1％ポリビニルピロリドン／50mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.5)、並びに750mMのNaCl，75mMのクエン酸ナトリウムを42℃で使用する条件である。もう１つの例は、50％ホルムアミド、５×SSC（0.75ＭのNaC l，0.075Ｍのクエン酸ナトリウム）、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1％ピロリン酸ナトリウム、５×Denhardt's溶液、音波処理されたサケ精子DNA（50μ ｇ／ml）、0.1％ SDS及び10％硫酸デキストランの42℃での使用、並びに0.2×SS C及び0.1％ SDSにおける42℃での洗浄である。緊縮条件の他の例に関しては、Sa mbrookなど．、前記を参照のこと。発現カセット又は発現ベクター宿主細胞において機能的なプロモーターに作用可能に連結された hK２をコードする組換えDNA配列を含んで成る発現カセット又はベクターは、環状又は線状、二本鎖又は一本鎖であり得る。一般的に、発現カセット又はベクターは、キメラDNAの形で、たとえば得られる細胞系に存在する組換えDNAの発現を促進する制御配列を端に有するコード領域をまた含むことができるプラスミドDN Aの形で存在する。たとえば、発現カセットは、哺乳類細胞において活性であるプロモーターをそれ事態含んで成り、又は形質転換標的物であるゲノムにすでに存在するプロモーターを用いることができる。そのようなプロモーターは、CMV プロモーター、並びにSV40後期プロモーター及びレトロウィルスLTR(長い末端反復体要素)を包含する。hK２又はその一部のための転写単位として作用する組換えDNA配列の他に、組換えDNAの一部は、転写されず、調節又は構造機能として作用する。細胞中に導入されるべき発現カセット又は発現ベクターはさらに、一般的に、形質転換されるべき細胞集団からの形質転換された細胞の同定及び選択を促進するために、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又は両者のいづれかを含むであろう。あるいは、選択マーカーはDNAの別の断片上に担持され、そして同時形質転換工程に使用され得る。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両者は、宿主細胞における発現を可能にするために適切な調節配列を端に有することができる。有用な選択マーカーは、当業界においてよく知られており、そしてたとえば、抗生物質及び除草剤−耐性遺伝子、たとえばneo，hpt，dhfr，bar，aroA及び同様のものを包含する。Lundquistなど.(アメリカ特許第5,554,798号)の表１もまた参照のこと。レポーター遺伝子は、潜在的に形質転換された細胞を同定するために、及び調節配列の機能性を評価するために使用される。容易にアセンブルできるタンパク質をコードするレポーター遺伝子は当業界においてよく知られている。一般的に、レポーター遺伝子は、受容体生物又は組織に存在しないか又はそれにより発現されず、そして発現がいくらかの容易に検出できる性質、たとえば酵素活性により明らかにされるタンパク質をコードする遺伝子である。好ましい遺伝子は、Ｅ．コリのTn９からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)、Ｅ．コリのuidA遺伝子座のβ−グルクロニダーゼ遺伝子(gus)、及び蛍フォチナス・ピラリス（photinus pyralis）からのルシフェラーゼ遺伝子を包含する。レポーター遺伝子の発現は、DNAが受容体細胞中に導入された後、適切な時間でアッセイされる。宿主細胞において機能的な他の要素、たとえばイントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列及び同様のものもまた、組換えDNAの一部でもあり得る。そのような要素はDNAの機能のために必要であっても又は必要でなくても良いが、しかし転写、mRNAの安定性、又は同様のものに影響を与えることによってDNAの改良された発現を提供することができる。そのような要素は、細胞における形質転換DNAの最適な性能を得ることが所望される場合、DNAに包含され得る。標的細胞を形質転換することができる組換えDNAを構成するための一般的な方法は、当業者に良く知られており、そして構成の同じ組成及び方法が、本明細書において有用なDNAを生成するために利用され得る。たとえば、J．Sambrookなど .，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press（２nd ed.，1989）は、構成の適切な方法を提供する。宿主細胞の形質転換及び組換えhK２ポリペプチドの回収 hK２ポリペプチドをコードする組換えDNAを含んで成る発現カセット又はベクターは、トランスフェクションにより、たとえばC．Chemなど．，M ol．Cell．Biol.，7，2745（1987）の改良されたリン酸カルシウム沈殿方法により、標的細胞中に容易に導入され得る。トランスフェクションはまた、BRLにより提供される市販のキットを用いて、リポフェクチンにより達成され得る。 hK２ポリペプチドの発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。そのような宿主細胞は、プロセッシング及びグリコシル化活性を複合することができる。原則的には、いづれかの高等真核細胞培養物（脊椎動物又は無脊椎動物の培養物からの）が、本発明の実施において使用され得る。無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を包含する。多くのバキュロウィルス株及び変異体、並びに宿主、たとえばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）(毛虫 )、アエデス・アエジプチ（Aedes aegypts）(蚊)、ドロソフイラ・メラノガステル（Drosophila melanogaster）(ショウジョウバエ)及びボンビックス・モリ(Bo mbyx mori)からの対応する許容できる昆虫宿主細胞が同定されている。たとえば、Luckowなど.，Bio/Technology，6，47（1988）；Millerなど.，Genetic Engin eering，J.K．Setlowなど.，eds.，Vol．8(Plenum Publishing，1986)，pp．277 -279；及びMaedaなど.，Nature，315，592(1985)を参照のこと。トランスフェクションのための種々のウィルス株、たとえばオートグラファカリホルニカ（Au tographa californica）NPVのＬ−１変異体及びボンビックスモリNPVのBm−５株は入手でき、そしてそのようなウィルスは、好ましくはスポドデテラフルギペルダ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。 hK２ポリペプチドがヒト起源の細胞以外の組換え細胞において発現される場合、そのhK２ポリペプチドは、ヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを完全に有さない。しかしながら、hK２ポリペプチドに関して実質的に相同である調製物を得るために、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからhK２ポリペプチドを精製することが必要である。たとえば、培養培地又は溶解物が、粒状細胞残骸を除去するために遠心分離され得る。次に、膜及び可溶性タンパク質画分が分離される。次に、hK２ポリペプチドが前記可溶性タンパク質画分から精製され得、そして必要なら、培養物溶解物の膜画分から精製され得る。次に、hK２ポリペプチドが、イムノアフィニティー又はイオン交換カラム上での分別；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカ又はアニオン交換樹脂、たとえばDEAE上でのクロマトグラフィー処理；クロマトフォーカシング；SDS −PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；たとえばSephadex Ｇ−75を用いてのゲル濾過；又はリガンドアフィニティークロマトグラフィーにより汚染性可溶性タンパク質及びポリペプチドから精製され得る。得られるトランスジェニック宿主細胞から単離されると、hK２ポリペプチドの誘導体及び変異体は容易に調製され得る。たとえば、本発明のhK２ポリペプチドのアミドはまた、カルボン酸グループ又は前駆体をアミドに転換するための当業界において良く知られている技法によっても調製され得る。Ｃ−末端カルボキシル基でのアミド形成のための好ましい方法は、適切なアミンにより固体支持体からポリペプチドを切断すること、又はエステルを生成するアルコールの存在下で、所望するアミンによるアミノ分解により切断することである。 hK２ポリペプチドのカルボキシル基の塩は、ペプチドと、所望する塩基、たとえば金属水酸化物塩基、たとえば水酸化ナトリウム；金属炭酸塩又は炭酸水素塩塩基、たとえば炭酸ナトリウム又は炭酸水素ナトリウム；又はアミン塩基、たとえばトリエチルアミン、トリエタノールアミン及び同様のものの１又は複数の同等物とを接触せしめることによって、通常の態様において調製され得る。本発明のポリペプチドのアミノ基のＮ−アシル誘導体は、最終縮合のためにＮ −アシル保護されたアミノ酸を用いることによって、又は保護されているか又は保護されていないペプチドをアシル化することによって調製され得る。Ｏ−アシル誘導体は、たとえば遊離ヒドロキシペプチド又はペプチド樹脂のアシル化により調製され得る。アシル化は、標準のアシル化試薬、たとえばアシルハロゲン化物、無水物、アシルイミダゾール及び同様のものを用いて実施され得る。Ｎ−及びＯ−アシル化は、所望により、一緒に実施され得る。さらに、図１の内部hK２アミノ酸配列は、Ｌ形よりもむしろＤ形を用いる置換を包含する、特定された位置のための１又は２つの保存性アミノ酸置換により修飾され得る。ポリペプチドの酸付加塩は、ポリペプチドと、所望する無機又は有機酸、たとえば塩酸の１又は複数の同等物とを接触せしめることによって調製され得る。ポリペプチドのカルボキシル基のエステルはまた、当業界において知られているいづれかの通常の方法によっても調製され得る。変異体hK２ポリペプチド変異体hK２ポリペプチドは配列番号１，３又は５に関して少なくとも１つのアミノ酸置換を有し、たとえば配列番号８は配列番号１に関して位置217でアラニンのバリンへの置換を有することが想定される。特に、アミノ酸は比較的保存性の態様で置換される。そのような保存性置換は、代表的な置換の見出し下で表１に示される。より好ましい置換は、好ましい置換の見出し下に存在する。置換が導入された後、生成物は生物学的活性、たとえばhK２−特異的抗体の生成能力、又はhK２−特異的抗体、すなわちhK２に対して結合するが、hK３（PSA）に対しては結合しない抗体と特異的に反応する能力についてスクリーニングされる。表１本発明内のアミノ酸置換は一般的に、（ａ）シート又はらせんコンホメーションとしての置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）大部分の側鎖の維持に対するそれらの効果において有意に異ならない置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通する側鎖特性に基づいて次のグループに分けられる：（１）疎水性：ノルロイシン、met，ala，val，leu，ile；（２）中性親水性：cys，ser，thr；（３）酸性：asp，glu；（４）塩基性：asn，gln，his，lys，arg；（５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：gly，pro；及び（６）芳香族性：trp，tyr，phe。本発明はまた、非保存性置換を有するhK２変異体にも関する。非保存性置換は、上記種類の１つのメンバーともう１つのメンバーとを交換を必要とする。アミノ酸置換は、当業界によく知られている方法により本発明のDNA分子中に導入される。組換えhK２ポリペプチドの使用単離されると、hK２ポリペプチド又はその抗原的活性変異体、誘導体及びフラグメントは、アメリカ特許第5,516,639号に詳細に開示されるように、hK２又は抗−hK２抗体を含むと思われる生物学的材料に由来するサンプル中のhK２についてのアッセイに使用され得る。たとえば、hK２ポリペプチドは、検出できるラベルにより、たとえば１又は複数の放射性ラベルされたペプチジル残基を通してラベルされ得、そして生理学的流体における抗−hK２抗体に結合する“捕獲抗原” として抗−hK２抗体に結合するための内因性hK２と競争するために使用され得、ここで固定化できる抗−hK２抗体を使用するhK２のための種々の競争イムノアッセイ形式は、（ａ）固体表面に結合できる量の抗−hK２抗体を供給し；（ｂ）混合されたサンプルを生成するために、hK２を含んで成る生理学的サンプルと、検出できるラベルを含んで成る既知量のhK２ポリペプチドとを混合し；（ｃ）前記抗体と前記混合されたサンプルとを、抗体−hK２複合体を形成するために前記抗体と前記hK２との間で、及び抗体−ラベルされたポリペプチド複合体を形成するために前記抗体と前記ラベルされたポリペプチドとの間で免疫学的反応の発生を可能にするのに充分な時間、接触せしめ；（ｄ）混合されたサンプルから、hK２に結合される抗体及びラベルされたポリペプチドに結合される抗体を分離し；（ｅ）固体表面上の抗体に結合されるか又は混合されたサンプルに残っているかいづれかのラベルされたポリペプチドの存在又は量を検出し又は決定し；そして（ｆ）前記サンプルにおける前記hK２の存在又は量を、段階（ｅ）の結果から決定することによって実施される。競争阻害イムノアッセイによりサンプル中の内因性hK２を検出できるもう１つの形式においては、既知量の抗−hK２抗体が既知量の内因性hK２を含むサンプルに添加される。前記既知量は、存在すると思われるすべてのhK２を複合体化するのに必要とされる量、たとえば前立腺癌を有することが知られている患者から得られたサンプル材料の同じ量のサンプルに存在する量よりも少なく選択される。次に、検出できるラベルを含んで成る既知量の本発明のhK２ポリペプチド又はそのサブユニットが添加される。内因性hK２がサンプルに存在する場合、より少ない抗体がラベルされたhK２ポリペプチドを結合するために利用でき、そしてそれは溶液に遊離して存続するであろう。内因性hK２が存在しない場合、添加されたラベルされたポリペプチドは、二元複合体を形成するために添加された抗−hK２抗体と複合体化するであろう。次に、二元抗体−抗原複合体が、抗−哺乳類IgG抗体（羊、ヤギ、マウス等）により沈殿せしめられる。沈殿物（三元複合体）における放射能又は他のラベルの量は、サンプルに存在する内因性hK２の量に反比例し、たとえば減じられた量の放射能を含むペレットは、内因性hK２の存在の表示である。実験用及び家畜用動物においてポリクローナル抗体又は抗血清を調製するための従来の技法に代わるものとして、hK２ポリペプチドに対するモノクローナル抗体が既知のハイブリドーマ細胞培養技法を用いて調製され得る。一般的に、この方法は、骨髄腫の適切な連続系により融合された一次脾臓細胞の抗体−生成融合細胞系を調製し、そして使用される骨髄腫細胞系が由来するか又は適合できる多量培養物又は動物種のいづれかにおいて前記融合された細胞を増殖せしめることを包含する。そのような抗体は、非常に特異的且つ敏感であり、そして免疫化学的に比較的“純粋”であるので、動物の接種により生成される抗体に比較して、多くの利点を提供する。本発明の抗体の免疫学的活性フラグメント、たとえば部分的にヒト適合されたモノクローナル抗体のようなｆ（ab）フラグメントはまた、本発明の範囲内である。キメラ及び修飾された抗体キメラ抗体は、１つの免疫グロブリンからの可変ドメインともう１つの免疫グロブリンからの不変ドメインとの融合体を含んで成る。通常、可変ドメインは、異なった種、たぶんヒトからの免疫グロブリン遺伝子に由来する。この技法は、当業界においてよく知られている。たとえば、組換えDNA技法を用いての免疫グロブリン型分子の変異体の調製を開示する、ヨーロッパ特許出願EP-A-0125,023 号（Cabilly/Genetech）及びEP-A-0120,694号及びアメリカ特許第 4,816,567号を参照のこと。キメラ又は修飾された抗体を調製するためのもう１つのアプローチは、誘導キメラ分子を生成するために、モノクローナル抗体の可変領域をもう１つの非免疫グロブリン分子に結合することである（WO86/01533号、Neuberger and Rabbits/ Celltechを参照のこと）。さらなるアプローチは、その異なる可変領域に異なる特異性を有するキメラ免疫グロブリンを調製することである（EP68763Aを参照のこと）。さらにもう１つのアプローチは、その必須特異性を変えないで、一定のその特徴を変更するために、モノクローナル抗体をコードするDNAに突然変異を導入することである。これは、特定部位の突然変異誘発又は当業界において知られている他の技法により達成され得る。 Winter特許出願EP-A-0239400号は、組換えDNA技法（“CDR−グラフティング” ）を用いて、免疫グロブリンの可変領域の相補性決定領域(CDR)を、異なる特異性の免疫グロブリンからのCDRにより置換することによる、変更された誘導抗体の調製を開示する。従って、CDR−グラフティングは、フレームワーク領域の変更と共に、抗体の“ヒト化”を可能にする。ヒト抗体はまた、それらの生来の免疫系を欠くマウスにおいてヒト免疫系を再構成し、次に免疫系に対して特異的であるヒト抗体を生成するためにマウスを免疫化することによっても調製され得る。注目の抗原に対して特異的なゲッ歯動物抗体のCDRを含む“ヒト化された”抗体は、ヒトの免疫系により外来物としてほとんど認識され得ない。たとえばHK1G 464と同じ結合特異性を有する“ヒト化された”抗体は、ヒトの治療及び／又は診断方法に特に使用できることになる。誘導抗体を生成するためのいづれかの与えられた抗体、又はその抗体をコードする遺伝子の操作及び／又は変更は、当業界において良く知られている。逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)によるhK２−特異的転写体の検出 hK２をコードするRNA転写体を検出するために、hK２ RNAを含むと思われる細胞サンプル、たとえばヒト前立腺組織から単離された全RNAからRNAが単離される。RNAは、当業界において知られている方法、たとえばTRIZOL^TM試薬(GIBCO-BRL/ Life Technologies，Gaithersburg，MD)を用いて単離され得る。Oligo−dTは、単離されたRNAからの第１鎖cDNAを調製するために逆転写酵素反応においてプライマーとして使用され得る。得られる第１鎖cDNAが次に、PCR反応において増幅される。 “ポリメラーゼ連鎖反応”又は“PCR”とは、核酸、RNA及び／又はDNAの予備選択されたフラグメントの量が、アメリカ特許第4,683,195号に記載されるように増幅される方法又は技法を意味する。一般的に、注目の又はそれ以外の領域の末端からの配列情報が、オリゴヌクレオチドプライマーを設計するために使用される。それらのプライマーは、増幅されるべき鋳型の対抗する鎖に対して配列において同一であるか又は類似するであろう。PCRは、特定のRNA配列、全ゲノムDN Aからの特定のDNA配列、及び全細胞RNAから転写されるcDNA、バクテリオファージ又はプラスミド配列、及び同様のものを増幅するために使用され得る。一般的には、Mullisなど.，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol.，51，263（1987 ）；Erlich，ed.，PCR Technology，(Stockton Press，NY，1989)を参照のこと。従って、PCRによる特定の核酸配列の増幅は、保存されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド又は“プライマー”に依存し、ここで前記保存された配列は、一連の関連する遺伝子又はタンパク質配列、たとえば哺乳類hK２遺伝子の配列比較から推定される。たとえば、hK２ポリペプチドをコードするDNA分子のアンチセンス鎖に対してアニーリングすることが予測される１つのプライマーが調製され、そしてそのセンス鎖に対してアニーリングすることが予測されるもう１つのプライマーが調製される。一般的に、単離されたRNAは、一本鎖cDNAを生成するために逆転写酵素（RT）反応においてプライマーと組合わされる。Oligo−dT又はランダム配列オリゴヌクレオチド、及び配列特異的オリゴヌクレオチドが、RT反応におけるプライマーとして使用され得る。Sambrookなど．，前記を参照のこと。次に、一本鎖cDNAが、増幅された生成物を得るために配列特異的プライマーにより増幅される。増幅された生成物を検出するために、反応混合物は典型的には、アガロースゲル電気泳動、又は他の便利な分離技法にかけられ、そしてhK２−特異的増幅されたDNAの存在又は不存在が検出される。増幅されたhK２ DNAの検出は、ゲルからフラグメントを切り出し、又は溶出し（たとえば、Lawnなど.，Nucleic Acids R es.，9，6103（1981）及びGoeddelなど.，Nucleic Acids Res.，8，4057（1980 ）を参照のこと）、増幅された生成物を適切なベクター、たとえばpCRIIベクター（Invitrogen）のクローニング部位中にクローニングし、クローン化された挿入体を配列決定し、そして既知のhK２配列にそのDNA配列を比較することによって達成される。他方では、たとえば、hK２増幅されたDNAは、hK２−特異的オリゴヌクレオチドプローブとのサザンハイブリダイゼーションを用い、又は既知分子量のDNA鎖とその電気泳動移動度とを比較して検出され得る。本発明は、次の詳細な例によりさらに記載されるであろう。例１材料及び方法哺乳類hK２発現ベクターの構成図２に示されるように、完全なプレプロ−hK２（pphK２）(pphK２転写体の開始部位に関してヌクレオチド＃40〜＃858)をコードするcDNA（約820bpの長さ）を、下記１対のhK２特異的オリゴヌクレオチドプライマー：（5'ACGCGGATCCAGCA TGTGGGACCTGGTTCTCT 3'；配列番号９及び5'ACAGCTGCAGTTTACTAGAGGTAGGGGTGGGAC 3'；配列番号10）と共に、逆転写ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR)技法を用いて、ヒトBPH組織のRNAから合成した。このcDNAを、５’及び３’末端（pphK２センス配列に関しての）がそれぞれ、BamH１及びPst１配列により挟まれるよう生成した。次に、cDNAをアガロースゲル電気泳動により精製し、そしてBamH１及びPst １制限酵素により消化した。制限されたcDNAをBamH１−Pst１消化されたpVL1393 プラスミドベクターにより連結し、そしてＥ．コリHB101株を形質転換した。pph K２ cDNA／pVL1393プラスミドベクターを有するＥ．コリを選択した。pphK２含有挿入体を配列決定した。プラスミドpphK２cDNA／pVL1393をＥ．コリにおいて多量生成し、そしてCsClグラジエント超遠心分離により精製した。Ｅ．コリHB101中のプラスミドpphK２／pVL1393を、ブダペスト条約に基づいて、1994年５月２日、American Type Culture Collection，Rockville，MD，USAに寄託し、そして受託番号ATCC 69614を得た。完全なpphK２コード配列（図２）を示す0.8kbのフラグメントを、鋳型としてp phK２を含むプラスミドpVL1393（Dr．Young，Mayo Clinicからの贈与物）及び下記プライマー：Ａ（5’ATATGGATCCATATGTCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCTCCA 3'）（配列番号11）及びＢ（5’ATATGGATCCTCAGGGGTTGGCTGCGATGGT 3'）（配列番号12）を用いて、PC Rにより生成した。PCR生成物をTA−クローニングベクター(Invitrogen Corp.，S an Diego，CA)中に挿入し、そして完全な挿入体のDNAを配列決定した。哺乳類hK２発現ベクターを得るために、hK２−含有挿入体をその対応するTAクローンから単離し、そしてGBMTプロモーターの制御下でプラスミドpGT−ｄ（Ber yなど.，Nucl．Acids Res.，20，54-85(1992)（Dr．Brian Grinnell，Lillyの贈与物）のBcl１部位中に挿入した。哺乳類発現ベクター、PLNS−hK２及びPLNC−h K２を、それぞれプラスミドpLNSX及びpLNCX（Millerなど.，Biotech.，9，980(1 989)中にその対応するTAベクターからの0.8kb野生型hK２挿入体をクローニングすることによって得た。すべての哺乳類発現ベクターにおける挿入体の配向を、 DNA配列決定により確認した。組換えクローンの生成 AV12−664（ATCC CRL-9595）、すなわちSyrianハムスターにおけるアデノウィルス−誘発された腫瘍に由来する細胞系、及びDU145細胞を、10％ウシ胎児血清（D10F）により補充されたグルベッコ変性イーグル培地（高いグルコース）において培養した。PC３細胞を、10％ウシ胎児血清を含む最少イーグル培地において培養した。AV12細胞を、リン酸カルシウム方法（Maniatisなど．、前記（1989）を用いて、hK２発現ベクターによりトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、細胞を、D10F＋200nMのメトトレキセート(MTX)に再懸濁した。耐薬物性クローン細胞系を、２〜３週間後、単離し、そしてそれらの消費された培地をウェスターンブロットにより分析した。PC３及びDU145細胞を、リポフェクタミン(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)を用いてhK２哺乳類発現ベクターによりトランスフェクトし、そしてクローン（PC3−hK２及びDU145−hK２）を、400μｇ／mlのG418を含む培地において選択した。タンパク質の精製及び配列決定 AV12−hK２クローンを、D10F＋200nMのMTXにおいて増殖せしめた。約60％の集密性で、細胞をハンクス溶液により洗浄し、そして血清フリーHM４培地に再懸濁した。消費された培地を、血清フリーの消費された培地の添加の７日後に集め、そして−20℃で貯蔵した。タンパク質を精製するために、血清フリーの消費された培地を濃縮し、そして50mMの炭酸水素ナトリウム（pH８）に変換する。サンプルを0.2μフィルターにより濾過し、そして次に、TSK DEAE−５PW HPLCカラム(2 1mm×150mm)上に５ml／分の流速で直接的にポンプで注入した。緩衝液Ａは、50m Mの炭酸水素ナトリウム(pH7.9)を含み、そして緩衝液Ｂは50mMの炭酸水素ナトリウム及び0.5ＭのNaClを含んだ(pH7.6)。溶離プロフィールは、35分間にわたっての０〜50％の緩衝液Ｂ；35〜40分の50〜100％の緩衝液Ｂのグラジエント、及び緩衝液Ａにおける再平衡化の前、５分間の100％緩衝液Ｂでのイソクラティク溶離により展開された。流速は、ずっと５ml／分であった。上記工程においては、硼酸塩緩衝液が、目立った差異のない炭酸水素塩緩衝液と交換できる。 DEAE画分を、ウサギ抗−pphK２(Saediなど.，Mol．Cell．Endoc.，109，237(1 995))を用いて、ドライド−ダウンELISA方法（下記参照のこと）によりhK２の存在についてアッセイした。hK２活性を有する画分をプールし、そして膜（10KDのカットオフ）を用いての限外濾過により約５〜８mlに濃縮した。次に、固体硫酸アンモニウムを添加し、1.2Ｍの最終濃度にした。次に、このサンプルをPolyLC 、ポリプロピルアスパルタミドカラム(1000Åの孔サイズ、4.6mm×200mm)上に注入し、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によりタンパク質を分解した。緩衝液Ａは20mMのリン酸ナトリウム、1.2Ｍの硫酸ナトリウムであり(pH6.3)、そして緩衝液Ｂは50 mMのリン酸ナトリウム、５％の２−プロパノールであった(pH7.4)。溶離グラジエントは、５分間にわたっての０〜20％のＢ；５〜20分での20〜55％のＢ；20〜 23分での55％のＢでのイソクラティク溶離；23〜25分での55〜100％のＢ；緩衝液Ａによる再平衡化の前、２分間の100％のＢでのイソクラティク溶離であった。流速は１ml／分であった。約50％のＢで溶離されるhK２を含有するHICピークを、Centricon−10（Amicon）（10Ｋ MWカットオフ）限外濾過による反復しての濃縮により50mMの硼酸塩緩衝液（pH８）中に交換した。純度を、SDS−PAGE及びウェスターンブロット分析の両者により評価した。hK２^V217濃度を見積るために使用される消衰係数は、1.84＝１mg／mlのＡ₂₈₀であった。いくつかの場合、hK２を含むHICピークを、10／30 Pharmacia Ｓ12カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によりさらに精製した。この場合、hK ２を含むHICピークを上記のような限外濾過により１ml以下に濃縮し、そして次に100mMの酢酸アンモニウム（pH７）又は硼酸ナトリウム（pH８）により平衡化されたサイズ排除カラムに適用した。流速は0.7ml／分であった。次に、hK２ピークを限外濾過により濃縮した。酢酸アンモニウムにSECにより集められたピークを凍結乾燥せしめ、緩衝液を除去し、そして次に、水に再構成した。このサンプルのアリコートを、112℃で20時間、真空下で６Ｎの気体HClにおいて加水分解し、次に0.1ＮのHClに再構成し、そして第１アミンのためのOPA及び第２アミンのためのFMOCと共に、アミノ酸のプレ−カラム誘導体化を利用するHewlett Pack ard Aminoquantアミノ酸分析機上で分析した。 HK1G586.1（下記参照のこと）親和性樹脂を、アフィニティークロマトグラフィーによりhK２を精製するために使用した。HK1G586.1モノクローナル抗体(mAb) を、Schneider（J．Biol．Chem.，257 ，10766(1982)）に従って、Pharmacia GammaBind＋Sepharose（カタログ番号17 −0886）により結合した。手短に言及すれば、HK1G586.1mAb及び樹脂を、４℃で一晩、回転しながらインキュベートした。樹脂を遠心分離し（４℃で５分間、50 0×ｇ）、そして0.2Ｍのトリエタノールアミン(pH8.2)により２度洗浄した。アミン基を、新鮮な架橋剤溶液(0.2Ｍのトリエタノールアミン(pH8.2)中、25mMのジメチルピメリミデート二塩酸塩)において、室温（22℃）45分間、架橋せしめた。樹脂を20mMのエタノールアミン(pH8.2)により室温で５分間、急冷し、そして次に、１ＭのNaCl，0.1ＭのPO₄溶液(pH7.0)により２度洗浄した。樹脂を、PBS によりさらに２度、洗浄し、そして使用するまで、0.05％のNaN₃と共に４℃で貯蔵した。 Applied Biosystems Model 477aパルス液相配列決定機を用いて、タンパク質及びペプチドを配列決定した。そのModel 477aは、Ｎ−末端からアミノ酸を連続的に開放するための自動化されたEdman分解化学、続いて、PTH誘導体化及び逆相 HPLCによるクロマトグラフィーを使用する。ペプチドサンプルをビオブレン−処理されたガラス繊維フィルター支持体上で配列決定機に適用し、そして全タンパク質を、ビオブレン−処理されたフィルター又は前−活性化されたProtonフィルター（Beckman，Fullerton，CA）のいづれか上に適用した。サンプル配列決定されたブロットをまず、Novexシステム（Novex，San Diego，CA）上でミニ−ゲルとして展開し、次に、Problot PVDF膜に移し、クーマシーブルーにより可視化し、適切なバンドを切り取り、そしてPVDF膜から直接的に配列決定した。モノクローナル抗体生成Ａ／Ｊマウスに、第１日目に、完全フロイントアジュバント(CFA)中50μｌのp hK２をi.p.投与し、14日目に、不完全フロイントアジュバント(IFA)中1.25μｇのphK２をi.p.投与し、そして28日目に、PBS中25μ ｇのphK２をi.p.注射した。融合の３日前、マウスに、PBS中10μｇのphK２をi.v .追加免疫した。マウスを殺し、そして単一細胞懸濁液を、脾臓から調製した。免疫Ｂ細胞と、P3.653骨髄腫細胞とを融合せしめた。クローン化されたハイブリドーマをELISAによりスクリーニングし、そしてhK２^V217及びphK２^V217に対する上清液の反応性及びPSAとの最小反応性に基づいて選択した。それらの基準により選択された２種のクローン、すなわちHK1G464及びHK1G586を、マウス脾臓支持細胞層上の沈積単一細胞に対して、FACStar＋細胞ソーターを用いてサブクローン化した。サブクローンHK1G464.3及びHK1G586.1をさらなる研究のために使用した。免疫原がhK２^V217であり、ミョウバンがCFA及びIFAの代わりに使用され、BALB ／ｃ細胞がＡ／Ｊマウスの代わりに使用されるのを除いて、上記と同じプロトコールを用いるもう１つの融合は、クローンHK1H247を生成した。ハイブリドーマクローンHK1G464.3，HK1G586.1，HK1H247，HK1A523及びHKD106 .4を、ブダペスト条約に従って、American Type Calture Collectionに寄託し、そしてそれぞれ受託番号HB11983，HB12026，HB12162，HB11876及びHB11937を得た。hK ２ペプチド免疫原に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体の生成羊及びヤギに、完全フロイントアジュバント(CFA)中100μｇのKLH−接合されたペプチドを皮下免疫化し、そして不完全フロイントアジュバント(IFA)中100μ ｇのペプチドを３週間隔で追加免疫化した。ペプチド免疫原に対するモノクローナル抗体のために、Balb／ｃマウスを、完全フロイントアジュバント(CFA)中、100μｇのKLH−接合されたペプチドにより皮下免疫し、そして不完全フロイントアジュバント(IFA)中100μｇのペプチドにより３週間隔で追加免疫した。他方では、Ａ／Ｊマウスを、50μｇのKLH−接合されたペプチドにより２度、腹腔内免疫化し、そして陽性力価を有するマウスを、25μｇの前記接合体により静脈内追加免疫化した。最初の３回の免疫化の後、動物からの血液を、免疫化の６〜10日後、抗体の存在について試験した。ペプチドを、pH9.6の炭酸緩衝液において0.25インチのポリスチレンビーズ（Clifton，Clifton Heights，PA）当たり１μｇのBSA(ウシ血清アルブミン)に結合されるペプチドを、４℃で一晩インキュベートすることによって、前記ビーズ上に固定した。前記ビーズを0.01Ｍのリン酸緩衝液溶液(PBS )（pH7.4）（0.1％のTween20を含む）により３度洗浄し、そして１％脱脂乳＋１％BSAによりブロックした。それらのビーズを、１：100，１：1000又は１：10,0 00希釈度の動物血清溶液250μｌと共に18時間インキュベートした。３回の洗浄に続いて、ホースラディシュペルオキシダーゼに接合されたウサギ抗−羊、抗− マウス又は抗−ヤギ抗体（Cappel-Organon Teknica Corporation，Durham，NC） 250μｌを、個々のビーズと共に３時間、水平インキュベーター上で150rpmでインキュベートした。酵素シグナルを、基質としてオルト−フェニレン−ジアミンを用いて、分光学的に定量化した。非免疫血清を負の対照として使用し、そして免疫血清測定値を、対照読取りの倍数として表わした。陽性の血清力価を有するマウスの脾臓からのリンパ球を骨髄腫細胞と融合せしめ、ハイブリドーマ細胞を生成した。それらの細胞のクローンにより生成される抗体を、上記のようにしてスクリーンした。陽性クローンを、制限希釈によりサブクローン化し、そして再スクリーンした。モノクローナルハイブリドーマを、プリスチン感作されたマウスの腹膜腔に注入し、腹水を得た。モノクローナル及びポリクローナル抗血清を精製するために、その抗血清をまず、飽和硫酸アンモニウムによる沈殿によるIgG分離、及びウルトラゲルACA34カラムを用いてのサイズクロマトグラフィー処理にかけた。Sepharose 4Bへのペプチドの臭化シアンカップリングにより生成されるカラムを用いて、ポリクローナル抗体をさらにアフィニティー精製した。精製された抗体を、酸性PBS(pH2.45) によりカラムから溶出した。ELISA アッセイ乾燥されたELISA型を用いて、クローンの血清フリーのスペント培地、及びhK ２精製の間に集められた画分におけるhK２を測定した。マイクロタイタープレート（Becton Dickinson Labware，NJ）を、50μｌのスペント培地又はカラム画分により37℃で一晩、被覆した。ウェルをPBS＋0.1％ Tween20(PBST)により洗浄し、そして50μｌの一次抗体と共に１時間インキュベートした。ウェルを再びPBST により洗浄し、そして50μｌのヤギ抗−IgG、又はホースラディシュペルオキシダーゼにより結合されたヤギ抗−ウサギ−IgG Fc抗体（１：500，Jackson Immun osearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA）と共に37℃で１時間インキュベートした。ウェルをPBSTにより洗浄し、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD ，Sigma，MO）と共に５分間インキュベートし、そして比色反応を、ELISAリーダー(Biotek Instruments，Inc.，model EL310，VT)によりＡ₄₉₀で測定した。すべてのサンプルを二重反復アッセイした。ベクターのみによりトランスフェクトされたAV12細胞からの血清フリーのスペント培地を、負の対照として使用した。抗体を、ビオチニル化されたphK２^V217，hK２^V217及びPSAを用いて、溶液中のELISA型により試験した。PSAを、Sensabaugh and Blake（J．Uro logy，144，1523(1990)）の方法により精製した。50μｌの緩衝液Ａ(8.82mMノクエン酸、82.1mMのリン酸ナトリウム（二塩基性）、10％のBSA，0.1％のマンニトール、0.1％のNonidet P-40，pH7.0)に希釈された20ngのビオチニル化されたhK ２^V217もしくはphK２^V217、又はPBS中、10％馬血清（HS）に希釈された0.25ngのビオチニル化されたPSAを、50μｌのハイブリドーマ上清液、負の対照上清液(すなわち、phK２^V217及びhK２^V217のための不適切なハイブリドーマ上清液、又はP SAのためのHS中20μｇ／mlの不適切な精製されたmAb)、又は正の対照上清液（すなわち、PSAのためのHS中20μｇ／mlの精製されたPSM773（抗−pSA）mAb、又はp hK２^V217及びhK２^V217のためのHK1D104(抗“hK２”)ハイブリドーマ上清液）と共にインキュベートした。HCO514、すなわちhCGに対するmAbを、PSAアッセイにおいて負の対照として使用し、そしてZTG085、すなわちtauに対するmAbを、hK２アッセイにおいて負の対照として使用した。抗体及び抗原のそれらの混合物を、ストレプトアビジンにより被覆されたマイクロタイタープレート(Labsystems，Helsinki，Finl and)において、振盪しながら１時間インキュベートした。プレートを、300μｌのPBS，0.1％ Tween-20(PBS T)により３度、洗浄し、そしてHSに１：10,000で希釈された100μｌのγ−特異的ヤギ−抗−マウスIgG−ホースラディシュペルオキシダーゼ接合体(Jackson Im muno Research Laboratories，Inc.，Westgrove，PA)と共に振盪しながら、１時間インキュベートした。２回目のPBST洗浄の後、50mMのリン酸−クエン酸緩衝液、0.03％過硼酸ナトリウム(pH5.0)（Sigma Chemical，St．Louis，MO）中、１mg ／mlのＯ−フェニレンジアミン溶液100μｌの添加に続いて、振盪しながら30分間、色彩を展開せしめた。反応を、４ＮのH₂SO₄50μｌの添加により急冷した。色の強度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、490nm及び540nmでの吸光度を測定することによって決定した。490nmで2.6以上の吸光度を、540nmの読取りにより訂正した。サンプル値は、三重反復試験の平均±標準偏差である。対照値は、二重反復試験の平均である。ウェスターンブロット分析ウェスターンブロット分析を、標準的方法を用いて行なった。血清フリーのスペント培地を、Centricon 10(Amicon，Inc.，Beverly，MA)を用いて10倍に濃縮し、そして12％のゲル(Bio-Rad，Inc.，Melville，NY)を用いてのSDS／PAGEにかけた。分析目的のために、SDS／PAGEを、８〜25％のグラジエントゲルを用いてのPharmacia Phast System上で行なった。電気泳動の後、タンパク質をニトロセルロース膜上に移し、そしてPBS中２％脱脂ドライミルクにより４℃で一晩ブロックした。ブロットをすすぎ、次に一次抗体（腹水による１：1000の希釈度、又は１μｇ／mlの精製されたmAb又はポリクローナルAb）と共に22℃で１時間インキュベートした。次に、ブロットを洗浄し、そして二次抗体（ヤギ抗−マウス− HRP又はヤギ抗−ウサギHRP，１：500，Jackson Immunosearch Laboratories，In c.，West Grove，PA）と共に45分間インキュベートした。免疫反応性バンドを、 DAB(Sigma，St．Louis，MO)及びH₂O₂を用いてブロットを展開することによって、又はECL(Amersham，Buckinghamshire，England)システムを用いることによって、製造業者の説明書に従って、検出した。共有結合複合体の形成共有結合複合体の形成について試験するために、0.175μＭのhK２を、100mMの硼酸緩衝液において20μＭのインヒビターと共にpH ８でインキュベートした。試験されるインヒビターは、１−抗キモトリプシン、１−抗トリプシン、１−抗プラスミン、抗トロンビン及び２−マクログロブリンであった。５μｌのhK２（10μｇ／ml）に、100mMの硼酸緩衝液において調製された、計算されたμｇのインヒビターを添加し、そして必要なら、個々のサンプルを、10μｌの合計体積にした。サンプルを37℃で３時間インキュベートし、これに、35％の２−メルカプトエタノールを含む７×Phast System SDSサンプル緩衝液1.5μｌを添加し、そしてサンプルを水浴において３分間、煮沸した。サンプルを、SDS／PAGE及びウェスターン分析に適用する前、SDSサンプル緩衝液に１／４に希釈した。ペプチド基質のタンパク質分解ペプチド基質を分解するhK２の能力を決定するために、ペプチドを10mg／mlで DMSOに溶解し、次にPSA，hK２又はトリプシンを含む100mMの硼酸緩衝液（pH８）に１：10で希釈した。典型的な実験は次の通りに実施された：１μｌのペプチドを、100mMの硼酸緩衝液７μｌに添加し、そして次に２μｌのhK２（10μｇ／ml ）、PSA（500μｇ／ml）又はトリプシン(0.5μｇ／ml)を添加した。一般的に、サンプルを37℃で16時間インキュベートした。サンプルを0.2％ TFA／水100μｌにより急冷し、そしてその急冷されたサンプルを、AS100オートサンプラー、二重1350ポンプ及びBiodimonsion走査UV−VIS検出器を備えたBioRad Model 800 HPLCに組合わされたVydac C-18逆相カラムに直接的に適用した。溶媒Ａは0.1％ TFA／水であり、そして溶媒Ｂはアセトニトリル含有0.1％ TFAであった。サンプルを、90％溶媒Ａに適用し、そしてそのグラジエントを、10分で、60％溶媒Ｂまで展開した。吸光度を、220nm及び280nmで同時にモニターした。 HPLC上で集められたピークを真空遠心分離又は凍結乾燥により濃縮し、そして個々のフラグメントを同定するためにアミノ酸配列決定器に適用した。いくつかの場合、10μｌの急冷されたサンプル混合物を急冷膜に直接的に適用し、そして、配列は知られているので、切断部位を、個々のサイクルに存在するアミノ酸の分布から決定した。色原体基質を用いてのプロテアーゼアッセイパラ−ニトロニトリル誘導体化された基質の加水分解を測定するためのアッセイを、プログラムされ、サーモスタット調温された７−位細胞ホルダーを備えた HP8452A UV−VIS分光計を用いて誘導体化した。アッセイを100mMの硼酸ナトリウム（pH８）において行ない、37℃でインキュベートし、その吸光度の上昇を405n mでモニターした。メトキシスクシニル−Arg−Pro−Tyr−パラニトロアニリド(M eO−Sur−Ｒ−Ｐ−Ｙ−pNA)及びＨ−Ｄ−pro−phe−arg−パラ−ニトロアニリド (Ｄ−Ｆ−Ｒ−pNA)は、アッセイにおいて１mMであった。標準のFust Moc化学を用いるABIモデル431Aペプチド合成機を用いて、図16に列挙されるペプチドのすべてを合成したが、但し、＃２のアンギオテンシノーゲン及び＃５のSigmaから得られたインシュリンの酸化されたβ−鎖を除いた。個々の合成されたペプチドの質量を、ES／MSを用いて質量分析法(Unirersity of M ichigan，Core Facility)により確かめた。上記ABIモデル477a配列決定機を用いてペプチド配列を確かめた。 phK２^V217からhK２^V217への転換５mMの硼酸ナトリウム中、100〜400μｇ／mlのphK２^V217のサンプルを、１％（ｗ／ｗ）のトリプシン又はhK２と共に37℃でインキュベートした。プロから成熟への転換を、1.2μｇのhK２^V217開始材料の100μｌのHIC緩衝液Ａへの希釈、及び上記のようなHIC −HPLCによる２種の形への分解によりモニターした。phK２^V217と共にhK２^V217 のインキュベーションを同じ態様で実施したが、但し２種の形の比較量が図17Ｂに見られるように一緒にインキュベートされた。例２哺乳類細胞におけるhK２^V217の発現及び精製哺乳類細胞系においてhK２を発現するために、hK２（pphK２）（図２）の完全なコード配列をコードする0.8kbのフラグメントを、PCRを用いて増幅し、ベクターPCRII（TA）中にサブクローン化し、そしていくつかのクローンを単離した。少数のそれらのクローンにおける完全なpphK２挿入体のヌクレオチド配列を決定し、PCR増幅により引き起こされ得たいづれかの突然変異を検出した。２種のクローン、すなわち野生型hK２挿入体を有する１つのクローンTA−hK２、及び変異体hK２挿入体を有する１つのクローンTA−hK２^V217を、さらなる分析のために選択した。TA−hK２^V217は、hK２のアミノ酸残基217でバリン(GTT)によるアラニン(GCT)の保存性置換をもたらす、hK２のコドン650でのＴによるＣの置換を含む（図２）。哺乳類発現ベクターを得るために、TA−hK２及びTA−hK２^V2 ¹⁷ のpphK２の挿入体を、GBMTプロモーターの制御下でプラスミドPGT−ｄ中にサブクローン化し、プラスミドpGThK２及びpGThK２^V217をもたらした（図３）。GB MTプロモーターは、いくつかの調節配列から構成され、そしてアデノウィルスEl aタンパク質(Bergなど．，前記(1992))により活性化される。 pphK２^V217遺伝子の生成物が哺乳類細胞において発現されるかどうかを決定するために、プラスミドpGThK２^V217をAV12−664細胞中にトランスフェクトした。この細胞系は、アデノウィルスタイプ12によりSyrianハムスターに誘発される腫瘍に由来し、そしてアデノウィルスElaタンパク質を発現する。Elaタンパク質は、このプロモーターの制御下での遺伝子生成物の発現をもたらすGBMTプロモーターを活性化する。２〜３週後、MTX−耐性クローン細胞を単離し、そしてそれらのスペント培地をウェスターンブロットにより分析した。抗−pphK２抗血清に対して免疫反応性のポリペプチドを培地中に分泌するいくつかのクローンを同定した。１つのクローン（AV 12−pGThK２^V217＃２）を、さらなる特性決定及びタンパク質精製のために選択した。 hK２ポリペプチドを精製するために、AV12−pGThK２^V217クローン＃２からの血清フリーのスペント培地を、７日後に集め、濃縮し、そしてアニオン交換クロマトグラフィー処理にかけた（図４Ａ）。hK２活性のピークは、ELISAアッセイにより決定される場合、約0.2ＭのNaClで溶出した（点線）。ELISAアッセイは、同じ画分においてSDS／PAGEにより見出される約34KDのバンドのタンパク質の出現と十分に相互関係した。アニオン交換カラムからのhK２−陽性画分を集め、そして疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)により処理した（図４Ｂ）。Ａ₂₈₀の主要部分は、HICカラム上に保持されなかった。22分で溶出した、HIC上に保持された主要ピークはまた、ELISAアッセイにより活性の最高のピークを示した（点線、図４Ｃ）。約34K Dでの主要タンパク質バンドもまた、SDS−PAGEにより観察した。HICからの22分でのピークをSECにより分解する場合、典型的には、タンパク質Ａ₂₈₀の約80〜90 ％が、19.4分、すなわち約34KDのタンパク質と適合する保持時間で溶出した（図４Ｃ）。16.7分で溶出する、SES上の唯一の他のタンパク質ピークは、前の精製段階において観察される約70KDのタンパク質に対応した。精製されたタンパク質をさらに同定するために、前記タンパク質の約2.5μｇを自動Ｎ−末端分析にかけ、次の配列得た。：Val−Pro−Leu−Ileu −Gln−Ser−Arg−Ile−Val−Gly−Gly−Trp−Glu−。競争配列は、エドマン分解方法により連続的に放されるアミノ酸のプロフィールから明らかではなかった。PSAに対する類似性により、このタンパク質はphK２^V217である。なぜならば、成熟PSA(精液から単離された)の既知の配列は、Ileu−Val−Gly−により開始し、そしてpPSA及びphK２はＮ−末端で余分の７個のアミノ酸を有することが仮定されるからである（図２）。このタンパク質のアミノ酸分析は、phK２^V217の予測される配列と適合するアミノ酸組成を生成した。このphK２ポリペプチドを単離し、そしてmg量で精製した。例３ phK２^V217の特徴化及びhK２^V217の生成例２に使用される精製スキムの効率を試験するために、1.5μｇの精製されたp hK２^V217を、β−メルカプトエタノール(BME)の存在又は不在下でSDS／PAGEにかけ、そしてゲルを銀により染色した。結果は、サンプル中のphK２^V217が約95％の純度であることを示した（図５）。それはまた、phK２^V217がBMEの不在下で約 30KD及びBMEの存在下で約34KDで移動することを示した。このパターンは、精液から精製されたPSAに関して観察されるパターンに類似する（図５）。 cDNA配列から推定される、hK２のアミノ酸配列は、残基78（Ｎ−Ｍ−Ｓ）での１つの可能性あるＮ−結合グリコシル化部位の存在を示す。この部位がグリコシル化されるかどうかを決定するために、phK２^V217をSDS／PAGEにかけ、ニトロセルロース紙に移し、ジゴキシゲニン(DIG)−結合レクチン、続いてホースラディシュペルオキシダーゼラベルされた抗−DIGと反応せしめた。図６（レーン１）においては、２μｇのphK２をコンカナバリンＡ（Con Ａ）により染色し、タンパク質における２種の置換されていないか又は２−Ｏ−置換されたα−マンノシル残基の存在を示した。レーン２は、陽性対照の糖タンパク質ZCEO25mABのCon Ａ染色を示す。このmAbのＨ鎖（50KD）及びＬ鎖（25KD）の両者は、マンノースコアを有するＮ−結合オリゴ糖を含むことが知られている。レーン３は、グリコシル化されていないタンパク質(BSA)がCon Ａレクチンと反応しないことを示す。phK２^V217はまた、RCA（Galｂ１−４GleNAc特異性）及びAAA (α（１−６）結合されたフコース特異性)とも反応した。このレクチン反応性のパターンは、複合体Ｎ−結合オリゴ糖の存在と一致する。phK２^V217に基づくオリゴ糖はまた、シアル酸も含む。なぜならば、SNA(ガラクトースにα（２−６）結合されるシアル酸)及びMAA(ガラクトースにα（２−６）結合されるシアル酸) の両者がphK２^V217と反応性であったからであった。 hK２のプロ領域の配列は、VPLIQSRである。このプロ配列におけるアルギニンのカルボキシ末端での酵素分解は、phK２をhK２に転換する。弱いトリプシン消化は、この位置での精製されたphK２^V217のペプチド結合の加水分解を進行せしめた。phK２^V217を１％トリプシンと共にインキュベートし、そしてその転換をH IC−HPLCによりモニターした（図７）。この方法は、hK２^V217へのphK２^V217の完全な転換をもたらした。hK２^V217と称するピークをＮ−末端配列決定し、そしてhK２の成熟形についてＮ−末端である配列IVGGWEから開始することが示された。上記以外の配列は検出されず、このことは、この弱いトリプシン処理がいかなる有意なレベルの非特異的分解ももたらさないことを示す。トリプシン処理されたサンプルのSDS／PAGEは、小さいが、しかし識別できる移動度の上昇を示し、これは一般的に、826ドルトンの質量、すなわちプロペプチドの質量の少々の低下と一致した。例４ hK ２−特異的Absの生成 phK２^V217及びhK２^V217を、hK２に対するmAbを生成するために免疫原として使用した。ハイブリドーマを、hK２^V217又はphK２^V217との高い反応性、及びPSAとの最少の反応性に基づいてスクリーンした。このハイブリドーマから得られるmA bの代表は表２に示される。phK２^V217による免疫化は、mAb HK1G586.1及びHK1G4 64.3をもたらした。HK1G586.1は、それがphK２^V217及びhK２^V217の両者を認識するが、しかしPSAを認識しないので、hK２−特異的であった。他方では、HK1G464 は、それがphK２^V217のみを認識し、そしてhK２^V217又はPSAを認識しないので、 phK２−特異的であった。表２ hK２^V217及びphK２^V217に対して生じさせた種々のmAbの特異性Ａ．phK２^V217に対して生じさせたmAb Ｂ．hK２^V217に対して生じさせたmAb hK２^V217による免疫感作は、mAb HK1H247をもたらした。このmAbは、それがhK ２^V217のみを認識するがしかしphK２^V217又はPSAを認識しないので、hK２−特異的であった。この結果は、phK２^V217及びhK２^V217が、hK２の異なった形に対して特異的なmAbを生成することにおいて、免疫原として有効であることを示す。ウェスターンブロット分析を用いて、HK1G586が精液中のhK２を認識するかどうかを試験した（図８）。約22KD，33KD及び85KDでのhK２−免疫反応性バンドを、このmAbにより認識した。精液における類似するhK２−免疫反応性パターンがまた最近、Deperthesなど．，Biochem．Biophy．Acta，1245，311(1995)により報告されている。この結果は、hK２^V217に対して生じさせたmAbが精液中の生来のhK２を認識することを示す。hK２^V217又はphK２^V217に対して生じさせたすべての抗体はまた、hK２及びphK２がそれぞれhK２^V217及びphK２^V217に免疫学的に類似することを示す、hK２及びphK２のその対応する形も認識した（下記参照のこと）。追加の抗−hK２抗体(Abs)を調製するために、ヒトカリクレイン遺伝子ファミリーのメンバーとコンピューター助力の抗原性及び疎水性分析との間の直接的な一次構造比較を行なった。この比較から、いくつかのhK２オリゴペプチド配列を選択した。選択されたhK２ペプチドは、成熟hK２アミノ酸残基８〜26（配列番号 19）、15〜26 （配列番号26）、41〜56（配列番号20）、43〜66（配列番号24）、153〜167(配列番号21)、17〜71（配列番号22）及び210〜235(配列番号25)に対応する。アミノ酸17〜71に対応するペプチドを、hK２の生来の形を認識する抗体を生成する傾向を高めるために合成した。前記ペプチドを合成し、そしてMayo Clinic／Found ationでのProtein Core FacilityにおいてHPLC精製した。ペプチドを、それぞれ免疫原及びアッセイ試薬のためにキーホールリンペット（カサガイ）のヘモシアニン(KLH)及びBSAにより接合せしめた。羊、ヤギ及びマウスを、ポリクローナル（羊及びヤギ；それぞれ配列番号20及び21、並びに配列番号19，20，21，24，25 及び26）及びモノクローナル（マウス；配列番号19，20，21，24，25及び26）抗体生成のためにKLH−hK２ペプチドにより免疫化した。17〜71ペプチド（配列番号22）を酸化し、cys 26と42との間に分子間ジスルフィド結合を生成し、そしてそれぞれポリクローナル及びモノクローナル抗体生成のためにヤギ及びマウスを免疫化するために使用した。羊からのhK２ 41〜56Abをまず、hK２ 41〜56ペプチド−親和性カラムにより精製し、そして次に、ウェスターンブロット分析のために使用した。その抗体は組換えhK２を認識した。hK２ 41〜56AbによるhK２の検出は、過剰のhK２ 46〜 56ペプチドの添加により完全に破壊されたが、しかしPSA 41〜56ペプチドによっては破壊されなかった。さらに、モノクローナル抗−hK２ 41〜56ペプチド抗体は、ウェスターンブロット分析においてhK２タンパク質に対して高い特異性を有した。抗−hK２ 153−167ペプチド抗血清（羊）は、組換えhK２を認識した。それらの結果は、ペプチド41〜56及び153〜167に対する抗体がhK２ポリペプチドにおける２つの明確なエピトープと反応することを示した。 hK２アミノ酸残基210〜235に対する抗血清は、最高の免疫反応性を示した。 PSAの対応する領域と69％の相同性を有する、hK２ペプチド17〜71に対して生ぜしめられたヤギ抗血清は、組換えhK２タンパク質を認識するが、しかしPSAを認識しなかった。 PSA及びhK２の両者を認識する、細菌により発現された組換えhK２タンパク質に対するウサギ抗血清は、アンドロゲンにより処理されたLNCaP細胞からの濃縮されたLNCaP細胞培地においてダブレットのタンパク質バンドを検出した。対照的に、免疫反応性タンパク質は、アンドロゲンにより処理されなかったLNCaP細胞からのLNCaP細胞培地において検出されなかった。従って、免疫反応性タンパク質は、アンドロゲンにより誘発された。さらに、LNCaP培地における上方のバンドは、PSA−特異的抗血清（細菌により発現された組換えPSAに対して生ぜしめられたウサギ抗−PSA抗血清）が主に上方のバンドを検出するので、PSA−関連タンパク質である。LNCaP培地における下方のバンドは、hK２に対して特異性を有さないhK２ 41〜56ペプチドに対するマウスモノクローナル抗体が下方のタンパク質バンドを認識するので、hK２−関連タンパク質である。それらの結果は、ダブレットバンドにおける個々のタンパク質のＮ−末端アミノ酸の配列分析により確かめられた。 hK２ペプチド41〜56(HK1A523)に対するモノクローナル抗体を使用するパラフィン−包埋されたヒト前立腺組織断片（例10を参照のこと）の免疫組織化学研究は、PSAのようなhK２が上皮において生成されるが、しかし支質においては生成されないことを示した。さらに、免疫染色は、試験された他の組織がhK２に対して陰性であったので、前立腺におけるhK２タンパク質に対して特異的である。例５哺乳類細胞におけるhK２の発現哺乳類細胞において野生型hK２（hK２）を発現するために、pGThK２（図３）を、AV12細胞中にトランスフェクトした。hK２ポリペプチドを発現するいくつかのクローンを、HK1D106.4(hK２のアミノ酸残基17〜71に対応するポリペプチドに対して生じさせたhK２−特異的mAb)を用いてウェスターン分析により同定した。クローンAV12−hK２＃27（AV12−hK２）を、そのより高いhK２発現レベルに基づくさらなる分析のために選択した。ベクターのみ(βGTD)によりトランスフェクトされた細胞は、HK1D106.4との反応性を示さなかった。 HK1D106.4mAbを用いてのELISAは、７日目で、AV12−hK２の血清フリーのスペント培地における約0.5〜１μｇ／mlのhK２ポリペプチドの存在を示した。AV12 −hK２^V217からのphK２^V217の精製に使用される同じ方法を用いて、AV12−hK２の７日目のスペント培地からhK２ポリペプチドを精製した。これは、精製工程において不安定であった、精製されたhK２ポリペプチドの低収率をもたらした。 hK２ポリペプチドを、上記方法を用いて部分的に精製し、SDS／PAGEにかけ、電気ブロットし、そしてＮ−末端アミノ酸配列決定にかけた。この分析は、７日目でのAV12−hK２のスペント培地中のhK２ポリペプチドが、Ｎ−末端で配列IVGG WECEKを有することを示した。競争配列は、エドマン分解方法により連続的に放されるアミノ酸のプロフィールから明らかではなかった。PSAに対する比較により、この配列は成熟hK２（hK２）に対応する。このタンパク質のアミノ酸分析はまた、hK２のその分析とも一致した。この発見は、phK２^V217が７日目でAV12−hK2V²¹⁷の血清フリーのスペント培地に優先的に存在し、そしてhK２は７日目でAV12−hK２の血清フリーのスペント培地に優先的に存在することを示す。１日目で、AV12−hK２の血清フリー培地に存在するhK２の形を試験するために、この材料を、HK1G586.1mAbを用いて親和性精製により部分的に精製した。34KDのタンパク質をPVDF中に移し、そしてＮ−末端分析にかけ、配列VPLIQSRIVGGを生成した。競争配列は、エドマン分解方法により連続的に放されるアミノ酸のプロフィールから明らかではなかった。PSAと比較する場合、この配列はphK２に対応する。これは、hK２ポリペプチドが、AV12−hK２及びAV12−hK２^V217細胞の両者によりプロ形として分泌されることを示す。しかしながら、phK２^V217は安定し、そしてhK２^V217に転換されないが、phK２は不安定性であり、そして細胞外的にh K２に容易に転換されない。例６ hK ２の生合成哺乳類細胞におけるhK２の生合成をさらに研究するために、時間経過研究を実施し、ここでAV12−hK２クローン＃27からの血清フリーのスペント培地を、８日間連続して、個々の日に集め、濃縮し、そしてSDS／PAGEにかけた。タンパク質をニトロセルロース膜に移し、そしてHK1D106.4又はHK1G464.3mAbによりプローブした（図９）。図９に示されるように、HK1D106.4は、phK２及びhK２の両者を認識し、他方、HK1G464.3は、そのエピトープがhK２の−７〜＋７の領域に存在するので、phK２のみを認識する。hK２ポリペプチド（約34KD）の発現は、HK1D1 06.4mAbにより検出した場合、３日目までにピークになり、そしてその後、平坦になった。約70KD及び約90KDで移動する２種の他の免疫反応性バンドもまた、４日目以後、検出された。他方では、同じサンプルがブロットされ、そしてHK1G464.3によりプローブされる場合、hK２のレベルが徐々に低下することが４日目までに検出された。８日目までに、非常に低いレベルのhK２がスペント培地に見出された。この結果は、phK２がAV12−hK２細胞により培地中に分泌され、そして細胞外でhK２に徐々に転換されることを示す。奇妙なことには、70KD及び90 KDのバンドがHK1G464.3mAbにより観察されず、このことは、それらのバンドがhK ２のホモ−オリゴマーであるか、又はまだ未知のタンパク質と共有結合複合体化されるhK２であるかのいずれかを示す。それらのバンドの正体がこの時点で知られていなくても、それらはスペント培地におけるhK２の存在のためのマーカーとして作用することができる。図９においては、精製されたphK２^V217及びhK２^V21 ⁷ タンパク質が対照として使用された。 AV12細胞におけるhK２^V217の生合成を研究するために、類似する時間経過研究を、AV12−hK２^V217クローン＃２に対して実施した。図10に示されるように、hK ２^V217ポリペプチドの発現は３日までにピークになり、そしてHK1D106.4mAbにより検出する場合、４日目以後、ほとんど変化しなかった。類似する結果が、ブロットがHK1G464.3mAbによりプローブされる場合に得られた（図10）。これは、AV 12−pGThK２^V217クローン＃２細胞が１日目以後、phK２^V217を発現し、そしてその後、少なくとも８日間、このタンパク質は成熟形に転換されないことを示した。それらの結果は、８日間培地に存続する場合、hK２に転換されるphK２の結果と対照をなし、このことは、phK２^V217が37℃で８日間、培地において安定することを示す。 phK２のhK２への細胞外転換が培養物におけるAV12−hK2クローン＃27細胞の生存率と相互関係するかどうかを研究するために、クローン＃27細胞を、トリパンブルー排除を用いて計数した。スペント培地中のhK２の発現を、HK1D106.4及びH K1G464.3mAbの両者を用いてELISAにより測定した。図11に示されるように、生存細胞の数は、３日目までに培養物において3800万でピークになり、そしてその後、徐々に低下した。 phK２の発現（HK1G464.3により測定される）もまた、３日目までにピークになり、そしてその後、徐々に低下した。他方では、hK２の発現（HK1D106.4により測定れさる）は、３日目までにピークになるが、しかしその後、平坦になった。この結果は、phK２がAV12−hK2細胞から分泌され、そしてその画分が４日目までに、hK２に徐々に、細胞外で転換されることを示す。さらに、それは、phK２のhK２への転換が細胞生存率の低下と相互関係することを示し、このことは、死亡細胞により放出される細胞外プロテアーゼがこの転換を担当する要因の１つであり得ることを示す。hK２の発現は、細胞が最とも生存している点で最高であった。hK２の低下は、細胞生存率の低下と平行し、このことは、hK２が、細胞の死及び溶解に続いて放出されるのと対照的に、それらの細胞により分泌されることを示す。また、hK２の上昇は、phK２の低下に対応し、このことは、hK２のプロ形が時間にわたって、成熟形に自動的に転換されたことを示す。前立腺癌細胞におけるhK２の生合成を試験するために、hK２をDU145及びPC３細胞系において発現した。pphK２をコードするDNAを、それぞれCMV及びSV40プロモーターの制御下で、プラスミドpLNCX及びpLNSX(Miller and Rosman，Bio Tech niques，７，980(1989))中にクローン化した。得られるプラスミド、pLNC−hK2 及びpLNS−hK２を、それぞれPC３及びDU145細胞中にトランスフェクトし、そしてクローンを、G418を含む培地において選択した。高レベルのhK２を発現するクローンを、ELISA及びウェスターンブロットにより選択した（PC３−hK２及びDU1 45−hK２）。培地中のhK２及びphK２のレベルを評価するために、PC３−hK２及びDU145−hK 2細胞の血清フリー培地を、HK1Dl06.4(hK２−特異的)及びHK1G464.3（phK２−特異的）mAbを用いて、ウェスターンブロット分析にかけた（図12）。結果は、phK ２がDU145−hK2及びPC３−hK２の両者のスペント培地に存在することを示した。これは、前立腺癌細胞において、hK２がphK２として分泌され、そして成熟形に細胞外で転換されることを示す。この発見は、AV12細胞により前に得られた結果を確認するものである。phK2は７日後でさえ、PC3−hK2細胞のスペント培地に優先的に検出されるが、しかしながら、hK２は１日目から出発して、DU145−hK2の血清フリー培地に優先的に存在した。これはたぶん、DU145スペント培地における多くの細胞外プロテアーゼのためである。上記結果が１つのクローンに制限されるかどうかを試験するために、AV12−hK ２の３種の他の独立して単離されたクローン、及びAV12−hK２^V217の４種の他の独立して単離されたクローンを、hK２ポリペプチドの発現について試験した。クローンの血清フリーのスペント培地を７日目で集め、そしてHK1D106.4(hK２−特異的)及びHK1G464（phK２−特異的）mAbを用いて、ウェスターンブロットにより hK２の発現について試験した（図13及び14）。すべてのAV12−hK２クローンにおいて、HK1D106.4mAbは主要34KDバンド（“hK２”）のみならず、またhK２の存在の表示である70KD及び90KDバンドを検出した（図13）。HK1G464.3は、すべてのA V12−hK2クローンにおいて、非常に低いレベルのphK２を検出した（図14）。この結果は、hK２がすべてのAV12−hK2クローンのスペント培地に優先的に存在することを示し、このことは、AV12−hK２＃27クローンのために確立された生合成機構を立証した。同じ分析をAV12−hK２^V217クローンに対して使用した（図14）。結果は、phK２^V217のみが７日目でそれらのクローンのスペント培地に存在することを示し、このことは、AV12 −hK２^V217クローンに関する本発明者の知見を立証するものである。上記結果は、hK２が啼乳類細胞においてプロ形として発現され、そしてまだ未知であるプロテアーゼにより成熟形に、細胞外で転換されることを集合的に示唆する。それらの結果はまた、phK２が生物学的流体に存在し、そして従って、pCa 及びBPHのための有用な診断マーカーであり得ることも示唆する。例７ hK ２及びhK２^V217の酵素活性及び特異性少量のhK２を、その酵素活性及び基質特異性を決定するために十分な純度に精製した。hK２の一般的な活性を、ｐ−ニトロアニリド誘導体に対するポリペプチドのそのアミド分解活性を色原体的に決定することによって測定した（表３）。それらの基質のタンパク質分解消化により放出されるｐ−ニトロアニリドを、吸光度Ａ₄₀₅で測定する。基質メトキシスクシニル−Arg−Pro−Tyr−パラ−ニトロアニリド(MeO−Suc−Ｒ−Ｐ−Ｙ−pNA)を用いて、フェニルアラニンで切断するキモトリプシン様プロテアーゼを測定した。この基質は、PSAの活性を測定するためにこれまで使用されて来た（Christenssonなど.，Eur．J．Biochem.，194， 755(1990)）。基質Ｈ−Ｄ−Pro−Phe−Arg−パラ−ニトロアニリド(Ｐ−Ｆ−Ｒ −pNA)は、アルギニン（Ｒ）で切断するトリプシン様プロテアーゼに対して特異的である。 hK２はＰ−Ｆ−Ｒ−pNAに対してhK２^V217よりも10倍高い全体活性を有することが見出され、そしていづれのタンパク質も、MeO−Suc−Ｒ−Ｐ−Ｙ−pNA、すなわちキモトリプシン基質を加水分解する能力を示さなかった。トリプシン様切断部位（リジン、アルギニン）を含む他の比較できる基質をまた試験し、そしてhK２が最高の速度で基質Ｐ−Ｆ−Ｒ−pNAを加水分解することが見出された。それらの発見は、hK２がトリプシン様活性を有することを示す。表３色原体基質に対するhK２，hK２^V217，PSA及びトリプシンのアミド分解活性 hK２及びhK２^V217の特異性を、ペプチド結合が加水分解されているかどうかを決定するためのＮ−末端アミノ酸配列分析と共に、ペプチド基質の使用により、より詳細に試験した。図15は、可能性あるトリプシン及びキモトリプシン切断部位の両者を有するポリペプチド：CALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAANに対するアミド分解活性を示す。hK２^V217は、キモトリプシン様分解に対して２：１の比でのトリプシン様分解を伴って、トリプシン（Ｒ−Ｋ）及びキモトリプシン（Ｙ−Ｒ）部位の両者で切断した。それらの実験における対照として、phK２^V217がまた、このペプチドと共にインキュベートされ、そしてアミド分解活性を示さなかった。hK２は、このペプチド基質に対して、hK２^V217よりも異なった特異性を示した。キモトリプシン様特異性は、この基質に対してhK２に関して見出されず、そしてその活性はトリプシン様部位（Ｒ−Ｋ）に対して限定的であった。このポリペプチドにおける他のリジン（Ｋ）残基のどれも加水分解されず、このことは、hK２の特異性がアルギニン（Ｒ）残基に対して特異的であることを示した。対照として、トリプシンがまた、基質に対して研究され、そしてすべてのリシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）部位を切断したが、但しトリプシン切断のために適切な部位であることが知られていないＫ−Ｐ結合を切断しなかった。トリプシンは、hK２よりも約４倍早い速度で、及びhK２^V217よりも約4000倍早い速度で21 0〜236基質（ペプチド＃１、図16）のＲ−Ｋ−部位を切断した。キモトリプシン様結合はトリプシンにより切断されなかった。PSAはＹ−Ｒ結合を主に切断した。Ｒ−Ｋ結合に対するマイナーなトリプシン様活性がまた、PSAについても見出された（図15）。これは、色原体基質に対するPSAに関して、前で見出されたマイナーなトリプシン様活性と一致した（表２）。いくつかの他のペプチド基質をまた、hK２及びPSAと共にインキュベートした（図16）。試験されたすべてのペプチドにおいて、hK２は選択されたアルギニンのためにのみ特異性を有し、そしてPSAは選択されたチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）及びロイシン（Ｌ）残基のために主に特異性を有した。図16におけるペプチド＃１のみが、図15におけるクロマトグラムにより詳細されるように、hK２^V217により切断された。例８ hK ２によるphK２^V217の活性化図16におけるペプチド＃３の配列は、phK２のアミノ酸残基−７〜＋７に対応する。この領域は、phK２^V217においてＮ−末端リーダーペプチドとして見出されるプロペプチドVPLIQSRを含む。上記で言及されたように、hK２はこのペプチドを切断でき、プロペプチド領域を開放するが、しかしhK２^V217はそのようなことができなかった。hK２が生来の基質に対するプロ配列を切断できるかどうかを証明するために、phK２^V217をhK２^V217に転換する能力をモニターした。phK２^V217を１％ hK ２と共にインキュベートし、そしてその転換をHIC−HPLC方法によりモニターした（図17A）。結果は、hK２が、トリプシンよりも約30倍遅い速度にかかわらず、phK２^V217をhK２^V217に転換できたことを示した。phK２^V217が40％のhK２^V217 と共にインキュベートされる場合、２つのhK２形の割合の差異は、６時間後でさえ、検出されなかった（図17B）。これは、ペプチド基質に関する前の観察を確証し、そして生来の基質に対してさえ、hK２のみがhK２のプロ領域を切断し、そしてhK２^V217はその領域を切断しなかったことを示した。それらの結果は、延長されたインキュベーションに対してのphK２^V217及びhK ２^V217の安定性を集合的に示す。hK２^V217と比較される場合、hK２は、図15におけるプロペプチドに対する活性及び図17におけるphK２^V217に対するその活性により示されるように、より高いタンパク質加水分解活性、高い程度の特異性、及び特に、hK２のプロ形に対する特異性を有することが示された。それらの結果は、hK２とhK２^V217との間の酵素活性の有意な差異を示し、そしてphK２^V217と比較して、培地からhK２を精製する試みに関連する低い収率の説明を助けることができる。より高度に精製されたhK２の調製物は、他の活性プロテアーゼのために見出されるように自己分解のために不安定である。それらの結果はさらに、免疫学的試験の他に、hK２−特異的基質に対する酵素活性が体液中のこのタンパク質のレベルをモニターするために使用され得ることを示唆する。例９ hK ２とのインヒビター複合体の形成 PSAは、α２マクログロブリン（MG）、及びセリンプロテアーゼインヒビター、すなわち抗キモトリプシン(ACT)と複合体を形成することが示されている。その複合体形成を調査するために、hK２を、ヒト血漿に存在する一連の通常のプロテアーゼ(ACT，α２−抗プラスミン、抗トロンビンIII及びα１−抗トリプシン( Travis and Salvesen，Ann．Rev．Biochem.，52，655(1983))と共にインキュベートし、そしてその混合物をウェスターンブロットにより分析した（図18）。それらのセリンとhK２とのいづれかの共有複合体は、還元条件下でSDS／PAGEに基づいて約80〜100KDのバンドをもたらすべきである。 ACT及びα２−抗プラスミンは、hK２との有意な複合体を形成した（図18、レーン１及び２）。抗トロンビンIII（レーン３）及びα１−抗トリプシン（α１プロテアーゼインヒビター、レーン４）は、hK２との検出できる複合体を形成しなかった。MG、すなわち血液血漿の主成分はまた、hK２と急速に複合体化した（レーン５）。この複合体は約200KD及び120KDのMrに相当し、それらはまた、PSA が精製されたMGと共にインキュベートされる場合に形成された（図18、レーン８、下記を参照のこと）。hK２が、このタンパク質が広範囲のトリプシン様プロテアーゼを阻害する場合でさえ、α１−抗トリプシンとの複合体を形成しなかったことは、特に興味深いことであった(Loebermannなど.，J．Mol．Biol.，177，53 1（1984）；Carrell and Travis，TIBS，10，20(1985))。 hK２が、このタンパク質がそのインヒビター活性部位にアルギニン残基を有するので、α２−抗プラスミンとの複合体を形成することは、驚くべきことではなかった（Hunt and Dayhoff，Biochem．Biophy．Res．Comm.，95，864（1980）； Chandraなど.，Biochemistry，22，5055（1983）；Potempa，など.，Science，2 41，699（19 85）；Shiehなど.，J．Biol．Chem.，264，13420（1989）；Mastなど.，Biochem istry，30，1723(1991)）。しかしながら、ATCがそのインヒビター活性部位にロイシンを有するので、hK２がACTとの複合体を形成するであろうことは、また予測されなかった。明確には、PSAとhK２との間の構造類似性は、それらのタンパク質分解特異性が図16及び表２に示されるように、完全に異なる場合でさえ、通常のインヒビターとのそれらの複合体形成に影響を及ぼす。ヒト女性血清中にスパイクされる場合、hK２は、ウェスターンブロットにより検出されるように、MGとの急速な複合体を形成した（図18）。レーン１及び３は、それぞれhK２及び血清のみの対照である。レーン２は、90KDのhK2−ACT複合体及び残留hK２を示す、ACTと共にインキュベートされたhK２である。レーン４及び５は、それぞれ15分及び１時間、血清中にスパイクされたhK２である。レーン６は、精製されたMGと共に４時間インキュベートされたhK２である。レーン７は血清中に15分間スパイクされたPSAであり、そしてレーン８は精製されたMGと共に４時間インキュベートされたPSAである。それらの結果は、MGが、hK２又はPSAがインビトロ実験においてヒト血清中にスパイクされる場合に形成される主要hK２又はPSA複合体であることを示す。ACT とのPSA複合体は前立腺疾病を有する患者の血清において生じることが知られているので、血清中に存在するhK２はまた、あるレベルのACT複合体を形成すると思われる。論議 PSA又はhK２のためのインビボタンパク質プロセッシング及び分泌機構は知られていない。本明細書に示される結果は、phK２がAV12−hK２，DU145−hK２、及びPC３−hK２細胞により分泌されることを示し、これは、hK２が通常、phK２として分泌され、そしてペプチドが細胞外で切断されることを示唆する。これは、phK２が生物学的流体に存在し、そして従って、pCa又はBPHのための有用な診断マーカーであり得ることを示す。 hK２（hK２^V217）の成熟形及びhK２の野生型の両者が、AV12細胞から精製された。hK２は、使用される精製方法に対して非常に不安定であり、これは、他のプロテアーゼにより見出されるように、その自己分解性質のためであり、そして免疫原及び検量体としての使用のために十分な量でのhK２又はphK２の精製を非常に困難にする。対照的に、phK２^V217は、非常に安定しており、そしてトリプシン消化によりhK２^V217に転換され、これはまた安定している。精製されたphK２^V ²¹⁷ 及びhK２^V217は、hK２及びphK２に対して特異的なmAbを生成するために免疫原を供給した。例10 前立腺組織とモノクローナル抗体586との免疫反応性 HK1523との、正常な前立腺組織の免疫組織化学は、上皮における染色を示すが、しかし支質における染色は示さなかった。さらに、hK２発現は、他の組織、たとえば腎臓及び膵臓は染色を示さなかったので、前立腺−特異的である。hK２が前立腺組織に発現され、そしてそうであるなら、前立腺癌と相互関係しているかどうかを決定するために、264個の基本的な前立腺切除検体（そのうち257個は未処理の患者からであり（図20）、そして７個はアンドロゲン奪取療法処理された患者からである（図21））を、比較研究において分析した。個々の検体を、良性上皮、高い程度の前立腺上皮間腫瘍形成(PIN)及び腺癌を有する領域におけるhK ２の細胞質発現について分析した。前立腺組織を、秤り取り、立体的に測定し、そしてインキで染色した。頂部及び基部を４〜５mmの厚さで切断し、そして連続的に、３mmで切断した。残る前立腺を、前立腺の頂部から精ノウの先端まで腺の長軸に対して垂直なナイフにより、４〜５mm間隔で連続的に切断した。横断面を調製し、そしてヘマトキシリン及びエオシンにより染色した。癌及び良性組織を包含する個々の患者の基本的な前立腺切除の単一スライスを、10％の中性緩衝ホルマリンに固定し、そして当業界において良く知られている方法によりパラフィンにより包埋した。スライド上の組織断片を、キシレン及び次に95％エタノールに含浸することによってパラフィン除去した。内因性ぺルオキシダーゼ活性を、メタノール／H₂O₂ に10分間、断片をインキュベートし、そして次に、水道水により断片をすすぐことによって阻止した。次に、断片を10mMのクエン酸緩衝液(pH6.0)に配置し、そして30分間、蒸気処理した。断片を、冷水道水によりすすぐ前、５分間冷却した。非特異的タンパク質結合を、５％ヤギ血清と共に10分間、断片をインキュベートすることによって阻止した。次に、スライドを静かに排水した。 0.5μｇ／mlでの一次抗体、hK1G586又はPSM 773を、室温で30分間、断片に添加し、そして次に、その断片を水道水によりすすいだ。次に、組織断片を、ビオチニル化されたウサギ抗−マウス抗体と共に１時間インキュベートし、そして水によりすすいだ。断片を、ペルオキシダーゼ接合されたストレプタビジン(１：5 00)と共に30分間インキュベートし、次に水道水によりすすいだ。続いて、断片を、水道水によるすすぎの前、15分間、３−アミノ−９−エチルカルバゾール(A BC)色原体溶液と共にインキュベートした。次に、断片を、水銀フリーのヘマトキシリンにより１分間、対比染色し、そして水道水により５分間すすいだ。スライドを、水性固定媒体（グリセロールゼラチン）により固定した。細胞染色の％を、良性上皮、高い程度のPIN及び腺癌のために０％から100％まで10％インクリメントで記録した。良性萎縮性腺は、最少量の染色を、特に炎症領域において示し、ここで実質的に免疫反応性は存在しなかった。萎縮性の証拠を有さない過形成性腺房及び良性腺房においては、中位いの強い免疫反応性が存在し、通常、核のすぐ上部の分泌管腔細胞層において粒状パターンで出現し、しばしば管腔表面まで延長する。基礎をなす腺はしばしば、免疫反応性を示すけれども、尿道又はビバモンタナム(v iva montanum)の尿上皮(uroepithelium)の染色は存在しなかった。基礎細胞は通常、陰性であった。高度のPINを有する検体は、大部分の場合において、細胞質を通して、及び細胞質先端ブレブにおいて強い免疫反応性を示した。PINの異なったパターン間に免疫反応性の明らかな差異は存在せず、但し、末梢に比較される場合、通常、中央部で強さが低下する有孔性パターンを除く。癌検体は、実質的にすべての場合において、強い細胞質反応性を示した。多数の細胞質液胞を有する細胞、印環細胞及びムチンの領域は低い染色性を示し；他方では、細胞質は強く染色された。最高の強度が、実質的にあらゆる場合において免疫反応性を示す最高の程度の腺癌（Gleasonパターン４）において観察された。有孔性癌を有する病巣は、中央よりも末梢においてより高い強度が存在することにおいて、有孔性PINに類似した。癌の末梢端及び先端は常に強い免疫反応性であった。アンドロゲン奪取療法を受けた患者からの７種の検体においては、大部分の良性萎縮性腺房においてほとんど又はまったく免疫反応性は存在しなかったが、しかしPIN及び腺癌は時おり、強い細胞質染色を示した。良性上皮、高度PIN及び腺癌におけるモノクローナル抗体HK1G586による細胞染色の数の要約が表４に示される。対様分析、すなわち良性対PIN、良性対癌、及びPIN対癌は、個々のカテゴリーに関して有意な差異を示した（Ｐ＜0.00）、Spe arman Rank Correlation)。表４ hK1G586 との免疫反応性平均標準偏差％良性上皮 44.3％ 10〜90 高度のPIN 69.1％ 20〜100 腺癌（未処理） 80.0％ 20〜100 従って、前立腺組織における細胞質hK２発現の上昇は、前立腺腫瘍形成及び前立腺癌と相互関連する。アンドロゲン奪取療法処理された患者から得られた前立腺からのデータは小さなサンプルサイズのために統計学的には有意でないが、未処理の患者に対するそれらの患者において、良性上皮、高い程度のPIN及び腺癌におけるhK２発現の低下が存在する。従って、前立腺におけるhK２発現の上昇は、高い程度のPIN及び前立腺癌のための新規マーカーである。例11 前立腺癌細胞におけるhK２RNAのRT−PCR検出前立腺癌の大部分は見分けるのに不十分な段階であるので、組織生検、たとえば前立腺ノウ、骨髄又はリンパ節において、又は生理学的流体、たとえば血液、血清又は精液中に存在するhK２発現細胞を検出することが興味の対象である。そのような検出方法は好ましくは、多数の非hK２発現細胞における単一のhK２発現細胞を検出することができる。好ましくは、前記方法は、少なくとも約10⁴個、より好ましくは、少なくとも10⁶個、又はさらにより好ましくは、10⁷個の細胞を含んで成るサンプルにおける単一のhK２発現細胞を検出することができる。そのような敏感な検出方法を提供するために、hK２転写体に対して特異的な逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)が使用される。Ａ．LNCaP 細胞系 RT−PCRによりhK２−特異的転写体の検出の感度を決定するために、ヒトPSA− 及びhK２−発現LNCaP細胞系の細胞を、バフィーコート（buffy coat）細胞のサンプルに連続的に希釈した。そのバフィーコート細胞を、正常な女性及び男性からの全血から単離した。静脈血液（５〜７ml）を、クエン酸塩−デキストロース管に集めた。サンプルを1000×ｇで、15分間４℃で遠心分離した。バフィーコート細胞を、細胞ペレットの上部から回収した。バフィーコート細胞及びLNCaP細胞の混合物を1,500rpmで５分間、遠心分離し、そしてRNAをペレット化された細胞から抽出した。RNAを、酸性フェノールクロロホルム−グアニジウムチオシアネート方法（Chomczynskiなど.，Anal ．Bioche m.，162 ，156(1987)）により単離した。RNAサンプルを、クロロホルム−ブタノール（４：１；ｖ／ｖ）によりさらに抽出し、残留ヘムを除去し、これにより、逆転写及びポリメラーゼ連鎖反応を阻害することができる。次に、単離されたRN Aを、RNアーゼ−フリーのDNアーゼにより処理した。第１鎖cDNAを調製するために、合計１μｇのRNAを含むアリコートを、100pモルのPSA−特異的オリゴヌクレオチドプライマー（5’TCATCTCTGTATCC3’;配列番号13）、又は100pモルのhK２−特異的オリゴヌクレオチドプライマー（5’GAGTA AGCTCTA3’;配列番号：14）、及びMoleneyネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（GI BCO BRL)を含む逆転写反応に添加し、そして25μｌの最終体積にした（50mMのトリス −HCl，pH8.3，75mMのKCl，３mMのMgCl₂，10mMのジチオトレイトール、0.5mMの個々のdNTP、及び800ＵのMoloneyネズミ白血病ウィルス逆転写酵素）。反応物を 42℃で15分間インキュベートし、そして酵素を95℃で15分間、熱不活性化した。 PSA第１鎖cDNAを増幅するために、10μｌのPSA−特異的オリゴヌクレオチドプライムされた第１鎖cDNAを、PSA−特異的プライマー対を有するPCR（0.2mMの個々のdNTP，0.5ＵのAmpli Taqポリメラーゼ、50mMのKCl，l0mMのトリス−HCl，pH 8.3，1.5mMのMgCl₂，0.1％（ｗ／ｖ）のゼラチン）において増幅した。PSAのPCR は、50ｐモルのPSA−１（5’GATGACTCCAGCCACGACCT3’;配列番号：15）及び50ｐモルのPSA−２（5’CACAGACACCCCATCCTATC3’;配列番号：16）を使用した。hK２第１鎖cDNAを増幅するために、10μｌのhK２ PSA−特異的オリゴヌクレオチドプライムされた第１鎖cDNAを、hK2−特異的プライマー対を含むPCR（0.2mMの個々のdNTP，0.5ＵのAmpli Taqポリメラーゼ、50mMのKCl，10mMのトリス−HCl，pH8. 3，1.5mMのMgCl₂，0.1％（ｗ／ｖ）のゼラチン）において増幅した。hK２ PCRは、50ｐモルのhK２−１（5’GAGGGTTGTGTACAGTCATGGAT3’;配列番号17）及び50ｐモルのhK２−２（5’ACACACTGAAGACTCCTGGGGCG3’;配列番号18）を使用した。使用される循環パラメーターは次の通りであった：94℃で１分；58℃(PSA)又は60℃（hK２）で90秒；及び72℃で90秒の35〜40サイクル。最終サイクルは、72 ℃で10分間であった。反応のアリコートを、1.0％アガロースゲル上で電気泳動した。ゲルを臭化エチジウムにより染色し、そして紫外線下で調べた。いくつかの増幅された生成物をゲルから切出し、そして配列決定のために、pCRIIベクター(Invitragen，San Diego，CA)中にサブクローン化した。 PSA−特異的PCRは、710bpの生成物を生成するが、ところがhK２−特異的PCRは 405bpの生成物を生成した。希釈分析の結果は、PSA及びhK２ RNAがそれぞれ、10⁶ 個及び10⁷個の白血球細胞当たり約１個のLNCaP細胞で検出できた（図22Ａ）。この結果は、RT-PCRがLNCaP−誘導されたPSA転写体よりも10倍高い希釈度でLNCa P−誘導されたhK２転写体を検出したので、予測されなかった。Ｂ．前立腺癌患者前立腺癌を有する６人の患者、及び２人の正常な男性からの血液をRT−PCRにより分析した。淡黄褐色の被膜細胞及び単離されたRNAをすべて８人の男性から得、そしてRT−PCRを上記のようにして実施した。６人の前立腺癌患者は、臨床段階Ｂの前立腺癌を有する１人、既知の転移性疾病（臨床段階Ｄ２）を有する２人、及び病理学的段階Ｃを有する３人を包含した。前立腺癌の病理学的段階Ａ− Ｃは、前立腺癌の形で局在化される。病理学的段階Ｄ１は、結節に拡張する前立腺癌である（結節性転移）。病理学的段階Ｄ２は、全身性（全身性転移）前立腺癌である。前立腺癌の病理学的段階のさらなる記載については、Morenoなど．（ Cancer Res.，52，6110(1992)）；Deguchiなど．（Cancer Res.，53：5350(1993 )）；及びkatzなど．（Urology，43，765(1994)）を参照のこと。前記結果は、前立腺癌患者の67％がhK２を発現し、17％がPSAを発現し、そして17％がhK２及びPSAの両者を発現した。検出できるレベルのPSA又はhK２ RNAは、正常な対照において見出されなかった。従って、hK２ RNAの検出は、前立腺癌の微小転移の初期検出のための有用なマーカーとして作動することができる。本発明は、示され、そして記載されて来た詳細に制限されるものではなく、多くの変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは、理解されるべきである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１１月３０日（１９９８．１１．３０）【補正内容】請求の範囲１．hK２ DNAを検出するための診断方法であって；（ａ）hK２ RNAを含むと思われる細胞を含んで成るヒト生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られた一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを生成するために、ポリメラーゼ鎖反応によりDNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり、そして前記サンプルが異常空間hK２発現に関連する徴候の危険な状態であるか、又はその特徴を有するヒトからであり；そして（ｂ）前記増幅されたhK２ DNAの存在を検出する；ことを含んで成る方法。２．ヒトにおける転移性前立腺癌を検出するための方法であって；（ａ）hK２ RNAを含むと思われる細胞を含んで成るヒト生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られた一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを生成するために、ポリメラーゼ鎖反応によりDNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり；そして（ｂ）前記増幅された存在を検出し、ここで前記hK２ DNAの存在が前記ヒトにおける転移性前立腺癌の存在の表示である；ことを特徴とする方法。３．前記生理学的サンプルが、組織サンプルである請求の範囲第１又は２項記載の方法。４．前記組織が、前立腺、前立腺ノウ、精ノウ、骨髄及びリンパ節から成る群から選択される請求の範囲第３項記載の方法。５．前記組織が非前立腺組織である請求の範囲第３項記載の方法。６．前記生理学的サンプルが流体である請求の範囲第１又は２項記載の方法。７．前記流体が、全血、血清及び精液から成る群から選択される請求の範囲第６項記載の方法。８．前記流体が全血である請求の範囲第７項記載の方法。９．前記増幅されたhK２ DNAが、検出の前、アガロースゲル電気泳動にゆだねられる請求の範囲第１又は２項記載の方法。 10．増幅されたhK２ DNAの量を定量化することをさらに含んで成る請求の範囲第１又は２項記載の方法。 11．（ａ）ヒト生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られる第２の一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、増幅されたP SA DNAを得るために、ポリメラーゼ鎖反応により、hK２ DNAではなく、前立腺特異的抗原(PSA)DNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ；そして（ｂ）前記増幅されたPSA DNAの存在を検出する；ことをさらに含んで成る請求の範囲第１又は２項記載の方法。 12．hK２ RNAを検出するための診断方法であって；（ａ）ヒトから得られた生理学的サンプルからRNAを抽出し；（ｂ）DNAを生成するために前記抽出されたRNAを逆転写し；（ｃ）前記DNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを得るために、ポリメラーゼ鎖反応により前記DNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり；そして（ｄ）前記増幅されたhK２ DNAの存在を検出し、ここで前記増幅されたhK２ D NAの存在がヒトにおける転移性前立腺癌の表示であることを特徴とする方法。 13．前記サンプルが組織サンプルである請求の範囲第12項記載の方法。 14．前記サンプルが生理学的流体サンプルである請求の範囲第12項記載の方法。 15．前記ヒトが基本的前立腺切除を有しており、そして前記hK２ DNAの存在がヒトにおける永続性前立腺癌の存在の表示である請求の範囲第12項記載の方法。 16．前立腺癌の進行をモニターするための方法であって；（ａ）前立腺癌を有するヒトから得られる生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られる一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを得るために、ポリメラーゼ鎖反応により DNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１種のオリゴヌクレオチドがhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり；（ｂ）前記増幅されたhK２ DNAの量を検出し、又は決定し；（ｃ）後のちょうどよい時点で段階（ａ）及び（ｂ）を反復し；そして（ｄ）前記段階（ｂ）の結果と、前記段階（ｃ）の結果とを比較し、ここで、 hK２ DNAの量の上昇が前記ヒトにおける前立腺癌の進行の表示である；ことを特徴とする方法。 17．前立腺癌を病理学的に段階分けするための方法であって；（ａ）前立腺癌を有するヒトから得られる生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られる一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを得るために、ポリメラーゼ鎖反応により DNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１種のオリゴヌクレオチドがhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり；そして（ｂ）前記増幅されたhK２ DNAの存在又は量を検出し；又は決定し、ここで前記増幅されたhK２ DNAの存在又は量が前立腺癌の病理学的段階の表示である；ことを特徴とする方法。 18．前記ヒトが基本的な前立腺切除のための候補体である請求の範囲第16又は 17項記載の方法。 19．前記段階（ａ）のサンプルが、ヒトがホルモン療法を受ける前に得られる請求の範囲第16項記載の方法。 20．前記ホルモン療法がアンドロゲン療法である請求の範囲第19項記載の方法。 21．前記アンドロゲン療法がアンドロゲン刺激療法である請求の範囲第20項記載の方法。 22．前記サンプルが非前立腺組織サンプルである請求の範囲第16又は17項記載の方法。 23．前記サンプルが生理学的流体サンプルである請求の範囲第16又は17項記載の方法。 24．前記流体が全血である請求の範囲第23項記載の方法。 25．hK２ RNAを含むと思われる生理学的サンプルにおけるhK２ RNAを検出するための診断キットであって、（ａ）既知量の第１のhK２−特異的オリゴヌクレオチド；及び（ｂ）既知量の第２のhK２-特異的オリゴヌクレオチドを含む包装を含んで成り、ここで前記第１のオリゴヌクレオチドが少なくとも約７〜50個のヌクレオチドから成り、そして配列番号４に対して少なくとも約80％の同一性を有しそして配列番号17を含んで成り；そして前記第２のオリゴヌクレオチドが約７〜50個のヌクレオチドから成り、配列番号４に対して相補的であるヌクレオチド配列に対して少なくとも約 80％の同一性を有し、そして配列番号14又は18を含んで成ることを特徴とする診断キット。 26．前記第２のオリゴヌクレオチドが配列番号14を含んで成る請求の範囲第25 項記載の診断キット。 27．前記第１のオリゴヌクレオチドが配列番号17を含んで成る請求の範囲第25 項記載の診断キット。 28．前記第２のオリゴヌクレオチドが配列番号18を含んで成る請求の範囲第25 項記載の診断キット。 29．配列番号22、その生物学的活性サブユニット、又はその生物学的活性変異体を含んで成る、単離され、精製されたペプチド。 30．配列番号26、その生物学的活性サブユニット、又はその生物学的活性変異体を含んで成る、単離され、精製されたペプチド。 31．請求の範囲第29又は30項記載のペプチドを含んで成る、タンパク質又はポリペプチドと特異的に反応する精製された抗体。 32．モノクローナル抗体である請求の範囲第31項記載の抗体。 33．請求の範囲第32項記載の抗体を生成するハイブリドーマ細胞系。 34．請求の範囲第31項記載の抗体を含んで成るポリクローナル抗体の調製物。 35．少なくとも約７〜50個のヌクレオチドから成り、そして配列番号４に対して少なくとも約80％の同一性を有するか、又は前記配列を有するヌクレオチド配列に対する相補性を有し、そして配列番号17，14又は18を含んで成るhK２−特異的オリゴヌクレオチド。 36．配列番号14を含んで成る請求の範囲第35項記載のオリゴヌクレオチド。 37．配列番号17を含んで成る請求の範囲第35項記載のオリゴヌクレオチド。 38．配列番号18を含んで成る請求の範囲第35項記載のオリゴヌクレオチド。 39．ヒト非前立腺組織サンプルにおける転移性前立腺癌の存在を検出し、又は決定するための方法であって、（ａ）hK２ポリペプチドに結合し、そしてhK３に結合しない一定量の剤と、前記ヒト組織サンプルの細胞とも、前記剤及び細胞を含んで成る二元複合体を形成するために、混合し；そして（ｂ）微小転移性前立腺癌の存在の表示で提供する、前記サンプルにおける前記複合体の存在又は量を決定し、又は検出する；ことを含んで成る方法。 40．前記剤が抗体である請求の範囲第39項記載の方法。 41．前記抗体がポリクローナル抗体集団のメンバーである請求の範囲第39項記載の方法。 42．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第39項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＰＧ０１Ｎ 33/50 33/574 Ａ 33/574 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者ヤング，チャールズワイ．エフ. アメリカ合衆国，ミネソタ 55901，ロチェスター，セントメリードライブノースウエスト 5100 (72)発明者マコーミック，ダニエルジェイ. アメリカ合衆国，ミネソタ 55904，ロチェスター，ナインスアベニュサウスイースト 1353 (72)発明者クリー，ジョージジー. アメリカ合衆国，ミネソタ 55902，ロチェスター，イレブンスアベニュサウスウエスト 5949 (72)発明者サエディ，モハメイドサイードアメリカ合衆国，カリフォルニア 92126, サンディエゴ，ヘリドリックスドライブ 7898 (72)発明者クマー，アブヘイアメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サンディエゴ，サーモンリバーロード 12638 (72)発明者リッテンハウス，ハリージー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92014, デルマー，マーケイドドライブ 13972 (72)発明者ウォルファート，ロバートエル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 92131, サンディエゴ，キャニオンレイクドライブ 10495

Claims

【特許請求の範囲】１．hK２ DNAを検出するための診断方法であって；（ａ）hK２ RNAを含むと思われる細胞を含んで成るヒト生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られた一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを生成するために、ポリメラーゼ鎖反応によりDNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり；そして（ｂ）前記増幅されたhK２ DNAの存在を検出する；ことを含んで成る方法。２．ヒトにおける転移性前立腺癌を検出するための方法であって；（ａ）hK２ RNAを含むと思われる細胞を含んで成るヒト生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られた一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを生成するために、ポリメラーゼ鎖反応によりDNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり；そして（ｂ）前記増幅された存在を検出し、ここで前記hK２ DNAの存在が前記ヒトにおける転移性前立腺癌の存在の表示である；ことを特徴とする方法。３．前記生理学的サンプルが、組織サンプルである請求の範囲第１又は２項記載の方法。４．前記組織が、前立腺、前立腺ノウ、精ノウ、骨髄及びリンパ節から成る群から選択される請求の範囲第３項記載の方法。５．前記組織が非前立腺組織である請求の範囲第３項記載の方法。６．前記生理学的サンプルが流体である請求の範囲第１又は２項記載の方法。７．前記流体が、全血、血清及び精液から成る群から選択される請求の範囲第６項記載の方法。８．前記流体が全血である請求の範囲第７項記載の方法。９．前記増幅されたhK２ DNAが、検出の前、アガロースゲル電気泳動にゆだねられる請求の範囲第１又は２項記載の方法。 10．増幅されたhK２ DNAの量を定量化することをさらに含んで成る請求の範囲第１又は２項記載の方法。 11．（ａ）ヒト生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られる第２の一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、増幅されたP SA DNAを得るために、ポリメラーゼ鎖反応により、hK２ DNAではなく、前立腺特異的抗原(PSA)DNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ；そして（ｂ）前記増幅されたPSA DNAの存在を検出する；ことをさらに含んで成る請求の範囲第１又は２項記載の方法。 12．hK２ RNAを検出するための診断方法であって；（ａ）ヒトから得られた生理学的サンプルからRNAを抽出し；（ｂ）DNAを生成するために前記抽出されたRNAを逆転写し；（ｃ）前記DNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを得るために、ポリメラーゼ鎖反応により前記DNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１つのオリゴヌクレオチドはhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり；そして（ｄ）前記増幅されたhK２ DNAの存在を検出し、ここで前記増幅されたhK２ D NAの存在がヒトにおける転移性前立腺癌の表示である；ことを特徴とする方法。 13．前記サンプルが組織サンプルである請求の範囲第12項記載の方法。 14．前記サンプルが生理学的流体サンプルである請求の範囲第12項記載の方法。 15．前記ヒトが基本的前立腺切除を有しており、そして前記hK２ DNAの存在がヒトにおける永続性前立腺癌の存在の表示である請求の範囲第12項記載の方法。 16．前立腺癌の進行をモニターするための方法であって；（ａ）前立腺癌を有するヒトから得られる生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られる一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを得るために、ポリメラーゼ鎖反応により DNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１種のオリゴヌクレオチドがhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり；（ｂ）前記増幅されたhK２ DNAの量を検出し、又は測定し；（ｃ）後のちょうどよい時点で段階（ａ）及び（ｂ）を反復し；そして（ｄ）前記段階（ｂ）の結果と、前記段階（ｃ）の結果とを比較し、ここで、 hK２ DNAの量の上昇が前記ヒトにおける前立腺癌の進行の表示である；ことを特徴とする方法。 17．前立腺癌を病理学的に段階分けするための方法であって；（ａ）前立腺癌を有するヒトから得られる生理学的サンプルからのRNAの逆転写により得られる一定量のDNAと、一定量の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドとを、一定量の増幅されたhK２ DNAを得るために、ポリメラーゼ鎖反応によりDNAを増幅するのに有効な条件下で接触せしめ、ここで少なくとも１種のオリゴヌクレオチドがhK２−特異的オリゴヌクレオチドであり；そして（ｂ）前記増幅されたhK２ DNAの存在又は量を検出し；又は決定し、ここで前記増幅されたhK２ DNAの存在又は量が前立腺癌の病理学的段階の表示である；ことを特徴とする方法。 18．前記ヒトが基本的な前立腺切除のための候補体である請求の範囲第16又は 17項記載の方法。 19．前記段階（ａ）のサンプルが、ヒトがホルモン療法を受ける前に得られる請求の範囲第16項記載の方法。 20．前記ホルモン療法がアンドロゲン療法である請求の範囲第19項記載の方法。 21．前記アンドロゲン療法がアンドロゲン刺激療法である請求の範囲第20項記載の方法。 22．前記サンプルが非前立腺組織サンプルである請求の範囲第16又は17項記載の方法。 23．前記サンプルが生理学的流体サンプルである請求の範囲第16又は17項記載の方法。 24．前記流体が全血である請求の範囲第23項記載の方法。 25．hK２ RNAを含むと思われる生理学的サンプルにおけるhK２ RNAを検出するための診断キットであって、（ａ）既知量の第１のhK２−特異的オリゴヌクレオチド；及び（ｂ）既知量の第２のhK２−特異的オリゴヌクレオチドを含む包装を含んで成り、ここで前記第１のオリゴヌクレオチドが少なくとも約７〜50個のヌクレオチドから成り、そして配列番号４に対して少なくとも約80％の同一性を有し；そして前記第２のオリゴヌクレオチドが約７〜50個のヌクレオチドから成り、そして配列番号４に対して相補的であるヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％の同一性を有することを特徴とする診断キット。 26．前記第２のオリゴヌクレオチドが配列番号14を含んで成る請求の範囲第25 項記載の診断キット。 27．前記第１のオリゴヌクレオチドが配列番号17を含んで成る請求の範囲第25 項記載の診断キット。 28．前記第２のオリゴヌクレオチドが配列番号18を含んで成る請求の範囲第25 項記載の診断キット。 29．配列番号22、その生物学的活性サブユニット、又はその生物学的活性変異体を含んで成る、単離され、精製されたペプチド。 30．配列番号26、その生物学的活性サブユニット、又はその生物学的活性変異体を含んで成る、単離され、精製されたペプチド。 31．請求の範囲第29又は30項記載のペプチドを含んで成る、タンパク質又はポリペプチドと特異的に反応する精製された抗体。 32．モノクローナル抗体である請求の範囲第31項記載の抗体。 33．請求の範囲第32項記載の抗体を生成するハイブリドーマ細胞系。 34．請求の範囲第31項記載の抗体を含んで成るポリクローナル抗体の調製物。 35．少なくとも約７〜50個のヌクレオチドから成り、そして配列番号４に対して少なくとも約80％の同一性を有するか、又は前記配列を有するヌクレオチド配列に対する相補性を有するオリゴヌクレオチド。 36．配列番号14を含んで成る請求の範囲第35項記載のオリゴヌクレオチド。 37．配列番号17を含んで成る請求の範囲第35項記載のオリゴヌクレオチド。 38．配列番号18を含んで成る請求の範囲第35項記載のオリゴヌクレオチド。 39．ヒト非前立腺組織サンプルにおける転移性前立腺癌の存在を検出し、又は決定するための方法であって、（ａ）hK２ポリペプチドに結合し、そしてhK３に結合しない一定量の剤と、前記ヒト組織サンプルの細胞とを混合して前記剤及び細胞を含んで成る二元複合体を形成し；そして（ｂ）微小転移性前立腺癌の存在の表示で提供する、前記サンプルにおける前記複合体の存在又は量を測定し、又は検出する；ことを含んで成る方法。 40．前記剤が抗体である請求の範囲第39項記載の方法。 41．前記抗体がポリクローナル抗体集団のメンバーである請求の範囲第39項記載の方法。 42．前記抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第39項記載の方法。