CN1238013A

CN1238013A - 转移性前列腺癌的检测方法

Info

Publication number: CN1238013A
Application number: CN 97199740
Authority: CN
Inventors: D·J·廷达尔; C·Y·F·尤恩格; D·J·麦克科米克; G·G·克利; M·S·萨狄; A·库马尔; H·G·里坦豪斯; R·L·沃尔福特
Original assignee: Hybritech Inc; Mayo Foundation for Medical Education and Research
Current assignee: Hybritech Inc; Mayo Foundation for Medical Education and Research
Priority date: 1996-11-14
Filing date: 1997-11-14
Publication date: 1999-12-08
Also published as: EP0941368A2; AU5260298A; CA2271770A1; WO1998021365A2; AU737659B2; WO1998021365A3; JP2001503991A

Abstract

通过测定生理样品中前列腺特异性腺激肽释放酶hK2多肽式hK2RNA的存在而检测前列腺癌。

Description

转移性前列腺癌的检测方法

政府权利申明

本发明是在美国政府通过国立卫生研究所进行的资助下完成的(基金号CA70893和DK41995)。政府可能在本发明中享有某些权利。

发明背景

激肽释放酶在特定多肽前体翻译后加工成其生物活性形式的过程中发挥作用，腺激肽释放酶是它的一个亚群。在人类中，已确定了该家族的三个成员，它们的某些特性也得到鉴定(Clements，内分泌评论，10,343(1989)；Clements，分子细胞内分泌学，99,1(1994)；Jones等，内分泌学报，127,481(1992)。hKLK1基因编码组织激肽释放酶蛋白质hK1,hKLK2基因编码前列腺特有的腺激肽释放酶蛋白质hK2,hKLK3基因编码前列腺特有的抗原蛋白质hK3(PSA)。mRNA Northern杂交分析表明hK2和PSA主要在人前列腺中表达，而hK1在胰腺，下颌下腺，肾脏和其它非前列腺组织中表达(Chapdelaine等，FEBS通信，236,205(1988)；Young等，生物化学，31,818(1992))。

HKLK2和hKLK3外显子之间的核苷酸序列同源性为80％，而hKLK2和hKLK1外显子之间的核酸苷序列的同源性为65％。hK2与PSA推测的氨基酸序列同源性为78％，而hK2与hK1推测的氨基酸序列同源性为57％。此外，hK2推测的氨基酸序列提示hK2可能是一种胰蛋白酶样蛋白酶，而PSA是一种胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。

PSA水平被广泛用作前列腺癌的预测指标。然而，由于血清PSA浓度在前列腺癌(pCa)患者或良性前列腺增生(BPH)患者中均升高，检测升高的PSA水平并不能区分这两种疾病。此外，hK2和PSA的高度同源性对目前用于检测PSA水平之抗体的特异性提出了疑问。如果循环中的hK2水平与pCa和BPH无关，那么由污染有hK2的PSA制剂，或由与hK2同源的PSA区域产生的抗体，会导致假阳性结果。

虽然目前广泛认为，血清PSA检测与手指直肠检查(DRE)的结合是确定临床上显著的和器官范围限定的前列腺癌最有效的手段，但PSA、DRE和前列腺超声波检查只能查出部分前列腺癌。例如，多至40％的经手术治疗的前列腺癌患者随后被发现是临床隐性的。此外，尸检基础上确定的组织性癌发生率相比于临床上显著的前列腺癌的发生率要高一些。再则，大约30％据认为是局部前列腺癌的患者中有隐秘(远距离)的转移病变(Moreno等，癌症研究，52,6110(1992))。在这些病人中，80％患者在治疗后经历了生化意义上的复发，即PSA水平升高，局部复发或明显全身性症状的出现或发病。

对已确知有转移的患者来说，手术治疗并不是一种合适的治疗方式。为了评估早期转移而使用的筛查方法往往不能发现患者中有侵入前列腺包膜和精囊这种局部侵袭病变的一大亚群。当用常规方法尚未检测到明显转移灶时，免疫组织化学方法可用来鉴定微转移的或循环中的前列腺肿瘤细胞。但免疫组织化学方法繁琐，对于转移或局部侵染性前列腺癌的早期检测缺乏所需的灵敏性。

这样，需要一种能早期检测具有转移潜力的前列腺癌细胞的方法。此外，需要一种能在对患者治疗之前确定前列腺癌发生期的方法，特别需要一种既能独立发挥作用又能与PSA结合应用的前列腺癌标志。

发明概述

本发明提供了用来检测hK2 DNA的一种诊断方法，其中生理样品中前列腺癌细胞的存在可以与该样品中hK2 RNA的检测发生关联。因为hK2的表达是前列腺组织所特有的，所以理论上讲，在未发生局部侵袭或转移病变时，或在所有前列腺组织(良性和恶性)均已被消除或破坏时，在体液的细胞中或非前列腺组织中不应检测到hK2的表达。本方法包括，由人类生理样品来源的RNA经逆转录(RT)产生一定量的DNA，使得到的DNA与众多的寡核苷酸引物相接触，优选至少两种寡核苷酸引物，其中至少一种是hK2特异的寡核苷酸，通过一个扩增反应产生一定量的扩增hK2 DNA。优选的扩增反应为聚合酶链式反应(PCR)。随后检测是否存在扩增的hK2 DNA。如下文所述，经过RT-PCR扩增后，血细胞中hK2 DNA扩增产物的存在与前列腺癌相关，也就是说67％的前列腺癌患者表达hK2,17％的患者表达PSA,17％的患者同时表达hK2和PSA。优选地，用于检测的样品来源于人类组织，如前列腺，前列腺包膜，精囊，骨髓或淋巴结，另一类优选的用于检测的样品来源于人类含有细胞的生理液体，如血，血清或精液。

此处所用的“扩增的hK2 DNA”是指经过一个扩增反应后样品中的hK2 DNA，其数量比扩增前同一样品中hK2 DNA的量多10倍，优选10⁴倍，更优选10⁶倍。

此处所用的“hK2特异的寡核苷酸或hK2特异的引物”指的是一段DNA序列，该序列与SEQ ID NO:4中不同于编码hK3的核苷酸序列(23号序列)的区域之间具有至少80％左右的序列同一性或同源性，优选至少90％左右，更优选至少95％左右。本发明的寡核苷酸或引物至少有7-50个左右的核苷酸，优选至少10-40个左右的核苷酸，更优选至少15-35个左右的核苷酸。优选地，本发明寡核苷酸引物的3’端至少有7个核苷酸与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6存在至少80％左右，更优选至少85％左右，还要优选至少90％左右相同。本发明的寡核苷酸可能还含有与hK2核酸序列无关的序列，如可能编码限制性内切酶识别位点的序列。本发明一个优选的hK2特异寡核苷酸包括SEQ IDNO:14，本发明另一个优选的hK2特异寡核苷酸包括SEQ ID NO:17，本发明又一个优选的hK2特异的寡核苷酸序列包括SEQ ID NO:18。

本发明一种优选的诊断方法是结合hK2转录物的RT-PCR检测和其它前列腺癌相关基因产物转录物的RT-PCR检测。两种或多种基因产物的联合检测使诊断更加准确，能提供更多的肿瘤分类信息。联合检测也有利于区分具有侵袭性生长潜力的细胞和更具惰性的细胞。本发明方法的一个特别优选的实施方案是将hK2 RNA的RT-PCR检测与PSA RNA的RT-PCR检测结合起来。

本发明进一步提供了一种检测hK2 RNA的诊断方法。该方法包括从来源于人的生理样品中提取RNA，将提取的RNA逆转录成DNA，将该DNA与一定量的至少两种能有效扩增DNA的寡核苷酸相结合，以产生一定量的扩增hK2 DNA，其中至少有一种寡核苷酸是hK2特异的寡核苷酸。随后检测是否存在扩增的hK2 DNA。扩增的hK2 DNA的存在指示此人患有转移性前列腺癌。

体液或非前列腺组织中hK2 RNA的存在，或hK2 RNA的水平随时间升高，可能合理地指示了存在以前未被诊断出的转移性病变。转移性病变的早期检测为考虑可供选择的治疗方案提供了领先时间，其中包括那些在外科手术阶段可能还不存在，而在以后被发展的治疗方案。这样，本发明提供了一种监测前列腺癌发展的方法。

这个方法包括，将来源于前列腺癌患者的生理样品中的RNA逆转录成DNA，将一定量的该DNA与一定量的、可有效扩增该DNA的至少两种寡核苷酸(其中至少一种是hK2特异的寡核苷酸)相结合，以产生一定量的扩增hK2 DNA，定性检测或定量测定扩增的hK2 DNA。至少在以后的某一时间点，取另一份样品，对扩增的hK2 DNA进行定性或定量检测。然后，对至少在两个不同时间点得到的hK2 DNA的扩增量进行比较。

并且提供了对人类前列腺癌进行病理分期的方法。这种方法包括，将来源于前列腺癌患者的生理样品的RNA逆转录成DNA，将一定量的该DNA与一定量的、可有效扩增该DNA的至少两种寡核苷酸(其中至少一种是hK2特异的寡核苷酸)结合，以产生一定量的扩增hK2 DNA，然后定性检测或定量测定扩增的hK2 DNA。扩增hK2 DNA的存在或数量是前列腺癌病理期的一个指标。

本发明的另一个实施方案是为包括激素疗法在内的治疗性干预提供一种监测方案。例如，因为hK2的表达是雄激素依赖性的，故hK2 DNA在外周血、其它身体组织或体液中的水平可以作为间歇性雄激素治疗或雄激素刺激实验的指标，其中使患者在雄激素刺激实验中暂时处于一种雄激素过多状态，以刺激任何尚存的前列腺癌细胞产生一定水平的hK2，从而检测到这些细胞的存在。参见T.K.Takayama等，肿瘤学讨论，21,542-553(1994)及其引用的文献。优选地，在激素治疗过程中周期性监测hK2水平。在治疗开始前或治疗结束后对hK2水平进行周期性测定可能非常有益。

并且提供了一种对怀疑有hK2 RNA的生理样品进行hK2 RNA检测的诊断试剂盒。该试剂盒包括含有下述的包装：(a)已知量的第一种hK2特异的寡核苷酸，该寡核苷酸至少包括7-50个左右的核苷酸，该寡核苷酸与SEQ ID NO:4至少有80％左右相同；(b)已知量的第二种hK2特异的寡核苷酸，该寡核苷酸至少包括7-50个左右的核苷酸，该寡核苷酸与互补于SEQ ID NO:4的核苷酸序列至少有80％左右相同。

本发明进一步提供了包含SEQ ID NO:22的一种经分离、纯化的肽，它的有生物活性的亚基或它的有生物活性的变体。本发明进一步提供了包含SEQ ID NO:26的一种经分离、纯化的肽，它的有生物活性的亚基或它的有生物活性的变体。还提供了能与包含本发明上述肽的蛋白质或多肽特异反应的一种经分离、纯化的抗体或抗体制剂。

此处所用的本发明肽的“有生物活性的亚基”一词，优选指具有SEQ ID NO:22的肽的亚基，该亚基至少有具SEQ ID NO:22之肽的活性的10％左右的活性，优选至少50％左右的活性，更优选至少90％左右的活性。本发明肽活性的测定可以采用本领域内通晓的方法，包括但不局限于该肽在施用到如山羊、兔、绵羊或小鼠等生物体中时其引发序列特异性免疫响应的能力。

此处所用的本发明肽“有生物活性的变体”一词，优选指与SEQ IDNO:22至少有80％左右相同或同源，优选至少有90％左右相同或同源，更优选至少有95％左右相同或同源的肽。本发明肽的有生物活性的变体至少有具SEQ ID NO:22之肽的10％左右生物活性，优选至少具有50％左右活性，更优选至少具有90％左右活性。本发明肽变体的活性可由上述方法测定。

本发明进一步提供一种检测或测定人类非前列腺组织样品中转移性前列腺癌的方法。该方法包括将一定量的试剂与哺乳动物组织样品中的细胞混合形成一种包括试剂和细胞的二价复合物，该试剂只与hK2多肽结合而不与hK3结合。对样本中形成的复合物进行定性检测和定量测定。该复合物的存在或数量是微转移前列腺癌存在的指征。此处所用的“微转移”是指局部侵袭性病变，通常包括前列腺包膜或精囊的侵袭，或隐性病变。此方法中一种优选的试剂是抗体。“抗体”一词包括人和动物的单克隆抗体，多克隆抗体制剂，以及抗体片段和合成抗体，包括重组抗体和嵌合抗体，其又包括人源化抗体，抗同种型抗体及其衍生物。为制备只与hK2而不与hK3结合的抗体，可以用分离的hK2多肽，分离的hK2肽、以及它们的变体或亚基来制备抗体群。随后这些抗体被用作检测和定量测定来源于骨髓、淋巴结等组织样品和诸如来源于含有细胞的生理液体的细胞样品中hK2多肽(或蛋白质)的直接或竞争实验的基础。

附图简述

附图1描述了成熟的野生型hK2(SEQ ID NO:1)和hK3(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列。

附图2描述了野生型pphK2(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)，phK2(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和hK2(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的氨基酸序列和对应的核酸序列。217号密码子(GCT，丙氨酸)以粗体和下划线标出。

附图3是pGT表达载体--pGThK2和pGThK2^v217的简图。

附图4是phK2^v217纯化的色谱图。(A)转染有编码pphK2^v217载体的AV12细胞培养7天的消耗培养基的DEAE色谱图。将消耗培养基样品在pH8的重碳酸盐缓冲液中上样，采用盐梯度洗脱。以实线表示A₂₈₀的洗脱曲线，虚线表示每个柱洗脱级分一部分的ELISA结果，即用兔抗pphK2抗体对干燥于微滴定板上的每一柱级分进行显色。(B)汇集DEAE级分的疏水作用曲线。汇集(A)中DEAE层析洗脱物的第24-30号级分，浓缩，上样到1.2M硫酸钠中的疏水作用柱(HIC)中，并以逐渐降低的盐浓度梯度洗脱。实线表示洗脱曲线(A₂₈₀)，虚线表示每个洗脱级分一部分的ELISA测试结果，以兔抗hK2抗体对干燥于微滴定板上的每个级分进行显色。(C)将(B)中22分钟峰的含有hK2的级分浓缩后上样到pharmacia S12大小排阻柱中，收集洗脱级分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS/PAGE)分析，其中19.4分钟的洗脱峰表现为SDS/PAGE均一。

附图5表示纯化的hK2和PSA的SDS/PAGE分析。将加入(R)或未加入(N)1％β-巯基乙醇的1.5毫克已纯化的phK2^v217或PSA煮沸，然后在4-20％的凝胶上进行SDS/PAGE，用银染法使蛋白质条带显色。

附图6描述了phK2^v217的伴刀豆球蛋白质A染色结果。箭头指示phK2的预期位置。分别用ZCE(一种抗CEA的单克隆抗体)和牛血清白蛋白(BSA)作为糖基化和非糖基化蛋白的例子，phK2泳道在预期位置出现了一个条带表明该蛋白质是糖基化蛋白。

附图7表示通过胰蛋白酶切割使hK2^v217前体蛋白质转化为成熟蛋白质。在37℃,pH8的100mM硼酸盐缓冲液条件下，将胰蛋白酶(1％w/w)和phK2^v217共同温育10分钟，然后进行HIC/HPLC检测。破折线表示胰蛋白酶温育前的phK2^v217曲线，实线表示胰蛋白酶温育后phK2的图形曲线。将两曲线叠加以进行比较。用蛋白质N端测序法确定两种蛋白质形式的相同性。

附图8描述了用单克隆抗体(mAb)hK1G586.1对精液的Western杂交结果。将处理过的精液1∶1稀释于PBS中，10000xg离心20分钟。上清在8-25％的凝胶上进行SDS/PAGE，采用Pharmacia的Phast System电泳系统。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，与经G-蛋白质纯化的HK1G586.1抗体(1μg/ml)共同温育，随后加入羊抗鼠IgG-HRT(1∶1000)。印迹用Amersham的ECL检测系统显色。

附图9表示了hK2在AV12细胞中表达的时间曲线。将AV12-hK2细胞27号克隆培养至约60-70％长满度，用HBSS冲洗细胞，加入无血清的HH4培养基。每日回收消耗培养基，浓缩后上样于12％的胶上进行SDS/PAGE。将蛋白质电转移后，用单克隆抗体HK1D106.4或HK1G464.3进行探查。HK1D106.4能检测phK2和hK2(1∶1000),HK1G464.3能检测phK2(1∶1000)。随后加羊抗鼠抗体IgG-HRP(1∶500)。按操作手册说明，以Amersham公司的ECL系统对印迹显色。以纯化的phK2^v217和hK2^v217作对照，箭头指示处为hK2的位置。

附图10表示经转染的AV12细胞中表达hK2变体的时间曲线。长至约60-70％融合的AV12-hK2^v217细胞用HBSS冲洗后，加入无血清的HH4培养基。每日收获消耗培养基，浓缩后上样于12％的胶上进行SDS/PAGE。蛋白质电转移后，以单克隆抗体HK1D106.4和HK1G464.3进行探查。以羊抗鼠IgG-HRP(1∶500)作为二抗，按操作手册，用ECL(Amersham)对印迹显色。用纯化的phK2^v217和hK2^v217作对照。箭头指示hK2的位置。

附图11是hK2表达和细胞活力的时间曲线。AV12-hK2细胞27号克隆长至60-70％融合，用HBSS冲洗，加入无血清的HH4培养基。每天收获消耗培养基，以HK1D106.4或HK1G464.3作为一抗，羊抗鼠IgG-HRP作为二抗，经ELISA反应测定hK2的浓度。用OPD(Sigma.St.Louis,MO)进行显色反应。用台盼兰排除法每日计数存活细胞。

附图12描述了PC3和DU145细胞中hK2的表达。转染有pGThK2的PC3和DU145细胞长至约60-70％融合，洗涤后重悬于无血清的HH4培养基中。重悬3天后收集转染有pGThK2的DU145细胞的消耗培养基，重悬5天后收集转染有pGThK2的PC3细胞的消耗培养基。消耗培养基浓缩后上样于12％的胶上进行SDS/PAGE电泳。如上述方法，在蛋白质电转移后用HK1D106.4和HK1G464.3作为探针进行探查。用纯化的phK2^v217和hK2^v217作对照。箭头指示hK2的位置。

图13描述了在经过选择的含有hK2的AV12细胞克隆中hK2的表达。含有hK2的AV12细胞的第10,27,31和32号克隆长至约60-70％融合，用HBSS冲洗，然后加入无血清的HH4培养基，培养7天后收集消耗培养基，浓缩并上样于12％的凝胶上进行SDS/PAGE电泳。蛋白质电转移，并以HK1D106.4或HK1G464.3作为探针进行探查。以羊抗鼠IgG-HRP(1∶500)作为二抗，按照操作说明用ECL(Amersham)对印迹显色。以纯化的phK2^v217和hK2^v217作为对照，箭头指示hK2的位置。

图14描述了在经过筛选的AV12-hK2^v217克隆中phK2^v217的表达。AV12第2,3,4,45和48号克隆的细胞长至约60-70％融合，用HBSS冲洗，加入无血清的HH4培养基。加入无血清培养基7天后收集消耗培养基，浓缩后上样于12％的凝胶中进行SDS/PAGE电泳。蛋白质电转移，以HK1D106.4或HK1G464.3作探针进行探查。以羊抗鼠IgG-HRP(1∶500)作为二抗，根据操作说明，用ECL(Amersham)对印迹显色。用纯化的phK2^v217和hK2^v217作对照。箭头指示hK2的位置。

图15描述了hK2^v217,hK2和PSA对hK2中210-236位残基的酰胺水解特异性。0.63mM合成肽在37℃下用1μg/ml hK2,40μg/ml hK2^v217或100μg/ml PSA消化过夜，以RP-HPLC分离消化产物，将各峰标准化以比较切割的性质方面。

附图16描述了hK2和PSA对不同肽底物的特异性。空心箭头指示被PSA切割的肽键，实心箭头表示被hK2切割的肽键。1号肽表示hK2中210-236位氨基酸残基，2号肽表示血管紧张素原1-14位氨基酸残基(即肾素底物十肽)，3号肽表示phK2中-7-+7位氨基酸残基，4号肽表示hK2中41-56位氨基酸残基，5号肽表示氧化型胰岛素β链的氨基酸序列，6号肽表示PMSA中196-213位氨基酸残基。

附图17描述了phK2^v217能被hK2激活，但不能被hK2^v217激活。phK2^v217含有前体蛋白质的前导肽序列VPLIQSR，该序列在hK2^v217中不存在。A表示与1％(重量比)hK2共同温育的phK2^v217。B为对照，其中phK2^v217与40％(重量比)hK2^v217共同温育6个小时。

附图18描述了与蛋白酶抑制剂共同温育的hK2的Western印迹分析。将每个样品在8-25％的梯度SDS/PAGE中分离，转膜并用HK1G586.1进行探查。37℃下，将hK2与下列抑制剂共同温育4个小时：1泳道，抗胰凝乳蛋白酶(ACT)；2泳道，α2抗纤溶酶；3泳道，抗凝血酶Ⅲ；4泳道，α1蛋白酶抑制剂(抗胰蛋白酶)；5泳道，α2巨球蛋白；1泳道和2泳道显示了推测分子量为90-100KD的一种共价复合物。丝氨酸蛋白酶抑制剂的浓度为20μM，巨球蛋白为2.8μM,hK2为0.175μM。5泳道显示了较大分子量的复合物，它们代表的是hK2与α2巨球蛋白的共价复合物。

附图19描述了hK2在人血清中形成复合物的情况。将hK2和PSA的Western印迹与人血清共同温育。以HK1G586.1探测hK2样品，以PSM773抗PSA单克隆抗体探测PSA样品。1泳道至6泳道含有hK2样品，7泳道和8泳道为PSA样品。1泳道代表hK2对照，2泳道为与ACT共同温育4小时的hK2,3泳道为不加蛋白酶的血清对照，4泳道含有与血清共同温育15分钟的hK2,5泳道为与血清共同温育4小时的hK2,6泳道为与纯化的α2巨球蛋白共同温育4小时的hK2,7泳道为与血清共同温育4小时的PSA,8泳道含有与纯化的α-2巨球蛋白共同温育4小时的PSA。

图20描述了单克隆抗体HK1G586在未经治疗的人前列腺中的免疫反应性(n=257)。

图21描述了单克隆抗体HK1G586在经雄激素饥饿治疗的人前列腺中的免疫反应性(n=7)。

图22描述了(A)在从稀释于全血的LNCaP细胞提取的RNA中，对PSA和hK2的mRNA进行RT-PCR检测，(B)在从以下病人的全血细胞提取的RNA中，对PSA和hK2的mRNA进行RT-PCR检测：17号病人，31岁，男性对照；21号病人，58岁，临床阶段B；24号病人，83岁，已知有转移病变(D2)；26号病人，75岁，病理阶段C(+边缘)；28号病人，57岁，病理阶段C(+边缘)；49号病人，64岁，病理阶段C(+精囊)；59号病人，31岁，男性对照；60号病人，73岁，已知有转移病变。

发明详述

hK2和PSA在氨基酸序列上的高度同源性，以及hK2和PSA两者的表达基本局限于前列腺细胞的事实，提示检测hK2和PSA在组织样品中的存在或测定其含量，或检测在包含有细胞的生理液体(如血液)或组织样品(如淋巴结)中hK2转录物的水平，有助于诊断和监测前列腺癌(pCa)。定义

此处所用的“hK2多肽”一词包括重组的前hK2多肽原，前hK2多肽和成熟的hK2多肽，成熟的hK2多肽包含图1(SEQ ID NO:1)中氨基酸序列，以及与SEQ ID NO:1中基本同源于hK3的区域(即图1中未被线条标出的区域)有至少90％同源性的“变体”多肽。本发明变体hK2多肽相对于相应的野生型多肽具有至少一个氨基酸的替换。一种优选的hK2变体多肽包括SEQ ID NO:8，即217位氨基酸上由缬氨酸取代丙氨酸。hK2多肽的抗原性与图1中成熟的hK2分子相同，也就是说所述多肽也可被能与其特异结合但不能与hK3(或hK1)交叉反应的抗体所定义。优选所述抗体能与也存在于图1成熟hK2分子中的抗原位点或表位相互反应。

系列列号08/096,946(目前是美国专利No.5,516,639)中详述了可用于定义共同抗原功能的抗体，即体内制备的针对hK2亚基41-56的多克隆抗血清。

“分离的hK2核酸序列”是指含有7个以上，优选15个以上，更优选20或更多个连续核苷酸碱基的RNA或DNA，所述RNA或DNA互补于天然hK2多肽RNA或DNA的非编码链或编码链，或能与它们杂交并能在严格条件下保持稳定结合。优选地，分离的核酸编码一种有生物活性的hK2多肽，其变体或其亚基。hK2多肽的生物活性能通过本领域所通晓的方法检测，包括但不局限于与hK2多肽特异性抗体反应的能力，切割hK2特异底物的能力(参见实施例7)，或与血清蛋白质结合的能力(参见实施例9)。hK2变体多肽或其亚基，或hK2多肽的亚基具有含SEQ ID NO:1氨基酸序列的hK2多肽之生物活性的至少10％左右，优选至少50％左右，更优选至少90％左右。

所以，分离的DNA或RNA是指这些核酸至少没有在其天然来源中与其正常连接的核酸的污染，优选基本上没有任何其它哺乳动物的DNA或RNA。“至少无正常连接的核酸的污染”包括将目的核酸序列重新导入其来源或天然细胞中、但位于染色体的不同位置或其两侧连接有来源细胞中通常不存在的核酸序列这种情形。一个分离的hK2核酸的例子是所编码的有生物活性的hK2多肽与如前所述的hK2肽中同源于hK3的同源区域(图1)至少有90％的序列相同的RNA或DNA。用于hK2多肽的“分离、纯化的”在以下的方法学讨论中得到定义。

此处所用的“重组核酸”一词，即“重组DNA”，是指从任何适当的组织来源衍生或分离得到的核酸，即DNA，其可以随后在体外化学法改变，然后导入目的宿主细胞，如来源于动物、植物、昆虫、酵母、真菌或细菌的细胞中。从某一来源“衍生”得到的重组DNA的例子是被确定为编码hK2或其片段或变体之有用片段的DNA序列，其可以基本纯净的方式进行化学合成。从某一来源“分离”的这种DNA的一个例子可以是一种有用的DNA序列，该DNA序列通过化学方法(如利用限制性内切酶)切割或从所述来源中取出来，以使得可通过遗传工程方法(如扩增)进一步加工以用于本发明。

这样，“重组DNA”包括完全合成的DNA序列，半合成的DNA序列，从生物来源分离的DNA序列，来源于导入RNA的DNA序列以及它们的混合物。一般来讲，重组DNA序列并不是作为DNA受体的宿主靶细胞中的原有成份，或者它位于其基因组中但不表达或不是高表达。

此处所用的“嵌合体”是指一个载体包含来源于至少两个不同种的DNA，或包含同一种来源的DNA，但却以该种中在天然或野生型状态下不存在的一种方式连接在一起。

“调控序列”是指在某一特定宿主生物体中表达一个可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核细胞的调控序列例如有启动子，可选择地包括操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞可利用启动子，多聚腺苷酸化信号和增强子。

“可操作连接”是指将核酸置于与另一核酸序列有功能关系的位置。例如，如果编码前序列或分泌前导肽的DNA序列以参与多肽的分泌的前体蛋白质形式表达，则其即是可操作地与该多肤的DNA连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则是与该序列可操作地联接；如果核糖体结合位点所处位置便于翻译，则是与编码序列可操作地连接。一般来讲，“可操作连接”是指连接的DNA序列是连续的，如在分泌性的前导肽中，序列连续并处于阅读框中。然而，增强子并不需要处于连续的位置上。在合适的限制性内切酶位点进行连接而完成连接。如果不存在这样的位点，按照常规方法利用合成的寡核苷酸衔接头或接头进行。

“Southern分析”或“Southern杂交”是以一个已知的并被标记的寡核苷酸或DNA片段，通过杂交手段确定在DNA或含有DNA的组合物的限制性酶切产物中存在某些DNA序列的一种方法。Southern杂交通常包括在琼脂糖凝胶中电泳分离DNA消化产物，电泳分离后变性DNA，将DNA转移到硝酸纤维素膜、尼龙膜或其它合适的支持膜上，按照Sambrook等(出处同前)9.37-9.52节所述的方法，用放射性标记、生物素标记或酶标记的探针进行分析。

“Northern杂交”或“Northern分析”是用来确定能与已知探针，如寡核苷酸，DNA片段，cDNA或其片段，或RNA片段杂交的RNA序列的一种方法。探针被放射性同位素(如³²p)，或生物素，或酶所标记。待分析的RNA通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，转移到硝酸纤维素膜、尼龙膜或其它合适膜上，采用本领域所通晓的方法对其进行杂交，如Sambrook等(出处同前)7.39-7.52节所述方法。

“严格条件”是指(1)低离子强度和高洗膜温度，如0.015MNaCl/0.0015M柠檬酸钠(SSC),0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)，温度50℃，或(2)在杂交过程中使用变性剂，如甲酰胺，如50％甲酰胺/0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5),750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，温度42℃。另一个例子是50％甲酰胺，5xSSC(0.75M氯化钠，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8),0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt溶液，经超声波处理的鲑精DNA(50μg/ml),0.1％十二烷基硫酸钠，10％硫酸葡聚糖，温度42℃，洗涤在42℃于0.2xSSC和0.1％SDS中进行。参见Sambrook等(出处同前)中的其它严格条件举例。表达盒或表达载体

包含可操作地连接了在宿主细胞中有功能之启动子的编码hK2之重组DNA序列的表达盒或载体可以是环状或线性，单链或双链。一般来讲，表达盒或表达载体是一种嵌合DNA，如质粒DNA，其含有编码区及两侧的调控区，该调控区可促进重组DNA在产生的细胞系中表达。例如，表达盒自身可能含有一个在哺乳动物细胞中有活性的启动子，或能利用已存在于被转化的目的基因组中的启动子。这些启动子包括CMV启动子，SV40晚期启动子和逆转录病毒LTR(长末端重复元件)。除了作为hK2或其部分的转录单位的重组DNA序列外，一部分重组DNA可能不被转录，起到调节或结构作用。

导入细胞中的表达盒或表达载体通常还包括一个选择标记基因或报告基因，或者两者都有，以方便从被转化的细胞群中确定和筛选转化细胞。另外，选择标记可能负载于另一段DNA中，用于共转化过程。选择标记或报告基因两侧都可能有合适的调控序列以使其在宿主细胞中表达。在本领域中熟知各种有效选择标记包括，例如抗生素和除草剂抗性基因，如neo,hpt,dhfr,bar,aroA等，参见Lundquist等人(美国专利NO.5,554,798)的表1。

报告基因可用于鉴定潜在的转化细胞或评价调控序列的功能。编码容易分析的蛋白质的报告基因在本领域是通晓的。一般来讲，报告基因是在受体组织或生物体中不存在或不表达的基因，用一些容易检测的特性(如酶活性)能显示其编码蛋白质的表达。优选的基因包括来源于大肠杆菌Tn9中的氯霉素乙酰转移酶基因(cat)，大肠杆菌uidA位点的β-葡糖醛酸酶基因(gus)，荧火虫Photinus pyralis来源的荧光素酶基因。分析报告基因的表达可在DNA导入受体细胞后的适当时间进行。

其它在宿主细胞中发挥功能的元件，如内含子，增强子，多聚腺苷酸化序列等，也可能成为重组DNA的一部分。这些元件在DNA发挥功能中不一定是必要元件，但可能通过影响转录、mRNA的稳定性等提高DNA的表达。可按需要将这些元件引入DNA中以期转化DNA在细胞中获得最优效果。

常用的构建用于转化目的细胞的重组DNA的方法在本领域是通晓的。可用同样的组合物和构建方法建立本文有用的DNA。例如，J.Sambrook编著的《分子克隆：实验室手册》(冷泉港实验室出版社，第二版，1989)提供了合适的构建方法。转化宿主细胞并回收hK2重组多肽

采用转染能容易地将包括有编码hK2多肽之重组DNA的表达盒或表达载体导入目的细胞，如C.Chen等人在分子细胞生物学7,2745(1987)中优化的磷酸钙沉淀法。转染也可用商品化试剂盒(如BRL公司提供)通过脂转染法进行。

合适于表达hK2多肽的宿主细胞来源于多细胞生物。这些细胞有复杂的加工和糖基化活性。原则上讲，任何高等真核细胞培养物，无论其来源于脊椎动物或无脊椎动物，均可用于本发明中。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定了众多的杆状病毒株，突变型和相应的允许昆虫宿主细胞，如草地夜蛾(毛虫)，埃及伊蚁(蚊子)，白纹伊蚊(蚊子)，黑腹果蝇(果蝇)和家蚕。参见Luckow等，生物/技术，6,47(1988)；Miller等，遗传工程，J.K.Settow等编，第8卷(PlerumPublishing,1986),pp.277-279；Maeda等，自然，315，592(1985)。许多用于转染的病毒株可公开得到，如苜蓿银纹夜蛾NPV的L-1突变株和家蚕NPV的Bm-5株，这些病毒优选可用于转染草地夜蛾细胞。

当hK2多肽在非人类来源的重组细胞中表达时，hK2多肽就完全不含人类来源的蛋白质或多肤。然而，必须从重组细胞蛋白质或多肽中纯化hK2多肤以得到基本同质于hK2多肽的制剂。例如，可通过离心培养基或裂解物除去细胞碎片，然后分离膜及可溶性蛋白质部分。可以从可溶性蛋白质级分中纯化hK2多肽，如有必要，可以从裂解培养物的膜级分中进行纯化。随后可从污染的可溶蛋白质或多肽中纯化hK2多肽，可采用的方法有免疫亲和或离子交换柱分离，乙醇沉淀，反相HPLC，硅胶层析或阴离子交换树脂层析(如DEAE)，层析聚焦，SDS-PAGE，硫酸铵沉淀，凝胶过滤(如利用Sephadex G-75)，或配体亲和层析。

一旦从所得转基因宿主细胞中分离出来，就很容易制备hK2多肽的衍生物和变体。如采用本领域所通晓的将羧基或前体转化成酰胺的方法，也可以制备本发明hK2多肽的酰胺。C末端羧基酰胺化的一种优选方法是从固相支持物上用合适的胺裂解多肽，或者在醇存在的条件下进行裂解，生成酯，随后用合适的胺进行氨基分解作用。

制备hK2多肤的羧基盐可按常规方法将肽与一或多当量的目的碱混合而进行，所述碱例如是金属氢氧化物碱(如氢氧化钠)，金属碳酸盐或碳酸氢盐(如碳酸钠或碳酸氢钠)；或胺基碱，如三乙胺，三乙醇胺等。

本多肽氨基的N-酰基衍生物的制备可通过用N-酰基保护的氨基酸进行最后的缩合反应，或使保护或未保护的肽酰化来完成。制备O-酰基衍生物可通过例如使自由羟基肽或肽树脂的酰化来完成。两种酰化均可采用常规的酰化试剂来完成，如酰基卤化物，酐，酰基咪唑等。如需要，O-酰化和N-酰化可同时进行。另外，图1中hK2的内部氨基酸序列可在指定位置进行1个或2个保守氨基酸的替代(包括用D型而非L型氨基酸进行替代)而得以修饰。

为制备多肽的酸化盐，可向多肽中加入一或多当量的无机酸或有机酸(如盐酸)而进行。多肽的羧基酯也可按本领域所通晓的常用方法进行。hK2多肽变体

已经认识到hK2多肽变体相对于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3或SEQID NO:5至少有1个氨基酸的替换，如相对SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:8在217位有由丙氨酸到缬氨酸的替换。特别地，氨基酸的替换以一种相对保守的方式进行。在表1中，这种保守替换显示在典型替换标题下，更优选的替换示于优选替换的标题下。在引入替换后，筛查产物的生物活性，如产生hK2特异抗体的能力，或与hK2特异抗体(即只与hK2结合而不与hK3(PSA)结合的抗体)特异反应的能力。

表1原始残基典型替换优选替换丙氨酸(A) 缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸缬氨酸精氨酸(R) 赖氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺赖氨酸天冬酰胺(N) 谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸谷氨酰胺天冬氨酸(D) 谷氨酸谷氨酸半胱氨酸(C) 丝氨酸丝氨酸谷氨酰胺(Q) 天冬酰胺天冬酰胺谷氨酸(E) 天冬氨酸天冬氨酸甘氨酸(G) 脯氨酸脯氨酸组氨酸(H) 天冬酰胺，谷氨酰胺，赖氨酸，精氨酸精氨酸异亮氨酸(I) 亮氨酸，缬氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，

苯丙氨酸，正亮氨酸亮氨酸亮氨酸(L) 正亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，用硫氨酸，

丙氨酸，苯丙氨酸异亮氨酸赖氨酸(K) 精氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺精氨酸甲硫氨酸(M) 亮氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸亮氨酸苯丙氨酸(F) 亮氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，丙氨酸亮氨酸脯氨酸(P) 甘氨酸甘氨酸丝氨酸(S) 苏氨酸苏氨酸苏氨酸(T) 丝氨酸丝氨酸色氨酸(W) 酪氨酸酪氨酸酪氨酸(Y) 色氨酸，苯丙氨酸，苏氨酸，丝氨酸苯丙氨酸缬氨酸(V) 异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸

丙氨酸正亮氨酸

本发明范围内的氨基酸替换，一般选用那些不会显著改变它们在维持下述方面的替换：(a)多肽骨架在替换区域的结构，如片层或螺旋构象；(b)分子在目标位点的电荷和疏水性；(c)侧链的大小。根据侧链的性质将天然存在的氨基酸分为以下几组：(1)疏水性：正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸；(2)中性亲水性：半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸；(3)酸性：天冬氨酸，谷氨酸；(4)碱性：天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸；(5)影响链走向的残基：甘氨酸，脯氨酸；(6)芳香族：色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。

本发明也包括非保守替换的hK2变体。非保守替换包括上述组之一中的一个成员改变为另一组中的成员。将氨基酸替换引入本发明中DNA分子是按本领域所通晓的方法进行的。重组hK2多肽的用途

一旦分离出来，即可将hK2多肽及其有抗原活性的变体，衍生物和片段用于对来源于怀疑含hK2或抗hK2抗体之生物材料的样品进行hK2分析，如美国专利No5,516,639中所述。例如，通过如一或多个放射性标记的肽残基，可以将hK2多肽标记上可检测的标志，用于和内源的hK2竞争结合抗hK2抗体，即作为“俘获抗原”与生理液体样品中的抗hK2抗体结合，通过多种竞争免疫测定方式同hK2竞争与可固定的抗hK2抗体的结合，步骤如下：

(a)提供一定量的可附着于固体表面的抗hK2抗体；

(b)混合含有hK2的生理样品和已知量的带有可检测标记的hK2多肽，以形成混合样本；

(c)将所述抗体和所述混合样本充分作用，使抗体和hK2间发生免疫反应，生成一种抗体-hK2复合物，以及在抗体与所述标记多肤之间发生免疫反应以形成抗体-标记多肽复合物。

(d)从混合样本中分离与hK2结合的抗体及与标记多肽结合的抗体；

(e)检测或测定与附着于固体表面的抗体结合的标记多肽以及仍存在于混合样本中的标记多肽的存在或量；

(f)从步骤(e)的结果确定样品中hK2的存在或数量。

在可通过竞争抑制免疫分析检测样品中内源hK2的另一种方法中，向含有未知量内源hK2的样品中加入已知量的抗hK2抗体。选择加入抗体的量，使其比全部结合样品中估计存在的hK2(如在一个前列腺癌患者同样数量的样品材料中可能存在的量)所需的量少一些。然后，将标记有可检测标记的已知量的本发明中hK2多肽或其亚基加入其中。如果内源性hK2存在于样品中，那么很少一些抗体与标记的hK2多肽结合，这样它就会以游离态存在于溶液中；如果样品中无内源性hK2，那么加入的标记多肽就会与抗hK2抗体反应形成二价复合物。随后以抗哺乳动物(绵羊，山羊，小鼠等)的IgG抗体使二价的抗原-抗体复合物沉淀下来。沉淀物(三价复合物)中放射活性或其它标记量与样品中内源性hK2的量成反比。例如，沉淀中放射活性的降低意味着内源性hK2的存在。

除了在实验动物和家畜中制备多克隆抗体或抗血清的常规方法外，可以利用已知的杂交瘤细胞培养技术制备抗hK2多肽的单克隆抗体。一般来讲，这一方法包括制备可产生抗体的融合细胞系，如初级脾细胞与相容的骨髓瘤连续培养细胞系的融合，通过细胞大量培养技术或转入骨髓瘤细胞来源动物或相容动物品系中培养，使融合细胞生长。与接种动物产生的抗体相比，此种抗体有较多优势，例如它们有很好的特异性，灵敏性，并在免疫化学上相对较“纯”。这些抗体的免疫活性片段如F(ab)片段以及部分人源化的单克隆抗体也属于本发明的范围之内。嵌合和修饰抗体

嵌合抗体包括从一种免疫球蛋白来源的可变区与另一种免疫球蛋白来源的恒定区之间的融合。可变区通常来源于另一个种的免疫球蛋白，也许是人。这一技术在本领域中是众所周知的。参见例如欧洲专利申请EP-A-0125 023(Cabilly/Genetech)和EP-A-0120694以及美国专利No4,816,567。这些文献中公开了用重组DNA方法制备免疫球蛋白类分子的变体。

另一种制备嵌合或修饰抗体的途径是将单克隆抗体的可变区与另一非免疫球蛋白分子连接，产生嵌合分子衍生物(参见WO86/01533,Neuberger and Rabbits/Celltech)。另一种方法是制备一种嵌合免疫球蛋白，使其在不同的可变区具有不同的特异性(参见EP68763A)。还有一种方法是向编码单克隆抗体的DNA中引入一个突变，在不改变其基本特异性的情况下改变它的某些性质。这可以通过定点诱变或本领域内所通晓的其它技术完成。

Winter专利申请EP-A-0239400揭示了利用重组DNA技术(“CDR移植”)制备有所改变的衍生化抗体的方法，即用不同特异性的免疫球蛋白的补体决定区替代免疫球蛋白可变区的补体决定区(CDR)。这样，与构架区域的改变相结合，CDR移植技术可以使抗体人源化。

也可以在缺乏天然免疫系统的小鼠体内重建人类的免疫系统，然后免疫该小鼠以产生对免疫原特异的人类抗体，从而制备人抗体。

包含对感兴趣抗原特异的啮齿类抗体CDR区域的人源化抗体，更有可能不被人类免疫系统识别为异己。因此，具有相同结合特异性的人源化抗体，如HK1G464，可能在人类基因治疗和/或诊断中有特异的用途。

操作和/或改变任何已知抗体或编码该抗体的基因，以产生衍生抗体的技术，为本领域所通晓。利用逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测hK2特异的转录物

为了检测编码hK2的RNA转录物，从怀疑有hK2 RNA的细胞样品中分离RNA，如从人前列腺组织中分离总RNA。可采用本领域通晓的方法分离RNA，如利用TRIZOLTM试剂(GIBCO-BRL/Life Techno1ies)。可利用Oligo-dT作为反转录酶反应中的引物从分离的RNA中制备第一链cDNA，产生的cDNA第一链随后在PCR反应中进行扩增。

“聚合酶链式反应”或PCR是指扩增大量选定的核酸片段、DNA和/或RNA的过程或技术，这一技术在美国专利No4,683,195中被详细叙述。通常，根据感兴趣区域两端或两侧的序列信息设计寡核苷酸引物。这些引物与待扩增模板的相对链在序列上相同或相似。可用PCR扩增特异的RNA序列，总基因组DNA来源的特异DNA序列，从总细胞RNA转录的cDNA，噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等，水生生物学冷泉港研讨会，51,263(1987)；Erlich等，PCR技术(StocktonPress,NY,1989)。这样，用PCR对特定核酸序列进行的扩增依赖于含有保守核苷酸序列的寡核苷酸或引物，可由相关基因或蛋白质序列如与哺乳动物hK2基因的序列比较推断出该保守序列。例如，制备一条预计可与编码hK2多肽之DNA的反义链退火的引物，和一条预计可与正义链退火的引物。

通常，分离的RNA在反转录酶(RT)反应中与一个引物配合，产生单链cDNA。O1igo-dT，随机序列寡核苷酸以及序列特异的寡核苷酸均可在逆转录反应中用作引物。参见Sambrook等(出处同前)。随后用序列特异引物扩增单链cDNA产生扩增产物。

为检测扩增产物，通常对反应混合物进行琼脂糖凝胶电泳或其它简易分离技术，并检测hK2特异的扩增产物是否存在。检测扩增的hK2DNA也可通过下述方法进行：将片段从胶中切割或洗脱下来(例如，参见Lawn等，核酸研究，9,6103(1981),Goeddel，核酸研究，8,4057(1980))，将扩增产物克隆到合适载体(如pCR Ⅱ载体，Invitrogen)的克隆位点，测定克隆插入片段的序列，并将该DNA序列与hK2的已知序列进行比较。另外，也可用hK2特异的寡核苷酸探针通过例如Southern杂交检测hK2的扩增DNA，或与已知分子量的DNA标准比较扩增DNA的电泳迁移率。

参照下述详细描述的实施例进一步描述本发明。实施例1材料与方法哺乳动物hK2表达载体的构建

采用一对hK2特异的寡核苷酸引物(5’ACGCGGATCCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCT 3’；SEQ ID NO:9和5’ACAGCTGCAGTTTACTAGAGGTAGGGGTGGGAC 3’；SEQ ID NO:10).从人BPH组织的RNA经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)合成一长约为820bp的cDNA，如图2所示，该cDNA编码整个前原hK2(pphK2)，相对于pphK2转录物起始位点的第40-858位核苷酸。此cDNA的5’和3’端(相对于pphK2的正义链)的两侧分别有BamHⅠ和PstⅠ酶切位点序列。随后，cDNA经琼脂糖凝胶电泳纯化，BamHⅠ和PstⅠ酶切消化。经消化的cDNA与经BamHⅠ-Pstl酶切的pVL1393质粒载体连接并转化到大肠杆菌HB101菌株中。筛选含有pphK2 cDNA/pVL1393质粒载体的大肠杆菌，测定其含有pphK2的插入片段的序列。在大肠杆菌中大量培养质粒pphK2 cDNA/pVL1393并用CsC1梯度超速离心纯化。

依据布达佩斯条款，于1994年5月2日将含有质粒pphK2/pVL1393的大肠杆菌HB101保藏于美国典型培养物保藏中心，分配的登记号为ATCC69614。

以含有pphK2的质粒pVL1393(由Young博士赠送，Mayo Clinic)为模板，利用引物：A(5’ATATGGATCCATATGTCAGCATGTGGGACCTGGTTCTCTCCA3’)(SEQ ID NO:11)和B(5’ATATGGATCCTCAGGGGTTGGCTGCGATGGT3’)(SEQ ID NO:12)通过PCR扩增，得到代表全部pphK2编码区的0.8Kb片段(图2)。将PCR产物插入TA-克隆抗体(Invitrogen Corp.,San Diego,CA)中并测定整个插入片段的DNA序列。

为了得到哺乳动物hK2表达载体，将含有hK2的插入片段从相应的TA克隆中分离出来并插入到pGT-d质粒(Berg等，核酸研究，20,54-85,1992)(由Brian Grinnell赠送，Lilly)中的BclⅠ位点位于GBMT启动子调控下。将来源于相应TA载体的0.8Kb野生型hK2插入片段分别克隆到质粒pLNSX和pLNCX中(Miller等，生物技术，9,980(1989))，从而得到哺乳动物表达栽体PLNS-hK2和PLNC-hK2。插入片段在所有哺乳动物表达载体中的方向由DNA测序鉴定。重组克隆的产生

AV12-664(ATCC CRL-9595)是来源于经腺病毒诱导的叙利亚仓鼠的一个细胞系，Du145细胞培养于补充了10％胎牛血清(D10F)的DMEM(高葡萄糖)培养基中，PC3细胞培养在含10％胎牛血清MEM培养基中。用磷酸钙法(Maniatis等，出处同前，1989)将hK2表达载体转染到AV12细胞中，转染3天后，将细胞重悬于D10F+200nM氨甲喋呤(MTX)中。2-3周后分离抗药的细胞克隆，收集消耗培养基进行Western分析。用脂质转染胺试剂(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)将hK2哺乳动物表达载体转染到PC3和Du145中，在含有400μg/ml G418的培养基中筛选得到PC3-hK2和DU145-hK2克隆。蛋白质的纯化与测序

将AV12-hK2克隆培养在D10F+200nM MTX培养基中，细胞长至约60％融合时，用Hanks平衡盐溶液洗涤细胞，并将其重悬于无血清的HH4培养基中。加入无血清的消耗培养基7天后收集消耗培养基并贮存于-20℃。为了纯化蛋白质，将无血清的消耗培养基浓缩，换成pH8的50mM碳酸氢钠溶液。样品经0.2μ滤器过滤后直接泵入TSK DEAE-5PW HPLC柱，21mm×150mm，流速为5ml/分钟。缓冲液A中含有pH7.9的50mM碳酸氢钠，缓冲液B含有50mM碳酸氢钠和0.5M氯化钠，pH7.6。用如下梯度洗脱得到洗脱曲线：0-50％的缓冲液B35分钟，第35-40分钟为50-100％的缓冲液B,100％缓冲液B无梯度洗脱5分钟，然后用缓冲液A进行重新平衡。流速一直保持5ml/分钟。在以上步骤中，可用硼酸盐缓冲液代替碳酸氢盐缓冲液，并不会产生显著影响。

采用干燥ELISA法(如下)，用兔抗pphK2抗体检测DEAE级分中hK2的存在(Saedi等，分子细胞内分泌学，109,237(1995))。汇集有hK2活性的各级分，用膜(10KD截留分子量)经超滤将其浓缩至约5-8ml，加入固体硫酸铵至终浓度1.2M。样品上样至PolyLC聚丙烯天门冬酰胺柱，孔径1000A,4.6mmX200mm，以通过疏水作用层析(HIC)分离蛋白质。缓冲液A含有20mM磷酸钠，1.2M硫酸钠，pH6.3；缓冲液B含有50mM磷酸钠，5％异丙醇，pH7.4。洗脱梯度是0-20％缓冲液B5分钟，第5-20分钟为20-55％缓冲液B，第20-23分钟为55％缓冲液B无梯度洗脱，第23-25分钟为55-100％的缓冲液B洗脱，再100％缓冲液B无梯度洗脱2分钟，然后缓冲液A重平衡，流速1ml/分钟。含有hK2的HIC洗脱峰在约50％的缓冲液B中洗脱下来，经Centricon-10(Amicon)(截留分子量10KD)超滤重复浓缩后换成50mM(pH8)的硼酸盐缓冲液中。用SDS-PAGE和Western杂交分析测定其纯度。用于估计hK2^v217浓度的消光系数为1.84A₂₈₀=1mg/ml。

某些情况下，含有hK2的HIC峰进一步用10/30 Pharmacia S12柱经大小排阻层析(SEC)进行纯化。在这种纯化中，含有hK2的HIC峰如上述超滤而浓缩至小于1ml，然后上样到经100mM pH7的乙酸铵或pH8的硼酸钠缓冲液平衡的大小排阻层析柱上。流速为0.7ml/分钟，随后将hK2峰超滤浓缩。将从大小排阻层析柱中收集到的于乙酸铵中的峰经冷冻干燥除去缓冲液，再重溶于水中。取一部分样品于112℃真空状态下在气态的6N盐酸中水解20小时，再重溶于0.1N盐酸中，用Hewlett Packard Amino quant氨基酸分析仪分析，用OPA对伯胺进行氨基酸柱前衍生化作用，用MOC对仲胺进行氨基酸柱前衍生化作用。

用HK1G586.1(如下)亲和树脂对hK2进行亲和层析纯化。按照Schneider(生物化学杂志，257,10766(1982))的方法将HK1G586.1单克隆抗体(mAb)与Pharmacia GammaBind Plus Sepharose(cat.No.17-0886)结合，简述如下：将HK1G586.1单克隆抗体与树脂在4℃条件下旋转搅拌过夜。对树脂离心(500xg 5分钟，4℃)，用0.2M三乙醇胺(pH8.2)洗涤树脂2次。室温(22℃)条件下，在新配制的交联剂(0.2M三乙醇胺，pH8.2中的25mM dimethyl pimelimidatedihydrochloride)中将胺基交联45分钟。在20mM pH8.2的乙醇胺中室温下淬灭树脂5分钟，后用1M氯化钠、0.1M的磷酸根，pH7.0洗涤2次，再用磷酸缓冲盐溶液洗涤树脂2次，于4℃保存于0.05％NaN3中备用。

采用Applied Biosystems Model 477a脉冲液相测序仪对蛋白质和肽进行测序。477a型测序仪应用自动Edman降解化学，使氨基酸从N末端顺序释放，随后形成PTH衍生物并由反相HPLC进行色谱分析。将肽样品上样于测序仪经biobrene处理的玻璃纤维滤膜支持物上，全蛋白质样品上样于经biobrene处理的滤膜上，或上样于已预先激活的Porton滤膜上(Beckman,Fullerton,CA)，测序仪下来的样品印迹首先在Novex系统(Novex,San Diego,CA)中以微凝胶进行电泳，然后转至Problot PVDF膜上，以考马斯亮蓝显色，切下适当条带后直接从PVDF膜上测序。单克隆抗体的制备

第一天将于完全福氏佐剂(CFA)中的50μl phK2腹膜内注射A/J小鼠，第14天腹膜内注射于不完全福氏佐剂中的phK2 25μg，并在第28天腹膜内注射溶于PBS的phK2 25μg。融合3天前，以10μg溶于PBS的phK2静脉内强化小鼠免疫。杀死小鼠后，由脾脏制得单细胞悬液。将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞P3.653融合，以ELISA筛选克隆化杂交瘤细胞，并依据其对hK2^v217上清和phK2^v217上清的反应性以及与PSA的最小反应性进行选择。根据这些标准得到2个克隆HK1G464和HK1G586，用FACstar脉冲细胞分选仪将单个杂交瘤细胞分配到小鼠脾饲养层上进行亚克隆。亚克隆HK1G464.3和HK1G586.1被用于进一步分析。

除了免疫原为hK2^v217，用明矾代替CFA和IFA，用BALB/C小鼠代替A/J小鼠外，采用与上述相同的步骤进行另外一种融合，得到克隆HK1H247。

根据布达佩斯条约，将杂交瘤克隆HK1G464.3,HK1G586.1,HK1H247,HK1A523和HKD106.4保藏于美国典型培养物保藏中心，登记号分别为HB11983,HB12026,HB12162,HB11876和HB11937。hK2肽免疫原的单克隆和多克隆抗体的制备

将于完全福氏佐剂(CFA)中的100μg KLH偶联肽皮下接种绵羊和山羊，间隔3周，用于不完全福氏佐剂(IFA)中的100μg肽加强免疫。

为制备肽免疫原的单克隆抗体，将100μg于完全福氏佐剂(CFA)中的KLH偶联的肽皮下接种免疫Balb/c小鼠，间隔三周，用于不完全福氏佐剂中的100μg肽加强免疫。或者，用50μg偶联了KLH的肽腹膜内注射免疫A/J小鼠二次，对阳性滴度的小鼠用25μg偶联剂静脉内加强免疫一次。

在前三次免疫后，免疫注射后6-10天取动物血对抗体进行测试。将肽固定于0.25英寸聚苯乙烯小珠上(Clifton,Clifton Heights,PA)，平均每一个小珠与1μg牛血清白蛋白偶联的肽在pH9.6的碳酸盐缓冲液中4℃温育过夜。用含有0.1％吐温20的0.01M磷酸缓冲盐溶液，pH7.4(PBS)洗涤小珠3次，用1％脱脂奶粉和1％BSA进行封闭。将小珠与250μl 1∶100,1∶1000或1∶10000稀释度的动物血清共同温育18小时。洗涤3次后，每小珠同与辣根过氧化物酶(Cappel-OrganonTeknica Corp.,Durham,Nc)偶联的250μl兔抗绵羊，兔抗小鼠或兔抗山羊抗体，以150rpm在水平培养器上温育3小时。以邻苯二胺为底物，用分光光度计定量检测酶信号。以未免疫的血清作阴性对照，并以对照读数的倍数来表示免疫血清的测量值。

将从呈阳性血清滴度的小鼠脾中分离的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞。用上述方法对这些细胞克隆产生的抗体进行筛选。用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆和再筛选。将单克隆杂交瘤注射到原初小鼠的腹腔内以产生腹水。

为了纯化单克隆和多克隆抗血清，首先用饱和硫酸铵沉淀及超凝胶ACA-34柱进行分子大小层析而对抗血清进行IgG分离。利用通过将肽经溴化氰偶联于Sepharose 4B而制成的柱进一步亲和层析纯化多克隆抗体。用酸性PBS(pH2.45)将纯化抗体从柱上洗脱下来。ELISA分析

应用干燥ELISA分析测定这些克隆的无血清消耗培养基中的hK2和hK2纯化过程中收集级分中的hK2。37℃下，用50μl消耗培养基或柱级分覆盖微滴定板(Becton Dickinson Labware,NJ)过夜。用含0.1％吐温20的PBS(PBST)冲洗各孔，并用50μl一抗温育1小时。用PBST再次冲洗培养孔，加入偶联有辣根过氧化物酶(1∶500,JacksonImmunosearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)的50μl羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG-Fc抗体在37℃温育1小时。用PBST冲洗培养孔，与邻苯二胺二氢氯化物(OPD,Sigma,MO)温育5分钟，用ELISA读数仪(Biotek Instruments,Inc.,EL310型，VT)测定显色反应在A490的读数。所有样品均分析二次，以转染了空质粒的AV12细胞的消耗培养基作阴性对照。

在液相ELISA中，可用生物素化的phK2^v217,hK2^v217和PSA对抗体进行测试。按照Sensabaugh和Blake(泌尿学杂志，144,1523(1994))的方法纯化PSA。将稀释于50μl缓冲液A(8.82mM柠檬酸，82.1mM磷酸钠(二价碱)，10％牛血清白蛋白，0.1％甘露糖醇，0.1％Nonidet P-40,pH7.0)中的20ng生物素化的hK2^v217或phK2^v217，或者稀释于含10％马血清(HS)的PBS中的0.25ng生物素化PSA与50μl杂交瘤上清，阴性对照上清(即，对于phK2^v217和hK2^v217，为无关的杂交瘤上清，对于PSA，为无关的溶于马血清中的20μg/ml纯化单克隆抗体)，或阳性对照上清(即，对于PSA为20μg/ml溶于马血清中的纯化单克隆抗体PSM773(抗PSA)，或对于phK2^v217和hK2^v217为杂交瘤HK1D104(抗hK2)的上清)共同温育。一种抗hCG的单克隆抗体HC0514在PSA分析中用作阴性对照，在hK2分析中，一种抗tau的单克隆抗体ZTG085用作阴性对照。

将这些抗体和抗原的混合物在链亲和素包被的微滴定板(Labsystems,Helsinki,Finland)中温育1小时，不断振荡。用300μl含有0.1％吐温20的PBS(PBST)冲洗滴定板三次，与1∶10000稀释于HS的100μl辣根过氧化物酶偶联的γ特异性山羊抗鼠IgG抗体(Jackson Immuno Research Laboratories,Inc.,Westgrove,PA)振荡温育1小时。第二次用PBST冲洗后，加入100μl于50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，0.03％高硼酸钠，pH5.0(SigmaChemical,St.Louis,MO)中的1mg/ml邻苯二胺，振荡显色30分钟。加入50μl 4N硫酸终止反应。用微滴定板读数计测量490nm和540nm处的光吸收以确定颜色强度。490nm吸收值超过2.6时用540nm处的读数来修正。样品测量值为平均数±三次测量的标准差，对照值为二次测量的平均数。Western杂交分析

采用标准步骤进行Western杂交分析。用Centricon10(AmiconInc.,Beverly,MA)将无血清的消耗培养基浓缩10倍，在12％的凝胶中进行SDS/PAGE电泳(Bio-Rad Inc,Melville,NY)。为了分析目的，用Pharmacia PhastSystem在8-25％梯度胶上进行SDS/PAGE电泳。电泳结束后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，4℃条件下用PBS中的2％脱脂奶粉封闭过夜。杂交膜经冲洗后与一抗(1∶1000稀释的腹水，或者1μg/ml纯化的单克隆抗体或多克隆抗体)在22℃下温育1小时，然后冲洗杂交膜并与二抗(1∶500稀释的偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗鼠抗体或偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗兔抗体，JacksonImmunosearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)温育。用DAB(Sigma,St.Louis,MO)和双氧水，或按操作手册使用ECL系统(Amersham,Buckinghamshire,England)使杂交条带显色，从而检测免疫反应性条带。共价复合物的形成

为测试共价化合物的形成，将0.175μM的hK2与20μM的抑制剂在pH8条件下温育于100mM硼酸盐缓冲液中。测试的抑制剂包括1-抗胰凝乳蛋白酶，1-抗胰蛋白酶，1-抗纤溶酶，抗凝血酶和2-巨球蛋白。向5μl hK2(10μg/ml)中加入制备于100mM硼酸盐缓冲液中的计算量抑制剂，如有必要，可将每份样品的总体积调整到10μl。样品在37℃温育3小时，加入1.5μl含35％β-巯基乙醇的7xPhastSystem SDS样品缓冲液，水浴煮样品3分钟。在样品进行SDS/PAGE和Western杂交前将样品1∶4稀释于SDS样品缓冲液中。肽底物的蛋白质水解

为了检测hK2切割肽底物的能力，将肽以10mg/ml的浓度溶于二甲基亚砜(DMSO)中，然后用100mM pH8的硼酸盐缓冲液进行1∶10稀释，该缓冲液中含有PSA,hK2或胰蛋白酶。典型的实验步骤如下：将1μl肽加入7μl 100mM硼酸盐缓冲液中，随后加入2μl hK2(10μg/ml)，PSA(500μg/ml)，或胰蛋白酶(0.5μg/ml)。通常样品在37℃温育16小时。

用100μl 0.2％TFA/水失活样品，直接上样于Vydac C-18反相柱中，该柱与配置有AS100自动上样器、双1350泵和Biodimension扫描式UV-VIS探头的Biorad Model 800HPLC连接。溶液A为0.1％TFA/水，溶液B为含有0.1％TFA的乙腈。样品在90％的溶剂A中上样，10分钟内，梯度变为60％的溶剂B。同时在220nm和280nm处监测吸收值。

以真空离心或冷冻干燥浓缩HPLC收集下来的峰，随后上样到氨基酸测序仪中以确定各个片段。有时将10μl的灭活样品直接上样到测序膜上，并且，因为序列是已知的，故通过每个循环中氨基酸的分布来确定切割位点。用生色底物进行蛋白酶分析

对硝基苯胺衍生化底物水解的检测是以配有可编程和热稳定的7室托架的HP8452A UV-VIS分光光度计进行的。在温育于37℃的100mM硼酸钠溶液pH8中进行测试，测定其在405nm的吸收强度增加值。甲氧基琥珀酰-精氨酸-脯氨酸-酪氨酸-对硝基苯胺(MeO-Suc-R-P-Y-pNA)和H-D-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(P-F-R-pNA)在测试中的浓度为1mM。

采用标准FastMoc化学的ABI 431A型肽合成仪合成图16中所列的除2号和5号以外所有的肽，2号为血管紧张肽原和5号氧化型胰岛素β链，均购自Sigma。用质谱仪通过ES/MS确定每一合成肽链的分子量，并用上述ABI 477a型测序仪证实肽序列。phK2^v217向hK2^v217的转化

将于50mM硼酸钠中的100-400μg/ml phK2^v217样品在37℃下与1％(重量比)胰蛋白酶或hK2共同温育。监测从前体蛋白质向成熟蛋白质的转化过程，这是通过取1-2μg的hK2^v217起始材料稀释于100μl HIC缓冲液中，如上所述用HIC-HPLC将2种形式分开而进行的。除如图17B所示将数量有可比性的这两种形式同时温育外，以同样方式进行hK2^v217和phK2^v217的温育。实例2哺乳动物细胞中hK2^v217的表达与纯化

为了在哺乳动物细胞系中表达hK2，用PCR方法扩增hK2(pphK2)(图2)的全部编码序列0.8Kb片段，亚克隆到PCRII(TA)载体中并分离到几个克隆。测定其中几个克隆的整个pphK2插入片段的核苷酸序列，以检测可能由PCR扩增产生的突变。

选出二个克隆作进一步分析，其中克隆TA-hK2含有野生型hK2插入片段，另一个克隆TA-hK2^v217含有突变的hK2插入片段。TA-hK2^v217在hK2的650位密码子含有一个C到T的替换，导致hK2 217位的氨基酸残基发生丙氨酸(GCT)到缬氨酸(GTT)的保守型替换(图2)。为了得到哺乳动物表达载体，将TA-hK2和TA-hK2^v217的pphK2插入片段亚克隆到PGT-d质粒中，使它们处于GBMT启动子的控制之下，从而得到pGThK2和pGThK2^v217质粒(图3)。GBMT启动子包含几个调控序列，并能被腺病毒Ela蛋白质激活(Berg等，出处同前，(1992))。

为了检测pphK2^v217基因产物能否在哺乳细胞中表达，将质粒pGThK2^v217转染到AV12-664细胞中。该细胞系来源于受12型腺病毒感染的叙利亚仓鼠产生的肿瘤，能表达腺病毒Ela蛋白质。Ela蛋白质激活GBMT启动子，从而使其控制下的基因开始表达。2-3周后，分离抗MTX的细胞克隆，用Western杂交分析其消耗培养基。鉴定了几个能向培养基中分泌一种能与抗pphK2抗血清起免疫反应的多肽的克隆。其中一个克隆(AV12-pGThK2^v217#2)被选出来做进一步的鉴定和蛋白质纯化。

为了纯化hK2多肽，收集AV12-pGThK2^v217细胞2号克隆培养7天后的无血清消耗培养基，浓缩，并进行阴离子交换层析(图4A)。经ELISA分析确定有hK2活性的峰在0.2M NaCl梯度附近洗脱下来(虚线)。ELISA测试与同样级分的SDS/PAGE中出现一条约34KD的蛋白质条带这一结果相符。

收集阴离子交换柱下来的hK2阳性级分，进行疏水作用层析(HIC)(图4B)。A₂₈₀的主要部分不停留在HIC柱中。主峰停留在HIC中，该峰在22分钟洗脱下来，并在ELISA测试中显示了最高的活性(图4C中虚线)。SDS/PAGE也能看到一条约34KD的主要蛋白质带。经SEC对从HIC中下来的22分钟洗脱峰进行分离发现，一般80-90％的蛋白质A₂₈₀在19.4分钟时被洗脱下来，保留时间与大约34KD的蛋白质相符(图4C)。SEC仅有的另一蛋白质峰在16.7分钟时被洗脱，对应于以前纯化步骤中观察到的大约70KD的蛋白质。

为进一步确定纯化的蛋白质，将大约2.5μg的该蛋白质加到自动N端分析仪上，得到如下序列结果：Val-Pro-Leu-Ile-Gln-Ser-Arg-Ile-Val-Gly-Gly-Trp-Glu-。Edman降解中顺序释放的氨基酸曲线未见明显的竞争序列。由PSA类推得出，此蛋白质是phK2^v217，因为已知成熟PSA的序列(由精液中分离)开始为Ile-Val-Gly-，而pPSA和phK2被认为在N末端有7个额外的氨基酸(图2)。对这个蛋白质的氨基酸分析结果与phK2^v217推测的序列一致。分离此phK2多肽并纯化得到毫克级样品。实施例3phK2^v217的鉴定和hK2^v217的生成

为了测定实施例2中纯化方案的效果，将1.5μg纯化的phK2^v217在有或者没有β-巯基乙醇(BME)的条件下进行SDS/PAGE电泳，并用银染处理凝胶，结果显示样品中phK2^v217的纯度为95％左右(图5)，同时显示无BME时，phK2^v217以30KD左右泳动，而在有BME时，以34KD左右泳动。这一情况与从精液中纯化的PSA的观察结果一致(图5)。

从cDNA序列推测的hK2氨基酸序列显示，在78位残基(N-M-S)处存在一个潜在的N-糖基化位点。为确定这一位点是否糖基化，将phK2^v217进行SDS/PAGE电泳，转移到硝酸纤维素膜上，与地高辛配基(DIG)偶联的凝集素反应，随后加用辣根过氧化物所标记的抗DIG抗体反应。

在图6(1泳道)中，伴刀豆球蛋白质A(ConA)对2μg phK2的染色提示蛋白质中存在两个非取代的或2-0-取代的α-甘露糖残基，2泳道为ConA染色的阳性对照糖蛋白-单克隆抗体ZCE025，该单克隆抗体的重链(50KD)和轻链(25KD)均有以甘露糖为核心的N联寡糖。3泳道显示非糖基化蛋白(BSA)不与ConA凝集素反应。phK2^v217也与RCA(Galbl-4GlcNAc特异性，和AAA(α(1-6)联岩藻糖特异性)起反应。这种凝集素反应形式与复合N联寡糖的存在相符。phK2^v217中的寡糖也含有唾液酸，因为SNA(唾液酸α(2-6)连接于半乳糖)和MAA(唾液酸α(2-6)连接于半乳糖)均能与phK2^v217反应。

hK2的前体区序列为VPLIQSR，在此前体序列中的精氨酸羧基端酶切能将phK2转化成hK2。设计温和的胰蛋白酶消化使其在纯化的phK2^v217这一位点将肽键水解。将phK2^v217与1％胰蛋白酶一起温育，用HIC-HPLC监测此转化过程(图7)。这一步骤使phK2^v217完全转化为hK2^v217。将确认为是hK2^v217的峰进行N-末端测序，证明其序列为IVGGWE，该序列正是hK2成熟形式的N端序列。未检测到除上述序列外的其它序列，说明胰蛋白酶的温和水解没有产生任何明显水平的非特异性切割。经胰蛋白酶处理的样品在SDS/PAGE中发现迁移率有很小的但可辩别的增加，与分子量上存在826道尔顿(前肽分子量)的很小减少相符。实施例4hK2特异抗体的制备

以phK2^v217和hK2^v217作免疫原来产生针对hK2的单克隆抗体。以对hK2^v217或phK2^v217的高反应性和对PSA的最小反应性为标准筛选杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞中得到的单克隆抗体代表如表2所示。以phK2^v217免疫产生HK1G586.1单克隆抗体和HK1G464.3单克隆抗体。HK1G586.1是hK2特异的，因为它能识别phK2^v217和hK2^v217，但不识别PSA。另一方面，HK1G464是phK2特异的，因为它仅识别phK2^v217，而不识别hK2^v217或PSA。

表2针对hK2^v217和phK2^v217产生的各种单克隆抗体的特异性

A．针对phK2^v217产生的单克隆抗体

单克隆抗体	PSA	hK2^v217	phK2^v217
单克隆抗体	PSA	hK2^v217	phK2^v217	无关抗体	0.245	0.162	0.125
阳性对照	2.242±0.06	9.196	8.91±0.02	无关抗体	0.245	0.162	0.125
阳性对照	2.242±0.06	9.196	8.91±0.02	HK1G586.1(10μg/ml)	0.150±0.004	11.154±0.18	10.146±0.87
HK1G464.3(腹水1∶2000)	0.143±0.03	0.245±0.02	6.644±0.17	HK1G586.1(10μg/ml)	0.150±0.004	11.154±0.18	10.146±0.87

B.针对hK2^v217产生的单克隆抗体

测试单克隆抗体	PSA	hK2^v217	phK2^v217
测试单克隆抗体	PSA	hK2^v217	phK2^v217	无关抗体	0.157±0.18	0.132±0.01	0.153±0.01
阳性对照	2.768±0.08	8.342±1.3	9.673±0.99	无关抗体	0.157±0.18	0.132±0.01	0.153±0.01
阳性对照	2.768±0.08	8.342±1.3	9.673±0.99	仅培养基(阴性对照)	0.129±0.02	0.240±0.02	0.247±0.01
HK1H247	0.157±0.01	9.34±0.7	0.179±0.004	仅培养基(阴性对照)	0.129±0.02	0.240±0.02	0.247±0.01

以hK2^v217免疫产生单克隆抗体HK1H247。这一抗体是hK2特异的，因为它仅识别hK2^v217而不识别phK2^v217或PSA。这些结果显示phK2^v217和hK2^v217是产生对不同hK2形式有特异性的单克隆抗体的有效免疫原。

用Western杂交来分析HK1G586是否识别精液中的hK2(图8)。这一单克隆抗体识别约22KD,33KD和85KD处的hK2免疫反应条带。最近Deperthes等，生物化学及生物物理学学报，1245,311(1995)也报导了在精液中相似的hK2免疫反应模式。这一结果表明针对hK2^v217的单克隆抗体能识别精液中的天然hK2。针对hK2^v217或phK2^v217产生的所有抗体均识别hK2的相应形式，这表明hK2和phK2在免疫学上分别类似于hK2^v217或phK2^v217(见下述)。

为了制备其它的抗hK2抗体，对人类激肽释放酶基因各成员的一级序列进行了比较，并用计算机辅助分析抗原性和疏水性。根据比较结果，选出了几个hK2寡肽序列。被选取的hK2肽分别对应于成熟hK2氨基酸残基的8-26位(SEQ ID NO:19),15-26位(SEQ ID NO:26),41-56位(SEQ ID NO:20),43-66位(SEQ ID NO:24),153-167位(SEQID NO:21),17-71(SEQ ID NO:22)和210-235(SEQ ID NO:25)。合成对应于17-71位氨基酸的肽以增加产生识别天然hK2形式的抗体的可能性。在Mayo Clinic/Foundation蛋白质中心试验室合成并以HPLC纯化诸肽。将肽分别与匙孔戚血蓝蛋白(KLH)和BSA偶联以作为免疫原和分析试剂。以KLH-hK2免疫绵羊、山羊和小鼠以生成多克隆抗体(绵羊为SEQ ID NO:20和21，山羊为SEQ ID NO:19、20、21、24、25、26)和单克隆抗体(小鼠，为SEQ ID NO:19、20、21、24、25和26)。将17-71肽(SEQ ID NO:22)氧化以在其26位和42位半胱氨酸之间产生分子内二硫键，用来免疫山羊和小鼠，以分别制备多克隆抗体和单克隆抗体。

首先用hK2 41-56肽亲和层析柱纯化来自绵羊的hK2 41-56抗体，然后用于Western杂交分析。该抗体能识别重组hK2。hK2 41-56抗体对hK2的检测可被过量加入的hK2 41-56肽所消除，但却不能被PSA41-56肽消除。并且抗hK2 41-56肽的单克隆抗体在Western分析中对hK2蛋白质高度特异。

抗hK2 153-167肽的抗血清(绵羊)识别重组的hK2。这些结果显示，针对肽41-56和肽153-167的抗体与hK2多肽的2个不同表位反应。

抗hK2 210-235位氨基酸残基的抗血清表现了最高的免疫反应性。

hK2 17-71肽与PSA对应区域同源性为69％，针对hK2 17-71肽的山羊抗血清识别重组hK2蛋白但不识别PSA。

针对细菌表达的重组hK2蛋白质的兔抗血清能识别PSA和hK2，其在用雄激素处理的LNCaP细胞的浓缩培养基中检测到一对蛋白质条带，而在未经雄激素处理的LNCaP细胞的培养基中则未检测到免疫反应性蛋白质，说明这些免疫反应性蛋白质是由雄激素诱导的。并且，LNCaP培养基中上面一条带是PSA相关蛋白质，因为PSA特异性抗血清(兔抗PSA抗血清，针对细菌表达的重组PSA产生的)主要检测到该条带。因为对hK2有单一特异性的抗hK2 41-56肽的小鼠单克隆抗体(HK1A523)识别LNCaP培养基中下面一条带，这说明它是hK2相关蛋白质。通过对这两条带中每一蛋白质N-末端氨基酸的序列分析也确定了这一结果。

用hK2 41-56肽的单克隆抗体(HK1A523)对石蜡包埋的人前列腺组织切片的组织化学染色结果(见实施例10)显示，如PSA一样，hK2产生于上皮细胞中，而在基质细胞中不产生。并且，免疫染色对前列腺组织中hK2蛋白是特异的，因为其它组织中hK2检测均为阴性。实施例5hK2在哺乳动物细胞中的表达

为了在哺乳动物细胞中表达野生型hK2(hK2)，将pGThK2(图3)转染到AV12细胞中。用HK1D106.4(一种针对对应于hK2 17-71位氨基酸残基的多肽产生的hK2特异性单克隆抗体)，通过Western分析鉴定了几个表达hK2多肽的克隆。AV12-hK2 27号克隆(AV1-hK2)因其较高的hK2表达水平而被选出来做进一步的分析。转染空载体(pGTD)的细胞与HK1D106.4没有反应性。

用HK1D106.4单克隆抗体进行ELISA测试表明，在培养7天的AV12-hK2无血清消耗培养基中存在浓度为0.5-1μg/ml的hK2多肽。利用与从AV12-hK2^v217中纯化phK2^v217的相同方法，从AV2-hK2培养7天的消耗培养基中纯化hK2多肽。得到的纯化hK2多肽产率较低，并且多肽对纯化过程不稳定。

将经过上述方法部分纯化的hK2多肽进行SDS/PAGE电泳，电转膜并进行N末端氨基酸测序。分析表明AV12-hK2培养7天的消耗培养基中hK2多肽的N末端序列为IVGGWECEK。由Edman降解步骤顺序释放的氨基酸图谱未见明显的竞争序列。与PSA比较得知，该序列对应于成熟的hK2(hK2)。蛋白质的氨基酸分析也表明与hK2相符。

该发现表明，在AV12-phK2^v217培养7天的无血清消耗培养基中，phK2^v217是主要成份，而在AV12-hK2培养7天的无血清消耗培养基中，hK2是主要成分。为了检测AV12-hK2培养1天的无血清培养基中hK2的存在形式，用HK1G586.1单克隆抗体对其进行亲和层析以部分纯化。将34KD的蛋白质转移到PVDF膜后进行N末端分析，得到序列为VPLIQSRIVGG。由Edman降解步骤顺序释放的氨基酸图谱未见明显的竞争序列。与PSA比较得知，这个序列对应于phK2。这揭示，在AV12-hK2和AV12-hK2^v217细胞中，hK2多肽均是以前体形式被分泌的。然而phK2^v217稳定，不转化成hK2^v217，而phK2不稳定，容易在细胞外转化成hK2。实施例6hK2的生物合成

为进一步研究hK2在哺乳动物细胞中的生物合成，每天收集AV12-hK2细胞27号克隆的无血清消耗培养基，连续8天，浓缩后进行SDS/PAGE电泳，进行时间分析。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并用HK1D106.4或HK1G464.3单克隆抗体探测(图9)。如图9所示，HK1D106.4识别phK2和hK2两种多肽，而HK1G464.3仅识别phK2，因为其表位位于hK2的-7-+7区域。以HK1D1.064单克隆抗体检测时，hK2多肽(约34KD)的表达在第3天达到最高，随后进入稳定期。培养4天后，能检测到另外两条以约70KD和约90KD迁移的免疫反应条带。

另一方面，将同样样品转膜并用HK1G464.3进行探测时，到第4天时能检测到hK2水平逐渐降低。到第8天，只有非常低水平的hK2存在于消耗培养基中。这一结果表明AV12-hK2细胞将phK2分泌到培养基中，并在胞外逐渐转化为hK2。奇怪的是，用HK1G464.3探测时，并未发现70KD和90KD这两条带，说明这些条带或是hK2的同型寡聚体，或是与另一未知蛋白质共价复合的hK2。虽然目前尚未确定这些条带的身份，但它们可以作为消耗培养基中hK2的存在标志。图9中，用纯化的phK2^v217和hK2^v217蛋白做对照。

为研究hK2^v217在AV12细胞中的生物合成，对AV12-hK2^v217细胞2号克隆作了一个类似的时间研究。如图10所示，以HK1D106.4单克隆抗体探测，hK2^v217多肽的表达在第3天达到最高，第4天后无大的变化。以HK1G464.3单克隆抗体作探针探测该印迹时获得类似的结果(图10)。这些结果显示，AV12-pGThK2^v217细胞2号克隆从第1天开始表达phK2^v217，至少在随后的8天中持续表达，这种蛋白质并不转化为成熟形式。这些结果与phK2的结果不同，如果在培养基中保留8天，phK2会转化成hK2，这就说明了phK2^v217在37℃培养基中8天内是稳定的。

为研究细胞外phK2向hK2的转化是否与培养物中AV12-hK2细胞27号克隆的活力相关，用台盼兰排除法对27号克隆细胞计数。用HK1D106.4和HK1G464.3两种单克隆抗体对消耗培养基中hK2的表达进行ELISA检测。如图11所示，培养物中存活细胞的数量在第3天时最高，达到3800万，随后逐渐减少。到第8天，存活细胞减少到1000万。phK2的表达(以HK1G464.3检测)也在第3天达到最高，并随后逐渐减少。

另一方面，hK2的表达(HK1D106.4检测)在第3天达到峰值，随后进入稳定期。这一结果表明AV12-hK2细胞分泌phK2，到第4天时，一部分phK2在胞外被逐渐转化成hK2。此外，结果显示phK2向hK2的转化与细胞活力的降低明显相关，表明由死亡细胞释放的胞外蛋白酶可能是这一转化的因素之一。细胞最有活力时hK2的表达最高。hK2的减少平行于细胞活力的降低，表明hK2是由这些细胞分泌的，而不是在这些细胞死亡和裂解后才释放出来。同时，hK2的升高与phK2的降低相对应，说明随着时间的发展，hK2的前体形式被自动转化为成熟形式。

为检测hK2在前列腺癌细胞中的生物合成，使hK2在DU145和PC3细胞系中表达。将编码pphK2的DNA克隆到pLNCX和pLNSX质粒(Miller和Rosman，生物技术，7,980(1989))中，使其分别在CMV和SV40启动子的控制之下，分别得到pLNC-hK2和pLNS-hK2质粒。将这两种质粒分别转染到PC3和DU145细胞中，并在含G418的培养基中进行筛选。用ELISA和Western杂交的方法筛选高水平表达hK2的克隆(PC3-hK2和DU145-hK2)。

为了评价hK2和phK2在培养基中的表达水平，利用单克隆抗体HK1D106.4(hK2特异)和HK1G464.3(phK2特异)，对PC3-hK2和DU145-hK2细胞的无血清培养基进行Western杂交(图12)。结果显示phK2存在于DU145-hK2和PC3-hK2的消耗培养基中，表明前列腺癌细胞中hK2是以phK2形式分泌的，并在胞外转化成成熟形式。这个发现证实了以前由AV12细胞得到的结果。甚至培养7天后，PC3-hK2细胞的消耗培养基中phK2仍为优势成分，而从第1天开始，hK2即为DU145-hK2细胞的无血清培养基中的优势成分。这可能是因为DU145消耗培养基中存在丰富的胞外蛋白酶。

为了检测以上结果是否仅局限于1个克隆，检测了另外3个独立分离的AV12-hK2克隆和另外4个独立分离的AV12-hK2^v217克隆中hK2多肽的表达。在第7天收集这些克隆的无血清培养基，利用HK1D106.4(HK2特异)和HK1G464(phK2特异)单克隆抗体为探针，对hK2的表达进行Western分析(图13和14)。在所有AV12-hK2克隆中，HK1D106.4单克隆抗体不仅检测到主要的34KD条带(hK2)，也检测到指示hK2存在的70KD和90KD条带(图13)。HK1G464.3在所有AV12-hK2克隆中检测到非常低水平的phK2(图14)。这一结果表明，所有AV12-hK2细胞克隆的消耗培养基中主要存在hK2，验证了在AV12-hK2细胞27号克隆中建立的生物合成机制。对AV12-hK2^v217克隆做同样分析(图14)，结果表明这些克隆第7天的消耗培养基中仅有phK2^v217的存在，验证了我们在AV12-hK2^v217克隆中的发现。

综上所述，以上结果表明hK2在哺乳动物细胞中以前体形式表达，并在胞外被尚不知道的酶转化为成熟形式。这些结果也表明phK2可能存在于生物液体中，因此能作为pCa和BPH的一个有用诊断指标。实施例7hK2和hK2^v217的酶活性和特异性

将少量hK2纯化到足以用来分析其酶活性和底物特异性的纯度，通过测定hK2对肽的对硝基苯胺衍生物的生色性酰胺水解活性来检测hK2的一般活性(表3)。以A₄₀₅的吸收测定这些底物的蛋白水解质消化中释放的对硝基苯胺。以底物甲氧基琥珀酰-精氨酸-脯氨酸-酪氨酸-对硝基苯胺(MeO-Suc-R-P-Y-pNA)来测定胰凝乳蛋白酶样蛋白酶的活性，该酶的切割位点在苯丙氨酸。该底物以前被用于检测PSA的活性(Christensson等，欧洲生物化学杂志，194,755(1990))。底物H-D-脯氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-对硝基苯胺(P-F-R-pNA)是胰蛋白酶样蛋白酶特异的，该酶切割位点在精氨酸(R)。

hK2对P-F-R-pNA底物的总活性比hK2^v217高10倍，但两者均未表现对胰凝乳蛋白酶底物MeO-Suc-R-P-Y-pNA的水解能力。试验其它含有胰蛋白酶样切割位点(赖氨酸、精氨酸)的可比底物，发现hK2水解P-F-R-pNA底物的速率最高，这些发现表明hK2有胰蛋白酶样活性。

表3hK2、hK2^v217、PSA和胰蛋白酶对生色底物的酰胺水解活性

蛋白酶	MeO-Suc-R-P-Y-pNAxmol/min/μg/ml	P-F-R-pNAxmol/min/μg/ml
蛋白酶	MeO-Suc-R-P-Y-pNAxmol/min/μg/ml	P-F-R-pNAxmol/min/μg/ml	hK2^v217	0	8.7pmol
hK2	0	4.1nmol	hK2^v217	0	8.7pmol
hK2	0	4.1nmol	PSA	13.3pmol	2.2pmol
胰蛋白酶	3.8pmol	25.5nmol	PSA	13.3pmol	2.2pmol

使用肽底物和N末端氨基酸序列分析仪以确定被水解的肽键，从而对hK2和hK2^v217的特异性进行详细分析。图15显示了对多肽CALPEKPAVYTKVVHYRKWIKDTIAAN的酰胺水解活性，该多肽含有胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶两种酶的潜在切点。hK2^v217在胰蛋白酶位点(R-K)和胰凝乳蛋白酶位点(Y-R)均可切割，且其在胰蛋白酶位点的切割与其在胰凝乳蛋白酶位点的切割比为2∶1。作为这些实验的对照，也将phK2^v217与该肽共同温育，并未发现酰胺水解活性。hK2对该肽底物表现了与hK2^v217不同的特异性。没有发现hK2对这个底物有胰凝乳蛋白酶样特异性，其活性全部在胰蛋白酶样位点(R-K)。该多肽中其它赖氨酸残基均未被水解，说明hK2的特异性只在精氨酸残基。

作为对照，将胰蛋白酶也用于对这个底物的研究，胰蛋白酶切割除K-P键(已知不是胰蛋白酶的合适切割位点)外的所有赖氨酸(K)和精氨酸(R)位点。对210-236底物(图16,1号肽)的R-K位点，胰蛋白酶的切割速度大约比hK2快4倍，比hK2^v217快大约4000倍。胰蛋白酶不切割胰凝乳蛋白酶样位点。PSA主要切割Y-R键。也发现PSA有较弱的对R-K键的胰蛋白酶样活性(图15)，这与以前发现PSA对生色底物(表2)有较弱胰蛋白酶样活性的结果相符。

也将其它几种肽底物与hK2和PSA共同温育(图16)。在所有试验肽中，hK2仅对某些精氨酸有特异性，PSA主要对某些酪氨酸(Y)、苯丙氨酸(F)和亮氨酸(L)残基有特异性。图16中只有1号肽被hK2^v217切割，在图15的色谱图中有详细说明。实施例8hK2对phK2^v217的激活

图16中3号肽的序列对应于phK2的-7-+7位的氨基酸残基。该区包含前肽VPLIQSR，已发现这是phK2^v217多肽的N末端前导肽。如上所述，hK2能够切割这个肽并释放前肽区域，而hK2^v217则不能。为了描述hK2是否能切割天然底物的这个前肽区域，对它将phK2^v217转化成hK2^v217的能力进行了监测。将phK2^v217与1％hK2共同温育，用HIC-HPLC方法监测转化过程(图17A)。结果显示hK2能够将phK2^v217转化为hK2^v217，但它的转化速率比胰蛋白酶慢近30倍。当phK2^v217和40％hK2^v217共同温育时，即使经过6个小时，两种hK2形式的比例也没有变化(图17B)。这个结果证实了以前对该肽底物的观察，还表明，即使对于天然底物，只有hK2能切割hK2的前肽区域，而hK2^v217则不能。

这些结果综合表明，即使延长温育时间，phK2^v217和hK2^v217也是稳定的。与hK2^v217相比，hK2具有更高的蛋白水解活性和更高的特异性，特别是具有对hK2前体形式的特异性，图15中对前体肽的活性和图17中对phK2^v217的活性均证实了这种特异性。

这些结果证实hK2和hK2^v217在酶活性方面有显著差异，并可能有助于解释从培养基中纯化hK2时的低产率(与phK2^v217相比)。如在其它活性蛋白酶中见到的一样，高纯度的hK2制剂可能因为自身水解而不稳定。这些结果进一步提示，除了免疫试验以外，还可用对hK2特异底物的酶活性监测体液中这种蛋白质的水平。实施例9与hK2形成抑制剂复合物

PSA能与α₂巨球蛋白(MG)，丝氨酸蛋白酶抑制剂抗胰凝乳蛋白酶(ACT)形成复合物。为了研究hK2复合物的形成，将其与人血浆中常见的一系列蛋白酶(ACT,α₂-抗纤溶酶，抗凝血因子Ⅲ和α₁-抗胰蛋白酶(Trayis和Salvesen，生物化学年度回顾，52,655(1983))一起温育，并对混合物进行Western杂交分析(图18)。在还原条件下，hK2与这些丝氨酸蛋白酶抑制剂形成的任何共价复合物都得到大约80-100KD的条带。

ACT和α₂-抗纤溶酶与hK2形成显著的复合物(图18,1泳道和2泳道)，抗凝血因子Ⅲ(3泳道)与α₁-抗胰蛋白酶(α₁蛋白酶抑制剂，4泳道)不与hK2形成可检测的复合物。血浆蛋白质的一种主要成分MG能迅速与hK2复合(5泳道)，该复合物对应的分子量为200KD和120KD左右，当PSA与经纯化的MG共同温育时也能形成这样的复合物(图18,8泳道，见下述)。非常有趣的是，虽然α1-抗胰蛋白酶这种蛋白质能抑制许多胰蛋白酶样蛋白酶(Loebermann等，分子生物学杂志，177,531(1984)；Carrell和Trayis,TIBS,10,20,(1985))，但hK2不能与它形成复合物。

hK2与α₂抗纤溶酶形成复合物并不奇怪，因为α₂抗纤溶酶在其抑制剂活性位点含有精氨酸残基(Hunt和Dayhoff，生物化学与生物物理学研究通讯，95,864(1980)；Chardra等，生物化学，22,5055(1983)；Potempa等，科学，241,699(1985)；Shieh等，生物化学杂志，264,13420(1989)；Mast等，生物化学，30,1723(1991))。然而hK2与ACT形成复合物却是在意料之外，因为ACT在其抑制剂活性位点有一个亮氨酸。虽然图16和表2表明PSA和hK2具有完全不同的蛋白水解特异性，但它们在结构上的相似性显然影响了它们与常见抑制剂形成复合物的性质。

Western杂交(图18)显示，加到人类女性血清中的hK2能迅速与MG形成复合物。1泳道和3泳道是分别仅有hK2和血清的对照。2泳道为与ACT共同温育的hK2，显示出90KD的hK2-ACT复合物及残余hK2。4泳道和5泳道分别为加入血清中15分钟和1小时的hK2。6泳道是与经纯化的MG温育4小时的hK2。7泳道是加入血清中15分钟的PSA,8泳道是与经纯化的MG温育4小时的PSA。

结果表明，在体外实验中，当把hK2或PSA加到人血清中时，MG是主要与hK2或PSA形成复合物的成份。因为已知在前列腺疾病患者的血清中PSA与ACT形成复合物，人们确信血清中存在的hK2也会形成一定水平的ACT复合物。讨论

目前尚不知道PSA或hK2在体内的蛋白质加工和分泌机制。本发明的结果表明，AV12-hK2、DU145-hK2和PC3-hK2细胞均能分泌phK2，说明正常情况下，hK2是以phK2形式分泌的，此前体肽在胞外被切割。这提示phK2存在于生物液体中，因此可用于诊断pCa或BPH的一个有效指标。

突变型hK2(hK2^v217)和野生型hK2都能从AV12细胞中纯化得到。如同在其它蛋白酶中发现的一样，可能由于其自身催化的能力，hK2对使用的纯化过程非常不稳定，使纯化足够量的hK2或phK2以用作免疫原和标准品非常困难。相反，phK2^v217高度稳定，可被胰蛋白酶消化，生成也很稳定的hK2^v217。纯化的phK2^v217和hK2^v217为产生hK2和phK2特异性单克隆抗体提供了免疫原。实施例10单克隆抗体586对前列腺组织的免疫反应性

以HK1523对正常前列腺组织进行免疫组化染色发现染色出现在上皮细胞而非基质细胞。并且，hK2的表达是前列腺特异的，因为其它组织，如肾脏和胰腺不能着色。为了确定hK2是否在前列腺组织中表达，如果是，是否和前列腺癌相关，取得264个前列腺全切除样品进行比较分析，其中257个样品来源于未受治疗的患者(图20)，7个样品来自经雄激素饥饿治疗的病人(图21)。分析每个样品中良性上皮细胞区、高度前列腺上皮内肉瘤区(PIN)和腺癌细胞区hK2的胞质表达。

将前列腺组织称重，三维测量并记录。顶端和底端各切去4-5mm后以3mm连续切块。剩余前列腺从腺体顶端到精囊尖端，垂直于腺体长轴用刀以4-5mm间距连续切块。制成横切片，用苏木精-伊红染色。每个前列腺全切除的癌患者选一张既包括癌组织又包括良性组织的切片，采用本领域通晓的技术固定于10％中性福尔马林缓冲液中并用石蜡包埋。

将载玻片上的组织切片先浸入二甲苯再浸入95％乙醇中脱蜡。为了封闭内源性过氧化物酶活性，将切片在甲醇/双氧水中温育10分钟，然后自来水冲洗。随后将切片置于pH6.0的10mM柠檬酸盐缓冲液中，蒸汽处理30分钟。切片冷却5分钟后，冷自来水流水冲洗。切片与5％山羊血清温育10分钟以封闭非特异性蛋白质结合，然后温和晾干切片。

将一抗(0.5μg/ml的hK1G586或PSM773)加到切片上，室温静置30分钟，然后用自来水冲洗切片，随后将切片与生物素标记的兔抗鼠抗体温育1小时，自来水冲洗。将切片与过氧化物酶偶联的链亲和素(1∶500)温育30分钟，然后自来水冲洗。随后，将切片与3-氨基-9-乙基卡巴腙(ABC)生色剂溶液温育15分钟，再自来水冲洗。然后将切片用无汞苏木精复染1分钟，流水冲洗5分钟。用水溶性粘片剂(甘油明胶)将切片固定。对良性上皮细胞、高度PIN和腺癌计数染色细胞，其中按10％进制从0％到100％进行分类。

良性萎缩腺体的染色最低，特别是炎症区域几乎没有免疫反应性，无明显萎缩的增生腺泡或良性腺泡有中度到强烈的免疫反应性，通常在核上方的分泌性腔细胞层中呈颗粒状分布，常延伸到腔表面。尿道和viva montanum的尿道上皮不着色，尽管下边的腺体常常显示免疫反应性。基细胞常为阴性。

有高度PIN的标本在整个胞质中、多数情况下在胞质顶端的小泡中显示出强烈的免疫反应性。在不同类型的PIN中免疫反应性并无明显差别，只是在Cribiform类型中，中央部分的强度通常比边缘部分浅。

实际上所有癌标本中均有强烈的胞质反应。含有较多胞质泡的细胞着色较浅，包括指环状细胞和粘蛋白区域，其它胞质均强烈染色。最强烈的染色出现在最高等级的腺癌中(Gleason四级)，其在所有病例中均表现免疫反应性。有Cribiform癌的病灶类似于CribiformPIN，相似之处在于边缘染色较中心强。边缘在域或癌发展的前沿常有强烈的免疫反应性。

在7个经过雄激素饥饿疗法治疗患者的样品中，大多数良性萎缩性腺泡中无免疫反应性或较弱，虽然PIN和腺癌有时表现出强烈的胞质染色。

以单克隆抗体HK1G586对良性上皮、高度PIN和腺癌进行染色，其细胞染色计数汇总于表4中。对其配对分析，即良性与PIN配对，良性与癌配对，PIN与癌配对可揭示各类之间的显著差异(P＜0.001,Spearman Rank Correlation)。

表4与hk1G586的免疫反应性

	平均值	标准偏差(％)
	平均值	标准偏差(％)	良性上皮	44.3％	10-90
高度PIN	69.1％	20-100	良性上皮	44.3％	10-90
高度PIN	69.1％	20-100	腺癌(未经治疗)	80.0％	20-100

这样，前列腺组织中胞质hK2表达的增加与前列腺增生和前列腺癌相关。虽然因为样品较少，来源于经雄激素饥饿疗法治疗的患者的数据在统计学上不太显著，但与未治疗病人相比，这些患者在良性上皮、高度PIN和腺癌中hK2的表达均有所减少。所以，前列腺中hK2表达的上升是高度PIN和前列腺癌的一个新指标。实施例11前列腺癌细胞中hK2 RNA的RT-PCR检测

因为大多数前列腺癌是隐性的，所以从组织活检样品中(如前列腺包膜、骨髓或淋巴结)或生理液体(如血液、血清或精液)检测表达hK2的细胞就非常有效。这种检测方法优选地可以从大量不表达hK2的细胞中检测出表达hK2的单个细胞。优选地，该方法能从包括至少约10⁴个细胞的样品中检测出表达hK2的单个细胞，更优选地为从包括至少10⁶左右个细胞，或更优选为10⁷左右个细胞的样品中检测出表达hK2的单个细胞。为了提供这样一种录敏的检测方法，应用了hK2转录物特异的逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)。

A．LNCaP细胞系

为了测定用RT-PCR方法检测hK2特异性转录物的灵敏性，将表达人PSA和hK2的LNCaP细胞系系列稀释于黄色层细胞中。黄色层细胞由正常男性或女性的全血中分离得到。在柠檬酸盐-右旋葡萄糖管中收集5-7ml静脉血，4℃下，将样本在1000xg离心15分钟。从细胞团的顶部回收黄色层细胞。

以每分钟1500转，将黄色层细胞和LNCaP细胞混合物离心5分钟，然后从沉淀的细胞团中提取RNA。采用酸酚-氯仿-异硫氰酸胍方法分离RNA(Chomczynski等，分析化学，162,156,1987，)用氯仿-T醇(4∶1，体积比)进一步抽提RNA以除去残留血红素，血红素会抑制逆转录和聚合酶链式反应。然后用无RNA酶的DNA酶处理分离的RNA。

为制备cDNA的第一链，将一份含有1μg总RNA的样品加入到逆转录反应体系中，该逆转录反应体系含100pmol PSA特异的寡核苷酸引物(5’TCATCTCTGTATCC 3’,SEQ ID NO:13)或100pmol hK2特异的寡核苷酸引物(5’GAGTAAGCTCTA 3’,SEQ ID NO:14)，和Moloney鼠白血病病毒逆转录酶(GIBCO BRL)。将终体积调至25μl(50mM Tris-盐酸，pH8.3,75mM氯化钾，3mM氯化镁，10mM二硫苏糖醇，0.5mM每种dNTP，以及800单位Moloney鼠白血病病毒逆转录酶)。将反应在42℃温育15分钟，然后95℃加热15秒使酶热灭活。

为扩增PSA第一链cDNA，以PSA特异的引物对，将由PSA特异寡核苷酸引发的第一链cDNA 10μl在PCR(0.2mM每种dNTP,0.5单位AmpliTaq聚合酶，50mM氯化钾，10mM Tris-盐酸，pH8.3,1.5mM氯化镁，0.1％(w/v)明胶)中进行扩增。PSA的PCR扩增利用了50pmol的PSA-1(5’GATGACTCCAGCCACGACCT 3’,SEQ ID NO:1 5)和50pmol的PSA-2(5’CACAGACACCCCATCCTATC 3’,SEQ ID NO:16)。为了扩增hK2的第一链cDNA，以hK2特异的引物对将由hK2特异寡核苷酸引发的第一链cDNA在PCR(0.2mM每种DNTP,0.5U AmpliTaq聚合酶，50mM KCl,10mMTris-HCl,pH8.3,1.5mM MgCl₂,0.1％(w/v)明胶)中进行扩增。hK2的PCR扩增利用了50pmol hK2-1(5’GAGGGTTGTGTACAGTCATGGAT3’,SEQID NO:17)和50pmol hK2-2(5’ACACACTGAAGACTCCTGGGGCG 3’,SEQID NO:18)。

所用的循环参数如下：35-40个循环，每个循环为94℃，1分钟；58℃(PSA)或60℃(hK2),90秒；72℃,90秒。最后一个循环为72℃ 10分钟。取反应样品在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，溴乙锭染色后在紫外灯下观察。将部分扩增产物从凝胶中切下来，并亚克隆到pCRⅡ载体(Invitrogen,San Diego,CA)中以供测序。

PSA特异的PCR扩增出一条710bp的产物，hK2特异的PCR扩增出一条405bp的产物。稀释分析结果表明，分别在10⁶和10⁷个白细胞中可有效检测到单个LNCaP细胞所表达的PSA或hK2 RNA(图22A)。非常出人意外的是RT-PCR检测LNCaP来源的hK2转录物比LNCaP来源的PSA转录物要高10倍稀释度。B．前列腺癌患者

用RT-PCR分析来自6个前列腺癌患者和2个正常男性的血样。按前述方法，从8个男性中取得黄色层细胞并提取RNA，进行RT-PCR反应。在6个前列腺癌患者中，包括1个临床B期前列腺癌患者，2个已知发生转移的患者(临床D2期)，和3个病理C期患者。病理A-C期的前列腺癌是局部形式的前列腺癌，病理D1期前列腺癌已扩散到淋巴结(淋巴结转移)，病理D2期是全身性前列腺癌(全身性转移)。关于前列腺癌病理期的详细内容，参见Moreno等(癌症研究，52,6110(1992))，Deguchi等(癌症研究53,5350(1993))和Katz等(泌尿学，43,765(1994))。

结果显示67％的前列腺癌患者表达hK2,17％表达PSA,17％既表达hK2也表达PSA。在正常对照组中，无可检测水平的PSA或hK2 RNA。

这样，hK2 RNA的检测可以作为前列腺癌微转移早期检测的一个有效标志。

本发明并不局限于所显示和所叙述的细节，因为在本发明权利要求所述的发明实质和范围内，可以做很多修改和变化。

序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人：Mayo Foundation for Medical Education and

Resarch,and Hybritech Incorporated(ⅱ)发明名称：转移性前列腺癌的检测方法(ⅲ)序列数：26(ⅳ)通信地址

(A)地址：Schwegman,Lundberg,Woessner和Kluth,P.A.

(B)街道：P.O.Box 2938

(C)城市：Minneapolis

(D)州：MN

(E)国家：美国

(F)邮政编码：55402(ⅴ)计算机可读形式

(A)介质类型：磁盘

(B)计算机：IBM兼容机

(C)操作系统：DOS

(D)软件：Fast SEQ Version 2.0(ⅵ)本次申请信息

(A)申请号：未知

(B)申请日：1997年11月14日

(C)分类：(ⅶ)在先申请信息

(A)申请号：08/759,354

(B)申请日：1996年11月14日

(A)申请号：PCT/US96/06167

(B)申请日：1996年5月2日

(A)申请号：08/622,046

(B)申请日：1996年3月26日

(A)申请号：08/427,707

(B)递交日期：1995年5月2日(ⅷ)代理机构/代理人信息

(A)姓名：Embretson,Janet E

(B)登记号：39,665

(C)参考/文档号：545.005WO1(ⅸ)电信联系信息

(A)电话：612-359-3260

(B)电传：612-359-3263

(C)电报：(2)SEQ ID NO:1信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：237个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val1 5 10 15Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His

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100 105 110Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys

115 120 125Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro

130 135 140Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys145 150 155 160Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly

165 170 175Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro

180 185 190Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu

195 200 205Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His

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(A)长度：711个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2:ATT GTG GGA GGC TGG GAG TGT GAG AAG CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG 48Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val1 5 10 15GCT GTG TAC AGT CAT GGA TGG GCA CAC TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC 96Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His

20 25 30CCC CAG TGG GTG CTC ACA GCT GCC CAT TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG 144Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln

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115 120 125TAC GCC TCA GGC TGG GGC AGC ATC GAA CCA GAG GAG TTC TTG CGC CCC 432Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro

130 135 140AGG AGT CTT CAG TGT GTG AGC CTC CAT CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT 480Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys145 150 155 160GCT AGA GCT TAC TCT GAG AAG GTG ACA GAG TTC ATG TTG TGT GCT GGG 528Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly

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(A)长度：261个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Gly Cys Thr Gly1 5 10 15Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu

20 25 30Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala

35 40 45His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala

50 55 60His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu65 70 75 80Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe

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100 105 110Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu

115 120 125Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln

130 135 140Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile145 150 155 160Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu

165 170 175His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val

180 185 190Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr

195 200 205Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln

210 215 220Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro225 230 235 240Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr

245 250 255Ile Ala Ala Asn Pro

260(2)SEQ ID NO:4信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：832个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:4:GGATCCAGC ATG TGG GAC CTG GTT CTC TCC ATC GCC TTG TCT GTG GGG 48

Met Trp Asp Leu Val Leu Ser Ile Ala Leu Ser Val Gly

1 5 10TGC ACT GGT GCC GTG CCC CTC ATC CAG TCT CGG ATT GTG GGA GGC TGG 96Cys Thr Gly Ala Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp

15 20 25GAG TGT GAG AAG CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG GCT GTG TAC AGT CAT 144Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His30 35 40 45GGA TGG GCA CAC TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC CCC CAG TGG GTG CTC 192Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu

50 55 60ACA GCT GCC CAT TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG GTC TGG CTG GGT CGG 240Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg

65 70 75CAC AAC CTG TTT GAG CCT GAA GAC ACA GGC CAG AGG GTC CCT GTC AGC 288His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser

80 85 90CAC AGC TTC CCA CAC CCG CTC TAC AAT ATG AGC CTT CTG AAG CAT CAA 336His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln

95 100 105AGC CTT AGA CCA GAT GAA GAC TCC AGC CAT GAC CTC ATG CTG CTC CGC 384Ser Leu Arg Pro Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg110 115 120 125CTG TCA GAG CCT GCC AAG ATC ACA GAT GTT GTG AAG GTC CTG GGC CTG 432Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu

130 135 140CCC ACC CAG GAG CCA GCA CTG GGG ACC ACC TGC TAC GCC TCA GGC TGG 480Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp

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160 165 170GTG AGC CTC CAT CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT GCT AGA GCT TAC TCT 576Val Ser Leu His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser

175 180 185GAG AAG GTG ACA GAG TTC ATG TTG TGT GCT GGG CTC TGG ACA GGT GGT 624Glu Lys Val Thr Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly190 195 200 205AAA GAC ACT TGT GGG GGT GAT TCT GGGGGT CCA CTT GTC TGT AAT GGT 672Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly

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225 230 235GAA AAG CCT GCT GTG TAC ACC AAG GTG GTG CAT TAC CGG AAG TGG ATC 768Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile

240 245 250AAG GAC ACC ATC GCA GCC AAC CCC TGAGTGCCCC TGTCCCACCC CTACCTCTAG 822Lys Asp Thr Ile Ala Ala Asn Pro

255 260TAAACTGCAG 832(2)SEQ ID NO:5信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：244个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:5:Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys1 5 10 15His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His

20 25 30Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His

35 40 45Cys Leu Lys Lys ASh Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe

50 55 60Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro65 70 75 80His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro

85 90 95Asp Glu Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro

100 105 110Ala Lys Ile Thr Asp Val Val Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu

115 120 125Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu

130 135 140Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His145 150 155 160Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr

165 170 175Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys

180 185 190Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly

195 200 205Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala

210 215 220Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile225 230 235 240Ala Ala Asn Pro(2)SEQ ID NO:6信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：766个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅸ)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：1..732(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:6:GTG CCC CTC ATC CAG TCT CGG ATT GTG GGA GGC TGG GAG TGT GAG AAG 48Val Pro Leu Ile Gln Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys1 5 10 15CAT TCC CAA CCC TGG CAG GTG GCT GTG TAC AGT CAT GGA TGG GCA CAC 96His Ser Gln Pro Trp Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His

20 25 30TGT GGG GGT GTC CTG GTG CAC CCC CAG TGG GTG CTC ACA GCT GCC CAT 144Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His

35 40 45TGC CTA AAG AAG AAT AGC CAG GTC TGG CTG GGT CGG CAC AAC CTG TTT 192Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe

50 55 60GAG CCT GAA GAC ACA GGC CAG AGG GTC CCT GTC AGC CAC AGC TTC CCA 240Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val Pro Val Ser His Ser Phe Pro65 70 75 80CAC CCG CTC TAC AAT ATG AGC CTT CTG AAG CAT CAA AGC CTT AGA CCA 288His Pro Leu Tyr Asn Met Ser Leu Leu Lys His Gln Ser Leu Arg Pro

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115 120 125CCA GCA CTG GGG ACC ACC TGC TAC GCC TCA GGC TGG GGC AGC ATC GAA 432Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu

130 135 140CCA GAG GAG TTC TTG CGC CCC AGG AGT CTT CAG TGT GTG AGC CTC CAT 480Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro Arg Ser Leu Gln Cys Val Ser Leu His145 150 155 160CTC CTG TCC AAT GAC ATG TGT GCT AGA GCT TAC TCT GAG AAG GTG ACA 528Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys Val Thr

165 170 175GAG TTC ATG TTG TGT GCT GGG CTC TGG ACA GGT GGT AAA GAC ACT TGT 576Glu Phe Met Leu Cys Ala Gly Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys

180 185 190GGG GGT GAT TCT GGG GGT CCA CTT GTC TGT AAT GGT GTG CTT CAA GGT 624Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys AsT Gly Val Leu Gln Gly

195 200 205ATC ACA TCA TGG GGC CCT GAG CCA TGT GCC CTG CCT GAA AAG CCT GCT 672Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala

210 215 220GTG TAC ACC AAG GTG GTG CAT TAC CGG AAG TGG ATC AAG GAC ACC ATC 720Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile225 230 235 240GCA GCC AAC CCC TGAGTGCCCC TGTCCCACCC CTACCTCTAG TAAA 766Ala Ala Asn Pro(2)SEQ ID NO:7信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：237个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ⅱ)分子类型：肽

(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:7:Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val1 5 10 15Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val Cys Gly Gly Val Leu Val His

20 25 30Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val

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50 55 60Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser65 70 75 80Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp

85 90 95Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val

100 105 110Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys

115 120 125Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro

130 135 140Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys145 150 155 160Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly

165 170 175Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro

180 185 190Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu

195 200 205Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His

210 215 220Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Val Ala Asn Pro225 230 235(2)SEQ ID NO:8信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：237个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:8:Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val1 5 10 15Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His

20 25 30Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln

35 40 45Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln

85 90 95Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro Ala Lys Ile Thr Asp Val Val

100 105 110Lys Val Leu Gly Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys

115 120 125Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu Pro Glu Glu Phe Leu Arg Pro

165 170 175Leu Trp Thr Gly Gly Lys Asp Thr Cys Gly Gly Asp Ser Gly Gly Pro

180 185 190Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly Ile Thr Ser Trp Gly Pro Glu

195 200 205Pro Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Val Val Tyr Thr Lys Val Val His

210 215 220Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Ala Ala Asn Pro225 230 235(2)SEQ ID NO:9信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:9:ACGCGGATCC AGCATGTGGG ACCTGGTTCT CT 32(2)SEQ ID NO:10信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:10:ACAGCTGCAG TTTACTAGAG GTAGGGGTGG GAC 33(2)SEQ ID NO:11信息： (ⅰ)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:11:ATATGGATCC ATATGTCAGC ATGTGGGACC TGGTTCTCTC CA 42(2)SEQ ID NO:12信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:12:ATATGGATCC TCAGGGGTTG GCTGCGATGG T 31(2)SEQ ID NO:13信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：14个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:13:TCATCTCTGT ATCC 14(2)SEQ ID NO:14信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：12个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:14:GAGTAAGCTC TA 12(2)SEQ ID NO:15信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:15:GATGACTCCA GCCACGACCT 20(2)SEQ ID NO:16信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:16:CACAGACACC CCATCCTATC 20(2)SEQ ID NO:17信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

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(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

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(A)长度：19个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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(A)长度：16个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部的(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:20:His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO:21信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：15个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部的(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:21:His Leu Leu Ser Asn Asp Met Cys Ala Arg Ala Tyr Ser Glu Lys1 5 10 15(2)SEQ ID NO:22信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：55个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部的(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:22:Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys Gly Gly Val Leu Val His1 5 10 15Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Lys Lys Asn Ser Gln

20 25 30Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu Pro Glu Asp Thr Gly Gln

35 40 45Arg Val Pro Val Ser His Ser

50 55(2)SEQ ID NO:23信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：711个碱基对

(B)类型：氨基酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:23:ATTGTGGGAG GCTGGGAGTG CGAGAAGCAT TCCCAACCCT GGCAGGTGCT TGTGGCCTCT 60CGTGGCAGGG CAGTCTGCGG CGGTGTTCTG GTGCACCCCC AGTGGGTCCT CACAGCTGCC 120CACTGCATCA GGAACAAAAG CGTGATCTTG CTGGGTCGGC ACAGCCTGTT TCATCCTGAA 180GACACAGGCC AGGTATTTCA GGTCAGCCAC AGCTTCCCAC ACCCGCTCTA CGATATGAGC 240CTCCTGAAGA ATCGATTCCT CAGGCCAGGT GATGACTCCA GCCACGACCT CATGCTGCTC 300CGCCTGTCAG AGCCTGCCGA GCTCACGGAT GCTGTGAAGG TCATGGACCT GCCCACCCAG 360GAGCCAGCAC TGGGGACCAC CTGCTACGCC TCAGGCTGGG GCAGCATTGA ACCAGAGGAG 420TTCTTGACCC CAAAGAAACT TCAGTGTGTG GACCTCCATG TTATTTCCAA TGACGTGTGT 480GCGCAAGTTC ACCCTCAGAA GGTGACCAAG TTCATGCTGT GTGCTGGACG CTGGACAGGG 540GGCAAAAGCA CCTGCTCGGG TGATTCTGGG GGCCCACTTG TCTGTAATGG TGTGCTTCAA 600GGTATCACGT CATGGGGCAG TGAACCATGT GCCCTGCCCG AAAGGCCTTC CCTGTACACC 660AAGGTGGTGC ATTACCGGAA GTGGATCAAG GACACCATCG TGGCCAACCC C 711(2)SEQ ID NO:24信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：24个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部的(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:24:Leu Lys Lys Asn Ser Gln Val Trp Leu Gly Arg His Asn Leu Phe Glu1 5 10 15Pro Glu Asp Thr Gly Gln Arg Val

20(2)SEQ ID NO:25信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：26个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部的(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:25:Cys Ala Leu Pro Glu Lys Pro Ala Val Tyr Thr Lys Val Val His Tyr1 5 10 15Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile Ala Ala

20 25(2)SEQ ID NO:26信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：12个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅴ)片段类型：内部的 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:26:Gln Val Ala Val Tyr Ser His Gly Trp Ala His Cys1 5 10

Claims

1．一种检测hK2 DNA的诊断方法，包括：

(a)从包含被怀疑含有hK2 RNA之细胞的人生理样品来源的RNA经逆转录生成DNA，在能有效地通过聚合酶链式反应扩增DNA的条件下，将一定量的该DNA与一定量的至少两种寡核苷酸接触，从而得到一定量的扩增hK2 DNA，其中至少一种寡核苷酸是hK2特异的寡核苷酸；和

(b)检测扩增的hK2 DNA的存在。

2．一种检测人转移性前列腺癌的方法，包括：

(a)从包含怀疑含有hK2 RNA之细胞的人生理样品来源的RNA经逆录生成DNA，在能有效地通过聚合酶链式反应扩增DNA的条件下，将一定量的该DNA与一定量的至少两种寡核苷酸接触，从而得到一定量的扩增hK2 DNA，其中至少一种寡核苷酸是hK2特异的寡核苷酸；和

(b)检测扩增的hK2 DNA的存在，其中hK2 DNA的存在表明所述人体中有转移性前列腺癌。

3．权利要求1或2的方法，其中生理样品是组织样品。

4．权利要求3的方法，其中所述组织选自于包括前列腺、前列腺包膜、精囊、骨髓和淋巴结之组。

5．权利要求3的方法，其中所述组织是非前列腺组织。

6．权利要求1或2的方法，其中所述生理样品是液体。

7．权利要求6的方法，其中所述液体选自包含全血、血清和精液之组。

8．权利要求7的方法，其中所述液体是全血。

9．权利要求1或2的方法，其中所述扩增的hK2 DNA在检测前进行琼脂糖凝胶电泳。

10．权利要求1或2的方法，其中还包括确定扩增的hK2 DNA的量。

11．权利要求1或2的方法，其中还包括：

(c)在能有效地通过聚合酶链式反应扩增前列腺特异抗原(PSA)DNA而扩增hK2 DNA的条件下，将由人生理样品来源的RNA经逆转录得到的DNA另一定量与一定量的至少两种寡核苷酸接触，以产生扩增的PSADNA；和

(d)检测扩增的PSA DNA的存在。

12．一种检测hK2 RNA的诊断方法，包括：

(a)从人类来源的生理样品中提取RNA；

(b)对提取的RNA进行逆转录以生成DNA；

(c)在能有效地通过聚合酶链式反应扩增DNA的条件下，将该DNA与一定量的至少两种寡核苷酸接触以生成一定量的扩增hK2 DNA，其中至少一种寡核苷酸是hK2特异的寡核苷酸；和

(d)检测扩增的hK2 DNA的存在，其中扩增hK2 DNA的存在表明人体中有转移性前列腺癌。

13．权利要求12的方法，其中所述样品是组织样品。

14．权利要求12的方法，其中所述样品是生理液体样品。

15．权利要求12的方法，其中所述人做过前列腺完全切除术，hK2DNA的存在表明此人有持续性前列腺癌。

16．一种监测前列腺癌发展的方法，包括：

(a)将由前列腺癌患者的生理样品来源的RNA经逆转录生成DNA，在能有效地通过聚合酶链式反应扩增DNA的条件下，将一定量的该DNA与一定量的至少两种寡核苷酸接触以产生一定量的扩增hK2 DNA，其中至少一种寡核苷酸是hK2特异的寡核苷酸；

(b)检测或测定扩增hK2 DNA的量；

(c)过一段时间后重复步骤(a)和(b)；和

(d)比较(b)和(c)步骤的结果，其中hK2 DNA量的增加表示所述人体中前列腺癌在发展。

17．一种病理确定前列腺癌阶段的方法，包括：

(a)从前列腺癌患者的生理样品来源的RNA经逆转录生成DNA，在能有效地通过聚合酶链式反应扩增DNA的条件下，将一定量的该DNA与一定量的至少两种寡核苷酸接触以生成一定量的扩增hK2 DNA，其中至少一种寡核苷酸是hK2特异的寡核苷酸；和

(b)检测扩增的hK2 DNA的存在或测定其量的大小，其中扩增hK2DNA的存在或数量指示了前列腺癌的病理阶段。

18．权利要求16或17的方法，其中所述人是前列腺完全切除术的候选者。

19．权利要求16的方法，其中(a)步骤的样品是在病人接受激素治疗以前取得的。

20．权利要求19的方法，其中激素治疗指雄激素治疗。

21．权利要求20的方法，其中雄激素治疗指雄激素刺激性治疗。

22．权利要求16或17的方法，其中所述样品是非前列腺组织样品。

23．权利要求16或17方法，其中所述样品是生理液体样品。

24．权利要求23的方法，其中所述液体是全血。

25．检测怀疑有hK2 RNA的生理样品中hK2 RNA的一种诊断试剂盒，包括(a)已知量的第一种hK2特异的寡核苷酸，该寡核苷酸含有至少约7-50个核苷酸，并且该寡核苷酸与SEQ ID NO:4有至少约80％相同，和(b)已知量的第二种hK2特异的寡核苷酸，该寡核苷酸含有至少约7-50个核苷酸，并且该寡核苷酸与互补于SEQ ID NO:4的核苷酸序列有至少约80％相同。

26．权利要求25的诊断试剂盒，其中第二种寡核苷酸包含SEQ IDNO:14。

27．权利要求25的诊断试剂盒，其中第一种寡核苷酸包含SEQ IDNO:17。

28．权利要求25的诊断试剂盒，其中第二种寡核苷酸包含SEQ IDNO:18。

29．包含SEQ ID NO:22的一种分离、纯化的肽，其生物活性亚基，或其生物活性变异体。

30．包含SEQ ID NO:26的一种分离、纯化的肽，其生物活性亚基，或其生物活性变异体。

31．一种与包含权利要求29或30中的肽的蛋白质或多肽可发生特异反应的纯化抗体。

32．权利要求31的抗体，它是一种单克隆抗体。

33．一种可产生权利要求32的抗体的杂交瘤细胞系。

34．一种包含权利要求31的抗体的多克隆抗体制剂。

35．一种寡核苷酸，其包含至少约7-50个核苷酸，并且与具有SEQ IDNO:4的核苷酸序列至少有约80％相同或与其互补。

36．权利要求35的寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:14。

37．权利要求35的寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:17。

38．权利要求35的寡核苷酸，其包含SEQ ID NO:18。

39．一种在人类非前列腺组织样品中检测或确定转移性前列腺癌存在的方法，包括：

(a)将一定量的可与hK2多肽结合但不与hK3结合的一种试剂与人组织样品的细胞混合，以形成一种包含该试剂和细胞的二价复合物。

(b)检测或测定样品中复合物的存在或量，其中所述复合物的存在或量为微转移前列腺癌的存在提供了指征。

40．权利要求39的方法，其中所述试剂是抗体。

41．权利要求39的方法，其中所述抗体是多克隆抗体群中的一个成员。

42．权利要求39的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。