CN101522913B

CN101522913B - 通过检测编码激肽释放酶8的klk8基因的主要选择性转录物的体外诊断支气管肺癌的方法及其预测生存率的用途

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Publication number: CN101522913B
Application number: CN2007800362405A
Authority: CN
Inventors: M·艾恩齐布鲁; Y·库尔蒂; C·若利韦-雷诺; C·普朗克
Original assignee: Biomerieux SA; Universite Francois Rabelais de Tours
Current assignee: Biomerieux SA; Universite de Tours
Priority date: 2006-09-28
Filing date: 2007-09-27
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2027-09-27
Also published as: DE602007003856D1; US8716458B2; US8486632B2; US20130289260A1; CN101522913A; US20120295261A1; ATE452209T1; JP2010504746A; FR2906537A1; WO2008037930A3; ES2338490T3; US8236506B2; WO2008037930A2; EP2066807A2; JP5394241B2; EP2066807B1; US20100255466A1

Abstract

本发明涉及一种体外诊断支气管肺癌尤其是非小细胞支气管癌的方法，其特征在于它包括在来自疑患所述支气管肺癌的患者的生物学样品中检测编码激肽释放酶8的KLK8基因的至少一种主要选择性转录物的步骤。这种方法尤其可用于支气管肺癌患者的生存率预测。

Description

通过检测编码激肽释放酶8的KLK8基因的主要选择性转录物的体外诊断支气管肺癌的方法及其预测生存率的用途

技术领域本发明涉及癌学领域。更具体的，本发明的主题是通过测定超过预定阈值的来自所述患者的生物学样品中激肽释放酶8的KLK8基因的主要转录物的存在体外诊断患者原发性支气管肺癌的方法。

背景技术在人类社会以及所有发达国家中，原发性支气管肺癌是癌症死亡的主要原因。最近的数据显示其在妇女中发病率显著增加。每年新增病例的数量在法国估计为25000例，在美国超过160000例，导致每年在法国大约22000例个体的死亡，在美国大约155000例个体的死亡。世界范围内，认为支气管肺癌每年造成大约900000例死亡，这相当于癌症导致死亡的大约18％。支气管肺癌的主要病因是烟草成瘾。男性中大约90％的支气管癌以及女性中大约50％的支气管癌由烟草造成。其他的环境或者职业因素在支气管致癌作用中的作用也是公认的。

世界卫生组织(WHO)区分了小细胞支气管癌(SCBC)(代表大约20％的病例)和非小细胞支气管癌(NSCBC)(尤其包括表皮样癌、腺癌和大细胞癌，代表大约80％的病例)。表皮样癌和腺癌是最普遍的癌。

目前，基本上通过肺部放射照相和胸部扫描进行支气管肺癌的诊断。支气管内窥镜检查使活检成为可能，然后确诊。令人遗憾的是，指示性症状是延迟的而且不是非常特异的，在晚期才获得诊断结果，因此极大削弱了现有疗法的效果和可行性。此外，这种类型的诊断需要代价昂贵的先进设备和合格人员。

现在已有各种治疗方法：手术，化疗和放疗。这些治疗可以分别进行、连续进行或者组合进行。

肺癌的存活率很大程度上决定于诊断时肿瘤的扩散程度。5年的总存活率只有15％。但是，该存活率掩盖了实质上的差异。诊断时癌已经远程转移的患者的存活率低于5％，而在发现时“非小细胞”癌(NSCBC)集中的患者存活率接近50％¹。后者通过手术切除肿瘤可以基本上治愈，这是代表当前唯一能治愈这类癌症的解决办法。但是，少于1/3的患者能够接受这种治疗，而接受手术治疗的患者中有1/2在手术后那个月因为肿瘤复发死亡。最近在NSCBC的现代化化疗领域的进展使设计辅助或者新-辅助疗法来提高患者(已经过手术)的预期寿命成为可能²。但是，这种治疗不是那么简单的，其相关死亡率不能被忽视。由于这个原因，重要的是能够鉴定因为复发而显示死亡高风险的可行手术的患者，以便易于决定是否给予新-辅助或者辅助化疗。

对于全部癌症尤其是支气管肺癌来说，数年来一直在寻找和研究能够区分肿瘤细胞和健康细胞的标记。它们将使以下成为可能：在早期诊断疾病，确定其预后和对治疗的敏感度，以及监测其进展。近年来，已经有超过100种候选物被建议作为支气管肺癌诊断的分子标记。因此所述研究设想了涉及细胞周期、凋亡或者血管发生的原癌基因、因子的诊断作用。但是，基于使用的技术(免疫组织化学，免疫分析，利用各种算法的DNA芯片)和肿瘤的复杂多样性(组织学类型，阶段，分化度)在各个群组的患者间通过不同的技术和确认得到的结果之间很少存在相关性。

也检验了属于丝氨酸蛋白酶的亚家族激肽释放酶(其存在15个成员)的其他标记。因此在利用DNA芯片的研究中，hKLK11基因被鉴定为C2型内分泌腺癌的标记³。类似的研究证实hKLK5和hKLK10在表皮样癌中过表达⁴。类似地，已经证明hKLK5和hKLK7基因(分别编码蛋白hK5和hK7)在表皮样癌的肿瘤组织中过表达，而在显示腺癌的患者中最常观察到肿瘤组织中hKLK7基因的下调。但是，还不能确定这些hKLK基因的差异表达与支气管肺癌患者的预后生存率之间的任何联系。

15种激肽释放酶的基因显示共同特征，在它们之间存在相同基因的数种转录物。这些基因的转录物也作为标记被研究。因此，已经显示与非癌组织比较，hKLK4⁶和hKLK5⁷基因的3种选择性转录物以及hKLK7⁷基因的一种转录物在肿瘤和/或卵巢细胞系中过表达。

众所周知hKLK8基因的表达谱产生至少4种不同的转录物，被称为NT1到NT4。转录物NT1或者“neuropsine 1型”，由Yoshida S.等鉴定⁸，编码260个氨基酸的前酶原(préproenzyme)，其含有28个氨基酸的分泌信号肽和非常短的4个残基的前片段，这必须被切除以释放活性形式的激肽释放酶8。 NT1被认为是所述基因的常规表达形式。转录物NT2或者“neuropsin-T2”由Mitsui S.等鉴定⁹，与NT1形式的区别在于在信号肽的羧基末端区域插入一个编码45个辅助氨基酸的序列。转录物NT3和NT4由Magklara A.等鉴定¹⁰，分别编码包含119和32个残基的蛋白。从NT3预测的蛋白形式只具有激肽释放酶8的信号肽的一部分，并且不保留后者的切割区。从NT4预测的蛋白由激肽释放酶8的信号肽的前23个残基和9个辅助残基(与激肽释放酶8没有相同性)组成。Magklara A.等¹⁰已经证明尽管KLK8基因的常规表达形式NT1可能在卵巢癌中具有预后价值，但NT3和NT4形式没有任何价值。发明内容

KLK8基因的选择性转录物旨在表示KLK8基因的转录产物。这类转录物是如上所述的那些，特别是被称为NT1、NT2、NT3和NT4。在下文中将见到，本申请人还发现被称为NT5和NT6的两种新转录物。

主要转录物旨在表示主要由表达激肽释放酶8的基因产生的转录物。根据一个实施方案，KLK8基因的主要选择性转录物选自转录物NT3和NT4。

主要转录物的高水平旨在表示大于指定阈值的水平。

众所周知，用于检测分析物的试验结果通常很大程度上依赖于使用的结合配偶体的性质。因此，例如对通过核苷酸探针杂交检测RNA来说，结果尤其依赖于以下性质：探针的大小、组成和互补百分比，并且这些性质影响利用这些探针测量得到的值。因此不可能给出准确的阈值，但在所有情况下可以通过简单的常规试验确定适于所用每种结合配偶体的阈值。

必须清楚理解对应于不确定区域的离散值或者值的范围在本文中被称

本发明的方法尤其适合于支气管肺癌患者的生存率预测。实际上，本申请人已经证明高水平的KLK8基因主要选择性转录物尤其是NT3和NT4在癌症尤其是NSCBC中是不利的预后因素。

因此，另一个主题在于本发明的诊断方法在支气管肺癌患者的生存率预测中的用途。

必须清楚理解对应于不确定区域的离散值或者值的范围在本文中被称为阈值。显而易见的是，当测量值位于不确定区间内或者在离散值情况下非常接近阈值，则不能做出明确的结论，应当进行进一步的研究。

可以实施本发明方法的生物学样品是能够含有KLK8基因的主要选择性转录物的任意生物学样品。作为这类样品的实例，可以列举固体样品如来自肿瘤、淋巴神经节、患者转移瘤活检的组织，生物学液体如血液、血清、血浆和痰，以及从这些固体或者液体样品纯化的细胞。

转录物尤其是主要选择性转录物的检测旨在表示转录物的直接检测，或者转录物的间接检测，或者本领域技术人员已知的确定样品中RNA存在的任意其他方法。

转录物尤其是主要选择性转录物的直接检测旨在表示生物学样品中所述转录物自身的检测。

生物学样品中主要选择性转录物的直接检测可以通过本领域技术人员已知的任意手段实施，例如通过与主要选择性转录物的特异性结合配偶体的杂交，如果必要的话在通过PCR或者NASBA技术扩增以后进行。

杂交旨在表示一种方法，在其过程中在合适的条件下两个核苷酸片段利用稳定和特异性的氢键结合在一起形成双链复合物。这些氢键在互补碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或者尿嘧啶(U))之间形成(称为A-T键)，或者在互补碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之间形成(称为G-C键)。两个核苷酸片段的杂交可以是完全的(则被称为互补核苷酸片段或者序列)，换言之在该杂交期间获得的双链复合物只含有A-T键和C-G键。这种杂交也可以是部分的(则被称为足够互补的核苷酸片段或者序列)，换言之获得的双链复合物包含能够形成双链复合物的A-T键和C-G键，但还包含未与互补碱基结合的碱基。两个核苷酸片段之间的杂交取决于使用的操作条件，尤其是严格性。严格性尤其根据两个核苷酸片段的碱基组成以及两个核苷酸片段之间的错配程度来定义。严格性还可以是反应参数(如杂交液中存在的离子种类的浓度和类型，变性剂的性质和浓度和/或杂交温度)的函数。所有这些数据都是公知的，本领域技术人员可以确定合适的条件。通常，根据需要杂交的核苷酸片段的长度，在浓度大约0.5到1M的盐溶液中杂交温度处于大约20到70℃之间，尤其是35到65℃之间。序列或者核苷酸片段或者寡核苷酸或者多聚核苷酸是通过磷酸酯键连接的核苷酸单位的链，其特征为能够与核苷酸片段杂交的天然核酸的信息序列，所述链有可能包含不同结构的单体及从核酸的天然分子和/或通过遗传重组和/或通过化学合成获得。单体来自于可以是核酸的天然核苷酸的单体，所述核苷酸的组成元件是糖、磷酸基和含氮碱基；在DNA中所述糖是脱氧-2-核糖，在RNA中所述糖是核糖；根据涉及的是DNA还是RNA，所述含氮碱基选自腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；否则所述单体是三个组成元件中至少之一被修饰的核苷酸；例如，所述修饰发生在碱基水平，具有修饰的碱基如肌苷，甲基-5-脱氧胞啶，脱氧尿苷，二甲基氨基-5-脱氧尿苷，二氨基-2，6-嘌呤，溴-5-脱氧尿苷或者能够杂交的任意其他修饰碱基，或者在糖水平，例如至少一个脱氧核糖通过聚酰胺¹¹的取代，或者在磷酸基水平，例如其通过酯(尤其选自二磷酸酯、烷基-和芳基-膦酸酯和硫代磷酸酯)的取代。

主要选择性转录物的特异性结合配偶体是能够与主要选择性转录物结合的任意配偶体。举例来说，可以列举的是能够结合主要选择性转录物的核酸探针、扩增引物和任意其他分子。

杂交探针旨在表示包括5到100个核酸单位，尤其是10到35个核酸单位的核苷酸片段，在指定条件下(用于与靶基因的特定材料形成杂交复合物)具有杂交特异性。在本发明中，靶基因的特定材料可以是源自靶基因的信使RNA中含有的核苷酸序列(被称为靶基因的特异性mRNA)，通过所述信使RNA的逆转录获得的互补DNA中含有的核苷酸序列(被称为靶基因的特异性cDNA)，或者通过上述cDNA的转录获得的互补RNA中含有的核苷酸序列(被称为靶基因的特异性cRNA)。杂交探针可以含有便于其检测的标记。

对本发明来说，扩增引物旨在表示包含5到100个核酸单位、优选15到30个核酸单位的核苷酸片段，能够起始酶聚合，如尤其是酶扩增反应。酶扩增反应旨在表示通过至少一种酶的作用产生核苷酸片段的多个拷贝的过程。这类扩增反应是本领域技术人员公知的，尤其可以引证下列技术：

-PCR(聚合酶链反应)，如美国专利4,683,195，US 4,683,202和US4,800,159所述，

-LCR(连接酶链反应)，例如专利申请EP 0,201,184公开的，

-RCR(修复链反应)，如专利申请WO 90/01069所述，

-3SR(自动维持序列扩增)，如专利申请WO 90/06995所述，

-NASBA(基于核酸序列的扩增)，如专利申请WO 91/02818所述，和

-TMA(转录介导的扩增)，如美国专利US 5,399,491所述。

当酶促扩增是PCR时，特定试剂包括对靶基因特异并能够扩增靶基因的特定材料的至少2条扩增引物。靶基因的特定材料优选包括通过源自靶基因的信使RNA的逆转录获得的互补DNA(被称为靶基因的特异性cDNA)或者通过靶基因的特异性cDNA的转录获得的互补RNA(被称为靶基因的特异性cRNA)。当酶促扩增是在逆转录反应后进行的PCR时，它被称作RT-PCR。

检测旨在表示物理方法或者利用嵌入染料如SYBR

Green I或者溴化乙锭的化学方法或者通过标记的检测方法。已经有很多用于核酸检测的方法^12，13。

标记旨在表示能够产生可检测信号的示踪物。这些示踪物的非限制性列表包括例如通过比色法、荧光或者发光产生可检测信号的酶，如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或者葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；生色团如荧光、发光或者着色化合物；具有可检测的电子密度的基团，通过电子显微镜检查或者通过它们的电性质如电导率、通过电流分析法或者电压分析法或者通过阻抗测量；通过光学方法如衍射、表面等离子体共振、接触角变化或者通过物理方法如原子力光谱学、隧道效应等可检测的基团；或者放射性分子如³²P，³⁵S或者¹²⁵I。

就本发明来说，杂交探针可以是所谓的检测探针。在这种情况下，所谓的检测探针用如上所述的标记进行标记。由于该标记的存在，可以检测到指定检测探针与待检测的转录物之间杂交反应的存在。

检测探针尤其可以是“分子信标”检测探针¹⁴。这些“分子信标”在杂交期间产生荧光。它们具有茎-和-环型结构，包含荧光团和“猝灭”基团。特异性环序列与其互补靶核酸序列的结合造成茎的解旋以及在合适波长激发的荧光信号的发射。

杂交探针还可以是所谓的捕获探针。在这种情况下，所谓的捕获探针可以通过任何合适的方法直接或者间接地固定在或者可固定在固相支持物上，例如通过共价结合或者吸附。可以使用的固相支持物包括合成材料或者天然材料可能是化学修饰的，尤其是多糖如基于纤维素的材料例如纸，纤维素衍生物如醋酸纤维素和硝化纤维素或者葡聚糖，聚合物，共聚物，尤其是基于苯乙烯类的单体，天然纤维如棉花和合成纤维如尼龙；无机材料如硅石，石英，玻璃或者陶器；胶乳；磁性颗粒；金属衍生物，凝胶等等。固相支持物可以采用以下形式：微量滴定板，如WO-A-94/12670所述的膜，或者颗粒。所述支持物上还可以固定数种不同的捕获探针，每种特异于一种靶转录物。尤其是其上固定大量探针的生物芯片可以用作支持物。生物芯片旨在表示小型的固相支持物，其中大量捕获探针被固定到预定位置。生物芯片，或者DNA生物芯片，其概念开始于1990年代初。它基于多学科技术：集成微电子学，核酸化学，图像分析和数据处理。工作原理基于分子生物学基础：杂交现象，换言之即通过碱基互补性的DNA和/或RNA的两条序列的配对。生物芯片法基于使用固定在固相支持物上的捕获探针，所述捕获探针用于和直接或者间接标记荧光染料的靶核苷酸片段样品作用。捕获探针以特定方式定位在支持物或者芯片上，每个杂交给出与靶核苷酸片段相关的特定信息单元。获得的信息是累积的，例如能够定量一种靶基因/转录物或者数种靶基因/转录物的表达水平。杂交后，清洗支持物或者芯片，通过例如与荧光染料类的标记结合的高亲和力配体来显示标记的cDNA或者cRNA/捕获探针复合物。例如利用扫描仪读取荧光并通过数据处理进行荧光分析。为了说明，可以引证Affymetrix公司开发的用于分子诊断的DNA芯片(“Accessing Genetic Information with High-DensityDNA arrays”)^15，16。在这种技术中，捕获探针通常是较小的，大约25个核苷酸。在许多出版物^{17，18，19，20，21}或者专利US-A-4,981,783，US-A-5,700,637，US-A-5,445,934，US-A-5,744,305和US-A-5,807,522中给出了生物芯片的其他实例。固相支持物的主要特征是必须保持捕获探针对靶核苷酸片段的杂交特性，并将检测方法的背景噪声降到最低。

为了将探针固定到支持物上，3种主要制备方法是有区别的。

首先，第一种技术在于预合成探针的沉积。通过直接转移，微量吸液管，微点(micro-pointes)或者喷墨类装置进行探针的固定。这种技术能够固定大小范围从几个碱基(5到10)直到相对较大的60个碱基(印刷)到几百个碱基(微沉积)的探针：

·印刷是通过墨喷式打印机所用步骤的改进。它基于微细球形液体(体积＜1nl)的推进，速率可到达4000滴/秒。所述印刷不涉及释放液体的系统与液体沉积的表面之间的接触。

·微沉积在于将长几十到几百碱基的探针固定到玻璃载玻片的表面。这些探针通常从数据库获取并采用扩增和纯化产物的形式。这种技术能够制备被称为微阵列的芯片，其在小于4cm²的区域载有大约一万个样点的DNA(所谓的识别区)。但是，尼龙膜的使用，所谓的“宏阵列”，其载有通常通过PCR扩增的产物，直径从0.5到1mm，最大密度是25个样点/cm²，这千万不能被忽略。许多实验室使用这种非常灵活的技术。在本发明中，后一技术被认为属于生物芯片类。但是，如专利申请WO-A-00/71750和FR00/14896所示，可以将一定体积的样品沉积于微量滴定板各孔的底部，或者根据另一个专利申请FR00/14691，将一定数量的液滴分别沉积于单个培养皿的底部。

第二种将探针固定到支持物或者芯片上的技术被称为原位合成。这种技术直接在芯片表面产生短探针。它基于寡核苷酸的原位合成(尤其参见专利申请WO 89/10977和WO 90/03382)并基于寡核苷酸合成仪的加工。它在于沿着玻璃表面移动反应室，在所述反应室中发生寡核苷酸延伸反应。

最后，第三种技术被称为光刻术，这是一种出现在Affymetrix开发生物芯片之后的方法。这也是原位合成。光刻术来源于微处理器技术。通过附着光不稳定化学基团(能够被光活化)而修饰芯片表面。一旦暴露于光下，这些基团能够与寡核苷酸的3′端反应。通过用指定形状的掩模保护该表面，有可能照亮从而选择性活化芯片区域，在所述区域希望附着4种核苷酸中的1种或其他种。不同掩模的连续使用有可能交替进行保护/反应循环，从而在大约数十平方微米(μm²)的样点上产生寡核苷酸探针。这种解析度有可能在数平方厘米(cm²)的区域上产生直到数十万个样点。光刻术具有以下优点：大规模平行，有可能仅在4×N个循环中产生N-聚体的芯片。显然所有这些技术都可在本发明中使用。

用于主要选择性转录物的直接检测的生物学样品(能够包含所述的主要选择性转录物)可以由生物学液体或者组织组成，所述组织来自淋巴神经节的肿瘤或者被怀疑患者的转移瘤的活检。

为了从生物学样品检测转录物，通常需要提取步骤。也可以不需要提取，而通过组织切片上的原位杂交技术进行检测。可以通过本领域技术人员公知的任意提取和纯化核酸的实验步骤进行提取。为了说明，可以如下进行核酸的提取：

■溶解生物学样品中存在的细胞的步骤，以便释放患者细胞中包含的核酸。举例来说，可以使用诸如下列专利申请中描述的溶解方法：

o WO 00/05338，关于混合型磁性和机械溶解，

o WO 99/53304，关于电溶解，

o WO 99/15321，关于机械溶解。

本领域技术人员将能够使用其他公知的溶解方法，诸如热或者渗透压休克或者利用离液剂诸如胍盐的化学溶解(US 5,234,809)。

■纯化步骤，能够将核酸与溶解步骤释放的其它细胞组分分开。这个步骤通常有可能浓缩核酸，并适合RNA的纯化。例如，可以使用磁性颗粒，其可能通过吸附或者共价结合用寡核苷酸包被(关于这个主题参见专利US4,672,040和US 5,750,338)，因此可以通过洗涤步骤纯化与这些磁性颗粒附着的核酸。如果随后需要扩增所述核酸的话，这种核酸纯化步骤是尤其有益的。这些磁性颗粒的尤其有益的实施方案描述于专利申请：WO-A-97/45202和WO-A-99/35500。这些磁性颗粒的尤其有益的实施方案描述于硅石的专利申请或者采用柱的形式或者采用惰性²²或者顺磁颗粒形式(Merck：MagPrepSilica，Promega：MagneSil^TM顺磁颗粒)。其他使用非常广泛的方法基于柱形式的离子交换树脂或者磁性粒子形式(Whatman：DEAE-Magarose)²³。另一种非常相关但不仅限于本发明的方法是在金属氧化物支持物(Xtrana公司：Xtra-Bind^TM基质)上的吸附。

当特别需要从生物学样品提取RNA时，尤其可能利用苯酚、氯仿和醇进行提取以去除蛋白并用100％乙醇沉淀RNA。然后将RNA通过离心旋转沉淀，洗涤并重新溶解。

生物学液体可能需要特殊处理。主要选择性转录物可能在溶液中或者包含在循环的肿瘤细胞中。如果选择性转录物的检测是针对肿瘤细胞中包含的级分，则需要事先处理生物学液体以便分离所述液体中包含的循环肿瘤细胞。

分离循环肿瘤细胞旨在表示获得富含循环肿瘤细胞中的细胞级分。

可以通过以下方法处理液体以分离循环肿瘤细胞：通过流式细胞仪的细胞分选，通过Ficoll的富集，通过利用包被特异性抗体的磁珠的富集，或者通过本领域技术人员已知的任意其他特异性富集方法。

可以通过将Ficoll上的细胞分离技术与利用偶联磁珠的抗CD45抗体(Dynal Biotech ASA，Norway)耗竭血细胞联用分离循环肿瘤细胞。

然后可以直接对从生物学液体分离的循环肿瘤细胞进行主要选择性转录物的直接检测。例如，可以将通过细胞离心涂片器沉积在载玻片上的循环肿瘤细胞接触特异于主要选择性转录物的探针以便进行原位杂交。

间接方法的一个实例在于在体外将从样品提取的RNA翻译为蛋白，例如通过表达系统如大肠杆菌(E.coli)，然后通过免疫试验如“夹心”试验(例如ELISA)或者竞争性试验检测选择性RNA的特定翻译产物。这些方法是本领域技术人员公知的，尤其使用单克隆和/或多克隆抗体作为从RNA翻译的肽的特异性结合配偶体。

本发明的方法可以分步骤的实施，包括：

i)测定生物学样品中主要选择性转录物的量，

ii)将生物学样品中主要选择性转录物的量与预定阈值比较，所述阈值根据所用分析法的类型选择并代表病理学的检测界限，和

iii)确定诊断结果。

可以通过本领域技术人员已知的定量生物学样品中标记的任意方法如通过使用如上所述的杂交试验进行主要选择性转录物的浓度定量。

同样如上所述，众所周知核酸检测试验的结果通常很大程度上依赖于所用结合配偶体的特性，这导致它不可能给出准确的阈值，在各种情况下可以通过简单的常规试验确定适于所用每种结合配偶体的阈值。

本发明的诊断方法还可以被改进以包括检测KLK8基因的至少一种其他转录物的辅助步骤，这构成本发明的特定实施方案。

KLK8基因的其他转录物旨在表示：

-KLK8基因的其它选择性转录物，称为次要转录物，如已知为NT2、NT3和NT4的那些转录物以及本申请人发现的新转录物，称为NT5和NT6，

-编码激肽释放酶KLK8的转录物，也称为NT1。

序列SEQ ID N°7和SEQ ID N°8分别所示的新转录物NT5和NT6是新的，构成本发明的另一个主题。

本发明的诊断方法(包括检测KLK8基因另一选择性转录物的辅助步骤)可以通过以下步骤实施：

i)测定KLK8基因的主要选择性转录物的量以及相同生物学样品中KLK8基因的其他(可能是选择性的)转录物的量，和

ii)将获得的量与预定阈值比较，所述阈值根据所用分析法的类型选择并代表病理学的检测界限，和

iii)确定诊断结果。

通过本领域技术人员公知的方法可以连续或者同时测定KLK8的主要选择性转录物以及相同KLK8基因的其他(可能是选择性的)转录物的量。

相同的生物学样品旨在表示取自相同对象的相同性质的样品，即来自同一次取样的两个级分或者来自两次不同取样的两个样品，但它们必须具有相同性质，例如癌组织性质。优选使用来自同一次取样的两个样品。

本发明的诊断方法还可以包括检测另一种激肽释放酶基因的至少一种转录物的辅助步骤，这构成本发明的另一个实施方案。

因此所述方法检测另一种激肽释放酶基因的至少一种转录物，以及：

(a)KLK8基因的至少一种主要选择性转录物，或者

(b)KLK8基因的至少一种主要选择性转录物和KLK8基因的至少一种次要(可能是选择性的)转录物。

该方法可以通过以下步骤实施：

i)测定生物学样品中KLK8基因的主要选择性转录物的量以及有可能KLK8基因的其他(可能是选择性的)转录物的量Q1，

ii)测定相同样品中其他激肽释放酶基因的转录物的量Q2，

iii)计算Q1/Q2或者Q2/Q1的比例，

iv)将所述比例与预定阈值比较，所述阈值根据所用分析法的类型选择并代表病理学的检测界限，和

v)确定诊断结果。

为了举例说明适合本发明目的的激肽释放酶的另一基因，可以引证在肺表达的激肽释放酶的基因如KLK5、KLK6、KLK7、KLK10、KLK11、 KLK13和KLK14。激肽释放酶的这些基因已经在文献中被广泛描述，所以它们是本领域技术人员已知的。激肽释放酶基因KLK5、KLK11和KLK13是优选的，KLK11是尤其优选的。

如上所述，可以通过上述本领域技术人员公知的方法连续或者同时测定不同性质的转录物的量，相同的生物学样品旨在表示取自相同对象的相同性质的样品。

除了检测KLK8基因的主要选择性转录物外，本发明的诊断方法还包括检测肺中表达的另一种基因的至少一种转录物的步骤，所述另一种基因被理解为不同于编码激肽释放酶的基因。

作为肺中表达的其他基因的实例，可以引证编码桥粒钙粘着蛋白的基因，如桥粒胶蛋白2或者Dsc2和桥粒芯蛋白2或者Dsg2。

所述方法(还包括检测肺中表达的另一种基因的至少一种转录物的步骤)可以通过以下步骤实施：

i)测定生物学样品中KLK8基因的主要选择性转录物的量Q1，

ii)测定相同生物学样品中在肺中表达的所述另一种基因的转录物的量Q4，

iii)计算Q1/Q4或者Q2/Q4的比例，

v)确定诊断结果。

在本发明的每个实施方案中，最后一个步骤包括确定诊断结果。

诊断旨在表示该术语广义的诊断，即早期诊断和筛查，治疗监测，预后以及复发的诊断。

诊断类型将依赖于生物学样品的性质，其中在所述生物学样品中实施本发明的方法。因此，生物学液体优选用于早期诊断、筛查、复发的诊断以及可能的治疗监测。就固体样品如癌组织、淋巴神经节或者转移瘤而言，癌是已知存在的。本发明方法因此可用于预后以及可能的治疗监测。

如前所述，可以通过包括下列步骤之一改进所述预测：

-检测KLK8基因的至少一种其他(可能是选择性的)转录物的步骤，

-检测激肽释放酶的另一种基因的至少一种转录物的步骤，所述基因优选KLK5、KLK11和KLK13，KLK11是尤其优选的，有可能与KLK8基因的至少一种其他选择性转录物的检测结合，

-检测在肺中表达的另一种基因的至少一种转录物的步骤。

为了实施本发明的诊断方法，本发明的另一个主题是诊断试剂盒，其包含检测KLK8基因的主要选择性转录物必需的工具。

作为检测KLK8基因主要选择性转录物必需工具的非限制性实例，可以引证所述主要转录物的结合配偶体如杂交和检测探针。

本发明还涉及KLK8基因(编码激肽释放酶8)的至少一种主要选择性转录物在制备用于支气管肺癌尤其是非小细胞支气管癌的检测方法的试剂中的用途，所述方法特征在于包括将所述KLK8基因的至少一种主要选择性转录物与来自怀疑患有所述支气管肺癌的患者的生物学样品接触。附图说明

借助于下列实施例(为了说明给出，并且是非限制性的)以及附图1和2可以更好的理解本发明，其中：

-图1是电泳凝胶图，显示从腺癌(Ad)或者表皮样癌(C.EPI)患者的癌组织获得的KLK8基因的各种选择性转录物NT1到NT6，左边的泳道对应于分子量标记泳道，和

-图2是电泳凝胶图，显示癌症患者的血液中转录物NT4的存在，左边泳道对应于分子量标记泳道(MM)。具体实施方式

实施例1：基因KLK8的主要肺部转录物和新转录物的证实

按照制造商的建议使用“RNAeasy Midi kit”系统(Qiagen S.A.，Courtaboeuf，France)从腺癌或者表皮样癌患者的癌组织提取总RNA。然后利用PowerScript逆转录酶(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)将所述总RNA逆转录成cDNA。

对于每种样品来说，在42℃ 20μl的终体积中进行逆转录反应1小时。反应介质包括2μg总RNA，5μM非特异性十聚体寡核苷酸(随机十聚体RETROscript，Ambion，Cambridgeshire)和浓度各为1mM的dNTP，20URNase抑制剂(Roche Diagnostics，Meylan)，1×浓缩反应缓冲液和1单位Power Script逆转录酶(BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA)。

通过PCR扩增cDNA。25μl反应混合物包含：50ng总RNA逆转录物，1单位FastStart Taq DNA(Polymerase Roche Diagnostics，Meylan)，1×浓缩反应缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.3，10mM KCl，5mM(NH4)₂SO₄，2mMMgCl₂)，浓度为0.3mM的dNTP和0.2μM特异性引物。

这些引物选择在编码激肽释放酶KLK8(NT1)的序列的两侧并包含限制性酶切割位点(Not 1或者EcoR V)。这些引物是：

-K8Not_for：TGG AGG GCG GCC GCA TGG GAC GCC CCC GAC(SEQ IDN°1)和

-K8Eco_rev：TCC TAG ATA TCG CCC TTG CTG CCT ATG(SEQ ID N°2)。

在温度梯度热循环仪(Master cycler Gradient，Eppendorf)中进行PCR反应。扩增条件如下：95℃变性循环5分钟，继之以45个循环，包括95℃变性步骤20秒，56℃杂交步骤20秒和72℃延伸步骤1.30分钟。通过72℃1.30分钟的补充延伸循环终止反应。

将10微升反应物加入包含0.5μg/ml溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶。通过电泳分离产物并在UV下观察。使用的大小标记(Gene Ruler DNA Laddermix)由MBI-Fermentas公司提供。

电泳图如图1所示，其显示源自KLK8基因肺部表达的各种转录物以及NT3和NT4的主要转录物的特征。应当注意到这些转录物已经被核苷酸测序(参见实施例2)鉴定为之前被称为Neuropsin 1到4型的转录物(NT1至NT4)，两种新的转录物也已经被鉴定，并被命名为NT5和NT6。

实施例2：基因KLK8肺部转录物的结构表征和特异性引物的设计。

按照制造商的推荐将实施例1中获得的PCR产物克隆入载体 pcDNA5-FRT-V5-His TOPO(Invitrogen，Cergy Pontoise)。利用“QiaprepMiniPrep”系统(Qiagen S.A，Courtaboeuf)从各种克隆制备质粒DNA。纯化的质粒DNA然后通过260nm处的分光光度法定量，之后利用引物对T7和pCR 3.1(BGH_rev)双向测序。将下文给出的所获序列与数据库中包括的序列比较。利用CLUSTAL W软件，通过与KLK8基因的序列进行比对，确定表1列出的克隆的转录物的结构。

-与转录物NT1相同的肺部cDNA YC 170310.03的序列(NM_007196).：SEQ ID N°3

-与转录物NT2相同的肺部cDNA YC140710.03的序列(NM_144505).：SEQ ID N°4

-与转录物NT3相同的肺部cDNA YC090310.03的序列(NM_144506).：SEQ ID N°5

-与转录物NT4相同的肺部cDNA YC100310.03的序列(NM_144507).：SEQ ID N°6

-对应于新转录物(NT5)的肺部cDNA YC210710.03的序列：SEQ IDN°7

-对应于新转录物(NT6)的肺部cDNA YC050710.03的序列.：SEQ IDN°8

表1

肺部转录物	通用名	结构
			YC170310.03	NT1	EX1+EX2+EX3+E4+EX5+EX6
YC140710.03	NT2	EX1+EX2+EX3 ALT+EX4+EX5+EX6
			YC090310.03	NT3	EX1+EX2+EX5+EX6
YC100310.03	NT4	EX1+EX2+EX6
			YC210710.03	NT5	EX1+EX2+EX4+EX5+EX6
YC050710.03	NT6	EX1+EX2+EX3+EX5+EX6

EX＝外显子；ALT＝选择性外显子

如表1所示，肺部转录物的不同仅在于相同外显子的不同组合。因此不可能利用新序列来分别靶向它们(除了NT2外，其在外显子2的5′具有附加序列)。对基因KLK8的肺部转录物组的知识使确定每种转录物外显子的组合成为可能，以便将其与该组织中存在的其他转录物区分，如表2所示。

表2

肺部转录产物	通用名	肺部水平的独特组合
			YC170310.03	NT1	EX2-EX3+EX4-EX5
YC140710.03	NT2	EX2-EX3 ALT
			YC090310.03	NT3	EX2-EX5
YC100310.03	NT4	EX2-EX6
			YC210710.03	NT5	EX2-EX4
YC050710.03	NT6	EX3-EX5

因此利用存在于这些组合中的外显子连接序列的杂交或者检测探针是特异性和单独靶向肺部转录物的唯一方法。利用其产生能够特异性定量该器官中主要转录物NT3和NT4的扩增引物(参见表3)。

表3

靶向的转录物	引物的位置	特异性有义引物和序列的名称(SEQ ID N°)
			NT3	连接EX2-EX5	NT3_for：GGA GCC TGG GCA GAG AAT (SEQ ID N°9)
NT4	连接EX2-EX6	NT4-2/6：TGG GCA GGG CGA TTC T (SEQ ID N°10)

实施例3：肺癌患者的肿瘤组织中转录物NT3和NT4的定量。

利用iCycler iQ Detection System热循环仪(Biorad，Marnes la Coquette)在嵌入荧光团“SYBR Green”存在的条件下通过定量实时PCR分析转录物NT3和NT4。每次分析包括定量来自肺部肿瘤样品的cDNA的两个测量值，无DNA对照的两个测量值，利用从克隆YC090310.03(NT3)和YC100310.03(NT4)分离的标准质粒DNA的各种稀释度构建的标定曲线(参见实施例2)。利用定量编码核糖体亚单位18S的转录物期间测定的值将每个样品的值归一化。在核糖体亚单位18S的情况，利用这个基因的序列(853bp)的不同稀释度产生标定曲线，所述序列通过常规PCR扩增并按照制造商的推荐直接利用Macherey Nagel试剂盒纯化。用于获得该序列的寡核苷酸是：-oligo 18S_for：CTA CCA CAT CCA AGG AAG GCA GCA(SEQ ID N°11)和-oligo 18S_rev：GCT ATC AAT CTG TCA ATC CTG TCC(SEQ ID N°12)。

用于NT3和NT4定量扩增的反应混合物包含：100ng总RNA逆转录物(参见实施例1)，1单位FastStart Taq DNA聚合酶，SYBR Green(RocheDiagnostics，Meylan)0.2×浓缩、1×浓缩反应缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.3，10mM KCl，5mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgCl₂)，浓度各为0.2mM的dNTP，被研究转录物的有义(表III，实施例2)反义寡核苷酸引物各0.2μM。转录物NT3和NT4的反义引物分别是：与外显子5和6的连接序列杂交的引物NT3_rev(CCT CCA GAA TCG CCC T-SEQ ID N°13)，引物NT4_rev(CAGTCC AGG TAG CGG CAG-SEQ ID N°14)，其靶序列位于外显子6。

在下列反应介质中定量测量编码核糖体亚单位18S的管家基因：0.5ng总RNA逆转录物，1单位FastStart Taq DNA聚合酶，SYBR Green 0.2×浓缩、1×浓缩反应缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.3，10mM KCl，5mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgCl₂)，其中添加2mM MgCl₂，浓度各为0.2mM的dNTP，有义(CGCGGT TCT ATT TTG TTG GTT TT-SEQ ID N°15)和反义(TTC GCT CTGGTC CGT CTT GC-SEQ ID N°16)引物各0.56μM。

用于各种转录物定量PCR的扩增条件显示于表4。

表4

对取自手术切除部分(来自2002年1月至2004年6月之间接受支气管肺癌手术的患者)的肿瘤组织的样品进行定量。群组研究包括60位患者，他们的年龄介于45到83岁，中位年龄为65岁(参见表5)。

表5

肿瘤类型	患者数目
		腺癌	33
表皮样癌	16
		大细胞癌	5
粘液表皮样癌	1
		神经内分泌癌	1
类癌瘤	4

根据pTNM分期²⁴，38位患者患有1或者2期癌症，24位患者患有3或者4期癌症。通过在2006年1月收集有关他们健康状况的信息进行生存率分析。在研究期间我们记录到26例死亡。

为了获得以任意单位(AU)表示的NT3和NT4的归一化值，我们通过χ2检验确定阈值以便最好的预测群体的总生存率。NT3的阈值是50AU(χ2＝7.54；P＝0.006)，NT4的阈值是1000AU(χ2＝7.54；P＝0.006)。将这些代表45^th和46^th百分位数的值用于后续分析。

将患者分成两组：一组对应于显示比确定的阈值更低表达水平的个体(弱表达；称为弱NT3或者NT4)，和一组具有更高表达水平(强表达；称为弱NT3或者NT3)。对于每一组，通过Kaplan-Meier方法构建生存曲线，并通过log rank检验评价曲线间差异的显著性。通过利用Cox模型(Cox比例风险回归模型)计算的HR(死亡相对风险)评价转录物表达(强表达对弱表达的比较)对患者总生存率的影响。进行的分析是单因素的。还可以在对肿瘤分期修正后(能够消除变量“分期”)实施，因为该变量与患者生存率密切相关(然后被称为修正的强NT3或者NT4)。

结果显示于表6。

表6

NC：未计算和CI：置信区间，vs＝比

Kaplan-Meier生存曲线显示强表达NT3或者NT4(强NT3或者NT4)的患者和弱表达这些转录物的患者之间生存率(log rank检验，表6)的显著差异(根据弱NT3或者NT4计算的P)。

Cox模型能够得出以下结论：强表达所述转录物的患者的生存率显著低于其他患者。实际上，Cox分析显示与NT3(增加到2.860倍；HR，表6)或者NT4(增加到3.608倍；HR，表6)的强表达有关的死亡风险增加是统计上有显著意义的。因此这些转录物的表达水平构成患者肺癌生存率的预后指标。

在对肿瘤分期修正后(修正的强NT3或者NT4)发现与“强NT3”有关的死亡风险增加失去统计显著性(P＝0.0779)。这表明所述两个变量(NT3的表达和肿瘤分期)看起来在本研究中是相关的。

尽管如此，“修正的强NT3”向着显著性的明显趋势表明在包括更多事件的更深入研究中所述两个变量可以变成是独立的。

这种情形对于变量“强NT4”来说是不同的，因为对于肿瘤分期的修正不改变死亡风险增加的统计显著性。该结果证明变量NT4是不依赖于肿瘤分期的预后指标。

实施例4：转录物NT3或者NT4的分析结合激肽释放酶其他基因的转录物的分析。

用于分析肺中表达的激肽释放酶其他基因(KLK5，KLK6，KLK7，KLK10，KLK11，KLK13和KLK14)的转录物的策略与实施例3所述的相同。总之，在每个循环后通过SYBR green的掺入测定源自cDNA和对照扩增的产物量。根据源自不同基因的cDNA克隆的质粒DNA产生标准曲线。将每位患者和每个基因的值用核糖体18S的值归一化并以任意单位表示。反应条件与所述用于NT3和NT4的条件(实施例3)相同。使用的PCR引物描述于表7。

表7

名称	序列	基因	方向	SEQ ID N°
					K5.398_for K5.682_rev	GCC ACT ACT CCC TGT CAC CA GCA TCC TCG CAC CTT TTC TG	KLK5	有义反义	1718
256.K6_for 393.K6_rev	TGA TGG TGG TGC TGA GT ACA GTG GAT GGA TAA GGA C	KLK6	有义反义	1920
					547.K7_for 615.K7_rev	GAG CCC AGA TGT GAC CTT TCC TTG TAA ACC TTC GTG C	KLK7	有义反义	2122
2K10.210_for 2K10.442_rev	GGA CCC CGA AGC CTA TG CCT GAG CCC TGG TGG TA	KLK10	有义反义	2324
					K11_for2 K11_rev2	CAG GAT CAT CAA GGG GTT CG CAT TGC GGT GGT CTT TGT TG	KLK11	有义反义	2526
576.K13_for 672.K13_rev	GTG CCA ACA TCC AAC TTC G CCC TCA CAG GAG TCTTTG C	KLK13	有义反义	2728
					448.K14_for 500.K14_rev	TGG GTC ATC ACT GCT GCT C CTC CTC AGG TTG TGC TTG C	KLK14	有义反义	2930

表8

用于分析各种基因的转录物的群组来自于实施例3中研究的群。该群组内的肿瘤组织学类型分布列于表9。

表9

肿瘤类型	KLK5，7	KLK6	KLK10，11，13	KLK14
					腺癌	29	33	28	33
表皮样癌	16	16	16	15
					大细胞癌	4	5	3	5
粘液表皮样癌	1	1	1	1
					神经内分泌癌	1	1	1	1
类癌瘤	3	4	1	4
					总数	54	60	50	59

对于每位患者，测定不同转录物的表达水平并计算与NT3或NT4的比例(表10是针对NT3的，表11是针对NT4的)。对于每个比例，我们然后确定阈值以便通过实施例3描述方法最准确的预测所述群的总生存率。

表10

变量	阈值	χ2	P	百分位数	死亡
						NT3/KLK5	0.05	5.54	0.019	46	26
NT3/KLK6	0.005	5.54	0.019	42	26
						NT3/KLK7	0.001	7.54	0.006	37	26
NT3/KLK10	0.01	10.66	0.001	36	24
						NT3/KLK11	0.0015	8.17	0.004	40	24
NT3/KLK13	0.008	8.17	0.004	40	24
						NT3/KLK14	0.10	6.00	0.014	53	24

表11

变量	阈值	χ2	P	百分位数	死亡
						NT4/KLK5	2	3.84	0.049	53	26
NT4/KLK6	2	3.84	0.049	43	26
						NT4/KLK7	0.1	7.50	0.006	39	26
NT4/KLK10	0.4	5.99	0.014	42	24
						NT4/KLK11	0.1	10.66	0.001	44	24
NT4/KLK13	0.7	8.17	0.004	46	24
						NT4/KLK14	0.5	5.99	0.014	52	24

如实施例3，患者被分成两组：一组对应于显示比确定的阈值更低表达水平的个体(弱表达)，和一组显示更高的表达水平(强表达)。对于每一组，通过Kaplan-Meier方法构建生存曲线并通过log rank检验评价曲线间差异的显著性。利用Cox模型(Cox比例风险回归模型)计算死亡的相对风险(HR)。在对肿瘤分期修正后进行分析，因为该变量与患者的生存率密切相关。

NT3的结果列于表12。

表12

NC：未计算和CI：置信区间

该研究证明NT3/KLKx比例大于阈值的患者与所述比例值低于阈值的患者相比具有显著将低的存活率(除了NT3/KLK7之外；log rank检验)。

Cox检验的结果显示比例NT3/KLK5、NT3/KLK11和NT3/KLK13是不依赖于肿瘤分期的预后指标(对于修正的变量P＜0.05)。因此产生NT3表达相对基因KLK5、KLK11和KLK13表达的比例将改良NT3的预测能力，因为单独的该变量不是完全独立于被研究群中的变量“肿瘤分期”(参见实施例3)。

NT4的结果列于表13。

表13

NC：未计算和CI：置信区间

如表13所示，NT4/KLKx比例大于阈值的患者与所述比例值低于阈值的患者相比显示显著将低的存活率(除了NT3/KLK6之外；log rank检验)。Cox检验的结果显示除了NT3/KLK6比例之外，所有其他比例构成不依赖于肿瘤分期的预后指标(对于修正的变量P＜0.05)。在本研究中，NT4/KLK11比例显得尤其有效，因为利用该变量计算的死亡相对风险大于从肿瘤分期获得的。

实施例5：转录物NT3以及基因KLK8的其他转录物(NT1，NT2，NT5和NT6)的定量，可能还结合激肽释放酶其他转录物的定量

在先前的实施例中，通过使用区别性PCR引物分别分析转录物NT3和NT4。本实施例旨在评价当通过非区别性PCR引物进行分析时这些转录物的预后价值。我们使用靶向外显子5和6的寡核苷酸，因此能够获得转录物NT1、NT2、NT3、NT5和NT6的总定量。测量的变量被命名为“KLK8”。这些引物的序列是：

-719.K8_for：CCA GAA GAA GTG TGA GGA TG(SEQ ID N°31)和

-890.K8_rev：GGT ATA GAC GCC AGG TTT G(SEQ ID N°32)。

使用的反应混合物与实施例3相同，扩增条件如下：95℃5分钟的1个循环，然后是50个循环，包括95℃20秒的变性步骤，60℃20秒的杂交步骤，72℃20秒的延伸步骤，和84℃15秒的荧光采集步骤。所述过程与先前的实施例相同，即：(1)通过标准曲线定量变量，(2)利用核糖体18SRNA表达水平归一化，(3)采用任意值形式的表达，可能与另一种基因的表达比较，(4)通过chi²检验确定阈值(表14)，(5)群的二值化(强表达＞阈值；弱表达＜阈值)，(6)统计检验(表15)。

所述针对变量“KLK8”的研究群组与实施例3相同，并与实施例4中以相对其他激肽释放酶基因的比例形式的表达相同。

表14

变量	阈值	χ2	P	百分位数	死亡
						KLK8	250	7.54	0.006	42	26
KLK8/KLK5	0.33	5.53	0.018	43	26
						KLK8/KLK6	0.10	7.54	0.006	22	26
KLK8/KLK7	0.020	15.39	0.00008	22	26
						KLK8/NT4	0.020	12.46	0.0004	19	26
KLK8/KLK10	0.2	8.16	0.004	44	24
						KLK8/KLK11	0.02	8.16	0.004	42	24
KLK8/KLK13	0.1	13.49	0.0002	40	24
						KLK8/KLK14	0.050	8.16	0.004	39	24

表15

CI，置信区间

具有变量“KLK8”高值的患者的生存率低于其他人(log rank检验，P＝0.0353)；但是，该变量与变量“肿瘤分期”有关，如修正变量的非显著P所示(表17)。

当变量“KLK8”以比例形式与其他激肽释放酶基因的表达水平结合时，该变量就成为独立的(P＜0.05；表17)。这适用于比例KLK8/KLK10、 KLK8/KLK11和KLK8/KLK13。这些变量因此构成肺癌的不利并且独立的预后指标。

实施例6：证实肺癌患者的血液中转录物NT4的存在。

基于癌症患者的外周血对潜伏癌的灵敏检测可能具有重要的预后或者治疗意义。因此我们进行本实验以证明有可能检测到血液中NT4转录物的存在以及该检测可能与肺癌有关。

将来自健康对象和肺癌对象的血液采集到“PAXgene^TM Blood RNA”管(Europe BD)，然后按照供应商的推荐利用PAXgene Blood RNA System(Qiagen，France)制备总RNA。按照实施例1描述的步骤将这些总RNA逆转录成cDNA。通过“嵌套式PCR”(2轮连续PCR)检测NT4转录物。在第一轮PCR，我们使用实施例1描述的引物K8Not_for和K8Eco_rev。所述反应介质与实施例1相同，PCR条件也一样。但是，只进行30个扩增循环。对于第二轮PCR，我们使用分别在实施例2和3中描述的引物NT4-2/6和NT4_rev。反应介质(包含1μl第一轮PCR产物)和扩增程序与实施例1相同，除了引物杂交期是在62℃进行以外。进行50个循环，将10μl PCR介质加到用溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶中。

结果显示于图2，这是从两位癌症患者和两位健康患者获得的电泳凝胶图。

如图2所示，不可能从健康患者的血液中检测到转录物NT4。该观察结果表明这种转录物在正常血细胞中不存在。在其中一名肺癌患者中检测到转录物NT4。因此该方法使在患有肺癌的某些对象中检测循环肿瘤细胞的存在成为可能。

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序列表

<110>生物梅里埃公司

费朗索瓦·拉伯雷大学

<120>通过检测编码激肽释放酶8的KLK8基因的主要选择性转录物的体外诊断支气管肺癌

的方法及其预测生存率的用途

<130>Trans KLK8

<160>32

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>1

tggagggcgg ccgcatggga cgcccccgac 30

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>2

tcctagatat cgcccttgct gcctatg 27

<210>3

<211>806

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>NT1 Transcrit ok Kallicreine 8

<400>3

tggaagggcg gccgcatggg acgcccccga cctcgtgcgg ccaagacgtg gatgttcctg 60

ctcttgctgg ggggagcctg ggcaggacac tccagggcac aggaggacaa ggtgctgggg 120

ggtcatgagt gccaacccca ttcgcagcct tggcaggcgg ccttgttcca gggccagcaa 180

ctactctgtg gcggtgtcct tgtaggtggc aactgggtcc ttacagctgc ccactgtaaa 240

aaaccgaaat acacagtacg cctgggagac cacagcctac agaataaaga tggcccagag 300

caagaaatac ctgtggttca gtccatccca cacccctgct acaacagcag cgatgtggag 360

gaccacaacc atgatctgat gcttcttcaa ctgcgtgacc aggcatccct ggggtccaaa 420

gtgaagccca tcagcctggc agatcattgc acccagcctg gccagaagtg caccgtctca 480

ggctggggca ctgtcaccag tccccgagag aattttcctg acactctcaa ctgtgcagaa 540

gtaaaaatct ttccccagaa gaagtgtgag gatgcttacc cggggcagat cacagatggc 600

atggtctgtg caggcagcag caaaggggct gacacgtgcc agggcgattc tggaggcccc 660

ctggtgtgtg atggtgcact ccagggcatc acatcctggg gctcagaccc ctgtgggagg 720

tccgacaaac ctggcgtcta taccaacatc tgccgctacc tggactggat caagaagatc 780

ataggcagca agggcgatat ctagga 806

<210>4

<211>940

<212>DNA

<213>Artificial seauence

<220>

<223>NT2 Transcrit of Kallicreine 8

<400>4

tggaaggcgg ccgcatggga cgcccccgac ctcgtgcggc caagacgtgg atgttcctgc 60

tcttgctggg gggagcctgg gcagcgtgtg gaagcctgga cctcctcact aagttgtatg 120

cggagaactt gccgtgtgtc catttgaacc cacagtggcc ttcccagccc tcgcactgcc 180

ccagagggtg gcgatccaac cctctccctc ctgctgcagg acactccagg gcacaggagg 240

acaaggtgct ggggggtcat gagtgccaac cccattcgca gccttggcag gcggccttgt 300

tccagggcca gcaactactc tgtggcggtg tccttgtagg tggcaactgg gtccttacag 360

ctgcccactg taaaaaaccg aaatacacag tacgcctggg agaccacagc ctacagaata 420

aagatggccc agagcaagaa atacctgtgg ttcagtccat cccacacccc tgctacaaca 480

gcagcgatgt ggaggaccac aaccatgatc tgatgcttct tcaactgcgt gaccaggcat 540

ccctggggtc caaagtgaag cccatcagcc tggcagatca ttgcacccag cctggccaga 600

agtgcaccgt ctcaggctgg ggcactgtca ccagtccccg agagaatttt cctgacactc 660

tcaactgtgc agaagtaaaa atctttcccc agaagaagtg tgaggatgct tacccggggc 720

agatcacaga tggcatggtc tgtgcaggca gcagcaaagg ggctgacacg tgccagggcg 780

attctggagg ccccctggtg tgtgatggtg cactccaggg catcacatcc tggggctcag 840

acccctgtgg gaggtccgac aaacctggcg tctataccaa catctgccgc tacctggact 900

ggatcaagaa gatcataggc agcaagggcg atatctagga 940

<210>5

<211>383

<212>DNA

<213>Artificial seauence

<220>

<223>NT3 Transcrit of Kallicreine 8

<400>5

tggaaggcgg ccgcatggga cgcccccgac ctcgtgcggc caagacgtgg atgttcctgc 60

tcttgctggg gggagcctgg gcagagaatt ttcctgacac tctcaactgt gcagaagtaa 120

aaatctttcc ccagaagaag tgtgaggatg cttacccggg gcagatcaca gatggcatgg 180

tctgtgcagg cagcagcaaa ggggctgaca cgtgccaggg cgattctgga ggccccctgg 240

tgtgtgatgg tgcactccag ggcatcacat cctggggctc agacccctgt gggaggtccg 300

acaaacctgg cgtctatacc aacatctgcc gctacctgga ctggatcaag aagatcatag 360

gcagcaaggg cgatatctag gga 383

<210>6

<211>248

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>NT4 Transcrit of Kallicreine 8

<400>6

tggaaggcgg ccgcatggga cgcccccgac ctcgtgcggc caagacgtgg atgttcctgc 60

tcttgctggg gggagcctgg gcagggcgat tctggaggcc ccctggtgtg tgatggtgca 120

ctccagggca tcacatcctg gggctcagac ccctgtggga ggtccgacaa acctggcgtc 180

tataccaaca tctgccgcta cctggactgg atcaagaaga tcataggcag caagggcgat 240

atctagga 248

<210>7

<211>645

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>NT5 Transcrit of Kallicreine 8

<400>7

tggaaggcgg ccgcatggga cgcccccgac ctcgtgcggc caagacgtgg atgttcctgc 60

tcttgctggg gggagcctgg gcaggaaata cacagtacgc ctgggagacc acagcctaca 120

gaataaagat ggcccagagc aagaaatacc tgtggttcag tccatcccac acccctgcta 180

caacagcagc gatgtggagg accacaacca tgatctgatg cttcttcaac tgcgtgacca 240

ggcatccctg gggtccaaag tgaagcccat cagcctggca gatcattgca cccagcctgg 300

ccagaagtgc accgtctcag gctggggcac tgtcaccagt ccccgagaga attttcctga 360

cactctcaac tgtgcagaag taaaaatctt tccccagaag aagtgtgagg atgcttaccc 420

ggggcagatc acagatggca tggtctgtgc aggcaacagc aaaggggctg acacgtgcca 480

gggcgattct ggaggccccc tggtgtgtga tggtgcactc cagggcatca catcctgggg 540

ctcagacccc tgtgggaggt ccgacaaacc tggcgtctat accaacatct gccgctacct 600

ggactggatc aagaagatca taggcagcaa gggcgatatc tagga 645

<210>8

<211>542

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>NT6 Transcrit of Kallicreine 8

<400>8

tggaaggcgg ccgcatggga cgcccccgac ctcgtgcggc ctagacgtgg atgttcctgc 60

tcttgctggg gggagcctgg gcaggacact ccagggcaca ggaggacaag gtgctggggg 120

gtcatgagtg ccaaccccat tcgcagcctt ggcaggtggc cttgttccag ggccagcaac 180

tactctgtgg cggtgtcctt gtaggtggca actgggtcct tacagctgcc cactgtaaaa 240

aaccagaatt ttcctgacac tctcaactgt gcagaagtaa aaatctttcc ccagaagaag 300

tgtgaggatg cttacccggg gcagatcaca gatggcatgg tctgtgcagg cagcagcaaa 360

ggggctgaca cgtgccaggg cgattctgga ggccccctgg tgtgtgatgg tgcactccag 420

ggcatcacat cctggggctc agacccctgt gggaggtccg acaaacctgg cgtctatacc 480

aacatctgcc gctacctgga ctggatcaag aagatcatag gcagcaaggg cgatatctag 540

ga 542

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>9

ggagcctggg cagagaat 18

<210>10

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>10

tgggcagggc gattct 16

<210>11

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>11

ctaccacatc caaggaaggc agca 24

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>12

gctatcaatc tgtcaatcct gtcc 24

<210>13

<211>16

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>13

cctccagaat cgccct 16

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>14

cagtccaggt agcggcag 18

<210>15

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>15

cgcggttcta ttttgttggt ttt 23

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>16

ttcgctctgg tccgtcttgc 20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>17

gccactactc cctgtcacca 20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>18

gcatcctcgc accttttctg 20

<210>19

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>19

tgatggtggt gctgagt 17

<210>20

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>20

acagtggatg gataaggac 19

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>21

gagcccagat gtgacctt 18

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>22

tccttgtaaa ccttcgtgc 19

<210>23

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>23

ggaccccgaa gcctatg 17

<210>24

<211>17

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>24

cctgagccct ggtggta 17

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>25

caggatcatc aaggggttcg 20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>26

cattgcggtg gtctttgttg 20

<210>27

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>27

gtgccaacat ccaacttcg 19

<210>28

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>28

ccctcacagg agtctttgc 19

<210>29

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>29

tgggtcatca ctgctgctc 19

<210>30

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>30

ctcctcaggt tgtgcttgc 19

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>31

ccagaagaag tgtgaggatg 20

<210>32

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial sequence

<220>

<223>Amplification primer

<400>32

ggtatagacg ccaggtttg 19

Claims

1.编码激肽释放酶8的基因KLK8的主要选择性转录物的扩增引物在制备用于确定非小细胞支气管癌人类患者的生存率的方法中所用的试剂盒中的应用，所述方法特征在于它包括在来自所述患者的生物学样品中检测KLK8基因的至少一种主要选择性转录物的步骤，其中所述KLK8基因的主要选择性转录物选自SEQ ID NO：5所示的转录物NT3和SEQ ID NO：6所示的NT4，其中用于扩增NT3的引物分别由SEQ ID NO：9和13的序列组成，用于扩增NT4的引物分别由SEQ ID NO：10和14的序列组成。

2.如权利要求1所述的应用，其中所述方法特征在于所述步骤包括：

i)测定生物学样品中主要选择性转录物的量，

iii)确定诊断结果。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述方法包括检测作为主要选择性转录物的NT3以及KLK8基因的至少一种其他转录物，所述KLK8基因的至少一种其他转录物选自SEQ ID NO：4所示的NT2、SEQ ID NO：6所示的NT4、SEQ ID NO：7所示的NT5和SEQ ID NO：8所示的NT6。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述方法包括检测作为主要选择性转录物的NT4以及KLK8基因的至少一种其他转录物，所述KLK8基因的至少一种其他转录物选自SEQ ID NO：4所示的NT2、SEQ ID NO：5所示的NT3、SEQ ID NO：7所示的NT5和SEQ ID NO：8所示的NT6。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述方法还包括检测SEQ IDNO：3所示的NT1。

6.如权利要求3或4所述的应用，其中所述方法特征在于所述步骤包括：

i)测定KLK8基因的主要选择性转录物的量以及相同生物学样品中基因KLK8的所述其他转录物的量，和

iii)确定诊断结果。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述方法还包括检测编码另一种激肽释放酶的基因的至少一种转录物的步骤。

8.如权利要求7所述的应用，其中所述方法特征在于所述步骤包括：

i)测定生物学样品中基因KLK8的主要选择性转录物的量Q1，和

ii)测定相同样品中编码其他激肽释放酶的基因的转录物的量Q2，

iii)计算Q1/Q2或者Q2/Q1的比例，

v)确定诊断结果。

9.如权利要求3或者4所述的应用，其特征在于所述方法还包括检测编码另一种激肽释放酶的基因的至少一种转录物的步骤。

10.如权利要求9所述的应用，其中所述方法特征在于所述步骤包括：

vi)测定生物学样品中基因KLK8的主要选择性转录物以及基因KLK8的其他转录物的量Q1，和

vii)测定相同样品中编码其他激肽释放酶的基因的转录物的量Q2，

viii)计算Q1/Q2或者Q2/Q1的比例，

ix)将所述比例与预定阈值比较，所述阈值根据所用分析法的类型选择并代表病理学的检测界限，和

x)确定诊断结果。

11.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述方法还包括检测在肺中表达的另一种基因的至少一种转录物的步骤，所述另一种基因不是编码激肽释放酶的基因。

12.如权利要求11所述的应用，其中所述方法特征在于所述步骤包括：

i)测定生物学样品中KLK8基因的主要选择性转录物的量Q1，

ii)测定相同样品中在肺中表达的所述另一种基因的转录物的量Q3，

iii)计算Q1/Q3或者Q3/Q1的比例，

v)确定诊断结果。

13.诊断试剂盒，其含有用于实施权利要求1到12任一项中所限定的方法的KLK8基因的主要选择性转录物的核酸扩增引物，其中用于扩增NT3的引物分别由SEQ ID NO：9和13的序列组成，用于扩增NT4的引物分别由SEQID NO：10和14的序列组成。