JP4944041B2 - 前立腺癌の予後判定用マーカー及び／又はテラノスティックマーカーとなる、尿沈渣及び／又は尿のｍＲＮＡ比 - Google Patents

前立腺癌の予後判定用マーカー及び／又はテラノスティックマーカーとなる、尿沈渣及び／又は尿のｍＲＮＡ比 Download PDF

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Description

本発明は、一般には、前立腺癌に関する。より詳細には、本発明は、前立腺癌の検出に加え、前立腺癌の予後判定及びステージの判定を行うための方法に関する。本発明は、患者の尿沈渣で発現されているｍＲＮＡの比を患者由来サンプルから決定することによって行う、前立腺癌のステージの判定及び予後判定に関する。さらに本発明は、前立腺由来ｍＲＮＡ比の、前立腺癌のテラノスティック（theranostic）マーカーとしての用途に関する。さらにまた本発明は、前立腺癌を発症しているヒトに由来するサンプルから前立腺癌の診断、ステージの判定及び予後判定を行うための、核酸プライマーを含むキット、及び、核酸プライマーと核酸プローブとを含むキットに関する。
過去１０年間において、前立腺癌は男性で最も多く診断される悪性腫瘍となり、肺癌に次いで、西洋社会における男性の癌死亡原因の第２位となった（Landis et al., 1998, CA Cancer J. Clin. 48(1):6-29）。すべての癌の中で、前立腺癌の発症率が年齢とともに最も急速に増大する。西洋社会においては、人の寿命が延びるにつれて、それに対応する前立腺癌の発症件数も増加し続け、この１０年間だけで６０％もの増大が予想される。死亡率の増加はよりゆっくりした速度であるが、この５０年間で全体として２倍になっている。前立腺癌の診断が下されるのは典型的には６５歳を越える男性であるが、それでも、その影響は、前立腺癌で死亡する男性の平均寿命が９〜１０年短くなるという点で重大である。前立腺癌が発見された場合、早期の前立腺癌であれば今では外科的処置によって症例の約９０％を完治することができる。しかし、一旦腫瘍が前立腺領域の外に広がって遠隔転移してしまうと、ゆっくりではあるが致命的である。したがって、前立腺癌の早期発見とステージの正確な判定が適切な治療法の選択に非常に重要であり、治療の成功率を向上させ、前立腺癌による死亡率を減少させることになる。
近年の多くの進歩にも拘らず、前立腺癌を発症した個体のステージを判定するための精度は、依然として不十分である。その主たる理由は、ステージの正確な判定のための非常に特異的で感度の高い分子検査法（molecular test）が存在しないことと、前立腺の外に広がった腫瘍は、通常、巨視的というよりは微視的であり、したがって検出困難であるためである。前立腺の直腸指診は、何十年にもわたって局所における前立腺癌のステージの判定のための柱石であったが、しばしば、前立腺癌の程度を過小評価してしまう。経直腸的超音波自体は、前立腺癌のステージの判定の手段としての用途は限られている。コンピューター断層写真術及び磁気共鳴画像化法は、通常、前立腺癌のステージの判定には役に立たない（Kirby, 1997, Prostate cancer and Prostatic Diseases 1:2-10）。前立腺癌のステージの判定を行うための最近の有望な研究として、前立腺細胞で優先的に発現されるタンパク質マーカー又はそれらに対応する核酸を主たる対象とする、生化学的及び分子工学的技術の利用が挙げられる（Lange, 1997,“Principles and Practice of Genitourinary Oncology”ed. Lippincott-Raven Publishers の第41章、417-425頁）。
腫瘍マーカーは、健常人から得た生物学的サンプルにおいてよりも、癌患者から得た生物学的サンプルにおいて、しばしば、高い濃度で検出される。これらのマーカーは、しばしば、タンパク質又はタンパク質をコードする核酸である。腫瘍マーカーは、非コード核酸分子でもよい。これらのマーカーは、時に、腫瘍患者のステージ判定、モニタリング、及び追跡調査に有用である可能性がある。
腫瘍マーカーレベルの変化は、レベル値の平均的健常人との比較とともに、癌治療のモニタリングに有用となる可能性がある。持続的な上昇や決められたカットオフ値を越える値は、再発癌や癌の特定のステージを示す指標となり得る。場合によっては、腫瘍マーカーは、癌の疑いのある人のスクリーニングにも用いることができ、ここで使用する腫瘍マーカーは、癌の何らかの臨床的証拠が現れる前にしばしば上昇するものである。
前立腺癌に関連する腫瘍マーカー又は腫瘍抗原の同定は、それらが前立腺癌のスクリーニング、診断、予後判定、臨床管理及び将来の治療薬としての有用性故に、かなりの関心を喚起した。実際、疾患が局所に限定された患者であれば、放射線前立腺切除や放射線療法によってしばしば治癒することができるが、疾患が遠方に拡大した患者に対しては、治療方法は存在しない。このことは、新たな前立腺（癌）特異的な治療標的の必要性を強調するのである。前立腺で特異的に発現するいくつかの遺伝子が知られている。このような遺伝子の例としては、ＰＳＡ（Sokoll et al., 1997, Prostate-specific antigen. Its discovery and biochemical characteristics. Urol. Clin. North Am. 24:253-259）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）（Fair et al., 1997, Prostate-specific membrane antigen. Prostate 32:140-148）、前立腺幹細胞抗原（Reiter et al., 1998. Prostate stem cell antigen: a cell surface marker overexpressed in prostate cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1735-1740）、ＴＭＰＲＳＳ２（Lin et al., 1999. Prostate-localized and androgen-regulated expression of the membrane-bound serine protease TMPRSS2. Cancer Res. 59:4180-4184）、ＰＤＥＦ（Oettgen et al., 2000. PDEF, a novel prostate epithelium-specific ets transcription factor, interacts with the androgen receptor and activates prostate-specific antigen gene expression. J. Biol. Chem. 275:1216-1225）、及び前立腺特異的遺伝子−１（Herness, 2003. A novel human prostate-specific gene-1 (HPG-1): molecular cloning, sequencing, and its potential involvement in prostate carcinogenesis. Cancer Res. 63:329-336）が挙げられる。さらに、以下に例示するいくつかの非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）が挙げられる： ＰＣＡ３（Bussemakers et al., 1999. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer [Cancer Res. 59:5975-5979]、WO98/045420、WO01/023550、WO2004/070056 及び WO2005/003387）、とＰＣＧＥＭ１（Srikantan et al., 2000. PCGEM1, a prostate-specific gene, is overexpressed in prostate cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:12216-12221）。また、遺伝子クラスターであるＰ７０４Ｐ、Ｐ７１２Ｐ、及びＰ７７５Ｐ（Stolk et al., 2004. P704P, P712P, and P775P: A genomic cluster of prostate-specific genes. Prostate 60:214-226）も挙げられる。列挙した遺伝子の一部のみが、前立腺癌の予後判定、進行及び／又は転移能力に関連付けられており、有用な治療標的となる可能性を有するものとされている。前立腺癌のサーベイランス、追跡調査、モニタリング及び治療法の選択に用いられる最もよく知られた前立腺腫瘍マーカーは、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）とＰＳＭ（前立腺特異的膜）抗原である。
ＰＳＡは、１９番染色体に位置するＰＳＡ遺伝子のコードするセリンプロテアーゼである。糖タンパク質であるＰＳＡは、前立腺の腺上皮細胞によってアンドロゲンの制御下で発現され、精液を液化するために精液中に分泌される。ＰＳＡタンパク質は、通常は前立腺内に留められているが、前立腺癌、ＢＰＨ（良性前立腺肥大）などの前立腺疾患の場合には、血液中に漏れる。血液中のＰＳＡは、タンパク質複合体に結合した形態、タンパク質複合体に結合しない形態など、様々な形態で存在する（El-Shirbiny, 1994, Adv. Clin. Chem. 31:99）。血清総ＰＳＡ濃度の測定は、前立腺癌患者のスクリーニング及び管理に最もよく用いられている、ＦＤＡ承認済の生化学的検査の１つである。これまでの研究の示唆するところによれば、直腸指診と経直腸的超音波をＰＳＡを用いたスクリーニングと併用することで、腫瘍が前立腺のみに局在しているような早期前立腺癌の発見の可能性が高まる（Brawer et al., 1992, J. Urol. 147:841）。血清ＰＳＡは、治療後の、特に外科的前立腺切除後の患者のモニタリングにも有用である。しかし、総ＰＳＡの測定は、異常に上昇したＰＳＡレベルを示すが、後に前立腺癌に罹患していないことが判明する多数の患者をも、前立腺癌と同定してしまう。最近、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡのパーセント比の測定を行うことによって、ＰＳＡ濃度が４〜１０ｎｇ／ｍｌの範囲内である男性を対象とした前立腺癌のスクリーニングの特異性が上昇することが明らかとなった（Letran et al., 1998, J. Urol. 160:426）。
ＰＳＭ遺伝子は、腺上皮細胞の発現する膜貫通糖タンパク質をコードする遺伝子であり、その発現は正常な前立腺、良性前立腺肥大、そして悪性の前立腺組織の大部分で見られる。低レベルのＰＳＭもまた、いくつかの他の組織において検出される（Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54:1807）。ＰＳＡとＰＳＭはまた、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応）を用いた前立腺癌の分子工学的アプローチの標的となっている。ＰＳＡとＰＳＭを用いた、前立腺癌患者の血液、リンパ節及び骨髄のＲＴ−ＰＣＲ解析によって、このアプローチが高感度であることが明らかになった。しかし、前立腺癌のマーカーとしてのＰＳＭの有用性を確立するには、更なる研究が必要である。
新規な前立腺癌マーカーであるＰＣＡ３が、前立腺癌の発達と関連した遺伝子を見出すためのディファレンシャルディスプレイ法によって数年前に発見された（PCT/CA98/00346 及び PCT/CA00/01154）。ＰＣＡ３は９番染色体に位置し、４つのエクソンからなる。これは、選択的スプライシング及びポリアデニル化によって生じる少なくとも４つの異なる転写産物をコードする。ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、ＰＣＡ３の発現は前立腺に限定され、精巣、卵巣、乳房及び膀胱を含むすべての他の組織には存在しないことが判明した。ノーザンブロット解析の結果は、ＰＣＡ３が試験した前立腺癌の大多数（５０人中４７人）で高度に発現されているが、同じ患者から得た良性の前立腺肥大細胞又は正常前立腺細胞では発現していないか、発現量が非常に低いことを示した。ＰＣＡ３の推定ＯＲＦのコードするタンパク質はまだ発見されていない。さらに、配列解析と in vitro 翻訳実験に基づく研究によっても、ＰＣＡ３のタンパク質産物はまだ発見されておらず、この結果は、ＰＣＡ３は非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）であるという主張を支持している。したがって、ＰＣＡ３はポリペプチドをコードする（そして、ポリペプチドは、たとえば、速やかに分解されるか、プロセシングされる）という可能性は依然としてあるが、ＰＣＡ３はｎｃＲＮＡである可能性が高い。
このように、ＰＣＡ３は前立腺癌に関連する初めての非コードＲＮＡであると考えられる。１つだけ明確に証明されていることは、今までに同定された遺伝子の中でＰＣＡ３は最も前立腺癌特異的な遺伝子であるということである。ＰＣＡ３は、選択的スプライシングを受け、ポリアデニル化され、前立腺癌組織及び前立腺癌転移組織の９５％において、正常な前立腺組織に比較して５０〜５００倍も過剰に発現される（de Kok et al., 2002. PCA3, a very sensitive and specific marker to detect prostate tumors. Cancer Res. 62:2695-2698; 及び Hessels et al., 2003. PCA3-based molecular urine analysis for the diagnosis of prostate cancer. Eur. Urol. 44:8-16）。他の正常な組織や癌組織における発現は検出されていない。
ＰＣＡ３遺伝子は、４つのエクソン（ｅ１〜ｅ４）と３つのイントロン（ｉ１〜ｉ３）とからなる。ＰＣＡ３は今までに同定された前立腺癌マーカーの中で最も優れたものであると考えられるが、その特異性については文献で議論されている。たとえば、Gandini et al. (Cancer Res. 2003; 63(15):4747) は、ＰＣＡ３の前立腺特異的発現はＰＣＡ３遺伝子のエクソン４に限られていると主張している。しかし、本願の出願人は、最近の特許出願において、これは正しくないことを示した（WO05/003387）。正常組織やＢＰＨ組織と比較して、前立腺の癌腫においてＰＣＡ３は少なくとも２０倍は過剰に発現する。ＰＣＡ３の発現は腫瘍のグレードとともに増加する傾向にあり、転移病変でも検出されるが、ＰＣＡ３の発現と腫瘍のグレードとの真の相関関係はまだ証明されていない。
癌研究においては、癌の侵襲性（aggressiveness）は癌細胞の浸潤性（invasiveness）の程度と関連するということが今では認められている。何百件もの論文がこのことを示している。さらに、浸潤と転移に関する分子メカニズムがますます理解されるようになった。しかし、これらの知見は、血液中を循環する癌細胞の検出に限定されているようであった。作業仮説は、浸潤性の癌細胞は血流中に移動するので、循環器中の癌細胞数は癌の浸潤性の程度に比例する、というものである。この考えは、５年以上前に大きな注目を浴びたが、実験による裏づけはまだなされていない。したがって、体液（特に血液）中の癌細胞を測定するという考えは、今でも論議の対象となっている。
一定の条件下において、正常細胞が支配的なバックグラウンドからたった１つの腫瘍細胞の検出さえ可能にする、ＰＣＲ技術などの高感度増幅技術の導入により、血液サンプルを用いた癌診断の精度を向上させることが可能になった。上皮細胞の転写産物は、通常、循環血には存在しないと考えられている。したがって、これらの転写産物が血清中又は血漿中から検出されれば、それは播種性前立腺癌細胞の存在を示している可能性がある。過去１２年の間に、ＰＳＡ ｍＲＮＡを標的とした、ＲＴ−ＰＣＲ解析に基づく播種性前立腺癌細胞の検出に関する報告が数多くなされている。しかし、これらのＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイは定性的なものであり、標準化されておらず、複数の実験室において再現することが困難であったために、検出感度には顕著な相違が見られた（Foster et al., 2004, Oncogene, 23, 5871-5879）。これらのアッセイの感度を高めるために、研究者はネステッドＰＣＲを用いた。残念ながらこの方法は、間違った転写産物の増幅をもたらした（Smith et al., 1995, Prostate-specific antigen messenger RNA is expressed in non-prostate cells: implications for detection of micrometastases [Cancer Res. 55: 2640-2644]）。検出されたこれらの転写産物は、正常な血液細胞や上皮細胞などの、人体のすべての正常な細胞が少量を産生及び分泌するものだった。その結果、ＰＳＡ ｍＲＮＡ転写産物は、女性の血清や健康な対照者からも検出された（Henke et al., 1997, Increased analytical sensitivity of RT-PCR of PSA mRNA decreases diagnostic specificity of detection of prostatic cells in blood [Int. J. Cancer. 70: 52-56]）。このように、上述のＲＴ−ＰＣＲ解析に基づく方法には、限られた有用性しかなかった。この問題は、外因性内部標準を用いる、ＰＳＡ転写産物及びｈｋ２ ｍＲＮＡ転写産物の検出のための新規な高感度且で定量的な、再現性の高いアッセイによって解決された（Ylikoski et al., 2002, Simultaneous quantification of prostate-specific antigen and human glandular kallikrein 2 mRNA in blood samples from patients with prostate cancer and benign disease [Clin. Chem. 48: 1265-127]）。しかし、ＰＳＡ ｍＲＮＡやｈｋ２ ｍＲＮＡなどの、癌特異的ではなく器官特異的な転写産物を用いることによって、別の問題が生じた。実際、前立腺生検の後に、前立腺癌を発症した男性と発症していない男性の血清又は血漿中にＰＳＡ ｍＲＮＡ転写産物が検出され、播種性癌細胞の存在について偽陽性の結果をもたらした（Moreno et al., 1997, Transrectal ultrasound-guided biopsy causes hematogenous dissemination of prostate cells as determined by RT-PCR [Urology 49: 515-520]；及び Polascik et al., 1999, Influence of sextant prostate needle biopsy or surgery on the detection and harvest of intact circulating prostate cancer cells [J. Urol. 162: 749-752]）。したがって、定量的な増幅に基づくアッセイに用いることのできる、高度に過剰発現し、真に前立腺癌特異的な遺伝子を同定する必要が依然として存在する。
癌細胞は導管に（したがって、また、腺液に）見られることを初めて示唆したのは Hessel et al., 2003 (Eur. Urol. 44: 8-16) である。しかし、器官に存在する癌細胞数の相対的な増加が癌細胞の浸潤性と相関するかどうかは、これから明らかにすべき問題である。また、腺液に存在する癌細胞の増加が、腺内（たとえば、前立腺内）に存在する癌細胞の浸潤性の増加と相関するかどうかも明らかにする必要がある。さらに、このような浸潤性が血液、尿又は他の体液に反映されるのかどうかも、これから明らかにすべき問題である。実際、（腺液に由来する）血液中の癌細胞数の増加は癌のグレードと相関するという仮説がずっと以前から提唱されているが、この仮説の臨床的な立証はこれから行うべきことである。
前立腺癌が依然として男性人口のかなりの割合において生命を脅かす病気であるという事実を考慮すると、効率的で迅速な診断、予後判定及び／又はテラノーシス（theranosis）を行う必要がある。ステージの正確な判定のための分子検査法の開発は、色々な利点の中でも、特に適切な治療法の選択を可能にすることによって、生存率を向上させると考えられる。しかし、近年の多くの進展にも拘らず、前立腺癌を発症した個体のステージを判定するための精度は依然として不十分である。前立腺癌のステージの判定のためにＰＳＡやＰＳＭを用いることの欠点の１つは、癌細胞のみならず正常細胞もこれらのマーカーを発現することである。また、分化の不十分な腫瘍は、より侵襲性の弱い腫瘍よりもＰＳＡタンパク質の産生量が有意に少ないため、診断から洩れる可能性がある。前立腺癌全体の約１０％がこれに該当する。
このように、前立腺癌のステージの判定及び予後判定を行うための、よりよい検査法の提供が望まれている。また、前立腺癌の検出、ステージの判定及び治療のための、特異性と信頼性の向上した方法となる前立腺癌検査法の提供も望まれている。
本発明は、このような要求を、他の要求とともに満足させることを目的とする。
本明細書は数々の文献に参照するが、その内容は明細書中の記載によって完全に組み込まれているものとする。
発明の詳細な説明
本発明は、ともに尿サンプルに発現されるＰＣＡ３と第２前立腺特異的マーカーとの比が、前立腺癌の存在、不存在又は素因を確立するのみならず、驚くべきことに、前立腺癌の侵襲性と該癌の帰結とを特異的且つ具体的に決定するという知見に基づくものである。
さらに、ＰＣＡ３と第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＳＡ）との比が腫瘍体積と相関し得ることを、意外にも知見した。前立腺癌腫を有する個々の患者の予後は腫瘍体積と強く相関するので、本発明の分子検査法は予後判定の道具として有効であることを証明し、その前立腺癌の予後判定結果が正確であることを明らかにする。よって、臨床医がより正確な判断を下すことが可能となる。たとえば、決定した比に基づき、前立腺癌の治療をより効率的に行うために、患者に合わせて特定の治療法を適用することが可能となる。本発明の１つの態様において、上記の第２前立腺特異的マーカーはＰＳＡである。
このように、本発明は、サンプル中のＰＣＡ３／ＰＳＡ発現比と、腫瘍体積や前立腺癌の侵襲性との関連を直接に証明する患者対照研究を始めて提供する。より詳細には、本発明は、前立腺癌のステージ判定及び侵襲性のマーカーとなる、尿サンプル中のＰＣＡ３／ＰＳＡ発現比の定量に関する。
したがって、本発明は、対象生物における前立腺癌の診断及び／又は予後判定を行う方法であって、（ａ）サンプルで発現されるＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡの比を決定する工程、及び（ｂ）決定した比を、前立腺癌の侵襲性やその死亡危険度のみならず、前立腺癌の存在又は不存在と相関させる工程、を包含する方法に関する。
本明細書において、「診断」、「診断用」、「診断する」などの用語は、当業界においてよく知られているように、少なくとも１つの巨大分子（ＰＣＡ３、ＰＳＡなど）の検出に基づく、前立腺癌の同定又は前立腺癌を発症する素因の発見を意味する。「予後判定」、「予後判定用」、「予後判定を行う」などの用語は、当業界においてよく知られているように、患者の前立腺癌の将来の帰結（悪性腫瘍、前立腺癌の治癒の見込み、生存率など）を予見又は予想する、あるいは一定の検出結果又は測定値を患者の帰結と相関させる行為を意味する。本発明の１つの態様においては、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比の測定は、腫瘍グレード及び／又は腫瘍体積の診断又は決定である。したがって、この比は、腫瘍グレード及び／又は腫瘍体積に関する臨床的知見に基づいて、前立腺癌の予後判定（たとえば、生存率の決定）を可能にする。本発明の別の態様においては、この比を経時的に決定することによって、患者の帰結（悪性度の増加又は低下、前立腺腫瘍のグレードの上昇又は下降、前立腺癌の治癒の見込み、生存率など）の予見を可能にする。
「正常対照比（normal control ratio）」とは、前立腺癌に罹患していない、正常で健康な個体又は個体群において検出される遺伝子発現から測定した比を意味する。正常な個体とは、前立腺癌の臨床的兆候の見られないものである。ＰＣＡ３／ＰＳＡ比の上昇は、ＰＳＡの検出量に対するＰＣＡ３ ｍＲＮＡの検出量の増加に対応し、悪性度、腫瘍グレード及び腫瘍体積に比例し、生存率に反比例する。対照的に、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比の減少は、ＰＳＡの検出量に対するＰＣＡ３ ｍＲＮＡの検出量の減少に対応し、悪性腫瘍、腫瘍グレード及び腫瘍体積の低下に比例し、生存率の上昇と比例する。
本発明はまた、テラノーシスの方法、即ち、本発明の分子検査法を用いた、前立腺癌の診断、正しい若しくは最も適切な治療方法の選択や適用、及び／又は治療に対する患者の応答のモニタリングのための方法に関する。
このように、本発明はまた、適切な治療方法を選択するために、対象生物由来のサンプルから前立腺癌を検出する方法、より詳細には、前立腺癌のステージを判定するための方法に関する。
本発明の方法は、in vitro、ex vivo 又は in vivo で実施することができる。しかし、最も好ましい方法は、生物学的サンプル、特に尿サンプル、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液又は膀胱洗浄物を用いて実施する方法である。
１つの態様において、本発明は、対象生物における前立腺癌の予後判定を行う方法に関し、該方法は、（ａ）サンプル中に発現されるＰＣＡ３ ｍＲＮＡ／第２前立腺特異的ｍＲＮＡの量比を決定する工程、及び（ｂ）該ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ／第２前立腺特異的ｍＲＮＡ量比を、前立腺癌の存在又は不存在のみならす、前立腺癌の侵襲性又はその死亡危険度と相関させる工程、を包含する方法である。本態様の１つの特定の態様においては、第２前立腺特異的ｍＲＮＡはＰＳＡ ｍＲＮＡであり、尿サンプルは直腸指診（ＤＲＥ）の後に得られたものである。
１つの特定の態様において、本発明は、患者の生物学的サンプルから前立腺癌の予後判定を行う方法に関し、該方法は、（ａ）生物学的サンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及びＰＳＡの量を評価する工程、（ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を決定する工程、及び（ｃ）該量比を、少なくとも１つの予め定めたカットオフ値と比較する工程を包含し、該予め定めたカットオフ値を超える量比を、該予め定めたカットオフ値よりも量比が低い場合と比べて前立腺癌によって死亡する危険度が高いことの指標とすることを特徴とする方法である。
別の１つの態様において、本発明は、生物学的サンプルから前立腺癌の予後判定を行う方法に関し、該方法は、（ａ）生物学的サンプルを、前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、（ｂ）該生物学的サンプルを、ＰＳＡ ｍＲＮＡにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、（ｃ）該生物学的サンプル中のＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及びＰＳＡ ｍＲＮＡの量を測定する工程、（ｄ）ＰＳＡ ｍＲＮＡ量に対するＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を決定する工程、及び（ｅ）ＰＳＡ ｍＲＮＡ量に対するＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を、少なくとも１つの予め定めたカットオフ値と比較する工程を包含し、該予め定めたカットオフ値を超える量比を、侵襲性の高い癌の存在の指標とし、該予め定めたカットオフ値よりも低い量比を、侵襲性のより低い癌の存在の指標とすることを特徴とする方法である。
さらに別の１つの態様において、本発明は、生物学的サンプル中の前立腺癌の腫瘍体積を評価する方法に関し、該方法は、（ａ）サンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸の量及びＰＳＡの量を評価する工程、（ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸の量比を決定する工程、及び（ｃ）該量比を、少なくとも１つの予め定めたカットオフ値と比較する工程を包含し、該予め定めたカットオフ値を超える量比を、該予め定めたカットオフ値より量比が低い場合と比べて前立腺癌の腫瘍体積が大きいことの指標とすることを特徴とする方法である。
さらに別の１つの態様において、本発明は、患者の生物学的サンプルから前立腺癌の腫瘍成長をモニターする方法に関し、該方法は、（ａ）第１の時点に得た生物学的サンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸の量及びＰＳＡの量を評価する工程、（ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸の量比を決定する工程、（ｃ）後期の時点に該患者から得た生物学的サンプルを用いて、工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返す工程、及び（ｄ）工程（ｂ）で得た量比を工程（ｃ）で得た量比と比較する工程を包含し、工程（ｂ）で得た量比が工程（ｃ）で得た量比より大きい場合を、前立腺癌の進行及び腫瘍体積増加の指標とすることを特徴とする方法である。
さらに別の１つの態様において、本発明は、生物学的サンプルから前立腺癌の進行をモニターする方法に関し、該方法は、（ａ）生物学的サンプルを、前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、（ｂ）該生物学的サンプルを、ＰＳＡ核酸にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、（ｃ）該生物学的サンプル中のＰＣＡ３核酸の量及びＰＳＡ核酸の量を測定する工程、（ｄ）ＰＳＡ核酸量に対するＰＣＡ３核酸の量比を決定する工程、（ｅ）後期の時点に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程、及び（ｆ）工程（ｄ）で得た量比を工程（ｅ）で得た量比と比較する工程を包含し、工程（ｅ）で得た量比が工程（ｄ）で得た量比よりも大きい場合を、前立腺癌の進行を示す指標とすることを特徴とする方法である。
さらに別の１つの態様において、本発明は、下記のものを収容する少なくとも１つの容器を含む、前立腺癌の診断及び予後判定を行うためのキットに関する。（ａ）下記の核酸配列（ｉ）〜（ｉｖ）からなる群より選ばれる前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチド：（ｉ）配列番号１の核酸配列、（ｉｉ）配列番号２の核酸配列、（ｉｉｉ）上記核酸配列（ｉ）又は（ｉｉ）に完全に相補的な核酸配列、及び（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で上記核酸配列（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）にハイブリダイズする核酸配列；（ｂ）下記の核酸配列（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群より選ばれるＰＳＡ核酸にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチド：（ｉ）配列番号３８の核酸配列、（ｉｉ）上記核酸配列（ｉ）に完全に相補的な核酸配列、及び（ｉｉｉ）ストリンジェントな条件下で上記核酸配列（ｉ）又は（ｉｉ）にハイブリダイズする核酸配列；及び（ｃ）ＰＳＡ核酸レベルに対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸レベルの特定の比の検出に基づいて前立腺癌の診断及び予後判定を行うための説明書。
また、１つの態様において、本発明は、治療後の前立腺癌の進行の危険度を判定するための方法に関し、該方法は、（ａ）治療前のサンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸の量及びＰＳＡの量を評価する工程、（ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸の量比を決定する工程、（ｃ）治療後の該患者の生物学的サンプルを用いて工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返す工程、及び（ｄ）治療後に得た量比を、治療前に得た量比と比較する工程、を包含し、治療後の量比が治療前の量比より大きい場合を、前立腺癌の進行の指標とすることを特徴とする方法である。
また、１つの態様において、本発明は、患者から得た生物学的サンプル中の前立腺癌のステージを判定するための方法に関し、該方法は、（ａ）生物学的サンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸の量及びＰＳＡの量を評価する工程、（ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸の量比を決定する工程、（ｃ）該量比を、少なくとも１つの予め定めたカットオフ値と比較する工程、及び（ｄ）量比を前立腺癌の特定のステージと相関させる工程を包含し、該予め定めたカットオフ値を超える量比を、該予め定めたカットオフ値よりも量比が低い場合と比べて前立腺癌のステージが進行していることの指標とし、この指標に基づいて前立腺癌のステージを判定することを特徴とする方法である。
さらに別の１つの態様において、本発明は、ヒト患者における前立腺癌の予後判定を行う方法に関し、該方法は、（ａ）患者から得た生物学的サンプル又はその抽出物について、前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸配列に特異的な第１のプライマーペアと、ＰＳＡ核酸配列に特異的な第２のプライマーペアとを用いて in vitro 核酸増幅アッセイを行う工程、（ｂ）ＰＣＡ３核酸配列とＰＳＡ核酸配列を定量する工程、及び（ｃ）ＰＳＡに対するＰＣＡ３の正規化された量比を計算する工程であって、該量比は、該患者におけるＰＣＡ３ ｍＲＮＡレベル及びＰＳＡ ｍＲＮＡレベルと相関させることができるものである工程を包含し、ＰＳＡに対するＰＣＡ３の該正規化された量比は、前立腺癌のグレード又はステージと相関性を有することを特徴とする方法である。
さらに別の１つの態様において、本発明は、患者における前立腺癌の予後判定を行うためのキットに関し、該キットは、（ａ）患者から得たサンプル中に存在する前立腺癌に関連するＰＣＡ３核酸を増幅するための、特異的な第１のプライマーペア、（ｂ）ＰＳＡ核酸を増幅するための、特異的な第２のプライマーペア、（ｃ）ＰＣＡ３と第２前立腺特異的核酸配列の両方が存在する時に、ＰＣＡ３核酸及びＰＳＡ核酸の増幅産物の定量的検出を可能にする試薬、及び（ｄ）ＰＳＡ核酸レベルに対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３核酸レベルの特定の比の検出に基づいて、前立腺癌の診断及び予後判定を行うための説明書を含むものである。
本発明の更なる態様においては、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比の測定をさらに必要とする患者を事前に選び出すために、ＰＳＡタンパク質の血清レベルを評価する。１つの特定の態様においては、さらに行うＰＣＡ３／ＰＳＡ比の測定のために、血清ＰＳＡタンパク質濃度の３ｎｇ／ｍｌというカットオフ値を用いる。当然のことながら、検査に必要な条件（標的の感度及び特異性）に応じて、他の値を血清ＰＳＡタンパク質濃度のカットオフ値として用いてもよい。また、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比による検査を必要とする患者を事前に選び出すために、血清ＰＳＡ濃度の代わりに、血清ＰＳＡ ｍＲＮＡレベルを評価してもよい。
関連した態様においては、サンプルで発現されるＰＣＡ３ ｍＲＮＡ／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比は、ＰＣＡ３遺伝子とＰＳＡ遺伝子のそれぞれがコードするＲＮＡを、増幅法を用いて検出することによって決定する。更なる態様においては、ＲＮＡ増幅法を、特異的な蛍光プローブを用いて増幅産物をリアルタイムで検出する方法と組み合わせて用いる。更なる別の態様においては、増幅法はＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法である。更なる態様においては、ＲＴ−ＰＣＲ法はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法又は増幅産物の検出をリアルタイムで行うことが可能な関連した方法である。
関連する態様においては、ＰＣＡ３遺伝子とＰＳＡ遺伝子のそれぞれがコードするＲＮＡは、核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）と呼ばれる in vitro ＲＮＡ増幅法によって抽出した核酸から検出する。もちろん、他のＲＮＡ増幅法も知られており、本発明の方法とキットはＮＡＳＢＡ法に限定されるものではない。本発明を限定することのないＲＮＡ増幅法の具体例としては、転写媒介性増幅法（ＴＭＡ法）、ローリングサークル型増幅法、ストランド置換増幅法（ＳＤＡ法）及びリガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）が挙げられる。
更なる態様においては、蛍光プローブを用いて均質相で増幅産物を検出する。１つの態様においては、ビーコン手法を用いる。他の態様においては、蛍光検出法又は比色検出法を用いて増幅産物を固相上で検出する。従って、ＲＮＡの検出及び／又は定量には、種々の蛍光検出法、比色検出法又は酵素検出法を本発明に従って使用できることを理解されたい。他の種類の標識プローブや標識プライマー、又は他の種類の検出方法も本発明で使用することができる（たとえば、ノーザンブロット法、ドットブロット法やスロットブロット法などのハイブリダイゼーション解析方法と、放射性標識したプローブやプライマーとを使用することができる）。
ＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡとＰＳＡ遺伝子のコードするＲＮＡの発現のレベル及びそれらの比を決定するために行うＲＮＡの増幅及び／又は検出は、２種のＲＮＡについて同時に行ってもよいし、個別に行ってもよい。生物学的サンプルは、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液及び膀胱洗浄物からなる群より選ぶことができる。直腸指診（ＤＲＥ）の後に得た尿サンプルは特に有用である。増幅方法及び／又は検出方法が標的マーカー（ＰＣＡ３と第２マーカー）を検出するのに十分な感度を有する時には、当然のことながら、本発明の方法及びキットは、ＤＲＥを行わずに得た尿サンプルや、精子や、精子と尿の混合物（たとえば、射精に続く最初の尿のサンプル）などの他の種類のサンプルに対しても使用可能であることを理解されたい。本発明の方法及びキットがこのようなサンプルでも実施可能であることは、実験によって示されている。
１つの態様においては、ＰＣＡ３遺伝子とＰＳＡ遺伝子のそれぞれがコードするＲＮＡは、患者の排泄した尿から得た尿サンプルに含まれる細胞から増幅する。
１つの態様においては、尿サンプルから回収した細胞を集め、総核酸抽出を実施する。１つの特定の態様においては、BOOM et al., 1990, J. Clin. Microbiol. 28: 495-503 の発表した、シリカビーズ上で行う固相バンド法（solid phase band method）を用いて総核酸抽出を行う。他の態様においては、別のターゲットキャプチャー法（下記参照）で核酸を精製する。当然のことながら、種々の核酸抽出法及び核酸精製法が存在するので、本発明に従って他の方法を用いることができる点を理解されたい。本発明を限定することのない具体例としては、フェノール／クロロホルム抽出法及びターゲットキャプチャー精製法（下記参照）が挙げられる。他の方法も本明細書で参照する教科書に記載されている。尿サンプル又は他のサンプルに含まれる前立腺細胞を安定化又は保護するための数々の方法に加えて、前立腺細胞内に存在するＲＮＡを安定化又は保護するための方法が当業界では知られている点も理解されたい。
他の態様においては、本発明の方法を、粗製、未精製又は部分精製のサンプルを用いて行う。
ｍＲＮＡの検出に基づいてＰＣＡ３／第２前立腺特異的マーカー比を決定することが好ましいが、これに限定されるわけではない。たとえば、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡと第２前立腺特異的マーカーとなるタンパク質又はポリペプチドとの比も、本発明において用いることができる。検出するマクロ分子のレベルが該分子の由来する遺伝子の転写活性と相関している限り、正確に検出される分子種（ｍＲＮＡ、ポリペプチドなど）の種類は、特定の要件を満たすように変更することができる。
１つの特定の態様においては、本発明は、サンプル中のＰＣＡ３核酸及びＰＳＡ核酸の存在及びそれらの量を検出するための、前立腺癌のテラノーシス、診断及び予後判定に用いるキットに関する。このようなキットは、通常、ＰＣＡ３核酸及び／又はＰＳＡ核酸（たとえば、ＰＣＡ３ ＲＮＡ、ＰＳＡ ＲＮＡ）にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブ及び／又はオリゴヌクレオチドプライマーを収容する第１容器、及び上記ＰＣＡ３特異的配列又はＰＳＡ特異的配列にハイブリダイズする少なくとも１種の他のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又はオリゴヌクレオチドプローブを収容する第２容器を包含する。他の態様においては、ＰＣＡ３やＰＳＡの増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブを収容する第３容器を更に包含する。好ましい態様においては、キットは更に補助成分を収容する他の容器を包含し、補助成分は、更なるオリゴヌクレオチドやプライマー、及び／又は下記群から選ばれる少なくとも１種である：緩衝剤、アッセイに使用する試薬（たとえば、洗浄試薬、ポリメラーゼ、内部対照（ＩＣ）など）、及び結合した核酸プローブ／核酸プライマーの存在を検出することを可能にする試薬。もちろん、本発明のキットを数々の態様で提供することが可能である。たとえば、増幅試薬と検出試薬の容器を分けることができる。このような態様の１つにおいては、本発明の標的核酸（たとえば、ＰＣＡ３、ＰＳＡ及び／又は内部対照核酸）に特異的な増幅用又はハイブリダイゼーション用の試薬が第１の容器に入っており、検出用の試薬が第２容器に入っている。また、検出用試薬と増幅用試薬が同じ容器に入っていてもよい。もちろん、試薬を同一の又は異なる容器に分けて入れるかまとめて入れるかは、抽出法、増幅法又はハイブリダイゼーション法の種類、使用する検出方法に加えて、試薬の安定性、保存料の必要性などの他のパラメーターによって決まる。さらに、キットは、本発明の診断方法、テラノーシスの方法及び／又は予後判定法を実施するための説明書を含んでいてもよい。そのような説明書は、実験のプロトコルに加えて、使用することのできるＰＣＡ３／第２前立腺特異的マーカー比のカットオフ値に関する詳細な情報に関するものでもよい。
関連する態様においては、本発明は、サンプル中のＰＣＡ３ ｍＲＮＡ及び第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＳＡ）のｍＲＮＡを特異的検出のための核酸プローブ及び核酸プライマーを使用する。さらに、１つ又は複数のＰＣＡ３／ＰＳＡ核酸に結合する核酸のアレイも提供する。
１つの特定の態様においては、本発明は、ＤＲＥ後の尿沈渣を用いたＰＣＡ３／ＰＳＡ比の決定に基づく、患者の前立腺癌の予後判定を行うためのキット及び方法に関し、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比は、ＤＲＥ後の尿中の癌細胞のパーセント比の増加に基づく、テラノーシス及び診断用のマーカーとして機能する。
本発明の１つの態様においては、ＰＣＡ３の検出は、１つのプライマーによるＰＣＡ３ エクソン１のターゲティングに基づく。このような特定の態様の１つにおいては、イントロン１の両側のプライマーを用いて、ＰＣＡ３のエクソン１とエクソン２の配列の一部を増幅する（イントロン１は約２０ｋｂのイントロンである）。本発明のＰＣＡ３配列（もちろん、エクソン１に限定されるわけではない）から数々のプライマーペアを設計することが可能である。
このように、本発明は、ＰＣＡ３の発現と第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＳＡ）の発現との比が、前立腺癌の診断のみならず、予後判定やテラノーシスにも有用であることを始めて実証する。もちろん、本発明における予後判定用の比は、所望により、前立腺癌や他の腫瘍性疾患のマーカー、たとえば尿プラスミノーゲン活性化因子、尿プラスミノーゲン活性化因子受容体、プラスミノーゲンインヒビター１、ｐ５３、Ｅ−カドヘリン、ＰＳＭ、ＶＥＧＦと組み合わせて用いてもよい。
さらに、本発明者らの知る限り、本発明以前には、腺液（たとえば、乳液、前立腺液）について、分泌物中の癌細胞数が癌の浸潤性と相関するという教示はなかった。さらに、第２前立腺特異的ｍＲＮＡ（たとえば、ＰＳＡ）に対するＰＣＡ３ ｍＲＮＡの比は癌の腫瘍体積及び侵襲性とともに増加するということ、したがってこの比は、テラノーシス、診断又はステージ判定用のマーカーとして用いることができるということについて、従来技術文献には何ら教示も示唆もなかった。本発明以前には、侵襲性の癌細胞が血流や尿に移動するかどうかを予見することはできなかった。本発明で開示した量比のテラノーシス及び予後判定における価値は、今までには知られていないが、本願によって明らかとなった以下の種々の現象に基づくものである：（１）侵襲性の前立腺癌細胞はより浸潤性である；（２）より浸潤性の細胞は、前立腺房に浸潤する能力が高い；（３）よって、尿沈渣中の癌細胞の画分が増加する；（４）したがって、ＰＣＡ３／第２マーカー（たとえば、ＰＳＡ）ｍＲＮＡ比が増加する；（５）腫瘍体積もまた、ＰＣＡ３／第２マーカーｍＲＮＡ比と相関する；そして（６）グレード共にＰＣＡ３は中庸に増加し、ＰＳＡ ｍＲＮＡの中庸な減少がこの効果を高め得る。
こうして、本発明の教示に従って、一旦、ＰＣＡ３／第２マーカー（たとえば、ＰＳＡ）比を評価すれば、以下のことが可能となる：（１）前立腺癌の存在、不存在又は発症素因の判定、（２）前立腺癌が検知された場合には、前立腺癌のステージ、腫瘍体積、腫瘍グレード及び侵襲性の判定、（３）前立腺癌の帰結の予見（予後判定）、及び（４）患者にとって最も適切な治療法の決定。
さらに、本発明の特に大きな利点の１つは、本発明で開示した量比をテラノーシス、診断又は予後判定の道具として用いることである。ＰＣＡ３／第２マーカー（たとえば、ＰＳＡ）比の実際の値は、（一定のステージ／グレード／腫瘍体積において、）使用する第２マーカーに依存して変化するものの、（一旦、特定のＰＣＡ３マーカー／第２マーカーペアを決めてしまえば）増幅／検出方法による相違はほんの僅かしかない。したがって、ＰＣＡ３マーカーと第２マーカーのレベルの決定に用いる方法が感度と特異性とにおいて同等のものである限り、与えられたサンプルにおける量比の値は、概ね同じとなる（即ち、選択した方法の違いを考慮すると、統計的には類似していると考えられる）。したがって、一旦マーカーペアを決めてしまえば、様々な検出方法を、それらが同等の特異性と感度とを有する限り、取り替えて用いることができる。
特に定義のない限り、本明細書で使用する科学用語と技術用語及び命名は、本発明の技術分野に属する当業者によって一般に理解されるものと同一である。分子生物学用語の一般に理解されている定義は、たとえば、以下の教科書に記載されている：Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed.（Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons, New York, NY）；The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial, New York, NY）；Rieger et al., Glossary of genetics: Classical and molecular, 5th edition, Springer-Verlag, New-York, 1991；Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 4th edition, Garland science, New-York, 2002；及び Lewin, Genes VII, Oxford University Press, New-York, 2000。概して、分子生物学的方法の手順などは、当業界で一般に用いられているものである。このような標準的な技術は参照したマニュアル、たとえば、Sambrook et al. （2000, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratories）；及び Ausubel et al.（1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New-York）に記載がある。
本発明の上記以外の目的及び利点は、以下の記載から明らかになるであろう。
用語の定義
本明細書の記載においては、種々の用語を広範にわたって使用する。本明細書と請求の範囲、並びにこのような用語によって含まれる範囲の理解を明瞭且つ一貫したものとするために、以下の定義を提供する。
本明細書においては、ヌクレオチド配列は一本鎖で、５’から３'の方向を左から右に示し、当業界で一般的に使用されており、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）の推奨する記載方法に従って１文字ヌクレオチド記号を用いて示した。
請求の範囲及び／又は明細書において「包含する」や「含む」（comprising）という用語に関連する名詞が単数形（冠詞がａまたはａｎ）で書かれている場合、その数は「１つ」であることを意味することもあるが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたは複数」といった数を意味することもある。
本願を通じて、「約」という用語は、ある数値を決定するために使用した装置や方法の標準誤差を含む値を表すために用いた。慣例的には、１０〜１５％、好ましくは１０％の誤差までが「約」という用語の範囲内である。
「ＤＮＡ」又は「ＲＮＡ」の分子又は配列という用語は（時には「オリゴヌクレオチド」という用語も）、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及び／又はシトシン（Ｃ）を塩基として有するデオキシリボヌクレオチドを概して含む分子である。「ＲＮＡ」では、Ｔがウラシル（Ｕ）で置換されている。
本明細書では、数々の日常的に使用されている組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技術用語に参照する。しかしながら、このようなｒＤＮＡ用語の定義を明瞭にし、一貫性を持たせるために、以下に選んだ用語の定義を説明する。
本明細書で使用するように、「核酸分子」や「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのポリマーを示す。例としては、ＤＮＡ（たとえば、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（たとえば、ｍＲＮＡ）およびそれらのキメラが挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸分子はクローニング技術や合成によって得ることができる。ＤＮＡは二本鎖でも一本鎖（コード鎖又は非コード鎖［アンチセンス鎖］）でもよい。従来のリボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）も「核酸」という用語に含まれ、ポリヌクレオチドやその類似体も同様である。核酸主鎖は、当業界では公知の種々の結合を含んでいてもよく、このような結合としては、１つ又は複数の糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）とも称する；Hydig-Hielsen et al., WO 95/32305）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合及びこれの組合せが挙げられる。核酸の糖構造は、リボース又はデオキシリボース、あるいは既知の置換を有する類似化合物、たとえば、２’メトキシ置換体（２’−Ｏ−メチルリボフラノシル構造を含有するもの、WO 98/02582を参照）及び／又は２’ハロゲン化合物置換体などである。窒素塩基は、通常の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その公知の類似体（たとえば、イノシンなど；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36、Adams et al. ed., 11th ed., 1992を参照）、プリン塩基又はピリミジン塩基の公知の誘導体（Cook, WO 93/13121 を参照）、あるいは主鎖に含まれる１つ又は複数の塩基が窒素塩基を含んでいない“脱塩基”残基（Arnold et al. U.S. Pat. No. 5,585,481）などである。核酸は、ＲＮＡやＤＮＡに見られるような通常の糖、塩基および結合のみを有するものでもよいし、通常の成分と置換体の両方を有するもの（たとえば、メトキシ主鎖を介して結合した通常の塩基や、通常の塩基と共に塩基の類似体を１つまたは複数個有する核酸）でもよい。
単離された核酸分子． 「単離された核酸分子」とは、一般に理解され、また、本発明で用いられているように、ヌクレオチドの重合体を意味する。ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。「単離された」核酸分子は、自然界における in vivo の状態から精製されるか、クローニング又は化学合成によって得られるものである。
「ＰＣＡ３核酸」及び「ＰＳＡ核酸」、又は「ＰＣＡ３ポリヌクレオチド」及び「ＰＳＡポリヌクレオチド」という用語は、本来のＰＣＡ３核酸配列又はＰＳＡ核酸配列を意味する。１つの態様においては、ＰＣＡ３核酸は配列番号１及び２の塩基配列を有する。関連する態様においては、ＰＳＡ核酸は配列番号３８の塩基配列を有する。他の態様においては、ＰＳＡ核酸はＰＳＡタンパク質をコードする。１つの態様において、推定ＯＲＦを含むＰＣＡ３核酸配列はＰＣＡ３ポリペプチドをコードする。更なる態様においては、ＰＣＡ３核酸とＰＳＡ核酸は非コード核酸配列である。更に別の態様においては、本発明の範囲に含まれるＰＣＡ３配列とＰＳＡ配列の標的となるＰＣＡ３配列とＰＳＡ配列は、患者サンプルに存在する天然のＰＣＡ３配列とＰＳＡ配列である。
本明細書で用いる「増幅用ペア」又は「プライマーペア」という用語は、本発明におけるオリゴヌクレオチド（オリゴ体）のペアを意味し、選択した核酸配列を種々の増幅方法の１つによって増幅する際に２つ一緒に使用することを目的として選択したものである。ＰＳＡを増幅するためのプライマーペアの例として、配列番号３６と３７の塩基配列が挙げられるが、これに限定されない。
「増幅法」は、標的核酸配列、その相補鎖又は断片のコピー（「アンプリコン」）を複数得るための、公知の in vitro 方法の全てに該当する。In vitro 増幅法は、増幅核酸を製造する方法を意味するが、増幅核酸は完全な標的領域よりも小さい部分やその相補鎖を含有するものでもよい。公知の in vitro 増幅法には、転写媒介性増幅法、レプリカーゼ媒介性増幅法、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅法及びストランド置換増幅法（ＳＤＡ法；マルチストランド置換増幅法（multiple strand-displacement amplification method；ＭＳＤＡ法）を含む）が挙げられる。レプリカーゼ媒介性増幅法は自己複製性ＲＮＡ分子とＱβ−レプリカーゼなどのレプリカーゼとを使用する（たとえば、Kramer et al., U.S. Pat. No. 4,786,600）。ＰＣＲ増幅法は広く知られており、ＤＮＡ又はｃＤＮＡの相補的な二本鎖のコピーを複数合成するために、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及びサーマルサイクリング反応を使用する（たとえば、Mullis et al., U.S. Pat. No. 4,683,195, No. 4,683,202 及び No. 4,800,159）。ＬＣＲ増幅法は、少なくとも４種の異なるオリゴヌクレオチドを用い、ハイブリダイゼーション、ライゲーション及び変性からなるサイクルを複数回行うことによって、標的とその相補鎖を増幅する（たとえば、EP Pat. App. Pub. No. 0 320 308）。ＳＤＡ法は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を有するプライマーを用いることで、部分修飾したＤＮＡ二本鎖の、標的配列を含む一本鎖に制限エンドヌクレアーゼでニックを導入し、続いてプライマー伸長工程とストランド置換工程からなる一連の増幅反応を行う方法である（たとえば、Walker et al., U.S. Pat. No. 5,422,252）。他の２つのストランド置換増幅法は、エンドヌクレアーゼによるニックの導入を必要としない（Dattagupta et al., U.S. Pat. No. 6,087,133 及び No. 6,124,120（ＭＳＤＡ法））。当業者は、本発明におけるオリゴヌクレオチドプライマー配列が、ポリメラーゼによるプライマー伸長反応に基づくいかなる in vitro 増幅法にも直ちに用いることができることを理解する（一般的記載については Kwoh et al., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25 を参照し、更に Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177；Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6:1197-1202；Malek et al., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260；及び Sambrook et al., 2000, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Third Edition, CSH Laboratories を参照）。当業界で一般的に知られているように、オリゴ体は選択した条件下で相補的配列に結合するように設計する。
アガロースゲル電気泳動． 二本鎖ＤＮＡを分画するために最も一般的に用いられている技術が、（これが唯一の技術というわけではないが）アガロースゲル電気泳動である。この方法の原理は、ゲルが最も大きい分子の移動を最大限に遅らせ、最も小さい分子の移動を最小限に遅らせる篩であるかのように、ＤＮＡ分子はゲルの中を移動するというものである。つまり、ＤＮＡ断片が小さいほど、電気泳動中のアガロースゲルにおける移動度が大きくなることに注目されたい。
アガロースゲル電気泳動によって分画されたＤＮＡ断片は、そのパターンに含まれる断片の数が少なければ、染色操作によって直接視覚化することができる。これらの断片の小さな部分集団を視覚化するために、ハイブリダイゼーション法（たとえば、サザンハイブリダイゼーション法）と呼ばれる方法が適用できる。
「核酸のハイブリダイゼーション」は、一般的に、相補的な塩基配列を有する２本の一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションを意味し、適切な条件下においては熱力学的に好ましい二本鎖構造が形成される。ハイブリダイゼーション条件の例としては、上述した２冊の実験マニュアル（上述の Sambrook et al., 2000；及び上述の Ausubel et al., 1994）、さらに Higgins and Hames (Eds.), Nucleic acid hybridization, a practical approach, IRL Press Oxford, Washington DC，(1985) に記載されており、当業界で一般に知られている。ニトロセルロースフィルター（又はナイロンなどの他の支持体）に対するハイブリダイゼーション、たとえば、よく知られているサザンブロット法では、ニトロセルロースフィルターは標識プローブと共に、高濃度の塩類（６×ＳＳＣ又は５×ＳＳＰＥ）、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性キャリアＤＮＡ（たとえば、サケ精子ＤＮＡ）を含む溶液中で、所望のストリンジェンシーとなる温度（高いストリンジェンシーの条件は６０〜６５℃、中庸なストリンジェンシーの条件は５０〜６０℃、低いストリンジェンシーの条件は４０〜４５℃）で一晩インキュベートすることができる。この後、非特異的結合プローブを洗い流すためにフィルターを０.２×ＳＳＣ／０.１％ ＳＤＳで数回洗浄するが、洗浄温度は所望のストリンジェンシーに基づいて選択することができる：室温（ストリンジェンシーの低い条件）、４２℃（ストリンジェンシーが中庸な条件）又は６５℃（ストリンジェンシーの高い条件）。洗浄溶液の塩濃度及びＳＤＳ濃度も、所望のストリンジェンシーに適応するために調整することができる。選択した温度と塩濃度は、ＤＮＡハイブリッドの融点（Ｔｍ）に基づくものである。当然のことながら、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、検出することもできる。このような場合に当業者は、よく知られた方法に従ってハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を適応させることができる。ストリンジェントな条件が好ましく用いられる（上述の Sambrook et al., 2000）。当業界でよく知られているように、異なるアニーリング溶液や洗浄溶液を用いる他のプロトコルや市販のハイブリダイゼーション用キット（たとえば、BD Biosciences Clonetech 社製の ExpressHybTM）も用いることができる。よく知られているように、プローブの長さと決定すべき核酸の組成は、ハイブリダイゼーション条件のさらなるパラメーターである。ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンド値を抑えるために用いるブロッキング試薬の添加及び／又は他の試薬との置換によって、上記条件の変法が得られる点に注目すべきである。典型的なブロッキング試薬の例として、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、及び市販の特許試薬が挙げられる。特異的ブロッキング試薬を添加する場合は、互換性の問題を解決するために、上記のハイブリダイゼーション条件の修飾が必要になる可能性がある。ハイブリダイズする核酸分子には、上記の分子の断片も含まれる。さらに、上記の核酸分子のいずれともハイブリダイズする核酸分子には、これらの分子の相補的な断片、誘導体及びアレル変異体も含まれる。なお、ハイブリダイゼーション複合体とは、相補性のＧ塩基とＣ塩基との間及び相補性のＡ塩基とＴ塩基との間に水素結合を形成してえられる、２本の核酸配列の複合体であり、水素結合は、塩基のスタッキング相互作用によってさらに安定化されていてもよい。２本の相補的な核酸配列は、逆平行の配置で水素結合を形成する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中（たとえば、コット解析（Cot analysis）、ロット解析（Rot analysis））で形成してもよいし、溶液中に存在する１つの核酸配列と固体の支持体（たとえば、膜、フィルター、チップ、ピン、細胞を固定したガラス板）の上に固定したもう１つの核酸配列との間に形成してもよい。
「相補的」及び「相補性」という用語は、塩濃度及び温度が許容される条件下における、塩基対形成によるポリヌクレオチドの自然結合に関する。たとえば、配列“Ａ−Ｇ−Ｔ”はその相補的配列“Ｔ−Ｃ−Ａ”に結合する。２本の一本鎖分子間の相補性は、「部分的」、即ち、一部の核酸のみが結合するだけでもよいし、２本の一本鎖分子間に完全な相補性が存在するときには、完全であってもよい。核酸鎖の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強度とに顕著な影響を与える。これは、核酸鎖の結合に依存する増幅反応において特に重要である。
本発明において、「ハイブリダイズする」という用語は、上述したようなストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションと非ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションとの両方を意味する。条件の設定は当業者の技術の範囲内であるし、公知のプロトコルに基づいて決定してもよい。「ハイブリダイズする配列」という用語は、配列の同一性が少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％の配列に対して用いることが好ましい。さらに、「ハイブリダイズする配列」という用語は、ＰＳＡタンパク質のアミノ酸配列に対する同一性が少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％のＰＳＡタンパク質をコードする配列に対して用いることが好ましい。
本発明において、２つ以上の核酸配列又はアミノ酸配列に対して用いる「同一」及び「同一性（％）」という用語は、２つ以上の配列を比較しアラインした際に、これら配列又はそのサブ配列が同じであるか、共通するアミノ酸残基又はヌクレオチドの量が特定パーセント（たとえば、６０％又は６５％の同一性、好ましくは７０〜９５％の同一性、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性）となることを意味し、配列の比較とアライメントは、最大の応答が得られる比較用枠内で行うか、公知の配列比較用アルゴリズムを用いて指定した領域に対して行うか、又は手作業によるアライメントと目視による判定を行う。たとえば６０〜９５％又はそれを超える配列の同一性を示す２つの配列は、実質的に同一であると考える。このような定義は、試験配列の相補鎖にも当てはまる。少なくとも約１５〜２５アミノ酸又はヌクレオチド長の領域が上述した同一性を示すことが好ましく、少なくとも約５０〜１００アミノ酸又はヌクレオチド長の領域が上述した同一性を示すことがさらに好ましい。当業者は、たとえば、当業界において知られている、ＣＬＵＳＴＡＬＷコンピュータープログラム（Thompson, Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680）やＦＡＳＴＤＢ（Brutlag, Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245）に基づくアルゴリズムを用いて配列間の同一性（％）を決定する方法を知っている。ＦＡＳＴＤＢに基づくアルゴリズムは、同一性の計算の際に配列内部の一致しない欠失や付加（即ち、ギャップ）を考慮しないが、これは、同一性（％）の過大評価を防ぐために、手作業で修正することができる。一方、ＣＬＵＳＴＡＬＷに基づくアルゴリズムは、同一性の計算の際に、配列内のギャップを考慮する。当業者が利用できるものとしては、さらに、ＢＬＡＳＴやＢＬＡＳＴ ２.０アルゴリズム（Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402）を挙げることができる。核酸配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムの初期設定では、ワード長さ（Ｗ）は１１、出現期待数（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４であり、両方の鎖を比較する。アミノ酸配列のためのプログラムであるＢＬＡＳＴＰの初期設定では、ワードの長さ（Ｗ）は３、出願期待数（Ｅ）は１０である。ＢＬＯＳＵＭ６２ スコアリングマトリックス（Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89 (1989), 10915）では、アライメント（Ｂ）は５０、出現期待数（Ｅ）は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４であり、両方の鎖を比較する。本発明はさらに、上記のハイブリダイズする分子の縮重によって得られる配列を有する核酸分子に関する。本発明において、「遺伝暗号による縮重」とは、遺伝暗号の重複によって、異なるヌクレオチド配列が同じアミノ酸をコードすることを意味する。本発明はまた、１つ又は複数の変異又は欠失を有する核酸分子、及び本明細書に記載した、１つ又は複数の変異又は欠失を有する核酸分子のいずれかにハイブリダイズする核酸分子に関する。
「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸やその相補鎖中に存在する標的配列に特異的にハイブリダイズする核酸オリゴマーを包含し、標識配列又はその増幅核酸の検出を可能にするものである。検出は、直接的（即ち、プローブが標的配列又は増幅配列に直接結合した結果）でも、間接的（即ち、プローブを標的配列又は増幅配列に繋ぐ中間分子構造にプローブが結合した結果）でもよい。プローブの「標的」は、概して増幅核酸配列（即ち、増幅した配列からなる部分集合）の中の配列であって、少なくともプローブ配列の一部に標準的な水素結合又は「塩基対形成」によってハイブリダイズするものである。「十分に相補的」な配列は、プローブ配列の標的配列への安定なハイブリダイゼーションを、２つの配列が完全に相補的でなくとも可能にする。プローブは標識されていても、標識されていなくともよい。プローブは、特定のＤＮＡ配列の分子クローニングによって製造することができるし、化学合成することもできる。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する人であれば、本発明に関連して設計し、使用することができる多数のプライマー及びプローブを容易に決定することができる。プライマー及びプローブを表２〜４に例示したが、これらに限定されるものではない。当業者であれば、本明細書の教示と技術常識とに基づいて、これら以外の多数のプライマー及びプローブを設計することができる。
「十分に相補的な」配列とは、一連の相補的な塩基の間の水素結合によって、他の配列にハイブリダイズ可能な連続した核酸塩基配列である。相補的な塩基配列は、標準的な塩基対形成（たとえば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕの対形成）によって配列の全ての位置が相補的なものであるか、又は標準的な塩基対形成では相補的ではない残基（そこには非塩基残基も含まれる）を１つ又は複数含有するが、適切なハイブリダイゼーション条件下で配列全体としては他の塩基配列に特異的にハイブリダイズするものでもよい。オリゴマーの連続した塩基は、オリゴマーが特異的にハイブリダイズする配列に、少なくとも約８０％（８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％）相補的であることが好ましく、少なくとも約９０％相補的であることがより好ましい。当業者は適切なハイブリダイゼーションの条件をよく知っており、配列の構成や状態に基づいて容易に予測するか、または慣例的な試験によって実験的に決定することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）の§§1.90〜1.91、7.37〜7.57、9.47〜9.51 及び 11.47〜11.57、特に§§9.50〜9.51、11.12〜11.13、11.45〜11.47 及び 11.55〜11.57を参照）。
核酸配列は、相補的配列（たとえば、オリゴヌクレオチドプローブ）を用いたハイブリダイゼーションによって検出することができる（U.S. Pat. No. 5,503,980（Cantor）、No. 5,202,231（Drmanac et al.）、No. 5,149,625（Church et al.）、No. 5,112,736（Caldwell et al.）、No. 5,068,176（Vijg et al.）及び No. 5,002,867（Macevicz）、を参照）。ハイブリダイゼーション検出方法に（たとえば、ＤＮＡチップ上の）プローブのアレイを用いることができ、こうすることで、１ヌクレオチドのみが異なる４種の関連したプローブ配列のセットから、完全に相補的なプローブ配列にのみ選択的にハイブリダイズする標的核酸に関する配列情報を提供することができる（U.S. Pat. No. 5,837,832 及び No. 5,861,242（Chee et al.）を参照）。
検出工程では、プローブオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって核酸の存在を検出するための、種々の公知の方法を用いることができる。検出工程の特定の一例においては、既に Arnold et al. Clinical Chemistry 35:1588-1594 (1989) 並びに U.S. Pat. No. 5,658,737（Nelson et al.）、No. 5,118,801 及び No. 5,312,728（Lizardi et al.）に詳細に記載されているような、ホモジニアス検出法を使用する。
プローブを用いることのできる検出方法の種類として、サザンブロット法（ＤＮＡ検出）、ドットブロット法又はスロットブロット法（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及びノーザンブロット法（ＲＮＡ検出）が挙げられる。標識したタンパク質も、それが結合する特定の核酸配列を検出するために用いることができる（たとえば、far western technology 社のタンパク質検出方法、Guichet et al., 1997, Nature 385(6616): 548-552；及び Schwartz et al., 2001, EMBO 20(3): 510-519）。他の検出方法としては、本発明における試薬が計量棒などの形で含まれるキットが挙げられる。当然のことながら、自動化に対応可能な検出方法を用いることが好ましいこともある。具体例としては、１種又は複数種の異なるプローブ（たとえば、アレイ）を包含するチップや他の支持体が挙げられるが、これらに限定されることはない。
「標識」とは、検出可能であるか、検出可能なシグナルをもたらす分子構造（molecular moiety）又は化合物である。標識は、核酸プローブ又は検出する核酸（たとえば、増幅した配列）に直接的又は間接的に結合させる。直接的な標識は、標識を核酸に繋ぐ結合又は相互作用（たとえば、共有結合や非共有相互作用）によって行うことができ、一方、間接的な標識は、直接的又は間接的に標識した、付加的なオリゴヌクレオチドなどの「リンカー」（架橋構造（bridging moiety））を介して行うことができる。架橋構造は検出可能なシグナルを増幅することもできる。標識には、検出可能ないかなる分子構造（たとえば、放射性核種；ビオチンやアビジンなどのリガンド；酵素や酵素基質；反応性基；染料や着色粒子などの発色団；生物発光性化合物、蛍光発光性化合物や化学発光性化合物などの発光性化合物；及び蛍光化合物）も含まれる。好ましくは、標識プローブ上の標識は、ホモジニアスなアッセイ系で検出可能なもの、即ち、混合物中で、結合した標識が未結合の標識と比べて検出可能な変化を生じるものである。
核酸鎖を断片化すると共に標識を付けるという、核酸を標識するための他の方法も知られており、この方法は、固定したＤＮＡプローブのアレイに対するハイブリダイゼーションによって検出する核酸を標識する際に有用である（たとえば、PCT/IB99/02073 を参照）。
「ホモジニアスな検出が可能なラベル」とは、標識したプローブが標的配列にハイブリダイズしているか否かに基づいて、その存在をホモジニアスな様式で検出することができるものである。ホモジニアスな検出が可能なラベルは、ハイブリダイズした標識プローブをハイブリダイズしていないものから物理的に分けることなく検出することができる。ホモジニアスな検出が可能なラベルとその検出方法については、他で詳細に説明されている（たとえば、U.S. Pat. No. 5,283,174、No. 5,656,207 及び No. 5,658,737 を参照）。
本明細書で使用しているように、「オリゴヌクレオチド」や「オリゴ体」とは、２個以上のヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）からなる分子である。オリゴ体の大きさは、特定の状況、最終的にはその特定の用途によって決まるものであり、当業者が状況に応じて適応させるものである。オリゴヌクレオチドは、公知の方法に従って、化学的に合成するか、クローニングによって誘導することができる。通常は一本鎖型であるが、二本鎖型でもよく、「制御領域」までも含有してもよい。天然では珍しいヌクレオチドや合成ヌクレオチドを含有してもよい。選択した基準、たとえば、安定性、を向上させるように設計することもできる。デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドのキメラも、本発明の範囲内である。
配列の増幅． 標的配列を大量に発生させる方法。一般に、１個以上の増幅プライマーを核酸配列にアニーリングする。適切な酵素を用いて、プライマーに隣接する、又はプライマー間にある配列を増幅する。
本明細書で使用しているように、「プライマー」とは、標的配列にアニーリングし、適切な条件下では核酸合成の開始点となる二本鎖領域を作製することが可能なオリゴヌクレオチドである。プライマーは、たとえば、アレル特異的増幅に用いるために、ある種のアレルに特異的になるように設計することができる。たとえば、プライマーは、短いＰＣＡ３ ＲＮＡに相補的になるように設計することができ、短いＰＣＡ３ ＲＮＡは前立腺の悪性状態と関連するが、長いＰＣＡ３ ＲＮＡは、前立腺の非悪性状態（良性状態）と関連する（WO 01/23550 として公開された PCT/CA00/01154）。プライマーの５’領域は標的核酸配列と非相補的でもよく、付加的な塩基、たとえば、プロモーター配列が含まれてもよい（このようなプライマーを「プロモータープライマー」と称する）。当業者は、プライマーとして機能し得るいかなるオリゴマーも５’プロモーター配列を含むように修飾可能であり、そのようなオリゴマーはプロモータープライマーとして機能することを理解している。同様に、いかなるプロモータープライマーも、その機能的なプロモーター配列とは独立してプライマーとして働くことができる。当然のことながら、公知の核酸配列からプライマーを設計する方法は当業界で知られている。オリゴ体については、種々の異なるヌクレオチドを包含してもよい。当業者は、よく知られたデータベース（たとえば、GenbankTM）を用いてコンピューターアライメント／サーチを行うことによって、選択したプライマーやプローブ（ＰＳＡ、ＰＣＡ３、対照配列など）の特異性を容易に評価することができる。
増幅用プライマー． 標的配列の隣にアニーリングし、核酸配列の相補鎖であるプライマー伸長産物の合成を開始する条件下においては、ＤＮＡ合成の開始点となることが可能なオリゴヌクレオチド。
ＮＡＳＢＡ法． 核酸増幅法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）（ＮＡＳＢＡ法）は、公知の技術（Malek et al., Methods Mol Biol, 28:253-260、並びに U.S. Pat. No. 5,399,491 及び No. 5,554,516）に従って実施することができる。１つの態様においては、ＮＡＳＢＡ増幅法は、（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む）アンチセンスプライマーＰ１のｍＲＮＡ標的へのアニーリングから始まる。次に逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）が相補的ＤＮＡ鎖を合成する。ＲＮＡ鎖を消化するＲＮａｓｅＨは二本鎖のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識し、センスプライマーＰ２が結合できる一本鎖ＤＮＡ分子を残す。Ｐ２は、２番目のＤＮＡ鎖を合成するＲＴａｓｅのアンカーとして働く。その結果として得られる二本鎖ＤＮＡは、機能的なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有し、対応する酵素はこれを認識する。ＮＡＳＢＡ反応は続いて以下の６つの工程を包含する循環的な増幅反応を開始することができる：(1) Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによる、短い一本鎖アンチセンスＲＮＡ分子の合成（ＤＮＡテンプレート当たり１０1〜１０3コピー）、(2) プライマーＰ２のＲＮＡ分子へのアニーリング、(3) ＲＴａｓｅによる相補的ＤＮＡの合成、(4) ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖の消化、(5) 一本鎖ＤＮＡへのプライマーＰ１のアニーリング、及び (6) ＲＴａｓｅによる二本鎖ＤＮＡ分子の作製。ＮＡＳＢＡ反応は等温性（４１℃）なので、サンプル調製工程においてｄｓＤＮＡの変性を防止すれば、ｓｓＲＮＡの特異的増幅は可能である。したがって、ゲノムｄｓＤＮＡによって生じる偽陽性結果を得ることなく、ｄｓＤＮＡのバックグラウンドからＲＮＡを取り出すことが可能である。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）． ポリメラーゼ連鎖反応は公知の技術に従って実施することができる。たとえば、U.S. Pat. No. 4,683,195、No. 4,683,202、No. 4,800,159 及び No. 4,965,188 を参照されたい（これら３つの米国特許の内容はこの記載によって本明細書に組み込まれているものとする）。一般的に、ＰＣＲは、検出すべき特定配列の各核酸鎖に対して１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、ハイブリダイゼーション条件下における核酸サンプルの（たとえば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下における）処理を含む。各プライマーの合成した伸長産物は２本の核酸鎖のそれぞれに相補的であり、プライマーは、特定配列とハイブリダイズするのに十分に相補的である。各プライマーから合成した伸長産物は、同じプライマーを用いた伸長産物の更なる合成のためのテンプレートとしても機能する。伸長産物の合成を十分な回数行った後には、検出すべき配列が存在するか否かを求めるためにサンプルを解析する。増幅配列の検出は、ゲル電気泳動後のＤＮＡの臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）染色による視覚化、公知の技術に従った検出可能なラベルの使用などによって行うことができる。ＰＣＲ技術の総論については、PCR Protocols, A Guide to Methods and Amplifications, Michael et al., Eds, Acad. Press, 1990 を参照されたい。
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、公知の技術（Weiss, 1991、Science 254:1292）に従って実施することができる。当業者は、プロトコルを所望の用途に適合させることができる。ストランド置換増幅法（ＳＤＡ法）も、公知の技術に従って実施したり、プロトコルを特定の用途に適合させたりできる（Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396; 及び、同上、1992, Nucleic Acids Res. 20:1691-1696）。
ターゲットキャプチャー法（Target capture）． １つの態様においては、in vitro 増幅を行う前に標的核酸の濃度又は純度を上げるためのターゲットキャプチャー法が本発明の方法に含まれる。好ましくは、ターゲットキャプチャー法は、既に報告されている方法に記載されているように、標的核酸をハイブリダイズし単離するといった比較的簡単な方法を含むものである（たとえば、U.S. Pat. No. 6,110,678、No. 6,280,952 及び No. 6,534,273号を参照）。一般的に、ターゲットキャプチャー法は２つのファミリー、即ち、配列特異的方法と配列非特異的方法に分けることができる。非特異的方法においては、試薬（たとえば、シリカビーズ）を用いて核酸をそこに非特異的に捕捉する。配列特異的方法においては、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、適切なハイブリダイゼーション条件下で標的核酸を含む混合物と接触させ、標的核酸を固体支持体に結合させることによって、他のサンプル成分からの標的核酸の精製を可能にする。ターゲットキャプチャーは、標的核酸と固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドとの直接的なハイブリダイゼーションの結果でもよいが、標的核酸を固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに繋げるためのハイブリダイゼーション複合体を形成するオリゴヌクレオチドとの間接的なハイブリダイゼーションの結果であることが好ましい。固体支持体は、溶液から分離することのできる粒子であることが好ましく、容器に磁場を与えることで回収することのできる常磁性粒子であることが更に好ましい。分離した後には、固体支持体に結合した標的核酸を洗浄し、in vitro 増幅反応系で適切なプライマー、基質及び酵素と標的核酸を接触させることで増幅する。
一般的に、キャプチャー用オリゴマー配列には、キャプチャー法が真に特異的な時には標的核酸配列に特異的に結合する配列と、固定化した配列に複合体をハイブリダイゼーションによって結合する「テール」配列が含まれる。即ち、キャプチャー用オリゴマーには、ＰＣＡ３、ＰＳＡや他の前立腺特異的マーカー（たとえば、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＭＳＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼ、ＰＣＧＥＭ１）である標的配列に特異的に結合する配列と、そこに共有結合した３’テール配列（たとえば、固定化したホモポリマー配列に相補的なホモポリマー配列）が含まれる。テール配列は、たとえば、５〜５０ヌクレオチドの長さで、標的含有複合体を固体支持体に結合するために固定化配列にハイブリダイズし、その結果、ハイブリダイズした標的核酸を他のサンプル成分から精製するものである。キャプチャー用オリゴマーはいかなる主鎖結合を有していてもよいが、いくつかの態様においては、１つ又は複数の２’−メトキシ結合を含む。当然のことながら、他のキャプチャー法も当業界ではよく知られている。キャップ構造上に捕捉する方法（Edery et al., 1988, gene 74(2): 517-525 と U.S. Pat. No. 5,219,989）やシリカ系の方法（silica based method）が他のキャプチャー法の２つの具体例であるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
「固定化プローブ」や「固定化核酸」は、キャプチャー用オリゴマーを、直接又は間接的に、固体支持体に結合する核酸である。固定化プローブは、固体支持体に結合したオリゴマーであって、サンプル中の未結合の物質からの結合した標的配列の分離を容易にする。公知のいかなる固体支持体、たとえば、マトリックスや溶液中に遊離した粒子も用いることができ、その材質はいかなる公知の物質（たとえば、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリレート、混合ポリマー、ポリスチレン、シラン化ポリプロピレン、金属粒子、好ましくは常磁性粒子）でもよい。好ましい支持体は、単分散性の常磁性球体（即ち、粒径±約５％の均一な大きさのもの）であり、これを用いることで固定化プローブが安定に、（たとえば、直接的な共有結合、キレート化又はイオン相互作用を介して）直接的に又は（たとえば、１つ又は複数のリンカーを介して）間接的に結合し、溶液中の他の核酸へのハイブリダイゼーションを可能にするので、一貫した結果が得られる。
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）． メッセンジャーＲＮＡ（“ＲＮＡ”）の逆転写によって合成される組換え核酸分子。
本明細書で使用するように「精製した」という用語は、元々存在していた組成物中の成分から分離した分子（たとえば、核酸）について用いる。したがって、たとえば、「精製した核酸」は、自然界では見られない程度まで精製したものである。「実質的に純粋な」分子とは、他の成分をほとんど含んでいない（たとえば、異物を３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％含んでいない）分子である。その反対に、「粗製」の分子は、存在していた元の組成物中の成分から分離していない分子である。簡潔にするために分子の量（たとえば、６６、６７．．．８１、８２、８３、８４、８５．．．９１、９２％．．．）を特に記述しないが、いずれも本発明の範囲内である。
「予後判定」、「ステージ判定」及び「侵襲性の判定」という用語は、前立腺癌の重症度及びその発症に関する予測、さらには前立腺癌の通常の進行から予測される回復の見込みを意味する。本発明においては、一旦前立腺癌の侵襲性が判定されれば、適当な治療方法を選択することができる。
「グリーソンスコア」とは、当業界においてよく知られているように、腺癌のグレード／ステージの判定及び予後判定に最もよく用いられる分類系である。この分類系には２から１０までのスコアがあり、２は侵襲性が最も低く、１０は侵襲性が最も高い。このスコアは、検出された腫瘍成長の中で最も多く見られる２つのパターン（グレード１〜５）の合計である。計測に含めるためには、あるパターン（グレード）は、生検標本の５％を越える面積を占めていなければならない。正確さを期すために、この分類系には生検材料（針生検や外科的標本）を用いる必要があり、細胞学的な標本を用いることはできない。
「グリーソングレード」とは、前立腺癌のグレードの判定のために最もよく用いられる分類系である。この分類系においては、前立腺癌細胞の形成する組織の形態が、正常な前立腺細胞が形成する腺の形態をどれだけ模倣しているかに基づいて、前立腺組織に１〜５の範囲内の値を割り当てる。そこに見られる、細胞の形成するパターンの中で最も優勢のもの２つにグレードを割り当て、これら２つのグレード（同一の場合も異なる場合もある）を合計し、グリーソンスコア（１から１０に亘る数値）を決定する。
グリーソン分類系は、もっぱら、前立腺腫瘍からなる前立腺の構造的パターンに基づいている。この分類系は、特定の癌の細胞が、どれほど効果的に、正常な前立腺に似た構造の腺を形成することができるかを評価する。腫瘍が正常な前立腺の構造を模倣する能力を腫瘍の「分化度」という。経験によれば、正常に近い構造を有する（高分化度の）腫瘍は、正常に比較的近い生物学的挙動を示す、即ち、侵襲性の高い悪性腫瘍ではない。
原理はかなり単純であり、グリーソングレードによる分類は、「非常に高分化型」（グレード１）から「非常に低分化型」（グレード５）に亘る評価を、通常は、癌の低倍率顕微像の観察によって行う。さらなる重要な詳細を知るには、より高倍率で観察する必要があり、腫瘍に正確なグレードを付すことは、病理学における多大な訓練と経験によってのみ可能となる。
グリーソングレード１と２： これら２つのグレードは、腫瘍が正常な前立腺によく似ていることを意味する。これらが一般的な集団で観察されることは滅多になく、これらが示す予後の利点もグレード３よりほんの少し多いだけなので、最も重要度の低いグレードである。これら２つのグレードの腫瘍は集塊を形成しており、グレード２では、腺はゆるやかに凝集しており、そのいくつかは周囲の筋肉（間質）に移動（浸潤）している。
グリーソングレード３： このグレードは、最も一般的に見られるグレードであり、（グリーソングレード１と２のように）高分化型とみなす。これは、これら３つのグレードの腫瘍は、正常な前立腺のような正常な「腺単位」を有する、即ち、全ての細胞が中央の腺腔（内腔）を取り囲むように円形に並んだ構造の一部であるからである。内腔は、正常な前立腺のように前立腺分泌物を含み、各腺単位は腺単位同士を隔てる前立腺筋肉に取り囲まれている。グレード２とは対照的に、はっきりとした腺の間質（筋肉）への移動（浸潤）が見られ、グレード３の主たる特徴となっている。細胞の色は薄いというよりもむしろ濃く、腺の形状はしばしばより多様である。
グリーソングレード４： このグレードは、かなり一般的に見られ、このグレードの腫瘍が多数存在するときには、患者の予後は通常は（しかし、常にというわけではないが）かなりの程度悪化するという事実によって、最も重要なグレードと考えられる。このグレードでも、構造の喪失に大きな飛躍がある。ここで始めて、正常な腺単位の崩壊と喪失が観察される。実際、グレード４の同定は、それぞれが内腔（分泌腔）を有する、個々の独立した腺単位を形成する能力の喪失にほぼ完全に基づいている。この重要な特徴は、概念的には単純であるが、実際に発見するのは容易ではない。その理由は、腺単位を形成しようとする癌の行動が歪んだ時に形成される腺の形は多様であるためである。それぞれの癌は、正常な構造の一部を形成するための、それぞれの機能を有している。グレード４は、大木の枝のようなものであり、これらの枝はグレード１、２及び３という（高分化度の）幹から数多くの方向に伸びている。このグレードの診断には多くの経験が必要であり、すべてのパターンをグレード３と容易に区別できるわけではない。グレード４は、低分化度の前立腺癌の主要なクラスであり、グレード４をグレード３から区別することは、グレードの判定の中で最も重要である。
グリーソングレード５： グリーソングレード５は、予後不良へ向けての別の重要なステップを予見させるという点で重要なグレードである。グレード４ほど一般的に見られず、癌が早期の段階にあると診断された男性には滅多に見られないという事実故に、一般的な集団にとってはグレード５の全体的な重要性は低い。このグレードもまた、多様なパターンを呈するが、腺単位を形成しようとする兆候は全く見られない。このグレードは、他の器官に発生する未分化の癌との区別が実質的にはつかないため、しばしば、未分化であると言われる。
病理学者が前立腺癌の標本を顕微鏡で観察してグリーソングレードを付す時には、２つの構造パターンを同定し、それぞれにグリーソングレードを付すようにする。病理学者が各標本についてパターンを決定する時には、まず一次的な（または、最もよく見られる）パターンを見出し、次いで二次的な（または、二番目によく見られる）パターンを見出すが、単一で同質なグレードしか存在しないこともしばしばある。
この分類系を開発したときに、グリーソン博士は、特定の患者の標本に見られる、最も一般的な２つのパターンのグレードの組合せを提供することで、患者の予後が良好か不良かの予想がより正確になることを見出した。したがって、紛らわしいようであるが、通常、医師が患者に付すグリーソンスコアは、実際は２つの数の組合せ又は合計であり、これによって、非常に広範に用いるのに十分な正確さが得られる。組み合わせたグリーソンスコア（Gleason sums or scores）は次のように決定する。
・ 可能な最小のグリーソンスコアは２（１＋１）、即ち、一次パターンと二次パターンとがともにグリーソングレード１を有する場合であり、２つのパターンのグレードを合計すると２になる。
・ 非常に典型的なグリーソンスコアは５（２＋３）又は６（３＋３）であろう。グリーソンスコアが５というのは、一次パターンのグリーソングレードが２、二次パターンのグリーソングレードが３の場合であり、グリーソンスコアが６というのは、同質なパターンである。
・ 他の典型的なグリーソンスコアは７（４＋３）、即ち、一次パターンのグリーソングレードが４、二次パターンのグリーソングレードが３の場合である。
・ 終わりに、可能な最大のグリーソンスコアは１０（５＋５）、即ち、一次パターンと二次パターンがともに、最も無秩序なパターンを示すグリーソングレード５の場合である。
前立腺癌のステージを判定するためのもう１つの方法は、ＴＮＭ分類系を用いる方法である。これは、原発腫瘍の規模（ステージＴ）、近傍リンパ節への転移の有無（ステージＮ）、及び遠隔転移（悪性転移）の有無（ステージＭ）を評価する。ＴＮＭ分類の各カテゴリーは、特定の状態を表すサブカテゴリーにさらに分類される。たとえば、原発腫瘍（ステージＴ）は、以下のようにさらに分類することができる。
Ｔ１： 腫瘍は、直腸指診による感知も画像解析による検出もできないが、生検標本から癌細胞が検出される。
Ｔ２： 腫瘍は、直腸指診による感知可能で、癌は前立腺に限局する。
Ｔ３： 腫瘍は、前立腺被膜（前立腺を取り囲む繊維組織層）の外及び／又は精嚢（精液を蓄える、前立腺に隣接する２つの小さい嚢）に転移しているが、他の器官には転移していない。
Ｔ４： 腫瘍は、（精嚢以外の）前立腺隣接臓器に転移しているか、固定している。
リンパ節の関与については、以下の４つのカテゴリーに分類される。
Ｎ０： 癌はリンパ節に転移していない。
Ｎ１： 癌は、（骨盤の内の）単一の所属リンパ節に転移しているが、その大きさは２ｃｍ以下である。
Ｎ２： 癌は１つ以上の所属リンパ節に転移しており、その大きさは２ｃｍを越えるが５ｃｍ以下である。
Ｎ３： 癌はリンパ節に転移しており、その大きさは５ｃｍ（２インチ）を越える。
悪性転移は、通常、以下の２つのカテゴリーに分類される。
Ｍ０： 癌は所属リンパ節以外には転移して（広がって）いない。
Ｍ１： 癌は、（骨盤外の）遠隔リンパ節、骨、又は遠隔の臓器（肺、肝臓、脳など）に転移している。
なお、ステージＴはさらに、Ｔ１ａ〜Ｔ１ｃ、Ｔ２ａ〜Ｔ２ｃ、Ｔ３ａ〜Ｔ３ｃ、及びＴ４ａ〜Ｔ４ｂのサブカテゴリーに分類される。これらのサブカテゴリーの各々の特徴は、当業界ではよく知られており、多数の教科書に記載されている。
本明細書で使用するように「前立腺特異的マーカー」という用語は、サンプルにおけるその存在が、前立腺細胞（又はそのマーカー）がサンプルに含まれていることを示すいかなる分子も意味する。したがって、「前立腺特異的配列」は、前立腺細胞に特異的に見出される核酸配列又はタンパク質配列であって、あるサンプルを「汚染」し得る他の組織に通常は存在しないものである。必然的に、尿サンプルを用いた時には、本発明における第２前立腺特異的マーカーが、前立腺でのみ発現されている必要はない。実際には、１つの器官又は組織でのみ発現されているマーカーはほとんどない。しかし、第２前立腺特異的マーカーが前立腺以外の組織で発現されていても、第２前立腺特異的マーカーが発現している組織や器官の細胞が通常は尿サンプル中には存在しない時には、このような非前立腺組織における発現は第２前立腺特異的マーカーの特異性を脅かすことはない。したがって、尿をサンプルとして用いる時には、第２前立腺特異的マーカーは、尿サンプルに見られる他の種類の細胞（たとえば、泌尿器系の細胞）では通常は発現していないものである。同様に、他の種類のサンプル（たとえば、精子サンプル）を用いる場合には、第２前立腺特異的マーカーは、そのようなサンプルに通常見出される他の種類の細胞では発現しないものである。
対照サンプル． 本明細書において「対照サンプル」又は「正常サンプル」とは、特別に選択した癌を含まないサンプルである。特定の態様においては、対照サンプルは前立腺癌を含まないか、前立腺癌の不存在を示すものである。対照サンプルは前立腺癌に罹患していない患者／個体から得ることができる。他の種類の対照サンプルを用いることもできる。たとえば、サンプルに前立腺特異的細胞が含まれることを確認するために、前立腺特異的マーカーを用いることができる（このようなマーカーは、本明細書では通常、第２前立腺特異的マーカーと称する）。関連した状況においては、対照反応は、方法そのものを制御するように設計することができる（制御することのできる方法としては、たとえば、細胞抽出法、キャプチャー法、増幅反応や検出方法、サンプル中の細胞数、これらの組み合わせ、又はシグナル（たとえば、ＰＣＡ３シグナル）の不存在が１つ又は複数の工程における失敗によるものではないことを判定するために観測するこのできる全ての工程が挙げられる）。一旦カットオフ値を決めれば、このカットオフ値に特徴的なシグナルを与える対照サンプルを設計し、本発明の方法に用いることもできる。診断／予後判定のための試験は、通例、次の４種類の業績評価指標によって特徴付けられる： 感度（Ｓｅ）、特異性（Ｓｐ）、陽性的中率（ＰＰＶ）、及び陰性適中率（ＮＰＶ）。次の表に、これら４種類の業績評価指標の計算に用いるデータを示す。
Figure 0004944041
感度は、真に疾患又は病態を有する対象生物のうち、診断試験で陽性と判定されたものの比率（Ｓｅ＝ａ／（ａ＋ｃ））に対応する。特異性は、疾患や病態を有していない対象生物のうち、診断試験で陰性と判定されたものの比率（Ｓｐ＝ｄ／（ｂ＋ｄ））に関連する。陽性適中率は、診断試験の結果が陽性だった時に、実際に対象生物が疾患又は病態を有する確率（ＰＰＶ＝ａ／（ａ＋ｂ））である。最後に、陰性適中率は、診断試験の結果が陰性だった時に、対象生物が真に疾患又は病態を有していない確率（ＮＰＶ＝ｃ／（ｃ＋ｄ））である。これらの値は通常パーセント（％）で表す。ＳｅとＳｐは、通常、試験の精度に関連し、ＰＰＶとＮＰＶは臨床上の有用性に関する。
カットオフ値（閾値）． 前立腺癌素因又は前立腺癌の存在のカットオフ値は、前立腺癌を有していない患者集団から求め、その値は、ＰＣＡ３ポリヌクレオチド又はその断片の平均シグナルを、第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＳＡ）のポリヌクレオチド、ポリペプチド又はその断片の平均シグナルで割った値に、標準偏差ｎを足した値（又は平均シグナル値の平均）と定義する。前立腺癌の存在を示すカットオフ値と前立腺癌素因を示すカットオフ値は、同じでもよいが、異なってもよい。腫瘍マーカーは多くの場合、腫瘍細胞のみが産生するものではないから、特定のマーカーから臨床上の用途を導き出すためには、しばしば、感度と特異性との間のバランスを見極めなければならない。このような妥協は、しばしば、特定の閾値である“カットオフ”値を用いることによって行われるものであり、カットオフ値は集積したデータに基づいて経験的に決められる。したがって、本発明の属する技術分野に属する当業者であれば、通常の実験を行うことで、所望の特異性と感度、使用するサンプルの種類、その調製法、癌のステージ、ＰＣＡ３の絶対的な発現レベルではなく、その比を用いるということ、及び、本明細書に記載した他の要因に基づいて、特定のカットオフ値を選択することができるということを、理解されたい。より具体的には、ＰＣＡ３の場合、当業者は、本明細書に記載した１３２×１０-3と２００×１０-3の２つの値よりも高いか低いカットオフ値も選択することができる。本発明の範囲内である、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比として用いることのできる低い値や高い値の具体例をここに列挙しないが、たとえば、有用なレベルの特異性と感度を選択するために、当業者であれば、正規化された量比である１００×１０-3、１５０×１０-3、１７５×１０-3又は２５０×１０-3という値をカットオフ値として選択することができるということを理解されたい。さらに、血清ＰＳＡタンパク質レベルを評価する際には、本明細書に記載した３ｎｇ／ｍｌという値以外のカットオフ値も、本発明において用いることができる。たとえば、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比による試験を更に必要とするサンプルを所望により予備選択する際には、５ｎｇ／ｍｌや１０ｎｇ／ｍｌというカットオフ値も本発明において用いることができる。前立腺癌のステージ判定や侵襲性の判定（予後判定）のためのカットオフ値は、様々なステージ又は様々な侵襲性（グリーソンスコア）の前立腺癌に罹っている患者の集団から決定するが、カットオフ値は、前立腺癌の特定のステージについて、ＰＣＡ３のポリヌクレオチド、又はその断片の平均シグナルを、第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＳＡ）のポリヌクレオチド、ポリペプチド又はその断片の平均シグナルで割って得られる値に、標準偏差ｎを足して得られる値（又は平均シグナル値の平均）と定義する。試験に望ましい特異性と感度や、検出する前立腺腫瘍のステージ、グレード又は体積に応じて、特定のカットオフ値を選択する。
本明細書において「レベル」及び「量」という用語は、測定するＰＣＡ３、ＰＳＡ又は他のマーカーについて用いる時には、互換的に使用する。
当業者であれば、試験が陽性か陰性かを決定するため、また、前立腺腫瘍のステージ、グレード又は体積や前立腺腫瘍の侵襲性を判定するために、本発明に関連して数々の統計方法を使用することができることを理解されたい。
変異体（Variant）． 本明細書において「変異体」とは、本発明におけるタンパク質又は核酸と実質的に類似した構造及び生物学的活性を有するタンパク質又は核酸分子であって、生物活性の少なくとも１つを保持するものである。よって、２個の分子が共通の活性を有して互いに代替可能であれば、これらの分子の一方の組成又は二次、三次若しくは四次構造が他方のものと同一でなかったり、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列が同一でなかったりしても、これらの分子は本発明で定義した変異体と考える。
「生物学的サンプル」又は「患者のサンプル」は、生存又は死亡したヒトから得た組織又は材料であって、ＰＣＡ３標的核酸及びＰＳＡ標的核酸を含むものをすべて包含する。サンプルには、たとえば、前立腺生検、尿、精液、膀胱洗浄液や他の体液、組織や材料などの、ＰＣＡ３標的物及びＰＳＡ標的物（又は他の前立腺特異的マーカー）に特異的な細胞を含むものが挙げられる。本発明においては、直腸指診（又は尿中の前立腺細胞量を増加させる他の方法）の後に得られる尿サンプルが好ましい。生物学的サンプルは、組織又は細胞構造を物理的に破壊するように処理して、細胞内成分を溶液中に放出させることもでき、溶液は、分析用サンプルを調製するために用いる酵素、緩衝剤、塩類、界面活性剤などを含んでいてもよい。１つの特定の態様においては、サンプルは直腸指診の後に得られる尿サンプルである。
本発明の他の諸目的、諸利益及び諸特徴は、本発明の好ましい態様に関する以下の説明から明らかになる。この説明は、添付の図面に参照して行われるが、あくまで例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。
上記で本発明の概要について説明したが、以下、添付の図面に参照しながら、本発明の好ましい態様について具体的に説明する。
前立腺癌に対するマーカーの主な課題の１つは、前立腺癌の臨床的挙動をも予測する診断用検査の必要性を満たすことである。ＰＣＡ３遺伝子は、独特の転写制御機構によって、悪性でない前立腺上皮細胞に比べて、前立腺癌で強く過剰発現する。本発明においては、侵襲性の細胞は浸潤性が高く、したがって、移動し、腺管系に流入する傾向がある。さらに、ＰＣＡ３／第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＳＡ）の比を腫瘍体積と相関させることができることが、意外にも明らかとなった。したがって、経直腸指診（extended DRE）の後には、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比を前立腺癌のステージ、グレードと腫瘍体積、即ち前立腺癌の生物学的侵襲性と相関させ、これにより、より正確な癌の診断及び予後判定、さらには、患者にとってより適切な治療法の処方が可能となる。
表４は、前立腺におけるＰＣＡ３の発現を示す。表６は、前立腺におけるＰＣＡ３ ｍＲＮＡ発現の比較を示す。表７は、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比と前立腺癌の悪性度との相関を示す。
１つの態様においては、ＰＳＡ血清レベルが上昇した（３ｎｇ／ｍｌを超えた）ために来院した患者からなる新たなコホートについて、前向きの研究を実施した。この研究に参加するために、患者は、研究に関する説明を受け、インフォームドコンセントに署名した。組織学的評価のために、悪性腫瘍の有無を調べるための超音波ガイド生検を実施した。生検の組織病理学的評価によって、４９人の患者から癌を同定した。組織学的評価結果と、生検の直前に得たＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比を比較した。
驚くべきことに、グリーソンスコアとＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比のレベルとの間に明白な相関が見られた（図３、５及び６）。続いて、検査結果が陽性／真陽性の症例と検査結果が陰性の症例について、グリーソングレードの分布を分析した。偽陰性患者のグレードは、真陽性患者のグレードよりも有意に低かった。
したがって、経直腸指診後に得た尿沈渣の分析から得られたＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比は、予後判定用及びテラノーシス用のパラメーターとなることが明らかになった。
近年の多くの進歩にも拘らず、前立腺癌を発症した個体のステージと予後判定の精度は、十分というにはほど遠い。その理由の１つは、ＰＳＡ前立腺マーカー及びＰＳＭ前立腺マーカーは正常な細胞と癌性の細胞で発現し、その発現は、（通常、侵襲性がより高い）低分化型の腫瘍においては減少する傾向があるためである。したがって、腫瘍が低分化型の傾向にある（腫瘍グレードが高くなる）ときには、ますます診断と予後判定の特異性と感度が劣ることになり、腫瘍が診断で発見されない可能性もある。
一方、ＰＣＡ３は、独特の転写制御機構のために、悪性でない前立腺上皮細胞に比べて前立腺癌で強く過剰発現し、その発現は前立腺に限られる（Vearhaegh et al., 2000, J Biol. Chem. 275:37496-37503）。その発現は前立腺の癌性細胞と正常細胞とで異なり、腫瘍グレードの上昇と共に有意な減少を示すことはない。したがって、ＰＣＡ３は、前立腺癌患者の診断、ステージ判定及び治療におけるＰＳＡやＰＳＭの欠点を克服しうる、有用な道具となる可能性がある。
ＰＣＡ３が非常に特異的で感度の高い診断用の道具であることは既に証明されていたが、ＰＣＡ３の予後判定及びテラノーシス用の道具としての価値は、本発明以前には確立されていなかった。本発明においては、ＰＣＡ３発現が生物学的な侵襲性と相関し、したがって、予後判定用マーカー及び／又はテラノーシス用マーカーとして用いることができることを示す。さらに本発明は、ＰＣＡ３／ＰＳＡ発現レベル比の、非常に効率的な予後判定用／テラノーシス用因子としての用途を確立する。さらに、本発明者らは、サンプル中のＰＣＡ３／ＰＳＡ発現比に関する値は、癌の腫瘍グレード、腫瘍体積及び侵襲性と相関する、予後判定／テラノーシス用の非常に高感度で特異的な道具であることを知見した。ＰＣＡ３とＰＳＡを前立腺マーカーとして使用すること、及びＰＳＡ発現レベルは前立腺癌の侵襲性とともに減少する傾向にあるという事実（これによって上記比の数値は増加するが、未だ当業界で議論されている知見）は、本発明の診断方法及び予後判定方法の感度と特異性とに貢献する。
したがって、本発明によって初めて、サンプル中のＰＳＡ遺伝子のコードするＲＮＡの発現レべル（量）に対する、ＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡの相対発現レべル（量）の決定に基づく、患者の前立腺癌の予後判定のための特異的且つ高感度の方法が提供される。ＰＣＡ３／ＰＳＡ発現レベル比の値を、前立腺癌の有無と相関させることで、前立腺癌の予後判定のためのステージや侵襲性の決定が可能となる。これは、前立腺癌の重症度の決定や、その発達の予測に特に有用であり、さらに、回復の確率を高めるために患者に適切な治療法を直ちに選択する上で最も重要である。
一般に、前立腺癌を発症する素因、前立腺癌の存在、又は前立腺癌の侵襲性は、生物学的サンプル（たとえば、ＤＲＥ後に得た尿サンプル）中の、ＰＳＡポリヌクレオチドに対するＰＣＡ３ポリヌクレオチドの相対量（ＰＣＡ３／ＰＳＡ比）の増加に基づいて、患者から検出することができる。前立腺癌の素因、その有無及び侵襲性（ステージ）の指標となるＰＣＡ３とＰＳＡをそれぞれコードするｍＲＮＡのレベルを検出するには、ポリヌクレオチドプライマー及びポリヌクレオチドプローブを用いることができる。一般的に、生物学的サンプルにおいて、ＰＳＡマーカーに対するＰＣＡ３マーカーの発現が正常対照サンプルと比べて高いことは、該生物学的サンプルが前立腺癌を含むか、または、前立腺癌に対する疾患感受性が高いかのどちらかを示す。サンプルが前立腺癌に対して陽性である特定の症例においては、ＰＣＡ３とＰＳＡとの発現レベル比は、前立腺癌の特定の進行ステージ又は侵襲性（たとえば、特定のグリーソンスコアや腫瘍体積）と相関する。
本発明の１つの態様において、本発明で使用するＰＣＡ３マーカー及びＰＳＡマーカーは、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡとＰＳＡ ｍＲＮＡ、又は、前立腺癌に関連するそれらの断片などの核酸である。ＰＣＡ３核酸は、配列番号１又は２のヌクレオチド配列を有していてもよい。しかし、「ＰＣＡ３核酸」という用語は、配列番号１又は２の配列や、それらの断片及び相補鎖に限定されるものではない。たとえば、ＰＣＡ３核酸配列は、アクセッション番号ＡＦ１０３９０７のもと、GenBankTMから得ることもできる。さらに、このような配列、断片又は相補鎖と高い相同性を示す配列も、本発明に用いることができる。ＰＳＡヌクレオチド配列は、配列番号３８として示したヌクレオチド配列を有していてもよい。もちろん、ＰＣＡ３やＰＳＡ（たとえば、ＰＣＡ３核酸配列及びＰＳＡ核酸配列）の一部又は断片も本発明に用いることができ、したがって、これらもＰＣＡ３マーカーやＰＳＡマーカーとみなすことを理解されたい。
前立腺癌の診断及び予後判定／テラノーシスのための方法の、非限定的な１例として、（ａ）生物学的サンプルを、ＰＣＡ３核酸にハイブリダイズする少なくとも１種のプローブ又はプライマーであるオリゴヌクレオチドと接触させ、ＰＣＡ３核酸にハイブリダイズする該オリゴヌクレオチドのレベルを検出する工程、（ｂ）該生物学的サンプルを、ＰＳＡ核酸にハイブリダイズする少なくとも１種のプローブ又はプライマーであるオリゴヌクレオチドと接触させ、ＰＳＡ核酸にハイブリダイズする該オリゴヌクレオチドのレベルを検出する工程、及び（ｃ）ＰＣＡ３にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのレベルとＰＳＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのレベルとの比を決定する工程を包含する方法が挙げられる。検出したＰＣＡ３とＰＳＡとの量比を、予め定めたカットオフ値と比較し、それに基づいて、患者における前立腺癌の素因、有無及びステージ、さらには患者の有する前立腺癌のおおよその腫瘍体積を知ることができる。
一般的に、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比が２００×１０-3を超える場合には、患者の予後は不良（即ち、非常に侵襲性の高い癌）と判定する。ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比が７５×１０-3〜２００×１０-3の場合には、予後は中庸であると判定し、０〜７５×１０-3の場合には、予後は良好又は危険度は低いと判定する。上述の量比と関連するグリーソンスコアは、それぞれ、７超、６〜７、及び０〜５である。もちろん、上記の量比の範囲は、試験の感度と特異性、及び選択する第２前立腺特異的マーカーによって異なり得る。したがって、当業者であれば、試験の特定の要求に応じて、異なる閾値、即ちカットオフ値を用いる（そして適合させる）であろう。
特定の態様においては、第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＳＡ）のポリペプチドレベルを、ＰＣＡ３／第２前立腺特異的マーカー比の決定に用いることができる。したがって、前立腺癌の診断、予後判定及びテラノーシスのための方法の１例として、（ａ）生物学的サンプルを、ＰＣＡ３核酸にハイブリダイズする少なくとも１種のプローブ又はプライマーであるオリゴヌクレオチドと接触させ、ＰＣＡ３核酸にハイブリダイズする該オリゴヌクレオチドのレベルを検出する工程、（ｂ）該生物学的サンプルを、ＰＳＡポリペプチドにハイブリダイズする少なくとも１種の抗体と接触させ、ＰＳＡポリペプチドにハイブリダイズする該抗体のレベルを検出する工程、及び（ｃ）ＰＣＡ３にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドのレベルとＰＳＡポリペプチドにハイブリダイズする抗体のレベルとの比を決定する（即ち、ＰＣＡ３／ＰＳＡ発現レベル比を決定する）工程を包含する方法が挙げられる。検出したＰＣＡ３とＰＳＡとの量比を、予め定めたカットオフ値と比較し、それに基づいて、患者における前立腺癌の素因、有無及びステージ、さらには患者の有する前立腺癌のおおよその腫瘍体積を知ることができる。もちろん、後述するように、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比は、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡとＰＳＡ ｍＲＮＡの検出に基づいて決定することができる。
さらなる態様において、本発明の方法は、患者における前立腺癌の進行のモニタリングにも用いることができる。この態様においては、上記のアッセイを経時的に実施し、サンプル（たとえば、尿サンプル）中の、ＰＣＡ３とＰＳＡの核酸又はタンパク質から求めた発現レベル比の変動を評価する。一般的に、検出されるＰＣＡ３発現レベルとＰＳＡ発現レベルとの比が時間とともに増加する場合には、前立腺癌は進行していると考えられる。対照的に、ＰＣＡ３発現レベルとＰＳＡ発現レベルとの比が時間とともに減少するか又は一定値を保つ場合には、前立腺癌は進行しているとは考えられない。
関連する状況においては、核酸の増幅及び／又は検出のみの効率は、核酸の増幅用及び／又は検出用の反応混合物に添加した高度に精製した対照標的核酸を用いた外部対照反応を行うことによって確認することができる。また、細胞及び／又は細胞小器官からの核酸回収の効率や、核酸の増幅及び／又は検出の阻害（存在する場合のみ）の程度も、各試験サンプルに対照となる細胞又は細胞小器官（たとえば、ＰＣＡ３と第２マーカーを発現する前立腺癌細胞系の任意の数の細胞）を添加し、外部対照反応と比較することで、確認し概算することができる。サンプル調製の効率と増幅及び／又は検出の効率の両方を確認するためには、上記のような外部対照反応を、細胞、細胞小器官及び／又は対照核酸配列を含有するウイルス粒子で強化した参照用試験サンプル又はブランクサンプルを用いて行うことができる。たとえば、各試験サンプルに添加した細胞、ウイルス及び／又は細胞小器官に存在する内部対照（ＩＣ）配列からのシグナルが、外部対照反応で観測されるシグナルよりも弱いことは、その試験サンプルに関して生じた不完全な細胞溶解、及び／又は増幅工程及び／又は検出工程の阻害によって説明することができる。一方、ＩＣ配列のシグナルが外部対照反応で観測されるシグナルと同等であることによって、その試験サンプルに関して細胞溶解を含むサンプル調製が効率よく行われ、増幅工程及び／又は検出工程の顕著な阻害は生じなかったことが確認される。また、サンプル調製の効率のみを確認するには、核酸試験以外の方法（たとえば、顕微鏡観察による分析、質量スペクトル法や免疫学的分析法）で解析した外部対照を用いることができる。
したがって、１つの特定の態様において本発明の方法は、細胞溶解やサンプル調製の効率に加えて、核酸の増幅及び／又は検出の性能を確認するために、核酸試験アッセイにおいて、内部対照（ＩＣ）の標的となる核酸配列を含有する、精製した核酸、前立腺細胞やウイルス粒子を用いる。もっと簡単に言うと、本発明の方法から選んだいずれの工程を確認するためにもＩＣを用いることができる。
ＰＣＲや関連する増幅技術におけるＩＣとしては、高度に精製したプラスミドＤＮＡが挙げられ、プラスミドＤＮＡはスーパーコイル状でも、制限エンドヌクレアーゼで消化した後に再精製した直鎖状のものでもよい。スーパーコイル状ＩＣテンプレートの増幅は、直鎖化して再精製したＩＣ核酸テンプレートと比べてずっと効率が低く（約１００分の１であり）、再現性も低い。したがって、プラスミドＤＮＡをＩＣとして用いる時には、本発明で行う増幅及び検出のためのＩＣ対照反応は、直鎖化して再精製したＩＣ核酸テンプレートを用いることが好ましい。
効率よく再現性の高いＩＣの増幅／検出を行うために、アッセイの最適化の際に行う試験に基づいて、核酸、細胞及び／又は細胞小器官を各試験サンプルに適切な濃度で導入する。添加した対照細胞の最適数はアッセイ方法に依存するが、核酸に基づくアッセイ方法において他の遺伝的標的の増幅及び／又は検出に著しく有害な影響を与えることがなく、再現性の高いＩＣ検出シグナルを生じる最少細胞数であることが好ましい。精製した直鎖状核酸、細胞、ウイルス粒子又は細胞小器官を添加したサンプルは、通常、「強化サンプル（spiked sample）」と称する。
ある種の態様においては、ｍＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイで検出してもよい。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を逆転写と共に用いる。このようなアッセイにおいては、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて生物学的サンプルから誘導したＰＣＡ３ ｃＤＮＡ又はＰＳＡ ｃＤＮＡの一部分を増幅することができるが、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドはＰＣＡ３ ＲＮＡ又はＰＳＡ ＲＮＡをコードするポリヌクレオチドに特異的（即ち、ハイブリダイズするもの）である。その後、当業界ではよく知られている技術、たとえば、ゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色によって、増幅したｃＤＮＡを分離して検出することができる。増幅は、試験患者から採取した生物学的サンプルと前立腺癌を患っていない個体から採取した生物学的サンプル（対照サンプル）、あるいは他の種類の対照サンプルに対して行うことができる。増幅反応は何段階かの希釈を行ったｃＤＮＡに対して（又は何段階かに希釈した生物学的サンプルに対して直接）行うことができ、希釈率は、たとえば２桁に及ぶ。予め定めたカットオフ値を超える量比は、前立腺癌の存在、あるいは前立腺癌を発症する素因又は前立腺癌が特定のステージに進行する（侵襲性の）素因を示す。通常、対照サンプルと比べて、生物学的サンプルにおいてＰＳＡ核酸に対するＰＣＡ３核酸の相対発現量が増加していることは、前立腺癌の存在又は前立腺癌を発症する素因を示す。特徴的な量比はまた、検出した前立腺癌のステージ及び侵襲性の指標でもある。
更なる態様においては、核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）と呼ばれる in vitro ＲＮＡ増幅法によって、生物学的サンプルの核酸抽出物からＰＣＡ３ ｍＲＮＡ及びＰＳＡ ｍＲＮＡを検出する。数多くの増幅技術が知られており、当業者の特定の要求に見合うように容易に適応させることができる。そのような増幅方法の非限定的な例として、ストランド置換増幅法（ＳＤＡ法）、転写媒介増幅法、Ｑβレプリカーゼシステム、及びＮＡＳＢＡ法が挙げられる（US 6,124,120；Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177；Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6:1197-1202；Malek et al., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260；及び上記の Sambrook et al., 2000を参照）。増幅方法のさらなる非限定的な例として、ローリングサークル型増幅法（ＲＣＡ）、ＲＮＡ技術によるシグナル媒介増幅（signal mediated amplification of RNA technology；ＳＭＡＲＴ）、スプリット コンプレックス増幅反応（split complex amplification reaction）（ＳＣＡＲ）、及びＲＮＡのスプリット プロモーター増幅（split promoter amplification of RNA）（ＳＰＡＲ）が挙げられる。
ＰＣＡ３ ＲＮＡ配列とＰＳＡ ＲＮＡ配列の増幅及び／又は検出は、（たとえば、多重リアルタイム増幅アッセイによって）同時に行うことができる。また、ストリンジェントな条件下でＰＣＡ３核酸又はＰＳＡ核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブは、生物学的サンプル中のＰＣＡ３ポリヌクレオチド及びＰＳＡポリヌクレオチドの存在及び／又は量を検出するために、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（たとえば、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、スロットブロット法、in situ ハイブリダイゼーション法など）に用いることができる。
また、オリゴヌクレオチドとプライマーは、増幅工程に続いて患者サンプル中の前立腺癌特異的ＰＣＡ３配列とＰＳＡ配列のシークエンシングを直接行い、それらの存在を確認するように設計することができる。このようなシークエンシングに基づく診断方法は自動化可能であり、本発明の範囲に含まれるものである。
癌腫の侵襲性は、癌細胞の浸潤能力の増大と関連する（これは侵襲性のグレードの高い前立腺癌における、浸潤サップレッサー遺伝子であるＥ−カドヘリンのダウンレギュレーションによって確認される）。これらの浸潤性細胞は、移動し、腺管系に流入する傾向にある。本発明は、経直腸指診の後には、尿沈渣の浸潤性細胞画分が増大するという事実を利用する。したがって、本発明において試験用のサンプルとして好ましいのは、直腸指診や、サンプル中の前立腺細胞数を増加させることのできる他の方法を行った後に得た尿である。もちろん、精液、尿と精液との混合物、及び膀胱洗浄液などの他のサンプルも、そのサンプルがＰＣＡ核酸やＰＳＡ核酸（又は他の第２前立腺特異的マーカー）の検出を可能にするのに十分な物質を含んでいる限り、本発明においては用いることができる。
核酸の合成
本発明を実施するための核酸（たとえば、ＤＮＡやＲＮＡ）は公知の方法に従って得ることができる。
本発明における単離された核酸分子には、クローニングによって得られたものと共に、化学的に合成された核酸分子も含まれる。同様に、核酸分子やそれを分割した断片に対応するオリゴマーも合成することができる。このような合成オリゴヌクレオチドは、たとえば、Matteucci et al., J．Am．Chem．Soc. 103:3185-3191 (1981) のトリエステル法や自動ＤＮＡ合成装置を用いて合成することができる。
オリゴヌクレオチドは、合成によってもクローニングによっても得ることができる。必要があれば、オリゴマーの５’末端を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化してもよい。アニーリングの前又は標識化のための一本鎖のリン酸化は、過剰量の酵素を用いて行うことができる。標識化のためにリン酸化を行う場合には、ＡＴＰは比活性の高い放射性同位体を含有していてもよい。その後、ＤＮＡオリゴマーをアニーリングとＴ４リガーゼなどによる連結反応に付すことができる。もちろん、核酸配列の標識化には、他の公知の方法を用いてもよい。
プライマーとプローブ
当業者は、公知の技術に従って核酸プライマーを選択することができる。試験用サンプルとしてヒト組織から得たＲＮＡサンプルを用いることができるが、これに限定されるわけではない。
１つの態様において、本発明は、下記のヌクレオチド配列（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれる配列に対して少なくとも９０％の同一性を示すポリヌクレオチド配列を包含する核酸分子から選ばれる、連続した少なくとも１０ヌクレオチド（好ましくは少なくとも１２、１５、１８、２０、２２、２５又は３０ヌクレオチド、あるいは後述するように、さらに長い配列）に相補的な核酸プライマー及び核酸プローブに関する。
（ａ）配列番号１又は２のヌクレオチド配列を包含する、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号３８のヌクレオチド配列を包含する、ＰＳＡ ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及び
（ｃ）ヌクレオチド配列（ａ）又は（ｂ）に相補的な核酸配列。
本発明は、前立腺癌に関連するＰＣＡ３核酸配列の存在をサンプルから特異的に検出し定量するための核酸に関し、該核酸は、ストリンジェントな条件下でＰＣＡ３核酸にハイブリダイズする、上記の核酸分子又は少なくともその断片を包含するものである。関連する態様においては、本発明は、前立腺癌に関連するＰＳＡ核酸配列の存在をサンプルから特異的に検出し定量するために核酸を使用するが、該核酸は、ストリンジェントな条件下でＰＳＡ核酸にハイブリダイズする、上記の核酸分子又は少なくともその断片を包含するものである。
１つの好ましい態様においては、本発明は、前立腺癌に関連するＰＳＡ ＲＮＡ配列とＰＣＡ３ ＲＮＡ配列を標的とし、その増幅を可能とするオリゴ体（即ち、各標的のための少なくとも１種のプライマー）に関する。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーは、特定のアッセイ形式、特定の用途や使用する標的配列に基づいた、いかなる適切な長さでもよい。好ましい態様においては、オリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーの長さは、少なくとも１０ヌクレオチド（好ましくは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２ヌクレオチド．．．）であり、選択した核酸増幅法に特に合うように適応させてもよい。より長いプローブやプライマーも本発明の範囲に含まれ、当業界でもよく知られている。ヌクレオチド数が３０超、４０超または５０超のプライマーや、ヌクレオチド数が１００超、２００超、３００超、５００超、８００超又は１０００超のプローブも本発明の範囲内である。当然、長いプライマーはより高価であるという不利益が生じるため、当業界では１２〜３０ヌクレオチドの長さのプライマーを通常は設計して使用している。当業界で知られているように、本発明の方法では、ヌクレオチド数が１０〜２０００超の長さのプローブを用いることができる。上述した同一性の％と同様に、大きさを特に記載しないプローブやプライマー（たとえば、１６、１７、３１、２４、３９、３５０、４５０、５５０、９００、１２４０ヌクレオチド．．．のもの）も本発明の範囲に含まれる。１つの態様においては、本発明におけるオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＡ３ ＲＮＡ（又はその相補的配列）やＰＳＡ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。より好ましくは、ＰＣＡ３プライマーやＰＣＡ３プローブは、前立腺癌に関連するＰＣＡ３ ＲＮＡを検出するために選択する。１つの態様においては、本発明で使用するプローブとプライマーは、ＰＣＡ３遺伝子やＰＳＡ遺伝子とハイブリダイズしない（即ち、遺伝子と発現されたＰＣＡ３核酸やＰＳＡ核酸との特定を可能にする）。ＰＳＡ遺伝子はカリクレイン遺伝子ファミリーに属する他の核酸と構造及び配列上の類似性を示すので、ＰＳＡ特異的なプローブやプライマーとして働くＰＳＡ配列を適宜選択することは、ＰＳＡ特異的核酸を増幅及び／又は検出する方法において重要である。
本発明のさらなる態様においては、本発明の開示にしたがって、他の前立腺特異的マーカーも用いることができる。ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡの増幅及び検出に適したプライマーの例（たとえば、US Patent 6,551,778）は当業界でよく知られており、その他にも、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼ及びＰＣＧＥＭ１に適したプライマーについてよく知られている。１つの態様においては、ＰＳＡオリゴヌクレオチドは、カリクレイン２（ｈＫ２／ｈＫＬＫ２）などのカリクレインファミリーに属する他のマーカーにハイブリダイズするものでもよい。このようなオリゴヌクレオチドの一例は配列番号３９である。もちろん、ＰＳＡに特異的な（即ち、カリクレインファミリーに属する他のマーカーにハイブリダイズしないように設計された）ＰＳＡオリゴヌクレオチドも用いることができる。当業者は、よく知られたデータベース（たとえば、GenbankTM）を用いたコンピューターによるアライメント／サーチを行うことによって、選択したプライマーやプローブの特異性を容易に評価することができる。
当業界で一般に知られているように、オリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーは、その標的配列とのハイブリダイゼーション産物の融点を考慮して設計する（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Edition, CSH Laboratories；“Current Protocols in Molecular Biology”の中の Ausubel et al., 1994, John Wiley & Sons Inc., N.Y.；及び下記参照）。
本発明で用いるアッセイ条件下でハイブリダイゼーションを行うためには、オリゴヌクレオチドプライマーとオリゴヌクレオチドプローブは、ＰＣＡ３ポリヌクレオチド又はＰＳＡポリヌクレオチドの一部と少なくとも７０％（少なくとも７１％、７２％、７３％又は７４％）、好ましくは少なくとも７５％（７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％又は８９％）、更に好ましくは少なくとも９０％（９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）の同一性を示すオリゴヌクレオチド配列を包含しなければならない。本発明におけるプローブとプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＰＣＡ３核酸又はＰＳＡ核酸（たとえば、ｃＤＮＡやｍＲＮＡ）配列とハイブリダイズするもの、及び少なくとも中庸なストリンジェシーの条件下でＰＣＡ３遺伝子やＰＳＡ遺伝子の相同体とハイブリダイズするものである。特定の態様においては、本発明におけるプローブとプライマーはＰＣＡ３遺伝子配列又はＰＳＡ遺伝子配列（たとえば、ｃＤＮＡやｍＲＮＡ）と完全な配列同一性を有するものである。しかし、本来のＰＣＡ３遺伝子配列やＰＳＡ遺伝子配列とは異なるが、ストリンジェントな条件下で本来のＰＣＡ３遺伝子配列やＰＳＡ遺伝子配列とハイブリダイズする能力を保持するプローブとプライマーも本発明で使用することができる。本明細書で開示するＰＣＡ３核酸配列やＰＳＡ核酸配列（配列番号１、２と３６）に基づいて、当業界で知られているコンピューターによるアライメントと配列解析の方法を用いて、他のプローブとプライマーも容易に設計・使用することが可能である点を理解されたい（Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Third Edition, edited by Cold Spring Harbor Laboratory, 2000 を参照）。
たとえば、前立腺癌の悪性状態に関連する短いＰＣＡ３ ＲＮＡと相補的になるようにプライマーを設計することが可能であるが、対する長いＰＣＡ３ ＲＮＡは、非悪性（良性）の状態に関連するものである（WO 01/23550 として公開された PCT/CA00/01154）。本発明によると、このようなプライマーをその他の必要な試薬とともに用いることによって、前立腺癌に関連する短いＰＣＡ３ ＲＮＡがサンプル中に存在する時にのみ増幅産物を生じる。より長いＰＣＡ３（たとえば、介在配列を有するもの）はアンプリコンを生じない。当然のことながら、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡの短いもの（全部又は大部分のイントロンを欠くもの）と長いもの（少なくとも１つのイントロン又はその一部を有するもの）を増幅するように増幅反応を設計することもできる。このような形式においては、長いＰＣＡ３ ｍＲＮＡを第２前立腺特異的マーカーとして用いることができる。
他の態様においては、ＰＣＡ３又はＰＳＡに特異的なプライマーペア（又はプローブ）を、ＰＣＡ３遺伝子又はＰＳＡ遺伝子あるいはスプライシングを受けていないＰＣＡ３ ＲＮＡ又はＰＳＡ ＲＮＡの検出を防止するように設計することができる。たとえば、本発明で使用することのできるプライマー配列は、ＰＣＡ３遺伝子又はＰＳＡ遺伝子のエクソン／イントロンジャンクションにハイブリダイズできないように、２つの連続したエクソンにわたるものでもよい。このようなプライマーを用いて得られる増幅産物は、選択した２つのエクソンの間のイントロンを有していない（このようなプライマーとプローブの具体例については下記の表２〜４を参照）。したがって、スプライシングを受けていない変異体とゲノムＤＮＡは増幅されない。当業者は、種々のプローブの設計が可能であり、本発明の多様な態様に基づいて使用することができる点を理解するであろう。このような試験は、ＰＣＡ３の配列や第２前立腺特異的マーカーの配列を用いて適合させることができる。当然ではあるが、異なるプライマーペア（及びプローブ）を、ＰＣＡ３配列（配列番号１と２）のいかなる部分からも設計することができる（ＰＣＡ３の増幅や検出に用いることのできるプライマーやプローブの非限定的な例については、表１〜３を参照）。当然ではあるが、プライマーやプローブを、配列番号３８に示したＰＳＡの配列（GenBankTM アクセッション番号Ｍ２７２７４）、のみならずカリクレインファミリーの他の核酸の配列や、選択した他のいかなる第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＫＬＫ２（GenBankTM アクセッション番号ＮＭ００５５５１）、ＰＳＭＡ（GenBankTM アクセッション番号ＢＣ０２５６７２）、トランスグルタミナーゼ４（GenBankTM アクセッション番号ＢＣ００７００３）、酸ホスファターゼ（GenBankTM アクセッション番号ＢＣ０１６３４４）、ＰＣＧＥＭ１（GenBankTM アクセッション番号ＡＦ２２３３８９））からも設計することができる。
本発明におけるプローブとしては、天然に存在する糖−リン酸主鎖を有するものに加えて、ホスホロチオエート、ジチオネート、アルキルホスホネート、α−ヌクレオチドなどを含む修飾した主鎖を有するものも用いることができる。修飾した糖−リン酸主鎖の一般的な説明は、Miller, 1988, Ann. Reports Med. Chem. 23:295 及び Moran et al., 1987, Nucleic Acids Res., 14:5019 に記載されている。本発明におけるプローブは、リボ核酸（ＲＮＡ）とデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれで構成されていてもよいが、ＤＮＡが好ましい。
本発明は特定の核酸配列の検出における標識の使用に特に依存するわけではないが、このような標識は検出感度を上げるので有利である。更に自動化も可能となる。プローブは種々の公知の方法（上記の Sambrook et al., 2000）に従って標識することができる。検出可能なマーカーや標識の具体例としては、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐと35Ｓ、リガンド、蛍光団、化学発光性試薬、酵素及び抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。プローブと共に用いる他の検出可能なマーカーであって、本発明の方法の感度を向上させるものには、ビオチンと放射性核種が挙げられる。当業者には、特定の標識の選択がプローブに結合する様式を支配することは明かである。
広く知られているように、放射性核種は、いくつかの方法で本発明で使用するプローブに取り込むことができる。このような方法の例としては、γ−32Ｐ ＡＴＰとポリヌクレオチドキナーゼを用いてプローブの５’末端をリン酸化する方法、放射性ｄＮＴＰの存在下で E. coli Pol I の Klenow 断片を用いる方法（たとえば、ランダムなオリゴヌクレオチドプライマーを用いて均一に標識したＤＮＡプローブ）、１種以上の放射性ＮＴＰの存在下で、ＳＰ６／Ｔ７システムを用いてＤＮＡセグメントを転写する方法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
１つの態様においては、ホモジニアス検出アッセイで用いる標識は化学発光性の化合物（たとえば、U.S. Pat. No. 5,656,207、No. 5,658,737 及び No. 5,639,604）であり、より好ましくはアクリジニウムエステル（“ＡＥ”）化合物、たとえば、標準ＡＥやその誘導体である。核酸に標識を付加する方法及び標識を検出する方法はよく知られている（たとえば、Sambrook et al., “Molecular Cloning - A Laboratory Manual”, 2nd ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）の第１０章；U.S. Pat. No. 5,658,737、No. 5,656,207、No. 5,547,842、No. 5,283,174 及び No. 4,581,333；並びにEuropean Pat. App. No. 0 747 706を参照）。リンカーを介して結合したＡＥ化合物でプローブを標識するための好ましい方法は、他で詳細に説明されている（たとえば、U.S. Pat. No. 5,639,604 の実施例８を参照）。
選択した、即ち標的となる、核酸配列の増幅は、種々の適切な方法で実施することができる。一般的な記載については、Kwoh et al., 1990, Am. Biotechnol. Lab. 8:14-25 を参照されたい。数多くの増幅方法が報告されており、当業者の特定の要求に見合うように容易に適応させることができる。増幅技術の例にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲなど）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介性増幅、Ｑβレプリカーゼシステム及びＮＡＳＢＡ（Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173-1177；Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6:1197-1202；Malek et al., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253-260；及び上記の Sambrook et al., 2000）が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明を限定することのない、他の増幅方法については、上記で例示した。
増幅産物の存在を検出するのに適した方法の例として次の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない：アガロースゲル又はポリアクリルアミドゲルを用いる方法、及び、ＤＮＡ標識色素（臭化エチジウム、ピコグリーン（picogreenTM）、ＳＹＢＥＲグリーンなど）を増幅反応系に添加し、適切な装置（ほとんどの場合は蛍光測定装置）を用いて検出する方法。その他の適切な方法としては、（手動または自動の）シークエンシング反応、（制限部位を増幅配列に組み込む）制限部位分析、又は配列特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションを含む方法（サザンブロット法、ノーザンブロット法、TaqManプローブや分子ビーコンの使用など）が挙げられる。当然であるが、他の増幅方法も本発明に含まれる。本発明の方法に従って増幅産物を検出する方法の一例として、分子ビーコンの使用を例示した（下記参照）。
当然であるが、いくつかの態様においては、特異的なプローブやプライマーを用いて、サンプル中のＰＣＡ３癌特異的配列に加えて他の前立腺特異的マーカー（たとえばＰＳＡ）を直接（たとえば、シークエンシングによって）検出することができる。
１つの態様において本発明は、核酸を検出し同定するための方法における技術の進歩を利用する。したがって、このような進歩した技術の１つである分子ビーコンと呼ばれるツールも、本発明における検出に適切である。
分子ビーコンは、ステムループ構造を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドからなるハイブリダイゼーションプローブ／プライマーである。ループは、標的配列に相補的なプローブ配列を含有し、ステム部分は、プローブ／プライマー配列のそれぞれの端に位置する相補的なアーム配列のアニーリングによって形成されるものである。蛍光団が１本のアームの末端に共有結合しており、もう一方のアームの末端にはクェンチャーが共有結合している。分子ビーコンは、溶液中で遊離状態では蛍光を発しない。しかし、標的配列を含む核酸鎖にハイブリダイズすると、強く蛍光を発することが可能な立体構造の変化を生じる（US Patent 5,925,517及び6,037,130を参照）。分子ビーコンはアンプリコン検出用プローブ／プライマーとして診断アッセイに用いることができる。ハイブリダイズしていない分子ビーコンは暗いので、たとえば、アッセイの途中で合成されたアンプリコンの数を求めるために、プローブ−標的ハイブリッドを単離する必要がない。したがって、分子ビーコンの使用は、従来の検出及び同定手段を用いた際には大概必要な操作を簡略化する。
異なる色の蛍光団を用いることで、たとえば、ＰＣＡ３核酸と第２前立腺特異的核酸（たとえば、ＰＳＡ（GenBankTM アクセッション番号Ｍ２７２７４、配列番号３８）、ｈＫ２／ＫＬＫ２（GenBankTM アクセッション番号ＮＭ００５５５１）、ＰＳＭＡ（GenBankTM アクセッション番号ＢＣ０２５６７２）、トランスグルタミナーゼ４（GenBankTM アクセッション番号ＢＣ００７００３）、酸ホスファターゼ（GenBankTM アクセッション番号ＢＣ０１６３４４）及びＰＣＧＥＭ１（GenBankTM アクセッション番号ＡＦ２２３３８９））を同時に増幅し検出することを目的としたアッセイなどの多重増幅アッセイにも分子ビーコンを用いることができる。分子ビーコン プローブ／プライマーの設計は当業界でよく知られており、設計の支援を目的としたソフトウエアが市販されている（たとえば、Premier Biosoft International 製の Beacon designer）。分子ビーコン プローブ／プライマーは種々のハイブリダイゼーション及び増幅アッセイ（たとえば、ＮＡＳＢＡ法とＰＣＲ法）に用いることができる。
本発明の１つの態様によると、増幅産物は、分子ビーコンをプライマーとして用いた増幅アッセイ（たとえば、リアルタイム多重ＮＡＳＢＡやＰＣＲアッセイ）によって直接検出するか、プライマーペア結合部位の内部配列として、増幅産物に特異的にハイブリダイズする１８〜２５（たとえば、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４か２５）ヌクレオチドの長さの分子ビーコンプローブを用いて間接的に検出する。本発明で使用する際には、１８ヌクレオチドと２５ヌクレオチドの間の長さの分子ビーコン プローブやプライマーが好ましい（Tyagi et al., 1996, Nature Biotechnol. 14: 303-308）。より短い断片は少ない蛍光シグナルしかもたらさず、一方、より長い断片だからといって、大概の場合、シグナルが著しく増加することはない。しかし、当然ではあるが、より短いものやより長いものも、プローブやプライマーとして用いることができる。
ＰＣＡ３ ＲＮＡ配列から誘導することのできる核酸プライマーの具体例を、以下の表２〜４に示した。
ＰＳＡ（たとえば、配列番号１１）から誘導することができる核酸プライマーの例として、後述のようにＲＮＡ配列が挙げられる。本発明で用いることのできる他のプライマーも、ＰＳＡから誘導することができる。もちろん、当業界においてよく知られている他の変異体も、第２前立腺特異的マーカーとして用いることができる（US Patent 6,479,263 及び 5,674,682）。ＰＳＡ遺伝子はカリクレイン遺伝子ファミリーに属する他の核酸と構造及び配列上の類似性を示すので、ＰＳＡ特異的なプローブやプライマーとして働くＰＳＡ配列を適宜選択することは、ＰＳＡ特異的核酸を増幅及び／又は検出する方法において重要である。ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡの増幅及び検出に適したプライマーの例（たとえば、US Patent 6,551,778）は当業界でよく知られており、その他にもトランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼ及びＰＣＧＥＭ１に適したプライマーについてもよく知られている。１つの態様においては、ＰＳＡオリゴヌクレオチドは、カリクレイン２（ｈＫ２／ｈＫＬＫ２）などのカリクレインファミリーに属する他のマーカーにハイブリダイズするものでもよい。このようなオリゴヌクレオチドの一例は配列番号１２である。
表２〜４に示したプライマーの配列やサイズは任意であり、本発明に従って多様な他の配列を設計し、使用することができる。
本発明は、ＰＣＡ３配列を標的とするプローブ（本発明で説明したＰＣＡ３のエクソンジャンクションなど）を用いることなく実施することもできるが、このようなプローブは、本発明の方法及びキットに更なる特異性を付与することができる。本発明で使用することのできる（そして表２のエクソン配列に基づいて設計することのできる）特異的核酸プローブの具体例を以下の表３に示したが、これらに限定されるものではない。
一般的に、増幅反応に用いるプライマーの１つは第１エクソン（または上流エクソン）内の配列に特異的にハイブリダイズし、増幅反応に用いるもう一方のプライマーは第２エクソン（または下流エクソン）内の配列に特異的にハイブリダイズし、プローブは第１エクソンの３’領域から第２エクソンの５’領域に架かる配列にハイブリダイズする。即ち、プライマーがハイブリダイズする上流と下流のエクソン配列の間に存在するイントロンの少なくとも１つを欠くスプライスされたＰＣＡ３ ＲＮＡから得た、増幅配列内の選ばれたエクソン−エクソンジャンクションにプローブは特異的である。選ばれたエクソン−エクソンジャンクションを含有するスプライスされたＲＮＡの配列を増幅するために用いるプライマーは、一対のプライマーで増幅される領域がエクソン−エクソンジャンクション配列又はその相補的配列を含有する限り、標準的な方法で容易に決定することができる。選ばれたエクソン−エクソンジャンクションを含有する配列を増幅するためにはいかなる核酸増幅方法を用いてもよく、種々のよく知られた増幅方法を用いる手順を当業者は容易に決定することができる。
選ばれたエクソン−エクソンジャンクションを検知するプローブは、プローブがエクソン−エクソンジャンクションを含有する増幅配列にハイブリダイズした際に直接又は間接的にシグナルをもたらすような種々の標識物質で標識してもよい。たとえば、標識物質は、公知の方法で検知可能な比色性、発光性、蛍光性、放射性又は酵素性のシグナルを発生する分子種でよい。プローブは、エクソン−エクソンジャンクションを含有する増幅配列に対してプローブが特異的に結合した結果、検知可能なシグナル、たとえば検知可能な電気刺激を発生する場合には、標識分子種で標識する必要はない。
エクソン−エクソンジャンクションを含有する核酸配列を増幅するための増幅用プライマーペアの組み合わせの具体例、及びエクソン−エクソンジャンクソン用プローブ配列のいくつかの態様について表４に示した。当業者であれば、下記に示すプローブ配列の開示には、開示した配列の相補的配列や、開示した特定の配列にあまり重要ではない変更（即ち、標準的なハイブリダイゼーション条件下でプローブが選ばれたエクソン−エクソンジャンクション配列に特異的にハイブリダイズする能力に影響を与えない変更）を加えた配列も包含されることを理解するであろう。更に、プローブ配列はＤＮＡ配列として開示したが、当業者であれば、対応するＲＮＡ配列やその相補配列もプローブとして使用可能であることを理解するであろう。また、プローブ塩基配列の主鎖には１つ以上の標準的なＲＮＡ連鎖、ＤＮＡ連鎖、ＲＮＡ−ＤＮＡ混合連鎖、又は２’−Ｏ−メチル連鎖やペプチド−核酸連鎖などの他の連鎖が含まれていてもよく、これらは当業者に広く知られているものである。
表４（第１欄）に示したように、検知すべき選ばれたエクソン−エクソンジャンクションはエクソン１と２（エクソン１／エクソン２）、エクソン１と３（エクソン１／エクソン３）、エクソン２と３（エクソン２／エクソン３）又はエクソン３と４（エクソン３／エクソン４）を結合する。プライマーペアは、選ばれたエクソン−エクソンジャンクションに直接又は間接的に隣接する２つの異なるエクソンに位置する配列である（表４、第２欄）。したがって、エクソン１／エクソン２ジャンクションに対するプライマーペアは、エクソン１に含まれる配列に特異的な１つのプライマーとエクソン２に含まれる配列に特異的な他のプライマーとのペアである。しかし、エクソン２／エクソン３ジャンクションやエクソン３／エクソン４ジャンクションを検知する場合には、増幅した配列が選ばれたエクソン−エクソンジャンクション領域を含む限り、プライマーペアは２種を超えるエクソンから選択してもよい（下記表の第２欄を参照）。「エクソン４」プライマーとしては、エクソン４ａ、４ｂ、４ｃ及び４ｄの配列のいずれかに含まれる配列に特異的なプライマーが挙げられる。
当然であるが、当業者が理解するように、多様な更なるプローブを、配列番号１に加え、配列番号２と３８や本発明における他の配列の同じ又は異なる領域から設計することが可能であり、それらはエクソンジャンクションを標的としてもよいし、しなくてもよい。表２及び３に示したプライマーのサイズは任意であり、本発明に従って多様な他の配列を設計し、使用することもできることは明らかである。
本発明における核酸配列（たとえば、プローブとプライマー）は、当業界で知られている数々の確立されたキットの形態に組み込むことが可能であることを、当業者は容易に理解するであろう。
上述した方法の１つの態様においては、核酸プローブは固体支持体に固定化されている。このような固体支持体の例としては、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロースやセファロースなどの炭水化物錯体、ポリアクリルアミドなどのアクリル樹脂やラテックスビーズが挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸プローブをこのような固体支持体に固定する方法は当業界でよく知られている。
本発明で実施する核酸プローブ法に適した試験サンプルの例としては、細胞、細胞の核酸抽出物、及び体液（たとえば、尿）が挙げられる。上述した方法で使用するサンプルは、アッセイの形式、検出方法、並びに分析する組織、細胞や抽出物の性質によって異なる。細胞の核酸抽出物を調製する方法は当業界ではよく知られており、使用するアッセイ方法に適合するように抽出方法を対応させることは容易である。好ましいサンプルは尿サンプルである。尿サンプルを使用する時には、本発明で使用する前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＣＡや３ＰＳＡ）の同定を可能にするために、少なくとも１つの前立腺細胞がサンプルに含まれていなければならない。実際、未処理の生物学的サンプルに含まれるＰＣＡ３ ｍＲＮＡの半減期が、この配列の完全性を容易に保存するには適していないと想定すると、採取したサンプルには、尿でもそれ以外のものでも、処理前に少なくとも１つの前立腺細胞が含まれていなければならない。サンプル中の細胞数は試験の判定と測定したＰＣＡ３（又はＰＳＡや他の第２前立腺特異的マーカー）の相対的存在量に影響を与える。
サンプル中のＰＣＡ３ ｍＲＮＡとＰＳＡ ｍＲＮＡを検出するためのキット
別の態様においては、本発明は、高感度であり且つ特異的な（即ち、偽陽性の数を低減した）、前立腺癌を診断するためのキットに関する。このようなキットは、通常、前立腺癌特異的ＰＣＡ３核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプローブ又はオリゴヌクレオチドプライマーを収容する第１の容器を包含する。１つの態様においては、本発明は、ＰＣＡ３の示す陰性の検出結果を判定するだけでなく、ＰＣＡ３の量比の決定をも可能にする、第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＳＡ）に特異的なオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーを収容する第２容器を更に包含するキットに関する。別の態様においては、本発明は、サンプル中の前立腺癌細胞の存在を確認することを可能にする、さらなる前立腺特異的マーカーに特異的な抗体を、該第２容器にさらに収容するキットに関する。
本発明の特定の態様においては、このキットは、ＰＣＡ３と、ＰＳＡ、ｈＫ２／ＫＬＫ２、ＰＳＭＡ、トランスグルタミナーゼ４、酸ホスファターゼ及びＰＣＧＥＭ１からなる群より選ばれる少なくとも１種の前立腺特異的マーカーとの増幅を可能にするプライマーペアを包含する。好ましい態様においては、この前立腺特異的マーカーはＰＳＡ核酸又はＰＳＡタンパク質である。当然のことながら、第３の前立腺特異的マーカーの使用も本発明の範囲に含まれる。
キットのオリゴヌクレオチド（プローブやプライマー）は、たとえば、ＮＡＳＢＡ法、ＰＣＲ法やハイブリダイゼーションアッセイに用いることができる。増幅アッセイは、複数の増幅産物のリアルタイムの検出（即ち、多重リアルタイム増幅アッセイ）に適合させることができる。
関連する特定の態様においては、キットは補助成分を収容する他の容器を更に包含し、補助成分は、更なるオリゴヌクレオチドやプライマー及び／又は下記群から選ばれる少なくとも１種である：緩衝剤、アッセイに使用する試薬（たとえば、洗浄試薬、ポリメラーゼ、内部対照核酸や内部対照細胞）、及び結合した核酸プローブや核酸プライマーの存在を検出することを可能にする試薬。検出試薬の例としては、放射性標識プローブ、酵素標識プローブ（西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）や親和性標識プローブ（ビオチン、アビジンやストレプトアビジン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。もちろん、試薬を同一の又は異なる容器に分けて入れるかまとめて入れるかは、抽出法、増幅法又はハイブリダイゼーション法の種類、使用する検出方法に加えて、試薬の安定性、保存料の必要性などの他のパラメーターによって決まる。上述した容器と試薬を異なる組み合わせにしたものも本発明の範囲内であることを理解されたい。キットは、ＰＳＡ ｍＲＮＡレベルに対するＰＣＡ３ ｍＲＮＡレベルの比を特定の診断、予後判定、テラノーシス又は用途と相関させることを利用した、実施可能な診断、予後判定、テラノーシス又は用途に関する説明書を含んでいてもよいし、この説明書はさらに、使用する実験のプロトコルに関する情報を含んでいてもよい。
１つの態様においては、検出試薬は、増幅産物に特異的に結合する分子ビーコンプローブである。他の態様においては、検出試薬は、アクリジニウムエステル（ＡＥ）などの化学発光性化合物である。
たとえば、本発明に従って区分けされたキットとしては、試薬類が別々の容器に収容されたキットが挙げられる。このような容器の例としては、小さなガラス容器、プラスチック容器や、プラスチック又は紙のストリップが挙げられる。このような容器は、サンプルと試薬が互いに汚染することなく、試薬が１つの区分から別の区分へ効率よく移動することを可能にし、各容器内の試薬や溶液は、定量的に１つの区分から別の区分に添加することが可能である。このような容器の例としては、試験サンプル（たとえば、生物学的サンプルや細胞のＲＮＡ抽出物）を許容する容器、アッセイに使用するプライマーの入った容器、酵素の入った容器、洗浄試薬の入った容器、伸長産物を検出するために用いる試薬の入った容器が挙げられる。上述したように、試薬類の分離や組み合わせは、好ましいキットの種類（たとえば、増幅法、ハイブリダイゼーション法又はその両方に基づく診断キット）、使用する試薬の種類及びそれらの安定性や他の本来の性質に基づいて、本発明の属する技術の分野の当業者が適応させることができる。１つの態様においては、１つの容器に増幅試薬が入っており、別の容器に検出試薬が入っている。別の態様においては、増幅試薬と検出試薬が同じ容器に入っている。
キットは、サンプルから標的核酸を精製するためのキャプチャー用オリゴマーとして働くオリゴヌクレオチドを含有してもよい。キャプチャー用オリゴマーの例としては、ＰＣＡ３標的核酸の一部に相補的な、少なくとも１５ヌクレオチドからなる配列が挙げられる。キャプチャー用オリゴマーの態様によっては、標的核酸を捕捉するためのハイブリダイゼーション工程において機能する、ＰＣＡ３標的配列に相補的な配列の３’又は５’末端に更なる塩基が付加していてもよい。このような付加的な配列としては、ポリＡ配列やポリＴ配列などのホモポリマーテール配列が好ましいが、他の態様のテール配列も本発明におけるキャプチャー用オリゴマーに含まれる。１つの態様においては、ＣＡＰ結合タンパク質（たとえば、ｅＩＦ４Ｇ−４Ｅ）やその部分を、ｍＲＮＡを含有するキャップ構造を捕捉するのに用いることができる（Edery et al., 1987,Gene 74(2): 517-525）。他の態様においては、非特異的なキャプチャー試薬（たとえば、シリカビーズ）を用いる。
本発明の方法を実施するのに有用なキットとしては、本明細書で開示する増幅用オリゴヌクレオチド及び／又は検出用プローブを、他の試薬と共にパッケージに含むキットが挙げられる。キットは、サンプルからＰＣＡ３標的核酸を精製するためのキャプチャー用オリゴマーを更に含んでいてもよく、キャプチャー用オリゴマーは増幅用オリゴヌクレオチド及び／又は検出用プローブと共にパッケージに含まれてもよい。最後に、キットは、本発明の診断、テラノーシス及び／又は予後判定のための方法を実施するための説明書をさらに含んでいてもよい。このような説明書は、実験のプロトコルに関する詳細のみならず、使用するカットオフ値に関する詳細を含んでいてもよい。
更なる態様においては、丁寧な直腸指診（ＤＲＥ）の後に排泄した尿から得た尿サンプルに含まれる細胞を採取し、溶解緩衝液中で溶解する。そして核酸を抽出する（たとえば、シリカビーズなどを用いた固相抽出法によって細胞溶解物から抽出する）。核酸抽出物からＰＣＡ３遺伝子のコードするＲＮＡの存在を検出する方法としては、in vitro 特異的ＲＮＡ増幅法を、特異的な蛍光プローブを用いて増幅産物をリアルタイムで検出する方法と組み合わせて用いる。この方法では、ＰＣＡ３前立腺癌特異的ＲＮＡの増幅と同時に、尿サンプル中に前立腺細胞が存在することを確認するための対照として用いる第２前立腺特異的マーカー（たとえば、ＰＳＡ ＲＮＡ）の増幅も行う。
本発明のスクリーニング方法及び診断方法は、全長ＰＣＡ３ ＲＮＡ配列の検出を必要としない。むしろ、正常又は病気の個体にＰＣＡ３核酸が存在すること、この核酸が存在しないこと、又はこの核酸の変化した形態（たとえば、異常なスプライシングパターン）を検出するのに十分な核酸の断片若しくは長さのみを検出すればよい。このような目的には、上述したいずれのプローブやプライマーを用いてもよく、更に多種にわたるものも、本明細書で開示する配列や当業界で公知の配列に基づいて、当業界で知られているように設計することができる。
以下の考察は特にヒト患者に関するものであるが、本願の教示はＰＣＡ３を発現するいかなる動物にも適応可能であることを理解されたい。
本発明の方法は、上述のような患者における前立腺癌の進行をモニターするのにも用いることができる。
本発明を、以下の本発明を限定することのない実施例によってさらに詳しく説明する。実施例は、説明のために記載しているに過ぎず、本発明を限定するものではない。
ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比は、生検から求めた組織学的グレードと相関する
ＰＣＡ発現レベルとＰＳＡ発現レベルとの比が、予後判定及びテラノーシスに有用であるかどうかを判定するために、血清ＰＳＡレベルの上昇（即ち、ＰＳＡレベル ＞ ３ｎｇ／ｍｌ）を指標とした１５０名の患者について、超音波ガイド生検及び悪性腫瘍の有無の組織学的判定についての研究を行った。研究に関する説明を受けた上で同意した患者を、本研究の対象とした。超音波ガイド生検及び組織学的グレード分析により、４９名の患者において癌を同定し、確認した。その多くは、現在、生物学的侵襲性の評価が最も困難であると考えられているＧＳ（グリーソンスコア）の範囲に分類された（即ち、生検のＧＳが６か７の患者が３８名）。
経直腸指診（extended DRE）の後の尿沈渣について、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比を評価し、この比の生物学的侵襲性との相関性を検討した。ＰＳＡ ｍＲＮＡレベルは、サンプル内の前立腺由来細胞の総数を補正して試験結果を正規化するために用いた。
図３においては、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比を組織学的グレードと対比した。ＧＳ（グリーソンスコア）が５〜８の患者では、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比のレベルとＧＳとの間に相関関係が存在することが明らかである。グリーソンスコア４及び５においては、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比の平均値は４１であり、グリーソンスコア６における上記平均値は１６３であり、グリーソンスコア７における上記平均値は１９３であり、グリーソンスコア８における上記平均値は５７７である（図３参照）。グリーソンスコア９の３例においては、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比は減少しているようである。
次に、上記評価結果が陽性（真陽性）の症例群と陰性（偽陰性）の症例群に関して、グリーソングレードの分布を分析した（図４参照）。この分析の結果は、経直腸指診後の尿沈渣を用いたＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比の評価は、グレードの高い癌においてより有意に陽性の結果をもたらすことを示している。上記のような検証結果により、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比は予後判定の指標と成り得ることを確認した。
尿沈渣を用いたＰＣＡ３遺伝子分析は予後判定に有用である
血清ＰＳＡレベルの上昇した（即ち、ＰＳＡレベル ＞ ３ｎｇ／ｍｌ）患者約３００名からなる新たなコホートに対し、実施例１と同様の研究を行った。研究に関する説明を受けた上で同意した患者を、本研究の対象とした。組織学的検証を目的として、悪性腫瘍の有無を判定するための超音波ガイド生検を行った。生検の病理組織学的評価により、１０８名の患者において癌を同定した。癌の組織学的特徴を、生検の直前に得たサンプルのＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比と比較した。
図５及び６から明らかなように、グリーソンスコア（即ち、グリーソングレードの和）とＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比のレベルとの間には明確な相関関係が存在する。次に、上記評価結果が陽性（真陽性）の症例群と陰性の症例群に関して、グリーソングレードの分布を分析した。各グレードについての感度は、閾値を１３２×１０-3として求めた。グレード（侵襲性）の高い癌ほど、高感度で検出された。換言すれば、偽陰性結果が得られたのは、真陽性結果が得られた症例よりも有意に低いグレードの症例だった（図７及び８参照）。
上記のことから、経直腸指診後の尿沈渣から検出したＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比は、テラノーシス、診断及び予後判定に非常に有用であることが明らかである。
病理組織学的パラメーター及びＰＣＡ３試験結果の詳細な分析
ＰＣＡ３遺伝子の発現は、前立腺特異的であり、前立腺癌細胞においては、悪性でない前立腺細胞における場合と比較して強くアップレギュレートされている。実施例１及び２においては、ＰＣＡ３遺伝子に基づいた分析は、経直腸指診後の尿沈渣から前立腺癌細胞を検出することができることを証明した。したがって、ＰＣＡ３遺伝子が、前立腺癌の診断に非常に有用であることが分かった。また、実施例１及び２において、より侵襲性が高い腫瘍はより高い浸潤性を示しながら増殖し、より多くの癌細胞が前立腺導管へ流入することが明らかになり、ＰＣＡ３遺伝子に基づいた分析は、生検におけるグリーソンスコアの増加と相関があり、それ故予後判定の指標として有用であることも証明した。このサブグループの分析において、前立腺の全摘標本に関する病理組織学的パラメーターをＰＣＡ３遺伝子に基づいた分析の結果と相関させた。
病院において、前立腺癌患者からなるコホートは、研究に関する説明を受けた上で試験への参加に同意した。これらの患者の内、４８名に前立腺全摘出術を施した。前立腺の全摘標本に関する病理組織学的パラメーターを、手術前に得た尿沈渣のＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比と比較した。全ての予後判定パラメーターを比較した。
図９から明らかなように、前立腺の全摘標本の総腫瘍体積とＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比のレベルとの間には相関関係が存在した。
上記のことから明らかなように、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比は、前立腺癌患者における総腫瘍体積の予後判定に使用することができ、したがって、前立腺癌のステージ／グレード及び侵襲性の予後判定に使用することができる。ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比を用いることにより、腫瘍のグレードを決定することのみならず、腫瘍のサイズを評価することもできる。ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比分析の結果、各患者に適した治療法を決定することができる。更に、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比を用いることにより、前立腺癌の帰結のより正確な予後判定を行うことが可能となる。
ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ及びＰＳＡ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイ
試薬及び方法
組織サンプル
前立腺の全摘標本を、カニシウス ウィルヘルミナ病院 ネイメーヘン（Canisius Wilhelmina Hospital Nijmegen）及びユニバーシティ メディカル センター ネイメーヘン（University Medical Center Nijmegen)より入手した。正常な前立腺、前立腺肥大、及び前立腺腫瘍の標本は新鮮なまま入手し、液体窒素で瞬間冷凍し、ステップ切片法（step sectioning）により加工した。一定の時間間隔でヘマトキシリン・エオジン染色を行い、組織切片中の正常な前立腺細胞、前立腺肥大細胞、及び前立腺腫瘍細胞の割合（％）を決定した。上記２つの病院の病理科において、上記の腫瘍のグリーソンスコア及びＴＮＭ分類を決定した。ＬｉＣｌ−尿素法（２２）を用いて、上記の組織標本から総ＲＮＡを抽出した。
ＰＣＡ３ ＲＮＡ及びＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡの製造
内部標準物質（ＩＳ−ＰＣＡ３）を、Promega社製の“GeneEditor”in vitro 部位特異的変異導入システム（“GeneEditor”in vitro site-directed mutagenesis system）を用いて構築した。ＰＣＡ３ ｃＤＮＡ構築物（ｐＭＢ４５）の、ＰＣＡ３ ｃＤＮＡ（GenBankTM ＃ＡＦ１０３９０７）の４１６番〜４１８番塩基に相当する位置に３つの置換（ＴＣＣからＣＧＴへの置換）を導入した。変異は、ＤＮＡ配列分析によって確認した。
直鎖化したｐＭＢ４５プラスミドＤＮＡ及び直鎖化したｐＭＢ４５−変異プラスミドＤＮＡを、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ（Roche Diagnostics 社製）を用いた in vitro 転写反応のテンプレートとして用いた。In vitro で調製したＲＮＡは、ＤＮａｓｅ−Ｉで処理し、フェノール抽出で精製し、沈殿させ、そしてジエチルピロカーボネート処理水に溶解した。ＲＮＡの濃度の測定及び完全であることの確認は、標準ＲＮＡを用いたアガロースゲル電気泳動によって行った。得られたＲＮＡは分取して−７０℃で保管した。
逆転写酵素反応
組織ＲＮＡ並びに in vitro で調製したＰＣＡ３ ＲＮＡ及びＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡを、一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Amersham Biosciences 社製）を用いたｃＤＮＡ合成用のテンプレートとして使用した。ＰＣＡ３ ＲＮＡ及びＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡは、キャリアＲＮＡ溶液として使用した、０．２ｍｇ／ｍｌの E. coli ｔＲＮＡ（Roche Diagnostics 社製）で希釈した。拡張した検量曲線（extended calibration curve）を作成するために、５×１０3コピーのＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡを種々の量（５０〜１×１０7コピー）のＰＣＡ３ ＲＮＡと混合した。組織サンプル中のＰＣＡ３を定量するために、総ＲＮＡを５×１０3コピーのＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡと混合した。得られたＲＮＡ混合物を６５℃で１０分間加熱し、続いて氷冷した。その後、０．２μｇのユニバーサル オリゴ‐ｄ(Ｔ)１８プライマー、２ｍＭのＤＴＴ及びバルク一本鎖反応混合物（Bulk 1st strand reaction mixture）（Amersham Biosciences 社製）を加え、最終反応容量を１５μｌとした。サンプルは、３７℃で１時間インキュベートし、得られたｃＤＮＡサンプルを９５℃で５分間加熱した。
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲ増幅を、以下のＰＣＡ３‐特異的プライマーを用いて行った：フォワードプライマーは、5’-TGGGAAGGACCTGATGATACA-3’（配列番号４０、ＰＣＡ３ ｃＤＮＡのエクソン１の９７番〜１０８番ヌクレオチド、GenBankTM ＃ＡＦ１０３９０７）、そしてリバースプライマーは、5’-CCCAGGGATCTCTGTGCTT-3’（配列番号４１、ＰＣＡ３ ｃＤＮＡのエクソン３からエクソン４に亘る４５９番〜４７７番ヌクレオチド）。リバースプライマーは、ビオチン化した。５μｌのｃＤＮＡサンプルを、１００μｌのＰＣＲ反応用混合液中で増幅した。上記のＰＣＲ反応用混合液は、０．１３３μＭのリバースプライマー、０．０６５μＭのビオチン化リバースプライマー、０．２μＭのフォワードプライマー、２５０ｍＭのデオキシヌクレオチド三リン酸（Roche Diagnostics 社製）及び２Ｕの Super TaqTM ポリメラーゼ（HT Biotechnology LTD 社製）を、１．５ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭのTris-HCl（pＨ ８．３）、５０ｍＭの塩化ナトリウム及び０．１％の Triton X-100 からなる緩衝液に溶解したものである。反応用混合液にミネラルオイルを重層し、Thermal CyclerTM（PerkinElmer Lifesciences Inc. 製）を用いて、以下の条件下でサーモサイクリングを行った：初めに９５℃で２分、次に９５℃で１分、６０℃で１分、そして７２℃で１分を３５サイクル、最後の伸長反応を７２℃で１０分。
ハイブリダイゼーションアッセイ
得られたＰＣＲ産物をミネラルオイルから精製した。各ＰＣＲ産物は、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイタープレート（InnoTrac Diagnostics 社製）の３つのウェルにそれぞれ１０μｌずつ加えた。１．５ＭのＮａＣｌを含む５０μｌのDELFIARアッセイ緩衝液を各ウェルに加えた。ビオチン化したＰＣＲ産物を、室温で１時間、ゆっくり振盪しながら、ストレプトアビジンで被覆したウェルに捕捉した。その後、サンプルを、DELFIAR洗浄液で３回洗浄した。二本鎖ＰＣＲ産物を変性するために、１００μｌの５０ｍＭ ＮａＯＨ溶液を用いて、サンプルを室温で５分間ゆっくり振盪した。サンプルをDELFIAR洗浄液で３回洗浄することにより、変性した遊離ＤＮＡ鎖を除去した。１．５ＭのＮａＣｌと５ｇ/リットルの脱脂粉乳を含むDELFIARアッセイ緩衝液の溶液とした、Ｅｕ3+で標識したＰＣＡ３検出用プローブ（配列番号４２、5’(modC)20CACATTTCCAGCCCCT-3’）（３０ｐｇ/μｌ）及びＴｂ3+で標識したＩＳ-ＰＣＡ３検出用プローブ（配列番号４３、5’(modC)20CACATTCGTAGCCCCT-3’）（３０ｐｇ/μｌ）を、各ウェルに加えた。検出用プローブは、３７℃で２．５時間放置することにより、捕捉されたＰＣＡ３のＤＮＡ鎖及びＩＳ-ＰＣＡ３のＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせた。サンプルは、室温にて、DELFIAR洗浄液で６回洗浄した。その後、２００μｌのDELFIAR増強溶液（enhancement solution）を各ウェルに加えた。遊離Ｅｕ3+イオンは、DELFIAR（Ｅｕ3+）増強溶液中の成分とともに速やかに高蛍光性で安定なキレートを形成する。ゆっくり振盪しながら室温で３０分間インキュベートした後、Ｅｕ3+キレートの発する蛍光シグナルを１４２０ VictorTM マルチラベルカウンター（Multilabel Counter）で計測した。次に、５０μｌの DELFIAR（Ｔｂ3+）増強溶液を各ウェルに加えて、Ｔｂ３＋による高蛍光性キレートを形成した。ゆっくり振盪しながら室温で５分間インキュベートした後、Ｔｂ3+キレートの発する蛍光シグナルを計測した。尚、上記の DELFIAR 試薬及び１４２０ VictorTM マルチラベルカウンターは、全て Perkin Elmer Life Sciences 社より入手したものである。
統計学的分析
社会科学統計パッケージ（ＳＰＳＳ）を用いて、データを受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）に纏めることにより、ＰＣＡ３のマーカーとしての効力を視覚化した。この曲線において、感度（真陽性率）をＹ軸として、Ｘ軸の１−特異性（偽陽性率）に対してプロットした。この曲線に示した全ての値を、任意に定めたカットオフ値と考えられる。曲線下面積（ＡＵＣ）及びその９５％信頼区間（ＣＩ）を、試験したマーカーによる識別の有効性の指標として計算した。マーカーに識別的な価値がない場合は、ＡＵＣ値は０．５に近く、この場合にはＲＯＣ曲線は対角線に近くなる。マーカーが強い識別力を示す場合には、ＲＯＣ曲線は左上角に近くなる（即ち、ＡＵＣが１に近づく）。
図２Ａ及び図２Ｂは、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比が、強力且つ有効な前立腺癌診断用マーカーであることを示している。
時間分解蛍光測定に基づくＰＣＡ３ ｍＲＮＡの定量：前立腺癌の高感度の予後判定手段
材料及び方法に関しては、実施例４を参照。
ハイブリダイゼーションアッセイの最適化
ＰＣＡ３とＩＳ−ＰＣＡ３のビオチン化したＰＣＲ産物を用いて、ハイブリダイゼーションアッセイの条件を最適化した。標的とそのハイブリダイゼーションプローブの両方に関して、１．５ＭのＮａＣｌ及び５ｇ/リットルの脱脂粉乳の存在下、３７℃で１５０分間インキュベートすることで、シグナル値／バックグラウンド値の比が高い、最適な蛍光シグナルが得られた。塩化ナトリウムはハイブリダイゼーションを促進するために使用し、脱脂粉乳の機能は、非特異的なバックグラウンドシグナルをブロックすることである。上記のストリンジェントな条件下では、３０ｐｇ／μｌの各プローブを用いた場合にハイブリダイゼーションアッセイの効率が最も良かった。
標的とプローブとの間のクロスハイブリダイゼーションの可能性を立証するために、１×１０2〜１×１０7個のＰＣＡ３ ＲＮＡ分子又はＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡ分子をＲＴ-ＰＣＲのテンプレートとして使用した。そして、ビオチン化ＰＣＲ産物をそれぞれのプローブにハイブリダイズさせた。１×１０6個のＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡ分子の増幅後にのみ、ＰＣＡ３プローブは、ＩＳ−ＰＣＡ３標的と僅かな交差反応（０．１％）を示した。上記のような最適化された条件下では、ＩＳ−ＰＣＡ３プローブはＰＣＡ３標的に対して検出可能な交差反応を示さなかった。ＰＣＡ３プローブの僅かな交差反応は、ミスマッチの安定性によるものである。ＩＳ−ＰＣＡ３標的に対するＰＣＡ３プローブの結合は、ＰＣＡ３標的に対するＩＳ−ＰＣＡ３プローブの結合よりも安定である。
ＰＣＲ増幅
ＰＣＲの増幅効率は、各プライマーを０．２μＭ使用した際に最大になった。Ylikoski (1999) は、大過剰量のビオチン化リバースプライマーは、ストレプトアビジン結合部位に対してはビオチン化ＰＣＲ産物と競合するということを示した（２３）。そのため、ビオチン化リバースプライマーの量を減らして用いることにより、ハイブリダイゼーションアッセイの前の増幅産物の希釈工程を省き、増幅産物の検出が信頼できるものとなるようにした。最適なＰＣＲ増幅のために、０．１３３μＭの未標識のリバースプライマー、０．０６５μＭのビオチン化リバースプライマー、及び０．２μＭのフォワードプライマーを用いた。
ＰＣＡ３標的及びＩＳ−ＰＣＡ３標的の両方の増幅効率を求めるために、５×１０3個のＰＣＡ３ ＲＮＡ分子とＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡ分子を、増幅サイクルの回数を変えたＲＴ-ＰＣＲによって増幅した。Raeymaekers (1993) は、ＰＣＲの増幅効率は、次の指数関数的増加を表す式に基づくことを示した：log Nc = log Ni + c[log(1+f)]（ここで、Nc は増幅サイクルを c 回実施することで得られる産物の量であり、Ni は標的の初期量であり、c は増幅サイクルの回数であり、f は増幅効率である）（２４）。Log Nc を増幅サイクルの回数に対してプロットすると、曲線の傾きは log(1+f) となる。ＰＣＡ３標的の増幅効率とＩＳ−ＰＣＡ３標的の増幅効率が一致するならば、２つの曲線の傾きは一致する。ＰＣＡ３ (f=0.63) とＩＳ−ＰＣＡ３ (f=0.64) はともに逆転写され、同一の効率で増幅された（データは示さない）。このことは、ＰＣＡ３／ＩＳ−ＰＣＡ３比の対数を増幅サイクルの回数に対してプロットすることによって確認された。即ち、プロットによって水平の線が得られ、両方の標的の増幅効率が一致することが示された（データは示さない）。
ＰＣＡ３に基づくアッセイの感度と解析範囲は、各サンプルに添加するＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡの量の影響を受ける可能性がある。たとえば、種々の量のＰＣＡ３とともに増幅される内部標準の量が余りに多いと、検出可能なシグナルを発生するのに十分なほどに少量のＰＣＡ３ ＲＮＡをＲＴ-ＰＣＲで増幅することはできない。したがって、技術感度には限界がある。同じことが、高濃度のＰＣＡ３ ＲＮＡの存在下における、非常に少量のＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡのＲＴ-ＰＣＲ増幅にも当てはまる。そこで、ＰＣＡ３標的の増幅とＩＳ−ＰＣＡ３標的の増幅との干渉を、ＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡの量が一定の条件下でＰＣＡ３ ＲＮＡの量を変化させたＲＴ-ＰＣＲ増幅を行うことによって調べた５×１０3個又は５×１０4個のＩＳ−ＰＣＡ３分子について得られる蛍光シグナルは、１×１０2〜５×１０5個のＰＣＡ３分子との共増幅の後でも変わらなかった。１×１０6個を超えるＰＣＡ３分子との共増幅の後で初めて、ＩＳ−ＰＣＡ３とＰＣＡ３の両方の蛍光シグナルが僅かながら減少した（データは示さない）。この現象は、ＰＣＲの最中の２種の標的分子の競合と、ＰＣＲ反応が飽和状態に達したこととによるものである。これらのデータは、ＰＣＡ３との共増幅に上記のいずれのＩＳ−ＰＣＡ３濃度を用いても、ＰＣＡ３の定量のための広い直線範囲を得ることができるということを示している。種々の量のＩＳ−ＰＣＡ３を一定量のＰＣＡ３と共増幅したときにも、同様の結果が得られた（データは示さない）。
検出限界と再現性
ＰＣＡ３ ＲＮＡの検出と定量のために提案した定量的ＲＴ-ＰＣＲ技術の感度と線形性を求めるために、検量曲線を作成した。種々の数のＰＣＡ３ ＲＮＡ分子（５０〜１×１０7個のＰＣＡ３ ＲＮＡ分子）を５×１０3コピーのＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡと混合した。既に示したように、このＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡの値は、ＰＣＡ３の定量のための広い直線範囲をもたらすＩＳ−ＰＣＡ３の最小量であった。さらに、この量のＩＳ−ＰＣＡ３を用いることで、ＰＣＡ３プローブと５×１０5コピーを超えるＩＳ−ＰＣＡ３との僅かな交差反応（０．１％）も避けることができた。バックグラウンドシグナルは、ＰＣＡ３ ＲＮＡもＩＳ−ＰＣＡ３ ＲＮＡも存在しない状態で得られるシグナルと定義した。この定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイの検出限界は、バックグラウンドシグナルの平均値の２倍とした。この定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイにおいては、検出限界は、５０コピーのＰＣＡ３ ＲＮＡを用いてＰＣＲ増幅サイクルを３５回実施した場合に対応した。飽和状態は（上述したように）両方の標的に同じ影響を与えたので、５０〜１×１０7個のＰＣＡ３ ＲＮＡ分子に亘る広い直線範囲を有する検量曲線を得た（データは示さない）。
ＰＣＡ３に基づくＲＴ-ＰＣＲアッセイの再現性は、４つの独立した検量曲線を比較することによって確認した。４つの独立したアッセイによって、ＰＣＡ３標的とＩＳ−ＰＣＡ３標的との希釈系列、逆転写アッセイ、ＰＣＲアッセイ及びハイブリダイゼーションアッセイのためのこれら４つの検量曲線を、４つの独立したアッセイによって作製し分析した。複合検量曲線（combined calibration curve）（データは示さない）から分るように、全体的なアッセイ内の再現性は、変動係数（ＣＶ）の中央値が６％（範囲：２〜２５％）と良好である。
組織標本におけるＰＣＡ３ ｍＲＮＡ発現の定量
上述したＰＣＡ３に基づくＲＴ-ＰＣＲアッセイを、ＰＣＡ３の前立腺癌診断用マーカーとしての潜在的な有用性を評価するために用いた。ＰＣＡ３の前立腺特異性は、乳房、膀胱、十二指腸、心臓、肝臓、肺、腎臓、前立腺、精嚢、皮膚、胃、睾丸及び抹消血白血球のいくつかの正常な組織から得たｃＤＮＡについて、ＰＣＡ３ ＲＮＡのコピー数を測定することによって決定した。前立腺以外のすべてのサンプルが、ＰＣＡ３に対して陰性を示し（データは示さない）、これは既に発行済みのデータと合致していた（２０、２１）。
次に、ＰＣＡ３の前立腺腫瘍マーカーとしての有用性を評価するために、以下の組織におけるＰＣＡ３ ＲＮＡ発現を求めた：前立腺肥大組織（ｎ＝８）、正常な前立腺組織（ｎ＝４）、前立腺癌細胞の含有量が１０％以下である前立腺腫瘍組織（ｎ＝１３）、及び前立腺癌細胞の含有量が１０％を越える前立腺腫瘍組織（ｎ＝２７）。悪性でない前立腺腫瘍組織と前立腺肥大組織との間ではＰＣＡ３ ＲＮＡ発現の違いは見られなかったので、これらの両方を悪性ではない対照群に含めた。前立腺癌細胞の含有量が１０％を越える前立腺腫瘍組織においては、ＰＣＡ３のアップレギュレーションの中央値（中央値：１５８．４×１０5、範囲：７．０×１０5〜９９４．０×１０5）は、悪性でない対照群におけるＰＣＡ３発現（中央値：２．４×１０5、範囲：０．２×１０5〜１０．１×１０5）と比べて、６６倍であった（表４）。前立腺癌細胞の含有量が１０％以下である前立腺腫瘍組織においてさえ、ＰＣＡ３のアップレギュレーションは、悪性でない対照群におけるＰＣＡ３発現と比べて１１倍であった（中央値：２５．３×１０5、範囲：６．６×１０5〜１６６．０×１０5）。７人の患者から得た全摘標本については、腫瘍領域におけるＰＣＡ３発現を、同じ患者から採取した隣接する非腫瘍性前立腺組織におけるＰＣＡ３発現と比較した。ＰＣＡ３に基づく定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイによって、これらの前立腺腫瘍組織においては、隣接する非腫瘍性前立腺組織と比べて、ＰＣＡ３発現が６〜１５００倍にアップレギュレートされていることが分かった（表６）。
ＰＣＡ３に基づく定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイの診断における潜在的有用性を判定するために、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を作成した（データは示さない）。曲線下面積（ＡＵＣ）は０．９８（９５％信頼区間は０．９４〜１．０１）であり、これはＰＣＡ３に基づく定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイが非常に特異的であり、強力な診断的価値を有することを示していた。
考察
現在、ＲＴ-ＰＣＲは、正常細胞が多量に存在するバックグラウンドから少数の腫瘍細胞を検出する際に最も広く用いられる方法である。近年、ＰＳＡ ｍＲＮＡとＰＳＭＡ ｍＲＮＡとをこの技術における最も一般的な標的として用いる前立腺癌細胞の同定を行うための様々なＲＴ-ＰＣＲアッセイが開発されている（２５、２６、２６〜２９）。これらのＲＴ-ＰＣＲアッセイの多くは定性的、即ち、ＰＣＲ反応産物中に標的が存在するかどうかに関する情報を提供するものであった。すべてのＰＣＲアッセイと同様に、ＲＴ-ＰＣＲは極度に感度の高いアッセイである。ネステッドＲＴ-ＰＣＲ法の導入後には、ＰＳＡ転写産物やＰＳＭＡ転写産物が、健常なドナーから得た抹消血白血球からも検出された（３０、３１）。このことは、ＲＴ-ＰＣＲ技術の感度が高過ぎる場合には、非前立腺細胞において低いバックグラウンドレベルで存在する可能性のある前立腺特異的遺伝子の基礎転写産物が、偽陽性シグナルをもたらす可能性があることを示している。ＲＴ-ＰＣＲ研究の成果の中でも、以前には組織又は腫瘍特異的であると考えられていた多くの遺伝子のバックグラウンド発現の検出は、感度と特異性とにおいて広範囲に寄与している。これらの矛盾した結果は、用いたＲＴ-ＰＣＲプロトコルに統一性がないことに帰せられる。組織特異的な遺伝子のバックグラウンド発現は、それらの臨床用途を無効にするわけではない。しかし、このことは、より再現性と信頼性の高い結果を得るためには、より定量的なＲＴ-ＰＣＲ技術の開発が必要であることを意味する。
ＲＴ-ＰＣＲ産物の検出と分析においては、サザンブロット法の後に特定の放射性オリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションを行う方法が、この２０年間、ハイブリダイゼーションアッセイの分野において支配的であった。この方法は、高感度ではあるものの、定性的であり、時間がかかる。放射性核種は健康への危害とその使用と処理に関連する諸問題が付随するため、この１０年間で、非放射性物質を用いる方法に移行している。
ＲＴ-ＰＣＲの分野における新たな技術の１つは、密閉したチューブ内の核酸を検出するリアルタイムＰＣＲ法である（３２、３３）。この方法は汚染の危険を減少させ、又、ＰＣＲ後のハイブリダイゼーション工程が不要なため分析を簡略化する。さらに、多数のサンプルを同時に分析することができる。定量のために最も広く用いられる方法は、目的のｃＤＮＡ挿入物を有する直鎖状プラスミドの希釈系列から得た検量曲線の一般化という方法である。この希釈系列を、サンプルとともに増幅する。広く用いられているものの、この手法はアッセイの正確さに問題を引き起こす可能性がある。ＲＮＡサンプルは、プラスミドＤＮＡの増幅と比べて、逆転写サンプル中に存在する阻害因子によって増幅効率にばらつきが生じやすい（３４）。主たるばらつきが逆転写工程で生ずるので、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲの後に得られるコピー数は、ｃＤＮＡ合成前のサンプル中のコピー数を反映しない可能性がある。検量曲線とサンプルの両方に外因性内部標準を用いれば、ｃＤＮＡ合成の際に起こり得るいかなるばらつきも修正すると考えられるから、上記問題の解決が期待できる。しかし、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいては、このような競合的内部標準を用いることはできない。標的と内部標準とがＰＣＲ試薬に対して競合してしまうからである。もし標的と内部標準との間に１０倍を越える差が存在するなら、より少ない方の分子種は、検出されるに十分なほどには増幅されないであろう。これは、より多い方の標的が、ＰＣＲ試薬、特にプライマー、の大部分を消費するからである（３４、３５）。リアルタイムＰＣＲにおけるこのようなサンプル間のばらつきを修正するために、細胞性ＲＮＡを標的ＲＮＡと同時にＲＴ増幅した。ハウスキーピング遺伝子と呼ばれる遺伝子を内因性内部標準として用いると、これらの遺伝子の発現は、研究対象の組織や細胞の違いや、実験処理の違いによってばらつきが生じることはない。これらのＲＮＡはまた、標的ＲＮＡとほぼ同じレベルで発現していなければならない。標的ＲＮＡのコピー数は、多量に存在するハウスキーピング遺伝子のＲＮＡ発現に基づいて正規化される。ｒＲＮＡは別のポリメラーゼによって生成されるので、内部標準として有用である（３６）。したがって、それらの発現レベルは、ＲＮＡの発現に影響を与える条件の下ではばらつきは発生しない傾向がある（３７）。しかし、ｒＲＮＡは、標的ＲＮＡよりもずっと高いレベルで発現する。したがって、少量の標的ＲＮＡを多量のハウスキーピング遺伝子（たとえば、１８スベドベリ単位（Ｓ）ｒＲＮＡ）に対して正規化することは困難である。１８Ｓ ｒＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ転写産物と比べて、非常に豊富に存在する。そのため、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲデータの解析においては、ベースライン値を正確に控除することが困難である（３８）。これらの問題を克服するために、Nurmi は、リアルタイムの定量的ＰＳＡアッセイのための、標的に類似した非競合的な外因性内部標準を開発した（３４）。リアルタイムＰＣＲを用いたＰＳＡ ｍＲＮＡ解析から内部標準を省くことによって、サンプル中のＰＳＡ ＲＮＡの量が１７２分の１に過小評価された。さらに、公知のTaqManTM プローブの代わりにランタノイドで標識したプローブを用いることによって、この研究グループは、初期量の差が１００倍もある場合でさえ、２つの異なる標的を検出することができた。シグナル対ノイズ比が高いために、検出限界は１０倍も上がった。通常のTaqManTM プローブと標識を、急減衰性蛍光分子（即ち、即時蛍光分子）とともに用いた場合、検出限界の標的ｍＲＮＡコピー数は１０００個であったが、ランタノイド標識に基づく検出を行った場合には、１００コピーのＰＳＡ ｍＲＮＡを検出することができた。この方法の開発はまだ研究段階にあり、時間分解蛍光検出に利用できるリアルタイムＰＣＲ装置はまだ存在しない。しかし、この手法は、低発現ｍＲＮＡの真の定量のためのリアルタイムＰＣＲにおける大きな進歩である。
１つの態様においては、サンプル調製物間のばらつきの修正と正確な定量とに関する前述の問題のために、リアルタイムＰＣＲを定量には用いないことに決めた。そこで、ＰＣＡ３のための時間分解蛍光測定に基づく定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイを開発した。現在では、時間分解蛍光（ＴＲＦ）法は、生物学的サンプルのバックグラウンドから得られる寿命の短い即時蛍光シグナルと、ランタノイド標識プローブの長い蛍光減衰時間との判別を可能にする、最も感度の高い非放射性技術の１つであると考えられている。ランタノイド蛍光シグナルの測定は、励起の瞬間から一定の時間が経過するまでは行わない。この遅延の間に、寿命の短い即時シグナルは消滅するため、この技術は高感度となる（３９）。Ylikoskiは、ＰＳＡのための時間分解蛍光測定に基づく定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイにおいて、これら２つの技術を組み合わせた（２３、４０）。これにより、生物学的サンプルにおけるＰＳＡ ｍＲＮＡを高感度で定量的且つ直線的に検出する方法が提供された。ここに記載したＰＣＡ３のための時間分解蛍光測定に基づく定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイは、彼らが用いた原理に基づいている。
先に議論したように、ＲＴ-ＰＣＲ法における最も困難な問題は、標的ＲＮＡの初期量の決定である。ＰＣＡ３の定量のために、一定量の外因性内部ＲＮＡ標準を、各サンプルと各検量用試料（５０〜１×１０7コピーのＰＣＡ３ ＲＮＡに亘る広い直線範囲をカバーするもの）に添加した。このＩＳ−ＰＣＡ３は、ＰＣＡ３ ｍＲＮＡとたった３ｂｐしか違わなかった。内部標準は、ｃＤＮＡ合成を行う前のサンプルに添加した。したがって、逆転写からハイブリダイゼーションアッセイによる増幅産物の検出に至るアッセイの全工程で生じるばらつきを修正することが可能となる。本発明者らは、両方の標的がサイズと配列の類似のために等しく共増幅されるということを示した。配列の小さな違いによって、ＰＣＡ３とＩＳ−ＰＣＡ３のそれぞれを検出するための２つの特異的ハイブリダイゼーションプローブの構築が可能となる。プローブとその標的との間のクロスハイブリダイゼーションを避けるために、ハイブリダイゼーションの条件を最適化した。本発明者らは、２つの標的がハイブリダイゼーションアッセイにおいてそれぞれのプローブによって選択的に検出されることを示した。プローブは、２種類のランタノイド、即ち、ユーロピウムとテルビウムで標識した。鋭い放出ピークと、Ｅｕ3+とＴｂ3+の異なる減衰時間とが、１つのマイクロタイターウェル内の２つの検体を同時に検出することを可能にした。サンプル中のＰＣＡ３ ｍＲＮＡの初期量を決定するために、サンプルから得たＰＣＡ３／ＩＳ−ＰＣＡ３蛍光比を、検量用試料から得た比と比較した。マイクロタイタープレートにおける二重標識ＴＲＦに基づくハイブリダイゼーションアッセイは、１２個の試料からなる１セットの検量用試料のみを用いるだけで、多数のサンプルからのＰＣＡ３ ｍＲＮＡの検出を可能にする。さらに、アッセイ内の再現性は、変動係数（ＣＶ）の中央値が６％（範囲：２〜２５％）と良好である。この方法を用いると、５０コピーまでのＰＣＡ３は、１００倍以上（５０００コピー）の内部標準と共増幅することで検出することができた。従来のリアルタイムＰＣＲ法では、標的と内部標準との差が１０倍を越えると、より少ないほうの分子種の検出が不十分になるため、上述のような検出は不可能であったと考えられる。この技術の感度は、少量の目的配列を検出しなければならない診断の場において重要である。時間分解蛍光測定に基づく上記の定量的ＲＴ-ＰＣＲ法は、定量的であり、サザンブロッティング法とメンブレンハイブリダイゼーションに基づく従来の解析方法よりも高感度、迅速且つ容易に実施することができる。
本明細書に記載の、ＰＣＡ３のための時間分解蛍光測定に基づく定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイにより、ＰＣＡ３は前立腺に限定的に発現することが示された。これは、既に発行済みのデータと合致していた（２０、２１）。この定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイによって得られたＰＣＡ３のＡＵＣ−ＲＯＣ値は、０．９８であった。この結果は、この転写産物が悪性前立腺組織と非悪性前立腺組織とを識別する能力が非常に高いことを示している。Bussemakersとその同僚らは、ノーザンブロッティング法を用いて、ＰＣＡ３は腫瘍領域においては、隣接する非腫瘍性前立腺組織と比べ、１０〜１００倍も過剰発現するということを発見した。本発明者らは、上述の時間分解蛍光測定に基づく定量的アッセイを用い、７人の患者から得た全摘標本について、隣接する非腫瘍性前立腺組織と比べて、前立腺腫瘍組織におけるＰＣＡ３発現は６〜１５００倍にアップレギュレートされていることを示した。非腫瘍性前立腺組織と対応させていない組織標本群においては、ＰＣＡ３のアップレギュレーションの中央値は、前立腺癌細胞の含有量が１０％を越える前立腺腫瘍組織では６６倍であった。前立腺癌細胞の含有量が１０％以下である前立腺腫瘍組織サンプルにおいては、ＰＣＡ３のアップレギュレーションの中央値は１１倍であり、この結果は、ＰＣＡ３アッセイは非悪性細胞が支配的なバックグラウンドから、少量の悪性細胞の検出が可能であることを示している。これらのデータは、最近開発したリアルタイムＰＣＲアッセイで得られたデータと合致していた（２１）。
上記データの組み合せと、ＰＣＡ３は（しばしば体液中に存在する）白血球では発現していないという事実から、ＰＣＡ３の定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイは診断手段として大いに有望であることが分かる。したがって、ＰＣＡ３の定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイは、前立腺癌の疑いのある患者から得た血液、尿又は精液の中の悪性前立腺細胞の検出に適応可能であると考えられる。最近、この仮説は、前立腺の徹底的な直腸指診後に得た尿沈渣の検査に本明細書に記載の分子検査法を用いることで、Hessels（上記のEur. Urol. 2003）によって検証された。データの組み合せから、徹底的な前立腺のマッサージの後に得た尿沈渣中のＰＣＡ３転写産物の定量による前立腺癌の検出は、血清ＰＳＡの特異性（２０％）と比べて高い（８３％）ということを示していた。さらに、この検査の陰性的中率は９０％であった。したがって、ＰＣＡ３の定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイは、生検数の減少に大きな可能性を有する。
本発明によって、５０〜１×１０7コピーのＰＣＡ３分子に亘る広い直線検出範囲を有する、非常に高感度な、時間分解蛍光測定に基づく定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイが開発された。このアッセイにおいては、ｃＤＮＡ合成からハイブリダイゼーションアッセイに至る工程で発生するサンプル間のばらつきを補正するための、標的に類似した外因性内部標準を用いた。このアッセイは、ＰＣＡ３が悪性前立腺組織と非悪性前立腺組織とを識別する能力が高いことを示した。本発明者らは、最近、この定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイを尿沈渣中の前立腺癌細胞の検出に用いることができることを示した。こうして、複数の医療機関にまたがった、検証済みのＰＣＡ３アッセイを用いた研究は、泌尿器科の臨床業務における分子的診断法の有用性を示す第１の基準を提供することができる。
ＰＣＡ３に基づくアッセイの診断における潜在的効力は、非悪性前立腺組織標本と悪性の前立腺組織標本とにおけるＰＣＡ３転写産物の定量によって判定した。逆転写反応の前に、正常な前立腺組織標本と前立腺癌組織標本とから得た総ＲＮＡを、外因性ＰＣＡ３様内部ＲＮＡ標準と混合した。この内部標準は、アッセイの全工程で生じるばらつきを修正する。ＲＴ-ＰＣＲによるＰＣＡ３と内部標準の共増幅の後に、サンプルを、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイターウェルに補足した。各標的は、ユーロピウム又はテルビウムで標識した特異的なプローブにハイブリダイズさせた。強蛍光性のランタノイドキレート産物の測定のために、時間分解蛍光測定を用いた。サンプル中のＰＣＡ３ ｍＲＮＡのコピー数の定量を、５０〜１×１０7コピーに亘るＰＣＡ３ ｍＲＮＡの広い直線範囲をカバーする検量曲線を用いて行った。
前立腺腫瘍組織におけるＰＣＡ３のアップレギュレーション（中央値：１５８．４×１０5コピー／１μｇの組織ＲＮＡ）は、良性前立腺組織の場合（中央値：２．４×１０5コピー／１μｇの組織ＲＮＡ）と比べて、６６倍であった。このアップレギュレーションは、検査した標本の９５％超において見られた。本明細書に示すデータは、癌細胞の含有量が１０％未満の組織標本と非悪性組織標本とを正確に識別できるということを示した。したがって、正常細胞のバックグラウンドから少量の前立腺癌細胞を検出することが可能と考えられる。ＰＣＡ３に基づくアッセイの診断における効力を、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）によって視覚化した。曲線下面積が０．９８（９５％信頼区間は０．９４〜１．０１）であることは、このアッセイが優れた識別力を有することを示していた。本明細書に記載したＰＣＡ３の定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイは、前立腺癌の予後判定（及び診断）のための手段として、非常に有望である。
最近、多数の前立腺特異的遺伝子が同定された。これらの例として、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）（１２）、ＮＫＸ３．１（１３）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（１４）、前立腺腫瘍誘導性遺伝子−１（prostate tumor inducing gene-1）（ＰＴＩ−１）（１５）、ＰＣＧＥＭ−１（１６）、ＰＤＥＦ（１７）、ＴＭＰＲＳＳ２（１８）、及びプロスターゼ（Prostase）（１９）が挙げられる。しかし、これらの前立腺特異的遺伝子の発現に基づいた診断については報告されていない。さらに、診断スクリーニング試験のための最も有望な候補遺伝子は前立腺特異的ＰＣＡ３遺伝子である。というのは、その発現は前立腺に限られており、原発性前立腺癌の９５％超において強くアップレギュレートされているからである（２０、２１）。ＰＣＡ３の前立腺癌診断マーカーとしての潜在的有用性をさらに実証するために、時間分解蛍光測定に基づく定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイ（外因性内部標準と外部検量曲線を用いる）を開発した。時間分解蛍光測定に基づくこのＰＣＡ３の定量的ＲＴ-ＰＣＲアッセイの感度と特異性は、よく特徴付けられた正常前立腺標本及び悪性前立腺標本からなる大きなパネルを用いて実証した。
上記のように本発明についてその好ましい態様を記述したが、添付の請求の範囲に定義された本発明の精神と本質から逸脱することなく、変更を加えることができる。
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本発明に関連するアッセイの原理の１つの具体例を示す図である。 経直腸指診の後に得た尿沈渣の、遺伝子に基づくＰＣＡ３解析を示す図である。図２Ａは、特異性に対して感度をプロットしたグラフである。尿沈渣は、血清ＰＳＡレベルが３ｎｇ／ｍｌを越える１０８人の男性からなるコホートから、経直腸指診後に得たものである。尿沈渣のＰＣＡ３に基づくアッセイによる診断効力は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線によって視覚化する。このＲＯＣ曲線に基づいて、２００×１０-3というカットオフ値を決定した。図２Ｂは、図２Ａの尿沈渣から得たＰＣＡ３／ＰＳＡ比を、箱ひげ図にまとめたものである。ＰＣＡ３／ＰＳＡ比の中央値（太い黒の水平線）、外れ値（白丸）、及び極値（星印）を示す。カットオフ値は、破線で示す。 ＰＣＡ３／ＰＳＡ比の予後判定における有意性を示す図である。尿沈渣は、血清ＰＳＡレベルが３ｎｇ／ｍｌを越える１３６人の男性からなる新たなコホートから、経直腸指診後に得たものである。箱ひげ図において、これらの尿沈渣から得たＰＣＡ３／ＰＳＡ比をグリーソンスコアと相関させた。ＰＣＡ３／ＰＳＡ比の中央値（太い黒の水平線）、外れ値（白丸）、及び極値（星印）を示す。アッセイ条件をわずかながら調節したため、新たなカットオフ値を１３２×１０-3と定め、破線で示した。 グリーソンスコアと相関させたＰＣＡ３／ＰＳＡ比の性能を示す図である。４９人の患者から、生検の組織病理学的評価によって癌が検出された。この図においては、ＰＣＡ３／ＰＳＡ試験の結果が陽性／真陽性である場合と試験結果が陰性である場合について、ＰＣＡ３／ＰＳＡ比のカットオフ値を１３２×１０-3と定めて、グリーソンスコアの分布を示した。症例数をｙ軸に示す。 本発明の１つの具体例を示す図であり、生検から得た、グリーソンスコア（悪性腫瘍なしとスコア４〜９）と、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比の平均及び中央値との相関を示す。 図５と同様の具体例を示すが、生検から得た、グリーソンスコア（悪性腫瘍なしとスコア４〜９）と、ＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比の平均及び中央値との相関をグラフにしたものである。 ＰＣＡ３／ＰＳＡ比の閾値を１３２×１０-3とした時の、本発明の方法の感度を各グリーソングレードに対して示したものである。 図７と同様の具体例を示すが、結果をグラフにしたものである。 平均腫瘍体積と特定のＰＣＡ３／ＰＳＡ ｍＲＮＡ比（１３２×１０-3未満の値と１３２×１０-3を越える値）との関係を示した図である。
配列番号１： １４７２番のnはa、c、g又はtである。
１５１７番のnはa、c、g又はtである。
１５６３番のnはa、c、g又はtである。
配列番号３： 合成構築物
配列番号４： 合成構築物
配列番号５： 合成構築物
配列番号６： 合成構築物
配列番号７： 合成構築物
配列番号８： 合成構築物
配列番号９： 合成構築物
配列番号１０： 合成構築物
配列番号１１： 合成構築物
配列番号１２： 合成構築物
配列番号１３： 合成構築物
配列番号１４： 合成構築物
配列番号１５： 合成構築物
配列番号１６： 合成構築物
配列番号１７： 合成構築物
配列番号１８： 合成構築物
配列番号１９： 合成構築物
配列番号２０： 合成構築物
配列番号２１： 合成構築物
配列番号２２： 合成構築物
配列番号２３： 合成構築物
配列番号２４： 合成構築物
配列番号２５： 合成構築物
配列番号２６： 合成構築物
配列番号２７： 合成構築物
配列番号２８： 合成構築物
配列番号２９： 合成構築物
配列番号３０： 合成構築物
配列番号３１： 合成構築物
配列番号３２： 合成構築物
配列番号３３： 合成構築物
配列番号３４： 合成構築物
配列番号３５： 合成構築物
配列番号３６： 合成構築物（ＰＳＡ）
配列番号３７： 合成構築物（ＰＳＡ）
配列番号３９： 合成構築物
配列番号４０： 合成構築物
配列番号４１： 合成構築物
配列番号４２： nは(modC)20である。
配列番号４３： nは(modC)20である。

Claims (23)

  1. 患者の生物学的サンプルから前立腺癌の予後判定を行う方法であって、
    （ａ）生物学的サンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の量を評価する工程、
    （ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を決定する工程、及び
    （ｃ）該量比を、少なくとも１つの予め定めたカットオフ値と比較する工程
    を包含し、該生物学的サンプルは尿、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液及び膀胱洗浄物からなる群より選ばれ、該予め定めたカットオフ値を超える量比を、該予め定めたカットオフ値よりも量比が低い場合と比べて前立腺癌によって死亡する危険度が高いことの指標とすることを特徴とする方法。
  2. 該生物学的サンプルが、直腸指診の後に得られる尿サンプルであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. ＰＳＡの量がＰＳＡ ｍＲＮＡの量であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 生物学的サンプルから前立腺癌の予後判定を行う方法であって、
    （ａ）生物学的サンプルを、前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、
    （ｂ）該生物学的サンプルを、ＰＳＡ ｍＲＮＡにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、
    （ｃ）該生物学的サンプル中のＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及びＰＳＡ ｍＲＮＡの量を測定する工程、
    （ｄ）ＰＳＡ ｍＲＮＡ量に対するＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を決定する工程、及び
    （ｅ）ＰＳＡ ｍＲＮＡ量に対するＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を、少なくとも１つの予め定めたカットオフ値と比較する工程
    を包含し、該生物学的サンプルは尿、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液及び膀胱洗浄物からなる群より選ばれ、該予め定めたカットオフ値を超える量比を、侵襲性の高い癌の存在の指標として、該予め定めたカットオフ値よりも低い量比を、侵襲性のより低い癌の存在の指標とすることを特徴とする方法。
  5. 生物学的サンプル中の前立腺癌の腫瘍体積を評価する方法であって、
    （ａ）サンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及びＰＳＡの量を評価する工程、
    （ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を決定する工程、及び
    （ｃ）該量比を、少なくとも１つの予め定めたカットオフ値と比較する工程
    を包含し、該生物学的サンプルは尿、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液及び膀胱洗浄物からなる群より選ばれ、該予め定めたカットオフ値を超える量比を、該予め定めたカットオフ値より量比が低い場合と比べて前立腺癌の腫瘍体積が大きいことの指標とすることを特徴とする方法。
  6. 患者の生物学的サンプルから前立腺癌の腫瘍成長をモニターする方法であって、
    （ａ）第１の時点に得た生物学的サンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及びＰＳＡの量を評価する工程、
    （ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を決定する工程、
    （ｃ）後期の時点に該患者から得た生物学的サンプルを用いて、工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返す工程、及び
    （ｄ）工程（ｂ）で得た量比を工程（ｃ）で得た量比と比較する工程
    を包含し、該生物学的サンプルは尿、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液及び膀胱洗浄物からなる群より選ばれ、工程（ｂ）で得た量比が工程（ｃ）で得た量比より大きい場合を、前立腺癌の進行及び腫瘍体積増加の指標とすることを特徴とする方法。
  7. 生物学的サンプルから前立腺癌の進行をモニターする方法であって、
    （ａ）生物学的サンプルを、前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、
    （ｂ）該生物学的サンプルを、ＰＳＡ ｍＲＮＡにハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドと接触させる工程、
    （ｃ）該生物学的サンプル中のＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及びＰＳＡ ｍＲＮＡの量を測定する工程、
    （ｄ）ＰＳＡ ｍＲＮＡ量に対するＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を決定する工程、
    （ｅ）後期の時点に工程（ａ）〜（ｄ）を繰り返す工程、及び
    （ｆ）工程（ｄ）で得た量比を工程（ｅ）で得た量比と比較する工程
    を包含し、該生物学的サンプルは尿、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液及び膀胱洗浄物からなる群より選ばれ、工程（ｅ）で得た量比が工程（ｄ）で得た量比よりも大きい場合を、前立腺癌の進行を示す指標とすることを特徴とする方法。
  8. 前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量の測定に増幅反応を用いることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 該増幅反応が
    （ａ）ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、
    （ｂ）核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ法）、
    （ｃ）転写媒介性増幅法（ＴＭＡ法）、
    （ｄ）リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ法）、及び
    （ｅ）ストランド置換増幅法（ＳＤＡ法）
    からなる群より選ばれるものであることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
  10. 前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及びＰＳＡ ｍＲＮＡの量の測定に、ハイブリダイゼーションアッセイ法を用いることを特徴とする、請求項４又は７に記載の方法。
  11. 前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量の評価を、下記の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるＰＣＡ３核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを用いて行うことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
    （ａ）配列番号１の核酸配列、
    （ｂ）配列番号２の核酸配列、及び
    （ｃ）ストリンジェントな条件下で上記核酸配列（ａ）又は（ｂ）にハイブリダイズする核酸配列。
  12. ＰＳＡの量の評価を、下記の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選ばれるＰＳＡ核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを用いて行うことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
    （ａ）配列番号３８の核酸配列、及び
    （ｂ）ストリンジェントな条件下で上記核酸配列（ａ）にハイブリダイズする核酸配列。
  13. 該生物学的サンプルに含まれるＰＳＡタンパク質の量を評価することを特徴とする、請求項１、２、５、６及び１１のいずれかに記載の方法。
  14. ＰＳＡタンパク質量の評価を、抗体を用いて行うことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  15. 治療後の前立腺癌の進行の危険度を判定するための方法であって、
    （ａ）治療前のサンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及びＰＳＡの量を評価する工程、
    （ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を決定する工程、
    （ｃ）治療後の該患者の生物学的サンプルを用いて工程（ａ）及び（ｂ）を繰り返す工程、及び
    （ｄ）治療後に得た量比を、治療前に得た量比と比較する工程
    を包含し、該生物学的サンプルは尿、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液及び膀胱洗浄物からなる群より選ばれ、治療後の量比が治療前の量比より大きい場合を、前立腺癌の進行の指標とすることを特徴とする方法。
  16. 該患者の前立腺サンプルのグリーソンスコアを決定する工程、及び該ＰＣＡ３／ＰＳＡ比と該グリーソンスコアを、前立腺癌によって死亡する危険度と相関させる工程を更に包含することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
  17. 該ＰＣＡ３／ＰＳＡ比と該グリーソンスコアを、医薬品の効能、患者の帰結、及び疾患危険度の予測からなる群より選ばれる少なくとも１種と相関させることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
  18. 患者から得た生物学的サンプル中の前立腺癌のステージを判定するための方法であって、
    （ａ）該生物学的サンプル中の前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量及びＰＳＡの量を評価する工程、
    （ｂ）ＰＳＡ量に対する前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡの量比を決定する工程、
    （ｃ）該量比を、少なくとも１つの予め定めたカットオフ値と比較する工程、及び
    （ｄ）量比を前立腺癌の特定のステージと相関させる工程
    を包含し、該生物学的サンプルは尿、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液及び膀胱洗浄物からなる群より選ばれ、該予め定めたカットオフ値を超える量比を、該予め定めたカットオフ値よりも量比が低い場合と比べて前立腺癌のステージが進行していることの指標とし、この指標に基づいて前立腺癌のステージを判定することを特徴とする方法。
  19. 該生物学的サンプルが、第１の時点と後期の時点との間に前立腺癌の治療を受けた患者から得たものであって、これを用いることで癌の腫瘍成長又は癌の進行に対する治療の効果をモニターすることを特徴とする、請求項６又は７に記載の方法。
  20. ヒト患者における前立腺癌の予後判定を行う方法であって、
    （ａ）患者から得た生物学的サンプル又はその抽出物について、前立腺癌特異的なＰＣＡ３ ｍＲＮＡ配列に特異的な第１のプライマーペアと、ＰＳＡ ｍＲＮＡ配列に特異的な第２のプライマーペアとを用いて in vitro 核酸増幅アッセイを行う工程、
    （ｂ）ＰＣＡ３ ｍＲＮＡ配列とＰＳＡ ｍＲＮＡ配列を定量する工程、及び
    （ｃ）ＰＳＡに対するＰＣＡ３の正規化された量比を計算する工程であり、該量比は、該患者におけるＰＣＡ３ ｍＲＮＡレベル及びＰＳＡ ｍＲＮＡレベルと相関させることができるものである、
    を包含し、該生物学的サンプルは尿、前立腺組織切片、前立腺組織生検、精液及び膀胱洗浄物からなる群より選ばれ、ＰＳＡに対するＰＣＡ３の該正規化された量比は、前立腺癌のグレード又はステージと相関性を有することを特徴とする方法。
  21. （ａ）該ＰＣＡ３／ＰＳＡ比が２００×１０-3を超える場合には、患者の予後は不良であると判定し、
    （ｂ）該ＰＣＡ３／ＰＳＡ比が７５×１０-3〜２００×１０-3である場合には、患者の予後は中庸であると判定し、
    （ｃ）該ＰＣＡ３／ＰＳＡ比が０〜７５×１０-3である場合には、患者の予後は良好又は危険度は低いと判定する
    ことを特徴とする、請求項１〜１２及び１８〜２０のいずれかに記載の方法。
  22. （ａ）該ＰＣＡ３／ＰＳＡ比が２００×１０-3を超える場合には、グリーソンスコア７超と相関させ、
    （ｂ）該ＰＣＡ３／ＰＳＡ比が７５×１０-3〜２００×１０-3である場合には、グリーソンスコア６又は７と相関させ、
    （ｃ）該ＰＣＡ３／ＰＳＡ比が０〜７５×１０-3である場合には、グリーソンスコア０〜５と相関させる
    ことを特徴とする、請求項１６又は１７に記載の方法。
  23. 該カットオフ値が、１３２×１０-3及び２００×１０-3からなる群より選ばれることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
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