JPH07502650A

JPH07502650A - ストレプトミセスにおけるＰ４５０ｓｏｙおよびフェレドキシン−ｓｏｙの構成性発現、および組み換え体生物による化学物質の生物変換

Info

Publication number: JPH07502650A
Application number: JP5511162A
Authority: JP
Inventors: サリアスラニ，フアテメ・シマ; トロワー，マイケル・キース; オマー，チヤールズ・アンソニー
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1991-12-16
Filing date: 1992-12-16
Publication date: 1995-03-23
Also published as: EP0618972A1; US5466590A; WO1993012236A1; CA2125947A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ストレプトミセスにおけるＰ４５０ｓｏｙおよびフェレドキシン−５ｏｙの構成性発現、および組み換え体生物による化学物質の生物変換発明の分野本発明は、チトクロームＰ４５０ｓｏｙおよびチトクロームＰ４５０ｓｏｙに電子を供与する鉄−硫黄タンパク質の構成性発現能を有するストレプトミセス属の組み換え体細菌に関する。これらの組み換え体細菌は、ＨＭ　Ｐ　Ａおよび類似の化合物の生物変換を含む多（の重要な化学的変換を実施するために有用である。

発明の背景チトクロームＰ４５０　（Ｐ２Ｓ５）は、波長４５Ｏｎｍ付近に主要な吸収帯をもつ一酸化炭素複合体を形成するところの広範に分布する一群の独特なヘムタンパク質に対して使用される用語である。これらのタンパク質は、酵素であって、特殊な細胞もしくは生体成分の生合成および異化、および生物に入ってくる外来物質の代謝に関与する種々の混合機能才キンダーゼ系において、オキシダーゼ機能を果たすものである。Ｐ２Ｓ５のような酸素添加酵素は、殆どの種類の好気性生物において基本的な細胞構成成分であると考えられる。これらの酵素による分子状酸素の活性化およびその原子酸素の有機化合物への組み込みは、生合成のみならず、薬物、食品保存剤および添加物、発がん物質および環境汚染物質のような外来因子の代謝活性化もしくは不活化に関する生体に重要な反応である。

真核生物系におけるＰ２Ｓ５、およびＰ４５０依存酵素は、フェノバルビトール、アンチピリン、ハロペリドールおよびプレドニゾンのような生体異物および薬物に作用することが知られている。環境上重要な既知物質には、ＤＤＴ、および種々のポリ塩化ビフェニールおよびポリ芳香族炭化水素、並びにハロベンゼンおよびクロロホルムを含むその他のハロゲン化化合物のような化合物を包含する。

ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）は、アラミド繊維の製造に際し、１９７０年代中旬に工業的に一般的な溶媒として盛んに使用された化合物である。ＨＭＰＡは、既知の発がん物質であり、種々の産業および化学廃棄物用地において、汚染物質の一つであることが分かっている。ＨＭ　Ｐ　Ａの哺乳動物の生体内分解に焦点を当てた研究は殆どないが、ラット肝臓および鼻粘膜から分離されたミクロソームＰ４５０がＨＭＰＡを脱メチルするであろうことは、既に知られていた（Ｌｏｎｇｏ　ｅｔ　ａｌ、　。

Ｔｏｘｉｃｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　４４：２８９　（１９８８））。

微生物系においては、チトクロームＰ４５０は、真核生物系におけると同様に生体異物の多くを酸化することが知られており、したがって、環境における毒性化合物の存在に関する可能な指標として、標的にすることができる。生体異物の変換についての最近の報告の一つは、細菌類ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）によってであり、それはチトクロームＰ４５０の発唄に関する遺伝子を保持することが知られている。この変換は、マンノシドストレプトマイノンのストレプトマイシンへの変換を伴う（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒａｌ　ｌｌｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ　３０：１６１　（１９８９））　ｏその時以来、これらの反応は、ベンゼンのような単純な分子から、複合アルカロイド（例えば、ビンドリンおよびジヒドロヒントリン、コディン、ステロイド、およびフェニルヒドラジンのような生体異物、アジマリンおよびコルビン）にわたる化合物について観察された（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ　ａｌ、、　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ　３０：１６１　（１９８９））。

Ｐ４５０遺伝子を発現する能力をもつ遺伝子工学的に改変された微生物は、いくつかの潜在的優位性を提供する。そのような微生物は、特定の化学物質を、より効率的もしくは急速に分解することができる正確に構築された酵素的経路を、発現するように計画され得るであろう。開発努力は、毒性があるか、または自然界に存在する細菌の分解に対して抵抗性がある化学物質に、広く向けられた。

ストレプトミセス属の細菌は、適切に誘導された場合には、チトクロームＰ４５０ｓｏｙ、およびチトクロームＰ４５０Ｓ（１’に電子を供与する鉄−硫黄タンパク質（フェレドキシン−５ｏｙ）の両方を産生ずることができることが分かっている（Ｓａｒｉａｓｌａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１４１：４０５　（１９８６））　。その誘導操作は、大豆粉、ゲニステインもしくはゲニスチンのような誘導物質を含む培地中で、細菌を生育させることを包含する。

Ｐ２Ｓ５を産生するための５ａｒｉａｓｌａｎｉらの方法は、有用ではあるが、ストレプトミセス属細菌にチトクロームＰ４５０ｓｏｙの産生を誘導するために、大豆粉もしくは大豆粉様物質のような誘導物質を利用する必要があるのが弱点である。そのような誘導物質は、取り扱いが困難であり、その分野ではよく分かっていない変化しやすいものである。また、標的の酵素を産生ずるようにその細菌を誘導する必要性は、その方法に付加的段階を導入して、その方法をさらに複雑にする。

酵素活性を高めるための誘導物質なしに、ＨＭＰＡのようなメチル化されたリン酸アミドを生物変換する単純な方法が必要である。単純な方法は、チトクロームＰ４５０ｓｏｙおよびチトクロームＰ４５０に電子を供与する鉄−硫黄タンパク質の構成性発現が可能な細菌の使用に基づくであろう。ストレプトミセス・グリセウスにおけるチトクロームＰ４５０ｓｏｙ酵素は、その酸化的反応において哺乳動物肝臓ミクロソームのチトクロームＰ４５０酵素との類似性を有しており、そのために、ストレプトミセス・グリセウスは、有害な化学物質の存在の指標並びにそれらの可能な生物変換のために、チトクロームＰ４５０の経済的で都合のよい給源として役立ち得るものであろう。

発明の概要本発明の一つの態様は、チトクロームＰ４５０ｓｏｙ１およびチトクロームＰ４５０ｓｏｙに電子を供与する鉄−硫黄タンパク質の構成性発現能のあるストレプトミセス属の組み換え体細菌を提供する。

本発明のその他の態様は、変異原物質もしくは発がん物質のような化学物質を、それらの酸化産物に変換するための方法を提供す暮。その方法は、チトクロームＰ４５０ｓｏｙおよび鉄−硫黄タンパク質の構成性発現能のあるストレプトミセス属の組み換え体細菌を、代謝される物質を含有する培地中で培養することを包含する。

図の簡単な説明図１ａは、Ｐ４５０ｓｏｙ遺伝子をコードしているストレプトミセス・グリセウスの２２ｋｂ領域の旦見思Ｈ■、旦立旦Ｒ１および旦見且Ｉ消化によって得られた共通制限酵素地図を示す。

図１ｂは、Ｍ１３ｍｐ１８／１９ベクターポリリンカーに独特なエンａｃｌ断片の制限酵素地図を示す。

図ＩＣは、５ｏｙＣおよび５ｏｙＢのコード領域を示す。

図２ａは、５ｏｙＣおよび５ｏｙＢ遺伝子の両方を有するストレプトミセス・グリセウスＤＮＡの１．７ｋｂヌクレオチド配列、およびＰ２Ｓ５−ｓｏｙタンパク質の４１２アミノ酸配列を示す。

図３は、５ｏｙＣおよび５ｏｙＢを有する４、８ｋｂ旦見且Ｉ断片のｐＭＭＯＯｌ中への挿入を示す。ｐＭＭＯＯｌからの４．８ｋｂ断片のその後の除去およびｐＭＭＯＯ２を作出するためのｐＣＡＯ２００への挿入。

図４は、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ、１ｉｖｉｄａｎｓ）Ｃ２００およびストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ２の下記比較実施例からのタンパク質抽出物のウェスタンプロットである。５ｏｙＢおよび５ｏｙＣのプロモーターは、ストレプトミセス・リビダンスにおいて調節される。

列１＝精製Ｐ４５０ｓｏｙ列２＝ＹＥＭＥ培地に生育したストレプトミセス・グリセウス抽出物列３＝５ｘＳＢＧ培地に生育したストレプトミセス・グリセウス抽出物列４＝ＹＥＭＥ培地に生育したストレプトミセス・リビダンスＣ２００抽出物列５＝５ｘＳＢＧ培地に生育したストレプトミセス・リビダンス０２００抽出物列６＝ＹＥＭＥ培地に生育したストレプトミセス・リビダンス〜？Ｍ００２（菌株３５）抽出物列７＝５ｘＳＢＧ培地に生育したストレプトミセス・リビダンスＭＭ００２（菌株３５）抽出物列８＝ＹＥＭＥ培地に生育したストレプトミセス・リビダンスＭＭＯ０２（菌株３６）抽出物列９＝５ｘＳＢＧ培地に生育したストレプトミセス・リビダンスＭＭ００２（菌株３６）抽出物図５は、ｐＭＭＯＯ４の作出を示す。５ｏｙＣおよび５ｏｙＢを有する４、８ｋｂＳａｃｌ断片のΣａｃ１部位におけるｐＵｃ１９中への挿入により、ｐＭＭＯＯ５を作出する。ストレプトミセス・グリセウス５ｏｙＣを有するＤＮＡ断片は、ＥｃｏＲＩ部位が、５°末端に導入されるように増幅された。その新しい断片は、ｐＭＭＯＯ３を作出するために、ｐＵｃ１９に挿入された。５ｕａＰを有するｐｃＡＯ３０２からの断片は、５ｏｙＣを有するｐＭＭＯＯ３からの断片、および５ｏｙＢおよびｐＵｃ１９を有するｐＭＭＯＯ５からの断片に連結された。

ａ　ｃ　Ｉ　ＤＮＡ断片に連結される。ｐＭＭＯＯ５は、旦旦互１により切断され、ｐＭＭＯＯ６からｐＢＲ３２２およびｐＭＭＯＯ７が分離される。

図７は、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・リビダンスＣ２００およびストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ２からのタンパク質抽出物のウェスタンプロットであり、ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ２がＰ４５０ｓｏｙを構成性発現することを示している。

列１＝精製Ｐ４５０ｓｏｙ列２＝ＹＥＭＥ培地に生育したストレプトミセス・グリセウス抽出物列３＝５ｘＳＢＧ培地に生育したストレプトミセス・グリセウス抽出物列４＝ＹＥＭＥ培地に生育したストレプトミセス・リビダンスＣ２００抽出物列５＝５ｘＳＢＧ培地に生育したストレプトミセス・リビダンスＣ２００抽出物列６＝５ｘＳＢＧ培地に生育したストレプトミセス・リビダンスＣ２００抽出物列７＝ＹＥＭＥ培地に生育したストレプトミセス・リビダンスＣ２００抽出物発明の詳細な記述本開示の文脈上、多くの用語が使用される。

“プロモーター”および“プロモーター領域”は、通常は、構造遺伝子のタンパク質をコードする配列に対して上流（５゛）側のＤＮＡの配列を指し、それは、正しい部位で開始するための転写に必要なＲＮＡポリメラーゼおよび／またはその他の因子に対する認識を与えることによって、コード領域の発現を制御する。

プロモーター配列は、遺伝子の発現を推進させるために必須であるが、必ずしも十分ではない。

”断片”は、核酸の配列を構成するものであって、完全な遺伝子、完全な遺伝子より小さいものおよび完全な遺伝子以上のものを包含してもよい。

“制御”および゛制御する”は、主として配置されるが、遺伝子の転写開始の必ずしも上流側（５′側）ではないＤＮＡ配列因子によって制御される遺伝子発現の調節を指す。制御は、刺激に対して完全な諾、否の応答であってもよいし、または遺伝子発現のレベルを変化させることでもよい。

用語“コード配列”は、タンパク質、ポリペプチド、またはそれらの一部をコードしており、そして転写の開始を推進する制御配列を含まない遺伝子の部分を指す。

“構築物”および“構築する”は、あらゆる起源に由来する一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡの、直鎖状もしくは環状の、プラスミド、ウィルス、自律複製配列、ファージもしくはヌクレオチド配列を指し、それらには、多くのヌクレオチド配列が、独特な構築物中に結合されているか、または組み込まれていて、その構築物は、適切な３゛側の非翻訳配列とともにプロモーター断片および選択された遺伝子産物に関するＤＮＡ配列を、細胞中に導入することができる。

“形質転換”は、核酸（通常は二本鎖ＤＮＡ）の組み込み後の細胞における新しい遺伝子の獲得である。

”操作可能に結合された”は、機能的ＲＮＡに転写されるように、適切な方向および読み枠における２個のＤＮＡ断片の化学的融合を指す。

本明細書で使用される“発現”は、遺伝子産物の配列をコードしている遺伝子から、遺伝子産物への転写および翻訳を意味すると考えられる。

その発現においては、遺伝子産物の配列をコードしているＤＮＡ鎖は、一般にメツセンシャーＲＮＡである相補的なＲＮＡに、最初に転写され、次に、その転写されたメソセンシャーＲＮＡが、もし遺伝子産物がタンパク質である場合には、上記遺伝子産物に翻訳される。

“転写開始シグナル”は、タンパク質合成の開始を指定する核酸中の３個のヌクレオチド（コドン）単位を指す。

本明細書で使用される“プラスミド”は、細胞の主代謝には係わらない遺伝子を、そして通常は環状の二本鎖ＤＮＡの形で、保持する外来の染色体因子を指す。

　“制限エンドヌクレアーゼ”は、二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ中の特異的ヌクレオチド配列において結合し、切断する酵素を指す。

ＡＴＣＣ″は、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄにある寄託機関Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎを指す。その“ＡＴＣＣＮｏ、”は、ＡＴＣＣへの寄託におけて培養物に付された受託番号である。

“ＮＲＲＬ”は、米国農務省のＰｅｏｒｉａ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓにあるＡｇｒｉｃｕｌ　ｔｕｒｅ。

Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを指し、その”ＮＲＲＬＮＯ”は、ＮＲＲＬへの寄託における培養物に付された受託番号である。

本発明は、ストレプトミセス・グリセウス由来の２種の遺伝子・チトクロームＰ４５０ＳＯｙをコードしている５ｏｙＣおよびＰ４５０ｓ。

ｙに電子を伝達するフエレドキノンーｓｏｙをコードしている５ｏｙＢ、によって形質転換されたストレプトミセス属を包含する。これらの２種の遺伝子は、他のストレプトミセス属、ストレプトミセス・グリセウス由来の構成性プロモーター、５ｕａＰによって転写される。これらにより形質転換されたストレプトミセス・リビダンス株は、代謝的に活性なＰ４５０ｓｏｙを構成的に発現し、それによって誘導される必要なしに種々の有機化学物質を代謝することができる。５ｏｙＣおよびΣ−ｏｙ一旦遺伝子の本来のプロモーター、５ｏｙＰは、ストレプトミセス・リビダンスにおいては構成性ではない。このことは、スルホニル尿素を代謝できるストレプトミセス・グリセオルス（ＡＴＣＣ１１−７６）由来の２種の誘導性のチトクロームＰ４５０系（ｓｕａＣおよび５ｕａＢ、ならおいては誘導が必要であるのに、ストレプトミセス・リビダンス中に導入された場合には、構成的に発現される（米国特許出願筒０７／４６４．４９９号、１９９０年１月１２日受理）。

一部に保持される。このＤＮＡの別の起源は、ストレプトミセス・グリセウス（ＡＴＣＣ１０１３７）およびストレプトミセス・グリセウス（ＡＴＣＣ５５１８５）であってもよく、それらは、また、ストレプトミセス・グリセウス（ＡＴＣＣ１３２７３）のチトクロームＰ４５０ｓｏｙと、たとえ同一でなくても、類似のタンパク質を保持している。

好適な給源は、ストレプトミセス・グリセオルス（ＡＴＣＣ１１７９６）由来のｐｃＡＯ３０２における０、６ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片である。

これは、ストレプトミセス・グリセオルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｃｓ　ｇｒｉｓｅｏｌｕｓ）　（ＡＴＣＣ１１７９６）のチトクロームＰ４５０ｓｕａお３３５（１９９０））。そのような構成性プロモーターの別な起源は、ストレプトミセス・クエリカラー（Ｓ、ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアガラーゼ遺伝子のプロモーター（Ｂｕｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　５２：５９９（１９８８））、ストレプトミセス・アズレウス（Ｓ、ａｚｕｒｅｕｓ）由来のチオストレプトン耐性遺伝子（Ｊａｎｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ｂｉｂｂ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２２１：３３９　（１９９０））、およびストレプトミセス・リビダンスのガラクトースオペロンの構成性プロモーター（Ｆｏｒｎｗａｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：２１３０　（１９８７））のものを含むが、それに限定されるものではない。

５ｏｙＣおよび５ｏｙＢ遺伝子に操作可能に結合された構成性プロモーターの組み合わせは、次に、ストレプトミセスを形質転換できるプラスミドＤＮＡ中に導入される。好適なプラスミドは、ｐｌＪ７０２である（Ｋａｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏ、　１２９：２７０３（１９８３））　、使用されるその他のプラスミドは、ｐｌＪｌｏｌの誘導体（Ｋｉｅｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｔ、　１８５：２２３（１９８２））およびＳ　ＣＰ　２　（Ｌｙｄｉａｔｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇｅｎｅ　３５：２２３（１９８５））を含むが、それに限定されるものではない。そのプラスミドは、次いで、宿主ストレプトミセス菌株中にクローン化される。好適なストレプトミセス属宿主は、ストレプトミセス・リビダンスＪ　Ｉ　１３２６である。使用されるその他のストレプトミセス宿主菌株は、ストレプトミセス・グリセウス（ＡＴＣＣ１０１７３）　、ストレプトミセス・グリセウス（ＡＴＣＣ１３２７３）　、ストレプトミセス・クエリカラーＡ３（２）およびストレプトミセス・バルブラス（Ｓ、ｐａｒｖｕｌｕｓ）（ＡＴＣＣ１２４３４）を含むが、それに限定されるものではない。

使用された細菌宿主菌株は、ストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１３２７３、ストレプトミセス・グリセオルスＡＴＣＣ１１７９６、およびストレプトミセス・リビダンスＪ　１１３２６　（ＡＴＣＣ５３９３９）を包含する。そのストレプトミセス菌株は、次の４種の培地で培養された：　（１）液体ＹＥＭＥ　（酵母エキス０．３％、ペプトン領　５％、麦芽エキス０．３％、グルコース１．０％、５ｍＭＭｇＣｌり；　（２）５ｘＳＢＧ　（グリセロール２％、酵母エキス０．５％、大豆粉２．５％、ＮａＣ１０，５％、Ｋ　２　ＨＰ　Ｏ４０、５％、ｐＨ７，０）；　（３）１ｘＳＢＧ（グリセロール２％、酵母エキス０．５％、大豆粉０．５％、ＮａＣｌ０１５％、Ｋ　ｘ　ＨＰ　Ｏ４０、５％、ｐＨ７，０）；　（４））リブティカーゼ・ソイ・ブロス（Ｔ　Ｓ　Ｂ）　（ＢＢＬ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）。一般的に、その培養は、温度２０〜３０℃、最適生育温度約２８〜３０℃ をもつので、好ましくは２５〜３７℃に維持されるべきである。培養は、２８〜３０℃で振盪により生育され、細胞は、約１０．０００ｘｇで１０〜３０分間の遠心により回収された。ペレット細胞は、ＤＥＰバッフｙ　（ＮａＨ２ＰＯ４− １２ＨｚＯ２９，３ｇ／ｌもしくはＮａＨｚＰＯｔ−７Ｈｚ０　２１．９８ｇ／ｌ、ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ２，６２ｇ／Ｉ、ＮａｚＥＤＴＡｏ、０３７ｇ／Ｉ、ジチオスレイトール０．１５４ｇ／Ｉ）に再懸濁され、ある場合には再びベレットにされた。

最終のペレットが、ＤＥＰバッファーに再懸濁され、フレンチプレスにより２０，０００ｐｓｉで細胞を破壊された。破壊細胞は、約４０゜０００ｘｇで３０分間遠心され、可溶性タンパク質画分が分離され、その濃厚液は、バイオラッド・タンパク質定量法（Ｂｉｏｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃ＾）を用いて測定された。ウェスタンプロットは、記載された方法およびチトクロームＰ４５０ｓｏｙに対する抗体を用いて実施された（Ｔｒｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７１：１７８１（１９８９））。

本発明の組み換え体細菌は、当業者には周知の方法を用いて作製される。例えば、ストレプトミセス・グリセオルスの５ｕａＣおよびＳＵａ旦遺伝子由来の転写プロモーター５ｕａＰを含むＤＮＡ断片の導入は、ストレプトミセス・リビダンス中のストレプトミセス・グリセウスの互ｏｙＣおよび５ｏｙＢ遺伝子の上流に、ｌｉｏｐｗｏｏｄらによって記載されたように実施される（Ｈｏｐｗｏｏｄ、　Ｄ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、ストレプトミセスの遺伝子操作：実験室’７−ユアル、Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｗｉｃｈ、　ＵＫ　（１９８５）。イー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）におけるこれらのＤＮＡのクローニングは、ｌ１ａｎｉａｔｉｓらにより記載されたように実施される（ｌｌａｎｉａｔｉｓ、　Ｔｅｔａｌ、、分子クローニングのガイド、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　（１９８２）　ｏ制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏａｂｓ　Ｉｎｃ、より得ることができる。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、Ｃｅｔｕｓ−１’ｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｉｎｃ。

より得ることができる。上記の操作にしたがって、組み換え体細菌ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７は、ストレプトミセス・リビダンスＪ１１３２６から作出された。

本発明の組み換え体細菌は、チトクロームＰ４５０ｓｏｙおよびチトクロームＰ４５０ｓｏｙに電子を供与する鉄−硫黄タンパク質の構成性発現能を有するストレプトミセス属の組み換え体細菌を、酸化されるべき化学物質を含有する培地で培養することによって、有機化学物質を酸化するために使用される。酸化産物は、必要ならば、標準法により測定され得る。

２段階の培養法を使用することが好ましい。段階１では、その細菌は、適切な培地中で温度約２５〜３７°Ｃて５日間生育させられる。段階２では、段階１の培養の一定量が、新鮮な培地に移植され、５日間維持される。その最適な培養法は、段階１では細菌を２８〜３０℃で３日間生育させ、その細菌を新鮮な培地に移植し、段階２では、同じ温度でさらに１日間生育させることによって実施される。第２段階の培養は、次に、本発明の方法のために使用される。すなわち、酸化されるべき物質の一定量が、２４時間経た第２段階培養とともにインキュベートされる。

例えば、第１段階の培養は、ストレプトミセス・リビダンスｐＭＭ００７からの胞子調製液０．５ｍｌを、２．５ＭＭｇＣｌ、溶液およびチオストレプトンの４ｍｇ／ｍｌ保存液６２．５μｌを添加されたＹＥＭＥ培地２５ｍ１と混合することによって調製される。次いで、これは、２８〜２９℃で７２時間、旋回振盪機において培養される。第２段階の培養は、第１段階の培養の２．５ｍｌを新鮮培地２５ｍ１に添加することによって調製される。最後に、評価されるべき物質（例えば、ベンゾピレンもしくはベンジジン）５ｍｇが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような溶媒に溶解され、２４時間目の前記第２段階の培養に添加され、さらに１〜１０日間培養される。液状物質は、直接、その培地に添加される。サンプル（５ｍｌ）が、これらの培養から一定期間毎に採取され、酸化物質の存在について標準法で分析される。

本発明によって提供される組み換え体細菌は、当業者にとって認められているように、多くの商業的に重要な酸化反応を実施するために利用することもできる。

提供された組み換え体細菌によって酸化され得る化合物（およびその結果得られた酸化化合物）は、次のものを包含するが、これに限定されるものではない：ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、ペンタメチルホスホルアミド（ＰＭＰＡ）　、テトラメチルホスホルアミド（テトラＭＰＡ）、ｌ−リンチルホスホルアミド（トリＭＰＡ）、７−ニドキシクマリン（７−ヒドロキシクマリン）；ブレコセン１１（プレコセンージオール）：アニソール（フェノール、２−ＯＨアニソール）：ベンゼン（フェノール）：ビフェニル（４−ＯＨビフェニル）：クロロベンゼン（２−ＯＨクロロベンゼン）；クマリン（７−ＯＨクマリン）；ナフタレン（１−ＯＨナフタレン）ニドランススチルベン（４−ＯＨスチルベン、４，４゛−ジ−ＯＨスチルベン）、トルエン（２−ＯＨｌ−ルエン）：グラウシン（プレジセントリン、ノルグラウシン）；１０，１１−ジメトキシアポルフィン（アポコディン、イソアポコディン）、パパベリン（６−ゾスメチルパパベリン、７−ゾスメチルパパベリン、４゛−デスメチルパバベリン）：ｄ−テトランドリン（Ｎ’−ノルテトランドリン）、サリカルビン（ヘルナンダリノール）、ブルセアンチン（側鎖アルコール、エポキシド）、ビンドリン（ジヒドロビンドリンエーテル、ジヒドロビンドリンエーテル・ダイマー、ジヒドロビンドリンエーテル・エナミン）、ジヒドロビンドリン（１１−デスメチルジヒドロヒントリン）；ロイロジン（１２°　−ヒドロキシロイロジン）：コデイン（１４−ヒドロキシコディン）。

実施例一般的方法チトクロームＰ４５０ｓｏｙおよびフェレドキシン−５ｏｙをコードしている５ｏｙｃおよび５ｏｙＢ遺伝子のクローニングおよびＤＮＡ配列決定チトクロームＰ４５０ｓｏｙは、文献記載のようにストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１３２７３より精製された（Ｔｒｏｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７１：１７８１（１９８９））　ｏチトクロームＰ４５０ｓｏｙの２種の類似形が単離された。Ｐ４５０ｓｏｙ△は、単離の間に試験管内でのタンパク質分解によって生成された（Ｔｒｏｗｅｒ　ｅｔ　ａｌｏ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７１：１７８１（１９８９））。精製Ｐ４５０ｓｏｙタンパク質は、４−ビニルピリジンによってアルキル化され、アルキル化チトクロームＰ４５０ｓｏｙの５ナノモルが、Ｔｒｏｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７１：１７８１（１９８９）に記載されたようにトリプシンで消化された。得られたペプチド断片は、Ｔｒｏｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７１：１７８１（１９８９）記載のように、逆相高速液体クロマトグラフィーによって分割された。Ｐ４５０ｓｏｙのトリプシン消化ペプチド断片の一つおよびＰ４５０ｓｏｙ△タンパク質の一つが、タンパク質／ペプチドの部分アミノ酸配列を決定するために、自動エドマン分解にかけられた。そのＰ４５０ｓｏｙ△タンパク質のＮＨ２−末端配列は、（配列番号　１）。

Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　八ｌａ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＰｒｏB トリプシン消化ペプチドのＮＨ２−末端配列は、（配列番号　２）Ｈｉｓ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ＨＬｓ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＡｓｎＩ　Ｓ　１０　１５である。

トリプシン消化のアミノ酸ＦＧＶ）（ＱＣＬ（配列番号　７）をコードできる可能性のあるＤＮＡ配列よりなるオリゴヌクレオチドの混合物が作製された。それは、次の配列　５’　−ＴＴＣＧＧ　（ＧまたはＣ）ＧＴ（ＧまたはＣ）ＣＡＣＣＡＧＴＧＣＣＴ−３°　（配列番号３−６）よりなる。そのオリゴヌクレオチド混合物の合成において、（ＧまたはＣ）として示された二つの位置は、ＧまたはＣの同等の混合物よりなり、したがって、オリゴヌクレオチド混合物は、全部で４種の異なる種類よりなる。

ＤＮＡライブラリーは、文献記載の方法によりストレプトミセス・グリセウスＡＴＣＣ１３２７２由来のＤＮＡを用いて、ベクターＥＭＢ　Ｌ４中に構築された（Ｏｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７２：３３３５（１９９０））。

オリゴヌクレオチド混合物は、Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼ（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、分子クローニングへのガイド、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

（１９８２））を用いて［３２Ｐコー末端にラベルされ、そしてＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ。

ｅｔａｌ、、分子クローニングへのガイド、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　（１９８２）記載のように、次の条件下でストレプトミセス・グリセウスＤＮＡのＥＭＢ　Ｌ　、４ライブラリーをプローブするために使用された　プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションは、６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣは０．１５ＭＮａＣ］、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）＋０５％ＳＤＳ中で５０°Ｃで実施された。フィルターは、６ｘＳＳＣ＋０５％ＳＤＳ中で５０°Ｃて２回、６ｘＳＳＣ十Ｑ、５％ＳＤＳ中て室温で１回洗浄された。

ハイブリダイズしたプラークが単離され、４．８ｋｂｓａｃｌＤＮＡ断片が、オリゴヌクレオチドプローブ混合物にハイブリダイズする一つのクローンから単離された。

４．８ｋｂＳａｃｌＤＮΔ断片のセグメントが、配列決定され（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　７４：５４６３　（１９７７））　［図１］、分子量約４５，４００のタンパク質をコードしている１２３６塩基対のオーブン読み枠を有することが分かった。このオーブン読み枠中に、上記チトクロームＰ４５０ｓｏｙのトリプシン消化ペプチドから決定されたアミノ酸配列に、正確に対応した部分があった。アミノ酸４で始まるオーブン読み枠のＮＨ，−末端配列は、Ｐ４５０ｓｏｙ△に対して決定されたアミノ酸配列と同じである（オーブン読み枠のアミノ酸３０において、セリンがシスティンに変わっているほかは）。我々は、Ｐ４５０ｓｏｙタンパク質をコードしているその遺伝子を５ｏｙＣと名づけだ。

５ｏｙＣに対する停止コドンの下流の５個のヌクレオチド、６５個のアミノ酸のその他のオーブン読み枠が、同定された。このオーブン読み枠は、それぞれｓ　ｕ’ａ　Ｂおよび５ｕｂＢ遺伝子によってコードされるストレプトミセス・グリセオルスの既に同定されたフェレドキシン、フェレドキシン−１およびフェレドキシンー２と４０〜５０％の同一性を示す（０°Ｋｅｅｆｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｓｔｒｙ　３０：４４７　（１９９１））　ｏストレプトミセス・グリセウス由来のこの明らかにフエレドキンン様タンパク質をコードしている遺伝子は、５ｏｙＢと命名され、そのタンパク質は、フェレドキシン−５ｏｙと命名される。

比較実施例ストレプトミセス・リビダンスにおける５ｏｙＣおよび５ｏｙＢの、５ｏｙＰプロモーターからの非構成性発現５ｏｙＣおよび５ｏｙＢ遺伝子を有する４、３ｋｂＳａｃｌＤＮΔが、プラスミドｐＭ〜１００１を作出するために５ａｃｌ開裂されたｐＢＩｕｅ　ｓ　ｃ　ｒ　ｉ　ｐ　ｔ　ｋ　ｓベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｉｎｃ、、　ＳａｎＤｉｅｇｏ、　ＣＡ）中に（図３）、およびプラスミドｐＭＭＯＯ５を作出するために５ａｃｌ開裂されたｐ　Ｕ　Ｃ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇｅｎｅ　３３：１０３（１９８５））中ニ（図５）クローン化（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　１９８２）された。次いで、その４．８ｋｂ旦見旦Ｉ挿入断片は、ｐＭＭＯＯｌから離脱され、ｐＣＡ０２００　（Ｏｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７０：２１７４（１９８８））のＳａｃ　１部位に、クローン化され、ｐＭＭＯＯ２（図５）を作出した。プラスミドｐＭＭＯＯ２は、ストレプトミセス・リビダンスに導入され、ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ２（図５）を作出した。

ベクターｐｃＡＯ２００を保持するストレプトミセス・リビダンスＭＭ００２の２種の独立した菌株およびストレプトミセス・リビダンスＣ２００の１株が、各々８．５％シュークロース含有の２５ｍＩＹＥＭＥ培地２本において、３０℃で約６０時間生育された。これらの各培養の一つが、４．２５％シュークロース含有のＹＥＭＥ培地１００ｍ１に、そして他のものは、５ｘＳＢＧ培地１００ｍ１で継代培養された。３０℃で４８時間生育後、さらに生育培地１００ｍ１が添加され、細胞はさらに３時間生育された。その細胞が回収され、材料および方法において記載されたように処理され、２種の異なる培地で生育された菌株の各々の可溶性タンパク質抽出物を得た。各タンパク質のサンプル１０μｇが、ウェスタンプロット分析によってチトクロームＰ４５０ｓｏｙの存在に関して分析された。

図４においては、高レベルのＰ４５０ｓｏｙは、精製Ｐ４５０ｓｏｙタンパク質を含む列に、および５ｘＳＢＧで生育されたストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ２においてのみ見られる。ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ２がＹＥＭＥにおいて生育した場合には、非常に低いレベルが見られる。したがって、ストレプトミセス・リビダンスにお１３２７２）ＤＮＡ断片由来のＰ　４５０−ｓ　ｏ　ｙ　ノ発現１；！、ストレフトミセス・グリセウスにおけると同様に大豆粉によって誘導された。このことは、ストレプトミセス・グリセオルス由来のチトクロームＰ４５０とは異なる。ストレプトミセス・グリセオルスにおいて２種のスルホニル尿素に誘導されるチトクロームＰ４５０に関する遺伝子は、ストレプトミセス・リビダンス中に導入された場合には、構成的に発現され、誘導物質の存在を必要としない。

実施例１か久ヒがｌ興り月肛ｌ虹」μ懸態駐い上辻ス・リビダンスストレプトミセス・リビダンスにおいてＰ４５０ｓｏｙを構成性発現するために、ストレプトミセス・グリセオルスの５ｕａＣおよびｓｕａ旦遺伝子の上流に知 −ン化された。５ｕａＰは、ストレプトミセス。

グリセオルス（ＡＴＣＣ１１７９６）ｓｕａＣ遺伝子の上流ζ＝配装され、ｐｃＡＯ３０２（Ｄｏ、６ｋｂＥ旦旦旧−且ａｍ旧断片上に配置される（Ｏｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１？２：３３３５（１９９０））　、旦ｃｏＲ１部位は、ストレプトミセス・グリ切ス５ｏｙＣのＡＴＧ開始コドンの２３ｂｐ上流に、ポリラーゼ連鎖反応を行って導入された（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｓｙ＋ｎｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　５１：２６３（１９８６））　ｏ　■ 対のプライマーが、５ｏｙＣ遺伝子においてＰＣＲを実施するために使用された。一つのオリゴヌクレオチド　５°　ＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＣＧＡＧＧＣＧＡＣ３’　（配列番号　８）　は、ソノ５’　、［近＜）ＥｃｏＲ１部位とともに、５ｏｙＣ遺伝子の上流に１５塩基対を有シタ。

その池のオリゴヌクレオチドは、５’　ＧＡＴＣＡＧＣＧＣＧＣＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ３’　（配列番号　９）であり、５ｏｙＣ遺伝子のＸｈ。

１部位の隣接領域と相同である。これらの２種のオリゴヌクレオチドが、鋳型としてｐＭＭＯＯｌを用いて５ｏｙＣを増幅するために使用された場合には、約０．６７ｋｂ断片が増幅された。このＤＮＡの増幅のために使用された条件は、次のようである　１０ｍＭＴｒｉｓ−ＣＩ　ｐＨ８，３，０，０５ＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣＩ２．ｏ、００１％ゼラチン、０．２ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、および０．０５ｍＭｄＧＴＰ＋０．１５ｍＭ　７−ゾアザーｄＧＴＰ０各オリゴヌクレオチドは、１ｍＭにおいて使用され、ｐＭＭＯＯ１鋳型１０ｎｇおよびＴａｑポリメリンセ２．５ユニツトが、１００μｍ反応において使用された。増幅に使用された温度は、次のとおり。

１、１００°Ｃ，２分、９２８Ｃ，５分（Ｔａｑポリメラーゼ添加）；７２℃、２分：１サイクル：２、９６℃、１分：４７°Ｃ，１分ニア２°０．２分、５サイクル：３　９６° Ｃ，１分、６５°Ｃ，１分ニア２°Ｃ，２分：２５サイクル；４　７２°Ｃ，５分、１サイクル。

増幅されたＤＮＡは、２Ｍ酢酸アンモニウム＋イソプロパツール１容量により、 −２０℃で一夜沈殿させた。その沈殿は、４°Ｃで１２．　０００ｘｇ１５分間遠心分離され、７０％エタノールで２回洗浄され、Ｈ２Ｏに最腎濁された。

ｐＭＮ４００４の作出は、次のように行った。ＥｃｏＲＩリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍ＾）を増幅されたＤＮＡ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔａｌ、　１９８２）に付加した後、増幅された０、６７ｋｂＤＮＡ断片が、ＰＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　３３：１０３（１９８５））のＥｃｏＲＩ部および５ｏｙＢをを含む４．８ｋｂ旦ａｃｌ断片が、ｐＭＭＯＯｌより切り取られ、Ｓａｃ１部位においてｐＵｃ１９中に挿入されて、プラスミドｐＭＭＯＯ５を作出した。３種の連結反応が、１）付加されたＥｃｏＲ１部位をもつ５ｏｙＣの一末端を有するｐＭＭＯＯ３（７）０．６７ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片、２）ｓｕａＰを有するｐｃＡＯ３０２（１）０．６ｋｂＥｃｏＲＩ一旦ａｍＨＩ断片、および３）ｓｏｙｃ遺伝子ノ部分、５ｏｙＢ遺伝子およびｐＵＣ１９を有するｐＭＭＯＯ５（７）約６゜０ｋｂＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片、の間で行われた。その結果得たベクターは、ｐＭＭＯＯ４（図５）である。

プラスミドｐＭＭＯＯ７の作出は、次のように行われた。プラスミドｐ　Ｉ　Ｊ７０２−３２２が、５ｐｈＩ開裂されたｐｌＪ７０２　（Ｋａｔｚｅｔａｌ、、　Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１２９：２７０３（１９８３））を、５ｐｈｌ開裂されたｐＢＲ３２２に連結することによってイー・コリ（Ｅ、ｃｏ　Ｉ　ｉ−）において作製された（Ｈｏｆｆ＋ｎａｎ、　Ｋ、　Ｈ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａ５ｉｃ　１ｌｉｃｒｏｂｉｏ１．３０：３７（１９９０））。ｐＢＲ３２２が、イー・コリにおいて複製するのに対して、ｐｌＪ７０２は、ストレプトミセス・リビダンスにおいて複製できる。

ｐＩ　Ｊ７０２−３２２は、旦ａｃｌにより切断され、５ｏｙＣ，ｓｏｙにより切断され、そのプラスミドのｐＢＲ３２２部分とｐＭＭＯＯ６の残りの部分とを分離するために、希釈条件下（〜３μｇ／ｍｌ）で自己連結させて（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２）　、イー・コリではできないがストレプトミセス・リビダンスでは複製できるプラスミドｐＭＭＯＯ７を作出した。この連結されたＤＮＡは、ストレプトミセス・リビダンスに導入してストレプトミセス・リビダンスＭＭＱＱ７を作出するために使用された（図６、参照）。

ストレプトミセス・リビダンスの形質転換は、）！ｏｐｗｏｏｄらの記載により実施された（Ｈｏｐｏｏｄ、　Ｄ、　Ａ、ｅｔ　ａｌ、、ストレプトミセスの遺伝子操作・実験室マニュアル、Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｄａｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｗｉｃｈ、　ＵＫ　（１９８５））。

イー・コリにおけるＤＮＡのクローニングは、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法により実施された（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、分子クローニングへのガイド、Ｃｏｔｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　（１９８２））　ｏ制限酵素およびＤＮＡ修飾酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡから入手した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、Ｃｅｔｕｓ−Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｉｎｃ、より入手した。

ｐ　Ｉ　Ｊ　７０２により形質転換されたストレプトミセス・リビダンスおよびストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７の２５ｍ１培養が、３０℃で６０時間、ＹＥＭＥ培地もしくはチオストレプトン５μｇ／ｍＩ添加の５ｘＳＢＧ培地で生育された。ストレプトミセス・グリセウスは、３０℃で６０時間、ＹＥＭＥ培地もしくは添加の５ｘＳＢＧ培地で生育された。６０時間後、新鮮培地１０ｍ１が、各培養に添加され、その培養は、さらに２時間、振盪で４５分間、３０℃で培養された。その培養が回収され、可溶性タンパク質画分が、各培養から分離された。その培養からのタンパク質のウェスタンプロットが、チトクロームＰ４５０ｓｏｙの発現を検出するために行われた。図７において見られるように、ストレプトミセス・リビダンス〜１Ｍ０Ｏ７におけるチトクロームＰ４５０ｓｏｙの発現は、少なくともストレプトミセス・グリセウスにおけると同程度に高く、大豆粉の添加は、ストレプトミセス・リビダンスＭＭ００７におりるＰ４５０ｓｏｙの高レベルの発現に対して必要ではなかった。

実施例２ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７が、２段階発酵法にしたがって生育された（２５ｍｌ培養）。その微生物の培養に使用された培地は、次のもの含有するＹＥＭＥであった・酵母エキス（３ｇ／Ｉ）；ペプトン（５ｇ／ｌ）；麦芽エキス（３ｇ／Ｉ）；グルコース（Ｌｏｇ／ｌ）；ンユークロース（３４０ｇ／ｌ）；　２．５ＭＭｇＣ１２溶液（２ｍｌ／Ｌ）。チオストレプトンが、その微生物におけるプラスミドの維持を安定化させるために添加された（４ｍｇ／ｍｌ保存溶液を６２，５μｍ）。

第１段階培養は、ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７の胞子懸濁液から開始した。段階１における３日間の生育後、２０％接種量が、新鮮なＹＥＭＥ培地の段階２培養を開始するために使用された。２４時間後、ＨＭＰＡ３ｍｌが、その培養に添加され、２４時間および４８時間におけるサンプル５ｍｌが、採取され、酢酸エチル３ｍｌを用いて抽出された。その混合液は、激しく旋回により抽出され、その有機層と水層を分別した。有機層は、ガラスびんに移され、窒素ガス流下で蒸発させた。

ガスクロマトグラフィーおよび’ＪｆＪｌスペクトル（ＧＣ：／ＭＳ）分析（カーボワックス毛細管カラム（Ｊ、Ｗ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｆｏｌｓｕｍ、　ＣＡ）を使用、２０ｍ、１０°／分において６０ないし２００の温度勾配）は、ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７によるＨＭＰＡの分解を示している。ペンタメチル−ホスホルアミド（ＰＭＰＡ）およびその他の代謝物が同定された。ガスクロマトグラフィー分析は、Ｖａｒｉａｎ　Ｖｉｓｔａ　６０００（Ｖａｒｉａｎ　Ｃｏ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）において行われた。質量スペクトル分析は、ＶＧ　７０７０　Ｉｔｓ　Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ　Ｌｔｄ、　、　Ｍａｎｃ■ ｅｓｔｅｒ、　ＵＪ：、）において行われた。

実施例３その他の実施態様においては、３個の段階１培養が遠心され、得られた細胞ペーストが、新鮮なＹＥＭＥ培地を有する１個の２５ｍ１容培養フラスコに添加されることを除いて、ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７が、上記のように使用された。ＨＭＰＡｏ、２ｍｌが、直ちに第２段階培養に添加された。サンプルは、上記のように採取された。ＧＣ／ＭＳ分析は、多（の異なる代謝物の存在を示した。ＨＭＰＡに接触させられた場合の、ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７によるＰＭＰＡおよびその他の代謝物の生成は、ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７のＨＭＰＡ分解能の強いことを示している。

実施例３におけるＩ−（Ｍ　Ｐ　Ａの代謝は、数種の化合物の生物変換のために、ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７が利用されることを示している。

対照実験が、ＨＭ　Ｐ　Ａがストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７の培養に添加されない状態で遂行された。この培養は、上記のように抽出され、ＧＣ／ＭＳによって分析された。すべての対照試験サンプルにおいて存在が見られる一つのピークは別として、ＨＭＰＡサンプルとストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７において観察されたピークは、全（、対照においては存在しなかった。このデータは、試験サンプルにおいて観察されたピークがストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７によるＩ−（Ｍ　Ｐ　Ａの代謝に由来することを確認させた。

以上の記述から、当業者は、容易に本発明の本質的特徴を把握することができ、その精神と範囲を逸脱することなく、種々の使用と条件に適応させるために、本発明に種々の変更と改変を加えることができる。ストレプトミセス・リビダンスＭＭＯＯ７は、ブダペスト条約の下に、米国タイプカルチャー・コレクションに寄託され、ＡＴＣＣ６８８８３と命名された。この菌株は、寄託日以降少なくとも３０年間、そして最も近いサンプル請求後生なくとも５年間、維持されるであろう。

配　列　表（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ・３０アミノ酸（Ｂ）　型　アミノ酸（Ｃ）　鎮の数　不明（Ｄ）　トポロジー　不明（１１）　分子型・ペプチド（ｘｉ）　配列名：配列番号１（２）　配列番号２に関する情報（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ・１９アミノ酸（Ｂ）　型　アミノ酸（Ｃ）　鎖の数　不明（Ｄ）　トポロジー　不明（１１）　分子型　ペプチド（Ｘｌ）　配列名：配列番号２Ｈｉｓ　Ｈ工５Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　）Ｉｉｓ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ５　Ｎｏ　１ｓＬａｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ（２）　配列番号３に関する情報（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：２０塩基対（Ｂ）　型　・核酸（Ｃ）　鎖の数、−末鎖（Ｄ）　トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）　分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列名、配列番号３ＴＴＣＧＧＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＴＧＣＣＴ　２０（２）　配列番号４に関する情報（１）　配列の特徴（Ａ）　長さ、２０塩基対（Ｂ）　型　：核酸（Ｃ）　鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）　トポロジー：直鎖状（１１）　分子型　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｘ　ｉ）　配列名・配列番号４ＴＴＣＧＧＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＧＣＣＴ　２０（２）　配列番号５に関する情報（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：２０塩基（Ｂ）　型　核酸（Ａ）　長さ＋１７３５アミノ酸（Ｂ）　型　、核酸（Ｃ）　鎖の数ニー重鎖（Ｄ）　トポロジー：直鎖状（ｉ　ｉ）　分子型：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘ　ｉ）　配列名：配列番号１０ＡＴＣＴＣＧＣ丁ＣＧ　ＧＣＡＣＧＴ？ＣＡＣＧＣＴＧＣ？ＧＡＧＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴＧＣＧＧＧＣＣ１０Q０ＧＧＣＧＧＧＡＣＧＡ　ＧＣＡＣＣＧＣＣＧＴ　ＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧ　ＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＴＴＣＣＴＣＴＣＣＡＴＣＧＣＣＧＡＧ@１０８０ＧＡＣＡＣＧＡＴＣＣＡＧＧＧＣＣＴＣＣＴ　ＣＧＡＣＣＴＧＣＣＣＧＴＧＧＣｔｊＧＧＴ　ＧＡＧＣＧＧＣＧＴＧ　ＧＧＡＧＴＣＣＡＧＧ@１１４０ τＣＧＡＣＡＡＧＧＡ　ＡＣＧＣＴＧＴＧＴＧ　ＧＧＣＧＣＣＧＧＣＡ　ＴＧテＧＴＧＣＧＣＴ　ＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧ　ＧＡＣＧ丁ＣＴ？b入　１５００（２）　配列番号１１に関する情報（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：４１２アミノ酸（Ｂ）　型　二アミノ酸（Ｃ）　！Ｊｌの数：不明（Ｄ）　トポロジー：不明（ｉ　ｉ）　分子型：タンパク質（ｘｉ）　配列名：配列番号１１Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｈ＠　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

０　ＣＩ　ＯＣ１０ＣＩ　ＣＩ　ＣＩ　：　０　０　真　：：ｚψ　へ　の　− 〇　Ｕ　Ｎ　：　、、　、、　。　ｉ　〉　ロ　■−−へ　Ｆｉｌ”ＩＣ（（’ＪＣ（Ｌｌ　％Ｃ）　１−Ｉ：ｊ　ｅｎ　：ｊ　ｆｉ□−Ｇ　ｆ）と　Ｓ鴬　？′　３　５　窃　武ε　昌　ご＋−１：Ｉ　Ｅ　Ｏ，ＯＡ　＞：ｊＷ　％Ｏａｌ；３Ｂ ′　計　ε　Ｂ　３　ε　四呂　＝ト　コ　り　＞　ＯＩＪ’１　勺　コ　−　り　−のｇ　！　５　３　にさ　篇　Ｓ　Ｓ　目　酩０（：ｕ’ｔＱ＋：ＩＱ＋０　Φイトωト！　じ　２　Ｊ　コ　！　だ胃Ｊ＝Ｊ１１　妨　弓　ひい　旬　Φ　飄　旬　コｕ’＋＋む　ミ　限　８　千　＝　＄　；　Ｓ疋　躍Φ　り　ひ　の　い　−コ　い　ω　コ０＝　Ｕ　曝　ご　５第　ε　３−　ｔ　冊ｆ−４ｕ＋Ｉ　コ　Ｃい　ひ　〜り　−　コ　■　υ＞、ｓａ＜＜＜　士　８３　謳　避田ψ　−ｒＩ　−− ０１ｄ　ＱＩ　：ｊＯコ　Ｐ−Ｉ　Ｃ：　コ　り　〇　−た　限　２　北　３　 ε　ｚ　３　翻　ＣＣ（トＨし− ■ Ｃ’Ｊトー→ 一ＦＩＧ、５ｂＦＩＧ、６１２、　ａ）（ｉ）ストレプトミセス属細菌において、５ｏｙＣおよりローン化されたプロモーターをコードしている第１の領域＋（ｉｉ）ストレプトミセス・グリセウスのチトクロームＰ４５０ｓｏｙをコードしている第２の領域であって、フェレドキシン−５ｏｙのコード領域の上流に存在する該第２の領域；および（ｉｉｉ）ストレプトミセス・グリセウスのフェレドキシンーｓｏｙをコードしている第３の領域であって、酸化されるべき化学物質の存在下に、プロモーター領域またはその下流に、操作可能に結合される該第３の領域；を必須のものとして含む配列番号１０に示した核酸断片を含有するストレプトミセス属微生物を生育させること、ならびにｂ）化学物質の酸化より生じる１種ないしそれ以上の生成物を得ること、を含んでなる生化学的酸化方法。

１３、本質的に以下のものよりなる群から選ばれる二酸化される化学物質が、ヘキサメチルホスホルアミド（Ｔ（ＭＰＡ）　、ペンタメチルホスポルアミド（ＰＭＰＡ）　、テトラメチルホスホルアミド（テトラＭＰＡ）、トリメチルホスホルアミド（トリＭＰＡ）　、７−ニトロアニリン、ブレコセンＩＩ、アニソール、ベンゼン、ビフェニル、クロロベンゼン、クマリン、ナフタレン、トランス− スチルベン、トルエン、グラウシン、１０，１１−ジメトキシアポルフィン、パパベリン、ｄ−テトランドリン、サリカルピン、プルセアンチン、ビンドリン、ジヒドロビ１４、酸化される化学物質が、１６−０−アセチルビンドリン、アグロクラビン、アジマリン、アングイジン、アニソール、アニリン、アスビドスペルミン、２−アミノアセチルフルオレン、２−アミノアントラセン、４−アミノビフェニルベンゼン、ベンジジン、ベンゾピレン、ビフェニル、ビス−ベンジルイソキノリン　ｄ−テトランドリン、プルセアンチン、クロラムフェニコール、クロロピクリン、クマリン、クロロベンゼン、１．４−シネオール、コディン、コルヒチン、コーチシン、シクロヘキサン、４−クロロ−２−ニトロアニリン、デオキシコルチコステロン、６ａ、９ａ−ジフルオロ−１１ｂ、２１−ジヒドロキシ−１６ａ、１７ａ−イソプロピリデンジオキシ−４−プレグネン−３，２０ −ジオン、１’　、２’−ジヒドロトチノン、ジヒドロストレブトシルーストレプチジン−６−ホスフェート、ジヒドロビンドリン、１４．１５−ジヒドロビンドリン、６．７−シヒドロキシクマリン、１０．１１−ジメトキシアポルフィン、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノメチル−エン−４−クロロ−２−メチルアニリン、３，３°−ジメチルベンジジン、３．３゛−ジメトキシベンジジン、２，４−ジアミノトルエン、７．１２−ジメチルベンズアントラセン　エリモクラビン、ニスタルジオール、エストロン、７−エ］・キシクマリン、フォルマイシン、グラウシン、グリソキセピド、ヒドロコルチゾン、ヘキサメチルホスホルアミド、ロイロジン、マンノシドストレプトマイシン、Ｎ−メチルコルヒセインアミド、ナフタレン、ヌシフェリン、Ｎ−ニトロソジメチルアミン、パバベリン、プロゲステロン、キニジン、トランス−スチルベン、ｄ−テトランドリン、テトラメチルホスホルアミド、サリカルピン、チオコルヒチン、トルエン、トリアセトキシシルペン、ビンドリン、およびピリジンを必須のちのとして含んでなる群より選ばれる請求の範囲第１２項の方法。

国際調査報告　！１ｒＴ／ｌｌｅ　（ｌつｕｎｏｏｃＰＣＴ／ＵＳ　９２／１０８８５フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　１１０６　Ｚ　７４１７−４Ｂ１３１０２　２１２１−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１０９　ＺＮＡＣ１２Ｒ１：５４５）（Ｃ１２Ｎ　１／２１Ｃ１２Ｒ１：４６５）（Ｃ１２Ｎ　９１０２Ｃ１２Ｒ１：４６５）（７２）発明者　オマー、チャールズ・アンソニーアメリカ合衆国ペンシルベニア州１９３３５ダウニングタウン・ノーウッドロード４０６ＩＣ１２Ｒ１：５４５）

Claims

【特許請求の範囲】

１．ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）由来のチトクロームＰ４５０ｓｏｙ遺伝子を含むＳａｃ１制限酵素断片を含んでなる精製核酸断片。
２．Ｓａｃ１断片の５′末端に、操作可能に結合されたプロモーター領域をさらに含む請求の範囲第１項記載の精製核酸断片。
３．請求の範囲第２項記載の精製核酸断片であって、そのプロモーター領域が、ストレプトミセス・グリセオルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｎｓｅｏｌｕｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・アズレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｚｕｒｅｕｓ）もしくはストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌｉｖｉｄａｎｓ）に由来する精製核酸断片。
４．フェレドキシン−ｓｏｙをコードしている領域をさらに含む請求の範囲第１項記載の精製核酸断片。
５．次のものを含む核酸断片：ａ）ストレプトミセス属細菌において、ｓｏｙＣおよびｓｏｙＢを構成的に転写できるストレプトミセス・グリセオルスからクローン化されたプロモーターをコードしている第１の領域：ｂ）ストレプトミセス・グリセウスのチトクロームＰ４５０ｓｏｙをコードしている第２の領域であって、フェレドキシン−ｓｏｙのコード領域の上流に存在する該第２の領域；およびＣ）ストレプトミセス・グリセウスのフェレドキシン−ｓｏｙをコードしている第３の領域であって、プロモーター領域の下流に、機能的に結合される該第３の領域。
６．請求の範囲第５項の核酸断片を含む、ストレプトミセスにおいて発現可能な組み換え体ベクター。
７．請求の範囲第６項のベクターを含む組み換え体ストレプトミセス。
８．図６記載のベクタ−ｐＭＭＯ０７を含むストレプトミセス・リビダンス。
９．ａ）適切な培地において請求の範囲第８項のストレプトミセスを生育させること；およびｂ）チトクロームＰ４５０ｓｏｙを単離することを含んでなるチトクロームＰ４５０ｓｏｙの構成性生産方法。
１０．ａ）代謝されるべき化学物質の存在下で、ｐＭＭ００７を含有するストレプトミセス属の微生物を生育させること；およびｂ）化学物質の代謝により生じる１種ないしそれ以上の生成物を得ること、を含んでなる生化学的酸化方法。
１１．酸化される化学物質が、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰＡ）、ペンタメチルホスホルアミド（ＰＭＰＡ）、テトラメチルホスホルアミド（テトラＭＰＡ）、トリメチルホスホルアミド（トリＭＰＡ）、７−エトキシクマリン；プレコセンＩＩ；アニソール；ベンゼン；ビフェニル；クロロベンゼン；クマリン；ナフタレン；トランス−スチルベントルエン；グラウシン；１０，１１−ジメトキシアポルフィン；パパベリン；ｄ−テトランドリン；サリカルピン；ブルセアンチン；ビンドリン；ジヒドロビンドリン；ロイロシン；およびコデインからなる群より選ばれる請求の範囲第１０項の方法。