KR20220054709A - 한 그룹의 글리코실전이효소 및 그 응용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 한 그룹의 글리코실전이효소 및 그 응용에 관한 것으로, 구체적으로, 글리코실전이효소 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7, 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4 및 이의 유도 폴리펩티드가 터페노이드계 화합물의 글리코실화에 대한 촉매 작용 및 새로운 사포닌 합성에 있어서의 응용을 제공하는 바, 여기서, 글리코실전이효소는 특이하고 효과적으로 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물 기질의 C-20부위 및/또는 C-6부위 및/또는 C-3의 히드록시기 글리코실화에 대하여 촉매 작용을 할 수 있거나, 및/또는 글리코실기 공여체에서 제공되는 글리코시기를 테트라사이클릭 트리터페노이드 화합물의 C-3부위의 첫 번째 글리코시기 상에 전이시켜 당사슬을 연장하도록 한다. 본 발명의 글리코실전이효소는 인공합성 희유 인삼 사포닌 및 다양한 새로운 인삼 사포닌 및 그 유도체를 구성하는데 응용될 수도 있다.

Description

한 그룹의 글리코실전이효소 및 그 응용{GROUP OF GLYCOSYLTRANSFERASES AND USE THEREOF}
본 발명은 생물기술과 식물생물학 분야에 관한 것인 바, 구체적으로, 본 발명은 글리코실전이효소(glycosyltransferase) 및 그 응용에 관한 것이다.
인삼 사포닌는 인삼 및 그 동족 식물(예를 들어, 삼칠삼, 서양삼 등) 중에서 분리해낸 사포닌의 총칭인 바, 트리테르페노이드계 사포닌(triterpenoid saponin)에 속하고, 인삼 중의 주요한 유효 성분이다. 현재, 인삼 중에서 적어도 60가지의 사포닌을 이미 분리해냈는데, 여기서, 일부 인삼 사포닌은 광범위한 생리적 기능과 약용가치를 구비한다는 것이 이미 실증되었는 바, 그 생리적 기능과 약용가치에는 항종양, 면역조절, 항피로, 심장보호, 간보호 등 기능들이 포함된다.
구조상에서 볼 때, 인삼 사포닌은 사포게닌(sapogenin)이 글리코실화를 거친 후 형성된 생물 활성 소분자이다. 인삼 사포닌의 사포게닌에는 유한한 몇가지 종류만 있는데, 주요하게 다마렌(dammarane) 타입의 프로토파낙사디올(protopanaxadiol), 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol) 및 올레아놀릭산(oleanolic acid)이 있다. 근년에, 사람들은 삼칠삼 중에서 새로운 사포게닌인 25-OH-PPD과 25-OCH3-PPD을 분리해냈는데, 이러한 새로운 사포게닌은 모두 아주 좋은 항종양 활성을 구비한다.
사포게닌은 글리코실화를 거친 후, 수용성이 향상될 수 있고, 상이한 생리 활성을 나타나게 될 수 있다. 프로토파낙사디올 타입 사포닌의 당사슬은 보통 사포게닌의 C3 (및) 또는 C20의 히드록시기 상에 결합된다. 프로토파낙사트리올 사포닌과 프로토파낙사디올 사포닌을 비교해 보면, C6부위에는 히드록시기가 하나 더 많고, 현재 발견된 프로토파낙사트리올 타입 사포닌은 모두 C6 (및) 또는 C20의 히드록시기 상에 글리코실화를 결합시킨 것이고, C3상에 글리코실기를 결합시킨 프로토파낙사트리올 타입 사포닌은 아직 보도된 바가 없다. 글리코실기는 포도당, 람노스(rhamnose), 자일로오스(xylose) 및 아라비노스(arabinose)일 수 있다.
상이한 글리코실기 결합부위, 당사슬조합 및 길이는 인삼 사포닌이 생리적 기능과 약용가치상에서 큰 차이점 발생되도록 한다. 예를 들어, 인삼 사포닌 Rb1, Rd 및 Rc는 모두 프로토파낙사디올을 사포게닌으로 한 사포닌으로서, 이들 사이의 차이점은 단지 글리코실기 수식 상에서의 차이점이지만, 이들 사이의 생리적 기능에는 아주 많은 차이점이 있다. Rb1은 중심신경세포 시스템을 안정시키는 기능을 가지고 있으나, Rc의 기능은 중심신경세포 시스템을 억제하는 것이고, Rb1의 생리적 기능은 아주 광범위하지만, Rd는 단지 아주 제한된 몇가지 기능만 가지고 있다.
인삼 사포닌 사포게닌과 사포닌 사이의 구조 다양성은 공간입체 구조 상에서 구현되기도 하는데, 비록 테트라사이클릭 트리터페노이드(tetracyclic triterpenoid)의 골격 상에 아주 많은 키랄(chiral) 탄소 원자가 존재하지만, 공간입체 구조를 형성할 수 있는 탄소 원자는 주요하게 C20부위 상에 존재한다. 거의 매 하나의 인삼 사포닌과 사포게닌에는 모두 C20부위의 에피머(epimer)가 존재한다. 인삼에서, C20부위 S 배열의 인삼 사포닌과 사포게닌의 함량은 C20부위 R 배열의 인삼 사포닌과 사포게닌의 함량보다 훨씬 높기에, 일반적인 정황하에서 말하는 인삼 사포닌과 사포게닌은 모두 C20부위 S 배열의 인삼 사포닌과 사포게닌을 의미한다. 그러나, 인삼 사포닌과 사포게닌 C20부위의 에피머는 현저히 다른 생리적 기능을 구비한다. 예를 들어, S 배열 인삼 사포닌 Rh2(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20(S)-protopanaxadiol)는 전립선암세포를 현저히 억제할 수 있으나, R 배열 인삼 사포닌(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20(R)-protopanaxadiol)의 억제효과는 아주 약하다. R 배열 인삼 사포닌 Rh2는 파골세포의 생성을 선택적으로 억제할 수 있고 어떠한 세포독성 작용이 없지만, S 배열 인삼 사포닌 Rh2는 파골세포의 생성을 억제하는 작용이 아주 약하나, 파골세포에 대한 세포독성 작용은 아주 강하다. 또한, S 배열과 R 배열 인삼 사포닌 Rh2은 P-당단백질에 대한 조절작용에서도 아주 큰 차이점이 존재한다.
글리코실전이효소의 기능은 글리코실기 공여체(뉴클레오시드2인산당(nucleoside diphosphate sugar), 예를 들어, UDP-포도당) 상의 글리코실기를 상이한 글리코실기 수용체 상에 전이시키는 것이다. 아미노산 서열이 상이함에 따라, 현재 글리코실전이효소에는 이미 94개의 패밀리가 있다. 현재 이미 시퀀싱(sequencing)된 식물 게놈 중에는, 수백가지 이상의 상이한 글리코실전이효소가 발견되었다. 이러한 글리코실전이효소의 글리코실기 수용체에는 당, 지방, 단백질, 핵산, 항생소 및 기타 소분자가 포함된다. 인삼 중에서 사포닌글리코실화에 참여하는 글리코실전이효소의 작용은 글리코실기 공여체 상의 글리코실기를 사포게닌 또는 아글루콘(aglucon)의 C-3, C-6 또는 C-20의 히드록시기 상에 전이시킴으로써, 상이한 약용가치를 구비하는 사포닌을 형성하는 것이다.
현재, 연구원들은 인삼, 화기삼 및 삼칠삼에 대한 전사체 분석을 통하여, 이미 대량의 글리코실전이효소 유전자를 발견하였지만, 어떤 글리코실전이효소가 인삼 사포닌의 합성에 참여하는지는 아직 확정하지 못하였다. 인삼 중에 아주 많은 양의 글리코실전이효소가 함유되어 있고, 그들의 함량이 또한 모두 낮기 때문에, 이들에 대한 분리정제 연구는 진전이 느리다.
희유 인삼 사포닌은 인삼 중에서의 함량이 극히 낮은 사포닌을 의미한다. 인삼 사포닌 CK(20-O-β-(D-glucopyranosyl)-20(S)-protopanaxadiol)은 프로토파낙사디올계의 사포닌에 속하고, 사포게닌의 C-20부위 히드록시기 상에 하나의 글루코실기(glucosyl)가 연결되어 있다. 인삼 중에서의 인삼 사포닌 CK의 함량이 극히 낮은데, 이는 프로토파낙사디올 타입 사포닌이 인체 장도 중에서 미생물에 의해 가수분해된 후 생성된 주요한 대사 산물이다. 연구 결과, 다수의 프로토파낙사디올 타입 사포닌은 단지 CK로 대사된 후에야만 인체에 흡수될 수 있기에, 인삼 사포닌 CK는 직접 인체에 흡수되고 작용을 발휘하는 진정한 실체이지만, 기타 사포닌는 단지 약물 전구체이다. 인삼 사포닌 CK는 아주 좋은 항종양 활성을 구비하므로, 종양세포의 아포토시스(Apoptosis)를 유도할 수 있어 종양세포의 전이를 억제할 수 있다. 이와 방사선 치료 및 화학 요법의 결합실험은 방사선 치료 및 화학 요법의 효과를 강화시킬 수 있다. 이 밖에, 인삼 사포닌 CK는 항과민 활성, 항염증 활성을 더 구비하고, 신경보호 작용, 항당뇨병 작용 및 항피부노화 작용을 일으킬 수 있다. 인삼 사포닌 CK의 약리적 활성은 멀티타겟(Multi-target), 고 활성 및 저독성 특징을 구비한다.
인삼 사포닌 F1(20-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)은 프로토파낙사트리올 타입 사포닌에 속하는데, 이가 인삼 중에서의 함량도 아주 낮고, 희유 인삼 사포닌에 속한다. 인삼 사포닌 F1의 구조는 인삼 사포닌 CK의 구조와 아주 근접한 바, 이 역시 사포게닌의 C-20부위 히드록시기 상에 하나의 글루코실기가 연결되어 있다. 인삼 사포닌 F1도 독특한 약용가치를 구비하는데, 이는 항노화 및 항산화 기능을 구비한다.
인삼 사포닌 Rh1(6-O-β-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)은 프로토파낙사트리올 타입 사포닌에 속하는데, 이가 인삼 중에서의 함량도 아주 낮고, 희유 인삼 사포닌에 속한다. 인삼 사포닌 Rh1의 구조는 인삼 사포닌 F1의 구조와 아주 근접하지만, 이의 글리코실화 부위는 C6부위 상의 히드록시기이다. 인삼 사포닌 Rh1도 특수한 생리적 기능을 구비하는데, 항과민 및 항염증 기능을 구비한다.
인삼 사포닌 Rh2(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20(S)-protopanaxadiol)이 인삼 중에서의 함량은 극히 낮은 바, 그 함량은 대략 인삼 건조중량의 만분의 1정도밖에 안되고, 이 역시 희유 인삼 사포닌에 속한다. 그러나, 인삼 사포닌 Rh2는 우수한 항종양 활성을 구비하는데, 인삼 중에서 제일 주요한 항종양 활성 성분 중의 하나로서, 종양세포의 생장를 억제하고, 종양세포의 아포토시스를 유도하며, 종양의 전이를 방지할 수 있다. 연구 결과, 인삼 사포닌 Rh2는 lung cancer cells 3LL (mice), Morris liver cancer cells (rats), B-16 melanoma cells (mice), 및 HeLa cells (human)의 증식을 억제할 수 있다. 임상에서, 인삼 사포닌 Rh2와 방사선 치료 및 화학 요법의 결합치료는 방사선 치료 및 화학 요법의 효과를 강화시킬 수 있다. 이 밖에, 인삼 사포닌 Rh2는 항과민 기능, 생물체 면역력을 향상시키는 기능, NO과 PGE이 발생시키는 염증을 억제하는 등 작용을 더 구비한다.
인삼 사포닌 Rg3이 인삼 중에서의 함량도 아주 낮은데, 이는 현저한 항종양 작용을 구비하고, 항종양 기능 방면에서 인삼 사포닌 Rg2와 상보성을 구비하며, 임상사용에서 증명된 바와 같이, Rg3과 Rh2를 연합하여 사용하면, 그 종양치료의 효과증대 작용은 진일보로 향상된다.
희유 인삼 사포닌 CK, F1, Rh1, Rh2 및 Rg3의 함량이 아주 낮기 때문에, 현재의 생산방법은 인삼 중에서 대량의 사포닌으로부터 출발하여, 글리코실기에 대하여 선택적으로 가수 분해를 진행하는 방법을 통하여 전환시킨 후, 추출 및 정제를 진행한다. 인삼속 식물의 조사포닌 또는 프로토파낙사디올계 사포닌을 원료로 하여, 20(S)-원 인삼 사포닌-Rh2에 대하여 전환, 분리 및 추출을 진행한다. 상기 제조방법의 장점은 대량의 글리콜계 사포닌을 이용한 것이지만, 고온 및 고압하에서 반응이 진행되어야 한다(쑹창춘(宋長春) 등. 20(S)-인삼 사포닌-Rh2의 제조방법 및 그 약물조성물 및 응용[P]. 중국특허: 1225366, 1999년). 한국 인삼 연초 연구소에서는, 우선, 프로토파낙사디올 사포닌 조성 성분을 얻은 후, 산 가수 분해 처리를 거쳐 20(R &S )-인삼 사포닌-Rg3을 얻고, 다음, 인삼 사포닌 Rg3를 처리하여 인삼 사포닌 Rh2를 얻는 것을 특징으로 하는 인삼 성분 중에서 20(R &S )-인삼 사포닌-Rh2를 제조하는 두가지 방법을 공개하였다. 상기 방법의 주요한 결점은, 산물의 최초재료로는 프로토파낙사디올계 패밀리 단량체 사포닌이 필요하기에 반응단계가 비교적 번거롭게 되고, 원료손실이 크게 되며, 조작이 번거롭게 되기에, 원가의 증가를 초래하였고, 또한, 산율의 향상이 어려워지는 것이다. CK와 F1은 C-20부위에서의 글리코실기가 가수 분해 과정 중에서 쉽게 파괴되기에, 화학법은 CK와 F1의 생산에 적용되지 않는다. 산성법과 알칼리법으로 사포닌을 가수분해하여 Rh1을 제조하는 산율은 아주 낮고, 또한 아주 많은 부산물이 존재하기도 한다.
효소전환법은, 조건이 온화하고, 전문성이 강하며, 산물이 쉽게 분리정제되는 특징이 있기 때문에, 현재 CK, F1 및 Rh1을 생산하는 주요방법이다. 인삼 사포닌 CK, F1, Rh1 및 Rh2를 제조하기 위한 효소로는 주요하게 나린기나아제(naringinase), 펙티나아제(pectinase), 셀룰라아제(cellulose) 및 락타아제(lactase) 등이 있다. 인삼 사포닌 CK도 미생물 전환방법을 통하여 얻을 수 있는데, 주요하게 장도에서 오는 혐기균을 이용한다. 비록 생물 전환법(효소법과 미생물법)으로 희유 인삼 사포닌 CK, F1, Rh1 및 Rh2를 제조하는데 있어서 아주 큰 진보를 가져왔지만, 그 원료가 인삼 사포닌이기에, CK, F1, Rh1 및 Rh2를 제조하는 원가가 여전히 높고, 그 생산량도 상당히 제한되어 있다(중국특허: CN1105781C; 찐뚱쓰(金東史) 등, 대련경공업학원학보, 2001년).
인삼 사포닌 Rh2의 중요한 생물 활성과 거대한 경제가치로 인하여, 수십년 동안 사람들도 화학합성 방법을 계속 이용하여 이러한 사포닌을 생산하려고 시도하였는데, 그 기본적인 사고의 맥락은 프로토파낙사디올과 상응한 글리코실기를 축합하여 형성되는 것인 바, 즉, 반합성법(일본특허: 特開平8-208688, 1996년)이다. 상기 방법은 프로토파낙사디올을 원료로 하여 20(S )-원 인삼 사포닌-Rh2에 대하여 반합성을 진행하는 것이고, 그 합성단계는 6개 단계로 나뉘고, 글리코실화반응 중에서 당량의 탄산은을 촉매로 하여 사용하였기에, 가격이 높음으로써, 상기 방법의 원가가 비교적 높게 되며, 아울러, 상기 촉매의 입체 선택성이 높지 않으므로, 산물 수득률이 낮다. 또 다른 방법은 방향족 탄화수소계의 아실기 또는 알킬기를 이용하여 프로토파낙사디올C-12부위의 히드록시기를 치환한 다음, 유기용매와 불활성 기체의 보호하에서, C-1이 히드록시기 활성화되게 하기 위한 글루코실기 공여체를 첨가하고, 분자체(molecular sieve)에 루이스산과의 촉매 작용하에서 일어나는 축합반응이 존재하고, 생성된 산물은 칼럼크로마토그래피(column chromatography) 또는 재결정정제를 거친 후, 보호라디칼을 제거하여, 20(S)-인삼 사포닌-Rh2를 얻는다(훼이융쩡(惠永正), 20(S)-인삼 사포닌-Rh2의 제조방법, 중국특허: CN 1587273A, 2005년).
현재 본 기술분야에는 아직 효과적으로 희유 인삼 사포닌 CK, F1, Rh1, Rh2 및 Rg3을 생산하는 방법이 결핍하므로, 다양한 특이하고 효과적인 글리코실전이효소의 개발이 절박하다.
본 발명의 목적은 한 그룹의 글리코실전이효소 및 그 응용을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1양태에서,
글리코실전이효소의 존재하에서, 글리코실기 공여체의 글리코실기를 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물의 C-20부위, C-6부위, C-3부위 상 또는 C-3부위의 첫 번째 글리코실기 상에 전이시키는 단계;
글리코실화된 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물을 형성하는 단계를 포함하고;
여기서, 상기 글리코실전이효소는,
SEQ ID NOs.: 2, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 글리코실전이효소에서 선택되는 체외 글리코실화 방법을 제공하였다.
본 발명의 제2양태에서,
(a) SEQ ID NOs.: 2, 16, 18, 20, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열을 구비하는 폴리펩티드;
(b) SEQ ID NOs.: 2, 16, 18, 20, 26, 28, 41, 4산 서열을 구비하는 폴리펩티드; 3, 55, 57, 59 또는 61 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드를 하나 또는 다수의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가를 거쳐 형성되거나, 또는 신호펩티드 서열을 첨가한 후 형성되고, 글리코실전이효소 활성을 구비하는 유도 폴리펩티드;
(c) 서열 중에, (a) 또는 (b)에 따른 폴리펩티드 서열이 함유되는 유도 폴리펩티드;
(d) 아미노산 서열과, SEQ ID NOs.: 2, 16, 18, 20, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열의 상동성≥85% 또는 ≥90%(바람직하게≥95%)이고, 글리코실전이효소 활성을 구비하는 유도 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 폴리펩티드를 제공하였다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 서열(c)은 (a) 또는 (b)에 표식서열, 신호서열 또는 분비신호서열을 추가한 후 형성된 융합단백질이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 2, 16, 18, 20, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드이다.
본 발명의 제3양태에서,
(a1) SEQ ID NOs.: 22, 24 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열을 구비하는 폴리펩티드;
(b1) 서열 중에 (a1)에 따른 폴리펩티드 서열이 함유되는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 및/또는
(a2) SEQ ID NOs.: 4 또는 6 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열을 구비하는 폴리펩티드;
(b2) SEQ ID NOs.: 4 또는 6 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드를 하나 또는 다수의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가를 거쳐 형성되거나, 또는 신호펩티드 서열을 추가한 후 형성되고, 글리코실전이효소 활성을 구비하는 유도 폴리펩티드;
(c2) 서열 중에 (b2)에 따른 폴리펩티드 서열이 함유되는 유도 폴리펩티드;
(d2) 아미노산 서열과 SEQ ID NOs.: 4 또는 6 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열의 상동성≥85%(바람직하게≥95%)이고, 글리코실전이효소 활성을 구비하는 유도 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 분리된 폴리펩티드를 제공하였다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 서열(c2)은 (a2) 또는 (b2)에 표식서열, 신호서열 또는 분비신호서열을 추가한 후 형성된 융합단백질이다.
본 발명의 제4양태에서,
(A) 제1양태 또는 제2양태에 따른 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열;
(B) SEQ ID NOS.: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열;
(C) SEQ ID NOS.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60으로 표시되는 뉴클레오티드 서열;
(D) SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60으로 표시되는 서열과의 상동성≥95%(바람직하게≥98%)인 뉴클레오티드 서열;
(E) SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5'말단 및/또는 3'말단에서 1~60개(바람직하게 1~30, 더욱 바람직하게 1~10개)의 뉴클레오티드를 절단하거나 첨가하여 형성된 뉴클레오티드 서열;
(F) (A)~(E)의 임의의 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 상보적인(바람직하게 완전히 상보적) 뉴클레오티드 서열에서 선택되는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공하였다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 뉴클레오티드의 서열은, SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60과 같다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 서열은, SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드가 아미노산 서열을 암호화한 것은 각각 SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 폴리펩티드이다.
본 발명의 제5양태에서, 제3양태에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터를 제공하였다. 바람직하게, 상기 벡터는 발현 벡터, 셔틀 벡터(shuttle vector), 통합 벡터(integration vector)를 포함한다.
* 본 발명의 제5양태에서, 본 발명의 제1양태 또는 제2양태에 따른 분리된 폴리펩티드의 용도를 제공하였는 바, 그 용도는 글리코실기 공여체에서 제공되는 글리코실기를 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물 C-20부위 및/또는 C-6부위 및/또는 C-3부위의 히드록시기에 전이시켜, 상기 히드록시기의 H를 교체하는 반응; 및 글리코실기 공여체에서 제공되는 글리코실기를 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물의 C-3부위의 첫 번째 글리코실기 상에 전이시켜 당사슬을 연장하는 반응 중의 하나 또는 여러가지 반응에 대하여 촉매 작용을 하거나, 또는 상기 하나 또는 여러가지 반응에 대하여 촉매 작용을 하는 촉매제제를 제조하기 위한 것이다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 글리코실기 공여체는, UDP-포도당, ADP-포도당, TDP-포도당, CDP-포도당, GDP-포도당, UDP-아세틸 포도당, ADP-아세틸 포도당, TDP-아세틸 포도당, CDP-아세틸 포도당, GDP-아세틸 포도당, UDP-자일로오스, ADP-자일로오스, TDP-자일로오스, CDP-자일로오스, GDP-자일로오스, UDP-갈락투론산(galacturonic acid), ADP-갈락투론산, TDP-갈락투론산, CDP-갈락투론산, GDP-갈락투론산, UDP-갈락토오스(galactose), ADP-갈락토오스, TDP-갈락토오스, CDP-갈락토오스, GDP-갈락토오스, UDP-아라비노스, ADP-아라비노스, TDP-아라비노스, CDP-아라비노스, GDP-아라비노스, UDP-람노스, ADP-람노스, TDP-람노스, CDP-람노스, GDP-람노스, 또는 기타 뉴클레오시드2인산 헥소오스(nucleoside diphosphate hexose) 또는 뉴클레오시드2인산 펜타오스(nucleoside diphosphate pentose), 또는 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오시드2인산당을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 글리코실기 공여체는 UDP-포도당, UDP-갈락투론산, UDP-갈락토오스, UDP-아라비노스, UDP-람노스, 또는 기타 우리딘 2인산 헥소오스 또는 우리딘 2인산 펜타오스, 또는 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 우리딘 2인산(UDP)당을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 분리된 폴리펩티드는 하기 하나 또는 여러가지 반응에 대하여 촉매 작용을 하거나, 또는 하기 하나 또는 여러가지 반응에 대하여 촉매 작용을 하는 촉매제제를 제조하기 위한 것이다.
Figure pat00001
상기 식에서, R1은 H, 단당 글리코실기 또는 다당 글리코실기이고; R2와 R3은 H 또는 OH이며; R4는 글리코실기이고; 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, 16, 18 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 단당은 포도당(Glc), 람노스(Rha), 아세틸 포도당(Glc(6)Ac), 아라비노푸라노오스(Araf), 아라보피라노오스(Arap), 자일로오스(Xyl) 등을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 다당은 Glc(2-1)Glc, Glc(6-1)Glc, Glc(6)Ac, Glc(2-1)Rha, Glc(6-1)Arap, Glc(6-1)Xyl, Glc(6-1)Araf, Glc(3-1)Glc(3-1), Glc(2-1) Glu(6)Ac, Glc(6-1)Arap(4-1)Xyl, Glc(6-1)Arap(2-1)Xyl, 또는 Glc(6-1)Arap(3-1)Xyl 등 2-4개의 단당으로 조성된 다당을 포함한다.
R1-R4가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00002
즉, 상기 R1, R2가 모두 H이고, R3이 OH일 때, 상기 식(I) 화합물은 프로토파낙사디올(PPD)이고;
R1이 하나의 글루코실기이고, R2가 H이며, R3이 OH일 때, 상기 식(I) 화합물은 인삼 사포닌 RH2이며;
R1이 두개의 글루코실기이고, R2가 H이며, R3이 OH일 때, 상기 식(I) 화합물은 인삼 사포닌 RG3이고;
R1이 H이고, R2가 OH이며, R3이 OH일 때, 상기 식(I) 화합물은 프로토파낙사트리올(PPT)이며;
R1이 H이고, R2가 H이며, R3이 H일 때, 상기 식(I) 화합물은 다마렌디올(DM)이다.
Figure pat00003
상기 식에서, R1은 H 또는 글리코실기이고, R2는 글리코실기이며, R3은 글리코실기이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 2, 16, 18 또는 20 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되거나;
또는, R1은 H 또는 글리코실기이고; R2은 H이며; R3은 글리코실기이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO.: 20 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
R1-R3가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00004
즉, R1, R2가 모두 H일 때, 상기 식(III) 화합물은 프로토파낙사트리올(PPT)이다.
R1이 H이고, R2가 글루코실기일 때, 상기 식(III) 화합물은 인삼 사포닌 F1이다.
Figure pat00005
상기 식에서, R1은 H 또는 OH이고; R2는 H 또는 OH이며; R3은 H 또는 글리코실기이고; R4는 글리코실기이며, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24, 41, 43 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
R1-R4가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00006
즉, R1과 R3이 모두 H이고, R2가 OH일 때, 상기 식(V) 화합물은 프로토파낙사디올(PPD)이고;
R1이 H이고, R2가 OH이며, R3이 글루코실기일 때, 상기 식(V) 화합물은 인삼 사포닌 CK이며;
R1이 OH이고, R2가 OH이며, R3이 H일 때, 상기 식(V) 화합물은 프로토파낙사트리올(PPT)이고;
R1이 OH이고, R2가 OH이며, R3이 글루코실기일 때, 상기 식(V) 화합물은 인삼 사포닌 F1이고;
R1이 H이고, R2가 OH이며, R3이 H일 때, 상기 식(V) 화합물은 다마렌디올(DM)이다.
기질이 PPD일 때, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24, 41, 43 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되고; 기질이 CK일 때, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24, 43 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되며; 기질이 PPT일 때, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24, 41 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되고; 기질이 F1과 DM일 때, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
Figure pat00007
상기 식에서, R1은 OH 또는 OCH3이고; R2는 글리코실기이며, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24, 41, 43 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
R1-R2가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00008
즉, R1이 OH일 때, 상기 식(VII) 화합물은 25-OH-PPD이고;
R1이 OCH일 때, 상기 식(VII) 화합물은 25-OCH3-PPD이다.
Figure pat00009
상기 식에서, R1은 글리코실기이고; R2와 R3은 OH 또는 H이며; R4는 글리코실기 또는 H이고; R5는 글리코실기이며, R5-R1-O은 C3 첫 번째 글리코실이 유도된 글리코실기이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 26, 28, 55, 57, 59, 61 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
R1-R4가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00010
즉, R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 H일 때, 식(IX) 화합물은 Rh2이다.
R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 글루코실기일 때, 식(IX) 화합물은 F2이다.
Figure pat00011
상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 22 또는 SEQ ID NO: 24 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다. 식(XI) 화합물은 라노스테롤(lanosterol)이고, 식(XII) 화합물은 3-O-β-(D- glucopyranosyl)-lanosterol이다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 글리코실기는 글루코실, 갈락투론산, 갈락토실(galactosyl), 아라비노실(arabinosyl), 람노실(rhamnosyl), 및 기타 헥소실(hexosyl) 또는 펜토실(pentosyl)에서 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 반응식 (I), (III), (V), (VII), (IX) 또는 (XI) 화합물은 S 배열 또는 R 배열의 다마렌 타입 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물, 라노스탄(Lanostane) 타입 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물, 티루칼레인(tirucallane) 타입 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물, 사이클로아르테인(cycloartane) 타입 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물, 쿠커비테인(cucuribitane) 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물, 또는 멜리아케인(meliacane) 타입 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 폴리펩티드는,
(a) SEQ ID NOs.: 2, 16, 18, 20, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열을 구비하는 폴리펩티드;
(b) SEQ ID NOs.: 2, 16, 18, 20, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드를 하나 또는 다수의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가를 거쳐 형성되거나, 또는 신호펩티드 서열을 추가한 후 형성되고, 글리코실전이효소 활성을 구비하는 유도 폴리펩티드;
*(c) 서열 중에, (a) 또는 (b) 중의 상기 폴리펩티드 서열이 함유되는 유도 폴리펩티드;
(d) 아미노산 서열과, SEQ ID NO: 2, 16, 18, 20, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열의 상동성≥85% 또는 ≥90%(바람직하게≥95%)이고, 글리코실전이효소 활성을 구비하는 유도 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 폴리펩티드는
(a1) SEQ ID NOs.: 22, 24 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열을 구비하는 폴리펩티드;
(b1) 서열 중에 (a1) 중의 상기 폴리펩티드 서열이 함유되는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 및/또는
(a2) SEQ ID NOs.: 4 또는 6 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열을 구비하는 폴리펩티드;
(b2) SEQ ID NOs.: 4 또는 6 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드를 하나 또는 다수의 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 첨가를 거쳐 형성되거나, 또는 신호펩티드 서열을 추가한 후 형성되고, 글리코실전이효소 활성을 구비하는 유도 폴리펩티드;
(c2) 서열 중에 (b2) 중의 상기 폴리펩티드 서열이 함유되는 폴리펩티드;
(d2) 아미노산 서열과 SEQ ID NOs.: 4 또는 6 중의 임의의 하나로 표시되는 아미노산 서열의 상동성≥85%(바람직하게≥95%)이고, 글리코실전이효소 활성을 구비하는 유도 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드는,
(A) 본 발명의 제1양태 또는 제2양태에 따른 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열;
(B) SEQ ID NOS.: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열;
(C) SEQ ID NOS.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60으로 표시되는 뉴클레오티드 서열;
(D) SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60으로 표시되는 서열과의 상동성≥95%(바람직하게≥98%)인 뉴클레오티드 서열;
(E) SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60으로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 5'말단 및/또는 3'말단에서 1~60개(바람직하게 1~30, 더욱 바람직하게 1~10개)의 뉴클레오티드를 절단하거나 첨가하여 형성된 뉴클레오티드 서열;
(F) (A)~(E)의 임의의 하나로 표시되는 뉴클레오티드 서열과 상보적인(바람직하게 완전히 상보적) 뉴클레오티드 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 뉴클레오티드의 서열은 SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60과 같다.
또 다른 바람직한 실시예에서, SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60으로 표시되는 폴리뉴클레오타이드가 아미노산 서열을 암호화한 것은 각각 SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 폴리펩티드이다.
본 발명의 제6양태에서, 글리코실기 전이 촉매화 반응을 진행하는 방법을 공개하였는 바, 본 발명의 제2양태 또는 제3양태에 따른 폴리펩티드 또는 이의 유도 폴리펩티드가 존재하는 조건하에서, 글리코실기 전이 촉매화 반응을 진행하는 단계를 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 방법은,
글리코실기 공여체 및 본 발명의 제2양태 또는 제3양태에 따른 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드의 존재하에서, 상기 식(I) 화합물을 상기 식(II) 화합물로 전환시키거나, 또는 식(III) 화합물을 상기 식(IV) 화합물로 전환시키거나, 또는 식(V) 화합물을 상기 식(VI) 화합물로 전환시키거나, 또는 식(VII) 화합물을 상기 식(VIII) 화합물로 전환시키거나, 또는 식(Ⅸ) 화합물을 상기 식(X) 화합물로 전환시키거나, 또는 식(XI) 화합물을 상기 식(XII) 화합물로 전환시키는 단계를 더 포함하고;
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 방법은,
상기 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드를 각각 촉매화 반응에 첨가하는 단계; 및/또는
상기 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드를 동시에 촉매화 반응에 첨가하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 방법은,
글리코실기 공여체 및 본 발명의 제2양태와 제3양태에 따른 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드 중에서 둘 이상의 폴리펩티드가 공동으로 존재하는 조건하에서, 식(I) 화합물을 식(IV), (VI), (VIII), (X)의 화합물로 전환시키거나, 또는 식(III) 화합물을 식(II), (VI), (VIII), (X)의 화합물로 전환시키거나; 또는 식(V) 화합물을 식(II), (IV), (VIII), (X)의 화합물로 전환시키거나, 또는 식(VII) 화합물을 식(II), (IV), (VI), (X)의 화합물로 전환시키거나, 또는 (IX) 화합물을 식(II), (IV), (VI), (VIII)의 화합물로 전환시키는 단계를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 방법은, 글리코실전이효소를 암호화한 뉴클레오티드 서열을 다마렌디올(dammarendiol) 및/또는 프로토파낙사디올 및/또는 프로토파낙사트리올 합성대사경로 중의 관건적인 유전자와 숙주세포 중에서 공통발현시킴으로써, 상기 식(II), (IV), (VI), (VIII), (X) 또는 (XII) 화합물을 얻는 단계를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 효모균 또는 대장균이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 아미노산 서열의 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드를 구비한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 폴리펩티드를 암호화한 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60과 같다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 반응 시스템에 효소 활성을 조절하기 위한 첨가물을 제공하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 효소 활성을 조절하기 위한 첨가물은, 효소 활성을 향상시키거나, 또는 효소 활성을 억제하는 첨가물이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 효소 활성을 조절하기 위한 첨가물은, Ca2+, Co2+, Mn2+, Ba2+, Al3+, Ni2+, Zn2+, 또는 Fe2+로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 효소 활성을 조절하기 위한 첨가물은, Ca2+, Co2+, Mn2+, Ba2+, Al3+, Ni2+, Zn2+, 또는 Fe2+의 물질을 생성할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 글리코실기 공여체는 뉴클레오시드2인산당인 바, UDP-포도당, ADP-포도당, TDP-포도당, CDP-포도당, GDP-포도당, UDP-아세틸 포도당, ADP-아세틸 포도당, TDP-아세틸 포도당, CDP-아세틸 포도당, GDP-아세틸 포도당, UDP-자일로오스, ADP-자일로오스, TDP-자일로오스, CDP-자일로오스, GDP-자일로오스, UDP-갈락투론산, ADP-갈락투론산, TDP-갈락투론산, CDP-갈락투론산, GDP-갈락투론산, UDP-갈락토오스, ADP-갈락토오스, TDP-갈락토오스, CDP-갈락토오스, GDP-갈락토오스, UDP-아라비노스, ADP-아라비노스, TDP-아라비노스, CDP-아라비노스, GDP-아라비노스, UDP-람노스, ADP-람노스, TDP-람노스, CDP-람노스, GDP-람노스, 또는 기타 뉴클레오시드2인산 헥소오스 또는 뉴클레오시드2인산 펜타오스, 또는 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 글리코실기 공여체는 우리딘 2인산당인 바, UDP-포도당, UDP-갈락투론산, UDP-갈락토오스, UDP-아라비노스, UDP-람노스, 또는 기타 우리딘 2인산 헥소오스 또는 우리딘 2인산 펜타오스, 또는 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 반응 시스템의 pH는 4.0-10.0이고, 바람직하게는 5.5-9.0이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 반응 시스템의 온도는 10℃-105℃이고, 바람직하게는 20℃-50℃이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 다마렌디올(dammarendiol) 합성대사경로 중의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성효소 유전자를 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 프로토파낙사디올 합성대사경로 중의 관건적인 유전자는, 다마렌디올 합성효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A47 유전자와 P450 CYP716A47의 환원효소 유전자, 또는 그 조합을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 프로토파낙사트리올 합성대사경로 중의 관건적인 유전자는, 다마렌디올 합성효소 유전자, 시토크롬(cytochrome) P450 CYP716A47 유전자, P450 CYP716A47의 환원효소 유전자, 및 시토크롬 P450 CYP716A53V2 유전자 및 그 환원효소 유전자, 또는 그 조합을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 글리코실 촉매화 반응의 기질은 식(I), (III), (V), (VII), (IX) 또는 (XI) 화합물이고, 상기 산물은 (II), (IV), (VI), (VIII), (X) 또는 (XII) 화합물이며;
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 식(I) 화합물은 프로토파낙사디올 PPD(Protopanaxadiol)이고, 식(II) 화합물은 인삼 사포닌 CK(20-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올)(20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))이거나;
또는, 상기 식(I) 화합물은 인삼 사포닌 Rh2(3-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올)(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))이고, 식(II) 화합물은 인삼 사포닌 F2(3-O-β-(D-글루코피라노실)-20-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올)(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))이거나;
또는, 상기 식(I) 화합물은 인삼 사포닌 Rg3이고, 식(II) 화합물은 인삼 사포닌 Rd이거나;
또는, 상기 식(I) 화합물은 프로토파낙사트리올 PPT(Protopanaxatriol)이고, 식(II) 화합물은 인삼 사포닌 F1(20-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사트리올)(20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol))이거나;
또는, 상기 식(I) 화합물은 다마렌디올 DM(Dammarenediol II)이고, 식(II) 화합물은 인삼 사포닌20-O-β-(D-글루코피라노실)-다마렌디올 (20-O-β-(D-glucopyranosyl)-Dammarenediol II이거나;
또는, 상기 식(III) 화합물은 프로토파낙사트리올 PPT이고, 식(IV) 화합물은 인삼 사포닌 Rh1(6-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사트리올)(6-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol))이거나;
또는, 상기 식(III) 화합물은 인삼 사포닌 F1이고, 식(IV) 화합물은 인삼 사포닌 Rg1 (6-O-β-(D-글루코피라노실)-20-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올)(6-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))이거나;
또는, 상기 식(V) 화합물은 프로토파낙사디올이고, 식(VI) 화합물은 인삼 사포닌 Rh2 (3-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올) (3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))이거나;
또는, 상기 식(V) 화합물은 CK이고, 식(VI) 화합물은 인삼 사포닌 F2(3-O-β-(D-글루코피라노실)-20-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사디올) (3-O-β-(D-glucopyranosyl)-20-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxadiol))이거나;
또는, 상기 식(V) 화합물은 프로토파낙사트리올 PPT이고, 식(VI) 화합물은 인삼 사포닌 3-O-β-(D-글루코피라노실)-프로토파낙사트리올(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol)이거나;
또는, 상기 식(V) 화합물은 인삼 사포닌 F1이고, 식(VI) 화합물은 인삼 사포닌 3-O-β-(D-글루코피라노실)-F1(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-F1)이거나;
또는, 상기 식(V) 화합물은 다마렌디올 DM이고, 식(VI) 화합물은 인삼 사포닌 3-O-β-(D-글루코피라노실)-다마렌디올 (3-O-β-(D-glucopyranosyl)-Dammarenediol II)이거나;
또는, 상기 식(VII) 화합물은 25-OH- 프로토파낙사디올(25-OH- protopanaxadiol)이고, 식(VIII) 화합물은 인삼 사포닌 3-O-β-(D-글루코피라노실)-25-OH-프로토파낙사디올(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-protopanaxadiol)이거나;
또는, 상기 식(VII) 화합물은 25-OCH3-프로토파낙사디올(25-OCH3-protopanaxadiol)이고, 식(VIII) 화합물은 인삼 사포닌 3-O-β-(D-글루코피라노실)-25-OCH3-프로토파낙사디올(3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OCH3-protopanaxadiol)이거나;
또는, 상기 식(IX) 화합물은 인삼 사포닌 Rh2이고, 식(X) 화합물은 인삼 사포닌 Rg3이거나;
또는, 상기 식(IX) 화합물은 인삼 사포닌 F2이고, 식(X) 화합물은 인삼 사포닌 Rd이거나.
또는, 상기 식(XI) 화합물은 라노스테롤(lanosterol)이고, 식(XII) 화합물은 3-O-β-(D-글루코피라노실)-라노스테롤(3-O-β-(D- glucopyranosyl)-lanosterol)이다.
본 발명의 제7양태에서, 본 발명의 제5양태에 따른 벡터를 포함하거나, 또는 이의 게놈 중에 본 발명의 제4양태에 따른 폴리뉴클레오타이드가 통합되어 있는 유전자 공학에 의한 숙주세포를 제공하였다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 글리코실전이효소는 본 발명의 제2양태 또는 제3양태에 따른 폴리펩티드 또는 이의 유도 폴리펩티드이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 글리코실전이효소를 암호화한 뉴클레오티드 서열은 본 발명의 제4양태에서 서술한 바와 같다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 세포는 원핵세포 또는 진핵세포이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 진핵세포인 바, 예를 들어, 효모 세포 또는 식물세포이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 사카로미세스 세레비시아(Saccharomycess cerevisiae)효모 세포이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 원핵세포인 바, 예를 들어, 대장균이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 인삼세포이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 (II), (IV), (VI), (VIII), (X) 또는 (XII) 화합물을 천연적으로 생성시키는 세포가 아니다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 희유 인삼 사포닌 CK 및/또는 희유 인삼 사포닌 F1 및/또는 희유 인삼 사포닌 Rh2 및/또는 Rg3 및/또는 Rh1, 및/또는 새로운 인삼 사포닌20-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β- (D-glucopyranosyl)-PPT, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-F1, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-DM, 3-O-β- D-glucopyranosyl)-25-OH-PPD, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OCH3-PPD, 및 및/또는 Rh1, F2, Rd 및 Rg1 등을 천연적으로 생성시키는 세포가 아니다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 다마렌디올(dammarendiol) 합성대사경로 중의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성효소 유전자를 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 프로토파낙사디올 합성대사경로 중의 관건적인 유전자를 함유하고, 다마렌디올 합성효소 유전자, 시토크롬 P450 CYP716A47 유전자, 및 P450 CYP716A47의 환원효소 유전자, 또는 그 조합을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는 프로토파낙사트리올 합성대사경로 중의 관건적인 유전자를 함유하고, 다마렌디올 합성효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A47 유전자, P450 CYP716A47의 환원효소 유전자, 및 시토크롬P450 CYP716A53V2 유전자, 또는 그 조합을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
본 발명의 제8양태에서, 효소 촉매제제를 제조하거나, 또는 글리코실전이효소를 생산하거나, 또는 촉매세포로 사용하거나, 또는 식(II), (IV), (VI), (VIII), (X) 또는 (XII), 화합물을 생성하기 위한 제7양태에 따른 숙주세포의 용도를 제공하였다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 숙주세포는, 다마렌디올(dammarendiol)(DM) 및/또는 프로토파낙사디올(PPD) 및/또는 프로토파낙사트리올(PPT)에 대한 글리코실화 반응을 통하여, 새로운 사포닌 20-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII 및/또는 3-O-β- (D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-F1 및/또는 희유 인삼 사포닌 CK 및/또는 희유 인삼 사포닌 F1 및/또는 희유 인삼 사포닌 Rh1 및/또는 희유 인삼 사포닌 Rh2 및/또는 희유 인삼 사포닌 Rg3을 생성하기 위한 것이다.
본 발명의 제9양태에서, 제7양태에 따른 상기 유전자 공학에 의한 숙주세포를 식물로 재생시키는 단계를 포함하고, 상기 유전자 공학에 의한 숙주세포가 식물세포인, 형질전환 식물을 생성하는 방법을 제공하였다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 유전자 공학에 의한 숙주세포는 인삼세포이다.
본 발명의 범위내에서, 본 발명의 상기 각 기술특징과 아래(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명하는 각 기술특징 사이에서는 모두 상호적인 조합이 가능함으로써, 새로운 또는 바람직한 기술적 해결수단을 구성함을 이해하여야 한다. 편폭의 제한으로 인해, 여기서 더 일일이 설명하지 않도록 한다.
아래 도면은 본 발명의 구체적인 실시방식을 설명하기 위한 것일 뿐, 특허청구범위에 의해 정해진 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.
도1은 gGT25 유전자, gGT25-1 유전자, gGT25-3 및 gGT25-5 유전자 PCR 산물의 아가로스 겔 전기영동(Agarose Gel Electrophoresis) 도이다.
도2는 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동(SDS-PAGE)이 gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5의 사카로미세스 세레비시아 효모 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여주고; 레인(lane)1은 단백질 마커(Marker)의 전기영동 결과(분자량은 위로부터 아래로 순차적으로 200, 116, 97.2, 66.4, 44.3kDa임)이며; 레인2는 gt25-pYES2 효모 레콘(recon)의 용균액(lysate) 상청액이고; 레인3은 gt25-1-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이며; 레인4는 gt25-3-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이고; 레인5는 gt25-5-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이며; 레인6은 pYES2빈 벡터 레콘의 용균액 상청액이다.
도3에서 웨스턴 블롯(Western Blot)으로 gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5 유전자가 사카로미세스 세레비시아 효모 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여주고; 레인1은 gt25-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이며; 레인2는 gt25-1-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이고; 레인4는 gt25-3-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이며; 레인5는 gt25-5-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이고; 레인3은 pYES2 빈 벡터(Empty vector) 레콘의 용균액 상청액이다.
도4는 SDS-PAGE이 gGT13과 gGT30의 사카로미세스 세레비시아 효모 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여주고; 레인1은 gt30-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이며; 레인2는 gt13-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이고; 레인3은 빈 벡터 pYES2레콘의 용균액 상청액이다.
도5에서 Western Blot으로 gGT13과 gGT30의 사카로미세스 세레비시아 효모 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여주고; 레인1은 gt30-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이며; 레인2는 gt13-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이고; 레인3은 빈 벡터 pYES2레콘의 용균액 상청액이다.
도6은 글리코실전이효소 gGT25, gGT25-1 및 gGT25-3이 프로토파낙사디올과 프로토파낙사디올 타입 사포닌에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이다 . 레인25는 gGT25조효소액(gt25-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이고; 레인25-1는 gGT25-1조효소액(gt25-1-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이며; 레인25-3, gGT25-3 조효소액(gt25-3-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이고; 레인 "-"은 음성 대조군으로서, 빈 벡터 효모의 용균액 상청액으로 효소액을 대체한 것이며; 레인 M은 프로토파낙사디올과 프로토파낙사디올 타입 사포닌의 혼합 표준샘플이다.
도7은 글리코실전이효소 gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5이 프로토파낙사트리올과 프로토파낙사트리올 타입 사포닌에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이고; 레인M은 프로토파낙사트리올(PPT)과 프로토파낙사트리올 타입 사포닌의 혼합 표준샘플이며; 레인25은 gGT25조효소액(gt25-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이고; 레인25-1은 gGT25-1조효소액(gt25-1-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이며; 레인25-3은 gGT25-3조효소액(gt25-3-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이고; 레인25-5는 gGT25-5조효소액(gt25-5-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이며; 레인 "-", 음성 대조군으로서, 빈 벡터 재조합 효모 용균액으로 효소액을 대체한 것이다.
도8은 글리코실전이효소 gGT25, gGT25-1 및 gGT25-3이 다마렌디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이다. 레인25는 gGT25조효소액(gt25-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이고; 레인25-1은 gGT25-1조효소액(gt25-1-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이며; 레인25-3은 gGT25-3조효소액(gt25-3-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이고; 레인 "-", 음성 대조군으로서, 빈 벡터 효모 용균액로 효소액을 대체한 것이며; 레인M은 표준샘플 다마렌디올(DM)이다.
도9는 글리코실전이효소 gGT13과 gGT30이 프로토파낙사디올과 트리올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이고; 레인M1은 프로토파낙사디올 사포닌 혼합 표준샘플이며; 레인M2은 프로토파낙사트리올 사포닌 혼합 표준샘플이고; 레인1은 gGT13조효소액이 프로토파낙사디올에 대해 촉매 작용을 한 것이며; 레인2는 gGT30조효소액이 프로토파낙사디올에 대해 촉매 작용을 한 것이고; 레인3은 음성 대조군으로서, ddH2O로 효소액을 대체한 것이며; 레인4는 gGT13 조효소액이 프로토파낙사트리올에 대해 촉매 작용을 한 것이고; 레인5는 gGT30조효소액이 프로토파낙사트리올에 대해 촉매 작용을 한 것이며; 레인6은 음성 대조군으로서, ddH2O로 효소액을 대체한 것이다.
도10은 글리코실전이효소 gGT25가 프로토파낙사디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 HPLC검출도이고, 제2행의 샘플은 프로토파낙사디올(PPD)과 여러가지 사포닌(CK, Rh2, F2, Rg3)의 혼합 표준샘플이며; 제1행의 샘플은 gGT25조효소액이 PPD에 대해 촉매 작용을 한 것이고; 제3행의 샘플은 음성 대조군1로서, 빈 벡터 재조합 효모 용균액이 PPD에 대해 촉매 작용을 하며; 제4행의 샘플은 음성 대조군2로서, dH2O이다.
도11은 글리코실전이효소 gGT25가 프로토파낙사트리올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 HPLC검출도이고, 제2행의 샘플은 프로토파낙사트리올(PPT)과 여러가지 트리올 사포닌(F1, Rh1, Rg1)의 혼합 표준샘플이며; 제1행의 샘플은 gGT25조효소액이 PPT에 대해 촉매 작용을 한 것이고; 제3행의 샘플은 음성 대조군1로서, 빈 벡터 재조합 효모 용균액이 PPT에 대해 촉매 작용을 한다.
도12는 글리코실전이효소 gGT25가 프로토파낙사디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 LC/MS검출도인 바, 도10 중의 피크(peak)2(산물피크)와 표준CK샘플의 질량 스펙트로그램(mass spectrogram)이다.
도13은 글리코실전이효소 gGT25가 프로토파낙사트리올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 LC/MS검출도인 바, 도11 중의 피크1(산물피크)과 표준F1샘플의 질량 스펙트로그램이다.
도14는 Western Blot으로 gGT25-pET28a가 E. coli BL21 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여주고; 레인1-3은 각각 50uM IPTG이 유도된 후의 총 단백질, 상청액 및 침전물이다.
도15는 gGT25-pET28a 재조합 대장균 세포 용균액 체외에서 PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC 검출도이고; 레인1은 PPD와 CK의 표준샘플 혼합물이며; 레인2는 gGT25-pET28a 재조합 대장균이 유도된 후(50 μM IPTG) 세포 용균액 상청액이 PPD에 대해 촉매 작용을 한 것이다.
도16은 CK생성 효모 엔지니어링 박테리아(engineering bacteria) A세포 용균액 추출물의 HPLC검출도이고, 제1행의 샘플은 프로토파낙사디올(PPD), 다마렌디올 및 CK의 혼합 표준샘플이며; 제2행의 샘플은 CK생성 효모 엔지니어링 박테리아 A세포 용균액이고; 제3행의 샘플은 음성 대조군1로서, 효모 출발균주(Starting strain)의 용균액이다.
도17은 글리코실전이효소 gGT25-5가 프로토파낙사트리올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 HPLC검출도이고, 제1행의 샘플은 프로토파낙사트리올(PPT)과 여러가지 트리올 사포닌(F1, Rh1, Rg1 및 Re)의 혼합 표준샘플이며; 제2행의 샘플은 gGT25-5조효소액이 PPT에 대해 촉매 작용을 한 후의 산물이다.
도18은 글리코실전이효소 gGT25-5가 프로토파낙사트리올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 LC/MS검출도인 바, 도17 중의 P1피크(산물Rh1피크)와 Rh1표준샘플의 질량 스펙트로그램이다.
도19는 (a) 3GT1과 3GT2, (b) 3GT3과 (c)3GT4 유전자 PCR산물의 아가로스 겔 전기영동 검출도이다.
도20은 SDS-PAGE이 (a)3GT1과 3GT2, (b)3GT3과 (c)3GT4 유전자가 대장균 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여주고; (a)에서, 레인1은 pet28a빈 벡터 대장균 레콘의 용균액 총 단백질이며; 레인2는 3GT1-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액이고; 레인3은 3GT1-pet28a대장균 레콘의 용균액 침전물이며; 레인4는 3GT1-pet28a대장균 레콘의 총 단백질이고; 레인5는 3GT2-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액이며; 레인6은 3GT2-pet28a대장균 레콘의 용균액 침전물이고; 레인7은 3GT2-pet28a대장균 레콘의 총 단백질이며; 레인8은 단백질 분자량 Marker이고; (b) 에서, 레인1은 단백질 분자량 Marker이며; 레인2는 3GT3-pET28a대장균 레콘의 용균액 상청액이고; 레인3은 3GT3-pET28a대장균 레콘의 용균액 침전물이며; 레인4는 3GT3-pET28a대장균 레콘의 용균액 총 단백질이고; (c) 에서, 레인1은 3GT4-pET28a대장균 레콘의 용균액 총 단백질이며; 레인2는 3GT4-pET28a대장균 레콘의 용균액 침전물이고; 레인3은 3GT4-pET28a대장균 레콘의 용균액 상청액이며; 레인4는 pet28a빈 벡터 대장균 레콘의 용균액이고; 레인5는 단백질 분자량 Marker이다. 화살표는 목적 단백질의 위치를 가리킨다.
도21은 Western Blot으로 (a)3GT1과 3GT2, (b)3GT3과 (c)3GT4 유전자가 대장균 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여준 도이고; (a)에서, 레인1은 pet28a빈 벡터 대장균 레콘의 용균액 총 단백질이며; 레인2는 3GT1-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액이고; 레인3은 3GT1-pet28a대장균 레콘의 용균액 침전물이며; 레인4는 3GT1-pet28a대장균 레콘의 총 단백질이고; 레인5는 3GT2-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액이며; 레인6은 3GT2-pet28a대장균 레콘의 용균액 침전물이고; 레인7은 3GT2-pet28a대장균 레콘의 총 단백질이며; (b)에서, 레인1은 3GT3-pET28a대장균 레콘의 용균액 상청액이고; 레인2는 3GT3-pET28a대장균 레콘의 용균액 침전물이며; 레인3은 3GT3-pET28a대장균 레콘의 용균액 총 단백질이고; (c)에서, 레인1은, 3GT4-pET28a대장균 레콘의 용균액 총 단백질이고; 레인2는 3GT4-pET28a대장균 레콘의 용균액 침전물이며; 레인3은 3GT4-pET28a대장균 레콘의 용균액 상청액이고; 레인4는 pet28a빈 벡터 대장균 레콘의 용균액이다.
도22는 글리코실전이효소 3GT1과 3GT2가 프로토파낙사디올과 CK에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이다. 레인1은 프로토파낙사디올 타입 사포닌 표준샘플이고, 레인2는 글리코실전이효소 3GT1이 프로토파낙사디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rh2이며; 레인3은 글리코실전이효소 3GT1이 인삼 사포닌 CK에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 F2이고; 레인4는 글리코실전이효소 3GT2가 프로토파낙사디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rh2이고; 레인5는 글리코실전이효소 3GT2가 인삼 사포닌 CK에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 F2이다.
도23은 글리코실전이효소 3GT1과 3GT2가 다마렌디올(DM)과 25-OH-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이고; (A)에서, 3GT1 조효소액(3GT1-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 다마렌디올(DM)과 25-OH-PPD에 대해 촉매 작용을 한 것이다. 레인1은 25-OH-PPD표준샘플이며, 레인2는 3GT1조효소액이 25-OH-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-protopanaxadiol이고; 레인3은 다마렌디올 표준샘플이며; 레인4는 3GT1조효소액이 다마렌디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β- (D-glucopyranosyl)-dammarendiolII이며; (B)는 3GT2 조효소액(3GT2-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 다마렌디올(DM)과 25-OH-PPD에 대해 촉매 작용을 한 것이다. 레인1은 25-OH-PPD 표준샘플이고, 레인2는 3GT2조효소액이 25-OH-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-protopanaxadiol이며; 레인3은 다마렌디올 표준샘플이고; 레인4는 3GT2조효소액이 다마렌디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII이다.
도24 는 글리코실전이효소 3GT1과 3GT2가 PPT와 F1에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이고, 레인1은 3GT1조효소액(3GT1-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 PPT에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol이며; 레인2는 3GT1조효소액이 F1에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β- (D-glucopyranosyl)-F1이고; 레인3은 3GT2조효소액(3GT2-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 PPT에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β- (D-glucopyranosyl)-protopanaxatriol이며; 레인4는 3GT2조효소액이 F1에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O- β-(D-glucopyranosyl)-F1이다.
도25는 글리코실전이효소 3GT1과 3GT2가 20(R)-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이다. 레인1은 20(R)-PPD표준샘플이고; 레인2는 3GT1조효소액(3GT1-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 20(R)-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 20(R)-Rh2이며; 레인3은 3GT2조효소액(3GT2-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 20(R)-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 20(R)-Rh2이고; 레인4는 대조군으로서, pet28a빈 벡터 대장균 레콘의 용균액 상청액으로 효소액을 대체한 것이며; 레인5는 20(R)-Rh2표준샘플이다.
도26는 글리코실전이효소 3GT1가 라노스테롤(lanosterol)에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이다. 레인1은 3GT1조효소액(3GT1-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 lanosterol에 대해 촉매 작용을 한 것이고; 레인2는 3GT2조효소액(3GT2-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 lanosterol에 대해 촉매 작용을 한 것이며; 레인3은 대조군으로서, pet28a빈 벡터 대장균 레콘의 용균액 상청액으로 효소액을 대체한 것이다.
도27은 글리코실전이효소 3GT3이 프로토파낙사디올, 프로토파낙사트리올 및 25-OH-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이다. (a)는 3GT3조효소액(3GT3-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 프로토파낙사디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rh2이고, M은 프로토파낙사디올 타입 사포닌혼합 표준샘플이며, (b)는 3GT3조효소액이 프로토파낙사트리올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-PPT(3-G-PPT)이고; (c)는 3GT3조효소액이 25-OH-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-PPD(3-G-25-OH-PPD)이다.
도28은 글리코실전이효소 3GT4가 프로토파낙사디올, CK 및 25-OH-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이다. (a)은 3GT4조효소액(3GT4-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 프로토파낙사디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rh2이고, M은 프로토파낙사디올 타입 사포닌혼합 표준샘플이며, "+"는 3GT4조효소액을 첨가한 샘플을 대표하고, "-"는 대조군인 바, 즉, pet28a빈 벡터 대장균 레콘의 용균액 상청액으로 효소액(b) 3GT4조효소액을 대체하여 CK에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 F2이며; "+"는 3GT4조효소액을 첨가한 샘플을 대표하고, "-"는 대조인 바, 즉, pet28a빈 벡터 대장균 레콘의 용균액 상청액으로 효소액을 대체한 것이며; (c)는 글리코실전이효소 3GT4가 25-OH-PP에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-PPD(3-G-25-OH-PPD)이고, "+"는 3GT4조효소액을 첨가한 샘플을 대표하며, "-"는 대조인 바, 즉, pet28a빈 벡터 대장균 레콘의 용균액 상청액으로 효소액을 대체한 것이다.
도29는 글리코실전이효소 3GT1, 3GT3 및 3GT4가 프로토파낙사디올에 대해 촉매작용을 하여 생성된 Rh2의 HPLC검출도이고, 제1행의 샘플은 인삼 사포닌 CK, Rh2 및 F2의 혼합 표준샘플이며; 제2행의 샘플은 글리코실전이효소 3GT1조효소액(3GT1-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 PPD에 대해 촉매 작용을 한 후의 산물이고; 제3행은 3GT3조효소액(3GT3-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 PPD에 대해 촉매 작용을 한 후의 산물이며; 제4행은 3GT4조효소액(3GT4-pet28a대장균 레콘의 용균액 상청액)이 PPD에 대해 촉매 작용을 한 후의 산물이다.
도30은 글리코실전이효소 3GT1, 3GT3 및 3GT4가 프로토파낙사디올에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 LC/MS검출도이다. Rh2표준샘플을 보여준 질량 스펙트로그램 및 도29 중의 P1피크(3GT1의 산물피크), P2피크(3GT2의 산물피크) 및 P3피크(3GT4의 산물피크)를 보여준 질량 스펙트로그램이다.
도31은 (a) gGT29/gGT29-3 유전자와 (b)gGT29-4/gGT29-5/gGT29-6및 gGT29-7 유전자 PCR산물의 아가로스 겔 전기영동도이다. (b)레인1은 핵산 Marker이고; 레인2는 gGT29/gGT29-3 유전자 PCR산물이며; (b)레인1은 gGT29-4/gGT29-5/gGT29-6 유전자 PCR산물이고; 레인2는 gGT29-7 유전자 PCR산물이며; 레인3은 핵산 Marker이다.
도32는 SDS-PAGE이 gGT29와 gGT29-3의 사카로미세스 세레비시아 효모 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여주고; 레인1은 빈 벡터 pYES2레콘의 용균액 상청액이며; 레인2는 gGT29-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이고; 레인3은 gGT29-3-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이다.
도33은 Western Blot으로 gGT29과 gGT29-3의 사카로미세스 세레비시아 효모 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여주고; 레인1은 빈 벡터 pYES2레콘의 용균액 상청액이며; 레인2는 gGT29-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이고; 레인3은 gGT29-3-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액이다.
도34은 글리코실전이효소 gGT29과 gGT29-3이 인삼 사포닌 Rh2와 F2에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이고; 레인1은 PPD 및 PPD 타입 사포닌 혼합 표준샘플이며, 레인2는 gGT29 조효소액(gGT29-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이 Rh2에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rg3이고, 레인3은 gGT29조효소액이 Rh2에 대해 촉매 작용을 한 대조군으로서, pYES2빈 플라스미드(plasmid)를 첨가하여 효모 레콘 용균액로 효소액을 대체한 것이며; 레인4는 gGT29가 F2에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rd이고, 레인5는 gGT29가 F2에 대해 촉매 작용을 한 대조군으로서, pYES2빈 플라스미드를 첨가하여 효모 레콘 용균액로 효소액을 대체한 것이며; 레인6은 gGT29-3조효소액(gGT29-3-pYES2효모 레콘의 용균액 상청액)이 Rh2에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rg3이고; 레인7은 gGT29-3조효소액이 F2에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rd이다.
도35는 글리코실전이효소 gGT29와 3GT1 또는 gGT29와 3GT4가 PPD에 대해 연합촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이고; (a)는 gGT29와 3GT1이 PPD에 대해 연합촉매 작용을 한 것이며, 레인1은 PPD 및 PPD 타입 사포닌 혼합 표준샘플이고; 레인2는 3GT1이 PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rh2이며; 레인3은 gGT29가 Rh2에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rg3이고; 레인4는 3GT1과 gGT29이 PPD에 대해 연합촉매 작용을 하여 생성된 Rg3이며; (b)는 gGT29과 3GT4이 PPD에 대해 연합촉매 작용을 한 것이고, 레인1은 PPD 및 PPD 타입 사포닌 혼합 표준샘플이며; 레인2는 3GT4가 PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 Rh2이고; 레인3은 PPD이며; 레인4는 3GT4와 gGT29가 PPD에 대해 연합촉매 작용을 하여 생성된 Rg3이다.
도36은 글리코실전이효소 3GT1과 gGT29가 각각 20(R)-PPD와 20(R)-PPD에 대해 촉매 작용 및 20(R)-PPD에 대해 연합촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이고; 레인1은 3GT1이 20(R)-PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 20(R)-Rh2이며; 레인2는 gGT29가 20(R)-Rh2에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 20(R)-Rg3이고; 레인3은 3GT1과 gGT29가 20(R)-PPD에 대해 연합촉매 작용을 하여 생성된 20(R)-Rg3이다.
도37은 글리코실전이효소 gGT29와 3GT1 또는 gGT29와 3GT4 PPD에 대해 연합작용을 하여 생성된 산물의 HPLC검출결과이다. 제1행은 Rg3, Rh2 및 PPD혼합 표준샘플이고; 제2행은 gGT29와 3GT1이 PPD에 대해 연합촉매 작용을 한 것이며, 제3행은 gGT29와 3GT4이 PPD에 대해 연합촉매 작용을 한 것이다.
도38은 글리코실전이효소 gGT29와 3GT1 또는 gGT29와 3GT가 PPD에 대해 연합작용을 하여 생성된 산물의 LC/MS검출결과이다. 표준샘플Rg3을 보여준 질량 스펙트로그램 및 도37 중의 P1피크(gGT29와 3GT1이 PPD에 대해 연합촉매 작용을 하여 생성된 산물)와 P2피크(gGT29와 3GT4가 PPD PPD에 대해 연합촉매 작용을 하여 생성된 산물의 산물피크)를 보여준 질량 스펙트로그램이다.
도39는 Rh2생성 효모 엔지니어링 박테리아 A1세포 용균액 추출물의 HPLC검출결과이고, 제1행의 샘플은 프로토파낙사디올(PPD), 다마렌디올(DM), 인삼 사포닌 Rh2 및 Rg3의 혼합 표준샘플이며; 제2행의 샘플은 Rh2생성 효모 엔지니어링 박테리아 A1세포 용균액 추출물이다.
도40은 Rg3 생성 효모 엔지니어링 박테리아 A2세포 용균액 추출물의 생성의 HPLC검출결과이고, 제1행의 샘플은 프로토파낙사디올(PPD), 다마렌디올(DM), 인삼 사포닌 Rh2 및 Rg3의 혼합 표준샘플이며; 제2행의 샘플은 Rg3생성 효모 엔지니어링 박테리아 A2세포 용균액 추출물이다.
도41은 Rh1생성 효모 엔지니어링 박테리아 A3세포 용균액 추출물의 HPLC 검출결과이고, 제1행의 샘플은 프로토파낙사트리올(PPT)과 인삼 사포닌 Rh1의 표준샘플이며; 제2행의 샘플은 Rh1 생성 효모 엔지니어링 박테리아 A3세포 용균액 추출물이다.
도42는 F1 생성 효모 엔지니어링 박테리아 A4세포 용균액 추출물의 HPLC검출결과이고, 제1행의 샘플은 프로토파낙사트리올(PPT)과 인삼 사포닌 F1의 표준샘플이며; 제2행의 샘플은 F1생성 효모 엔지니어링 박테리아A4세포 용균액 추출물이다.
도43은 Rh2생성 효모 엔지니어링 박테리아A5세포 용균액 추출물의 HPLC검출결과이고, 제1행의 샘플은 다마렌디올(DM), 프로토파낙사디올(PPD), 인삼 사포닌 Rh2 및 인삼 사포닌 Rg3의 표준샘플이며; 제2행의 샘플은 Rh2효모 엔지니어링 박테리아 A5세포 용균액 추출물이다.
도44는 SDS-PAGE이 gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7의 재조합 대장균 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여준다. 레인1은 gGT29-4-pET28a재조합 대장균체 용균 총 단백질이고; 레인2는 gGT29-4-pET28a재조합 대장균체 용균 상청액이며; 레인3은 gGT29-5-pET28a재조합 대장균체 용균 총 단백질이고; 레인4는 gGT29-5-pET28a재조합 대장균체 용균 상청액이며; 레인5는 gGT29-6-pET28a재조합 대장균체 용균 총 단백질이고; 레인6은 gGT29-6-pET28a재조합 대장균체 용균 상청액이며; 레인7은 gGT29-7-pET28a재조합 대장균체 용균 총 단백질이며; 레인8은 gGT29-7-pET28a재조합 대장균체 용균 상청액이고; 레인9는 단백질 분자량 Marker이다.
도45는 Western Blot으로 gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7의 재조합 대장균 중에서의 발현을 검출해낸 것을 보여준다. 레인1은 gGT29-4-pET28a재조합 대장균체 용균 총 단백질이고; 레인2는 gGT29-4-pET28a재조합 대장균체 용균 상청액이며; 레인3은 gGT29-5-pET28a재조합 대장균체 용균 총 단백질이고; 레인4는 gGT29-5-pET28a재조합 대장균체 용균 상청액이며; 레인5는 gGT29-6-pET28a재조합 대장균체 용균 총 단백질이고; 레인6은 gGT29-6-pET28a재조합 대장균체 용균 상청액이며; 레인7은 gGT29-7-pET28a재조합 대장균체 용균 총 단백질이고; 레인8은 gGT29-7-pET28a재조합 대장균체 용균 상청액이다.
도46은 글리코실전이효소 gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7가 각각 Rh2와 F2에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물의 TLC검출도이다. 레인Rh2는 사포닌 Rh2를 기질로 한 것을 의미하고; 레인F2는 사포닌 F2를 기질로 한 것을 의미한다. gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7은 상이한 효소액으로 촉매화 반응을 진행한 것을 의미한다.
본 발명인은 광범위하고 심도깊은 연구를 거쳐, 글리코실전이효소 gGT25(SEQ ID NO.: 2), gGT25-1(SEQ ID NO.: 16), gGT25-3(SEQ ID NO.: 18), gGT25-5(SEQ ID NO.: 20), gGT29(SEQ ID NO.: 26), gGT29-3(SEQ ID NO.: 28), gGT29-4(SEQ ID NO.:55), gGT29-5 (SEQ ID NO.:57), gGT29-6(SEQ ID NO.:59), gGT29-7(SEQ ID NO.:61)및 3GT1(SEQ ID NO.: 22), 3GT2(SEQ ID NO.: 24), 3GT3(SEQ ID NO.: 41), 3GT4(SEQ ID NO.: 43), gGT13(SEQ ID NO.: 4), gGT30(SEQ ID NO.: 6)이 테르페노이드 글리코실화 촉매 작용 및 새로운 사포닌 합성 중에서의 응용을 처음으로 제공하였다. 구체적으로, 본 발명의 글리코실전이효소는 특이하고 효과적으로 테트라사이클릭 트리터페노이드 화합물 기질의 C-20부위 및/또는 C-6부위 및/또는 C-3의 히드록시 글리코실화에 대하여 촉매 작용을 할 수 있거나, 및/또는 글리코실기 공여체에서 제공되는 글리코실기를 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물의 C-3부위의 첫 번째 글리코실기 상에 전이시켜 당사슬을 연장하도록 한다. 특히, 프로토파낙사디올을 항암 활성을 구비하는 희유 인삼 사포닌 CK와 Rh2으로 전환시킬 수 있고, 프로토파낙사트리올을 항노화 활성을 구비하는 희유 인삼 사포닌 F1과 항과민 작용을 구비하는 희유 인삼 사포닌 Rh1로 전환시킬 수 있으며, Rh2를 항암 활성이 우수한 희유 인삼 사포닌 Rg3으로 전환시킬 수 있다. 본 발명의 글리코실전이효소는 다마렌디올(dammarendiol), 프로토파낙사트리올, F1, 25-OH-PPD, 25-OCH3-PPD를 그 전에 보도된 바가 없는 새로운 사포닌 20-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-PPT, 3-O-β-(D-glucopyrano -syl)-F1, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-PPD, 3-O-β-(D- glucopyrano -syl)-25-OCH3-PPD로 합성할 수도 있다.
본 발명의 글리코실전이효소는 Rh2, CK, Rg3을 각각 인삼 사포닌인삼 사포닌 F2, Rd 및 Rg1등으로 전환시킬 수도 있다. 본 발명은 전환 및 촉매화 방법을 더 제공하였다. 본 발명의 글리코실전이효소는 다마렌디올 및/또는 프로토파낙사디올 또는 프로토파낙사트리올 합성대사경로 중의 관건 효소와 숙주세포 중에서 공통발현될 수도 있거나, 또는 다마렌디올(DM), 프로토파낙사디올(PPD) 및 프로토파낙사트리올(PPT)을 제조하기 위한 유전자 공학 세포에 응용되고, 인공합성 희유 인삼 사포닌 CK, F1, Rh1, Rh2 및 Rg3을 구성, 및 새로운 인삼 사포닌 20-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-PPT, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-F1, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-PPD, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OCH3-PPD 및 F2, Rd 및 Rg1 등의 대사경로에 응용된다. 이 기초상에서 본 발명을 완성하였다.
정의
예를 들어, 본문에서 사용한 용어 "활성 폴리펩티드", "본 발명의 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드", "본 발명의 효소", "글리코실전이효소", "본 발명의 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4단백질" 또는 "본 발명의 글리코실전이효소"는 모두 글리코실전이효소 gGT25(SEQ ID NO.: 2), gGT13(SEQ ID NO.: 4), gGT30(SEQ ID NO.: 6), gGT25-1(SEQ ID NO.: 16), gGT25-3(SEQ ID NO.: 18), gGT25-5(SEQ ID NO.: 20), gGT29(SEQ ID NO.: 26), gGT29-3(SEQ ID NO.: 28), gGT29-4(SEQ ID NO.:55), gGT29-5 (SEQ ID NO.:57), gGT29-6(SEQ ID NO.:59), gGT29-7(SEQ ID NO.:61)및 3GT1(SEQ ID NO.: 22), 3GT2(SEQ ID NO.: 24), 3GT3(SEQ ID NO.: 41), 3GT4(SEQ ID NO.: 43) 폴리펩티드 및 이의 유도 폴리펩티드를 의미한다.
특별한 설명이 없으면, 본문에서 설명한 인삼 사포닌과 사포게닌은 C20부위의 S 배열의 사포닌과 사포게닌을 의미한다.
본문에서 사용된 바와 같이, "분리된 폴리펩티드"는 상기 폴리펩티드는 기본적으로 천연적으로 그와 관련된 기타 단백질, 지질, 당류 또는 기타 물질을 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 표준 단백질 정제기술을 이용하여 상기 폴리펩티드를 정제할 수 있다. 기본적으로 순수한 폴리펩티드는 비환원 폴리아크릴아미드 겔 상에서 단일한 메인 밴드(main band)를 생성할 수 있다. 아미노산 서열로 상기 폴리펩티드의 순도에 대하여 진일보로 분석을 진행할 수 있다.
본 발명의 활성 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 천연적으로 정제된 산물이거나, 또는 화학적으로 합성된 산물이거나, 또는 재조합 기술을 사용하여 원핵 또는 진핵 숙주(예를 들어, 세균, 효모, 식물) 중으로부터 생성된 것일 수 있다. 재조합 생산방식에서 사용한 숙주에 근거하여, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나, 또는 비글리코실화된 것일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 최초의 메티오닌(methionine) 잔기를 더 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다.
본 발명은 상기 폴리펩티드의 세그먼트, 유도체 및 아날로그(analogue)를 더 포함한다. 본문에서 사용된 바와 같이, 용어 "세그먼트", "유도체" 및 "아날로그"는 기본적으로 상기 폴리펩티드와 동일한 생물학 기능 또는 활성을 유지하는 폴리펩티드를 의미한다.
본 발명의 폴리펩티드의 세그먼트, 유도체 또는 아날로그는 (i) 하나 또는 다수의 보수성 또는 비보수성 아미노산 잔기(바람직하게 보수성 아미노산 잔기임)가 치환된 폴리펩티드일 수 있는데, 이렇게 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호로 암호화된 것일 수 있고 아닐 수도 있거나, 또는 (ii) 하나 또는 다수의 아미노산 잔기 중에서 치환 라디칼을 구비하는 폴리펩티드, 또는 (iii) 성숙된 폴리펩티드와 다른 하나의 화합물 (예를 들어, 폴리펩티드의 반감기를 연장한 화합물, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol))이 융합되어 형성된 폴리펩티드, 또는 (iv) 부가된 아미노산 서열이 이 폴리펩티드 서열에 융합되어 형성된 폴리펩티드(예를 들어, 선도 서열 또는 분비 서열, 또는 이 폴리펩티드의 서열 또는 단백질원 서열을 정제시키거나, 또는 항원IgG세그먼트과 형성된 융합단백질)일 수 있다. 본문의 시사에 근거하여, 이러한 세그먼트, 유도체 및 아날로그는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자의 공지된 범위에 속한다.
본 발명의 활성 폴리펩티드는 글리코실전이효소 활성을 구비하고, 하기의 하나 또는 여러가지 반응에 대해 촉매 작용을 할 수 있다.
Figure pat00012
상기 식에서, R1은 H, 단당 글리코실기 또는 다당 글리코실기이고; R2와 R3은 H 또는 OH이며; R4는 글리코실기이고; 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2, 16 또는 18 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 단당은 포도당(Glc), 람노스(Rha), 아세틸 포도당(Glc(6)Ac), 아라비노푸라노오스(Araf), 아라보피라노오스(Arap), 자일로오스(Xyl) 등을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 다당은 Glc(2-1)Glc, Glc(6-1)Glc, Glc(6)Ac, Glc(2-1)Rha, Glc(6-1)Arap, Glc(6-1)Xyl, Glc(6-1)Araf, Glc(3-1)Glc(3-1), Glc(2-1)Glu(6)Ac, Glc(6-1)Arap(4-1)Xyl, Glc(6-1)Arap(2-1)Xyl, Glc(6-1)Arap(3-1)Xyl등 2-4개의 단당으로 조성된 다당을 포함한다.
R1-R4가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00013
즉, 상기 R1, R2가 모두H이고, R3이 OH일 때, 상기 식(I) 화합물은 프로토파낙사디올(PPD)이다.
R1이 하나의 글루코실기이고, R2가 H이며, R3이 OH일 때, 상기 식(I) 화합물은 인삼 사포닌 RH2이다.
R1이 두개의 글루코실기이고, R2가 H이며, R3이 OH일 때, 상기 식(I) 화합물은 인삼 사포닌 RG3이다.
R1이 H이고, R2가 OH이며, R3이 OH일 때, 상기 식(I) 화합물은 프로토파낙사트리올(PPT)이다.
R1이 H이고, R2가 H이며, R3이 H일 때, 상기 식(I) 화합물은 다마렌디올(DM)이다.
Figure pat00014
상기 식에서, R1은 H 또는 글리코실기이고, R2는 글리코실기이며, R3은 글리코실기이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 2, 16, 18 또는 20또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되거나;
또는, R1은 H 또는 글리코실기이고; R2는 H 또는 글리코실기이며; R3은 글리코실기이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO.: 20 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
R1-R3가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00015
즉, R1, R2가 모두 H일 때, 상기 식(III) 화합물은 프로토파낙사트리올(PPT)이다.
R1이 H이고, R2가 글루코실기일 때, 상기 식(III) 화합물은 인삼 사포닌 F1이다.
Figure pat00016
상기 식에서, R1은 H 또는 OH이고; R2는 H 또는 OH이며; R3은 H 또는 글리코실기이고; R4는 글리코실기이며, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24, 41 또는 43 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
R1-R4가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00017
R1과 R3이 모두H이고, R2가 OH일 때, 상기 식(V) 화합물은 프로토파낙사디올 (PPD)이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24, 41 또는 43 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
R1이 H이고, R2가 OH이며, R3이 글루코실기일 때, 상기 식(V) 화합물은 인삼 사포닌 CK이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24 또는 43 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되며;
R1이 OH이고, R2가 OH이며, R3이 H일 때, 상기 식(V) 화합물은 프로토파낙사트리올(PPT)이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24 또는 41 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되며;
R1이 OH이고, R2가 OH이며, R3이 글루코실기일 때, 상기 식(V) 화합물은 인삼 사포닌 F1이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22 또는 24 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택되며;
R1이 H이고, R2가 OH이며, R3이 H일 때, 상기 식(V) 화합물은 다마렌디올(DM)이고, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22 또는 24 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
Figure pat00018
상기 식에서, R1은 OH 또는 OCH3이고; R2는 글리코실기이며, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24, 41 또는 43 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
R1-R2가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00019
즉, R1이 OH일 때, 상기 식(VII) 화합물은 25-OH-PPD이고;
R1이 OCH일 때, 상기 식(VII) 화합물은 25-OCH3-PPD이다.
Figure pat00020
상기 식에서, R1은 글리코실기이고; R2와 R3은 OH 또는 H이며; R4는 글리코실기 또는 H이고; R5는 글리코실기이며, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 26, 28, 55, 57, 59 또는 61 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
R1-R4가 치환을 거친 후의 화합물은 하기 표와 같다.
Figure pat00021
즉, R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 H일 때, 식(IX) 화합물은 Rh2이다.
R1이 글루코실기이고; R2가 H이며, R3이 OH이고, R4가 글루코실기일 때, 식(IX) 화합물은 F2이다.
Figure pat00022
상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22 또는 24 또는 이의 유도 폴리펩티드로부터 선택된다.
상기 폴리펩티드의 바람직한 서열은 SEQ ID NOs.: 2, 16, 18, 20, 22, 24, 41, 26, 28, 43, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 폴리펩티드이고, 상기 용어는 상기 폴리펩티드와 동일한 기능을 구비하는 SEQ ID NOs.: 2, 16, 18, 20, 22, 24, 41, 26, 28, 43, 55, 57, 59 또는 61서열의 변이형식 및 유도 폴리펩티드를 더 포함한다. 이러한 변이형식은 하나 또는 다수(통상적으로 1-50개, 바람직하게는 1-30개, 더욱 바람직하게는 1-20개, 가장 바람직하게는 1-10개)의 아미노산의 결실, 삽입 및/또는 치환, 및 C말단 및/또는 N말단에 하나 또는 다수(통상적으로 20개 이내, 바람직하게는 10개 이내, 더욱 바람직하게는 5개 이내)의 아미노산이 첨가되는 것을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다). 예를 들어, 본 기술분야에서, 성능이 근접하거나 또는 유사한 아미노산으로 치환을 진행할 때, 통상적으로 단백질의 기능을 개변시키지 않는다. 또 예를 들어, C말단 및/또는 N말단에 하나 또는 다수의 아미노산을 첨가하는 것도 통상적으로 단백질의 기능을 개변시키지 않는다. 상기 용어는 인체 EGFRvA단백질의 활성 세그먼트과 활성 유도체를 더 포함한다. 본 발명은 상기 폴리펩티드의 아날로그를 더 제공한다. 이러한 아날로그와 천연적인 인체 EGFRvA폴리펩티드의 차이점은 아미노산 서열 상의 차이점일 수 있고, 서열에 대해 영향을 주지 않는 수식 형식 상에서의 차이점일 수도 있으며, 또는 상기 두가지를 겸유한다. 이러한 폴리펩티드는 천연적 또는 유도된 유전자 변이체를 포함한다. 유도된 변이체는 각종 기술을 통하여 얻을 수 있는 바, 예를 들어, 복사 또는 돌연변이 유도제에 노출됨에 따라 임의 돌연변이 유발(random mutagenesis)의 발생을 통하여 얻을 수 있고, 지정 돌이변이 유발법 또는 기타 이미 공지된 생물학의 기술을 통하여 얻을 수도 있다. 아날로그는 천연 L-아미노산(예를 들어, D-아미노산)과 상이한 잔기를 구비하는 아날로그, 및 비천연적으로 존재하는 또는 합성된 아미노산(예를 들어, β, γ-아미노산)을 구비하는 아날로그를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드 상기 예를 든 대표적인 폴리펩티드에 한정되진 않는 것을 이해하여야 한다.
수식(통상적으로 일차 구조를 개변시키지 않는다) 형식은 체내 또는 체외의 폴리펩티드의 화학 유도형식, 예를 들어, 아세틸화(acetylation) 또는 카르복실화(carboxylation)를 포함한다. 수식은 글리코실화를 더 포함하는데, 예를 들어, 폴리펩티드의 합성 및 가공 중에서 또는 진일보 가공단계 중에서 글리코실화 수식을 진행하여 생성된 그런 폴리펩티드이다. 이러한 수식은 폴리펩티드를 글리코실화를 진행하는 효소(예를 들어, 포유동물의 글리코실화 효소 또는 탈당화 효소)에 노출시키는 것을 통해 완성될 수 있다. 수식 형식은 인산화 아미노산 잔기(예를 들어, 포스포티로신(phosphotyrosine), 포스포세린(phosphoserine), 포스포트레오닌(phosphothreonine))를 구비하는 서열을 더 포함한다. 수식되어 그 항단백질 가수분해 성능이 향상되거나 또는 용해 성능이 최적화된 폴리펩티드를 더 포함한다.
본 발명의 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4단백질의 아미노말단 또는 카르복실말단은 하나 또는 다수의 폴리펩티드 세그먼트를 더 함유하여, 단백질 태그(tag)로 사용할 수 있다. 어떠한 적합한 태그는 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 태그는 FLAG, HA, HA1, c-Myc, Poly -His, Poly-Arg, Strep-TagII, AU1, EE, T7, 4A6, ε, B, gE, 및 Ty1일 수 있다. 이러한 태그는 단백질에 대해 정제를 진행할 때 사용될 수 있다. 표1은 그 중의 일부 태그 및 그 서열을 열거하였다.
Figure pat00023
번역된 단백질이 분비발현(예를 들어, 세포밖으로 분비)되게 하기 위하여, 상기 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT의 아미노산 아미노기 말단에 신호펩티드 서열, 예를 들어, pelB신호펩티드 등을 더 첨가할 수 있다. 신호펩티드는 폴리펩티드가 세포 내에서 분비하여 나오는 과정 중에서 절단될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA형식 또는 RNA형식일 수 있다. DNA형식은 cDNA, 게놈(genome) DNA 또는 인공합성 DNA를 포함한다. DNA는 단일가닥 또는 2중가닥일 수 있다. DNA는 암호가닥 또는 비암호가닥일 수 있다. 성숙된 폴리펩티드를 암호화한 암호영역 서열은 SEQ ID NOs.: 1로 표시되는 암호영역 서열과 동일하거나 또는 변성(degeneration)된 변이체일 수 있다. 예를 들어, 본문에서 사용한 "변성된 변이체"는 본 발명 중에서, SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61을 구비하는 단백질을 암호화한 것이지만, SEQ ID NOs.: 1, 3, 5, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 40, 42, 54, 56, 58 또는 60으로 표시되는 암호영역 서열과 차이점이 있는 핵산 서열을 의미한다.
SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61의 성숙된 폴리펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 단지 성숙된 폴리펩티드만 암호화한 암호서열; 성숙된 폴리펩티드의 암호서열 및 각종 부가적 암호서열; 성숙된 폴리펩티드의 암호서열(및 임의로 선택된 부가적 암호서열) 및 비암호서열을 포함한다.
용어 "폴리펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드"는 이 폴리펩티드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있고, 부가적 암호 및/또는 비암호서열의 폴리뉴클레오타이드를 더 포함할 수도 있다.
본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드의 변이체에 관한 것이기도 한 바, 이는 본 발명과 동일한 아미노산 서열을 가지고 있는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 세그먼트, 아날로그 및 유도체를 암호화한다. 이 폴리뉴클레오타이드의 변이체는 천역적으로 발생된 대립 변이체(Allelic variation) 또는 비천연적으로 발생된 변이체일 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 변이체는 치환 변이체, 제결실 변이체 및 삽입 변이체를 포함한다. 본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 대립 변이체는 하나의 폴리뉴클레오타이드의 교체형식이고, 이는 하나 또는 다수의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있으나, 실제적으로 그 암호화된 폴리펩티드의 기능을 개변시킬 수 없다.
본 발명은 상기 서열과 교잡되고 두개의 서열 사이에는 적어도 50%, 바람직하게 적어도70%, 더욱 바람직하게 적어도 80% 상동성이 구비되는 폴리뉴클레오타이드에도 관한 것이기도 하다. 본 발명은 특히 엄격한 조건(또는 엄밀한 조건)하에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드와 교잡할 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명에서, "엄격한 조건"은 하기와 같은 조건을 의미한다. (1) 비교적 낮은 이온 강도와 비교적 높은 온도하에서의 교잡 및 용출, 예를 들어, 0.2×SSC, 0.1%SDS, 60℃; 또는 (2) 교잡될 때, 변성제(denaturant)가 첨가되는 것, 예를 들어, 50%(v/v) 포름아미드(formamide), 0.1% 송아지 혈청/0.1% Ficoll, 42℃ 등; 또는 (3) 단지 두가닥 서열 사이에서만의 상동성이 적어도 90% 이상일 때, 더 바람직하게 95% 이상일 때에만 교잡이 일어난다. 또한, 교잡될 수 있는 폴리뉴클레오타이드가 암호화한 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 2, 4, 6, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 41, 43, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 성숙된 폴리펩티드와 동일한 생물학 기능과 활성을 가진다.
본 발명은 상기 서열과 교잡되는 핵산 세그먼트에 관한 것이기도 하다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "핵산 세그먼트"의 길이는 적어도 15개 뉴클레오티드, 바람직하게 적어도 30개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 적어도 50개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 적어도 100개 뉴클레오티드 이상을 함유한다. 핵산 세그먼트는 핵산의 증폭기술 (예를 들어, PCR)에 사용됨으로써, gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4단백질을 암호화한 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)를 확정 및/또는 분리할 수 있다.
본 발명에서의 폴리펩티드과 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게 분리된 형식으로 제공되고, 더욱 바람직하게 균질로 정제된 형식으로 제공된다.
본 발명의 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7 및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4뉴클레오티드(nucleotide)의 전체 길이 서열 또는 그 세그먼트는 통상적으로 PCR증포법, 재조합법 또는 인공합성 방법으로 얻을 수 있다. PCR증폭법에 있어서, 본 발명에서 공개된 관련 뉴클레오티드 서열, 특히 오픈리딩프레임(open reading frame) 서열에 근거하여 프라이머(primer)를 설계할 수 있고, 시중에 판매되는 cDNA베이스를 사용하거나 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 이미 알고 있는 통상적인 방법으로 제조한 cDNA베이스를 템플릿(template)으로 하여, 증폭시켜 관련 서열을 얻는다. 서열이 비교적 길 때, 흔히 두차례 또는 여러차례의 PCR증폭을 진행하여야 하고, 다음, 각 차례에서 증폭된 세그먼트를 정확한 순서에 따라 한데 연결시킨다.
일단 관련된 서열만 획득하면, 재조합법으로 대량의 관련 서열을 획득할 수 있다. 이는 통상적으로 상기 관련 서열을 벡터속으로 클로닝시킨 다음, 세포속에 전이시키고, 그 다음 통상적인 방법을 통하여 증식된 후의 숙주세포 중으로부터 관련 서열을 분리하여 얻는다.
이 밖에, 인공합성 방법으로 관련 서열을 합성할 수도 있는데, 특히 세그먼트 길이가 비교적 짧을 때 사용된다. 통상적으로, 먼저 다수의 작은 세그먼트를 합성한 다음 연결을 진행하는 것을 통하여 서열이 아주 긴 세그먼트를 획득할 수 있다.
현재, 이미 화학합성을 통하여 본 발명의 단백질(또는 그 세그먼트, 또는 그 유도체)를 암호화한 DNA서열을 얻을 수 있다. 다음, 상기 DNA서열을 본 기술분야에서 이미 공지된 각종 기존의 DNA분자(또는 예를 들어 벡터)와 세포 중에 도입시킬 수 있다. 이 밖에, 화학합성을 통하여 돌연변이를 본 발명의 단백질 서열 중에 도입시킬 수도 있다.
PCR기술을 응용하여 DNA/RNA을 증폭시키는 방법은 본 발명의 유전자의 획득에 사용되는 것이 바람직하다. 특별히 도서관(Library)에서의 전체 길이의 cDNA를 획득하는 것이 아주 어려울 때, RACE법(RACE-cDNA 말단 신속 증폭법)을 사용하는 것이 바람직할 수 있고, PCR에 사용되는 프라이머는 본문에서 공개한 본 발명의 서열 정보에 근거하여 적당하게 선택될 수 있고, 통상적인 방법으로 합성될 수 있다. 사용할 수 있는 통상적인 방법은 예를 들어, 겔 전기영동을 통하여 증폭된 DNA/RNA세그먼트를 분리 및 정제시키는 것이다.
본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 벡터를 포함하고, 및 본 발명의 벡터 또는 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4단백질 암호서열을 이용하여 유전자 공학을 거쳐 생성된 숙주세포, 및 재조합 기술을 거쳐 본 발명에 따른 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이기도 하다.
일반적으로 통상적인 재조합 DNA기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 이용하여, 재조합된 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4폴리펩티드를 발현 또는 생성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 하기와 같은 단계들이 있다.
(1) gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4폴리펩티드를 암호화한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(또는 변이체)를 사용하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 발현 벡터를 사용하여 적합한 숙주세포를 전환 또는 형질도입(transduction)하는 단계;
(2) 적합한 배지 중에서 숙주세포를 배양하는 단계;
(3) 배지 또는 세포 중으로부터 단백질을 분리 및 정제시키는 단계.
본 발명에서, gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4 폴리뉴클레오타이드서열은 재조합 발현 벡터 중에 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 본 기술분야에서 숙지된 세균 플라스미드, 박테리오파지(bacterio-phage), 효모 플라스미드, 식물세포 바이러스, 아데노바이러스(Adenovirus)와 같은 포유동물 세포 바이러스, 레트로바이러스(retrovirus) 또는 기타 벡터를 의미한다. 숙주체내에서 복제 및 안정될 수 있기만 하면, 어떠한 플라스미드와 벡터든지 모두 사용될 수 있다. 발현 벡터의 하나의 중요한 특징은 복제기점, 프로모터(promoter), 표기 유전자 및 번역제어소자를 포함하는 것이다.
본 발명의 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 숙지한 방법은 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4 암호 DNA서열과 적합한 전사/번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 구성하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 체외 재조합 DNA기술, DNA합성기술, 체내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA서열은 효과적으로 발현 벡터 중의 적절한 프로모터 상에 연결될 수 있음으로써, mRNA 합성을 가이드한다. 이러한 프로모터의 대표적인 예로는, 대장균의 lac 또는 trp프로모터; λ박테리오파지 PL프로모터가 있고; 진핵 프로모터는 CMV 급속초기 프로모터(immediate early promoter), HSV 티미딘키나아제(thymidine kinase) 프로모터, 초기와 말기 SV40프로모터, 레트로바이러스의 LTRs 및 기타 부분적인 공지된 유전자가 원핵 또는 진핵세포 또는 그 바이러스 중에서의 발현을 제어할 수 있는 프로모터를 포함한다. 발현 벡터는 번역시작용인 리보솜(ribosome) 결합부위와 전사 터미네이터(terminator)를 더 포함한다.
이 밖에, 발현 벡터는 바람직하게 하나 또는 다수의 선택성 표기 유전자를 포함함으로써, 숙주세포의 전환을 선택하기 위한 형질(phenotypic traits)을 제공하는 바, 예를 들어, 진핵세포 배양용인 디히드로엽산환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신저항(Neomycin resistance) 및 녹색형광단백질(GFP), 또는 대장균에 사용되는 테트라사이클린(tetracycline) 또는 엠피실린저항(ampicillin resistance)이다.
상기 적절한 DNA서열 및 적절한 프로모터 또는 서열을 제어하는 벡터를 포함하여, 적절한 숙주세포의 전환에 사용됨으로써, 이가 단백질을 발현시킬 수 있도록 한다.
숙주세포는 원핵세포, 예를 들어, 세균세포일 수 있거나; 또는 하등 진핵세포, 예를 들어, 효모세포이거나; 또는 고등 진핵세포, 예를 들어, 포유동물세포이다. 대표적인 예로는 대장균 , 스트렙토미세스(Streptomyces); 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)의 세균세포; 진균세포, 예를 들어, 효모; 식물세포; 초파리S2 또는 Sf9의 곤충세포; CHO, COS, 293 세포, 또는 Bowes흑색종세포의 동물세포 등이 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 고등 진핵세포 중에서 발현될 때, 만약 벡터 중에 인핸서(enhancer) 서열을 삽입할 때, 전사를 강화시킬 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스 작용(cis-acting) 인자인 바, 통상적으로 대략 10 내지 300개 염기쌍을 가지고 있어, 프로모터에 작용되어 유전자의 전사를 강화시킨다. 들 수 있는 예로는 복제기점 말기 일측에서의 100 내지 270개 염기쌍의 SV40인핸서, 복제기점 말기 일측에서의 폴리오마(polyoma) 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서 등을 포함한다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자들은 모두 어떻게 적절한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 숙주세포를 선택하겠는가 하는 것을 명백히 알고 있다.
본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 숙지하고 있는 통상적인 기술을 사용하여 재조합 DNA로 숙주세포를 전환시킬 수 있다. 숙주가 원핵생물, 예를 들어, 대장균일 때, DNA를 흡수할 수 있는 컴피턴트세포(competent cell)는 지수생장기(exponential phase) 후 수확될 수 있고, CaCl2법으로 처리되며, 사용되는 단계는 본 기술분야에서 공지된 것이다. 다른 방법은 MgCl2을 사용하는 것이다. 필요하면, 전기천공법으로 전환을 진행할 수도 있다. 숙주가 진핵생물일 때, 인산칼슘공침법, 미세주사법과 같은 통상적인 기계적 방법, 전기천공법, 리포솜(liposome) 포장 등과 같은 DNA 트랜스펙션(transfection) 방법을 선택할 수 있다.
획득한 컨버터(converter)는 통상적인 방법으로 배양할 수 있는 바, 본 발명의 유전자가 암호화한 폴리펩티드를 발현시킨다. 사용되는 숙주세포에 근거하여, 배양과정에서 사용되는 배지는 각종 통상적인 배지에서 선택될 수 있다. 숙주세포 생장에 적합한 조건하에서 배양을 진행한다. 숙주세포가 적절한 세포밀도까지 생장된 후, 적합한 방법(예를 들어, 온도전환 또는 화학유도)으로프로모터의 선택을 유도하여, 세포를 일정한 시간동안 더 배양시킨다.
상기 방법 중에서의 재조합 폴리펩티드는 세포 내 또는 세포막 상에서 발현될수 있거나, 또는 세포밖으로 분비된다. 필요하면, 그 물리적, 화학적 및 기타 특성을 이용하여 각종 분리방법을 통하여 재조합의 단백질을 분리 및 정제시킨다. 이러한 방법은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 숙지하고 있는 것이다. 이러한 방법의 예로는 통상적인 복원처리, 단백질 침전제로 처리(염석방법), 원심분리, 삼투압을 이용한 균 파쇄, 울트라 처리, 초원심(ultra centrifugation) 분리, 분자체(molecular sieve) 크로마토그래피(겔 여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 고속능액체크로마토그래피(HPLC) 및 기타 각종 액체크로마토그래피 기술 및 이러한 방법들의 결합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
응용
본 발명에 관한 활성 폴리펩티드 또는 펩티딜(peptidyl) 전이효소 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4의 용도는 특이하고 효율적으로 테트라사이클릭 트리터페노이드 화합물 기질의 C-20부위 및/또는 C-6부위 및/또는 C-3의 히드록시 글리코실화에 대하여 촉매 작용을 하거나, 또는 글리코실기 공여체에서 제공되는 글리코실기를 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물의 C-3부위의 첫 번째 글리코실기 상에 전이시켜 당사슬을 연장시키는 것을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다). 특히 프로토파낙사디올을 항암 활성을 구비하는 희유 인삼 사포닌 CK와 Rh2로 전환시킬 수 있고, 프로토파낙사트리올을 항노화 활성을 구비하는 희유 인삼 사포닌 F1과 항과민 작용을 구비하는 희유 인삼 사포닌 Rh1로 전환시킬 수 있으며, Rh2를 항암 활성이 더 우수한 희유 인삼 사포닌 Rg3으로 전환시킬 수 있다. 본 발명의 글리코실전이효소는 다마렌디올(dammarendiol), 프로토파낙사트리올, F1, 25-OH-PPD, 25-OCH3-PPD를 그 전에 보도된 바가 없는 새로운 사포닌20-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-PPT, 3-O-β-(D- glucopyranosyl)-F1, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-PPD, 3-O-β-(D- glucopyranosyl)-25-OCH3-PPD로 합성시킬 수도 있다. 본 발명의 글리코실전이효소는 Rh2, CK, Rg3을 인삼 사포닌인삼 사포닌 F2, Rd 및 Rg1 등으로 전환시킬 수도 있다.
상기 테트라사이클릭 트리터페노이드 화합물은 S 배열 또는 R 배열의 다마렌 타입, 라노스탄(Lanostane) 타입, 티루칼레인(tirucallane) 타입, 사이클로아르테인(cycloartane) 타입, 쿠커비테인(cucurbitane), 멜리아케인(meliacane) 타입 등 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
본 발명은 공업 촉매화 방법을 제공하였는 바, 글리코실기 공여체가 제공되는 조건하에서, 본 발명의 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7, 3GT1, 3GT2, 3GT3 및/또는 3GT4활성 폴리펩티드 또는 펩티딜전이효소로 (II), (IV), (VI), (VIII), (X) 및 (XII) 화합물을 획득하는 것을 포함한다. 구체적으로, 상기 (a)반응에 사용되는 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 2, 16 또는 18에서 선택되고; 상기 (b)반응에 사용되는 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.:20, 2, 16 또는 18에서 선택되며; 상기 (c)와 (d)반응에 사용되는 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22, 24, 41 및 43에서 선택되고; 상기 (e)반응에 사용되는 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 26, 28, 55, 57, 59 또는 61로 표시되는 아미노산 서열의 활성 폴리펩티드로부터 선택되며; 상기 (F) 반응에 사용되는 폴리펩티드는 SEQ ID NOs.: 22 또는 24로 표시되는 아미노산 서열의 활성 폴리펩티드로부터 선택된다.
상기 글리코실기 공여체는 뉴클레오시드2인산당이고, UDP-포도당, ADP-포도당, TDP-포도당, CDP-포도당, GDP-포도당, UDP-아세틸 포도당, ADP-아세틸 포도당, TDP-아세틸 포도당, CDP-아세틸 포도당, GDP-아세틸 포도당, UDP-자일로오스, ADP-자일로오스, TDP-자일로오스, CDP-자일로오스, GDP-자일로오스, UDP-갈락투론산(galacturonic acid), ADP-갈락투론산, TDP-갈락투론산, CDP-갈락투론산, GDP-갈락투론산, UDP-갈락토오스(galactose), ADP-갈락토오스, TDP-갈락토오스, CDP-갈락토오스, GDP-갈락토오스, UDP-아라비노스(arabinose), ADP-아라비노스, TDP-아라비노스, CDP-아라비노스, GDP-아라비노스, UDP-람노스(rhamnose), ADP-람노스, TDP-람노스, CDP-람노스, GDP-람노스, 또는 기타 뉴클레오시드2인산 헥소오스(nucleoside diphosphate hexose) 또는 뉴클레오시드2인산 펜타오스(nucleoside diphosphate pentaose), 또는 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 글리코실기 공여체는 우리딘 2인산당(uridine diphosphate sugar)이고, UDP-포도당, UDP-갈락투론산, UDP-갈락토오스, UDP-아라비노스, UDP-람노스, 또는 기타 우리딘 2인산 헥소오스 또는 우리딘 2인산 펜타오스(Uridine diphosphate pentaose), 또는 그 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 방법에서, 효소 활성 첨가물(효소 활성을 향상키기거나 또는 효소 활성을 억제시키는 첨가물)을 더 첨가할 수 있다. 상기 효소 활성의 첨가물은 Ca2+, Co2+, Mn2+, Ba2+, Al3+, Ni2+, Zn2+, Fe2+; 또는 Ca2+, Co2+, Mn2+, Ba2+, Al3+, Ni2+, Zn2+, Fe2+을 생성할 수 있는 물질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 방법의 pH조건은 pH4.0-10.0이고, 바람직하게 pH6.0-pH8.5이며, 더욱 바람직하게 8.5이다.
상기 방법의 온도 조건은 10℃-105℃이고, 바람직하게 25℃-35℃이며, 더욱 바람직하게 35℃이다.
본 발명은 유효량의 본 발명의 활성 폴리펩티드 또는 펩티딜전이효소 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7, 3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4, 및 식품학 또는 공업 적으로 허용 가능한 벡터 또는 부형제를 함유하는 조성물을 제공한다. 이러한 벡터는 물, 완충용액, 포도당, 물, 글리세린(glycerin), 에탄올, 및 그 조합을 포함한다(그러나 이제 한정되지 않는다).
상기 조성물에 본 발명의 gGT25효소 활성을 조절하는 물질이 더 첨가될 수 있다. 효소 활성을 향상시키는 기능을 구비하는 어떠한 물질도 모두 사용가능하다. 바람직하게, 상기 본 발명의 gGT25효소 활성을 향상시키는 물질은 메르캅토에탄올(mercaptoethanol)에서 선택된다. 이 밖에, 아주 많은 물질은 효소 활성을 감소시킬 수 있는 바, Ca2+, Co2+, Mn2+, Ba2+, Al3+, Ni2+, Zn2+ 및 Fe2+; 또는 기질까지 첨가한 후 가수분해되어 Ca2+, Co2+, Mn2+, Ba2+, Al3+, Ni2+, Zn2+ 및 Fe2+을 형성할 수 있는 물질을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
본 발명의 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4를 획득한 후, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 상기 효소를 편리하기 응용하여 글리코실전이 작용을 발휘시키도록 할 수 있는데, 특히 다마렌디올(dammarendiol), 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사트리올에 대하여 글리코실전이 작용을 발휘하도록 할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시방식으로서, 희유 인삼 사포닌을 형성하는 두가지 방법을 더 제공하였는 바, 상기 방법 중의 하나는 본 발명의 상기 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7, 3GT1 및/또는 3GT2효소로 글리코실전이시키려는 기질을 처리하는 것을 포함하고, 상기 기질은 다마렌디올(dammarendiol), 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사트리올 및 그 유도체 등 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물을 포함한다. 바람직하게, pH가 3.5-10인 조건하에서, 상기 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4 효소로 글리코실전이시키려는 기질을 처리한다. 바람직하게, 온도가30-105℃인 조건하에서, 상기 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4, gGT29-3, 3GT1 및/또는 3GT2 효소로 글리코실전이시키려는 기질을 처리한다.
상기 방법 중의 다른 하나 방법은 본 발명의 상기 gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4 유전자를 다마렌디올(dammarendiol), 프로토파낙사디올 또는 프로토파낙사트리올을 합성할 수 있는 엔지니어링 박테리아(예를 들어, 효모 또는 대장균 엔지니어링 박테리아) 중에 도입시키거나, 또는, gGT25, gGT13, gGT30, gGT25-1, gGT25-3, gGT25-5, gGT29, gGT29-3, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6, gGT29-7및 3GT1, 3GT2, 3GT3, 3GT4 유전자를 다마렌디올(dammarendiol), 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사트리올 합성대사경로 중의 관건적인 유전자와 숙주세포(예를 들어, 효모 세포 또는 대장균) 중에서 공통발현시켜, 희유 인삼 사포닌 CK, Rh2, Rg3, Rh1 또는 F1의 재조합 균을 직접 생산하는 것을 포함한다.
상기 다마렌디올(dammarendiol) 합성대사경로 중의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성효소 유전자를 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다).
다른 바람직한 실시예에서, 상기 프로토파낙사디올 합성대사경로 중의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성효소 유전자, 시토크롬P450 CYP716A47 유전자, 및 P450 CYP716A47의 환원효소 유전자, 또는 그 조합을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다). 또는 이상의 각종 효소의 동질 효소(isoenzyme) 및 그 조합을 포함한다. 여기서, 다마렌디올 합성 효소는 옥사이도스쿠알렌(oxidosqualene)(사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces) 효모 자체 합성)을 다마렌디올, 시토크롬P450 CYP716A47 및 그 환원 효소로 전환시키고, 다음 다마렌디올을 프로토파낙사디올로 전환시킨다.(Han et.al, plant & cell physiology, 2011, 52.2062-73)
또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 프로토파낙사트리올 합성대사경로 중의 관건적인 유전자는 다마렌디올 합성효소 유전자, 시토크롬 P450 CYP716A47 유전자, P450 CYP716A47의 환원효소 유전자, 및 시토크롬 P450 CYP716A53V2 유전자, 또는 그 조합을 포함한다(그러나 이에 한정되지 않는다). 또는 이상의 각종 효소의 동질 효소 및 그 조합을 포함한다. 여기서, 다마렌디올 합성 효소는 옥사이도스쿠알렌(사카로미세스 세레비시아 효모 자체 합성)을 다마렌디올, 시토크롬P450 CYP716A47 및 그 환원 효소로 전환시키고, 다음 다마렌디올을 프로토파낙사디올, 시토크롬P450 CYP716A53v2(JX036031) 및 P450 CYP716A47의 환원 효소로 전환시키며, 그 다음 진일보로 프로토파낙사디올을 프로토파낙사트리올로 전환시킨다.(Han et.al, plant & cell physiology, 2012, 53. 1535-45)
본 발명의 주요한 장점
(1) 본 발명의 글리코실전이효소는 특이하고 효과적으로 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물 기질의 C-20부위 및/또는 C-6부위 및/또는 C-3부위 히드록시기 상에 포도당을 도입시킬 수 있고;
(2) 본 발명의 글리코실전이효소 gGT29와 gGT29-3는 글리코실기 공여체에서 제공되는 글리코실기를 테트라사이클릭 트리터페노이드계 화합물의 C-3부위의 첫 번째 글리코실기 상에 전이시켜 당사슬을 연장할 수 있으며;
(3) 본 발명의 글리코실전이효소 특히 프로토파낙사디올과 프로토파낙사트리올을 각각, 항암 활성을 구비하는 희유 인삼 사포닌 CK, Rh2 또는 Rg3, 및 항노화 활성을 구비하는 희유 인삼 사포닌 F1, 항과민 작용을 구비하는 희유 인삼 사포닌 Rh1으로 전환시킬 수 있고;
(4) 본 발명의 글리코실전이효소는 다마렌디올(dammarendiol), 프로토파낙사트리올, F1, 25-OH-PPD, 25-OCH3-PPD를 그 전에 보도된 바가 없는 새로운 화합물 20-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-PPT, 3-O-β- (D-glucopyranosyl)-F1, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-PPD, 3-O-β- D-glucopyranosyl)-25-OCH3-PPD, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-lanosterol을 합성시킬 수도 있다.
(5) 3GT1, 3GT2, gGT29, gGT29-3 및 gGT25-5의 촉매 작용 활성은 라사이클릭 트리터페노이드 화합물 상의 20부위 히드록시기 또는 글리코실기 공간 배열의 영향을 받지 않으므로, 20(S)배열의 인삼 사포닌(사포게닌)에 대하여 촉매 작용을 할 수 있을 뿐만 아니라 20(R)배열의 인삼 사포닌(사포게닌)에 대하여 촉매 작용을 할 수 있다.
(6) 효모 중에서 인삼 사포게닌(다마렌디올(dammarendiol), 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사트리올)의 합성경로를 구성함으로써, 포도당 등 단당을 기질로 하고, 효모로 발효시켜 새로운 화합물 20-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-PPT, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-F1, 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-lanosterol 등 및 희유 인삼 사포닌 CK, F1, Rh1, Rh2 및 Rg3의 생산을 실현하였기에, 이는 사포닌 생산에서의 원료래원 문제를 해결했을 뿐만 아니라, 희유 사포닌 CK, F1, Rh1, Rh2 및 Rg3의 생산 원가를 대폭 감소시킬 수 있다.
아래 구체적인 실시예에 결부시켜 진일보로 본 발명에 대하여 상세히 설명하도록 한다. 이러한 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아닌 것으로 이해하여야 한다. 아래 실시예에서는 구체적인 조건을 밝히지 않은 실험방법은, 일반적으로 통상적인 조건, 예를 들어, Sambrook 등, 분자클론: 실험실 수첩(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) 중에 기재된 조건, 또는 제조업체에서 권장하는 조건에 따라 실험을 진행한다.
실시예1
글리코실전이효소 및 그 암호 유전자의 분리
발표된 인삼속 식물 발현 프로필 데이터로부터 100여가닥의 글리코실전이효소를 예측하는 cDNA서열을 추출하였고, 거기에서 60가닥의 cDNA 전체 길이 서열을 복제하였으며 그들에 대해 발현 및 글리코실전이 반응 분석을 진행하였는데, 여기서, 11가지의 발현 산물이 인삼 사포게닌 및 사포닌에 대해 글리코실전이 활성을 구비하고 있다.
인삼RNA를 추출하고 역전사를 진행하여, 인삼의 cDNA를 획득한다. 상기 cDNA를 템플릿으로 하여 PCR증폭을 진행하고, 그중의 프라이머 쌍1(SEQ ID NOs.: 7, 8); 프라이머 쌍2(SEQ ID NOs.: 9, 10); 프라이머 쌍3 (SEQ ID NOs.: 11, 12); 프라이머 쌍5(SEQ ID NOs.: 34, 35); 프라이머 쌍7(SEQ ID NOs.: 46, 47); 프라이머 쌍8(SEQ ID NOs.:62, 63); 프라이머 쌍9 (SEQ ID NOs.:64, 65) 전부를 사용하여 증폭산물을 획득한다. DNA 중합효소(polymerase)로는 보생물공정유한회사의 고충실도의 KOD DNA중합효소를 사용한다. PCR산물은 아가로스 겔 전기영동의 검출을 거친다(도1, 19(c)과 31). 자외선의 조사하에서, 타겟(target) DNA 스트립(strip)을 절단한다. 다음, Axygen Gel Extraction Kit(AEYGEN 회사)를 응용하여 아가로스 겔 중으로부터 DNA를 회수하는 바, 즉, 증폭된 DNA세그먼트이다. 이 DNA세그먼트에 대하여, 보생물공정유한회사의 rTaq DNA 중합효소로 말단에 A를 첨가한 후, 상기 DNA 세그먼트를 시중에 판매되는 클론 벡터 pMD18-T Vector와 연결시키고, 연결된 산물은 시중에 판매되는 대장균 EPI300컴피턴트 세포(competent cell)를 전환시키며, 전환된 후의 대장균 균액을 암피실린(ampicillin) 50ug/mL, IPTG 0.5mM, X-Gal 25μg/mL를 첨가한 LB플레이트 상에 도포하고, 진일보로 PCR과 제한 효소를 통하여 재조합 클론을 검증한다. 각각 그중 하나의 클론 추출 재조합 플라스미드를 선택한 후 시퀀싱(sequencing)을 진행한다. BESTORF소프트웨어로 오픈리딩프레임(ORF)을 찾는다. 서열 정렬(sequence alignment)을 통하여, ORF는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역(conserved domain)을 암호화하여, 글리코실전이효소 유전자라는 것을 표명한다.
프라이머 쌍1(SEQ ID NOs.: 7, 8)로 획득한 유전자는 SEQ ID NOs.: 1, 15, 17 및 19로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비하는 바, 각각 gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5라고 명명한다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 1에서의 5'말단 제1 내지 1425부위 뉴클레오티드는 gGT25의 단백질 암호서열(CDS)이고, SEQ ID NO.: 1에서의 5'말단의 제1-3부위 뉴클레오티드는 gGT25 유전자의 개시암호(initiation codon) ATG이다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 15에서의 5'말단 제1 내지 1428부위 뉴클레오티드는 gGT25-1의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.: 15에서의 5'말단의 제1-3부위 뉴클레오티드는 gGT25-1 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 15에서의 5'말단의 제1426 내지 1428부위 뉴클레오티드는 gGT25-1 유전자의 종결암호(termination codon) TAA이다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 17에서의 5'말단 제1 내지 1428부위 뉴클레오티드는 gGT25-3의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.: 17에서의 5'말단의 제1-3부위 뉴클레오티드는 gGT25-3 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 17에서의 5'말단의 제1426 내지 1428부위 뉴클레오티드는 gGT25-3 유전자의 종결암호 TAA이다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 19에서의 5'말단 제1 내지 1419부위 뉴클레오티드는 gGT25-5의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.: 19에서의 5'말단의 제1-3부위 뉴클레오티드는 gGT25-5 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 19에서의 5'말단의 제1426 내지 1428부위 뉴클레오티드는 gGT25-5 유전자의 종결암호 TAA이다.
프라이머 쌍2(SEQ ID NOs.: 9, 10)로 획득한 유전자는 SEQ ID NO.: 3로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비하는 바, gGT13이라고 명명한다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 3에서의 5'말단 제1 내지 1431부위 뉴클레오티드는 gGT13의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.: 3에서의 5'말단의 제1-3부위 뉴클레오티드는 gGT13 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 1에서의 5'말단의 제1429 내지 1431부위 뉴클레오티드는 gGT13 유전자의 종결암호 TAA이다.
프라이머 쌍3 (SEQ ID NOs.: 11, 12) 으로 획득한 유전자는 SEQ ID NO.: 5로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비하는 바, gGT30이라고 명명한다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 5에서의 5'말단 제1 내지 1353부위 뉴클레오티드는 gGT30의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.: 5에서의 5'말단의 1-3부위부위 뉴클레오티드는 gGT30 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 5에서의 5'말단의 제1351 내지 1353부위 뉴클레오티드는 gG30 유전자의 종결암호 TAA이다.
프라이머 쌍5(SEQ ID NOs.: 34, 35)로 획득한 유전자는 SEQ ID NOs.: 25, 27로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비하는 바, 각각 gGT29와 gGT29-3이라고 명명한다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 25에서의 5'말단 제1 내지 1329부위 뉴클레오티드는 gGT29의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.: 25에서의 5'말단의 1-3부위부위 뉴클레오티드는 gGT29 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 25에서의 5'말단의 제1327 내지 1329부위 뉴클레오티드는 gG29 유전자의 종결암호 TAG이다. SEQ ID NO.: 27에서의 5'말단의 1-3부위부위 뉴클레오티드는 gGT29-3 유전자의 개시암호 ATG이고, SEQ ID NO.: 27에서의 5'말단의 제1327 내지 1329부위 뉴클레오티드는 gGT29-3 유전자의 종결암호 TAG이다.
프라이머 쌍6(SEQ ID NOs.: 46, 47)으로 획득한 유전자는 SEQ ID NO.:42로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비하는 바, 3GT4라고 명명한다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 42에서의 5'말단 제1 내지 1374부위 뉴클레오티드는 3GT4의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.:42에서의 5'말단의 1-3부위 뉴클레오티드는 3GT4 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 42에서의 5'말단의 제1372 내지 1374부위 뉴클레오티드는 3GT4 유전자의 종결암호 TAG이다.
프라이머 쌍7(SEQ ID NOs.:62, 63)로 획득한 유전자는 SEQ ID NO.54, 56, 58로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비하는 바, gGT29-4, gGT29-5 및 gGT29-6이라고 명명한다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 54에서의 5'말단 제1 내지 1341부위 뉴클레오티드는 gGT29-4의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.:54에서의 5'말단의 1-3부위 뉴클레오티드는 gGT29-4 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 54에서의 5'말단의 제1339 내지 1341부위 뉴클레오티드는 gGT29-4 유전자의 종결암호 TAG이다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 56에서의 5'말단 제1 내지 1341부위 뉴클레오티드는 gGT29-5의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.:56에서의 5'말단의 1-3부위 뉴클레오티드는 gGT29-5 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 56에서의 5'말단의 제1339 내지 1341부위 뉴클레오티드는 gGT29-5 유전자의 종결암호 TAG이다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 58에서의 5'말단 제1 내지 1341부위 뉴클레오티드는 gGT29-6의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.:58에서의 5'말단의 1-3부위 뉴클레오티드는 gGT29-6 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 58에서의 5'말단의 제1339 내지 1341부위 뉴클레오티드는 gGT29-6 유전자의 종결암호 TAG이다.
프라이머 쌍8(SEQ ID NOs.:64, 65)로 획득한 유전자는 SEQ ID NO. 60으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비하는 바, gGT29-7이라고 명명한다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 60에서의 5'말단 제1 내지 1341부위 뉴클레오티드는 gGT29-7의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.:60에서의 5'말단의 1-3부위 뉴클레오티드는 gGT29-7 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 60에서의 5'말단의 제1339 내지 1341부위 뉴클레오티드는 gGT29-7 유전자의 종결암호 TAG이다. 인공합성은 SEQ ID NOs.: 21, 23 및 40으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 구비하는 바, 각각 3GT1, 3GT2 및 3GT3이라고 명명한다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 21에서의 5'말단 제1 내지 1488부위 뉴클레오티드는 3GT1의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.: 21에서의 5'말단의 제1-3부위 뉴클레오티드는 3GT1 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 21에서의 5'말단의 제1486 내지 1488부위 뉴클레오티드는 3GT1 유전자의 종결암호 TAA이다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 23에서의 5'말단 제1 내지 1488부위 뉴클레오티드는 3GT2의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.: 23에서의 5'말단의 제1-3부위 뉴클레오티드는 3GT2 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 23에서의 5'말단의 제1486 내지 1488부위 뉴클레오티드는 3GT2 유전자의 종결암호 TAA이다. 서열표 중 SEQ ID NO.: 40에서의 5'말단 제1 내지 1494부위 뉴클레오티드는 3GT3의 오픈리딩프레임(ORF)이고, SEQ ID NO.: 40에서의 5'말단의 제1-3부위 뉴클레오티드는 3GT3 유전자의 개시암호 ATG이며, SEQ ID NO.: 40에서의 5'말단의 제1492 내지 1494부위 뉴클레오티드는 3GT3 유전자의 종결암호 TAA이다. 프라이머 쌍4(SEQ ID NOs.: 29, 30) 로 그중 두가닥의 인공합성된 유전자(SEQ ID NO.: 21과 SEQ ID NO.: 23)에 대하여 PCR증폭을 진행하고, 획득한 PCR산물은 SEQ ID NO.: 21과 SEQ ID NO.: 23으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(도19(a))을 구비하며; 프라이머 쌍6(SEQ ID NOs.: 44, 45)으로 다른 한가닥의 인공합성된 유전자(SEQ ID NO.: 40)에 대하여 PCR증폭을 진행하고, 획득한 PCR산물은 SEQ ID NO.: 40으로 표시되는 뉴클레오티드 서열(도19(b))을 구비한다.
글리코실전이효소 유전자 gGT25는 475개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT25를 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 2로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량 크기는 53 kDa이고, 등전점(isoelectric point)pI는 5.14이다. SEQ ID NO.: 2의 아미노 말단의 제344-387부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 인삼 전사체 중에서 예측된 사포닌 글리코실전이효소 유전자의 아미노산 서열 일치성은 52%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자 gGT25-1은 475개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT25-1을 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 16으로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 53 kDa이고, 등전점pI는 4.91이다. SEQ ID NO.: 16의 아미노 말단의 제344-387부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 인삼 전사체 중에서 예측된 사포닌 글리코실전이효소 유전자의 아미노산 서열 일치성은 52%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자 gGT25-3은 475개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT25-3을 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 18로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 상기 단백질을 예측한 이론 분자량은 53 kDa이고, 등전점pI는 5.05이다. SEQ ID NO.: 18의 아미노 말단의 제344-387부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 인삼 전사체 중에서 예측된 사포닌 글리코실전이효소 유전자의 아미노산 서열 일치성은 52%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자 gGT25-5는 472개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT25-5를 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 20으로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 53 kDa이고, 등전점pI는 4.98이다. SEQ ID NO.: 20의 아미노 말단의 제343-386부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 인삼 전사체 중에서 예측된 사포닌 글리코실전이효소 유전자의 아미노산 서열 일치성은 52%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자 gGT13은 476개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT13을 암호화하고, 서열표 중 서열SEQ ID NO.: 4로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 53 kDa이고, 등전점pI는 4.91이다. SEQ ID NO.: 4의 아미노 말단의 제343-386부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 인삼 전사체 중에서 예측된 사포닌 글리코실전이효소 유전자의 아미노산 서열 일치성은 제일 높아서 99.5%이다.
글리코실전이효소 유전자 gGT30은 451개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT30을 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 51 kDa이고, 등전점pI는 6.79이다. SEQ ID NO.: 6의 아미노 말단의 제318-361부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소는 비티스 비니훼라(Vitis vinifera)와 마찬가지로 글리코실전이효소(XP_002271587) 유사성이 제일 높은 바(53%), 상기 글리코실전이효소는 새로운 효소라는 것을 표명한다.
글리코실전이효소 유전자3GT1은 495개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질3GT1을 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 22로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 56kDa이고, 등전점pI는 5.52이다. SEQ ID NO.: 22의 아미노 말단의 제355-398부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 유럽나도냉이(Barbarea vulgaris)에서 얻은 글리코실전이효소UGT73C10의 상동성>99%이다.
글리코실전이효소 유전자3GT2는 495개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질3GT2를 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 24로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 56kDa이고, 등전점pI는 5.62이다. SEQ ID NO.: 24의 아미노 말단의 제355-398부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 유럽나도냉이(Barbarea vulgaris)에서 얻은 글리코실전이효소UGT73C12의 상동성>99%이다.
글리코실전이효소 유전자 gGT29는 442개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT29를 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 26으로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 49kDa이고, 등전점pI는 5.93이다. SEQ ID NO.: 26의 아미노 말단의 제317-360부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 비티스 비니훼라(Vitis vinifera)에서 얻은 글리코실전이효소의 서열 유사성은 56%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자 gGT29-3은 442개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT29-3을 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 28로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 49kDa이고, 등전점pI는 5.48이다. SEQ ID NO.: 28의 아미노 말단의 제317-360부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 비티스 비니훼라(Vitis vinifera)에서 얻은 글리코실전이효소의 서열 유사성은 56%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자3GT3은 497개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질3GT3을 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 41로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 55kDa이고, 등전점pI는 5.50이다. SEQ ID NO.: 41의 아미노 말단의 제350-393부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)에서 얻은 글리코실전이효소의 상동성>99%이다.
글리코실전이효소 유전자 3GT4는 458개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질 3GT4를 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 43으로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 51kDa이고, 등전점pI는 5.10이다. SEQ ID NO.: 43의 아미노 말단의 제333-376부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 비티스 비니훼라(Vitis vinifera)에서 얻은 글리코실전이효소의 서열 상동성은 50%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자 gGT29-4는 446개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT29-4를 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 55로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 50kDa이고, 등전점pI는 5.78이다. SEQ ID NO.: 55의 아미노 말단의 제321-364부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 북시호(Bupleurum chinense)에서 얻은 글리코실전이효소의 서열 유사성은 57%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자 gGT29-5는 446개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT29-5를 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 57로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 50kDa이고, 등전점pI는 5.93이다. SEQ ID NO.: 57의 아미노 말단의 제321-364부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 북시호(Bupleurum chinense)에서 얻은 글리코실전이효소의 서열 유사성은 58%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자 gGT29-6은 446개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT29-6을 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 59로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 50kDa이고, 등전점pI는 6.03이다. SEQ ID NO.: 59의 아미노 말단의 제321-364부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 북시호(Bupleurum chinense)에서 얻은 글리코실전이효소의 서열 유사성은 59%보다 낮다.
글리코실전이효소 유전자 gGT29-7은 446개 아미노산을 함유하는 하나의 단백질gGT29-7을 암호화하고, 서열표 중 SEQ ID NO.: 61로 표시되는 아미노산 서열을 구비한다. 스프트웨어로 예측한 상기 단백질의 이론 분자량은 50kDa이고, 등전점pI는 5.80이다. SEQ ID NO.: 61의 아미노 말단의 제321-364부위는 글리코실전이효소 제1패밀리 보존 영역이다. 상기 글리코실전이효소와 북시호(Bupleurum chinense)에서 얻은 글리코실전이효소의 서열 유사성은 57%보다 낮다.
Figure pat00024
실시예2
글리코실전이효소 유전자 gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5의 효모 재조합 발현 벡터의 구성
실시예1에서 구성된, gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5 유전자를 함유하는 플라스미드gGT25-pMD18T, gGT25-1-pMD18T, gGT25-3-pMD18T 및 gGT25-5-pMD18T를 템플릿으로 하여 타겟 유전자를 증폭시킨다.
사용되는 정방향 프라이머(Forward primer)는 모두 하기와 같다.
5'- GCCGGAGCTCATGAAGTCAGAATTGATATTC - 3' (SEQ ID NO.: 13), 그 5'말단에 SacI인식 부위:GAGCTC를 첨가한 것;
사용되는 역방향 프라이머(Reverse primer)는 모두 하기와 같다.
5'-GCCGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCATAATTTCCTCAAATAGCTTC-3' (SEQ ID NO.: 14), 그 5'말단에 XholI 인식 부위:CTCGAG를 첨가한 것, 역방향 프라이머는 6×His Tag를 도입하여, Western Blot 검출발현 및 정제를 진행하도록 한다.
상기 프라이머와 템플릿을 통하여 PCR방법을 이용하여 gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5 유전자를 증폭시킨다. DNA중합효소로 Toyobo회사의 하이파이(High Fidelity) DNA중합효소kod를 사용하는데, 그 설명서에 설정된 PCR 프로그램을 참고해 보면, 94°C 2min; 94°C 15s, 58°C 30s, 68°C 1.5min, 총 30개 순환; 68°C 10min; 10°C 보온이 설정되어 있다. PCR산물은 아가로스 겔 전기영동 검출을 거쳐, 자외선하에서, 타겟 DNA 크기와 일치한 스트립를 절단한다. 다음, AXYGEN회사의 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit를 사용하여 아가로스 겔 중으로부터 DNA세그먼트를 회수한다. Takara회사의 QuickCut 제한성 엔도뉴클레아제(endonuclease) Kpn I와 Xba I 더블 제한 효소(Double enzyme digestion)로 회수한 DNA세그먼트를 30min동안, AXYGEN회사의 AxyPrep PCR Cleanup Kit로 제한 효소산물에 대해 세척회수를 진행한다. NEB회사의 T4 DNA 연결 효소를 이용하여 제한 효소 산물을 사카로미세스 세레비시아 효모와 발현 플라스미드pYES2(마찬가지로 Kpn I와 Xba I제한 효소로 절단 및 러버 태핑(rubber tapping)하여 회수) 25°C에서 2h동안 연결시킨다. 연결된 산물은 E. coli TOP 10컴피턴트 세포를 전환시키고, 100μg/mL 엠피실린이 첨가된 LB플레이트 상에 도포시킨다. 콜로니(colony) PCR을 통하여 양성 컨버터를 검증하고, 진일보 검증을 시퀀싱한다. 발현 플라스미드gt25-pYES2, gt25-1-pYES2, gt25-3-pYES2 및 gt25-5-pYES2의 구성이 성공되었음을 진일보로 검증한다.
실시예3
글리코실전이효소 유전자 gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5가 사카로미세스 세레비시아 효모 중에서의 발현
전기전환 방법을 통하여, 구성된 발현 플라스미드gt25-pYES2를 사카로미세스 세레비시아 효모(Saccharomyces cerevisiae) 중에 전환시키고, 선별 플레이트 SC-Ura(아미노산 기본 질소원이 없는0.67% 효모, 2% 포도당)에 도포한다. 콜로니 PCR을 통하여 효모 레콘을 검증한다. 효모 레콘 콜로니를 10mL SC-Ura (2% 포도당) 배지 중에 골라놓고, 30°C, 200rpm에서 20h동안 배양한다. 4°C 3500 g 원심분리를 통해 균체를 수집하고, 무균 탈이온수로 균체를 두번 세척하며, 유도 배지SC-Ura (2% 갈락토오스)로 균체를 재부유(resuspension)시키고, 50 mL 유도 배지 중에 접종시켜, OD600이 0.4좌우로 되게 하여, 30°C, 200rpm에서 유도발현을 시작한다. 4°C, 3500g원심분리를 통해 12h동안 유도발현된 균체를 수집하고, 무균 탈이온수로 균체를 두번 세척하며, 효모 용균 완충용액 중에 재부유시켜, OD600이 50-100사이에 있게 한다. Fastprep세포파쇄기로 효모 세포를 진탕시켜 파쇄하고, 4°C, 12000g 원심분리로 10min동안 세포 조각을 제거하며, 세포 용균액 상청액을 수집한다. 적량의 용균액 상청액을 취하여 SDS-PAGE전기영동 검출을 진행하여, pYES2빈 벡터의 레콘과 비교해 보면, gt25-pYES2, gt25-1-pYES2, gt25-3-pYES2, gt25-5-pYES2레콘은 뚜렷한 스트립 특징이 없는 바, 도2에 도시된 바와 같다. anti-6×His Tag Western Blot을 응용하여 발현정황을 검출하고, 도3에 도시된 바와 같이, gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5을 발현하는 사카로미세스 세레비시아 효모 레콘은 아주 강한 Western Blot신호를 나타내기에, gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5가 효모 중에서 수용성 발현된다는 것을 표명지만, pYES2빈 벡터 전이의 레콘에는 anti-6×His Tag Western Blot신호가 없다.
실시예4
효모 발현 산물gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5글리코실전이 반응과 산물 감정
gGT25, gGT25-1, gGT25-3 및 gGT25-5를 발현하는 재조합 효모 용균 상청액을 효소액으로 하여 기질인 프로토파낙사디올(Protopanoxadiol PPD), 프로토파낙사트리올(Protopanaxatriol PPT) 및 다마렌디올(Dammarenediol II, DM)의 글리코실전이 반응에 대하여 촉매 작용을 하여, 빈 벡터을 발현하는 재조합 효모 용균 상청액을 대조군으로 한다. 100μL반응 시스템(reaction system)은 표3과 같다.
Figure pat00025
반응은 35℃하에서 12h동안 진행된 다음 100μL 부탄올을 첨가하여 반응을 중지시키고, 산물을 추출한다. 산물을 진공건조시킨 후, 메탄올로 용해시킨다.
반응 산물은 먼저 박층크로마토그래피(TLC)로 검출하고, gGT25 또는 gGT25-1 또는 gGT25-3을 발현하는 재조합 효모 용균 상청액 효소액은 프로토파낙사디올과 프로토파낙사트리올의 20부위 히드록시 글리코실화에서, 각각 희유 인삼 사포닌 CK와 F1로 전환될 수 있으며(도6과 도7); 3부위 히드록시기가 이미 글리코실화된 프로토파낙사디올 타입 사포닌(Rh2와 Rg3)은, gGT25, gGT25-1 및 gGT25-3의 촉매 작용하에서, 20부위 히드록시기를 계속하여 글리코실화하여, 각각 F2와 Rd를 생성할 수 있고(도6); gGT25, gGT25-1 및 gGT25-3은 PPT의 20부위 히드록시를 글리코실화하여 F1을 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 진일보로 6부위 히드록시기에서 계속하여 글리코실화를 진행하여 Rg1을 형성할 수도 있으며(도7); gGT25, gGT25-1 및 gGT25-3은 PPD의 전구체 다마렌디올의 20부위 히드록시를 글리코실화하여, 보도된 바가 없는 사포닌 20-O-β-(D-glucopyranosyl)-dammarendiolII(도8)을 얻을 수도 있다. 그러나, 6부위 히드록시기가 이미 글리코실화된 프로토파낙사트리올 타입 사포닌(Rh1, Rg2 및 Rf)은 gGT25, gGT25-1 및 gGT25-3의 촉매 작용하에서 20부위 히드록시를 글리코실화하지 못한다. 아울러, gGT25, gGT25-1 및 gGT25-3도 당사슬의 연장에 대하여 촉매 작용을 하지 못한다. gGT25-5와 gGT25, gGT25-1 및 gGT25-3은 촉매 활성에서 차이점이 존재하는데, gGT25-5는 gGT25, gGT25-1 및 gGT25-3처럼, PPD, PPT 또는 다마렌디올의 20부위 히드록시에서 글리코실화될 수 없고, PPT의 6부위 히드록시만을 글리코실화하여, 희유 인삼 사포닌 Rh1로 전환시킬 수 있다(도7).
진일보로 gGT25의 전환 산물에 대하여 HPLC로 감정을 진행한다 (도10과 도11). 도10에서, 세개의 피크가 나타나는데, 여기서, 피크2는 표준샘플 중 CK의 유지시간과 일치하고, 피크3은 프로토파낙사디올의 피크와 일치하다. 피크3이 이미 아주 낮은데, 이는 프로토파낙사디올이 기본적으로 모두 CK로 전환되었다는 것을 설명한다. 피크1은 음성 대조군의 도면 중에서도 나타나므로, 프로토파낙사디올의 전환과 무관할 것이다. 도11에서도, 세개의 피크가 나타나는데, 피크1은 표준샘플 중 F1의 유지시간과 일치하고, 피크3은 프로토파낙사트리올의 피크와 일치하다. 피크3이 이미 아주 낮은데, 이는 프로토파낙사트리올이 기본적으로 모두 F1로 전환되었다는 것을 설명한다. 피크2는 음성 대조군의 도면 중에서도 나타나므로, 프로토파낙사트리올의 전환과 무관되어야 한다.
마지막으로, LC/MS로 산물에 대하여 더 진일보로 감정을 진행한다(도12와 도13). 도12는 프로토파낙사디올 전환 산물 중 CK피크(도10 중 피크2)에 대한 질량 스펙트로그램이고, 이는 표준 CK샘플의 질량 스펙트로그램과 완전히 일치하다. 도13은 프로토파낙사트리올 전환 산물 중 F1피크(도11 중 피크1)에 대한 질량 스펙트로그램이고, 이는 표준 샘플F1의 질량 스펙트로그램과 완전히 일치하다. 이러한 결과들은 프로토파낙사디올과 트리올의 gGT25 전환 산물이 각각 CK와 F1이라는 것을 진일보로 검증하였다.
실시예5
글리코실전이효소 유전자 gGT13과 gGT30의 클론, 발현 및 그 발현 산물의 글리코실전이 반응
실시예2와 동일한 방법으로, gGT13과 gGT30의 클론을 획득하였고, 그들의 효모 재조합 발현 벡터를 구성하였으며, 사카로미세스 세레비시아 효모에 도입시켰다. 실시예3과 동일한 단계에 따라 발현 글리코실전이효소의 발현을 유도하고, 비록 SDS-PAGE 겔 상에는 뚜렷한 목적 단백질의 스트립이 없지만(도4), Western Blot은 뚜렷한 교잡정보를 검출해냈기에, 이는 gGT13과 gGT30이 모두 효모 중에서 발현된다는 것을 표명한다(도5).
실시예4와 동일한 방법으로, gGT13과 gGT30을 발현하는 재조합 효모 세포용 균액을 이용하여 각각 프로토파낙사디올(PPD)과 프로토파낙사트리올(PPT)에 대하여 촉매 작용을 한다.
*결과로부터 gGT13과 gGT30의 단백질 발현 산물이 모두 PPD 또는 PPT를 전환시키지 못하고(도9); 또한, gGT13과 gGT30도 모두 프로토파낙사디올 타입 사포닌 Rh2, CK, F2 및 Rg3 및 프로토파낙사트리올 타입F1, Rh1 및 Rg1을 전환시킬 수 없다는 것을 발견하였다.
이상의 결과는, 비록 gGT13과 인삼 전사체 중 예측된 인삼 사포닌글리코실전이효소 아미노산 서열의 일치성이 아주 높더라도(99.5%), gGT13과 gGT30이 상기 기질에 대해 모두 글리코실전이 작용이 없다는 것을 표명한다.
실시예6
글리코실전이효소 유전자 gGT25가 대장균 중에서의 발현 및 그 발현 산물의 글리코실전이 반응
실시예1에서 구성된, gGT25 유전자를 함유하는 플라스미드gGT25-pMD18T를 템플릿으로 하여 타겟 유전자 gGT25를 증폭시키고, 이를 대장균 발현 벡터pet28a(Merck회사에서 구매) 중에 클로닝하여, 대장균 발현 벡터gt25-pet28a를 구성하고, 시중에 판매되는 E. coli BL21 중에 전환시킨다. 하나의 레콘을 LB배지 중에 접종시키고, 30°C, 200rpm에서 OD600이 약 0.6-0.8이 될 때까지 배양하여, 균액의 온도가 4°C까지 내려가도록 하며, 최종 농도가 50 μM인 IPTG를 첨가하여, 18°C 200rpm에서 15 h동안 발현을 유도한다. 4°C 원심분리를 통하여 균체를 수집하고, 초음파로 세포를 파쇄하며, 4°C 12000 g원심분리를 통하여 세포 용균액 상청액을 수집하고, 샘플을 취하여 SDS-PAGE전기영동을 진행한다.
Western Blot(도14)이 표명하는 바와 같이, 50 μM IPTG 유도 조건하에서, 글리코실전이효소 gGT25는 대장균 중에서도 발현될 수 있다. 상기 재조합 대장균의 세포 용균액 상청액을 조효소액으로 하여 글리코실전이 반응을 진행하고, 반응의 조건은 실시예4에서의 반응조건과 동일하다.
*반응은 35℃하에서 12h동안 진행된 후, 다음 100μL 부탄올을 첨가하여 반응을 중지시키고, 산물을 추출한다. 산물을 진공건조시킨 후, 메탄올로 용해시킨다. 반응 산물은 먼저 박층크로마토그래피(TLC)로 검출하고, 도15에서 알 수 있는 바, gGT25조효소액은 PPD를 CK로 전환시킬 수 있다.
실시예7
CK생성 효모 엔지니어링 박테리아의 구성과 산물 감정
pESC-HIS플라스미드((Stratagene, Agilent) 상에서, 다마렌디올 합성 효소(Dammarenediol synthase)(ACZ71036.1)(GAL1/GAL10 GAL10측 프로모터, ADH1터미네이터), 시토크롬(cytochrome)P450 CYP716A47(AEY75213.1)(FBA1프로모터, CYC1터미네이터) 및 글리코실전이효소 gT25(GAL1/GAL10 GAL1측 프로모터, TDH2터미네이터)를 동시에 조립하여, 유리형 플라스미드를 구성하고, 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742를 전환시키며, 애기장대에서 얻은 시토크롬P450환원 효소ATR2-1(NP_849472.2)를 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742염색체 중의 염색체trp1 유전자 부위(GAL1프로모터, trp1 고유 터미네이터를 이용)에 통합시켜, 재조합 효모A를 구성하였다. 동일한 방법으로, 재조합 효모B를 구성하였는 바, 구별점은, 애기장대에서 얻은 환원 효소ATR2-1을 다마렌디올 합성 효소, 시토크롬P450 CYP716A47 및 글리코실전이효소 gT25를 함유하는 재조합 플라스미드 상에 통합시키는 것이고, ATR2-1에는 프로모터와 터미네이터가 있는데 각각 TEF2프로모터와 TPI1터미네이터이고, 기타 3개 유전자의 프로모터와 터미네이터는 재조합 균A의 대응되는 유전자와 동일하다.
재조합 효모균B와 동일한 방법으로 재조합 효모균C를 구성하였지만, 각 유전자의 프로모터와 터미네이터를 다시 기획하였는 바, 표4와 같다.
Figure pat00026
재조합 효모균주A, B, C는 SC-Ura(아미노산 기본 질소원이 없는0.67% 효모, 2% 갈락토오스) 배지 중에서 발효되고, 각 재조합균은 첨가로 첨가된 아미노산 또는 우라실이 수요되며(표5 참조바람), 50mL재조합 효모의 발효액을 취하여, 원심분리후 침전된 균체를 5mL효모 용균 완충용액(50mM Tris-Hcl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 5% 글리세린, pH 7.5)으로 재부유시킨 후, Fastprep로 효모를 진탕시켜 용균시키되, 공률을 6M/S로 설정하고, 7~8차 진탕시켜 효모가 충분히 용균되도록 한다. 용균액을 2mL EP관 중에 전이시켜, 매 하나의 관에 1mL를 담고, 동일한 체적(1mL)의 n-부탄올을 첨가하여 약 30min동안 추출한 후, 12000g로 10min동안 원심분리한다. 상청액을 흡수하여 새로운 EP관에 넣는다. 45℃, 진공 조건하에서 n-부탄올이 증발 건조되도록 한다. 100μL 메탄올로 용해시킨 후 HPLC검출에 사용한다.
HPLC분석을 통하여, 재조합 효모A의 세포 용균액 중에 다마렌디올, 프로토파낙사디올(PPD) 및 인삼 사포닌 활성 대사물CK가 함유되고(도16), 효모A가 CK를 합성하는 생산량이 0.6mg/L에 도달한다는 것을 발견하였다. HPLC분석으로부터 재조합 효모B와 C의 세포 용균액에 미량의 CK가 함유된다는 것을 발견하였다.
Figure pat00027
실시예8
Rh1생성 효모 엔지니어링 박테리아의 구성과 산물 감정
pESC-HIS플라스미드((Stratagene, Agilent)상에서, 다마렌디올 합성 효소(Dammarenediol synthase)(ACZ71036.1)(GAL1/GAL10 GAL10즉 프로모터, ADH1터미네이터), 시토크롬P450 CYP716A47(AEY75213.1)(FBA1프로모터, CYC1터미네이터), 시토크롬P450 CYP716A53V2 유전자(ENO2 프로모터, CYC1터미네이터) 및 글리코실전이효소 gGT25-5(GAL1/GAL10 GAL1즉 프로모터, TDH2터미네이터)를 동시에 조립하여, 유리형 플라스미드를 구성하고, 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742를 전환시키며, 애기장대에서 얻은 시토크롬P450환원 효소ATR2-1(NP_849472.2)를 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742염색체 중의 염색체trp1 유전자 부위(GAL1프로모터, trp1 고유 터미네이터를 이용)에 통합시켜, 재조합 효모A3을 구성하였다. 재조합 효모균에 첨가로 첨가될 상응한 아미노산 또는 우라실은 표5와 같다.
재조합 효모 A3 용균액을 2mL EP관 중에 전이시켜, 매 하나의 관에 1mL를 담고, 동일한 체적(1mL)의 n-부탄올을 첨가하여 약 30min동안 추출한 후, 12000g로 10min동안 원심분리한다. 상청액을 흡수하여 새로운 EP관에 넣는다. 45℃, 진공 조건하에서 n-부탄올이 증발 건조되도록 한다. 100μL 메탄올로 용해시킨 후 HPLC검출에 사용한다.
HPLC분석을 통하여, 재조합 효모A3의 세포 용균액 중에 프로토파낙사트리올(PPT) 및 인삼 사포닌 활성 대사물Rh1이 함유되게 한다는 것을 발견하였다(도41).
실시예9
글리코실전이효소 유전자3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4의 대장균 재조합 발현 벡터의 구성
실시예1에서 구성된, GT1과 3GT2 유전자를 함유하는 플라스미드 3GT1-pMD18T, 3GT2-pMD18T를 템플릿으로 하여 타겟 유전자를 증폭시킨다.
3GT1과 3GT2에 사용되는 정방향 프라이머는 모두 SEQ ID NO.: 31, 그 5'말단에 BamH I인식 부위: GGATCC를 첨가한 것; 3GT1에 사용되는 역방향 프라이머는 SEQ ID NO.: 32, 그 5'말단에 Sal I인식 부위: CTCGAG를 첨가한 것; 3GT2에 사용되는 역방향 프라이머는 SEQ ID NO.: 33, 그 5'말단에 Sal I인식 부위: CTCGAG를 첨가한 것이다.
상기 프라이머와 템플릿을 이용하고 PCR방법을 통하여 3GT1과 3GT2 유전자를 증폭시킨다. DNA중합효소는 Toyobo회사의 고충실도 DNA중합효소kod를 사용하는데, 그 설명서에 설정된 PCR프로그램을 참고해 보면, 94°C 2min; 94°C 15s, 58°C 30s, 68°C 1.5min, 총 35개 순환; 68°C 10min; 10°C 보온이 설정되어 있다. PCR산물은 아가로스 겔 전기영동 검출을 거쳐, 자외선하에서, 타겟 DNA 크기와 일치한 스트립를 절단한다. 다음, AXYGEN회사의 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit를 사용하여 아가로스 겔 중으로부터 DNA세그먼트를 회수한다. Takara회사의 QuickCut 제한성 엔도뉴클레아제(endonuclease) Kpn I와 Xba I 더블 제한 효소로 회수한 DNA세그먼트를 30min동안, AXYGEN회사의 AxyPrep PCR Cleanup Kit로 제한 효소산물에 대해 세척회수를 진행한다. NEB회사의 T4 DNA 연결 효소를 이용하여 제한 효소 산물을 사카로미세스 세레비시아 효모와 발현 플라스미드pET28a (마찬가지로 BamH I와 Sal I제한 효소로 러버 태핑하여 회수) 16°C에서 4 h동안 연결시킨다. 연결된 산물은 E. coli EPI300컴피턴트세포를 전환시키고, 50μg/mL 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB플레이트 상에 도포한다. 콜로니 PCR을 통하여 양성 컨버터를 검증하고 시퀀싱하여, 진일보로 발현 플라스미드3GT1-pET28a와 3GT2-pET28a의 구성이 성공되었음음 진일보로 검증한다.
실시예1에서 구성된, 3GT3과 3GT4 유전자를 함유하는 플라스미드 3GT3-pMD18T, 3GT4-pMD18T를 템플릿으로 하여 타겟 유전자를 증폭시킨다.
3GT3에 사용되는 정방향 프라이머는 SEQ ID NO.: 48과 같고, 그 5'말단에 벡터pET28a와 상동적인 서열:ACTTTAAGAAGGAGATATACC를 첨가한 것이며; 3GT3에 사용되는 역방향 프라이머는 SEQ ID NO.: 49와 같고, 그 5'말단에 벡터pET28a와 상동적인 서열: CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT를 첨가한 것이다.
3GT4에 사용되는 정방향 프라이머는 SEQ ID NO.: 50과 같고, 그 5'말단에 벡터pET28a와 상동적인 서열:ACTTTAAGAAGGAGATATACC를 첨하한 것이며; 3GT4에 사용되는 역방향 프라이머는 SEQ ID NO.:51, 그 5'말단에 벡터pET28a와 상동적인 18개 알칼로이드 세그먼트:CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTT를 첨가한 것이다.
상기 프라이머를 이용하고 PCR방법을 통하여 3GT3과 3GT4 유전자를 증폭시킨다. 유전자의 증폭에는 NEB회사의 Q5고충실도 DNA중합효소가 사용되고,그 설명서를 참조하여 PCR프로그램을 하기와 같이 설정한다. 98°C 30s; 98°C 15s, 58°C 30s, 72°C 1min, 총 35개 순환; 72°C 2min; 10°C보온으로 설정되어 있다.
아울러, SEQ ID NO.: 52와 SEQ ID NO.: 53을 각각 정방향과 역방향 프라이머로 사용하여 벡터pET28a를 증폭시켜, 선형화된 벡터pET28a를 획득한다. pET28a 선형화 벡터의 증폭에도 NEB회사의 Q5고충실도DNA중합효소가 사용되고, 그 설명서를 참조하여 PCR프로그램을 98°C 30s; 98°C 15s, 58°C 30s, 72°C 3min, 총35개 순환; 72°C 2min; 10°C보온으로 설정한다.
상기 3GT3과 3GT4 유전자 PCR산물 및 선형화된 벡터pET28a가, 아가로스 겔 전기영동 검출을 거친 후, 자외선하에서, 타겟 DNA 크기와 일치한 스트립를 절단한다. 다음, AXYGEN회사의 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit를 사용하여 아가로스 겔 중에서 DNA세그먼트를 회수한다. 낙정생물과학기술유환회사의 BGclonart 심리스클론(Seamless cloning) 키트 설명서를 참조하여, 회수한 선형화된 pET28a벡터 세그먼트, 회수한 3GT3 또는 3GT4 유전자 세그먼트 및낙정생물과학기술유환회사의 BGclonart심리스클론반응액을 적당한 비례로 혼합시켜, 총 20μl가 되게 한다. 균일하게 혼합시킨 후 50℃에서 30분 동안 부화시킨 다음 혼합 반응액을 얼음 상에 전이시킨다. 5μl의 반응액을 사용하여 E. coli EPI300컴피턴트세포를 전환시키고, 50μg/mL 카나마이신이 첨가된 LB플레이트 상에 도포한다. 콜로니 PCR을 통하여 양성 컨버터를 검증하고 시퀀싱하여, 진일보로, 발현 플라스미드3GT3-pET28a와 3GT4-pET28a의 구성이 성공되었음음 진일보로 검증한다.
실시예10
글리코실전이효소 유전자3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4가 대장균 중에서의 발현
실시예9에서 구성된 대장균 발현 벡터3GT1-pET28a, 3GT2-pET28a, 3GT3-pET28a 및 3GT4-pET28a를, 시중에 판매되는 E. coli BL21 중에 전환시킨다. 하나의 레콘을 LB배지 중에 접종시키고, 30°C 200rpm에서 OD600이 약 0.6-0.8이 될 때까지 배양하여, 균액의 온도가 4°C까지 내려가도록 하며, 최종 농도가 50 μM인 IPTG를 첨가하여, 18°C 200rpm에서 15 h동안 발현을 유도한다. 4°C 원심분리를 통하여 균체를 수집하고, 초음파로 세포를 파쇄하며, 4°C, 12000 g원심분리를 통하여 세포 용균액 상청액을 수집하고, 샘플을 취하여 SDS-PAGE전기영동을 진행한다(도20). pet28a빈 벡터의 레콘과 비교해 보면, 3GT1-pet28a, 3GT2-pet28a, 3GT3-pet28a 및 3GT4-pet28a레콘은 뚜렷한 스트립(대략 55KD) 표징 3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4가 있다. Western Blot의 결과로부터(도21), 목표 단백질 3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4가 숙주 중에서 용해 가능한 발현을 실현하였음을 증명한다.
실시예11
대장균 발현 산물 3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4글리코실전이 반응과 산물의 감정
3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4를 발현하는 재조합 대장균 용균 상청액을 조효소액으로 하여 인삼 사포닌과 사포게닌의 글리코실전이 반응에 대하여 촉매 작용을 하여, 빈 벡터를 발현하는 재조합 효모 용균 상청액을 대조군으로 한다. 100μL반응 시스템은 표3과 같다. 반응은 35℃하에서 12h동안 진행된 후, 다음 100μL 부탄올을 첨가하여 반응을 중지시키고, 산물을 추출한다. 산물을 진공건조시킨 후, 메탄올로 용해시킨다.
반응 산물은 먼저 박층크로마토그래피(TLC)로 검출하고(도22-도28), 3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4의 조효소액으로 프로토파낙사디올(PPD)의 C3부위 히드록시 글리코실화를, 각각 희유 인삼 사포닌 Rh2으로 전환시킬 수 있고(도22, 27(a)와 28(a)); 20부위 히드록시기가 이미 글리코실화된 프로토파낙사디올 타입 사포닌(CK)은, 3GT1, 3GT2 및 3GT4조효소액의 촉매 작용하에서, 3부위 히드록시기를 계속하여 글리코실화하여, 각각 F2를 생성할 수 있고(도22와 28(b)); 글리코실전이효소 3GT1과 3GT2는 각각 다마렌디올 DM의 C3부위 히드록시 글리코실화를, 새로운 화합물 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-Dammarenediol II(도23)로 전환시킬 수도 있으며; 글리코실전이효소 3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4는 25-OH-PPD의 C3부위 히드록시 글리코실화를, 새로운 화합물 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-25-OH-PPD로 전환시킬 수 있고 (도23, 도27(c) 및 도28(c)); 3GT1, 3GT2 및 3GT3은 프로토파낙사트리올(PPT)의 C3부위 히드록시 글리코실화를, 그 전에 보도된 바가 없는 새로운 사포닌 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-PPT로 전환시킬 수도 있으며(도24와 27(b)); 3GT1과 3GT2는 F1의 C3부위 히드록시 글리코실화를, 그 전에 보도된 바가 없는 새로운 사포닌 3-O-β-(D- glucopyranosyl)-F1로 전환시킬 수도 있고(도24); 3GT1과 3GT2는 라노스테롤(lanosterol)의 C3부위 히드록시 글리코실화를, 새로운 화합물 3-O-β-(D-glucopyranosyl)-lanosterol로 전환시킬 수도 있다(도26). 아울러, 3GT1과 3GT2의 촉매 활성은 20부위 히드록시기 또는 글리코실의 공간 배열의 영향을 받지 않는데, 예를 들어, 20(S)-PPD에 대해 촉매 작용을 할 수 있을 뿐만 아니라, 20(R)-PPD에 대해 촉매 작용을 할 수도 있어 희유 인삼 사포닌 20(R)-인삼 사포닌 Rh2를 생성한다(도25). 비록 3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4 네가지의 글리코실전이효소가 모두 테트라사이클릭 트리터페노이드 사포게닌의 3부위에서 글리코실기를 첨가할 수 있지만, 이들이 촉매 작용을 할 수 있는 기질계보는 아주 큰 차이점이 있다. 표6에서와 같이, 3GT1과 3GT2가 촉매 작용을 할 수 있는 기질이 제일 많고, 3GT3이 촉매 작용을 할 수 있는 기질이 제일 적으나, 3GT4의 전일성(專一性)이 제일 좋고, 이는 단지 프로토파낙사디올 및 프로토파낙사디올 타입(CK) 사포닌에 대해서만 촉매 작용을 할 수 있다.
진일보로 HPLC으로 3GT1, 3GT3 및 3GT4가 PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물에 대하여 검출을 진행한다(도29). 도29에서, 글리코실전이효소 3GT1, 3GT3 및 3GT4가 PPD에 대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물 중에서 모두 유지시간이 동일한 피크(P1, P2 및 P3)가 나타났고, 이들은 표준샘플 중 인삼 사포닌 Rh2의 유지시간과 일치하기에, 글리코실전이효소 3GT1, 3GT3 및 3GT4가 PPD에 대해 촉매 작용을 하여 인삼 사포닌 Rh2를 생성하였다는 것을 설명한다. 마지막으로, LC/MS로 도29 중의 P1, P2 및 P3 세개의 샘플피크에 대하여 질량 스펙트럼 (mass spectrum) 감정을 하였는데(도30), 이들은 표준샘플 인삼 사포닌 Rh2의 질량 스펙트럼과 완전히 일치하기에, 이는 진일보로 글리코실전이효소 3GT1, 3GT3과 3GT4가 PPD대해 촉매 작용을 하여 생성된 산물이 Rh2라는 것을 설명하였다.
글리코실전이효소 3GT1, 3GT2, 3GT3 및 3GT4가 촉매 작용을 할 수 있는 기질의 비교는 표6과 같다.
Figure pat00028
실시예12
Rh2효모 엔지니어링 박테리아를 생성하는 구성과 산물 감정
12.1 pESC-HIS플라스미드((Stratagene, Agilent) 상에서, 다마렌디올 합성 효소(Dammarenediol synthase)(ACZ71036.1)(GAL1/GAL10 GAL10즉 프로모터, ADH1터미네이터), 시토크롬P450 CYP716A47(AEY75213.1)(FBA1프로모터, CYC1터미네이터) 및 글리코실전이효소 3GT4 (GAL1/GAL10 GAL1측 프로모터, TDH2터미네이터)를 동시에 조립하여, 유리형 플라스미드를 구성하고, 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742를 전환시키며, 애기장대에서 얻은 시토크롬P450환원 효소ATR2-1(NP_849472.2)를 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742염색체 중의 염색체trp1 유전자부위(GAL1프로모터, trp1 고유 터미네이터를 이용)에 통합시켜, 재조합 효모A1을 구성하였다. 재조합 효모균에 첨가로 첨가될 상응한 아미노산 또는 우라실은 표5와 같다.
재조합 효모A1용균액을 2mL EP관 중에 전이시켜, 매 하나의 관에 1mL를 담고, 동일한 체적(1mL)의 n-부탄올을 첨가하여 약 30min동안 추출한 후, 12000g로 10min동안 원심분리한다. 상청액을 흡수하여 새로운 EP관에 넣는다. 45℃와 진공 조건하에서 n-부탄올이 증발 건조되도록 한다. 100μL 메탄올로 용해시킨 후 HPLC검출에 사용한다.
12.2 방법은 12.1과 같은데, 구별점이라면 글리코실전이효소 3GT1로 3GT4를 대체하여, 재조합 효모A5를 얻는 것이다.
결과는 도43을 참조하고, HPLC분석을 통하면, 재조합 효모A5의 세포 용균액 중에 다마렌디올, 프로토파낙사디올(PPD) 및 인삼 사포닌 활성 대사물Rh2가 함유한다.
실시예13
글리코실전이효소 유전자 gGT29와 gGT29-3의 효모재조합 발현 벡터의 구성
각각 실시예1에서 구성된, gGT29와 gGT29-3 유전자를 함유하는 플라스미드gGT29-pMD18T와 gGT29-3-pMD18T를 템플릿으로 하여 타겟 유전자를 증폭시킨다.
gGT29에 사용되는 정방향 프라이머는 모두 (SEQ ID NO.: 36), 그 5'말단에 Kpn I인식 부위: GGATCC를 첨가한 것; 사용되는 역방향 프라이머는 모두 (SEQ ID NO.: 37), 그 5'말단에 XhoI인식 부위: CTCGAG를 첨가한 것이고, 역방향 프라이머는 6×His Tag를 도입하여, Western Blot검출발현 및 정제를 진행하도록 한다.
gGT29-3에 사용되는 정방향 프라이머는 모두 (SEQ ID NO.: 38), 그 5'말단에 Kpn I인식 부위: GGATCC를 첨가한 것; 사용되는 역방향 프라이머는 모두 (SEQ ID NO.: 39), 그 5'말단에 XhoI인식 부위: CTCGAG를 첨가한 것이고, 역방향 프라이머는 6×His Tag를 도입하여, Western Blot검출발현 및 정제를 진행하도록 한다.
플라스미드gGT29-pMD18T와 gGT29-3-pMD18T를 템플릿으로 하고, 상기 프라이머와 템플릿을 이용하고 PCR방법을 통하여 gGT29와 gGT29-3의 유전자를 증폭시킨다. DNA중합효소로 Toyobo회사의 고충실도DNA중합효소kod를 사용하는데, 그 설명서에 설정된 PCR프로그램을 참고해 보면, 94°C 2min; 94°C 15s, 58°C 30s, 68°C 1.5min, 총 30개 순환; 68°C 10min; 10°C보온이 설정되어 있다. PCR산물은 아가로스 겔 전기영동 검출을 거쳐, 자외선하에서, 타겟 DNA 크기와 일치한 스트립를 절단한다. 다음, AXYGEN회사의 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit를 사용하여 아가로스 겔 중으로부터 DNA세그먼트를 회수한다. Takara회사의 QuickCut 제한성 엔도뉴클레아제(endonuclease) Kpn I와 Xba I 더블 제한 효소로 회수한 DNA세그먼트를 30min동안, AXYGEN회사의 AxyPrep PCR Cleanup Kit로 제한 효소산물에 대해 세척회수를 진행한다. NEB회사의 T4 DNA 연결 효소를 이용하여 제한 효소 산물을 사카로미세스 세레비시아 효모와 발현 플라스미드pYES2(마찬가지로 Kpn I와 Xba I제한 효소로 러버 태핑하여 회수) 25°C에서 2 h동안 연결시킨다. 연결된 산물은 E. coli TOP 10컴피턴트세포를 전환시키고, 100μg/mL 엠피실린이 첨가된 LB플레이트 상에 도포한다. 콜로니PCR을 통하여 양성 컨버터를 검증하고 시퀀싱하여 발현 플라스미드gGT29- pYES2와 T29-3-pYES2의 구성이 성공되었음을 진일보로 검증한다.
실시예14
글리코실전이효소 유전자 gGT29와 gGT29-3이 사카로미세스 세레비시아 효모 중에서의 발현
전기전환 방법을 통하여 구성된 발현 플라스미드gGT29- pYES2와 gGT29-3-pYES2를 사카로미세스 세레비시아 효모(Saccharomyces cerevisiae) 중에 전환시키고, 선별된 플레이트SC-Ura(아미노산 기본 질소원이 없는 0.67% 효모, 2% 포도당)에 도포한다. 콜로니PCR을 통하여 효모 레콘을 검증한다. 효모 레콘 콜로니를 10 mL SC-Ura (2% 포도당) 배지 중에 골라놓고, 30°C 200rpm에서 20 h동안 배양한다. 4°C 3500 g 원심분리를 통해 균체를 수집하고, 무균 탈이온수로 균체를 두번 세척하며, 유도 배지SC-Ura (2% 갈락토오스)로 균체를 재부유시키고, 50 mL 유도 배지 중에 접종시켜, OD600이 0.4좌우로 되게 하여, 30°C 200rpm에서 유도발현을 시작한다. 4°C, 3500 g원심분리를 통해 12h동안 유도발현된 균체를 수집하고, 무균 탈이온수로 균체를 두번 세척하며, 효모 용균 완충용액 중에 재부유시켜, OD600이 50-100사이에 있게 한다. Fastprep세포파쇄기로 효모 세포를 진탕시켜 파쇄하고, 4°C 12000 g원심분리로 10min동안 세포 조각을 제거하며, 세포 용균액 상청액을 수집한다. 적량의 용균액 상청액을 취하여 SDS-PAGE전기영동 검출을 진행하여, pYES2빈 벡터의 레콘과 비교해 보면, gGT29-pYES2와 gGT29-3-pYES2레콘은 뚜렷한 스트립 특징이 없다(도32). anti-6×His Tag Western Blot을 응용하여 발현정황을 검출하고, gGT29와 gGT29-3을 발현하는 사카로미세스 세레비시아 효모는 아주 강한 Western Blot신호를 나타내기에, gGT29와 gGT29-3이 효모 중에서 수용성 발현된다는 것을 표명하지만, pYES2빈 벡터 전이의 레콘에는 anti-6×His Tag Western Blot신호가 없다다(도33).
실시예15
효모 발현 산물gGT29와 gGT29-3글리코실전이 반응과 산물 감정
gGT29와 gGT29-3을 발현하는 재조합 효모 용균 상청액을 효소액으로 하고 인삼 사포닌 Rh2와 F2의 글리코실전이 반응에 대하여 촉매 작용을 하여, 빈 벡터를 발현하는 재조합 효모 용균 상청액 을 대조로 한다. 100μL반응 시스템은 표3과 같다. 반응은 35℃하에서 12h동안 진행된 후, 다음 100μL 부탄올을 첨가하여 반응을 중지시키고, 산물을 추출한다. 산물을 진공건조시킨 후, 메탄올로 용해시킨다.
반응 산물은 먼저 박층크로마토그래피(TLC)로 검출하고, gGT29와 gGT29-3을 발현하는 효모 숙주 용균 상청액 효소액은 인삼 사포닌 Rh2와 F2의 3부위 글리코실에서 하나의 글리코실기를 더 연장시켜, 인삼 사포닌 Rg3과 Rd로 전환시킬 수 있다(도34). gGT29와 gGT29-3의 촉매 활성은 인삼 사포닌20부위 글리코실기 또는 히드록시기 배열의 영향을 받지 않고, 20(R)-Rh2를20(R)-Rg3으로 전환시킬 수 있다(도36).
실시예16
글리코실전이효소 3GT1/3GT4와 gGT29의 연합 글리코실전이 반응과 산물 감정
3GT1 또는 3GT4를 발현하는 대장균 숙주 용균 상청액, 및 gGT29를 발현하는 효모 숙주 용균 상청액을 효소액으로 하여 프로토파낙사디올(PPD)에 대하여 공통으로 촉매 작용을 한다. 100μL반응 시스템은 표3과 같다. 73.4μL의 효소액 중에서 40μL가 3GT1의 대장 숙주 용균 상청액이고, 나머지 33.4μL는 gGT29를 발현하는 효모 숙주 용균 상청액이다. 반응은 35℃하에서 12h동안 진행된 후, 다음 100μL 부탄올을 첨가하여 반응을 중지시키고, 산물을 추출한다. 산물을 진공건조시킨 후, 메탄올로 용해시킨다. 반응 산물은 먼저 박층크로마토그래피(TLC)로 검출하면(도35), 글리코실전이효소 3GT1과 gGT29 또는 3GT4 및 gGT29의 연합사용은 모두 PPD를 Rg3으로 전환시킬 수 있다는 것을 보아낼 수 있다.
글리코실전이효소 3GT1과 gGT29 또는 3GT2및 gGT29의 연합사용은 모두 20(R)-PPD에 대해 촉매 작용을 하여, 20(R)-Rg3을 생성할 수 있다(도36).
실시예17
Rg3효모 엔지니어링 박테리아를 생성하는 구성과 산물 감정
17.1 pESC-HIS플라스미드((Stratagene, Agilent) 상에서,다마렌디올 합성 효소(Dammarenediol synthase)(ACZ71036.1)(GAL1/GAL10 GAL10즉 프로모터, ADH1터미네이터), 시토크롬P450 CYP716A47(AEY75213.1)(FBA1프로모터, CYC1터미네이터) 및 글리코실전이효소 3GT4와 gGT29(GAL1/GAL10 GAL1측 프로모터, TDH2터미네이터)를 동시에 조립하여, 유리형 플라스미드를 구성하고, 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742를 전환시키며, 애기장대에서 얻은 시토크롬P450환원 효소ATR2-1(NP_849472.2)를 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742염색체 중의 염색체trp1 유전자부위(GAL1프로모터, trp1 고유 터미네이터를 이용)에 통합시켜, 재조합 효모A2를 구성하였다. 재조합 효모균에 첨가로 첨가될 상응한 아미노산 또는 우라실은 표5와 같다.
재조합 효모A2용균액을 2mL EP관 중에 전이시켜, 매 하나의 관에 1mL를 담고, 동일한 체적(1mL)의 n-부탄올을 첨가하여 약 30min동안 추출한 후, 12000g로 10min동안 원심분리한다. 상청액을 흡수하여 새로운 EP관에 넣는다. 45℃와 진공 조건하에서 n-부탄올이 증발 건조되도록 한다. 100μL 메탄올로 용해시킨 후 HPLC검출에 사용한다.
HPLC분석을 통하면, 재조합 효모A2의 세포 용균액 중에다마렌디올, 프로토파낙사디올(PPD) 및 인삼 사포닌 활성 대사물Rh3이 함유된다(도40).
17.2 방법은 17.1과 같은데, 구별점이라면 글리코실전이효소 3GT1로 3GT4를 대체하여, 재조합 효모A6을 얻는 것이다. HPLC분석을 통하면, 재조합 효모A6의 세포 용균액 중에 다마렌디올, 프로토파낙사디올(PPD) 및 인삼 사포닌 활성 대사물Rh3이 함유된다.
실시예18
F1생성 효모 엔지니어링 박테리아의 구성과 산물 감정
pESC-HIS플라스미드((Stratagene, Agilent) 상에서, 다마렌디올 합성 효소(Dammarenediol synthase)(ACZ71036.1)(GAL1/GAL10 GAL10측 프로모터, ADH1터미네이터), 글리코실전이효소 gGT25(GAL1/GAL10 GAL1측 프로모터, TDH2터미네이터), 시토크롬P450 CYP716A47(AEY75213.1)(FBA1프로모터, FBA1터미네이터), 시토크롬P450 CYP716A53V2(ENO2 프로모터, CYC1터미네이터) 를 동시에 조립한다. 유리형 플라스미드를 구성하고, 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742를 전환시키며, 애기장대에서 얻은 시토크롬P450환원 효소ATR2-1(NP_849472.2)를 사카로미세스 세레비시아 효모BY4742염색체 중의 염색체trp1 유전자부위(GAL1프로모터, trp1 고유 터미네이터를 이용)에 통합시켜, 재조합 효모A1을 구성하였다. 재조합 효모균에 첨가로 첨가될 상응한 아미노산 또는 우라실은 표5와 같다.
재조합 효모A4용균액을 2mL EP관 중에 전이시켜, 매 하나의 관에 1mL를 담고, 동일한 체적(1mL)의 n-부탄올을 첨가하여 약 30min동안 추출한 후, 12000g로 10min동안 원심분리한다. 상청액을 흡수하여 새로운 EP관에 넣는다. 45℃와 진공 조건하에서 n-부탄올이 증발 건조되도록 한다. 100μL 메탄올로 용해시킨 후 HPLC검출에 사용된다.
HPLC분석을 통하여, 재조합 효모A4의 세포 용균액 중에 프로토파낙사디올(PPD) 및 인삼 사포닌 활성 대사물 F1이 함유되게 한다(도42).
실시예19
글리코실전이효소 유전자 gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-7의 대장균 재조합 발현 벡터의 구성
실시예1에서 구성된, gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-7 유전자를 함유하는 플라스미드gGT29-4-pMD18T, gGT29-5-pMD18T, gGT29-6-pMD18T 및 gGT29-7-pMD18T를 템플릿으로 하여 타겟 유전자를 증폭시킨다.
gGT29-5와 gGT29-6 유전자에 사용되는 정방향 프라이머는 SEQ ID NO.: 66과 같고, 그 5'말단에 벡터pET28a와 상동적인 서열: CTGGTGCCGCGCGGCAGC를 첨가한 것이고; 사용되는 역방향 프라이머는 SEQ ID NO.: 68과 같으며, 그 5'말단에 벡터pET28a와 상동적인 서열: TGCGGCCGCAAGCTTGTC를 첨가한 것이다.
gGT29-4와 gGT29-7 유전자에 사용되는 정방향 프라이머는 SEQ ID NO.: 67, 그 5'말단에 벡터pET28a와 상동적인 서열: CTGGTGCCGCGCGGCAGC를 첨가한 것이고; 사용되는 역방향 프라이머는 SEQ ID NO.:68, 그 5'말단에 벡터pET28a와 상동적인 18개 알칼로이드 세그먼트: TGCGGCCGCAAGCTTGTC를 첨가한 것이다.
상기 프라이머를 이용하고 PCR방법을 통하여 gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-7 유전자를 증폭시킨다. 유전자의 증폭에는 NEB회사의 Q5고충실도 DNA중합효소가 사용되고, 그 설명서를 참조하여 PCR프로그램을 98°C 30s; 98°C 15s, 58°C 30s, 72°C 1min, 총 35개 순환; 72°C 2min; 10°C보온으로 설정한다.
아울러, SEQ ID NO.: 69과 SEQ ID NO.: 70을 사용하여 각각 정방향과 역방향 프라이머로 하여 벡터 pET28a를 증폭시켜, 선형화된 벡터 pET28a를 획득한다. pET28a 선형화 벡터의 증폭에도 NEB회사의 Q5고충실도DNA중합효소가 사용되고, 그 설명서를 참조하여 PCR프로그램을 98°C 30s; 98°C 15s, 58°C 30s, 72°C 3min, 총35개 순환; 72°C 2min; 10°C보온으로 설정한다.
상기 gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-7 유전자PCR산물 및 선형화된 벡터pET28a가, 아가로스 겔 전기영동 검출을 거친후, 자외선하에서, 타겟 DNA 크기와 일치한 스트립를 절단한다. 다음, AXYGEN회사의 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit를 사용하여 아가로스 겔 중으로부터 DNA세그먼트를 회수한다. 낙정생물과학기술유환회사의 BGclonart심리스클론키트 설명서를 참조하여, 회수한 선형화된pET28a벡터 세그먼트, 회수한 gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-74 유전자 세그먼트 및낙정생물과학기술유환회사의 BGclonart심리스클론반응액을 적당한 비례로 혼합시켜, 총 20μL 되게 한다. 균일하게 혼합시킨 후 50 ℃에서 30분 동안 부화시키고, 다음 혼합 반응액을 얼음 상에 전이시킨다. 5μL의 반응액을 사용하여 E. coli EPI300컴피턴트세포를 전환시키고, 50μg/mL 카나마이신이 첨가된 LB플레이트 상에 도포한다. 콜로니 PCR을 통하여 양성 컨버터를 검증하고 시퀀싱한다. 발현 플라스미드gGT29-4-pET28a, gGT29-5-pET28a, gGT29-6-pET28a 및 gGT29-7-pET28a의 구성이 성공되었음음 진일보로 검증한다.
실시예20
글리코실전이효소 유전자 gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-7이 대장균 중에서의 발현
실시예19에서 구성된 대장균 발현 벡터gGT29-4-pET28a, gGT29-5-pET28a, gGT29-6-pET28a 및 gGT29-7-pET28a를 시중에 판매되는 E. coli BL21 중에 전환시킨다. 하나의 레콘을 LB배지 중에 접종시키고, 30°C 200rpm에서 OD600이 약 0.6-0.8까지 배양하여, 균액의 온도가 4°C까지 내려가도록 하며, 최종 농도가 50 μM인 IPTG를 첨가하여, 18°C 200rpm에서 15 h동안 발현을 유도한다. 4°C 원심분리를 통하여 균체를 수집하고, 초음파로 세포를 파쇄하며, 4°C 12000 g원심분리를 통하여 세포 용균액 상청액을 수집하고, 샘플을 취하여 SDS-PAGE전기영동을 진행한다(도44). gGT29-4-pET28a, gGT29-5-pET28a, gGT29-6-pET28a 및 gGT29-7-pET28a레콘용균액 및 총 단백질 및 상청액 중에는 모두 뚜렷한 목적 단백질 스트립(대략 50KD)이 있고, 각각 글리코실전이효소 gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-7를 표징한다. Western Blot의 결과로부터(도45), 목표 단백질gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-7이 숙주 중에서 수용성 발현의 실현을 증명한 것을 보아낼 수 있다.
실시예21
대장균 발현 산물gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-7글리코실전이 반응과 산물의 감정
gGT29-4, gGT29-5, gGT29-6 및 gGT29-7을 발현하는 재조합 효모 용균 상청액을 효소액으로 하여 인삼 사포닌 Rh2와 F2의 글리코실전이 반응에 대하여 촉매 작용을 한다. 100μL반응 시스템은 표3과 같다. 반응은 35℃하에서 12h동안 진행된 후, 다음 100μL 부탄올을 첨가하여 반응을 중지시키고, 산물을 추출한다. 산물을 진공건조시킨 후, 메탄올로 용해시킨다.
반응 산물은 박층크로마토그래피(TLC)로 검출하고, gGT29-6의 조효소액은 인삼 사포닌 Rh2와 F2의 3부위 글리코실기 상에서 하나의 글리코실기를 더 연장시켜, 각각 인삼 사포닌 Rg3과 Rd로 생성될 수 있고(도46); gGT29-4, gGT29-5 및 gGT29-7의 조효소액은 인삼 사포닌 F2의 3부위글리코실에서 하나의 글리코실기를 더 연장시켜 사포닌 Rd를 생성할 수 있으나, 이들은 사포닌 Rh2에 대해 촉매 작용을 할 수 없다(도46).
본 발명에서 언급한 모든 문헌은 모두 본원 발명에 인용된 것으로 참조하고, 매 한편의 문헌이 단독으로 인용되는 것으로 참조되는 것과 같다. 이 밖에, 본 발명의 상기 내용을 열독한 후, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명에 대하여 여러가지 변경 또는 보정을 진행할 수 있고, 이러한 등가 형식은 마찬가지로 본원 발명에 첨부된 특허청구범위에 한정된 범위에 속하는 것으로 이해해야 한다.
<110> SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES <120> Group of Glycosyltransferases and Use Thereof <130> P2013-1295 <150> CN 201210520787.5 <151> 2012-12-06 <150> CN 201310227689.7 <151> 2013-06-07 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1425 <212> DNA <213> Panax ginseng <220> <221> misc_feature <223> gGT25 <400> 1 atgaagtcag aattgatatt cttgcccgcc ccggccatcg gacacctcgt gggaatggtg 60 gagatggcta aactcttcat cagtcgacat gaaaacctct cggtcaccgt cctcatcgcg 120 aaattctaca tggatacggg ggtagacaac tacaataaat cactcttaac aaaccctacc 180 ccgcgtctca caattgtaaa tctcccggaa accgaccccc aaaactatat gctcaaacca 240 cgccatgcca tctttcctag cgtcatcgag actcagaaga cacacgtgcg agacataata 300 tcaggcatga ctcagtccga gtcgactcgg gtcgttggtt tgctggctga ccttttgttc 360 atcaacatta tggacattgc caatgagttc aatgttccaa cttatgtata ctcccctgcc 420 ggagccggtc atcttggcct cgcgttccat ctccagacac tcaacgacaa aaagcaagat 480 gtgaccgagt tcaggaactc ggacactgag ttattggtac cgagttttgc aaacccggtt 540 cccgccgagg 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240 Pro Lys Thr Glu Gln Phe Ile Asn Trp Leu Asp Lys Arg Ala Glu Ser 245 250 255 Thr Val Val Phe Val Cys Phe Gly Ser Glu Cys Phe Leu Ser Asn Glu 260 265 270 Glu Leu Glu Glu Val Ala Ile Gly Leu Glu Ile Ser Met Val Asn Phe 275 280 285 Ile Trp Ala Val Arg Leu Ile Glu Gly Glu Lys Lys Gly Val Leu Pro 290 295 300 Glu Gly Phe Val Gln Arg Val Gly Asp Arg Gly Leu Val Val Glu Glu 305 310 315 320 Trp Ala Pro Gln Ala Arg Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335 Val Ser His Cys Gly Trp Asn Ser Ile Thr Glu Ser Met Lys Phe Gly 340 345 350 Val Pro Val Ile Ala Met Ala Arg His Phe Asp Gln Pro Leu Asn Gly 355 360 365 Lys Leu Ala Ala Glu Val Gly Val Gly Met Glu Val Val Arg Asp Glu 370 375 380 Asn Gly Lys Tyr Lys Arg Glu Gly Ile Ala Glu Val Ile Arg Lys Val 385 390 395 400 Val Val Glu Lys Ser Gly Glu Val Ile Arg Arg Lys Ala Arg Glu Leu 405 410 415 Ser Glu Lys Met Lys Glu Lys Gly Glu Gln Glu Ile Asp Arg Val Val 420 425 430 Glu Glu Leu Val Gln Ile Cys Lys Lys Lys Lys Asp Glu Gln 435 440 445 <210> 62 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequece <220> <223> synthesized nucleotides <400> 62 acagcaagag agagacacag agttca 26 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequece <220> <223> synthesized nucleotides <400> 63 gttcaaagcc caacctaagc gca 23 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequece <220> <223> synthesized nucleotides <400> 64 atgaaattat acagagaggg agaga 25 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequece <220> <223> synthesized nucleotides <400> 65 tggttttctt cacaacacaa agtac 25 <210> 66 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequece <220> <223> synthesized nucleotides <400> 66 ctggtgccgc gcggcagcat ggataaccaa aagggtagaa tca 43 <210> 67 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequece <220> <223> synthesized nucleotides <400> 67 ctggtgccgc gcggcagcat ggataaccaa aaaggtagaa tca 43 <210> 68 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequece <220> <223> synthesized nucleotides <400> 68 tgcggccgca agcttgtctt gttcatcttt cttcttctta caa 43 <210> 69 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequece <220> <223> synthesized nucleotides <400> 69 gctgccgcgc ggcaccaggc cgctgctgtg 30 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequece <220> <223> synthesized nucleotides <400> 70 tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag 30

Claims (4)

  1. SEQ ID NOs.: 13 및 14로 표시되는 글리코실전이효소(glycosyltransferase) 유전자 증폭용 프라이머 염기쌍.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 글리코실전이효소는 인삼속 식물의 글리코실전이효소인 것인, 프라이머 염기쌍.
  3. (a) 글리코실전이효소(glycosyltransferase)로 예측되는 유전자를 준비하는 단계; 및,
    (b) SEQ ID NOs.: 13 및 14로 표시되는 프라이머 염기쌍으로 상기 유전자를 증폭하는 단계;를 포함하는, 글리코실전이효소의 스크리닝 또는 검출 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 글리코실전이효소는 인삼속 식물의 글리코실전이효소인 것인, 스크리닝 또는 검출 방법.
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