KR102252056B1 - 재조합 벡터 및 이를 이용한 재조립 시토크롬 p450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 벡터 및 이를 이용한 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것으로, 재조합 벡터가 도입된 숙주세포에서 옥시게나아제와 리덕타아제를 독립적으로 발현시킨 후, 이들을 스플릿 인테인의 단백질 스플라이싱에 의해 재조립함으로써, 옥시게나아제의 활성 부위에 포함되는 헴 함량을 증가시키고, 효소 활성 및 안정성을 향상시킬 수 있다.

Description

재조합 벡터 및 이를 이용한 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질의 제조 방법{RECOMBINANT VECTOR AND METHOD FOR PRODUCING RECONSTITUTED CYTOCHROME P450 OXYGENASE-REDUCTASE FUSION PROTEIN USING THE SAME}

본 발명은 재조합 벡터 및 이를 이용한 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.

시토크롬 P450(본 출원에서 의미전달이나 기존 결과와의 상대적 비교를 위해 ‘P450’,‘CYP’ 등으로 약칭하는 경우도 있음)은 모노옥시게나아제로서 고세균(archaea)에서부터 박테리아, 곰팡이, 식물, 동물 및 인간에 이르는 대부분의 생물 종에서 발견되며, 생체 성분인 스테로이드, 지방산 및 지용성 비타민 등의 대사와 약물, 발암물질 및 살충제 등을 포함한 비생체 성분(xenobiotics)의 해독 및 배출 등에 관여하는 효소로 활성 부위에 하나의 철이 배위 결합된 헴(Heme) 구조의 보결 분자단을 갖고 있다. 시토크롬 P450은 5만 종 이상 존재하는 것으로 보고되고 있으며, 이에 따라 광범위한 종류의 기질 산화 반응를 매개할 수 있어 가치가 높은 효소이나, 대부분이 막 단백질로 존재하여 외래 숙주에서의 발현이나 정제가 매우 어렵다. 또한 효소 활성을 위해 고가의 조효소(NADPH)가 필요하다는 것과 대부분의 시토크롬 P450이 조효소를 산화시켜 환원력을 제공하는 리덕타아제의 추가 발현이 필요한 점은 시토크롬 P450의 산업적 활용을 제한하고 있다(도 1a 참조).

바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 유래 박테리아 시토크롬인 P450 BM3는 리덕타아제를 포함한 하나의 단백질 형태로 세포질에서 발현되어, 옥시게나아제와 리덕타아제가 따로 존재하는 여타의 시토크롬 P450에 비해 발현과 정제가 용이한 장점이 있다(도 1b 참조). 또한 P450 BM3는 옥시게나아제와 리덕타아제 두 개의 도메인을 포함해 약 119 kDa 크기의 멀티도메인 단백질임에도 불구하고, 대장균 전체 단백질 농도의 10% 이상을 차지할 만큼 과발현되며, 발현된 단백질의 90% 이상이 가용성으로 발현되는 우수한 특성을 지니고 있다. 따라서 P450 BM3는 단백질 특성 개량 기술을 통해 산업적 가치가 높은 화합물의 생산이나 독성 평가에 적합하도록 조효소 선택성, 기질 특이성 및 효소 활성 등의 특성이 개량된 시토크롬 P450 BM3 변이체를 얻기 위한 주형으로 흔히 사용되고 있다.

그러나 대장균에서 과발현되는 P450 BM3는 효소 활성에 중요한 보결 분자단인 헴을 갖는 완전한 형태로 발현되는 비율이 낮은데, 대장균에서 발현된 전체 P450 BM3 중 대략 10-30% 정도의 단백질만이 정상적인 효소 활성에 필요한 헴을 보유하고 있으며, 헴 보유 편차 또한 큰 것으로 알려져 있다. 따라서 균일한 효소 확보가 힘들어 재현성 있는 결과 도출이 어렵다. 이러한 문제로 인해 높은 발현율에도 불구하고 효소의 비활성(specific activity)이 낮고, 클론들 사이에서 활성 편차가 큰 문제점이 있다. 또한 세포 내에서 자연적인 품질 조절(quality control)로 적정량이 생산되는 효소에 비해, 외래 숙주에서 인위적인 과발현으로 생산된 헴이 없는 불안정한 구조는 안정성이 낮은 문제점도 지니고 있다. 이러한 낮은 헴 함량(Heme content)을 개선하기 위해, 배양 조건 조절, 헴 전구체를 배지에 첨가하는 등의 배지 조성 변경, 또는 대사 경로 조절을 통한 대장균 세포질 내 헴 농도 증가 등의 연구가 수행되고 있으나, 헴 함량은 크게 개선되지 못하고 있다. 따라서 상기와 같은 문제점에 대한 해결방안 도출이 절실하며, 이를 활용한 높은 비활성과 안정성, 그리고 재현성을 갖는 시토크롬 P450 BM3의 균일한 생산이 가능하다면, 산업적 활용을 위한 생산 시스템 구축에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

한국공개특허 제10-2018-0023735호

본 발명은 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질의 옥시게나아제의 활성 부위에 헴 함량을 높여 효소 활성을 향상시키는 재조합 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기 숙주세포를 배양하여 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 시토크롬 P450 옥시게나아제 및 이에 대한 리덕타아제가 독립 발현되어 재조립되는 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질을 제조하기 위한 재조합 벡터로서, 상기 시토크롬 P450 옥시게나아제를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 상기 리덕타아제를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 개재된, 스플릿 인테인을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.

2. 위 1에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것인, 재조합 벡터.

3. 위 1에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것인, 재조합 벡터.

4. 위 1에 있어서, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것인, 재조합 벡터.

5. 위 1에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열로 이루어지고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 서열로 이루어지며, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 서열로 이루어진 것인, 재조합 벡터.

6. 위 1 내지 5 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.

7. 위 6에 있어서, 상기 숙주세포는 에셰리키아 콜라이(Esherichia coli)인, 숙주세포.

8. 위 6의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질 제조방법.

9. 위 8의 방법으로 제조된, 헴 함량, 효소 활성 또는 안정성이 증가된 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질.

10. 위 9의 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질을 포함하는 기질의 하이드록실화용 조성물.

11. 위 10에 있어서, 상기 기질은 오메프라졸, 오메프라졸 설파이드, 에톡시쿠마린 또는 니트로페놀인, 조성물.

본 발명은 재조합 벡터 및 이를 이용한 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것으로, 재조합 벡터가 도입된 숙주세포에서 옥시게나아제와 리덕타아제를 독립적으로 발현시킨 후 스플릿 인테인으로 융합시킴으로써, 옥시게나아제의 활성 부위에 포함되는 헴 함량을 증가시키고, 효소 활성 및 안정성을 향상시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 기술적 원리와 효과를 기존의 방법과 비교하는 모식도이다. 도 1a는 진핵 유래의 시토크롬 P450을 나타낸다. 도 1b는 바실러스 메가테리움 유래 시토크롬 P450 BM3를 나타낸다. 도 1c는 본 발명의 기술적 원리를 나타내는 모식도로서, 시토크롬 P450 BM3를 하나의 단백질로 발현시키는 기존 방법(도 1c의 P450 BM3 WT 부분)과, 스플릿 인테인을 융합해 옥시게나아제와 리덕타아제 2개의 도메인을 각각 독립적으로 발현시키는 본 발명의 방법(도 1c의 P450 BM3 IMR 부분)을 비교하고 있다. 도 1c의 P450 BM3 IMR 부분에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에서는 헴을 함유하여 완전한 구조를 보유하는 옥시게나아제 도메인이 그렇지 않은 경우보다 단백질 스플라이싱 효율이 높고, 그 결과 헴 함량이 높은 재조립 시토크롬 P450을 생산할 수 있다.
도 2는 발현 벡터에 삽입할 목적 유전자의 모식도이다. 도 2a는 히스티딘 태그(his tag)가 카르복실 말단에 융합된 바실러스 메가테리움 유래 시토크롬 P450 단백질의 두 도메인, 즉 옥시게나아제 및 리덕타아제 도메인을 나타낸다. 이하, 본 출원에서는 자연계에 존재하는 두 개의 도메인이 분할되지 않고 발현되는 바실러스 메가테리움 유래 시토크롬 P450 단백질은‘WT'(본 출원에서 ‘야생형’이라 칭하는 경우도 있음)라 칭한다.
도 2b는 도 2a에 기재된 바실러스 메가테리움 유래 시토크롬 P450 단백질의 두 도메인 사이에 스플릿 인테인을 융합한 과정을 나타내는 모식도이다. 이하, 본 출원에서는 이러한 발현 방법에 의해 스플릿 인테인에 의해 재조립된 단백질을 "IMR(Intein-mediated reconstituted) 시트크롬 P450" 이라 부른다.
도 3은 재조합 발현 벡터 pET24a-WT(옥시게나아제-리덕타아제)를 나타낸다.
도 4는 재조합 발현 벡터 pET24a-IMR(옥시게나아제-인테인-리덕타아제)을 나타낸다.
도 5a는 T7 프로모터 제어 하에서 발현된 바실러스 메가테리움 유래 P450 단백질의 발현 양상을 확인할 수 있는 SDS-PAGE 분석 결과이다. 도 5a에서, N.C는 pET24a 공벡터를 나타내고, T는 전체 단백질 분획을 나타내며, S는 가용성 분획을 나타낸다. 이하, SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 도면에서 T 및 S는 상기한 바와 동일한 의미이다. 도 5b는 T7 프로모터 제어 하에서 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가하고 40분 동안 단백질의 발현을 유도한 후, 클로람페니콜 75 ㎍/mL를 처리하여 단백질 합성 기능을 저해한 다음 P450 단백질의 스플라이싱 결과를 확인할 수 있는 SDS-PAGE 분석 결과 및 웨스턴 블랏 분석 결과이다.
도 6a 및 6b는 각각 도 3의 재조합 발현 벡터(pET24a-WT) 및 도 4의 재조합 발현 벡터(pET24a-IMR)를 이용하여 발현된 바실러스 메가테리움 유래 P450 단백질, 즉 도 5a의 WT와 도 5b의 IMR을 히스티딘 태그를 이용하여 정제한 결과를 확인할 수 있는 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 7은 도 6a 및 6b에서 각각 정제한 두 가지 P450 단백질, 즉 WT와 IMR을 이용해 측정한 CO 스펙트럼(CO spectra)의 차이를 분석하여 비교한 결과이다.
도 8은 도 7에서 측정된 결과에 기반하여 기질인 오메프라졸(omeprazole)을 하이드록실화하는 두 가지 P450 단백질, 즉 WT와 IMR의 효소 활성을 측정하여 비교한 결과이다.
도 9a는 두 가지 P450 단백질, 즉 WT와 IMR 각각이 기질인 7-에톡시쿠마린(7-ethoxycoumarin)을 하이드록실화하여 7-OH 쿠마린을 생성하는 효소 반응 결과를 측정하여 비교한 결과이다. 도 9b는 두 가지 P450 단백질, 즉 WT와 IMR 각각이 기질인 7-에톡시쿠마린을 하이드록실화하여 3-OH 7-에톡시쿠마린을 생성하는 효소 반응 결과를 측정하여 비교한 결과이다. 도 9c는 두 가지 P450 단백질, 즉 WT와 IMR 각각이 기질인 p-니트로페놀(p-nitrophenol)을 하이드록실화하여 4-니트로카테콜(4-Nitrocatechol)을 생성하는 효소 반응 결과를 측정하여 비교한 결과이다.
도 10은 분리정제된 두 가지 P450 단백질, 즉 WT와 IMR의 장기 보관에 대한 안정성을 비교한 결과이다.
도 11은 옥시게나아제와 리덕타아제 도메인을 영역 교환(domain swapping)하는 방법을 설명하는 모식도이다.
도 12는 이종의 옥시게나아제와 리덕타아제 도메인으로 구성된 하이브리드 시토크롬 P450 제작과정을 설명하는 모식도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

용어 "목적 단백질(target protein)"은 당해 기술분야의 통상의 기술자가 재조립하여 높은 활성과 안정성이 담보된 형태로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현 벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

본 발명의 상기 목적 단백질은 옥시게나아제(oxygenase) 계통 시토크롬 P450(P450 또는 CYP), (S)-리모넨 3-모노옥시게나아제((S)-limonene 3-monooxygenase), (S)-리모넨 6-모노옥시게나아제((S)-limonene 6-monooxygenase), (S)-리모넨 7-옥시게나아제((S)-limonene 7-monooxygenase), 3,9-다이하이드록시프테로카르판 6a-모노옥시게나아제(3,9-dihydroxypterocarpan 6a-monooxygenase), 4'-메톡시소플라본 2'-하이드록실라아제(4'-methoxyisoflavone 2'-hydroxylase), 27-히드록시콜레스테롤 7알파-모노옥시게나아제(27-hydroxycholesterol 7alpha-monooxygenase), 클로라이드 퍼옥시다아제(Chloride peroxidase), 캄포르 5-모노옥시게나아제(Camphor 5-monooxygenase), 알칸 1-모노옥시게나아제(Alkane 1-monooxygenase), 콜레스테롤 7알파-모노옥시게나아제(Cholesterol 7alpha-monooxygenase), 히드록시페닐아세토니트릴 2-모노옥시게나아제(Hydroxyphenylacetonitrile 2-monooxygenase), 히포타우린 데하이드로게나아제(Hypotaurine dehydrogenase), 인돌-3-아세트알데히드 옥시데아제(Indole-3-acetaldehyde oxidase), 이소플라본 3'-하이드록실라아제 (Isoflavone 3'-hydroxylase), 리나룰 8-모노옥시게나아제(Linalool 8-monooxygenase), 루코트리엔-B4 20-모노옥시게나아제 (Leukotriene-B4 20-monooxygenase), 리그닌 퍼옥시다아제(Lignin peroxidase), 망간 퍼옥시다아제(Manganese peroxidase), 트립토판 2'-디옥시게나아제(Tryptophan 2'-dioxygenase), 스페르미딘 데하이드로게나아제(Spermidine dehydrogenase), 스테로이드 11베타-모노옥시게나아제(Steroid 11beta-monooxygenase), 스테로이드 17알파-모노옥시게나아제(Steroid 17alpha-monooxygenase), 트립토판 알파,베타-옥시다아제(Tryptophan alpha,beta-oxidase) 및 이들의 단편으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 둘 이상일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

또한, 용어 "재조합 단백질(recombination protein)"은 원래 목적 단백질 서열의 아미노 말단 또는 카르복실 말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다. 본 발명에서는 시토크롬 P450 BM3를 구성하는 두 가지 도메인, 즉 옥시게나아제 도메인과 리덕타아제 도메인 사이에 상기 두 도메인과 융합 발현되어 각각 폴딩된 도메인의 재조립(reconstitution)을 유도할 수 있는 단백질, 예를 들어 스플릿 인테인이 동시에 발현되도록 재조합 발현 벡터를 구성하고, 이 재조합 발현 벡터에 의해 발현된 옥시게나아제 도메인과 리덕타아제 도메인은 스플릿 인테인의 단백질 스플라이싱 반응에 의해 완전한 시토크롬 P450 BM3 단백질로 재조립된다.

또한, 용어 "벡터(vector)", "발현 벡터(expression vector)", 또는 재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)"는 유전자 전사와 번역에 제공되는 요소와 추가 단편을 포함하고, 작동 가능하도록 연결된 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 추가 단편은 프로모터, 전사종결 서열 등을 포함한다. 벡터, 발현 벡터, 또는 재조합 발현 벡터는 하나 이상의 복제 개시점과 하나 이상의 선택 마커 등을 포함한다. 벡터, 발현 벡터, 또는 재조합 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 포함한다.

본 발명은 시토크롬 P450 옥시게나아제 및 이에 대한 리덕타아제가 독립 발현되어 재조립되는 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질을 제조하기 위한 재조합 벡터로서, 상기 시토크롬 P450 옥시게나아제를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 상기 리덕타아제를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 개재된, 스플릿 인테인을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 재조합 벡터는 시토크롬 P450 옥시게나아제 및 상기 옥시게나아제에 대한 리덕타아제가 독립 발현된 후, 스플릿 인테인의 자발적 단백질 스플라이싱에 의해 옥시게나아제와 리덕타아제가 연결된 하나의 단백질로 재조립되도록 하기 위한 것이다.

상기 시토크롬 P450의 옥시게나아제는 그 유래가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 박테리아 유래일 수 있고, 구체적으로는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드는 시토크롬 P450의 옥시게나아제를 코딩하는 것이라면 제한되지 않으며, 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것일 수 있다.

제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 리덕타아제는 조효소를 산화시켜 시토크롬 P450 옥시게나아제에 환원력을 제공하는 것이라면, 그 유래가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 박테리아 유래일 수 있고, 구체적으로는, 바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium) 유래의 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 옥시게나아제 및 리덕타아제는 서로 다른 종으로부터 유래한 것일 수 있다. 이 경우, 각 종의 공지된 서열을 사용할 수 있다.

상기 제2 폴리뉴클레오티드는 시토크롬 P450 옥시게나아제에 대한 리덕타아제를 코딩하는 것이라면 제한되지 않으며, 예를 들면 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것일 수 있다.

제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 스플릿 인테인은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 개재된다.

상기 스플릿 인테인은 자발적인 펩타이드 절단 및 결합 능력을 가진 것으로, 사용되는 스플릿 인테인은 목적 단백질의 종류 등에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어 상기 스플릿 인테인은 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래일 수 있다.

또한, 상기 스플릿 인테인은 필요에 따라 말단에 익스테인(extein) 서열이 추가로 융합되도록 구성할 수 있다. 예를 들어, 익스테인은 야생형의 "CFNKTSGS" 등의 아미노산 서열로 구성될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니며, 필요에 따라 상기 아미노산 서열 중 일부 아미노산의 삭제, 다른 아미노산의 첨가, 다른 아미노산으로의 치환 등의 돌연변이를 도입할 수도 있다.

상기 제3 폴리뉴클레오티드는 스플릿 인테인을 코딩하는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 서열번호 5의 서열로 이루어진 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme) 유래 DnaE 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드, 제3 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 순차적으로 연결된 것일 수 있다. 구체적으로 제3 폴리뉴클레오티드의 5' 말단은 제1 폴리뉴클레오티드의 3' 말단에 융합되고, 제3 폴리뉴클레오티드의 3' 말단은 제2 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 융합된 것일 수 있다. 이 경우, 예를 들어 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열로 이루어지고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 서열로 이루어지며, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 서열로 이루어진 것일 수 있다.

상기 제1 폴리뉴클레오티드, 제2 폴리뉴클레오티드 및 제3 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.

용어 "작동 가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현 벡터와의 작동 가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

상기 프로모터는 본 발명의 재조합 벡터를 도입하고자 하는 대상의 유래일 수 있으며, 그 종류는 제한되지 않는다. 예를 들어, T7 프로모터일 수 있다.

상기 재조합 벡터가 도입된 숙주세포에서 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 독립적으로 발현될 수 있고, 제3 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 스플릿 인테인의 단백질 스플라이싱을 통해 하나의 목적 단백질로 재조립될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 주형으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 재조합 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 벡터가 도입된 숙주의 선별을 위해 항생제 저항성 마커를 포함할 수 있고, 이는 벡터에 내재된 것이거나 외부에서 도입된 것일 수 있다.

본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

상기 숙주세포는 본 발명의 재조합 벡터가 도입되어, P450의 옥시게나아제, 스플릿 인테인 및 P450의 리덕타아제를 발현시키고, 상기 옥시게나아제 및 리덕타아제를 하나의 단백질로 재조립하는데 사용될 수 있다.

상기 숙주세포는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 에셰리키아속, 살모넬라속, 시겔라속, 엔테로박터속, 프로테우스속, 슈도모나스속, 모락셀라속, 헬리코박터속, 스테노트로포모나스속, 델로비브리오속, 레지오넬라속, 나이세리아속, 에르위니아속 균주 등일 수 있고, 구체적으로, 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)일 수 있다. 더욱 구체적으로는 대장균 BL21(DE3)일 수 있다.

상기 형질전환은 당해 기술분야의 통상적인 방법에 의해 실시될 수 있고, 예를 들면, 자연도입법, 열 충격법, 전기충격법 등을 통해 도입할 수　있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 상기 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.

숙주세포는 전술한 바와 같다.

숙주세포를 배양하는 조건은 특별히 한정되지 않으며, 공지의 배양 조건을 이용할 수 있다.

미생물 배양 배지는 당해 기술분야에 공지된 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들어 LB(Luria-Bertani) 배지를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

숙주세포가 상기 재조합 벡터의 도입에 의해 재조립 목적 단백질을 발현하는 경우, 배양 배지는 형질전환 미생물 선별을 위한 항생제를 더 포함하는 것일 수 있다.

필요에 따라, 배양 배지는 재조립 목적 단백질의 발현 촉진을 위해 IPTG를 더 포함할 수 있다.

상기 방법은 상기 숙주세포의 배양물로부터 재조립 목적 단백질을 분리하여 얻는 것일 수 있다.

상기 배양물은 숙주세포 또는 그 배양 배지일 수 있다.

상기 재조립 시토크롬 P450 단백질의 보다 용이한 분리를 위해 상기 숙주세포는 파괴된 것일 수 있다.

상기 숙주세포는 초음파 분해 등에 의해 물리적으로 파괴되거나, 계면활성제 등에 의해 화학적으로 파괴된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배양 배지는 숙주세포를 포함하는 배지일 수 있고, 숙주세포를 분리한 배지일 수도 있다.

또한, 본 발명의 제조 방법은 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단계는 생산된 단백질을 목적 용도로 사용하기 위해 수행되는 당해 기술분야 통상의 과정과 결부되어 수행될 수 있다.

상기 방법으로 제조된 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질은 헴 함량, 효소 활성 또는 안정성이 증가될 수 있다.

본 발명은 상기 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질을 포함하는 기질의 하이드록실화용 조성물을 제공한다.

상기 기질은 오메프라졸, 오메프라졸 설파이드, 에톡시쿠마린, 니트로페놀 등일 수 있다.

상기 조성물은 효소 활성이 증가된 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질을 포함하고 있어, 광범위한 기질의 하이드록실화 반응의 생물학적 촉매로서 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실험재료

본 실시예에서 PCR (중합연쇄 반응) 증폭, DNA 클로닝, 형질전환 등을 위해 사용된 시약, 재료 및 프로토콜은 다음과 같으며, 이는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다.

- 대장균 XL1-Blue는 Stratagene (USA)에서 구입하여 사용하였다.

- 대장균 BL21(DE3)은 Stratagene (USA)에서 구입하여 사용하였다.

- pET24a 플라스미드는 New England Labs (UK)에서 구입하여 사용하였다.

- pET24a-옥시게나아제-리덕타아제(pET24a-WT)의 증폭을 위한 프라이머는 BIONICS (Korea)에서 합성하여 사용하였다.

- pGEM-Npu_PCC73102 플라스미드는 Bioneer (Korea)에서 합성하여 사용하였다.

- nPfu-Special DNA 폴리머라아제는 Enzynomics (Korea)에서 구입하여 사용하였다.

- In-Fusion® HD 클로닝 키트는 Takara Korea Biomedical Inc. (Korea)에서 구입하여 사용하였다.

- 기타 XbaI, EcoRI 제한효소는 New England Biolabs (UK)에서 구입하여 사용하였다.

- 그 외 시약은 Sigma Aldrich (USA) 등에서 구입하여 사용하였다.

플라스미드 형질전환과 유전자 조작을 위한 숙주로는 대장균 XL1-Blue를 사용하였고, 단백질 생산에는 대장균 BL21(DE3)을 이용하였다.

인테인의 자발적 스플라이싱을 유도하기 위해서는, N 말단-인테인의 첫번째 아미노산과 카르복실 말단-인테인의 마지막 아미노산은 아스파라긴이 바람직하고, 카르복실 말단 인테인의 마지막 아미노산에 연결되는 아미노산은 시스테인이 바람직하기 때문에, 이를 고려하여 PCR을 위한 프라이머를 제작하였다.

실시예

[실시예 1] 단백질 스플라이싱을 이용한 박테리아 시토크롬 P450 BM3의 옥시게나아제 및 리덕타아제 도메인의 재조립을 위한 재조합 유전자 제작

본 발명에 필요한 플라스미드 제작에 사용된 DNA의 취급은 표준 프로토콜을 기반으로 수행하였다.

바실러스 메가테리움 유래 시토크롬 P450 BM3를 구성하는 옥시게나아제 도메인 및 리덕타아제 도메인의 독립 발현과 두 도메인의 번역 후 재조립을 위한 스플릿 인테인의 융합은 PCR 반응을 통해 진행하였다. 이 PCR 반응을 위해 하기의 서열로 구성된 각각의 프라이머를 합성하여 사용하였다. 실험에서 사용된 프라이머는 표 1에 나타내었다.

서열번호	프라이머 명칭	서열 (5' → 3')	제한효소
9	BM3_#10 F	5'- GGA GAT ATA CATATG ACA ATT AAA GAA ATG CCT CAG CC -3'	Xho I
10	BM3_#10 R	5'- ACG GAG CTC GAATTC TTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG CCC AGC CCA CAC GTC-3'	Eco RI
11	OXI INFUSION F	5'- TAA CAA TTC CCC TCT AGA AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CATATG AC -3'	Xho I
12	OXI OVERLAP R	5'- GTA CAG CTA GCC TGT TCA GTG CTA GGT GAA G - 3'
13	RE OVERLAP F	5'- CAA GAC TAG TTC TGC TAA AAA AGT ACG CAA AAA GGC -3'
14	RE INFUSION R	5'- TCG ACG GAG CTC GAATTC TTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG CCC AG - 3'	Eco RI
15	INTEIN OVERLAP F	5'- CAC TGA ACA GGC TAG CTG TAC TAA ATG TCT GAG CTA TGA AAC C -3'
16	INTEIN INFUSION R	5'- GCG TAC TTT TTT AGC AGA ACT AGT CTT GTT AAA GCA GTT GCT TGC -3'

전남대학교로부터 제공받은 pET24a-WT를 주형으로 상기 서열번호 9와 10의 프라이머를 사용하여, 바실러스 메가테리움 유래 시토크롬 P450 BM3 단백질(WT)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 PCR로 증폭하고(도 2a 참조), 상기 과정을 통해 얻은 생성물을 주형으로 서열번호 11과 12, 및 서열번호 13과 14의 프라이머를 사용하여 바실러스 메가테리움 유래 P450 BM3 단백질의 옥시게나아제 도메인을 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 리덕타아제 도메인을 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 스플릿 인테인과의 오버랩핑 PCR이 가능한 형태로 증폭시켰다. 또한, 단백질 스플라이싱을 유도하기 위한 스플릿 인테인을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 pGEM-Npu_PCC73102를 주형으로 서열번호 15와 16의 프라이머를 사용하여 스플릿 인테인의 아미노 말단 영역이 옥시게나아제 도메인과 카르복실 말단이 리덕타아제 도메인과 오버랩핑 PCR이 가능한 형태로 증폭시켰다. 이와 같이 얻어진 PCR 생성물에 기초하여 도 2b에 나타낸 바와 같이 오버랩핑 PCR을 진행하였다. 상기 모든 PCR 반응에서는 변이 유발 빈도가 낮은 nPfu-Special DNA 폴리머라아제를 사용하였다.

도 2a 및 2b에 각각 나타낸 PCR을 통해 수득된 DNA 단편은 각각 XbaI 및 EcoRI 제한효소로 처리한 pET24a 플라스미드에 In-Fusion® HD 클로닝 키트로 클로닝하여, 도 3에 나타낸 바와 같은 재조합 발현 벡터인 pET24a-옥시게나아제-리덕타아제(pET24a-WT) 및 도 4에 나타낸 바와 같은 재조합 발현 벡터인 pET24a-옥시게나아제-스플릿 인테인-리덕타아제(pET24a-IMR)를 제작하였다.

도 4에 나타낸 옥시게나아제 도메인의 카르복실 말단에 스플릿 인테인의 아미노 말단 영역 및 리덕타아제 도메인의 아미노 말단에 스플릿 인테인의 카르복실 말단 영역이 융합하도록 제작한 옥시게나아제-스플릿 인테인-리덕타아제 구조체는 XbaI과 NheI으로 옥시게나아제 도메인을 SpeI과 EcoRI으로 리덕타아제 도메인을 제거 가능하도록 설계 하였다. 따라서 임의의 시토크롬 P450(BM3를 포함한 진핵의 해당 단백질도 포함)로부터 유래한 옥시게나아제 또는 리덕타아제 도메인을 클로닝하여 서로 다른 종의 시토크롬 P450으로부터 유래한 옥시게나아제와 리덕타아제로 구성된 하이브리드 시토크롬 P450을 구성할 수 있도록 하였다.

[실시예 2] 스플릿 인테인을 통해 독립 발현된 옥시게나아제와 리덕타아제 도메인의 재조립 확인

시토크롬 P450 BM3의 두 도메인이 스플릿 인테인과 융합되어 독립 발현된 후, 스플릿 인테인의 단백질 스플라이싱 반응에 의해 기능적으로 재조립되는지 여부를 확인하기 위해 시토크롬 P450 BM3 야생형과 발현 양상을 비교하였다. 상기 실시예 1에서 제작한 야생형 시토크롬 P450 BM3 유전자가 클로닝된 pET24a-옥시게나아제-리덕타아제와 스플릿 인테인과 융합되어 두 도메인이 독립 발현되는 pET24a-옥시게나아제-스플릿 인테인-리덕타아제를 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 자명한 방법에 따라 대장균 XL1-Blue에 각각 형질전환한 후, 50 ㎍/mL의 카나마이신을 포함하는 LB(Luria-bertani) 고체 배지에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다.

이어서, 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 대장균 XL1-Blue를 각각 50 ㎍/mL의 카나마이신을 포함하는 LB 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하여 재조합 발현 벡터를 순수 분리하였다. 상기 과정을 통해 얻은 재조합 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 각각 형질전환한 후, 50 ㎍/mL의 카나마이신을 포함하는 LB 고체 배지에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배지에서 성장한 단일 클론을 50 ㎍/mL의 카나마이신을 포함하는 LB 액체 배지에 접종한 후, 37℃에서 200 rpm으로 전배양하며 흡광도를 측정하였다. 배양액의 흡광도(600 nm)가 2.0~2.5에 도달하였을 때, 동일한 조성을 갖는 LB 액체 배지에 계대하고, 600 nm에서 흡광도가 0.6~0.8에 도달할 때까지 배양하였다. 이후, 100 mM IPTG를 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 첨가하고, 동일 조건에서 2.5시간 추가 배양하였다.

배양 종료 후, 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 되도록 보정하여 세포를 수확하였다. 이를 20 mM Tris-HCl(pH 8.0) 300 ㎕에 재현탁한 후, 초음파 처리하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄 직후 전체 단백질 분획을 취한 후, 4℃에서 16,000xg로 30분 동안 원심분리하여 불용성 응집체를 제거한 후, 가용성 분획을 분취하였다.

각 단계에서 취한 시료에 5x 샘플 로딩 버퍼(0.225 M Tris-HCl pH 6.8, 50% 글리세롤, 5% SDS, 0.005 M 브로모페놀 블루 및 0.25 M 디티오트레이톨(DTT))를 5:1의 비율로 첨가하고, 100℃에서 15분간 가열하여 모든 단백질의 변성을 유도하였다. 이어서, 각 시료를 천천히 냉각한 후, 8% 아크릴아미드 겔에 준비한 시료를 로딩하여 160 V로 고정해 전기 영동을 수행하였다. 전기 영동이 완료된 후 아크릴아미드 겔을 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색 용액으로 염색하여 옥시게나아제-리덕타아제(WT)와 스플릿 인테인으로 옥시게나아제 도메인과 리덕타아제 도메인이 독립 발현되는 IMR의 발현 양상을 비교 분석하였다.

도 5a는 상기 언급된 두 개의 단백질에 대한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸다. 도 5a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 야생형 단백질인 박테리아 시토크롬 P450 BM3는 알려진 것과 동일하게 약 119 kDa 위치에서 과발현된 단백질 밴드를 관찰할 수 있다. IMR을 발현시킨 경우는, 옥시게나아제와 리덕타아제 도메인이 각각 스플릿 인테인과 결합된 이론적 크기인 약 63 kDa과 69 kDa에서 보였으며, 두 도메인의 단백질 스플라이싱으로 재조립된 것으로 추정되는 119 kDa 위치에서 과발현된 밴드들을 관찰할 수 있었다. 따라서 각각의 도메인은 물론, 스플릿 인테인에 의해 재조립된 결과물이 야생형 시토크롬 P450 BM3와 크기가 같음을 알 수 있었다.

상기 과정에서 시토크롬 P450 BM3의 옥시게나아제와 리덕타아제 도메인의 독립 발현 시 공간적으로 인접해 발현될 수 있도록, 인테인의 아미노 및 카르복실 말단 영역 사이에 리보솜 결합 위치(ribosome binding site)를 삽입해 하나의 프로모터에서 두 개의 유전자를 발현시키는, 즉 다 시스트론성 mRNA(polycistronic mRNA) 형태를 구성하였다. 이 경우 프로모터와 가까운 유전자가 먼 것보다 발현량이 높은 것이 일반적인 현상으로, 시토크롬 P450 BM3의 경우에도 프로모터에 가까운 옥시게나아제의 발현 정도가 리덕타아제보다 높은 것이 지속적으로 관찰되었다. 박테리아 시토크롬 P450 BM3의 경우 두 개의 단백질(옥시게나아제와 리덕타아제)이 진화과정 중 하나의 단백질로 융합되었을 것으로 예상되고 있으며, 각각의 도메인의 독립 발현도 잘 되는 것으로 알려져 있다. 따라서 두 도메인의 발현 또는 안정성에 있어 현저한 차이가 나타나지는 않을 것임에도 불구하고, 리덕타아제 도메인의 세포 내 발현 정도가 옥시게나아제보다 약 10배 이상 낮은 것은, 스플릿 인테인의 융합 또는 접힘 과정에서 헴 혼입에 따른 구조적 변형과 관련되어 있을 것으로 예상된다.

인테인에 의한 단백질 스플라이싱을 통해 박테리아 시토크롬 P450 BM3의 재구성 효율을 보다 정확하게 관찰하고자, 발현 유도 후 재조립되는 시토크롬 P450 BM3의 양을 시간에 따라 확인해 보았다. 실험 과정은 도 5a의 SDS-PAGE 분석 결과를 도출하기 위한 과정과 동일하게 수행하였으나, IPTG를 첨가하고 40분 간 추가 배양한 후, 리보좀의 50S 서브유닛에 결합하여 펩티딜트랜스퍼라아제 활성을 억제시키는 기작을 통해 단백질 합성을 저해하는 클로람페니콜 항생제를 75 ㎍/mL의 농도로 처리하여 추가적인 단백질 합성을 억제하였다. 따라서 클로람페니콜을 처리한 후에는 기 발현된 옥시게나아제-인테인 아미노 말단과 인테인 카르복실 말단-리덕타아제만이 단백질 스플라이싱 통한 시토크롬 P450 BM3 재조립을 위한 구성 요소가 된다. 시간에 따른 재조립 효율을 SDS-PAGE와 리덕타아제 도메인 카르복실 말단에 융합된 히스티딘 태그(6xHis)를 인식하는 항체를 활용한 웨스턴 블랏으로 측정한 결과는 도 5b와 같다. 도 5b의 웨스턴 블랏 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, IPTG 첨가로 발현을 유도한 후 10분이 경과한 이후부터 재조립된 시토크롬 P450 BM3가 생성되는 것을 확인할 수 있다. 또한 클로람페니콜을 처리하여 단백질 합성을 저해한 후에도 재조립된 시토크롬 P450 양이 증가하는 것으로부터, 스플릿 인테인을 통해 독립 발현된 옥시게나아제와 리덕타아제 도메인의 단백질 스플라이싱을 통해 시토크롬 P450 BM3가 재조립되는 것임을 알 수 있다.

이와 같이, 본 발명에서 스플릿 인테인에 의한 단백질 스플라이싱을 통해 옥시게나아제 도메인과 리덕타아제 도메인의 재조립을 유도하기 위해 제작한 재조합 발현 벡터 시스템이 정상적으로 작동하는 것을 확인하였다.

염기서열 검증

상기 조건으로 두 가지 P450 단백질 야생형 및 IMR의 발현을 위해 사용된 재조합 발현 벡터에 대하여 통상적인 염기서열 분석을 수행하였다. 그 결과, 분석된 염기 서열은 모두 본 발명에서 제작한 P450 단백질 발현을 위한 재조합 발현 벡터의 염기 서열과 일치하였다(서열번호 18).

[실시예 3] 박테리아 시토크롬 P450 BM3 야생형과 IMR의 정제

시토크롬 P450 BM3 야생형 및 IMR의 정제를 위한 세포 배양은 배양 부피를 150 mL로 증가시켜 실시예 2와 동일한 절차에 따라 진행하였다.

수확한 각 세포는 20 mM의 이미다졸을 함유하는 PBS(phosphate-buffered saline) 40 mL를 첨가하여 재현탁하였다. 이후, 재현탁된 세포를 초음파 처리하여 파쇄하고, 4℃에서 16,100xg로 1시간 동안 원심분리하여, 불용성 응집체가 제거된 상등액을 분리하였다. 이후, 20 mM의 이미다졸을 함유하는 PBS 80 mL를 각각 추가하여, 야생형 또는 IMR을 포함하는 120 mL의 가용성 단백질 용액을 5 mL의 Histrap 컬럼(GE healthcare Life Science, US)에 각각 로딩하였다. 각각의 가용성 단백질 분획의 로딩을 완료한 후, Histrap 컬럼을 PBS로 컬럼 부피의 10배 이상의 양으로 충분히 세척하고, 160 mM의 이미다졸을 함유하는 PBS를 사용하여, 농도 구배를 유도함으로써 야생형과 IMR 단백질의 용출을 수행하였다.

시토크롬 P450 BM3 야생형 및 IMR 단백질의 용출 후에 수집한 분획의 SDS-PAGE 분석 결과는 도 6a 및 6b에 나타내었다. 도 6a 및 6b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 시토크롬 P450 BM3 야생형과 IMR은 약 90-95% 이상의 고순도로 5 mg 이상의 단백질이 단일 과정으로 정제되었다.

[실시예 4] 박테리아 시토크롬 P450 BM3 야생형과 IMR의 헴 함량 비교

정제된 시토크롬 P450 BM3 야생형 및 IMR의 헴 함량은 문헌[참조: Guengerich, F. P., Martin, M. V., Sohl, C. D., & Cheng, Q. (2009). Measurement of cytochrome P450 and NADPH-cytochrome P450 reductase. Nature protocols, 4(9), 1245]에 기재된 방법에 따라 측정하였고, 그 결과는 도 7에 나타냈다.

도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 야생형 시토크롬 P450 BM3의 경우 측정에 사용된 전체 단백질의 32%만이 헴을 갖고 있는데 비해, 스플릿 인테인을 통해 옥시게나아제와 리덕타아제 두 도메인을 독립 발현 후 재조립한 시토크롬 P450 BM3 IMR의 경우, 측정한 전체 단백질의 47%가 헴을 함유하고 있는 것으로 측정되었다. 상기 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 스플릿 인테인을 이용해 두 도메인을 독립 발현 후 단백질 스플라이싱 과정을 통해 재조립한 시토크롬 P450 BM3 IMR이 그렇지 않은 경우(WT의 경우)보다, 약 50% 가량 헴 함량이 증가한 것을 확인할 수 있다. 이는 P450 단백질의 비활성에 직접적인 영향을 미칠 수 있는 유의미한 증가이다.

[실시예 5] 박테리아 시토크롬 P450 BM3 야생형과 IMR의 효소 활성 비교

높은 헴 함량이 효소 활성에 미치는 영향을 확인해보기 위해, 다양한 기질들에 대한 활성을 비교해 보았다. 시토크롬 P450 BM3는 다양한 비생체성분(xenobiotics)들에 대한 활성이 보고되고 있으며, 이를 토대로 의약품 안정성 검증을 위한 모델 시스템으로 활용되고 있다. 또한 생리 활성 증대를 위한 고부가 산물의 하이드록실화 과정에도 흔히 이용된다. 이러한 시토크롬 P450 BM3의 하이드록실화 활성에 기초하여, 다양한 기질, 예를 들어 오메프라졸(omeprazole), 7-에톡시쿠마린(7-ethoxycoumarin), p-니트로페놀(p-nitrophenol)에 대한 시토크롬 P450 BM3 WT(야생형) 및 IMR의 활성을 비교하였다. 먼저 오메프라졸에 대한 시토크롬 P450 BM3 야생형과 IMR의 효소 활성 측정은 문헌[참조: Ryu, S. H., Park, B. Y., Kim, S. Y., Park, S. H., Jung, H. J., Park, M., Yun, C. H. (2014). Regioselective hydroxylation of omeprazole enantiomers by bacterial CYP102A1 mutants. Drug Metabolism and Disposition, 42(9), 1493-1497.]에 기재된 절차에 따라 진행하였으며, 이때 CO 차이 스펙트럼 측정을 통해 얻은 헴 함량에 기초하였다. 측정 결과는 도 8에 나타냈다.

도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 스플릿 인테인을 융합해 단백질 스플라이싱 과정에 의한 옥시게나아제 도메인과 리덕타아제 도메인의 재조립이 유도된 시토크롬 P450 BM3 IMR의 경우, 야생형에 비해 오메프라졸을 하이드록실화하는 효소 비활성이 약 2배 가량 증가한 것을 확인할 수 있다.

이러한 시토크롬 P450 BM3 IMR의 증가된 효소 비활성이 오메프라졸 이외의 기질에서도 동일하게 나타나는지 여부를 확인하기 위해, 상기한 기질들에 대한 효소 활성을 비교 측정해 보았으며, 그 결과는 도 9a 내지 9c에 나타냈다.

구체적으로, 도 9a는 시토크롬 P450 BM3 WT 및 IMR 각각이 기질인 7-에톡시쿠마린을 7-OH 쿠마린으로 하이드록실화시킨 결과를 나타내고, 도 9b는 7-에톡시쿠마린을 3-OH 7-하이드록시쿠마린으로 하이드록실화시킨 결과를 나타내며, 도 9c는 p-니트로페놀을 4-니트로카테콜로 하이드록실화시킨 결과를 나타낸다.

상기 결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 옥시게나아제 도메인과 리덕타아제 도메인의 독립 발현 후 스플릿 인테인에 의해 재조립된 시토크롬 P450 BM3 IMR이 야생형에 비해 사용된 기질들에 대해 적게는 30% 정도에서 많게는 80% 정도까지 비활성이 증가하였다. 이는 CO 차이 스펙트럼 결과를 토대로, 정제한 시토크롬 P450 BM3 야생형과 IMR이 동량의 헴 함유 단백질이 되도록 보정하여 효소 활성을 측정한 결과로 WT와 IMR이 유사한 활성이 나타낼 것이라는 예상과 다른 결과이다. 최근 아미노산을 암호화하는 코돈을 코돈 출현 빈도(codon usage)가 다른 동의코돈으로 치환하였을 때 번역 속도에 변화를 유도하고, 이러한 번역 속도 변화는 단백질에 접힘 경로(folding pathway)를 변화시키며, 결과적으로 단백질의 3차 구조에 차이를 유발할 수 있다는 결과가 보고되었다. 또한 이렇게 유도된 구조적 차이는 단백질의 특성, 예를 들면 항체의 항원 인식 능력 또는 효소 활성에도 영향을 준다고 보고되고 있다. 특정 이론에 의한 제한을 의도하는 것은 아니지만, 이러한 결과들로부터, 두 도메인의 독립된 발현은 단순한 시공간적 분리 발현 외에 재조립한 시토크롬 P450 BM3 IMR의 3차 구조의 차이를 유발해, 상기 비교한 결과와 같은 활성 차이가 나타나는 것으로 생각된다. 또한, 이러한 결과는, 본 발명의 기대 효과와 같이, 스플릿 인테인에 의한 단백질 스플라이싱이 (접힘이) 완전한 구조를 이룬 도메인 간의 재조립에 우선하거나 더 높은 효율을 가질 것이라는 가설에도 부합한다.

이러한 결과로부터 본 발명의 재조합 발현 벡터 시스템에 의해 제조된 P450 단백질의 효소 활성은 특정 기질에 의존적으로 개선된 것이 아니라, 다양한 기질에 대해 효소 자체의 비활성이 증가해 결과적으로 효소 특성이 전향적으로 개선되었음을 확인할 수 있다. 종래 시토크롬 P450 단백질의 근본적인 문제점인 옥시게나아제 도메인의 낮은 헴 함량 개선을 위한 대사공학 과정이나 아미노산 변형(돌연변이 유발) 없이 비활성을 개량한 본 발명의 효과는 종래 P450 단백질의 활성 부위 또는 기타 부위의 아미노산 변경에 의한 개량을 전제로 한 방향적 인공 진화 기법과 명확하게 구분되는 방법이다.

[실시예 6] 박테리아 시토크롬 P450 BM3 야생형과 IMR의 안정성 비교

단백질의 구조가 견고(rigid)하거나 안정한 경우, 단백질 분해 효소에 의한 분해 또는 보관에 따른 변성(구조의 풀림)이 적을 수 있다. 본 발명의 재조립 시토크롬 P450 BM3의 경우, 아미노산 변화 즉 구조의 변화가 전제되는 전형적인 단백질 인공 진화 기법과 달리, 단백질 3차 구조에 큰 변형이 유발될 가능성이 낮다. 따라서 단백질 분해 효소에 대한 감수성을 관찰하는 것보다 보관에 따른 변성 정도를 기반으로 야생형과 재조립 시토크롬 P450 BM3의 구조적 완전함(integrity)을 비교하였다. 단백질 구조의 변성은 효소 활성에 직접적인 영향을 주므로, 단백질의 변성 정도는 일정 시간 동안 보관 후 잔류한 효소의 활성으로 평가하였다. 이를 위해 실시예 5에서 활성 비교를 위해 정제한 야생형과 IMR을 4℃에서 5일 간 보관한 후, 두 단백질의 잔여 활성을 측정하였다. 두 효소의 활성 측정 방법은 실시예 5에 기재한 바와 같으며, 기질은 오메프라졸을 사용하였다. 측정 결과는 도 10에 나타냈다.

도 10에서 확인 할 수 있는 바와 같이, 5일 간 냉장보관을 한 후 잔여 활성을 측정한 결과 P450 BM3 야생형은 보관 전에 비해 70% 이상 감소되었으나, IMR의 경우 55% 정도만 감소되었다. 이러한 결과는 재조립한 시토크롬 P450 BM3 IMR이 야생형보다 완전한 구조를 갖고 있음을 간접적으로 보여주는 결과이다.

[실시예 7] 박테리아 시토크롬 P450 BM3 옥시게나아제와 리덕타아제 영역 교환 (domain swapping)으로 재조립된 하이브리드 라이브러리 제작

상기 언급한 것처럼 박테리아 시토크롬 P450 BM3는 옥시게나아제 도메인과 리덕타아제 도메인을 갖는 하나의 단백질로, 세포막이 아닌 세포질에서 발현되는 특성으로 산업적 활용이 용이해, 방향적 인공 진화 기법을 통해 다양한 기질에 대한 특이성을 갖는 변이체 개발을 위한 주형으로 흔히 사용되고 있다. 또한 독성 평가를 위한 중요한 단백질이나 발현 및 정제가 어려운 인간 유래 시토크롬 P450을 대체할 수 있는 동질 효소(isozyme) 개발을 위한 주형으로도 활용되고 있어, 다양한 분야에서 박테리아 시토크롬 P450 BM3의 효소 특성 개량 및 선별 방법에 관한 연구가 지속적으로 수행되고 있다.

박테리아 P450 BM3의 효소적 특성 개량은 기질을 산화하는 옥시게나아제 도메인 개량과 활성을 위한 환원력을 공급하는 리덕타아제 도메인의 동시 개량을 통해 최적 조합을 구성하는 것이 이상적이다. 하지만 큰 분자량(119 kDa)을 지닌 박테리아 시토크롬 P450 BM3를 구성하는 긴 길이의 아미노산 1차 서열로 인해, 단백질 인공 진화 기법으로 제작 가능한 모든 변이체를 탐색할 수 있는 라이브러리를 제작하기는 매우 어렵다. 많은 경우 효소 활성 및 기질 특이성에서 중요한 역할을 수행하는 옥시게나아제 도메인에 한정해 변이를 유도하거나 두 도메인을 독립적으로 개량하고 있다.

이러한 상황에서, 본 발명에서 개발한 옥시게나아제와 리덕타아제 두 도메인의 독립 발현 및 재조립 방법은 단백질의 특성 개량을 위해 종래에 널리 활용되는 제한된 도메인 또는 영역의 아미노산 변이 유발 방법인 단백질 인공 진화 기술과는 다른 경로를 제공할 수 있는 기법이다. 즉, 우수한 기질 특이성을 지닌 시토크롬 P450 BM3 옥시게나아제에 최적의 환원력 전달이 가능한 리덕타아제를 조합하는 방법으로 효소 특성 개량에 활용할 수 있을 것으로 예상하였다. 이에 기초해, 인간 시토크롬 P450 CYP2E1, 2D6, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4 및 1A2의 동질 효소로 개발된 박테리아 P450 BM3 R47L/F87V/L188Q, M11, 9-10A-87A, M1, 2C11, D6H10, 193-3 및 9C1 변이체의 옥시게나아제 도메인과 리덕타아제 도메인을 분할한 인테인을 융합해 분리 후, 도 11에서 모사한 것과 같이 두 도메인이 교차 치환된 하이브리드 라이브러리를 제작하였다. 해당 변이체의 각 도메인의 양 말단은 박테리아 시토크롬 P450 BM3의 서열과 다르지 않아, 서열 번호 9 ~ 15의 프라이머들을 사용하였으며, 실시예 1과 동일한 방법을 사용해 하이브리드 라이브러리를 제작해 최적 활성을 갖는 박테리아 P450 BM3 하이브리드 변이체를 탐색하였다. 변이체 탐색은 방향적 인공 진화 기법을 통한 변이체 선별 과정에서 널리 활용되고 있는 96 웰 플레이트 기반 발색 선별 방법을 사용하였다. 비록 사용한 대부분의 박테리아 P450 BM3 변이체의 경우, 돌연변이가 옥시게나아제 도메인에 집중되어 있기 때문에 다양한 조합의 하이브리드 P450 BM3 제작에는 한계가 있었으나, 리덕타아제 도메인의 영역 교환을 통해 활성이 개선된 변이체 선별이 가능함을 확인하였다.

[실시예 8] 이종의 시토크롬 P450 간의 옥시게나아제와 리덕타아제 영역 교환(domain swapping)을 통해 재조립 시토크롬 P450 하이브리드 라이브러리 제작

실시예 7에서 동종의 박테리아 시토크롬 P450 BM3를 주형으로 옥시게나아제 도메인과 리덕타아제 도메인을 교차 치환한 하이브리드 라이브러리를 제작하고, 활성이 증가한 변이체 선별이 가능함을 확인하였다.

이 결과를 바탕으로 각 도메인을 한 종의 시토크롬 P450에서 벗어나, 두 도메인을 독립적으로 갖고 있는 이종의 시토크롬 P450과 리덕타아제 도메인으로 구성된 교차 치환 라이브러리를 제작해 보고자 하였다. 이 경우 아미노산의 길이 및 3차 구조적 특성이 다른 효소들의 상호 작용을 탐색할 수 있어, 기존에 하나의 주형(박테리아 P450 BM3)으로부터 도출할 수 없는 변이체 선별이 가능할 것이라 예상하였다.

두 도메인을 교차 치환한 하이브리드 라이브러리는, 먼저 리덕타아제 도메인을 고정하고 옥시게나아제 도메인을 치환하는 방법, 이와 반대로 옥시게나아제 도메인을 고정하고 리덕타아제 도메인을 치환하는 방법을 순차적으로 적용해 이종으로부터 유래한 두 도메인으로 구성된 시토크롬 P450 하이브리드 라이브러리 제작을 설계하였다(도 12 참조).

각 도메인의 선정은 일차적으로 박테리아 시토크롬 P450 BM3 또는 효소적 특성이 비교적 잘 알려진 인간 유래 시토크롬 P450의 서열을 기반으로 PSI-BLAST 검색을 통해 특정 영역, 즉 보존적인 영역의 서열 상동성(sequence homology)을 기반으로 유사 시토크롬 P450 서열을 탐색하고, 도출된 단백질들 중 아미노산 서열 상동성이 60 ~ 80 % 이상인 단백질 중, 바실러스 속에 속하지 않는 미생물, 식물 또는 인간으로부터 유래한 서열들을 추출하였다. 추출한 서열들을 계통수(Phylogenetic tree)를 분석하여 상위에 있는 서열들을 선택하고, 박테리아 P450 BM3의 각 도메인과 길이, 보존 영역, 2차 구조를 비교해 전체 영역, 아미노 말단 영역 길이 또는 카르복실 말단 영역 길이를 조절하여 실시예 1에서 사용한 방법으로 분할한 인테인을 융합하였다. 이와 같은 방법으로 이종 숙주로부터 유래한 옥시게나아제 도메인과 박테리아 시토크롬 P450 BM3의 리덕타아제 도메인을 갖는 하이브리드 시토크롬 P450 라이브러리를 제작하였다. 이후 96 웰 기반 효소 활성 탐색 방법을 통해 목적 기질에 활성을 갖는 하이브리드 시토크롬 P450을 탐색해, 선별한 옥시게나아제 도메인의 서열 분석 및 기원을 확인하고, 해당 옥시게나아제 도메인을 갖는 생물종의 리덕타아제 도메인의 아미노산 서열을 수집해, 상기 옥시게나아제 도메인을 탐색하는 방법과 동일한 과정으로 리덕타아제 도메인을 탐색한 후 분할한 인테인을 융합해, 이종 숙주로부터 유래한 시토크롬 P450 하이브리드 라이브러리를 제작하였다. 결과적으로 다양한 효소 활성과 안정성, 그리고 발현율이 다르며 헴 함량이 높아진 하이브리드 단백질의 생성을 확인하였다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> RECOMBINANT VECTOR AND METHOD FOR PRODUCING RECONSTITUTED CYTOCHROME P450 OXYGENASE-REDUCTASE FUSION PROTEIN USING THE SAME <130> 20P03058 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 466 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 1 Met Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys 1 5 10 15 Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys 20 25 30 Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Leu 35 40 45 Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp 50 55 60 Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg 65 70 75 80 Asp Phe Ala Gly Asp Gly Leu Val Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn 85 90 95 Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala 100 105 110 Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val 115 120 125 Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu 130 135 140 Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr 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gattcctcag 1080 cttcaccgtg ataaaacaat ttggggagac gatgtggaag agttccgtcc agagcgtttt 1140 gaaaatccaa gtgcgattcc gcagcatgcg tttaaaccgt ttggaaacgg tcagcgtgcg 1200 tgtatcggtc agcagttcgc tcttcatgaa gcaacgctgg tacttggtat gatgctaaaa 1260 cactttgact ttgaagatca tacaaactac gagctcgata ttaaagaaac tttaacgtta 1320 aaacctgaag gctttgtggt aaaagcaaaa tcgaaaaaaa ttccgcttgg cggtattcct 1380 tcacctagca ctgaacaggc tagcgcgact aaatgtctga gctatgaaac cgagatttta 1440 acggttgagt acggactgct cccaatcggt aaaattgttg aaaagcgcat cgaatgcacg 1500 gtctacagcg tcgataacaa tggcaacatt tatacacagc ctgtagcaca gtggcacgat 1560 cggggcgagc aagaggtgtt tgaatattgc cttgaggatg gtagcctgat acgtgccaca 1620 aaagaccata aatttatgac cgtggatggg cagatgctgc cgattgatga gatcttcgaa 1680 cgtgaactgg acttgatgcg cgttgacaat ctgcccaatg gatcctaatg aggaggttta 1740 aaatatggag ctcatcaaaa ttgcgacccg caagtatctg ggcaagcaga acgtgtacga 1800 tattggggtg gaacgcgacc ataactttgc cctgaaaaac ggtttcatcg caagcaactg 1860 ctttaacaag actagttctg ctaaaaaagt acgcaaaaag gcagaaaacg ctcataatac 1920 gccgctgctt gtgctatacg gttcaaatat gggaacagct gaaggaacgg cgcgtgattt 1980 agcagatatt gcaatgagca aaggatttgc accgcaggtc gcaacgcttg attcacacgc 2040 cggaaatctt ccgcgcgaag gagctgtatt aattgtaacg gcgtcttata acggtcatcc 2100 gcctgataac gcaaagcaat ttgtcgactg gttagaccaa gcgtctgctg atgaagtaaa 2160 aggcgttcgc tactccgtat ttggatgcgg cgataaaaac tgggctacta cgtatcaaaa 2220 agtgcctgct tttatcgatg aaacgcttgc cgctaaaggg gcagaaaaca tcgctgaccg 2280 cggtgaagca gatgcaagcg acgactttga aggcacatat gaagaatggc gtgaacatat 2340 gtggagtgac gtagcagcct actttaacct cgacattgaa aacagtgaag ataataaatc 2400 tactctttca cttcaatttg tcgacagcgc cgcggatatg ccgcttgcga aaatgcacgg 2460 tgcgttttca acgaacgtcg tagcaagcaa agaacttcaa cagccaggca gtgcacgaag 2520 cacgcgacat cttgaaattg aacttccaaa agaagcttct tatcaagaag gagatcattt 2580 aggtgttatt cctcgcaact atgaaggaat agtaaaccgt gtaacagcaa ggttcggcct 2640 agatgcatca cagcaaatcc gtctggaagc agaagaagaa aaattagctc atttgccact 2700 cgctaaaaca gtatccgtag aagagcttct gcaatacgtg gagcttcaag atcctgttac 2760 gcgcacgcag cttcgcgcaa tggctgctaa aacggtctgc ccgccgcata aagtagagct 2820 tgaagccttg cttgaaaagc aagcctacaa agaacaagtg ctggcaaaac gtttaacaat 2880 gcttgaactg cttgaaaaat acccggcgtg tgaaatgaaa ttcagcgaat ttatcgccct 2940 tctgccaagc atacgcccgc gctattactc gatttcttca tcacctcgtg tcgatgaaaa 3000 acaagcaagc atcacggtca gcgttgtctc aggagaagcg tggagcggat atggagaata 3060 taaaggaatt gcgtcgaact atcttgccga gctgcaagaa ggagatacga ttacgtgctt 3120 tatttccaca ccgcagtcag aatttacgct gccaaaagac cctgaaacgc cgcttatcat 3180 ggtcggaccg ggaacaggcg tcgcgccgtt tagaggcttt gtgcaggcgc gcaaacagct 3240 aaaagaacaa ggacagtcac ttggagaagc acatttatac ttcggctgcc gttcacctca 3300 tgaagactat ctgtatcaag aagagcttga aaacgcccaa agcgaaggca tcattacgct 3360 tcataccgct ttttctcgca tgccaaatca gccgaaaaca tacgttcagc acgtaatgga 3420 acaagacggc aagaaattga ttgaacttct tgatcaagga gcgcacttct atatttgcgg 3480 agacggaagc caaatggcac ctgccgttga agcaacgctt atgaaaagct atgctgacgt 3540 tcaccaagtg agtgaagcag acgctcgctt atggctgcag cagctagaag aaaaaggccg 3600 atacgcaaaa gacgtgtggg ctgggcatca ccatcaccat cactaa 3646 <210> 8 <211> 1063 <212> PRT <213> Bacillus megaterium <400> 8 Met Thr Ile Lys Glu Met Pro Gln Pro Lys Thr Phe Gly Glu Leu Lys 1 5 10 15 Asn Leu Pro Leu Leu Asn Thr Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu Met Lys 20 25 30 Ile Ala Asp Glu Leu Gly Glu Ile Phe Lys Phe Glu Ala Pro Gly Arg 35 40 45 Val Thr Arg Tyr Leu Ser Ser Gln Arg Leu Ile Lys Glu Ala Cys Asp 50 55 60 Glu Ser Arg Phe Asp Lys Asn Leu Ser Gln Ala Leu Lys Phe Val Arg 65 70 75 80 Asp Phe Ala Gly Asp Gly Leu Phe Thr Ser Trp Thr His Glu Lys Asn 85 90 95 Trp Lys Lys Ala His Asn Ile Leu Leu Pro Ser Phe Ser Gln Gln Ala 100 105 110 Met Lys Gly Tyr His Ala Met Met Val Asp Ile Ala Val Gln Leu Val 115 120 125 Gln Lys Trp Glu Arg Leu Asn Ala Asp Glu His Ile Glu Val Pro Glu 130 135 140 Asp Met Thr Arg Leu Thr Leu Asp Thr Ile Gly Leu Cys Gly Phe Asn 145 150 155 160 Tyr Arg Phe Asn Ser Phe Tyr Arg Asp Gln Pro His Pro Phe Ile Thr 165 170 175 Ser Met Val Arg Ala Leu Asp Glu Ala Met Asn Lys Leu Gln Arg Ala 180 185 190 Asn Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Asp Glu Asn Lys Arg Gln Phe Gln Glu 195 200 205 Asp Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Val Asp Lys Ile Ile Ala Asp Arg 210 215 220 Lys Ala Ser Gly Glu Gln Ser Asp Asp Leu Leu Thr His Met Leu Asn 225 230 235 240 Gly Lys Asp Pro Glu Thr Gly Glu Pro Leu Asp Asp Glu Asn Ile Arg 245 250 255 Tyr Gln Ile Ile Thr Phe Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr Ser Gly 260 265 270 Leu Leu Ser Phe Ala Leu Tyr Phe Leu Val Lys Asn Pro His Val Leu 275 280 285 Gln Lys Ala Ala Glu Glu Ala Ala Arg Val Leu Val Asp Pro Val Pro 290 295 300 Ser Tyr Lys Gln Val Lys Gln Leu Lys Tyr Val Gly Met Val Leu Asn 305 310 315 320 Glu Ala Leu Arg Leu Trp Pro Thr Ala Pro Ala Phe Ser Leu Tyr Ala 325 330 335 Lys Glu Asp Thr Val Leu Gly Gly Glu Tyr Pro Leu Glu Lys Gly Asp 340 345 350 Glu Leu Met Val Leu Ile Pro Gln Leu His Arg Asp Lys Thr Ile Trp 355 360 365 Gly Asp Asp Val Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Glu Asn Pro Ser 370 375 380 Ala Ile Pro Gln His Ala Phe Lys Pro Phe Gly Asn Gly Gln Arg Ala 385 390 395 400 Cys Ile Gly Gln Gln Phe Ala Leu His Glu Ala Thr Leu Val Leu Gly 405 410 415 Met Met Leu Lys His Phe Asp Phe Glu Asp His Thr Asn Tyr Glu Leu 420 425 430 Asp Ile Lys Glu Thr Leu Thr Leu Lys Pro Glu Gly Phe Val Val Lys 435 440 445 Ala Lys Ser Lys Lys Ile Pro Leu Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Thr 450 455 460 Glu Gln Ala Ser Cys Phe Asn Lys Thr Ser Ser Ala Lys Lys Val Arg 465 470 475 480 Lys Lys Ala Glu Asn Ala His Asn Thr Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly 485 490 495 Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile 500 505 510 Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln Val Ala Thr Leu Asp Ser His 515 520 525 Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala Val Leu Ile Val Thr Ala Ser 530 535 540 Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala Lys Gln Phe Val Asp Trp Leu 545 550 555 560 Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe 565 570 575 Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala 580 585 590 Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala Asp 595 600 605 Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu 610 615 620 Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Val Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp 625 630 635 640 Ile Glu Asn Ser Glu Asp Asn Lys Ser Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val 645 650 655 Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala Lys Met His Gly Ala Phe Ser 660 665 670 Thr Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu Gln Gln Pro Gly Ser Ala Arg 675 680 685 Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln 690 695 700 Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val 705 710 715 720 Asn Arg Val Thr Ala Arg Phe Gly Leu Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg 725 730 735 Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala His Leu Pro Leu Ala Lys Thr 740 745 750 Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr Val Glu Leu Gln Asp Pro Val 755 760 765 Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro 770 775 780 His Lys Val Glu Leu Glu Ala Leu Leu Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu 785 790 795 800 Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr 805 810 815 Pro Ala Cys Glu Met Lys Phe Ser Glu Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser 820 825 830 Ile Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu 835 840 845 Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser 850 855 860 Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala Ser Asn Tyr Leu Ala Glu Leu 865 870 875 880 Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe Ile Ser Thr Pro Gln Ser Glu 885 890 895 Phe Thr Leu Pro Lys Asp Pro Glu Thr Pro Leu Ile Met Val Gly Pro 900 905 910 Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln 915 920 925 Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly 930 935 940 Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu Tyr Gln Glu Glu Leu Glu Asn 945 950 955 960 Ala Gln Ser Glu Gly Ile Ile Thr Leu His Thr Ala Phe Ser Arg Met 965 970 975 Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln His Val Met Glu Gln Asp Gly 980 985 990 Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys 995 1000 1005 Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro Ala Val Glu Ala Thr Leu Met Lys 1010 1015 1020 Ser Tyr Ala Asp Val His Gln Val Ser Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp 1025 1030 1035 1040 Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly Arg Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala 1045 1050 1055 Gly His His His His His His 1060 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BM3_#10 F <400> 9 ggagatatac atatgacaat taaagaaatg cctcagcc 38 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BM3_#10 R <400> 10 acggagctcg aattcttagt gatggtgatg gtgatgccca gcccacacgt c 51 <210> 11 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXI INFUSION F <400> 11 taacaattcc cctctagaaa taattttgtt taactttaag aaggagatat acatatgac 59 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXI OVERLAP R <400> 12 gtacagctag cctgttcagt gctaggtgaa g 31 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RE OVERLAP F <400> 13 caagactagt tctgctaaaa aagtacgcaa aaaggc 36 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RE INFUSION R <400> 14 tcgacggagc tcgaattctt agtgatggtg atggtgatgc ccag 44 <210> 15 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INTEIN OVERLAP F <400> 15 cactgaacag gctagctgta ctaaatgtct gagctatgaa acc 43 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INTEIN INFUSION R <400> 16 gcgtactttt ttagcagaac tagtcttgtt aaagcagttg cttgc 45 <210> 17 <211> 3150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET24a-oxygenase-reductase <400> 17 atgacaatta aagaaatgcc tcagccaaaa acgtttggag agcttaaaaa tttaccgtta 60 ttaaacacag ataaaccggt tcaagctttg atgaaaattg cggatgaatt aggagaaatc 120 tttaaattcg aggcgcctgg tcgtgtaacg cgctacttat caagtcagcg tctaattaaa 180 gaagcatgcg atgaatcacg ctttgataaa aacttaagtc aagcgcttaa atttgtacgt 240 gattttgcag gagacgggtt atttacaagc tggacgcatg aaaaaaattg gaaaaaagcg 300 cataatatct tacttccaag cttcagtcag caggcaatga aaggctatca tgcgatgatg 360 gtcgatatcg ccgtgcagct tgttcaaaag tgggagcgtc taaatgcaga tgagcatatt 420 gaagtaccgg aagacatgac acgtttaacg cttgatacaa ttggtctttg cggctttaac 480 tatcgcttta acagctttta ccgagatcag cctcatccat ttattacaag tatggtccgt 540 gcactggatg aagcaatgaa caagctgcag cgagcaaatc cagacgaccc agcttatgat 600 gaaaacaagc gccagtttca agaagatatc aaggtgatga acgacctagt agataaaatt 660 attgcagatc gcaaagcaag cggtgaacaa agcgatgatt tattaacgca tatgctaaac 720 ggaaaagatc cagaaacggg tgagccgctt gatgacgaga acattcgcta tcaaattatt 780 acattcttaa ttgcgggaca cgaaacaaca agtggtcttt tatcatttgc gctgtatttc 840 ttagtgaaaa atccacatgt attacaaaaa gcagcagaag aagcagcacg agttctagta 900 gatcctgttc caagctacaa acaagtcaaa cagcttaaat atgtcggcat ggtcttaaac 960 gaagcgctgc gcttatggcc aactgctcct gcgttttccc tatatgcaaa agaagatacg 1020 gtgcttggag gagaatatcc tttagaaaaa ggcgacgaac taatggttct gattcctcag 1080 cttcaccgtg ataaaacaat ttggggagac gatgtggaag agttccgtcc agagcgtttt 1140 gaaaatccaa gtgcgattcc gcagcatgcg tttaaaccgt ttggaaacgg tcagcgtgcg 1200 tgtatcggtc agcagttcgc tcttcatgaa gcaacgctgg tacttggtat gatgctaaaa 1260 cactttgact ttgaagatca tacaaactac gagctcgata ttaaagaaac tttaacgtta 1320 aaacctgaag gctttgtggt aaaagcaaaa tcgaaaaaaa ttccgcttgg cggtattcct 1380 tcacctagca ctgaacagtc tgctaaaaaa gtacgcaaaa aggcagaaaa cgctcataat 1440 acgccgctgc ttgtgctata cggttcaaat atgggaacag ctgaaggaac ggcgcgtgat 1500 ttagcagata ttgcaatgag caaaggattt gcaccgcagg tcgcaacgct tgattcacac 1560 gccggaaatc ttccgcgcga aggagctgta ttaattgtaa cggcgtctta taacggtcat 1620 ccgcctgata acgcaaagca atttgtcgac tggttagacc aagcgtctgc tgatgaagta 1680 aaaggcgttc gctactccgt atttggatgc ggcgataaaa actgggctac tacgtatcaa 1740 aaagtgcctg cttttatcga tgaaacgctt gccgctaaag gggcagaaaa catcgctgac 1800 cgcggtgaag cagatgcaag cgacgacttt gaaggcacat atgaagaatg gcgtgaacat 1860 atgtggagtg acgtagcagc ctactttaac ctcgacattg aaaacagtga agataataaa 1920 tctactcttt cacttcaatt tgtcgacagc gccgcggata tgccgcttgc gaaaatgcac 1980 ggtgcgtttt caacgaacgt cgtagcaagc aaagaacttc aacagccagg cagtgcacga 2040 agcacgcgac atcttgaaat tgaacttcca aaagaagctt cttatcaaga aggagatcat 2100 ttaggtgtta ttcctcgcaa ctatgaagga atagtaaacc gtgtaacagc aaggttcggc 2160 ctagatgcat cacagcaaat ccgtctggaa gcagaagaag aaaaattagc tcatttgcca 2220 ctcgctaaaa cagtatccgt agaagagctt ctgcaatacg tggagcttca agatcctgtt 2280 acgcgcacgc agcttcgcgc aatggctgct aaaacggtct gcccgccgca taaagtagag 2340 cttgaagcct tgcttgaaaa gcaagcctac aaagaacaag tgctggcaaa acgtttaaca 2400 atgcttgaac tgcttgaaaa atacccggcg tgtgaaatga aattcagcga atttatcgcc 2460 cttctgccaa gcatacgccc gcgctattac tcgatttctt catcacctcg tgtcgatgaa 2520 aaacaagcaa gcatcacggt cagcgttgtc tcaggagaag cgtggagcgg atatggagaa 2580 tataaaggaa ttgcgtcgaa ctatcttgcc gagctgcaag aaggagatac gattacgtgc 2640 tttatttcca caccgcagtc agaatttacg ctgccaaaag accctgaaac gccgcttatc 2700 atggtcggac cgggaacagg cgtcgcgccg tttagaggct ttgtgcaggc gcgcaaacag 2760 ctaaaagaac aaggacagtc acttggagaa gcacatttat acttcggctg ccgttcacct 2820 catgaagact atctgtatca agaagagctt gaaaacgccc aaagcgaagg catcattacg 2880 cttcataccg ctttttctcg catgccaaat cagccgaaaa catacgttca gcacgtaatg 2940 gaacaagacg gcaagaaatt gattgaactt cttgatcaag gagcgcactt ctatatttgc 3000 ggagacggaa gccaaatggc acctgccgtt gaagcaacgc ttatgaaaag ctatgctgac 3060 gttcaccaag tgagtgaagc agacgctcgc ttatggctgc agcagctaga agaaaaaggc 3120 cgatacgcaa aagacgtgtg ggctgggtaa 3150 <210> 18 <211> 3192 <212> DNA <213> Bacillus megaterium <400> 18 atgacaatta aagaaatgcc tcagccaaaa acgtttggag agcttaaaaa tttaccgtta 60 ttaaacacag ataaaccggt tcaagctttg atgaaaattg cggatgaatt aggagaaatc 120 tttaaattcg aggcgcctgg tctggtaacg cgctacttat caagtcagcg tctaattaaa 180 gaagcatgcg atgaatcacg ctttgataaa aacttaagtc aagcgcttaa atttgtacgt 240 gattttgcag gagacgggtt agtgacaagc tggacgcatg aaaaaaattg gaaaaaagcg 300 cataatatct tacttccaag cttcagtcag caggcaatga aaggctatca tgcgatgatg 360 gtcgatatcg ccgtgcagct tgttcaaaag tgggagcgtc taaatgcaga tgagcatatt 420 gaagtaccgg aagacatgac acgtttaacg cttgatacaa ttggtctttg cggctttaac 480 tatcgcttta acagctttta ccgagatcag cctcatccat ttattacaag tatggtccgt 540 gcactggatg aagcaatgaa caagcagcag cgagcaaatc cagacgaccc agcttatgat 600 gaaaacaagc gccagtttca agaagatatc aaggtgatga acgacctagt agataaaatt 660 attgcagatc gcaaagcaag cggtgaacaa agcgatgatt tattaacgca tatgctaaac 720 ggaaaagatc cagaaacggg tgagccgctt gatgacgaga acattcgcta tcaaattatt 780 acattcttaa ttgcgggaca cgaaacaaca agtggtcttt tatcatttgc gctgtatttc 840 ttagtgaaaa atccacatgt attacaaaaa gcagcagaag aagcagcacg agttctagta 900 gatcctgttc caagctacaa acaagtcaaa cagcttaaat atgtcggcat ggtcttaaac 960 gaagcgctgc gcttatggcc aactgctcct gcgttttccc tatatgcaaa agaagatacg 1020 gtgcttggag gagaatatcc tttagaaaaa ggcgacgaac taatggttct gattcctcag 1080 cttcaccgtg ataaaacaat ttggggagac gatgtggaag agttccgtcc agagcgtttt 1140 gaaaatccaa gtgcgattcc gcagcatgcg tttaaaccgt ttggaaacgg tcagcgtgcg 1200 tgtatcggtc agcagttcgc tcttcatgaa gcaacgctgg tacttggtat gatgctaaaa 1260 cactttgact ttgaagatca tacaaactac gagctcgata ttaaagaaac tttaacgtta 1320 aaacctgaag gctttgtggt aaaagcaaaa tcgaaaaaaa ttccgcttgg cggtattcct 1380 tcacctagca ctgaacaggc tagctgcttt aacaagacta gttctgctaa aaaagtacgc 1440 aaaaaggcag aaaacgctca taatacgccg ctgcttgtgc tatacggttc aaatatggga 1500 acagctgaag gaacggcgcg tgatttagca gatattgcaa tgagcaaagg atttgcaccg 1560 caggtcgcaa cgcttgattc acacgccgga aatcttccgc gcgaaggagc tgtattaatt 1620 gtaacggcgt cttataacgg tcatccgcct gataacgcaa agcaatttgt cgactggtta 1680 gaccaagcgt ctgctgatga agtaaaaggc gttcgctact ccgtatttgg atgcggcgat 1740 aaaaactggg ctactacgta tcaaaaagtg cctgctttta tcgatgaaac gcttgccgct 1800 aaaggggcag aaaacatcgc tgaccgcggt gaagcagatg caagcgacga ctttgaaggc 1860 acatatgaag aatggcgtga acatatgtgg agtgacgtag cagcctactt taacctcgac 1920 attgaaaaca gtgaagataa taaatctact ctttcacttc aatttgtcga cagcgccgcg 1980 gatatgccgc ttgcgaaaat gcacggtgcg ttttcaacga acgtcgtagc aagcaaagaa 2040 cttcaacagc caggcagtgc acgaagcacg cgacatcttg aaattgaact tccaaaagaa 2100 gcttcttatc aagaaggaga tcatttaggt gttattcctc gcaactatga aggaatagta 2160 aaccgtgtaa cagcaaggtt cggcctagat gcatcacagc aaatccgtct ggaagcagaa 2220 gaagaaaaat tagctcattt gccactcgct aaaacagtat ccgtagaaga gcttctgcaa 2280 tacgtggagc ttcaagatcc tgttacgcgc acgcagcttc gcgcaatggc tgctaaaacg 2340 gtctgcccgc cgcataaagt agagcttgaa gccttgcttg aaaagcaagc ctacaaagaa 2400 caagtgctgg caaaacgttt aacaatgctt gaactgcttg aaaaataccc ggcgtgtgaa 2460 atgaaattca gcgaatttat cgcccttctg ccaagcatac gcccgcgcta ttactcgatt 2520 tcttcatcac ctcgtgtcga tgaaaaacaa gcaagcatca cggtcagcgt tgtctcagga 2580 gaagcgtgga gcggatatgg agaatataaa ggaattgcgt cgaactatct tgccgagctg 2640 caagaaggag atacgattac gtgctttatt tccacaccgc agtcagaatt tacgctgcca 2700 aaagaccctg aaacgccgct tatcatggtc ggaccgggaa caggcgtcgc gccgtttaga 2760 ggctttgtgc aggcgcgcaa acagctaaaa gaacaaggac agtcacttgg agaagcacat 2820 ttatacttcg gctgccgttc acctcatgaa gactatctgt atcaagaaga gcttgaaaac 2880 gcccaaagcg aaggcatcat tacgcttcat accgcttttt ctcgcatgcc aaatcagccg 2940 aaaacatacg ttcagcacgt aatggaacaa gacggcaaga aattgattga acttcttgat 3000 caaggagcgc acttctatat ttgcggagac ggaagccaaa tggcacctgc cgttgaagca 3060 acgcttatga aaagctatgc tgacgttcac caagtgagtg aagcagacgc tcgcttatgg 3120 ctgcagcagc tagaagaaaa aggccgatac gcaaaagacg tgtgggctgg gcatcaccat 3180 caccatcact aa 3192

Claims (11)

1. 시토크롬 P450 옥시게나아제 및 이에 대한 리덕타아제가 독립 발현되어 재조립되는 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질을 제조하기 위한 재조합 벡터로서,
   상기 시토크롬 P450 옥시게나아제를 코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드, 상기 리덕타아제를 코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드, 및 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사이에 개재된, 스플릿 인테인을 코딩하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것인, 재조합 벡터.
   
3. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것인, 재조합 벡터.
   
4. 청구항 1에 있어서, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 것인, 재조합 벡터.
   
5. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3의 서열로 이루어지고,
   상기 제2 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 서열로 이루어지며,
   상기 제3 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 서열로 이루어진 것인, 재조합 벡터.
   
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
   
7. 청구항 6에 있어서, 상기 숙주세포는 에셰리키아 콜라이(Esherichia coli)인, 숙주세포.
   
8. 청구항 6의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질 제조방법.
   
9. 청구항 8의 방법으로 제조된, 헴 함량, 효소 활성 또는 안정성이 증가된 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질.
   
10. 청구항 9의 재조립 시토크롬 P450 옥시게나아제-리덕타아제 융합 단백질을 포함하는 기질의 하이드록실화용 조성물.
    
11. 청구항 10에 있어서, 상기 기질은 오메프라졸, 오메프라졸 설파이드, 에톡시쿠마린 또는 니트로페놀인, 조성물.

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