KR20180023735A

KR20180023735A - 박테리아 시토크롬 p450 단백질 변이체 및 그를 이용한 시료 중 플루오르화된 메탄의 농도를 감소시키는 방법

Info

Publication number: KR20180023735A
Application number: KR1020160109544A
Authority: KR
Inventors: 정유경; 김태용; 아니르반 바두리; 쿠마르 타디 벤카다 시바; 박진환
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2016-08-26
Filing date: 2016-08-26
Publication date: 2018-03-07

Abstract

박테리아 시토크롬 P450 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물, 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)을 제거하는데 사용하기 위한 재조합 P450 단백질을 포함하는 조성물 및 시료 중 CHnF4-n의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

박테리아 시토크롬 P450 단백질 변이체 및 그를 이용한 시료 중 플루오르화된 메탄의 농도를 감소시키는 방법{Bacterial cytochrome 450 protein variant and method for reducing concentration of fluorinated methane in sample}

박테리아 시토크롬 P450 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물, 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)으로 표시되는 플루오로메탄을 제거하는데 사용하기 위한 재조합 P450 단백질을 포함하는 조성물 및 시료 중 CHnF4-n의 농도를 감소시키는 방법에 관한 것이다.

지구의 온난화를 가속시키는 온실가스의 배출은 심각한 환경 문제 중의 하나이며 이를 규제하고 방지하기 위해서 온실가스 배출량에 대한 규제가 강화되고 있다. 이 중 퍼플루오로카본(perfluorocarbons:PFCs), 히드로플루오로카본(hydrofluorocarbons:HFCs), 술퍼 헥사플루오리드(SF6)와 같은 불화가스 (F-가스)는 절대 배출량은 낮으나 반감기가 길고 지구온난화 계수가 월등히 높아 더욱 심각한 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. F-가스의 주요 배출원인 반도체 및 전자 산업 분야 등에서 F-가스의 발생량은 온실가스 배출 할당량을 초과하여 증가 추세에 있고 이에 따라 온실가스 분해 및 배출권 구입에 필요한 비용 부담이 매년 증가하고 있는 상황이다.

하지만, 기존의 F-가스 분해는 열분해 또는 촉매열산화 공정을 이용하고 있으나 제한된 분해율 및 2차 유해물질 배출, 고비용 등의 한계가 존재한다. 이를 해결하기 위해 미생물 생촉매를 이용한 생물학적 F-가스 분해 공정의 도입으로 기존의 화학적 분해 공정의 한계를 극복하고 보다 경제적이고 친환경적인 F-가스의 처리가 가능할 것으로 보인다.

시토크롬 P450 (CYP)은 헴 보조인자(heme cofactor)를 포함한 단백질의 수퍼패밀리에 속하며, 헤모단백질(hemoprotein)이다. 시토크롬 P450은 효소 반응에서 기질로서 다양한 작고 큰 분자를 기질로서 사용한다. 시토크롬 P450은 일반적으로, 넓게 P450 함유 시스템으로 카테고리화된, 전자 전달 사슬 (electron transfer chain)의 말단 옥시다제 효소이다.

박테리아 시토크롬 P450은 종종 가용성 효소이며, 다양한 대사 과정에 관여한다. 대장균과 같은 일부 박테리아는 시토크롬 P450을 포함하고 있지 않다. P. putida 유래의 시토크롬 P450 (CYP101)은 2Fe-2S 클러스터-함유 단백질 보조요소(cofactor)인 푸티다레독신(putidaredoxin)으로부터 2개 전자 전달 단계를 구성하는 캄포르-히드록실화 촉매 사이클(camphor-hydroxylating catalytic cycle)의 일부분이다.

B.megaterium 유래의 시토크롬 P450 BM3 (CYP102)은 ω-1 내지 ω-3 위치에서 여러 긴 사슬 지방산의 NADPH-의존성 히드록실화를 촉매한다. 시토크롬 P450 BM3은 CYP 도메인과 전자 공여 보조인자 (electron donating cofactor) 사이에 천연 융합 단백질(natural fusion protein)로 구성된다.

그러나, 박테리아 시토크롬 P450이 시료 중의 불화 메탄을 제거하는 것을 촉매하는지는 알려져 있지 않다.

일 양상은 박테리아 시토크롬 P450 단백질 또는 그의 변이체를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.

다른 양상은 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)으로 표시되는 플루오로메탄을 제거하는데 사용하기 위한 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 양상은 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체를 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)으로 표시되는 플루오로메탄 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 플루오로메탄의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 CHnF4-n의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.

다른 양상은 박테리아 시토크롬 P450 단백질의 변이체 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 재조합 미생물에 있어서, 상기 시토크롬 P450 단백질은 EC 1.14.15.1 또는 EC 1.14.14.1에 속하는 것일 수 있다. 상기 시토크롬 P450 단백질은 P450Cam 또는 P450_BM3일 수 있다. P450Cam은 Pseudomonas putida PpG786 유래의 것일 수 있다. P450_BM3은 Bacillus megaterium (ATCC 14581) 유래의 것일 수 있다. 상기 시토크롬 P450_CAM 단백질은 CamA, CamB, 및 CamC의 복합체의 형태로 박테리아 CYP101 시스템을 구성할 수 있다. CamA는 FAD 함유 레덕타제(reductase)일 수 있다. CamA는 NADH 또는 NADPH 의존성일 수 있다. 상기 CamA는 EC 1.18.1.5에 속하는 것일 수 있다. CamB는 [2Fe2S]타입의 페레독신(ferredoxin)일 수 있다. CamC는 P450Cam(CYP101) 또는 P450Cam이라고도 하며, 시토크롬 450을 포함하고, EC 1.14.15.1에 속하는 것일 수 있다. CamA, CamB, 및 CamC는 각각 서열번호 2, 4, 및 6의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. CamA, CamB, 및 CamC를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 1, 3, 및 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산 서열의 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖고 EC 1.14.15.1에 속하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 아미노산 변경은 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산, 예를 들면, 19개 천연 아미노산으로 치환한 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 6의 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 Y, T, N, Q, H, 또는 D로 치환한 것일 수 있다. EC 1.14.15.1는 (+)-캄포르+환원된 푸티다레독신 + O₂ ⇔ (+)-엑소-5-히드록시캄포르+산화된 푸티다레독신 + H₂O의 반응을 촉매하는 효소를 나타낼 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산을 갖는 P450CAM에서 F351을 다른 아미노산, 예를 들면, 19개 천연 아미노산으로 치환한 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산을 갖는 P450CAM은 F351Y, F351T, F351N, F351Q, F351H, 또는 F351D 치환을 갖는 것일 수 있다. 상기 P450CAM 변이체를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 아미노산을 갖는 P450CAM에서 F351Y, F351T, F351N, F351Q, F351H, 또는 F351D 치환을 갖는 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다. 이 유전자는 서열번호 51, 52, 53, 54, 55, 또는 56의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 미생물은 CamA를 코딩하는 유전자 및 CamB를 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다.

P450_BM3은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. P450_BM3를 코딩하는 유전자는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열의 갖는 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 8의 아미노산 서열의 N320 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖고 EC 1.14.14.1에 속하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 아미노산 변경은 N320 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산, 예를 들면, 19개 천연 아미노산으로 치환한 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 8의 N320 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 W, F, G, P, S, 또는 E로 치환한 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 8의 아미노산을 갖는 P450BM3에서 N320을 다른 아미노산, 예를 들면, 19개 천연 아미노산으로 치환한 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 8의 아미노산을 갖는 P450BM3에서 N320W, N320F, N320G, N320P, N320S, 또는 N320E 치환을 갖는 것일 수 있다. 상기 P450BM3 변이체를 코딩하는 유전자는 서열번호 8의 아미노산을 갖는 P450BM3에서 N320W, N320F, N320G, N320P, N320S, 또는 N320E 치환을 갖는 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다. 이 유전자는 서열번호 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. "EC 1.14.14.1"란 하기 반응을 촉매하는 것일 수 있다.

RH+ 환원된 NADPH---헤모단백질 레덕타제(hemoprotein reductase)+O₂=ROH+산화된 NADPH---헤모단백질 레덕타제+H₂O

본 명세서에 사용된 용어 "해당하는(corresponding)"은, BLAST 페어와이즈 정렬, 또는 잘 알려진 리프만-피어슨 단백질 정렬(Lipman-Pearson Protein Alignment) 프로그램과 같은 당업계에서 수용될 수 있는(art-acceptable) 단백질 정렬 프로그램(protein alignment program)을 하기 정렬 파라미터을 가지고 이용하여 관심 대상 단백질과 표준 단백질의 아미노산 서열(예, 서열번호 6 또는 서열번호 8)을 정렬하였을 때, 표준 단백질의 언급된 위치(예, 서열번호 6의 F351 위치 또는 서열번호 8의 N320 위치)와 정렬하는 관심 대상 단백질의 아미노산 위치를 나타낸다. 표준서열이 저장된 데이터베이스(DB)는 NCBI의 RefSeq non-redundant proteins일 수 있다. 서열의 정렬에 사용되는 파라미터는 다음과 같을 수 있다: Ktuple=2, Gap Penalty=4, 및 Gap length penalty=12. 이때 상기 "해당하는" 서열에 포함되는 범위는 E-value 0.00001 및 H-value 0.001의 범위 속하는 것일 수 있다.

상기 정렬 조건에 따라 얻어진 서열번호 6의 아미노산 서열의 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 갖는 단백질 (이하,이들을 "P450CAM의 호모로그(homolog)"라 한다)의 예는 아래 표 1, 2, 및 3과 같다.

또한, 상기 정렬 조건에 따라 얻어진 서열번호 8의 아미노산 서열의 N320 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 갖는 단백질 (이하,이들을 "P450BM3의 호모로그(homolog)"라 한다)의 예는 아래 표 4, 및 5와 같다.

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상기 재조합 미생물은 박테리아 또는 진균(fungi)일 수 있다. 상기 박테리아는 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 상기 그람 음성 박테리아는 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 패밀리에 속하는 것일 수 있다. 상기 그람 음성 박테리아는 에스케리키아(Escherichia) 속, 살모넬라(Samonella) 속, 잔토모나스(Xanthomonas) 속 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 에스케리키아 속 미생물은 대장균일 수 있다. 잔토박터 속 미생물은 잔토박터 아우토트로피쿠스를 포함하는 것일 수 있다. 그람 양성 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 또는 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 것일 수 있다.

상기 재조합 미생물은 NADPH를 생성하는 반응을 촉매하는 효소로서, 상기 반응에 의하여 세포 내의 NADPH의 수준을 증가시키는 효소의 수준을 증가시키는 유전적 변형 (genetic modification)을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 내재적 유전자의 증폭, 및 외래 유전자의 도입을 포함한다. 상기 효소는 EC 1.1.1.49에 속하는 단백질일 수 있다. 상기 효소는 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제(G6PD 또는 G6PDH)일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 G6PDH를 코딩하는 외래 유전자를 더 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)으로 표시되는 플루오로메탄을 제거하는데 사용하기 위한 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 달리 언급이 없으면, 상기 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체는 상기한 바와 같다.

상기 조성물에 있어서, CHnF4-n으로 표시되는 플루오로메탄은 예를 들면, CHF₃, CH₂F₂, CH₃F, 또는 CF₄일 수 있다. 용어 "제거"는 시료 중의 플루오로메탄의 농도를 감소시키는 것을 포함한다. 상기 감소는 완전하게 제거하는 것을 포함한다.

상기 조성물에 있어서, 상기 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체는 발현된 박테리아 시토크롬 P450 단백질을 포함하고 있는 재조합 미생물, 그 파쇄물(lysate), 그 파쇄물의 수용성 물질 분획, 또는 재조합 P450 단백질의 형태일 수 있다. 박테리아 시토크롬 P450 또는 그의 변이체는 외래 유전자로부터 발현된 것일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 제거는 플루오로메탄의 C-F의 결합을 절단하거나, 플루오로메탄을 다른 물질로 전환하거나, 세포 내에 축적하여, 플루오로화 메탄의 농도를 줄이는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 전환은 플루오로화 메탄에 히드록실기와 같은 친수성 기를 도입하는 것, 또는 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중결합을 도입하는 것일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 시료는 액체 또는 기체 상태일 수 있다. 상기 시료는 공장 폐수 또는 폐기체일 수 있다.

다른 양상은 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체를 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)으로 표시되는 플루오로메탄 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 플루오로메탄의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 플루오로메탄의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다. 달리 언급이 없으면, 상기 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체는 상기한 바와 같다.

상기 방법에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 접촉은 기체 시료와 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체 함유 액체를 접촉시키는 기체-액체 접촉일 수 있다. 또한, 상기 접촉은 액체 시료와 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체 함유 액체를 접촉시키는 액체-액체 접촉일 수 있다. 상기 액체-액체 접촉은 혼합하는 것을 포함한다.

상기 방법에 있어서, 상기 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체는 발현된 박테리아 시토크롬 P450 단백질을 포함하고 있는 재조합 미생물, 그 파쇄물(lysate), 그 파쇄물의 수용성 물질 분획, 또는 재조합 P450 단백질의 형태인 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 재조합 미생물이 생존가능한 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 생존가능한 조건은 재조합 미생물이 증식가능한 조건 또는 휴지 상태(resting sate)로 있게 하는 조건일 수 있다. 이 경우, 상기 접촉은 플루오로메탄의 존재하에서 미생물을 배양하는 것일 수 있다. 상기 배양은 호기 또는 혐기 조건에서 수행되는 것일 수 있다.

상기 방법에 있어서, 상기 시료는 액체 또는 기체 상태일 수 있다. 상기 시료는 공장 폐수 또는 폐기체일 수 있다.

상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산 서열의 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖고 EC 1.14.15.1에 속하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산을 갖는 P450CAM의 camC에서 F351을 다른 아미노산, 예를 들면, 19개 천연 아미노산으로 치환한 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산을 갖는 P450CAM의 camC에서 F351Y, F351T, F351N, F351Q, F351H, 또는 F351D 치환을 갖는 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 8의 아미노산 서열의 N320 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖고 EC 1.14.14.1에 속하는 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 8의 아미노산을 갖는 P450BM3에서 N320을 다른 아미노산, 예를 들면, 19개 천연 아미노산으로 치환한 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 8의 아미노산을 갖는 P450BM3에서 N320W, N320F,N320G,N320P,N320S,또는 N320E 치환을 갖는 것일 수 있다.

상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 중에 포함된 것일 수 있다. 상기 벡터는 폴리뉴클레오티드를 미생물 내로 도입하는데 사용될 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다.

일 양상에 따른 재조합 미생물은 시료 중 CHnF4-n으로 표시되는 플루오로메탄을 제거하는데 사용될 수 있다.

일 양상에 따른 재조합 P450 단백질의 변이체는 시료 중 플루오로메탄을 제거하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 재조합 P450 단백질 또는 그의 변이체를 포함하는 조성물은 시료 중 플루오로메탄을 제거하는데 사용될 수 있다.

다른 양상에 따른 시료 중 플루오로메탄의 농도를 감소시키는 방법은 시료 중 플루오로메탄의 농도를 효율적으로 감소시킬 수 있다.

도 1은 pETDuet-camC-camAB 벡터의 벡터 지도를 나타낸다.
도 2는 CHF₃ 함유 기체와 접촉된 배지 중에서 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB를 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CHF₃의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 3a는 CHCl₃ 함유 배지 중에서 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB를 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CHCl₃의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 3b는 CF₄ 함유 기체와 접촉된 배지 중에서 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB를 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CF₄의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 3c는 돌연변이 camC 유전자가 도입된 대장균 BL21/pETDuet-camCmt-camAB의 시간에 따른 시료 중 CF₄ 정도를 나타낸다.
도 4는 pET28a-P450_BM3 벡터의 벡터 지도를 나타낸다.
도 5는 pACYCDuet-zwf벡터의 벡터 지도를 나타낸다.
도 6은 CHF₃ 함유 기체와 접촉된 용액 중에서 재조합 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3 또는 재조합 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf를 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CHF₃의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 7은 CHCl₃ 함유 용액 중에서 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3를 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CHCl₃의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 8은 CF₄ 함유 기체와 접촉된 배지 중에서 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3 균주를 7일 동안 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CF₄의 시간에 따른 변화를 나타낸다.
도 9는 돌연변이 P450BM3 유전자가 도입된 대장균 BL21/pET28a-P450BM3mt의 시간에 따른 시료 중 CF₄ 정도를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: P450 _CAM 유전자를 발현하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 시료 중 할로메탄의 제거

본 실시예에서는 P450_CAM 유전자를 발현하는 재조합 대장균을 제작하고, 그를 이용하여 시료 중 할로메탄, 즉, CHF₃, CF₄ 또는 CHCl₃의 제거 효과를 확인하였다.

(1) P450 _CAM 유전자를 발현하는 재조합 대장균의 제작

P450_CAM 유전자는 Pseudomonas putida PpG786 균주의 CAM 플라스미드로부터 camC, camA, 및 camB 유전자를 증폭하였다. camC, camA, 및 camB 유전자는 각각 서열번호 5, 서열번호 1, 및 서열번호 3의 뉴클레오티드를 갖고 있으며 이들 유전자는 각각 서열번호 6, 서열번호 2, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩한다. 구체적으로, P. putida PpG786 균주 DSM 7162를 LB 배지 중에서 30℃에서 230 rpm으로 교반하면서 밤새 배양한 후, 총 DNA 추출 키트(total DNA extraction kit)(Invitrogen Biotechnology)를 사용한 방법으로 CAM 플라스미드를 분리하고, 이 CAM 플라스미드를 주형으로 하고, 서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열의 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 뉴클레오티드 서열의 프라이머 세트; 및 서열번호 15 및 16의 뉴클레오티드 서열의 프라이머 세트를 각각 프라이머로 하여 PCR을 수행하여, camA, camB, 및 camC 유전자를 각각 증폭하여 얻었다.

서열번호 11 및 12의 뉴클레오티드 서열의 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의하여 증폭된 camC 유전자는 제한효소 NcoI 및 HindII를 사용하여 절단된 pETDuet (Novagen, Cat. No.71146-3)와 InFusion Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.)를 통해 연결하여 pETDuet-camC 벡터를 제조하였다. 또한, 제조된 pETDuet-camC 벡터를 제한효소 NdeI 및 XhoI를 사용하여 절단하고, 상기 증폭된 camA 유전자와 상기 증폭된 camB 유전자 단편과 InFusion Cloning Kit를 통해 연결하여 pETDuet-camC-camAB 벡터를 제조하였다.

도 1은 pETDuet-camC-camAB 벡터의 벡터 지도를 나타낸다.

다음으로, 제작된 pETDuet-camC-camAB 벡터를 대장균 BL21 균주에 열충격 (heat shock) 방법에 의하여 도입하고, 암피실린 100㎍/mL이 포함된 LB 평판 배지 중에서 배양하여, 암피실린 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 최종적으로 선별된 균주를 재조합 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB로 명명하였다.

(2) P450 _CAM 유전자를 발현하는 재조합 대장균에 의한 시료 중 CHF ₃ 또는 CHCl ₃ 제거 효과

본 절에서는 (1)절에서 제작된 P450_CAM 유전자가 도입된 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB 균주가 시료 중 CHF₃ 또는 CHCl₃를 제거하는데 미치는 효과를 확인하였다. 구체적으로, 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB를 TB 배지에서 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 배양하여, OD₆₀₀=0.5 정도에서 IPTG 0.5mM를 첨가한 후, 25℃에서 230rpm으로 교반하면서 밤새 배양하였다. 이 세포를 회수하고 OD₆₀₀=2.5의 세포 농도가 되도록 4g/L 글루코스가 보충된 M9 배지 중에 현탁하였다. 이 세포액 10ml를 60ml 혈청병에 첨가하고 밀봉하였다. 상기 TB (Terrific broth) 배지는 증류수 1L 당 트립톤(tryptone) 12 g, 효모 추출물(yeast extract) 24 g, 글리세롤(glycerol) 5 g, 및 포스페이트 버퍼(phosphate buffer) 89mM의 성분을 포함하였다. 또한, 상기 M9 배지는 증류수 1L 당 Na₂HPO₄ 6g, KH₂PO₄ 3g, NaCl 0.5g, 및 NH₄Cl 1g의 성분을 포함하였다.

다음으로, 기체 상의 CHF₃를 헤드스페이스 대비 200ppm이 되도록 주사기를 사용하여 혈청병의 캡의 탄성 재질(rubber stopper)을 통하여 주입하였다. 또한, 액체 상의 CHCl₃를 배지 중 0.02mM이 되도록 주사기를 사용하여 혈청병의 캡의 탄성 재질을 통하여 주입하였다. 그 후, 상기 혈청병을 30℃에서 200rpm으로 교반하면서 18 시간 내지 152 시간 동안 배양하였다. 실험은 3배수 (triplicate)로 하였다.

배양 중 일정한 시간 간격으로 혈청병 중 배지가 포함되지 않은 헤드스페이스 중의 기체를 1.0ml 헤드스페이스용 주사기를 사용하여 0.5ml를 채취하여, GC(Agilent 7890, Palo Alto, CA, USA)에 주입하였다. 주입된 CHF₃ 또는 CHCl₃는 CP-PoraBOND Q 칼럼(25m length, 0.32mm i.d., 5um film thickness, Agilent)을 통해 분리되었고, 질량 분석(mass spectrometry)(Agilent 5973, Palo Alto, CA, USA)를 통해 CHF₃ 또는 CHCl₃ 농도 변화를 분석하였다. 운반 기체는 헬륨을 사용하였고 1.5ml/min 속도로 칼럼에 흘려 보냈다. 기체 크로마토그라피(GC) 조건은 주입구 온도 250℃, 초기 온도 40℃에 2분간 유지하고, 290℃까지 20℃/min으로 승온시켰다. 질량 분석 조건은 70eV의 이온화 에너지, interface 온도 280℃, ion source 온도 230℃, 및 quadrupole 온도 150℃였다.

도 2는 CHF₃ 함유 기체와 접촉된 배지 중에서 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB를 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CHF₃의 시간에 따른 변화를 나타낸다.

도 3a은 CHCl₃ 함유 배지 중에서 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB를 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CHCl₃의 시간에 따른 변화를 나타낸다. 도 2, 도 3a 및 도 3b에서, NC는 음성 대조군, 'CAM'은 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB를 사용한 실험을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 62시간 및 152 시간 동안 배양한 경우, 대조군에 비하여 헤드스페이스 중의 CHF₃의 농도는 각각 5.6% 및 17.3% 감소하였다. 또한, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 18시간 동안 배양한 경우, 대조군에 비하여 헤드스페이스 중의 CHCl₃의 농도는 14.8% 감소하였다.

(3) P450 _CAM 유전자를 발현하는 재조합 대장균의 시료 중 CF ₄ 제거 효과

본 절에서는 (1)절에서 제작된 P450_CAM 유전자가 도입된 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB 균주가 시료 중 CF₄를 제거하는데 미치는 효과를 확인하였다.

실험은 (2)절에서 CHF₃에 대하여 수행된 과정과 동일하게 수행하였으나, CHF₃ 대신에 CF₄를 사용하고, 기체 상의 CF₄를 헤드스페이스 대비 1000ppm이 되도록 주사기를 사용하여 혈청병의 캡의 탄성 재질을 통하여 주입하였다. 그 후, 상기 혈청병을 30℃에서 200rpm으로 교반하면서 7일 동안 배양한 것을 제외하고는 동일하게 수행하였다. 그 결과는 도 3b에 나타낸 바와 같다.

도 3b는 CF₄ 함유 기체와 접촉된 배지 중에서 대장균 BL21/pETDuet-camC-camAB를 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CF₄의 시간에 따른 변화를 나타낸다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 7일 동안 배양한 경우, 대조군에 비하여 헤드스페이스 중의 CF₄의 농도는 3.57% 감소하였다.

(4) P450 _CAM 돌연변이 유전자를 발현하는 재조합 대장균 및 그의 시료 중 CF ₄ 제거 효과

본 절에서는 P450_CAM의 시료 중 플루오로메탄 제거 활성을 개선하기 위하여 돌연변이체를 제작하였다. 서열번호 6의 아미노산 서열 중 351번 위치의 페닐알라닌(phenylalanine)(이하 "F351"이라고도 함)을 다른 19개 천연 아미노산으로 치환(이하 "F351X"라고도 한다. 여기서, X는 페닐알라닌 외의 19개 천연 아미노산을 나타낸다.)하고, 얻어진 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 대장균에 도입하여 얻어진 대장균의 시료 중 CF₄ 제거 활성을 확인하였다. camC는 헴 도메인(heme domain)에 해당하며, F351은 여러 종 유래의 camC의 아미노산 서열 중 보존된 아미노산(conserved amino acid) 중의 하나이다.

(4.1) 19개 돌연변이체의 제조

서열번호 6의 F354X 돌연변이체의 제작은 QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technology, USA)를 사용하여 이루어졌다. 상기 Kit를 사용한 위치-지향 돌연변이 유발 방법은 가장 높은 신뢰도(highest fidelity)를 갖는 두 플라스미드 가닥의 돌연변이유발성 프라이머-지향된 복제(mutagenic primer-directed replication)를 위하여 PfuUlta 고-신뢰도(high-fidelity:HF) DNA 폴리머라제를 사용하여 수행된다. 기본 과정은 원하는 삽입체(insert)를 가진 수퍼코일된 이중가닥 DNA(dsDNA) 벡터 및 둘다 원하는 돌연변이를 포함하는, 두 개 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한다. 상기 벡터의 마주보는 가닥(opposite strand)에 각각 상보적인 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 프라이머 치환(primer displacement) 없이, PfuUlta HF DNA 폴리머라제에 의한 온도 순환(temperature cycling) 동안 연장된다. 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 연장으로 인하여, 스태거 닉(staggered nick)을 포함한 돌연변이된 플라스미드가 생성된다. 상기 온도 순환 후, 산물을 DpnI으로 처리한다. DpnI 엔도뉴클레아제(표적 서열: 5'-Gm⁶ATC-3')는 메틸화 및 헤미메틸화 DNA에 특이적이고 부모(parental) DNA 주형을 분해하여 돌연변이-함유 합성된 DNA를 선택하기 위하여 사용된다. 그 후 원하는 돌연변이를 포함한 이 닉이 생성된 벡터 DNA는 XL1-Blue 수퍼콤페텐트 세포에 형질도입된다. F351X 돌연변이 유발을 위하여 사용된 각 프라이머 세트 중 시료 중 야생형 대장균 대비 플루오로메탄을 제거하는 활성이 증가된 것에 대한 것은 다음 표 6에 기재하였다.

번호	돌연변이 형태	프라이머 서열
1	F351Y	서열번호 21 및 22
2	F351T	서열번호 23 및 24
3	F351N	서열번호 25 및 26
4	F351Q	서열번호 27 및 28
5	F351H	서열번호 29 및 30
6	F351D	서열번호 31 및 32

구체적으로, (1)에서 제작된 pETDuet-camC-camAB 벡터를 주형으로 하고, 상기 표 6에 기재된 각 프라이머 세트를 프라이머로 하고 PfuUlta HF DNA 폴리머라제를 사용한 PCR을 통하여 돌연변이된 벡터를 얻었다. 이 벡터 산물을 DpnI으로 처리하여 돌연변이-함유 합성된 DNA를 선택하였다. 그 후 얻어진 원하는 돌연변이를 포함한 벡터 DNA를 XL1-Blue 수퍼콤페텐트 세포에 형질도입하여, pETDuet-camCmt-camAB 벡터를 클로닝하였다.

마지막으로, 클로닝된 pETDuet-camCmt-camAB 벡터와 pETDuet-camCwt-camAB 벡터를 (1)에 기재된 바와 동일한 과정을 거쳐서 대장균 BL21 균주에 도입하여 최종적으로 선별된 균주를 재조합 대장균 BL21/pETDuet-camCmt-camAB로 명명하였다.

(4.2) 재조합 대장균 BL21 / pETDuet - camCmt - camAB 의 시료 중 CF ₄ 제거 효과

본 절에서는 (4.1)절에서 제작된 돌연변이 camC 유전자가 도입된 대장균 BL21/pETDuet-camCmt-camAB가 시료 중 CF₄를 제거하는데 미치는 효과를 확인하였다.

실험은 (2)절에서 CHF₃에 대하여 수행된 과정과 동일하게 수행하였으나, CHF₃ 대신에 CF₄를 사용하고, 기체 상의 CF₄를 헤드스페이스 대비 1000ppm이 되도록 주사기를 사용하여 혈청병의 캡의 탄성 재질을 통하여 주입하였다. 그 후, 상기 혈청병을 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 6일 동안 배양한 것을 제외하고는 동일하게 수행하였다. 그 결과는 표 7에 나타낸 바와 같다.

번호	돌연변이 형태	CF4 잔여율(대조군 대비 백분율)	CF4 감소율(대조군 대비 백분율)
1	F351Y	91.82	8.18
2	F351T	95.42	4.58
3	F351N	92.56	7.44
4	F351Q	94.12	5.88
5	F351H	89.85	10.15
6	F351D	94.31	5.69
7	F351*	96.43	3.57

표 7에서 대조군은 pETDuet-camCmt-camAB 벡터 대신 pETDuet 벡터가 도입된 대장균이며, F351*는 야생형 camC를 나타낸다.

또한, 본 절에서는 (4.1)절에서 제작된 돌연변이 camC 유전자가 도입된 대장균 BL21/pETDuet-camCmt-camAB 20mL(OD₆₀₀=3.0)을 175mL 플라스크에 주입하고 CHF₃ 대신에 CF₄를 사용하고, 기체 상의 CF₄를 헤드스페이스 대비 1000ppm이 되도록 주입하고, 상기 혈청병을 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 6일 동안 배양한 것을 제외하고는 실험은 (2)절에서 CHF₃에 대하여 수행된 과정과 동일하게 배양하여 시간에 따른 CF4 잔여율(residual rate) 즉, CF4 잔존량 백분율(CF4 remaining, %)을 확인하였다. 그 결과는 도 3c에 나타내었다.

도 3c는 돌연변이 camC 유전자가 도입된 대장균 BL21/pETDuet-camCmt-camAB의 시간에 따른 시료 중 CF₄ 정도를 나타낸다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 6일 배양한 경우, 재조합 대장균 P450CAM 균주 즉, F351N 및 F351H 돌연변이 유전자를 함유하는 균주는 대조군 대비 CF₄의 수준을 7.02% 및 8.92% 더 감소시켰으나 야생형 균주는 대조군 대비 CF₄의 수준을 3.14% 더 감소시켰다.

실시예 2: P450 _BM3 유전자를 발현하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 시료 중 할로메탄의 제거

본 실시예에서는 P450_BM3 유전자를 발현하는 재조합 대장균을 제작하고, 그를 이용하여 시료 중 할로메탄, 즉, CHF₃, CF₄ 또는 CHCl₃의 제거 효과를 확인하였다.

(1) P450 _BM3 유전자를 발현하는 재조합 대장균의 제작

P450_BM3 유전자는 Bacillus megaterium (ATCC 14581) 균주의 P450_BM3 유전자를 증폭하였다. P450_BM3 유전자는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 각각 갖고 서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩한다. 구체적으로, B.megaterium (ATCC 14581)를 LB 배지 중에서 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 밤새 배양한 후, 총 DNA 추출 키트 (total DNA extraction kit)(Invitrogen Biotechnology)를 사용한 방법으로 게놈 DNA를 분리하고, 이 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 17 및 18의 뉴클레오티드 서열을 프라이머 세트로 하여 PCR을 수행하여, P450_BM3 유전자를 증폭하여 얻었다. 증폭된 P450_BM3 유전자는 제한효소 NcoI 및 XhoI를 사용하여 절단된 pET28a (Novagen, Cat. No.69864-3)와 InFusion Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.)를 통해 연결하여 pET28a-P450_BM3 벡터를 제조하였다. 도 4는 pET28a-P450_BM3벡터의 벡터 지도를 나타낸다.

또한, 세포 내 NADPH 양을 증가시키기 위해 E. coli K12(MG1655)의 글루코스 6-포스페이트 데히드로게나제(glucose 6-phosphate dehydrogenase)를 코딩하는 zwf 유전자를 증폭하였다. Zwf 유전자는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖고 서열번호 10의 아미노산 서열을 코딩한다. 구체적으로, E. coli를 LB 배지 중에서 37℃에서 230rpm으로 교반하면서 밤새 배양한 후, 총 DNA 추출 키트 (total DNA extraction kit)(Invitrogen Biotechnology)를 사용한 방법으로 게놈 DNA를 분리하고, 이 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19 및 20의 뉴클레오티드 서열을 프라이머 세트로 하여 PCR을 수행하여, zwf 유전자를 증폭하여 얻었다. 증폭된 zwf 유전자는 제한효소 NcoI 및 SacI를 사용하여 절단된 pACYCDuet(Novagen, Cat. No. 71147-3)와 InFusion Cloning Kit(Clontech Laboratories, Inc.)를 통해 연결하여 pACYCDuet-zwf 벡터를 제조하였다.

도 5는 pACYCDuet-zwf벡터의 벡터 지도를 나타낸다.

다음으로, 제작된 pET28a-P450_BM3 벡터를 대장균 BL21에 열 충격(heat shock) 방법으로 도입하고, 카나미신 50㎍/mL이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여, 카나미신 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 최종적으로 선별된 균주를 재조합 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3로 명명하였다.

또한, 제작된 pET28a-P450_BM3 벡터와 pACYCDuet-zwf 벡터를 대장균 BL21 균주에 열 충격 방법으로 도입하고, 카나미신 50㎍/mL과 클로람페니콜 35㎍/mL이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여, 카나미신과 클로람페니콜 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 최종적으로 선별된 균주를 재조합 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf로 명명하였다

(2) P450 _BM3 유전자를 발현하는 재조합 대장균의 시료 중 CHF ₃ 또는 CHCl ₃ 제거 효과

본 절에서는 (1)절에서 제작된 P450_BM3 유전자가 도입된 재조합 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3 균주 또는 BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf 균주가 시료 중 CHF₃ 또는 CHCl₃를 제거하는데 미치는 효과를 확인하였다.

구체적으로, 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3 또는 BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf 균주를 TB 배지에서 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 배양하여 OD₆₀₀=0.5 정도에서 IPTG 0.2mM을 첨가한 후, 25℃에서 230rpm으로 교반하면서 밤새 배양하였다. 이 세포를 수확하고, 세포 농도 OD₆₀₀= 2.5가 되도록 M9 배지 중에 현탁하였다. 이 세포액 10ml을 60ml 혈청 병에 첨가하고 밀봉하였다. 상기 TB 배지 및 M9 배지는 실시예 1에 기재된 바와 같다.

다음으로, 기체 상의 CHF₃를 헤드스페이스 대비 200ppm이 되도록 주사기를 사용하여 혈청병의 캡의 탄성 재질(rubber stopper)을 통하여 주입하였다. 또한, 액체 상의 CHCl₃를 배지 중 0.02mM이 되도록 주사기를 사용하여 혈청병의 캡의 탄성 재질을 통하여 주입하였다. 그 후, 상기 혈청병을 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 15 시간 내지 142 시간 동안 배양하였다. 실험은 3배수 (triplicate)로 하였다.

배양 중 일정한 시간 간격으로 혈청병 중 헤드스페이스 중의 CHF₃ 또는 CHCl₃를 실시예2의 (2)에 기술된 조건과 동일하게 하여 분석하였다.

도 6은 CHF₃ 함유 기체와 접촉된 배지 중에서 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3 또는 BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf 균주를 142시간 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CHF₃의 시간에 따른 변화를 나타낸다.

도 7은 CHCl₃ 함유 배지 중에서 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3을 15시간 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CHCl₃의 변화를 나타낸다. 도 6, 도 7 및 8에서, NC는 음성 대조군, 'BM3'은 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3, 및 'BM3+Zwf'는 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf를 사용한 실험을 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 70시간 및 142시간 동안 배양한 경우, 대조군에 비하여 헤드스페이스 중의 CHF₃의 농도는 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3, 및 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3+pACYCDuet-zwf에 대하여, 70시간 배양의 경우 각각 3.93% 및 4.57%, 및 142시간 배양의 경우 각각 4.15% 및 11.03% 감소하였다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, 15시간 동안 배양한 경우, 대조군에 비하여 헤드스페이스 중의 CHCl₃의 농도는 4.1% 감소하였다.

(3) P450 _BM3 유전자를 발현하는 재조합 대장균의 시료 중 CF ₄ 제거 효과

본 절에서는 (1)절에서 제작된 P450_BM3 유전자가 도입된 재조합 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3 균주가 시료 중 CF₄를 제거하는데 미치는 효과를 확인하였다.

실험은 (2)절에서 CHF₃에 대하여 수행된 과정과 동일하게 수행하였으나, CHF₃ 대신에 CF₄를 사용하고, 기체 상의 CF₄를 헤드스페이스 대비 1000ppm이 되도록 주사기를 사용하여 혈청병의 캡의 탄성 재질을 통하여 주입하고, 그 후, 상기 혈청병을 30℃에서 200rpm으로 교반하면서 7일 동안 배양한 것을 제외하고는 동일하게 수행하였다. 그 결과는 도 8에 나타낸 바와 같다.

도 8은 CF₄ 함유 기체와 접촉된 배지 중에서 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3 균주를 7일 동안 배양한 경우, 헤드스페이스 중의 CF₄의 시간에 따른 변화를 나타낸다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 7일 동안 배양한 경우, 대조군에 비하여 헤드스페이스 중의 CF₄의 농도는 대장균 BL21/pET28a-P450_BM3에 대하여, 3.03% 감소하였다.

(4) P450 _BM3 돌연변이 유전자를 발현하는 재조합 대장균 및 그의 시료 중 CF ₄ 제거 효과

본 절에서는 P450_BM3의 시료 중 플루오로메탄 제거 활성을 개선하기 위하여 돌연변이체를 제작하였다. 서열번호 8의 아미노산 서열 중 320번 위치의 아스파라긴(asparagine)(이하 "N320"이라고도 함)을 다른 19개 천연 아미노산으로 치환(이하 "N320X"라고도 한다. 여기서, X는 아스파라긴 외의 19개 천연 아미노산을 나타낸다.)하고, 얻어진 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 대장균에 도입하여 얻어진 대장균의 시료 중 CF₄ 제거 활성을 확인하였다. N320은 헴 도메인 P450 옥시게나제 도메인에 포함되어 있으며, N320은 동일 기능을 갖는 효소의 아미노산 서열 중 보존된 아미노산(conserved amino acid) 중의 하나이다.

(4.1) 19개 돌연변이체의 제조

서열번호 8의 N320X 돌연변이체의 제작은 QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technology, USA)를 사용하여 이루어졌다. 상기 Kit를 사용한 돌연변이 유발법은 상기한 바와 같다.

N320X 돌연변이 유발을 위하여 사용된 각 프라이머 세트 중 시료 중 야생형 대장균 대비 플루오로메탄을 제거하는 활성이 증가된 것에 대한 것은 다음 표 3에 기재하였다.

번호	돌연변이 형태	프라이머 서열
1	N320W	서열번호 33 및 34
2	N320F	서열번호 35 및 36
3	N320G	서열번호 37 및 38
4	N320P	서열번호 39 및 40
5	N320S	서열번호 41 및 42
6	N320E	서열번호 43 및 44

구체적으로, (1)에서 제작된 pET28a-P450BM3 벡터를 주형으로 하고, 상기 표8에 기재된 각 프라이머 세트를 프라이머로 하고 PfuUlta HF DNA 폴리머라제를 사용한 PCR을 통하여 돌연변이된 벡터를 얻었다. 이 벡터 산물을 DpnI으로 처리하여 돌연변이-함유 합성된 DNA를 선택하였다. 그 후 얻어진 원하는 돌연변이를 포함한 벡터 DNA를 XL1-Blue 수퍼콤페텐트 세포에 형질도입하여, pET28a-P450BM3mt 벡터를 클로닝하였다.

마지막으로, 클로닝된 pET28a-P450BM3 벡터와 pET28a-P450BM3mt 벡터를 (1)에 기재된 바와 동일한 과정을 거쳐서 대장균 BL21 균주에 도입하여 최종적으로 선별된 균주를 재조합 대장균 BL21/pET28a-P450BM3mt로 명명하였다.

(4.2) 재조합 대장균 BL21 / pET28a - P450BM3mt 의 시료 중 CF ₄ 제거 효과

본 절에서는 (4.1)절에서 제작된 돌연변이 P450BM3mt 유전자가 도입된 대장균 BL21/pET28a-P450BM3mt가 시료 중 CF₄를 제거하는데 미치는 효과를 확인하였다.

실험은 (2)절에서 CHF₃에 대하여 수행된 과정과 동일하게 수행하였으나, CHF₃ 대신에 CF₄를 사용하고, 기체 상의 CF₄를 헤드스페이스 대비 1000ppm이 되도록 주사기를 사용하여 혈청병의 캡의 탄성 재질을 통하여 주입하였다. 그 후, 상기 혈청병을 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 6일 동안 배양한 것을 제외하고는 동일하게 수행하였다. 그 결과는 표 9에 나타낸 바와 같다.

번호	돌연변이 형태	CF4 잔여율(대조군 대비 백분율)	CF4 감소율(대조군 대비 백분율)
1	N320W	94.42	5.58
2	N320F	87.38	12.62
3	N320G	89.82	10.18
4	N320P	86.89	13.11
5	N320S	82.03	17.97
6	N320E	88.48	11.52
7	N320*	96.97	3.03

표 9에서 대조군은 pET28a-P450BM3mt 벡터 대신 pET28a 벡터가 도입된 대장균이며, N320*는 야생형 P450BM3를 나타낸다.

또한, 본 절에서는 (4.1)절에서 제작된 돌연변이 P450BM3 유전자가 도입된 대장균 BL21/pET28a-P450BM3mt 100mL(OD₆₀₀=15.0)을 250mL 플라스크에 주입하고 CHF₃ 대신에 CF₄를 사용하고, 기체 상의 CF₄를 헤드스페이스 대비 1000ppm이 되도록 주입하고, 상기 혈청병을 30℃에서 230rpm으로 교반하면서 48시간 동안 배양한 것을 제외하고는 실험은 (2)절에서 CHF₃에 대하여 수행된 과정과 동일하게 배양하여 시간에 따른 CF4 잔여율(residual rate) 즉, CF4 잔존량 백분율(CF4 remaining, %)을 확인하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.

도 9는 돌연변이 P450BM3 유전자가 도입된 대장균 BL21/pET28a-P450BM3mt의 시간에 따른 시료 중 CF₄ 정도를 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 48시간 배양한 경우, 재조합 대장균 P450BM3 균주 즉, N320E 돌연변이 유전자를 함유하는 균주는 대조군 대비 CF₄의 수준을 14.3% 더 감소시켰으나 야생형 균주는 대조군 대비 CF₄의 수준을 5.5% 더 감소시켰다.

<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Bacterial cytochrome 450 protein and method for reducing concentration of fluorinated methane in sample <130> PN114291KR <160> 56 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1269 <212> DNA <213> P. putida PpG786 strain DSM 7162 <400> 1 atgaacgcaa acgacaacgt ggtcatcgtc ggtaccggac tggctggcgt tgaggtcgcc 60 ttcggcctgc gcgccagcgg ctgggaaggc aatatccggt tggtggggga tgcgacggta 120 attccccatc acctaccacc gctatccaaa gcttacttgg ccggcaaagc cacagcggaa 180 agcctgtacc tgagaacccc agatgcctat gcagcgcaga acatccaact actcggaggc 240 acacaggtaa cggctatcaa ccgcgaccga cagcaagtaa tcctatcgga tggccgggca 300 ctggattacg accggctggt attggctacc ggagggcgtc caagacccct accggtggcc 360 agtggcgcag ttggaaaggc gaacaacttt cgatacctgc gcacactcga ggacgccgag 420 tgcattcgcc ggcagctgat tgcggataac cgtctggtgg tgattggtgg cggctacatt 480 ggccttgaag tggctgccac cgccatcaag gcgaacatgc acgtcaccct gcttgatacg 540 gcagcccggg ttctggagcg ggttaccgcc ccgccggtat cggcctttta cgagcaccta 600 caccgcgaag ccggcgttga catacgaacc 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Ala Thr Val Ile Pro His His Leu Pro Pro Leu 35 40 45 Ser Lys Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Ala Thr Ala Glu Ser Leu Tyr Leu 50 55 60 Arg Thr Pro Asp Ala Tyr Ala Ala Gln Asn Ile Gln Leu Leu Gly Gly 65 70 75 80 Thr Gln Val Thr Ala Ile Asn Arg Asp Arg Gln Gln Val Ile Leu Ser 85 90 95 Asp Gly Arg Ala Leu Asp Tyr Asp Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Gly 100 105 110 Arg Pro Arg Pro Leu Pro Val Ala Ser Gly Ala Val Gly Lys Ala Asn 115 120 125 Asn Phe Arg Tyr Leu Arg Thr Leu Glu Asp Ala Glu Cys Ile Arg Arg 130 135 140 Gln Leu Ile Ala Asp Asn Arg Leu Val Val Ile Gly Gly Gly Tyr Ile 145 150 155 160 Gly Leu Glu Val Ala Ala Thr Ala Ile Lys Ala Asn Met His Val Thr 165 170 175 Leu Leu Asp Thr Ala Ala Arg Val Leu Glu Arg Val Thr Ala Pro Pro 180 185 190 Val Ser Ala Phe Tyr Glu His Leu His Arg Glu Ala Gly Val Asp Ile 195 200 205 Arg Thr Gly Thr Gln Val Cys Gly Phe Glu Met Ser Thr Asp Gln Gln 210 215 220 Lys Val Thr Ala Val Leu Cys Glu Asp Gly Thr Arg Leu Pro Ala Asp 225 230 235 240 Leu Val Ile Ala Gly Ile Gly Leu 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atgggtagac tccattactg aggcgtgggc gatggacaat 1380 gatgcgccga aaccgtatca ggccggaacc tggggacccg ttgcctcggt ggcgatgatt 1440 acccgtgatg gtcgttcctg gaatgagttt gagtaa 1476 <210> 10 <211> 491 <212> PRT <213> E. coli K12 (MG1655) <400> 10 Met Ala Val Thr Gln Thr Ala Gln Ala Cys Asp Leu Val Ile Phe Gly 1 5 10 15 Ala Lys Gly Asp Leu Ala Arg Arg Lys Leu Leu Pro Ser Leu Tyr Gln 20 25 30 Leu Glu Lys Ala Gly Gln Leu Asn Pro Asp Thr Arg Ile Ile Gly Val 35 40 45 Gly Arg Ala Asp Trp Asp Lys Ala Ala Tyr Thr Lys Val Val Arg Glu 50 55 60 Ala Leu Glu Thr Phe Met Lys Glu Thr Ile Asp Glu Gly Leu Trp Asp 65 70 75 80 Thr Leu Ser Ala Arg Leu Asp Phe Cys Asn Leu Asp Val Asn Asp Thr 85 90 95 Ala Ala Phe Ser Arg Leu Gly Ala Met Leu Asp Gln Lys Asn Arg Ile 100 105 110 Thr Ile Asn Tyr Phe Ala Met Pro Pro Ser Thr Phe Gly Ala Ile Cys 115 120 125 Lys Gly Leu Gly Glu Ala Lys Leu Asn Ala Lys Pro Ala Arg Val Val 130 135 140 Met Glu Lys Pro Leu Gly Thr Ser Leu Ala Thr Ser Gln Glu Ile Asn 145 150 155 160 Asp Gln Val Gly Glu 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ttcaccgagg actacgccga acccttcccg 480 atacgcatct tcatgctgct cgcaggtcta ccggaagaag atatcccgca cttgaaatac 540 ctaacggatc agatgacccg tccggatggc agcatgacct tcgcagaggc caaggaggcg 600 ctctacgact atctgatacc gatcatcgag caacgcaggc agaagccggg aaccgacgct 660 atcagcatcg ttgccaacgg ccaggtcaat gggcgaccga tcaccagtga cgaagccaag 720 aggatgtgtg gcctgttact ggtcggcggc ctggatacgg tggtcaattt cctcagcttc 780 agcatggagt tcctggccaa aagcccggag catcgccagg agctgatcga gcgtcccgag 840 cgtattccag ccgcttgcga ggaactactc cggcgcttct cgctggttgc cgatggccgc 900 atcctcacct ccgattacga gtttcatggc gtgcaactga agaaaggtga ccagatcctg 960 ctaccgcaga tgctgtctgg cctggatgag cgcgaaaacg cctgcccgat gcacgtcgac 1020 ttcagtcgcc aaaaggtttc acacaccacc tatggccacg gcagccatct gtgccttggc 1080 cagcacctgg cccgccggga aatcatcgtc accctcaagg aatggctgac caggattcct 1140 gacttctcca ttgccccggg tgcccagatt cagcacaaga gcggcatcgt cagcggcgtg 1200 caggcactcc ctctggtctg ggatccggcg actaccaaag cggtataa 1248 <210> 52 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CamC F351T <400> 52 atgacgactg aaaccataca aagcaacgcc aatcttgccc ctctgccacc ccatgtgcca 60 gagcacctgg tattcgactt cgacatgtac aatccgtcga atctgtctgc cggcgtgcag 120 gaggcctggg cagttctgca agaatcaaac gtaccggatc tggtgtggac tcgctgcaac 180 ggcggacact ggatcgccac tcgcggccaa ctgatccgtg aggcctatga agattaccgc 240 cacttttcca gcgagtgccc gttcatccct cgtgaagccg gcgaagccta cgacttcatt 300 cccacctcga tggatccgcc cgagcagcgc cagtttcgtg cgctggccaa ccaagtggtt 360 ggcatgccgg tggtggataa gctggagaac cggatccagg agctggcctg ctcgctgatc 420 gagagcctgc gcccgcaagg acagtgcaac ttcaccgagg actacgccga acccttcccg 480 atacgcatct tcatgctgct cgcaggtcta ccggaagaag atatcccgca cttgaaatac 540 ctaacggatc agatgacccg tccggatggc agcatgacct tcgcagaggc caaggaggcg 600 ctctacgact atctgatacc gatcatcgag caacgcaggc agaagccggg aaccgacgct 660 atcagcatcg ttgccaacgg ccaggtcaat gggcgaccga tcaccagtga cgaagccaag 720 aggatgtgtg gcctgttact ggtcggcggc ctggatacgg tggtcaattt cctcagcttc 780 agcatggagt tcctggccaa aagcccggag catcgccagg agctgatcga gcgtcccgag 840 cgtattccag ccgcttgcga ggaactactc cggcgcttct cgctggttgc cgatggccgc 900 atcctcacct ccgattacga gtttcatggc gtgcaactga agaaaggtga ccagatcctg 960 ctaccgcaga tgctgtctgg cctggatgag cgcgaaaacg cctgcccgat gcacgtcgac 1020 ttcagtcgcc aaaaggtttc acacaccacc accggccacg gcagccatct gtgccttggc 1080 cagcacctgg cccgccggga aatcatcgtc accctcaagg aatggctgac caggattcct 1140 gacttctcca ttgccccggg tgcccagatt cagcacaaga gcggcatcgt cagcggcgtg 1200 caggcactcc ctctggtctg ggatccggcg actaccaaag cggtataa 1248 <210> 53 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CamC F351N <400> 53 atgacgactg aaaccataca aagcaacgcc aatcttgccc ctctgccacc ccatgtgcca 60 gagcacctgg tattcgactt cgacatgtac aatccgtcga atctgtctgc cggcgtgcag 120 gaggcctggg cagttctgca agaatcaaac gtaccggatc tggtgtggac tcgctgcaac 180 ggcggacact ggatcgccac tcgcggccaa ctgatccgtg aggcctatga agattaccgc 240 cacttttcca gcgagtgccc gttcatccct cgtgaagccg gcgaagccta cgacttcatt 300 cccacctcga tggatccgcc cgagcagcgc cagtttcgtg cgctggccaa ccaagtggtt 360 ggcatgccgg tggtggataa gctggagaac cggatccagg agctggcctg ctcgctgatc 420 gagagcctgc gcccgcaagg acagtgcaac ttcaccgagg actacgccga acccttcccg 480 atacgcatct tcatgctgct cgcaggtcta ccggaagaag atatcccgca cttgaaatac 540 ctaacggatc agatgacccg tccggatggc agcatgacct tcgcagaggc caaggaggcg 600 ctctacgact atctgatacc gatcatcgag caacgcaggc agaagccggg aaccgacgct 660 atcagcatcg ttgccaacgg ccaggtcaat gggcgaccga tcaccagtga cgaagccaag 720 aggatgtgtg gcctgttact ggtcggcggc ctggatacgg tggtcaattt cctcagcttc 780 agcatggagt tcctggccaa aagcccggag catcgccagg agctgatcga gcgtcccgag 840 cgtattccag ccgcttgcga ggaactactc cggcgcttct cgctggttgc cgatggccgc 900 atcctcacct ccgattacga gtttcatggc gtgcaactga agaaaggtga ccagatcctg 960 ctaccgcaga tgctgtctgg cctggatgag cgcgaaaacg cctgcccgat gcacgtcgac 1020 ttcagtcgcc aaaaggtttc acacaccacc aacggccacg gcagccatct gtgccttggc 1080 cagcacctgg cccgccggga aatcatcgtc accctcaagg aatggctgac caggattcct 1140 gacttctcca ttgccccggg tgcccagatt cagcacaaga gcggcatcgt cagcggcgtg 1200 caggcactcc ctctggtctg ggatccggcg actaccaaag cggtataa 1248 <210> 54 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CamC F351Q <400> 54 atgacgactg aaaccataca aagcaacgcc aatcttgccc ctctgccacc ccatgtgcca 60 gagcacctgg tattcgactt cgacatgtac aatccgtcga atctgtctgc cggcgtgcag 120 gaggcctggg cagttctgca agaatcaaac gtaccggatc tggtgtggac tcgctgcaac 180 ggcggacact ggatcgccac tcgcggccaa ctgatccgtg aggcctatga agattaccgc 240 cacttttcca gcgagtgccc gttcatccct cgtgaagccg gcgaagccta cgacttcatt 300 cccacctcga tggatccgcc cgagcagcgc cagtttcgtg cgctggccaa ccaagtggtt 360 ggcatgccgg tggtggataa gctggagaac cggatccagg agctggcctg ctcgctgatc 420 gagagcctgc gcccgcaagg acagtgcaac ttcaccgagg actacgccga acccttcccg 480 atacgcatct tcatgctgct cgcaggtcta ccggaagaag atatcccgca cttgaaatac 540 ctaacggatc agatgacccg tccggatggc agcatgacct tcgcagaggc caaggaggcg 600 ctctacgact atctgatacc gatcatcgag caacgcaggc agaagccggg aaccgacgct 660 atcagcatcg ttgccaacgg ccaggtcaat gggcgaccga tcaccagtga cgaagccaag 720 aggatgtgtg gcctgttact 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cgtgaagccg gcgaagccta cgacttcatt 300 cccacctcga tggatccgcc cgagcagcgc cagtttcgtg cgctggccaa ccaagtggtt 360 ggcatgccgg tggtggataa gctggagaac cggatccagg agctggcctg ctcgctgatc 420 gagagcctgc gcccgcaagg acagtgcaac ttcaccgagg actacgccga acccttcccg 480 atacgcatct tcatgctgct cgcaggtcta ccggaagaag atatcccgca cttgaaatac 540 ctaacggatc agatgacccg tccggatggc agcatgacct tcgcagaggc caaggaggcg 600 ctctacgact atctgatacc gatcatcgag caacgcaggc agaagccggg aaccgacgct 660 atcagcatcg ttgccaacgg ccaggtcaat gggcgaccga tcaccagtga cgaagccaag 720 aggatgtgtg gcctgttact ggtcggcggc ctggatacgg tggtcaattt cctcagcttc 780 agcatggagt tcctggccaa aagcccggag catcgccagg agctgatcga gcgtcccgag 840 cgtattccag ccgcttgcga ggaactactc cggcgcttct cgctggttgc cgatggccgc 900 atcctcacct ccgattacga gtttcatggc gtgcaactga agaaaggtga ccagatcctg 960 ctaccgcaga tgctgtctgg cctggatgag cgcgaaaacg cctgcccgat gcacgtcgac 1020 ttcagtcgcc aaaaggtttc acacaccacc catggccacg gcagccatct gtgccttggc 1080 cagcacctgg cccgccggga aatcatcgtc accctcaagg aatggctgac caggattcct 1140 gacttctcca ttgccccggg tgcccagatt cagcacaaga gcggcatcgt cagcggcgtg 1200 caggcactcc ctctggtctg ggatccggcg actaccaaag cggtataa 1248 <210> 56 <211> 1248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CamC F351D <400> 56 atgacgactg aaaccataca aagcaacgcc aatcttgccc ctctgccacc ccatgtgcca 60 gagcacctgg tattcgactt cgacatgtac aatccgtcga atctgtctgc cggcgtgcag 120 gaggcctggg cagttctgca agaatcaaac gtaccggatc tggtgtggac tcgctgcaac 180 ggcggacact ggatcgccac tcgcggccaa ctgatccgtg aggcctatga agattaccgc 240 cacttttcca gcgagtgccc gttcatccct cgtgaagccg gcgaagccta cgacttcatt 300 cccacctcga tggatccgcc cgagcagcgc cagtttcgtg cgctggccaa ccaagtggtt 360 ggcatgccgg tggtggataa gctggagaac cggatccagg agctggcctg ctcgctgatc 420 gagagcctgc gcccgcaagg acagtgcaac ttcaccgagg actacgccga acccttcccg 480 atacgcatct tcatgctgct cgcaggtcta ccggaagaag atatcccgca cttgaaatac 540 ctaacggatc agatgacccg tccggatggc agcatgacct tcgcagaggc caaggaggcg 600 ctctacgact atctgatacc gatcatcgag caacgcaggc agaagccggg aaccgacgct 660 atcagcatcg ttgccaacgg ccaggtcaat gggcgaccga tcaccagtga cgaagccaag 720 aggatgtgtg gcctgttact ggtcggcggc ctggatacgg tggtcaattt cctcagcttc 780 agcatggagt tcctggccaa aagcccggag catcgccagg agctgatcga gcgtcccgag 840 cgtattccag ccgcttgcga ggaactactc cggcgcttct cgctggttgc cgatggccgc 900 atcctcacct ccgattacga gtttcatggc gtgcaactga agaaaggtga ccagatcctg 960 ctaccgcaga tgctgtctgg cctggatgag cgcgaaaacg cctgcccgat gcacgtcgac 1020 ttcagtcgcc aaaaggtttc acacaccacc gatggccacg gcagccatct gtgccttggc 1080 cagcacctgg cccgccggga aatcatcgtc accctcaagg aatggctgac caggattcct 1140 gacttctcca ttgccccggg tgcccagatt cagcacaaga gcggcatcgt cagcggcgtg 1200 caggcactcc ctctggtctg ggatccggcg actaccaaag cggtataa 1248

Claims

박테리아 시토크롬 P450 단백질의 변이체를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물로서, 상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산 서열의 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖고 EC 1.14.15.1에 속하는 활성을 갖는 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 변경은 상기 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 Y, T, N, Q, H, 또는 D로 치환인 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 변경은 F351Y, F351T, F351N, F351Q, F351H, 또는 F351D 치환인 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, P450 CamA를 코딩하는 외래 유전자, 및 P450 CamB를 코딩하는 외래 유전자를 더 포함하는 것인 미생물.
청구항 1에 있어서, EC 1.1.1.49에 속하는 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 더 포함하는 것인 미생물.
시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)으로 표시되는 플루오로메탄을 제거하는데 사용하기 위한 재조합 P450 단백질의 변이체를 포함하는 조성물로서, 상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산 서열의 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖고 EC 1.14.15.1에 속하는 활성을 갖는 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 재조합 P450 단백질의 변이체는 외래 유전자로부터 발현된 박테리아 시토크롬 P450 단백질의 변이체를 포함하고 있는 재조합 미생물의 형태인 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 아미노산 변경은 상기 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 Y, T, N, Q, H, 또는 D로 치환인 것인 미생물.
청구항 6에 있어서, 상기 아미노산 변경은 F351Y, F351T, F351N, F351Q, F351H, 또는 F351D 치환인 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 시료는 액체 또는 기체 상태인 것인 조성물.
청구항 6에 있어서, 상기 미생물은 Escherichia 속 미생물인 것인 조성물.
재조합 P450 단백질의 변이체를 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)으로 표시되는 플루오로메탄 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 플루오로메탄의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 플루오로메탄의 농도를 감소시키는 방법으로서, 상기 변이체는 서열번호 6의 아미노산 서열의 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖고 EC 1.14.15.1에 속하는 활성을 갖는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 수행되는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 재조합 P450 단백질의 변이체는 발현된 박테리아 시토크롬 P450 단백질의 변이체를 포함하고 있는 재조합 미생물의 형태인 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 재조합 미생물이 생존가능한 조건에서 수행되는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 접촉은 상기 플루오로메탄의 존재하에서 미생물을 배양하는 것인 방법.
청구항 14에 있어서, 상기 시료는 공장 폐수 또는 폐기체인 것인 방법.
서열번호 6의 아미노산 서열의 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖고 EC 1.14.15.1에 속하는 박테리아 P450CamC의 변이체.
서열번호 6의 아미노산 서열의 F351 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖고 EC 1.14.15.1에 속하는 박테리아 P450CamC의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.