KR20180041008A - 데할로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 플루오로화 메탄의 농도를 감소시키는 방법 - Google Patents

데할로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 플루오로화 메탄의 농도를 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

데할로게나제 변이체, 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또한, 데할로게나제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 상기 미생물을 포함하는 조성물, 상기 미생물을 이용하여 플루오로화 메탄의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

데할로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 플루오로화 메탄의 농도를 감소시키는 방법{Dehalogenase variant, polynucleotide coding the variant, microorganism including genetic modification having the polynucleotide, composition including the microorganism and method for reducing concentration of fluorinated methane in sample using the same}
데할로게나제 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 플로오르화 메탄의 농도를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
지구의 온난화를 가속시키는 온실가스의 배출은 심각한 환경 문제 중의 하나이며 이를 규제하고 방지하기 위해서 온실가스 배출량에 대한 규제가 강화되고 있다. 이 중 퍼플루오로카본(perfluorocarbons: PFCs), 히드로플루오로카본(hydrofluorocarbons: HFCs), 설퍼 헥사플루오리드(sulfur hexafluoride: SF6)와 같은 불화가스 (F-가스)는 절대 배출량은 낮으나 반감기가 길고 지구온난화 계수가 월등히 높아 더욱 심각한 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. F-가스의 주요 배출원인 반도체 및 전자 산업 분야 등에서 F-가스의 발생량은 온실가스 배출 할당량을 초과하여 증가 추세에 있고 이에 따라 온실가스 분해 및 배출권 구입에 필요한 비용 부담이 매년 증가하고 있는 상황이다. 기존의 F-가스 분해는 열분해 또는 촉매열산화 공정을 이용하고 있으나 제한된 분해율 및 2차 유해물질 배출, 고비용 등의 한계가 존재한다. 이를 해결하기 위해 미생물 생촉매를 이용한 생물학적 F-가스 분해 공정의 도입으로 기존의 화학적 분해 공정의 한계를 극복하고 보다 경제적이고 친환경적인 F-가스의 처리가 가능할 것으로 보인다.
상기 데할로게나제는 히드록실라제의 일종으로서, 기질로부터 염소, 브롬 또는 요오드 원자의 제거를 촉매하는 효소의 일 타입이다. 그러나, 상기 데할로게나제가 기질로부터 플루오로 원자의 제거를 촉매하는 것은 알려져 있지 않다. 또한, 상기한 종래 기술에 의하더라도 플루오로화 메탄에 작용하는 데할로게나제 유전자를 포함한 미생물, 그를 이용한 시료 중 플루오로화 메탄의 농도를 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 대하여는 개시된 바 없다.
일 양상은 데할로게나제(dehalogenase) 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 데할로게나제 변이체를 제공한다.
다른 양상은 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 양상은 데할로게나제의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기 데할로게나제 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 데할로게나제 변이체를 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수) 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)의 농도를 감소시키는 단계를 포함하는, 시료 중 CHnF4-n의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출 가능한 증가를 나타낸다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)" 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소의 수준보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낸다. "세포의 활성"이란 세포의 특정 폴리펩티드, 단백질 또는 효소의 활성을 나타낸다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 폴리펩티드, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 폴리펩티드, 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 폴리펩티드, 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 폴리펩티드, 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 미생물에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 폴리펩티드 또는 단백질 (예를 들면, 데할로게나제 변이체)의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 미생물을 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다. 동일한 비교가 다른 유전적 변형에도 적용된다.
용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 gDNA 및 cDNA와 같은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하며, 폴리뉴클레오티드의 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다.
용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전 물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.
일 양상은 데할로게나제(dehalogenase) 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 데할로게나제 변이체를 제공한다.
데할로게나제는 기질로부터 플루오로, 염소, 브롬, 또는 요오드 원자의 제거를 촉매하는 효소의 일 타입이다. 클로로포름 리덕티브 데할로게나제는 EC1.97.1.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 데할로게나제일 수 있고, 예를 들면 클로로포름 리덕티브 데할로게나제(chloroform reductive dehalogenase: CfrA)일 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 Dehalobacter 속 미생물, 즉 Dehalobacter sp. CF, Dehalobacter restrictus PER K23, Dehalobacter sp. E1, Dehalobacter sp. TCA1, Dehalobacter sp. MS Dehalobacter sp. WL 등에서 유래한 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기는, 서열번호 1의 아미노산 서열의 다른 위치에 해당하는 아미노산 잔기에 비하여 기질과의 가까운 거리에 위치할 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 유도하여, 기질과의 결합을 강화시키거나, 또는 기질과의 거리를 더욱 단축시킬 수 있다.
상기 아미노산 변경은 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서, 다른 아미노산, 예를 들면 19개의 천연 아미노산으로 치환한 것일 수 있다.
상기 아미노산 변경은 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 W, Y279 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 K, E302 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 Q, R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 I, Q, E 또는 S, 또는 그의 조합으로 치환인 것일 수 있다. 상기 아미노산 변경은 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184W, Y279K, E302Q, R305I, R305Q, R305E 또는 R305S, 또는 그의 조합으로 치환인 것일 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체는, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖을 수 있거나, A184W 치환을 갖을 수 있거나, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖을 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 Y279 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖을 수 있거나, Y279K 치환을 갖을 수 있거나, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖을 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 E302 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖을 수 있거나, E302Q 치환을 갖을 수 있고, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖을 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖을 수 있거나, R305I, R305Q, R305E 또는 R305S 치환을 갖을 수 있거나, 또는 서열번호 6, 25, 26 또는 27의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 서열번호 3 내지 6, 및 25 내지 27의 아미노산 서열은, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 각각의 위치에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 데할로게나제 변이체를 개시한 것이나, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302 및 R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기로 이루어진 군에서, 2종의 아미노산 변경, 3종의 아미노산 변경, 4종의 아미노산 변경 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 데할로게나제 변이체은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 또는 야생형 데할로게나제에 비하여 데할로게나제 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 데할로게나제 변이체는 기질로부터 플루오로 원자의 제거를 촉매하는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 데할로게나제 변이체는 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)로부터 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)의 농도를 감소시키는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 제외한 서열에 대하여, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Dehalobacter 속 미생물, 즉 Dehalobacter sp. CF, Dehalobacter restrictus PER K23, Dehalobacter sp. E1, Dehalobacter sp. TCA1, Dehalobacter sp. MS Dehalobacter sp. WL 등에서 유래한 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포인 재조합 미생물에 대하여 코돈 최적화된 것일 수 있다. 코돈 최적화란 동일한 아미노산을 코딩하지만 내재적 코돈 중 하나 이상이 해당 숙주에서 발현에 유리한 코돈으로 치환된 유전자를 생성하는 것을 나타낸다.
상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184W 치환을 갖거나, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다. 이 유전자는 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 Y279K 치환을 갖거나, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다. 이 유전자는 서열번호 8 또는 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 E302Q 치환을 갖거나, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다. 이 유전자는 서열번호 10 또는 11의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305I, R305Q, R305E 또는 R305S 치환을 갖거나, 또는 서열번호 6, 25, 26 또는 27의 아미노산 서열을 갖는 변이체를 코딩하는 유전자일 수 있다. 이 유전자는 서열번호 12, 13 또는 14의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 15 또는 16의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 17 또는 18의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 19, 20, 21, 22, 23 또는 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 550 내지 552번째 GCG가 TGG로 치환되거나, 835 내지 837번째 TAC가 AAA 또는 AAG로 치환되거나, 904 내지 906번째 GAA가 CAA 또는 CAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 ATT, ATC 또는 ATA로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 CAA 또는 CAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 GAA 또는 GAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 AGT, AGC, TCT, TCC, TCA 또는 TCG로 치환되거나, 또는 그의 조합인 것일 수 있다.
용어 "해당하는(corresponding)"은, BLAST 페어와이즈 정렬, 또는 잘 알려진 리프만-피어슨 단백질 정렬(Lipman-Pearson Protein Alignment) 프로그램과 같은 당업계에서 수용될 수 있는(art-acceptable) 단백질 정렬 프로그램(protein alignment program)을 하기 정렬 파라미터을 가지고 이용하여 관심 대상 단백질과 표준 단백질의 아미노산 서열(예, 서열번호 1)을 정렬하였을 때, 표준 단백질의 언급된 위치(예, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치)와 정렬하는 관심 대상 단백질의 아미노산 위치를 나타낸다. 표준서열이 저장된 데이터베이스(DB)는 NCBI의 RefSeq non-redundant proteins일 수 있다. 서열의 정렬에 사용되는 파라미터는 다음과 같을 수 있다: Ktuple=2, Gap Penalty=4, 및 Gap length penalty=12. 이때는 상기 "해당하는" 서열에 포함되는 범위는 E-value 0.00001 및 H-value 0.001의 범위 속하는 것일 수 있다.
상기 정렬 조건에 따라 얻어진 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 갖는 단백질 (이하, 이들을 "cfrA A184의 호모로그(homolog)"라 한다)의 예는 아래 표와 같다.
번호 NCBI ID
1 putative PceA [Dehalobacter sp. UNSWDHB] EQB22800.1
2 1,1-dichloroethane reductive dehalogenase WP_015043247.1
상기 정렬 조건에 따라 얻어진 서열번호 1의 아미노산 서열의 Y279 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 갖는 단백질 (이하, 이들을 "cfrA Y279의 호모로그(homolog)"라 한다)의 예는 아래 표와 같다.
번호 NCBI ID
1 1,1-dichloroethane dehalogenase WP_034377773.1
2 chloroform and 1,1,1-trichloroethane reductive dehalogenase AGO27983.1
상기 정렬 조건에 따라 얻어진 서열번호 1의 아미노산 서열의 E302 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 갖는 단백질 (이하, 이들을 "cfrA E302의 호모로그(homolog)"라 한다)의 예는 아래 표와 같다.
번호 NCBI ID
1 1,1-dichloroethane dehalogenase [Dehalobacter restrictus] WP_025205280.1
2 reductive dehalogenase [Desulfosporosinus orientis DSM 765] AET69295.1
상기 정렬 조건에 따라 얻어진 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 갖는 단백질 (이하, 이들을 "cfrA R305의 호모로그(homolog)"라 한다)의 예는 아래 표와 같다.
번호 NCBI ID
1 dehalogenase [Gracilibacter sp. BRH_c7a] KUO60930 .1
2 reductive dehalogenase [Dehalobacter] WP _015044413.1
다른 양상은 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 터미네이터, 인핸서, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 상기 벡터는 복제기점, 전사 조절 부위, 다중 클로닝 부위, 선별 마커, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 데할로게나제의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물을 제공한다. 상기 유전적 변형은 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다. 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302 및 R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기로 이루어진 군에서, 1종 이상의 아미노산 변경을 갖는 데할로게나제 변이체를 코딩하는 외인성 유전자를 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 아미노산 변경은 상기 A184W, Y279K, E302Q, R305I, R305Q, R305E 또는 R305S, 또는 그의 조합으로 치환인 것일 수 있다.
상기 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 550 내지 550번째 GCG가 TGG로 치환되거나, 835 내지 837번째 TAC가 AAA 또는 AAG로 치환되거나, 904 내지 906번째 GAA가 CAA 또는 CAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 ATT, ATC 또는 ATA로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 CAA 또는 CAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 GAA 또는 GAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 AGT, AGC, TCT, TCC, TCA 또는 TCG로 치환되거나, 또는 그의 조합인 것인 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
상기 유전자는 외인성(exogenous)일 수 있다. 외인성 유전자는 외부로부터 세포 내로 도입되는 유전자를 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. "이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.
상기 재조합 미생물은 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 외인성 유전자를 하나 이상, 예를 들면, 2 이상, 3 이상, 3 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 10 이상, 또는 50 이상 포함할 수 있다. 상기 미생물에 복수 개의 유전자가 포함되는 경우, 이들은 서로 다른 유전자일 수 있다. 상기 유전자는 상기 재조합 미생물의 게놈에 통합되거나, 그와 독립적으로 존재하는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 미세적 크기를 갖는 원핵생물, 진핵생물 세포 또는 유기체를 포함할 수 있다. 상기 미생물은 고세균, 진정세균, 또는 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물을 포함할 수 있다. 상기 미생물은 혐기 배양이 가능한 미생물일 수 있다.
상기 재조합 미생물은 박테리아 또는 진균(fungi)일 수 있다. 상기 박테리아는 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 상기 박테리아는 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 패밀리에 속하는 것일 수 있다. 상기 박테리아는 에스케리키아(Escherichia) 속, 살모넬라(Samonella) 속, 잔토모나스(Xanthomonas) 속 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 박테리아는 바실러스(Bacillus) 속, 잔토박터(Xanthobacter) 속, Azotobacter 속 또는 Agrobacterium 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 미생물은 대장균 또는 X.아우토트로피쿠스일 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물은 모균주 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물에 비하여 데할로게나제 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물은 모균주 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물에 비하여 기질로부터 플루오로 원자의 제거를 촉매하는 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물은 모균주 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물에 비하여 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)의 농도를 더욱 감소시키는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물은, 박테리아 시토크롬 P450, 테트라클로로에텐 리덕티브 데할로게나제, 디클로로메탄 데할로게나제, 할로알칸 데할로게나제, 알킬할리다제, 할로산 데할로게나제, 할로아세테이트 데할로게나제, 또는 그의 조합을 코딩하는 외인성 유전자를 하나 이상 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 재조합 미생물에 있어서, 상기 유전자는 당업계에 알려진 통상적인 방법, 예를 들면, 형질전환, 전기천공 등의 방법에 의하여 상기 미생물 내로 도입될 수 있다. 달리 언급이 없으면, 데할로게나제 변이체 및 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에 대하여는 상기한 바와 같다.
다른 양상은 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)의 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 상기 데할로게나제 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)의 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 데할로게나제 변이체를 포함하는 조성물로서, 상기 변이체는 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 것인 조성물을 제공한다.
상기 아미노산 변경은 상기 A184 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 W, Y279 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 K, E302 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 Q, R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 I, Q, E 또는 S, 또는 그의 조합으로 치환인 것일 수 있다. 상기 아미노산 변경은 상기 A184W, Y279K, E302Q, R305I, R305Q, R305E 또는 R305S, 또는 그의 조합으로 치환인 것일 수 있다.
상기 데할로게나제 변이체는 외래 유전자로부터 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하는 재조합 미생물의 형태인 것일 수 있다. 상기 데할로게나제 변이체는 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하고 있는 재조합 미생물, 그의 파쇄물(lysate), 그 파쇄물의 수용성 물질 분획, 또는 재조합 데할로게나제 변이체의 형태일 수 있다. 상기 데할로게나제 변이체는 외인성 유전자로부터 발현된 것일 수 있다. 상기 조성물은 배지 또는 배양물에 대한 상기 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)로 표시되는 플루오로화 메탄의 용해도를 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다.
용어 "감소"는 시료 중의 플루오로화 메탄 농도를 감소시키는 것으로서, 일부 제거 또는 완전하게 제거하는 것을 포함한다. 상기 조성물은 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)로 표시되는 플루오로화 메탄의 농도를 감소시킬 수 있다. 상기 감소는 상기 플루오로화 메탄의 C-F 결합을 절단하거나, 플루오로화 메탄을 다른 물질로 전환하거나, 세포 내에 축적하여 플루오로화 메탄의 농도를 감소시킬 수 있다. 상기 전환은 플루오로화 메탄에 히드록실기와 같은 친수성 기를 도입하는 것, 또는 탄소-탄소 이중결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합을 도입하는 것일 수 있다.
상기 시료는 액체 또는 기체 상태인 것일 수 있다. 상기 시료는 공장 폐수 또는 폐기체일 수 있다. 상기 시료는 상기 플루오로화 메탄을 포함하는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 플루오로화 메탄은 CF4, CHF3, CH2F2, CH3F, 또는 그의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.
달리 언급이 없으면, 데할로게나제 변이체 및 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.
다른 양상은 데할로게나제 변이체를 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수) 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다. 데할로게나제 변이체를 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수) 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 CHnF4-n의 농도를 감소시키는 방법으로서, 상기 변이체는 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 것인 방법을 제공한다.
상기 데할로게나제 변이체는 외래 유전자로부터 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하는 재조합 미생물의 형태인 것일 수 있다. 상기 데할로게나제 변이체는 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하고 있는 재조합 미생물, 그의 파쇄물(lysate), 그 파쇄물의 수용성 물질 분획, 또는 재조합 데할로게나제 변이체의 형태일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 것일 수 있다.
상기 접촉은 외래 유전자로부터 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하는 재조합 미생물을 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수) 함유 시료와 접촉시키면서 배양 또는 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 외래 유전자로부터 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하는 재조합 미생물이 증식하는 조건에서 배양하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 접촉은 기체 시료와 데할로게나제 변이체 함유 액체를 접촉시키는 기체-액체 접촉일 수 있다. 또한, 상기 접촉은 액체 시료와 데할로게나제 변이체 함유 액체를 접촉시키는 액체-액체 접촉일 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면 배지 중에 배양되는 미생물의 배양물과 상기 시료를 접촉시킴으로써 이루어질 수 있다. 상기 액체-액체 접촉은 혼합하는 것을 포함한다.
상기 접촉은 호기 또는 혐기 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 재조합 미생물이 생존 가능한 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 생존 가능한 조건은 재조합 미생물이 증식 가능한 조건 또는 휴지 상태(resting sate)로 있게 하는 조건일 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면, 플루오로화 메탄의 존재하에서 미생물을 배양하는 것일 수 있다. 상기 접촉은 상기 미생물의 생육 단계가 지수기(exponential phase), 또는 정체기(stationary phase)인 때에 이루어지는 것일 수 있다.
상기 접촉은 배치(batch) 또는 연속적으로 수행될 수 있다. 상기 접촉은 예를 들면, 상기 감소시키는 단계에서 얻어진 접촉된 시료 중 플루오로화 메탄을 신선한 데할로게나제 변이체를 코딩하는 하나 이상의 외인성 유전자를 포함하는 재조합 미생물로서, 상기 미생물은 모균주에 비하여 증가된 데할로게나제 활성을 갖는 것인 미생물과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 신선한 미생물과의 접촉은 2회 이상, 예를 들면, 2, 3, 5, 또는 10 회 이상 이루어질 수 있다. 상기 접촉은 시료 중의 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)로 표시되는 플루오로화 메탄의 원하는 감소된 농도가 달성될 때까지의 시간 동안 지속되거나, 반복될 수 있다.
상기 시료는 액체 또는 기체 상태일 수 있다. 상기 시료는 공장 폐수 또는 폐기체일 수 있다.
달리 언급이 없으면, 데할로게나제 변이체 및 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 하나 이상의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드, 재조합 미생물, 플루오로화 메탄 함유 시료에 대하여는 상기한 바와 같다.
다른 양상에 따른 재조합 미생물은 시료 중 플루오로화 메탄을 제거하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 시료 중 플루오로메탄의 농도를 감소시키는 방법은 시료 중 플루오로메탄의 농도를 효율적으로 감소시킬 수 있다.
데할로게나제 변이체, 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물을 이용하여 플루오로화 메탄의 농도를 효율적으로 감소시킬 수 있다.
도 1은 pMALc2-CfrA 또는 pMALc2-CfrA-wt 벡터의 벡터 지도를 나타낸 도면이다.
도 2는 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산, 예를 들면 19종의 천연 아미노산으로 치환하고, 상기 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체에 의하여 CF4가 분해된 정도를 잔존율로 나타낸 그래프이다.
도 3은 서열번호 1의 아미노산 서열을 각각 A184W, Y279K, E302Q, R305I 치환하고, 상기 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체에 의하여 CF4가 분해된 정도를 분해율 및 활성으로 나타낸 그래프이다. 분해율(%)은 (△ 피크 면적 / 대조군의 피크 면적) x 100의 값이며, 여기서 △ 피크 면적은 (대조군 피크 면적- 데할로게나제 변이체 피크 면적)의 값을 나타낸다.
도 4는 대조군, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A184W, Y279K, E302Q, 및 R305I 치환된 데할로게나제 변이체, 대조군과 P450-BM3, 및 상기의 데할로게나제 변이체와 P450-BM3 각각에 의하여 CF4가 분해된 정도를 나타낸 그래프이다. 세로 축은 피크 면적(peak area)을 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 : 데할로게나제 변이체를 발현하는 대장균 및 그를 이용한 시료 중 플루오로화 탄소의 분해
1: 데할로게나제의 뉴클레오티드 서열 변경
데할로게나제 유전자는 Dehalobacter 속 균주의 클로로포름 리덕티브 데할로게나제(chloroform reductive dehalogenase: CfrA) 유전자를 기반으로, 대장균의 코돈에 최적화되도록 DNA를 합성하여 제작하였다 (Cosmogenetech).
CfrA 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖고 있으며, 이 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩한다. 데할로게나제 활성의 개량을 위하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 데할로게나제 활성을 갖는 아미노산 서열과 보존적 서열(conserved sequence)인 아미노산 서열 중, 기질과의 거리가 짧은 아미노산 위치를 스크리닝하여 총 4종의 아미노산 위치을 선별하였다.
서열번호 1의 아미노산 서열의 n 위치에 해당하는 아미노산을 다른 아미노산으로 변경하기 위하여, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 상기 n 위치 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드를 19종의 다른 천연 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드가 되도록 변경하였다. 변경된 뉴클레오티드 서열과 바로 인접하고 있는 일부 뉴클레오티드를 중복하여 증폭하였다. 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 1번째 뉴클레오티드부터 n-1 위치 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드까지 증폭하였다. 또한, 치환된 뉴클레오티드의 5` 앞에 위치하는 임의의 뉴클레오티드부터 종결 코돈 부근을 코딩하는 뉴클레오티드까지 증폭하였다.
1-1: 서열번호 1의 R305의 아미노산 변경을 위한, 뉴클레오티드 변경
구체적인 과정은 다음과 같다. 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305 위치에 해당하는 아미노산을 다른 아미노산으로 변경하기 위하여, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 913번째 뉴클레오티드부터 915번째 뉴클레오티드, CGT를 각각 19종의 다른 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드가 되도록 치환하였다.
치환된 913번째 뉴클레오티드부터 915번째 뉴클레오티드와 바로 인접하고 있는 일부 뉴클레오티드를 중복하여 증폭하였다. 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 1번째 뉴클레오티드부터 912번째 뉴클레오티드를 primestar MAX (TaKaRa) DNA 중합효소 및 서열번호 28 및 서열번호 30의 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 또한, 898번째 뉴클레오티드부터 종결코돈을 코딩하는 뉴클레오티드까지, 치환된 913번째 뉴클레오티드부터 915번째 뉴클레오티드를 포함하도록, primestar MAX (TaKaRa) DNA 중합효소, 및 서열번호 31 내지 49 중 어느 하나 및 서열번호 29의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
프라이머 서열번호 프라이머 서열 5`-
CfrA-F 서열번호 28 atcgagggaaggatttcagaattcATGGACAAAGAGAAATCCAA
CfrA-R 서열번호 29 gtcgactctagaggatccgaattcTTACTATTTCCACCAATCGG
305 PMR 서열번호 30 AGAATATTCGCCCAGACC
Phe305 서열번호 31 CTGGGCGAATATTCTtttTCTGGCCTGATGATTACTC
Val305 서열번호 32 CTGGGCGAATATTCTgtgTCTGGCCTGATGATTACTC
Ala305 서열번호 33 CTGGGCGAATATTCTgcgTCTGGCCTGATGATTACTC
Asn305 서열번호 34 CTGGGCGAATATTCTaacTCTGGCCTGATGATTACTC
Cys305 서열번호 35 CTGGGCGAATATTCTtgcTCTGGCCTGATGATTACTC
Leu305 서열번호 36 CTGGGCGAATATTCTcugTCTGGCCTGATGATTACTC
Gly305 서열번호 37 CTGGGCGAATATTCTggcTCTGGCCTGATGATTACTC
Tyr305 서열번호 38 CTGGGCGAATATTCTtatTCTGGCCTGATGATTACTC
Lys305 서열번호 39 CTGGGCGAATATTCTaaaTCTGGCCTGATGATTACTC
Trp305 서열번호 40 CTGGGCGAATATTCTtggTCTGGCCTGATGATTACTC
Ile305 서열번호 41 CTGGGCGAATATTCTattTCTGGCCTGATGATTACTC
Pro305 서열번호 42 CTGGGCGAATATTCTccgTCTGGCCTGATGATTACTC
His305 서열번호 43 CTGGGCGAATATTCTcatTCTGGCCTGATGATTACTC
Asp305 서열번호 44 CTGGGCGAATATTCTgatTCTGGCCTGATGATTACTC
Met305 서열번호 45 CTGGGCGAATATTCTatgTCTGGCCTGATGATTACTC
Thr305 서열번호 46 CTGGGCGAATATTCTaccTCTGGCCTGATGATTACTC
Gln305 서열번호 47 CTGGGCGAATATTCTcagTCTGGCCTGATGATTACTC
Glu305 서열번호 48 CTGGGCGAATATTCTgaaTCTGGCCTGATGATTACTC
Ser305 서열번호 49 CTGGGCGAATATTCTagcTCTGGCCTGATGATTACTC
상기와 같은 방법과 동일하게 수행하여, A184, Y279, E302 위치에 해당하는 아미노산을 각각 19종의 다른 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드가 되도록 치환하였다.
1-2: 서열번호 1의 A184의 아미노산 변경을 위한, 뉴클레오티드 변경
서열번호 1의 아미노산 서열의 A184 위치에 해당하는 아미노산을 다른 아미노산으로 변경하기 위하여, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 550번째 뉴클레오티드부터 552번째 뉴클레오티드, GCG를 각각 19종의 다른 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드가 되도록 치환하였다.
치환된 550번째 뉴클레오티드부터 552번째 뉴클레오티드와 바로 인접하고 있는 일부 뉴클레오티드를 중복하여 증폭하였다. 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 1번째 뉴클레오티드부터 549번째 뉴클레오티드를 primestar MAX (TaKaRa) DNA 중합효소 및 서열번호 28 및 서열번호 50의 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 또한, 532번째 뉴클레오티드부터 종결코돈을 코딩하는 뉴클레오티드까지, 치환된 550번째 뉴클레오티드부터 552번째 뉴클레오티드를 포함하도록, primestar MAX (TaKaRa) DNA 중합효소, 및 서열번호 51 내지 69 중 어느 하나 및 서열번호 29의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
프라이머 서열번호 프라이머 서열
CfrA-F 서열번호 28 atcgagggaaggatttcagaattcATGGACAAAGAGAAATCCAA
CfrA-R 서열번호 29 gtcgactctagaggatccgaattcTTACTATTTCCACCAATCGG
184 PMR 서열번호 50 GATCTTCTTCACAGCCAT
Phe184 서열번호 51 ATGGCTGTGAAGAAGATCtttCGTTTCTTCGGTGCTG
Val184 서열번호 52 ATGGCTGTGAAGAAGATCgtgCGTTTCTTCGGTGCTG
Glu184 서열번호 53 ATGGCTGTGAAGAAGATCgaaCGTTTCTTCGGTGCTG
Asn184 서열번호 54 ATGGCTGTGAAGAAGATCaacCGTTTCTTCGGTGCTG
Cys184 서열번호 55 ATGGCTGTGAAGAAGATCtgcCGTTTCTTCGGTGCTG
Leu184 서열번호 56 ATGGCTGTGAAGAAGATCctgCGTTTCTTCGGTGCTG
Gly184 서열번호 57 ATGGCTGTGAAGAAGATCggcCGTTTCTTCGGTGCTG
Tyr184 서열번호 58 ATGGCTGTGAAGAAGATCtatCGTTTCTTCGGTGCTG
Lys184 서열번호 59 ATGGCTGTGAAGAAGATCaaaCGTTTCTTCGGTGCTG
Trp184 서열번호 60 ATGGCTGTGAAGAAGATCtggCGTTTCTTCGGTGCTG
Ile184 서열번호 61 ATGGCTGTGAAGAAGATCattCGTTTCTTCGGTGCTG
Pro184 서열번호 62 ATGGCTGTGAAGAAGATCccgCGTTTCTTCGGTGCTG
His184 서열번호 63 ATGGCTGTGAAGAAGATCcatCGTTTCTTCGGTGCTG
Asp184 서열번호 64 ATGGCTGTGAAGAAGATCgatCGTTTCTTCGGTGCTG
Met184 서열번호 65 ATGGCTGTGAAGAAGATCatgCGTTTCTTCGGTGCTG
Thr184 서열번호 66 ATGGCTGTGAAGAAGATCaccCGTTTCTTCGGTGCTG
Gln184 서열번호 67 ATGGCTGTGAAGAAGATCcagCGTTTCTTCGGTGCTG
Arg184 서열번호 68 ATGGCTGTGAAGAAGATCcgtCGTTTCTTCGGTGCTG
Ser184 서열번호 69 ATGGCTGTGAAGAAGATCagcCGTTTCTTCGGTGCTG
1-3: 서열번호 1의 Y279의 아미노산 변경을 위한, 뉴클레오티드 변경
서열번호 1의 아미노산 서열의 Y279 위치에 해당하는 아미노산을 다른 아미노산으로 변경하기 위하여, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 835번째 뉴클레오티드부터 837번째 뉴클레오티드, TAC를 각각 19종의 다른 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드가 되도록 치환하였다.
치환된 835번째 뉴클레오티드부터 837번째 뉴클레오티드와 바로 인접하고 있는 일부 뉴클레오티드를 중복하여 증폭하였다. 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 1번째 뉴클레오티드부터 834번째 뉴클레오티드를 primestar MAX (TaKaRa) DNA 중합효소 및 서열번호 28 및 서열번호 70의 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 또한, 819번째 뉴클레오티드부터 종결코돈을 코딩하는 뉴클레오티드까지, 치환된 835번째 뉴클레오티드부터 837번째 뉴클레오티드를 포함하도록, primestar MAX (TaKaRa) DNA 중합효소, 및 서열번호 71 내지 89 중 어느 하나 및 서열번호 29의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
프라이머 서열번호 프라이머 서열
CfrA-F 서열번호 28 atcgagggaaggatttcagaattcATGGACAAAGAGAAATCCAA
CfrA-R 서열번호 29 gtcgactctagaggatccgaattcTTACTATTTCCACCAATCGG
279 PMR 서열번호 70 GCCCAGGTCTTTGATG
Phe279 서열번호 71 CATCAAAGACCTGGGCtttCACGCCGTTCCGATT
Val279 서열번호 72 CATCAAAGACCTGGGCgtgCACGCCGTTCCGATT
Ala279 서열번호 73 CATCAAAGACCTGGGCgcgCACGCCGTTCCGATT
Asn279 서열번호 74 CATCAAAGACCTGGGCaacCACGCCGTTCCGATT
Cys279 서열번호 75 CATCAAAGACCTGGGCtgcCACGCCGTTCCGATT
Leu279 서열번호 76 CATCAAAGACCTGGGCctgCACGCCGTTCCGATT
Gly279 서열번호 77 CATCAAAGACCTGGGCggcCACGCCGTTCCGATT
Tyr279 서열번호 78 CATCAAAGACCTGGGCtatCACGCCGTTCCGATT
Lys279 서열번호 79 CATCAAAGACCTGGGCaaaCACGCCGTTCCGATT
Trp279 서열번호 80 CATCAAAGACCTGGGCtggCACGCCGTTCCGATT
Ile279 서열번호 81 CATCAAAGACCTGGGCattCACGCCGTTCCGATT
Pro279 서열번호 82 CATCAAAGACCTGGGCccgCACGCCGTTCCGATT
His279 서열번호 83 CATCAAAGACCTGGGCcatCACGCCGTTCCGATT
Asp279 서열번호 84 CATCAAAGACCTGGGCgatCACGCCGTTCCGATT
Met279 서열번호 85 CATCAAAGACCTGGGCatgCACGCCGTTCCGATT
Thr279 서열번호 86 CATCAAAGACCTGGGCaccCACGCCGTTCCGATT
Gln279 서열번호 87 CATCAAAGACCTGGGCcagCACGCCGTTCCGATT
Glu279 서열번호 88 CATCAAAGACCTGGGCgaaCACGCCGTTCCGATT
Ser279 서열번호 89 CATCAAAGACCTGGGCagcCACGCCGTTCCGATT
1-4: 서열번호 1의 E302의 아미노산 변경을 위한, 뉴클레오티드 변경
서열번호 1의 아미노산 서열의 E302 위치에 해당하는 아미노산을 다른 아미노산으로 변경하기 위하여, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 904번째 뉴클레오티드부터 906번째 뉴클레오티드를 각각 19종의 다른 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드가 되도록 치환하였다.
치환된 904번째 뉴클레오티드부터 906번째 뉴클레오티드와 바로 인접하고 있는 일부 뉴클레오티드를 중복하여 증폭하였다. 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에서 1번째 뉴클레오티드부터 903번째 뉴클레오티드를 primestar MAX (TaKaRa) DNA 중합효소 및 서열번호 28 및 서열번호 90의 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 또한, 889번째 뉴클레오티드부터 종결코돈을 코딩하는 뉴클레오티드까지, 치환된 904번째 뉴클레오티드부터 906번째 뉴클레오티드를 포함하도록, primestar MAX (TaKaRa) DNA 중합효소 및 서열번호 91 내지 109 중 어느 하나 및 서열번호 29의 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
프라이머 서열번호 프라이머 서열
CfrA-F 서열번호 28 atcgagggaaggatttcagaattcATGGACAAAGAGAAATCCAA
CfrA-R 서열번호 29 gtcgactctagaggatccgaattcTTACTATTTCCACCAATCGG
302 PMR 서열번호 90 GCCCAGACCCGCCTG
Phe302 서열번호 91 CAGGCGGGTCTGGGCtttTATTCTatTTCTGGCCTG
Val302 서열번호 92 CAGGCGGGTCTGGGCgtgTATTCTatTTCTGGCCTG
Ala302 서열번호 93 CAGGCGGGTCTGGGCgcgTATTCTatTTCTGGCCTG
Asn302 서열번호 94 CAGGCGGGTCTGGGCaacTATTCTatTTCTGGCCTG
Cys302 서열번호 95 CAGGCGGGTCTGGGCtgcTATTCTatTTCTGGCCTG
Leu302 서열번호 96 CAGGCGGGTCTGGGCctgTATTCTatTTCTGGCCTG
Gly302 서열번호 97 CAGGCGGGTCTGGGCggcTATTCTatTTCTGGCCTG
Tyr302 서열번호 98 CAGGCGGGTCTGGGCtatTATTCTatTTCTGGCCTG
Lys302 서열번호 99 CAGGCGGGTCTGGGCaaaTATTCTatTTCTGGCCTG
Trp302 서열번호 100 CAGGCGGGTCTGGGCtggTATTCTatTTCTGGCCTG
Ile302 서열번호 101 CAGGCGGGTCTGGGCattTATTCTatTTCTGGCCTG
Pro302 서열번호 102 CAGGCGGGTCTGGGCccgTATTCTatTTCTGGCCTG
His302 서열번호 103 CAGGCGGGTCTGGGCcatTATTCTatTTCTGGCCTG
Asp302 서열번호 104 CAGGCGGGTCTGGGCgatTATTCTatTTCTGGCCTG
Met302 서열번호 105 CAGGCGGGTCTGGGCatgTATTCTatTTCTGGCCTG
Thr302 서열번호 106 CAGGCGGGTCTGGGCaccTATTCTatTTCTGGCCTG
Gln302 서열번호 107 CAGGCGGGTCTGGGCcagTATTCTatTTCTGGCCTG
Arg302 서열번호 108 CAGGCGGGTCTGGGCcgtTATTCTatTTCTGGCCTG
Ser302 서열번호 109 CAGGCGGGTCTGGGCagcTATTCTatTTCTGGCCTG
2: 데할로게나제 변이체를 발현하는 대장균의 제작
pMALc2 벡터 (New England Biolabs Inc.)의 EcoRI 부위를 절단하였다. 1절에서 제작된 두개의 증폭 산물을 In-Fusion® HD Cloning plus (TaKaRa Cat No.638909.)를 이용하여 절단된 pMALc2 벡터의 EcoRI 부위에 삽입하였다. 그로써 데할로게나제 변이체 발현 벡터인 pMALc2-CfrA-mut를 수득하였다. 시퀀싱을 통해 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자의 도입 여부를 확인하였다. 이 벡터를 대장균 BL21 Star 균주에 열충격 방법에 의하여 도입하였다. 상기 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 대장균을 E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut로 명명하였다.
대조군(control 또는 negative control: NC)으로는, 데할로게나제를 코딩하는 유전자로 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 pMALc2 벡터에 삽입한 것을 삽입한 것을 제외하고는, 상기와 같은 방법과 동일하게 수행하여, 데할로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 대장균을 제작하였다. 상기 데할로게나제를 코딩하는 유전자가 도입된 대장균을 E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-wt로 명명하였다. 또한, pMALc2 벡터를 삽입한 것을 제외하고, 상기와 같은 방법과 동일하게 수행하여, pMALc2 벡터가 도입된 대장균을 제작하였다. 상기 pMALc2 벡터가 도입된 대장균을 E.coli BL21 star/pMALc2로 명명하였다.
3: 데할로게나제 변이체에 의한 플루오로화 메탄의 분해
데할로게나제 변이체를 발현하는 대장균이 플루오로화 메탄(CF4)에 대하여 분해 활성을 갖는지 여부를 확인하였다.
2절에서 수득된 E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut를 진탕 배양기 중 배지에 접종하고 0.2mM IPTG, 1μM 코발아민 보조인자(cobalamin cofactor) 존재하에서 20℃에서 20시간 동안 인큐베이션하여 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자의 발현을 유도하였다. 배양물로부터 세포 펠렛을 얻고 이들 파쇄 용액인 PBS 버퍼(Sigma-Aldrich Inc.) 중에서 파쇄하여 파쇄물(lysate)을 얻고 이 파쇄물로부터 조 추출물(crude extract)을 얻었다. 다음으로서, 혈청병에 Ti(III)-NTA 2mM, 메틸비올로겐(methylviologen) 2mM 및 5ml 조추출물을 첨가하고 헤드스페이스에는 1,000ppm CF4를 첨가하고 밀봉한 후 30℃에서 지정된 시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 헤드스페이스 중 CF4의 양을 분석하였다. 분석은 헤드스페이스로부터 주사기를 사용하여 0.5㎖m를 채취하여, GC(Agilent 7890, Palo Alto, CA, USA)에 주입하였다. 주입된 CF4는 CP-PoraBOND Q 칼럼(25m length, 0.32mm i.d., 5um film thickness, Agilent)을 통해 분리되었고, MSD(Agilent 5973, Palo Alto, CA, USA)를 통해 CF4 농도 변화를 분석하였다. 운반 기체는 헬륨을 사용하였고 1.5ml/min 속도로 칼럼에 흘려 보냈다. GC 조건은 주입구 온도는 250℃이고, 초기 온도 40℃에서 2분간 유지하고, 290℃까지 20℃/min으로 승온시켰다. MS 조건은 70eV의 이온화 에너지, 접촉부(interface) 온도는 280℃이고, 이온원(ion source) 온도는 230℃이고, 4중극자(quadrupole) 온도는 150℃이었다. 대조군인, E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-wt 또는 E.coli BL21 star/pMALc2의 경우, 상기와 같은 조건에서 CF4와 인큐베이션한 후 헤드스페이스 중 CF4의 양을 분석하였다.
3-1: R305이 다른 아미노산으로 변경된 데할로게나제 변이체를 발현하는 대장균에 의한 플루오로화 메탄의 분해
(3)절에 기재된 방법과 동일하게 수행하여, 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305가 다른 19종의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체를 발현하는 재조합 대장균(E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-R305X)에 의하여 CF4가 분해된 정도를 확인하였다.
도 2는 대조군 및 상기 데할로게나제 변이체를 발현하는 재조합 대장균에 의하여 CF4가 분해된 정도를 잔존율로 나타낸 그래프이다. 즉 시료 중 CF4의 농도 변화를 대조군 값으로 정규화하여 나타낸 것이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 I, Q, E, S, C 또는 Y로 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체는 대조군에 비해 CF4의 양을 더욱 감소시켰다. 도 2의 결과는, 상기 데할로게나제 변이체가 대조군에 비하여 증가된 CF4의 분해 활성을 갖는다는 것을 나타낸다.
하기 표 5는 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 각각 I, Q, E 및 S로 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체를 발현하는 재조합 대장균에 의하여 CF4가 분해된 정도를 분해율 및 활성으로 나타낸 것이다.
표 5의 결과에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 각각 I, Q, E 및 S로 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체는 대조군에 비하여 CF4의 양을 약 16% 이상 감소시켰다. 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열의 R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 각각 I, Q, E 및 S로 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체는 대조군에 비하여, CF4의 양을 분해시키는 활성이 약 15% 이상 높았다. 여기서, 활성은 데할로게나제 또는 데할로게나제 변이체를 발현하는 재조합 미생물의 세포(cell) 1 그람(g)이 1분(min) 동안 분해할 수 있는 CF4의 μmol 수를 의미한다.
아미노산 변경 사용된 재조합 대장균 CF 4 분해율
(%) 		활성
( μmol / gcell ·min)
R305 E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-wt 8.3 0.0030
R305I E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-R305I 14.3 0.0052
R305Q E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-R305Q 13.3 0.0048
R305E E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-R305E 13.4 0.0049
R305S E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-R305S 13 0.0047
3-2: A184가 다른 아미노산으로 변경된 데할로게나제 변이체를 발현하는 대장균에 의한 플루오로화 메탄의 분해
3절에 기재된 방법과 동일하게 수행하여, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184가 다른 19종의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체를 발현하는 재조합 대장균(E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-A184X)에 의하여 CF4가 분해된 정도를 확인하였다.
3-3: Y279가 다른 아미노산으로 변경된 데할로게나제 변이체를 발현하는 대장균에 의한 플루오로화 메탄의 분해
3절에 기재된 방법과 동일하게 수행하여, 서열번호 1의 아미노산 서열의 Y279가 다른 19종의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체를 발현하는 재조합 대장균(E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-Y279X)에 의하여 CF4가 분해된 정도를 확인하였다.
3-4: E302가 다른 아미노산으로 변경된 데할로게나제 변이체를 발현하는 대장균에 의한 플루오로화 메탄의 분해
3절에 기재된 방법과 동일하게 수행하여, 서열번호 1의 아미노산 서열의 E302가 다른 19종의 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제 변이체를 발현하는 재조합 대장균(E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-E302X)에 의하여 CF4가 분해된 정도를 확인하였다.
하기 표 10 및 도 3은 3-2 내지 3-4의 결과에 따라, 대조군 및 상기 데할로게나제 변이체를 발현하는 재조합 대장균에 의하여 CF4가 분해된 정도를, 분해율 및 활성으로 나타낸 것이다.
아미노산
변경 		사용된 재조합 대장균 분해율
(%) 		활성
(U/ gcellmin )
WT - E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-wt 8.3 0.003
1st R305I E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-R305I 14.3 0.0052
2nd Y279K E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-Y279K 16 0.0059
3rd E302Q E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-E302Q 17 0.0062
4th A184W E.coli BL21 star/pMALc2-CfrA-mut-A184W 19 0.0069
표 6 및 도 3의 결과는, 상기 데할로게나제 변이체가, 아미노산을 치환하지 않은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 데할로게나제에 비하여, 2배 이상 높은 분해율과 분해 활성을 가진다는 것을 나타낸다.
4: A184, Y279, E302, R305가 다른 아미노산으로 변경된, 데할로게나제 변이체를 발현하는 대장균에 의한 플루오로화 메탄의 분해
3절에 기재된 방법과 동일하게 수행하여, 대조군, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A184W, Y279K, E302Q 및 R305I 치환된 데할로게나제 변이체 (pMALc2-CfrA-mut-A184W-Y279K-E302Q-R305I 또는 eCfrA로 표기), 대조군과 P450-BM3 및 상기의 데할로게나제 변이체와 P450-BM3 각각을 발현하는 재조합 대장균에 의하여 CF4가 분해된 정도를 확인하였다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A184W, Y279K, E302Q 및 R305I 치환을 갖는 데할로게나제 변이체는 서열번호 110의 아미노산 서열을 갖을 수 있고, 서열번호 111의 뉴클레오티드 서열을 갖을 수 있다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 A184W, Y279K, E302Q, 및 R305I로 모두 치환된 경우, 약 20%의 분해율을 보였다. 또한, 상기 데할로게나제 변이체와 P450-BM3를 동시에 발현하는 재조합 대장균에 의하여, 약 27%의 CF4가 분해되었다. 즉 상기 데할로게나제 변이체는, 4종의 아미노산 치환에 의해 높은 CF4의 분해 활성을 보이며, 다른 데할로게나제와의 조합에도, CF4의 분해 활성을 유지할 수 있다.
<110> SAMSUNG ELECTRONIS CO., LTD. <120> Dehalogenase variant, polynucleotide coding the variant, microorganism including genetic modification having the polynucleotide, composition including the microorganism and method for reducing concentration of fluorinated methane in sample using the same <130> PN115424 <160> 111 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 456 <212> PRT <213> Dehalobacter sp. <400> 1 Met Asp Lys Glu Lys Ser Asn Asn Asp Lys Pro Ala Thr Lys Ile Asn 1 5 10 15 Arg Arg Gln Phe Leu Lys Phe Gly Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ile Ala 20 25 30 Ile Ala Thr Ala Ala Thr Ala Leu Gly Gly Lys Ser Leu Ile Asp Pro 35 40 45 Lys Gln Val Tyr Ala Gly Thr Val Lys Glu Leu Asp Glu Leu Pro Phe 50 55 60 Asn Ile Pro Ala Asp Tyr Lys Pro Phe Thr Asn Gln Arg Asn Ile Tyr 65 70 75 80 Gly Gln Ala Val Leu Gly Val Pro Glu Pro Leu Ala Leu Val Glu Arg 85 90 95 Phe Asp Glu Val Arg Trp Asn Gly Trp Gln Thr Asp Gly Ser Pro Gly 100 105 110 Leu Thr Val Leu Asp Gly Ala Ala Ala Arg Ala Ser Phe Ala Val Asp 115 120 125 Tyr Tyr Phe Asn Gly Glu Asn Ser Ala Cys Arg Ala Asn Lys Gly Phe 130 135 140 Phe Glu Trp His Pro Lys Val Ala Glu Leu Asn Phe Lys Trp Gly Asp 145 150 155 160 Pro Glu Arg Asn Ile His Ser Pro Gly Val Lys Ser Ala Glu Glu Gly 165 170 175 Thr Met Ala Val Lys Lys Ile Ala Arg Phe Phe Gly Ala Ala Lys Ala 180 185 190 Gly Ile Ala Pro Phe Asp Lys Arg Trp Val Phe Thr Glu Thr Tyr Ala 195 200 205 Phe Val Lys Thr Pro Glu Gly Glu Ser Leu Lys Phe Ile Pro Pro Asp 210 215 220 Phe Gly Phe Glu Pro Lys His Val Ile Ser Met Ile Ile Pro Gln Ser 225 230 235 240 Pro Glu Gly Val Lys Cys Asp Pro Ser Phe Leu Gly Ser Thr Glu Tyr 245 250 255 Gly Leu Ser Cys Ala Gln Ile Gly Tyr Ala Ala Phe Gly Leu Ser Met 260 265 270 Phe Ile Lys Asp Leu Gly Tyr His Ala Val Pro Ile Gly Ser Asp Ser 275 280 285 Ala Leu Ala Ile Pro Ile Ala Ile Gln Ala Gly Leu Gly Glu Tyr Ser 290 295 300 Arg Ser Gly Leu Met Ile Thr Pro Glu Phe Gly Ser Asn Val Arg Leu 305 310 315 320 Cys Glu Val Phe Thr Asp Met Pro Leu Asn His Asp Lys Pro Ile Ser 325 330 335 Phe Gly Val Thr Glu Phe Cys Lys Thr Cys Lys Lys Cys Ala Glu Ala 340 345 350 Cys Ala Pro Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Asp Pro Thr Ile Asp Gly Pro 355 360 365 Arg Gly Gln Met Gln Asn Ser Gly Ile Lys Arg Trp Tyr Val Asp Pro 370 375 380 Val Lys Cys Leu Glu Phe Met Ser Arg Asp Asn Val Gly Asn Cys Cys 385 390 395 400 Gly Ala Cys Ile Ala Ala Cys Pro Phe Thr Lys Pro Glu Ala Trp His 405 410 415 His Thr Leu Ile Arg Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ile Thr Pro Phe 420 425 430 Met Lys Asp Met Asp Asp Ile Phe Gly Tyr Gly Lys Leu Asn Asp Glu 435 440 445 Lys Ala Ile Ala Asp Trp Trp Lys 450 455 <210> 2 <211> 1371 <212> DNA <213> Dehalobacter sp. <400> 2 atggacaaag agaaatccaa caacgacaaa ccggcgacca agatcaaccg ccgccagttc 60 ctgaaattcg gcgcaggtgc atctagcggt atcgctatcg caactgcagc aactgcactg 120 ggtggcaaat ccctgatcga tcctaaacag gtgtacgcag gtactgtgaa agagctggac 180 gagctgccgt tcaacatccc tgcagactac aaaccgttca ctaaccagcg taacatctac 240 ggccaggcag tactgggtgt acctgagcct ctggcactgg tagaacgctt tgacgaagta 300 cgttggaacg 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tcttcgagtg gcacccgaaa gtggctgaac tgaacttcaa atggggcgac 480 ccagaacgta acatccacag cccaggtgtc aaatccgctg aagaaggtac catggctgtg 540 aagaagatcg cgcgtttctt cggtgctgct aaagcgggta tcgctccatt cgacaaacgt 600 tgggtcttca ccgaaaccta cgccttcgtg aagaccccag aaggtgaatc tctgaaattc 660 atcccgccgg acttcggctt cgaaccgaaa cacgttatca gcatgatcat cccgcagagc 720 ccggaaggtg tcaaatgcga cccgagcttt ctgggttcta ccgaatacgg tctgtcttgt 780 gctcaaatcg gttacgccgc cttcggtctg tctatgttca tcaaagacct gggctaccac 840 gccgttccga ttggttctga cagcgccctg gccattccga ttgcgattca ggcgggtctg 900 ggcgaatatt ctagctctgg cctgatgatt actccggaat ttggcagcaa cgttcgtctg 960 tgtgaagtgt ttacggatat gccgctgaac catgacaaac cgatctcctt cggcgttacc 1020 gaattctgta agacgtgcaa gaaatgcgcg gaagcgtgtg cgccgcaggc gatttcctat 1080 gaagacccga ccattgatgg cccgcgtggc cagatgcaga actccggcat caaacgctgg 1140 tatgttgatc cggtaaaatg tctggaattc atgtcccgcg ataatgttgg caattgctgc 1200 ggcgcgtgca ttgcggcgtg cccgtttacc aaaccggaag cgtggcatca caccctgatt 1260 cgctccctgg ttggcgcgcc ggttattacg ccgtttatga aagatatgga tgatatcttt 1320 ggctatggca aactgaatga tgagaaagcc atcgccgatt ggtggaaata g 1371 <210> 21 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cfrA R305S <400> 21 atggacaaag agaaatccaa caacgacaaa ccggcgacca agatcaaccg ccgccagttc 60 ctgaaattcg gcgcaggtgc atctagcggt atcgctatcg caactgcagc aactgcactg 120 ggtggcaaat ccctgatcga tcctaaacag gtgtacgcag gtactgtgaa agagctggac 180 gagctgccgt tcaacatccc tgcagactac aaaccgttca ctaaccagcg taacatctac 240 ggccaggcag tactgggtgt acctgagcct ctggcactgg tagaacgctt tgacgaagta 300 cgttggaacg gttggcaaac tgacggttct ccaggtctga ccgttctgga tggtgcagct 360 gcgcgtgcta gctttgctgt tgattattac ttcaacggcg agaactctgc ttgccgtgct 420 aacaagggtt tcttcgagtg gcacccgaaa gtggctgaac tgaacttcaa atggggcgac 480 ccagaacgta acatccacag cccaggtgtc aaatccgctg aagaaggtac catggctgtg 540 aagaagatcg cgcgtttctt cggtgctgct aaagcgggta tcgctccatt cgacaaacgt 600 tgggtcttca ccgaaaccta cgccttcgtg aagaccccag aaggtgaatc tctgaaattc 660 atcccgccgg acttcggctt cgaaccgaaa cacgttatca gcatgatcat cccgcagagc 720 ccggaaggtg tcaaatgcga cccgagcttt ctgggttcta ccgaatacgg tctgtcttgt 780 gctcaaatcg gttacgccgc cttcggtctg tctatgttca tcaaagacct gggctaccac 840 gccgttccga ttggttctga cagcgccctg gccattccga ttgcgattca ggcgggtctg 900 ggcgaatatt cttcttctgg cctgatgatt actccggaat ttggcagcaa cgttcgtctg 960 tgtgaagtgt ttacggatat gccgctgaac catgacaaac cgatctcctt cggcgttacc 1020 gaattctgta agacgtgcaa gaaatgcgcg gaagcgtgtg cgccgcaggc gatttcctat 1080 gaagacccga ccattgatgg cccgcgtggc cagatgcaga actccggcat caaacgctgg 1140 tatgttgatc cggtaaaatg tctggaattc atgtcccgcg ataatgttgg caattgctgc 1200 ggcgcgtgca ttgcggcgtg cccgtttacc aaaccggaag cgtggcatca caccctgatt 1260 cgctccctgg ttggcgcgcc ggttattacg ccgtttatga aagatatgga tgatatcttt 1320 ggctatggca aactgaatga tgagaaagcc atcgccgatt ggtggaaata g 1371 <210> 22 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cfrA R305S <400> 22 atggacaaag agaaatccaa caacgacaaa ccggcgacca agatcaaccg ccgccagttc 60 ctgaaattcg gcgcaggtgc atctagcggt 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ttggcagcaa cgttcgtctg 960 tgtgaagtgt ttacggatat gccgctgaac catgacaaac cgatctcctt cggcgttacc 1020 gaattctgta agacgtgcaa gaaatgcgcg gaagcgtgtg cgccgcaggc gatttcctat 1080 gaagacccga ccattgatgg cccgcgtggc cagatgcaga actccggcat caaacgctgg 1140 tatgttgatc cggtaaaatg tctggaattc atgtcccgcg ataatgttgg caattgctgc 1200 ggcgcgtgca ttgcggcgtg cccgtttacc aaaccggaag cgtggcatca caccctgatt 1260 cgctccctgg ttggcgcgcc ggttattacg ccgtttatga aagatatgga tgatatcttt 1320 ggctatggca aactgaatga tgagaaagcc atcgccgatt ggtggaaata g 1371 <210> 23 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cfrA R305S <400> 23 atggacaaag agaaatccaa caacgacaaa ccggcgacca agatcaaccg ccgccagttc 60 ctgaaattcg gcgcaggtgc atctagcggt atcgctatcg caactgcagc aactgcactg 120 ggtggcaaat ccctgatcga tcctaaacag gtgtacgcag gtactgtgaa agagctggac 180 gagctgccgt tcaacatccc tgcagactac aaaccgttca ctaaccagcg taacatctac 240 ggccaggcag tactgggtgt acctgagcct ctggcactgg tagaacgctt tgacgaagta 300 cgttggaacg gttggcaaac tgacggttct ccaggtctga ccgttctgga tggtgcagct 360 gcgcgtgcta gctttgctgt tgattattac ttcaacggcg agaactctgc ttgccgtgct 420 aacaagggtt tcttcgagtg gcacccgaaa gtggctgaac tgaacttcaa atggggcgac 480 ccagaacgta acatccacag cccaggtgtc aaatccgctg aagaaggtac catggctgtg 540 aagaagatcg cgcgtttctt cggtgctgct aaagcgggta tcgctccatt cgacaaacgt 600 tgggtcttca ccgaaaccta cgccttcgtg aagaccccag aaggtgaatc tctgaaattc 660 atcccgccgg acttcggctt cgaaccgaaa cacgttatca gcatgatcat cccgcagagc 720 ccggaaggtg tcaaatgcga cccgagcttt ctgggttcta ccgaatacgg tctgtcttgt 780 gctcaaatcg gttacgccgc cttcggtctg tctatgttca tcaaagacct gggctaccac 840 gccgttccga ttggttctga cagcgccctg gccattccga ttgcgattca ggcgggtctg 900 ggcgaatatt cttcatctgg cctgatgatt actccggaat ttggcagcaa cgttcgtctg 960 tgtgaagtgt ttacggatat gccgctgaac catgacaaac cgatctcctt cggcgttacc 1020 gaattctgta agacgtgcaa gaaatgcgcg gaagcgtgtg cgccgcaggc gatttcctat 1080 gaagacccga ccattgatgg cccgcgtggc cagatgcaga actccggcat caaacgctgg 1140 tatgttgatc cggtaaaatg tctggaattc atgtcccgcg ataatgttgg caattgctgc 1200 ggcgcgtgca ttgcggcgtg cccgtttacc aaaccggaag cgtggcatca caccctgatt 1260 cgctccctgg ttggcgcgcc ggttattacg ccgtttatga aagatatgga tgatatcttt 1320 ggctatggca aactgaatga tgagaaagcc atcgccgatt ggtggaaata g 1371 <210> 24 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cfrA R305S <400> 24 atggacaaag agaaatccaa caacgacaaa ccggcgacca agatcaaccg ccgccagttc 60 ctgaaattcg gcgcaggtgc atctagcggt atcgctatcg caactgcagc aactgcactg 120 ggtggcaaat ccctgatcga tcctaaacag gtgtacgcag gtactgtgaa agagctggac 180 gagctgccgt tcaacatccc tgcagactac aaaccgttca ctaaccagcg taacatctac 240 ggccaggcag tactgggtgt acctgagcct ctggcactgg tagaacgctt tgacgaagta 300 cgttggaacg gttggcaaac tgacggttct ccaggtctga ccgttctgga tggtgcagct 360 gcgcgtgcta gctttgctgt tgattattac ttcaacggcg agaactctgc ttgccgtgct 420 aacaagggtt tcttcgagtg gcacccgaaa gtggctgaac tgaacttcaa atggggcgac 480 ccagaacgta acatccacag cccaggtgtc aaatccgctg aagaaggtac catggctgtg 540 aagaagatcg cgcgtttctt cggtgctgct aaagcgggta tcgctccatt 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Gly Ser Asn Val Arg Leu 305 310 315 320 Cys Glu Val Phe Thr Asp Met Pro Leu Asn His Asp Lys Pro Ile Ser 325 330 335 Phe Gly Val Thr Glu Phe Cys Lys Thr Cys Lys Lys Cys Ala Glu Ala 340 345 350 Cys Ala Pro Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Asp Pro Thr Ile Asp Gly Pro 355 360 365 Arg Gly Gln Met Gln Asn Ser Gly Ile Lys Arg Trp Tyr Val Asp Pro 370 375 380 Val Lys Cys Leu Glu Phe Met Ser Arg Asp Asn Val Gly Asn Cys Cys 385 390 395 400 Gly Ala Cys Ile Ala Ala Cys Pro Phe Thr Lys Pro Glu Ala Trp His 405 410 415 His Thr Leu Ile Arg Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ile Thr Pro Phe 420 425 430 Met Lys Asp Met Asp Asp Ile Phe Gly Tyr Gly Lys Leu Asn Asp Glu 435 440 445 Lys Ala Ile Ala Asp Trp Trp Lys 450 455 <210> 28 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CfrA F-primer <400> 28 atcgagggaa ggatttcaga attcatggac aaagagaaat ccaa 44 <210> 29 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CfrA R-primer <400> 29 gtcgactcta gaggatccga attcttacta tttccaccaa tcgg 44 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 305 PMR primer <400> 30 agaatattcg cccagacc 18 <210> 31 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phe305 primer <400> 31 ctgggcgaat attctttttc tggcctgatg attactc 37 <210> 32 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val305 primer <400> 32 ctgggcgaat attctgtgtc tggcctgatg attactc 37 <210> 33 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ala305 primer <400> 33 ctgggcgaat attctgcgtc tggcctgatg attactc 37 <210> 34 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asn305 primer <400> 34 ctgggcgaat attctaactc tggcctgatg attactc 37 <210> 35 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cys305 primer <400> 35 ctgggcgaat attcttgctc tggcctgatg attactc 37 <210> 36 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leu305 primer <400> 36 ctgggcgaat attctcugtc tggcctgatg attactc 37 <210> 37 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gly305 primer <400> 37 ctgggcgaat attctggctc 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Sequence <220> <223> Met305 primer <400> 45 ctgggcgaat attctatgtc tggcctgatg attactc 37 <210> 46 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thr305 primer <400> 46 ctgggcgaat attctacctc tggcctgatg attactc 37 <210> 47 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gln305 primer <400> 47 ctgggcgaat attctcagtc tggcctgatg attactc 37 <210> 48 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu305 primer <400> 48 ctgggcgaat attctgaatc tggcctgatg attactc 37 <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ser305 primer <400> 49 ctgggcgaat attctagctc tggcctgatg attactc 37 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 184 PMR primer <400> 50 gatcttcttc acagccat 18 <210> 51 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phe184 primer <400> 51 atggctgtga agaagatctt tcgtttcttc ggtgctg 37 <210> 52 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Val184 primer <400> 52 atggctgtga agaagatcgt gcgtttcttc ggtgctg 37 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Gln Ala Gly Leu Gly Gln Tyr Ser 290 295 300 Ile Ser Gly Leu Met Ile Thr Pro Glu Phe Gly Ser Asn Val Arg Leu 305 310 315 320 Cys Glu Val Phe Thr Asp Met Pro Leu Asn His Asp Lys Pro Ile Ser 325 330 335 Phe Gly Val Thr Glu Phe Cys Lys Thr Cys Lys Lys Cys Ala Glu Ala 340 345 350 Cys Ala Pro Gln Ala Ile Ser Tyr Glu Asp Pro Thr Ile Asp Gly Pro 355 360 365 Arg Gly Gln Met Gln Asn Ser Gly Ile Lys Arg Trp Tyr Val Asp Pro 370 375 380 Val Lys Cys Leu Glu Phe Met Ser Arg Asp Asn Val Gly Asn Cys Cys 385 390 395 400 Gly Ala Cys Ile Ala Ala Cys Pro Phe Thr Lys Pro Glu Ala Trp His 405 410 415 His Thr Leu Ile Arg Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ile Thr Pro Phe 420 425 430 Met Lys Asp Met Asp Asp Ile Phe Gly Tyr Gly Lys Leu Asn Asp Glu 435 440 445 Lys Ala Ile Ala Asp Trp Trp Lys 450 455 <210> 111 <211> 1371 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cffA-A184W-Y279K-E302Q-R305I <400> 111 atggacaaag agaaatccaa caacgacaaa ccggcgacca agatcaaccg ccgccagttc 60 ctgaaattcg gcgcaggtgc atctagcggt atcgctatcg caactgcagc aactgcactg 120 ggtggcaaat ccctgatcga tcctaaacag gtgtacgcag gtactgtgaa agagctggac 180 gagctgccgt tcaacatccc tgcagactac aaaccgttca ctaaccagcg taacatctac 240 ggccaggcag tactgggtgt acctgagcct ctggcactgg tagaacgctt tgacgaagta 300 cgttggaacg gttggcaaac tgacggttct ccaggtctga ccgttctgga tggtgcagct 360 gcgcgtgcta gctttgctgt tgattattac ttcaacggcg agaactctgc ttgccgtgct 420 aacaagggtt tcttcgagtg gcacccgaaa gtggctgaac tgaacttcaa atggggcgac 480 ccagaacgta acatccacag cccaggtgtc aaatccgctg aagaaggtac catggctgtg 540 aagaagatct ggcgtttctt cggtgctgct aaagcgggta tcgctccatt cgacaaacgt 600 tgggtcttca ccgaaaccta cgccttcgtg aagaccccag aaggtgaatc tctgaaattc 660 atcccgccgg acttcggctt cgaaccgaaa cacgttatca gcatgatcat cccgcagagc 720 ccggaaggtg tcaaatgcga cccgagcttt ctgggttcta ccgaatacgg tctgtcttgt 780 gctcaaatcg gttacgccgc cttcggtctg tctatgttca tcaaagacct gggcaaacac 840 gccgttccga ttggttctga cagcgccctg gccattccga ttgcgattca ggcgggtctg 900 ggccagtatt ctatttctgg cctgatgatt actccggaat ttggcagcaa cgttcgtctg 960 tgtgaagtgt ttacggatat gccgctgaac catgacaaac cgatctcctt cggcgttacc 1020 gaattctgta agacgtgcaa gaaatgcgcg gaagcgtgtg cgccgcaggc gatttcctat 1080 gaagacccga ccattgatgg cccgcgtggc cagatgcaga actccggcat caaacgctgg 1140 tatgttgatc cggtaaaatg tctggaattc atgtcccgcg ataatgttgg caattgctgc 1200 ggcgcgtgca ttgcggcgtg cccgtttacc aaaccggaag cgtggcatca caccctgatt 1260 cgctccctgg ttggcgcgcc ggttattacg ccgtttatga aagatatgga tgatatcttt 1320 ggctatggca aactgaatga tgagaaagcc atcgccgatt ggtggaaata g 1371

Claims (22)

  1. 데할로게나제(dehalogenase) 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 데할로게나제 변이체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 변경은 상기 A184 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 W, Y279 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 K, E302 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 Q, R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 I, Q, E 또는 S, 또는 그의 조합으로 치환인 것인 변이체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 변경은 상기 A184W, Y279K, E302Q, R305I, R305Q, R305E 또는 R305S, 또는 그의 조합으로 치환인 것인 변이체.
  4. 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 데할로게나제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 550 내지 552번째 GCG가 TGG로 치환되거나, 835 내지 837번째 TAC가 AAA 또는 AAG로 치환되거나, 904 내지 906번째 GAA가 CAA 또는 CAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 ATT, ATC 또는 ATA로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 CAA 또는 CAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 GAA 또는 GAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 AGT, AGC, TCT, TCC, TCA 또는 TCG로 치환되거나, 또는 그의 조합인 것인 폴리뉴클레오티드.
  6. 데할로게나제의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 유전적 변형은 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 것인 미생물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 아미노산 변경은 상기 A184W, Y279K, E302Q, R305I, R305Q, R305E 또는 R305S, 또는 그의 조합으로 치환인 것인 미생물.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 550 내지 552번째 GCG가 TGG로 치환되거나, 835 내지 837번째 TAC가 AAA 또는 AAG로 치환되거나, 904 내지 906번째 GAA가 CAA 또는 CAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 ATT, ATC 또는 ATA로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 CAA 또는 CAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 GAA 또는 GAG로 치환되거나, 913 내지 915번째 CGT가 AGT, AGC, TCT, TCC, TCA 또는 TCG로 치환되거나, 또는 그의 조합인 것인 폴리뉴클레오티드인 것인 미생물.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 재조합 미생물은 Escherichia 속, Bacillus 속, 잔토박터(Xanthobacter) 속, Azotobacter 속, Agrobacterium 속, 또는 그의 조합인 것인 미생물.
  11. 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)의 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 데할로게나제 변이체를 포함하는 조성물로서, 상기 변이체는 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 것인 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 아미노산 변경은 상기 A184 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 W, Y279 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 K, E302 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 Q, R305 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 I, Q, E 또는 S, 또는 그의 조합으로 치환인 것인 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 아미노산 변경은 상기 A184W, Y279K, E302Q, R305I, R305Q, R305E 또는 R305S, 또는 그의 조합으로 치환인 것인 조성물.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 데할로게나제 변이체는 외래 유전자로부터 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하는 재조합 미생물의 형태인 것인 조성물.
  15. 데할로게나제 변이체를 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수) 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수)의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 CHnF4-n의 농도를 감소시키는 방법으로서, 상기 변이체는 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 데할로게나제 변이체는 외래 유전자로부터 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하는 재조합 미생물의 형태인 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 재조합 미생물은 데할로게나제 활성을 갖고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 A184, Y279, E302, R305 위치 또는 그의 조합에 해당하는 아미노산 잔기에서 아미노산 변경을 갖는 데할로게나제 변이체를 코딩하는 유전자가 도입된 것인 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 상기 접촉은 외래 유전자로부터 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하는 재조합 미생물을 CHnF4-n (n은 0 내지 3의 정수) 함유 시료와 접촉시키면서 배양 또는 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 15에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 외래 유전자로부터 발현된 데할로게나제 변이체를 포함하는 재조합 미생물이 증식하는 조건에서 배양하는 것을 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 15에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 수행되는 것인 방법.
  21. 청구항 15에 있어서, 상기 시료는 액체 또는 기체 상태인 것인 방법.
  22. 청구항 15에 있어서, 상기 CHnF4-n은 CF4, CHF3, 또는 CH2F2인 것인 방법.
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