KR20190025362A - 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질 변이체 및 그를 이용한 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법 - Google Patents

할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질 변이체 및 그를 이용한 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질 변이체 및 그를 이용한 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.

Description

할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질 변이체 및 그를 이용한 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법{Haloacid dehalogenase superfamily protein variant and method for reducing concentration of fluorine containing compound in sample}
할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질 변이체를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물, 시료 중 불소 함유 화합물을 제거하는데 사용하기 위한 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질을 포함하는 조성물, 및 상기 단백질을 이용하여 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
지구의 온난화를 가속시키는 온실가스의 배출은 심각한 환경 문제 중의 하나이며 이를 규제하고 방지하기 위해서 온실가스 배출량에 대한 규제가 강화되고 있다. 이 중 퍼플루오로카르본(perfluorocarbons: PFCs), 히드로플루오로카르본(hydrofluorocarbons: HFCs), 설퍼 헥사플루오리드(sulfur hexafluoride: SF6)와 같은 불화가스 (fluorinated gas: F-가스)는 절대 배출량은 낮으나 반감기가 길고 지구온난화 계수가 월등히 높아 더욱 심각한 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다. F-가스의 주요 배출원인 반도체 및 전자 산업 분야 등에서 F-가스의 발생량은 온실가스 배출 할당량을 초과하여 증가 추세에 있고 이에 따라 온실가스 분해 및 배출권 구입에 필요한 비용 부담이 매년 증가하고 있는 상황이다.
하지만, 기존의 F-가스 분해는 열분해 또는 촉매열산화 공정을 이용하고 있으나 제한된 분해율 및 2차 유해물질 배출, 고비용 등의 한계가 존재한다. 이를 해결하기 위해 미생물 생촉매를 이용한 생물학적 F-가스 분해 공정의 도입으로 기존의 화학적 분해 공정의 한계를 극복하고 보다 경제적이고 친환경적인 F-가스의 처리가 가능할 것으로 보인다.
할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(haloacid dehalogenase superfamily: HAD)는 포스파타제, 포스포나타제(phosphonatase), P-타입 ATPase, 베타-포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase), 포스포만노뮤타제(phosphomannomutase) 및 데할로게나제를 포함하는 효소의 수퍼패밀리이다. HAD는 아미노산 생합성에서 해독(detoxification)까지 여러 세포 과정에 관여한다.
이러한 종래 기술에도 불구하고, 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리의 변이체에 대한 요구가 있다.
일 양상은 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질 변이체를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
다른 양상은 시료 중 불소 함유 화합물을 제거하는데 사용하기 위한, 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 양상은 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질의 변이체를 불소 함유 화합물 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 양상은 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질의 변이체 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자 (gene)"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding 서열)과 3'-비코딩 서열 (3'-non coding 서열) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다. 상기 조절 영역은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터, 리보좀 결합 부위, polyA 결합 서열, 터미네이터 영역 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열(reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN 또는 BLASTP (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다. 본 명세서에서 달리 언급이 없으면, 상기 프로그램을 실행하는데 사용되는 파라미터의 선택은 아래와 같을 수 있다: E-값(value) 0.00001 및 H-값(value) 0.001이다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
일 양상은, 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(haloacid dehalogenase superfamily: HAD) 단백질의 변이체를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 제공한다.
상기 재조합 미생물에 있어서, 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(haloacid dehalogenase superfamily: HAD)는 포스파타제, 포스포나타제(phosphonatase), P-타입 ATPase, 베타-포스포글루코뮤타제(phosphoglucomutase), 포스포만노뮤타제(phosphomannomutase) 및 데할로게나제를 포함하는 효소일 수 있다. HAD는 HAD 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 상기 HAD는 EC 3.6.3.1에 속하는 포스포리피드-전치 ATPase(phospholipid-translocating ATPase), EC 3.1.3.45에 속하는 3-데옥시-D-만노-옥툴로소네이트(KDO) 8-포스페이트 포스파타제, EC 3.1.3.70에 속하는 만노실-3-포스포글리세레이트 포스파타아제, EC 3.1.3.18에 속하는 포스포글리콜레이트 포스파타아제, 또는 EC 3.8.1.2에 속하는 할로산 데할로게나제일 수 있다.
상기 ATPase는 Arabidopsis의 냉-내성(cold-tolerance) 추정 리피드-플립핑 효소일 수 있다. 3-데옥시-D-만노-옥툴로소네이트(KDO) 8-포스페이트 포스파타제는 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카리드의 성분인 KDO의 생합성에서 최종 단계를 촉매하는 것일 수 있다. 만노실-3-포스포글리세레이트 포스파타아제는 만노실-3-포스포글리세레이트를 가수분해하여 오스몰라이트 만노실글리세레이트를 형성하는 것일 수 있다. 상기 포스포글리콜레이트 포스파타아제는 2-포스포 글리콜레이트의 탈인산화를 촉매하는 것일 수 있다.
상기 HAD 단백질 또는 그의 변이체는 서열번호 1, 5, 29, 30, 31, 32 또는 33의 아미노산 서열과 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열을 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 변이체는 N122 및 S184로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 것으로서, 상기 번호는 서열번호 1의 아미노산 서열의 번호 또는 그에 해당하는 번호인 것일 수 있다. 상기 변이체는 HAD에 속하는 효소, 예를 들면, EC 3.8.1.2에 속하는 할로산 데할로게나제 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 아미노산 변경은 N122가 V 또는 Y로 치환된 것, 상기 아미노산 변경은 S184가 H, Q 또는 D로 치환된 것, 또는 이들의 조합, 또는 이들에 대하여 보존적 치환인 것일 수 있다. 상기 그에 해당하는 번호는 서열번호 5, 29, 30, 31, 32 및 33의 아미노산 서열의 N122 또는 S184인 것일 수 있다. 상기 단백질은 서열번호 1, 5, 29, 30, 31, 32 또는 33의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산을 갖는 BC3334에서 N122 및 S184에 해당하는 잔기 중 하나 이상을 다른 아미노산, 예를 들면, 19개 천연 아미노산으로 치환한 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 BC3334에서 N122 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 V 또는 Y로의 치환인 것을 갖는 것을 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 BC3334에서 S184 위치에 해당하는 아미노산 잔기가 H, Q 또는 D로의 치환인 것을 갖는 것을 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열의 BC3334에서 N122 위치에 해당하는 아미노산 잔기 및 S184 위치에 해당하는 아미노산 잔기는 각각 서열번호 5의 아미노산 서열의 SF0757에서 N122 위치에 해당하는 아미노산 잔기 및 S184 위치에 해당하는 아미노산 잔기인 것일 수 있다.
상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N122V, N122Y, 또는 둘 다를 갖는 것, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열에서 S184H, S184Q, S184D, 또는 이들의 조합 치환을 갖는 것일 수 있다.
상기 변경은 N122V, N122Y, S184H, S184Q, 또는 S184D과 같이 단독 변이 뿐만 아니라, N122V 및 S184H; N122V 및 S184Q; N122V 및 S184D; N122Y 및 S184H; N122Y 및 S184Q; 또는 N122Y 및 S184D와 같은 이중 변이를 포함할 수 있다.
상기 아미노산 변경은 치환, 삽입 또는 결실일 수 있다. 상기 치환은 번역 후된 변형된 아미노산으로 치환되는 것을 포함할 수 있다. 상기 치환은 천연 아미노산 20개 아미노산 중 해당 아미노산을 제외한 19개 중 하나의 아미노산으로 치환되는 것일 수 있다. 본 명세서에 사용된 아미노산 및 그 약자는 표 1과 같다.
약자 아미노산
A Ala 알라닌
C Cys 시스테인
D Asp 아스파르트산
E Glu 글루탐산
F Phe 페닐알라닌
G Gly 글리신
H His 히스티딘
I Ile 이소루신
K Lys 리신
L Leu 루신
M Met 메티오닌
N Asn 아스파라긴
P Pro 프롤린
Q Gln 글루타민
R Arg 아르기닌
S Ser 세린
T Thr 트레오닌
V Val 발린
W Trp 트립토판
Y Tyr 티로신
용어 "보존적 돌연변이(conservative mutation)" 또는 "보존적 치환(conservative substitution)"은 각각 통상의 기술자가 제1 돌연변이에 대하여 보존성(conservative)일 것이라고 여기는 아미노산 돌연변이를 나타낸다. 본 명세서에서 "보존성(conservative)"은 아미노산 특성의 관점에서 비슷한 아미노산을 의미한다. 예를 들면, 특정 위치에서 비-지방족 아미노산 잔기 (non-aliphatic amino acid residue)(예, Ser)가 지방족 아미노산 잔기 (예, Leu)로 치환된 경우, 동일한 위치에서 다른 지방족 아미노산 잔기 (예, ILe 또는 Val)로 치환하는 것은 보존성 돌연변이라고 한다. 또한, 아미노산 특성은 잔기의 크기, 소수성, 극성, 전하, pK-값, 및 당업계에 알려진 다른 아미노산 특성을 포함한다. 따라서, 보존적 돌연변이는 염기성 대신 염기성, 산성 대신 산성, 극성 대신 극성 등과 같은 치환을 포함한다. 이들 아미노산 세트는 구조적 원인으로 보존되기 쉽다. 보존적 치환은 일반적으로 수용되고 있는 아미노산의 특성 그룹핑을 기술하는 표 2에 따라 이루어질 수 있다.
세트 서브-세트
소수성
 F W Y H K M I L V A G C
 방향족 F W Y H
지방족 I L V

극성
W Y H K R E D C S T N Q
 전하 H K R E D
양전하 H K R
음전하 E D
작은(small) V C A G S P T N D 아주 작은(tiny) A G S
본 명세서에 사용된 용어 "해당하는(corresponding)"은, BLAST 페어와이즈 정렬, 또는 잘 알려진 리프만-피어슨 단백질 정렬(Lipman-Pearson Protein Alignment) 프로그램과 같은 당업계에서 수용될 수 있는(art-acceptable) 단백질 정렬 프로그램(protein alignment program)을 하기 정렬 파라미터를 가지고 이용하여 관심 대상 단백질과 표준 단백질의 아미노산 서열(예, 서열번호 1)을 정렬하였을 때, 표준 단백질의 언급된 위치(예, 서열번호 1의 N122 위치 또는 S184)와 정렬하는 관심 대상 단백질의 아미노산 위치를 나타낸다. 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열의 BC3334에서 N122 위치에 해당하는 아미노산 잔기 및 S184 위치에 해당하는 관심 대상 단백질 SF0757의 아미노산 잔기는 각각 서열번호 5의 아미노산 서열의 SF0757에서 N122 위치에 해당하는 아미노산 잔기 및 S184 위치에 해당하는 아미노산 잔기인 것일 수 있다. 상기 관심 대상 단백질은 HAD, 예를 들면, EC 3.8.1.2에 속하는 것일 수 있다. 표준서열이 저장된 데이터베이스(DB)는 NCBI의 RefSeq non-redundant proteins일 수 있다. 서열의 정렬에 사용되는 파라미터는 다음과 같을 수 있다: E-값 0.00001 및 H-값 0.001의 범위 속하는 것일 수 있다.
상기 정렬 조건에 따라 얻어진 서열번호 1의 아미노산 서열의 N122 위치 및 S184에 해당하는 아미노산 잔기를 갖는 단백질 (이하,이들을 "BC3334의 호모로그(homolog)"라 한다)의 예는 아래 표 3과 같다. 상기 호모로그는 서열번호 1의 아미노산 서열과 85 % 이상의 서열을 동일성을 갖는 것일 수 있다. 이들 서열을 정렬(alignment)한 결과 및 번호매김은 도 4에 나타낸 바와 같다. 도 4에서 밑줄친 부분은 N122, 및 S184를 나타내며 N 말단 잔기는 1, C 말단 잔기를 236이다.
서열번호 유전자 심볼
(로커스 태그)		 유전자 설명
29 CT43_CH3258 2-할로알카노산 데할로게나제
Bacillus thuringiensis serovar chinensis CT-43
30 BTB_c33930 yfnB1: 잠정적 HAD-히드롤라제 YfnB
Bacillus thuringiensis Bt407
31 BMB171_C3020 2-할로알카노산 데할로게나제
Bacillus thuringiensis BMB171
32 BCB4264_A3346 히드롤라제, 할로산 데할로게나제-유사 패밀리
Bacillus cereus B4264
33 BTG_02795 2-할로알카노산 데할로게나제
Bacillus thuringiensis HD-771
상기 재조합 미생물은 박테리아 또는 진균(fungi)일 수 있다. 상기 박테리아는 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 상기 그람 음성 박테리아는 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae) 패밀리에 속하는 것일 수 있다. 상기 그람 음성 박테리아는 에스케리키아(Escherichia) 속, 살모넬라(Samonella) 속, 잔토박터(Xanthobacter) 속 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 속에 속하는 것일 수 있다. 에스케리키아 속 미생물은 대장균일 수 있다. 잔토박터 속은 잔토박터 아우토트로피쿠스를 포함하는 것일 수 있다. 그람 양성 박테리아는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 또는 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 서열번호 2, 6, 20, 22, 24, 26, 또는 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상이 도입된 것일 수 있다.
다른 양상은 시료 중 불소 함유 화합물을 제거하는데 사용하기 위한, 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(HAD) 단백질의 변이체를 포함하는 조성물을 제공한다. 달리 언급이 없으면, 상기 재조합 HAD 단백질의 변이체는 상기한 바와 같다. 상기 불소 함유 화합물은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 것일 수 있다:
<화학식 1>
C(R1)(R2)(R3)(R4)
<화학식 2>
(R5)(R6)(R7)C-[C(R11)(R12)]n-C(R8)(R9)(R10)
상기 식들에서, n은 0 내지 10의 정수이며, R1, R2, R3 및 R4가 서로 독립적으로 F, Cl, Br, I, 또는 H이며, R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상이 F이며, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12이 서로 독립적으로 F, Cl, Br, I, 또는 H이며, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12 중 하나 이상이 F이다.
상기 조성물에 있어서, 상기 불소 함유 화합물은 예를 들면, CHF3, CH2F2, CH3F, 또는 CF4일 수 있다. 용어 "제거"는 시료 중의 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 것을 포함한다. 상기 감소는 완전한 제거를 포함한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 HAD 단백질의 변이체는 EC 3.8.1.2에 속하는 것일 수 있다. 상기 HAD 단백질 변이체는 상기한 바와 같다.
상기 조성물에 있어서, HAD 단백질의 변이체는, 상기 단백질의 변이체를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물 중에 포함된 것일 수 있다. 상기 조성물은 상기 재조합 미생물, 그의 파쇄물(lysate), 또는 상기 파쇄물의 수용성 물질 분획을 포함하는 것일 수 있다. 달리 언급이 상기 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 조성물에 있어서, 상기 불소 함유 화합물의 제거는 불소 함유 화합물의 C-F의 결합을 절단하거나, 불소 함유 화합물을 다른 물질로 전환하거나, 세포 내에 축적하여, 불소 함유 화합물의 농도를 줄이는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 전환은 불소 함유 화합물에 히드록실기와 같은 친수성 기를 도입하는 것, 또는 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중결합을 도입하는 것일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 시료는 액체 또는 기체 상태일 수 있다. 상기 시료는 공장 폐수 또는 폐기체일 수 있다.
다른 양상은 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(HAD) 단백질의 변이체를 화학식 1 또는 2의 불소 함유 화합물 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법을 제공한다. 달리 언급이 없으면, 상기 재조합 HAD 단백질의 변이체는 상기한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 접촉은 기체 시료와 HAD 단백질의 변이체 함유 액체를 접촉시키는 기체-액체 접촉일 수 있다. 또한, 상기 접촉은 액체 시료와 HAD 단백질의 변이체 함유 액체를 접촉시키는 액체-액체 접촉일 수 있다. 상기 액체-액체 접촉은 혼합하는 것을 포함한다.
상기 방법에 있어서, HAD 단백질의 변이체는, 상기 단백질의 변이체를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물 중에 포함된 것일 수 있다. 따라서, 상기 접촉은 시료가 세포와 먼저 접촉한 후 세포 중의 상기 변이체와 접촉하는 것일 수 있다. 상기 변이체는 상기 재조합 미생물, 그의 파쇄물, 또는 상기 파쇄물의 수용성 물질 분획을 포함된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물에 포함된 외래 유전자에 대해서는 전술된 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 상기 접촉은 밀폐된 용기 중에서 재조합 미생물이 생존가능한 조건에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 생존가능한 조건은 재조합 미생물이 증식가능한 조건 또는 휴지 상태(resting state)로 있게 하는 조건일 수 있다. 이 경우, 상기 접촉은 불소 함유 화합물의 존재하에서 미생물을 배양하는 것일 수 있다. 상기 배양은 호기 또는 혐기 조건에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 시료는 액체 또는 기체 상태일 수 있다. 상기 시료는 공장 폐수 또는 폐기체일 수 있다.
다른 양상은 N122 및 S184로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 것으로서, 상기 번호는 서열번호 1의 아미노산 서열의 번호 또는 그에 해당하는 번호인 것인 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(HAD) 단백질 변이체를 제공한다. 상기 변이체는 상기한 바와 같다.
다른 양상은 N122 및 S184로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 것으로서, 상기 번호는 서열번호 1의 아미노산 서열의 번호 또는 그에 해당하는 번호인 것인 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(HAD) 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 변이체는 상기한 바와 같다.
상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 중에 포함된 것일 수 있다. 상기 벡터는 폴리뉴클레오티드를 미생물 내로 도입하는데 사용될 수 있는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
일 양상에 따른 재조합 미생물은 시료 중 불소 함유 화합물을 제거하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 HAD 단백질을 포함하는 조성물은 시료 중 불소 함유 화합물을 제거하는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법은 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 효율적으로 감소시킬 수 있다.
다른 양상에 따른 상기 변이체 및 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 시료 중 불소 함유 화합물을 제거하는데 또는 상기 변이체를 생산하는데 사용될 수 있다.
도 1은 pET-BC3334 벡터의 벡터 지도를 나타낸다.
도 2는 유리 딤로스 나사관 환류 냉각기의 개략도이다.
도 3은 pET-SF0757 벡터의 벡터 지도를 나타낸다.
도 4는 BC3334 단백질의 호모로그 서열을 정렬한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: BC3334 유전자를 발현하는 재조합 대장균 및 그를 이용한 시료 중 불소 함유 화합물의 제거
본 실시예에서는 HAD 유전자로서 Bacillus cereus 유래 BC3334 및 그의 변이체 유전자를 발현하는 재조합 대장균을 제작하고, 그를 이용하여 시료 중 CF4의 제거 효과를 확인하였다.
1. Bacillus cereus 유래 할로산 데할로게나제 유전자 ( BC3334 ) 증폭 및 대장균에 도입
B. cereus (ATCC 14579) 유래 BC3334 유전자의 공지된 서열을 증폭하였다. 증폭은 상기 균주의 게놈을 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 프라이머 세트로 하여 PCR을 수행하였고, 증폭된 유전자는 제한효소 NcoI 및 HindIII를 사용하여 절단된 pETDuet-1 (Novagen, Cat. No. 71146-3)와 InFusion Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.)를 통해 연결하여 pET-BC3334 벡터를 제조하였다. 도 1은 pET-BC3334 벡터의 벡터 지도를 나타낸다. BC3334 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖고 그 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
다음으로, 제작된 pET-BC3334를 대장균 BL21에 열 충격(heat shock) 방법으로 도입하고, 암피실린 100 ㎍/mL이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여, 암피실린 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 최종적으로 선별된 균주를 재조합 대장균 BL21/pET-BC3334wt로 명명하였다.
2. 돌연변이 BC3334 유전자를 발현하는 재조합 대장균
본 절에서는 BC3334의 시료 중 불소 함유 화합물 제거 활성을 개선하기 위하여 돌연변이체를 제작하였다. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 122번 위치의 아스파라긴(asparagine))(이하 "N122"이라고도 함) 및/또는 184번 위치의 세린(이하 "S184"라고도 함)을 다른 19개 천연 아미노산으로 치환하였다. 여기서, 상기 치환을 이하 각각 "N122X" (여기서, X는 아스파라긴 외의 19개 천연 아미노산을 나타낸다.) 또는 "S184X" (여기서, X는 세린 외의 19개 천연 아미노산을 나타낸다.)라고도 한다. 얻어진 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 대장균에 도입하여 얻어진 대장균의 시료 중 CF4 제거 활성을 확인하였다.
서열번호 1의 N122X 및/또는 S184X 돌연변이체의 제작은 QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent Technology, USA)를 사용하여 이루어졌다. 상기 Kit를 사용한 위치-지향 돌연변이 유발 방법은 가장 높은 신뢰도(highest fidelity)를 갖는 두 플라스미드 가닥의 돌연변이유발성 프라이머-지향된 복제(mutagenic primer-directed replication)를 위하여 PfuUlta 고-신뢰도(high-fidelity:HF) DNA 폴리머라제를 사용하여 수행된다. 기본 과정은 원하는 삽입체(insert)를 가진 수퍼코일된 이중가닥 DNA(dsDNA) 벡터 및 둘 다 원하는 돌연변이를 포함하는, 두 개 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한다. 상기 벡터의 마주보는 가닥(opposite strand)에 각각 상보적인 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 프라이머 치환(primer displacement) 없이, PfuUlta HF DNA 폴리머라제에 의한 온도 순환(temperature cycling) 동안 연장된다. 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 연장으로 인하여, 스태거 닉(staggered nick)을 포함한 돌연변이된 플라스미드가 생성된다. 상기 온도 순환 후, 산물을 DpnI으로 처리한다. DpnI 엔도뉴클레아제(표적 서열: 5'-Gm6ATC-3')은 메틸화 및 헤미메틸화 DNA에 특이적이고 부모(parental) DNA 주형을 분해하여 돌연변이-함유 합성된 DNA를 선택하기 위하여 사용된다. 그 후 원하는 돌연변이를 포함한 이 닉이 생성된 벡터 DNA는 XL1-Blue 수퍼콤페텐트 세포에 형질도입된다.
N122X 및 S184X 돌연변이 유발을 위하여 사용된 각 프라이머 세트 중 N122Y 및 N122V에 대한 것은 각각 서열번호 9 및 10, 및 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트이다. N122Y 및 N122V를 변이를 갖는 BC3334 단백질은 각각 서열번호 19 및 21의 아미노산 서열을 갖고, 이들은 각각 서열번호 20 및 22의 뉴클레오티드 서열에 의하여 코딩될 수 있다.
구체적으로, 1절에서 제작된 pET-BC3334wt 벡터를 주형으로 하고, 상기 각 돌연변이에 대한 프라이머 세트를 프라이머로 하고 PfuUlta HF DNA 폴리머라제를 사용한 PCR을 통하여 스태거 닉을 포함한 돌연변이된 벡터를 얻었다. 이 벡터 산물을 DpnI으로 처리하여 돌연변이-함유 합성된 DNA를 선택하였다. 그 후 얻어진 원하는 돌연변이를 포함한 이 닉이 생성된 벡터 DNA를 XL1-Blue 수퍼콤페텐트 세포에 형질도입하여, pET-BC3334mt 벡터를 클로닝하였다.
마지막으로, 클로닝된 pET-BC3334wt 벡터를 1절에 기재된 바와 동일한 과정을 거쳐서 대장균 BL21 균주에 도입하여 최종적으로 선별된 균주를 재조합 대장균 BL21/pET-BC3334mt로 명명하였다.
3. BC3334 변이체가 도입된 재조합 대장균의 시료 중 CF 4 제거 효과
본 절에서는 2절에서 제작된 돌연변이 BC3334 유전자가 도입된 대장균 BL21/pET-BC3334mt가 시료 중 CF4를 제거하는데 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 대장균 BL21/pET-BC3334mt 균주를 LB 배지에서 30 ℃에서 230 rpm으로 교반하면서 배양하여 OD600=0.5 정도에서 IPTG 0.2 mM을 첨가한 후, 20 ℃에서 230 rpm으로 교반하면서 밤새 배양하였다. 이 세포를 수확하고, 세포 농도 OD600=3.0이 되도록 LB 배지 중에 현탁하였다. 이 세포액 10 mL을 60 mL 혈청 병에 첨가하고 밀봉하였다. 상기 LB 배지는 증류수 1 L 당 트립톤 10 g, 효모 추출물 5 g, 및 NaCl 10 g을 포함한다. 다음으로, 기체 상의 CF4를 헤드스페이스 내 1000 ppm이 되도록 주사기를 사용하여 혈청 병의 캡의 탄성재질(rubber stopper)을 통하여 주입하였다. 그 후, 상기 혈청 병을 30 ℃에서 230 rpm으로 교반하면서 4일 동안 배양하였다. 실험은 3 배수(triplicate)로 하였다. 인큐베이션 후 혈청 병 중 배지가 포함되지 않은 헤드스페이스 중의 기체를 1.0 mL를 주사기를 사용하여 0.5 mL 채취하여, GC(Agilent 7890, Palo Alto, CA, USA)에 주입하였다. 주입된 CF4는 CP-PoraBOND Q 칼럼(25 m 길이, 0.32 mm 내경(inner diameter), 5 um 필름 두께, Agilent)을 통해 분리되었고, 질량 분석(mass spectrometry)(Agilent 5973, Palo Alto, CA, USA)를 통해 CF4 농도 변화를 분석하였다. 운반 기체는 헬륨을 사용하였고 1.5 ml/min 속도로 칼럼에 흘려 보냈다. GC 조건은 주입구 온도는 250 ℃이고, 초기 온도 40℃에서 2 분간 유지하고, 290 ℃까지 20 ℃/min으로 승온시켰다. 질량 분석 조건은 70 eV의 이온화 에너지, 인터페이스 온도는 280 ℃이고, 이온 소스 온도는 230 ℃이고, 쿼드루플(quadrupole) 온도는 150 ℃이었다. 그 결과, 표 4는 야생형 대비 상기 변이체를 포함하는 균주가 시료 중 CF4 가스를 제거하는 활성을 나타낸다.
균주 CF4 분해율(%, 대조군 대비)
야생형 4.11
BL21/pET-BC3334wt(N122Y) 9.29
BL21/pET-BC3334mt(N122V) 5.99
표 4에서, 대조군은 pET-BC3334mt 벡터 대신 pETDuet 공백터가 도입된 대장균 BL21이다. 야생형은 야생형 BC3334를 포함하는 대장균을 나타낸다.
표 4에 나타낸 바와 같이, BC3334 야생형 유전자를 포함하는 대장균은 대조군 대비 CF4의 수준을 4.11% 감소시켰으며, BC3334 변이체 즉, N122Y 및 N122V 유전자를 포함하는 대장균은 대조군 대비 CF4의 수준을 각각 9.29 % 및 5.99 % 감소시켰다.
4. 순환공정을 사용한 불소 함유 화합물의 분해
도 2에서 보여지는 바와 같이, 고온 멸균되고 수직 방향으로 배치된 유리 딤로스(Dimroth) 나사관 환류 냉각기(반응기 길이 350 mm, 외관 직경 35 mm, 내부 부피 200 mL) 내에 LB 배지 50 ml 및 CF4 가스 1000 ppm을 주입한 후 LB 배지를 순환시켰다. 도 2는 유리 딤로스 나사관 환류 냉각기의 개략도이다. LB 배지는 냉각기 상부의 입구로 공급되어 냉각기의 내면 벽을 타고 흘러 냉각기 하부의 출구로 배출되었다. 배출된 LB 배지는 순환라인을 따라 입구에 재공급되었다. 도 2에 도시되지 않으나, 냉각기의 내부 나사관은 온도 유지를 위하여 30 ℃ 항온존에 연결하였다. LB 배지의 순환속도는 4 mL/min로 유지하였다. 지정된 시간 즉, 0, 48, 96, 및 144 시간 경과 후, 냉각기 내부의 CF4 가스 함량을 GC-MS로 확인하였다. CF4 가스 함량의 변화가 없었다.
이어서, 1 및 2절에 언급된 재조합 미생물 및 대조군 미생물을 각각 냉각기 내의 LB 배지에 주사기로 초기 농도 OD600 5.0이 되도록 접종하였다. 재조합 미생물은 BC3334 야생형 및 변이체 유전자가 각각 도입된 재조합 대장균이다. BC3334 야생형 유전자가 도입된 대장균과 BC3334 변이체 유전자가 도입된 대장균의 CF4 분해능을 비교하였다. 공벡터가 도입된 대장균은 음성 대조군으로 사용하였으며, CF4 수준은 변화가 없었다.
LB 배양액의 순환속도는 4 mL/min이었으며, 냉각기 내부 온도는 30 ℃로 유지하였다. 균주 접종 후 144 시간 경과 후, 냉각기 내부의 CF4 가스 함량을 GC-MS(Gas Chromatography Mass-Spectrum)로 확인하여 CF4 분해율을 하기 수학식 1로부터 계산하고 그 결과를 표 5에 나타내었다.
<수학식 1>
CF4 분해율 = [(초기 CF4 함량 - 반응 후 CF4 함량) / 초기 CF4 함량] × 100
균주 CF4 분해율(%)
BL21/pET-BC3334wt 33.1
BL21/pET-BC3334mt(N122Y) 44.5
표 5에 나타낸 바와 같이, 배양 144 시간 후 BC3334 변이체는 야생형 대비하여 미생물을 이용한 기상순환 공정을 적용하였을 때 1.34 배의 분해율 증가를 보였다.
실시예 2: SF0757 및 그의 변이체 유전자를 발현하는 재조합 대장균에 의한 시료 중 CF 4 제거
1. 바실러스 봄비셉티쿠스 SF3 균주 선별 및 그에 의한 불소 함유 화합물의 분해
본 실시예에서는 반도체 공장 폐수 중의 CF4의 농도를 감소시킬 수 있는 미생물을 선별하였다.
삼성전자 기흥 공장에서 방출된 폐수 중의 슬러지를 탄소가 함유되지 않은 배지 (0.7 g/L K2HPO4, 0.7 g/L MgSO4·7H2O, 0.5 g/L (NH4)2SO4, 0.5 g/L NaNO3, 0.005 g/L NaCl, 0.002 g/L FeSO4·7H2O, 0.002 g/L ZnSO4·7H2O, 0.001 g/L MnSO4 및 15 g/L Agar)가 함유된 아가 플레이트에 도말하고, GasPak™ Jar(BD Medical Technology)에 넣고 자(jar)의 내부를 99.9 v/v% CF4로 충진 후 밀폐하여 혐기 조건에서 30 ℃에서 정치 배양하였다. 배양 후 형성된 싱글 콜로니를 고속 대량스크리닝 (high throughput screening: HTS) 시스템 (Thermo Scientific/Liconic/Perkin Elmer)을 이용하여 배양하였다. 각각의 싱글 콜로니를 LB 배지 100 μL/well이 함유된 96 웰 마이크로 플레이트에 접종하고 30 ℃에서 96 시간 동안 호기 상태에서 정치 배양하면서 12 시간마다 600 nm에서 흡광도를 측정하여 성장 능력을 관찰하였다.
우수한 성장능을 보여주는 상위 2 %의 균주들을 선별하여 각각의 균주들을 LB 배지 10 mL이 담겨 있는 부피 75 mL의 유리 혈청 병(serum bottle)에 OD600이 0.5이 되도록 접종한 후, 밀봉하고 CF4 가스가 1000 ppm이 되도록 주사기를 사용하여 CF4를 주입하고, 진탕 배양기(shaking incubator)에서 4일 동안 30 ℃에서 230 rpm으로 교반하면서 인큐베이션한 후, 헤드스페이스 중 CF4의 양을 분석하였다.
분석은 헤드스페이스로부터 주사기를 사용하여 0.5 ml를 채취하여 3절에 기재된 조건과 동일한 조건에서 CF4 양을 분석하였다. 대조군의 경우, 세포를 포함하지 않은 1000 ppm의 CF4를 동일 조건에서 인큐베이션한 후 측정하였다.
그 결과, 분리된 미생물은 세포를 포함하지 않은 대조군에 비하여 CF4 농도가 10.27% 감소하였다. 상기 미생물은 0.02586 g/kg-cell/h의 분해 활성을 가지고 있다. 선별된 균주를 동정하기 위하여, 균주의 게놈 서열을 분석하였다.
넥스트 제너레이션 시퀀싱(Next generation sequenceing: NGS)에서 얻어진 3개 콘티그(contig)를 어셈블리하여 얻은 게놈의 최종 크기는 5.3 Mb이며 어노테이션 결과 총 5,490개의 유전자가 존재하였다. 각 콘티그에 대하여 계통수(phylogenetic tree) 분석결과 Bacillus bombysepticus 계열임을 확인하였다.
이렇게 분리된 미생물을 Bacillus bombysepticus SF3로 새롭게 명명하고, 2017년 2월 24일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국생물자원센터(Korea Collection for Type Culture: KCTC)에 기탁하여, 수탁번호 KCTC 13220BP를 수여받았다.
2. 바실러스 봄비셉티쿠스 SF3 균주 유래 유전자 및 그 변이체를 포함하는 재조합 미생물의 제조
1절에 기재된 바와 같이 동정된 바실러스 봄비셉티쿠스 SF3 균주의 게놈 서열분석을 통해 데할로게나제를 코딩하는 것으로 추정되는 유전자 SF0757 (서열번호 6)을 선별하였다.
B. bombysepticus SF3를 LB 배지 중에서 30 ℃에서 230 rpm으로 교반하면서 밤새 배양한 후, 총 DNA 추출 키트 (total DNA extraction kit)(Invitrogen Biotechnology)를 사용한 방법으로 게놈 DNA를 분리하고, 이 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 뉴클레오티드 서열을 프라이머 세트로 하여 PCR을 수행하여, SF0757 유전자를 증폭하여 얻었다. 증폭된 유전자는 제한효소 NcoI 및 XhoI를 사용하여 절단된 pET28a (Novagen, Cat. No. 69864-3)와 InFusion Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc.)를 통해 연결하여 pET-SF0757 벡터를 제조하였다. 도 3은 pET-SF0757 벡터의 벡터 지도를 나타낸다. SF0757는 각각 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖고, 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩한다.
다음으로, 제작된 pET-SF0757을 대장균 BL21에 열 충격 방법으로 도입하고, 카나미신 50 ㎍/mL이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여, 카나미신 내성을 보이는 균주를 선별하였다. 최종적으로 선별된 재조합 대장균 BL21/pET-SF0757로 명명하였다.
3. SF0757 돌연변이 유전자를 발현하는 재조합 대장균 제작
본 절에서는 SF0757의 시료 중 불소 함유 화합물 제거 활성을 개선하기 위하여 돌연변이체를 제작하였다. 서열번호 5의 아미노산 서열 중 122번 위치의 아스파라긴(이하 "N122"이라고도 함) 및/또는 184번 위치의 세린(이하 "S184"라고도 함)을 다른 19개 천연 아미노산으로 치환하였다. 여기서, 상기 치환을 이하 각각 "N122X" (여기서, X는 아스파라긴 외의 19개 천연 아미노산을 나타낸다.) 또는 "S184X" (여기서, X는 세린 외의 19개 천연 아미노산을 나타낸다.)라고도 한다. 얻어진 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 대장균에 도입하여 얻어진 대장균의 시료 중 CF4 제거 활성을 확인하였다.
N122X 및 S184X 돌연변이 유발을 위하여 사용된 각 프라이머 세트 중 S184H, S184Q, 및 S184D에 대한 것은 각각 서열번호 13 및 14, 서열번호 15 및 16, 서열번호 17 및 18이다. S184H, S184Q, 및 S184D를 변이를 갖는 SF0757 단백질은 각각 서열번호 23, 25 및 27의 아미노산 서열을 갖고, 이들은 각각 서열번호 24, 26 및 28의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
상기 돌연변이체 제작 및 그 유전자를 포함하는 재조합 대장균의 제작은 실시예1의 3절에 기재된 바와 같다.
마지막으로, 클로닝된 pET-SF0757mt 벡터를 1절에 기재된 바와 동일한 과정을 거쳐서 대장균 BL21 균주에 도입하여 최종적으로 선별된 균주를 재조합 대장균 BL21/pET-SF0757mt로 명명하였다.
4. SF0757 변이체가 도입된 재조합 대장균의 시료 중 CF 4 제거 효과
본 절에서는 3절에서 제작된 돌연변이 SF0757 유전자가 도입된 대장균 BL21/pET-SF0757mt가 시료 중 CF4를 제거하는데 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 대장균 BL21/pET-SF0757mt 균주를 LB 배지에서 30 ℃에서 230 rpm으로 교반하면서 배양하여 OD600=0.5 정도에서 IPTG 0.2 mM을 첨가한 후, 20 ℃에서 230 rpm으로 교반하면서 밤새 배양하였다. 이 세포를 수확하고, 세포 농도 OD600=3.0이 되도록 LB 배지 중에 현탁하였다. 이 세포액 10 mL을 60 mL 혈청 병에 첨가하고 밀봉하였다. 다음으로, 기체 상의 CF4를 헤드스페이스 내 1000 ppm이 되도록 주사기를 사용하여 혈청 병의 캡의 탄성재질을 통하여 주입하였다. 그 후, 상기 혈청 병을 30 ℃에서 230 rpm으로 교반하면서 4 일 동안 배양하였다. 실험은 3 배수로 하였다. 인큐베이션 후 혈청 병 중 배지가 포함되지 않은 헤드스페이스 중의 CF4를 실시예 1의 3절에 기재된 것과 동일한 조건으로 분석하였다.
그 결과, 표 6은 야생형 대비 상기 변이체를 포함하는 균주가 시료 중 CF4 가스를 제거하는 활성을 나타낸다
균주 CF4 분해율(%, 대조군 대비)
야생형 3.95
BL21/pET-SF0757(S184H) 8.76
BL21/pET-SF0757(S184Q) 7.35
BL21/pET-SF0757(S184D) 5.61
표 6에서, 대조군은 pET-SF0757 벡터 대신 pET28a 공백터가 도입된 대장균 BL21이다. 야생형은 야생형 SF0757을 포함하는 대장균을 나타낸다.
표 6에 나타낸 바와 같이, SF0757 야생형 유전자를 포함하는 대장균은 대조군 대비 CF4의 수준을 3.95% 감소시켰으며, SF0757 변이체 즉, S184H, S184Q, 및 S184D 유전자를 포함하는 대장균은 대조군 대비 CF4의 수준을 각각 8.76 %, 7.35 % 및 5.61 % 감소시켰다.
5. 순환공정을 사용한 불소 함유 화합물의 분해
3절에서 제작된 재조합 대장균 BL21/pET-SF0757 균주를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 4절에 기재된 바와 동일한 과정에 의하여 시료 중 불소 함유 화합물의 분해율을 측정하였다.

균주		 CF4 분해율(%)
BL21/pET-SF0757wt 25.7
BL21/pET-SF0757mt(S184H) 29.9
표 7에 나타낸 바와 같이, 배양 144 시간 후 SF0757 변이체는 야생형 대비하여 미생물을 이용한 기상순환 공정을 적용하였을 때 1.16 배의 분해율 증가를 보였다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Haloacid dehydrogenase superfamily protein variant and method for reducing concentration of fluorine containing methane in sample <130> PN118043KR <160> 33 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 1 Met Lys Tyr Lys Val Ile Leu Phe Asp Val Asp Asp Thr Leu Leu Asp 1 5 10 15 Phe Pro Glu Thr Glu Arg His Ala Leu His Asn Ala Phe Val Gln Phe 20 25 30 Asp Met Pro Thr Gly Tyr Asn Asp Tyr Leu Ala Ser Tyr Lys Glu Ile 35 40 45 Ser Asn Gly Leu Trp Arg Asp Leu Glu Asn Lys Met Ile Thr Leu Ser 50 55 60 Glu Leu Ala Val Asp Arg Phe Arg Gln Leu Phe Ala Leu His Asn Ile 65 70 75 80 Asp Val Asp Ala Gln Gln Phe Ser Asp Val Tyr Leu Glu Asn Leu Gly 85 90 95 Lys Glu Val His Leu Ile Glu Gly Ala Val Gln Leu Cys Glu Asn Leu 100 105 110 Gln Asp Cys Lys Leu Gly Ile Ile Thr Asn Gly Tyr Thr Lys Val Gln 115 120 125 Gln Ser Arg Ile Gly Asn Ser Pro Leu Cys Asn Phe Phe Asp His Ile 130 135 140 Ile Ile Ser Glu Glu Val Gly His Gln Lys Pro Ala Arg 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S184D mutant <400> 28 atgaaataca aatttatatt attcgacgta gacgatacat tattagattt ccctgaaacg 60 gaaagacacg cattacataa tgcgtttgta cagttcggga tgcctacagg gtataatgat 120 tatcttgcaa gttataaaga gattagtaat ggattatgga gagatttaga aaataaaatg 180 attacgctaa gtgaattagc ggtagatcga tttagacaat tatttgccct tcataatata 240 aaagtagatg cgcagcaatt tagcgatgta tatcttgaaa acttagggaa agaagtacat 300 cttatagaag gtgcagtgca attatgtgag gatctacaag attgcaagtt aggtattatt 360 acgaatggat atacgaaggt gcaacaatcg agaattggaa attcgcctgt atgtaatttc 420 tttgatcata ttattatttc agaagaggtt ggtcatcaaa aaccagcacg tgagattttt 480 gattatgcgt ttgaaaagtt tgggattaca gataaatcaa gtgtattaat ggttggagat 540 tcgctttctg atgatatgag aggcggagaa gattacggca ttgatacgtg ttggtataat 600 ccgagtttga aagaaaatag gacagatgtt aagccgtctt atgaagtgga gagtctgcta 660 caaattttag aaattgtaga agtgactaaa gaaaaagtag cttcatttta a 711 <210> 29 <211> 236 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 29 Met Lys Tyr Lys Val Ile Leu Phe Asp Val Asp Asp Thr Leu Leu Asp 1 5 10 15 Phe Pro Lys Thr Glu Arg His Ala Leu His Asn Ala Phe Val Gln Phe 20 25 30 Asp Met Pro Thr Gly Tyr Asn Asp Tyr Leu Ala Ser Tyr Lys Glu Ile 35 40 45 Ser Asn Gly Leu Trp Arg Asp Leu Glu Asn Lys Met Ile Thr Leu Ser 50 55 60 Glu Leu Ala Val Asp Arg Phe Arg Gln Leu Phe Ala Leu His Asn Ile 65 70 75 80 Asp Val Asp Ala Gln Gln Phe Ser Asp Val Tyr Leu Glu Asn Leu Gly 85 90 95 Lys Glu Val His Leu Ile Glu Gly Ala Val Gln Leu Cys Glu Asn Leu 100 105 110 Gln Asp Cys Lys Leu Gly Ile Ile Thr Asn Gly Tyr Thr Lys Val Gln 115 120 125 Gln Ser Arg Ile Gly Asn Ser Pro Leu Ser Asn Phe Phe Asp His Ile 130 135 140 Ile Ile Ser Glu Glu Val Gly His Gln Lys Pro Ala Arg Glu Ile Phe 145 150 155 160 Asp Tyr Ala Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ser Val Leu 165 170 175 Met Val Gly Asp Ser Leu Thr Ser Asp Met Lys Gly Gly Glu Asp Tyr 180 185 190 Gly Ile Asp Thr Cys Trp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Glu Asn Gly Thr 195 200 205 Asp Val Asn Pro Thr Tyr Glu Val Glu Ser Leu Leu Gln Ile Leu Glu 210 215 220 Ile Val Glu Val Ala Glu Glu Lys Val Ala Ser Phe 225 230 235 <210> 30 <211> 236 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 30 Met Lys Tyr Lys Val Ile Leu Phe Asp Val Asp Asp Thr Leu Leu Asp 1 5 10 15 Phe Pro Lys Thr Glu Arg His Ala Leu His Asn Ala Phe Val Gln Phe 20 25 30 Asp Met Pro Thr Gly Tyr Asn Asp Tyr Leu Ala Ser Tyr Lys Glu Ile 35 40 45 Ser Asn Gly Leu Trp Arg Asp Leu Glu Asn Lys Met Ile Thr Leu Ser 50 55 60 Glu Leu Ala Val Asp Arg Phe Arg Gln Leu Phe Ala Leu His Asn Ile 65 70 75 80 Asp Val Asp Ala Gln Gln Phe Ser Asp Val Tyr Leu Glu Asn Leu Gly 85 90 95 Lys Glu Val His Leu Ile Glu Gly Ala Val Gln Leu Cys Glu Asn Leu 100 105 110 Gln Asp Cys Lys Leu Gly Ile Ile Thr Asn Gly Tyr Thr Lys Val Gln 115 120 125 Gln Ser Arg Ile Gly Asn Ser Pro Leu Ser Asn Phe Phe Asp His Ile 130 135 140 Ile Ile Ser Glu Glu Val Gly His Gln Lys Pro Ala Arg Glu Ile Phe 145 150 155 160 Asp Tyr Ala Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ser Val Leu 165 170 175 Met Val Gly Asp Ser Leu Thr Ser Asp Met Lys Gly Gly Glu Asp Tyr 180 185 190 Gly Ile Asp Thr Cys Trp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Glu Asn Gly Thr 195 200 205 Asp Val Asn Pro Thr Tyr Glu Val Glu Ser Leu Leu Gln Ile Leu Glu 210 215 220 Ile Val Glu Val Ala Glu Glu Lys Val Ala Ser Phe 225 230 235 <210> 31 <211> 236 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 31 Met Lys Tyr Lys Val Ile Leu Phe Asp Val Asp Asp Thr Leu Leu Asp 1 5 10 15 Phe Pro Glu Thr Glu Arg His Ala Leu His Asn Ala Phe Val Gln Phe 20 25 30 Asp Met Pro Thr Gly Tyr Asn Asp Tyr Leu Ala Ser Tyr Lys Glu Ile 35 40 45 Ser Asn Gly Leu Trp Arg Asp Leu Glu Asn Lys Met Ile Thr Leu Ser 50 55 60 Glu Leu Ala Val Asn Arg Phe Arg Gln Leu Phe Ala Leu His Asn Ile 65 70 75 80 Asp Val Asp Ala Gln Gln Phe Ser Asp Val Tyr Leu Glu Asn Leu Gly 85 90 95 Lys Glu Val His Leu Ile Glu Gly Ala Val Gln Leu Cys Glu Asn Leu 100 105 110 Gln Asp Cys Lys Leu Gly Ile Ile Thr Asn Gly Tyr Thr Lys Val Gln 115 120 125 Gln Ser Arg Ile Gly Asn Ser Pro Leu Cys Asn Phe Phe Asp His Ile 130 135 140 Ile Ile Ser Glu Glu Val Gly His Gln Lys Pro Ala Arg Glu Ile Phe 145 150 155 160 Asp Tyr Ala Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ser Val Leu 165 170 175 Met Val Gly Asp Ser Leu Thr Ser Asp Met Lys Gly Gly Glu Asp Tyr 180 185 190 Gly Ile Asp Thr Cys Trp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Glu Asn Gly Thr 195 200 205 Asp Val Asn Pro Thr Tyr Glu Val Glu Ser Leu Leu Gln Ile Leu Glu 210 215 220 Ile Val Glu Val Ala Glu Glu Lys Val Ala Ser Phe 225 230 235 <210> 32 <211> 236 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 32 Met Lys Tyr Lys Val Ile Leu Phe Asp Val Asp Asp Thr Leu Leu Asp 1 5 10 15 Phe Pro Glu Thr Glu Arg His Ala Leu His Asn Ala Phe Val Gln Phe 20 25 30 Gly Met Ser Thr Gly Tyr Asn Asp Tyr Leu Ala Ser Tyr Lys Glu Ile 35 40 45 Ser Asn Gly Leu Trp Arg Asp Leu Glu Asn Lys Met Ile Thr Leu Ser 50 55 60 Glu Leu Ala Val Asn Arg Phe Arg Gln Leu Phe Ala Leu His Asn Ile 65 70 75 80 Asp Val Asp Ala Gln Gln Phe Ser Asp Val Tyr Leu Glu Asn Leu Gly 85 90 95 Lys Glu Val His Leu Ile Glu Gly Ala Val Gln Leu Cys Glu Asn Leu 100 105 110 Gln Asp Cys Lys Leu Gly Ile Ile Thr Asn Gly Tyr Thr Met Val Gln 115 120 125 Gln Ser Arg Ile Gly Asn Ser Pro Leu Cys Asn Phe Phe Asp His Ile 130 135 140 Ile Ile Ser Glu Glu Val Gly His Gln Lys Pro Ala Arg Glu Ile Phe 145 150 155 160 Asp Tyr Ala Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ser Val Leu 165 170 175 Met Val Gly Asp Ser Leu Thr Ser Asp Met Lys Gly Gly Glu Asp Tyr 180 185 190 Ser Ile Asp Thr Cys Trp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Glu Asn Gly Thr 195 200 205 Asp Val Asn Pro Thr Tyr Glu Val Glu Ser Leu Leu Gln Ile Leu Glu 210 215 220 Ile Val Glu Val Ala Glu Glu Lys Val Ala Ser Phe 225 230 235 <210> 33 <211> 236 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 33 Met Lys Tyr Lys Val Ile Leu Phe Asp Val Asp Asp Thr Leu Leu Asp 1 5 10 15 Phe Pro Glu Thr Glu Arg His Ala Leu His Asn Ala Phe Val Gln Phe 20 25 30 Gly Met Pro Thr Gly Tyr Asn Asp Tyr Leu Ala Ser Tyr Lys Glu Ile 35 40 45 Ser Asn Gly Leu Trp Arg Asp Leu Glu Asn Lys Met Ile Thr Leu Ser 50 55 60 Glu Leu Ala Val Asp Arg Phe Arg Gln Leu Phe Ala Leu His Asn Ile 65 70 75 80 Asn Val Asp Ala Gln Gln Phe Ser Asp Val Tyr Leu Glu Asn Leu Gly 85 90 95 Lys Glu Val His Leu Ile Glu Gly Ala Val Gln Leu Cys Glu Asn Leu 100 105 110 Gln Asp Cys Lys Leu Gly Ile Ile Thr Asn Gly Tyr Thr Lys Val Gln 115 120 125 Gln Ser Arg Ile Gly Asn Ser Pro Leu Cys Asn Phe Phe Asp His Ile 130 135 140 Ile Ile Ser Glu Glu Val Gly His Gln Lys Pro Ala Arg Glu Ile Phe 145 150 155 160 Asp Tyr Ala Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Asp Lys Ser Ser Val Leu 165 170 175 Met Val Gly Asp Ser Leu Thr Ser Asp Met Lys Gly Gly Glu Asp Phe 180 185 190 Gly Ile Asp Thr Cys Trp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Glu Asn Lys Thr 195 200 205 Ser Val Asn Pro Thr Tyr Glu Val Glu Ser Leu Leu Gln Ile Leu Glu 210 215 220 Ile Val Glu Val Ala Glu Glu Lys Val Ala Ser Phe 225 230 235

Claims (20)

  1. 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(haloacid dehalogenase superfamily: HAD)에 속하는 단백질의 변이체를 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 미생물로서, 상기 변이체는 N122 및 S184로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 것으로서, 상기 번호는 서열번호 1의 아미노산 서열의 번호 또는 그에 해당하는 번호인 것인 미생물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 변경은 N122가 V 또는 Y로 치환된 것, 또는 이들에 대하여 보존적 치환인 것인 미생물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 변경은 S184가 H, Q 또는 D로 치환된 것, 또는 이들에 대하여 보존적 치환인 것인 미생물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 그에 해당하는 번호는 서열번호 5, 29, 30, 31, 32 및 33의 아미노산 서열의 N122 또는 S184인 것인 미생물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1, 5, 29, 30, 31, 32 또는 33의 아미노산 서열과 85% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 미생물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 N122Y 치환을 갖는 것, 또는 서열번호 5의 아미노산 서열에서 S184H 치환을 갖는 것, 또는 이들에 대하여 보존적 치환인 것인 미생물.
  7. 시료 중 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 불소 함유 화합물을 제거하는데 사용하기 위한, 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(HAD) 단백질의 변이체를 포함하는 조성물로서, 상기 변이체는 N122 및 S184로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 것으로서, 상기 번호는 서열번호 1의 아미노산 서열의 번호 또는 그에 해당하는 번호인 것인 조성물:
    <화학식 1>
    C(R1)(R2)(R3)(R4)
    <화학식 2>
    (R5)(R6)(R7)C-[C(R11)(R12)]n-C(R8)(R9)(R10)
    상기 식들에서, n은 0 내지 10의 정수이며, R1, R2, R3 및 R4가 서로 독립적으로 F, Cl, Br, I, 또는 H이며, R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상이 F이며, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12이 서로 독립적으로 F, Cl, Br, I, 또는 H이며, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12 중 하나 이상이 F이다.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 아미노산 변경은 N122가 V 또는 Y로 치환된 것 또는 이들에 대하여 보존적 치환인 것인 조성물.
  9. 청구항 7에 있어서, 상기 아미노산 변경은 S184가 H, Q 또는 D로 치환된 것 또는 이들에 대하여 보존적 치환인 것인 조성물.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 조성물은 외래 유전자로부터 발현된 상기 변이체를 포함하는 재조합 미생물을 포함하는 것인 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 미생물이 Escherichia 속 미생물인 것인 조성물.
  12. 청구항 7에 있어서, 상기 그에 해당하는 번호는 서열번호 5, 29, 30, 31, 32 및 33의 아미노산 서열의 N122 또는 S184인 것인 조성물.
  13. 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(HAD) 단백질의 변이체를 하기 화학식 1 또는 2의 불소 함유 화합물 함유 시료와 접촉시켜 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 단계;를 포함하는, 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법으로서, 상기 변이체는 N122 및 S184로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 것으로서, 상기 번호는 서열번호 1의 아미노산 서열의 번호 또는 그에 해당하는 번호인 것인 방법:
    <화학식 1>
    C(R1)(R2)(R3)(R4)
    <화학식 2>
    (R5)(R6)(R7)C-[C(R11)(R12)]n-C(R8)(R9)(R10)
    상기 식들에서, n은 0 내지 10의 정수이며, R1, R2, R3 및 R4가 서로 독립적으로 F, Cl, Br, I, 또는 H이며, R1, R2, R3 및 R4 중 하나 이상이 F이며, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12이 서로 독립적으로 F, Cl, Br, I, 또는 H이며, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11 및 R12 중 하나 이상이 F이다.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 아미노산 변경은 N122가 V 또는 Y로 치환된 것 또는 이들에 대하여 보존적 치환인 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 아미노산 변경은 S184가 H, Q 또는 D로 치환된 것 또는 이들에 대하여 보존적 치환인 것인 방법.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 그에 해당하는 번호는 서열번호 5, 29, 30, 31, 32 및 33의 아미노산 서열의 N122 또는 S184인 것인 방법.
  17. 청구항 13에 있어서, 상기 HAD 단백질의 변이체는 발현된 상기 변이체를 포함하는 재조합 미생물에 포함된 것인 방법.
  18. 청구항 13에 있어서, 상기 접촉이 불소 함유 화합물의 존재하에서 상기 미생물을 배양하는 것인 방법.
  19. N122 및 S184로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 것으로서, 상기 번호는 서열번호 1의 아미노산 서열의 번호 또는 그에 해당하는 번호인 것인 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(HAD) 단백질 변이체.
  20. N122 및 S184로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 변경(alteration)을 갖는 것으로서, 상기 번호는 서열번호 1의 아미노산 서열의 번호 또는 그에 해당하는 번호인 것인 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리(HAD) 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
KR1020170111925A 2017-09-01 2017-09-01 할로산 데할로게나제 수퍼패밀리 단백질 변이체 및 그를 이용한 시료 중 불소 함유 화합물의 농도를 감소시키는 방법 KR20190025362A (ko)

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