JP4786844B2 - パラ−ヒドロキシ桂皮酸の生物学的製造 - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／１４７７１９号（１９９９年８月６日出願）の特典を請求するものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、分子生物学および微生物学に関するものである。さらに具体的には、本発明では促進されたチロシンアンモニア−リアーゼ活性を有する新規の遺伝子工学的生体触媒について記載する。
【０００３】
（発明の背景）
フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）（ＥＣ４．３．１．５）は植物（Ｋｏｕｋｏｌ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３６：２６９２〜２６９８（１９６１））、菌類（Ｂａｎｄｏｎｉ他、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７：２０５〜２０７（１９６８））、酵母（Ｏｇａｔａ他、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３１：２００〜２０６（１９６７））、および放線菌（Ｅｍｅｓ他、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４８：６１３〜６２２（１９７０））に広く分布しているが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉあるいはほ乳類細胞では発見されていない（Ｈａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｖｉｒ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ、３版；Ｂｏｙｅｒ、Ｐ．、Ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９６７；ｐｐ７５〜１６７）。ＰＡＬはフェニルプロパノイド代謝の第１酵素で、Ｌ−フェニルアラニンから（ｐｒｏ−３Ｓ）−水素および−ＮＨ₃ ⁺を除去してトランス−桂皮酸の形成を触媒する。Ｐ４５０酵素系の存在下では、トランス−経皮酸をパラ−ヒドロキシ経皮酸（ＰＨＣＡ）に変換することができ、これはリグニンおよびイソフラボノイドなど種々の第２代謝物の産生のための植物における一般的な中間体として働く。しかし微生物では、第２代謝物形成のための前駆体として経皮酸は役立つが、ＰＨＣＡは役立たない。これまでに経皮酸ヒドロキシラーゼ酵素は微生物材料からは特性が発見されていない。植物ではＰＡＬ酵素はリグニン、イソフラボノイドおよびその他のフェニルプロパノイドの生合成における調節酵素であると考えられている（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：３４７〜３６９（１９８９））。しかし、紅色酵母、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）では、このリアーゼは代謝機能としてフェニルアラニンを分解し、この酵素の作用によって形成された桂皮酸は安息香酸塩およびその他の細胞物質に変換される。
【０００４】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓを含めた様々な材料から得られたＰＡＬの遺伝子配列は、配列決定され発表されている（Ｅｄｗａｒｄｓ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ ８２：６７３１〜６７３５（１９８５）；Ｃｒａｍｅｒ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３６７〜３８３（１９８９）；Ｌｏｉｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．８：１６４１〜１６４８（１９８９）；Ｍｉｎａｍｉ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１９〜２５（１９８９）；Ａｎａｓｏｎ他、Ｇｅｎｅ ５８：１８９〜１９９（１９８７）；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ＆Ｏｅｒｕｍ、ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、１：２０７〜２１１（１９９１）。様々な材料から得られたＰＡＬ遺伝子は、酵母、大腸菌および昆虫細胞培養物において活性ＰＡＬ酵素として過剰発現された（Ｆａｕｌｋｎｅｒ他、Ｇｅｎｅ １４３：１３〜２０（１９９４）；Ｌａｎｇｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１０８６７〜１０８７１（１９９７）；ＭｃＫｅｇｎｅｙ他、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１２５９〜１２６３（１９９６））。ＰＡＬは生まれつきの代謝異常フェニルケトン尿症の正常化（Ｂｏｕｒｇｅｔ他、ＦＥＢＳ ｌｅｔｔ．１８０：５〜８（１９８５）；米国特許第５７５３４８７号）、腫瘍代謝の変化（Ｆｒｉｔｚ他Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：４６４６〜４６５０（１９７６））、血清フェニルアラニンの定量分析（Ｋｏｙａｍａ他、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１３６：１３１〜１３６（１９８４））において、および桂皮酸からのＬ−フェニルアラニンの合成経路として（Ｙａｍａｄａ他、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：７７３（１９８１）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ他、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：６４〜６８（１９８５）およびＥｖａｎｓ他、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５：３９９〜４０５（１９８７））有用な可能性があるので注目されてきた。
【０００５】
植物では、ＰＡＬ酵素はフェニルアラニンをトランス−桂皮酸に変換し、次に桂皮酸−４−ヒドロキシラーゼによってパラ位が水酸化されてＰＨＣＡが形成される（Ｐｉｅｒｒｅｌ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：８３５（１９９４）；Ｕｒｂａｎ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２２：８４３（１９９４）；Ｃａｂｅｌｌｏ−Ｈｕｒｔａｄｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７２６０（１９９８）；およびＴｅｕｔｓｃｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４１０２（１９９３））。しかし微生物系では、桂皮酸のさらなる代謝はＰＨＣＡへのパラ位水酸化を必要としないので、微生物におけるこの反応に関する情報は乏しい。
【０００６】
入手した情報によって、いくつかの植物および微生物から得られたＰＡＬは、フェニルアラニンを桂皮酸に変換する能力に加えて、チロシンを基質として受容できることが示された。このような反応における酵素活性はチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）と呼ばれる。ＴＡＬによるチロシンの変換によって、桂皮酸の仲介なしにチロシンからＰＨＣＡの直接形成がもたらされる。しかし、天然のＰＡＬ／ＴＡＬ酵素は全て、基質としてチロシンよりもフェニルアラニンを使用することを好む。ＴＡＬ活性の程度は常にＰＡＬ活性よりも低いが、この差の大きさは広く変化する。たとえば、パセリの酵素は、Ｋ_Mがフェニルアラニンでは１５〜２５μＭ、チロシンでは２．０〜８．０ｍＭで、代謝回転数はそれぞれ２２／秒および０．３／秒である（Ａｐｐｅｒｔ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２５：４９１（１９９４））。対照的に、トウモロコシの酵素では、フェニルアラニンに対するＫ_Mはチロシンの１５倍のみであるが、代謝回転数は約１０倍高い（Ｈａｖｉｒ他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４８：１３０（１９７１））。この通例の例外は酵母、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍで、ＰＡＬ触媒活性に対するＴＡＬ触媒活性の比は約０．５８である（Ｈａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｖｉｒ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１；Ｖｏｌ．７、ｐｐ５７７〜６２５）。
【０００７】
前述した生物学的系では、ＰＨＣＡの生成に有用ないくつかの酵素が提供されるが、このモノマーの効果的な生成は実現されていない。したがって、達成するために問題なのは、安価な物質または発酵可能な炭素源を使用して生物学的原料からＰＨＣＡを効果的に生成する方法の考案および実施である。出願人等は、微生物および植物宿主の両者を操作して、ＰＡＬおよびｐ４５０／ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする外来遺伝子を過剰発現させるか、変異型および野生型ＴＡＬ活性をコードする遺伝子を発現させることによって記載した問題を解決した。
【０００８】
（発明の概要）
本発明の目的は、液晶ポリマー（ＬＣＰ）製造用モノマーとして有望な化合物、ＰＨＣＡの生物学的製造である。グルコースおよびその他の発酵可能な炭素基質からＰＨＣＡを製造するためには、２種類の有望な生物学的経路がある。
１）フェニルアラニンから桂皮酸、さらにＰＨＣＡへの変換。この経路には、酵素ＰＡＬ並びにチトクロームＰ−４５０およびチトクロームｐ−４５０レダクターゼが必要である（スキーム１）。
２）桂皮酸が介在しないチロシンからＰＨＣＡへの一段階変換（スキーム１）。この経路には、ＰＡＬと非常に類似した傾向があるが、チロシンに対する基質特異性がより高い酵素ＴＡＬが必要である。この経路には、チトクロームｐ−４５０およびチトクロームｐ−４５０レダクターゼは必要ない。したがって、ＴＡＬ経路の操作には、ＴＡＬ経路によって機能するためのＴＡＬ活性が増強された生体触媒の生成が必要である。
【０００９】
【化１】

【００１０】
本発明では、１）桂皮酸からＰＨＣＡへの変換、２）ＰＡＬ経路を介したグルコースからフェニルアラニン、ひいてはＰＨＣＡへの変換、および３）促進されたチロシンアンモニア−リアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する新規の生体触媒の生成によるＰＨＣＡの生物学的製造方法を説明する。ＴＡＬの創出には酵母ＰＡＬ遺伝子の単離、ＰＡＬをコードする配列の変異誘発および創出、および改善されたＴＡＬ活性を有する変異体の選択が必要である。本発明はさらに、種々の菌類および細菌において、前述の経路によるグルコースからのＰＨＣＡの生物学的製造を示す。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ＰＨＣＡの製造方法であって、（ｉ）組換え宿主細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞はＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系を欠損し、適切な調節配列と制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含んでおり、（ｉｉ）前記組換え細胞を、ＰＨＣＡを製造するために十分な時間生育させること、および（ｉｉｉ）任意選択で前記ＰＨＣＡを回収することを含む方法を提供することである。本発明の内容の中で、発酵可能な炭素基質は、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、蟻酸塩、および炭素を含むアミンから成る群から選択され、宿主細胞は細菌、酵母、糸状菌、藻類および植物細胞から成る群から選択されることが可能である。
【００１２】
同様に、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系を欠損し、適切な調節配列と制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含む組換え宿主細胞を提供する。
【００１３】
さらに、ＰＨＣＡの製造方法であって、（ｉ）組換え酵母細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞は、ａ）植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系、およびｂ）適切な調節配列と制御可能に結合した酵母ＰＡＬ活性をコードする遺伝子を含んでおり、（ｉｉ）前記組換え細胞を、ＰＨＣＡを製造するために十分な時間生育させること、および（ｉｉｉ）任意選択で前記ＰＨＣＡを回収することを含む製造方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的は、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子の同定方法であって、（ｉ）ＴＡＬ活性をコードすると推測される外来遺伝子を含む組換え微生物を、ＰＨＣＡを代謝するために十分な時間ＰＨＣＡと接触させること、および（ｉｉ）組換え微生物の生育を監視して、微生物の生育によってＴＡＬ活性をコードする遺伝子の存在が示されることを含む同定方法を提供することである。
【００１５】
同様に、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子の同定方法が提供され、（ｉ）単一の炭素源としてＰＨＣＡを使用することが可能な宿主細胞を、ＴＡＬ活性をコードすると考えられる遺伝子で形質転換して、形質転換体を生成すること、（ｉｉ）形質転換体の生育速度を単一の炭素源としてＰＨＣＡを使用することが可能な形質転換してない宿主細胞と比較し、形質転換によって加速した生育速度はＴＡＬ活性をコードする遺伝子の存在を示すことを含む。
【００１６】
（配列の説明および生物の寄託）
出願人は、特許手続き上の微生物寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の条件に基づいて、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）、Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０〜２２０９に以下の生物寄託を行った。
【００１７】
【表１】

【００１８】
本発明は、以下の詳細な説明および本明細書の一部を形成する添付の配列の説明によってさらに完全に理解することができる。
【００１９】
出願人（等）は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＤＩｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ」に準拠し、世界知的所有権機構（ＷＩＰＯ）Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５（１９９８）、およびＥＰＯおよびＰＣＴ（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、および行政指導２０８項および補遺Ｃ）の配列リスト必要条件に適合する１４個の配列を提供する。
【００２０】
配列番号１〜６はベクター構築用プライマーである。
【００２１】
配列番号７は、野生型Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ ＰＡＬ酵素をコードするヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号８は、野生型Ｒ．ｇｌｕｔｉｎｉｓ ＰＡＬ酵素をコードするヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号９は、促進されたＴＡＬ活性を有する変異Ｒ．ｇｌｉｔｉｎｉｓ ＰＡＬ酵素をコードするヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号１０は、促進されたＴＡＬ活性を有する変異Ｒ．ｇｌｉｔｉｎｉｓ ＰＡＬ酵素をコードするヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号１１は、Ｈ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ チトクロームｐ−４５０酵素をコードするヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号１２は、Ｈ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ チトクロームｐ−４５０酵素をコードするヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号１３は、Ｈ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ ｐ−４５０レダクターゼ酵素をコードするヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１４は、Ｈ．ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ ｐ−４５０レダクターゼ酵素をコードするヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列である。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＰＨＣＡを生成する生物学的方法を説明する。一実施形態では、様々な細菌および菌類はトランス桂皮酸をＰＨＣＡに変換する能力を有することが発見された。他の実施形態では、酵母ＰＡＬを宿主Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換すると、グルコースがＰＨＣＡに変換されることが示された。他の実施形態では、酵母ＰＡＬおよびキクイモの植物チトクロームＰ−４５０およびチトクロームＰ−４５０レダクターゼ遺伝子を酵母宿主に取り込ませると、この組換え酵母はグルコースをＰＨＣＡに変換する能力を獲得した。さらに他の実施形態では、増強されたチロシンアンモニア−リアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する新規生体触媒が開発され、この活性をコードする遺伝子はＰＨＣＡ生成用に組換え宿主を形質転換するために使用された。ＴＡＬの創出には、機能性ＰＡＬ遺伝子の単離、弱い発現ベクターの構築、ＰＡＬコーディング配列の変異誘発および創出、および改善されたＴＡＬ活性を有する変異体の選択が必要であった。創出したＴＡＬ酵素によって、微生物において１段階でチロシンからＰＨＣＡを生成することが可能である。
【００３０】
以下の略語および定義を本明細書および特許請求の範囲の説明に使用する。
【００３１】
「フェニルアンモニア−リアーゼ」はＰＡＬと略する。
【００３２】
「チロシンアンモニア−リアーゼ」はＴＡＬと略する。
【００３３】
「パラ−ヒドロキシ桂皮酸」はＰＨＣＡと略する。
【００３４】
「桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ」はＣ４Ｈと略する。
【００３５】
本明細書では、「桂皮酸（ｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ）」および「桂皮酸（ｃｉｎｎａｍａｔｅ）」は交換して使用できる。
【００３６】
「ＴＡＬ活性」という用語は、チロシンのＰＨＣＡへの直接変換を触媒する蛋白質の能力を意味する。
【００３７】
「ＰＡＬ活性」という用語は、フェニルアラニンの桂皮酸への直接変換を触媒する蛋白質の能力を意味する。
【００３８】
「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」という用語は、桂皮酸をＰＨＣＡに触媒的に変換する役割を果たす蛋白質系である。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系は、桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ機能を実施する当業界で公知のいくつかの酵素または酵素系の１つである。本明細書では、「桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ」という用語は、桂皮酸のＰＨＣＡへの変換をもたらす全般的な酵素活性を意味し、一方「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」という用語は、桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性を有する特異的な２成分蛋白質系のことである。
【００３９】
「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」という用語は、ＰＡＬおよびＴＡＬ活性の両者を含む蛋白質を意味する。このような蛋白質は、酵素基質としてチロシンおよびフェニルアラニンの両方に少なくともある程度の特異性を有する。
【００４０】
「変異ＰＡＬ／ＴＡＬ」という用語は、ＰＡＬ活性よりも強いＴＡＬ活性を有する野生型ＰＡＬ酵素から得られた蛋白質を意味する。このように、変異ＰＡＬ／ＴＡＬ蛋白質はフェニルアラニンよりもチロシンに対してより強い基質特異性を有する。
【００４１】
「触媒効率」という用語は、酵素のｋ_cat／Ｋ_Mとして定義される。「触媒効率」は、ある酵素のある基質に対する特異性を量的に示すために使用される。
【００４２】
「ｋ_cat」という用語は、「回転数」と呼ばれることも多い。「ｋ_cat」という用語は、単位時間当たり活性部位当たり生成物に変換される基質分子の最大数として、または単位時間当たりで酵素回転数として定義される。Ｋ_cat＝Ｖ_max／［Ｅ］で、式中、［Ｅ］は酵素濃度である（「Ｆｅｒｓｔ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｍ」２版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５；ｐｐ９８〜１２０）。
【００４３】
「芳香族アミノ酸生合成」という用語は、芳香族アミノ酸を製造するために必要とされる細胞内の生物学的過程および酵素的経路を意味する。
【００４４】
「発酵可能な炭素基質」という用語は、本発明の宿主生物によって代謝されることが可能な炭素源であり、特に単糖類、オリゴ糖類、多糖類、および炭素１個の物質またはそれらの混合物から成る群から選択された炭素原料を意味する。
【００４５】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するために使用する。たとえばＤＮＡに関しては、アデノシンはチミン、シトシンはグアニンと相補的である。したがって、本発明にはまた、添付した配列リストに報告された完全な配列並びに実質的に同様の核酸配列と相補的な単離済み核酸フラグメントが含まれる。
【００４６】
「遺伝子」とは、コーディング配列の前（５′−非コード配列）および後（３′−非コード配列）にある調節配列を含めた特定の蛋白質を発現する核酸フラグメントのことである。「天然遺伝子」または「野生型遺伝子」とは、独自の調節配列を備えた天然に見いだされる遺伝子のことである。「キメラ遺伝子」とは、天然には一緒に見いだされない調節遺伝子およびコーディング配列を含む、天然遺伝子ではない遺伝子のことである。したがって、キメラ遺伝子には、異なる原料から得られた調節配列およびコーディング配列、または同一の原料から得られるが天然に見いだされる様式とは異なる配置の調節配列およびコーディング配列を含めることが可能である。「内在性遺伝子」とは、生物のゲノムに天然に位置する天然遺伝子のことである。「外来」遺伝子とは、通常宿主生物には見いだされないが、遺伝子導入によって宿主細胞に導入された遺伝子のことである。外来遺伝子には、天然にはない生物に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含めることが可能である。
【００４７】
「コーディング配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列のことである。
【００４８】
「適切な調節配列」とは、コーディング配列の上流（５′−非コード配列）、内部、または下流（３′−非コード配列）に位置し、関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列のことである。調節配列には、プロモータ、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含めることが可能である。
【００４９】
「プロモータ」とは、コーディング配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列のことである。一般に、コーディング配列はプロモータ配列の３′に位置している。プロモータは、天然遺伝子からそのままの状態で得られるか、または天然に見いだされる異なるプロモータ由来の異なる要素から構成されるか、または合成ＤＮＡ部分を含むことが可能である。異なるプロモータは異なる組織または細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境条件に応答して、遺伝子を発現させることが可能であることを当業者等は理解するであろう。ほとんどの細胞型で最も多く遺伝子を発現させるプロモータは、通常「構成的プロモータ」と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合において調節配列の正確な境界は完全には定義されていないので、長さの異なるＤＮＡフラグメントが同一のプロモータ活性を有する可能性があると考えられる。
【００５０】
「制御可能に結合した」という用語は、１個の核酸フラグメントと核酸配列の関係が、一方の機能が他方によって影響を受けるようになっていることを意味する。たとえばプロモータは、コーディング配列の発現に影響を与えることができるとき（すなわち、コーディング配列はプロモータの転写制御下にあるとき）、コーディング配列に制御可能に結合している。コーディング配列は、センス方向またはアンチセンス方向で制御配列に制御可能に結合することができる。
【００５１】
「発現」という用語は、本明細書では本発明の核酸フラグメントから得られたセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を意味する。発現とはまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳のことである。「アンチセンス阻害」とは、標的蛋白質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生のことである。「過剰発現」とは、通常の、または形質転換してない生物よりも産生濃度が過剰なトランスジェニック生物における遺伝子生成物の産生のことである。「相互抑制効果」とは、同一の、または実質的に同様の外来遺伝子または内在性遺伝子の発現を抑制できるセンスＲＮＡ転写物の産生のことである（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００５２】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼの触媒によるＤＮＡ配列の転写によって得られた生成物のことである。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列と全く完全に相補的なコピーであるときは、第１転写物と称するか、または第１転写物の転写後のプロセシングによって得られたＲＮＡ配列であるときは、成熟ＲＮＡと称する。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンが無く、細胞によって蛋白質に翻訳されることができるＲＮＡのことである。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的で、ｍＲＮＡから得られた２重鎖ＤＮＡのことである。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞によって蛋白質に翻訳することができるＲＮＡ転写物のことである。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的第１転写物またはｍＲＮＡの全てまたは一部と相補的で、標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写物のことである（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡは、特定の遺伝子転写物のいずれかの部分、すなわち、５′非コーディング配列、３′非コーディング配列、イントロン、またはコーディング配列に相補的であることが可能である。「機能性ＲＮＡ」とは、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されなくても細胞プロセスに影響を及ぼす他のＲＮＡのことである。
【００５３】
「形質転換」とは、核酸断片を宿主生物のゲノムに導入して、遺伝的に安定して受け継がれるようになることである。形質転換した核酸フラグメントを含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【００５４】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、しばしば細胞の主要な代謝部分ではない遺伝子を運ぶ余分な染色体要素のことで、通常環状２本鎖ＤＮＡ分子の形態をしている。このような要素は、任意の原料から得られた自動複製配列、ゲノム統合配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線状または環状の１本鎖または２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであることが可能で、いくつかのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子のプロモータ断片およびＤＮＡ配列を適切な３′非翻訳配列と一緒に細胞内に導入することができる独自の構造と結合または再結合している。「形質転換カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する因子を有する特異的ベクターのことである。「発現カセット」とは、外来遺伝子を含み、外来遺伝子に加えて外来宿主でその遺伝子の発現を促進させる因子を有する特異的ベクターのことである。
【００５５】
「ラインウィーバー−バークプロット」とは、反応速度パラメータ、Ｋ_MおよびＶ_MAXを評価するための酵素反応速度データのプロットのことである。
【００５６】
本明細書で使用した標準的組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当業界ではよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ」２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９（以後「Ｍａｎｉａｔｉｓ」とする）、およびＳｉｌｈａｖｙ、Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｌ．Ｗ．「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４、およびＧｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによって出版されたＡｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、「Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９８７に記載されている。
【００５７】
本発明は、ＰＨＣＡの生物学的製造方法について説明する。この方法では、桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ活性（Ｃ４Ｈ）、フェニルアラニンアンモニウム−リアーゼ（ＰＡＬ）活性またはチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を使用する。桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性は、桂皮酸をＰＨＣＡに変換する。本発明の内容では、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系は、このＣ４Ｈ機能を果たす。ＰＡＬ活性は、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系の存在下でフェニルアラニンをＰＨＣＡに変換する。これらの活性は、以下のスキームに従って連携している。

ＴＡＬ活性は、以下のスキームに従って、中間段階を介さずにチロシンを直接ＰＨＣＡに変換する。

【００５８】
一実施形態では、この方法は同一蛋白質内にＰＡＬおよびＴＡＬの両機能を含む活性を発現する組換え微生物宿主細胞を使用する。この実施形態では、宿主細胞はＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系を欠損しており、ＴＡＬ経路を介してＰＨＣＡを産生する。
【００５９】
他の実施形態では、この方法はＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子の存在下でＰＡＬ活性をコードする遺伝子を含む組換え宿主を使用する。
【００６０】
他の実施形態で、本発明はＣ４Ｈ活性で選択した生物によって桂皮酸からＰＨＣＡを生成する方法を説明する。
【００６１】
本発明は、液晶ポリマー（ＬＣＰ）製造用モノマーとして使用可能なＰＨＣＡの生物学的製造に有用である。ＬＣＰ類は、電気的連結装置および遠距離通信および航空宇宙科学の用途で使用することができる。滅菌照射に耐性のあるＬＣＰによって、医療装置、並びに薬品、および食品包装用途でこれらを使用することが可能になる。
【００６２】
遺伝子
本発明で使用した鍵となる酵素活性は、当業界で公知のいくつかの遺伝子によってコードされる。主要な酵素には、桂皮酸４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）活性（Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ）、フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）およびチロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）が含まれる。
【００６３】
フェニルアラニンアンモニウムリアーゼ（ＰＡＬ）、チロシンアンモニウムリアーゼ（ＴＡＬ）活性およびＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系
ＰＡＬをコードする遺伝子は当業界で公知で、いくつかは植物および微生物原料の両方から配列決定されている（たとえば、ＥＰ３２１４８８［Ｒ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ］、ＷＯ９８１１２０５［Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ ａｎｄ Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ］、ＷＯ９７３２０２３［Ｐｅｔｕｎｉａ］、ＪＰ０５１５３９７８［Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ］、ＷＯ９３０７２７９［ジャガイモ、コメ］を参照のこと）。ＰＡＬ遺伝子の配列は市販されている（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＪ０１０１４３およびＸ７６９６７を参照のこと）。組換え宿主で野生型ＰＡＬを発現することが望ましい場合、野生型は限定しないが、Ｒｈｏｄｏｔｒｏｒｕｌａ種、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種およびＳｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ種などの酵母、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどの細菌微生物、およびエンドウマメ、ジャガイモ、コメ、ユーカリ、マツ、トウモロコシ、ツクバネアサガオ、シロイヌナズナ、タバコおよびパセリなどの植物を含めた原料から得ることが可能である。
【００６４】
独占的にＴＬＡ活性を有する酵素、すなわちＰＨＣＡ生成のために基質としてチロシンだけを使用する酵素をコードする遺伝子は知られていない。前述のＰＡＬ酵素のいくつかは、チロシンに対していくらかの基質親和性を有する。したがって、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子は、前述のＰＡＬ遺伝子と同一で、同時に単離することが可能である。たとえば、パセリ（Ａｐｐｅｒｔ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２５：４９１（１９９４））およびトウモロコシ（Ｈａｖｉｒ他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４８：１３０（１９７１））から単離されたＰＡＬ酵素はいずれも基質としてチロシンを使用する能力を示す。同様に、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍから単離されたＰＡＬ酵素はまた（Ｈｏｄｇｉｎｓ ＤＳ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４６：２９７７（１９７１））、基質としてチロシンを使用できる。このような酵素は、本明細書ではＰＡＬ／ＴＡＬ酵素または活性と称する。ＰＡＬ／ＴＡＬ活性をコードする野生型遺伝子を発現する組換え生物を作り出すことが望ましい場合、トウモロコシ、コムギ、パセリ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓａｌａｎｉ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ ｐａｒａｒｏｓｅｕｓおよびＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍから単離された遺伝子は、Ｈａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｖｉｒ「Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１、Ｖｏｌ．７、ｐｐ５７７〜６２５で論じられた通りに使用することが可能であるが、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍの遺伝子が好ましい。
【００６５】
本発明では、桂皮酸をＰＨＣＡに変換するために有用なＣ４Ｈ活性を有するＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系を提供する。この系は当業界では公知で、様々な植物組織から単離されている。たとえば、レダクターゼは、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｓｕｓ）、［ｅｍｂｌ遺伝子座ＨＴＵ２ＮＦＲ、登録番号Ｚ２６２５０．１］、パセリ（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ ｃｒｉｓｐｕｍ）［Ｋｏｏｐｍａｎｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（２６）、１４９５４〜１４９５９（１９９７）、［遺伝子座ＡＦ０２４６３４、登録番号ＡＦ０３４６３４．１］、ハナビシソウ（Ｅｓｃｈｓｃｈｏｌｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、Ｒｏｓｃｏ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３４８（２）、３６９〜３７７（１９９７）、［遺伝子座ＥＣＵ６７１８６、登録番号Ｕ６７１８６．１］、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、［ｐｉｒ：遺伝子座Ｓ２１５３１］、オオカラスノエンドウ（Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ）、［ｐｉｒ：遺伝子座Ｓ３７１５９］、ヤエナリ（Ｖｉｇｎａ ｒａｄｉａｔａ）、Ｓｈｅｔ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０（７）、２８９０〜２８９４（１９９３）、［ｐｉｒ：遺伝子座Ａ４７２９８］、およびケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）、［遺伝子座ＰＳＵ６７１８５、登録番号Ｕ６７１８５．１］から単離されている。
【００６６】
チトクロームは、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、［ｅｍｂｌ遺伝子座ＨＴＴＣ４ＭＭＲ、登録番号Ｚ１７３６９．１］、Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ、［ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＴＣＭＯ＿ＺＩＮＥＬ、登録番号Ｑ４３２４０］Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ［ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＴＣＭＯ＿ＣＡＴＲＯ、登録番号Ｐ４８５２２］、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ［ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＴＣＭＯ＿ＰＯＰＴＭ、登録番号Ｏ２４３１２］、Ｐｏｐｕｌｕｓ ｋｉｔａｋａｍｉｅｎｓｉｓ［ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＴＣＭＯ＿ＰＯＰＫＩ、登録番号Ｑ４３０５４］、Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｅｃｈｉｎａｔａ［ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＴＣＭＯ＿ＧＬＹＥＣ、登録番号Ｑ９６４２３］、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ［ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：遺伝子座ＴＣＭＯ＿ＳＯＹＢＮ、登録番号Ｑ４２７９７］並びにその他の原料から単離された。
【００６７】
本発明では、配列番号１１および配列番号１３で記載したようなキクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）から単離されたＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子が好ましい。当業者等は、本発明の目的には植物から単離されたチトクロームＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系が適していることを理解するであろう。チトクローム遺伝子（配列番号１１）の配列は、この系で公知のＰ−４５０チトクロームと約９２％（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ、Ｑ４３２４０）から約６３％（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、ｅｍｂｌ遺伝子座ＰＶ０９４４９、登録番号Ｙ０９４４９．１）の範囲で同一性を示すので、配列番号１１と少なくとも６３％の同一性を示す植物から単離されたＰ−４５０チトクロームが本発明に適しているものと考えられる。同様に、この系のＰ４５０レダクターゼ（配列番号１３）は、公知のレダクターゼＰ−４５０と約７９％（パセリ、ＡＦ０２４６３２．１）から約６８％（ケシ、Ｕ６７１８５．１）の範囲で同一性を示すので、配列番号１３と少なくとも６８％の同一性を示す植物から単離されたＰ−４５０レダクターゼが本発明に適しているものと考えられる。
【００６８】
配列に応じた手順でこれらまたは相同な野生型遺伝子を得る方法は、当業界で公知である。配列に応じた手順には、限定はしないが、核酸ハイブリダイゼーション法、および核酸増幅技術（たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ））の様々な使用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法が含まれる。
【００６９】
たとえば、前述の活性（ＰＡＬ、ＴＡＬまたはチトクロームＰ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系）の相同物またはいずれかをコードする遺伝子は、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして公知の配列全てまたは一部を使用することによって直接単離して、当業界で周知の方法を使用して所望する植物、菌類、酵母、または細菌からライブラリをスクリーニングすることができる。文献による核酸配列をベースとした特定のオリゴヌクレオチドプローブを当業界で公知の方法によって設計して合成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前述）。さらに、完全な配列を直接使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識法、ニックトランスレーション法、または末端標識法など当業者に公知の方法によってＤＮＡプローブを合成したり、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系に有用なＲＮＡプローブを合成したりすることができる。さらに、特異的プライマーを設計し使用して、この配列の一部または完全長を増幅することができる。得られた増幅精製物を直接増幅反応中または増幅反応後に標識して、プローブとして使用して適度に厳密な条件下で完全長ｃＤＮＡまたはゲノム断片を単離することができる。
【００７０】
さらに、文献の配列の短い２配列をポリメラーゼ連鎖反応方法で使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡから相同な遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅することが可能である。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローンした核酸断片のライブラリに実施することが可能で、１個目のプライマー配列は文献の配列から得られ、もう１個のプライマー配列は細菌遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３′末端のポリアデニル酸領域の存在を利用する。あるいは、第２のプライマー配列は、クローニングベクターから得られた配列をベースとすることが可能である。たとえば、当業者はＲＡＣＥプロトコール（Ｆｏｒｈｍａｎ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８５：８９９８（１９９８））に従って、転写物上の１点と３′または５′末端との間の領域のコピーを増幅するＰＣＲを使用することによってｃＤＮＡを作製することができる。３′および５′方向に向いたプライマーは、文献の配列から設計することができる。市販の３′ＲＡＣＥまたは５′ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を使用して、特異的な３′または５′ｃＤＮＡ断片を単離することができる（Ｏｈａｒａ他、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：５６７３（１９８９）、Ｌｏｈ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２１７（１９８９））。
【００７１】
変異ＰＡＬ／ＴＡＬ活性
本発明の目的は、フェニルアラニンよりもチロシンにより基質特異性を示す変異ＰＡＬ／ＴＡＬ活性を提供することである。一般な取り組みには、フェニルアラニンよりもチロシンにより基質特異性を示すＰＡＬ／ＴＡＬ活性を有する生物の選択が含まれる。一般的に、基質特異性はｋ_cat／Ｋ_M（触媒効率）によって量的に表し、酵素で確認された活性部位の数に基づいて計算する。
【００７２】
フェニルアラニンアンモニア−リアーゼは、分子量約３３００００で、約８０ＫＤの同一サブユニット４個から構成される（Ｈａｖｉｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４：１６２０〜１６２６（１９７５））。ＰＡＬは触媒上必須のデヒドロアラニン残基を含むことが示唆された（Ｈａｎｓｏｎ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１４１：１〜１７（１９７０））。パセリのＰＡＬのＳｅｒ−２０２は、デヒドロアラニンの前駆体であることが示された（Ｌａｎｇｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６：１０８６７〜１０８７１（１９９７））。ＰＡＬのｋ_catは、相同な酵素、ヒスチジンアンモニア−リアーゼ（ＨＡＬ）の結晶構造に関する最近の研究から得られた情報に基づいて計算された。これらの研究によって、酵素の活性部位の反応性求電子性残基は４−メチリデン−イジダゾール−５−オンであり、これはＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列を含む１４２〜１４４残基の環化および脱水によって自動触媒的に形成されることが明らかになった（Ｓｃｈｗｅｄｅ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：５３５５〜５３６１（１９９９））。今までに研究された４量体のＰＡＬ酵素はまた、全てそれぞれの活性部位にＡｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列を含むので、ＰＡＬの各活性部位はまた、この配列から形成された４−メチリデン−イジダゾール−５−オンを含む。
【００７３】
本発明の内容では、変異誘発用に選択された適切な野生型酵素は、チロシンに対する触媒効率が約４．１４×１０³から１×１０⁹Ｍ^-1ｓｅｃ^-1であり、約１×１０⁴Ｍ^-1ｓｅｃ^-1から約５×１０⁴Ｍ^-1ｓｅｃ^-1の範囲が好ましい。
【００７４】
適切なＰＡＬ／ＴＡＬ酵素の選択方法には、弱発現ベクターの構築、変異誘発およびＰＡＬコーディング配列の創出、および最終的には改善されたＴＡＬ活性を有する変異体の選択が含まれる。
【００７５】
ＰＡＬの変異誘発
様々な取り組みを使用してＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を変異誘発することが可能である。本明細書で使用した適切な２通りの取り組みには、誤りがちなＰＣＲ（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）（Ｌｅｕｎｇ １９：６０５２〜６０５２（１９９１）およびＳｐｅｅ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１：７７７〜７７８（１９９３））およびｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発が含まれる。
【００７６】
誤りがちなＰＣＲの主な利点は、この方法によって導入される変化は全てＰＡＬ遺伝子内部で、変化はＰＣＲ条件の変化によって容易に制御することが可能であることである。他方のｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｒｅｄ株、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、Ｇｒｅｅｎｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｌａｈａｎ、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ７：３２〜３４（１９９４））のＥｐｉｃｕｒｉａｎ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｒｅｄ変異誘発遺伝子株など市販されている材料を使用して実施することが可能である。この株は１次ＤＮＡ修復経路の３種（ｍｕｔＳ、ｍｕｔＤおよびｍｕｔＴ）を欠損しており、変異率が野生型よりも５０００倍高い。Ｉｎ ｖｉｖｏ変異誘発は、（誤りがちなＰＣＲのように）連結効率に左右されないが、変異はベクターの任意領域に生じる可能性があり、変異率は一般的にかなり低い。
【００７７】
あるいは、増強されたＴＡＬ活性を有する変異ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を「遺伝子シャフリング」法（米国特許第５，６０５，７９３号、米国特許第５，８１１，２３８号、米国特許第５，８３０，７２１号、および米国特許第５，８３７，４５８号）を使用して構築することが計画される。遺伝子シャフリングは、実施の容易さ、および高い変異誘発率のために特に魅力がある。遺伝子シャフリングの方法には、関心のある遺伝子と同一または異なるＤＮＡ領域の集団をさらに存在させて、関心のある遺伝子を特定の大きさの断片に制限することが含まれる。次いで、この断片のプールを変性させ、次に再度アニーリングして変異遺伝子を作製する。次に、変異遺伝子を改変された活性によってスクリーニングする。
【００７８】
この方法によってＴＡＬ活性を改変または増強するために、野生型ＰＡＬ／ＴＡＬ配列を変異させスクリーニングする。この配列は２本鎖で、５０ｂｐから１０ｋｂまでの範囲の様々な長さであることが可能である。この配列は、当業界で周知の制限エンドヌクレアーゼを使用して約１０ｂｐから１０００ｂｐまでの範囲の断片に無作為に切断することが可能である（Ｍａｎｉａｔｉｓ 前述）。さらに、完全長配列には配列の全てまたは一部にハイブリダイズすることができる断片の集合体を付け加えることができる。同様に、野生型配列にハイブリダイズできない断片の集合体もまた付け加えてよい。一般に、これらの断片集合体を添加するには、核酸全体と比較して約１０倍から２０倍過剰な重量で添加する。一般に、この方法によって混合物中に約１００から１０００個の特異性の異なる核酸断片を生成することが可能である。無作為な核酸断片の混合集合体を変性して１本鎖核酸断片を形成し、次いで再度アニーリングする。他の１本鎖核酸断片と相同な領域を有する１本鎖核酸断片だけがアニーリングする。無作為核酸断片は、加熱によって変性することが可能である。当業者であれば、２本鎖核酸を完全に変性するために必要な条件を決定することができよう。温度は、８０℃から１００℃が好ましい。核酸断片は冷却することによって再度アニーリングすることが可能である。その温度は２０℃から７５℃が好ましい。復元は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩を添加することによって加速することができる。塩濃度は、０ｍＭから２００ｍＭが好ましい。アニールした核酸断片は、次に核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下でインキュベートする。この核酸ポリメラーゼはクレノウフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼまたは当業界で公知のその他のＤＮＡポリメラーゼであることが可能である。このポリメラーゼは、アニーリング前、アニーリングと同時に、またはアニーリング後に無作為核酸断片に添加することが可能である。変性、復元およびポリメラーゼ存在下でのインキュベーションのサイクルは所望する回数で繰り返す。このサイクルは、２回から５０回が好ましく、一連の操作は１０から４０回繰り返すことがより好ましい。得られた核酸は、約５０ｂｐから約１００ｋｂの大きな２本鎖ポリヌクレオチドで、標準的クローニング法および発現方法によって発現および改変したＴＡＬ活性をスクリーニングすることが可能である（Ｍａｎｉａｔｉｓ 前述）。
【００７９】
変異誘発法に関わりなく、触媒効率が約４．１４×１０³Ｍ^-1ｓｅｃ^-1から約１×１０⁹Ｍ^-1ｓｅｃ^-1で、一般的な触媒効率は１２．６×１０³Ｍ^-1ｓｅｃ^-1である遺伝子を創出できるものと考えられる。
【００８０】
改善されたＴＡＬ活性を有する変種の選択
増強されたＴＡＬ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を有する変異体を選択するために、チロシンからＰＨＣＡへの反応の可逆性に基づいた選択システムを開発した。チロシンをＰＨＣＡに変換する役割を果たすＴＡＬ活性は、逆反応と平衡状態にあることが理解されよう。変異遺伝子は、標準的方法によって、チロシン無しでは生育できないＥ．ｃｏｌｉチロシン栄養素要求変異株にクローニングされた。形質転換体を適切な濃度のＰＨＣＡ存在下でチロシン欠損培地で培養した。これらの条件で生育したコロニーを採取して、変異遺伝子の存在を分析した。この方法で触媒効率が約１２．６×１０³Ｍ^-1ｓｅｃ^-1で、ＰＡＬ触媒活性に対するＴＡＬ触媒活性の比が野生型では０．５であるのに比べて１．７である遺伝子が単離された。
【００８１】
当業者等は、増強されたＴＡＬ活性をコードする遺伝子の選択のために、さらにスクリーニングを考えることができよう。たとえば、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＤＳＭ５８６（ＡＴＣＣ ３３３０４）は効率的にｐ−クマリン酸（ＰＨＣＡ）を分解することができ、それを単一の炭素源として利用することがよく知られている（Ｄｅｌｎｅｒｉ他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １２４４：３６３〜３６７（１９９５））。この分解のために提案された経路は、経路Ｉとして示される。
【００８２】
経路Ｉ
ｐ−ヒドロキシ桂皮酸 → ｐ−ヒドロキシ安息香酸 → プロトカテキン酸 この提案した経路に含まれる酵素は全て、ＰＨＣＡを細胞培養物に添加することによって誘導される。ＴＡＬ遺伝子をＡ．ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ ３３０４）、またはＰＨＣＡを単一の炭素源として使用できるその他の微生物に形質転換することによって、前記の経路は変更されて、経路ＩＩに例示したようにＰＨＣＡのためにチロシンが基質となることが示される。
【００８３】
経路ＩＩ
Ｌ−チロシン → ｐ−ヒドロキシ桂皮酸 → ｐ−ヒドロキシ安息香酸→プロトカテキン酸
経路ＩＩの要素を有する細胞は、ＰＨＣＡで生育するとき、経路Ｉだけを有するものよりも活発に増殖することが理解されよう。したがって、ＴＡＬ活性を有する遺伝子の確認用の篩い分けとしてこの系を使用することが可能である。細胞には炭素が中枢代謝に入るまでこの化合物をさらに分解する経路が含まれるので、この選択系は阻害濃度のＰＨＣＡの影響を回避できるという他の利点を有する。
【００８４】
産生用生物
微生物宿主
本発明の産生用生物には、ＰＨＣＡ産生に必要な遺伝子を発現できる生物が含まれよう。一般に産生用生物は微生物および植物に限られる。
【００８５】
本発明のＰＨＣＡ産生に有用な微生物は、限定はしないが、たとえば腸内細菌（たとえば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ）並びにＢａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａなどの細菌、ＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒおよびＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓなどの藍細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｍｕｃｏｒ、ＰｉｃｈｉａおよびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓなどの酵母、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓおよびＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓなど糸状菌、および藻類を含むことが可能である。本発明のＰＡＬ、ＰＡＬ／ＴＡＬおよびＰ−４５０およびＰ−４５０レダクターゼ遺伝子は、これらおよびその他の微生物宿主で産生して、商用に有用な大量のＰＨＣＡを調製することが可能である。
【００８６】
外来蛋白質の高濃度発現を目的とする調節配列を含む微生物発現系および発現ベクターは、当業者等にとって周知である。これらはいずれもＰＨＣＡ産生用キメラ遺伝子を構築するために使用できる。次いで、これらのキメラ遺伝子は形質転換によって微生物に導入し、高濃度でこの酵素を発現させることができる。
【００８７】
適切な微生物宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当業界では周知である。一般に、ベクターまたはカセットは、関連する遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択マーカー、および自律複製または染色体への組み込みを可能にする配列を含む。適切なベクターには、転写開始制御部分を収容した遺伝子の５′領域および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３′領域が含まれる。両方の制御領域を形質転換した宿主細胞と相同な遺伝子から得られると最も好ましいが、このような制御領域は産生用宿主として選択した特定の種に本来ある遺伝子から得る必要はないと考えるべきである。
【００８８】
所望する宿主細胞の関連遺伝子の発現させる上で有用な開始制御領域またはプロモータは数多く、当業者によく知られている。実質的には、これらの遺伝子を作動できるプロモータは本発明に適しており、限定はしないが、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓでの発現に有用）、ＡＯＸ１（Ｐｉｃｈｉａでの発現に有用）、およびｌａｃ、ｔｒｐ、ｌＰ_L、ｌＰ_R、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの発現に有用）が含まれる。
【００８９】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に本来ある種々の遺伝子から得ることが可能である。任意選択では終結部位は不要であるが、含まれるならば最も好ましい。
【００９０】
ＰＨＣＡの商用製造を所望する場合、様々な発酵方法を適用することが可能である。たとえば、大量生産は、回分または連続発酵の両方によって実施することが可能である。
【００９１】
古典的な回分発酵法とは、培地の組成物を発酵開始時に設定し、発酵中人為的に変化を与えない閉鎖系である。したがって、発酵開始時に培地に所望する微生物または微生物類を接種し、系に何も添加することなく発酵を起こさせる。しかし、一般的に「回分」発酵法の炭素源濃度は限定されており、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の制御がしばしば行われる。回分式では、系の代謝物およびバイオマス組成物は発酵を停止するときまで絶えず変化する。回分培養内では、細胞は静的な遅滞期からゆっくり増殖の盛んな対数期に移行し、最後には増殖速度が減速するか、または停止した定常期に達する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最後には死滅してしまうだろう。一般的に、対数期の細胞が最終産物または中間体製造のバルクとして役立つ。
【００９２】
標準的回分系を変更したものが半回分式である。半回分式発酵法はまた本発明に適しており、発酵が進行するにつれて基質をさらに添加すること以外は一般的な回分式を含む。半回分式は、代謝が抑えられると細胞の代謝が阻害される傾向があり、培地中の基質量を制限することが好ましい場合に有用である。半回分式における実際的な基質濃度の測定は困難で、したがってｐＨ、溶存酸素およびＣＯ₂などの排気ガス分圧などの測定要素の変化に基づいて評価する。回分式および半回分式発酵法は当業界では一般的では周知であり、実例は、本明細書に参考として援用した、Ｂｒｏｃｋ、Ｔ．Ｄ．「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、２版；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓ、１９８９；またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ、Ｍ．Ｖ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７、（１９９２）に見いだすことが可能である。
【００９３】
ＰＨＣＡの商用製造はまた、連続発酵法で実現することが可能である。連続発酵法は限定した発酵培地を連続的にバイオリアクターに添加すると同時に、等量の調整培地を処理のために除去する開放系である。連続発酵では一般に培地は一定した高密度に維持されており、細胞は主として対数増殖期にある。
【００９４】
連続発酵法では、細胞増殖または最終産物濃度に影響を及ぼすいくつかの因子を調整することを考慮する。たとえば、１方法では炭素源または窒素源などの制限的栄養物質を固定した割合に制限し続け、その他の変数は全て適度にする。他の系では、増殖に影響を及ぼすいくつかの要素を連続的に変化させ、一方細胞濃度は培地濁度で測定して一定に維持する。連続式では定常状態を維持することに努力が払われ、したがって培地除去による細胞損失は発酵中の細胞増殖速度に対して釣り合っていなければならない。連続発酵法のための栄養素および成長因子を調節する方法並びに生成物形成速度を最大にする技術は、産業微生物学の業界では周知であり、様々な方法がＢｒｏｃｋ、前述、によって説明されている。
【００９５】
Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系の存在下でＰＡＬ経路を介してＰＨＣＡを産生するためには、細胞の生育を維持する培地が適している。しかし、微生物の自然な炭素の流れの一部としてＰＨＣＡの生成を所望する場合、発酵培地は適切な炭素基質を含まなければならない。適切な基質には、限定はしないがグルコース、ラフィノースおよびフルクトースなどの単糖類、乳糖およびショ糖などのオリゴ糖類、澱粉またはセルロースまたはそれらの混合物などの多糖類およびチーズホエー透過物、コーンシロップリカー、テンサイ糖蜜、および大麦モルトなどの再生可能な供給原料から得られた未精製混合物が含まれることが可能である。さらに、炭素基質はまた、鍵となる生化学的中間体に代謝によって変換することが示された二酸化炭素、ホルムアルデヒド、蟻酸またはメタノールなどの１炭素基質であることが可能である。
【００９６】
植物宿主
あるいは、本発明は関連するＰＡＬ、ＰＡＬ／ＴＡＬおよびＰ−４５０およびＰ−４５０レダクターゼ遺伝子を収容した植物細胞においてＰＨＣＡを産生することを提供する。好ましい植物宿主は、高濃度のＰＨＣＡまたはＰＨＣＡ−グルコシド複合体産生を維持する種類である。適切な緑色植物には、限定はしないが、ダイズ、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｓ）、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｉｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ種）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖａｌｇａｒｅ）、オートムギ、（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ、Ｌ）、サトウモロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、コメ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）、Ａｒａｖｉｄｏｐｓｉｓ、アブラナ科植物（ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウなど）、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、緑色種子作物、テンサイ、サトウキビ、インゲンマメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草が含まれる。本発明に必要な遺伝子の過剰発現は、まず所望する組織で所望する発達段階で遺伝子を発現させることができるプロモータに制御可能にコーディング領域が結合したキメラ遺伝子を構築することによって実現することが可能である。便利であるという理由から、キメラ遺伝子は同一の遺伝子から得られたプロモータ配列および翻訳リーダー配列を含むことが可能である。転写終結シグナルをコードする３′非コーディング配列もまた提供しなければならない。このキメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を促進するために１個または複数のイントロンを含むことが可能である。
【００９７】
コーディング領域の発現を誘導可能な任意プロモータと任意ターミネータの任意の組み合わせは、キメラ遺伝子配列で使用することが可能である。プロモータおよびターミネータの適切な組み合わせの例の中には、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）、オクトピン合成酵素（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のものが含まれる。使用可能な効果的な植物プロモータの１種は、高等植物プロモータである。本発明の遺伝子配列に制御可能に結合したこのようなプロモータは、本発明の遺伝子産物の発現を促進することができるだろう。本発明で使用可能な高等植物プロモータには、たとえばダイズから得られたリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモータ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ他、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ａｐｐ．Ｇｅｎ．１：４８３〜４９８（１９８２））、およびクロロフィルａ／ｂ結合蛋白質のプロモータが含まれる。これらの２種のプロモータは植物細胞において光で誘導されることが知られている（たとえば、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ａ．「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ、ａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」；Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３：ｐｐ２９〜３８；Ｃｏｒｕｚｚｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１３９９（１９８３）、およびＤｕｎｓｍｕｉｒ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２：２８５（１９８３）を参照のこと）。
【００９８】
次に、このキメラ遺伝子を含むプラスミドベクターを構築することができる。プラスミドベクターの選択は、宿主植物を形質転換するために使用する方法に左右される。当業者等は、キメラ遺伝子を含む宿主細胞の形質転換、選択および増殖を成功させるためにプラスミドベクターに存在させなければならない遺伝子要素をよく知っている。当業者等はまた、異なる独立した形質転換現象は異なる濃度およびパターンの発現をもたらすこと（Ｊｏｎｅｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２４１１〜２４１８（１９８５）；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ他、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２１８：７８〜８６（１９８９））、したがって所望する発現濃度およびパターンを示す細胞株を得るために多数の現象をスクリーニングしなければならないことを認識するであろう。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３（１９７５））、ｍＲＮＡ発現のノザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８：１３３〜１４５（１９９３））、蛋白質発現のウェスタン分析、発現遺伝子産物の酵素活性分析、または表現型分析によって実現することが可能である。
【００９９】
いくつかの適用では、ＰＨＣＡを産生する遺伝子の遺伝子産物を異なる細胞区分に誘導することは有用であろう。したがって、酵素をコードするコーディング配列に適切な細胞内標的配列、たとえば添加したトランジット配列（Ｋｅｅｇｓｔｒａ、Ｋ．、Ｃｅｌｌ ５６：２４７〜２５３（１９８９））、シグナル配列または小胞体局在をコードする配列（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１〜５３（１９９１））、または核酸局在シグナル（Ｒａｉｋｈｅｌ、Ｎ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ．１００：１６２７〜１６３２（１９９２））を添加して、および／または既に存在する標的配列を除去して改変することによって、前述のキメラ遺伝子をさらに補足することが可能である。引用された文献はこれらそれぞれの例を挙げているが、そのリストは完全なものではなく、本発明に有用なより実用的な標的シグナルが将来発見される可能性がある。
【０１００】
任意選択で、植物におけるＰＨＣＡ産生は、ＰＨＣＡの下流の酵素をコードする遺伝子のアンチセンス阻害したり、または共抑制したりすることによって促進されると考えられる。これらの酵素は、ＰＨＣＡを有用性の少ない生成物に形質転換したり、ＰＨＣＡの蓄積を妨害したりする可能性がある。これらの下流遺伝子をコードする遺伝子をアンチセンス構造で収容する構成物を含むトランスジェニック植物は、ＰＨＣＡ蓄積促進に役立つことが可能である。同様に、同遺伝子が過剰発現すると、遺伝子共抑制によってＰＨＣＡ蓄積の促進に役立つ可能性がある。したがって、当業者等は、このすぐ下流の遺伝子の全てまたは一部のための、アンチセンスＲＮＡを発現するように設計されたキメラ遺伝子（米国特許第５，１０７，０６５号）は、植物プロモータ配列に対して逆向きに遺伝子または遺伝子断片を結合することによって構築できることを理解するだろう。共抑制またはアンチセンスキメラ遺伝子のいずれかは、形質転換によって植物内に導入され、それによって対応する内在性遺伝子の発現を減少させるか、または排除することができる。
【０１０１】
製造方法
本発明は、ＰＨＣＡのいくつかの生物学的製造方法を提供する。一実施形態では、桂皮酸を必須のＣ４Ｈ活性を含む生物と接触させることが可能である。これらの生物は野生型または組換え体であることが可能である。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ＡＴＣＣ １３７２３、ＡＴＣＣ １３９６８，ＴＵ６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ ４２７７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｅｔｒａｋｉｉ（ＡＴＣＣ １２３３７）、Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ １０５４９）およびＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｒｏｂｕｓｔａ（ＡＴＣＣ １１８５６）を含めた桂皮酸をＰＨＣＡに変換する能力を有するようないくつかの生物は、本発明では含めなかった。
【０１０２】
他の実施形態では、酵母ＰＡＬおよび植物チトクロームＰ−４５０およびチトクロームＰ−４５０遺伝子を、グルコースをＰＨＣＡに変換する能力を示す酵母宿主種および組換え酵母に取り込ませた。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、この製造方法のために選択されたが、当業者等は様々な酵母が適しており、前述の微生物製造用生物は含まれるが限定はされないことを理解するだろう。同様に、グルコースを炭素基質として使用したが、様々な他の発酵可能な炭素基質を使用することが可能である。
【０１０３】
好ましい実施形態では、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系を欠損し、ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を収容しており、酵素が最小限のＴＡＬ活性レベルを有し、炭素が発酵可能な炭素源からチロシンを介してＰＨＣＡに向かって流れている組換え微生物または植物細胞からＰＨＣＡは製造することが可能である。
【０１０４】
本発明はさらに以下の実施例で明確に説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示のためだけに記載するものである。前記の解説およびこれらの実施例から、当業者等は本発明の本質的な特性を把握することができ、それらの精神および範囲を逸脱することなく、様々な用途および条件に適応させるために本発明の様々な変化および変更を実施できる。
以下に、本発明の好ましい態様を示す。
［１］ （ｉ）組換え宿主細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞は桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性を欠損し、適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含んでいること、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記組換え細胞を生育させること、および
（ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ桂皮酸を回収することを含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸の生成方法。
［２］ 前記発酵可能な炭素基質が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、蟻酸および炭素を含むアミンから成る群から選択されることを特徴とする［１］に記載の方法。
［３］ 前記発酵可能な炭素基質がグルコースであることを特徴とする［２］に記載の方法。
［４］ 前記組換え宿主細胞が細菌、酵母、糸状菌、藻類および植物細胞から成る群から選択されることを特徴とする［１］に記載の方法。
［５］ 前記組換え宿主細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｍｕｃｏｒ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓから成る群から選択されることを特徴とする［４］に記載の方法。
［６］ 前記組換え宿主細胞がダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウモロコシ、コメ、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、緑色種子作物、テンサイ、サトウキビ、インゲンマメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草から成る群から選択されることを特徴とする［１］に記載の方法。
［７］ 前記チロシンアンモニアリアーゼが触媒効率約４．１４×１０³Ｍ^-1ｓｅｃ^-1から約１×１０⁹Ｍ^-1ｓｅｃ^-1であることを特徴とする［１］に記載の方法。
［８］ チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする前記遺伝子が配列番号８または配列番号１０で記載したポリペプチドをコードすることを特徴とする［１］に記載の方法。
［９］ チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする前記遺伝子がＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種から得られることを特徴とする［１］に記載の方法。
［１０］ ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ４０７およびＰＴＡ４０９を有する細胞から成る群から選択された適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子を含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
［１１］ 桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性を欠損し、適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼをコードする遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、前記チロシンアンモニアリアーゼの触媒効率が４．１４×１０³Ｍ^-1ｓｅｃ^-1から約１×１０⁹Ｍ^-1ｓｅｃ^-1であることを特徴とする宿主細胞。
［１２］ 配列番号１０に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするチロシンアンモニアリアーゼ遺伝子。
［１３］ 配列番号１０に記載のポリペプチド。
［１４］ （ｉ）組換え酵母細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞が、
ａ）植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子、および
ｂ）適切な調節配列と制御可能に結合した酵母フェニルアンモニア−リアーゼ活性をコードする遺伝子を含むこと、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記組換え細胞を生育させること、および
（ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ桂皮酸を回収することを含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸の生成方法。
［１５］ 前記発酵可能な炭素基質が単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、蟻酸および炭素を含むアミンから成る群から選択されることを特徴とする［１４］に記載の方法。
［１６］ 前記発酵可能な炭素基質がグルコースであることを特徴とする［１５］に記載の方法。
［１７］ 前記組換え酵母細胞がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｍｕｃｏｒ、ＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍから成る群から選択されることを特徴とする［１４］に記載の方法。
［１８］ 植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする前記遺伝子がキクイモ、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、オートムギ、サトウモロコシ、コメ、ブロッコリ、カリフラワー、キャベツ、アメリカボウフウ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナツ、ブドウ、緑色種子作物、テンサイ、サトウキビ、インゲンマメ、エンドウマメ、ライムギ、アマ、広葉樹木、針葉樹木、および飼草から成る群から選択される植物から得られたことを特徴とする［１４］に記載の方法。
［１９］ 植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする前記遺伝子が配列番号１１および配列番号１３に記載されていることを特徴とする［１８］に記載の方法。
［２０］ 酵母ＰＡＬ活性をコードする前記遺伝子がＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ種、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ種およびＳｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ種から成る群から得られたことを特徴とする［１４］に記載の方法。
［２１］ 酵母ＰＡＬ活性をコードする前記遺伝子が配列番号８に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とする［２０］に記載の方法。
［２２］ ＡＴＣＣ名称、ＰＴＡ４０８を有することを特徴とする組換え宿主細胞。
［２３］ （ｉ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ＡＴＣＣ１３２７３、ＡＴＣＣ１３９６８、ＴＵ６）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ４２７７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｅｔｒａｋｉｉ（ＡＴＣＣ１２３３７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ１０５４９）およびＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｒｏｂｕｓｔａ（ＡＴＣＣ１１８５６）から成る群から選択された微生物細胞を桂皮酸と接触させること、
（ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記微生物を生育させること、および
（ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ酸を回収することを含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸を生成方法。
［２４］ チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子の同定方法であって、
（ｉ）チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードすることが推測される外来遺伝子を含むチロシン要求組換え微生物を、パラ−ヒドロキシ桂皮酸を代謝するために十分な時間パラ−ヒドロキシ桂皮酸と接触させること、および
（ｉｉ）前記組換え微生物の生育を監視することであって、前記生物が生育することによってチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子の存在が示されることを含むことを特徴とする遺伝子の同定方法。
［２５］ チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする遺伝子の同定方法であって、
（ｉ）単一の炭素源としてパラ−ヒドロキシ桂皮酸を使用する宿主細胞を、チロシンアンモニアリアーゼ活性をコードすることが推測される遺伝子で形質転換して形質転換体を生成すること、
（ｉｉ）形質転換体の生育速度を単一の炭素源としてパラ−ヒドロキシ桂皮酸を使用することができる非形質転換宿主細胞と比較して、形質転換体の生育速度が加速するとＴＡＬ活性をコードする遺伝子の存在が示されることを含むことを特徴とする遺伝子の同定方法。
［２６］ 酵母ＰＡＬ活性をコードする前記遺伝子が配列番号１０で記載したポリペプチドをコードすることを特徴とする［２０］に記載の方法。
［２７］ ＡＴＣＣ名称、ＰＴＡ４０９を有することを特徴とする組換え宿主細胞。
【０１０５】
実施例
一般的方法
ＰＣＲ増幅、ＤＮＡクローニング用に所望する末端を作り出すためのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるＤＮＡ変更、連結および細菌の形質転換に必要な手順は、当業界では周知である。本明細書で使用した標準的な分子クローニング技法は、当業界では周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｃｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、２版；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９（以後「Ｍａｎｉａｔｉｓ」とする）、およびＳｉｌｈａｖｙ、Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．Ｌ．ａｎｄ Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｌ．Ｗ．「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８４およびＡｕｓｕｂｅｌ他、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；１９８７に記載されている。
【０１０６】
細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法は、当業界では周知である。以下の実施例で使用するために適した技法は、「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」：Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｅｉｇ ａｎｄ Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ著、「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ、１９９４またはＢｒｏｃｋ、Ｔ．Ｄ．「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、２版、；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ、１９８９の記載に見いだすことが可能である。試薬、制限酵素および細菌細胞の生育および維持に使用する物質は全て、他に特定しなければ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。
【０１０７】
ＰＣＲ反応は、ＡｍｐｌｉｔａｑまたはＡｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ Ｅｎｚｙｍｅを使用したＧｅｎｅＡＭＰ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で実施した。反復条件および反応は、製造元の指示に従って標準通りとした。
【０１０８】
略号の意味は以下の通りである。「ｓｅｃ」は秒の意味であり、「ｍｉｎ」は分の意味であり、「ｈ」は時間の意味であり、「ｄ」は日の意味であり、「μＬ」はミクロリットルの意味であり、「ｍＬ」はミリリットルの意味であり、「Ｌ」はリットルの意味であり、「ｍｍ」はミリメートルの意味であり、「ｎｍ」はナノメートルの意味であり、「ｍＭ」はミリモルの意味であり、「Ｍ」はモルの意味であり、「ｍｍｏｌ」はミリモルの意味であり、「μモル」はミクロモルの意味であり、「ｇ」はグラムの意味であり、「μｇ」はミクログラムの意味であり、「ｎｇ」はナノグラムの意味であり、「Ｕ」は単位の意味であり、および「ｍＵ」はミリ単位の意味である。
【０１０９】
菌種、ベクターおよび培養条件
チロシン栄養要求型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ種ＡＴ２４７１および野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ３１１０は、当初はＣｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ ＃４５１０）、Ｙａｌｅ大学、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴ．）から入手した。Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｒｅｄ種は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、酵素過剰発現のために使用した（Ｓｈｕｓｔｅｒ、Ｂ．ａｎｄ Ｒｅｔｅｙ、Ｊ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４９：２５２〜２５４（１９９４））。ｐＢＲ３２２およびｐＥＴ−２４ｄベクターはそれぞれ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ（Ｂｅｖｅｌｙ、ＭＡ）およびＮａｖａｇｅｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。ｐＫＫ２３３−３は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。
【０１１０】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ用生育培地
複合培地：Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ番号１０７８８）は、脱イオン水に溶かしたモルト抽出物（１．０％）、酵母抽出物（０．１０％）およびＬ−フェニルアラニン（０．１０％）を含む培地で培養した。Ｄｉｆｃｏ保証Ｂａｃｔｏ−モルトおよびＢａｃｔｏ−酵母抽出物を使用した。モルトおよび酵母抽出物の溶液は、フェニルアラニンを入れずに高圧滅菌した。フィルタ滅菌したフェニルアラニン２％溶液の一定量（５０ｍＬ）を高圧滅菌したモルトおよび酵母抽出物溶液１．０Ｌに添加した（Ａｂｅｌｌ他、「ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｙｅａｓｔ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４２：２４２〜２４８（１９８７））。
【０１１１】
最小培地：培地には、脱イオン水に溶かした５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２）、ＭｇＳＯ₄（１００ｍｇ／Ｌ）、ビオチン（１０ｍｇ／Ｌ）およびＬ−フェニルアラニン（２．５ｇ／Ｌ）が含まれた。リン酸緩衝溶液は、その他の生物を入れずに高圧滅菌した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２）１．０ｌに溶かしたＬ―フェニルアラニン（２５ｇ／Ｌ）、ＭｇＳＯ₄（１．０ｇ／Ｌ）およびビオチン（０．１ｇ／Ｌ）の溶液を濾過によって滅菌して、１００ｍＬを高圧滅菌したリン酸緩衝液９００ｍＬに添加した。この成分の最終濃度は、ＫＨ₂ＳＯ₄（５．５５ｇ／Ｌ）；Ｋ₂ＰＯ₄（１．６１ｇ／Ｌ）ＭｇＳＯ₄（１００ｍｇ／Ｌ）；ビオチン（１０ｍｇ／Ｌ）およびＬ−フェニルアラニン（２．５ｇ／Ｌ）（Ｍａｒｕｓｉｃｈ、Ｗ．Ｃ．、Ｊｅｎｓｅｎ、Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｚａｍｉｒ、Ｌ．Ｏ．「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ａｍｍｏｎｉａ−Ｌｙａｓｅ Ｄｕｒｉｎｇ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ ａｓ ａ Ｃａｒｂｏｎ ｏｒ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｏｕｒｃｅ ｉｎ Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ」、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４６：１０１３〜１０１９（１９８１））。
【０１１２】
酵素活性アッセイ
精製酵素のＰＡＬまたはＴＡＬ活性は、Ａｂｅｌｌ他、「Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ Ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ ｆｒｏｍ Ｙｅａｓｔ Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４２：２４２〜２４８（１９８７）に従って、分光光度計を使用して測定した。ＰＡＬを決定するための分光光学的アッセイは、酵素を１．０ｍＭ ｐ−フェニルアラニンおよび５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を含む溶液に添加することよって開始した。次に、この反応に続いて、９０００ｃｍ^-1のモル吸光計数を使用して、２９０ｎｍにおける生成物、桂皮酸の吸光度を監視した。このアッセイは、０．００７５から０．００１８／ｍｉｎの範囲の吸光度変化をもたらす酵素量を使用して５分間行った。１活性単位によって、１分あたりフェニルアラニン１．０μｍｏｌが桂皮酸へ脱アミノ化することが示された。ＴＡＬ活性は、反応溶液中にチロシンを使用して同様に測定した。生成したパラ−ヒドロキシ桂皮酸の吸光度は３１５ｎｍで追跡し、その活性はＰＨＣＡの１００００ｃｍ^-1のモル吸光計数を使用して測定した。活性１単位によって、１分あたりチロシン１．０μｍｏｌがパラ−ヒドロキシ桂皮酸へ脱アミノ化することが示された。
【０１１３】
ＳＤＳゲル電気泳動法
８〜２５％既製ＰｈａｓｔＧｅｌｓで、列当たり蛋白質４．０μグラムを泳動させ、クーマシーブルーで染色した。Ｐｈａｒｍａｃｉａ高分子量（ＨＭＷ）マーカーおよびＳｉｇｍａの等級Ｉ ＰＡＬを標準として使用した。
【０１１４】
ＨＰＬＣ分析用の試料調製法
ＨＰＬＣアッセイは、細胞全体によって形成した桂皮酸およびＰＨＣＡの濃度を測定するために開発された。一般的なアッセイでは、選択培地で増殖した培養物を遠心した後、上清２０〜１０００μＬをリン酸で酸性化し、０．２または０．４５ミクロンフィルタで濾過して、ＨＰＬＣで分析して、生育培地中のＰＨＣＡおよび桂皮酸の濃度を測定した。あるいは遠心に続いて、細胞をチロシン１．０ｍＭまたはフェニルアラニン１．０ｍＭを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）に懸濁して、室温で１．０〜１６ｈインキュベートした。次いで、濾過したこの懸濁液の一定量（２０〜１０００μＬ）を分析した。
【０１１５】
ＨＰＬＣ法
オートサンプラーおよびダイオードアレイＵＶ／ｖｉｓ検出器を装備したＨｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ １０９０Ｍ ＨＰＬＣシステムを、ＭＡＣ−ＭＯＤ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．から供給された逆相Ｚｏｒｂａｘ ＳＢ−Ｃ８カラム（４．６ｍＭ×２５０ｍｍ）と共に使用した。流速は１分あたり１．０ｍＬ、カラム温度は４０℃で実施した。ＵＶ検出器は、波長２５０、２３０、２７０、２９０および３１０ｎｍに設定して、溶出液を監視した。
【０１１６】
【表２】

【０１１７】
前述したＨＰＬＣシステムを使用した関連代謝物の保持時間（ＲＴ）を以下にまとめて示した。
【０１１８】
【表３】

【０１１９】
ＭＯＮＯＱ緩衝液
これらの分析の緩衝液は、開始緩衝液としてリン酸カリウム５０ｍＭ、ｐＨ７．０を使用し、次にＭＯＮＯＱカラムの溶出液として４００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２を使用した。
【０１２０】
実施例１
桂皮酸をＰＨＣＡに変換するための微生物
図１は、種々の微生物における桂皮酸ヒドロキシラーゼの存在についてのスクリーニングおよび桂皮酸からＰＨＣＡへの変換能力の調査を示した図である。
【０１２１】
桂皮酸ヒドロキシラーゼを有する微生物を発見するために、１５０株を超える様々な微生物および真菌の桂皮酸からＰＨＣＡに変換する能力をスクリーニングした。２段階発酵方法を使用した。まず微生物を培地中で３日間培養し、次いでその２０％を接種物として第２段階の培養に使用した。第２段階で２４時間増殖させた後、桂皮酸を添加し、間隔をおいて試料を採取し、ＨＰＬＣによってＰＨＣＡの存在について分析した。
【０１２２】
生育培地
ＡＴＣＣ培地＃１９６−酵母／モルト培地
この培地には、（１リットル当たりグラムで）モルト抽出物、６．０；マルトース、１．８；デキストロース、６．０；および酵母抽出物、１．２が含まれた。ｐＨは、７．０に調節した。
【０１２３】
ＡＴＣＣ培地＃５−胞子形成ブロス
この培地には、（１リットル当たりグラムで）酵母抽出物、１．０；牛肉エキス、１．０；トリプトン、２．０；およびグルコース、１０．０が含まれた。
【０１２４】
ダイズ粉／グリセロール培地（ＳＢＧ）
この培地には、（１リットル当たりグラムで）グリセロール、２０；酵母抽出物、５．０；ダイズ粉、５．０；塩化ナトリウム、５．０；リン酸水素２カリウム、５．０が含まれた。ｐＨは７．０に調節した。
【０１２５】
ジャガイモ−デキストロース／酵母培地（ＰＤＹ）
（１リットル当たりグラムで）ジャガイモデキストロースブロス、２４．０；酵母抽出物、５．０が含まれたこの培地を真菌株の生育用に使用した。
【０１２６】
試験した１００〜１５０種の微生物の中で、異なる３株、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ＡＴＣＣ １３２７３、ＡＴＣＣ １３９６８、ＴＵ６）、細菌Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ ４２７７）、および真菌株、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐｅｔｒａｋｉｉ（ＡＴＣＣ １２３３７）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ １０５４９）およびＡｒｔｈｒｏｂｏｔｒｙｓ ｒｏｂｕｓｔａ（ＡＴＣＣ １１８５６）において、桂皮酸をＰＨＣＡに変換する能力が示された。この結果によって、一般にＳｐｒｅｐｒｏｍｙｃｅｔｅ類、特にＳｔｒｅｐｔｉｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓはこのヒドロキシル化において最も活性を表すことが示された。したがって、以下のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ株（ＡＴＣＣ １３２７３、ＡＴＣＣ １３９６８、ＴＵ６）を使用してさらに研究を実施した。
【０１２７】
３種の複合培地（ＳＢＧ、胞子形成ブロスおよび酵母／モルト培地）において生育中のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓのパラ−ヒドロキシル化桂皮酸をＰＨＣＡにする能力を調べた。ＳＢＧ、胞子形成ブロスおよびモルト／酵母培地での２段階発酵方法を使用した。様々な間隔で試料を採取し、ＰＨＣＡの存在についてＰＨＣＡで分析した。データを以下の表１に示す。
【０１２８】
【表４】

【０１２９】
【表５】

【０１３０】
【表６】

【０１３１】
データによってわかるように、試験したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ株、ＡＴＣＣ１３２７３次いでＡＴＣＣ１３９６８およびＴＵ６は、ＳＢＧ培地で生育させるとＰＨＣＡ産生活性が最も高かった。ＳＢＧと胞子形成ブロスの両方で生育させたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓのＡＴＣＣ１３９６７株は、桂皮酸をＰＨＣＡに変換することができた。胞子形成培地で生育させた細胞（ＡＴＣＣ１３９６８）は、生育２４時間後に最も高いＰＨＣＡ産生能力を示し、一方ＳＧＢ培地で生育した細胞は６０時間後に最大ＰＨＣＡ産生活性に達した。
【０１３２】
実施例２
最適なＴＬＡ／ＰＡＬ活性比を含む微生物のスクリーニング
実施例２では、種々の微生物のＰＡＬおよびＴＡＬ活性についてのスクリーニングを説明する。この情報は、ＰＡＬおよびＰＡＬ／ＴＡＬ酵素のさらなるクローニング、発現、精製および反応速度分析用に最も適した微生物の選択を可能にするために必要である。
【０１３３】
生育培地およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおけるＰＡＬの誘導
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓには、２段階発酵方法を使用した。段階Ｉ培地には、グルコース（２％）、ダイズ粉（１％）、酵母抽出物（０．５％）、肉エキス（０．３％）、炭酸カルシウム（０．３％）が含まれ、第ＩＩ段階の接種のためには４％を使用した。段階ＩＩ培地には、グルコース（２％）、酵母抽出物（２％）、塩化ナトリウム（０．５％）、炭酸カルシウム（０．３％）が含まれた。この培地を１００ｍＬずつ５００ｍＬのフラスコに分配した。この培地に移した細胞を振盪機において２５℃で２４時間インキュベートした。
【０１３４】
複合培地で生育後のＲｈｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ細胞の準備
増殖収量およびＰＡＬ／ＴＡＬ比活性を測定するために、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ細胞を（２５０ｍＬ容量のＤｅＬｏｎｇフラスコに入れた）複合培地５０ｍＬで増殖させた。収量（細胞の湿重量）は８．１１グラムであった。次に、最初の収集物から０．８ｇ（湿重量）を使用して（１０×１リットルＤｅｌｏｎｇフラスコに入れた）２００ｍＬに移した。リン酸緩衝液１００ｍＭ（ｐＨ７．１）で３回洗浄した後の収量は、１６．０グラムであった。
【０１３５】
細胞抽出物の調製
細胞ペレットを５．０ｍＬ／ｇ細胞で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して、Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌに２００００ｐｓｉで１回通過させることによって破壊した。次いで、破壊した細胞を１４２００×ｇで３０分間遠心して、破壊していない細胞を除去した。抽出物試料を蛋白質濃度アッセイよびＰＡＬ／ＴＡＬ活性測定のために使用した。蛋白質測定はＰｉｅｒｃｅ Ｃｏ．のＢＣＡ法（ビシンコニン酸）によって実施した。
【０１３６】
ゲル
ＢｉｏＲａｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）製の成形済みの７．５％アクリルアミドゲルを使用した。細胞抽出物または酵素溶液の試料をＰｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｓｕｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）製の分子量標準物と共にゲルに添加した。凍結乾燥した高分子量（ＨＭＷ）蛋白質を１００μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５に溶解し、ブロモフェノールブルーを添加した。ＢｉｏＲａｄ製の泳動用緩衝液は、１０倍溶液から調製して、ゲルを１５０ボルトで泳動した。泳動色素が泳動によってゲルから排出した後、さらに１時間ゲルを泳動した。分子量マーカーおよび試料の列を含むゲルの１端を切断し、クーマシーブルーで約４５分間染色した。ゲルを２分割してゲル物質を裁断し、１．０〜２．０ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５に入れて４℃で放置した。次いで、ＰＡＬ活性は間隔を空けて２回測定した。前述のように測定したところ、ゲル切片は最大１７３ｍＵのＰＡＬ活性を含んでいた。
【０１３７】
ＰＡＬ／ＴＡＬ活性
ＰＡＬ／ＴＡＬ活性は前述のように測定した。この方法を使用して、ＰＡＬおよびＴＡＬそれぞれの比活性を測定したところ、０．０２４１±０．０００５Ｕ／ｍｇおよび０．０１４３±０．０００５Ｕ／ｍｇであった（表２）。これらの結果に基づいて、ＰＡＬ／ＴＡＬの比を算出すると、１．６８±０．０７であった。精製酵素で測定すると、ＰＡＬ／ＴＡＬ比は２．１２であった。文献ではこれらの酵素の値は１．７であると報告されている（Ｈａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｖｉｒ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ；Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８１；Ｖｏｌ．７、ｐｐ５７７〜６２５）。この完全なデータを表２に示す。
【０１３８】
【表７】

【０１３９】
表２に概略を示したように、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ（ＡＴＣＣ １０７８８）としても知られるＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓは最高のＴＡＬ活性を有するので、さらに研究を行うために選択した。
【０１４０】
実施例３
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＲｈｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬのクローニングおよび発現
実施例３では、精製のために十分な量のＰＡＬを産生するために、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）をクローニングし、発現させることを説明する。
【０１４１】
ＲＮＡ精製
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＲＮＡは、フェニルアラニンを含んだ複合培地で生育した対数期の細胞から精製した。全ＲＮＡを単離して、ｍＲＮＡはＱｉａｇｅｎ 全ＲＮＡおよびｍＲＮＡ単離キットそれぞれを使用して、製造者の指示に従って精製した。
【０１４２】
逆転写
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ｍＲＮＡ（３μＬ、７５ｎｇ）をＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗｉｃｈ ＣＴ．）に従って逆転写した。ＧｅｎｅＡｍｐキットの指示では、ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水を使用しない。使用したＰＣＲプライマー（０．７５μＭ）は、キット付属のランダムヘキサマーで、ＥｃｏＲＩ制限部位を含む上流プライマー（配列番号１）５′−ＡＴＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＣＴＣＧＡＣＴＣＧＡ−３′およびＰｓｔＩ制限部位を含む下流ＰＣＲプライマー（配列番号２）５′−ＧＡＧＡＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＡＣＧ−３′である。これらは、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬ遺伝子から合成した。キットのｐＡＷ１０９ ＲＮＡおよびＤＭ１５１およびＤＭ１５２プライマーを使用した陽性対照もまた実施した。ＰＣＲは、変性温度９５℃、１．０分、アニーリング温度５５℃、１．０分および伸長温度７２℃、２．０分のサイクルを３０回実施した。サイクル当たり５秒を伸長段階に付加し、最終伸長段階は１０分を使用した。一定量（５．０μＬ）をＰＣＲ反応混合物から採取し、１％アガロースゲルに添加して、ＰＣＲ反応生成物を確認した。
【０１４３】
ＰＣＲ断片の消化は、１０×マルチバッファ（２．０μＬ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ、１０ｍｇ／ｍＬ、１．０μＬ）、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ（それぞれ０．５μＬ）、ＰＣＲ生成物（４．０μＬ）および蒸留脱イオン水（１２．５μＬ）を使用して実施した。反応物全体を１％アガロースゲルに添加し、所望する大きさのＤＮＡ断片を精製した。
【０１４４】
ライゲーション
構築用ライゲーション混合物（全量５０μＬ）には、ライゲーション緩衝液（１０×、５．０μＬ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ ３．０Ｕ／μＬ（１．０μＬ）、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、２．５μＬ）、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ制限部位を有するプライマーを使用したＰＣＲ生成物 １９ｎｇ／μＬ（２５μＬ）、既にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断されたｐＫＫ２３３−３ ３３ｎｇ／μＬ（２．０μＬ）および脱イオン蒸留水（１４．５μＬ）が含まれた。対照ベクター用ライゲーション混合物（全量５０μＬ）には、ライゲーション緩衝液（１０×、５．０μＬ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ ３．０Ｕ／μＬ（１．０μＬ）、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ、２．５μＬ）、既にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ（２．０μＬ）で切断されたｐＫＫ２３３−３ ３３ｎｇ／μＬおよび脱イオン蒸留水（３９．５μＬ）が含まれた。この反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした。
【０１４５】
形質転換
コンピテントＤＨ１０ｂＥ．ｃｏｌｉ細胞（Ｇｉｂｃｏ）は、氷上で約２０分間解凍した。次いで、ライゲーション混合物２．０μＬを細胞５０μＬに添加し、氷上で３０分間インキュベートした。この細胞に２０秒間３７℃で熱ショックを与え、次いで再度氷上で冷却した。次いで、ＬＢブロス０．９５ｍＬをこの細胞に添加し、振盪機上で３７℃で１．０時間インキュベートした。次いでこの細胞を遠心して、ＬＢブロス約５０μＬに再懸濁して、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢプレートに画線して、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１４６】
クローン
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで過剰発現させた。この実施例で調製したＰＣＲ生成物をまず標準的クローニングベクターにクローニングし、次いでＤＨ１０ｂ Ｅ．ｃｏｌｌｉのｔａｃプロモータ制御下で過剰発現するのｐＫＫ２３３−３ベクターにクローニングした。６個のクローン全部について、細胞全体および無細胞両方のＰＡＬ活性を調べた。
【０１４７】
細胞生育
細胞を最初に、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含んだＬＢ培地５０ｍＬを入れた２５０ｍＬの邪魔板付きフラスコ内で３７℃で一晩生育させた。誘導されなかった細胞を収集する前に、一定量５．０ｍＬを新鮮培地に移し、約０．９（ＯＤ₆₀₀）になるまで生育させた。次いでＩＰＴＧを最終濃度０．２ｍｇ／ｍＬになるまで添加して酵素を誘導させ、さらに細胞を３．０時間生育させた。ＯＤ₆₀₀測定値を表３に示した。
【０１４８】
【表８】

【０１４９】
細胞全体のＰＡＬ活性
一定量の誘導されなかった細胞（１．０ｍＬ）および誘導された細胞（０．２ｍＬ）を収集前に採取した。細胞をペレット状にして、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８．５、１０ｍＬに再懸濁した。次いでフェニルアラニンを添加し（最終濃度１．０ｍＭ）、混合物を振盪機上で３７℃で１．０時間インキュベートした。次いで、この混合物をリン酸５０μＬで酸性にして、細胞をペレット状にした。次いで溶質を濾過し、前述のようにＨＰＬＣで分析した。誘導細胞の培養培地も同様に処理して、ＨＰＬＣで分析した。桂皮酸およびＰＨＣＡ標準物（１．０ｍＭ）もまた分析して、試料中の化合物の濃度を計算するために使用した（たとえば、（１７７．６６ｍＡＵ試料）／（１２７３４．１３ｍＡＵ／ｍＭ標準物）^*（１０００μＭ／ｍＭ）＝１３．９５μＭ桂皮酸である）。結果を表３に示す。
【０１５０】
無細胞のＰＡＬ活性
細胞を遠心によって収集した。この収集した細胞ペレットに、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）１．０ｍＬを添加し、この細胞をＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌに約１８０００ｐｓｉで１回通過させて破壊した。この抽出物をＥｐｅｎｄｏｒｆ Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ中で４℃で１０〜１５分間遠心した。上清（１．０ｍＬ）を除去して、ＰＡＬ活性およびＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイのために使用した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２、２４８、１９７６）。最高の比活性、０．２４４（ＰＡＬ）および０．０６５０（ＴＡＬ）Ｕ／ｍｇ蛋白質が認められた。
【０１５１】
ＳＤＳゲル電気泳動
一般的方法で説明したように、精製したＰＡＬ蛋白質を８〜２５％既製ＰｈａｓｔＧｅｌで泳動した。精製したＰＡＬの分子量は、これらの分析に基づいて２８７ｋＤａであると推定された。
【０１５２】
前記の実験中、ＬＢ培地で細胞が生育する間および細胞全体アッセイ中に、ＰＨＣＡおよび桂皮酸の両者が出現することが発見された。Ｅ．ｃｏｌｉは桂皮酸をＰＨＣＡに変換する酵素機構を有さないので、形質転換したＥ．ｃｏｌｉ培養物でＰＨＣＡが検出されたことは予期せぬ発見であった。したがって、これらの培養物にＰＨＣＡが存在することによって、Ｅ．ｃｏｌｉで発現した野生型酵母ＰＡＬ酵素には、ＰＡＬ活性に加えてチロシンを直接ＰＨＣＡに変換するＴＡＬ活性が含まれることが示唆された。
【０１５３】
実施例４
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ野生型ＰＡＬを過剰発現する組換えＥ．ｃｏｌｉによるＰＨＣＡ産生
この実施例では、野生型ＰＡＬを過剰発現するＥ．ｃｏｌｉ株がグルコースまたはＬＢ培地のいずれかでの生育する間のＰＨＣＡ産生能力についての分析を説明する。
【０１５４】
前述のように、ＰＨＣＡの合成経路は２種類ある。１経路では、ＰＨＣＡはＰＡＬによるフェニルアラニンからトランス桂皮酸への変換、次いでチトクロームＰ４５０酵素系によるパラ位のヒドロキシル化によって合成することができる。もう１種の経路では、ＴＡＬによってチロシンが１段階反応でＰＨＣＡに変換され、Ｐ−４５０は必要ない。チトクロームＰ−４５０酵素はＥ．ｃｏｌｉには存在しないので、これらの細胞で形成されたＰＨＣＡはＴＡＬ経路によるものであろう。この仮説を確かめるために、以下の実験を実施した。ＰＣＡ １２Ｋｍ（実施例８で説明）を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を１．０ｍＭ桂皮酸と共に一晩インキュベートして、ＰＨＣＡ産生をＨＰＬＣで監視した。
【０１５５】
細胞生育
細胞を、ＬＢブロス、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢ＋０．２％グルコース中で３０℃で一晩、またはＭ９培地（以下参照）＋０．２％グルコースまたはアンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含むＭ９培地＋２％グルコース中で３０℃で２４ｈ生育させた。Ｍ９培地＋グルコースで生育させた細胞は、ＬＢ培地の細胞よりも顕著に増殖が遅かった。
【０１５６】
ＰＨＣＡアッセイ
各細胞培養物の一定量（１．０ｍＬ）をリン酸５０μＬで酸性化し、ペレット状にして、上清を濾過して一般的方法で説明したようにＨＰＬＣで分析した。２４時間後、または７２時間後に試料を採取した。ＰＨＣＡ標準物（１．０ｍＭ）もまた分析して、試料中の化合物濃度の決定に使用した。生育をＰＨＣＡ産生に関連づけるために、試料をまた採取して６００ｎｍでの細胞密度を測定した（表３参照、実施例２）。
【０１５７】
表３のデータからわかるように、野生型ＰＡＬを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞はＬＢ（グルコースの有無にかかわらず）またはグルコースを含むＭ９培地（以下参照）のいずれかで生育させるとＰＨＣＡを産生した。ＬＢ培地にグルコースを添加すると、形成されるＰＨＣＡ全量および培養物の細胞密度が増加するが、細胞密度当たりのＰＨＣＡ産生を減少した。
【０１５８】
Ｍ９培地
細菌培養用Ｍ９最小培地には、（１リットルあたりグラムで）Ｎａ₂ＨＰＯ₄、６．０；ＫＨ₂ＰＯ₄、３．０；ＮＨ₄Ｃｌ、１．０；ＮａＣｌ、０．５；およびグルコース、４が含まれる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、付録Ａ．３）。
【０１５９】
実施例５
Ｅ．ｃｏｌｉからの組換え野生型Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬの精製
熱処理、硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換カラム、疎水性相互作用クロマトグラフィおよびゲル濾過を使用して、形質転換したＥ．ｃｏｌｉから野生型組換えＲ．ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬを精製した。
【０１６０】
細胞生育
細胞は、１０Ｌの発酵漕内で、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含む２×ＹＴ培地で、２８℃で生育させた。
【０１６１】
無細胞抽出液の調製
細胞を収集し、用時まで凍結ペレットとして保存した。このペレット（湿重量７６ｇ）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５で洗浄し、密度が緩衝液１．０ｍＬ当たりの細胞湿重量が２．０ｇとなるように同緩衝液で再懸濁した。少量のＤＮａｓｅを添加して、細胞を２回Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌに約１８０００ｐｓｉで通過させた。次いで、プロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦを抽出物に最終濃度０．５ｍＭになるように添加した。細胞残渣を１３０００×ｇ、３０分間、次いでさらに１０５０００×ｇ、１．０時間の遠心で除去した。
【０１６２】
抽出物の熱処理
抽出物を温度６０℃で１０分間加熱し、その後氷上に置いた。変性蛋白質を２５０００×ｇ、３０分間の遠心でペレットにした。
【０１６３】
硫酸アンモニウム沈殿
硫酸アンモニウム沈殿は、硫酸アンモニウム飽和溶液を４℃で添加することによって実施した。溶液を氷上で１５〜３０分間攪拌した。沈殿した蛋白質を２５０００×ｇ、１５分間の遠心でペレットにして、ペレットを最小量のＴｒｉｓ緩衝液に溶解した。硫酸アンモニウム３５％で沈殿中、溶液のｐＨを測定して、８．５に調節した。抽出物の量は、各沈殿毎に測定した。抽出物は硫酸アンモニウムによって別々に沈殿したが、両操作から得られた硫酸アンモニウム５０％沈殿物を集めて、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０限外濾過管（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）で脱塩した。
【０１６４】
陰イオン交換クロマトグラフィ
陰イオン交換クロマトグラフィは、２０ｍｍ×１６５ｍｍ、５０μｍ ＨＱカラム（Ｐｅｒｓｐｅｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）で、３０ｍＬ／ｍｉｎの流速で実施した。開始緩衝液（緩衝液Ａ）は５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５で、溶出緩衝液（緩衝液Ｂ）は５．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、ＮａＣｌ ０．５Ｍであった。カラムをカラム量（ＣＶ）の２倍の緩衝液Ａで平衡化し、試料注入後２ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。勾配は１０ＣＶで１００％緩衝液Ａから５０％緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂとした。次いで、第２勾配は２ＣＶで５０％緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂから１００％緩衝液Ｂとした。このカラムを２ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで２ＣＶの緩衝液Ａで再度平衡化した。蛋白質は２８０ｎｍで監視し、最初の勾配中の１０ｍＬずつ画分を氷上に収集した。試料の大きさは５．０ｍｌまでで、蛋白質３４０ｍｇ、またはカラム許容量、２８５０ｍｇの約１２％を含んでいた。異なる操作から得た画分をプールして、前記で示したように濃縮した。
【０１６５】
疎水性相互作用クロマトグラフィ
疎水性相互作用クロマトグラフィは、２０ｍｍ×１６７ｍｍ、５０μｍ ＰＥカラム（Ｐｅｒｓｐｅｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）で、流速３０ｍＬ／ｍｉｎで実施した。開始緩衝液（緩衝液Ａ）は５．０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １．０Ｍで、溶出緩衝液（緩衝液Ｂ）は５．０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．５であった。カラムは２ＣＶで平衡化し、試料注入後２ＣＶの緩衝液Ａで洗浄した。次いで、勾配は１０ＣＶで緩衝液Ａ１００％から緩衝液Ｂ１００％とした。このカラムを２ＣＶの緩衝液Ｂで洗浄し、次いで２ＣＶの緩衝液Ａで再度平衡化した。蛋白質を２８０ｎｍで監視し、１０ｍＬずつ画分を集め、勾配中、氷上で維持した。５．０ｍＬまで、蛋白質５０ｍｇまで、またはカラム許容量４２０ｍｇの１２％までの試料に、飽和硫酸アンモニウム溶液を添加することによって（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ １．０Ｍに調節した。異なる操作から得られた画分を集め、前述のように脱塩して濃縮した。
【０１６６】
ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦ）
ゲル濾過は、１０ｍｍ×３０５ｍｍ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ＨＲカラムで、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで実施した。ＮａＣｌ ０．２Ｍを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を使用して、カラムを１ＣＶ操作し、蛋白質溶出を２８０ｎｍで監視した。画分（０．５ｍＬ）を集めて、氷上に維持した。カラムに添加した試料量は１００μＬで、蛋白質を１０ｍｇまで含んでいた。ピーク中央から得た画分をプールし、前述のように濃縮した。
【０１６７】
精製度および比活性の上昇を説明するデータを表４に示す。
【０１６８】
【表９】

【０１６９】
実施例６
炭素源の選択
この実施例では、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬ遺伝子（配列番号７）および植物Ｐ−４５０およびＰ−４５０レダクターゼ（それぞれ、配列番号１１および配列番号１３）を含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＰＴＡ ４０８）のフェニルアラニンをＰＨＣＡに変換する能力に対する様々な炭素源の影響を説明する。
【０１７０】
酵母ＰＡＬおよび植物Ｐ−４５０およびＰ−４５０レダクターゼを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２個のコロニー（＃１および＃２）を選択し、ラフィノース、ガラクトースおよびグルコースのいずれかを含む３種の異なる培地で生育させた。この培地は、Ｒａｆ／ＳＣＭまたはＧａｌ／ＳＣＭまたはＧｌｕ／ＳＣＭと称した。これらの３実験で使用した種々の培地の配合は以下の通りである。
【０１７１】
Ｇｌｕ／ＳＣＭ（Ａｄｅ／Ｈｉｓ／Ｕｒａ）には、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ窒素基（６．７ｇ／Ｌ）；グルコース、（２０．０ｇ／Ｌ）；およびＳＣＭ、（２．０ｇ／Ｌ）が含まれた。
【０１７２】
Ｒａｆ／ＳＣＭ（Ａｄｅ／Ｈｉｓ／Ｕｒａ）には、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ窒素基（６．７ｇ／Ｌ）；ラフィノース、（２０．０ｇ／Ｌ）；およびＳＣＭ、（２．０ｇ／Ｌ）が含まれた。
【０１７３】
Ｒａｆ／Ｇａｌ ＳＣＭ（Ａｄｅ／Ｈｉｓ／Ｕｒａ）／Ｔｙｒ／Ｐｈｅには、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ窒素基（６．７ｇ／Ｌ）；ラフィノース、（１０．０ｇ／Ｌ）；ガラクトース、（１０．０ｇ／Ｌ）；およびＳＣＭ、（２．０ｇ／Ｌ）；チロシン、（０．５ｇ／Ｌ）；およびフェニルアラニン、（１０．０ｇ／Ｌ）が含まれた。
【０１７４】
酵母用ＳＣＭ（Ａｄｅ／Ｈｉｓ／Ｕｒａ）寒天プレートには、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ窒素基（３．３５ｇ／Ｌ）；デキストロース、（１０．０ｇ／Ｌ）；寒天、（１０．０ｇ／Ｌ）；ＳＣＭ、（１．０ｇ／Ｌ）；およびｄｄＨ₂Ｏ（５００ｍＬ）が含まれた。
【０１７５】
コロニーそれぞれのグリセロールストック（３００μＬ）を、Ｇｌｕ／ＳＣＭ、Ｇａｌ／ＳＣＭおよびＲａｆ／ＳＣＭ培地に接種するために使用した。各株および各培地について２連で培養物を調製し、培養物を２４時間および４８時間生育させた。
【０１７６】
細胞密度は前述のように測定し、次いで細胞を遠心して、０．８５％食塩リン酸緩衝液で１回洗浄して、ＳＣＭ培地（５．０ｍＬ）に懸濁して、ＯＤ₆₀₀を再度測定した。次いで、細胞をＲａｆ／ＳＣＭまたはＧａｌ／ＳＣＭ培地いずれかを２５．０ｍＬ含んだ対応するフラスコに最終ＯＤ₆₀₀、０．５になるまで添加した。ガラクトース（最終濃度５％）をフラスコそれぞれに添加して、振盪機で約１６時間振盪して誘導させた。誘導後、フェニルアラニン（最終濃度１．０ｍＭ）をフラスコそれぞれに添加して、試料（１．０ｍＬ）をそれぞれのフラスコから２、４、６、２４および４８時間後に採取し、ＰＨＣＡの存在をＨＰＬＣで分析した（表５参照）。
【０１７７】
【表１０】

【０１７８】
【表１１】

【０１７９】
表５のデータからわかるように、試験した株はいずれも異なる培地中で生育するとき同様の挙動を示した。６〜２４時間の間に、最高濃度のＰＨＣＡ産生が認められ、フェニルアラニンの約３０％はＰＨＣＡに変換された。最初の出現および蓄積に続いて、ＰＨＣＡ濃度の減少が認められた（４８時間）。
【０１８０】
実施例７
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ ＰＡＬ、植物チトクロームＰ−４５０およびチトクロームＰ−４５０レダクターゼを含む組換えＳａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株によるＰＨＣＡの産生
この実施例では、野生型ＰＡＬおよび、植物チトクロームＰ−４５０およびチトクロームＰ−４５０レダクターゼ遺伝子を含む組換えＳａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株によるＰＨＣＡの産生のガラクトースによる誘導を説明する。
【０１８１】
Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株に取り込まれたＰＡＬ、チトクロームＰ−４５０およびチトクロームＰ−４５０レダクターゼはガラクトースプロモータ制御下にあるので、形成するＰＨＣＡ濃度に対するガラクトースの誘導の長さを調べるために実験を実施した。ＰＨＣＡを最高濃度で産生するＳａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株＃２を選択して、ガラクトースによって誘導した。組換えＳａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが直接グルコースをＰＨＣＡに変換することができるかどうかを調べるために、ガラクトースで１時間誘導後、１群の細胞にグルコースを与え、フェニルアラニンは添加しなかった。他の群の細胞はラフィノースで生育させた。フラスコ全てから間隔をおいて試料を採取し、前述のようにＨＰＬＣ分析用に調製した。
【０１８２】
Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのグリセロール懸濁試料をＳＣＭ−グルコースプレートに画線して、３０℃でインキュベートした。コロニー４個をプレートから採取し、Ｇｌｕ／ＳＣＭ培地４．０ｍＬに接種して、振盪機上で（３０℃、２５０ｒｐｍ）一晩放置した。細胞懸濁液１ｍＬを採取し、ＯＤ₆₀₀を測定した。生育２４時間後、ＯＤ₆₀₀が約１．４から１．６のとき、細胞（１．０ｍＬ）をＧｌｕ／ＳＣＭ培地２５ｍＬまたはＲａｆ／ＳＣＭ培地５０ｍＬに移した。一晩生育後（３０℃、２５０ｒｐｍ）、試料（１．０ｍＬ）を各フラスコから採取し、ＯＤ₆₀₀を測定した。
【０１８３】
【表１２】

【０１８４】
ＯＤデータからわかるように、ラフィノースと比較してグルコースで生育するとより多くの細胞集団が得られた。組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅがフェニルアラニンを添加しないで直接グルコースをＰＨＣＡに変換できるかどうかを調べるために、グルコースまたはラフィノースで生育させた後、細胞をグルコース添加前にガラクトースによって誘導する実験を計画した。間隔をおいて試料を採取し、前述のようにＨＰＬＣ分析用に準備した。データを表６に示す。
【０１８５】
【表１３】

【０１８６】
【表１４】

【０１８７】
表６のデータでわかるように、グルコースを含む培地で生育するとより多くの細胞量が得られるが、形成するＰＨＣＡの量はラフィノース存在下で生育させるとより多くなった（２４時間ラフィノースで生育させるとＰＨＣＡが約２００μＭであるのに対し、グルコースでの生育では約１４．５μＭである）。このことによって、ガラクトースによって誘導可能なプロモータに対するグルコースの阻害効果が強調される。
【０１８８】
他の実験では、グルコースまたはラフィノースを含む生育培地にフェニルアラニンを添加する効果を判定した。フラスコそれぞれの試料（１０ｍＬ）を培地２５ｍＬを含む容量１２５ｍＬのフラスコに移し、細胞をガラクトース（最終濃度２％）で誘導した。この誘導を、１．０、３．０、６．０時間および一晩行った。特定の誘導時間後、フェニルアラニン（１．０ｍＭ）をフラスコそれぞれに添加し、ＰＨＣＡの形成を測定した。結果を以下の表７にまとめて示す。
【０１８９】
【表１５】

【０１９０】
予想通り、かつ表７からわかるように、両培地にフェニルアラニンを添加するとフェニルアラニンを添加しない場合と比較してＰＨＣＡの産生がより高くなった。一般に、ラフィノースで生育した細胞はグルコースで生育した細胞と比較してより多量のＰＨＣＡをフェニルアラニンから産生した。ラフィノースで生育した細胞によるフェニルアラニンからのＰＨＣＡの平均産生量は約５００μＭで、約２４時間後に最高濃度のＰＨＣＡが形成された。ほとんどの場合、ＰＨＣＡ濃度は約２４時間後に最大値に達し、顕著な変化なく実験終了時（約５４時間）まで維持された。誘導期間（すなわち、１．０、３．０、６．０時間および一晩）は、ＰＨＣＡ産生濃度に顕著な差異をもたらさないようであった。グルコースで生育させた培養物中の形成されたＰＨＣＡの濃度は、約３００μＭであった。グルコース生育細胞によって形成されたＰＨＣＡの全量はラフィノース生育細胞による生成よりも少ないが、ＰＨＣＡの形成パターンは同一であった。
【０１９１】
要約すると、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ野生型ＰＡＬおよび植物チトクロームＰ−４５０およびチトクロームＰ−４５０レダクターゼを含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、フェニルアラニンを添加しないでもグルコースを直接ＰＨＣＡに変換する能力を有していた（約２５％変換）。フェニルアラニンを添加すると、約５０％がＰＨＣＡに変換された。
【０１９２】
実施例８
変異ＰＡＬ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）酵素同定用選択システムの開発
この実施例では、改善されたＴＡＬ活性を有する変異ＰＡＬ酵素の選択方法について説明する。現在のところ、中間段階無しにチロシンを直接ＰＨＣＡに効率的に変換できるように操作した酵素はない。この反応では、酵素はチロシンをＰＨＣＡおよびアンモニアに変換する一方、逆反応として同酵素はＰＨＣＡおよびアンモニアをチロシンに変換する。チロシンをＰＨＣＡに変換できる変異ＰＡＬ酵素を検出するために、以下のスクリーニングを開発した。
【０１９３】
発現ベクターの構築（ＰＣＡ１２Ｋｍ）
弱発現ベクターは、市販のｐＢＲ２３３ベクターを変更することによって作製した。簡単に言うと、ｐＢＲ３２２をＰｓｔＩで切断し、２種のプライマー、ｐＢＲ１（配列番号３）
５′−ＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡＴＡ−３′
およびｐＢＲ２（配列番号４）
５′−ＧＡＧＡＧＡＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧ−３′
でＰＣＲを２０サイクル行った。
【０１９４】
ＰＣＲ反応生成物をフェノールクロロホルムで抽出して、ＥｔＯＨ沈殿させ、ＸｈｏＩで切断した。次いで、ＸｈｏＩ切断生成物をゲルで単離して、連結してＥ．ｃｏｌｉに形質転換してテトラサイクリン耐性で選択した。したがって、このベクターはアンピシリン耐性は欠損するが、β−ラクタマーゼプロモータおよび以下の制限部位、ＸｂａＩ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｍａＩ、ＢｇｌＩＩを含むｐＢＲ３２２である。ｐＢＲ３２２のテトラサイクリン耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えられた。テトラサイクリン耐性遺伝子をｐＣＡ１２（図１）からＥｃｏＲＶ（１８５）およびＮｒｕＩ（９７２）部位で切り出し、末端をｐｆｕポリメラーゼ（ＰＣＲ ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ ｋｉｔ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して削り、平滑末端Ｐｋｂ カナマイシン耐性遺伝子断片（Ｖｉｅｉｒａ ａｎｄ Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｇｅｎｅ １９：２５９〜２６８（１９８２））と連結した。最終構築物は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅベクター（図１）へのライゲーションの形質転換後にＬＢ／ｋｍプレートで選択した。
【０１９５】
Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓのＰＡＬ遺伝子のＰＣＡ１２Ｋｍへのサブクローニング
酵母（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）ＰＡＬの遺伝子配列は決定され、報告されている（Ａｎｓｏｎ他、Ｇｅｎｅ ５８：１８９〜１９９（１９８７））。報告された配列に基づいて、ｐＢＲ３２２をベースとしたベクターにサブクローニングした。次いで、完全なＰＡＬ遺伝子をプラスミドからＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断によって取り出し、この遺伝子をＸｂａ−ＰｓｔＩ−切断ＰＣＡ１２Ｋｍに連結した。ＰＡＬ遺伝子を含む新規構築物をＰＣＡ１８Ｋｍと称した。
【０１９６】
チロシン要求株Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＡＬ酵素の発現
ＰＣＡ１２ＫｍおよびＰＣＡ１８Ｋｍをチロシン要求Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴ２４７１に形質転換して、ＴＡＬおよびＰＡＬ活性を細胞全体のアッセイを使用して測定した。少量のＰＨＣＡまたは桂皮酸の形成がこれらの細胞とチロシンまたはフェニルアラニンとのインキュベーション後に検出された（表８）。
【０１９７】
【表１６】

【０１９８】
表８に見られるように、酵母ＰＡＬ酵素はＰＣＡ１８Ｋｍベクターを含むチロシン要求Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴ２４７１で弱く発現した。
【０１９９】
選択条件の決定（選択システムの開発）
ＰＣＡ１８Ｋｍベクターを含むチロシン要求Ｅ．ｃｏｌｉ株ＡＴ２４７１は、元の株と同様のチロシン要求特性を示した。この細胞は最小培地のプレートでは生育しないが、チロシン０．００４ｍＭをプレートに添加すると良好に生育した。適切な選択条件を発見するために、様々な濃度のチロシンまたはＰＨＣＡを含む最小培地プレートで細胞生育を試験した（表９参照）。
【０２００】
【表１７】

【０２０１】
表９で示した結果は、高濃度のＰＨＣＡは細胞に毒性であることを示唆している。ＰＨＣＡ濃度２．０ｍＭを選択実験用に選択した。異なるチロシン濃度での細胞増殖に関する情報は選択のために重要である。たとえば、細胞によるＰＨＣＡからのチロシン生成は、細胞生育を維持するために十分ではなく、少量のチロシン（０．０００１〜０．０００２ｍＭ）をプレートに添加することが可能である。これによって、わずかに改善されたＴＡＬ活性を有する酵素を発現する株の同定が可能となろう。言い換えると、選択の厳密さは選択プレートのＰＨＣＡおよびチロシン濃度を変化させることによって調節することができる。
【０２０２】
実施例９
改善されたＴＡＬ活性を有する変異ＰＡＬ酵素の操作
誤りがちなＰＣＲ
ＰＣＡ１８Ｋｍ構築物から完全なＰＡＬ遺伝子を増幅するために、以下のプライマーを使用した。
プライマーＡ（配列番号５）
５′−ＴＡＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧ−３′
プライマーＢ（配列番号６）
５′−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＧＣＧＡＧＣＡＴＣ−３′
プライマーＡ（前向きプライマー）はＡＴＧコドン直前にＸｂａＩ制限酵素部位を含み、プライマーＢ（逆向きプライマー）は停止コドン直後にＰｓｔＩ部位を有する。ＰＣＲの誤る割合を増加させるために、単純なＴａｑポリメラーゼおよび回数の多い反応サイクル（３５サイクル）を使用した。さらに、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰの割合を変化させた。４種の異なる反応を実施した。それぞれの反応において、ｄＮＴＰの１種の濃度を０．１ｍＭとし、その他の３種のｄＮＴＰを０．４ｍＭに調節した。４種の反応のＰＣＲ産物を反応完了後に一緒に混合した。誤りがちなＰＣＲ生成物をＸｂａＩおよびＰｓｔＩで切断後、断片をＸｂａＩ−ＰｓｔＩ−切断ＰＣＡ１２Ｋｍに連結した。
【０２０３】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−Ｒｅｄ株を使用したＩｎ ｖｉｖｏ変異誘発
ＰＣＡ１８Ｋｍは、ＸＬ１−Ｒｅｄ株に形質転換し、細胞をＬＢ培地およびカナマイシンで一晩生育させた。変異率を増加させるために、細胞を新鮮な生育培地で希釈して、さらに生育させた。２〜４細胞世代周期後、プラスミドを精製して、選択用に使用した。
【０２０４】
選択
変異誘発後、無作為に変異したＰＡＬ遺伝子を含む変異ＰＣＡ１８Ｋｍのプールをエレクトロポレーションによってチロシン要求Ｅ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。形質転換効率は、１．５×１０⁸ｃｆｕ／μｇＤＮＡであった。次いで、抗生物質を入れたＬＢ培地で細胞を５．０時間を超えてインキュベートした。最小培地で洗浄後、細胞をチロシン０．０００２ｍＭおよびＰＨＣＡ２．０ｍＭを補充した最小培地を含むプレートに画線した。３０℃で３．０〜５．０日インキュベーション後、１．０〜１０個のコロニーが各プレートに出現した。
【０２０５】
選択プレートに出現したコロニーのＰＡＬ／ＴＡＬ活性を一般的方法で説明した細胞全体のアッセイを使用して分析した。ＥＰ１８Ｋｍ−６と称する変異体の１種では、野生型の細胞よりもＴＡＬ活性比が増大していることが認められた。ＥＰ１８Ｋｍ−６変異体の一般的分析を実施した。プラスミドＤＮＡを変異細胞から精製して、次にＥ．ｃｏｌｉに再度形質転換した。新規の形質転換体は元の変異体と同様にＴＡＬ比が増大しており、ＴＡＬ活性の改善に関与する変異は全てプラスミド上にあることが示された。変異体をより特徴付けるために、以下の分析を実施した。
【０２０６】
実施例１０
変異ＰＡＬ酵素の特徴付け
変異遺伝子の配列分析
ＥＰ１８Ｋｍ−６の全遺伝子をＡＢＩ３７７自動シークエンサ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で配列決定して、ＤＮＡｓｔａｒプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用してデータを処理した。得られたＰＡＬ変異体の分析に続いて野生型遺伝子（配列番号７）との比較を行って、変異遺伝子（配列番号９）が以下の４種の１塩基置換変異（点突然変異）、すなわちＣＴＧ（Ｌｅｕ２１５）からＣＴＣ、ＧＡＡ（Ｇｌｕ２６４）からＧＡＧ、ＧＣＴ（Ａｌａ２８６）からＧＣＡおよびＡＴＣ（Ｉｌｅ５４０）からＡＣＣへの変異を含むことが示された。最初の３種の変異は３番目の塩基で生じており、アミノ酸変化を起こさないサイレント突然変異であった。４種目の変異は２番目の塩基変化（ＡＴＣからＡＣＣ）であった。この変異は、酵素の保存領域にあるイソロイシン−５４０をトレオニンに変化させた。様々な原料から得られた種々のＰＡＬ酵素は、この重要な位置にイソロイシンまたはロイシンのいずれかを有する。
【０２０７】
ＥＰ１８Ｋｍ−６変異酵素の過剰発現および精製
酵素反応速度分析用に純粋な酵素を十分量得るために、この酵素を過剰発現ベクター、ｐＥＴ−２４―ｄで発現させた。ｐＥＴ−２４−ｄベクターをＥｃｏＲＩで切断して、製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の指示に従ってクレノウ酵素を使用して切断生成物を充填した。次いで、線状になったベクターをＮｈｅＩで切断し、ＸｂａＩおよびＳｍａＩでＥＰ１８Ｋｍ−６を切断することによって変異ＰＡＬ遺伝子を得た。ＮｈｅＩおよびＸｂａＩは両立可能な部位なので、変異遺伝子はｐＥＴＡＬ構築物（図２）を調製するためにライゲーションによってｐＥＴ２４−ｄベクターにサブクローニングした。ｐＥＴ−２４−ｄベクターはＮ末端Ｔ７タグ配列および任意選択でＣ末端ＨｉｓＴａｇ配列を有しているので、酵素がＮ末端およびＣ末端の両方で天然の配列を発現できるように、これらのタグを使用しなかった。変異遺伝子をｐＥＴ−２４−ｄベクターにクローニングした後、この構築物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した（ＤＥ３）。過剰発現させるため、ＩＰＴＧ１．０ｍＭを添加する前に細胞をカナマイシンを含むＬＢ培地でＯＤ₆₀₀が１．０になるまで生育させた。誘導４．０時間後、細胞を遠心によって収集し、一般的方法の項で説明したように粗抽出物を調製した。粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、発現した酵素は際立った蛋白質バンドであり、発現濃度は前蛋白質の１０〜１５％と推定されることが明らかとなった（図３）。図３は、精製した変異ＰＡＬ酵素（Ａ列）および精製用に出発物質として使用した細胞粗抽出物（列Ｂ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。Ｃ列は標準的分子量マーカー（上から下へ、９４，６７、４３、３０、２０および１４ｋＤａ）である。ＰＡＬの精製のために、プロテアーゼ阻害剤ＰＭＳＦ、アミノカプロン酸およびベンズアミジン（それぞれ１．０ｍＭ）を含んだ１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．６に細胞ペレットを懸濁した。細胞を超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎモデル１８５、出力設定７０％、氷浴中４分）で破壊して、次に遠心した（３００００×ｇ、３０分）。透明な上清をＭｏｎｏ−Ｑ ＨＰＬＣカラム（流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ）に添加した。このカラムを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０で開始して、次に溶出緩衝液として４００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２で溶出した。この酵素はリン酸カリウム濃度約９０ｍＭで溶出した。活性画分を集め、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ１００（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して濃縮した。酵素の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって判定したところ＞９８％であった（図３）。
【０２０８】
変異ＰＡＬ酵素の生化学的特性
酵母野生型および精製した変異ＰＡＬ酵素と、基質としてチロシンまたはフェニルアラニンを使用して、詳細な酵素反応速度分析を実施した。ＰＡＬおよびＴＡＬ活性を一般的方法で説明したように分光光学的に測定し、Ｋ_MおよびＶ_MAXをラインウィーバーバークプロットから決定した。活性テトラマーには４個の活性部位が存在すると仮定して、Ｖ_MAXからｋ_catを計算した。決定した酵素のＫ_Mおよびｋ_catを表１０に示した。
【０２０９】
【表１８】

【０２１０】
ｋ_cat／Ｋ_Mとして定義した触媒効率は、野生型および変異酵素の両方について計算した。野生型酵素のＴＡＬ対ＰＡＬ触媒効率の比は０．５である一方、変異酵素の比は１．７に増加していた（表１１参照）。この結果から、フェニルアラニンを使用することを好む野生型と異なり、変異酵素は基質としてチロシンを使用することを好むことが示され、それによって酵母ＰＡＬの基質特異性が変異誘発および選択後に変化したことが明確に示唆された。
【０２１１】
【表１９】

【０２１２】
実施例１１
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴＡＬ経路によるグルコースからのＰＨＣＡの生物学的製造
変異ＰＡＬを使用したＥ．ｃｏｌｉにおけるグルコースからのＰＨＣＡの製造
改善されたＴＡＬ活性（ＥＰ１８Ｋｍ−６）を有する変異ＰＡＬ遺伝子のプラスミドを野生型Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０に形質転換した。この細胞をグルコースを単一の炭素源として使用した最小培地で生育させた。一晩生育後、生育培地２０μＬを濾過して、ＰＨＣＡを検出するためにＨＰＬＣで分析した。野生型（対照）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ではＰＨＣＡの蓄積は認められなかった。しかし、変異ＰＡＬ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで発現させたとき、グルコースを単一の炭素源として含む最小培地で一晩細胞を生育させるとＰＨＣＡ０．１３８ｍＭが検出された（表１２参照）。
【０２１３】
【表２０】

【０２１４】
桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性を欠損したＥ．ｃｏｌｉ細胞
ＰＣＡ１２Ｋｍベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を一晩桂皮酸１．０ｍＭとインキュベートしてもＰＨＣＡは産生されず、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞は桂皮酸をＰＨＣＡに変換する能力を欠如していることが強調された。
【０２１５】
実施例１２
変更ＰＡＬの酵母発現ベクターへの取り込み
以下の酵母株およびｐＧＰＤ３１６発現ベクターを使用した。ＺＸＹ３４−１Ａ株は遺伝子型、Ｍａｔａ、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００、ｈｉｓ３−１１、−１５、ｌｅｕ２−３、−１１２、ｔｒｕｐ１−１、ｕｒａ３−１、ａｒｏ３：：ΔＵＲＡ３、ａｒｏ４：：ΔＨＩＳ３を含み、ａｒｏ３、ａｒｏ４ダブルノックアウトと称した。ＺＸＹ０３０４Ａ株は遺伝子型、Ｍａｔａ、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００、ｈｉｓ３−１１、−１５、ｌｅｕ２−３、−１１２、ｔｒｕｐ１−１、ｕｒａ３−１、ａｒｏ３：：Δｕｒａ３、ａｒｏ４：：ΔＨＩＳ３を含み、ａｒｏ３、ａｒｏ４ダブルノックアウトであった。
【０２１６】
当業界で周知の標準的サブクローニング法を使用して、変更したＰＡＬを前記ベクターに取り込ませた。変更したＰＡＬ ｃＤＮＡ（２．０ｋｂ）をＸｂａＩおよびＳｍａＩ制限酵素で切断し、得られた切断断片をＳｐｅＩおよびＳｍａＩ制限酵素で切断した発現ベクターｐＧＰＤ３１６に連結した。ｐＧＰＤ３１６およびｐＥｐ１８のインサートによる新規構築物をｐＧＳＷ１８と称した（図４）。新規構築物を制限酵素で切断し、続いてアガロースゲルで電気泳動して確認した。
【０２１７】
実施例１３
芳香族アミノ酸無しでグルコースをＰＨＣＡに変換するＡＲＯ４ＧＳＷの能力
遺伝子型、Ｍａｔａ、ａｄｅ２−１、ｃａｎ１−１００、ｈｉｓ３−１１、−１５、ｌｅｕ２−３、−１１２、ｔｒｕｐ１−１、ｕｒａ３−１、ａｒｏ３：：Δｕｒａ３、ａｒｏ４：：ΔＨＩＳ３を含み、ａｒｏ３、ａｒｏ４ダブルノックアウトと称したＺＸＹ０３０４Ａ株を使用した。このＺＸＹ０３０４Ａ株を標準的酢酸リチウム法で変更ＰＡＬを含むｐＧＳＷ１８によって形質転換した。形質転換体、ＡＲＯ４ＧＳＷはＳＣＭ培地（ロイシンおよびウラシルを含まない）を使用して選択した。ＡＲＯ４ＧＳＷ（グリセロールストック１００μＬ）を使用して、２％グルコースを含む標準ＳＣＭ培地に接種した。この生物を３０℃で５．０時間生育させ、細胞を遠心して、２％グルコースを含むが芳香族アミノ酸は含まないＳＣＭ培地に再懸濁して、一晩生育させた。次いで、この細胞を遠心して、以下の培地、ａ）フェニルアラニンおよびチロシン約４００μｍを含む標準ＳＣＭ培地、およびｂ）芳香族アミノ酸を含まないＳＣＭ培地に最終細胞密度１．０（ＯＤ₆₀₀ｎｍ）になるまで再懸濁した。この細胞を振盪機上（２５０ｒｐｍ、０℃）に維持して、ＨＰＬＣ分析用に試料（１．０ｍＬ）を２．０、４．０、６．０および１６時間後に採取した。結果を表１３に示す。
【０２１８】
【表２１】

【０２１９】
表１３に示されるように、組換え酵母ＡＲＯ４ＧＳＷ株は生育培地に芳香族アミノ酸を加えなくても、グルコースからＰＨＣＡを産生した。このデータからまた、生育培地に芳香族アミノ酸を添加すると芳香族アミノ酸無しの生育と比較してＰＨＣＡ産生濃度がほぼ２．５倍増加することが示される。これらの結果から、チトクロームＰ−４５０およびチトクロームＰ−４５０レダクターゼ無しでグルコースをＰＨＣＡに変換する変異ＰＡＬを含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの能力が強調される。
【０２２０】
実施例１４
芳香族アミノ酸飢餓中の変更ＰＡＬを含むＡＲＯ４ＧＳＷによるＰＨＣＡ産生に対するフェニルアラニンおよびチロシンの影響
この実施例では、芳香族アミノ酸飢餓中の変更ＰＡＬを含むＡＲＯ４ＧＳＷによるＰＨＣＡ産生に対するフェニルアラニンおよびチロシンの影響を調べる。
【０２２１】
ＡＲＯ４ＧＳＷのグリセロールストック試料（１００μＬを）２％グルコースを含む標準ＳＣＭ培地に接種した。収集前に細胞を振盪機上に３０℃で５．０時間維持した。ペレットを２％グルコースは含むが芳香族アミノ酸は含まないＳＣＭ培地に再懸濁して、振盪機上において３０℃で一晩生育させた。次に、この培養液を遠心して、以下の培地、ａ）標準ＳＣＭ培地、ｂ）芳香族アミノ酸を含まず、２％グルコースおよび１．０ｍＭフェニルアラニンを含むＳＣＭ培地、およびｃ）芳香族アミノ酸を含まず、２％グルコースおよび１．０ｍＭチロシンを含むＳＣＭ培地に最終細胞密度１．０ＯＤ_600nmになるまで再懸濁した。これらの培養物を振盪機（２５０ｒｐｍ、３０℃）に戻し、ＨＰＬＣ分析用に試料（１．０ｍＬ）を２．０、４．０、６．０および１６時間後に採取した。結果を表１４に示す。
【０２２２】
【表２２】

【０２２３】
表１４のデータでわかるように、細胞を芳香族アミノ酸飢餓にすると、あまりＰＨＣＡは産生されなかった。フェニルアラニンを添加しても産生するＰＨＣＡの濃度にあまり影響はなかった。しかし、チロシンを添加すると、ＰＨＣＡの著しい増加が生じた。したがって、この結果から本発明で開発した変更ＰＡＬ遺伝子を含む新規組換え株は、ＰＨＣＡ産生の基質としてチロシンを好むことが確認される。
【０２２４】
実施例１５
トウモロコシにおける変異ＰＡＬ／ＴＡＬの形質転換および発現とＰＨＣＡ産生
センス方向に変異ＰＡＬ／ＴＡＬ遺伝子（配列番号８）を含むキメラ遺伝子は、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって構築することができる。以下に説明するように、クローニング部位（ＮｃｏＩまたはＳｍａＩ）をオリゴヌクレオチドに取り込ませて、切断ベクターｐＭＬ１０３に挿入したとき適切なＤＮＡ断片方向をもたらすことができる。次いで、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、ＫＣｌ ５０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂ １．５ｍＭ、ｄＧＴＰ ２００ｍＭ、ｄＡＴＰ ２００ｍＭ、ｄＴＴＰ ２００ｍＭ、ｄＣＴＰ ２００ｍＭおよびＤＮＡポリメラーゼ ０．０２５単位に溶かした各オリゴヌクレオチド ０．４ｍＭおよび標的ＤＮＡ ０．３ｐＭから成る標準ＰＣＲ混合物１００μＬ量で増幅を実施する。反応はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（商標）で、９５℃１分、５５℃２分および７２℃３分を含む３０サイクルおよび最終サイクル後の７２℃７分の最終伸長を実施した。次いで、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｍａＩで切断して、０．７％低融点アガロースゲルで４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸塩、ｐＨ８．５、ＥＤＴＡ １ｍＭで分画した。適切なバンドをゲルから摘出し、６８℃で融解して、プラスミドｐＭＬ１０３の４．９ｋｂ ＮｃｏＩ−ＳｍａＩ断片と一緒にした。プラスミドｐＭＬ１０３をブタペスト条約に基づきＡＴＣＣに寄託し、受け入れ番号ＡＴＣＣ９７３６６を受け取った。ｐＭＬ１０３のＤＮＡ断片には、ｐＧｅｍ９Ｚｆ（＋）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、７１１３ Ｂｅｎｈａｒｔ Ｄｒ．、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）中のトウモロコシの２７ｋＤゼイン遺伝子の１．０５ｋｂ ＳａｌＩ−ＮｃｏＩプロモータ断片およびトウモロコシの１０ｋＤゼイン遺伝子３′末端の０．９６ｋｂＳｍａＩ−ＳａｌＩ断片が含まれる。ベクターおよび挿入ＤＮＡを本質的に前述のように（Ｍａｎｉａｔｉｓ）１５℃で一晩ライゲーションした。次いで連結したＤＮＡを使用してＥ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ Ｃｏｌｉ ＸＬ−１；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を形質転換した。細菌の形質転換体はプラスミドＤＮＡの制限酵素切断およびチェインターミネータ法（ＤＮＡ配列決定キット、Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用した限定ヌクレオチド配列分析によってスクリーニングした。得られたプラスミド構築物には、５′から３′末端に向かって、トウモロコシ２７ｋＤゼインプロモータ、変異ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素をコードするＤＮＡフラグメント、および１０ｋＤゼイン３′領域が含まれる。
【０２２５】
次にこのように構築したキメラ遺伝子を以下の手順によってトウモロコシ細胞に導入することができる。未熟なトウモロコシ胚を近交系Ｈ９９とＬＨ１３２の雑種（Ｉｎｄｉａｎａ Ａｇｒｉｃ．Ｅｘｐ．Ｓｔａｔｉｏｎ、ＩＮ、ＵＳＡ）から得た発生穎果から切断することができる。この胚は受粉後１０から１１日経て１．０から１．５ｍｍの長さになったとき切除する。次いで、この胚を胚軸が下面になるように置いて、アガロース固形化Ｎ６培地と接触させる（Ｃｈｕ他、Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．Ｐｅｋｉｎｇ １８：６５９〜６６８（１９７５））。この胚を２７℃の暗所に維持した。胚柄構造に支えられた体性前胚様体および胚様体の未分化細胞集団から成る破砕されやすい胚発生カルスが、これらの未熟な胚の胚盤から増殖する。最初の外植片から単離された胚発生カルスは、Ｎ６培地で培養して、２〜３週間毎にこの培地で継体培養することができる。（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｅｃｋｅｓ、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ａｇ、ｖ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手した）プラスミド、ｐ３５Ｓ／Ａｃを選択可能なマーカーを提供するための形質転換実験で使用することができる。このプラスミドにはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするＰａｔ遺伝子（欧州特許第０２４２２３６号参照）が含まれる。酵素ＰＡＴはホスフィノトリシンなど除草剤グルタミン合成酵素阻害剤に対する耐性をもたらす。ｐ３５Ｓ／Ａｃのｐａｔ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０〜８１２（１９８５））およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ由来のノパリン合成酵素遺伝子３Ｍ領域に制御下にある。パーティクルガン法（Ｋｌｅｉｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０〜７３（１９８７））を使用して、カルス培養細胞に遺伝子を導入した。この方法に従って、金粒子（直径１μｍ）に以下の技法を使用してＤＮＡをコーティングした。プラスミドＤＮＡ１０μｇを金粒子の懸濁液５０μＬに添加する（１ｍＬ当たり６０ｍｇ）。塩化カルシウム（２．５Ｍ溶液５０μＬ）およびスペルミジン遊離塩基（１．０Ｍ溶液２０μＬ）をこの粒子に添加する。この溶液を添加する間、懸濁液を激しく攪拌する。１０分後、試験管を一時的に遠心して（１５０００ｒｐｍで５秒）、上清を除去した。この粒子を無水エタノール２００μＬに懸濁して、再度遠心して上清を除去する。エタノール洗浄を再度実施して、この粒子をエタノール最終量３０μＬに懸濁する。ＤＮＡコーティング金粒子の一定量（５μＬ）をフライングディスク（Ｂｉｏ−Ｒａｄｓ、８６１ Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｄｒ、Ｍｅｄｉｎａ、ＯＨ）の中央に置くことが可能である。次いで、この粒子をトウモロコシ細胞にＰＤＳ−１０００／Ｈｅを使用して（Ｂｉｏ−Ｒａｄｓ Ｌａｂｓ、８６１ Ｒｉｄｇｅｖｉｅｗ Ｄｒ、Ｍｅｄｉｎａ、ＯＨ）、ヘリウム圧１０００ｐｓｉ、ギャップ距離０．５ｃｍおよびフライング距離１．０ｃｍで加速する。
【０２２６】
パーティクルガンのために、胚組織をアガロース固形化Ｎ６培地上の濾紙に置く。この組織を薄い芝生のように整え、直径約５ｃｍの円形領域を被覆させる。この組織を含むペトリ皿をＰＤＳ−１０００／Ｈｅのチャンバー内のストッピングスクリーンから約８ｃｍのところに置く。次いで、チャンバー内の空気を、Ｈｇ２８インチの真空まで排気する。衝撃管のＨｅ圧が１０００ｐｓｉに達すると破裂するラプチャ膜を使用してマクロキャリアをヘリウム衝撃波で加速する。
【０２２７】
パーティクルガン後７日経て、組織をグルホシネート（１リットルあたり２ｍｇ）を含み、カゼインまたはプロリンを欠如したＮ６培地に移すことが可能である。さらに２週間後、この組織をグルホシネートを含む新鮮なＮ６培地に移すことが可能である。６週間後、グルホシネート補充培地を含むプレートのいくつかにカルスが活発に増殖する直径約１ｃｍの領域を確認することができる。これらのカルスは選択培地でサブクローニングしたとき、生育し続けることが可能である。組織集団をまず２，４−Ｄを１リットル当たり０．２ｍｇ補充したＮ６培地に移すことによって、遺伝子導入したカルスから植物を再度発生させることができる。２週間後、組織を再発生培地に移すことができる（Ｆｒｏｍｍ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：８３３〜８３９（１９９０））。
【０２２８】
ＰＨＣＡ産生濃度は、植物組織乾燥重量の約０．１％から約１０％の範囲であることが期待される。
【０２２９】
実施例１６
単一炭素源としてＬ−チロシンを使用した改善されたＴＡＬ酵素の選択
変異誘発したＴＡＬ遺伝子（配列番号８）を、本明細書に参考として援用したＫｏｋ他による記載のように（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：１６７５〜１６８０（１９９０））、自然な形質転換によってＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ染色体に導入する。ＴＡＬ遺伝子は構成的プロモータの制御下にあり、抗生物質耐性マーカー遺伝子の存在するベクターで宿主に挿入される。形質転換体は蒸留水１Ｌ（ｐＨ７．４）に溶かした寒天１５ｇ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ６ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ₄Ｃｌ １ｇ、Ｌ−チロシン ０．５ｇ、１Ｍ ＭｇＣｌ₂ ２ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ₂ ０．１ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ₂ ０．１ｍｌを含むＭ９塩培地（実施例４）で培養する。形質転換体を抗生物質耐性に基づいて単離する。Ｌ−チロシンからＰＨＣＡへの変換を改善した創出ＴＡＬ遺伝子を含む形質転換体は、Ｌ−チロシンを含む最小培地で良好な生育を示し、大きなコロニーを形成する。所望する濃度のＴＡＬ活性が実現するまでさらに創出を行うために、これらの大きなコロニーを回収する。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＢＲ２３３から得られ、ＰＡＬ発現ベクターＰＣＡ１８Ｋｍの構築のために使用されるベクターＰＶＡ１２Ｋｍのプラスミドマップである。
【図２】 変異ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素を含むベクターｐＥＴＡＬのプラスミドマップである。
【図３】 精製した変異ＰＡＬ酵素および変異ＰＡＬ酵素精製用出発物質として使用した細胞粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示した図である。
【図４】 酵母の変異ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素発現用に使用した発現ベクターｐＧＳＷ１８のプラスミドマップである。
【配列表】

Claims (8)

1. （ｉ）組換え宿主細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞は桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性を欠損し、適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする配列番号１０に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含んでいること、
   （ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記組換え細胞を生育させること、および
   （ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ桂皮酸を回収すること
   を含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸の生成方法。
2. 前記チロシンアンモニアリアーゼが触媒効率約４．１４×１０³Ｍ^-1ｓｅｃ^-1から約１×１０⁹Ｍ^-1ｓｅｃ^-1であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 桂皮酸ヒドロキシラーゼ活性を欠損し、適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする配列番号１０に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
4. 前記チロシンアンモニアリアーゼの触媒効率が４．１４×１０³Ｍ^-1ｓｅｃ^-1から約１×１０⁹Ｍ^-1ｓｅｃ^-1であることを特徴とする請求項３に記載の宿主細胞。
5. ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ４０７およびＰＴＡ４０９を有する細胞から成る群から選択された適切な調節配列に制御可能に結合したチロシンアンモニアリアーゼ活性をコードする配列番号１０に記載のポリペプチドをコードする遺伝子を含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
6. 配列番号１０に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするチロシンアンモニアリアーゼ遺伝子。
7. 配列番号１０に記載のポリペプチド。
8. （ｉ）組換え酵母細胞を発酵可能な炭素基質と接触させることであって、前記組換え細胞が、
   ａ）配列番号１１および配列番号１３に記載されている植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子、および
   ｂ）適切な調節配列と制御可能に結合したロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）由来のフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を含むこと、
   （ｉｉ）パラ−ヒドロキシ桂皮酸を産生するために十分な時間、前記組換え細胞を生育させること、および
   （ｉｉｉ）任意選択で前記パラ−ヒドロキシ桂皮酸を回収すること
   を含むことを特徴とするパラ−ヒドロキシ桂皮酸の生成方法。

Images