JPS63317086A - Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリア−ゼ発現用組換え体プラスミド及び該プラスミドを有する形質転換株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリアーゼ
（以後ＰＡＬと略称する）の大腸菌における効率良い発
現を可能とする組換え体プラスミド及び３組換え体プラ
スミドによって形質転換された大腸菌株に関する。

詳しくは、外来遺伝子の大腸菌での発現を可能とする発
現ベクターにＰＡＬ構造遺伝子を遺伝子操作技術により
挿入して新たなハイブリットプラスミド（組換え体プラ
スミド）を構築するに際し、構造遺伝子発現のためのプ
ロモーターに、大腸菌トリプトファンオペロンのプロモ
ーターと大腸菌ラクトースオペロンのプロモーターの融
合プロモーター（ｔａｃプロモーター）と；大腸菌ラム
ダファージのＰＬプロモーターとを特定順序で配列した
連結プロモーターを用いることによって、より効率良い
大腸菌でのＰＡＬの発現を可能としたハイブリッドプラ
スミド及びそれにより形質転換された大腸菌株に関する
。

〔従来の技術〕

ＰＡＬは、Ｌ−フェニルアラニンからアンモニアが除か
れてトランス桂皮酸を生じる反応を触媒する酵素であり
、この逆反応を利用し、桂皮酸とアンモニアからし一フ
ェニルアラニンを生産するのに有用である。

このＰＡＬの生産は、従来より酵母、カビおよび植物か
らの抽出により行なわれていたが、これらＰＡＬ生産能
を有する生物のＰＡＬ生産量は僅かであり、工業的規模
での生産には問題があった。

そこで、ＰＡＬの大量生産を実現するための方法として
、大量培養可能な大腸菌などの微生物等にＰＡＬを遺伝
４組換え技術を用いて生産させる方法が注目されている
。

このような観点から本発明者らは、ロドスポリジウム　
トルロイデス（肚犯則止肛違１四Ｌｏｒｕｌｏｉｄｅｓ
）のＰＡＬの構造遺伝子の構成を明らかとし、該構造遺
伝ｆ産物であるＰＡＬを大腸菌内で発現させることに成
功している。

一方、遺伝子組換え技術を用いた外来蛋白質（すなわち
宿り菌では通常生産されない蛋白質）を生産するために
用いる宿主菌としては、その生物学的特性の解析が十分
になされており、また病原性を持たず、簡単な組成の培
地で容易に培養可能であるという点から大腸菌が広く用
いられている。

所望の蛋白質を大腸菌で発現させるために用いる発現ベ
クターとしては、その下流に連結される所望の外来蛋白
質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列の大腸菌内
での転写を可能とするプロモーターと、大腸菌内で複製
可能であるベクターとを基本的構成要素としたものが用
いられる。

このような発現ベクターのプロモーターとしては柿々の
構成のものが知られており、例えば、プロモーターに、
大腸菌ラムダファージのＰＬプロモーター（以後ＰＬラ
ムダプロモーターと略称する）、大腸菌トリプトファン
オペロンのプロモーター（以下ｔｒｐプロモーターと略
称する）、大腸菌ラクトースオペロンのプロモーター（
以下Ｊ２ａｃブロモターと略称する）、及びＬｒｐプロ
モーターと、１２ａｃプロモータ、−との融合プロモー
ター（以下Ｌａｃプロモーターと略称する）等が広く用
いられている。

また、発現ベクターを用いて外来蛋白質を宿主大腸菌に
更により効率良く生産させるためには、より効率良い発
現を可能とする活性の高い新たなプロモーターの検索や
従来よりあるプロモーターの活性を向」ニさせるための
種々の検討が必要である。

例えば、より活性の高いプロモーターを得るために、Ｍ
ａｃｋｅｎｎｅｙ、に、らは複数のプロモーターの直列
での連結を試みており［Ｇｅｎｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎａｎｄ　　八ｎａｌｙｓｉｓ、ｖｏｌ　　Ｎ　
　、、ｐｐ３８：ｌ　　〜４１５．ＥｌｓｅｖｉｅｒＳ
ｃｉｅｎｃｅ出版、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９８１）
　］、、また］特開昭６０−１２６０８６公報には同様
の目的のためのｔｒｐプロモーターもしくはＩＬａｃＬ
ａ上−ターのに流にＰＬＬａ上−ターもしくはＰ、プロ
モーター（大腸菌ラムダファージのＰ、プロモーター）
１等を直列に連結した連結プロモーターが開示されてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

ところが、発現ベクターに組込むプロモーターと、発現
させようとする蛋白質との適合性については未だ十分に
解明されていない。そのため、例えば、ある種の蛋白質
の発現に対して高い活性を有するプロモーターが、他種
の蛋白質の発現に高い活性を示すかどうかを理論的に推
定することは非常に困難である。また、発現効率の同士
を目的とした連結プロモーターの作用についても不明の
点が多く、どのようなプロモーターをどのような順序で
連結するかは、発現させようとする蛋白質に応じて選択
する必要がある。

したがって、発現させようとする個々の蛋白質ごとによ
り効率良い発現を可能とするプロそ一ターの選定や開発
が必要である。

このような理由から、大腸菌でのＰＡＬの発現において
も、より好適なプロモーターの選定や開発か急務であっ
た。

しかも、例えば先に挙げたような従来より知られている
プロモーターを使用した場合、その発現効率は必ずしも
十分に高くなく、ＰＡＬの高発現に好適なプロモーター
の開発が更に必要とされていた。

本発明者らは、このような観点から先に述べたＰＡＬの
遺伝子操作による大腸菌での生産において好適な発現ベ
クターを開発する上で、ＰＡＬの発現と発現ベクターに
組込むプロモーターとの組合せについて着目し、更に連
結プロモーターを用いた場合の連結されるプロモーター
の配列とＰＡＬの発現の関係について種々検討した。そ
の結果、発現ベクターのプロモーターに、Ｌａｃプロモ
ーターと、　ＰＬＬａ上−ターとを特定された方向性と
順序をもって配列した連結プロモーターを用いることに
より、大腸菌でのＰＡＬの高効率での発現が実現できる
との結論が得られ、本発明が完成されるに至った。

本発明の目的は、遺伝ｆ操作による大腸菌でのＰＡＬ生
産において、大腸菌でのより効率良いＰＡＬの発現を可
能とする組換え体プラスミド及び該プラスミドによって
形質転換され、ＰＡＬの大量生産に好適である大腸菌株
を提供することにある。

（問題点を解決するためのｆ段〕 上記目的は以下の本発明によって達成することができる
。

すなわち本発明は、 ａ）大腸菌内で複製可能であるベクターと：ｂ）大腸菌
トリプトファンオペロンのプロモーターと大腸菌ラクト
ースオペロンのプロモーターの融合プロモーター（Ｌａ
ｃプロモーター）と、該融合プロモーター下流に連結さ
れた大腸菌ラムダファージのＰＬＬａ上−ターとを有す
る連結プロモーターと； Ｃ）該連結プロモーター上流に挿入されたＬ−フェニル
アラニン・アンモニアリアーゼをコートするＤＮＡ配列
とを有し、 Ｏｎ記連結プロモーターを構成する２つの一プロモータ
ーの方向性が同一であり、かつ面記ＰＬプロモーターが
前記ＤＮＡ配列の転写を特徴とする特許性をもって前記
ＤＮＡ配列の上流に配列されているものであることを特
徴とする組換え体プラスミド、および該プラスミドによ
って形質転換された大腸菌株である。

なお、本発明ていう「上流」、「下流」とは、ＰＡＬを
コードするＤＮＡ配列のＰＡＬの開始コドンから終了コ
ドンへ向う方向を基準として、ある部位からこの基準方
向と順方向に進んだ側を「下流」、逆方向に進んだ側を
「上流」と呼ぶ。

本発明のハイブリッドプラスミド（組換え体プラスミド
）に用いるベクターとしては、宿主大腸菌内で安定保持
され、かつ複製可能である、すなわち大腸菌内で行動に
機能できるプラスミド複製起点（複製オリジン）を有す
るＤＮＡ断片ならばどのようなものでも用いることがで
きる。

このベクターの複製起点としては、ｐＭＢ　Ｉ、ｐｓｃ
＋旧、Ｃｏ１Ｅ１およびｐ１５八等を用いることができ
、なかでもプラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点はｐ
ＭＢ　Ｉ由来のもので大腸菌中ではマルチコピーである
のでより好適である。

また、これらベクターは、宿−Ｌ菌に組換え体プラスミ
ドを導入した際の選択マーカーとなる遺伝子を含んでい
ると便利である。

このようなマーカー遺伝子としては、例えばプラスミド
ｐＢＲ３２２、ｐＫＣ７、ｐＭに１６　、９ＭＧ４１１
、ｐ八（：ＹＣｌ３４等に由来する大腸菌でアンピシリ
ン耐性を発現可能な各種遺伝子、テトラサイクリン耐性
、カナマイシン耐性などを発現可能な各種遺伝ｆおよび
ｌ　ａｃＺ遺伝子などが利用できる。

本発明のハイブリッドプラスミドに組込む連結プロモー
ターは、ｔａｃプロモーター（ｔｒｐプロモーターとｌ
ａｃプロモーターとの融合プロモーター）と、該融合プ
ロモーターＦ流に連結された大腸菌ラムダファージのＰ
Ｌプロモーターとを打して構成される。

この連結プロモーターに用いる　ｔａｃプロモーターは
、Ｅ、Ａｍａｎｎらにより報告された方法［Ｇｅｎｅ、
２５．１６７−１７８．（＋９８３）］により、ｔｒｐ
プロモーターとｊ２ａｃプロモーターより構築すること
ができる。また、例えばＪ、１ｌｉｒｏｓｉｕｓらによ
って構築されたベクターｐＨに２３３−３　（ファルマ
シア社製）なとのような、ｔａｃプロモーターを有する
適当なベクターから切出して用いてもよい。

なお、この　ｔａｃプロモーターはＳＤ（シャインーダ
ルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ）　］配列を含
むことが好ましい。

ＰＬラムダプロモーターとしては、例えば大腸菌ラムダ
ファージＤＮＡの１ｌｉｎｄ　ｍ　−ＢａｍＨＩ断片に
含まれているものなどが利用でき、該ラムダ７７−シＩ
ＩＮ八から制限酵素１１ｉｎｄ　ｍ及びＢａｍＨＩを用
いて直接切出して、あるいはこのような断片を含む例え
ばＳｈｉｍａｔａｋｅらの方法［Ｎａｔｕｒｅ、２９２
゜１２８、（１９８＋）］で］配しているような適当な
プラスミドから切出して用いることができる。

これら連結プロモーターを構成する各プロモーターは、
ハイブリッドプラスミドに組み込まれる際に、航述した
ように、同一・の方向性で配列される。

なお、この「同一の方向性」とは、プロモーターに特徴
的なＲＮＡポリメラーゼ認識部位とＲＮＡポリメラーゼ
結合部位の配列方向が、　ｔａｃプロモーターと　ＰＬ
ラムダプロモーターとで同一であることを言う。

更に、連結プロモーターのｔａｃプロモーター下流に配
置されるＰＬラムダプロモーターは、その下流側に位置
するＤＮＡ配列を転写させるのに必要な活性を有する方
向、すなわちＰＬラムダプロモーターのＲＮＡポリメラ
ーゼ結合部位がＲＮＡポリメラーゼ認識部位の下流に位
置する方向性をもって配列され、　ＰＬプロモーターの
ＳＤ配列を含む。

本発明の組換え体プラスミドにおいて、ト記構成の連結
プロモーターの下流側に組込むＰＡＬをコードするＤＮ
Ａ配列としては、例えば、本発明者らによってロドスポ
リジウム属に属する酵ｇ）から以下に示す実施例に記載
の方法に従ってクローン化されたＰＡＬ構造遺伝子を含
むＤＮＡ配列（開始コドンおよび終了コドンを含む）な
どが利用でき、またＰＡＬ生産能を有する各種植物、動
物、微生物等からクローン化したものの利用も可能であ
る。

本発明のハイブリッドプラスミトにおいて、ＰＡＬをコ
ードするＤＮＡ配列の下流に位置するように組み込むｍ
ＲＮＡのターミネータ−としては。

大腸菌内で有効に機能するものであればどのようなもの
でも利用できるが、ｒｒｎＢ、　ＬｒｐＡ等の強力な活
性を示すターミネータ−を用いるのが、先に述べた連結
プロモーターの活性とのバランスを取るトで望ましい。

本発明の組換え体プラスミドは上記のような各構成材料
を、先に述べたような所定の配列で遺伝１組換え技術を
用いて連結して得ることができる。

各構成材料を連結する方法としては、例えば、後述する
実施例に示された本発明者による方法が有用である。

なお、このようにして構築された組換え体プラスミドに
おいては、先に述べたマーカーとなる遺伝子と複製開始
起点は、ＰＡＬをコードするＤＮＡ配列の下流に接続さ
せたターミネータ−の下流に、マーカーとなる遺伝子、
複製開始起点の順に、それぞれがト流から下流方向へ有
効に機能する方向性を持って史に連結されているのが好
ましい。

以トのような構成を有する本発明の組換え体プラスミド
を宿主大腸菌に導入することによって、該宿主大腸菌で
のより効率の高いＰＡＬ発現が０１能となる。

以下に本発明について、フェニルアラニン・アンモニア
リアーゼ（ＰＡＬ）での例を参考例、実施例および比較
例により示す。

（参考例） 以下、参考例としてＰＡＬ構造遺伝子のクローニングの
一例を挙げる。

参考例 １、ｍＲＮＡ　　ＰＡＬ　　の、　および　１０ドスボ
リジウム・トルロイデス班肛並肚五此ｄｉｕａ＋　　ｔ
ｏｒｕｌｏｉｄｅｓ　ＩＦＯ５５９、この菌はＡＴＣＣ
１０７８８としても収載されている。）を２％グルコー
スを含む合成培地（表１）で、２７℃で通気撹拌培養を
行い、培養初期に添加したグルコースを全て消費した直
後に、菌体を遠心分離して集菌し、湿菌体を滅菌した０
、８５％食塩水で洗浄後再度遠心分離を行い、湯洗浄菌
体を得た。

表！ グルコース２０ｇ　／　Ｑ　　ビオチン２μｇ／Ｉｔ（
Ｎ１１　、）　２Ｓｏ、　　　３　　ノｌ　　パントテ
ン酸カルシウム　　４００〃Ｋ１１２ＰＯ，ｓ　　　　
　　ｌ　　／／　　　イノシトール　　　　　　２００
０　　　ｔｔＭｇＳＯ７＋１　、０　　０．５　／／　
　　ナイアシン　　　　　　　　４００〃Ｎａ１ｌ　　
　　　　　Ｏ，１ツノ　　パラアミノ安息容管　　　　
２００〃Ｃａに１７　　　　　０．１　／／　　　ピリ
ドキシン−１１ｃＩ塩　　　４００〃リボフラビン　　
　　　　　２００〃 サイアミン−１１ｃＩ　　塩　　　　４００〃該湿洗浄
菌体は直ちにＰＡＬ誘導培地［２％Ｌ−Ｐｈｅを含む０
６１７％Ｙｅａｓｔ　Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ　　
（Ｄｉｆｃ。

社製、無硫安および無アミノ酸タイプ）］に菌体濃度０
．５〜０．８％になるように懸濁し、２７℃にて震盪撹
拌を行いＰＡＬを誘導した。

無処理の菌体及び２時間誘導処理を行った菌体はＰＡＬ
誘導培地からそれぞれ遠心分離で回収し、得られた湿菌
体は等晴の滅菌水に懸濁後、該懸濁液を液体窒素中に滴
下して凍結菌体とした。

凍結菌体１０ｇを液体窒素中で乳鉢で粉砕を行い、５０
ｍ１（７）５％＋７）　ｓｏｓを添加したＭ？＃液Ｃ（
０，ＩＭＮａ、　ＩＩＰＯ、（ｐＨ７，４）　、０．１
５Ｍ食塩、１％デオキシコール酸ナトリウム、１％Ｔｒ
ｉＬｏｎＸ−１００）を加え、緩やかに３０分間撹拌し
た。

３０分後、５０１のフェノール・クロロホルム混液（フ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合容
！■比２５　：　２４　：　ｌ）５０ｍｌを加え、１５
分間撹拌混合した。

、該混合液を遠心分離し水層を回収し、この水層に新た
に５０ｍ１のフェノール・クロロホルム混液を加え、１
５分間撹拌後遠心分離し、更に水層を回収して再びフェ
ノール・クロロホルム混液抽出操作を２回繰り返した。

最後に得られた水層に食塩を終濃度０．２Ｍになるよう
に滅菌した５Ｍ食塩水を加え、さらに２．５容の冷エタ
ノールを加え、−２０℃以下に保存して核酸成分を沈澱
させた。

この沈澱物を遠心分離により回収し、冷エタノールで洗
浄しその後、減圧乾燥を行なった。

該乾燥物をｌ０ｍ１の滅菌水に溶解し、６５℃、５分間
加熱処理を行い、オリゴｄ　（Ｔ）セルロースを用いた
ｍＲＮへの公知のマニアティス法［Ｍａｎｉａｔｉｓ、
Ｔ、ｅｔａｌ、、　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ　”　（１９８２）］に準じてｍＲＮＡを１１ｉ、
Ｍｉシた。

得られたＩＩＩＲＮ＾をサンプル緩衝液（５Ｍ尿素、１
ｍＭ　ＥＤＴ＾、　０．０５％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ
ｂｌｕｅ）に溶解後、６５℃、２分間加熱処理を行いＲ
ＮＡの高次構造を変性させた後、８Ｍ尿素ニアクリルア
ミドスラブゲル（アクリル濃度３％、８Ｍ尿素存在）を
用いて泳動用緩衝液（８９ｍＭ　Ｔｒｉｓ、８９ｍＭホ
ウ酸、２ｍＭ　ＥＤＴ＾）中で、＋００ボルト１．５時
間電気泳動に供した。

泳動後、アクリルアミドゲルをエチジウムブロマイド処
理し、紫外線ドでｍＲＮへのバンドを発色させてｍＲＮ
Ａの大きさで２．０〜：）、Ｏｋｂの範囲を長さで三等
分に分割し、スラブゲルから各ゲル断片を切り出した。

各ゲル断片を透析チューブに封入し、泳動用緩衝液に沈
め、ｍＲＮＡをゲルから電気的に溶出した。

透析チューブ内液にフェノール・クロロホルム混液を加
え抽出操作を２回縁り返し、残フェノールをエーテル抽
出後、水層の１７１Ｏ容の３Ｍ酢酸ナトリウム水溶液（
ｐＨ５，２）を加え、さらに２．５容の冷エタノールを
添加して一２０℃に保存し、ｍＲＮＡを沈澱させた。

ト記で得られたｍＲＮＡがＰＡＬｍＲＮＡを含有するも
のであることを確認するために、各ｍＲＮＡ画分から蛋
白質に翻訳させ、産生蛋白質をＰＡＬ特異抗体を用いて
同定する方法を行なった。

すなわち、各分画ｍＲＮＡはウサギの網状赤血球溶解物
を用いた無細胞系の翻訳キットに供した［（Ｐｅｌｈａ
ｍ、１１．ｌ（、ｅｔ　ａｌ、、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、６７゜２４７−２５６．　（＋
９７６）　］。

ウサギの網状赤血球アッセイ用キットはＰｒｏｍｃｇａ
　Ｂｉｏｔｅｃ社のものを用い、標識アミノ酸としては
３ｓＳ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いた。

ウサギの網状赤血球ｉｎ　　ｖｉＬｒｏ翻訳システムで
翻訳された蛋白質を確認するために、翻訳反応液に緩衝
液Ｃを加えて溶解し、不溶物を遠心分離で除き、ト清に
自製のウサギの抗ＰＡＬ１ｇＧを加えて、氷トで３０分
間反応させ、反応液に羊の抗ウサギＩｇＧ　　（自製）
を加えて、氷りで３０分間反応させ、ウサギ抗体と沈澱
させた。

沈澱物を遠心分離して回収し、緩衝液Ｃで２回洗浄を行
い、該沈澱物を２％ＳＤＳ　、１０％β−メルカプトエ
タノール混液とＯ，１Ｍ　Ｔｒｉｓ−リン酸（ｐｌ＋６
．８）、１％ＳＯ５、５０％グリセリン混液とを３＝１
の８計で混合した溶液に溶解し、９５℃、２分間処理を
行い、蛋白質のジスルフィド結合と切断し、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドスラブゲル電気泳動（アクリルアミド
濃度１０％）をレムリの方法［Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２２７，６８０−６８５．（１９７０）　］に
準して行い、泳動後のゲルを乾燥後、オートラジオグラ
フィーによりＰＡＬの同定を行った。

２、　ＰＡＬｍＲＮへの一、　　３　ｃＤＡＮ　ｄｓ−
ｃＤＮＡ　への亦ＰＡＬ誘導処理２時間後の細胞から得
たｍＲＮＡをＦ記の方法で錆製し、得られたｍＲＮＡを
、Ａｗｖ逆転写酵素を作用させて、−末鎖ＣＤへＮ分子
に変換した　［Ｇｕｇｇｅｒ、Ｕ、、ｅｔ　　ａｌ、、
Ｇｅｎｅ、２５．２６３−２６９．（１９８３）］。

該　末鎖ｃＤＮ＾−＋１ＲＮＡ　Ａイブリットに、ＲＮ
ａｓｅｌｌ、ＯＮ八へリメラーゼエおよびリガーゼを作
用させて、ｍＲＮＡをとりのぞき二本鎖ｃＤＮＡ（ｄ、
−ｃＤＮＡ）を構築した。

３．３°　ＵにオリゴｄＣ尾を　するｄｓ−ｃＤＮＡの
呆 ト記第２項で得られたｄｓ−ｃＤＮＡに末端デオキシヌ
クレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を作用させ
てｄｓ−ｃＤＮＡの３°末端にオリゴｄＣを付加させた
。

即ち、３　μｇ　ｄｓ−ｃＤＮＡをＴｄＴ緩衝液（Ｉ０
０ｍＭカコジル酸カリウム（ｐ）Ｉ　７．２）　、２ｍ
Ｍ塩化コバルト、０．２ｍＭジチオスレイトール〕と０
．２ｍＭ　ｄ（：ＴＰを含む反応液に溶解し、３７℃５
分間前処理を行い、次いで５０東位のＴｄＴを加え、３
７℃１５分間反応を進行させ、その後ＥＣＴ八か終濃度
４０ｍＭになるように加え、氷トに置き、フェノール・
クロロホルム混液を加えて、ＴｄＴを変性失活させ、変
性不溶化蛋白質を遠心除去し、ト清をフェノール抽出、
冷エタノール沈澱操作後、該沈澱物を７０％エタノール
で洗浄後減圧乾燥を行い、３°末端にオリゴｄＣ付加ｄ
ｓ　−ｃＤＮＡを得た。

４、ハイブリットプラスミドの構築 ［ｐＵｃ９　（オリゴｄｃ尾を有する）分子−とｄｓ−
ｃＤＮＡ（オリゴｄｃ尾を有する）分子との結合］上記
第３項で得られたオリゴｄｃ付加ｄｓ−ｃＤＮへとプラ
スミドｐＵｃ９　［オリゴｄＧ尾付加。Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社（スウェーデン）より容易に人手可能１分子とを
ｄＣ−ｄＧホモポリマー法として公知の方法であるマニ
アティス法に準する方法て結合させた。

５、び′転　およびクローンの巽） 上記４．でｊｉ？られたハイブリットプラスミド（オリ
ゴｄＧ付加ｐｕｃ９分子−とオリゴｄＣ付加ｄｓ−ｃＤ
Ｎ＾分子−とからなる）をＣａＣｌ２処理した大腸菌に
コンピテント法て導入した。

約４万個の形質転換体のコロニーを１７だ後、前記の第
２項においてＰＡＬｍＲＮＡから　一本３ｊｌｃＤＮＡ
を合成するに際して、反応液中のｄｃＴＰのかわりにα
−”Ｐ−ｄｃＴＰを用いて、３２．で標識した一末鎖ｃ
ＤＮＡをプローブとして、グルンステインらの方法［Ｇ
ｒｕｎｓｔ。

ｅｉｎ、Ｍ、　　ｃｌ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ
ｔｌ、　　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ、。

７２、３９６１（１９７＋）］に準じたコロニーハイブ
リダイゼイション法で、細胞の選択を行った。

その結果、陽性のコロニーの中から、プラスミドを抽出
して精製し、更に各種の制限酵素で切断し、アガロース
ケル電気泳動によってＤＮＡ断片の大きさを調べた。

６、完全なＰＡＬ　′告′　云−を　「するｄｓｌ’−
ｃＤＮ八Δへ】 上記第５項で得られた形質転換体からプラスミドｐｓｌ
１２およびｐｓＷｌｌを得た。

つまりＰＡＬｍＲＮＡの完全なｃＤＮＡは、ｐｓＷ２お
よびｐｓＷｌｌを組み合わせることにより構築可能なこ
とが明らかとなったので、それぞれを含有する形質転換
細胞からプラスミドを抽出、蹟製し、制限酵素Ｂａｎ　
ｍで切断後、ｐｓＷ２においては、制限酵素ｌｌ１ｎｄ
ＩＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動による分画を
行ない、４．２ｋｂの大きさのＤＮＡ断片を回収し、フ
ェノール・クロロホルム混液処理及び冷エタノール沈澱
操作をそれぞれ数回縁返して該ＤＮＡ断片を精製した。

一方、ｐｓＷｌｌは制限酵素Ｂａｎ　ＩＩ＋および旧ｎ
ｄＩＩＩで切断後、電気泳動により０．９ｋｂのＤＮＡ
断片を回収し精製した。

Ｌ２ｋｂおよび０．９ｋｂのおのおのＤＮＡ断片をリガ
ーゼにより環状にし、該生成物で大腸菌を形質転換した
。

マーカーとしたアンピシリン耐性の転換体からプラスミ
ドを抽出し、各種の制限酵素を作用させて切断地図を作
成し、第１図に示した制限酵素切断地図の構造を有する
正しいＰＡＬ構造のｐｓＷ１３を選択した。

７、クローンヒＤＮＡの塩基　１の　。

上記のプラスミドｐｓｗｔ３を含むクローンからプラス
ミドｐｓｌｌｌ：］を単離し、そのクローン化ＤＮＡ断
片を神々の一１限酵素で分解し、適当な制限酵素断片に
ついて、それぞれＤＮＡのヌクレオチド配列分析をマク
サム−ギルバート法（化学分解法）により、またマート
法［Ｍａａｔ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　５．４５３７−４５４
５．　　（１９７８）］によるＤｉｄｅｏｘｙ法により
生化学的に行った。得られたそれぞれのＤＮＡ断片の塩
基配列の結果を三片情報開発■製のＧＥＮＡＳプログラ
ムによりＤＮＡ　ｋ４集を行ない、その塩基配列は第２
図（Ａ）〜（Ｃ）に示すとおりであった。

なお、この塩基配列の２１５１ｂｐまでが開始コドンお
よび終ｒコドンを含むＰＡＬ構造遺伝ｒ−であった。

８．５Ｗ１０１の　築　γ′Ｓ３〆１　昭プラスミドｐ
Ｕｃｌ：１　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）０．９μｇに
１０　ｊ）ｊ、位の制限酵素Ｓａｌ　Ｉを１４Ｊの反応
液［７ｍＭＴｒｉｓ−１１ＣＩ　（ｐＨ７，５）、　０
．７ｍＭ　　ＥＤＴ八、７ｍＭ　　ＭｇＣｌ　　７　　
、　１７５ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ　２−メルカプトエ
タノール、０．０１％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ
と略す）］中で、３７℃１６時間作用させ、フェノール
・クロロホルム混液処理、エタノール沈澱操作を行い、
開環線状ＤＮＡを得た。

註線状ＤＮＡをニック・トランスレーション緩衝液［５
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩｃＩ（ｐＨ７，５）　、　　ｌ
ｏｍＭ　ＭｇＣ１７，０，１ｍＭジチオスレイトール、
２％０Ｓ＾、ａｏμｘｄＡＴＰ、８０μＭ　ｄＧＴＰ、
８０μＭ　ｄＴＴＰ、８０μＭ　ｄｃＴＰ］の存在ドで
、ＤＮＡポリメラーゼクレノフ断片（宝酒造■製）を室
温で３０分間作用させ、粘着末端を上滑末端にした後、
フェノールで除蛋白を行い、冷エタノールでＤＮＡを沈
澱回収した。このＤＮＡ断片にｒ牛牌臓由来リン酸ジェ
ステラーゼ（ＣＩＰ：ベーリンガ社製）を作用させ、５
°末端のリン酸基を除去し、線状ｐｕｃ＋３の自己閉環
を防いだ。

一方ｐｓｌｌ＋：］を含有する細胞から、このプラスミ
ドを抽出し精製し、制限酵素Ｄｒａｌを反応液Ａ（４ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＩＩｃＩ（ｐＨ７，５）、０．４ｍＭ　ｌ
ミＤＴ＾、５０ｍＭ　ＮａＣ１）中３７℃で２８時間作
用させ、ついで食塩液を加えて食塩濃度を１００ｍＭと
し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびｌ１ｉｎｄＩＩＩを３７
℃で１６時間作用させた。

反応路γ、反応液をアカロースケル電気泳動に供し、２
．３ｋｂの大きさのＤＮＡ断片をゲル中がら回収し、フ
ェノール抽出、フェノール・クロロボルム混液処理、冷
エタノール沈澱をそれぞれ３回繰返した後にＰＡＬｃＤ
ＮＡ断片を得た。

該ｃＤＮ＾ＤＮＡ断片１述のニック・トランスレーショ
ン緩衝液を加え、ＤＮＡポリメラーゼクレノフ断片を室
温で４５分間作用させ、フェノール・クロロポルム混液
処理、冷エタノール沈澱操作をそれぞれ３回繰返し、平
滑末端を両端に有するｃＤＮＡ断片を得た。

平滑末端を有するｐｌＬｃ１３断片と平滑末端を有する
ｃＤＮ＾ＤＮＡ断片ガーゼで結合し、環状プラスミドｐ
ｓｌｌ１０１を構築した。

このハイブリッドプラスミドＤＮＡで大腸菌を公知の方
法で形質転換し、アンピシリン耐性コロニーから細胞（
ＭＴ−１０４１０、ＦＥＲＭ　Ｐ−８８３４）を選び出
し、ＰＡＬ活性を測定した。

９、Ｙｔｒ　６の　築　び形１転 上記第８項に記載した方法で構築したｐｓＷＩ旧をＰｓ
ｔｌ及びＢａｍ１ｌｌで消化し、アガロースゲル電気泳
動後、３７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し、それを２分割
し、それぞれＢａｎ１およびＢｂｅ　ｒで消化した。

消化後アクリルアミドゲル電気泳動により、Ｂａｎ１消
化のものからは７０ｂｐの大きさの断片を回収し、Ｂｂ
ｅｌ消化のものからは２８０ｂｐの大きさのＤＮＡ片を
回収した。

７０ｂｐの断片はＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にして
、これにＣ１ａｒ（ＩｌａｎＩＩＩ　）　　リンカ−を
リガーゼで結合せさた。

こうして得られたＣ１ａｌリンカ−を両端に結合したＤ
ＮＡ断片を耽ｎＩＩ［及びＢｂｅ　ｌで消化し、先に調
製したＢｂｅ　Ｉ断片（２８０ｂｐ）およびｐ［ｌＲ：
１２２をＲａｎ　ＩｌｌおよびＢａｍ１ｌｌで消化して
、アガロースゲル電気泳動により４　、ＯｋｂのＤＮＡ
断片を回収したものとをリガーゼで結合し、ｐｓＹＡＩ
を得、これで大腸菌を公知のカルシウム法で形質転換し
た。

上記第６項で構築したｐｓＷＩ：ｌをＸｂａ　Ｉで消化
し、粘着末端をＤＮＡポリメラーゼで埋めて上滑末端と
し、ｌ１ｉｎｄＩＩＩリンカ−をリガーゼで結合して、
ｐｓＷｌ：Ｉｌｌを構築し、これで大腸菌を公知の方法
で形質転換した。

ｐｓＹＡＩを含む大腸菌から公知の方法でｐｓＹＡＩを
抽出し、Ｂａｍ１ｌｌおよびＢａｎ　［１で消化し、３
５０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。

ｐｓＷ１３１１を含む大腸菌から公知の方法でｐｓＷＩ
：Ｉｌｌを抽出し、抽出したｐｓＷＩ３１１をＢａｍ１
ｌｌおよび１ＩｉｎｄｌＩＩで消化し、アガロースゲル
電気泳動により１．Ｏｋｂの大きさのＤＮＡ断片を回収
した。

次に、大腸菌のｔｒｐオペロンの一部を含有するプラス
ミドｐＶＶｌ　［口ｒｉａｎ　Ｐ、Ｎ１ｃｏｌｓ　＆　
ＣｈａｒｌｅｓＹａｎｏｒｓｋｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　ＥｎｚｙＬＩＩｏｌｏ）＜ｙ、封す、　１５５；（
＋９８３）］に制限酵素１１ｉｎｆＩを作用させて−、
プラスミドｐＶＶｌを消化した。

１該消化プラスミド　ＤＮＡ断片をアカロースゲル電気
味動で分離し０．９ｋｂの大きさのＤＮＡ断片をケルか
ら先に述べた方法て回収した。

０．９ｋｂのＤＮＡ断片のｌ１ｉｎｆｌで生じた粘着末
端を先の第８項に記載した方法でＳＰ−滑末端とした後
、ｌ：ｃｏＲＩリンカ−（ＧＧ八へへｒＴＣ（：）をリ
ガーゼて平滑末端の５′末端に結合した。

Ｆ、ｃＯＲＩリンカ−結合ＤＮＡ断片に制限酵素ｌミｃ
ｏＲＩを作用させ、ＥｃｏＲＩ切断粘着末端付加ＤＭＡ
断片を創製した［Ｂｒ１ａｎ　Ｐ、Ｎ１ｃｏｌｓ　＆　
Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｙａｎｏｆｓｋｙ。

ＭｅＬｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１
　、１５５．（＋９８３）］。

、？Ａ　Ｆ、ｃｏＲＩ粘着末端付加ＤＮＡ断片とｐＨ１
１３２２のＥｃｏＲＩ消化物を前記第８項に記載の方法
でＣＩＰ処理を行なったものをリガーゼにより結合し、
註結合生成物を；し１限酵素ＩＸｃｏｌ（ＩおよびＢｇ
ｌ■で消化し、消化生成物をアガロースケル電気泳動で
分離して、０．４ｋｂの大　きさをもつＤＮＡ断片を回
収した。

該ＤＮＡ断片には制限酵素ＴａｑＩの切断箇所が３箇所
含まれるが、該ＤＮＡ断片をＴａｑ　Ｉで部分的に消化
して：１４５ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。

、；亥３４５ｂｐ　ＤＮＡ断片をｐ　１１　Ｉｔ　３２
２を１ｉｃｏＲＩおよびＣ１ａ　Ｉで消化して１：？ら
れる４、３ｋｂのＤＮＡ断片と結合し、Ｌｒｐプロモー
ターを含有するプラスミドｐＦＬｐｒ２を得た。

このようにして構築されたｐＦｔｒｐ２をＢａｎ　ｍお
よびｌｌ１ｎｄ［Ｉで消化し、アガロースゲル電気体動
により４．７ｋｂの断片を回収し、この４．７ｋｂ断片
と先に得た３５０ｂｐの［ｌａｍｌｌｌ＋Ｂａｍ　ＩＩ
Ｉ断片および１．９ｋｂのＢａｍ旧＋１ＩｉｎｄＩ［＋
断片をリガーゼで閉環し、ｐＳＹ＾２を構築した。

ｐＳＹ＾２をＢａＩＩＩｍで部分消化して生じた粘着末
端をＤＮＡポリメラーゼを用いて埋めてＮＶ−滑末端と
してリガーゼで開環し、Ｎｒｕ　Ｉ切断点を打するｐＹ
Ｌｒｐ６を構築した。

このｐ　Ｙ　１．　ｒ　ｐ　６で大腸菌な公知の方法で
形質転換し、アンピシリン耐性のコロニーから細胞を選
び出し、ＰＡＬ活性を測定した。ｐＹＬｒｐ６の構築の
フローシートを第４図に、またその詳細を第３図〜第５
図に示す。ここで　られたＰＡＬ活性を示す大腸菌形質
転換株をＭＴ−１０４目（ＦＥＲＭ　Ｐ−８８７６）と
した。

（実施例） 以Ｆ本発明の実施例および比較例を示す。

なお、以下の実施例および比較例における各プラスミド
の構築過程の概略図を第８図に示す。

実施例１ ［プラスミドｐｓｗ＋＋ｓの構築］ （１）第９図に示した１程に従ったプラスミドｐＴａｃ
１１の構築 まず、参考例に記載の方法に従って得られたロドスボリ
ジウム・トルロイデスのＰＡＬ構造遺伝ｆかクローン化
されているプラスミドｐＹｔｒｐ　６を打する大腸菌Ｍ
Ｔ　１０４１４　（ＦＥＲＭＰ−８８７６）株より抽出
したプラスミドを制限酵素Ｎｒｕ　Ｉと旧ｎｄｌＩＩで
消化して得たＤＮＡ断片混合物から′屯気味動法によっ
て２．４　ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を分離回収した
。

これとは別に、　ｔａｃプロモーターを有するプラスミ
ドｐにに２２３−３　（ファルマシア社製）を制限酵素
ＥＣ（ＩＲＩで消化して、ＤＮＡ断片を得た後、これら
ＤＮＡ断片の粘着末端をＤＮＡポリメラーゼを用いて・
ト滑化した。

次に、このようにして得られた粘着末端を打するＤＮＡ
断片と、先に得た２、４　ｉ＜ｂｐの［ｌＮ八へ片とを
、リガーゼの存在−Ｆで反応させた後、得られた反応生
成物を大腸菌にＳ、Ｎ、Ｃｏｈｃｎらの方法によって導
入した。

続いて、この反応生成物が導入された大腸菌を、アンピ
シリンプレート［ＬＢ培地［バクトドリプトン（商品名
；　ＢａｃＬｏ−ＬｒｙｐｔｏｎＰ、　Ｄｉｆｃｏ社’
１）　ｌｏｇ　；ハクトイ−ストエキストラクト（Ｂａ
ｃＬ。

−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｌ■、Ｄ　ｉ　ｒ　ｃｏ社
製　）５ｇニゲルコース１ｇ：蒸留水１　ｇ、（Ｎａ０
１１でｐＨ７，５に調整）］にアンピシリンを５０μｚ
／ｍｌの濃度で添加した培地に寒天を　１．５ｔの濃度
で含有させたもの）で培養した。培養後、プレートＶに
出現したアンピシリン耐性の各コロニーのそれぞれから
個々にプラスミドを抽出し、各プラスミドの制限酵素地
図を作製して、［１的とする第９図に示したような構成
のプラスミドｐＴａｃｌｌを有するコロニーを同定し、
更に該コロニーからプラスミドｐＴａｃｌｌをｌｌ１ｌ
ｌ！ｉシた。

（２）第１Ｏ図のＬ程に従ったプラスミドｐＰＬ−ＰＡ
Ｌ−ｈｃａｄの構築 プラスミドｐＰＬ−λ（ファルマシア社製）を制限酵素
ＥｃｏＲＩと１ＩｐａＩて消化して、得られたＤＮＡ断
片混合物から電気泳動法により４７０　ｂｐのＤＮＡ断
片を分離回収した。この４７０　ｂｐのＤＮＡ断片を次
に制限酵素１１ｉｎｆＩで部分消化し、得られたＤＮＡ
断片混合物から電気泳動法により３７０　ｂｐのＤＮＡ
断片を分離回収した。

更に、この：］７０　ｂｐのＤＮＡ断片の末端をＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて平滑末端化してから、それをリガ
ーゼの存在ドでＣ１ａ　ニリンカー（宝酒造社製）と反
応させた。反応路ｒ後、得られた反応生成物を制限酵素
ＥｃｏＲＩと　Ｃ，Ｑａｌで消化して１ミｃｏＲＩ　−
ＣＱａ　Ｉ　　ＤＮＡ断片を含む混合物を得た。

これとは別に、先に示した参考例におけるロトスボリジ
ウム　トルロイデスの構造遺伝ｒのクローニング過程で
構築したプラスミドｐＳＹへ２を、制限酵素ＥｃｏＲＩ
で消化した後、得られたＤＮＡ断片を、更に制限酵素＋
４ａＩで部分消化し、得られた大小２種のＤＮＡ断片の
混合物から電気泳動法によって大ＤＮＡ断片を抽出分離
した。

次に、このようにして得られたプラスミドｐＳＹＡ　２
由来の大ＤＮＡ断片と、先に得たＥｃｏＲＩ　−（：ｆ
ｆ１ａ　Ｉ断片を含む混合物とをＴ４リガーゼの存在ド
で反応させ、得られた反応生成物を大腸菌に導入し、こ
れをアンピシリンプレートで培養した。アンピシリンプ
レート上に出現した各コロニーからプラスミドを調製し
、その制限酵素地図を作製して、目的とする第１Ｏ図に
示す構成のプラスミドｐＳＹＰＬ−３を有するコロニー
を同定し、該コロニーからプラスミドｐＳＹＰＬ−３を
ｍ離した。

更に、このようにして得られたプラスミドｐＳＹＰＬ−
３をＥｃｏＲＩとＢａｍ１ｌＩとで消化し、得られた大
小２種のＤＮＡ断片から電気泳動法によって小ＤＮＡ断
片を分離回収した。

次に、プラスミドｐＢＲ：１２２　（ファルマシア社製
）を制限酵ＪＥｃｏＲＩとＢａｍ１ｌＩとで消化し、得
られた大小２種のＤＮＡ断片から電気泳動法によって大
ＤＮＡ断片を分離回収した後、この大ＤＮＡ断片と先に
得たプラスミド９ＳＹＰ１．−：］由来の小断片とを、
リガーゼの存在下で反応させ、第１０図の構成やプラス
ミドｐｐＬ−ｐへＬ−ｈｅａｄを得た。なお、ここで目
的のプラスミドが得られたかどうかは、リガーゼを用い
た反応で生成された反応生成物を大腸菌に４人し、これ
をアンピシリンプレートで培養し、アンピシリンプレー
トＬに出現した各コロニーからプラスミドを調製し、そ
の制限酵素地図を作成することで確認した。

（３）第１２図に示した１程に従ったプラスミドｐＳＷ
１１５の構築 まず、前記（１）項で得たプラスミドｐＴａｃｌｌを制
限酵素ＥｃｏＲＩと＾ａｔＩで消化し、得られた大小２
種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法により大ＤＮＡ
断片を分離回収した。

次に、前記（２）項で得たプラスミドｐＰＬ−１１Ａ１
．。

−ｈｅａｄを制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔ、Ｉで消化し
、得られた大小２種のＤＮＡ断片混合物から′電気泳動
法により小ＤＮＡ断片を分離回収した。

最後に、このようにして得たプラスミドｐ’ｒａｃｌｌ
由末の大ＤＮＡ断片とプラスミドｐＰＬ−ＰＡＬ−ｈｅ
ａｄ由来の小ＤＮＡ断片とをＴ、リガーゼのＨ在ドで反
応させて結合させ、プラスミドｐｓＷｌ１５を得た。

なお、［１的とするプラスミドか得られたかどうかは、
得られたプラスミドを大腸菌に導入して、形質転換株を
アンピシリンプレートで選択し、アンピシリン耐性を有
する各形質転換株からプラスミドを調製して、そわらの
■１限酵素地図を作製するとともに、形質転換株のＰＡ
Ｌ活性を後述する方法によって測定して確認した。ここ
で得られたＰＡＬ活性を有する形１１転換大腸菌株をＭ
Ｔ−１０４２４１株（ＦＥＲＭ　Ｐ−９０２３）とした
。

（４）プラスミドｐｓＷＩＩ５によるＰＡＬの発現上記
（３）項で得たプラスミドｐｓｗｕｓが導入された形質
転換大腸菌を先にアンピシリンプレートの組成に用いた
Ｌ１１培地（ｐＨ７，５）にアンピシリンを５０μｐ、
／ｍｆｌの濃度で添加した培地に接種し、これを′３０
℃で振どう培養した。

２０時間の培養により６６０ｎｍでのＯＤが５．１０を
示す培養菌体濃度が１！−られたので、培養液から菌体
を遠心分離によって集め、得られた菌体のＰＡＬ活性を
以下の方法に従って測定し、乾燥菌体１「量あたりの比
活性を算出した。その結果を表２に示ＰＡＬ活性の測定
； 菌体を遠心分離によって培養液から集１″Ａし、集菌し
た菌体を０．８５％食塩水に懸濁してから１１４度遠心
分離にかけて洗浄した後、洗浄菌体を、２５ｍＭＴｒｉ
ｓ−１１ｃ、ｅ緩衝液（ｐｌ＋　８．８）に湿−Ｔｊ　
ｉｉ）で１％となるように懸濁させ、この懸濁液を、そ
の組成が２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩｃＲｇ樹液（ｐＨ１
８，８）　、　２５ｍＭ　　Ｌ−フェニリアラニン、０
．００５％セチルピリジウム塩酸塩となるようにした酵
素反応液中に加えて、これらを３０℃、２０分間反応さ
せた。　ｌＮ−１１ｃｆｉの添加で反応を終ｒさせ、反
応液中に生成した杆皮酸呈を、液体クロマトグラフィー
により分析してＰＡＬ活性をｄ！１定した。なお、ここ
でのＩＵ（ユニット）は１分間当りに　１マイクロモル
の桂皮酸を生成させる酵素晴に相当する。

なお、表２に示した乾燥閑体用星は、洗浄菌体を乾燥し
て測定した。

比較例１ ［第１１図及び第１２図に示した工程に従ったプラスミ
ドｐｓＷ１１６の構築とそれを用いた大腸菌でのＰＡＬ
の発現］ （１）プラスミドｐｓＷＩ０８の構築 まず、参考例におけるロドスポリジウム・トルロイデス
のＰＡＬ構造遺伝子のクローニング過程において構築さ
れたプラスミドｐｓｗ＋３を制限酵素１１ｉｎｄｌＩＩ
とＥｃｏＲＩで消化し、得られＤＮＡ断片混合物から電
気泳動法によって２．３　ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離回
収し、更にこのＤＮＡ断片の末端を、ＤＮＡポリメラー
セを用いて＋−渚末端化した。

これとは別に、プラスミドｐＰ＋、−λ（ファルマシア
社！！りを制限酵素１１ｐａＩで消化後、得られたＤＮ
Ａ断片に自己１１結合防市のためのＭａｎｉａＬｉｓら
の　ＣＩｌ＋処理［Ｔ、ＭａｎｉａＬｉｓら；　Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；ａ　１ａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ　ｍａｎｕａｌ、ｌ：１’！、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇｌｌａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（＋９８２）］を行なってから、こ
のＤＮＡ断ノ１と先に得たプラスミドｐｓＷｌ：Ｉから
の２．３　ｋｂｐのＤＮＡ断片をリガーセの存在Ｆで反
応させた。反応路ｒ　ｇ＆、反応物を大腸菌に導入し、
アンピシリンプレートで培養した。次に、プレートＬに
出現したアンピシリン耐性の各コロニーのそれぞれから
プラスミドを抽出し、各プラスミドの制限酵素地図を作
製して目的とする第１１図に示したような構成のプラス
ミドｐｓＶＩ＋ｏａを有するコロニーを同定し、更に該
コロニーからプラスミドｐｓＷＩ０８をｌｌ’１した。

（２）プラスミドｐＰＬ−［ＩＥ］の構築プラスミド１
）ＰＬ−λ（ファルマシア社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ
で消化して開環後、得られたＤＮＡ断片の末端をＤＮＡ
ポリメラーゼ処理によって゛Ｙ滑末端化したのち、更に
リカーゼを作用させて閉環してプラスミドＩ）ＰＬ　−
［Ｅ］を得た。

（３）プラスミドｐｓＷｌ１３の構築 まず、プラスミドｌ’ＰＬ−λ（ファルマシア社製）を
制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｐａＩで消化し、得られたＤＮ
Ａ断片混合物から電気泳動法によって、４７０ｂｐのＤ
ＮＡ断片を分離回収した。次に、得られた４７０　ｂｐ
のＤＮＡ断片を；開眼酵素１１ａｅ［で消化し、得られ
た反応生成物とＥｃｏＲＩリンカ−（宝酒造社製）とを
、　Ｔ４リガーゼでの存在ドで反応させた。次に、該反
応で得られた反応生成物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍ
１ｌＩで処理して、ＤＮＡ断片の混合物を得た。このよ
うにして得らたＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法によ
って２４０　ｂｐのＤＮＡ断片を分離回収した。

これとは別に、上記（１）項で得たプラスミドｐｓｌｌ
＋０８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｒｕ　Ｉとで消化し、
得られたＤＮＡ断片１ｄ合物から電気泳動法により、４
．１　ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離回収した。

史に、Ｌ記（２）項で得たプラスミドｐＰｔ、　−［ｈ
ｌを＋ｌ＋（Ｉ酵素素Ｂａｍ１ｌＩと　ＮｒｕＩとで消
化し、得られたＤＮＡ断片混合物から電気泳動法により
、３．４　　ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離回収した。

最後に、以トのようにして得られた３種のＤＮＡ断片を
、　■、リガーゼの存在ドで反応させて反応生成物を得
た後、該生成物を大腸菌に導入し、これをアンピシリン
プレートで培養した。次に、プレートＬに出現したアン
ピシリン耐性の各コロニーのそれぞれから個々に抽出し
たプラスミドの制限酵素地図を作製するとともに、各コ
ロニーの部を実施例１と同様にして培養してそのＰＡＬ
活性を測定し、Ｉ］的とする第１１図に示したような構
成のプラスミドｐｓＷＩＩ：ｌを有するコロニーを同定
し、史に、４亥コロニーがらプラスミドｐｓＷＩＩ：ｌ
をＩＮ−ｍした。

（４）プラスミドｐｓＷｌ１６の構築 まず、Ｌ記（３）項で得たプラスミドｐｓＷＩ＋３を制
限酵素ＥｃｏＲＩとＡａｔ、Ｉで消化し、１１？られた
大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法によって
大ＤＮＡ断片を分離回収した。

これとは別に、実施例１の（３）項で得たプラスミドｐ
ＰＬ−＋１什−ｈｅａｄを制限酵素ＥｃｏＲＩと八ａＬ
Ｉで消化し、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物か
ら電気泳動法によって小ＤＮＡ断片を分離回収した。

次に、こうして分離回収した２種のＤＮＡ断片をＴ４　
リガーゼの存在下で反応させて結合させ、第１２図に示
したようにプラスミドｐｓＷ１１６を得た。

なお、ここで目的とするプラスミドが得られたかどうか
は、実施例１と同様にして、得られたプラスミドの制限
酵素地図を作製するとともに、形質転換株のＰＡＬ活性
を測定することによって確認した。

（５）プラスミドｐｓＷ１＋６によるＰＡＬの発現［記
（４）項で得たプラスミドｐｓＷ１１６を用いる以外は
、実施例１の（４）と同様にして、大腸菌を形′ｉ１転
換してＰＡＬを発現させ、生産されたＰＡＬの比活性を
算出した。形質転換株の培養における最終培養菌体濃度
及び得られたＰＡＬ比活性の値を表２に示す。

比較例２ ［プラスミドｐｓＷＩＩ７の構築とそれを用いた大腸菌
でのＰＡＬの発現］ 比較例１の（３）項て得たプラスミドｐｓＷ１１：］を
、制限酵素ＥｃｏＲＩと八ａＬＩで消化し、得られた大
小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動法により大Ｄ
ＮＡ断片を分離回収した。

これとは別に、実施例１の（＋）項で用いたプラスミド
ｐＹＬｒｐ６を制限酵素ＥｃｏＲＩと八ａＬＩで消化し
、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気泳動
法により小ＤＮＡ断片を分離回収した。

次に、こうして分離回収した２種のＤＮＡ断片をＴ４リ
ガーゼの存在Ｆで反応させて結合させ、第１３図に示し
たようにプラスミド１）ＳＷ１１７を得た。

なお、ここで目的とするプラスミドが得られたかどうか
は、実施例１と同様にして、得られたプラスミドの制限
酵素地図の作製と、形質転換株のＰＡＬ活性の測定とに
よって確認した。

更に、このようにして得たプラスミドｐｓＷ１１７を用
いる以外は、実施例１の（４）と同様にして、大腸菌を
形質転換してＰＡＬを発現させ、生産されたＰＡＬの比
活性を算出した。形質転換株の培養における最終培養菌
体濃度及び得られたＰＡＬ比活性の値を表２に示す。

比較例３ ［プラスミドｐｓＷ１１８の構築とそれを用いた大腸菌
でのＰＡＬの発現］ 実施例１の（２）項で得たプラスミドｐｐＬ−ｐ＾１゜
−ｈｅａｄを、制限酵素ＥｃｏＲＩとＡａＬＩで消化し
、ＩＨ７られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物から電気
泳動法により小ＤＮＡ断片を分離回収した。

これとは別に、実施例１の（１）項で用いたプラスミド
ｐＹｔ、ｒｐ６を制限酵素ＥｃｏＲＩと　八ａｔＩで消
化し、得られた大小２種のＤＮＡ断片の混合物がら電気
泳動法により大ＤＮＡ断片を分離回収した。

次に、こうして分離回収した２種のＤＮＡ断片をＴ、リ
ガーゼの存在Ｆで反応させて結合させ、第１３図に示し
たようにプラスミドｐｓｗ＋＋ａを得た。

なお、ここで目的とするプラスミドが得られたかどうか
は、実施例１と同様に得られたプラスミドの；し１酵解
素地図の作製と、形質転換株のＰＡＬ活性の測定とによ
って確認した。

更に、このようにして得たプラスミドｐｓＷｌ１８を用
いる以外は、実施例１の（４）と同様にして、大腸菌を
形質転換してＰＡＬを発現させ、生産されたＰＡＬの比
活性を算出した。形質転換株の培養における最終培養菌
体濃度及び得られたＰＡＬ比活性の値を表２に示す。

なお、以上の実施例および比較例における組換え体プラ
スミドの大腸菌への導入は、Ｓ、Ｎ、（：ｏｈｅｎらの
方ン人　［Ｓ、Ｎ、Ｃｏｈｅｎ　　ら　；　　Ｐｒｏｃ
、　　Ｎａｔｌ、　　八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＩＩｓ八、肋、２１１０（＋９７２）］を用
イテ行ナツタ。

また、制限酵素、リガーゼ、Ｔ、リガーゼ、ＤＮＡポリ
メラーゼを用いたプラスミドやＤＮＡ断片の処理および
菌体からのプラスミドの調製は、特に指定されている場
合以外は通常用いられている方法によって行なった。更
に、宿り大腸菌としては、ＭＣｌ０６１株　［Δ　　（
ＩＬ　ａｃｌＰＯＺＹ八）Ｆ−、ａｒａＤｌ］９　　、
　Δ（ａｒａ　Ｑ　ｅｕ）　７６９７Ｘ　７４ｇａｌ　
Ｕ　ｇａｊ２に５ｔｒＡ］　　［Ｍ、Ｊ。

Ｃａ５ａｄａｂａｎ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１３８
　、１７９．（１９８０）］を用いた。なお、制限酵素
類、リガーゼ、　Ｔ、リガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼは
特に指定しない限り宝酒造社製を用いた。

〔発明の効果〕

本発明の大腸菌でのＰＡＬ発現用バイブツリドブラスミ
ドは、ｔａｃプロモーターと　Ｐしラムダプロモーター
とが組合わされて、これらがＰＡＬをコートするＤＮＡ
配列ト流に特定の位置関係で配列された構成を有し、こ
のような特徴ある構成によってＰＡＬのより効率良い発
現が可能となった。

また、本発明の組換え体プラスミドで大腸菌を形質転換
することによって、効果的なＰＡＬの大）１」生産に行
用な形質転換株を提供することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｓｑＷｌｌ、　ｐｓＷ２およびｐｓｗｔ：＋
のＰＡＬ構造遺伝子に関わる部分の制限酵素切断地図を
示す。 第２図（Ａ）〜（Ｃ）は、参考例でクローン化したＰＡ
Ｌ構造遺伝ｒ−に含まれる、フェニルアラニン・アンモ
ニアリアーゼをコードする領域を含むＤＮＡ配列の一方
の３０の有する塩基配列を示したものである。 第３図はｐｓＷｌ旧を構築する手順のフローチャート、
第４ＵＡはｐＹｊ、ｒｐ　６を構築するＬ順のフローチ
ャートのであり、第５図〜第７図はそれぞれ第４図に示
したフローチャートの内の一部を詳しく示したものであ
る。 第８図は実施例１および比較例１〜３で構築された芥組
換え体プラスミドの構築Ｔ程の概略図であり、第９図は
プラスミドｐＴａｃｌｌの、第１θ図はプラスミドｐＰ
Ｌ−ＰＡＬ−ｈｅａｄの、第１１図はプラスミドｐｓＷ
１１３の、第１２図はプラスミドｐｓｗｎｓおよびｐｓ
Ｗ１１６（７）、第１３図はプラスミドｐｓＷ１１７お
よび＋１８の構築１程を具体的に示した図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）ａ）大腸菌内で複製可能であるベクターと； ｂ）大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーターと大
   腸菌ラクトースオペロンのプロモーターの融合プロモー
   ター（ｔａｃプロモーター）と、該融合プロモーター下
   流に連結された大腸菌ラムダファージのＰ＿Ｌプロモー
   ターとを有する連結プロモーターと； ｃ）該連結プロモーター下流に挿入されたＬ−フェニル
   アラニン・アンモニアリアーゼをコードするＤＮＡ配列
   とを有し、 前記連結プロモーターを構成する２つのプロモーターの
   方向性が同一であり、かつ前記Ｐ＿Ｌプロモーターが前
   記ＤＮＡ配列の転写を可能とする方向性をもって前記Ｄ
   ＮＡ配列の上流に配列されているものであることを特徴
   とする組換え体プラスミド。 ２）前記Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリアーゼが
   以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第１項
   に記載の組換え体プラスミド。 【遺伝子配列があります】 ３）ａ）大腸菌内で複製可能であるベクターと； ｂ）大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーターと大
   腸菌ラクトースオペロンのプロモーターの融合プロモー
   ター（ｔａｃプロモーター）と、該融合プロモーター下
   流に連結された大腸菌ラムダファージのＰ＿Ｌプロモー
   ターとを有する連結プロモーターと； ｃ）該連結プロモーター下流に挿入されたＬ−フェニル
   アラニン・アンモニアリアーゼをコードするＤＮＡ配列
   とを有し、 前記連結プロモーターを構成する２つのプロモーターの
   方向性が同一であり、かつ前記Ｐ＿Ｌプロモーターが前
   記ＤＮＡ配列の転写を可能とする方向性をもって前記Ｄ
   ＮＡ配列の上流に配列されている組換え体プラスミドに
   より形質転換された大腸菌株。 ４）前記Ｌ−フェニルアラニン・アンモニアリアーゼが
   以下に示すアミノ酸配列を有する特許請求の範囲第３項
   に記載の大腸菌株。 【遺伝子配列があります】