PT97081B - Processo para a preparacao de vectores bacterianos - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAçSO DE VECTORES BACTERIANCS

MEaãRiA„afeSCRITIvA

O invento está relacionado com o campo da engenharia genética e proporciona novas moléculas tís DNA recombinante; que compreendem origens de rsplicação multifuncionais e/ou uma sequência de DNA codificadora da proteína mais abundante no sobrenadante de culturas de Lactococcus spec, designada Principal Produto de Secreção (Major Secretion Protíuct, MSP), d?;; seu peptídeo sinal e/ou do promotor do gene MSP» As novas moléculas são usadas para a produção de novos vectores vai-vem para a clonagem de DNA em pelo menos E» coli s Lactococcus spsc,, ou de novos vectores para a expressão de genes homólogos ou heteróloqos e para a produção dos produtos de genes secretários em bactérias grans-positivas tais como Lactococcus soece Bacilíus spec- -

Câmi2O_dcLJÍnventa invento está relacionado com o campo da engenharia genética e proporciona novas moléculas de DNA que compreendem origens de replicação multifuncionais e/ou uma sequência ds DNA codificadora da proteína mais abundante no sobrenadante ds culturas de Lactococcus lactís, daqui em diante designado Principal Produto de Secreção (MSP), do seu peptídeo sinal e/ou o promotor do gene MSP. As novas moléculas de DNA foram usadas para a produção ds novos vectores vai-vem para a clonagem ds DNA em pelo menos E. coli e Lactococcus spec, ou novos vectores para a expressão ds genes homólogos ou heterólogos e produção dos produtos sscrstados em bactérias Brsm positivas tais como Lactococcus.....spgç^, s Bacillus spec..

h.und.amen,to„,dp Invento

Se bem que em técnicas d-e engenharia, genética sejam já conhecidos numerosos sistemas sistemas vector-hospedeiro procarióticos para a clonagem de genes- heterólogos ou homólogos sejam já conhecidos, existe u.ma necessidade contínua de novos -si temas que possam ter vantagens reiativamente aos sistemas conhecidos.

A maior parte do trabalha com recombinantes na tecnologia de DNA tem sido efectuado com bactérias tais como Escherichia coli ou Bacillus subtil is, As bactérias do ácido láctico, no entanto,, têm muito mais interesse industrial. Por este motivo, foram feitos esforços no sentido de desenvolver vectores plasmídeos para clonagem e expressão de genes homólogos e heterólogos em bactérias do ácido láctico, particularmente em Lacto-baci 11 us spec, e Lactococcus spec. tver Pus WD Bb/0394o, Basson e Anderson (1985)₅ EP-A-® 3íó 677, Bates et al., (1989). dos st al., (1985) tes artigos de revisão Laçtocpççus.....speç. era

anteriormente designado Streptococcus soec»

-As estirpes de lactococos até agora investigada são portadoras de uia complemento de plasmídeos característico consistindo em vários plasmídeos diferentes» Esta propsrieda.de pode ser usada para diferenciar várias estirpes de lactococos CDavíes et al», 1981). Para estudos genéticos, foram construídas estirpes sem plasmídeos por eliminação repetida no decurso dos estudos de funções dos plasmídeos íDe Vos, 1987)»

Por exemplo, o complemento de plasmídeos de L. lactis 712» daqui em diante designado L» lactis LL712, consiste em 5 plasmídeos tendo os -pesos moleculares de Í,B Md, 2,5 Md, 5,2 Md, 9 Md e 33 Md que foram designados pSK71, pSH72, pSH73, pSH74 e pLP712, respectivamente CBasson, 1983)=

\_z

Com base no plasmídeo pSH7í ds L. lactis s no plasmídeo relacionado pWvwí de L» cremoeis COtio et a», 1982) foram construídos vários vectorss ds clonagem» Os vectorss de clonagem foram produzidos através- da inserção de marcas genéticas tais como genes de resistência -a antibióticas nos plasmídeos ou por despiste dos fragmentos dos plasmídeos relativamente à função de origem de replicação, i.e» capacidade -para suportar a replicação de fragmentos de DNA seleccionados» Um vector de clonagem produzido de acordo com este último método é pNZ12 que contem o fragmento de restrição Ciai de 1,7 Kp do p8H71 compreendendo a origem ds repl icação -CSasson e Anderson» 1985), A origem de repl icação do- pSH71 é também funcional noutras bactérias Bram—positivas tais como Baci 11 us spec , -e na Bram-negativa Escherichia Çoll»

')o ti

Com base nestes plasmídeos desenvolveram-se vectores de clonagem úteis para a introdução s expressão de genes homólogos ou heteróloqos em bactérias do ácido láctico. 0 desenvolvimento u>.

os vectores ds clonagem resultou em estirpes lactococoí transformadas com melhores caracteristicas as ausis são úteis na indústria alimentar, por exemplo uma estirpe de % t:.r

316 6/z) riEí5Íte- so~- b*sctoriófapos ou liíb-s s?stir'ps ds? L_o 1 -actis que produz proquimosina bovina CPCT WO 85/®3945)» 0 desenvolvimento de vectores de clonagem para a produção de produtos génicos homólogos ou heterólogos tem interesse não só pela produção ds células bacterianas de ácido lático melhoradas como também pela produção de proteínas recombinantes» Um dos principais problemas com a produção de proteínas heteróloqas em sistemas de expressão ia ic r Qu i anc purzfcoação produto» A purificação de proteínas intracelulares é demorada e muitas resulta em rendimen-

»;__- , j__„i..

i U5_ Aii (.CíQtí pode ser consxaeraveiRisntB se o produto for secretado pela célula hospedeira» Para evitar os problemas de purificação dos produtos expressos em bactérias, os sistemas vector-hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes que são sscrstadas para o sobrenadante podem ser úteis» tos fraco ft purificação

Uma outra vantagem das proteínas •etadas node ser que elas possam ter uma conformação nativa e biologicamente activa pois em seguida é necessário o processo de reenrolamento» u reenrolamento per i men te necessário se

DOí iPKutifífciu depositado intracelularmente» A secreção de uma proteína geral mente requere um peptideo sinal no extremo tradução primário que dirige a proteína para vantagem se o peptideo sinal fSr clivado proteína durante a translocação através da Isto, no entanto» nem sempre é o caso» mina do produto de v i a sec re to ra» Tem enzimatioamente da mem u ϊ^- *ana c e x u 1 a r»

Π ι_ ;__λ. <ό ο ο invento

J. ΙΑΙ» -„t·—

Constitui um chjectivo do invento proporcionar novos

vectares	híbrids que passara	r^pl	X C 5. Γ “~'3©	tóiT;	faau té r 1 as g r	ara pu	51 tl—
vas e gr	ara negativas e/ou	nu©	per mi. t.	-3.ΓΠ		de	genes
homólogos	ou heterólogos s	5SC Γ*	©çã© d©	pfi	□dutos protei	cos	es ca-
çà £3, Oct Γ E?	c sobrenadante.
	Era particulars es	4-.~.	otajecti	vo	τ 0 x c 0 π ©-©g u	ido	pe 1 as
Or*!-?'Ξ·ξ~Π	vectores híbridos	pu©	sêío nov	05	c 0ííí p r ©©n d ©n d o	uma	nova
in-serçao	de DNA que compreen	L.3 tX)	rsgxMo	do	pf'~OOíQ tõr 3 -5.	sequ	ênc ia

de DMA codificadora, do peptídeo sinal e a região codificadora de um gene até aqui desconhecido codificador de ura polipeptídeo que ê a proteína mais abundante no sobrsnadante de L. lactis conforme avaliado após precipitação cora TCA do sobrsnadante» slectroforese era em SDS— poliacrilamida das proteínas- precipitadas e coloração do gel cora azul Coomassie brilhante e que ê aqui designado Principal Produto tíe Secreção (MPS)»

Jraa outra solução para ura objectivc ii ϊ ven uo au novos vectores de híbridos compreendendo uma oriqsm de replicacão derivada do plasraídeo 2»5 Md ou 0 = 2 Md ds i origem de replicação relacionada, a qual é funcional em hactèr

IdLLib i_.i_ / i2 uu uma grara positivas e orara neaativas»

Assim» proporcionar nov promotor _? a sequ a região codific OrÍQSiY‘ d© rBQliC lactis LL712 ou uma outra solução para ura objectivo do invento é QS vectores híbridos compreendendo a região do jãncia de DNA codificadora do peptídeo sinal e/ou adora do gene MSP ou de ura gene relacionado e uma ;ação derivada tío plasmídeo 2»5 Md ou 5=2 Md de L„ uma origem de replicação relacionada»

invento diz respeito das novas inserções de DNA ou à= Eles- são úteis para a produção para a secreçáo proteínas hom invento proporciona, a çãodas novas moléculas de DNA e para a produção dos produtos· q hospedeiros transformados com um invento propo pura ί·.

também a	fragment		í un c i on a i s
OrÍQenS	de repli	caçã	o per se.
de novos	vec to r es	de	e x pres-sao
άIogas ou	heterólQi	d-âlS-	derivadas
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vectoras	híbridos		um método
énicos Si	scretados	por	(HS 2.0 03

tiOVO Vautur híbrido du iifVwitu.

tamh proceina nòK na torma

Descrição detalhada do invento

Moléculas de UNA invento diz respeito a urn vector híbrido compreendem

a.) a inserção EcoRl/SalI de -aproximadamente 3,5 K.pb de

L. lactis do plasmídeo pUCRS ou um seu fragmento funcional ou com um •eu. t r ρΓΌΟΙΟΊΣΟΓ* soquênc itó d 3 ds DNA que agmento fun naturalment hibridação ou hibrida com a refer cional ou compreende e está opsracionalme da inserção ou uma região de te ligado a tal uma sequência degenerada de uma sequência ds DNA que está englobada em a) ou b) e que codifica um peptídeo sinal ou

ura derivado ds unia, molécula, de uNA englo s/ ou ‘ffi -5: ? , b) OU C >

e) a origem de replicação ds (I) do plasmídeo 2„5 Md ds I- v 1 actisLL712 ou ds C11’) do plssmídeo 5 = 2 Md ds L» lactisLL712 ou de CHI) um plasmídeo do mesmo grupo de incompatibilidade do plasmídeo 2=5 Md ou do plasmídeo 5 = ' de L«1 sc t x sLL /12»

Md

A inserção EcotíI/S-al I de 3,0 ríph de L lactis- do plasmídeo pUCRS compreende a região do promotor do gene MSP, a sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal de MSP e a região codificadora de MSP, MSP com o seu peptídeo sinal ligado é daqui em diante designado pre—MSP» A inserção EcoRI/SalI compreende a. sequência de DNA ds 1926 pb de comprimento com a SEQ ID Meí descrita na listagem de seouê’ncias numa orientação tal que a posição de bases 1 é proximal reiativamente ao sítio EcoRI.

A região codificadora ds Mf'S estende···

492 até à posição de bases Í793 sequência com vEu

ID

N51 a

A sequência ds DMA que codifica :itíos ds comprimento estende ?/ peptídeo sinal d de amxnoí

região do prosuotor	aqui d st
DNA codificadora do	MSP mad
até à posição 491 d	& S-S'C|LíSó”j

como cotfu j_ ₈ q _c íjssds com SEQ ID ss desde o extremo da çando na sequência de de MSP ou um seu fragmento funcional faz seja secretaria de uma célula hospedeira, e ácido lático, como seja Lactococcus lactis

a posição	ds bses 411
MSI» 0 pe	ptídso sinal
com que	uma prote ín a
g» de uma	bactéria do
ou de Bac	illus spec.»

tal como B« thurínqiensis, se o extremo M de. ligado covalentemente ao extremo C do peptídeo covalente do extremo C do peptídeo sinal de MPS proteína estiver sinal» A ligação s o extremo N de

LUTíc- ρΓ*GXjE:XΠ£á GLíS: 'x-tí Ο%ί’»νΧΠ«4 3. Ή·£5Γ* íSXC tíeira pode ser obtida pela produção de um qene ds fusão em que toda a sequência de DNA codificadora do peptideo sinal MPS ou parte codificadora do fragmento funcional do peptideo sinal MPS compreendendo o extremo C está ligada na. grelha de leitura

ítâda dfcf Ui„3. uélulâ i~sQ-SpS‘“ correcta ao extremo 5·' se um qene estrutural cotiiTicaoor ua proteína pretendida» Tal qene de tusão é por exemplo a molécula de DNA com StU ID N22 que compreende a sequência ds uMA codificadora do peptideo sinal MSP e o qene estrutural da hirudina.

As sequências de aminoácidos do peptideo sinal de MSF de MSP estão também apresentadas na sequência com SEQ TO N2Í=

A região	do	prosoto	r do gene MrS	está lai tuada -a	montan-
ts da sequência d<	s	DNA cod	if icsdors do	peptideo sinal	MSP e
compreende -até cen	ca	de 130Θ,	de preferênc	ia até cerca de	100 a
1000 nuc1sót idos»	Ns	in-Brçe.o	EcoRI/SalI	QG SprOX ii&sdsniGn	te 3,5
Kpb de comprimento	de	L = 1ac t	is do plasmí	deo pUCKS, a reqião do

—se desde o extremo ds inserríão cortad :om tcoRl promotor estende situado a montan cia de Cf NA com pa r t ic uI a r men te, sitio de restriç dendo à posição 1 até á. posição tor pode ligar a RNA—polimerase e pode controlar a expressão d# te da base correspondendo è. posição 1 da sequênSEQ ID NQl até è. posição de bases 411» Mais a região do promotor estende-se desde o primeiro

So HindiII situado a montante da base corresponde bases 411= A região do promoassim como proteínas reguladoras í um gene estrutural operacionalmente liqado a ela» contendo o promotor

U termo fragmento funcional inclui os fragmentos d? funções ds sinal e/ou estruturais» contéí» a

Os fragmentos funcionais preferidos são aqueles região do promotor de MSP, a sequência de que nwA

codificadora do peptídeo sinal ds MPS ou a região do promotor e a sequência de DMA codificadora do peptídeo sinal ds MF*3» Os fragmentos de acorda com o invento são também compostos por fragmentos mais pequenos mantendo a actividade de promotor de MSP e/ou codificadora de um peptídeo com actividade de peptídeo sinal»

Os fragmentos com função de- promotor, por exemplo, os que começam com a primeira base no extremo do corte com EcoRI da inserção EcoRI/SalI de aproximadamente 3,5 Kpb de L» lactis ou em particular os que começam no sítio HindiII e estendendo-se até uma base correspondendo à posição aproximada 410 da sequência com SEQ ID MSI» Outros fragmentos com função ds -promotor foram seleccionados do grupo de fragmentos começando com qualquer uma das bases entre o sitio EcoRI e o sitio HindiII e terminando com uma base por volta da posição 410 tis sequência com SEQ ID NQí= Ds fragmentos mais pequenos da região do promotor também retêm actividade de promotor» um fragmento de DMA que codifica um peptídeo sinal estende-se por exemplo desde aproximadamente base 411 até ã base 491 da sequência com SEQ ID IMS!» Ele pode prolongar-se no extremo 5com um fragmento da região do promotor que não retesa a actividade de promotor»

Um fragmento mantendo a função de promotor MSP e codificador de um peptídeo sinal estende-se desde o extremo cortado com EcoRI da inserção situada a montante da base correspondendo à posição 1 da sequência ds DNA com SEQ ID N21 até à posição de bases 491» Um outro fragmento mantendo a função do promotor de MSP s codificador de um peptídeo sinal estende-se desde o primeiro sítio de restrição HindiII situado a montante da base correspondendo à posição 1 da sequência de DNA com SEQ ID

Ν21 até por volta da base correspondendo à posição 491» Outros fragmentos mantendo a função de promotor MSP e codificadores de u.m peptídeo sinal foram seleccionados do grupo de fragmentos começando com qualquer uma das bases entre os referidos sítios EcoRI e Hindi ΣΙ e terminando numa base por volta da posição 491 da sequência com SEQ ID N21»

Os fragmentos podem conter adaptadores que proporcionam uma ligação a outras moléculas de DMA» Adaptadores adequados para os fragmentos acima têm uma sequência de DNA que se adapta a um sítio de restrição do DNA ao qual o fragmento se vai ligar» Eles podem também conter um sítio de restrição predeterminado»

Uma molécula de DNA -que hibrida com a referida inserção é hibritíada em condições convencionais» Um processo de hibridação convencional está descrito e.-.g» por Benton e Davis CÍ977Í» Tal molécula de DNA hibridante compreende por exemplo como sequência de DNA hibridante uma variante do gene- estrutural codificador de MSP» Tal variante de hibridação é daqui em diante também referida como um gene estrutural relacionado com o gene MSP» A proteína codificada por tal gene relacionado é referido como uma proteína relacionada com MSP» Assim» uma região de promotor que está naturalmente ligada a. uma sequência de DNA que hibrida com a referida inserção é uma região de promotor de um gene relacionado com o gene MPS»

Um gene estrutural relacionado com o gene MPS é por exemplo uma variante natural derivada de uma outra bactéria diferente de L» lactis^ particularmente de uma outra bactéria do ácido láctico por exemplo de Laçtobaçillus__spec^. ou Lactococçus spec»„ e»g» L» cremoris ou L» thermophilus» é também uma variante natural a que seja codificada por um isoqene no cromossoma de L. lactis ou num plasmídeo que exista naturalmsnte em L» lactis»

As· moléculas de DMA do invent ι ί 5··-;Π i ΛιΤ«5?Σ^ιΤί ~ΐΓίΗ£Ξ-- 1 /5“.

que possuem sequências ds DMA degeneradas ••ão dtíuanKradss dentro do significado do código genético pelo facto de um número ilimitado de nucleótidos serem substituídos por outros nucleótidos sem alteração da sequência de- aminoácidos que eles codificam. Moléculas tendo tais sequências de DMA degeneradas podem ser úteis- devido aos seus diferentes sítios de restrição ou devido deuma utilização de codSes preferida num hospedeiro particular. São preferidas as sequências degeneradas da sequência de DMA codificadora do peptídeo sinal MSP ou de uma sua variante.

molécula de em relação com uma o.· ou c/ inclui fragmentos, tal molécula de DMA, D termo

D termo derivado quando usado DMA englobado em a), mutantes ou derivados maiores de derivado inclui também derivados maiores de fragmentes ou mutantes de tal molécula de DNA, São preferidos os fragmentos de DMí que retenham as funçSes ds promotor, sinal ou estruturais. Sãi dados abaixo exemolos de tais- fragmentos.

Um mutante ds uma molécula de DMA descrito em a), b) ou

c) é por exemplo, uma molécula de DMA tendo uma deleção, inserção, inversão ou mutação pontual que podem acorrer naturalmente ou serem introduzidas artificialmente na molécula de DMA in vivo ou in vitro ds acordo com métodos convencionais. Um mutante pode apresentar um padrão de restrição alterado,

Derivados maiores de uma molécula de DNA englobados por iles podem ser encontrados numa biblioteca genómica de L, lactis

a), b) ou c) são por exemplo retiráveis do genoma de L i ac t is tf

LM023© obtida por fragmentação dos ácidos nucleicos, tratamento dos fragmentos com uma enzima de restrição adequada, e.g. Sau3AI, o faqo

tcoRJ.,	BamH I	ou	Hindi115 ligação num vector ad	equado, e.i
1ambda	EMBL3	OU	o plasmídeo oBR322, clonapem	E: u G u ç?ííi £
nova, r	£5 íTl O Ç õd O	com	a mesma ou outra enzima de re	strição adi

Os derivados maiores de uma molécula de DNA englobados em a), b) ou c) são também moléculas de DMA recombinante com sequências flanqueantes, por exemplo as que compreendem adaptadores que proporcionam sítios de restrição adequados ou que colocam

1adoras, tais como	Ufft profftc t, €	3r, uma sequência	de
•a ds um peptídeo s	x π -Ξι I ou d s	um terminado!- e	um
na distância ou	Q r~G I Ks OS	1 e i tu. r a c o r r ec t a	ou
vadas de um vector.	e.g. de t	íffl fago ou plasmí	dsc

usado na construção de um vector híbrido» As sequências flanaue— antes contidas nos derivados maiores podem dar origem a genes os fusão «

Uma oriqem de r

ou iní fa

5=2 Md de L. lactis LL712 ou de osipatibilidade do plasmídso 2.5 er com que um plasmídeo se rep

.. Life	sri	vada do plasmídso 2.5	Md
um	pl	asmídeo do mesmo grupo	de
Md	GU	do plasmídeo 5.2 Md pc	-?U izf
iqt	♦ G	em bactérias ácidas, f	inr

exemp 1 o em 1 at_ Lu ou L„ cremoris e diferentes ds E» ocus,

e.g.

?m lactis, em E, çol coli ou das bactérias do ácido láctico» i ou também em í: em bac terias g r<

bactérias gram negativas :m positivas diferentes em Bacillus spec. ta.is como

Uma origem de replicai ou 5.,2 Md de L. lactis LL.7Í2 ou imcompatibilidade do plasmídeo por exemplo contido no total do obtido após tratamento com ao que aeriva oo de um plasmídeo do mesmo grupo ds no ,_1 2>.o Md ou do plasmídeo 5.2 está respectivo plasmídso linearizado uma endonuc leas-s ds restrição adequada = Assim uni vector híbrido do inventes é também um que compreenda toda a sequência de DNA do plasmídeo 2=5 Md ou 5=2 Md ou de um plasmídeo do mesmo grupo de imcompatibilidade do plasmídeo 2=5 Md ou 5=2 Md» Ambos os plasmídeos podem ser isolados, por exemplo a partir da estirpe L» lacfcisLL.712 que está depositada na DSM como DSM 58Ô4»

Uma sequência de DMA que funcione como origem replicação é também um fragmenta de qalquer um dos referidos plasmídeos mantendo a função de origem de replícação» Tal fragmento de DNApode ser obtido por exemplo através do seu isolamento após a fragmentação do respectivo plasmídeo ou de um seu fragmento, por exemplo, com forças físicas, e = g» forças tangenciais ou com reacçSes de clivagem química ou com enzimas que clivem DNA tais como nucleases, e»g» as exonucleases Bal-3í, Sí ou exonuclease III ou endonucleases, e = g = endonucleases de restrição» Em particular, tal fragmento de DNA é um fragmento de restrição obtido após tratamento do respectivo plasmídeo ou seu fragmento com uma ou com duas endonucleases de restrição diferentes que são no caso do plasmídeo 2 = 5 Md-_;í por exemplo Ndel, Sphl e/ou EcoRV e no caso do plasmídeo 5 = 2 Md, por exemplo» Sau3ft, Ndel, HindíII, Accl e/ou EcoRI.

A origem de repiicsção do plasmídeo 2=5 Md esté. situada por exemplo no fragmento Ndel/Sphl de aproximadamente 1,8 Kpb de comprimento» no fragmento EcoRV/Sphl de aproximadamente 3,1 Kpb de comprimento obtido por digestão parcial com EcoRV do fragmento de Sphl de aproximadamente 3,5 Kpb de comprimentoo fragmento Sphl de aproximadamente 3,5 Kpb de comprimento, o fragmento Ndel/EcoRV de aproximadamente 1,2 Kpb de comprimento» o fragmento EcoRV de aproximadamente 2,5 Kpb de comprimento ou o fragmento EcoRV/Sphl de aproximadamente 2,5 Kpb de comprimento obtido após digestão parcial com EcoRV do fragmento Sphl de aproximadamente 3,5 Kpb» D fragmento Sphl de aproximadamente 3,5 Kpb de comprimento s outros fragmentos aqui referidos strásestão também incluídos em pSC12= A produção ds pSC12 está descrita no Exemplo 1.2= Na Figura 2 está apresentado um mapa de restrição»

A origem de replicação do plasmideo 5»2 Md está situada por exemplo no fragmento Mdel/HindlíI de aproximadamente 1,® Kpb de comprimento, no fragmento Ndel/Accl de aproximadamente 2,2 Kpb de comprimento» no fragmento Ndel/EcoRI de aproximadamente 2,7 Kpb, o fragmento NdeI/Sau3A de aproximadamente 3,1 Kpb de comprimento, no fragmento Sau3AzHindiII de aproximadamente 2,® Kpb de comprimento, no fragmento Sau3A/AccI de aproximadamente 3,2 Kbp de comprimento, no fragmento SauA/EcoRI de aproximadamente 3,7 Kpb de comprimento ou no fragmento Sau3A de aproximadamente 4=1 Kpb de comprimento» Os fragmentos com os extremos Ssu3A foram obtidos após digestão parcial com Sau3A do plasmideo 5»2Md, ds pSCIS ou de fragmentos de restrição adequados destes plasmideos» A produção de pSCIS está descrita no Exemplo í»3» Na Figura 3 está apresentado um mapa de restrição»

Os plasmideos do mesmo grupo de incompatibilidade não podem coexistir estavelmente na mesma; célula» Eles são portadores de origens de replicação relacionadas»

Uma molécula de DNA recombinante contem por exemplo adaptadores e/ou sequências derivadas ds um vector tal como um fago ou plasmideo e facultativamente um gene marcador tal como um gene de marca de resistência, e»g= um gene de resistência ã eritromicina, ampicilina ou tetraciclina ou similares» Uma molécula de DNA recombinante compreendendo uma origem de replicação do presente invento é por exemplo um vector plasmideo para as bactérias do ácido lático, de preferência um vector vai-vem que se pode replicar pelo menos em bactérias do ácido lático e E»

coli e em que uma origem derivada dí única, oriqem de reolicação» actococos ao invento é «_ f—/~· ΐ -^-) j _ x. „ r·» poUiXulíi t.cai” »1

Um vector vai-vem preferido pSC12deltaN, p5C12dsltaP, pSC12deI taíMP, pSClS, pSCIBdeltaP ou pSCíSdeltaN» Um vector vai-vem preferida para a expressão de um gene estranho em bactérias do ácido láctico é pSCÍ2HIR, pSC12HÍR-1 ou pSC12HIRTerm» Os vectores vai—vem preferidos estão descritos- nos Exemolos» r-G” * O J. X~ í

Uiílí sequência dí ϋ-ΝΑ que f une ion uomu uma o-í ;íTs dí replicscão pelo menos nas bactérias do ácido láctico e sm fc.

que se pretende incluida em e) é- também uma inversão, inserção, deleção ou mutação pontual ds uma sequência de DMA aqui já definida que retem a função de origem ds replicação» tais mutantes têm uma sequência, de nucleótidos alterada, nas sequências de )IMA f 1 anqusan tes ljí igem de repiicaçâo real» por mutações pontuais que provocam um pavdrão de restrição alterado ou mutantes de deleção tais como as inserçSes de L. lactis dos plasmídeos pSC12deltaP, pSC12deltaN, pSC12deltaNP, pSCISdeltaP ou pSCíSdeltaN (ver Tabela 1). A origem de replicação real anteriormente referida, é- o fragmento de DMA mais pequeno que funciona como oriqem □<

aplicação»

Os vectores híbridos do clonagem em hospedeiros tais como fungos ou em bactérias particulares» Eles podem derivar de qualquer vector útil em engenharia genética, como sejam fagos, cosmídeos ou plasmídeos» Eles são, por exemplo, derivados do fago lambda, e»g. ΝΜ939 ou EMBL3, tio fago Mi3» e = g» Hí-3mpíu ou Mí3mpí9, de plasmídeos- bacterianos, e.g» pBR 322, pUCIS ou pUC19 ou plasmídeos das bactérias do ácido lático ou plasmídeos ds levedura, e.g» plasmídeo 2 μ de levedura ou também dos fagos dsfectivos ou plasmídeo dsfectivos na dsfectivos

presença ds um fago auxiliar ou ds um plasmídeo auxiliar permitindo a replicação dos referidos fagos ou plasmídeos defectivos.

Um vector híbrido do invsnto compreende uma sequência ds riucleótidos de uma molécula de DNA englobada em a>, b?» c> ou

d). Eis compreende em particular a inserção EcoRI/SalI ds L. lactxs com aproximadamenie 3.5 Kpb» um seu fragmento codificador do psptídso sinal MSP e/ou o promotor do gene MSP. Dependendo do tipo ds molécula de DNA do invento inserida no vector híbrido, o vsctor pode compreender uma sequência de controle de expressão híbrida. Tal sequência ds controle da expressão híbrida consiste parcialmente numa molécula de DNA englobada em a) , b5 ou c> s parcialmente numa molécula de DNA diferente de uma molécula de DNA englobada sm a) , b) ou c)= Por exemplo, o vector híbrido pode compreender o promotor MSP em combinação com uma sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal não MSP, um fragmento de DNA codificador do peptídeo sinal MSP em combinação com um promotor diferente ds MSP. Em adição, um vector híbrido do Invento facultativamente compreende uma região tsrminadora da transcrição, e.g. o terminador da transcrição trpA de E. coli. Qs vectores híbridos compreendendo uma sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal do presente invento, i.e. derivado do gene de pre-MSP ou de um gene relacionado, são úteis na produção de produtos génlcos secretados em bactérias do ácido lático, particularmente em t a c t oc oc u s s pec.„ espscia1mente em L. lactis- ou L. cremoris ou noutras bactérias, por exemplo num Baci11us spec. tal como 6, thuringíensis. Tal vsctor híbrido compreende um promotor que funciona na bactéria pretendida,, por exemplo o promotor MSP para a expressão em bactérias do ácido lático e íscultativamente uma região de terminação da transcrição que funcione na bactéria pretendida. A utilização de um terminador pode aumentar o rendimento do produto do gene recombinante se ele estiver operacionalmente ligado ao respectivo gene estrutural homólogo ou

hs Lerólogo » Por BJíSiiipiGj S6 u t.síflHXnach-Jf' t.i' jjA de ÍO , COi 1 SstlYSf operacionalmente ligado a um t?ene da hirudina qus seja expresso sob o controle do promotor MSP e uma molécula de DMA codificadora do peptídeo sinal de MSP em bactérias do ácido láctico? a “produção de dessulfato-hirudina é marcadamente aumentada»

Um vector híbrido do invento também compreende uma origem de replicaçSo que funciona no hospedeiro pretendido? e,g» em bactérias do ácido láctico e/ou Bacillus spec» e/ou E« coli»

Uma sequência de DMA portadora de uma origem de replifunciona pelo menos em bactérias do ácido láctico é por exempla o fragmento Ciai de 1?7 Kpb do plasmídeo pSH71 (Gasson e Anderson? 1985) ou um dos fragmentos de DNA aqui definido que compreende a origem de replicação do plasmídeo 2»5Md ou do plasmídeo 5 = 2 Md de L» IactisLL.712»

Um vector híbrido do presente invento pode conter uma marca seleccionável·.· a escolha da. marca depende do hospedeiro que se pretende transformar? seleccionar e clonar» Pode ser usado qualquer gene marcador que facilite a selecção dos transformantes devido à expressão fenotípica da marca» São marcadores adequados particularmente os que expressão resistência a. antibióticos? e»q» contra eritromicina? tetraciclina ou ampicilina ou no caso de mutantes auxotróficos? qenes- que complementem lesões do hospedeiro» e.-.q» qenes da via de metabolização da lactose» realizações prefenoas c-o presenc vector Sb fiiúndus comprendendu um gene escrucut i nvento são homóloqo ou heterólogo? cor exemplo o MSP ou especialmente um gene estrutural hetsróloqo aqui definido o qual é operacionalmente ligado na qreiha de leitura sequênc

DNA c od i f i c ad o r a d o peptídeo sins! MSP promotor MSP ou de

e que pode ser expresso sob um promotor heterólogo» o controle do

Os genes estruturais podem derivar de vírus, células procarióticas ou células eucarióticas e podem derivar ds DNA genómico ou de cDNft preparado pela via do m.RNA ou podem ser sinteti 2ados químicamen · podem codificar um;

qranoe variedadede polipeptídeos úteis, incluindo polipeptídeas glicosilados, em particular de eucariotas superiores especialmente mamíferos, animais ou esoecialments humanos, como sejam enzimas que podem ser usadas, por exemplo, para a produção de e para a realizaçQao de reaí polipeptídeas que sejam úteis ?

hormonas, polipeptídeos com nutrientes

>es en z i ma ci c as	em	química
mportantes para	o t	ratamento
s ou. de anima	is,	por exem
p r o p r i e d a d e s	imun<	omodu1ador

Siiii-virsis e r» í ... -jtumoraxs, arrcxcoroos, antigemos virais, vacinas, factores ds coaqulação, alimentos e similares.

São exemplos de tais qenes estruturais heterólogos e.g. os codificadores de hormonas tais como secrstina, timosina, relaxina, caicitonina, hormona luteinizsnte, hormona da paratiróide, adrenocorticotropina, hormon s úiatu 1 atíora os wslfinocitos.

β-Ιipotropina, uragsstrons ou insulina, factores de crescimento, lãis como Tscxor ae crescimento epidérmico, fscxor de crescimento tipo insulina (IGF), e„q. IGF-l e IGF-IÍ, factor de crescimento de crescimento ds células nervosas derivadas da qlia ou factor de crescimento transformante CTGF), tal como TBFp, hormonas ds crescimento, tais como hormonas de crescimento bovina ou humana, interleuquina, tal como interlsuquina-i ou -2, factor inibidor da migração de macrófagos humano CMIF), interferSes, tais como irstertsráo ® numano por exemplo int,ei ferao cia.

Interferão interferSo qaraa ou um interferão híbrido. por 'J

'-ί-Λ ?lí <xB ”<xD, espec i s. I men te o ubidores de proteinaseiexemplo um interferão híbrido «m «« «« >.*«, i ;-·««Vcay^cavSf··* H~ hri rlr*i P:V\!3T3 á ·--*· ·« í--* ~ .--.-.-.

mterTerão na.dr3.ba isuats cq -antitripsina, SLPI -e similares, antigénios do vírus da hepatite, tais como antigénio de superfície ou do nucleóids do vírus da hepatite B ou antigénio do víru hepatite não A—não B, activadores do DiasffiinoqôniG activador do plasminogénío tipo tecido ou urocinase, factor de necrose tumor®. 1 , somatostatina, renina, Is—ertdorfins, imunoglobu linas, tais como

D, E ou 8₃ ou imunoglobulinas híbridas humana de ligação a imunoglobulinas, tai ia hepatite A ou antigénio da

Ι-5ΙΞ- COÍBO

4-,·

pesadas de	i mun oq 1 o bu 1 i n a
humana.—mu-rg	anho, factores
como f actor	de ligação a
n i n a, pe pt í d	•eo relacionado

como factor IX ou VHIc, eritropoistina, eglina, tal como eglina C, hirudina, dessulfato-fhirudina, como sejam variantes HVl, HV2, HV3, ELeu, ire^-J—HVl, ELis^r’3-HV2 da dessulfato—hirudina ou PA, superóxido dismutase humana, timidina-cinase virai, β-lactamase, glucose-isomerase. Um gene preferido é o codificador da. dessulraw-niruoina,

t.—. 4Nos vectores- híbridos do

DNA jjressSjio~ invento, u premente promotur e/uu a molécula dê codificadora do peptídeo sinal de MSP está operacionalmente ligado a região codificadora do polipeptídeo de forma a assegurar uma expressão eficaz do polipeptídeo₀

Os vectores híbridos preferidos são pUCRS, M13 mplQRS, Ml 3 mplRH, pVAHIR, pVAHIR—1, pSCíSHIR, pSC12HIR—í e em particular pSCí2HIRTerm. Qs vectores híbridos estão a seguir descritos nos Exemolos» invento também dia respeito a uma molécula de DMA gue

a) é a inserção tcoRI/Sa.11 de aproximadamente 3,0 Kpb de

L,lactis do plasmídeo pUCRS ou um seu fragmento funcional

b) hibrida cons a referida inserção ou com uib seu fragmento •funcional ou compreendo uma região de promotor que está operacional mente ligada a tal sequência de DNA hibridantí é uma sequência degenerada uma íquência de DNA que es<

englobada em a) ou b) e que codifica um peptídeo sinal ou

d) ê um derivado de uma molécula de DNA englobada

c) e/ou

s) compreende a origem de replicação ds CI) plasmídeo 2»5 Md de L» lactisLL712 ou ds (II) plasmídeo 5 = 2 Md de L» lactisLL.712 ou ds (III) um plasmídeo do mesmo grupo de incompatibilidade do plasmídeo actisLL/12 rtd ou ao plasmídeo 5=z Ma de L.« 1ac per se» Esta- moléculas ds DNA ssSd úteis para vsctores híbridos do invento ou para o despiste a preparação aos de bib1iotecas de

DIM.A ou de mRFMA re 1 at.ivamente a DNAs uu mKNAs semelhantes.

Processo para a preparação das moléculas de DNA e de MSP

Um	outro objectivo	do	invento é
preparação d	s uma molécula de	DNA	do invento
hí b rido OU d	s uma molécula ds	DNA	aaui defini

... ...

dendo:

.essa para a de um vector is, compreenA) cultura ds um hospedeiro que compreende uma molécula de DNA do invento s isolamento de uma molécula ds DNA do invento a partir de tal hospedeiro em cultura ou

B) preparação de uma molécula de DNA do invento por uma síntes in vitro»

i' 1'

A cultura dos hososdeiros é realizada num meio nutritivo convencionai qu© pode ser compostos qu2.m1.cos· que permitam suplementado com ou retirados a sslecçãa negativa ou positiva dos trsnsforstantes, i.e. tais hospedeiros contenoo a moiecula tíe DNA pretendida juntamente com uma marca de selecç-ão, de entre os não transforsisntes» i=e- hospedeiros se® a molécula de DNA pre tend xda»

Podem ser usados quaisquer hospedeiros transformáveis adequados úteis na área, por exemplo bactérias adequadas tais como bactérias gram negativas, positivas, e.g. Baci11us.spec» spec i ac tooac ι i ± us e»q» L~» 1 ac cis, t., xaccis

í.q» E. coli.	ou	bactérias- Sram
ou bactérias	do	cíQ X ·~= Ο i -SQ t ICO it
f;f ? .í. *f C<5	imen	i L--3.CZLOQQQQU.S·
d .1. ac e t. i 1 a c t i s	QU	L« cremoris»
isformadas por		íBÉzt-OÚQ CChHVSn—

COs iVsfi’ cional ε os transformantes foram identifiçados de forma cional clina.

e.g» ps i a

-».È resisisncia, por exemplo contra tetraci

Em particular os vectores híbrido descritos foram propagados em estirpes hospedeiras de E„ coli adequadas, tais como TB1, HB10Í_? JM109, KH1 e similares ou sm estirpes de Bacillus adequadas ou em bactérias do ácido láctico adequadas, e.g» estirpes de Lactococcus tais como L. 1actis0230, L. lactis d iace ty1ac tis, L. cremoris e similares» Os hospedeiros foram transformados e seleccionados por métodos convencionais» 0 DNA de plasmídeo propagado é isolado das bactérias por métodos convencionais, por exemplo como descrito sor Birnboim & Doly (1979)»

Uma molécula de DNA do invento pode também ser preparada através- de uma síbnese in vitro de acordo com métodos convencionais» A síntese in vitro é especialmente aplicável para a

	DNA do qene MSP ou de um qene relacionado codificador
	ou em particular do peptídeo smal»
	Uma molécula de DNA do invento pode ser obt
o	de uma bactéria do ácido láctico contendo tal molécul
	particular a partir de uma sua biblioteca genómica ou

dtí prOfiV

Ofc;

ΙδίδΒκίϊΙ mRNfi :

IMA tor ti r

Sffl

5sque~se uma descrição mais detalhada da preparação uma molécula de DNA qu-e é a inserção EcoRI/SalI de L,

CQÍO aproximadament© 3.5 Kpb do plasmídeo oUCRS qenofnxc

Como material de partida pode ser usad; se Lactococçus spec», e»q, L.

uma QiuíiuLtiLd qual preparada de acordo com métodos convencionais, e.g» por . digestão parcial do DNA qenómico de uma estirpe de L._. lactis» e»q» LM 0230, C2 ou LL712, com uma enzima de restrição, e.g. Sau3A ou Mhol e clonaqem dos fragmentos de DNA de alto peso molecular num vector adequado, e»g» o plasmídeo pUN121 de E„ coli ou um fago lam hd a, e»q. 1amhd a EMBL3«

	Qualquer outra	estirpe de	bactérias do ác	JLVlO	1 á tl!_!J
produtora	de MSP podem	S5 F* V 3. r Ο ΟίΠΌ	fonte para a	bibl	ioteca
genómica	e igual mente ou ti	r o o v e o t o r e o	adequados poder»	θ (Γ·	usadas

como recipientes dos fraqmentos.

Para se fazer um despis genómica relativamente a sequências * necessária uma sonda de DNA que bifar e,q» com o gene estrutural nSP = Est· sintética se a sequência de e = g» o conhecida» Como nem a proteína

MSP nocn te com êxito da biblioteca de DNA do presente invente é ide com ta.i sequência de DNA, c*. Í_t£Tlc*. tc-C?F~iGcd CsS?

Qsní? MSP ou psrts deis for s. sequ@nc i.êt do qene MSP ou

P -a r t s d s I a eram conhecidas

MSP s da preparação de sondas de UNA hibridantes foram primeiro r eso 1 vi dos»

MSP é o produt

O ujest.

íTiSis abundante no sobrenadante e.q« L«_lactis conforme avaliae1ectroforese em qem s coloração do □o por precipitação com TcA do sobrenadant? de SDS—poiiacrilamxda d«s proteínas precipitada qel com azul Coomassie brilhante»

Para a purificação de MSP pode ser usada qualquer fonte em que esteja presente, por exemplo o sobrenadante de uma cultura de bactérias do ácido lático, e = q» Lactococcus soec. tal como L. 1ac tis. MSP pode ser purificado a partir de um qel de SDS—poli— acrilamida cortando do gel um pedaço contendo a principal banda proteica e eluindo—a MSP»

LlLl t. í~iJ'cõ	métodos	d e pu r i f i c a ç 3 o	tais como	prec xpi Laç-as
c oíb ác ido, © s Q «	ácido t	r i c1oroac é ti c o,	r smoç ão d e
precipitação na	forma de	LuTí 3-31 ÚXTOCOnto	, dxá1ise,	C r*Oí7‘-~i tOu r~ 3.'
fia, e=g= cromat	oQrsfis	de af inidade, c r	Gíftâ t OQ Γ 6. f i S.	de per mu t:

iénica, cromatografia ds permeação em gel, electroforese, e.g» com qel de SDS···poliacrilamida, focagem isoeléctrica, electroelui— çáo e similares ou qualquer cumbiuação aplicado de forma a obter-se MSP puro» ode esmoem ser

Mo presente invento, um MSP com um so moiecuiar aparente de aproximadamente bó KU foi isolado na forma pura por t ric1oroacético.

âc i d o t ric i oroacético, dor proteína precipitada num gel região com a principal banda uma e1ec troforese .tbsequen te com ds de aDS-poliacrilamida, cortando a proteica, e e 1 ec troei uindo MSP do

V fcí 1 -5C X QFifiíj-5 5

UUlií

MtíP tendo um outro peso molecular -aparente, sequência de aminoácidos ds MtíP foi parcialmente determinada por sequenciação e parcialmente deduzida da sequência de DNA, Está apresentado na listagem de sequências em 3EQ ID NS1 e estende—se desde a posição 28 até à 466 da sequência í aminoácidos descrxA proteína MSP pura foi também tema do invento,

A sequenciação do extremo N de MSP foi realizada de forma convencional e revelou a seguinte sequência de aminoácidos? X—X—Asn- Ser—Asp— 11 ε—A1 -a—Lis—S1 n—Asp—A1 a—T re— 11 e—Ser—X—A1 a—G1 π —Ser —Ala™Lis—Ala—Gin—Ala—Gin—Ala—Gin—Vai—Asp, Os dois prxmexros aminoácidos e o aminoácido na posição 15 que estão indicados com não foram detsrmxnados,

Com base na sequência dos aminoacidos na posição 5· a 13 sintetizou-se a seguinte mistura de oligonuclsótidos?

GAíf-L AlN._. Gt_- 1 OAtM ϊ5ΑΝ_Λ idOx AC_e Nesta seouêncxa de nucleóti—

2 -3 -3 1 ’ dos, !M_. é T ou Cs N,» é T, C ou As N_. é A ou G» A representa um * Λ ,-f* * ¹ nucleótido com a base Adsnxna, T com Timxna, C com Citidina, G com Guanosina e 0 com Inosina, A mistura de oligonucleótidos foi marcada radioactivaroente de forma convencional e usada para fazer de Lactococcus spec«, particularmente L» lactxsLM©23©.

despiste de uma biblioteca genómica

As sondas ds DNA contendo sequências codificadoras da sequências de aminoácidos de MSP e tendo pelo menos cerca de 14 pb podem ser usadas para o despiste de ácidos nuclsicos compreendendo genes de MSP’ relacionados ou partes deles, as quais incluem também o despiste de ro.FíNA codificador de

Para fins de despiste as sondas ds DNA foram marcadas radioactivamente no seu extremo 5^? por métodos conhecidos na área

32- __ usando gama p-Aip e cinase ds T4» Os microorganismos hospedeiros ou fagos portadores de ácidos de nucleicos do presente invento como uma inserção foram identificados por hibritíação com a sonda de DNA marcado das réplicas em filtro da biblioteca de genes.

As condições de hibridação usadas foram as convencionais e podem ser mais ou menos restringentes, e.g» simplesmente escolhendo diferentes temperaturas»

A parte hibridante de um clone de cDNA da biblioteca que híbrida com a mistura de oligonucleótidos foi parcialmente sequenciada de sctjrtíD com métodos convencionais-, A sequência determinada compreende quase todo o gene funcional de MSP, A sequência está descrita na listagem de sequências SEQ ID NQ1,

A inserção EcoRI/Sall de 3,5 Kpb de L, lactis pode ser isolada a partir de clones positivos de uma biblioteca genómica por digestão com EcoRI s Sall e subsequente purificação da inserção de acordo com métodos convencionais e pode ser ligada num vector adequado, e.g» em M13mpl8 para gerar M13mpí8RS ou em pUCÍ8 para gerar pUCRS.

Igualmente, qualquer outra inserção de L. lactis compreendendo sequências de MSP, por exemplo derivadas maiores, variantes ou fragmentos da inserção EcoRí/SalI de 3,5 Kpb ou moléculas de DNA que hibridam com a inserção EcoRI/Sall de 3,5 Kpb ou que compreendem uma região de promotor que está naturalmente ligada a tal molécula de DNA hibridante pode ser isolado a partir de uma biblioteca genómica de bactérias do ácido lático.

'-íf'

Fragmentos da mulè-eulcí da DNA de Suordo uo® aj a ci podem ser obtidos de forma convencional, e.g. por isolamento dos fragmentos após digestão da inserção com exo- ou endonucleases adequadas, e = g = com exonuclease III, Ba.131 ou SI ou endonucleases de restrição, tais como Sau3A, HindiIX e similares. Os fragmentos podem também ser obtidos por síntese de DNA in vitro de acordo com métodos convencionais»

Os mutantes da. molécula de DNA englobados oor a) a c) aqui r «ter íuu inversão, delação, inserção uu mutações pontuais, podem ser preparados de acordes com métodos convencionais, por ?iTj o lí in vivu uu m por mutagéní dirigida (ver artigo de revisão de Zoller e Smith 1983, Botstein e Sbortle, 1985 ou Morris et al., 1983) usando oligonucleótidos iniciadores mutaqênicos ou por delecão de fragmentos de DNA entreos dois sítios de restrição cortando com as enzimas de restrição adequadas e reliqando o DNA, facultativamente em solução diluída»

Segue-se uma descrição detalhada da preparação d#

Uma molécula ds DNA recombinante de acordo com o invento compreendendo uma sequência cie DNA que funciona como uma origem de repl icação = acordo com métodos convencionais, e = q = como descrito por B s Doly CÍ979) com as modificações descritas nos exemplos e separados ds forma convencional, e = g» usando técnicas de c grafia, por exemplo cromatografia em Man ia. tis et al.

/ X X U B irnboim íiJF cí.fír

ΓΌΠΙ-S to—‘

La em gel de agarose como descrito «± = , (1982). 0 plasmídeo 2=5 Md ε o plasmídeo 5=2 Md foram isolados e fragmentados ds acordo com métodos convencionais»

- ·.< C λ

As misturas ds fragmentos assim obtidos foram ligados com um vsctor adequado de- acordo com métodos convencionais, e»g» como descrito em maniatis et al», (1982) e estas misturas de ligação foram usadas para transformar de forma convencional uma estirpe hospedeira intermetíiària-

Um vector adequado é portador de uma marca genética para selecção em bactérias do ácido láctico, e,g» um gene de uma marca ds resistência, por exemplo o gene de resistência è eritromicina e uma origem de replicação que não funciona em bactérias do ácido láctico mas antes numa bactéria adequada como hospedeiro intermediário para a clonagem ds fragmentos dos plasmídeos de L. lactís» Um vector adequado compreende também um gene ds uma marca para selecção no hospedeiro intermediário que pode ser idêntico ao gene da marca que funciona na bactéria do ácido lático» Um hospedeiro intermediário é por exemplo uma estirpe de E. coli, e„q, E = coliTGí s um vector de clonagem adequado é então umvector ds £== coli, por exemplo um derivado de pUCÍS portador de um gene de resistência à eritromicina, como seja pUC-383, a construção do qual está descrita nos Exemplos.

As células hospedeiras intermediárias que são transformadas com um vector compreendendo fragmentos do plasmídeo 2,5 Md ou 5,2 Md de L. lactis podem ser ssleccionadas facultativamentede foram convencional que depende do tipo de célula hospedeira intermediária e do vector usado. As marcas selectivas podem ser por exemplo marcas ds resistência ou genes codificadores de uma enxima que possa ser defectada, e»g, o produto do gene lacZ de Éreo li , ,β-galactosidadss, desde que o hospedeiro seja uma estirpe de E» coli defectiva no gene lacZ genómico» Os genes da marca sslectiva podem ser perturbados pela inserção de um fragmento de DNA» Se a marca for lacZ, as células hospedeiras portadoras de um vector com um fragmento inserido no gene lacZ deixam de ser capazes de converter X~Gal num corante azul e como consequência, os clones positivos em placas ds ag-ar contendo X—Gel permanecem brancas após indução da expressão do gene lacZ com IPTS»

Os vectores portadores de uma inserção do plasmídeo 2,5 Md ou 5 = 2 Md de L» lactis foram testados quanto ã sua. capacidade para se replicarem numa estirpe de L» lactis sem plasmídeos, s = g = em L. lactis 023@» Com esta finalidade os plasmídeos foram isolados a partir de um hospedeiro intermédio e usados para transformar células de L = lactis 0230 de acordo com métodos convencionais, e»g„ como descrito sm Powell st al», (1988)» Os vectores de replicação compreendem uma inserção de DNA derivada do plasmídeo 5=2 Md ou 2=5 Md de L= lactis que funciona como origem de repllcação» Uma molécula de DNA compreendendo esta função pode ser isolada a partir dos vectores de replicação, fragmentada, mulagenizada e sujeita a outros tratamentos similares e ser usada p-ara construir moléculas de DNA recombinante de acordo com o invento, e.g» vectores de clonagem ou expressão que se repliquem em bactérias do ácido lático» As origens ds replicação derivadas do plasmídeo 2=5 Md ou 5=2 Md de L = lactis são também funcionais noutras bactérias para além das do ácido láctico, e»g» sm Bácillus spec» ou E» coli» Portanto, os vectores compreendendo tais fragmentos de DNA podem ser usados como vectores vai-vem»

Os fragmentos do plasmídeo 2=5 Md ou 5=2 Md portadores de uma origem de replicação podem também ser identificados e isolados de acordo com o método descrito atrás a partir de uma mistura de fragmentos que foi obtida por fragmentação do total de plasmídeos de L. 1actisLL712» Os fragmentos clonados portadores de uma origem de replicação derivados do plasmídeo 2»5 Md ou 5=2 Md podem ser determinados por hibridação dos fragmentos clonados com os plasmídeos do conjunto de plasmídeos derivado de t. lactis L.L712 que foram separados num gel de agarose ou por comparação do

acorc-o com ο

2.5

As moléculas de DNA recombinante dt invento que compreendem toda a. seqiféncxa de DNA do plasmídeo Md ou 5»2 Md de L» lactis ou de um plasmídeo do mesmo qrupo- de incompatibilidade do plasmídeo 2.,5 Md ou 5,2 Md podem ser obtidos por exemplo cortando o respectivo plasmídeo com uma endonuclease de restrição adequada e ligando-o por exemplo com um fragmento de DNA compreendendo ufft pene estrutural homólogo ou heteróloqo, uma região do promotor ou sequências de vsctor ou com um adapcaoor ou simxxares» têm apenas um sitio ds olasmídeo.

As endonucleases de restriçãc í i ! t_O i sTicc⁵} i UtJ a d e q u a d a s ulxvsqeHi no respecc

Uma molécula sequência com a função dt=· DiMf-i 'f «_ΰίΓιυΧΓ(3Π Lh c cíiípf -~ei ;Q de oriqem de replicação derivada do Md pode ser obtida por exemplo por um método compreendendo a preparação do conjunto de plasmídeos de L, do plasmídeo 2=5 Md ou 5=2 Md, e.g. por cálculo do peso molecular por elsctroforese em gel de agarose, fragmentação do respectivo plasmídeo, e=q= com enzimas ds restrição adequadas, preparação ds um fragmento compreendendo a função ds origem di ípl « S = G::

um dos fragmentos aqui referidos atrás e liqação de tal fraqmento molécula de DNA não compreendendo origem de replicação, e=g» um vector de clonagem sem a sua origem de replicação, e selecção das moléculas de .DNA que se replicam em pelo menos i_. lactis e em E, coli.

Os plasmídeos compreendendo uma oriqem de replicação do mesmo grupo ds incompatibilidade do plasmídeo 2,5 Md ou 5,2 Md

puderam ser identificados por não poderem ser mantidos junuaraente com o plasmídeo 2.5 Md ou 5=2 Md, respectivamente dentro da mesma cé1u1a = □ invento dis respeito também a utilização de uma molécula de DNA ou de uma molécula de DNA recombinante do invento para a preparação de vectores híbridos para a expressão de um gene estrutural« Exemplos de tais genes estruturais são dados abaixo. Os vectores- híbridos- podem ser preparados de acordo com métodos convencionais usando enzimas tais como enzimas de restrição, DNA—polimerases, DNA—liqases e similares.

Os Exemplos 4 e 5 descrevem de forma exemplificativa e mais detalnaaamente a preparaçao de vsciorss hionoos para a expressão de um gene estrutural em bactérias do ácido lático.

particularmente em L. lactis ou em Baci par ti cui ar menB. thurir.qiensis.

Hosped e i r os t r -a n s f o r m a d o processos sara a sua preparaçao

U invento diz respeito a um hospedeiro bacterisno transformado com um vector híbrido do invento.

Qs hospedeiros bacterianos transformados de acordo com

o invento são a	dequados para	3 C	lonagem,	a<n:	plificação e	!/OU
preparação de um	vector híbrido	coínpr	eenoendo	uma	molécula de	DNA
rifôfxnids &Π1 â) -£»		ss h x	bridos pc	idem	Γ3P1Í CSΓ“S3

ressão selectiva na popula0 hospedeiro que pode ser contida no vector híbrido.

uma sequência de DNA com tirpe de E. coli, Baci 1 lustais hospeoeirus e não se perdem s-ob p cão celular durante· a proliferação, usado depende da origem de replicação No caso do vector híbrido compreender uma função de origem de replicação de ro -adequado é por exemplo qualquer es spec = ou Lactococcus spec. que não contenha ura plasmídeo com uma origem de replicação do mesmo grupo de incompatibilidade»

No caso do vector híbrido compreender um gene estrutural homólogo ou heterólogo fundida numa grelha de leitura correcta cora a sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal de MSP, um hospedeiro transformado do invento ê tal que è adequado para a produção de uma proteína secretada homóloga ou heteróloga, e»g» uma estirpe de L= lactis»

Ura exeraplo de ura hospedeiro cotransforraado de acordo cora o invento é uma estirpe de E» coli, e»g» TG1, C60® ou HBÍ01 transforraada cora pUCRS, pSC12, pSC12deltaP, pSC12deltaN, pSC12deitaMP, pSCÍS, pSCISdeltaN, pSCiSdsltaP„ pVAHIR, pVAHIR-1, pSC12HIR, pSCÍ2HIR-l ou pSC12HIRTerm ou L. cremoris ou L» lactis sem plasmídeos, e.g» L» lactisLM025© ou uma estirpe de Bacillus,

e.g» Eh_thurinqíensis transformadas cora ura destes plasmídeos» São preferidos E» coli ΊΈί transformada cora pECRS» L» lactis transforraada com pUCRS, pSC12HIRTerm, pSC12 ou pSCÍS e B» thurinqiensis transforraada cora pvAHIR ou pVAHIR-1» invento também diz respeito a um método para a preparação de tais trsnsformantes compreendendo trataraentode ura hospedeiro era condições de transformação cora uma molécula de DNA recombinante do presente invento, espscialmente um vector híbrido do invento, facultativamente juntamente cora ura gene de marca selectiva e selecção dos transformantes»

D^Cssso._par^^_j3r(^raçãcLjs_.£2ll2^t.ÍQeos.

O invento diz ainda respeito a ura método para a preparação de ura polipeptídeo, caracterizado por ura gene estrutural ο' ο

homólogo ou heterólogo ser fundido na grelha de leitura correcta com a sequência ds UíMfi codificadora do peptídeo sinal de MSP, que um hospedeiro hacteriano gram-positivo adequado por exemplo um hospedeiro lactococus, e =g« L. lactis LM0230 ou Bacillus spe nrompreendendo tal gene fundido e por o polipeptideo codificada peio referido gene ser secr '! pelas células hospedeira·:

Quando nsusíssáno, ο polxp^pfitísu é isuladu a partir do subrena·dante de acordo com métodos convencionais» Numa realização secreta uma protesse no seu meie proteína expressa„ u 11 u ra a q u a 1 d e g r a d e preTsriQâ ao xnventx g» dessulfato-hirudina, que são secretarias pelas células de L = 1actistM0230 transformadas com um vector híbrido do invento compreendendo um gene codificador de tal pr o te í n a, e »gpSC 1 2HIR, pSC 12HIR-1 ou em pa r t i c u lar póL.- λ kn ι η I e. m» L.*Oi icen cr apões L-S uessui Tau_?~niruaina -áLLivi pudam ser obtidas a partir do sobren-adan te de culturas na fase estacionária de células ds L. lactisLMo25®t transformadas com pSC12HIR ou p-SC12HIR—i·.. Mo sobrenadante das células de L» .lactis transformadas com pSC12HIRTerm a concentração de aumentou. Surpreendentemente,

Tal realização po r e x em pio.

produção da proteínas.

dessu1fato-hirudina s níveis dos produtos ds genes heterólogos, e«g« dessulfato-hirudina, não decrescem após incubação prolongada, e»g= durante a noite, das culturas em fase estacionária indicando ausência produtos dos genes heterólogos no sobrenadante.

Numa outra realização do invento as células podem ser colhidas a partir do meio nutritivo da cultura na fase logarítmica ou na fase estacionária, e«g« por centrifugação ou filtração e ressuspenso num volume mais pequeno» e«g» em cerca de iX s. 20Z do

volume de cultura original, de meio nutritivo fresco ou solução tampão adequada. A incubação das células ressuspensas resulta num aumento do rendimento do produto do gene heterólogo que é secretado para o sobrsnadante. Por exemplo, numa cultura de L, lactis LM®23® transformada com pSC12HIR pode ser obtido um aumento da quantidade de dessulfato-nirudína no sobrenadantí de uma cultura na. fase estacionária forem colhida? qação, ressuspensas em cerca de 1/1® do

Sj S? -xíto CÍ t? j. tA X ct fzj por centrifufresco e incubadas durante cerca de õ® min. a cerca de iUi Uf X i *·

Uma outra realização do invento é a produção de MSP que ê secretada por células hospedeiras qraia positivas transformadas com um vector híbrido do invento, e.g. pUCRS, de acordo com os métodos descritos atrás.

Uma outra realização do invento é a produção de dessulfato—hirudina em B =, thurinqiensis, de preferência na estirpe HDí :ryB CDSM 4574) transformada com pVAHIR ou pVAHIR-1

Breve descricão das fiquras

Figura ís Mapa físico do plasmíd publirC&ns do mapa.

são aproximadas e dadas em Kpb, A fracção ds pUClQ estende—ss desde a posição ® do mapa até ã 2,7 e a fracçãode pVA838 portadora do qene ds resistência àeritromicina estende—se desde a posição do mapa 2,7 até 4,4, Ds sítios ds restrição apresentados entre parêntesis foram destruídos durante a preparação da molécu_ _ _______ ____ __ _ _ __ Π ΐ^ί j da resistênc' ' · - - - >

cina; ori„,,_ la recombinante. Os significados das abreviaturas sãos amp ι à ampicilina? ery* gene de resistência a eritromi origem de replicacão derivada de oUCÍS.

Figura 2s Mapa físico do plasmídeo pSC12. As posições do mapa são aproximadas e são dadas em Kpb» 0 DNA ds pUCJS estende-se desde a posição v até à posição 2.7. 0 fragmento portador da resistência à eritromicina de 1,7 Kfodo pvA838 estende-se desde a posição 2.7 até 4.4. A inserção derivada do plasmídeo 2=5 Md de L. lactis estende se dBSBs a posição 4.4 axe 8.0/v. Us sítios de restrição apresentados entre parêntesis foram destruídos durante a preparação das moléculas recombinantes. Os significados das abreviaturas sãos PL1, região do poliadaptador de pUC do sitio EcoRI até ao sítio CSmal). F‘L.2, região do poliadaptador de pUC desde o sitio íSmal) até ao sítio Sphl? amp' , gene ds resistência à ampicilina? sry , gene de resistência a eritromicina? ori = origem de replicaçã derivada de pUC? ori origem de replieação derivada do plasmídeo 2.5 Md de lactococos conforme deduzido da análise de Í3 td X 5 O Figura 5s Mapa físico do plasmídso p8C18. As aproximadas e são dadas em Kpb. 0 DNA de pUCÍS estende-se desde a posição ® ate à posição 2.7. 0 fragmento portador da resistência â eritromicina de 1,7 Kb do pVA83Q estende—se desde a posição a té 4.4. A ί ϊ s s s rç S o d er x v ad a d o smídeo 5.2 Md de L. lactis 'J estende—se desde a posição 4.4 até à posição íá.5/0» Os sítios de restrição apresentados entre parêntesis foram destruídos durante a preparação das moléculas recombinantes. Os significados das abreviaturas sãos PL1, região do poliadaptador de pUC desde o sítio EcoRI até ao sitio CSmal)s F'L2_? região do poliadaptader de pUC desde o sítio (BamHI) até ao sítio Hindi II § amp¹ , gene de à sritromiciresistência à ampicílinas ery^f, gene de resistência nas ori

PUC jrigem de replieação deriv-ada de pUCs ori^, oriqem de replicaçãp derivada do plasmídeo 5=2 Md de lactococos conforme deduzido da análise de deleção.

í i^; V λ

«Pre ν3. a tur aí dhiTF' trifosfato ds desoxinucleótido

HPLC cronsatograf ia líquida ds alta resolução

IPTG isopropi tioga 1 ac topi r-anosido

Kpb Kilopares ds bases k D K i I od a 11 on s

LB meio nutritivo de Luria em caldo (Gibco/BRL)

Md Meq a. d a I ton s sCD23 CD23 solúvel, i„e = factor de ligação a IgE de 25 K SLPI Inib-idor ds leucoproteinas-es secretado

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente invento, no entanto, eles não deverão ser pensados como uma Iimitação ds1s «

Materiais e Métodos

J

L„ lactisLr	10230	é um derivado sem	ρ1ssfflídeos	de L.
1ac t i s C2 íE f sta h iou	J. D«	e L»i_ = McKav, 1977)»	Ela foi dep	ositada
n a Deutsc he Sao 1 unq	von	Mi k r oorq an i seien und	Z e 11 k u 1 tu r e·	n Cver

iaqui sm diante)

L« 1actisC2 (NCDU2031) e L» 1acfisLL712 que mais tarde serviu como fonte dos pls.s-mid<

nts relacionados	ou	i d's'n 11 c os (
imeiro foi obtido	por	exemplo dai
ganisms, UK CiMCDD	207,	1) i; este ώ 11

fius v»o Md s o«2 Mo, sáu estreita.= Davis et al·.,, 19S1)= n

Sammlung von Mikroorganismen und ielIkulturen (ver ã frente) ε, uoilTBl teflf! o isnófcipo

- iíO·'' ac-proí junith i 5 hsDb/F⁵ traD3á = ρroAB ₅1acI„1ac ide1taM 1 b ii adquirida

Amersham? está descrita no manual DXiqonucIeotide—directed in

Métodos Gerai:

j rans τorsisação rsuada rl s r* π Σ··· rs r\ cloreto de cálcio como descrito em Maniatis et al», Cí9tí2)

A transformação da estirpe de lactococus foi realizada R por electrcporação usando um sistema Gene Pulser da BioRad e sequindo o seu orotocolo cara L» lactis LM©23©«

Preparação de plasmídeo

O uNA de plasmídeo de E= coli foi oreoarado de com o método de Birnboiai e Doly (1979) = :oroo □ mesmo método foi usado para o isolamento de plasmí· deos a partir ds lactococos com as sequintes modificações:

a) Culturas crescidas durante a nc Sadine, 1975) a 30°C» diluídas a li durante mais duas horas» em meio M1/-G («erzaghi

b) Incubação com lisozima foi realizada também na presença de mutanolisina (50 mq/ml) durante 10-20 min a 37°C.

Preparou-se um conjunta de plasmídeos pelo mesmo itodo e a fracção de plasmídeo foi ainda purificada por centrifugação «I

Í96v)» Os três plasmídeos mais pequenos <1.8 Md, 2,0 Md, 5=2 Md? Gasson, 198-3) foram enriquecidos na fracção de plasmídeo purificada enquanto os dois plasmídeos maiores C9Md e 33 Md 5 Gasson,

198-5) estão presentes em quantidades menore

•J pVA838 CATCC 37íô©| Mac rins et al»₃ 1982) é um ρ las-mí deo ds Isctococos portador do gens da resistência á eritromicina expresso constitutivamente num fragmento de restrição Av-al/Hind 111 ds 1,7 Kpfa» Cerca ds 1© μα de DMA de pVA838 foram digeridas com Aval e HindlII. Ds extremos dos fragmentos de DNA foram tornados cerses com a enzima Klenow na presença dos- quatro dNTPs. Os fragmentos foram separados num gel de agaross e o fragmento Aval/HindIII ds í_?7Kpb foi recuperado do gel por electroeluição»

Cerca de 2©@ ng do referido fragmento e í©© ng de pUcltí cortado com Smal (Norrander et al.) foram ligadas na presencia ds ligase ds T4 como sugerido por Rusche et al. e a mistura de ligação foi usada para transformar E. coli TQl. Repicaram-se colónias brancas de caixas de agar L.B contendo X—Sal, IPTS e 1Θ© mg/ml de ampicilina. Os clones correctos foram identificados por isolamento, análise do seu DNA de plasmídeo e fcapacidade de crescimento em placas- de agar LB contendo eritromicina <1©© mg/ml). 0 plasmídeo resultante foi designado pUC838= Qs sítios de restrição e carac ter is ticais ds pUC83S estão apresentados na Figura 1„

í.2 Construção de pSd

LUtij Lu ê ut de pxasmíd partir de L.» lactisLL7í2 ΐ or am separados nu<n gel preparativo de

agarose» A segunda banda de DNA forma ccc do plasmídeo 2,= 5 Fití» Retirou-se do gel e foi electroeluido» A digestão deste plasmídeo com Sphl e electroforese em aqarose revelou um único fragmento de 3,5 Kpb indicando a

iVaUteí»!	por Sphl
0 Sohl	e tratado
5fc? nq	de vector
til ds	3,5 Kpb do

pUCS38 foi cortado no seu único sítdn com fosfatase ds intestino ds vitela» Cerca ds tratado com fosfatase e 15® rsg do fragmento S plasmídeo 2.5 Md foi ligado com ligase ds T ligação foi usada parai transformar células competentes de coliTSlA mistura de transformação foi cultivada a 37*C em 1 de LB durante 90 minutos e depois transferida para 200 ml de de

E»_

ÍT* t

Jit ~

LB con t en d u 1®® mg/1 noite» 0 DMA ds de eritromícina :rescxoa a 3/^!-o durante plasmídeo foi preparado a partir das células desta cultura e cerca de 2 μα foram usados para transformar lactis LM0230» As células transformadas de L= 1 ac tisLI-1o23o f seleccionadas 3 3®°C em plac<

e ri tromic i n a» de aqar M-l/S contendo 5 mo/ml de

SJ DNA de plasmídeo fo:

d© clones das células transformadas de L» Iac11sLM0230 e sujeito a análise com enzimas de restrição» Todos os transformantes investigados continham um plasmídeo de 8,0 Kpb, pSC12, do qual foi recuperada a inserção Sphl de 3,5 Kpb» Na Figura 12 está apresentado um mapa físico de pSC12» pSCi2 pode passar várias vezes de coli e vice-versa sem alterações do padrão de restrição»

1,3 Construção ds pSClí

DMA do conjunt jfliídeos dt

Íacxxsi id i /12 fox pareialmente digerido com 5au3AZ por incubacão de quantidades de 500 ng ds DNA com diferentes quantidades da enzima de restrição, O As amostras contendo DNA parcialmente cortado foram identificadas num gel de agsrose. Este DNA foi ligado ao vector pUC838 que foi previamente cortado no seu único sítio BamHI fosfatase alcalina de intestino de vitela» cratado com n cranstormac de fc., coli, isolamneto tío p1asmídeo e subsequente transformação de L, lactis LM023® foi realizado como descrito para pSC12» Novamente, realizaram—se digestões ds restrição em DNA de plasmídeo isolado a partir de vários clones dos transforroantes de L = _ lactis, Eles são portadores- de usi plasmídeo de 8,8 Kpb, pSclS» A passagem do plasmídeo várias vezes ds L» lactis para E» coli e vice—versa não resultou em quaisquer alterações do padrão de restrição indicando estabilidade da construção em ambos os tipos ds células» Na Fig, 3 está apresentado um mapa físico de pSC18» lentiíicação ds oriqens de replicação de lactococuss enaxxse por dejeção qsísçSo de pSCi2 e oe obUiS

As regiões nos plasmídeos pSC12 e p8C18 portadoras das origens de replicação de lactococos foram definidas pela análise ds delecão como se seques

DNA entre os sítios de restrição adequados foi zortando os plasmídeos com a correspondente enzima de strxdos sítios ds clivagem com enzimas de restrição em pSCl2 e pSCIS ção e recirculari zsrân com Ixqase de i4,

A λulcii xzaçcio aproxxmada estão apresentados nas Figura Tabela 1»

Μ

-J

‘s pec c x vamen re ?

pBCÍSdsXt-=Ãh^! & p-SClBctelter ΐον'β.ι'π constriddοϊξ- por doloção do DNA entre os dois sítios de restrição FvuII na parte pUC18 dos plasmídeos pSC12 e pSCÍB, respectivamente» removendo assim as origens de replicação derivadas de E. coli»

Em pbC12deltaN e psClódeltaN o fragmento mais pequeno

Mdel do pSC12 s do lactococos de pSul2» puu jpecci vsffiSs ί ί_ΐ2 5 Torsi» removiduí fragmento EcotíV no DNA de

Em pSC12tíeltaNH removeu—se DMA entre o sítio F'vulí em

JC e o sítio Ndel na parte ds lactococos do pSCÍ2» Neste caso o DNA vector foi dotado de extremos cerses com a enzima Kleno^f <sn tes da re 1 xqacáo»

Um outro derivado de pSCíS? pbL-lSdel taH, não possui DNA entre os sítios HindiΙΣ no plasmídeo»

DNAs de plasmídeo mutagenizados- foram primeiro dos transformantes de E» coliTGl que são resistentes a eritromicina» Foi então testado s-e eles- oodiam ser usados para cransformar l,» 1 actis-Ls402-5^;3 relativamente -a. resistência à eritromicina» A ausência de transformação foi assumido como xnoicando que a origem de replicação de Isctococus foi removida pela deleção» Quando são obtidos transformantes

IGdO5 OS isolados a partir ou. destruída resistentes a eritromicina o piasiMeo svamnete xsoiaoo e sua inteqridade estrutural onTirmada por análise oe restriçãt

Tanto para ο plasmídeo

Md como par identificada uma região necessária â repliuaçáo ksi ^hep· Do facto de os derivados tíeltaP poderem replicar-se em E. óbvio que as origens de lactococus clonadas podem também nar na bactéria gram-negativa E» coli»

Ds resultados desta experiência estão apt

Tabela í»

Tabela is Resultados da anâlií

Plasmídeo Região eliminad;

Fragmento eliminado'' po'L i 2 nsnnuma pSC12dsItaP pSCÍ2deltaN p>SC 12d e 11 aR

PvuII (0,1), PvuII (2,5) Ndel (0,2), Ndel (6,2)

Ec oR V C 5,0), Ec oRV (7,55 pSC 12de 1 t-3'ΝΡ Nde I (6,2), Pvu II (2,5) pSC18 nenhuma pSClSdeltaP pSC1bde1taN pSCÍSdeltaH

PvuII (0,1), PvuII (2,5) Ndel (0,2), Ndel C7,5)

HindIII O), HindIII (ó,5>

:Md foi lOCDCDS , ml -i a

Tuncioíentaaos

Keplicaç: plssmíds rtli L

ND' o em

Isctí s

As deleçSes estendem—se entre os dois sítios de restrição. As posições aproximadas dos sítios de restrição em pSC12 ou pSC18 estão apresentadas entre parêntesis como distâncias até ao HindIII na fracção dos plasmídeos derivados da p!JC83 que definida como a posição (0)» Eles estão relacionados com as posições de bases dadas na Figura 2 e 3, res-psctivamente»

Comprimento aproximado do fragmento eliminado em kpb.

Não determinado» χ τ n

j.

— »4~?

ϊ-onte das origens de re

I Λ . UJLULUb

A origem ds replicação em pSC12 deriva do plasmídeo 2»5 Md de L» lactis-LL712 conforme descrito no protocolo de isolamento do fragmento de DNA portador da origem» padrão de clivagem com enzimas de restrição indica que a origem de repl icação em ρ-SClB derivai do plasmídeo 5 = 2 Md»

z.«a Repiicaçáo oe Pd--12 e PSt-18 noucros isccococus lactxcos creiT;oris foram transformadas com êxito usando ambos os plasmídeos» Os plasmídeos permanecem estávelmente associados com a população celular sob pressão selectiva»

3» Clonagem do gene codificador do príncipal produto de secreção

CMPS) de L. lactis LMÔ233 'solamenfo da principal proteína secretada (MSP5 de L» lactis dos em

... Λ.

1,5 1 de uma cultura crescida durante f _ lactisLM ‘3230» cultivada a 3S°C em M-17G, foi cenrifugado num rotor Sorvall GS'3 a 7000 rpm durante 23 minutos a 4^&C» 0 sobrenadante foi colhido e as proteínas precipitadas pela adição de um volume igual de ácido tricloroacético a 107 e incubando durante 30 minutos à temperatura ambiente» 0 precipitado foi colhido por centrifugação num rotor Sorvall GS—3 a B 000 rpm s 4°C durante 30 minutos» Os sedimentos de proteína foram escorridos e redissolvi> ml de tampão de amostra com SDS (aemmli, 1970/. A amostra foi neutralizada pela adição de uma pequena quantidade de NaOH 4IM e depois diálise durante 4 horas contra 4 1 de 25 mM

Tris—HCl dH 6,3, 0,02% 8D3» A amostra recuperada tinha um volume de aproximadamente 4 ml ,= Adicionou—se smpao de amosií

- OÍÍÍ O amostra para aumentar volume para 6 mi.

w •J

As proteínas foram separadas fazendo migrar quantidades de 2 ml géis preparativos de 8% deSDS—poliacrilamida ÍLaemmli, 1970) usando uma célula Protean da BioRad, Cortaram-se pequenas tiras ao longo do gel, coradas com Coomassie Brilliant Blue e descorado numa solução aquosa contendo 1Θ7 de metanol s 10% de ácido acético» Elas serviram como marcadores para identificar e cortar a principal banda proteica com um peso molecular aparente de aproximadamente 56 KD que foi retirada do gel» proteína MSP foi recuperada do gel po

----.?---- ?------- -------- u ££ -- — ³------ ’ mM e

150 V durante 2 horas usando um sistem contendo acetato de amónia 2© mM e 0_s©íz dializado durante 43 horas contra duas mudas de aceta proteína dializada migrou nun

2@ mM, 0,005% SDS» Uma amostra da

Siotrap e um tampão

Biotrap

SDS» G eluato ato de amónio foi gel de 8% SDS-PAGt e observou-se uma única banda proteica com um peso molecular apa muito beis! deíinxd KD» ípar feíiíte de apr de aproximadamente

5,2 Analise da sequência do extremo amina de MSP

A sequenciação do extremo amina da proteína MSP isolada foi realizada de acordo com métodos convencionais usando um sequenciador de fase gasosa (Applied Biosystems Inc», Modelo 470A) com quantificação por HPLC dos derivados de feniltio-hidantoina dos resíduos de aminoácidos clivados,

A sequência de 2tí aminoácidos de comprimento obtida és

AS

-Lis—Ala— Sln-Ala-Bln—Ala—G?ln—Vai—Asp» Os dois primeiros âuiinoácxóos e o amxnoâcxdo na pusiçâo 10 gue sscso indxcaoos i_U»i n'ao Tora® aeterroinasos.

3.3 Síntese de uma sonda de oiiqonucleótidos mista

Com base na sequência de

i.: t UC··.

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jX·*— X i- ^**7'	”A x ·Ξν
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4· fsf €---ZZ.CO	£=.- i
de uma	zJ X
. no 2 o·--	ΠίΕΓΟ
. dos 4	dMTP
:ncia de	nu

D X 1O“

-Sln-Asp-Ala-Tre-Ile, que corresponde aos amirx 5 a 13 na sequência do extremo N de MSP, projectou—se truiu.—se um oligonucleótióo misto para o despiste de uma raro riso FtKbCí 7 rv ·~ csó ti—«=« » í r~_s zc- riss«t rhiae ?-er->-=z τ r~#

tidos da	mistura de	ol igc	jfhXu xtóo 5~
SAN. SCI X	AC. N1 é T í	ou C?,	K! ·*· ~r í«._t fcs 1
senta um	nucleótido	com	a base
c itidina	« lá CUUS (áLító-SnitxS-XHcã S I CQ?

Λ-J C , ou A 5 N._T

A TN», tJUl AAhU CAN-y

Zs Zt e A ou G = A repre— com tiiBxna, C com

3„4 Construção ds uma biblioteca genómica de

Íactis LM®230

L>N’r

•sóntico foi	JL ~’ 1 -S d o	a cartir de	L.	lactís
.1.do ?	protocolo	usado para o	isol	·5’Τΐ’Ξ:Π to
. tratamento	c om 1 i so	cima e mutarx	□ 1 isi	Π %·& & E*
das durante	duas hora	s a tfâ’-‘C com	prot	einase

de plasmídeoss a· cé 1u1as foram inct K Cl®® mg/ml) em í© mM Tris—HC1 pH S, 2D- mM EDTA, 0,05% SDS. 0 DNA foi extraído uma vez com fenol/clorofórmio (1 vols Ivol) e depois purificado por cenrifugsção em gradiente de densidade de CsCI.

□ DNA cromossómico foi parcialmente digerido com SauóAI e fraccionado de acordo com o seu tamanho em gradientes de

sacarose como descrito em Maniatis» Gs fragmentos que tinham cerca de l©-2© Kpb foram colhidos»

DNA de lambda EMBL3 foi clivado com BamHI e EcoRI e purificado por extracção com fenol e precipitação com etanol» Foi então ligado com os fragmentos de í©-2©Kpb na presença ds hexami·nacobal toC ϊ 11)cloreto para favorecer a. formação de concâtemeros»

ÍRusche J»R» et al», 19855» A mistura de ligação foi encapsidada P in vitro usando o sistema Sigapack Plus' da Stratagene»

Os recombinantes foram seleccionados por sementeira da biblioteca em £„ coliG359 CKahn J» et al», 19305» Obteve—se um total de cerca, de 6©© ©©© fagos recombinantes»

3ft5J>esaiste__Ja_&jMliateça__^ _sggulncias^de___DNA

SPdlfiÇã.doras.de MSP

Cerca de ío ©O© piscas ds lambda. EMBL3 recombinantes foram semeadas por placa de petri Cío cm cie diâmetro) e transfeP __ „ ridas para membranas Plaque Screen'' CNfc.N.5 » Us filtros foram despistados por hibridação com a sonda ds oligonucleótidos mista descrita no Exemplo 3»3 que foi marcada com Cgama^PjATP usando cinase de T4 ds acordo com processos convencionais descritos em Maniatis et al» <19825=

As placas positivas foram identifiçadas e sujeitas a uma segunda volta de despiste a uma densidade ds placas baixa»

Preparou-se DNA a partir de fagos positivos, digeriu-se com enzimas de restrição e submeteu-se a análise Southern como descrito em naniatis» As transferências Southern foram despistadas com a mistura de oligonucleótidos» Ela híbrida com um fraqmento EcoRIZSalI de 3,5 Kpb na inserção de L» lactis de ura fago

positivo„ Mais ensaios de despiste mostraram um 'fragmento HindiII de 2,1 Kpb dentro do fragmento EcoRI/SalI de 3,5 Kpb que híbridou com a mistura de ol ioonucleótidos»

As distâncias aproximadas dos diferentes sítios de restrição ao extremo cortado com EcoRI do fragmento EcoRI/Sal I de

3,5 Kpb foram determinadas por electroforese em gel de agarose após digestão do fragmento com as respectivas enzimas de misturas de enzimas adequadas» 0 extremo cortado com EcoRI dista cerca de 0,5 Kpb do sítio Hindi II_s cerca de 2,6 Kpb de um segundo sitio Hindi II e cerca de 3»15 Kpb de um terceiro sitio HindIII»

3.6 Construção de oUCks

DNa de um fago positivo foi digerido com EcoRI e Sall» □s fragmentos de DNA foram searados num oel de 0,6% de aaarose e o fragmento EcoRI/Sal I de 3»5 Kpb foi cortado do gel e isolado por electroeluição» Um excesso molar de três vezes deste fragmento foi ligado a pUC19 que foi cortada com EcoRI e Sall ε com fosfatase alcalina.» •J

A mistura de iigação foi u&ads para transioreiar E_«_ coliTSl e os transformantes foram seleccionados em placas contendo 100-mg/ml de ampicilina» D DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos transformantes e realizadas análises de restrição para a construção correcta que se designou pUCRS»

E, colifSl transfarmada com oUCRS foi depositada na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zel 1 kuituren ÍES?¹!) =

j~'r udufct) d© Saur«ção ( MSP )

3,7 Seq uenciação do gene do Pri η o ip

A sequenciacão foi feita, pelo método de terminação de caosias CSanqer r» ec //) usando Sequensse' da USBC.

fragmento EcoRI/SalI de 3,5 Kpb preparado como descrita no Exsplo 3,6 foi subclonado em Mi3mpl8» 0 plasmídeo resultante foi designada MÍ3mpl8RS» 0 fragmento Hindi II de 2,1 Kpb do fragmenta EcoRIZSa.ll' de 3,5 Kpb foi clonado em M13mpl9» o plasmídeo resultante e M13mpl9Hr. Serou—se uma série de deleções unidireccionais a partir do extremo extremo Sall da inserção em M13mpíSRS por digestão do DNA com exanuclease III e SI CHenikoff, 1934, Yanisch-Perron et al,₅ 1985)= As deleções estendem—se cerca de 2Kpb para a inserção, A sequencisção destas deleções a partir do iniciador universal mplS deu informação acerca da. sequência de uma cadeia. Com base nesta sequência sintetizou-se uma série de oligonucleótidos sintéticos que serviram como iniciadores da sequência da segunda cadeia» Obteve-se informação adicional sobre sequências por sequencisção das deleções exoIII—SI geradas a partir de Mí3mpí9H com o mesmo método» A sequência de DNA de um fragmento de 192© pb do fragmento EcoRI/SalX de 3,5 kpb está descrita na listagem de sequências sm SEQ ID nSl„ Ela compreende parte da região do promotor de MSP, a sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal ds MSP e o gene estrutural de MSP madura.

A análise da sequência de UNA con? cerca de 2kpb de comprimento revelou a presença de uma única grelha de aberta ÍORF) codificadora de uma proteína tendo 461 resíduos ds aminoácidos» A comparação da sequência ds aminoácidos deduzida com os dados obtidos a partir da sequenciação do extremo N de MSP isolada identificou uma forma madura da. proteína com 434 aminoáiSX *CLt r~-3 cidos que é precedida peptídeo formado po?·'

Λ. _ _ mesma, grelha por 2/ aminoácidos, U últimos aminoácidos tem a estrutura kJ ui

pica de um peptídeo sinal. Us resíduos carregados foram encontrados no extremo N enquanto o resto da sequência consiste principalmente em resíduos de aminoácidos hidrofóbicos. A cospo•bíoSUj em noácidos ã volt-s do oítio do clivagem seciue ·;?--· regras deduzidas dos outros eptideos sinal CVon Heijne₅ 19835»

4« Produção de dessulfato—hirudina lactis recombinante em Lactococcus

4.1 Construção de plasffiideos de secreção de dessulfato—hirudina

U plasmídeo R13 mplVH contem um fragmento Hxndlll de

2.1 Kpb codificador da metade do extremo N de MSP incluindo o peptídeo sinal e cerca de 1,5 Rpb de DNA a montante. fc.ste plasmi— deo é clivado no seu único sitio Seal 129 pb a jusante do extremo

COUH do peptídeo sinal. Um fragmento

IJU Ufc %s?X t.( cerses codificador da informação genética da dessulfato—hirudint foi isolado a partir do plasmídeo pML3ÍO (publicado Patente Eurooeia EP—A—168 342) e inserido no sítio do M13 mplPH» Uma fusão na mesma grelhi sequência de DNA codificadora do peptídeo sinal de MPS e o gene estrutural da dessulfato-hirudina foi criada através da remoção do excesso de DNA separando o codão do último aminoácido do peptídeo sinal (Ala) e o codSo do primeiro aminoácido d fato—hirudina (Vai) . Isto foi conseguido ^or eiuíanénese com ol iqonuc leótidos- in_vitro usando no roo xoo os r 11 v 5 H m 8(2 a. 1 ⁵-í =Pd'SbX diriqida da Amersha»!« 0 oliqonucleótido de 2v pb compreende as últimas 14 pb do peptíd sinal e os primeiros 15 pb do gene da hirudina. A sequência da fusão resultante está descrita na listagem de sequências em SEQ 1D N22, fragmento HindiII portador da fusão foi retirado li iisSr

Ha

φ' f V inserção foram recuperadas» Us plasmideos resultantes foram desiqnados pSC12HIR e d-5C12HIR~1 » respectivamente»

Um outro plasmideo <pSCÍSHIRTerm) foi construído por inserção do terminador da transcrição trpA tíe E» coli (Pharmacia) no único sitio Hpal do pSCISHIR cerca de 125 ph a jusante do gene da dessu1fato-hi rud i na» toecreç-ao

55ui ra co-ηχr

Dur í = us plasmideos de fusão da dessulfato—hirudina foram visados para transformar L. 1 actisI~n0250. Os transformantes for-am cultivados em meio M—Í76 suplementado com 2/1 de glucose na presença de eritromicina (5 mg/ml) a 30°C» Quando as culturas atingiram qadas num estacionária» amostras oe

E—. n t. — ___ c. _ : HIJ, TUF CAHÍ USP; LF X í U.“ rSmuVlúQS S LOnQSiSuuS 3 — sobrenadantes de cultura foram As culturas foram então cultivadas ainda durante a noite antes de se retirar uma segunda amostra, centrifugar, remover o sobrenadante e congelar também» A produção de dessulfato-hirudxna foi determinado com um bioe-nsaio» biosnsaio mede a actividade ds inibição da trombina

pe1a dessu1τ a to—nx r	udina nos	3-0 b F* Of’? 3 tí 3 Π	ites colhidos·» Segue-	‘33 sã
apresentação ds um	protocolo	dtE t-—x í í-tódo	do bioensaxo o qual	é um
ensaio tíe inibição	da trombin

amostras e reagentes é ®,2n Tris—HCl, pH 7.,5 contendo t,0 M NaCl e 0,01/1 de albumina sérica bovina» A trombina é de plasma humano (Protogen AG, Laufelfingen, produto NS 80-13—1102), o substrato croroogenxco da trombxna e Lnromosvme To ídoehrxnger» riannhexm, produto N2 20084-9)» A p—nitro—anilina libertada a oartir de

Chromosym TH foi medida com um leitor ds microolacas Dynatech cão CNunc, olac

foram realizados em placas ds microtitulaMicroWell). Cada cavidade recebeu; 50 μΐ fí í=f 5= ~:Π Hfi

L 4~ί· carnpão, 50 μΐ ds sobrenadante com concentração desconhecida ue actividade inibidora da trombina, i. .e. dessuitato^-hiruflirsa e gl de solução ds trombina» A reacção começou pela adição de 150 μΐ de solução de substrato (330 uo/ml 5 e as placas· foram incuba— ajustada para dar uma A-„.nm==0,S±0«2 numa cavidade testemunha. 4tí5

Tanto a solução de substrato como ds trombina foram mantidas usadas. Uma curva padrão com concentrações conhecida rLTvr^G’^_'3dess.ulfato~hirudina (40. 20. 10, 5, 2 usada para converter aessui ta iQ~hiruo ma act i va..

Qfcf U.íFs-S e 1,25 ng/rnl) foi medições de OD em concentrações de

No sobren ad an te

células L. lactis LM0230 transformadas

OSC12HIR ou píSCÍ 2HlR— í foi determinado o mesmo nível de actividade de dessulfato-hírudik.!,-r - r. “ Hί-.-· .-ί.-—. ;:.t.-. s r 1 na. No soorenaaante oe uma cultura na

i.-4

T-3’= es t ac i on a r i a •foi aumentado em cer· nível de actividade de dessulfato—hirudina de 50%. Qs sobrenadantes das células transformadas com pSC12 serviu como testemunha sem actividade tíe dessulfato—hirudina»

Us níveis ds dessul ΐ aLu—hirudina no sobresiadcinte nãc decresceram após incubação prolongada durante 16 horas daí culturas na fase estacionária. Estes resultados indicam a ausênQeorauacác proteoíitica no sosrenaoante :tis

LMO230.

NtUuâ G-tpGu	riência,	as	células	foram primeiro colhidas
ρο r c Sn tr x f xtg -âç 3o o	Ú Ό OQ X £	rsss	uspensas	em 1/1*0 do volume ds meio
íresco e χΓίθυ.ο-”ί.ς:3ζϋ	a 3€s °C	dur	ante 30	min para um período de

expressão= Q bioensaio mediu um

;· v nivel cerca de seis vezes mais alto de actividade de dessulfato-hirudina do que nas experiências atrás descritas. Numa forma mais sofisticada, a concentração das células para um período d-s expressão ê uma maneiras de aumentar a concentração de produto secretado no sobrsnadante»

5» Produção ds dessulfato-hirudina recombinante em Bacillus t hu r i n q i en s i s

5,:1 Construção cio plasmídeo pVAHIR plasmídeo pVA838 (Macrina st al., 1982) foi digerido com HindiII e o fragmento ds 5,® Kpb portador do gene de resistência à eritromicina e a oriqem de replicacão ds Qram positivas foi aoíaoo pamr um ι ae *9,’ por e isc troeluição» □ fragmento Hindiii contendo o gene da dessulfato-hirudina foi isolado de forma semelhante a partir do oSCÍ2HIR»

Os dois fragmentos foram ligados na presença de ligase ds T4 s amistura ds ligação foi usada directamente para transformar L, lactis LM023® por electroporação» Os transformantes resistentes à eritromicina foram seleccionados e o DNA de plasmídeo preparado a partir deles»

As análises de restrição destes plasmídeos foram realizadas para identificar as construções correctas» Ambas as orientacSes da cassete de expressão Hindi II d-a dessulato—hirudina podem ser usadas para a produção de Dessulf atoforam obtidas

-hirudina em Bacillus thurinqiensis» Os plasmídeos foram designa dos pVAHIR ε pVAHIR—1=

tição ds dessuliatu—hirudxna oor B thurinqxensis

B» thurinqiensis estiro© HDí crv (DSM 4o74> foi xans

Tormada com pVAHlH usando «leutrupuração íW= Schurter sL al 1989 í _

	Os transformantss foram	seleccionados em=	olacas	LB
contendo ;	20 pg/ffll de eritr-omicins	a 27 C ou a. 30 '-'C »	0 DMA	ds
plasmídeo	τοχ ρ r e píxí r a d o a pa r 13. r	de transformantss	individu	tais

pelo mesmo método usado para L. lactis. As analises de restrição pVAHIR»

Qs transformantss portadores de pVAHIR ou de pVA838, como testemunha, foram cultivados sm meio LB contando 2G> mq/ml de sritromicina a 27*C durante a noite» as culturas foram diluidas a Ís200 para meio fresco e cultivadas a 30'^:’C» As culturas foram centrifugadas e os sobrenadante© foram testados relativamente è actividade de dessulfato—hirudina 7 horas após diluição»

A dessulfato-hirudina foi detectada no células transformadas com pVAHIR, enquanto que nenhuma no controle com pVA838»

Microorqanísmos Depositados

5D? ccíl-cíO-Sn Ci&í oi medida

Os microorganismos que se seguem foram depositado? acordo com o Tratado de Budapeste na. Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen (DSM), Ma-scheroder Weg D—3300 Braunschweigs

Hc

DepósiLu Nl coli K12TS1ZpUuRS

DSM 5803

Fsvereiro ,

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Listagem de Sequências

SEQ ID N21

TIPO DE SEQUêNCIA? nucleótidos com correspondente proteína COMF'KlMt.Ml 0 DA CADLlAs 19z^® pares de bases TIPO DE CADEIAS dupla

TOPOLGtí1A 5 Iinear

ORGANISMO FONTE DRISIMALs Lactococcus lactis LM023© íDSri FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA? Plasmídeo pUCRS (DSM 5803)

FOSIyííLS ND SENOMA; CARACTERÍSTICAS?

:romos£ i « 410 parte da região do promotor 411 a 491 peptídeo sinal de MSP

179-5 p ro ts ί n a nsadur 'OSSsyO }

PROPRIhDADESs Gene do principal produto 1aceis = < Rh”ó )

TTTAGGTATT TACGGAATTG CGACCTTATT

ATTGCTCTTT TTGTATATAA TATACAAATA

CTAATCGCTG GACAAGGCTT TTTACAACAA

GACCGCTTTT GAAGTTTTTA GTGCAATCAT

TTTGGATTTG CCCAACTTCA GTTTATCAAA

ACCAGTTAGC GCCTACACTT TTGCTCAATA

TGTAGCCTTA CAATTCCCTT TAGAAATCTT

AAGAAAAGTC ATGTAAGATA CAATTAGAAA

GTTCCCACTT	40
ACTATATTTA	80
TTATTATTGT	120
TATGACAGCT	160
TTTGTTGTTT	200
TTATCTTAGC	240
TTACAGATTA	280
GTGTTTTGTA	320

'O

ATCATAAAGA AATATTAAGG TGGGGTAGGA ATAGTATAAT 360

ATGTTTATTC AACCGAACTT AATGGGAGGA ΑΑΑΆΤΤΑΑΑΑ 400

AAGAACAGTT ATG AAA AAA AAG ATT ATC TCA GCT Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala

434

ATT	TTA	ATG	TCT	ACA	GTG	ATA	CTT	TCT	GCT	GCA
Ile	Leu	Met	Ser	Thr	Vai	ile	Leu	Ser	Ala	Ala
	10					15
GCC	CCG	TTG	TCA	GGT	GTT	TAC	GCT	GAC	ACA	AAC
Ala	Pro	Leu	Ser	Gly	Vai	Tyr	Ala	Asp	Thr	Asn
20					25					30
TCA	GAT	ATT	GCT	AAA	CAA	GAT	GCG	ACA	ATT	TCA
Ser	Asp	Ile	Ala	Lys	Gin	Asp	Ala	Thr	Ile	Ser
				35					40
AGC	GCG	CAA	TCT	GCT	AAA	GCA	CAA	GCA	CAA	GCA
Ser	Ala	Gin	Ser	Ala	Lys	Ala	Gin	Ala	Gin	Ala
			45					50
CAA	GTT	GAT	AGC	TTG	CAA	TCA	AAA	GTT	GAC	AGC
Gin	Vai	Asp	Ser	Leu	Gin	Ser	Lys	Vai	Asp	Ser
		55					60
TTA	CAA	CAA	AAG	CAA	ACA	AGT	ACT	AAA	GCA	CAA
Leu	Gin	Gin	Lys	Gin	Thr	Ser	Thr	Lys	Ala	Gin
	65					70
ATC	GCT	AAA	ATC	GAA	AGC	GAA	CGT	AAA	GCA	CTT
Ile	Ala	Lys	Ile	Glu	Ser	Glu	Arg	Lys	Ala	Leu
75					80					85
AAT	GCT	CAA	ATT	GCT	ACT	TTG	AAC	GAA	AGT	ATC
Asn	Ala	Gin	Ile	Ala	Thr	Leu	Asn	Glu	Ser	Ile
				90					100
AAA	GAA	CGT	ACA	AAG	ACA	TTG	GAA	GCT	CAA	GCA
Lys	Glu	Arg	Thr	Lys	Thr	Leu	Glu	Ala	Gin	Ala

105

110

467

500

533

566

599

632

665

698

731

764

CGT	AGT	GCT	CAA	GTT	AAC	AGC	TCA	GCA	ACA	AAT
Arg	Ser	Ala	Gin	Vai	Asn	Ser	Ser	Ala	Thr	Asn
		115					120
ΤΑΤ	ATG	GAT	GCT	GTT	GTT	AAT	TCA	AAA	TCT	TTG
Tyr	Met	Asp	Ala	Vai	Vai	Asn	Ser	Lys	Ser	Leu
	125					130				•
ACA	GAT	GTT	ATT	CAA	AAA	GTA	ACA	GCT	ATT	GCT
Thr	Asp	Vai	Ile	Gin	Lys	Vai	Thr	Ala	Ile	Ala
135					140					145
ACT	GTT	TCT	AGT	GCC	AAC	AAA	CAA	ATG	TTG	GAA
Thr	Vai	Ser	Ser	Ala	Asn	Lys	Gin	Met	Leu	Glu
				150					155
CAA	CAA	GAA	AAA	GAG	CAA	AAA	GAG	CTT	AGC	CAA
Gin	Gin	Glu	Lys	Glu	Gin	Lys	Glu	Leu	Ser	Gin
			160					165
AAG	TCA	GAA	ACT	GTT	AAA	AAG	AAC	TAC	AAC	CAG
Lys	Ser	Glu	Thr	Vai	Lys	Lys	Asn	Tyr	Asn	Gin
		170					175
TTC	GTT	TCT	CTT	TCA	CAA	AGT	TTG	GAT	TCT	CAA
Phe	Vai	Ser	Leu	Ser	Gin	Ser	Leu	Asp	Ser	Gin
	180					185
GCT	CAA	GAA	TTG	ACT	TCA	CAA	CAA	GCT	GAA	CTC
Ala	Gin	Glu	Leu	Thr	Ser	Gin	Gin	Ala	Glu	Leu
190					195					200
AAA	GTT	GCG	ACT	TTG	AAC	TAT	CAA	GCA	ACA	ATT
Lys	Vai	Ala	Thr	Leu	Asn	Tyr	Gin	Ala	Thr	Ile
				205					210
GCA	ACT	GCG	CAA	GAT	AAA	AAA	CAA	GCT	TTA	TTA
Ala	Thr	Ala	Gin	Asp	Lys	Lys	Gin	Ala	Leu	Leu

215

220

797

830

863

896

9

962

995

1028

1061

1094

GAT	GAA	AAA	GCA	GCT	GCA	GAA	AAA	GCA	GCT	CAA
Asp	Glu	Lys	Ala	Ala	Ala	Glu	Lys	Ala	Ala	Gin
		225					230
GAA	GCA	GCT	AAA	AAA	CAA	GCG	GCT	TAT	GAA	GCT
Glu	Ala	Ala	Lys	Lys	Gin	Ala	Ala	Tyr	Glu	Ala
	235					240
CAA	CAA	AAA	GAA'	GCA	GCA	CAA	GCA	CAA	GCA	GCT
Gin	Gin	Lys	Glu	Ala	Ala	Gin	Ala	Gin	Ala	Ala
245					250					255
TCA	ACA	GCA	GCA	ACT	GCT	AAA	GCT	GTA	GAA	GCA
Ser	Thr	Ala	Ala	Thr	Ala	Lys	Ala	Vai	Glu	Ala
				260					265
GCA	ACT	TCA	TCA	GCT	TCT	GCT	TCA	TCT	AGT	CAA
Ala	Thr	Ser	Ser	Ala	Ser	Ala	Ser	Ser	Ser	Gin
			270					275
GCT	CCA	CAA	GTA	AGT	ACA	AGC	ACT	GAT	AAT	ACA
Ala	Pro	Gin	Vai	Ser	Thr	Ser	Thr	Asp	Asn	Thr
		280					285
ACA	TCA	AAT	GCT	AGT	GCC	TCA	AAC	AGT	TCT	AAT
Thr	Ser	Asn	Ala	Ser	Ala	Ser	Asn	Ser	Ser	Asn
	290					295
AGT	TCA	TCA	AAC	TCA	AGT	TCA	AGT	TCT	AGC	AGT
Ser	Ser	Ser	Asn	Ser	Ser	Ser	Ser	Ser	Ser	Ser
300					305					310
TCA	TCA	AGC	TCA	AGC	TCA	AGC	TCA	AGT	AAT	TCT
Ser	Ser	Ser	Ser	Ser	Ser	Ser	Ser	Ser	Asn	Ser
				315					320
AAT	GCT	GGT	GGG	AAT	ACA	AAT	TCA	GGC	ACT	AGT
Asn	Ala	Gly	Gly	Asn	Thr	Asn	Ser	Gly	Thr	Ser
			325					330
ACT	GGA	AAT	ACT	GGA	GGA	ACA	ACT	ACT	GGT	GGT
Thr	Gly	Asn	Thr	Gly	Gly	Thr	Thr	Thr	Gly	Gly

335 340

1127

1160

1193

1226

1259

1292

1325

1358

1391

1424

AGC	GGT ATA AAT AGT TCA CCA ATT
Ser	Gly	Ile	Asn	Ser	Ser	Pro	Ile
	345					350
TAT	GCT	GTT	GGT	GGA	TGT	ACT	GAC
Tyr	Ala	Vai	Gly	Gly	Cys	Thr	Asp
355					360
CAA	TAC	TTT	GCT	GCA	CAA	GGA	ATT
Gin	Tyr	Phe	Ala	Ala	Gin	Gly	Ile
				370
AAT	ATC	ATG	CCT	GGT	AAT	GGT	GGA
Asn	Ile	Met	Pro	Gly	Asn	Gly	Gly
			380
TCT	AAT	GGA	CCT	GCC	CAA	GGC	GTG
Ser	Asn	Gly	Pro	Ala	Gin	Gly	Vai
		390					395
GTA	GGA	GCT	GCT	CCT	GGT	GTT	ATC
Vai	Gly	Ala	Ala	Pro	Gly	Vai	Ile
	400					405
TTC	TCA	GCT	GAT	TTT	GTT	GGA	TAT
Phe	Ser	Ala	Asp	Phe	Vai	Gly	Tyr
410					415
CCT	TAC	GGT	CAC	GTA	GCT	ATT	GTA
Pro	Tyr	Gly	His	Vai	Ala	Ile	Vai

425

GGA AAT CCT 1457

Gly Asn Pro

ΤΑΤ GTA TGG 1490

Tyr Vai Trp

365

TAT ATC AGA 1523

Tyr Ile Arg

375

CAA TGG GCT 1556

Gin Trp Ala

385

CTC CAT GTT 1589

Leu His Vai

GCA TCA AGC 1622

Ala Ser Ser

GCA AAC TCA 1655

Ala Asn Ser

420

AAA TCA GTT 1688

Lys Ser Vai

430

AAT	TCA	GAT	GGT	ACA	ATT	ACT	ATC	AAA	GAA	GGC	1721
Asn	Ser	Asp	Gly	Thr	ile	Thr	Ile	Lys	Glu	Gly
			435					440
GGA	TAT	GGT	ACA	ACT	TGG	TGG	GGA	CAT	GAA	CGT	1754
Gly	Tyr	Gly	Thr	Thr	Trp	Trp	Gly	His	Glu	Arg
		445					450
ACT	GTA	AGT	GCG	TCT	GGT	GTT	ACT	TTC	TTG	ATG	1787
Thr	Vai	Ser	Ala	Ser	Gly	Vai	Thr	Phe	Leu	Met
	455					460

CCA AAC TAG AAAAAAGTCT TAATAAATAA AAAATAGTGG 182 6

Pro Asn

O ⁴⁶⁵

TTTGATAGTG GGGAATAATT TTCCTTCTGT CAAATCATTT 1866

TTTATTATTG TGGTATAATA ATAAGGAAAA ATGATAAGGG 1906

GATAGATACA AATG

1920

SEQ ID NQ2

TIFO DE SEQUÊNCIA: Nucleótidos com corrsspondcTíte polxpeptídeo COMPRIMENTO DA CADEIAs '279 pb TIFO DE CADEIAs dupla TOPOLOGIA? linear

TIPO DE MOLÉCULAS recombinante

Hirudo

ORGANISMO FONTE ORIGINALs L„ lactis LM0230 ÍDGM

FONTE EXPERIMENTAL IMEDIATA? Plasmídeo pUCRS (DSM 5303?, pia deo pML310 (ver pedido de patente europeiaEP-A-lóS 342)

5BtlCARACTERÍSTICAS;

a al pb peptídeo sinal de Mst pb região codificadora da d essuIfato~hi rud i na

PROPRIEDADES? Fusão do DNA de L, 1 act isLMãããã codificador do peptídeo sinal de MSP e do gene estrutural da hirudina para a oroduçSo ds hirudina secretada em bactérias»

ATG

AAA

AAA

AAG

ATT

ATC

TCA

GCT

ATT

TTA

ATG

TCT

36

Met

Lys

Lys

Lys

Ile

Ile

Ser

Ala

Ile

Leu

Met

Ser

-25

-20

ACA

GTG

ATA

CTT

TCT

GCT

GCA

GCC

CCG

TTG

TCA

GGT

72

Thr

Vai

Ile

Leu

Ser

Ala

Ala

Ala

Pro

Leu

Ser

Gly

-15

-10

-5

GTT

TAC

GCT

GTT

GTT

TAC

ACC

GAC

TGC

ACC

GAA

TCT

108

Vai

Tyr

Ala

Vai

Vai

Tyr

Thr

Asp

Cys

Thr

Glu

Ser

GGT Gly 10

CAG AAC

CTG TGC CTG TGC GAA GGT TCT AAC GTT

144

Gin

Asn

Leu

Cys

Leu Cys Glu Gly Ser Asn

Vai

15

20

TGC

GGT

CAG

GGT

AAC

AAA

TGC

ATC

CTG

GGT

TCT

GAC

180

J

Cys

Gly

Gin

Gly . 25

Asn

Lys

Cys

Ile

Leu 30

Gly

Ser

Asp

GGT

GAA

AAA

AAC

CAG

TGC

GTT

ACC

GGC

GAA

GGT

ACC

216

Gly

Glu

Lys

Asn

Gin

Cys

Vai

Thr

Gly

Glu

Gly

Thr

40 45

CCG Pro

AAA CCG CAG TCT

CAC AAC GAC GGT GAC TTC GAA

252

Lys

Pro

Gin

Ser 50

His

Asn Asp

Gly

Asp 55

Phe

Glu

GAA

ATC

CCG

GAA

GAA

TAC

CTG

CAG

TAG

279

Glu

Ile

Pro

Glu

Gin

Tyr

Leu

Gin

60

65

compreendendo:

)

b) a inserção EcoRI/SalI ds lactis do plasmídeo pUCF .proximadamente 3,0 Kpb de L» ou uni seu fragmento funcional,, ou uma sequênci vutu UíH ©-©Ll T de DNA que hibrida com a referida inserção ou gmenta funcional» ou compreende uma região de promotor que está operacionalmente ligada a DNA b i b r i d an te, ou

Claims (3)

1. ,eq

   LCi— X *3. Q’ uma sequência degenerada de uma sequência, de DMA que está coberta em a) ou b) e que codifica um peptídeo sinal, ou

   d) um derivado de uma molécula de DNA coberto s© a), b) ou c) ©/ QLl origem de replicação (I) do plasmídeo 2»5Md de L„ lactis L2 ou (II) do plasmídeo 5»2Md de L» lactis 712» caracterizado por compreender:

   A) cultura de um hospedeiro que compreende tal vector híbrido e isolamento de tal vector híbrido a partir do referido hospedeiro em cultura, ou

   B> preparação de tal vector híbrido por uma síntese in vitro»

   - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar um vector híbrido que compreendende a inserção tcoRI/SalI de aproximadamente 3,5 Kpi plasmídeo pUCRS ou um seu fragmento funcional» de L» lactis do

   3ã — Processo de acordo con» a reivindicação caracteri zado por se preparar um vector híbrido em que o referido fragmento funcional retém as funções de promotor, sinal e/ou estrutural ds MSP,

   4s3 Processo ds acordo com a reivindicação 3 caract 'i^adu pur —s p? «parar um híbrido em que o referido fragmento funcional retém a função do promotor de MSP» rizado por se preparar um vector híbrido em que

   FruCKsSQ oe acordo cout a rsiviudiuaçao uat aute—

   5 T y* .3.ζ3ΓΓϊζτΓ: XO funcionai retendo a Tunçao de promotor se prolonga desde o codao de iniciação da seqtfencia pre—MSP até uma base por volta da posição —ISO® do gene MSP»

   6ã - Processo de acordo com a reivindicação o caracterizado por se preparar um vector híbrido em que o fragmento funcional retendo a função de promotor se estende desde de iniciação da sequãncia pre-MSP numa base por volta da —100 até —í®0® do gene MSP»

   7â — Processo de acordo com a reivindicação 3 rizado por ss preparar um vector híbrido em que o fragmento Tuncxonal retem a Tunçào oa sequsncxa sxnal de .ga - Processo de acordo com a reivindicação 7 rizado por se preparar um vector híbrido em que o funcional retendo a função sinal de MSP codifica a sinal ds MSP de 27 aminoácidos ds comprimento» •j »“ 5~jsÍ θ posição caractereferido hiCO rior « carac te— fragmentc SSQUê*nC ÍS a A 'J

   - í í v ·' -

   Processa de acordo com a reivindicação 7 caracteem que o fragmento

   1 retendo a função sinal de MSP se estende desde uma base rizado por ss preparar um vector híbridí

   TUhCiOnâ por volta da posição 41í da por volta da posição 491« sequência de DNA com SEQ ID N2 1 até

   10ã - Processo de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por se preparar um vector híbrido em que o referido fragmento funcional retém a função da sequência de promotor de MSP e a função de sequência sinal de MSP» — Processo de acordo com a reivindicação IO carac— s preparar um vector híbrido em que o fragmento terizaoo por f une i ona.1 retendo sequência sinal ss tendend o-se desde i n se rç ão Ec oR I / Sa 11 unção do promotor de MSP e a ; seleccionado do qrupo de qualquer base entre o extremo f une ao o a. fragmentos EcoRI da da .5,0 Kpb de L« lactis do plasmídeo pUCRS e o primeiro sítio de restrição HindiII situado na. referida, inserção a montante da base correspondendo à posição 1 da. sequência ds Dbift com SEQ ID N21a.té cerca da base correspondente â posição 491 da. sequência, ds DNA com SEQ 1U NQ1 =

   Í2ã — Processo de acordo com a reivindicação 3 caracte— rizsoo por ss prsparar um vector híbrido em que o referido fragmento funcional retém a função do gene estrutural MSP»

   Processo de acordo uOtii a reivindicação 12 caracterizado por se preparar um vector híbrido em que o referido fragmento funcional retendo a função do gene estrutural MSP se estende desde uma. ba.se por volta da. posição 492 até por volta, da. posição Í793 da. sequência de DNA com SEQ ID NS1»

   i- prouesso de auordo coui a reiviiidicação 1 caracte rizado por se preparar um vector híbrido de acordo com a reivin— oxcaçao 1 que compreende uma sequência de vp4h que niondã com a inserção EcoRI/Ssll de aproximadamente 3,5 Kb do plasmídeo pUCRS ou com ura seu fragmento funcional ou com um seu fragmento funcional ou compreende uma região de promotor que está naturalmente 1xgada operacxonamenfe a tal sequência oí

   J

   15ã — Processo de acordo com a reivindicação Í4 carac— terizado por se preparar um vector híbrido que compreende uma sequência de DNA que codifica um qene relacionado com o qene MSF¹ ou com um sii ragmento funcional ou uma região de promotor de um lóã - Processo de acordo com a reivindicação í caracterizado por se preparar um vector híbrido que compreende uma sequência de DNA que codifica um peptídeo sinal de rítíP ou um peptxdeo relacionado e que é degenerada de acordo com o signifi— ado do código genético para uma sequência de DMA de acordo

   UOHf reivindicação la) ou lb>»

   17-ã - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracte-

   Γ1 2 -3.d O DO Γ S-e* preparar um vector híbrido que compreende um derivado de UíUâ molécula de DMA) de acordo com a re i v i nd i c 3.ç ão 1 3. ) :_Σ X d } OU 4 _ ·. ± L_ 7

   Í8â - Processo de acordo com a reivindicação í caracterizado por se preparar um vector híbrido que compreende a origem plasmídeo 2 = 5Md de L= lactis 712 ou CII) do L= 1actis 712 ou (III) de um plasmídeo do de replicação CI) o plasmídeo 5 = 2Md de mesmo grupo de imcompatibilidade do plasmídeo 2 = 5Md ou do pias lacxxs 712=

   í‘?ã — Processa ds acorde? com a. reivindicação 18 caracterizado por ss preparar um vector híbrido que compreende a origem de replicação situada, no fragmento Ndel/Sphl de aproximadamente i.= 8 Kpb de comprimento do plasmídeo 2,,5 Md de L·.- lactis

   712 =
2. 2uâ — Processo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado por se preparar um vector híbrido que compreende a origem de replicação situada no fragmento IMdel/HindlII de 1₅® Kpb do plasmídeo 5=2 Md de L, lactis 712=

   21â ~ Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar um vector híbrido que é seleccionado do grupo vectores constituído por pUCRS_? pSCÍ2₅ pSC12deltaP_? pSCÍ2deltaN, pSC12deItsNP, pSC18_? pSCISdeltaP ou pSCÍ8deltaM_? pSC12HlR-l_? pSCí2HIRTerm= M13mpl8RS_? M13mpl9H_s pVAHIR-l e pVAHIR=

   22â — Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se preparar o vector híbrido pSCÍ2HIRTsrm=

   2-5â ··· Processa ds acordo com a reivindicação 1 caracte— rizado por se preparar um vector híbrido que compreende um gene estrutural homólogo ou heteróloqo que está operacionalmente ligado numa grelha de leitura correcta à sequência de DNA codificadora do peptideo sinal de MSP e ao promotor de MSP ou a um promotor heteróloqo»

   24s — Processo -para a preparação de uma molécula de DNA que é a inserção tcoRI/SalI de· aproximadamente -5_?5 Kpb ds L» lactis do plasmídeo pUCRS ou um seu fragmento funcional;, ou

   b) que hxbrxda com a xda xiiserçau ou luís um -^.^u frãgmwH co funcional ou compreende uma região de promotor que estâ naturalmente ligada a tal sequência de DNA hibridsnte, ou ê uma sequência degenerada de uma sequência de DNA que este coberta em a) ou to) e que codifica um peptídeo sinal, ou um derivado de uma molécula de DNA coberto em a), b) ou c

   e) compreende a origem de replicação (I) do plasmídeo 2«5Md de

   L» lactis /12 ou ίII) dc *U* M* MM MM 2 «X MM MM 1m* MM M«f MM J p idísiiJiueu -.J» Ζ-ϊίΟ Oe f_ lactis /12 ou (!!!) de um plasmídeo do mesmo grupo de imcompatibilidade do plasmídeo 2,5Md ou do plasmídeo 5»2Md de L lactis 712, carac teri 2ado por s

   A) cultura ds um hospedeiro que compreende tal molécula de DNA e isolamento o’e tal molécula de DNA a partir rip referido hospedeiro em cultura, ou \J

   B) preparação de tal molécula -de DNA através de uma síntese in transformado- com um vector híbrido preparado de acordo com a reivindicação 1, caracteriasdo por comoreeender os oassos de (a) tratamento de um hospedeiro em condições ds transformação vector híbrido preparado de acordo com a reivindicação 1, tativamente juntamente com um gene de marca s-electiva selecção dos transformantes.

   om um faculs (b)
3. 3 ,

   2óê ~ Processo ds acordo cora a reivindicação 25 caracterizado por se preparar um hospedeiro transformado seieccionado do grupo de hospedeiros transformados constituído por E. coli