JPH02247198A - 大腸菌でペプチドを分泌させるためのシグナルペプチドおよびその取得方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグラム陰性菌種の細菌の内膜と外膜の間のベリ
ブラスム空間に異種タンパク質を導き入れることができ
るボルデテラ・ペルツツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来のタンパク質のシグナルペプ
チドに関する。本発明は更に、このシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列、このタイプの遺伝子構造を含む
プラスミド、およびこのタイプのプラスミドを有する宿
主生物に関する。更に本発明は既知および新規のシグナ
ル配列の効率の測定および比較を可能にするプラスミド
ベクターに関する。かかる比較研究の結果として特に効
率的なシグナル配列を同定し、クローン化しそして異種
タンパク質の発現のために三つのすべての翻訳枠に用い
ることができる。

原則として、二つの異なるタイプのシグナル配列、すな
わち“疎水性″タイプと゛′親水性″′タイプに区別す
ることができる。“疎水性群のシグナル配列は通常約１
３〜３０個のアミノ酸より成るのに対し、“親木性１群
は約１２〜７０個のアミノ酸より成る。パ疎水性′″タ
イプのシグナル配列は三つの構成要素に分けることがで
きる。

それは、１個または２個の塩基性アミノ酸を有する比較
的親水性のＮＨ２末端、７個または８個のアミノ酸の非
極性で主として疎水性のブロック、および小さな側鎖を
有するアミノ酸を末端に持つ比較的親木性Ｃ０ＯＨ末端
で構成されている。

かかる゛疎水性″′シグナル配列はタンパク質を案内し
て小胞体（ＥＲ）膜を通過させ、そして細菌膜を通過さ
せる。細菌およびＥＲシグナル配列は相互にわずかに異
なるが、機能的には相互交換可能である。″親水性′″
タイプの構造は前述＝４− のパ疎水性″タイプのそれと大きく異なる。すなわち、
“親水性″タイプには疎水性アミノ酸の中断されていな
い長セクションは存在しないが、通常多くの塩基性でヒ
ドロキシル化されたアミノ酸が存在しそして酸性アミノ
酸はほとんどあるいは全く存在しない。゛親水性″タイ
プのシグナル配列はミトコンドリア、葉緑体、そして場
合によってはペルオキシシーム中にもタンパク質を案内
する。それは本発明には意義を持たない。

前述の如く、原核および真核由来の″゛疎水性″タイプ
のシグナル配列は共通した特徴を有し、そして機能的に
は相互交換可能であるが、認むべき相違も存在する：す
なわち、これまでに知られている大抵の原核性シグナル
配列は、“疎水性″タイプ（−ＥＲタイプ）の真核性シ
グナル配列に比べ、非極性セクションの疎水性が低くま
た通常、ＮＨ，領域に付加的な塩基性アミノ酸を有して
いる。多分このために異種タンパク質の天然シグナル配
列がこのタンパク質に先行する細菌性シグナル配列より
も、通常、より非効率的に認識されプロセシングを受け
るのであろう。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）における異種タンパク質の分
泌は、通常、内膜からペリプラスム空間内への輸送とし
て行われる。異種タンパク質が周囲媒質中に分泌される
例外はほんのわずかしか知られていない。大腸菌におけ
るペリプラスム空間内への異種タンパク質の輸送は、機
能的には、真核細胞の小胞体の管腔内へのタンパク質輸
送に実質的に相当する。このプロセスの結果として、タ
ンパク質を正しく折りたたむことができ、そして大腸菌
内で分子内ジスルフィド架橋を正しく作ることもできる
。シグナル配列は特異的シグナルペプチダーゼによるタ
ンパク質加水分解により除かれ、そしてそのようにして
成熟したパプロセシングされた（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）
　’″異種タンパク質が大腸菌内で合成される。

一部のタンパク質は、細菌、作えば大腸菌、内で細胞質
発現後年安定であり、そしてプロテアーゼにより再び極
めて迅速に分解されてしまう。この分解は、就中、これ
らのタンパク質が先行する極めて効率的なシグナル配列
によりペリブラスム空間内に迅速に分泌されることによ
って防止することができる。従って、特に効率のよいシ
グナル配列を単離しそしてこれに適した方法を設計する
ことが課題であった。

ＨｏｆｆｍａｎおよびＷｒｉｇｂｔ　（Ｐｒｏｃ、　Ａ
ｃａｄ、　　Ｎａｔｌ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ；　（１９８５）　８２．５１０７−
５１１１）は、それに属するシグナル配列のない大腸菌
由来のペリプラスミツクアルカリ性ホスファターゼ（ｐ
ｈｏＡＥＣ３，１，３，１）をコードするプラスミドを
記載している。それら自身のシグナル配列を有する融合
相手と試験管内で融合すると、融合タンパク質の形で活
性アルカリ性ホスファターゼが分泌されるのに対し、融
合付加されたシグナル配列が存在しないときは、細胞質
内に放出されるアルカリ性ホスファターゼの活性は検出
し得ない。

ＭａｎｏｉｌおよびＢｅｃｋｗｉｔｈ　（Ｐｒｏｃ、　
　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ（１９８５）　８２．８１２Ｌ８１３
３）はこの研究を続けて３′側にシグナル配列およびそ
れに続く５個のアミノ酸を持たないｐｈｏＡをコードす
るｃＤＮＡをトランスポゾンＴｎ５の前に置き（Ｉｏｃ
、　ｃｉｔ、）そしてそれによって分泌タンパク質との
融合だけでなく膜タンパク質との融合によっても活性ｐ
ｈｏＡが得られることを示すことができた。従って前述
の構築物”ＴｎｐｈｏＡ”はシグナル配列またはシグナ
ル配列に類似する構造をつきとめるのに適している。

Ｓ、ＫｎａｐｐおよびＪ、　　Ｍａｋａｌａｎｏｓ　（
Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（１９８８）　　１７０．
　５０５Ｌ５０６６）は、ＴｎｐｈｏＡ突然変異誘発に
より、変調信号（この場一８＝ 合にはニコチン酸およびＭｇ５Ｏ，）により影響を受け
るボルデテラ・ベルッッシスの突然変異体を作ったが、
大部分のこれらの突然変異体は抑制されておりそして一
部は活性化されている。このことは少くとも二つの調節
遺伝子が働いている（　ｔｒａｎｓａｃｔｉｎｇ）こと
を示唆している。

我々はそこに記載されている突然変異体ＳＫ６が新規で
あって極めて効率のよいシグナル配列を含んでいること
を見出した。

この新規シグナル配列はボルデテラ・ベルッツシス由来
の分泌タンパク質であって次の配列 ＭＫＫＷＦＶＡＡＧ　　ＩＧＡＧＬＬＭＬＳＳＡＡを有
する（第２表および第３表参照）。

更に、一方において″シグナル配列クローン化ベクター
″として極めて適し、他方において様々なシグナル配列
をそれらのパ分泌効率″によって定量的に比較すること
を可能にするｐｈｏＡ含有プラスミドも記載される。両
目的に特に有用なのはベクターｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏ
Ａである（第１図、第１表および実施例２）。このベク
ターは、ｐＴｒｃ９９Ｃ（Ａｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　
Ｇｅｎｅ　６９　（１９８８）３０１３１５）およびそ
の趣旨に沿って修飾されまたシグナルペプチド配列を持
たないｐｂｏＡ　ＤＮＡから、ｐｈｏＡの構造遺伝子が
ｐＴｒｃ９９Ｃの翻訳開始コードンに関し正しい解読枠
に位置しそしてＮｃｏ　Ｉ切断部位が（シグナル配列の
ない）　ｐｈｏＡ構造遺伝子の５′端に直接設けられる
ように構築した。

従って、本発明は、 ａ）　シグナル配列 ＭＫＫＷＦＶＡＡＧＩＧＡＧＬＬＭＬＳＳＡＡｂ）この
タイプの配列を有するプラスミドＣ）タンパク質分泌の
ためのその使用 ｄ）調節可能な強力なプロモーター、例えばｔｒｃ、の
次に１ａｃＺリポソ一ム結合部位（ＲＢＳ）が、そして
その１ａｃＺ　ＲＢＳから高発現のために至適化された
ある距離をおいてベクター・コード化翻訳開始コードン
がくるようにし、Ｎｃｏ　Ｉ切断部位をシグナル配列を
持たないｐｈｏＡ構造遺伝子の５′端に直接存在させ、
ｐｈｏＡ配列の中からは突然変異により欠失させた、シ
グナル配列のクローン化および定量的評価に特に適した
プラスミド、好ましくはｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡ に関する。

更に本発明を実施例および特許請求の範囲に詳述する。

実施例　１ ボルデテラ・ベルッッシスシグナル配列の同定および単
離 以下に用いるトランスボゾンＴｎｐｈｏＡはトランスボ
ゾンＴｎ５の誘導体である。ＴｎｐｈｏＡは左ｌ５５０
挿入要素中にシグナル配列を持たない大腸菌ｐｈｏＡ構
造遺伝子誘導体を有している。後者はＭａｎｏｉｌおよ
びＢｅｃｋｗｉｔｈ（ｌｏｃ、　ｃｉｔ、）の方法によ
り、ＴｎｐｈｏＡが染色体またはプラスミド−コード化
遺伝子中に転移した場合に、ＴｎｐｈｏＡからの大腸菌
ｐｈｏＡ構造遺伝子とその転移により影響を受けた構造
遺伝子のシグナル配列の解読枠が符号するときにだけｐ
ｈｏＡ陽性遺伝子融合が生じるように構築されている。

かかるｐｈｏＡ陽性コロニりロ素指示薬である５−ブロ
モ−４−クロロインドキシルホスフェートトルイジン（
ｘｐ）を用いて容易に確認できる。前述の方法を用いて
ボルデテラ・ペルツツシス野生株１８３２３　（Ｋｎａ
ｐｐおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ　（１９８８）　Ｉｏｃ
、　ｃｉｔ、）においてＴｎｐｈｏＡ突然変異誘発を行
った。この結果、就中、ｐｈｏＡ−陽性ＴｎｐｈｏＡ突
然変異体ＳＫ６が生じたが、そのＴｎｐｈｏＡ遺伝子融
合をｖｒｇ［ｉと呼ぶ。そのｖｒｇ５遺伝子融合を次の
ようにしてベクタープラスミドｐＢＲ３２２中の２０　
ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片にクローン化した。すなわち、突
然変異体ＳＫ６のゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで切断しそ
してＢａｍＨＩで切断されたｐＢＲ３２２ＤＮＡと連結
しそしてそれを用いて大腸菌株ＣＣ１１８（−ｐｈｏＡ
陰性）を形質転換した。ＴｎｐｈｏＡ遺伝子融合を有す
るゲノム断片を含むクロロをカナマイシン／アンピシリ
ン寒天プレートで選抜した（ＴｎｐｈｏＡはＴｎ５と同
様ＴｎｐｈｏＡの５　’　ｐｈｏＡ部分とＴｎｐｈｏＡ
内の特有のＢａｍＨＩ切断部位の間に位置するカナマイ
シン抵抗性遺伝子をコードする）。

カナマイシン抵抗性を有するＴｎｐｈｏＡ突然変異体か
らのゲノムＢａｍＨＩ断片は従って、次のゲノムＢａｍ
ＨＩ切断部位までの上流に位置するゲノムボルデテラ・
ベルツッシスＤＮＡおよびｐｈｏＡ構造遺伝子を有しな
ければならない。サイズが２０ｋｂでありｖｒｇ３遺伝
子融合を有するＢａｍＨＩ断片の場合、約１４ｋｂがゲ
ノムボルデテラ・ベルッッシスＤＮＡに対応しそして約
６ｋｂがＴｎｐｈｏＡをコードするＤＮＡに対応する。

ｖｒｇ５遺伝子融合の転写および翻訳調節配列を更に位
置決めする。このために、２０ｋｂのサイズのＢａｍＨ
Ｉ断片を制限分析にかけ、そしてＴｎｐｈｏＡからの全
ｐｈｏＡ配列を有するが２０ｋｂ断片に比べ切込まれた
ボルデテラ・ベルフッシスＤＮＡ領域を有するサブ断片
をｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１８中にクローン化した。

このようにして得られた欠失誘導体をボルデテラ・ベル
フッシス中で複製し得るプラスミドｐＬＡＦＲ２中に再
クローン化しくＦｒｉｅｄｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、　（
１９８２）、　Ｇｅｎｅ　１８．２８９１９６）そして
ボルデテラ・ベルフッシス中に接合伝達（ｃｏｎｊｕｇ
ａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）後、変調を受けやすい
ｐｈｏＡ活性を検査した。このようにして約３．２　ｋ
ｂのサイズのＰｓｔＩ断片を同定しそしてその段階にお
いてｖｒｇ５遺伝子融合のＴｎｐｈｏＡ挿入部位の上流
にわずか約５００塩基対のボルデテラ・ペルツツシスＤ
ＮＡｔ、か含まずそしてボルデテラ・ペルツツシスにお
いて誘導後ｐｈｏＡ陽性であるｐＵｃ１８（以下ｐＵＣ
−ＰＩ　ト呼ばれる）中ニサフク゛ローン化した。２０
　　ｋｂのサイズのクローン化されたＢａｍＨＩ断片ま
たは３．２ｋｂのサイズのＰｓｔＩ断片を含むボルデテ
ラ・ベルッッシス誘導体のｐｈｏＡ活性はそれらのホス
ファターゼ活性において本質的に相違しないことから、
後者の断片のｖｒｇ５遺伝子融合の転写および翻訳調節
配列は依然として完全に存在しているはずである。ｐＵ
Ｃ−ＰＩより出発して、Ｈｅｎ１ｋｏｆｆの方法（（１
９８４）　Ｇｅｎｅ　２８゜３５１−３５９）により酵
素エクソヌクレアーゼ■およびＳｌヌクレアーゼを用い
てＴｎｐｈｏＡ挿入部位の上流５００塩基対に位置する
ＤＮＡ領域中に欠失を導入した。これにより、就中、２
つのｐＵＣ−ＰＩ誘導体ｖｒｇ５−デルタ１２およびｖ
ｒｇ５−デルタ１１が得られた。ｖｒｇ５−デルタ１２
はＴｎｐｈｏＡ挿入部位の上流に約２００塩基対のボル
デテラ・ベルッッシス特異的ＤＮＡを含み、そして同じ
（ｐｈｏＡ陽性である。

ＤＮＡシーケンシングを用いてこの組換えプラスミドの
ボルデテラ・ベルッッシスシグナル配列を決定した。

シグナル配列は次のとおりである： ＭＫＫＷＦＶＡＡＧＩＧＡＧＬＬＩｉｌＬＳＳＡＡ（第
２表も参照のこと）。このようにして特徴付けられたボ
ルデテラ・ペルツツシスシグナル配列は２１個のアミノ
酸より成り、そして次いで実施例２に記載の如く調製し
クローン化する。

それは異種タンパク質の分泌に適している。

ｖｒｇ５−デルタ１１はＴｎｐｈｏＡ挿入部位の上流に
４個のボルデテラ・ペルツツシス特異的ヌクレオチドし
か含まず、その次にｐＵｃ１８−特異的Ｓａｃ　Ｉ切断
部位を伴う（第１表）。ｖｒｇ５−デルタ１１　ＤＮＡ
のＰｓｔ　Ｉ　／　Ｓａｃ　ＩによりＴｎｐｈｏＡから
の完全なｐｈｏＡ構造遺伝子が得られるが、これはシグ
ナル配列を持たずそして約２．６　ｋｂのサイズであっ
て、実施例２においてシグナル配列を持たないｐｈｏＡ
構造遺伝子の給源として役立つ断片にある。

実施例　２ シグナル配列のクローン化および効率の比較測定のため
のベクタープラスミド（ｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡ）の
構築 ベクタープラスミドｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡの構築を
以下記載する。このベクタープラスミドは必須要素とし
て既に前に記載され、シグナル配列を持たず、そしてＴ
ｎｐｈｏＡから単離されたｐｈｏＡ構造遺伝子を有する
。そのｐｈｏＡ構造遺伝子は内部Ｎｃｏ　Ｉ切断部位を
有する。この切断部位を、アミノ酸配列は維持しながら
、部位−指向性（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変
異誘発方法により除去した。

このために、まず組換えｐｈｏＡ−陰性プラスミドｐｖ
ｒｇ６−デルタ１１（実施例１参照）をＥｃｏＲＩで切
断し、そしてｐｈｏＡ構造遺伝子の内部領域からの３３
０塩基対のサイズの断片を単離した。突然変異を受ける
べきＮｃｏ　Ｉ切断部位を含むこの断片を突然変異誘発
ベクターｐＭａ５〜８（第３図）のＥｃｏＲＩ部位に連
結した。得られたプラスミドｐＭａ５−８−ＥｃｏＲＩ
　　３３０を単離し、そして−本鎖の調製に用いた。こ
のようにして得られたクローン化されたＥｃｏＲＩ断片
を有する一本鎖を次いで既知の方法により単離し、そし
て次のオリゴデオキシヌクレオチド、すなわち ５’　ＡＴＣＧＡＴＡＴＴＧＣＣＧＴＧＧＴＡＣＧＴＴ
ＧＣＴＴＴＣ３’を用いて公表されたギヤップトーデュ
プレックス（ｇａｐｐｅｄ−ｄｕｐｌｅｘ）突然変異誘
発プロトコール（Ｋｒａｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９
８４）　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２゜９
４４１−９４５６）に付した。

目的とするＮｃｏ　Ｉ突然変異の生じたプラスミドを適
宜の制限分析により同定し、そして関連の領域を配列決
定しそして正しいことを確認した。次に３３０塩基対の
サイズのＥｃｏＲＩ断片をこのプラスミドから再単離し
そしてプラスミドｐｖｒｇ６−デルタ１１の対応する断
片と入れ替えた。

このために、ｐｖｒｇ６−デルタ１１をＥｃｏＲＩで部
分消化し、そして、部分消化により線状化された出発時
のプラスミドｐｖｒｇ−デルタ１１（約６７００ｂｐ）
よりも３３０塩基対だけ短い断片を単離した。このサイ
ズ（約６４００ｂｐ）のＥｃｏＲＩ断片をアルカリ性ホ
スファターゼで処理し、そして３３０塩基対のサイズの
突然変異したＥｃｏＲＩ断片に連結し、そしてその連結
混合物を用いて大腸菌を形質転換した。３３０塩基対Ｅ
ｃｏＲＩ断片が正しく挿入された復元されたｐｈｏＡ構
造遺伝子を含む組換えプラスミドを制限分析およびＤＮ
Ａシーケンシングにより同定した。このタイプの組換え
プラスミド、ｐｖｒｇ６−デルタ１１−デルタＮｃｏＩ
、を複製させ、そしてハイブリッドプラスミドｐＴｒｃ
９９ＣｐｈｏＡの構築に用いた。このために、約２６０
０塩基対のサイズのＳａｃ　Ｉ　−３ｃａ　Ｉ断片をｐ
ｖｒｇ６−アルク１１−デルタＮｃｏ　Ｉから単離した
。次の段階で、ｐＴｒｃ９９ｃ　（Ａｍａｎｎ　ｅｔ　
ａｌ、　（１９８８）　Ｇｅｎｅ　６９．３０１３１５
）からの約９００塩基対のサイズのＳａｃ　Ｉ　−３ｅ
ａ　工断片を約２６００塩基対のサイズのこの３ａｃ　
ｌ５ｃａ　Ｉ断片で置き代えた。得られた組換えプラス
ミドｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡは、前述の操作の結果、
シグナル配列を持たないｐｈｏＡ構造遺伝子の５′端に
直接、特有のＮｅｏ　Ｉ切断部位を有しており、そして
それは次の実施例に示されるとおり、任意の所望の合成
または天然シグナル配列のクローン化に用いることがで
きる。ｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡは発現ベクターｐ’Ｔ
ｒｃ９９Ｃの翻訳開始コードンに関し正しい解読枠でｐ
ｈｏＡの構造遺伝子を有しているが、ｐｈｏＡシグナル
配列が存在しないために、形質転換大腸菌細胞中で酵素
的に活性なアルカリ性ホスファターゼの合成を生起させ
ることができず、従って゛′シグナル配列クり−ニング
ベクトル″として適している。更に、ｐＴｒｃ９９Ｃ−
ｐｈｏＡは、ハイブリッドｔｒｃプロモーター（Ａｍａ
ｎｎおよびＢｒｏｓｉｕｓ　（１９８５）　Ｇｅｎｅ　
４０．１８３−１９０）の上流に、ｌ　ａｃＺリポソー
ム結合部位（ＲＢＳ）を、そしてその２Ｏ− １ａｃＺ　ＲＢＳから高発現のために至適化されたある
距離をおいて翻訳開始コードンを有する。組換えプラス
ミドｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡを含む大腸菌細胞はプラ
スミドにコード化された生物学的に活性なアルカリ性ホ
スファターゼ活性を産生じないが、それはこのプラスミ
ドのｐｈｏＡｍ造遺伝子がシグナル配列を欠いているた
めである。ｐｈｏＡ−陽性コロニーは、シグナル配列を
コードするＤＮＡ断片をｐｈｏＡ構造遺伝子の前に正し
い解読枠で置くことにより生成させることができる。こ
れは、ｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡをＮｅｏ　Ｉで切断し
そしテシグナル配列をコードする合成りＮＡ断片をこの
ベクターＤＮＡに挿入することにより行われる。この操
作のハイブリッドプラスミドを有する細菌コロニーは、
既に前述した色素指示薬ＸＰを用いてそれらの新しいｐ
ｈｏＡ−陽性表現量により容易に同定することができる
。以上に示された原理を、以下、例示の態様の形で説明
する。様々な分泌タンパク質のシグナル配列をｐＴｒｃ
９９Ｃ−ｐｈｏＡベクターにクローン化するとシグナル
配列だけが異なる同質遺伝子の（ｉｓｏｇｅｎｉｃ）組
換えプラスミドが得られる。こうした理由から、かかる
構築物を含む大腸菌細胞のｐｈｏＡ活性は、関連のクロ
ーン化されたシグナル配列の効率の尺度となる。

ベクターｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｂｏＡのもう一つの可能な
用途は、明確に規定されたシグナル配列をコードするこ
となく、シグナル配列の各位置に対し複数のアミノ酸が
可能となるように縮退している合成りＮＡ断片のクロー
ニングである。これはある程度、ショットガンクローニ
ングであり、そして、このベクター故に可能となったｐ
ｈｏＡ活性測定値は人工シグナル配列の効率の尺度とな
る。

この方法を用いて、クローン化遺伝子の異種発現に使用
可能な新しいシグナル配列を調製しそして評価すること
ができる。

ｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡの構築原理を第１図に図示す
る。

略語の意味：Ｎ＝ＮｃｏＩ、Ｓ　＊Ｓａｃ　Ｉ、Ｐ−Ｐ
ｓｔＩ、（Ｎ）一連結後Ｎｃｏ　Ｉ部位が再生されてい
ない、’ｐｈｏＡ−シグナル配列を持たないｐｈｏＡ構
造遺伝子。矢印は転写方向または翻訳された領域のＮＨ
，→ｃｏｏＨ配向を示す。Ｏｌｉｇｏは合成オリゴヌク
レオチド配列を意味する。第１表はｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐ
ｈｏＡの関連のクローニングおよび翻訳開始領域を示し
ている。

実施例　３ ボルデテラ・ペルツツシスシグナル配列の、および分泌
タンパク質の５種類の他の天然微生物シグナル配列のＤ
ＮＡ合成とクローニングベクターｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈ
ｏＡを用いて第２表に示されたアミノ酸配列に対する６
種類の異なるシグナル配列をクローン化した。新しいボ
ルデテラ・ペルツツシスシグナル配列のはか５種類の他
のシグナル配列は次の基準に基づいて選抜した： ａ）ペリプラスミックタンパク質のシグナル配列 一大腸菌由来のアルカリ性ホスファターゼ（ｐｈｏＡ）
　（Ｋｉｋｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　９．５６７１−５６
７８）ｂ）外膜タンパク質のシグナル配列 −大腸菌由来の外膜タンパク質（ｏｍｐＡ）（Ｍｏｖｖ
ａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ。

２５５、２７−２９） Ｃ）媒質中に分泌される三種類のタンパク質のシグナル
配列 一大腸菌由来の熱安定性毒素Ｉ　（ＳＴＩ　）　、（Ｓ
。

およびＭｃＣａｒｔｈｙ　（１９８０）　Ｐｒｏｃ−Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７７、４０１１−４０１５）−大腸
菌由来の熱安定性毒素Ｉ［（ＳＴＩ［）　（Ｌｅｅｅｔ
　ａｌ、　（１９８３）　１ｎｆｅｃｔ、　１ｍｍｕｎ
、　４２．２６４−一枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ）由来のアミラーゼ（Ｙａｎｇ　ａｔ　　
ａｌ　　（１９８３）　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒ
ｅｓ、１１．２３７−２４９）三種類のシグナル配列の
合成およびクローニングには次の簡略名称を用いた： ボルデテラ・ペルツツシス ｖｒｇ−６シグナル配列−３ｅｑ　１ ｐｈｏＡ　　シグナル配列＝　Ｓｅｑ　２０ｍｐＡ　　
シグナル配列−３ｅｑ　３ＳＴＩ　　　シグナル配列＝
　Ｓｅｑ　４ＳＴＩＩ　　シグナル配列−５ｅｑ　５枯
草菌アミラ一ゼシグナル配列 ”Ｓｅｑ　６ 前述の６種類すべてのシグナル配列をＤＮ八へ成により
製造した。（第３表に示された）この目的のために合成
されたＤＮＡ断片を実施例２に記載のアルカリ性ホスフ
ァターゼを指標とする選抜を用いてテストベクターｐＴ
ｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡでクローン化し同定した。シグナ
ル配列をコードする合成りＮＡ断片は、ベクターｐＴｒ
ｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡに正しい方向に挿入後唯一のＮｃｏ
　Ｉ部位が（詳細にはそのシグナル配列コードする領域
の下流に）、再生されるように設計した（第１図、第３
表および第４表も参照）。このようにして、実施例４で
更に詳述されるように、このＮｃｏ　Ｉ部位を異種遺伝
子をｐＳＥＣベクター（ｐＳＥＣ＝分泌）に挿入するた
めのクローニング部位として更に用いることができる。

第３表に示した１２種類のＤＮＡ断片をβ−シアノエチ
ルアミダイト類を用いて既知の方法により合成した（Ｓ
ｉｎｈａ　ｅｔ　ａｌ、　　（１９８４）　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．４５３９−４５５７）　
、それら合成は、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ合成装置を用いて
ホスファイトトリエステル法により行った（Ｌｅｔｓｉ
ｎｇｅｒ　　（１９７５）Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｓｏｃ、　９７．３２７８；　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ
（１９７６）　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ
、　９８．３６５５）。室温で５〜８時間濃アンモニア
を用いて担体（ｃｐｃ）から分解除去しそして塩基の保
護基を同じ溶液中５５°Ｃで１２時間分解除去した後、
オリゴデオキシヌクレオチドをゲル電気泳動または逆相
ＨＰＬＣにより精製した。それらオリゴデオキシヌクレ
オチドをアニーリング緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣＱ。

１０ｍＭ　ＴＲｌ５−Ｃ（ｉ　（ｐＨ７，８）　、０．
１ｍＭ　ＥＤＴＡ）にとり、モル量の各鎖を混合し、９
５°Ｏで５分間インキュベートし、そして徐々に室温に
冷却した。それら二本鎖ＤＮＡ断片は、５′端に、４塩
基長であってＮｃｏ　Ｉ認識部位に相補的な一本鎖領域
を有する。テストベクターｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡを
Ｎｅｏ　Ｉで線状化し、そして様々な混合物中でノ＼イ
ブリダイズしたＤＮＡ断片と共に連結した。受容能力を
持つ（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ’）大腸菌細胞をそれら連結
混合物を用いて既知の方法により形質転換し、ＬＢ／ａ
ｍｐ寒天プレー寒天プレートドし、そして３７℃で一夜
インキユベートした。それらコロニーをレプリカ平板法
によりＬＢ／Ａｍｐ／ＸＰ／　ＩＰＴＧ指示薬プレトに
移しそして３７°Ｃでインキュベートした。

ｐｈｏＡ−陽性コロニーはこの指示薬プレート上で青色
を呈する。これらコロニーのプラスミドＤＮＡを単離し
配列決定をし、そして前述の６例について、合成りＮＡ
断片の配向の正しさ、およびシグナル配列の予測された
正しさを確認することができた。このようにして得られ
、そして配列決定により正しいことが確認された特定の
シグナル配列を有するプラスミドを、前記表に従ってｐ
Ｔｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡ−３ｅｑ　−１、−２、−３、
−４、−５および−６と呼んだ。標準化された条件下に
、吸光度（遊離色素の測定）に基づいてこれらのシグナ
ル配列を比較しそして評価することができるが、ボルデ
テラ・ペルツツシスから見出されたものが比較的最強の
部類に属する。

実施例　４ 分泌ベクターｐＳＥＣ−Ｂｐ−１、ｐＳＥＣ−Ｂｐ−２
およびｐｓＥｃ−Ｂｐ−３の構築 クローンｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡ−３ｅｑ−１のプラ
ス・ミドＤＮＡをＳａｃ　ＩおよびＳｅａ　Ｉで消化し
、そして約３．１　ｋｂのサイズの断片を単離した。こ
の断片はボルデテラ・ペルツツシスシグナル配列のほか
にｐ７ｒｃ９９Ｃ−特異的配列だけを有している（第１
図も参照のこと）。この断片を、三種類の別個の混合物
の各々の中で、プラスミドｐＴｒｃ９７ＡｓｐＴｒｃ９
７ＢおよびｐＴｒｃ９７Ｃ（Ａｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、
　　Ｉｏｃ。

ｃｉｔ、）の約０．９　ｋｂのＳａｃ　Ｉ　／　Ｓｅａ
　Ｉ断片のうちの一つと連結し、そして得られたプラス
ミドをｐＳＥＣ−Ｂｐ−１、ｐＳＥＣ−Ｂｐ−２および
ｐＳＥＣ−Ｂｐ−３と呼んだ。この操作には、ボルデテ
ラ・ペルツツシスシグナル配列をコードする領域の下流
に複数の制限部位が三つのすべての解読枠で利用可能と
なるように、プラスミドｐＴｒｃ９７Ａ、　ｐＴｒｃ９
７ＢおよびｐＴｒｃ９７Ｃの長ポリリンカー領域を用い
た（第４表）。これらの構築と同様にして、プラスミド
ｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡ−３ｅｑ　−２、−３、−４
、−５および−６を用いることにより異種タンパク質の
発現および分泌のための同様の分泌ベクターを調製する
ことができる。このようにして調製された分泌ベクター
は、各場合に用いられたシグナル配列の起源に応じて、
それらの相対的効率および発現産生物の細胞内位置を異
にしている。

第２図はｐＳＥＣ−ＢＰＩのプラスミド構造を示し、ま
た第５表はｐＳＥＣ−ＢＰＩの完全なりＮＡ配列を示し
、モしてｘｘｘは開始または停止コードンを表わす。

第３図の説明ニ プラスミドｐＭＡＣ５−８（＝　ｐＭＡ５−８および、
ｌ）ＭＣ５−８）のマツプ Ｆｌ−ＯＲＩ　：ファージｆ１の複製開始点；ＯＲＩ　
：　Ｃｏ１２Ｅｌタイプの複製開始点；ＣＡＴ：クロラ
ムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのコード領
域； ＡＭＰ　：β−ラクタマーゼのコード領域。

ｐＭＡ５−８はＣＡＴにアンバー突然変異（３４０９位
のＡ） を有し、そしてｐＭＣ５−８はＡＭＰにアンバー突然変
異（２２３８位のＣ）を有する。

七　− 七　部 和　あ 第 表 ＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴ　ＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡ　ＧＧＡ
ＣＡＡＡＴＣＣＧＣＣＧＧＧＡＧＣＧ　ＧＡＴＴＴＧＡ
ＡＣＧＴＡＡＴＣＡＴＣＣＧ　ＧＣＴＣＧＴＡＴＡＡ　
ＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴ　ＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡ　ＴＡＡ
ＣＡＡＴＴＴＣ★★★ ＮｃｏＩ　　ＥｃｏＲＩ ＳｓｔＩ　　ＫｐｎＩ ＳｍａＩＢａｍＨＩＸｂａＩ ａｌＩ ５ｔＩ Ｓｐｈ　Ｉ　ＨｉｎｄｌｌＩ ＣＧＧＡＴＧＡＧＡＧ　ＡＡＧＡＴＴＴＴＣＡ　ＧＣＣ
ＴＧＡＴＡＣＡ　ＧＡＴＴＡＡＡＴＣＡ　ＧＡＡＣＧＣ
ＡＧＡＡ★★★　　　　　　　　　★★★　　　　★籠
ＣＧＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡ　ＣＴＧＧ
ＧＣＣＴＴＴ　ＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴ　ＧＴＴＧＴＴＴ
ＧＴＣＣＴＣＴＡＣ；ＣＴＴＣＣＣＧＧＣＡＡＣＡＡ　
ＴＴＡＡＴＡＧＡＣＴ　ＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴ
ＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧ　ＣＡＣＧＡＧＧＧ
ＡＧ　ＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧ　ＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧ　
ＧＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧ　ＧＣＧＴ
ＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＴＣＴＧ　ＧＣＣＣＴＧＣＡ
ＣＧ　ＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡＡＡＴＴＧＴＣＧ部ＧＣＧ
ＡＴＴＡＡＡＴ　ＣＴＣＧαｒｃｃＧＡ　ＴＣＡＡＣＴ
ＧＧＧＴ　ＧＣＣＡＧ美ＴＧＧ

【図面の簡単な説明】

第１ａおよび１ ｂ図はｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡ構造の原理を示した図
であり、 第２図はｐＳＥＣ−ＢＰ　１のプ ラスミド構造を示す図であり、 第３図はプラス トｐＭＡＣ５ ８のマツプである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）アミノ酸配列が ＭＫＫＷＦＶＡＡＧＩＧＡＧＬＬＭＬＳＳＡＡであるボ
   ルデテラ・ペルツツシス由来のシグナルペプチド。 ２）請求項１に記載のシグナルペプチドをコードするＤ
   ＮＡまたはＲＮＡ。 ３）請求項２記載のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むベク
   ター、プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物。 ４）請求項２記載のＤＮＡまたはＲＮＡを関連の構造遺
   伝子の前に置くことより成るグラム陰性細菌でのタンパ
   ク質の分泌方法。 ５）請求項１記載のシグナルペプチドの、グラム陰性細
   菌でのタンパク質の分泌のための使用。 ６）（ａ）調節可能な強力プロモーター、好ましくはｔ
   ｒｃ、 （ｂ）ｌａｃＺリボソーム結合部位、および（ｃ）ベク
   ターＡＴＧ開始点に関し正しい解読枠にあるペリプラス
   ミツクアルカリ性ホスフ ァターゼ（ｐｈｏＡ）のシグナル配列を持たない構造遺
   伝子であって、ｐｈｏＡ中のＮｃｏＩ切断部位が欠失し
   ておりそしてかかる部位が シグナル配列を持たないｐｈｏＡ構造遺伝子の５′端に
   直接存在するもの、 を順次に有する発現ベクター。 ７）プラスミドｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡ。 ８）請求項６記載の発現ベクターを用いることより成る
   シグナル配列の単離方法。 ９）請求項６記載の発現ベクターを用いることより成る
   シグナル配列の定量的評価方法。 １０）ｐＴｒｃ９９Ｃ−ｐｈｏＡが用いられる請求項８
   または９記載の方法。 １１）請求項６または７記載の発現ベクターのシグナル
   配列の定量的評価のための使用。