JP2939283B2 - 大腸菌でペプチドを分泌させるためのシグナルペプチドおよびその取得方法 - Google Patents
大腸菌でペプチドを分泌させるためのシグナルペプチドおよびその取得方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はグラム陰性菌種の細菌の内膜と外膜の間のペ
リプラスム空間に異種タンパク質を導き入れることがで
きるボルデテラ・ペルツツシス（Bordetella pertussi
s）由来のタンパク質のシグナルペプチドに関する。本
発明は更に、このシグナルペプチドをコードするDNA配
列、このタイプの遺伝子構造を含むプラスミド、および
このタイプのプラスミドを有する宿主生物に関する。更
に本発明は既知および新規のシグナル配列の効率の測定
および比較を可能にするプラスミドベクターに関する。
かかる比較研究の結果として特に効率的なシグナル配列
を同定し、クローン化しそして異種タンパク質の発現の
ために三つのすべての翻訳枠に用いることができる。
リプラスム空間に異種タンパク質を導き入れることがで
きるボルデテラ・ペルツツシス（Bordetella pertussi
s）由来のタンパク質のシグナルペプチドに関する。本
発明は更に、このシグナルペプチドをコードするDNA配
列、このタイプの遺伝子構造を含むプラスミド、および
このタイプのプラスミドを有する宿主生物に関する。更
に本発明は既知および新規のシグナル配列の効率の測定
および比較を可能にするプラスミドベクターに関する。
かかる比較研究の結果として特に効率的なシグナル配列
を同定し、クローン化しそして異種タンパク質の発現の
ために三つのすべての翻訳枠に用いることができる。
原則として、二つの異なるタイプのシグナル配列、す
なわち“疎水性”タイプと“親水性”タイプに区別する
ことができる。“疎水性”群のシグナル配列は通常約13
〜30個のアミノ酸より成るのに対し、“親水性”群は約
12〜70個のアミノ酸より成る。“疎水性”タイプのシグ
ナル配列は三つの構成要素に分けることができる。それ
は、１個または２個の塩基性アミノ酸を有する比較的親
水性のNH2末端、７個または８個のアミノ酸の非極性で
主として疎水性のブロツク、および小さな側鎖を有する
アミノ酸を末端に持つ比較的親水性COOH末端で構成され
ている。かかる“疎水性”シグナル配列はタンパク質を
案内して小胞体（ER）膜を通過させ、そして細菌膜を通
過させる。細菌およびERシグナル配列は相互にわずかに
異なるが、機能的には相互交換可能である。“親水性”
タイプの構造は前述の“疎水性”タイプのそれと大きく
異なる。すなわち、“親水性”タイプには疎水性アミノ
酸の中断されていない長セクシヨンは存在しないが、通
常多くの塩基性でヒドロキシル化されたアミノ酸が存在
しそして酸性アミノ酸はほとんどあるいは全く存在しな
い。“親水性”タイプのシグナル配列はミトコンドリ
ア、葉緑体、そして場合によってはペルオキシゾーム中
にもタンパク質を案内する。それは本発明には意義を持
たない。
なわち“疎水性”タイプと“親水性”タイプに区別する
ことができる。“疎水性”群のシグナル配列は通常約13
〜30個のアミノ酸より成るのに対し、“親水性”群は約
12〜70個のアミノ酸より成る。“疎水性”タイプのシグ
ナル配列は三つの構成要素に分けることができる。それ
は、１個または２個の塩基性アミノ酸を有する比較的親
水性のNH2末端、７個または８個のアミノ酸の非極性で
主として疎水性のブロツク、および小さな側鎖を有する
アミノ酸を末端に持つ比較的親水性COOH末端で構成され
ている。かかる“疎水性”シグナル配列はタンパク質を
案内して小胞体（ER）膜を通過させ、そして細菌膜を通
過させる。細菌およびERシグナル配列は相互にわずかに
異なるが、機能的には相互交換可能である。“親水性”
タイプの構造は前述の“疎水性”タイプのそれと大きく
異なる。すなわち、“親水性”タイプには疎水性アミノ
酸の中断されていない長セクシヨンは存在しないが、通
常多くの塩基性でヒドロキシル化されたアミノ酸が存在
しそして酸性アミノ酸はほとんどあるいは全く存在しな
い。“親水性”タイプのシグナル配列はミトコンドリ
ア、葉緑体、そして場合によってはペルオキシゾーム中
にもタンパク質を案内する。それは本発明には意義を持
たない。
前述の如く、原核および真核由来の“疎水性”タイプ
のシグナル配列は共通した特徴を有し、そして機能的に
は相互交換可能であるが、認むべき相違も存在する：す
なわち、これまでに知られている大抵の原核性シグナル
配列は、“疎水性”タイプ（＝ERタイプ）の真核性シグ
ナル配列に比べ、非極性セクシヨンの疎水性が低くまた
通常、NH2領域に付加的な塩基性アミノ酸を有してい
る。多分このために異種タンパク質の天然シグナル配列
がこのタンパク質に先行する細菌性シグナル配列より
も、通常、より非効率的に認識されるプロセシングを受
けるのであろう。
のシグナル配列は共通した特徴を有し、そして機能的に
は相互交換可能であるが、認むべき相違も存在する：す
なわち、これまでに知られている大抵の原核性シグナル
配列は、“疎水性”タイプ（＝ERタイプ）の真核性シグ
ナル配列に比べ、非極性セクシヨンの疎水性が低くまた
通常、NH2領域に付加的な塩基性アミノ酸を有してい
る。多分このために異種タンパク質の天然シグナル配列
がこのタンパク質に先行する細菌性シグナル配列より
も、通常、より非効率的に認識されるプロセシングを受
けるのであろう。
大腸菌（E.coli）における異種タンパク質の分泌は、
通常、内膜からペリプラスム空間内への輸送として行わ
れる。異種タンパク質が周囲媒質中に分泌される例外は
ほんのわずかしか知られていない。大腸菌におけるペリ
プラスム空間内への異種タンパク質の輸送は、機能的に
は、真核細胞の小胞体の管腔内へのタンパク質輸送に実
質的に相当する。このプロセスの結果として、タンパク
質を正しく折りたたむことができ、そして大腸菌内で分
子内ジスルフィド架橋を正しく作ることもできる。シグ
ナル配列は特異的シグナルペプチターゼによるタンパク
質加水分解により除かれ、そしてそのようにして成熟し
た“プロセシング”された（processed）”異種タンパ
ク質が大腸菌内で合成される。
通常、内膜からペリプラスム空間内への輸送として行わ
れる。異種タンパク質が周囲媒質中に分泌される例外は
ほんのわずかしか知られていない。大腸菌におけるペリ
プラスム空間内への異種タンパク質の輸送は、機能的に
は、真核細胞の小胞体の管腔内へのタンパク質輸送に実
質的に相当する。このプロセスの結果として、タンパク
質を正しく折りたたむことができ、そして大腸菌内で分
子内ジスルフィド架橋を正しく作ることもできる。シグ
ナル配列は特異的シグナルペプチターゼによるタンパク
質加水分解により除かれ、そしてそのようにして成熟し
た“プロセシング”された（processed）”異種タンパ
ク質が大腸菌内で合成される。
一部のタンパク質は、細菌、例えば大腸菌、内で細胞
質発現後不安定であり、そしてプロテアーゼにより再び
極めて迅速に分解されてしまう。この分解は、就中、こ
れらのタンパク質が先行する極めて効率的なシグナル配
列によりペリプラスム空間内に迅速に分泌されることに
よって防止することができる。従って、特に効率のよい
シグナル配列を単離しそしてこれに適した方法を設計す
ることが課題であった。
質発現後不安定であり、そしてプロテアーゼにより再び
極めて迅速に分解されてしまう。この分解は、就中、こ
れらのタンパク質が先行する極めて効率的なシグナル配
列によりペリプラスム空間内に迅速に分泌されることに
よって防止することができる。従って、特に効率のよい
シグナル配列を単離しそしてこれに適した方法を設計す
ることが課題であった。
HoffmanおよびWright（Proc.Acad.Natl.Sci.USA;（19
85）82,5107−5111）は、それに属するシグナル配列の
ない大腸菌由来のペリプラスミツクアルカリ性ホスフア
ターゼ（phoA,EC 3.1.3.1）をコードするプラスミドを
記載している。それら自身のシグナル配列を有する融合
相手と試験官内で融合すると、融合タンパク質の形で活
性アルカリ性ホスフアターゼが分泌されるのに対し、融
合付加されるシグナル配列が存在しないときは、細胞質
内に放出されるアルカリ性ホスフアターゼの活性は検出
し得ない。ManoilおよびBeckwith（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA（1985）82,8129−8133はこの研究を続けて３′側
にシグナル配列およびそれに続く５個のアミノ酸を持た
ないphoAをコードするcDNAをトランスポゾンTn5の前に
置き（loc.cit.）そしてそれによって分泌タンパク質と
の融合だけでなく膜タンパク質との融合によっても活性
phoAが得られることを示すことができた。従って前述の
構築物“TnphoA"はシグナル配列またはシグナル配列に
類似する構造をつきとめるのに適している。
85）82,5107−5111）は、それに属するシグナル配列の
ない大腸菌由来のペリプラスミツクアルカリ性ホスフア
ターゼ（phoA,EC 3.1.3.1）をコードするプラスミドを
記載している。それら自身のシグナル配列を有する融合
相手と試験官内で融合すると、融合タンパク質の形で活
性アルカリ性ホスフアターゼが分泌されるのに対し、融
合付加されるシグナル配列が存在しないときは、細胞質
内に放出されるアルカリ性ホスフアターゼの活性は検出
し得ない。ManoilおよびBeckwith（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA（1985）82,8129−8133はこの研究を続けて３′側
にシグナル配列およびそれに続く５個のアミノ酸を持た
ないphoAをコードするcDNAをトランスポゾンTn5の前に
置き（loc.cit.）そしてそれによって分泌タンパク質と
の融合だけでなく膜タンパク質との融合によっても活性
phoAが得られることを示すことができた。従って前述の
構築物“TnphoA"はシグナル配列またはシグナル配列に
類似する構造をつきとめるのに適している。
S.KnappおよびJ.Mekalanos（J.Bacteriology（1988）
170,5059−5066）は、TnphoA突然変異誘発により、変調
信号（この場合にはニコチン酸およびMgSO4）により影
響を受けるボルデテラ・ペルツツシスの突然変異体を作
ったが、大部分のこれらの突然変異体は抑制されており
そして一部は活性化されている。このことは少くとも二
つの調節遺伝子が働いている（transacting）ことを示
唆している。
170,5059−5066）は、TnphoA突然変異誘発により、変調
信号（この場合にはニコチン酸およびMgSO4）により影
響を受けるボルデテラ・ペルツツシスの突然変異体を作
ったが、大部分のこれらの突然変異体は抑制されており
そして一部は活性化されている。このことは少くとも二
つの調節遺伝子が働いている（transacting）ことを示
唆している。
我々はそこに記載されている突然変異体SK6が新規で
あって極めて効率のよいシグナル配列を含んでいること
を見出した。
あって極めて効率のよいシグナル配列を含んでいること
を見出した。
この新規シグナル配列はボルデテラ・ペルツツシス由
来の分泌タンパク質であって次の配列 を有する（第２表および第３表参照）。
来の分泌タンパク質であって次の配列 を有する（第２表および第３表参照）。
更に、一方において“シグナル配列クローン化ベクタ
ー”として極めて適し、他方において様々なシグナル配
列をそれらの“分泌効率”によつて低量的に比較するこ
とを可能にするphoA含有プラスミドも記載される。両目
的に特に有用なのはベクターpTrc99C−phoAである（第
１図、第１表および実施例２）。このベクターは、pTrc
99C（Amann et al.Gene 69（1988）301−315）およびそ
の趣旨に沿って修飾されまたシグナルペプチド配列を持
たないphoA DNAから、phoAの遺伝子がpTrc99Cの翻訳開
始コドンに関し正しい解読枠に位置しそしてNco I切断
部位が（シグナル配列のない）phoA構造遺伝子の５′端
に直接設けられるように構築した。
ー”として極めて適し、他方において様々なシグナル配
列をそれらの“分泌効率”によつて低量的に比較するこ
とを可能にするphoA含有プラスミドも記載される。両目
的に特に有用なのはベクターpTrc99C−phoAである（第
１図、第１表および実施例２）。このベクターは、pTrc
99C（Amann et al.Gene 69（1988）301−315）およびそ
の趣旨に沿って修飾されまたシグナルペプチド配列を持
たないphoA DNAから、phoAの遺伝子がpTrc99Cの翻訳開
始コドンに関し正しい解読枠に位置しそしてNco I切断
部位が（シグナル配列のない）phoA構造遺伝子の５′端
に直接設けられるように構築した。
従って、本発明は、 ａ） シグナル配列 ｂ） このタイプの配列を有するプラスミド ｃ） タンパク質分泌のためのその使用 ｄ） 調節可能な強力なプロモーター、例えばtrc、の
次にlacZリボソーム結合部位（RBS）が、そしてそのlac
Z RBSから高発現のために至適化されたある距離をおい
てベクター・コード化翻訳開始コドンがくるようにし、
Nco I切断部位をシグナル配列を持たないphoA構造遺伝
子の５′端に直接存在させ、phoA配列の中からは突然変
異により欠失させた、シグナル配列のクローン化および
定量的評価に特に適したプラスミド、好ましくはpTrc99
C−phoA に関する。
次にlacZリボソーム結合部位（RBS）が、そしてそのlac
Z RBSから高発現のために至適化されたある距離をおい
てベクター・コード化翻訳開始コドンがくるようにし、
Nco I切断部位をシグナル配列を持たないphoA構造遺伝
子の５′端に直接存在させ、phoA配列の中からは突然変
異により欠失させた、シグナル配列のクローン化および
定量的評価に特に適したプラスミド、好ましくはpTrc99
C−phoA に関する。
更に本発明を実施例および特許請求の範囲に詳述す
る。
る。
実施例 １ ボルデテラ・ペルツツシスシグナル配列の同定および単
離 以下に用いるトランスポゾンTnphoAは、トランスポゾ
ンTn5の誘導体である。TnphoAは左IS50挿入要素中にシ
グナル配列を持たない大腸菌phoA構造遺伝子誘導体を有
している。後者はManoilおよびBeckwith（loc.cit.）の
方法により、TnphoAが染色体またはプラスミド−コード
化遺伝子中に転移した場合に、TnphoAからの大腸菌pho
構造遺伝子とその転移により影響を受けた構造遺伝子の
シグナル配列の解読枠が符号するときにだけphoA陽性遺
伝子融合が生じるように構築されている。かかるphoA陽
性コロニーは色素指示薬である５−ブロモ−４−クロロ
−インドキシルホスフエートトルイジン（XP）を用いて
容易に確認できる。前述の方法を用いてボルデテラ・ペ
ルツツシス野生株18323（KnappおよびMekalanos（198
8）loc.cit.）においてTnphoA突然変異誘発を行った。
この結果、就中、phoA−陽性TnphoA突然変異体SK6が生
じたが、そのTnphoA遺伝子融合をvrg6と呼ぶ。そのvrg6
遺伝子融合を次のようにしてベクタープラスミドpBR322
中の20 kb BamH I断片にクローン化した。すなわち、突
然変異体SK6のゲノムDNAをBamH Iで切断しそしてBamH I
で切断されたpBR322 DNAと連結しそしてそれを用いて大
腸菌株CC118（＝phoA陰性）を形質転換した。TnphoA遺
伝子融合を有するゲノム断片を含むコロニーをカナマイ
シン／アンピリシン寒天プレートで選抜した（TnphoAは
Tn5と同様TnphoAの５′phoA部分とTnphoA内の特有のBam
H I切断部位の間に位置するカナマイシン抵抗性遺伝子
をコードする）。
離 以下に用いるトランスポゾンTnphoAは、トランスポゾ
ンTn5の誘導体である。TnphoAは左IS50挿入要素中にシ
グナル配列を持たない大腸菌phoA構造遺伝子誘導体を有
している。後者はManoilおよびBeckwith（loc.cit.）の
方法により、TnphoAが染色体またはプラスミド−コード
化遺伝子中に転移した場合に、TnphoAからの大腸菌pho
構造遺伝子とその転移により影響を受けた構造遺伝子の
シグナル配列の解読枠が符号するときにだけphoA陽性遺
伝子融合が生じるように構築されている。かかるphoA陽
性コロニーは色素指示薬である５−ブロモ−４−クロロ
−インドキシルホスフエートトルイジン（XP）を用いて
容易に確認できる。前述の方法を用いてボルデテラ・ペ
ルツツシス野生株18323（KnappおよびMekalanos（198
8）loc.cit.）においてTnphoA突然変異誘発を行った。
この結果、就中、phoA−陽性TnphoA突然変異体SK6が生
じたが、そのTnphoA遺伝子融合をvrg6と呼ぶ。そのvrg6
遺伝子融合を次のようにしてベクタープラスミドpBR322
中の20 kb BamH I断片にクローン化した。すなわち、突
然変異体SK6のゲノムDNAをBamH Iで切断しそしてBamH I
で切断されたpBR322 DNAと連結しそしてそれを用いて大
腸菌株CC118（＝phoA陰性）を形質転換した。TnphoA遺
伝子融合を有するゲノム断片を含むコロニーをカナマイ
シン／アンピリシン寒天プレートで選抜した（TnphoAは
Tn5と同様TnphoAの５′phoA部分とTnphoA内の特有のBam
H I切断部位の間に位置するカナマイシン抵抗性遺伝子
をコードする）。
カナマイシン抵抗性を有するTnphoA突然変異体からの
ゲノムBamH I断片は従って、次のゲノムBamH I切断部位
までの上流に位置するゲノムボルデテラ・ペルツツシス
DNAおよびphoA構造遺伝子を有しなければならない。サ
イズが20kbでありvrg6遺伝子融合を有するBamH I断片の
場合、約14kbがゲノムボルデテラ・ペルツツシスDNAに
対応しそして約6kbがTnphoAをコードするDNAに対応す
る。vrg6遺伝子融合の転写および翻訳調節配列を更に位
置決めする。このために、20kbのサイズのBamH I断片を
制限分析にかけ、そしてTnphoAからの全phoA配列を有す
るが20kb断片に比べ切込まれたボルデテラ・ペルツツシ
スDNA領域を有するサブ断片をpBR322およびpUC18中にク
ローン化した。このようにして得られた欠失誘導体をボ
ルデテラ・ペルツツシス中で複製し得るプラスミドpLAF
R2中に再クローン化し（Friedmann et al.（1982）,Gen
e 18,289−196）そしてボルデテラ・ペルツツシス中に
接合伝達（conjugative transfer）後、変調を受けやす
いphoA活性を検査した。このようにして約3.2kbのサイ
ズのPst I断片を同定しそしてその段階においてvrg6遺
伝子融合のTnphoA挿入部位の上流にわずか約500塩基対
のボルデテラ・ペルツツシスDNAしか含まずそしてボル
デテラ・ペルツツシスにおいて誘導後phoA陽性であるpU
C18（以下pUC−PIと呼ばれる）中にサブクローン化し
た。20kbのサイズのクローン化されたBamH I断片または
3.2kbのサイズのPst I断片を含むボルデテラ・ペルツツ
シス誘導体のphoA活性はそれらのホスフアターゼ活性に
おいて本質的に相違しないことから、後者の断片のvrg6
遺伝子融合の転写および翻訳調節配列は依然として完全
に存在しているはずである。pUC−PIより出発して、Hen
ikoffの方法（（1984）Gene 28,351−359）により酵素
エクソヌクレアーゼIIIおよびS1ヌクレアーゼを用いてT
nphoA挿入部の上流500塩基対に位置するDNA領域中に欠
失を導入した。これにより、就中、２つのpUC−PI誘導
体vrg6−デルタ12およびvrg6−デルタ11が得られた。vr
g6−デルタ12はTnphoA挿入部位の上流に約200塩基対の
ボルデテラ・ペルツツシス特異的DNAを含み、そして同
じくphoA陽性である。DNAシーケンシングを用いてこの
組換えプラスミドのボルデテラ・ペルツツシスシグナル
配列を決定した。
ゲノムBamH I断片は従って、次のゲノムBamH I切断部位
までの上流に位置するゲノムボルデテラ・ペルツツシス
DNAおよびphoA構造遺伝子を有しなければならない。サ
イズが20kbでありvrg6遺伝子融合を有するBamH I断片の
場合、約14kbがゲノムボルデテラ・ペルツツシスDNAに
対応しそして約6kbがTnphoAをコードするDNAに対応す
る。vrg6遺伝子融合の転写および翻訳調節配列を更に位
置決めする。このために、20kbのサイズのBamH I断片を
制限分析にかけ、そしてTnphoAからの全phoA配列を有す
るが20kb断片に比べ切込まれたボルデテラ・ペルツツシ
スDNA領域を有するサブ断片をpBR322およびpUC18中にク
ローン化した。このようにして得られた欠失誘導体をボ
ルデテラ・ペルツツシス中で複製し得るプラスミドpLAF
R2中に再クローン化し（Friedmann et al.（1982）,Gen
e 18,289−196）そしてボルデテラ・ペルツツシス中に
接合伝達（conjugative transfer）後、変調を受けやす
いphoA活性を検査した。このようにして約3.2kbのサイ
ズのPst I断片を同定しそしてその段階においてvrg6遺
伝子融合のTnphoA挿入部位の上流にわずか約500塩基対
のボルデテラ・ペルツツシスDNAしか含まずそしてボル
デテラ・ペルツツシスにおいて誘導後phoA陽性であるpU
C18（以下pUC−PIと呼ばれる）中にサブクローン化し
た。20kbのサイズのクローン化されたBamH I断片または
3.2kbのサイズのPst I断片を含むボルデテラ・ペルツツ
シス誘導体のphoA活性はそれらのホスフアターゼ活性に
おいて本質的に相違しないことから、後者の断片のvrg6
遺伝子融合の転写および翻訳調節配列は依然として完全
に存在しているはずである。pUC−PIより出発して、Hen
ikoffの方法（（1984）Gene 28,351−359）により酵素
エクソヌクレアーゼIIIおよびS1ヌクレアーゼを用いてT
nphoA挿入部の上流500塩基対に位置するDNA領域中に欠
失を導入した。これにより、就中、２つのpUC−PI誘導
体vrg6−デルタ12およびvrg6−デルタ11が得られた。vr
g6−デルタ12はTnphoA挿入部位の上流に約200塩基対の
ボルデテラ・ペルツツシス特異的DNAを含み、そして同
じくphoA陽性である。DNAシーケンシングを用いてこの
組換えプラスミドのボルデテラ・ペルツツシスシグナル
配列を決定した。
シグナル配列は次のとおりである： （第２表も参照のこと）。このようにして特徴付けられ
たボルデテラ・ペルツツシスシグナル配列は21個のアミ
ノ酸より成り、そして次いで実施例２に記載の如く調製
しクローン化する。それは異種タンパク質の分泌に適し
ている。
たボルデテラ・ペルツツシスシグナル配列は21個のアミ
ノ酸より成り、そして次いで実施例２に記載の如く調製
しクローン化する。それは異種タンパク質の分泌に適し
ている。
vrg6−デルタ11はTnphoA挿入部位の上流に４個のボル
デテラ・ペルツツシス特異的ヌクレオチドしか含まず、
その次にpUC18−特異的SacI切断部位を伴う（第１
表）。vrg6−デルタ11 DNAのPstI/SacIによりTnphoAか
らの完全なphoA構造遺伝子が得られるが、これはシグナ
ル配列を持たずそして約2.6kbのサイズであって、実施
例２においてシグナル配列を持たないphoA構造遺伝子の
給源として役立つ断片にある。
デテラ・ペルツツシス特異的ヌクレオチドしか含まず、
その次にpUC18−特異的SacI切断部位を伴う（第１
表）。vrg6−デルタ11 DNAのPstI/SacIによりTnphoAか
らの完全なphoA構造遺伝子が得られるが、これはシグナ
ル配列を持たずそして約2.6kbのサイズであって、実施
例２においてシグナル配列を持たないphoA構造遺伝子の
給源として役立つ断片にある。
実施例 ２ シグナル配列のクローン化および効率の比較測定のため
のベクタープラスミド（pTrc99C−phoA）の構築 ベクタープラスミドpTrc99C−phoAの構築を以下記載
する。このベクタープラスミドは必須要素として既に前
に記載され、シグナル配列を持たず、そしてTnphoAから
単離されたphoaA構造遺伝子を有する。そのphoA構造遺
伝子は内部NcoI切断部位を有する。この切断部位を、ア
ミノ酸配列は維持しながら、部位−指向性（site−dire
cted）突然変異誘発方法により除去した。
のベクタープラスミド（pTrc99C−phoA）の構築 ベクタープラスミドpTrc99C−phoAの構築を以下記載
する。このベクタープラスミドは必須要素として既に前
に記載され、シグナル配列を持たず、そしてTnphoAから
単離されたphoaA構造遺伝子を有する。そのphoA構造遺
伝子は内部NcoI切断部位を有する。この切断部位を、ア
ミノ酸配列は維持しながら、部位−指向性（site−dire
cted）突然変異誘発方法により除去した。
このために、まず組換えphoA−陰性プラスミドpvg6−
デルタ11（実施例１参照）をEcoR Iで切断し、そしてph
oA構造遺伝子の内部領域からの330塩基対のサイズの断
片を単離した。突然変異を受けるべきNco I切断部位を
含むこの断片を突然変異誘発ベクターpMa5−８（第３
図）のEcoR I部位に連結した。得られたプラスミドpMa5
−８−EcoR I 330を単離し、そして一本線の調製に用
いた。このようにして得られたクローン化されたEcoR I
断片を有する一本鎖を次いで既知の方法により単離し、
そして次のオリゴデオキシヌクレオチド、すなわち を用いて公表されたギヤツプト−デユプレツクス（gapp
ed−duplex）突然変異誘発プロトコール（Kramer et a
l.（1984）Nucl.Acids Res.12,9441−9456）に付した。
デルタ11（実施例１参照）をEcoR Iで切断し、そしてph
oA構造遺伝子の内部領域からの330塩基対のサイズの断
片を単離した。突然変異を受けるべきNco I切断部位を
含むこの断片を突然変異誘発ベクターpMa5−８（第３
図）のEcoR I部位に連結した。得られたプラスミドpMa5
−８−EcoR I 330を単離し、そして一本線の調製に用
いた。このようにして得られたクローン化されたEcoR I
断片を有する一本鎖を次いで既知の方法により単離し、
そして次のオリゴデオキシヌクレオチド、すなわち を用いて公表されたギヤツプト−デユプレツクス（gapp
ed−duplex）突然変異誘発プロトコール（Kramer et a
l.（1984）Nucl.Acids Res.12,9441−9456）に付した。
目的とするNco I突然変異の生じたプラスミドを適宜
の制限分析により同定し、そして関連の領域を配列決定
しそして正しいことを確認した。次に330塩基対のサイ
ズのEcoR I断片をこのプラスミドから再単離しそしてプ
ラスミドpvrg6−デルタ11の対応する断片と入れ替え
た。このために、pvrg6−デルタ11をEcoR Iで部分消化
し、そして、部分消化により線状化された出発時のプラ
スミドpvrg−デルタ11（約6700bp）よりも330塩基対だ
け短い断片を単離した。このサイズ（約6400bp）のEcoR
I断片をアルカリ性ホスフアターゼで処理し、そして33
0塩基対のサイズの突然変異したEcoR I断片に連結し、
そしてその連結混合物を用いて大腸菌を形質転換した。
330塩基対EcoR I断片が正しく挿入された復元されたpho
A構造遺伝子を含む組換えプラスミドを制限分析およびD
NA−シーケンシングにより同定した。このタイプの組換
えプラスミド、pvrg6−デルタ11−デルタNcoR I、を複
製させ、そしてハイブリツドプラスミドpTrc99C−phoA
の構築に用いた。このために、約2600塩基対のサイズの
Sac I−Sca I断片をpvrg6−デルタ11−デルタNcoR Iか
ら単離した。次の段階で、pTrc99C（Amann at al.（198
8）Gene 69,301−315からの約900塩基対のサイズのSac
I−Sca I断片を約2600塩基対のサイズのこのSac I−Sca
I断片で置き代えた。得られた組換えプラスミドpTrc99
C−phoAは、前述の操作の結果、シグナル配列を持たな
いphoA構造遺伝子の５′端に直接、特有のNco I切断部
位を有しており、そしてそれは次の実施例に示されると
おり、任意の所望の合成または天然シグナル配列のクロ
ーン化に用いることができる。pTrc99C−phoAは発現ベ
クターpTrc99Cの翻訳開始コマンドに関し正しい解読枠
でphoAの構造遺伝子を有しているが、phoAシグナル配列
が存在しないために、形質転換大腸菌細胞中で酵素的に
活性なアルカリ性ホスフアターゼの合成を生起させるこ
とができず、従って“シグナル配列クローニングベクト
ル”として適している。更に、pTrc99C−phoAは、ハイ
ブリツドtrcプロモーター（AmannおよびBrosius（198
5）Gene 40,183−190）の上流に、lacZボソーム結合部
位（RBS）を、そしてそのlacZ RBSから高発現のために
至適化されたある距離をおいて翻訳開始コドンを有す
る。組換えプラスミドpTrc99C−phoAを含む大腸菌細胞
はプラスミドにコード化された生物学的に活性なアルカ
リ性ホスフアターゼ活性を産生しないが、それはこのプ
ラスミドのphoA構造遺伝子がシグナル配列を欠いている
ためである。phoA−陽性コロニーは、シグナル配列をコ
ードするDNA断片をphoA構造遺伝子の前に正しい解読枠
で置くことにより生成させることができる。これは、pT
rc99C−phoAをNco Iで切断しそしてシグナル配列をコー
ドする合成DNA断片をこのベクターDNAに挿入することに
より行われる。この操作のハイブリツドプラスミドを有
する細菌コロニーは、既に前述した色素指示薬XPを用い
てそれらの新しいphoA−陽性表現型により容易に同定す
ることができる。以上に示された原理を、以下、例示の
態様の形で説明する。様々な分泌タンパク質のシグナル
配列をpTrc99C−phoAベクターにクローン化するとシグ
ナル配列だけが異なる同質遺伝子の（isogenic）組換え
プラスミドが得られる。こうした理由から、かかる構築
物を含む大腸菌細胞のphoA活性は、関連のクローン化さ
れたシグナル配列の効率の尺度となる。
の制限分析により同定し、そして関連の領域を配列決定
しそして正しいことを確認した。次に330塩基対のサイ
ズのEcoR I断片をこのプラスミドから再単離しそしてプ
ラスミドpvrg6−デルタ11の対応する断片と入れ替え
た。このために、pvrg6−デルタ11をEcoR Iで部分消化
し、そして、部分消化により線状化された出発時のプラ
スミドpvrg−デルタ11（約6700bp）よりも330塩基対だ
け短い断片を単離した。このサイズ（約6400bp）のEcoR
I断片をアルカリ性ホスフアターゼで処理し、そして33
0塩基対のサイズの突然変異したEcoR I断片に連結し、
そしてその連結混合物を用いて大腸菌を形質転換した。
330塩基対EcoR I断片が正しく挿入された復元されたpho
A構造遺伝子を含む組換えプラスミドを制限分析およびD
NA−シーケンシングにより同定した。このタイプの組換
えプラスミド、pvrg6−デルタ11−デルタNcoR I、を複
製させ、そしてハイブリツドプラスミドpTrc99C−phoA
の構築に用いた。このために、約2600塩基対のサイズの
Sac I−Sca I断片をpvrg6−デルタ11−デルタNcoR Iか
ら単離した。次の段階で、pTrc99C（Amann at al.（198
8）Gene 69,301−315からの約900塩基対のサイズのSac
I−Sca I断片を約2600塩基対のサイズのこのSac I−Sca
I断片で置き代えた。得られた組換えプラスミドpTrc99
C−phoAは、前述の操作の結果、シグナル配列を持たな
いphoA構造遺伝子の５′端に直接、特有のNco I切断部
位を有しており、そしてそれは次の実施例に示されると
おり、任意の所望の合成または天然シグナル配列のクロ
ーン化に用いることができる。pTrc99C−phoAは発現ベ
クターpTrc99Cの翻訳開始コマンドに関し正しい解読枠
でphoAの構造遺伝子を有しているが、phoAシグナル配列
が存在しないために、形質転換大腸菌細胞中で酵素的に
活性なアルカリ性ホスフアターゼの合成を生起させるこ
とができず、従って“シグナル配列クローニングベクト
ル”として適している。更に、pTrc99C−phoAは、ハイ
ブリツドtrcプロモーター（AmannおよびBrosius（198
5）Gene 40,183−190）の上流に、lacZボソーム結合部
位（RBS）を、そしてそのlacZ RBSから高発現のために
至適化されたある距離をおいて翻訳開始コドンを有す
る。組換えプラスミドpTrc99C−phoAを含む大腸菌細胞
はプラスミドにコード化された生物学的に活性なアルカ
リ性ホスフアターゼ活性を産生しないが、それはこのプ
ラスミドのphoA構造遺伝子がシグナル配列を欠いている
ためである。phoA−陽性コロニーは、シグナル配列をコ
ードするDNA断片をphoA構造遺伝子の前に正しい解読枠
で置くことにより生成させることができる。これは、pT
rc99C−phoAをNco Iで切断しそしてシグナル配列をコー
ドする合成DNA断片をこのベクターDNAに挿入することに
より行われる。この操作のハイブリツドプラスミドを有
する細菌コロニーは、既に前述した色素指示薬XPを用い
てそれらの新しいphoA−陽性表現型により容易に同定す
ることができる。以上に示された原理を、以下、例示の
態様の形で説明する。様々な分泌タンパク質のシグナル
配列をpTrc99C−phoAベクターにクローン化するとシグ
ナル配列だけが異なる同質遺伝子の（isogenic）組換え
プラスミドが得られる。こうした理由から、かかる構築
物を含む大腸菌細胞のphoA活性は、関連のクローン化さ
れたシグナル配列の効率の尺度となる。
ベクターpTrc99C−phoAのもう一つの可能な用途は、
明確に規定されたシグナル配列をコードすることなく、
シグナル配列の各位置に対し複数のアミノ酸が可能とな
るように縮退している合成DNA断片のクローニングであ
る。これはある程度、シヨツトガンクローニングであ
り、そして、このベクター故に可能となったphoA活性測
定値は人工シグナル配列の効率の尺度となる。この方法
を用いて、クローン化遺伝子の異種発現に使用可能な新
しいシグナル配列を調製しそして評価することができ
る。
明確に規定されたシグナル配列をコードすることなく、
シグナル配列の各位置に対し複数のアミノ酸が可能とな
るように縮退している合成DNA断片のクローニングであ
る。これはある程度、シヨツトガンクローニングであ
り、そして、このベクター故に可能となったphoA活性測
定値は人工シグナル配列の効率の尺度となる。この方法
を用いて、クローン化遺伝子の異種発現に使用可能な新
しいシグナル配列を調製しそして評価することができ
る。
pTrc99C−phoAの構築原理を第１図に図示する。
略語の意味:N＝Nco I、Ｓ＝Sac I、Ｐ＝Pst I、〔Ｎ〕
＝連結後Nco I部位が再生されていない。′phoA＝シグ
ナル配列を持たないphoA構造遺伝子。矢印は転写方向ま
たは翻訳された領域のNH2→COOH配向を示す。Oligoは合
成オリゴヌクレオチド配列を意味する。第１表はpTrc99
C−phoAの関連クローニングおよび翻訳開始領域を示し
ている。
＝連結後Nco I部位が再生されていない。′phoA＝シグ
ナル配列を持たないphoA構造遺伝子。矢印は転写方向ま
たは翻訳された領域のNH2→COOH配向を示す。Oligoは合
成オリゴヌクレオチド配列を意味する。第１表はpTrc99
C−phoAの関連クローニングおよび翻訳開始領域を示し
ている。
実施例 ３ ボルデテラ・ペルツツシスシグナル配列の、および分泌
タンパク質の５種類の他の天然微生物シグナル配列のDN
A合成とクローニング ベクターpTrc99C−phoAを用いて第２表に示されたア
ミノ酸配列に対する６種類の異なるシグナル配列をクロ
ーン化した。新しいボルデテラ・ペルツツシスシグナル
配列のほか５種類の他のシグナル配列は次の基準に基づ
いて選抜した： ａ） ペリプラスミツクタンパク質のシグナル配列 −大腸菌由来のアルカリ性ホスフアターゼ（phoA）
（Kikuchi et al.（1981）Nucleic Acid Res.9,5671−5
678） ｂ） 外膜タンパク質のシグナル配列 −大腸菌由来の外膜タンパク質（ompA）（Movva et a
l.（1980）J.Biol.Chem.255,27−29） ｃ） 媒質中に分泌される三種類のタンパク質のシグナ
ル配列 −大腸菌由来の熱安定性毒素Ｉ（STI）（SoおよびMcC
arthy（1980）−Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,4011−401
5） −大腸菌由来の熱安定性毒素II（ST II）（Lee et a
l.（1983）Infect.Immun.42,264−268） −枯草菌（Bacillus subtillis）由来のアミラーゼ
（Vang et al（1983）Nucleic Acids Res.11,237−24
9） 三種類のシグナル配列の合成およびクローニングには
次の簡略名称を用いた： ボルデテラ・ペルツツシス vrg−6 シグナル配列＝Seq1 phoA シグナル配列＝Seq2 OmpA シグナル配列＝Seq3 ST I シグナル配列＝Seq4 ST II シグナル配列＝Seq5 枯草菌アミラーゼシグナル配列＝Seq6 前述の６種類すべてのシグナル配列をDNA合成により
製造した。（第３表に示された）この目的のために合成
されたDNA断片を実施例２に記載のアルカリ性ホスフア
ターゼを指標とする選抜を用いてテストベクターpTrc99
C−phoAでクローン化し同定した。シグナル配列をコー
ドする合成DNA断片は、ベクターpTrc99C−phoAに正しい
方向に挿入後唯一のNco I部位が（詳細にはそのシグナ
ル配列コードする領域の下流に）再生されるように設計
した（第１図、第３表および第４表も参照）。このよう
にして、実施例４で更に詳述されるように、このNco I
部位を異種遺伝子をpSECベクター（pSEC＝分泌）に挿入
するためのクローニング部位として更に用いることがで
きる。
タンパク質の５種類の他の天然微生物シグナル配列のDN
A合成とクローニング ベクターpTrc99C−phoAを用いて第２表に示されたア
ミノ酸配列に対する６種類の異なるシグナル配列をクロ
ーン化した。新しいボルデテラ・ペルツツシスシグナル
配列のほか５種類の他のシグナル配列は次の基準に基づ
いて選抜した： ａ） ペリプラスミツクタンパク質のシグナル配列 −大腸菌由来のアルカリ性ホスフアターゼ（phoA）
（Kikuchi et al.（1981）Nucleic Acid Res.9,5671−5
678） ｂ） 外膜タンパク質のシグナル配列 −大腸菌由来の外膜タンパク質（ompA）（Movva et a
l.（1980）J.Biol.Chem.255,27−29） ｃ） 媒質中に分泌される三種類のタンパク質のシグナ
ル配列 −大腸菌由来の熱安定性毒素Ｉ（STI）（SoおよびMcC
arthy（1980）−Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77,4011−401
5） −大腸菌由来の熱安定性毒素II（ST II）（Lee et a
l.（1983）Infect.Immun.42,264−268） −枯草菌（Bacillus subtillis）由来のアミラーゼ
（Vang et al（1983）Nucleic Acids Res.11,237−24
9） 三種類のシグナル配列の合成およびクローニングには
次の簡略名称を用いた： ボルデテラ・ペルツツシス vrg−6 シグナル配列＝Seq1 phoA シグナル配列＝Seq2 OmpA シグナル配列＝Seq3 ST I シグナル配列＝Seq4 ST II シグナル配列＝Seq5 枯草菌アミラーゼシグナル配列＝Seq6 前述の６種類すべてのシグナル配列をDNA合成により
製造した。（第３表に示された）この目的のために合成
されたDNA断片を実施例２に記載のアルカリ性ホスフア
ターゼを指標とする選抜を用いてテストベクターpTrc99
C−phoAでクローン化し同定した。シグナル配列をコー
ドする合成DNA断片は、ベクターpTrc99C−phoAに正しい
方向に挿入後唯一のNco I部位が（詳細にはそのシグナ
ル配列コードする領域の下流に）再生されるように設計
した（第１図、第３表および第４表も参照）。このよう
にして、実施例４で更に詳述されるように、このNco I
部位を異種遺伝子をpSECベクター（pSEC＝分泌）に挿入
するためのクローニング部位として更に用いることがで
きる。
第３表に示した12種類のDNA断片をβ−シアノエチル
アミダイト類を用いて既知の方法により合成した（Sinh
a et al.（1984）Nucl.Acids Res.12,4539−4557）。そ
れら合成は、Biosearch合成装置を用いてホスフアイト
トリエステル法により行った（Letsinger（1975）J.Ame
r.Chem.Soc.97,3278;Letsinger（1976）J.Amer.Chem.So
c.98,3655）。室温で５〜８時間濃アンモニアを用いて
担体（CPG）から分解除去しそして塩基の保護基を同じ
溶液中55℃で12時間分解除去した後、オリゴデオキシヌ
クレオチドをゲル電気泳動または逆相HPLCにより精製し
た。それらオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリング
緩衝液（100mM NaCl,10mM TRIS−Cl（pH7.8）、0.1mM E
DTA）にとり、モル量の各鎖を混合し、95℃で５分間イ
ンキユベートし、そして徐々に室温に冷却した。それら
二本鎖DNA断片は、５′端に、４塩基長であってNco I認
識部位に相補適な一本鎖領域を有する。テストベクター
pTrc99c−phoAをNco Iで線状化し、そして様々な混合物
中でハイブリダイズしたDNA断片と共に連結した。受容
能力を持つ（competent）大腸菌細胞をそれら連結混合
物を用いて既知の方法により形質転換し、LB/amp寒天プ
レート上にプレートし、そして37℃で一夜インキユベー
トした。それらコロニーをレプリカ平板法によりLB/Amp
/XP/IPTG指示薬プレートに移しそして37℃でインキユベ
ートした。phoA−陽性コロニーはこの指示薬プレート上
で青色を呈する。これらコロニーのプラスミドDNAを単
離し配列決定をし、そして前述の６例について、合成DN
A断片の配向の正しさ、およびシグナル配列の予測され
た正しさを確認することができた。このようにして得ら
れ、そして配列決定により正しいことが確認された特定
のシグナル配列を有するプラスミドを、前記表に従って
pTrc99C−phoA−Seq−１、−２、−３、−４、−５およ
び−６と呼んだ。標準化された条件下に、吸光度（遊離
色素の測定）に基づいてこれらのシグナル配列を比較し
そして評価することができるが、ボルデテラ・ペルツツ
シスから見出されたものが比較的最強の部類に属する。
アミダイト類を用いて既知の方法により合成した（Sinh
a et al.（1984）Nucl.Acids Res.12,4539−4557）。そ
れら合成は、Biosearch合成装置を用いてホスフアイト
トリエステル法により行った（Letsinger（1975）J.Ame
r.Chem.Soc.97,3278;Letsinger（1976）J.Amer.Chem.So
c.98,3655）。室温で５〜８時間濃アンモニアを用いて
担体（CPG）から分解除去しそして塩基の保護基を同じ
溶液中55℃で12時間分解除去した後、オリゴデオキシヌ
クレオチドをゲル電気泳動または逆相HPLCにより精製し
た。それらオリゴデオキシヌクレオチドをアニーリング
緩衝液（100mM NaCl,10mM TRIS−Cl（pH7.8）、0.1mM E
DTA）にとり、モル量の各鎖を混合し、95℃で５分間イ
ンキユベートし、そして徐々に室温に冷却した。それら
二本鎖DNA断片は、５′端に、４塩基長であってNco I認
識部位に相補適な一本鎖領域を有する。テストベクター
pTrc99c−phoAをNco Iで線状化し、そして様々な混合物
中でハイブリダイズしたDNA断片と共に連結した。受容
能力を持つ（competent）大腸菌細胞をそれら連結混合
物を用いて既知の方法により形質転換し、LB/amp寒天プ
レート上にプレートし、そして37℃で一夜インキユベー
トした。それらコロニーをレプリカ平板法によりLB/Amp
/XP/IPTG指示薬プレートに移しそして37℃でインキユベ
ートした。phoA−陽性コロニーはこの指示薬プレート上
で青色を呈する。これらコロニーのプラスミドDNAを単
離し配列決定をし、そして前述の６例について、合成DN
A断片の配向の正しさ、およびシグナル配列の予測され
た正しさを確認することができた。このようにして得ら
れ、そして配列決定により正しいことが確認された特定
のシグナル配列を有するプラスミドを、前記表に従って
pTrc99C−phoA−Seq−１、−２、−３、−４、−５およ
び−６と呼んだ。標準化された条件下に、吸光度（遊離
色素の測定）に基づいてこれらのシグナル配列を比較し
そして評価することができるが、ボルデテラ・ペルツツ
シスから見出されたものが比較的最強の部類に属する。
実施例 ４ 分泌ベクターpSEC−Bp−１、pSEC−Bp−２およびpSEC−
Bp−３の構築 クローンpTrc99C−phoA−Seq−１のプラスミドDNAをS
acIおよびSca Iで消化し、そして約3.1kbのサイズの断
片を単離した。この断片はボルデテラ・ペルツツシスシ
グナル配列のほかにpTrc99C−特異的配列だけを有して
いる（第１図も参照のこと）。この断片を、三種類の別
個の混合物の各々の中で、プラスミドpTrc97A、pTrc97B
およびpTrc97C（Amann et al.loc.cit.）の約0.9kbのSa
c I/Sca I断片のうちの一つと連結し、そして得られた
プラスミドをpSEC−Bp−１、pSEC−Bp−２およびpSEC−
Bp−３と呼んだ。この操作には、ボルデテラ・ペルツツ
シスシグナル配列をコードする領域の下流に複数の制限
部位が三つのすべての解読枠で利用可能となるように、
プラスミドpTrc97A、pTrc97BおよびpTrc97Cの長ポリリ
ンカー領域を用いた（第４表）。これらの構築と同様に
して、プラスミドpTrc99C−phoA−Seq−２、−３、−
４、−５および−６を用いることにより異種タンパク質
の発現および分泌のための同様の分泌ベクターを調製す
ることができる。このようにして調製された分泌ベクタ
ーは、各場合に用いられたシグナル配列の起源に応じ
て、それらの相対的効率および発現産生物の細胞内位置
を異にしている。第２図はpSEC−BP1のプラスミド構造
を示し、また第５表はpSEC−BP1の完全なDNA配列を示
し、そしてxxxは開始または停止コドンを表わす。
Bp−３の構築 クローンpTrc99C−phoA−Seq−１のプラスミドDNAをS
acIおよびSca Iで消化し、そして約3.1kbのサイズの断
片を単離した。この断片はボルデテラ・ペルツツシスシ
グナル配列のほかにpTrc99C−特異的配列だけを有して
いる（第１図も参照のこと）。この断片を、三種類の別
個の混合物の各々の中で、プラスミドpTrc97A、pTrc97B
およびpTrc97C（Amann et al.loc.cit.）の約0.9kbのSa
c I/Sca I断片のうちの一つと連結し、そして得られた
プラスミドをpSEC−Bp−１、pSEC−Bp−２およびpSEC−
Bp−３と呼んだ。この操作には、ボルデテラ・ペルツツ
シスシグナル配列をコードする領域の下流に複数の制限
部位が三つのすべての解読枠で利用可能となるように、
プラスミドpTrc97A、pTrc97BおよびpTrc97Cの長ポリリ
ンカー領域を用いた（第４表）。これらの構築と同様に
して、プラスミドpTrc99C−phoA−Seq−２、−３、−
４、−５および−６を用いることにより異種タンパク質
の発現および分泌のための同様の分泌ベクターを調製す
ることができる。このようにして調製された分泌ベクタ
ーは、各場合に用いられたシグナル配列の起源に応じ
て、それらの相対的効率および発現産生物の細胞内位置
を異にしている。第２図はpSEC−BP1のプラスミド構造
を示し、また第５表はpSEC−BP1の完全なDNA配列を示
し、そしてxxxは開始または停止コドンを表わす。
第３図の説明： プラスミドpMAC5−８（＝pMA5−８およびpMC5−８）の
マツプ F1−ORI:フアージf1の複製開始点； ORI:ColE1タイプの複製開始点； CAT:クロラムフエニコールアセチルトランスフエラー
ゼのコード領域； AMP:β−ラクタマーゼのコード領域。
マツプ F1−ORI:フアージf1の複製開始点； ORI:ColE1タイプの複製開始点； CAT:クロラムフエニコールアセチルトランスフエラー
ゼのコード領域； AMP:β−ラクタマーゼのコード領域。
pMA5−８はCATにアンバー突然変異（3409位のＡ）を有
し、そしてpMC5−８はAMPにアンバー突然変異（2238位
のＣ）を有する。
し、そしてpMC5−８はAMPにアンバー突然変異（2238位
のＣ）を有する。
第1a図および1b図はpTrc99C−phoA構造の原理を示した
図であり、第２図はpSEC−BP1のプラスミド構造を示す
図であり、第３図はプラスミドpMAC5−８のマツプであ
る。
図であり、第２図はpSEC−BP1のプラスミド構造を示す
図であり、第３図はプラスミドpMAC5−８のマツプであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 カルル‐ヨーゼフ・アーベル ドイツ連邦共和国デー‐3550マルブル ク．アム・ツイーゲンベルク８ (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ 82（1985）ｐ．5107−5111 Ｇｅｎｅ 69 （1988） ｐ．301− 315 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】アミノ配列が であるボルデテラ・ペルツッシス由来のシグナルペプチ
ド。 - 【請求項２】請求項１記載のシグナルペプチドをコード
するDNAまたはRNA。 - 【請求項３】請求項２記載のDNAまたはRNA配列を含むベ
クター、プラスミド、DNAまたはRNA構築物。 - 【請求項４】請求項２記載のDNAまたはRNAを関連の構造
遺伝子の前に置くことより成るグラム陰性細菌でのタン
パク質の分泌方法。
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-
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