DK175206B1

DK175206B1 - Ekspressionskontrolsekvenser

Info

Publication number: DK175206B1
Application number: DK198603206A
Authority: DK
Inventors: Hermann Bujard; Stuart Le Grice
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1985-07-05
Filing date: 1986-07-04
Publication date: 2004-07-12
Also published as: DK320686D0; NZ216688A; ATE62020T1; JPS6214786A; DE3678343D1; AU5938586A; JPH10229878A; EP0207459A3; GB8517071D0; IL79291A0; EP0207459B1; EP0207459A2; IE59165B1; AU594349B2; US4868111A; IL79291A; JP2632809B2; CA1316850C; DK320686A; IE861806L

Description

i DK 175206 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte grampositive ekspressionkontrol DNA-sekvenser, ekspressionsvektorer indeholdende disse DNA-sekvenser, værtsceller, som er transformeret med disse ekspressionsvektorer, og fremgangsmåder til fremstilling af pro-og eukaryote proteiner under anvendelse af de hidtil ukendte ekspressionskontrol DNA-5 sekvenser, vektorer og transformanter.

Det meste rekombinante DNA-arbejde til dato er blevet udført med Escherichia coli (E. coli). E. coli er medlem af den gramnegative klasse af bakterier, der indeholder to lag af membraner, som omslutter et periplasmisk rum. Mange af de produkter, som dannes i 10 E.coli, udskilles i dette periplasmiske rum, om overhovedet. Fa produkter udskilles fra de levende celler til vækstmedierne.

På den anden side er Bacillus subtilis (B. subtilis) medlem af den grampositive klasse af bakterier, der kun indeholder et enkelt lag af bakteriemembran. B. subtilis kan således 15 danne store mængder protein, som udskilles direkte i vækstmediet. Endvidere er dannelse af proteiner i B. subtilis fordelagtig, da organismen er ikke-patogen og ikke danner endotoxiner. Endvidere er B. subtilis blevet grundigt undersøgt og er forbillede for genetiske studier blandt grampositive mikroorganismer. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 -- --- .

Selv om den generelle fremgangsmådes genkloning i E. coli kan anvendes på B. subtilis, er 2 forsøg på at fremstille et nyttigt produkt af et heterologt gen klonet ind i B. subtilis og 3 udskilt i vækstmedierne blevet forsinket og gjort særlig vanskelig på grund af den 4 generelle mangel på hensigtsmæssig klonings- og ekspressionsvektorer. Denne knaphed 5 på ekspressionsvektorer er delvis forklaret ved manglen på genkendelse af fremmede 6 transkriptions- og translationsinitieringssignaler i B. subtiiis. Som følge heraf er de 7 - velkendte trp (R.A. Hdllewell og S. Emtage, Gene 9, 1980, s. 27-47), lac (K. ItaKura et al., 8

Science 198, 1977, s. 1056-1063; T.M. Roberts et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 1979, 9 s. 5596-5600), Ipp (N. Lee et al., J. Bacteriol. 146, 1981, s. 861-866; LJ. Zwiebel et al., J.

10

Bacteriol. 145, 1981, s. 654-656 og K. Natamura og M. Inouye, Cell 18, 1979, s. 1109) og 11 bakteriofag λ PL (H. Bernard et al., Gene 5, 1979, s. 59-76) og transkriptions- og 12 translationsregulerende systemer ikke funktionelle i B. subtiiis. Med undtagelse af muse- 13 dihydrofolatreduktase (Grange et al., Nucleic Acids Research 12, 1984, s. 3585-3601) og 14 nogle få lægemiddelresistensgener fra grampositive organismer såsom staphylococcus og 15 streptococcus er kun få fremmede gener, som indkoder prokaryote og eukaryote proteiner, 16 således blevet udtrykt i Bacillus, især B. subtilis (en oversigt heraf er angivet i Genetics and Biotechnology of Bacilli, red. A.T. Ganesan og J.A. Hoch; Academic Press, Inc., 1984, og J. Palva's afhandling, infra). Endvidere er ekspressionsudbyttet sædvanligvis lille, og det har derfor været ønsket at udvikle forbedrede ekspressionsvektorer med stærke promotorer for Bacillus subtilis.

I DK 175206 B1 I

I I

I For tiden omfatter de kendte Bacillus subtilis-pro motorer, hvis respektive basesekvenser er I

I opklaret, veg-promotoren, tms-promotoren, pen-P-promotoren (C.P. Moran Jr. et al., Mol. I

I Gen. Genetics 186, 1982, s. 339-346), spo VC-promotoren (C.P. Moran Jr. et al., Nucl. I

I 5 Acids Res. 9, 1981, s. 5979-5990, spo VG-promotoren (C.P. Moran Jr. et al., Cell 25, 1981, I

I s. 783-791), 0 29 G3a-promotoren, 0 29 G3b-promotoren, 0 29 G2-promotoren, 0 29 Al- I

I promotoren (C.L. Murray og J.C. Rabinowitz, J. Biol. Chem. 257, 1982, s. 1053-1062), I

I pMG 102-promotoren, pMG 201-promotoren (M.Z. Gilman et al., Nucl. Acids Res. 9, 1991, I

I s. 5991-6000), spo 1-15-promotoren (G. Lee et al., J. Mol. Biol. 139, 1980, s. 407-422), I

I 10 spo 1-16-promotoren (G. Lee et al., Molec. Gen. Genetics 180, 1980, s. 57-65) og SP02- I

I promotoren (R.G. Schoner et al., Gene 22, 1983, s. 47-57). Blandt disse er SP02- I

I promotoren (R.G. Schoner et al., supra) og veg-promotoren (europæisk I

I offentliggørelsesskrift nr. 116.411) de eneste promotorer, som faktisk er blevet anvendt til I

I genekspression. I

I 15 I

I Under disse forhold er det således fordelagtigt at udvikle stærkere I

I genekspressionssystemer til anvendelse i grampositive bakterier, fx Bacillus, især B. I

I subtilis. I denne henseende er de alsidige ekspressionsvektorer ifølge den foreliggende I

I opfindelse særlig vigtige, fordi de for første gang muliggør ekspressionen af gener, som I

I 20 indkoder prokaryote og eukaryote proteiner, i Bacillus, især B. subtilis, og andre I

I grampositive værtsceller under kontrol af transkriptionsinitierings- og -terminerings-DNA- I

I sekvenser af gramnegativ oprindelse. I

I Den foreliggende opfindelse angår specifikt grampositive bakterielle ekspressionskontrol I

I 25 DNA-sekvenser, der proksimalt til den ene ende indeholder en transkriptionsinitierings-

I DNA-sekvens af gramnegativ bakteriel oprindelse, og proksimalt til den anden ende I

I indeholder en transkriptionsterminerings-DNA-sekvens af gramnegativ eller grampositiv I

I bakteriel oprindelse, og som mellem transkriptionsinitierings-DNA-sekvensen og I

I transkriptionsterminerings-DNA-sekvensen har en ribosombindingsstedkodende DNA- I

I 30 sekvens af grampositiv eller gramnegativ oprindelse, som eventuelt er operativt forbundet I

I med et fremmed gen, der indkoder prokaryote eller eukaryote polypeptider, samt en I

I fremgangsmåde til fremstilling af sådanne ekspressionskontrol DNA-sekvenser, hvilken I

I fremgangsmåde omfatter kombination i nedstrømsretning (5' til 3’) af en I

I transkriptionsinitierings-DNA-sekvens af gramnegativ bakteriel oprindelse, en I

I 35 ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens af grampositiv eller gramnegativ oprindelse og I

I en transkriptionsterminerings-DNA-sekvens af gramnegativ eller grampositiv bakteriel I

I oprindelse til en funktionel enhed ved velkendte DNA-rekombinationsteknikker. I

I Nærmere betegnet muliggør den foreliggende opfindelse følgende kombinationer af: I

3 DK 175206 B1 a) en transkriptionsinitierings-DNA-sekvens (promotor) af gramnegativ bakteriel oprindelse med en ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens af grampositiv bakteriel oprindelse og en transkriptionsterminerings-DNA-sekvens af gramnegativ bakteriel oprindelse, 5 b) en transkriptionsinitierings-DNA-sekvens (promotor) af gramnegativ bakteriel oprindelse med en ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens af gramnegativ bakteriel oprindelse og en transkriptionsterminerings-DNA-sekvens af gramnegativ bakteriel oprindelse, 10 c) en transkriptionsinitierings-DNA-sekvens (promotor) af gramnegativ bakterie! oprindelse med en ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens af grampositiv bakteriel oprindelse og en transkriptionsterminerings-DNA-sekvens af grampositiv bakteriel oprindelse, og 15 d) en transkriptionsinitierings-DNA-sekvens (promotor) af gramnegativ bakteriel oprindelse med en ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens af gramnegativ bakteriel oprindelse og en transkriptionsterminerings-DNA-sekvens af grampositiv bakteriel oprindelse.

20 Udtrykket."bakteriel oprindelse" anvendt i forbindelse med transkriptionsinitierings-DNA-sekvenser omfatter a) naturligt forekommende bakterielle transkriptionsinitieringssekvenser og funktionelle varianter deraf, herunder substitutioner eller inversioner af enkelte eller flere nucleotider og gentagelser af sådanne transkriptionsinitierings-DNA-sekvenser, og b) kemisk syntetiserede (syntetiske) 25 transkriptions-DNA-sekvenser, som er i stand til at initiere transkription i bakterier.

Udtrykket bakteriel oprindelse anvendt i forbindelse med ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser omfatter a) naturligt forekommende bakterielle ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser og funktionelle varianter deraf, herunder 30 substitutioner eller inversioner af enkelte eller flere nucleotider, og b) kemisk syntetiserede (syntetiske) ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser, som er i stand til at initiere translation i bakterier.

Udtrykket bakteriel oprindelse anvendt i forbindelse med transkriptionsterminerings-DNA-35 sekvenser omfatter a) naturligt forekommende bakteriel transkriptionsterminerings-DNA-sekvenser og funktionelle varianter deraf, herunder substitutioner eller inversioner af enkelte eller flere nucleotider og gentagelser af sådanne transkriptionsterminerings-DNA-sekvenser, og b) kemisk syntetiserede (syntetiske) transkriptionsterminerings-DNA-sekvenser, som er i stand til at terminere transkription i bakterier.

I DK 175206 B1 I 4 I en foretrukken udførelsesform kan gener, der indkoder prokaryote eller eukaryote proteiner udtrykkes i Bacillus, især B. subtilis, og andre grampositive organismer under I transkriptionel kontrol fra promotorer, der stammer fra colifag T5 eller T7, og fra E. coli- 5 stammende terminatorer.

I nærværende sammenhæng defineres T5- og T7-promotorer som promotorfunktions- medierende DNA-sekvenser, som forekommer i colifag T5- og T7-familiernes genomer, og funktionelle kombinationer, som stammer fra sidanne sekvenser.

I 10 T5-promotorer, som kan anvendes i den foreliggende opfindelse, er sådanne fra en "præ* tidlig" "tidlig" og "sen" ekspressionsklasse af fagen, især de sekvenser, der er beskrevet i I R. Gentz' afhandling, Universitet Heidelberg, 1984: PJ5, PM25, PN26, PD/E20, PG5, PG20, PG22,

Pg2S/ Pg28/ Pk283» pR28b· I 15 T7-promotorer, som kan anvendes i den foreliggende opfindelse, omfatter den "tidlige" ekspressionsklasse af fagen, især promotorerne Al og A2 (D.K. Hawley og W.D. McClure,

Nucleic Acids Res. 11, 1983, s. 2237-2255).

20 DNA-sekvenserne for nogle af de foretrukne T5- eller T7-promotorer, som er nævnt I

H ovenfor, er vist i tabel 1 nedenfor. I

I Tabel I I

I _ A:T Βαχ -35 -10 |

sPD/£ 20 ACT6CAAAAAATA6TTTGACACCCTAGCC6ATAGGCTrTAAGATGTACCCAGTTCGATGA

I PN 25 TCATAAAAAATTTATTTGCTTTCAGGAAAATTTTTCTGTATÅATAGATTCATAAATTTGA

I .'llll _ ·

pn 26 ACTTAAAAATTTCAGTTGCTTAATCCTACAATTCTTGATATAATATTCTCATAGTT7GAA I

I I II I _

30 PJ 5 ATATAAAAACCGTTATTGACACAGGTG6AAATTTAGAATATACTGTTAGTAAACCTAATG Pnagc T 5 I

I PK 28a TAGnAAAATTGTAlTTGClLATGCTTAAATACTTGClATAATATTTATATAAATTGAT I

I ,5P i- ii i _ I p i ii i —

35 p6 25 AAAAATAAAAATnCTTGATAAAATTTTCCAATACTAnATAATAlTGTTATTAAAGAGG -* I

I i || _

T?Al TT AT CAAAAAGAGTAnGACTT AAAGT CT AACCT ATAGGAT ACTTACAGCCA1C GAGA6G Ί I

I „„ I II _ Prage T7

l/h2 CAC6AAAAACAGGTATTGACAACATGAAGTAACATGCAGTAAGATACAAATCGCUGGTA J I

5 DK 175206 B1

Tabel I viser nudeotidsekvensen af de promotorer, der anvendes i den foreliggende opfindelse. Sekvensen mellem -50 og +10 er vist, inden for hvilken -35 hexamererne og opstrøms A:T-rige regioner er indrammet, medens der er sat streg over -10-hexamererne.

5 Den ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens, der er nødvendig for initiering af translation i en værtscelle, består af 1) en ATG-translationsinitieringskodon for aminosyremethionin, 2) en sekvens på 4-12 baser, som er komplementære med baser ved 3’-enden af 16s-ribosomal RNA, og som er kendt fra Shine Dalgarno (SD)-sekvensen, og 3) en sekvens af baser mellem disse to områder, som er kendt som linkerregionen.

10

De ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser, der anvendes i den foreliggende opfindelse, og som udgør en del deraf, kan udgøres af ribosombindingsstedkodende sekvenser af grampositiv eller gramnegativ oprindelse, der er i stand til at fungere i Bacillus, især B. subtilis, og andre grampositive organismer, herunder flere kendte orga-15 nismer (J.R. McLaughlin et al., J. Biol. Chem. 256, 1981, s. 11283-11291; C.P. Moran Jr. et al., Mol. Gen. Genetics 186, 1982, s. 339-346).

Imidlertid er de foretrukne ribosombindingsstedkodende sekvenser, der anvendes i den foreliggende opfindelse, flytbare syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekkvenser 20 (SRBS) med de i tabel II nedenfor viste formler:

Tabel II

5* 3*

25 AGCTTTATATAAGGAGGAGTTAAGCATGCAC

SRBS I AATATATTCCTCCTCAATTCGTACGTGTCGA

3* 5' 5' 3'

AGCTTGGATTTAAAATTTAGGAGGAATTTAAGCATG SRBSII ACCTAAATTTTAAATCCTCCTTAAATTC

30 31 5‘ 5 * 3 *

AATT C ATTAAAG AGGAG AAATT AACT ATG AGGG RBSII. 3A+5A GTAATTTCTCCTCTTTAATTGATACTCCCCTAG

3' 5» 1 5* 3'

AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAG RBSII GTAATTTCTCCTCTTTAATTGATACTCTCCTAG

3 · 5'

I DK 175206 B1 I

I I

I S· 3' I

I AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGGAAG I

I RBSII „ 9 A GTAATTTCTCeTCTTTAATTGATACCTTCCTAG I

I 3' 5' I 5

I Disse SRBS'er er blevet konstrueret således, at de kan fungere sammen med et hvilket I

I som helst gen, der indkoder prokaryote eller eukaryote polypeptider i Bacillus, især B. I

I subtilis, og andre grampositive organismer. Evnen til at fungere på denne måde gør SRBS I

I 10 "flytbar”. I

I Transkriptionsterminerings-DNA-sekvensen kan udgøres af terminatorer af gramnegativ I

I bakteriel oprindelse, som er i stand til at fungere i Bacillus, især B. subtilis, og andre I

I grampositive organismer. De foretrukne gramnegative terminatorer, der anvendes i den I

I 15 foreliggende opfindelse, omfatter de fra E. coli stammende terminatorer t0 (M. Rosenberg I

I et al-, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1976, s. 717-721), TI, T2 (J. Brosius et al., J. Mol. I

I Biol. 148, 1981, s. 107-127) og T7 {JJ. Dunn og F.W. Studier, Nucleic Adds Res. 8, 1980, I

I s. 2119-2132). I

I 20 Transkriptionsinitierings-DNA-sekvenserne, de flytbare ribosombindingsstedkodende I

I sekvenser og transkriptionstermineringssekvenserne ifølge opfindelsen kan fås i henhold til I

I velkendte metoder inden for DNA-kemien, herunder total kemisk syntese af den respektive I

I DNA-sekvens, fx i et nucleotidsynteseapparat. I

25 Opfindelsen angår endvidere ekspressionsvektorer, der er i stand til at regulere I

I ekspression af et gen, som indkoder pro- og eukaryotproteiner i en Bacillus, især B. I

I subtilus, eller en anden grampositiv organisme, som er transformeret dermed, hvilke I

I vektorer indeholder a) en grampositiv bakteriel ekspressionskontrol DNA-sekvens, som i I

I nedstrøms retning i forhold til transkriptionen består af følgende enheder: Mindst én I

I 30 transkriptionsinitierings-DNA-sekvens af gramnegativ bakteriel oprindelse kombineret med I

I en ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens af grampositiv eller gramnegativ oprindelse, I

I eventuelt et fremmed gen, der indkoder prokaryote eller eukaryote polypeptider, og en I

I transkriptionsterminerings-DNA-sekvens, b) mindst et vektorreplikationsinitieringssted, og I

I c) mindst ét antibiotikaresistensgen, samt en fremgangsmåde til fremstilling af sådanne I

I 35 ekspressionsvektorer. Transkriptionsinitierings-DNA-sekvensen kan udgøres af en I

I gramnegativ promotor. De foretrukne anvendte gramnegative promotorer er colifag T5- I

I eller colifag T7-promotorer med de i tabel I viste formler. En ribosombindingsstedkodende I

I DNA-sekvens kan udgøres af et ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens af grampositiv I

I eller gramnegativ bakteriel oprindelse, som er i stand til at fungere i Bacillus, især B. I

7 DK 175206 B1 subtilis, eller andre grampositive organismer, herunder adskillige kendte organismer (J.R. McLaughlin et al., supra; C.P. Moran Jr. et al.. Mol. Gen. Genetics 186, 1982, s. 339*346).

De foretrukne anvendte ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser er flytbare syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser med de i tabel II viste formler.

5 Transkriptionsterminerings-DNA-sekvensen kan udgøres af terminatorer af gramnegativ bakteriel oprindelse, som er i stand til at fungere i Bacillus, især B. subtilis, og andre grampositive organismer. De foretrukne transkriptionsterminerings-DNA-sekvenser, der anvendes i den foreliggende opfindelse, omfatter gramnegative E. co/Z-terminatorer t„ (M. Rosenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 1976, s. 717-721), TI, T2 (J. Brosius et 10 al., J. Mol. Biol. 148, 1981, s. 107-127) og T7 (JJ. Dunn og F.W. Studier, Nucleic Acids Res. 8, 1980, s. 2119-2132). Replikationsinitieringsstedet kan være af gramnegativ og/eller grampositiv oprindelse, og således kan ekspressionsvektorerne anvendes som shuttle-vektorer (S.D. Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1978, s. 1433-1436; J. Kreft et al., Molec. gen. Genet. 162, 1978, s. 59-67; B. Michel et al., Gene 12, 1980, s. 147-15 154), som både kan repiikere i E. coli og Bacillus, især B. subtilis. Foretrukne ekspressionsvektorer, som anvender syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser ligeret til en colifag T5-promotor, hvilke vektorer er i stand til at repiikere både i E. coli og B. subtilis (shuttle-vektorer), er beskrevet i eksempel 4 og 5 og 7-10.

20 Ekspressionsvektorerne ifølge opfindelsen kan konstrueres under anvendelse af velkendte DNA-rekombinationsteknikker (jfr. laboratoriemanualen Molecular Cloning, Maniatis et al..

Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), hvilket omfatter følgende trin: a) indsættelse af i det mindste én transkriptionsinitierings-DNA-sekvens af 25 gramnegativ bakteriel oprindelse og en ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens af grampositiv eller gramnegativ bakteriel oprindelse i en eksisterende kloningsvektor i nedstrøms retning i forhold til transkriptionen, b) tilvejebringelse i kloningsvektoren af mindst ét restriktionsendonucleasested 30 nabostillet til den ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens, c) indsættelse af mindst ét fremmed gen, som indkoder prokaryote eller eukaryote polypeptider, i restriktionsendonucleasestedet nabostillet til den ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens, og 35 d) indsættelse af mindst én transkriptionsterminerings-DNA-sekvens i nedstrøms retning i forhold til det fremmede gen, der indkoder prokaryote eller eukaryote polypeptider.

I DK 175206 B1 I

i 8 I

I Den vektor, der anvendes til at samle ekspressionvektorerne ifølge opfindelsen, kan være I

I et hvilket som helst egnet plasmid, cosmid eller fag, som er i stand til at transformere og I

I replikere sig selv i værtsmikroorganismerne. Plasmider, der egner sig til kloning i 8. I

I subtilis og/eller E. coli er fx nævnt i laboratoriemanualen Molecular Cloning, Maniatis et al., I

I 5 supra, og i 3. Palva's afhandling, Helsinki Universitet, 1983. Foretrukne vektorer af I

I plasmidoprindelse, der anvendes til samling af ekspressionsvektorerne ifølge opfindelsen, I

I er pUB 110 (TJ. Gryczan et al., J. Bacteriol 134, 1978, s. 318-329), pDS 5 og pDS 6 (D. I

I Stueber et al., EMBOJ. 3, 1984, s. 3143-3148). I

10 Plasmider af p602- og p25-familierne er specifikke eksempler på plasmid-shuttle-vektorer I

I ifølge opfindelsen. Deres fremstilling er beskrevet i detaljer i eksempel 1-5 og 7-10. 8. I

I subtilis-stammer, der indeholder de særlig foretrukne plasmider af p25-familien (8. subtilis I

I BR 151 transformeret med p25RBSI; p25RBSII, p25*RBSII), blev deponeret i Deutsche I

I Sammlung von Mikroorganismen (DSM) i Géottingen den 20. juni 1985, henholdsvis under I

I 15 deponeringsnumrene DSM 3350, DSM 3351 og DSM 3352. 8. subt/7/s-stammer, der I

I indeholder de særlig foretrukne plasmider af p602-familien {8. subtilis BR151 I

I transformeret med p602/18, p602/19, p602/20 og p602/21), blev deponeret i Deutsche I

I Sammlung von Mikroorganismen (DSM) i Géottingen den 14. maj 1986, henholdsvis under I

I deponeringsnumrene DSM 3723, DSM 3724, DSM 3725 og DSM 3726. I

I 20 I

I Fremmede gener, som kan indsættes i ekspressionsvektorerne ifølge opfindelsen, kan I

vælges blandt en lang række gener (DNA-gener eller DNA-kopier af RNA-gener), som I

indkoder prokaryote eller eukaryote polypeptider in vivo og in vitro. Fx kan sådanne gener I

indkode enzymer, hormoner, polypeptider med immunmodulerende, antiviral- eller I

I 25 anticanceregenskaber, antistoffer, antigener og andre nyttige polypeptider af prokaryot I

I eller eukaryot oprindelse. De foretrukne fremmede gener, der anvendes i den foreliggende I

I opfindelse, er generne, som indkoder E. coli chloramphenicolacetyltransferase (cat) og I

I muse-dihydrofolatreduktase (dhfr). I

I 30 Eksempler på proteiner, som kan udtrykkes under anvendelse af det forbedrede I

I ekspressionskontrolsystem ifølge opfindelsen, er dihydrofolatreduktase, chloramphenicol- I

I acetyltransferase, malariaoverfladeantigener, lymfokiner såsom IL-2, alpha-, beta- og I

gamma-interferon, insulin og insulinprecursorer, væksthormoner, vævsplasminogen- I

I aktivator, humant renin og HTLV-lli-proteiner. I

I 35 I

I Fremgangsmåder til udtrykkelse af gener, der indkoder prokaryote eller eukaryote I

I proteiner, under anvendelse af ekspressionsvektorerne, især shuttle-vektorerne, ifølge I

I opfindelsen er velkendte (Maniatis et al., supra). De omfatter transformation af en I

I hensigtsmæssig vært med en ekspressionsvektor, som har den ønskede DNA-sekvens I

9 DK 175206 B1 operativt indsat i en ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge opfindelsen, dyrkning af værten under hensigtsmæssige betingelser for vækst og isolering af det ønskede polypeptid fra kulturen. Fagfolk kan blandt disse kendte metoder vælge sådanne, som er mest effektive for en speciel genekspression uden at afvige fra opfindelsens omfang.

5

Udvælgelsen af en bestemt vært til anvendelse ifølge opfindelsen afhænger af en række faktorer, som er kendte inden for området. Disse omfatter fx kompatibilitet med den valgte ekspressionsvektor, toxiciteten af de proteiner, som indkodes af hybridplasmidet, den lethed, hvormed det ønskede protein isoleres, ekspressionskarakteristika, biosikkerhed 10 og omkostninger. Inden for disse generelle retningslinjer er eksempler på nyttige bakterieværter gramnegative og grampositive bakterier, især stammer af E. coli og S. subtilis. Den mest foretrukne værtscelle ifølge opfindelsen er B. subtilis BR151 (opbevaret i The Bacillus Genetic Stock Center under BGSC nr. 1A40). Imidlertid kan der også anvendes andre B. subtilis-stammer såsom B. subtilis BD 170 (opbevaret i The Bacillus 15 Genetic Stock Center under BGSC nr. 1A 42) og S. subtilis JH646 (opbevaret i The Bacillus Genetic Stock Center under BGSC nr. 1S9).

Den foreliggende opfindelse belyses nærmere med baggrund i de følgende eksempler med henvisning til de følgende figurer: 20

Restriktionsendonucleaser er forkortet som følger: E: EcoRl; Sm: Smal; B: SamHI; S: Sall; P: PstI; H: Hindlll; Xh: Xhol; X: Xbal; K: Kpnl;

Pv: PvuII; A: Accl; Sp: Sphl; Bg: BgflV, D: Oral.

25

Endvidere er følgende forkortelser blevet anvendt: kan: strukturgen for kanamycinnucleotidyltransferase; cat: strukturgen for chloramphenicolacetyltransferase; dhfr: strukturgen for muse-dihydrofolatreduktase; 30 bla: strukturgen for betalactamase; CAT: chloramphenicolacetyltransferase-protein; DHFR: dihydrofolatreduktase-protein; ori+: grampositivt replikationsinitieringssted; ori-: gramnegativt replikationsinitieringssted; 35 SRBS: flytbar ribosom bindingsstedkodende syntetisk DNS-sekvens; RBS: ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens; SD: Shine- Dalgarno-sekvens; to.: TI, T2, T7: transkriptionel terminator t0, TI, T2, T7, og _ _____.__l

I DK 175206 B1 I

I 10 I

I (H): Kohæsiv ende af Hindlll, der kan ligeres med en H/'ndlll-terminai uden at generere

I et /7/ndlII-sted. I

I Fig. 1 viser konstruktionen af den basale E. coli/B. subt/7/s-shuttle-vektor p602/5, der I

I 5 indeholder et grampositivt (ori+) og gramnegativt (ori-) replikationsinitieringssted, I

I samt lægemiddelresistensmarkørerne kanamycin (kan) og chloramphenicol. Som I

I sådan meddeler dette plasmid kanamycinresistens både i E.coli og B. subtilis. I

I Chloramphenicolresistens opnås ved indsætning af promotorholdige fragmenter I

I mellem EcoRI (E) og HindiII (H)-stederne. E. coli cat-genet, der er vist i denne I

I 10 figur, har sin naturlige ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens. I

Fig. 2 viser konstruktionen af de generelle ekspressionsvektorer p602/7 og p602/25 samt I

I vektorerne p602/7RBSI og p602/7RBSII, der indeholder de ribosombindingssted- I

I kodende DNA-sekvenser SRBSI og SRBSII. Indsætning af de ribosombindingssted- I

I 15 kodende DNA-sekvenser SRBSI og SRBSII fører til syntesen af to CAT-type I

I proteiner i E. coli, dvs. naturligt CAT-protein fra den vildtype-cat-ribosombindings- I

I stedkodende DNA-sekvens og et CAT-fusionsprotein, som stammer fra SRBSI eller I

I SRBSII, i samme læseramme. I S. subtilis dannes et enkelt CAT-fusionsprotein, I

I som stammer fra de ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser SRBSI og I

I 20 SRBSII. Plasmiderne p602/7, p602/25, p602/7RBSI og p602/7RBSII meddeler alle I

I chloramphenicolresistens i 5. coli og B. subtilis. I

Fig. 3 viser konstruktionen af vektorerne p25RBSI, p25RBSII og p25*RBSII, der I

I indeholder colifag T5-promotoren PG25 kombineret med de syntetiske I

I 25 ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser SRBSI og SRBSII-S. si/btf(/s-celler, I

I som indeholder vektoren p25RBSI, syntetiserer et enkelt CAT-fusionsprotein, som I

I stammer fra det område, der ligger umiddelbart nedstrøms for SRBSI. B. subtilis- I

I celler, som indeholder vektoren p25RBSll, syntetiserer to CAT-fusionsproteiner, I

I som stammer fra området umiddelbart nedstrøms for SRBSII, samt et længere I

I 30 fusionsprotein, som stammer fra et ribosombindingssted i umiddelbar nærhed af I

I pG25- Proteinsyntese, som stammer fra dette yderligere ribosombindingssted, blev I

I elimineret ved at tilvejebringe en translationstermineringskodon opstrøms for I

I SRBSII, hvilket fører til vektoren p25*RBSII. Celler, der indeholder p25*RBSII, I

I syntetiserer nu et enkelt CAT-fusionsprotein, som stammer fra SRBSII. I

I 35 I

I Fig. 4 viser totalproteiner, der syntetiseres i B. subtilis stamme BR151, som indeholder I

I ekspressionsvektorerne p25RBSI, p25RBSII og p25*RBSII. Positionen af CAT- I

I proteinet, der stammer fra SRBSI eller SRBSII, er vist med "CAT"; det yderligere I

11 DK 175206 B1 CAT-fusionsprotein fra celler, som indeholder p25RBSII, er vist med "f-CAT". LYS betegner lysozym, der tilsættes eksternt for at medvirke til cellelyse.

Fig. 5 viser skematisk CAT-proteiner, som syntetiseres i B. subtilis, der indeholder 5 vektorerne p25RBSI, p25RBSIl og p25*RBSII. En translationsstopkodon (ty i samme læseramme forhindrer gennemlæst proteinsyntese ind i catgenet fra PG25RBS. En sådan stopkodon i samme læseramme er fraværende i konstruktionen P25RBSII; som følge heraf kommer der CAT-proteiner fra RBS og SRBSII.

Modifikation af H/ndlll-stedet i p25*RBSII indfører en stopkodon i samme 10 læseramme og giver som følge heraf et enkelt CAT-protein fra SRBSII.

Fig. 6 viser in vitro transkriptionel analyse af de i tabel 1 viste promotorer. Notationerne "Ec” og ”Bs” viser analyse med henholdsvis E. coli og B. subtilis RNA-polymerase, og tallene i forbindelse hermed den saltkoncentration, hvorved transkriptionen blev 15 udført. ”oriM og "bla“ transkripter stammer fra den vektor, ind i hvilken promotorerne blev klonet. Skiltet med betegnelsen "veg" betegner transkription af B.subtilis-veg-promotoren alene {S.F.J. Le Grice og A.L. Sonenshein, J. Mol. Biol., 162, 1982, s. 551-564). "veg" vist på siden af feltet viser transkription af internt tilført veg-promotor DNA. M betegner molekylvægtmarkør, Wpall-spaltede pBR322 20 DNA. Kun størrelsen af de bånd, der er relevante for den foreliggende opfindelse, er vist. Det skal bemærkes, at det felt, der viser transkription fra T5-promotoren ρκ28Β/Ρκ28ΐ>» har to nye transkripter, da begge promotorer er til stede på et enkelt restriktionsfragment.

25 Fig. 7 viser konstruktionen af shuttle-vektorerne p602/18 og p602/19, der indeholder colifag T5-promotor PN2S operativt forbundet med én af de syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser RBSII, 9A (p602/18) eller RBSII, 3A+5A (p602/19). Indsætning af de syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser fører i begge tilfælde til syntese af et CAT-fusionsprotein, som starter i 30 umiddelbar nærhed af det syntetiske ribosombindingssted, og som slutter ved cat- genets naturlige translationsstopkodon. Plasmiderne p602/18 og 602/19 meddeler begge B. subtilis chloramphenicolresistens.

Fig. 8 viser konstruktion af shuttle-vektorerne p602/20 og p602/21, der indeholder 35 colifag T5-promotoren PN25 operativt forbundet med det syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser RBSII (p602/20) eller RBSII,3A+5A (p602/2l). Indsætning af de syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvenser medfører i begge tilfælde syntese af et DHFR-fusionsprotein, som starter i umiddelbar nærhed af det syntetiske ribosombindingssted og slutter ved dhfr-

I DK 175206 B1 I

I I

I genets naturlige translationsterminationskodon. B. subtilis-ceIler, der indeholder I

I 602/20 eller 602/21, er modstandsdygtige over for 10 μς/ml trimethoprim. I

I Fig. 9 viser totalproteinerne, der syntetiseres i B. subtilis-stamme BR151, som indeholder I

I 5 plasmiderne p602/18, p602/19, p602/20 og p602/21. Celle betegner I

I proteinsyntese fra plasmidfri celler. Til sammenligning er CAT-syntese fra I

I p25*RBSII blevet inkluderet. Positionen af CAT-fusionsproteinet CAT* (fra p602/18 I

I og p602/19) og DHFR-fusionsproteinet (fra p602/20 og p602/21) er vist. I

I 10 Generelle metoder I

I Følgende metoder blev udført som beskrevet af Maniatis et al., supra, medmindre andet er I

I angivet: Restriktionsendonucleasespaltninger ved 37eC (s. 100-101), dephosphorylering I

I med bakteriel alkalisk phosphatase (BAP) ved 37°C (s. 133-134), ligation med T4-DNA- I

I 15 ligase ved 14°C (s. 390-391), transformation af DNA til CaCI2-celler af £. co//HBl01 og I

I selektion af transformanter på agarplader indeholdende LB-medium plus 100 pg/ml I

I ampicillin (s. 250-251), DNA-plasmidpræparation (s. 86-94), udfyldning af enkeltstrengede I

I DNA-haler med det store fragment af DNA-polymerase I (Klenow-fragment) ved 14°C I

I (s. 113-114), DNA-separation og fragmentoprensning fra agarosegeler (s. 164-167), I

I 20 anvendelsen af syntetiske DNA-linkere til subkloning (s. 392-397) og I

I SDS/polyacrylamidgelelektroforese (s. 348-349). I

I Transformation af DNA til celler af S. subtilis blev udført som beskrevet af S. Contente og I

I D. Dobnau, Mol. Gen. Genet 167, 1979, s. 251-258. I

I 25 I

I In vitro transkription med RNA-polymeraser fra E. coli og B. subtilis blev udført i- 50 μΙ: I

I assays med følgende sammensætning, 40 mM Tris/HCI, pH 7,9, 10 mM MgCI2, 0,1 mM I

I DTT, 0,1 mM EDTA, 50-200 mM NaCI, 10% (v/v) glycerol, 150 μΜ ATP, GTP, CTP, 50 μΜ I

I UTP, 5 μΟ 32P-UTP (~ 3000 Cl/m mol, Amersham Buchler, Braunschweig), 0,05 pmol I

I 30 endonudeolytisk spaltet DNA, 0,25 pmol RNA-polymerase. Reaktioner blev starter ved I

I tilsætning af RNA-polymerase og lodes forløbe imellem 1 og 5 minutter ved 37°C. I

I Syntetiseret RNA blev isoleret ved gentagen ethanoludfældning og analyseret ved I

I højvoltsgelelektroforese gennem 0,4 mm tyk 5 eller 8%'s polyacrylamidgeler indeholdende I

I 8M urinstof. Efter elektroforese blev gelerne tørret og underkastet autoradiografi under I

I 35 anvendelse af Kodax X-OMAT XAR 5-film ved stuetemperatur. I

13 DK 175206 B1 EKSEMPEL 1

Konstruktion af shuttle-vektoren p602/5 5 I) 2 Mg g af plasmidet pUBllO spaltes fuldstændigt med restriktionsendonucleasen Pvu II.

En octamer Kpn/-linker ligeres med /VuII-enderne. Efter ligation spaltes DNA'et fuldstaéndigt med endonudeaserne Kpnl og EcoRI. Det resulterende spaltede DNA underkastes elektroforese gennem 1%’s lavt smeltende agarosegel indeholdende 1 ng/ml ethidiumbromid. Efter 2 timers elektroforese ved 70V visualiseres DNA-båndene ved 10 fluorescens, og det øverste 3,5 Kb store bånd skæres ud fra gelen. Dette 3,5 Kb EcoRI/ΚρπΙ-fragment oprenses derefter fra den lavtsmeltende agarose.

II) 5 Mg af plasmidet pDS5 spaltes fuldstændigt med Dral, og radioaktive octamere Kpril-linkere ligeres med Dral-enderne. Ugationsprodukterne spaltes derefter fuldstændigt med 15 endonudeaserne Kpnl og Xba\ og separeres ved elektroforese gennem en 6%'s polyacrylamidgel. Et Xpnl/Xbal-fragment pi ca. 1,2 Kb lokaliseres ved autoradiografi og skæres ud fra gelen. Xpnl/Xbal-fragmentet oprenses derefter fra acrylamidgelskiven.

III) 5 Mg af plasmidet pDS5 spaltes fuldstændigt med endonudeaserne EcoRI og Xbal og 20 adskilles derefter ved elektroforese gennem en 1%’s lavtsmeltende agarosegel, der indeholder 1 M9/ml ethidiumbromid. Efter elektroforese visualiseres DNA-båndene ved fluorescens, og et ca. 900 bp EcoRI/Xbal-fragment skæres ud. EcoRI/Xbal-fragmentet oprenses derefter fra den lavtsmeltende agarose.

25 IV) Ækvimolære mængder af de oprensede DNA-fragmenter fra trin I-II1 ligeres, og ligationsprodukterne transformeres til kompetente kulturer af E. coE-stamme AB1157 (Maniatis et al., supra). Transformerede celler udplades på LB-agar, der indeholder 10 Mg/ml kanamycin. Plasmid DNA isoleres fra kanamycinresistente kolonier, og integriteten af de respektive fragmenter bekræftes ved restriktionsendonudeasespaltning. Det således 30 fremstillede plasmid betegnes p602/5. Konstruktionen af p602/5 er vist i fig. 1.

EKSEMPEL 2 35 Konstruktion af ekspressionsvektoren p602/7RBSI og p602/7RBSII, der bærer de flytbare ribosombindingsstedkodende syntetiske DNA-sekvenser I) 2 m9 af plasmidet p602/5 spaltes fuldstændigt med restriktionsendonucleaserne EcoRI og HindlU, og det ca. 5,6 Kb store vektor DNA-fragment isoleres. Dette fragment ligeres

I DK 175206 B1 I

I I

I derefter med et 125 bp 5coRI/W/ndIIl-fragment, der indeholder B. subtilis-promotoren PvII I

I med følgende DNA-sekvens: I

I 5 5 * AATTCTCATG TTTGACAGCT TATCATCGAA TTATAGGAAT AGAGCAAACA I

I 3' GAGTAC AAACTGTCGA ATAGTAGCTT AATATCCTTA TCTCGTTTGT I

I AGCAAAGGAA ATTTTGTCAA AATAATTTTA TTGACAACGT CTTATTAACG I

I TCGTTTCCTT TAAAACAGTT TTATTAAAAT AACTGTTGCA GAATAATTGC I

I 10 I

I TTGATATAAT TTGCA 3' I

I AACTATATTA AACGTTCGA 5' I

I 15 Ugationsprodukterne transformeres til E. coli-stamme ABI 157, og transformerede celler I

I udvælges på LB-agar indeholdende 50 ng/ml chloramphenicol. Chloramphenicolresistente I

I kolonier analyseres for at bekræfte indsætningen af promotoren PvII i plasmidet p602/5. I

I Det resulterende plasmid betegnes p602/7. I

I 20 II) 2 pg af plasmidet p602/7 spaltes fuldstændigt med endonucleasen HincflU. Den flytbare I

I ribosombindingsstedkodende syntetiske DNA-sekvens SRBSI med sekvensen I

I 5’ 3' I

I AGCTTTATATAAGGAGGAGTTAAGCATGCAC I

aatatattcctcctcaattcgtacgtgtcga I

I 25 3- 5' I

ligeres ind i H/ndIII-sted. Ugationsprodukterne transformeres til E.coli stamme ABI 157, og I

transformerede celler udvælges på LB-agar indeholdende 50 pg/ml chloramphenicol. I

I 30 Chloramphenicolresistente kolonier analyseres for deres optagelse af plasmider, som I

indeholder den flytbare ribosombindingsstedkodende syntetiske DNA-sekvens SRBSI ved I

I hjælp af I

H a) evnen til at syntetisere et CAT-fusionsprotein fra SRBSI og I

H 35 b) restriktionsenzymanalyse af det rekombinante plasmid, der indeholder et I

nyerhvervet Sp/rl-sted. I

I Det således karakteriserede plasmid-DNA betegnes p602/7RBSI. Oprenset p502/7RBSI- DNA transformeres derefter til B. subtilis stamme BR151, og chloramphenidlresistente 15 DK 175206 B1 kolonier (i dette tilfælde kolonier, der er resistente over for 10 pg/ml chloramphenicol) analyseres som nævnt under II a) og b) for at bekræfte anvendeligheden af SRBSI i B. subtilis.

5 III) Plasmidet p602/7RBSI spaltes fuldstændigt med Hindlll og Sphl og oprenses fra SRBSI ved elektroforese gennem en 1%’s lavtsmeltende agarosegel, der indeholder 1 μ9/ηηΙ ethidiumbromid. Efter elektroforese visualiseres DNA ved fluorescens og skæres ud fra gelen. DNA oprenses derefter fra agarosen. En flytbar ribosombindingsstedkodende syntetisk DNA-sekvens med betegnelsen SRBSII og sekvensen 10 5' 3· AGCTTGGATTTAAAATTTAGGAGGAATTTAAGCATG ACCTAAATTTTAAATCCTCCTTAAATTC 3· 5.

15 ligeres med det med HincflU/Sphl spaltede p602/7RBSI-DNA. E. co//stamme AB 1157 transformeres med denne ligationsblanding, og transformerede celler udvælges pi LB-agar, der indeholder 50 ng/ml chloramphenicol. Chloramphenicolresistente kolonier analyseres for tilstedeværelsen af SRBSII ved hjælp af 20 a) evnen til at syntetisere et CAT-fusionsprotein og b) restriktionsenzymanalyse af det rekombinante plasmid, der indeholder et nyt Dral-sted. 1 2 3 4 5 6

Dét således karakteriserede plasmid DNA betegnes p602/7RBSII. Plasmidet p602/7RBSII

2 indføres i kompetente celler af B. subt/Y/sstamme BR151 og, og transformerede celler 3 udvælges pi LB-agar indeholdende 10 pg/m! chloramphenicol. Chloramphenicolresistente 4 kolonier analyseres for udnyttelsen af SRBSII i B. subtilis som beskrevet under trin III a) 5 og b). Konstruktion af vektorerne p602/7RBSI og p602/7RBSII er vist i fig. 2.

6 EKSEMPEL 3

Konstruktion af ekspressionsvektoren p602/25, der bærer colifag T5-promotoren PG25 35 I) 2 μς af plasmidet p602/5 spaltes fuldstændigt med restriktionsendonuclasen EcoRI.

Dette DNA ligeres derefter med ækvimolære mængder af et 250 bp langt EcoRI-fragment, som indeholder colifag T5-promotoren PG2S (R. Gentz, supra). Ligationsprodukterne transformeres til £. coli stamme ABI 157, og transformerede celler udvælges på LB-agar,

I DK 175206 B1 I

I 16 I

I som indeholder 100 μg/ml chloramphenicol. Plasmid DNA isoleres fra I

I chloramphenicolresistente kolonier og analyseres ved spaltning med fcoRI eller DNA- I

I sekventering for tilstedeværelsen af det 250 bp lange fragment, som indeholder I

I promotoren PG25. Det således karakteriserede plasmid DNA betegnes p602/25. I

I 5 Konstruktionen af p602/25 er vist i fig. 2. I

I EKSEMPEL 4 I

I 10 Konstruktion af vektoren p25RBSI, der bærer colifag T5 promotoren PG25 kombineret med I

I den flytbare ribosombindingsstedkodende syntetiske DNA-sekvens SRBSI I

I I) 2 μg af plasmidet p602/7RBSl spaltes fuldstændigt med restriktionsendonucleaserne I

I Hincflll og Bgfll og fraktioneres ved elektroforese gennem en 1%’s lavtsmeltende I

I 15 agarosegel indeholdende 1 μg/ml ethidiumbromid. Efter elektroforese visualiseres DNA- I

I båndene ved fluorescens, og det øverste, ca. 3,2 Kb lange bånd skæres ud. Dette frag- I

I ment oprenses derefter fra agarosen. I

II) 2 μg af plasmidet p602/25 spaltes ligeledes fuldstændigt med re- I

I 20 striktionsendonudeaseme HindlU og Bgfll og fraktioneres ved elektroforese gennem en I

I 1%‘s agarosegel, som indeholder ethidiumbromid. DNA-båndene visualiseres ved I

I fluorescens, og det lavere, ca. 2,6 Kb lange bånd skæres ud og oprenses fra agarosen. I

I III) Ækvimolære mængder af de i eksempel 4 I) og II) fremstillede DNA-fragmenter I

I 25 ligeres, og ligationsprodukterne transformeres til E.co//-stamme AB1157. Plasmid DNA I

I isoleres fra kolonier, som er resistente over for 100 Mg/ml chloramphenicol, og analyseres I

I for tilstedeværelsen af det 250 bp lange £coRI-bånd. Det således karakteriserede plasmid I

I DNA betegnes p25RBSI. Konstruktionen af plasmidet p25RBSl er vist i fig. 3. I

I 30 IV) Plasmid DNA isoleres fra E. coli, som indeholder p25RBSl, og transformeres til I

I kompetente kulturer af B. subtilis stamme BR151, og transformerede celler udvælges på I

I LB-agar indeholdende 10 pg/ml chloramphenicol. Plasmid DNA isoleres fra I

I chloramphenicolresistente kolonier, og strukturen af plasmidet p25RBSI i B. subtilis I

I bekræftes ved restriktionsendonudeaseanalyse. I

I 35 I

V) B. subtilis-kolonier, som indeholder plasmidet p25RBSI, dyrkes i L-væske indeholdende I

I 10 μθ/ml chloramphenicol, og totalproteinet, der syntetiseres ved disse kulturer, I

I analyseres ved SDS/polyacrylamidgelelektroforese. Anvendelsen af colifag T5-promotoren I

I Pg2s sammen med den syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens SRBSI I

17 DK 175206 B1 bekræftes ved syntese af et CAT-fusionsprotein, som starter i umiddelbar nærhed af SRBSI og slutter ved E. coli-catgenets naturlige translationstermineringskodon. Resultaterne af en sådan analyse er vist i fig. 4.

5 EKSEMPEL 5

Konstruktion af vektorerne p25RBSII og p25*RBSII, der bærer cotifag T5-promotoren PG2s kombineret med den flytbare ribosombindingsstedkodende syntetiske DNA-sekvens SRBSI1 10 I) 2 ug af plasmidet p602/7RBSII spaltes fuldstændigt med restriktionsendonudeaserne HindlU og BglU, og produkterne fraktioneres ved elektroforese gennem en 1%'s lavtsmeltende agarosegel indeholdende 1 μ9/ιηΙ ethidiumbromid. Efter elektroforese visualiseres DNA-blndene ved fluorescens; øverste, ca. 3,2 Kb lange bånd skæres ud og 15 oprenses fra agarosen.

II) 2 ug af piasmidet p602/25 spaltes tilsvarende fuldstændigt med re-striktionsendonudeaserne HindlU og Bgfll og fraktioneres ved elektroforese gennem en 1%’s lavtsmeltende agarosegel indeholdende 1% ethidiumbromid. Efter elektroforese 20 visualiseres DNA-båndene ved fluorescens, og det laveste, ca. 2,6 Kb lange bånd skæres ud og oprenses fra gelen. Ækvimolære mængder af DNA-fragmenterne, der er isoleret ifl. eksempel 5 I)-II), ligeres, og ligationsprodukterne transformeres til E. coli stamme ABI 157; de transformerede celler udvælges på LB-agar indeholdende 100 pg/ml chloramphenicol. Plasmid DNA isoleres fra chloramphenicolresistente kolonier, og 25 tilstedeværelsen af både colifag T5-promotoren PG25 og den syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens SRBSII bekræftes ved restriktionsendonudeaseanalyse.

Det således karakteriserede plasmid DNA betegnes p25/RBSII. Konstruktionen af plasmidet p25RBSII er vist i fig. 3.

30 Proteinsyntese i B. subtilis indeholdende vektoren p25RBSIl er vist i fig. 4. Det viste sig, at det EcoRI-fragment, som indeholder promotoren PG25f indeholder et yderligere ribosombindingssted, som fremkalder et fusionsprotein, som strækker sig til enden af catgenet. Den umiddelbare effekt er drastisk at nedsætte effektiviteten af RBSI1; som følge heraf blev proteinlæserammen fra ribosombindingsstedet i umiddelbar nærhed af PG2s 35 ændret som følger for at maksimere proteinsyntese fra SRBSII: IV) 2 ug af plasmidet p25/RBSII spaltes fuldstændigt med restriktionsendonucleasen HindlU. De kohæsive W/ndIII-ender omdannes til stumpe ender ved inkubation med DNA-polymerase Klenow-fragment i nærværelse af alle fire dNTP'er. Duodecamere HindlU-

I DK 175206 B1 I

I 18 I

I linkere tigeres til disse stumpe ender, og ligationsprodukterne spaltes fuldstændigt med I

I HindUl. Dette DNA fraktioneres ved elektroforese gennem en 1%'s lavtsmeltende I

I agarosegel, der indeholder 1 ng/ml ethidiumbromid. Efter elektroforese visualiseres DNA'et I

I ved fluorescens, udskæres fra gelen og oprenses fra agarosen. Dette DNA ligeres på ny, og I

I 5 ligationsprodukterne transformeres til E. coli stamme ABI 157. Transformerede celler I

I udvælges på LB-agar, der indeholder 100 ug/ml chloramphenicol. Plasmid DNA isoleres fra I

I chloramphenicolresistente kolonier, og tilstedeværelsen af det netop indførte W/ndlll-sted I

I bekræftes ved restriktionsendonucleaseanalyse. Det således karakteriserede plasmid DNA I

I betegnes p25*RBSII. Konstruktionen af plasmidet p25*RBSII er vist i fig. 3. I

I 10 I

I V) Plasmidet p25*RBSII indføres i kompetente kulturer af B. subt/7/sstamme BR151, og I

I transformerede celler udvælges på LB-agar indeholdende 10 μg/ml chloramphenicol. I

I Derefter isoleres plasmid DNA fra chloramphenicolresistente kolonier, og dets strukturelle I

I identitet med p25*RBS!I isoleret fra E. coli bestemmes ved restriktionsendonudease- I

I 15 analyse. I

I VI) Individuelle chloramphenicolresistente kolonier af B. subtilis dyrkes i L-væske I

indeholdende 10 pg/ml chloramphenicol, og totalprotein syntetiseret af disse kolonier I

20 PG25 sammen med den syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens SRBSII I

bekræftes ved syntesen af et CAT-fusionsprotein, som starter i umiddelbar nærhed af I

I SRBSII, og som slutter ved E. coli catgenets naturlige termineringskodon. Resultaterne af I

I en sådan analyse er vist i fig. 5. I

I 25 I

I EKSEMPEL 6 I

I In Wfro-analyse af E. co//-promotorer med B. subtilis RNA-polymerase I

I 30 Tabel 1 viser de promotorer, som blev anvendt. Deres potentiale blev bestemt ved I

I transkriptionsfrekvensen in vitro, hvis resultater er vist i fig. 6. I hvert tilfælde er I

I promotorudnyttelsen af B. subtilis 65SRNA-polymerase blevet bestemt som en funktion af I

I stigende ionstyrke og sammenlignet med dens effektivitet, nir den transkriberes med I

I E.coli RNA-polymerase ved 200 mM NaCI. Hvert transkriptionsassay indeholder ud over I

I 35 den pågældende promotor støkiometriske mængder af B. subt/7/s-veg-promotoren, der I

I tidligere har vist sig at blive effektivt udnyttet af B. subtilis δ55 RNA-polymerase (Moran Jr. I

I et al., Mol. Gen. Genetics 186, 1982, s. 339-346). Det fremgår af de i fig. 6 viste data, at I

alle de testede promotorer genkendes af B.subtilis RNA-polymerase, omend i varierende I

I omfang. I tilfælde af colifag T5-promotoreme PN26 og pK28a/PK28b kan transkriptionen faktisk I

19 DK 175206 B1 være stærkere end fra veg-promotoren. Endvidere er effekten af saltkoncentration på promotoreffektivitet tydelig. Ved 50 mM NaCI initierer B. subtilis RNA-polymerase ikke alene transkription fra de pågældende promotorer, men også fra pBR322 vektor DNA’ets "bla" og "ori"-promotorer (til indledende undersøgelser blev alle promotorer indsat i 5 pBR322-afledte vektorer: disse plasmider blev derefter spaltet, således at de gav et konstant "bla"-transknpt på 350 nucleotider og et transkript af variabel længde fra den pågældende colifag T5-promotor). Nar saltkoncentrationen øges, bliver promotorselektion tydelig, idet den er fordelt mellem veg- og colifag T5-promotorerne. For at teste om resultaterne fra fig. 6 har relevans in vivo, kan colifag T5-promotorer eller Al-promotoren 10 fra colifag T7 anvendes i stedet for PGz5-promotoren i vektoren p25*RBSII (fig. 3), og CAT-syntese i B. subtitis kan bestemmes.

EKSEMPEL 7 15

Konstruktion af vektoren p602/18, der bærer colifag T5-promotoren PN25 kombineret med den flytbare ribosombindingsstedkodende syntetiske DNA-sekvens RBS1I, 9A

I) 2 μg af plasmidet pDS5/RBSII, 9A spaltes fuldstændigt med restriktionsendonudeaserne 20 Xho\ og Xbal og fraktioneres ved elektroforese gennem en 1%’s lavtsmeltende agarosegel indeholdende 1 Mg/ml ethidiumbromid. Efter elektroforese visualiseres DNA-båndene ved fluorescens, og det laveste, ca. 1,0 Kb lange bånd skæres ud. Dette fragment oprenses derefter fra agarosen.

25 II) 2 pg af plasmidet p25*RBSII spaltes ligeledes fuldstændigt med restriktionsendonudeaserne Xhol og Xbal og fraktioneres gennem en 1%‘s lavtsmeltende agarosegel indeholdende 1 Mg/ml ethidiumbromid. Båndene visualiseres ved fluorescens, og det øverste, ca. 4,6 Kb lange bånd skæres ud og oprenses fra agarosen.

30 III) Ækvimolære mængder af de i eksempel 7 I) og II) fremstillede DNA-fragmenter ligeres, og ligationsprodukterne transformeres til kompetente celler af B. subtilis stamme BR151. Plasmid DNA isoleres fra transformerede celler, som er resistente over for 10 Mg/ml kanamycin og 10 Mg/ml chloramphenicol, og analyseres for tilstedeværelsen af det 1,0 Kb lange Xhol/Xbal -fragment. Det således karakteriserede plasmid betegnes p602/18.

35 Konstruktionen af p602/18 er vist i fig. 7.

IV) B. subt/7/s-kolonier indeholdende plasmidet p602/l8 dyrkes i L-væske indeholdende 10 Mg/ml chloramphenicol, og totalproteinet, som syntetiseres af disse kulturer, analyseres ved SDS/polyacrylamidgelelektroforese. Udnyttelsen af colifag promotoren PH25 sammen

I DK 175206 B1 I

I 20 I

I med den syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens RBSII, 9A bekræftes ved I

I syntesen af et CAT-fusionsprotein, som starter i umiddelbar nærhed af RBSII, 9A og slutter I

I ved E. coii-cat-genets naturlige translationstermineringskodon. Resultaterne af en sådan

I analyse er vist i fig. 9. I

I 5 I

I EKSEMPEL 8 I

I Konstruktion af vektoren p602/19, der bærer colifag T5-promotoren PN25 kombineret med I

I 10 den flytbare ribosombindingsstedkodende syntetiske DNA-sekvens RBSII, 3A+5A I

I I) 2 pg af plasmidet pDS5/RBSll, 3A+5A spaltes fuldstændigt med I

I restriktionsendonucleaserne XhoI og Xbal og fraktioneres ved elektroforese gennem en I

I 1%’s lavtsmeltende agarosegel indeholdende 1 μο/ηηΙ ethidiumbromid. Efter elektroforese I

I 15 visualiseres DNA-båndene ved fluorescens, og det laveste, ca. 1,0 Kb lange bånd skæres I

I ud. Dette fragment oprenses derefter fra agarosen. I

I II) 2 μς af plasmidet p25*RBSII spaltes ligeledes fuldstændigt med I

I restriktionsendonucleaserne Xho I og Xbal og fraktioneres ved elektroforese gennem en I

I 20 1%’s lavtsmeltende agarosegel indeholdende 1 pg/ml ethidiumbromid. DNA-båndene I

I visualiseres ved fluorescens, og det øverste, ca. 4,7 Kb lange bånd skæres ud og oprenses I

fra agarosen. I

I III) Ækvimolære mængder af de i eksempel 8 I) og II) oprensede DNA-fragmenter ligeres, I

I 25 og ligationsprodukterne transformeres til kompetente celler af B. subtilis stamme BR151. I

I Plasmid DNA oprenses fra transformanter, som er resistente over for 10 Mg/ml kanamycin I

og 10 pg/ml chloramphenicol, og analyseres for tilstedeværelsen af det 1,0 Kb lange I

I XboI/Xbal-fragment. Det således karakteriserede plasmid DNA betegnes p602/19. I

I Konstruktionen af p602/19 er vist i fig. 7. I

I 30 I

I IV) B. subtilis-kolonier indeholdende plasmidet p602/19 dyrkes i L-væske indeholdende 10 I

Mg/ml chloramphenicol, og totalproteinet, der syntetiseres af disse kulturer, analyseres ved I

I SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Udnyttelse af colifag T5-promotoren PN25 sammen med I

I den syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens RBSII, 3A+5A bekræftes ved I

I 35 syntese af et CAT-fusionsprotein, der starter i umiddelbar nærhed af RBSII, 3A+5A og I

.. slutter ved cat-genets naturlige translationstermineringskodon. Resultaterne af en sådan I

I analyse er vist i fig. 9. I

21 DK 175206 B1 EKSEMPEL 9

Konstruktion af vektoren p602/20, der bærer colifag T5-promotoren PN25 kombineret med den flytbare ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens RBSII 5 I) 2 af plasmidet pDS8/RBSII spaltes fuldstændigt med restriktionsendonucleaserne Xhol og Xbal og fraktioneres ved elektroforese gennem en 1%'s lavtsmeltende agarosegel, der indeholder 1 Mg/ml ethidiumbromid. Efter elektroforese visualiseres DNA-båndene ved fluorescens, og det laveste, ca. 2,0 Kb lange bånd skæres ud. Fragmentet oprenses 10 derefter fra agarosen.

II) 2 μg af plasmidet p25*RBSII spaltes ligeledes fuldstændigt med restriktionsendonucleaserne Xhol og Xbal og fraktioneres ved elektroforese gennem en 1%'s lavtsmeltende agarosegel indeholdende 1 pg/ml ethidiumbromid. DNA-båndene 15 visualiseres ved fluorescens, og det øverste, ca. 4,7 Kb lange bånd skæres ud og oprenses fra agarosen.

III) Ækvimolære mængder af de i eksempel 9 I) og II) fremstillede DNA-fragmenter ligeres, og ligationsprodukterne transformeres til kompetente celler af B. subtilis stamme 20 BR151. Plasmid DNA oprenses fra transformanter, som er resistente over for 10 pg/ml kanamycin og 10 pg/ml trimethoprim, og analyseres for tilstedeværelsen af det 2,0 Kb lange Xhol/Xbal-fragment. Det således karakteriserede plasmid DNA betegnes p602/20. Konstruktionen af p602/20 er vist i fig. 8.

25 IV) B. subtilis-kolonier, der indeholder plasmidet p602/20, dyrkes i L-væske indeholdende 10 Mg/ml kanamycin, og totalproteinet, som syntetiseres af disse kulturer, analyseres ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Udnyttelse af colifag T5-promotoren PM2S sammen med den syntetiske ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens RBSII bekræftes ved syntesen af et DHFR-fusionsprotein, som starter i umiddelbar nærhed af RBSII og slutter ved dhfr-30 genets naturlige translationstermineringskodon. Resultaterne af denne analyse er vist i fig.

9.

I DK 175206 B1 I

I I

I EKSEMPEL 10 I

I Konstruktion af vektoren p602/21, der indeholder colifag T5-promotoren PM2S kombineret I

I med den flytbare ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens RBSII, 3A+5A I

I 5 I

I I) 2 pg af plasmidet pDS8/RBS!I, 3A+5A spaltes fuldstændigt med H

I restriktionsendonucleaserne Xhol og Xbal, og produkterne fraktioneres gennem en 1%‘s I

I lavtsmeltende agarosegel indeholdende 1 ng/ml ethidiumbromid. Efter elektroforese I

I visualiseres DNA-båndene ved fluorescens, og det laveste, ca. 2,0 Kb lange bånd skæres I

I 10 ud og oprenses fra agarosen. I

I II) 2 Mg af plasmidet p25*RBSII spaltes ligeledes fuldstændigt med I

I restriktionsendonucleaserne Xhol og Xbal, og produkterne fraktioneres gennem en 1%'s I

I lavtsmeltende agarosegel indeholdende 1 pg/ml ethidiumbromid. Efter elektroforese I

I 15 visualiseres DNA-båndene ved fluorescens, og det laveste, ca. 2,0 Kb lange bånd skæres I

I ud og oprenses fra agarosen. I

I III) Ækvimolære mængder af de i eksempel 10 I) og II) oprensede DNA-fragmenter I

I ligeres, og' ligationsprodukterne transformeres til kompetente celler af B. subtilis stamme I

I 20 BR151. Plasmid DNA isoleres fra transformanter, som er resistente over for 10 Mg/ml I

I kanamycin og 10 ng/ml trimethoprim, og analyseres for tilstedeværelsen af det 2,0 Kb I

I lange Xhol/Xbal fragment. Det således karakteriserede plasmid DNA betegnes p602/21. I

I Konstruktioner af p602/21 er vist i fig. 8. I

I 25 IV) B. subtilis kolonier indeholdende plasmidet p602/21 dyrkes i L-væske, der indeholder I

10 pg/ml kanamycin, og totalproteinet, som syntetiseres af disse kulturer, analyseres ved I

SDS/polyacrylamidgelelektroforese. Udnyttelse af colifag T5-promotoren PN2S sammen med I

I syntesen af et DHFR-fusionsprotein, som starter i umiddelbar nærhed af RBSII, 3A+5A og I

I 30 slutter ved dhfr-genets naturlige translationstermineringskodon. Resultaterne af en sådan I

I analyse er vist i fig. 9. I

Claims

1. Grampositiv bakteriel ekspressionskontrol DNA-sekvens, der i nedstrøms retning i forhold til transkriptionen omfatter: 5 a) en colifag T5- eller T7-promotor; b) en ribosombindingsstedkodende syntetisk DNA-sekvens med formlen 5’ 3' 10 AGCTTTATATAAGGAGGAGTTAAGCATGCAC ( SRBSI) , AATATATTCCTCCTCAATTCGTACGTGTCGA 3 ’ 5’ 15 5· 3* AGCTTGGATTTAAAATTTAGGAGGAATTTAAGCATG (SRBSII), ACCTAAATTTTAAATCCTCCTTAAATTC 3’ 3’ 20 5 ’ 3 ’ AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGGG {RBSII, 3A+5A), GTAATTTCTCCTCTTTAATTGATACTCCCCTAG 3' 5' 25 5» 31 AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAG (RBSII) eller GTAATTTCTC CTCTTTAATTGATACTCTC CTAG 3’ 5' 30 31 AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGGAAG (RBSII, 9A); GTAATTTCTC CTCTTTAATTGATAC CTTC CTAG 3’ 5' 35 og c) en transkriptionsterminerings-DNA-sekvens af gramnegativ oprindelse. I DK 175206 B1 I I 24 I

2. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor colifag T5-promotoren er PN25- I I promotoren. I

3. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor colifag T5-promotoren er PN26- I I 5 promotoren. I

4. Ekspressionskontroi DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor colifag T5-promotoren er PG25- I I promotoren. I I 10

5. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor colifag T5-promotoren er PJ5- I I promotoren. I

6. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor colifag T5-promotoren er Pd/e2ct I I promotoren. I I 15 I

7. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor colifag T5-promotoren er PK28a* I I promotoren.

8. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor colifag T5-promotoren er PK28b- I I 20 promotoren. H

9. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor T7-promotoren erT7Al- I I promotoren. I I 25

10. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge krav 1, hvor T7-promotoren erT7A2- I I promotoren. I

11. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, hvor I I transkriptionsterminerings-DNA-sekvensen er den fra E. cofi stammende terminator to. I I 30 I

12. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, hvor I I transkriptionsterminerings-DNA-sekvensen er den fra E. cofi stammende terminator TI. I

13. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, hvor I I 35 transkriptionsterminerings-DNA-sekvensen er den fra E. cofi stammende terminator T2. I

14. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, hvor I I transkriptionsterminerings-DNA-sekvensen er den fra E. cofi stammende terminator T7. I DK 175206 B1

15. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-14, der er i stand til at fungere i Bacillus.

16. Ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge krav 15, der er i stand til at fungere i Bacillus 5 subtilis.

17. Ribosombindingsstedkodende syntetisk DNA-sekvens, der er i stand til at fungere i grampositive organismer, hvilken syntetisk DNA-sekvens har formlen 10 5' 3' AGCTTTATATAAGGAGGAGTTAAGCATGCAC {SRBSI), AATATATTCCTCCTCAATTCGTACGTGTCGA 3» 5, 15 5' 3* AGCTTGGATTTAAAATTTAGGAGGAATTTAAGCATG (SRBSII), ACCTAAATTTTAAATCCTCCTTAAATTC 3' 3' 20 5' 3* · . AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGGG (RBSII, 3A+5A), GTAATTTCTCCTCTTTAATTGATACTCCCCTAG 3* 5' 5’ 3’ AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAG (RBSII) eller GTAATTTCTCCTCTTTAATTG ATACTCTC CTAG 3' 5» 30 5' 3' AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGGAAG (RBSI1, 9 A) ; GTAATTTCTCCTCTTTAATTGATACCTTCCTAG 3’ 5’ 35

18. Ribosombindingsstedkodende syntetisk DNA-sekvens ifølge krav 17, der er i stand til at fungere i Bacillus. I DK 175206 B1 I I 26 I

19. Ribosombindingsstedkodende syntetisk DNA-sekvens ifølge krav 18, der er i stand til I I at fungere i Bacillus subtilis. I I 5

20. Ekspressionsvektor, der indeholder I I a) en grampositiv bakteriel ekspressionskontrol DNA-sekvens Ifølge et hvilket som I I helst af kravene 1-16, idet den ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens I I eventuelt er operativt forbundet med et fremmed gen, som indkoder prokaryote I 10 eller eukaryote polypeptider, I b) mindst ét vektorreplikationsinitieringssted og I c) mindst ét antibiotikaresistensgen. I I 15 I

21. Ekspressionsvektor ifølge krav 20, der er en plasmid shuttle-vektor, som er i stand til I I at replikere i gramnegative og grampositive bakterier. I

22. Ekspressionsvektor ifølge krav 21, der er i stand til at repiikere i en stamme af E. cofi I I 20 og Bacillus. I

23. Ekspressionsvektor ifølge krav 22, der er i stand til at replikere i en stamme af E. coli I I og B. subtilis. I I 25

24. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 20-23, der er p25RBSI DSM I 3350. I

25 AGCT1TATATAAGGAGGAGTTAAGCATGCAC (SRBSI), AATATATTCCTCCTCAATTCGTACGTGTCGA 3» 5' 5' 3'

25. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 20-23, der er p25RBSII DSM I I 3351. I I 30 i

26. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 20-23, der er p25*RBSIl I I DSM 3352. I

27. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 20-23, der er p602/l8 DSM I I 35 3723. I

28. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 20-23, der er p602/19 DSM I I 3724. I DK 175206 B1

29. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 20-23, der er p602/20 DSM 3725.

30 AGCTTGGATTTAAAATTTAGGAGGAATTTAAGCATG (SRBSII) , ACCTAAATTTTAAATCCTCCTTAAATTC 3’ 3' 5' 3*

30. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 20-23, der er p602/21 DSM 5 3726.

31. Transformant, der bærer en ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene kravene 20-30.

32. Transformant ifølge krav 31, der er en Bacillus subtilis stamme.

33. Transformant ifølge krav 32, der er en Bacillus subtilis BR151-stamme.

34. Fremgangsmåde til fremstilling af en grampositiv bakteriel ekspressionskontrol DNA-15 sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-16, hvilken fremgangsmåde der i nedstrøms retning i forhold til transkriptionen omfatter kombination af a) en colifag T5- eller T7-promotor; 20 b) en ribosombindingsstedkodende syntetisk DNA-sekvens med formlen 5’ 3'

35. Fremgangsmåde til fremstilling af en ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af I I 15 kravene 20-30 ved velkendte DNA-rekombinationsteknikker, hvilken fremgangsmåde I I omfatter at: I I a) der i en eksisterende kloningsvektor i nedstrøms retning i forhold til transkriptionen I I indsættes mindst én colifag T5- eller T7-promotor og en ribosom- I I 20 bindingsstedkodende DNA-sekvens som defineret i krav 17, I b) der i kloningsvektoren tilvejebringes mindst ét restriktionsendonucleasested ved I I siden af den ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens, I I 25 c) mindst ét fremmed gen, som indkoder prokaryote eller eukaryote polypeptider, I I indsættes i restriktionsendonucleasestedet ved siden af den I I ribosombindingsstedkodende DNA-sekvens, og I I d) mindst én transkriptionsterminerings-DNA-sekvens af gramnegativ oprindelse I I 30 indsættes i nedstrøms retning i forhold til det fremmede gen, som indkoder I I prokaryote eller eukaryote polypeptider. I

35 AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGGG (RBSII, 3A+5A), GTAATTTCTCCTCTTTAATTGATACTCCCCTAG 3' 5’ I DK 175206 B1 I I 28 I I 5’ 3' I I AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGAGAG (RBSII) eller I I GTAATTTCTCCTCTTTAATTGATACTCTCCTAG I I 3’ 5’ ' I I 5 5* 3' I I AATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGGAAG (RBSII, 9A); I I GTAATTTCTCCTCTTTAATTGATACCTTCCTAG I I 3» 51 I I og I I 10 I I c) en transkriptionsterminerings-DNA-sekvens af gramnegativ oprindelse til en I I funktionel enhed ved velkendte DNA-rekombinationsteknikker. I

36. Fremgangsmåde til fremstilling af et pro- eller eukaryot polypeptid, hvilken I I fremgangsmåde omfatter at en vært transformeres med en ekspressionsvektor ifølge et I I 35 hvilket som helst af kravene 20-30, hvilken ekspressionsvektor indeholder en DNA- I I sekvens, der koder for et polypeptid, operativt indsat i en ekspressionskontrol DNA- I I sekvens ifølge krav 1-16, transformanten dyrkes under hensigtsmæssige I I vækstbetingelser, og det dannede polypeptid isoleres fra kulturen. I DK 175206 B1

37. Fremgangsmåde ifølge krav 36, hvor vektoren er en plasmid-shuttle-vektor, som er i stand til at replikere i gramnegative og grampositive bakterier.

38. Fremgangsmåde ifølge krav 37, hvor plasmid-shuttle-vektoren er i stand til at replikere 5 i en stamme af E. coli og Bacillus.

39. Fremgangsmåde ifølge krav 38, hvor plasmid-shuttle-vektoren er i stand til at replikere i en stamme af E. coli og Bacillus subtilis.

40. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 36-39, hvor shuttle-vektoren er P25RBSI DSM 3350.

41. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 36-39, hvor shuttle-vektoren er P2SRBS11 DSM 3351. 15

42. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 36-39, hvor shuttle-vektoren er p25*RBSII DSM 3352.

43. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 36-39, hvor shuttle-vektoren er 20 p602/18 DSM 3723.

44. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 36-39, hvor shuttle-vektoren er Ρ602/19 DSM 3724.

45. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 36-39, hvor shuttle-vektoren er Ρ602/20 DSM 3725.

46. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 36-39, hvor shuttle-vektoren er Ρ602/21 DSM 3726. 30

47. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 36-44, hvor polypeptidet er E. coli chloramphenicolacetyltransferase.

48. Fremgangsmåde ifølge krav 45 eller 46, hvor polypeptidet er muse-dihydrofolatre-35 duktase.

49. Anvendelse af en ekspressionskontrol DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-16 til ekspression af et gen, som indkoder pro- eller eukaryote polypeptider.