JP2887248B2 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はグラム陽性菌用の新
規発現調節ＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転
換した形質転換株を用いて原核細胞および真核細胞たん
白質を生産する方法に関するものである。 【０００２】 【従来の技術】従来の組換えＤＮＡの研究のほとんどは
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を
用いて行なわれてきた。Ｅ．ｃｏｌｉは、ペリプラズマ
空間を含んで二層の膜を有するグラム陰性細菌群に属す
る。Ｅ．ｃｏｌｉが生産するたん白質の多くは、分泌す
るとしてもこのペリプラズマ空間に分泌される。生細胞
から外部の生育培地中に分泌される物質はほとんどな
い。 【０００３】一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は一層の細胞膜を有するグ
ラム陽性細菌群の一員である。従って、Ｂ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓは生育培地中に多量のたん白質を分泌して生産す
る。さらに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは非病源性であり、
内毒素を生産しないので、本細菌でたん白質を生産させ
るのは有利である。その上、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは今
までに多く研究されており、グラム陽性菌の中で遺伝研
究の原型である。 【０００４】Ｅ．ｃｏｌｉを用いた遺伝子クローニング
の一般的手法はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにも応用できる
が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにクローン化した異種遺伝子
の有用産物を生産し、生育培地中に分泌させる試みは遅
れており、有用なクローニングおよび発現ベクターの一
般的不足により特に困難であった。この発現ベクターの
不足は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける異種ＤＮＡの転
写および翻訳開始シグナルの理解の不足により、一部説
明できる。従って、よく知られているｔｒｐ（Ｒ．Ａ．
ＨａｌｌｅｗｅｌｌおよびＳ．Ｅｍｔａｇｅ、Ｇｅｎｅ
９巻、２７〜４７頁〔１９８０年〕）、ｌａｃ（Ｋ．
Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８巻、１０５
６〜１０６３頁〔１９７７年〕：Ｔ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔ
ｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ
７６巻、５５９６〜５６００頁〔１９７９年〕）、ｌｐ
ｐ（Ｎ．Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４６
巻、８６１〜８６６頁〔１９８１年〕：Ｌ．Ｊ．Ｚｗｉ
ｅｂｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５巻、６５
４〜６５６頁〔１９８１年〕およびＫ．Ｎａｔａｍｕｒ
ａおよびＭ．Ｉｎｏｕｙｅ、Ｃｅｌｌ １８巻、１１０
９頁〔１９７９年〕）およびバクテリオファージ入ＰL
（Ｈ．Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｇｅｎｅ ５巻、５９〜７６
頁〔１９７９年〕）の転写および翻訳システムはＢ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓでは作用しない。従って、Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの
ようなグラム陽性菌からのいくつかの薬剤耐性遺伝子を
除いて、原核細胞および真核細胞たん白質をコードする
外来遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ中で発現されていない（Ａ．Ｔ．Ｇａｎｅｓａｕお
よびＪ．Ａ．Ｈｏｃｈ編集、“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎ
ｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”；Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ〔１９８４年〕および後述のＪ．Ｐａｌｖ
ａの学位論文の総説を参照）。その上、発現量は一般的
に少なく、その結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓのための有能なプロモーターを有するより良い発現
ベクターの開発が望まれてきた。 【０００５】現在、塩基配列が明かにされている既知の
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓプロモーターとし
ては、ｖｅｇプロモーター、ｔｍｓプロモーター、ｐｅ
ｎＰプロモーター（Ｃ．Ｐ．Ｍｏｒａｎ Ｊｒ．ら、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６巻、３３９〜
３４６頁〔１９８２年〕）、ｓｐｏ ＶＣプロモーター
（Ｃ．Ｐ．Ｍｏｒａｎ Ｊｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９巻、５９７９〜５９９０〔１９８
１年〕）、ｓｐｏ ＶＧプロモーター（Ｃ．Ｐ．Ｍｏｒ
ａｎ Ｊｒ．ら、Ｃｅｌｌ ２５巻、７８３〜７９１頁
〔１９８１年〕）、φ２９Ｇ３ａプロモーター、φ２９
Ｇ３ｂプロモーター、φ２９Ｇ２プロモーター、φ２９
Ａ１プロモーター（Ｃ．Ｌ．ＭｕｒｒａｙおよびＪ．
Ｃ．Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５７巻、１０５３〜１０６２頁〔１９８２年〕）、ｐ
ＭＧ１０２プロモーター、ｐＭＧ２０１プロモーター
（Ｍ．Ｚ．Ｇｉｌｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．９巻、５９９１〜６０００〔１９８１
年〕）、ｓｐｏ １−１５プロモーター（Ｇ．Ｌｅｅ
ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３９巻、４０７〜４２２
頁〔１９８０年〕）、ｓｐｏ １−１６プロモーター
（Ｇ．Ｌｅｅら、Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、１８０巻、５７〜６５頁〔１９８０年〕）、および
ＳＰＯ ２プロモーター（Ｒ．Ｇ．Ｓｃｈｏｎｅｒら、
Ｇｅｎｅ ２２巻、４７〜５７頁〔１９８３年〕）があ
る。これらの中ではＳＰＯ ２プロモーター（Ｒ．Ｇ．
Ｓｃｈｏｎｅｒら、前述）およびｖｅｇプロモーター
（ヨーロッパ特許出願公開番号１１６４１１）のみが実
際に遺伝子発現に利用されている。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】このような状況下で、
例えばＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの
ようなグラム陽性細菌で使用できるより良い遺伝子発現
システムを開発することは有利である。このような観点
から、本発明の一般的に使用し得る発現ベクターは原核
細胞および真核細胞たん白質をコードする遺伝子をＢａ
ｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他のグ
ラム陽性宿主中、グラム陰性菌由来の転写開始および終
了ＤＮＡ配列の調節下ではじめて発現できるようになる
ため特に重要である。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、具体的には、
一方の末端付近にグラム陰性細菌の転写開始ＤＮＡ配列
を、他方の末端付近にグラム陰性またはグラム陽性菌由
来の転写終了ＤＮＡ配列を有し、該転写開始ＤＮＡ配列
と転写終了ＤＮＡ配列との中間にグラム陽性またはグラ
ム陰性菌由来のリボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ
配列が原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコードす
る外来遺伝子に機能的に結合して有するグラム陽性細菌
用発現調節ＤＮＡ配列、さらに、５′から３′への下流
方向にグラム陰性菌由来の転写開始ＤＮＡ配列、グラム
陽性またはグラム陰性菌由来のリボゾーム結合部位をコ
ードするＤＮＡ配列およびグラム陰性またはグラム陽性
細菌由来の転写終了配列を機能単位に、公知のＤＮＡ組
み換え技術により結合することより成る発現調節ＤＮＡ
配列を使用するタンパク質の調製法を提供するものであ
る。 【０００８】さらに詳細には、本発明は以下の組み合わ
せより成るものである。 （ａ） グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（プ
ロモーター）とグラム陽性細菌由来のリボゾーム結合部
位をコードするＤＮＡ配列およびグラム陰性細菌由来の
転写終了ＤＮＡ配列。 （ｂ） グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（プ
ロモーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部
位をコードするＤＮＡ配列およびグラム陰性細菌由来の
転写終了ＤＮＡ配列。 （ｃ） グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（プ
ロモーター）とグラム陽性細菌由来のリボゾーム結合部
位をコードするＤＮＡ配列およびグラム陽性細菌由来の
転写終了ＤＮＡ配列、および （ｄ） グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（プ
ロモーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部
位をコードするＤＮＡ配列およびグラム陽性細菌由来の
転写終了ＤＮＡ配列。 【０００９】転写開始ＤＮＡ配列に関連して用いている
細菌由来というのは（ａ）自然界に存在する細菌の転写
開始配列および、そのような転写開始ＤＮＡ配列の一個
または数個のヌクレオチドおよびリピートの置換或いは
逆転を含むその機能的変異種および（ｂ）化学的に合成
した（合成）転写ＤＮＡ配列で細菌で転写開始可能なも
のより成る。 【００１０】リボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配
列に関連して用いている細菌由来という言葉は、（ａ）
自然界に存在する細菌のリボゾーム結合部位をコードす
るＤＮＡ配列および一個又はいくつかのヌクレオチドの
置換または逆転を含むその機能的変異種、および（ｂ）
細菌中で翻訳開始可能な化学的に合成した（合成）リボ
ゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列を含む。 【００１１】転写終了ＤＮＡ配列に関連して用いられて
いる細菌由来という意味は、（ａ）自然界に存在する細
菌転写終了ＤＮＡ配列および、その転写終了ＤＮＡ配列
の一個またはいくつかのヌクレオチドの置換あるいは逆
転を含む機能的変異種、および（ｂ）化学的に合成した
（合成）転写終了ＤＮＡ配列で細菌中で転写を終了する
ことの出来るものを含む。 【００１２】好ましい適用においては、原核細胞または
真核細胞のたん白質をコードする遺伝子がＢａｃｉｌｌ
ｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および他のグラム陽
性菌中で大腸菌ファージＴ５またはＴ７起源のプロモー
ターおよびＥ．ｃｏｌｉ起源のターミネーターの転写調
節下で発現できる。本発明に於いてＴ５およびＴ７プロ
モーターは大腸菌ファージＴ５およびＴ７群のゲノムに
存在するプロモーター機能を仲介するＤＮＡ配列および
そのような配列由来の機能的な組合せと定義される。 【００１３】本発明に於いて有効なＴ５プロモーターは
ファージの“前初期”、“初期”および“後期”発現の
プロモーターであり、特にＲ．Ｇｅｎｔｚのハイデルベ
ルグ大学学位論文〔１９８４年〕に記載される以下の配
列である。 ＰJ5、ＰN25 、ＰN26 、ＰD/E20 、ＰG5、ＰG20 、Ｐ
G22 、ＰG25 、ＰG28 、ＰK28a、ＰK28b 【００１４】本発明に於いて有効なＴ７プロモーターは
ファージの“初期”発現プロモーター、特にＡ１および
Ａ２プロモーター（Ｄ．Ｋ．ＨａｗｌｅｙおよびＷ．
Ｄ．ＭｃＣｌｕｒｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１１巻、２２３７〜２２５５頁〔１９８３年〕）
である。 【００１５】上述の好ましいＴ５またはＴ７プロモータ
ーのいくつかのＤＮＡ配列を下の表１に示す。表１は本
発明で用いられるプロモーターのヌクレオチド配列を示
す。−５０から＋１０までの配列を示し、−３５のヘキ
サマーおよびその上流のＡ：Ｔ−豊富な領域を線で囲ん
であり、−１０ヘキサマーは上線を印してある。 【００１６】 【表１】【００１７】宿主中での翻訳開始に必要なリボゾーム結
合部位をコードするＤＮＡ配列は、（１）アミノ酸メチ
オニンのコドンであるＡＴＧ翻訳開始コドン、（２）シ
ャイン ダルガーノ（ＳＤ）配列として知られる１６Ｓ
リボゾームＲＮＡの３′−末端の塩基に相応する４〜１
２塩基の配列、および（３）リンカー領域として知られ
るこれら２つの間の塩基配列とから成る。 【００１８】本発明で使用され、また本発明の一部を成
しているリボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列は
グラム陽性菌またはグラム陰性菌由来でＢａｃｉｌｌｕ
ｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および他のグラム陽性
菌中で機能することの出来るリボゾーム結合部位をコー
ドするＤＮＡ配列より調製されるもので、既知のいくつ
かのものを含む（Ｊ．Ｒ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６巻、１１２８３〜１１
２９１頁〔１９８１年〕；Ｃ．Ｐ．ＭｏｒａｎＪｒ．
ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６巻、３
３９〜３４６頁〔１９８２年〕）。 【００１９】しかしながら、本発明で使用される好まし
いリボゾーム結合部位をコードする配列は下記の表２に
示す式で表わされる可動性リボゾーム結合部位をコード
する合成のＤＮＡ配列（ＳＲＢＳ）である。 【００２０】 【表２】【００２１】これらのＳＲＢＳは原核細胞または真核細
胞ポリペプチドをコードするいかなる遺伝子とも連動し
てＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およ
び他のグラム陽性菌中で機能できるように構築されてい
る。そのような機能を保持することでＳＲＢＳは“移動
可能”と言える。 【００２２】転写終了ＤＮＡ配列はグラム陰性細菌由来
のターミネーターでＢａｃｉｌｌｕ、特にＢ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ、および他のグラム陽性菌で機能できるものか
ら調製される。本発明で使用される好ましいグラム陰性
菌ターミネーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のターミ
ネーターｔ0 （Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３巻、７１７
〜７２１頁〔１９７６年〕）、Ｔ１、Ｔ２（Ｊ．Ｂｒｏ
ｓｉｕｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４８巻、１０７
〜１２７頁〔１９８１年〕）およびＴ７（Ｊ．Ｊ．Ｄｕ
ｎｎおよびＦ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８巻、２１１９〜２１３２頁〔１
９８０年〕）がある。 【００２３】本発明の転写開始ＤＮＡ配列、移動可能な
リボゾーム結合部位をコードする配列、および転写終了
配列は、例えばヌクレオチド合成器のように相当するＤ
ＮＡ配列の全化学合成を含むＤＮＡ化学でよく知られる
方法により得られる。 【００２４】本発明はさらに原核細胞および真核細胞た
ん白質をコードする遺伝子を形質転換したＢａｃｉｌｌ
ｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、或いは他のグラム陽
性菌中で発現するよう指示できる以下の配列を含む発現
ベクターをも包含する：（ａ）転写の下流方向に向って
次の単位を有するグラム陽性細菌発現調節ＤＮＡ配列：
少なくとも一個のグラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ
配列がグラム陽性菌又はグラム陰性菌由来のリボゾーム
結合部位をコードするＤＮＡ配列と結合し、任意に原核
細胞および真核細胞ポリペプチドをコードする外来遺伝
子、および転写終了ＤＮＡ配列、（ｂ）少なくとも一個
のベクターの複製開始点、および（ｃ）少なくとも一個
の抗生物質耐性遺伝子。またこのような発現ベクターの
製造方法にも関連している。 【００２５】転写開始ＤＮＡ配列はグラム陽性菌プロモ
ーターから得られる。使用される好ましいグラム陰性菌
プロモーターは表１に示す式を有する大腸菌ファージＴ
５または大腸菌ファージＴ７プロモーターである。リボ
ゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列は、グラム陽性
菌またはグラム陰性菌由来でＢａｃｉｌｌｕｓ、特に
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および他のグラム陽性菌中で機
能することのできるリボゾーム結合部位をコードするＤ
ＮＡ配列より調製されるもので、既知のものを含む
（Ｊ．Ｒ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、前述；Ｃ．Ｐ．Ｍ
ｏｒａｎ Ｊｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、１８６巻、３３９〜３４６頁〔１９８２年〕）。リ
ボゾーム結合部位をコードする好ましいＤＮＡ配列は表
２に示す式を有する、リボゾーム結合部位をコードする
移動可能な合成ＤＮＡ配列である。転写終了ＤＮＡ配列
は、グラム陰性細菌由来でＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および他のグラム陽性菌中で機能可
能なターミネーターより得られる。本発明で使用される
好ましい転写終了ＤＮＡ配列としてはグラム陰性Ｅ．ｃ
ｏｌｉターミネーターｔ0 （Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７３巻、７１７〜７２１頁〔１９７６年〕、Ｔ１、Ｔ２
（Ｊ．Ｂｒｏｄｉｕｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４
８巻、１０７〜１２７頁〔１９８１年〕）、およびＴ７
（Ｊ．Ｊ．ＤｕｎｎおよびＦ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、８巻、２１１９〜
２１３２頁〔１９８０年〕）。複製開始点はグラム陰性
菌および／またはグラム陽性菌由来のものであり、従っ
て本発明の発現ベクターはシャトルベクターとして使用
可能であり（Ｓ．Ｄ．Ｅｈｒｌｉｃｌｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５巻、１４３３
〜１４３６頁〔１９７８年〕；Ｊ．Ｋｒｅｆｔら、Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６２巻、５９〜６７
頁〔１９７８年〕；Ｂ．Ｍｉｃｈｅｌら、Ｇｅｎｅ １
２巻、１４７〜１５４頁〔１９８０年〕）、Ｅ．ｃｏｌ
ｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
の両者で複製可能である。リボゾーム結合部位をコード
する合成ＤＮＡ配列を大腸菌ファージＴ５のプロモータ
ーに結合して使用し、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓの両方で複製可能（シャトルベクター）な好ま
しい発現ベクターは実施例４および５、並びに実施例７
〜１０に記載されている。 【００２６】本発明で使用される発現ベクターは文献で
公知のＤＮＡ組換え技術を用いて構築され（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらの実験マニュアル“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｇ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２年、参照）、以下のス
テップより成る。 【００２７】（ａ） 既存のクローニングベクターに転
写下流方向に少なくとも一個のグラム陰性菌由来の転写
開始ＤＮＡ配列と、グラム陽性菌またはグラム陰性菌由
来のリボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列とを挿
入し、（ｂ） 該クローニングベクターに少なくとも一
個の制限酵素切断部位を該リボゾーム結合部位をコード
するＤＮＡ配列に隣接して組み入れ、（ｃ） 該リボゾ
ーム結合部をコードするＤＮＡ配列に隣接する該制限酵
素部位に、原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコー
ドする少なくとも一個の外来遺伝子を挿入し、そして、
（ｄ） 原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコード
する該外来遺伝子の下流方向に少なくとも一個の転写終
了ＤＮＡ配列を挿入する。 【００２８】本発明で使用される発現ベクターを構築す
るために用いるベクターは適当ないかなるベクター、コ
スミド、或いはファージで形質転換でき、宿主微生物中
でそれ自体複製可能なものである。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓおよび／またはＥ．ｃｏｌｉでのクローニングに適し
たプラスミドは、例えばＭａｎｉａｔｉｓらの実験マニ
ュアル“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（前
述）およびＪ．Ｐａｌｖａの学位論文（ヘルシンキ大
学）、１９８３年に記載されている。本発明の発現ベク
ターを構築するため使用されるプラスミド由来の好まし
いベクターはｐＶＢ１１０（Ｔ．Ｊ．Ｇｒｙｃｚａｎ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３４巻、３１８〜３２
９頁〔１９７８年〕）、ｐＤＳ５およびｐＤＳ６（Ｄ．
Ｓｔｕｅｂｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ、３巻、３１４３〜３
１４３頁〔１９８４年〕）である。 【００２９】ｐ６０２およびｐ２５のプラスミドは本発
明のプラスミド性シャトルベクターの具体例である。そ
れらの調製は実施例１〜５および７〜１０により詳細に
記載されている。ｐ２５群の特に好ましいプラスミドを
含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株（ｐ２５ＲＢＳ
Ｉ；ｐ２５ＲＢＳ ＩＩ；ｐ２５* ＲＢＳ ＩＩで形質
転換したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１）はゲッチ
ンゲンのＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に１９８
５年６月２０日、それぞれ寄託番号ＤＳＭ３３５０、Ｄ
ＳＭ３３５１およびＤＳＭ３３５２として寄託されてい
る。ｐ６０２群の特に好ましいプラスミドを含有する
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの菌株（ｐ６０２／１８；ｐ６０
２／１９；ｐ６０２／２０；ｐ６０２／２１で形質転換
したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１）はゲッチンゲ
ンのＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍ
ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に１９８６年
５月１４日付けで、それぞれ寄託番号ＤＳＭ３７２３、
ＤＳＭ３７２４、ＤＳＭ３７２５およびＤＳＭ３７２６
として寄託されている。 【００３０】本発明で使用される発現ベクターに挿入さ
れる外来遺伝子はｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコードする
各種遺伝子（ＤＮＡ遺伝子またはＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ
コピー）から選ぶことができる。例えば、遺伝子は酵
素、ホルモン、免疫調節、抗ウイルス性、または抗癌性
を有するポリペプチド、抗体、抗原およびその他の原核
細胞または真核細胞由来のポリペプチドをコードする。
本発明で使用する好ましい外来遺伝子はＥ．ｃｏｌｉの
クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ
（ｃａｔ）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄ
ｈｆｒ）の遺伝子である。 【００３１】本発明による改良発現調節システムを用い
て発現され得るたん白質の例は、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、マラリア表面抗原、ＩＬ−２、インタフェロンアル
ファ、ベータ、ガンマのようなリンフォカイン類、イン
シュリンおよびインシュリン前駆体、成長ホルモン、テ
イシュ・プラスミノーゲンアクチベーター、ヒトレニン
或いはＨＴＬＶ−ＩＩＩたん白などがある。 【００３２】本発明で使用される発現ベクター、特にシ
ャトルベクターを用いて原核細胞または真核細胞たん白
をコードする遺伝子を発現する方法はよく知られている
（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前述）。それは、目的のＤＮＡ
配列が本発明の発現調節ＤＮＡ配列に機能的に挿入され
ている発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、生育の
適当な条件下で宿主を培養し、培養物から目的のポリペ
プチドを単離することより成る。本技術に熟練している
者は本発明の範囲から出ることなく、個々の遺伝子の発
現に最も効率のよい公知の方法を選ぶことができる。 【００３３】本発明で用いる特別の宿主の選択はこの分
野で認められている多くの要因に依存している。例え
ば、選んだ発現ベクターとの適合性、雑種プラスミドに
よりコードされるたん白質の毒性、目的たん白質の回収
の容易さ、発現の特徴、生物安全性およびコストなどで
ある。これらの一般的指針の範囲内で有用な宿主細菌は
グラム陰性およびグラム陽性細菌、特にＥ．ｃｏｌｉお
よびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株である。本発明における
最も好ましい宿主細胞はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＲ１５
１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ
ＣｅｎｔｅｒにおいてＢＧＳＣ Ｎｏ．１Ａ４０として
保存されている）である。しかしながら、他のＢ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ菌株、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＤ
１７０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃ
ｋ ＣｅｎｔｅｒにてＢＧＳＣＮｏ．１Ａ４２として保
存）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＪＨ６４６（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒにてＢＧＳＣ Ｎｏ．１Ｓ９として保存）なども使用
できる。 【００３４】 【実施例】以下に続く実施例は以下の図面を参照してよ
り詳細に本発明を説明するものである。 【００３５】制限エンドヌクレアーゼは以下のように略
称した。 Ｅ：ＥcoＲＩ；Ｓm ：Ｓma Ｉ；Ｂ：ＢamＨ Ｉ；Ｓ：
Ｓal Ｉ；Ｐ：Ｐst Ｉ；Ｈ：Ｈind ＩＩＩ；Ｘｈ：Ｘho Ｉ；Ｘ：Ｘba
Ｉ；Ｋ：Ｋpn Ｉ；Ｐv：Ｐvu ＩＩ；Ａ：Ａcc Ｉ；
Ｓp ：Ｓph Ｉ；Ｂg ：Ｂgl ＩＩ；Ｄ：ＤraＩ その他の略称は以下の通りである。 ｋａｎ：カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラー
ゼの構造遺伝子； ｃａｔ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼの構造遺伝子； ｄｈｆｒ：マウス ジヒドロ葉酸レダクターゼの構造遺
伝子 ｂｌａ：ベータ・ラクタマーゼ構造遺伝子； ＣＡＴ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼたん白； ＤＨＦＲ：ジヒドロ葉酸レダクターゼたん白； ｏｒｉ＋：グラム陽性菌複製開始点； ｏｒｉ−：グラム陰性菌複製開始点； ＳＲＢＳ：リボゾーム結合部位をコードする可動合成Ｄ
ＮＡ配列； ＲＢＳ：リボゾーム結合部をコードするＤＮＡ配列； ＳＤ ：シャインダルガノ配列； ｔ0 、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ７：転写ターミネーターｔ0 、Ｔ
１、Ｔ２、Ｔ７；および （Ｈ）；Ｈｉｎｄ ＩＩＩの接着末端をＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ末端に結合してＨｉｎｄ ＩＩＩ部位をつぶしたも
の。 【００３６】図１：グラム陽性菌の（ｏｒｉ＋）および
グラム陰性菌の（ｏｒｉ−）複製開始点と共にカナマイ
シン（ｋａｎ）およびクロラムフェニコール薬剤耐性マ
ーカーを含む基本的なＥ．ｃｏｌｉ／Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓシャトルベクターｐ６０２／５の構築を示す。この
結果、本プラスミドはＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓの両者でカナマイシン耐性を示す。クロラムフ
ェニコール耐性はＥｃｏ ＲＩ（Ｅ）とＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ（Ｈ）部位の間にプロモーターを含むフラグメントを
挿入することで出現する。ここで示すＥ．ｃｏｌｉ ｃ
ａｔ遺伝子は天然のリボゾーム結合部位をコードするＤ
ＮＡ配列を有する。 【００３７】図２：一般の発現ベクターｐ６０２／７お
よびｐ６０２／２５、並びにリボゾーム結合部位をコー
ドするＤＮＡ配列ＳＲＢＳ ＩおよびＳＲＢＳ ＩＩを
それぞれ有するベクターｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉおよ
びｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩの構築を示す。リボゾー
ム結合部位をコードするＤＮＡ配列ＳＲＢＳ Ｉおよび
ＳＲＢＳ ＩＩを挿入することにより、野生型のｃａｔ
リボゾーム結合部−ＤＮＡ配列からの天然のＣＡＴたん
白とそれぞれＳＲＢＳ Ｉ又はＳＲＢＳ ＩＩに由来す
る融合ＣＡＴたん白の２種のＣＡＴたん白質をＥ．ｃｏ
ｌｉ中で合成するようになる。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中
ではリボゾーム結合部位−ＤＮＡ配列、ＳＲＢＳ Ｉお
よびＳＲＢＳ ＩＩに起因する融合ＣＡＴたん白のみ生
産される。ｐ６０２／７、ｐ６０２／２５、ｐ６０２／
７ ＲＢＳ Ｉおよびｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩの全
てのプラスミド共Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓの両方でクロラムフェニコール耐性を示す。 【００３８】図３：大腸菌ファージＴ５プロモーターＰ
G25 をリボゾーム結合部位−合成ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ
Ｉ，ＳＲＢＳ ＩＩのそれぞれと結合して含有している
ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ，ｐ２５ ＲＢＳ ＩＩお
よびｐ２５* ＲＢＳ ＩＩの構築を示す。ベクターｐ２
５ ＲＢＳ Ｉを含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞
はＳＲＢＳ Ｉのすぐ下流付近に由来するたん白とＰ
G25 のすぐ近くのリボゾーム結合部位に由来するものと
二つの融合ＣＡＴたん白質を合成する。後者のリボゾー
ム結合部位に由来するたん白合成はＳＲＢＩＩの上流に
転写終了コドンを入れることにより除去され、その結合
ｐ２５* ＲＢＳ ＩＩベクターが得られる。ｐ２５* Ｒ
ＢＳ ＩＩを含有する細胞はＳＲＢＳ ＩＩに由来する
一つのＣＡＴたん白を合成する。 【００３９】図４：発現ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ，
ｐ２５ ＲＢＳ ＩＩおよびｐ２５ * ＲＢＳ ＩＩを含
有するＢ，ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１で生産される
全たん白質を示す。ＳＲＢＳ ＩまたはＳＲＢＳ ＩＩ
に基づいて合成されるＣＡＴたん白質の位置を“ＣＡ
Ｔ”で示し、ｐ２５ ＲＢＳ ＩＩを有する細胞のもう
一つの融合ＣＡＴたん白を“ｆＣＡＴ”で示した。ＬＹ
Ｓは細胞融解を補助するため添加したリゾチームの位置
を示す。 【００４０】図５：ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ，ｐ２
５ ＲＢＳ ＩＩおよびｐ２５* ＲＢＳ ＩＩを含有す
るＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中でのＣＡＴたん白質合成を模
式図により示する。挿入した翻訳停止コドン 【外１】 によりＰG25 ＲＢＳからｃａｔ遺伝子までの翻訳継続を
阻止できる。ｐ２５ ＲＢＳ ＩＩではそのようなフレ
ームの合った停止コドンが存在しないためｃａｔたん白
はＲＢＳおよびＳＲＢＳ ＩＩの両方から生成する。ｐ
２５* ＲＢＳ ＩＩにおけるＨｉｎｄＩＩＩ部位の修飾
の結果、ＳＲＢＳ ＩＩのみから単一のＣＡＴたん白を
生成する。 【００４１】図６：表１に示したプロモーターのインビ
トロ系転写解析を示す。“ＥC ”および“ＢS ”はそれ
ぞれＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＮＡ
ポリメラーゼによる解析を表わし、数字は転写を行なわ
せた塩濃度を示す。プロモーターをクローン化したベク
ターで’ｏｒｉ’および’ｂｌａ’転写物が生じてい
る。’ｖｅｇ’と示した列はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖ
ｅｇプロモーター（Ｓ．Ｆ．Ｊ．Ｌｅ Ｇｒｉｃｅおよ
びＡ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１６２巻，５５１〜５６４頁，１９８２年）のみ
の転写物を示す。横に’ｖｅｇ’と示してあるのは内部
標準のｖｅｇプロモーターＤＮＡである。ＭはＨｐａ
ＩＩで切断したｐＢＲ３２２の分子量マーカーである。
本研究で対応する大きさのバンドのみ示した。Ｔ５プロ
モーターＰK28a／ＰK28bは両プロモーターが同一の制限
断片上に存在するため、これらのプロモーターからの転
写物には新しい２つのものが認められる。 【００４２】図７：大腸菌ファージプロモーターＰN25
が合成リボゾーム結合部位−ＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ，
９Ａ（ｐ６０２／１８）またはＲＢＳ ＩＩ，３Ａ＋５
Ａ（ｐ６０２／１９）に機能的に結合して有しているシ
ャトルベクターｐ６０２／１８およびｐ６０２／１９の
構築を示す。いずれの場合も合成リボゾーム結合部位−
ＤＮＡ配列を挿入することにより合成リボゾーム結合部
位のすぐ近くより融合ＣＡＴたん白の合成を開始し、ｃ
ａｔ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで停止するようにな
る。ｐ６０２／１８およびｐ６０２／１９の両プラスミ
ド共Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓでクロラムフェニコール耐性
を示す。 【００４３】図８：大腸菌ファージプロモーターＰN25
が合成リボゾーム結合部位のＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ
（ｐ６０２／２０）またはＲＢＳ ＩＩ，３Ａ＋５Ａ
（ｐ６０２／２１）に機能的に結合して有しているシャ
トルベクターｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１の構
築を示す。いずれのプラスミドの場合も、合成リボゾー
ム結合部位−ＤＮＡ配列を挿入することにより、合成リ
ボゾーム結合部位のすぐ下流から融合ＤＨＦＲたん白を
合成し、ｄｈｆｒ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで停止
するようになる。ｐ６０２／２０またはｐ６０２／２１
を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞は１０μｇ／ｍ
ｌのトリメトプリムに耐性である。 【００４４】図９：プラスミドｐ６０２／１８，ｐ６０
２／１９，ｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１を含有
するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株により合成さ
れる全たん白質を示す。’Ｃｅｌｌ’と示してあるのは
プラスミドを含有しない細胞でのたん白合成を表わす。
対照としてｐ２５* ＲＢＳ ＩＩからのＣＡＴ合成も示
してある。融合ＣＡＴたん白ＣＡＴ* （ｐ６０２／１８
およびｐ６０２／１９由来）の位置および融合ＤＨＦＲ
たん白（ｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１から）の
位置は図示してある。 【００４５】一般的な方法 別に記載していない限り、以下の方法は前述のＭａｎｉ
ａｔｉｓらにより記載されている通り行なった；３７℃
に於ける制限エンドヌクレアーゼ消化（１００〜１０１
頁）；３７℃に於ける細菌アルカリフォスファターゼ
（ＢＡＰ）による脱りん酸化（１３３〜１３４頁）；Ｃ
ａＣｌ2 処理Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞へのＤＮＡ
の形質転換および１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有
ＬＢ培地を含む寒天平板上での形質転換株の選択（２５
０〜２５１頁）；ＤＮＡプラスミドの調製（８６〜９４
頁）；一本鎖ＤＮＡ末端の１４℃に於けるＤＮＡポリメ
ラーゼＩの大断片（クレナウ断片）による充填（１１３
〜１１４頁）；アガロスゲルによるＤＮＡの分離および
断片の精製（１６４〜１６７頁）；サブクローニングへ
の合成ＤＮＡリンカーの使用（３９２〜３９７頁）；お
よびＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（３４８
〜３４９頁）。 【００４６】Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞へのＤＮＡの形
質転換はＳ．ＣｏｎｔｅｎｔｅおよびＤ．Ｄｏｂｎａｕ
により記載されている通り（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ，１６７巻，２５１〜２５８頁〔１９７９
年〕）行なった。 【００４７】Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
のＲＮＡポリメラーゼによる試験管内転写は次の組成を
有する５０μｌの反応液中で行なった：４０ｍＭトリス
／塩酸、ｐＨ７．９；１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；０．１ｍ
Ｍ ＤＴＴ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；５０〜２００ｍＭ
ＮａＣｌ；１０％（ｖ／ｖ）グリセロール；１５０μ
Ｍ ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ；５０μＭ ＵＴＰ；５μ
Ｃｉ 32Ｐ−ＵＴＰ（〜３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、ア
マーシャム・ブフラー、ブラウンシュバイク）；０．０
５ｐｍｏｌｅエンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡ；０．２５
ｐｍｏｌｅ ＲＮＡポリメラーゼ。反応はＲＮＡポリメ
ラーゼの添加により開始し、３７℃１〜５分間行なっ
た。合成されたＲＮＡはエタノール沈でんをくり返えす
ことにより単離し、８Ｍ尿素含有の５または８％ポリア
クリルアミド製０．４ｍｍ厚さの高圧ゲル電気泳動で分
析した。電気泳動後、ゲルを乾燥し、コダック社製Ｘ−
ＯＭＡＴ ＸＡＲ５のフイルムを用いて室温でオートラ
ジオグラフィーに供した。 【００４８】実施例 １ シャトルベクターｐ６０２／５の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＵＢ１１０を制限酵素Ｐ
ｖｕＩＩで完全消化する。８塩基ＫｐｎＩリンカーをＰ
ｖｕＩＩ末端に結合する。結合後、ＤＮＡをＫｐｎＩお
よびＥｃｏＲＩで完全消化する。得られたＤＮＡ消化物
を１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド含有の低融解１％
アガロースゲルで電気泳動にかける。７０Ｖで２時間電
気泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で確認し、３．５Ｋｂの
バンドをゲルから切り出す。この３．５ＫｂのＥｃｏＲ
Ｉ／ＫｐｎＩ断片を低温融解アガロースでさらに精製す
る。 【００４９】（ＩＩ） プラスミドｐＤＳ５ ５μｇを
ＤｒａＩで完全消化し、ＤｒａＩ末端に放射活性のＫｐ
ｎＩオクタマーリンカーを結合する。結合生成物をさら
に制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで完全消化し、６％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。およそ
１．２ＫｂのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片をオートラジオグ
ラフィーで位置の確認し、ゲルより切り出す。ＫｐｎＩ
／ＸｂａＩ断片をさらにアクリルアミドゲルで精製す
る。 【００５０】（ＩＩＩ） ５μｇのプラスミドｐＤＳ５
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで
完全消化し、１μｇ／ｍｌのエチジウムクロリド含有の
１％低温融解アガロースゲル電気泳動で分離する。電気
泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で確認し、およそ９００ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を切り出す。ＥｃｏＲＩ
／ＸｂａＩ断片をさらに低温融解アガロースで精製す
る。 【００５１】（ＩＶ） ステップ（Ｉ）およびステップ
（ＩＩＩ）の精製したＤＮＡ断片の等量を結合し、結合
生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＡＢ／１５７株（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、前述）のコンピーテント細胞に形質転換する。
形質転換株を１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有のＬＢ寒
天上にプレートする。カナマイシン耐性コロニーからプ
ラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素切断によりそれぞれ
の断片の挿入を確認する。このようにして得られるプラ
スミドをｐ６０２／５と命名する。ｐ６０２／５の構築
を図１に図示する。 【００５２】実施例 ２ リボゾーム結合部位をコードする可動性合成ＤＮＡ配列
を含む発現ベクターｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉおよびｐ
６０２／７ ＲＢＳ ＩＩの構築 【００５３】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／５
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩで完全消化し、およそ５．６Ｋｂのベクター由来Ｄ
ＮＡ断片を得る。この断片を以下のＤＮＡ配列を有する
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓプロモーターＰｖＩＩを含む１２
５ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と結合する： 【００５４】 【化２】 【００５５】結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＡＢ１１５７
株に形質転換し、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのクロラ
ムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択する。クロラムフ
ェニコール耐性コロニーについてプロモーターＰｖＩＩ
がｐ６０２／５プラスミドに挿入していることを確認の
ため分析する。 【００５６】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／
７を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全消化する。次の配列
を有するリボゾーム結合部位をコードする可動性合成Ｄ
ＮＡ配列ＳＲＢＳ ＩをＨｉｎｄＩＩＩの部位に結合す
る。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉＡＢ１１５７株に形質転
換し、形質転換株を５０μｇ／ｍｌの 【００５７】 【化３】 【００５８】クロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選
択する。クロラムフェニコール耐性コロニーについて以
下の方法によりリボゾーム結合部位をコードする可動合
成ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ Ｉを含有するプラスミドの有無
を分析する。 ａ） ＳＲＢＳ ＩからのＣＡＴ融合たん白の合成能力 ｂ） 新たに獲得したＳｐｈ Ｉ部位を有する組換えプ
ラスミドの制限酵素分析 【００５９】このような解析のできたプラスミドＤＮＡ
をｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉと命名した。この後ｐ６０
２／７ ＲＢＳ Ｉ ＤＮＡをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＲ１５１株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性
コロニー（この場合、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニ
コール耐性コロニー）につき上記（ＩＩ）のａ）および
ｂ）により分析してＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中でのＳＲＢ
Ｓ Ｉの有効性を確認する。 【００６０】（ＩＩＩ） プラスミドｐ６０２／７ Ｒ
ＢＳ ＩをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで完全消化
し、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド含有の１％低温
融解性アガロースゲルによる電気泳動によりＳＲＢＳ
Ｉと分離する。電気泳動後、ＤＮＡを蛍光で確認し、ゲ
ルより切り出す。続いてＤＮＡをアガロースより精製す
る。以下の配列を有するＳＲＢＳ ＩＩと命名したリボ
ゾーム結合部位をコードする可動合成ＤＮＡ配列をｐ６
０２／７ ＲＢＳ ＩのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ切断
ＤＮＡと結合する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＢ１１５７株を本 【００６１】 【化４】 【００６２】結合混合物により形質転換し、形質転換株
を５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天
上で選択する。クロラムフェニコール耐性コロニーを以
下の点によりＳＲＢＳ ＩＩ存在の有無を分析する。 ａ） 融合ＣＡＴたん白の合成能力 ｂ） 新たにＤｒａ Ｉ部位を獲得した組換えプラスミ
ドの制限酵素解析 【００６３】このような性状を確認したプラスミドＤＮ
Ａをｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩと命名した。プラスミ
ドｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＲ１５１株のコンピーテント細胞に導入し、形質転
換株を１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ
寒天上で選択する。クロラムフェニコール耐性コロニー
について上記ステップ（ＩＩＩ）ａ）およびｂ）に記載
されるようにＳＲＢＳＩＩの有効性を分析する。ベクタ
ーｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉおよびｐ６０２／７ ＲＢ
Ｓ ＩＩの構築を図２に図示してある。 【００６４】実施例 ３ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰG25 を有する発現ベ
クターｐ６０２／２５の構築 【００６５】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／５
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全消化する。
その後、本ＤＮＡを大腸菌ファージＴ５プロモーターＰ
G25 （Ｒ．Ｇｅｎｔｚ、前述）を含む２５０ｂｐのＥｃ
ｏＲＩ断片の等モル量と結合する。結合生成物をＥ．ｃ
ｏｌｉ ＡＢ１１５７株に導入し、形質転換株を１００
μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有のＬＢ寒天上で
選択する。クロラムフェニコール耐性コロニーよりプラ
スミドＤＮＡを分離し、ＥｃｏＲＩ消化またはＤＮＡ配
列決定によりプロモーターＰG25 を含む２５０ｂｐ断片
の存在を分析する。確認されたプラスミドＤＮＡをｐ６
０２／２５と命名した。ｐ６０２／２５の構築を図２に
図示してある。 【００６６】実施例 ４ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰG25 とリボゾーム結
合部位をコードする可動合成ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ Ｉと
を合せ有するベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉの構築 【００６７】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／７
ＲＢＳ Ｉを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩ
ＩおよびＢｇｌ ＩＩで完全消化し、１μｇ／ｍｌのエ
チジウムブロミドを含有する１％低温融解アガロースゲ
ルで電気泳動して分画を行なう。電気泳動の後ＤＮＡバ
ンドを蛍光で確認し、およそ３．２Ｋｂの上のバンドを
切り出す。この断片をアガロースより精製する。 【００６８】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／
２５を同じように制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌ
ＩＩで完全消化し、エチジウムブロミド含有の１％ア
ガロースゲル電気泳動で分画する。ＤＮＡバンドを蛍光
で確認し、およそ２．６Ｋｂの下のバンドを切り出し、
アガロースから精製する。 【００６９】（ＩＩＩ） 上記実施例４の（Ｉ）および
（ＩＩ）で調製したＤＮＡ断片を各等モル量を結合し、
結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＡＢ１１５７株に導入す
る。１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに耐性な
コロニーよりプラスミドＤＮＡを分離し、２５０ｂｐの
ＥｃｏＲＩバンドの存在を確認する。このように確認さ
れたプラスミドＤＮＡをｐ２５ ＲＢＳ Ｉと命名し
た。プラスミドｐ２５ ＲＢＳ Ｉの構築を図３に図示
した。 【００７０】（ＩＶ） ｐ２５ ＲＢＳ Ｉを保有する
Ｅ．ｃｏｌｉよりプラスミドＤＮＡを単離し、Ｂ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１のコンピーテント細胞に導入
し、形質転換株を１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコー
ル含有ＬＢ寒天上で選択する。クロラムフェニコール耐
性コロニーよりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミド
ｐ２５ ＲＢＳ ＩのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中での構造
を制限酵素解析で確認する。 【００７１】（Ｖ） プラスミドｐ２５ ＲＢＳ Ｉを
含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／
ｍｌクロラムフェニコールを含むＬ−ブロス中で培養
し、合成した全たん白をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分析した。大腸菌ファージＴ５プロモータ
ーＰG25 をリボゾーム結合部位の合成ＤＮＡ配列ＳＲＢ
ＳＩと共に用いると、ＳＲＢＳ Ｉの近接で開始し、
Ｅ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで
停止する融合ＣＡＴたん白の合成が確認された。分析結
果は図４に示す。 【００７２】実施例 ５ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰG25 およびリボゾー
ム結合部位をコードする可動合成ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ
ＩＩを含有するベクターｐ２５ ＲＢＳ ＩＩおよびｐ
２５* ＲＢＳ ＩＩの構築 【００７３】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／７
ＲＢＳ ＩＩを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩおよびＢｇｌ ＩＩで完全に消化し、生成物を１μ
ｇ／ｍｌのエチジウムブロミド含有の１％低温融解アガ
ロースゲルによる電気泳動で分画する。電気泳動後、Ｄ
ＮＡバンドを蛍光で確認し、およそ３．２Ｋｂの上のバ
ンドを切り出してアガロースより精製する。 【００７４】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／
２５を同様に制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢｇｌ
ＩＩで完全消化し、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド
含有の１％低温融解アガロースゲルで電気泳動して分画
する。電気泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で確認し、およ
そ２．６Ｋｂの下のバンドを切り出してゲルから精製す
る。実施例５の（Ｉ）および（ＩＩ）で得られたＤＮＡ
断片の等モル量を結合し、結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ
ＡＢ１１５７株に導入する。形質転換株を１００μｇ／
ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択す
る。クロラムフェニコール耐性コロニーからプラスミド
ＤＮＡを分離し、大腸ファージＴ５プロモーターＰG25
および合成リボゾーム結合部位−ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ
ＩＩの両方の存在を制限エンドヌクレアーゼ解析で確認
する。確認されたプラスミドＤＮＡをｐ２５／ＲＢＳ
ＩＩと命名した。プラスミドｐ２５ ＲＢＳ ＩＩの構
築を図３に図示する。 【００７５】ベクターｐ２５ ＲＢＳ ＩＩを保有する
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中でのたん白合成を図４に示す。
ここで明かなように、プロモーターＰG25 を含むＥｃｏ
ＲＩ断片は余分のリボゾーム結合部位を含有し、その結
果ｃａｔ遺伝子の端まで伸びた融合たん白を生成する。
この直接の影響としてＲＢＳ ＩＩの効率を極端に低下
させる。従ってＰG25 の近接リボゾーム結合部位の翻訳
フレームを次の様に改修してＳＲＢＳ ＩＩからのたん
白合成を最大となるようにした。 【００７６】（ＩＶ） ２μｇのプラスミドｐ２５／Ｒ
ＢＳ ＩＩを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩ
で完全消化する。４つのｄＮＴＰ存在下ＤＮＡポリメラ
ーゼクレナウ断片と反応させてＨｉｎｄ ＩＩＩ末端を
平滑末端とする。これらの平滑末端に１２塩基対Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩリンカーを結合し、結合生成物をＨｉｎｄＩ
ＩＩで完全消化する。このＤＮＡを１μｇ／ｍｌのエチ
ジウムブロミド含有の１％低温融解アガロースゲルの電
気泳動にて分画する。泳動後ＤＮＡを蛍光で確認し、ゲ
ルより切り出してアガロースから精製する。得られるＤ
ＮＡを再び結合し、結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＡＢ１
１５７株に導入する。形質転換株を１００μｇ／ｍｌの
クロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択する。クロ
ラムフェニコール耐性コロニーよりプラスミドＤＮＡを
単離し、新たに出来たＨｉｎｄＩＩＩ部位を制限酵素解
析で確認する。このように確認されたプラスミドＤＮＡ
をｐ２５* ＲＢＳ ＩＩと命名した。プラスミドｐ２５
* ＲＢＳ ＩＩの構築を図３に示す。 【００７７】（Ｖ） プラスミドｐ２５* ＲＢＳ ＩＩ
をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコンピーテン
ト細胞に導入し、形質転換株を１０μｇ／ｍｌクロラム
フェニコール含有ＬＢ寒天上で選択する。クロラムフェ
ニコール耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、
その構造がＥ．ｃｏｌｉから単離したｐ２５* ＲＢＳＩ
Ｉと同一であることを制限酵素解析により決定する。 【００７８】（ＶＩ） Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのクロラ
ムフェニコール耐性コロニーの夫々を１０μｇ／ｍｌク
ロラムフェニコール含有Ｌ−ブロス中で培養し、これら
のコロニーにより合成される全たん白をＳＤＳ／ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分析する。大腸菌ファージ
Ｔ５プロモーターＰG25 を合成リボゾーム結合部位−Ｄ
ＮＡ配列ＳＲＢＳ ＩＩと合わせて使用すると、ＳＲＢ
Ｓ ＩＩの近接の部位で翻訳が開始し、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｃａｔ遺伝子の天然の停止コドンで停止する融合ＣＡＴ
たん白の合成が確認できる。そのような分析結果は図５
に示す。 【００７９】実施例 ６ Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｒ
ＮＡポリメラーゼによるインビトロ解析 【００８０】表１に使用したプロモーターを示した。こ
れらのプロモーターの性能をインビトロの“ラン−オ
フ”転写により測定し、その結果を図６に示す。それぞ
れのケースでプロモーターのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ δ
55 ＲＮＡポリメラーゼによる利用を異なるイオン強度
で測定して２００ｍＭ ＮａＣｌに於けるＥ．ｃｏｌｉ
ＲＮＡポリメラーゼによる転写効率と比較した。転写測
定の反応液はプロモーターの他に既にＢ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ δ55 ＲＮＡポリメラーゼにより効率よく利用さ
れるとわかっているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｖｅｇプロ
モーターを含有する（Ｍａｒａｎ Ｊｒ．ら、Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６巻、３３９〜３４６
頁〔１９８２年〕）。図６のデータから明かなように、
試験したプロモーターは全てその程度は異なるがＢ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＮＡポリメラーゼにより認識され
る。大腸ファージＴ５プロモーターＰN26 およびＰK28a
／Ｐ K28bの場合、転写はｖｅｇプロモーターからの場合
より強いかも知れない。さらに、塩濃度のプロモーター
効率に対する影響も明かである。５０ｍＭ ＮａＣｌで
はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＮＡポリメラーゼは試験し
たプロモーターから転写を開始するばかりか、ｐＢＲ３
２２ベクターＤＮＡの“ｂｌａ”および“ｏｒｉ”プロ
モーターからも開始する（予備試験ではプロモーターは
全てｐＢＲ３２２由来のベクターに挿入している：それ
らのプラスミドは切断して常に３５０ヌクレオチドの
“ｂｌａ”転写物と大腸菌ファージＴ５プロモーターか
らの種々の長さの転写物を生成する。）。塩濃度が上が
るに伴ない、プロモーターの効率はｖｅｇと大腸菌ファ
ージＴ５プロモーターの間ではっきりと分かれる。図６
の結果が生菌中でも成り立つかどうか調べるため大腸菌
ファージＴ５プロモーター、或いは大腸菌ファージＴ７
のＡ１プロモーターがベクターｐ２５* ＲＢＳ ＩＩ
（図３）のＰG25 プロモーターの代わりとなり、Ｂ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ中でＣＡＴ合成を確認できる。 【００８１】実施例 ７ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25 と可動性リボゾ
ーム結合部位−合成ＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ、９Ａとを
含有するベクターｐ６０２／１８の構築 【００８２】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＤＳ５／Ｒ
ＢＳ ＩＩ、９Ａを制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ Ｉ
およびＸｂａ Ｉで完全１μｇ／ｍｌのエチジウムブロ
ミド含有１％低温融解アガロースゲルで電気泳動にかけ
て分画する。電気泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で確認
し、およそ１．０Ｋｂの下の方のバンドを切り出す。Ｄ
ＮＡ断片をアガロースより精製する。 【００８３】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ２５* Ｒ
ＢＳ ＩＩを同じように制限酵素Ｘｈｏ ＩおよびＸｂ
ａ Ｉで完全消化し、１μｇ／ｍｌエチジウムブロミド
含有の１％低温融解性アガロースゲルで分画する。蛍光
でＤＮＡバンドを確認し、およそ４．６Ｋｂの上のバン
ドを切り出してアガロースより精製する。 【００８４】（ＩＩＩ） 実施例７（Ｉ）および（Ｉ
Ｉ）で調製したＤＮＡ断片の等モル量を結合し、結合生
成物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコンピー
テント細胞に導する。１０μｇ／ｍｌのカナマイシンお
よび１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに耐性な形
質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、１．０Ｋｂの
Ｘｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片の存在を分析する。確認さ
れたプラスミドをｐ６０２／１８と命名した。ｐ６０２
／１８の構築を図７に図示する。 【００８５】（ＩＶ） プラスミドｐ６０２／１８を含
有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／ｍ
ｌクロラムフェニコール含有Ｌ−ブロス中で培養し、培
養物により生成された全たん白質をＳＤＳ／ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分析する。大腸菌ファージ
プロモーターＰN25 とリボゾーム結合部位をコードする
合成ＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ、９Ａ、とが利用されたこ
とは、ＲＢＳ ＩＩ、９Ａ、の近接に始まり、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ｃａｔ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで終了する
融合ＣＡＴたん白の合成により確認される。分析結果は
図９に示す。 【００８６】実施例 ８ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25 とリボゾーム結
合部位をコードする可動性合成ＤＮＡ配列ＲＢＳ Ｉ
Ｉ、３Ａ＋５Ａを含むベクターｐ６０２／１９の構築 【００８７】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＤＳ５／Ｒ
ＢＳ ＩＩ、３Ａ＋５Ａを制限エンドヌクレアーゼＸｈ
ｏ ＩおよびＸｂａ Ｉで完全消化し、１μｇ／ｍｌの
エチジウムブロミドを含む１％低温融解アガロースゲル
の電気泳動により分画する。電気泳動後、ＤＮＡバンド
を蛍光により検出し、およそ１．０Ｋｂの下のバンドを
切り出す。本断片をアガロースより精製する。（ＩＩ）
２μｇのプラスミドｐ２５* ＲＢＳ ＩＩを同様に制
限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａ Ｉで完全消化し、１μｇ
／ｍｌのエチジウムブロミド含有の１％低温融解アガロ
ースゲルの電気泳動で分画する。ＤＮＡバンドを蛍光に
より検出し、およそ４．７Ｋｂの上部バンドを切り出し
てアガロースより精製する。 【００８８】（ＩＩＩ） 実施例８の（Ｉ）および（Ｉ
Ｉ）で精製したＤＮＡ断片を等モル量ずつ結合し、結合
生成物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコンピ
ーテント細胞に導入する。１０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンおよび１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに耐性
な形質転換株よりプラスミドＤＮＡを精製し、１．０Ｋ
ｂのＸｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片の存在を確認する。確
認できたプラスミドＤＮＡをｐ６０２／１９と命名し
た。ｐ６０２／１９の構築を図７に示す。 【００８９】実施例 ９ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25 およびリボゾー
ム結合部位をコードする可動性ＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ
を含有するベクターｐ６０２／２０の構築 【００９０】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＤＳ８／Ｒ
ＢＳ ＩＩを制限酵素Ｘｈｏ ＩおよびＸｂａ Ｉで完
全消化した後、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含
む１％低温融解アガロースゲルの電気泳動で分画する。
電気泳動後ＤＮＡバンドを蛍光で検出し、下のおよそ
２．０Ｋｂのバンドを切り出す。次にその断片をアガロ
ースより精製する。 【００９１】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ２５* Ｒ
ＢＳ ＩＩを同じように制限酵素Ｘｈｏ ＩおよびＸｂ
ａ Ｉで完全消化した後、１μｇ／ｍｌのエチジウムブ
ロミド含有の１％低温融解アガロースゲル電気泳動にて
分画する。ＤＮＡバンドを蛍光で検出し、上のおよそ
４．７Ｋｂのバンドを切り出し、アガロースより精製す
る。 【００９２】（ＩＩＩ） 実施例９の（Ｉ）および（Ｉ
Ｉ）で調製したＤＮＡ断片の等モル量を結合し、結合生
成物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコンピー
テント細胞に導入する。１０μｇ／ｍｌのカナマイシン
および１０μｇ／ｍｌのトリメトプリムに耐性を示す形
質転換株よりプラスミドＤＮＡを精製し、２．０Ｋｂの
Ｘｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片の存在を分析する。そのよ
うな性質が確認されたプラスミドＤＮＡをｐ６０２／２
０と命名した。ｐ６０２／２０の構築を図８に示す。 【００９３】（ＩＶ） プラスミドｐ６０２／２０を含
有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／ｍ
ｌのカナマイシンを含むＬ−ブロス中で培養し、生成す
る全たん白質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析する。大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25
とリボゾーム結合部位をコードする合成ＤＮＡ配列ＲＢ
Ｓ ＩＩの利用はＲＢＳ ＩＩの近接から開始し、ｄｈ
ｆｒ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで終了する融合ＤＨ
ＦＲたん白の合成により確認できる。分析結果を図９に
示す。 【００９４】実施例 １０ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25 とリボゾーム結
合部位をコードする可動性合成ＤＮＡ配列ＲＢＳ Ｉ
Ｉ、３Ａ＋５Ａを含有するベクターｐ６０２／２１の構
築 【００９５】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＤＳ８／Ｒ
ＢＳ ＩＩ、３Ａ＋５Ａを制限エンドヌクレアーゼＸｈ
ｏ ＩおよびＸｂａ Ｉで完全消化した後、１μｇ／ｍ
ｌのエチジウムブロミドを含む１％低温融解アガロース
ゲルの電気泳動にかけて分画する。電気泳動後ＤＮＡバ
ンドを蛍光で検出し、下のおよそ２．０Ｋｂのバンドを
切り出してアガロースから精製する。 【００９６】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ２５* Ｒ
ＢＳ ＩＩを同様に制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａ Ｉ
で完全消化し、消化物を１μｇ／ｍｌのエチジウムブロ
ミド含有１％低温融解アガロースゲルで分画する。電気
泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で検出して下のおよそ２．
０Ｋｂのバンドを切り出し、アガロースより精製する。 【００９７】（ＩＩＩ） 実施例１０、（Ｉ）および
（ＩＩ）により精製したＤＮＡ断片を等モル量結合し、
結合生成物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコ
ンピーテント細胞に導入する。１０μｇ／ｍｌのカナマ
イシンおよび１０μｇ／ｍｌのトリメトプルムに耐性な
形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、２．０Ｋｂ
のＸｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片の存在を分析する。性質
が確認されたプラスミドＤＮＡをｐ６０２／２１と命名
した。ｐ６０２／２１の構築を図８に図示する。 【００９８】（ＩＶ） プラスミドｐ６０２／２１を含
有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／ｍ
ｌカナマイシン含有のＬ−ブロス中で培養し、合成され
た全たん白質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析する。大腸菌ファージＴ５のプロモーターＰ
N25 とリボゾーム結合部位をコードする合成ＤＮＡ配列
ＲＢＳ ＩＩ、３Ａ＋５Ａの有効性はＲＢＳ ＩＩ、３
Ａ＋５Ａのすぐ近接より開始し、ｄｈｆｒ遺伝子の天然
の停止コドンで停止した融合ＤＨＦＲたん白の合成で確
認される。分析の結果は図９に示す。
規発現調節ＤＮＡ配列を含む発現ベクターにより形質転
換した形質転換株を用いて原核細胞および真核細胞たん
白質を生産する方法に関するものである。 【０００２】 【従来の技術】従来の組換えＤＮＡの研究のほとんどは
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を
用いて行なわれてきた。Ｅ．ｃｏｌｉは、ペリプラズマ
空間を含んで二層の膜を有するグラム陰性細菌群に属す
る。Ｅ．ｃｏｌｉが生産するたん白質の多くは、分泌す
るとしてもこのペリプラズマ空間に分泌される。生細胞
から外部の生育培地中に分泌される物質はほとんどな
い。 【０００３】一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）は一層の細胞膜を有するグ
ラム陽性細菌群の一員である。従って、Ｂ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓは生育培地中に多量のたん白質を分泌して生産す
る。さらに、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは非病源性であり、
内毒素を生産しないので、本細菌でたん白質を生産させ
るのは有利である。その上、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは今
までに多く研究されており、グラム陽性菌の中で遺伝研
究の原型である。 【０００４】Ｅ．ｃｏｌｉを用いた遺伝子クローニング
の一般的手法はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにも応用できる
が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにクローン化した異種遺伝子
の有用産物を生産し、生育培地中に分泌させる試みは遅
れており、有用なクローニングおよび発現ベクターの一
般的不足により特に困難であった。この発現ベクターの
不足は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける異種ＤＮＡの転
写および翻訳開始シグナルの理解の不足により、一部説
明できる。従って、よく知られているｔｒｐ（Ｒ．Ａ．
ＨａｌｌｅｗｅｌｌおよびＳ．Ｅｍｔａｇｅ、Ｇｅｎｅ
９巻、２７〜４７頁〔１９８０年〕）、ｌａｃ（Ｋ．
Ｉｔａｋｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８巻、１０５
６〜１０６３頁〔１９７７年〕：Ｔ．Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔ
ｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ
７６巻、５５９６〜５６００頁〔１９７９年〕）、ｌｐ
ｐ（Ｎ．Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４６
巻、８６１〜８６６頁〔１９８１年〕：Ｌ．Ｊ．Ｚｗｉ
ｅｂｅｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５巻、６５
４〜６５６頁〔１９８１年〕およびＫ．Ｎａｔａｍｕｒ
ａおよびＭ．Ｉｎｏｕｙｅ、Ｃｅｌｌ １８巻、１１０
９頁〔１９７９年〕）およびバクテリオファージ入ＰL
（Ｈ．Ｂｅｒｎａｒｄら、Ｇｅｎｅ ５巻、５９〜７６
頁〔１９７９年〕）の転写および翻訳システムはＢ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓでは作用しない。従って、Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの
ようなグラム陽性菌からのいくつかの薬剤耐性遺伝子を
除いて、原核細胞および真核細胞たん白質をコードする
外来遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ中で発現されていない（Ａ．Ｔ．Ｇａｎｅｓａｕお
よびＪ．Ａ．Ｈｏｃｈ編集、“Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎ
ｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”；Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ〔１９８４年〕および後述のＪ．Ｐａｌｖ
ａの学位論文の総説を参照）。その上、発現量は一般的
に少なく、その結果、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓのための有能なプロモーターを有するより良い発現
ベクターの開発が望まれてきた。 【０００５】現在、塩基配列が明かにされている既知の
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓプロモーターとし
ては、ｖｅｇプロモーター、ｔｍｓプロモーター、ｐｅ
ｎＰプロモーター（Ｃ．Ｐ．Ｍｏｒａｎ Ｊｒ．ら、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６巻、３３９〜
３４６頁〔１９８２年〕）、ｓｐｏ ＶＣプロモーター
（Ｃ．Ｐ．Ｍｏｒａｎ Ｊｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９巻、５９７９〜５９９０〔１９８
１年〕）、ｓｐｏ ＶＧプロモーター（Ｃ．Ｐ．Ｍｏｒ
ａｎ Ｊｒ．ら、Ｃｅｌｌ ２５巻、７８３〜７９１頁
〔１９８１年〕）、φ２９Ｇ３ａプロモーター、φ２９
Ｇ３ｂプロモーター、φ２９Ｇ２プロモーター、φ２９
Ａ１プロモーター（Ｃ．Ｌ．ＭｕｒｒａｙおよびＪ．
Ｃ．Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５７巻、１０５３〜１０６２頁〔１９８２年〕）、ｐ
ＭＧ１０２プロモーター、ｐＭＧ２０１プロモーター
（Ｍ．Ｚ．Ｇｉｌｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．９巻、５９９１〜６０００〔１９８１
年〕）、ｓｐｏ １−１５プロモーター（Ｇ．Ｌｅｅ
ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３９巻、４０７〜４２２
頁〔１９８０年〕）、ｓｐｏ １−１６プロモーター
（Ｇ．Ｌｅｅら、Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、１８０巻、５７〜６５頁〔１９８０年〕）、および
ＳＰＯ ２プロモーター（Ｒ．Ｇ．Ｓｃｈｏｎｅｒら、
Ｇｅｎｅ ２２巻、４７〜５７頁〔１９８３年〕）があ
る。これらの中ではＳＰＯ ２プロモーター（Ｒ．Ｇ．
Ｓｃｈｏｎｅｒら、前述）およびｖｅｇプロモーター
（ヨーロッパ特許出願公開番号１１６４１１）のみが実
際に遺伝子発現に利用されている。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】このような状況下で、
例えばＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの
ようなグラム陽性細菌で使用できるより良い遺伝子発現
システムを開発することは有利である。このような観点
から、本発明の一般的に使用し得る発現ベクターは原核
細胞および真核細胞たん白質をコードする遺伝子をＢａ
ｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他のグ
ラム陽性宿主中、グラム陰性菌由来の転写開始および終
了ＤＮＡ配列の調節下ではじめて発現できるようになる
ため特に重要である。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明は、具体的には、
一方の末端付近にグラム陰性細菌の転写開始ＤＮＡ配列
を、他方の末端付近にグラム陰性またはグラム陽性菌由
来の転写終了ＤＮＡ配列を有し、該転写開始ＤＮＡ配列
と転写終了ＤＮＡ配列との中間にグラム陽性またはグラ
ム陰性菌由来のリボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ
配列が原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコードす
る外来遺伝子に機能的に結合して有するグラム陽性細菌
用発現調節ＤＮＡ配列、さらに、５′から３′への下流
方向にグラム陰性菌由来の転写開始ＤＮＡ配列、グラム
陽性またはグラム陰性菌由来のリボゾーム結合部位をコ
ードするＤＮＡ配列およびグラム陰性またはグラム陽性
細菌由来の転写終了配列を機能単位に、公知のＤＮＡ組
み換え技術により結合することより成る発現調節ＤＮＡ
配列を使用するタンパク質の調製法を提供するものであ
る。 【０００８】さらに詳細には、本発明は以下の組み合わ
せより成るものである。 （ａ） グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（プ
ロモーター）とグラム陽性細菌由来のリボゾーム結合部
位をコードするＤＮＡ配列およびグラム陰性細菌由来の
転写終了ＤＮＡ配列。 （ｂ） グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（プ
ロモーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部
位をコードするＤＮＡ配列およびグラム陰性細菌由来の
転写終了ＤＮＡ配列。 （ｃ） グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（プ
ロモーター）とグラム陽性細菌由来のリボゾーム結合部
位をコードするＤＮＡ配列およびグラム陽性細菌由来の
転写終了ＤＮＡ配列、および （ｄ） グラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ配列（プ
ロモーター）とグラム陰性細菌由来のリボゾーム結合部
位をコードするＤＮＡ配列およびグラム陽性細菌由来の
転写終了ＤＮＡ配列。 【０００９】転写開始ＤＮＡ配列に関連して用いている
細菌由来というのは（ａ）自然界に存在する細菌の転写
開始配列および、そのような転写開始ＤＮＡ配列の一個
または数個のヌクレオチドおよびリピートの置換或いは
逆転を含むその機能的変異種および（ｂ）化学的に合成
した（合成）転写ＤＮＡ配列で細菌で転写開始可能なも
のより成る。 【００１０】リボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配
列に関連して用いている細菌由来という言葉は、（ａ）
自然界に存在する細菌のリボゾーム結合部位をコードす
るＤＮＡ配列および一個又はいくつかのヌクレオチドの
置換または逆転を含むその機能的変異種、および（ｂ）
細菌中で翻訳開始可能な化学的に合成した（合成）リボ
ゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列を含む。 【００１１】転写終了ＤＮＡ配列に関連して用いられて
いる細菌由来という意味は、（ａ）自然界に存在する細
菌転写終了ＤＮＡ配列および、その転写終了ＤＮＡ配列
の一個またはいくつかのヌクレオチドの置換あるいは逆
転を含む機能的変異種、および（ｂ）化学的に合成した
（合成）転写終了ＤＮＡ配列で細菌中で転写を終了する
ことの出来るものを含む。 【００１２】好ましい適用においては、原核細胞または
真核細胞のたん白質をコードする遺伝子がＢａｃｉｌｌ
ｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および他のグラム陽
性菌中で大腸菌ファージＴ５またはＴ７起源のプロモー
ターおよびＥ．ｃｏｌｉ起源のターミネーターの転写調
節下で発現できる。本発明に於いてＴ５およびＴ７プロ
モーターは大腸菌ファージＴ５およびＴ７群のゲノムに
存在するプロモーター機能を仲介するＤＮＡ配列および
そのような配列由来の機能的な組合せと定義される。 【００１３】本発明に於いて有効なＴ５プロモーターは
ファージの“前初期”、“初期”および“後期”発現の
プロモーターであり、特にＲ．Ｇｅｎｔｚのハイデルベ
ルグ大学学位論文〔１９８４年〕に記載される以下の配
列である。 ＰJ5、ＰN25 、ＰN26 、ＰD/E20 、ＰG5、ＰG20 、Ｐ
G22 、ＰG25 、ＰG28 、ＰK28a、ＰK28b 【００１４】本発明に於いて有効なＴ７プロモーターは
ファージの“初期”発現プロモーター、特にＡ１および
Ａ２プロモーター（Ｄ．Ｋ．ＨａｗｌｅｙおよびＷ．
Ｄ．ＭｃＣｌｕｒｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１１巻、２２３７〜２２５５頁〔１９８３年〕）
である。 【００１５】上述の好ましいＴ５またはＴ７プロモータ
ーのいくつかのＤＮＡ配列を下の表１に示す。表１は本
発明で用いられるプロモーターのヌクレオチド配列を示
す。−５０から＋１０までの配列を示し、−３５のヘキ
サマーおよびその上流のＡ：Ｔ−豊富な領域を線で囲ん
であり、−１０ヘキサマーは上線を印してある。 【００１６】 【表１】【００１７】宿主中での翻訳開始に必要なリボゾーム結
合部位をコードするＤＮＡ配列は、（１）アミノ酸メチ
オニンのコドンであるＡＴＧ翻訳開始コドン、（２）シ
ャイン ダルガーノ（ＳＤ）配列として知られる１６Ｓ
リボゾームＲＮＡの３′−末端の塩基に相応する４〜１
２塩基の配列、および（３）リンカー領域として知られ
るこれら２つの間の塩基配列とから成る。 【００１８】本発明で使用され、また本発明の一部を成
しているリボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列は
グラム陽性菌またはグラム陰性菌由来でＢａｃｉｌｌｕ
ｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および他のグラム陽性
菌中で機能することの出来るリボゾーム結合部位をコー
ドするＤＮＡ配列より調製されるもので、既知のいくつ
かのものを含む（Ｊ．Ｒ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６巻、１１２８３〜１１
２９１頁〔１９８１年〕；Ｃ．Ｐ．ＭｏｒａｎＪｒ．
ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６巻、３
３９〜３４６頁〔１９８２年〕）。 【００１９】しかしながら、本発明で使用される好まし
いリボゾーム結合部位をコードする配列は下記の表２に
示す式で表わされる可動性リボゾーム結合部位をコード
する合成のＤＮＡ配列（ＳＲＢＳ）である。 【００２０】 【表２】【００２１】これらのＳＲＢＳは原核細胞または真核細
胞ポリペプチドをコードするいかなる遺伝子とも連動し
てＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およ
び他のグラム陽性菌中で機能できるように構築されてい
る。そのような機能を保持することでＳＲＢＳは“移動
可能”と言える。 【００２２】転写終了ＤＮＡ配列はグラム陰性細菌由来
のターミネーターでＢａｃｉｌｌｕ、特にＢ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ、および他のグラム陽性菌で機能できるものか
ら調製される。本発明で使用される好ましいグラム陰性
菌ターミネーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のターミ
ネーターｔ0 （Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７３巻、７１７
〜７２１頁〔１９７６年〕）、Ｔ１、Ｔ２（Ｊ．Ｂｒｏ
ｓｉｕｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４８巻、１０７
〜１２７頁〔１９８１年〕）およびＴ７（Ｊ．Ｊ．Ｄｕ
ｎｎおよびＦ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８巻、２１１９〜２１３２頁〔１
９８０年〕）がある。 【００２３】本発明の転写開始ＤＮＡ配列、移動可能な
リボゾーム結合部位をコードする配列、および転写終了
配列は、例えばヌクレオチド合成器のように相当するＤ
ＮＡ配列の全化学合成を含むＤＮＡ化学でよく知られる
方法により得られる。 【００２４】本発明はさらに原核細胞および真核細胞た
ん白質をコードする遺伝子を形質転換したＢａｃｉｌｌ
ｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、或いは他のグラム陽
性菌中で発現するよう指示できる以下の配列を含む発現
ベクターをも包含する：（ａ）転写の下流方向に向って
次の単位を有するグラム陽性細菌発現調節ＤＮＡ配列：
少なくとも一個のグラム陰性細菌由来の転写開始ＤＮＡ
配列がグラム陽性菌又はグラム陰性菌由来のリボゾーム
結合部位をコードするＤＮＡ配列と結合し、任意に原核
細胞および真核細胞ポリペプチドをコードする外来遺伝
子、および転写終了ＤＮＡ配列、（ｂ）少なくとも一個
のベクターの複製開始点、および（ｃ）少なくとも一個
の抗生物質耐性遺伝子。またこのような発現ベクターの
製造方法にも関連している。 【００２５】転写開始ＤＮＡ配列はグラム陽性菌プロモ
ーターから得られる。使用される好ましいグラム陰性菌
プロモーターは表１に示す式を有する大腸菌ファージＴ
５または大腸菌ファージＴ７プロモーターである。リボ
ゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列は、グラム陽性
菌またはグラム陰性菌由来でＢａｃｉｌｌｕｓ、特に
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および他のグラム陽性菌中で機
能することのできるリボゾーム結合部位をコードするＤ
ＮＡ配列より調製されるもので、既知のものを含む
（Ｊ．Ｒ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、前述；Ｃ．Ｐ．Ｍ
ｏｒａｎ Ｊｒ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、１８６巻、３３９〜３４６頁〔１９８２年〕）。リ
ボゾーム結合部位をコードする好ましいＤＮＡ配列は表
２に示す式を有する、リボゾーム結合部位をコードする
移動可能な合成ＤＮＡ配列である。転写終了ＤＮＡ配列
は、グラム陰性細菌由来でＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ、および他のグラム陽性菌中で機能可
能なターミネーターより得られる。本発明で使用される
好ましい転写終了ＤＮＡ配列としてはグラム陰性Ｅ．ｃ
ｏｌｉターミネーターｔ0 （Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７３巻、７１７〜７２１頁〔１９７６年〕、Ｔ１、Ｔ２
（Ｊ．Ｂｒｏｄｉｕｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４
８巻、１０７〜１２７頁〔１９８１年〕）、およびＴ７
（Ｊ．Ｊ．ＤｕｎｎおよびＦ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、８巻、２１１９〜
２１３２頁〔１９８０年〕）。複製開始点はグラム陰性
菌および／またはグラム陽性菌由来のものであり、従っ
て本発明の発現ベクターはシャトルベクターとして使用
可能であり（Ｓ．Ｄ．Ｅｈｒｌｉｃｌｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５巻、１４３３
〜１４３６頁〔１９７８年〕；Ｊ．Ｋｒｅｆｔら、Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６２巻、５９〜６７
頁〔１９７８年〕；Ｂ．Ｍｉｃｈｅｌら、Ｇｅｎｅ １
２巻、１４７〜１５４頁〔１９８０年〕）、Ｅ．ｃｏｌ
ｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ、特にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
の両者で複製可能である。リボゾーム結合部位をコード
する合成ＤＮＡ配列を大腸菌ファージＴ５のプロモータ
ーに結合して使用し、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓの両方で複製可能（シャトルベクター）な好ま
しい発現ベクターは実施例４および５、並びに実施例７
〜１０に記載されている。 【００２６】本発明で使用される発現ベクターは文献で
公知のＤＮＡ組換え技術を用いて構築され（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓらの実験マニュアル“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｇ”、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２年、参照）、以下のス
テップより成る。 【００２７】（ａ） 既存のクローニングベクターに転
写下流方向に少なくとも一個のグラム陰性菌由来の転写
開始ＤＮＡ配列と、グラム陽性菌またはグラム陰性菌由
来のリボゾーム結合部位をコードするＤＮＡ配列とを挿
入し、（ｂ） 該クローニングベクターに少なくとも一
個の制限酵素切断部位を該リボゾーム結合部位をコード
するＤＮＡ配列に隣接して組み入れ、（ｃ） 該リボゾ
ーム結合部をコードするＤＮＡ配列に隣接する該制限酵
素部位に、原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコー
ドする少なくとも一個の外来遺伝子を挿入し、そして、
（ｄ） 原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコード
する該外来遺伝子の下流方向に少なくとも一個の転写終
了ＤＮＡ配列を挿入する。 【００２８】本発明で使用される発現ベクターを構築す
るために用いるベクターは適当ないかなるベクター、コ
スミド、或いはファージで形質転換でき、宿主微生物中
でそれ自体複製可能なものである。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓおよび／またはＥ．ｃｏｌｉでのクローニングに適し
たプラスミドは、例えばＭａｎｉａｔｉｓらの実験マニ
ュアル“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（前
述）およびＪ．Ｐａｌｖａの学位論文（ヘルシンキ大
学）、１９８３年に記載されている。本発明の発現ベク
ターを構築するため使用されるプラスミド由来の好まし
いベクターはｐＶＢ１１０（Ｔ．Ｊ．Ｇｒｙｃｚａｎ
ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３４巻、３１８〜３２
９頁〔１９７８年〕）、ｐＤＳ５およびｐＤＳ６（Ｄ．
Ｓｔｕｅｂｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ、３巻、３１４３〜３
１４３頁〔１９８４年〕）である。 【００２９】ｐ６０２およびｐ２５のプラスミドは本発
明のプラスミド性シャトルベクターの具体例である。そ
れらの調製は実施例１〜５および７〜１０により詳細に
記載されている。ｐ２５群の特に好ましいプラスミドを
含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株（ｐ２５ＲＢＳ
Ｉ；ｐ２５ＲＢＳ ＩＩ；ｐ２５* ＲＢＳ ＩＩで形質
転換したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１）はゲッチ
ンゲンのＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ
Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に１９８
５年６月２０日、それぞれ寄託番号ＤＳＭ３３５０、Ｄ
ＳＭ３３５１およびＤＳＭ３３５２として寄託されてい
る。ｐ６０２群の特に好ましいプラスミドを含有する
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの菌株（ｐ６０２／１８；ｐ６０
２／１９；ｐ６０２／２０；ｐ６０２／２１で形質転換
したＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１）はゲッチンゲ
ンのＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍ
ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に１９８６年
５月１４日付けで、それぞれ寄託番号ＤＳＭ３７２３、
ＤＳＭ３７２４、ＤＳＭ３７２５およびＤＳＭ３７２６
として寄託されている。 【００３０】本発明で使用される発現ベクターに挿入さ
れる外来遺伝子はｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで原核細胞または真核細胞ポリペプチドをコードする
各種遺伝子（ＤＮＡ遺伝子またはＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ
コピー）から選ぶことができる。例えば、遺伝子は酵
素、ホルモン、免疫調節、抗ウイルス性、または抗癌性
を有するポリペプチド、抗体、抗原およびその他の原核
細胞または真核細胞由来のポリペプチドをコードする。
本発明で使用する好ましい外来遺伝子はＥ．ｃｏｌｉの
クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ
（ｃａｔ）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄ
ｈｆｒ）の遺伝子である。 【００３１】本発明による改良発現調節システムを用い
て発現され得るたん白質の例は、ジヒドロ葉酸レダクタ
ーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ、マラリア表面抗原、ＩＬ−２、インタフェロンアル
ファ、ベータ、ガンマのようなリンフォカイン類、イン
シュリンおよびインシュリン前駆体、成長ホルモン、テ
イシュ・プラスミノーゲンアクチベーター、ヒトレニン
或いはＨＴＬＶ−ＩＩＩたん白などがある。 【００３２】本発明で使用される発現ベクター、特にシ
ャトルベクターを用いて原核細胞または真核細胞たん白
をコードする遺伝子を発現する方法はよく知られている
（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前述）。それは、目的のＤＮＡ
配列が本発明の発現調節ＤＮＡ配列に機能的に挿入され
ている発現ベクターで適当な宿主を形質転換し、生育の
適当な条件下で宿主を培養し、培養物から目的のポリペ
プチドを単離することより成る。本技術に熟練している
者は本発明の範囲から出ることなく、個々の遺伝子の発
現に最も効率のよい公知の方法を選ぶことができる。 【００３３】本発明で用いる特別の宿主の選択はこの分
野で認められている多くの要因に依存している。例え
ば、選んだ発現ベクターとの適合性、雑種プラスミドに
よりコードされるたん白質の毒性、目的たん白質の回収
の容易さ、発現の特徴、生物安全性およびコストなどで
ある。これらの一般的指針の範囲内で有用な宿主細菌は
グラム陰性およびグラム陽性細菌、特にＥ．ｃｏｌｉお
よびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株である。本発明における
最も好ましい宿主細胞はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＢＲ１５
１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ
ＣｅｎｔｅｒにおいてＢＧＳＣ Ｎｏ．１Ａ４０として
保存されている）である。しかしながら、他のＢ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ菌株、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＤ
１７０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃ
ｋ ＣｅｎｔｅｒにてＢＧＳＣＮｏ．１Ａ４２として保
存）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＪＨ６４６（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅ
ｒにてＢＧＳＣ Ｎｏ．１Ｓ９として保存）なども使用
できる。 【００３４】 【実施例】以下に続く実施例は以下の図面を参照してよ
り詳細に本発明を説明するものである。 【００３５】制限エンドヌクレアーゼは以下のように略
称した。 Ｅ：ＥcoＲＩ；Ｓm ：Ｓma Ｉ；Ｂ：ＢamＨ Ｉ；Ｓ：
Ｓal Ｉ；Ｐ：Ｐst Ｉ；Ｈ：Ｈind ＩＩＩ；Ｘｈ：Ｘho Ｉ；Ｘ：Ｘba
Ｉ；Ｋ：Ｋpn Ｉ；Ｐv：Ｐvu ＩＩ；Ａ：Ａcc Ｉ；
Ｓp ：Ｓph Ｉ；Ｂg ：Ｂgl ＩＩ；Ｄ：ＤraＩ その他の略称は以下の通りである。 ｋａｎ：カナマイシンヌクレオチジルトランスフェラー
ゼの構造遺伝子； ｃａｔ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼの構造遺伝子； ｄｈｆｒ：マウス ジヒドロ葉酸レダクターゼの構造遺
伝子 ｂｌａ：ベータ・ラクタマーゼ構造遺伝子； ＣＡＴ：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼたん白； ＤＨＦＲ：ジヒドロ葉酸レダクターゼたん白； ｏｒｉ＋：グラム陽性菌複製開始点； ｏｒｉ−：グラム陰性菌複製開始点； ＳＲＢＳ：リボゾーム結合部位をコードする可動合成Ｄ
ＮＡ配列； ＲＢＳ：リボゾーム結合部をコードするＤＮＡ配列； ＳＤ ：シャインダルガノ配列； ｔ0 、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ７：転写ターミネーターｔ0 、Ｔ
１、Ｔ２、Ｔ７；および （Ｈ）；Ｈｉｎｄ ＩＩＩの接着末端をＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ末端に結合してＨｉｎｄ ＩＩＩ部位をつぶしたも
の。 【００３６】図１：グラム陽性菌の（ｏｒｉ＋）および
グラム陰性菌の（ｏｒｉ−）複製開始点と共にカナマイ
シン（ｋａｎ）およびクロラムフェニコール薬剤耐性マ
ーカーを含む基本的なＥ．ｃｏｌｉ／Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓシャトルベクターｐ６０２／５の構築を示す。この
結果、本プラスミドはＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓの両者でカナマイシン耐性を示す。クロラムフ
ェニコール耐性はＥｃｏ ＲＩ（Ｅ）とＨｉｎｄ ＩＩ
Ｉ（Ｈ）部位の間にプロモーターを含むフラグメントを
挿入することで出現する。ここで示すＥ．ｃｏｌｉ ｃ
ａｔ遺伝子は天然のリボゾーム結合部位をコードするＤ
ＮＡ配列を有する。 【００３７】図２：一般の発現ベクターｐ６０２／７お
よびｐ６０２／２５、並びにリボゾーム結合部位をコー
ドするＤＮＡ配列ＳＲＢＳ ＩおよびＳＲＢＳ ＩＩを
それぞれ有するベクターｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉおよ
びｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩの構築を示す。リボゾー
ム結合部位をコードするＤＮＡ配列ＳＲＢＳ Ｉおよび
ＳＲＢＳ ＩＩを挿入することにより、野生型のｃａｔ
リボゾーム結合部−ＤＮＡ配列からの天然のＣＡＴたん
白とそれぞれＳＲＢＳ Ｉ又はＳＲＢＳ ＩＩに由来す
る融合ＣＡＴたん白の２種のＣＡＴたん白質をＥ．ｃｏ
ｌｉ中で合成するようになる。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中
ではリボゾーム結合部位−ＤＮＡ配列、ＳＲＢＳ Ｉお
よびＳＲＢＳ ＩＩに起因する融合ＣＡＴたん白のみ生
産される。ｐ６０２／７、ｐ６０２／２５、ｐ６０２／
７ ＲＢＳ Ｉおよびｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩの全
てのプラスミド共Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓの両方でクロラムフェニコール耐性を示す。 【００３８】図３：大腸菌ファージＴ５プロモーターＰ
G25 をリボゾーム結合部位−合成ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ
Ｉ，ＳＲＢＳ ＩＩのそれぞれと結合して含有している
ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ，ｐ２５ ＲＢＳ ＩＩお
よびｐ２５* ＲＢＳ ＩＩの構築を示す。ベクターｐ２
５ ＲＢＳ Ｉを含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞
はＳＲＢＳ Ｉのすぐ下流付近に由来するたん白とＰ
G25 のすぐ近くのリボゾーム結合部位に由来するものと
二つの融合ＣＡＴたん白質を合成する。後者のリボゾー
ム結合部位に由来するたん白合成はＳＲＢＩＩの上流に
転写終了コドンを入れることにより除去され、その結合
ｐ２５* ＲＢＳ ＩＩベクターが得られる。ｐ２５* Ｒ
ＢＳ ＩＩを含有する細胞はＳＲＢＳ ＩＩに由来する
一つのＣＡＴたん白を合成する。 【００３９】図４：発現ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ，
ｐ２５ ＲＢＳ ＩＩおよびｐ２５ * ＲＢＳ ＩＩを含
有するＢ，ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１で生産される
全たん白質を示す。ＳＲＢＳ ＩまたはＳＲＢＳ ＩＩ
に基づいて合成されるＣＡＴたん白質の位置を“ＣＡ
Ｔ”で示し、ｐ２５ ＲＢＳ ＩＩを有する細胞のもう
一つの融合ＣＡＴたん白を“ｆＣＡＴ”で示した。ＬＹ
Ｓは細胞融解を補助するため添加したリゾチームの位置
を示す。 【００４０】図５：ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ，ｐ２
５ ＲＢＳ ＩＩおよびｐ２５* ＲＢＳ ＩＩを含有す
るＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中でのＣＡＴたん白質合成を模
式図により示する。挿入した翻訳停止コドン 【外１】 によりＰG25 ＲＢＳからｃａｔ遺伝子までの翻訳継続を
阻止できる。ｐ２５ ＲＢＳ ＩＩではそのようなフレ
ームの合った停止コドンが存在しないためｃａｔたん白
はＲＢＳおよびＳＲＢＳ ＩＩの両方から生成する。ｐ
２５* ＲＢＳ ＩＩにおけるＨｉｎｄＩＩＩ部位の修飾
の結果、ＳＲＢＳ ＩＩのみから単一のＣＡＴたん白を
生成する。 【００４１】図６：表１に示したプロモーターのインビ
トロ系転写解析を示す。“ＥC ”および“ＢS ”はそれ
ぞれＥ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＮＡ
ポリメラーゼによる解析を表わし、数字は転写を行なわ
せた塩濃度を示す。プロモーターをクローン化したベク
ターで’ｏｒｉ’および’ｂｌａ’転写物が生じてい
る。’ｖｅｇ’と示した列はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｖ
ｅｇプロモーター（Ｓ．Ｆ．Ｊ．Ｌｅ Ｇｒｉｃｅおよ
びＡ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１６２巻，５５１〜５６４頁，１９８２年）のみ
の転写物を示す。横に’ｖｅｇ’と示してあるのは内部
標準のｖｅｇプロモーターＤＮＡである。ＭはＨｐａ
ＩＩで切断したｐＢＲ３２２の分子量マーカーである。
本研究で対応する大きさのバンドのみ示した。Ｔ５プロ
モーターＰK28a／ＰK28bは両プロモーターが同一の制限
断片上に存在するため、これらのプロモーターからの転
写物には新しい２つのものが認められる。 【００４２】図７：大腸菌ファージプロモーターＰN25
が合成リボゾーム結合部位−ＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ，
９Ａ（ｐ６０２／１８）またはＲＢＳ ＩＩ，３Ａ＋５
Ａ（ｐ６０２／１９）に機能的に結合して有しているシ
ャトルベクターｐ６０２／１８およびｐ６０２／１９の
構築を示す。いずれの場合も合成リボゾーム結合部位−
ＤＮＡ配列を挿入することにより合成リボゾーム結合部
位のすぐ近くより融合ＣＡＴたん白の合成を開始し、ｃ
ａｔ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで停止するようにな
る。ｐ６０２／１８およびｐ６０２／１９の両プラスミ
ド共Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓでクロラムフェニコール耐性
を示す。 【００４３】図８：大腸菌ファージプロモーターＰN25
が合成リボゾーム結合部位のＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ
（ｐ６０２／２０）またはＲＢＳ ＩＩ，３Ａ＋５Ａ
（ｐ６０２／２１）に機能的に結合して有しているシャ
トルベクターｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１の構
築を示す。いずれのプラスミドの場合も、合成リボゾー
ム結合部位−ＤＮＡ配列を挿入することにより、合成リ
ボゾーム結合部位のすぐ下流から融合ＤＨＦＲたん白を
合成し、ｄｈｆｒ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで停止
するようになる。ｐ６０２／２０またはｐ６０２／２１
を含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞は１０μｇ／ｍ
ｌのトリメトプリムに耐性である。 【００４４】図９：プラスミドｐ６０２／１８，ｐ６０
２／１９，ｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１を含有
するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株により合成さ
れる全たん白質を示す。’Ｃｅｌｌ’と示してあるのは
プラスミドを含有しない細胞でのたん白合成を表わす。
対照としてｐ２５* ＲＢＳ ＩＩからのＣＡＴ合成も示
してある。融合ＣＡＴたん白ＣＡＴ* （ｐ６０２／１８
およびｐ６０２／１９由来）の位置および融合ＤＨＦＲ
たん白（ｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１から）の
位置は図示してある。 【００４５】一般的な方法 別に記載していない限り、以下の方法は前述のＭａｎｉ
ａｔｉｓらにより記載されている通り行なった；３７℃
に於ける制限エンドヌクレアーゼ消化（１００〜１０１
頁）；３７℃に於ける細菌アルカリフォスファターゼ
（ＢＡＰ）による脱りん酸化（１３３〜１３４頁）；Ｃ
ａＣｌ2 処理Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１細胞へのＤＮＡ
の形質転換および１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有
ＬＢ培地を含む寒天平板上での形質転換株の選択（２５
０〜２５１頁）；ＤＮＡプラスミドの調製（８６〜９４
頁）；一本鎖ＤＮＡ末端の１４℃に於けるＤＮＡポリメ
ラーゼＩの大断片（クレナウ断片）による充填（１１３
〜１１４頁）；アガロスゲルによるＤＮＡの分離および
断片の精製（１６４〜１６７頁）；サブクローニングへ
の合成ＤＮＡリンカーの使用（３９２〜３９７頁）；お
よびＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（３４８
〜３４９頁）。 【００４６】Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞へのＤＮＡの形
質転換はＳ．ＣｏｎｔｅｎｔｅおよびＤ．Ｄｏｂｎａｕ
により記載されている通り（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ，１６７巻，２５１〜２５８頁〔１９７９
年〕）行なった。 【００４７】Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
のＲＮＡポリメラーゼによる試験管内転写は次の組成を
有する５０μｌの反応液中で行なった：４０ｍＭトリス
／塩酸、ｐＨ７．９；１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ；０．１ｍ
Ｍ ＤＴＴ；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；５０〜２００ｍＭ
ＮａＣｌ；１０％（ｖ／ｖ）グリセロール；１５０μ
Ｍ ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ；５０μＭ ＵＴＰ；５μ
Ｃｉ 32Ｐ−ＵＴＰ（〜３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、ア
マーシャム・ブフラー、ブラウンシュバイク）；０．０
５ｐｍｏｌｅエンドヌクレアーゼ消化ＤＮＡ；０．２５
ｐｍｏｌｅ ＲＮＡポリメラーゼ。反応はＲＮＡポリメ
ラーゼの添加により開始し、３７℃１〜５分間行なっ
た。合成されたＲＮＡはエタノール沈でんをくり返えす
ことにより単離し、８Ｍ尿素含有の５または８％ポリア
クリルアミド製０．４ｍｍ厚さの高圧ゲル電気泳動で分
析した。電気泳動後、ゲルを乾燥し、コダック社製Ｘ−
ＯＭＡＴ ＸＡＲ５のフイルムを用いて室温でオートラ
ジオグラフィーに供した。 【００４８】実施例 １ シャトルベクターｐ６０２／５の構築 （Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＵＢ１１０を制限酵素Ｐ
ｖｕＩＩで完全消化する。８塩基ＫｐｎＩリンカーをＰ
ｖｕＩＩ末端に結合する。結合後、ＤＮＡをＫｐｎＩお
よびＥｃｏＲＩで完全消化する。得られたＤＮＡ消化物
を１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド含有の低融解１％
アガロースゲルで電気泳動にかける。７０Ｖで２時間電
気泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で確認し、３．５Ｋｂの
バンドをゲルから切り出す。この３．５ＫｂのＥｃｏＲ
Ｉ／ＫｐｎＩ断片を低温融解アガロースでさらに精製す
る。 【００４９】（ＩＩ） プラスミドｐＤＳ５ ５μｇを
ＤｒａＩで完全消化し、ＤｒａＩ末端に放射活性のＫｐ
ｎＩオクタマーリンカーを結合する。結合生成物をさら
に制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｂａＩで完全消化し、６％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。およそ
１．２ＫｂのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ断片をオートラジオグ
ラフィーで位置の確認し、ゲルより切り出す。ＫｐｎＩ
／ＸｂａＩ断片をさらにアクリルアミドゲルで精製す
る。 【００５０】（ＩＩＩ） ５μｇのプラスミドｐＤＳ５
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで
完全消化し、１μｇ／ｍｌのエチジウムクロリド含有の
１％低温融解アガロースゲル電気泳動で分離する。電気
泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で確認し、およそ９００ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を切り出す。ＥｃｏＲＩ
／ＸｂａＩ断片をさらに低温融解アガロースで精製す
る。 【００５１】（ＩＶ） ステップ（Ｉ）およびステップ
（ＩＩＩ）の精製したＤＮＡ断片の等量を結合し、結合
生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＡＢ／１５７株（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、前述）のコンピーテント細胞に形質転換する。
形質転換株を１０μｇ／ｍｌカナマイシン含有のＬＢ寒
天上にプレートする。カナマイシン耐性コロニーからプ
ラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素切断によりそれぞれ
の断片の挿入を確認する。このようにして得られるプラ
スミドをｐ６０２／５と命名する。ｐ６０２／５の構築
を図１に図示する。 【００５２】実施例 ２ リボゾーム結合部位をコードする可動性合成ＤＮＡ配列
を含む発現ベクターｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉおよびｐ
６０２／７ ＲＢＳ ＩＩの構築 【００５３】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／５
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩで完全消化し、およそ５．６Ｋｂのベクター由来Ｄ
ＮＡ断片を得る。この断片を以下のＤＮＡ配列を有する
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓプロモーターＰｖＩＩを含む１２
５ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片と結合する： 【００５４】 【化２】 【００５５】結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＡＢ１１５７
株に形質転換し、形質転換株を５０μｇ／ｍｌのクロラ
ムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択する。クロラムフ
ェニコール耐性コロニーについてプロモーターＰｖＩＩ
がｐ６０２／５プラスミドに挿入していることを確認の
ため分析する。 【００５６】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／
７を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完全消化する。次の配列
を有するリボゾーム結合部位をコードする可動性合成Ｄ
ＮＡ配列ＳＲＢＳ ＩをＨｉｎｄＩＩＩの部位に結合す
る。結合生成物をＥ．ｃｏｌｉＡＢ１１５７株に形質転
換し、形質転換株を５０μｇ／ｍｌの 【００５７】 【化３】 【００５８】クロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選
択する。クロラムフェニコール耐性コロニーについて以
下の方法によりリボゾーム結合部位をコードする可動合
成ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ Ｉを含有するプラスミドの有無
を分析する。 ａ） ＳＲＢＳ ＩからのＣＡＴ融合たん白の合成能力 ｂ） 新たに獲得したＳｐｈ Ｉ部位を有する組換えプ
ラスミドの制限酵素分析 【００５９】このような解析のできたプラスミドＤＮＡ
をｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉと命名した。この後ｐ６０
２／７ ＲＢＳ Ｉ ＤＮＡをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＲ１５１株に形質転換し、クロラムフェニコール耐性
コロニー（この場合、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニ
コール耐性コロニー）につき上記（ＩＩ）のａ）および
ｂ）により分析してＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中でのＳＲＢ
Ｓ Ｉの有効性を確認する。 【００６０】（ＩＩＩ） プラスミドｐ６０２／７ Ｒ
ＢＳ ＩをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで完全消化
し、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド含有の１％低温
融解性アガロースゲルによる電気泳動によりＳＲＢＳ
Ｉと分離する。電気泳動後、ＤＮＡを蛍光で確認し、ゲ
ルより切り出す。続いてＤＮＡをアガロースより精製す
る。以下の配列を有するＳＲＢＳ ＩＩと命名したリボ
ゾーム結合部位をコードする可動合成ＤＮＡ配列をｐ６
０２／７ ＲＢＳ ＩのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｐｈＩ切断
ＤＮＡと結合する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＢ１１５７株を本 【００６１】 【化４】 【００６２】結合混合物により形質転換し、形質転換株
を５０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天
上で選択する。クロラムフェニコール耐性コロニーを以
下の点によりＳＲＢＳ ＩＩ存在の有無を分析する。 ａ） 融合ＣＡＴたん白の合成能力 ｂ） 新たにＤｒａ Ｉ部位を獲得した組換えプラスミ
ドの制限酵素解析 【００６３】このような性状を確認したプラスミドＤＮ
Ａをｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩと命名した。プラスミ
ドｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩをＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
ＢＲ１５１株のコンピーテント細胞に導入し、形質転
換株を１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ
寒天上で選択する。クロラムフェニコール耐性コロニー
について上記ステップ（ＩＩＩ）ａ）およびｂ）に記載
されるようにＳＲＢＳＩＩの有効性を分析する。ベクタ
ーｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉおよびｐ６０２／７ ＲＢ
Ｓ ＩＩの構築を図２に図示してある。 【００６４】実施例 ３ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰG25 を有する発現ベ
クターｐ６０２／２５の構築 【００６５】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／５
を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全消化する。
その後、本ＤＮＡを大腸菌ファージＴ５プロモーターＰ
G25 （Ｒ．Ｇｅｎｔｚ、前述）を含む２５０ｂｐのＥｃ
ｏＲＩ断片の等モル量と結合する。結合生成物をＥ．ｃ
ｏｌｉ ＡＢ１１５７株に導入し、形質転換株を１００
μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有のＬＢ寒天上で
選択する。クロラムフェニコール耐性コロニーよりプラ
スミドＤＮＡを分離し、ＥｃｏＲＩ消化またはＤＮＡ配
列決定によりプロモーターＰG25 を含む２５０ｂｐ断片
の存在を分析する。確認されたプラスミドＤＮＡをｐ６
０２／２５と命名した。ｐ６０２／２５の構築を図２に
図示してある。 【００６６】実施例 ４ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰG25 とリボゾーム結
合部位をコードする可動合成ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ Ｉと
を合せ有するベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉの構築 【００６７】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／７
ＲＢＳ Ｉを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩ
ＩおよびＢｇｌ ＩＩで完全消化し、１μｇ／ｍｌのエ
チジウムブロミドを含有する１％低温融解アガロースゲ
ルで電気泳動して分画を行なう。電気泳動の後ＤＮＡバ
ンドを蛍光で確認し、およそ３．２Ｋｂの上のバンドを
切り出す。この断片をアガロースより精製する。 【００６８】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／
２５を同じように制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌ
ＩＩで完全消化し、エチジウムブロミド含有の１％ア
ガロースゲル電気泳動で分画する。ＤＮＡバンドを蛍光
で確認し、およそ２．６Ｋｂの下のバンドを切り出し、
アガロースから精製する。 【００６９】（ＩＩＩ） 上記実施例４の（Ｉ）および
（ＩＩ）で調製したＤＮＡ断片を各等モル量を結合し、
結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＡＢ１１５７株に導入す
る。１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに耐性な
コロニーよりプラスミドＤＮＡを分離し、２５０ｂｐの
ＥｃｏＲＩバンドの存在を確認する。このように確認さ
れたプラスミドＤＮＡをｐ２５ ＲＢＳ Ｉと命名し
た。プラスミドｐ２５ ＲＢＳ Ｉの構築を図３に図示
した。 【００７０】（ＩＶ） ｐ２５ ＲＢＳ Ｉを保有する
Ｅ．ｃｏｌｉよりプラスミドＤＮＡを単離し、Ｂ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１のコンピーテント細胞に導入
し、形質転換株を１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコー
ル含有ＬＢ寒天上で選択する。クロラムフェニコール耐
性コロニーよりプラスミドＤＮＡを分離し、プラスミド
ｐ２５ ＲＢＳ ＩのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中での構造
を制限酵素解析で確認する。 【００７１】（Ｖ） プラスミドｐ２５ ＲＢＳ Ｉを
含有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／
ｍｌクロラムフェニコールを含むＬ−ブロス中で培養
し、合成した全たん白をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で分析した。大腸菌ファージＴ５プロモータ
ーＰG25 をリボゾーム結合部位の合成ＤＮＡ配列ＳＲＢ
ＳＩと共に用いると、ＳＲＢＳ Ｉの近接で開始し、
Ｅ．ｃｏｌｉ ｃａｔ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで
停止する融合ＣＡＴたん白の合成が確認された。分析結
果は図４に示す。 【００７２】実施例 ５ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰG25 およびリボゾー
ム結合部位をコードする可動合成ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ
ＩＩを含有するベクターｐ２５ ＲＢＳ ＩＩおよびｐ
２５* ＲＢＳ ＩＩの構築 【００７３】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／７
ＲＢＳ ＩＩを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩおよびＢｇｌ ＩＩで完全に消化し、生成物を１μ
ｇ／ｍｌのエチジウムブロミド含有の１％低温融解アガ
ロースゲルによる電気泳動で分画する。電気泳動後、Ｄ
ＮＡバンドを蛍光で確認し、およそ３．２Ｋｂの上のバ
ンドを切り出してアガロースより精製する。 【００７４】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ６０２／
２５を同様に制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢｇｌ
ＩＩで完全消化し、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド
含有の１％低温融解アガロースゲルで電気泳動して分画
する。電気泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で確認し、およ
そ２．６Ｋｂの下のバンドを切り出してゲルから精製す
る。実施例５の（Ｉ）および（ＩＩ）で得られたＤＮＡ
断片の等モル量を結合し、結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ
ＡＢ１１５７株に導入する。形質転換株を１００μｇ／
ｍｌのクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択す
る。クロラムフェニコール耐性コロニーからプラスミド
ＤＮＡを分離し、大腸ファージＴ５プロモーターＰG25
および合成リボゾーム結合部位−ＤＮＡ配列ＳＲＢＳ
ＩＩの両方の存在を制限エンドヌクレアーゼ解析で確認
する。確認されたプラスミドＤＮＡをｐ２５／ＲＢＳ
ＩＩと命名した。プラスミドｐ２５ ＲＢＳ ＩＩの構
築を図３に図示する。 【００７５】ベクターｐ２５ ＲＢＳ ＩＩを保有する
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ中でのたん白合成を図４に示す。
ここで明かなように、プロモーターＰG25 を含むＥｃｏ
ＲＩ断片は余分のリボゾーム結合部位を含有し、その結
果ｃａｔ遺伝子の端まで伸びた融合たん白を生成する。
この直接の影響としてＲＢＳ ＩＩの効率を極端に低下
させる。従ってＰG25 の近接リボゾーム結合部位の翻訳
フレームを次の様に改修してＳＲＢＳ ＩＩからのたん
白合成を最大となるようにした。 【００７６】（ＩＶ） ２μｇのプラスミドｐ２５／Ｒ
ＢＳ ＩＩを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ ＩＩＩ
で完全消化する。４つのｄＮＴＰ存在下ＤＮＡポリメラ
ーゼクレナウ断片と反応させてＨｉｎｄ ＩＩＩ末端を
平滑末端とする。これらの平滑末端に１２塩基対Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩリンカーを結合し、結合生成物をＨｉｎｄＩ
ＩＩで完全消化する。このＤＮＡを１μｇ／ｍｌのエチ
ジウムブロミド含有の１％低温融解アガロースゲルの電
気泳動にて分画する。泳動後ＤＮＡを蛍光で確認し、ゲ
ルより切り出してアガロースから精製する。得られるＤ
ＮＡを再び結合し、結合生成物をＥ．ｃｏｌｉ ＡＢ１
１５７株に導入する。形質転換株を１００μｇ／ｍｌの
クロラムフェニコール含有ＬＢ寒天上で選択する。クロ
ラムフェニコール耐性コロニーよりプラスミドＤＮＡを
単離し、新たに出来たＨｉｎｄＩＩＩ部位を制限酵素解
析で確認する。このように確認されたプラスミドＤＮＡ
をｐ２５* ＲＢＳ ＩＩと命名した。プラスミドｐ２５
* ＲＢＳ ＩＩの構築を図３に示す。 【００７７】（Ｖ） プラスミドｐ２５* ＲＢＳ ＩＩ
をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコンピーテン
ト細胞に導入し、形質転換株を１０μｇ／ｍｌクロラム
フェニコール含有ＬＢ寒天上で選択する。クロラムフェ
ニコール耐性コロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、
その構造がＥ．ｃｏｌｉから単離したｐ２５* ＲＢＳＩ
Ｉと同一であることを制限酵素解析により決定する。 【００７８】（ＶＩ） Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのクロラ
ムフェニコール耐性コロニーの夫々を１０μｇ／ｍｌク
ロラムフェニコール含有Ｌ−ブロス中で培養し、これら
のコロニーにより合成される全たん白をＳＤＳ／ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で分析する。大腸菌ファージ
Ｔ５プロモーターＰG25 を合成リボゾーム結合部位−Ｄ
ＮＡ配列ＳＲＢＳ ＩＩと合わせて使用すると、ＳＲＢ
Ｓ ＩＩの近接の部位で翻訳が開始し、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｃａｔ遺伝子の天然の停止コドンで停止する融合ＣＡＴ
たん白の合成が確認できる。そのような分析結果は図５
に示す。 【００７９】実施例 ６ Ｅ．ｃｏｌｉプロモーターのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｒ
ＮＡポリメラーゼによるインビトロ解析 【００８０】表１に使用したプロモーターを示した。こ
れらのプロモーターの性能をインビトロの“ラン−オ
フ”転写により測定し、その結果を図６に示す。それぞ
れのケースでプロモーターのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ δ
55 ＲＮＡポリメラーゼによる利用を異なるイオン強度
で測定して２００ｍＭ ＮａＣｌに於けるＥ．ｃｏｌｉ
ＲＮＡポリメラーゼによる転写効率と比較した。転写測
定の反応液はプロモーターの他に既にＢ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ δ55 ＲＮＡポリメラーゼにより効率よく利用さ
れるとわかっているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｖｅｇプロ
モーターを含有する（Ｍａｒａｎ Ｊｒ．ら、Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６巻、３３９〜３４６
頁〔１９８２年〕）。図６のデータから明かなように、
試験したプロモーターは全てその程度は異なるがＢ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＮＡポリメラーゼにより認識され
る。大腸ファージＴ５プロモーターＰN26 およびＰK28a
／Ｐ K28bの場合、転写はｖｅｇプロモーターからの場合
より強いかも知れない。さらに、塩濃度のプロモーター
効率に対する影響も明かである。５０ｍＭ ＮａＣｌで
はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＲＮＡポリメラーゼは試験し
たプロモーターから転写を開始するばかりか、ｐＢＲ３
２２ベクターＤＮＡの“ｂｌａ”および“ｏｒｉ”プロ
モーターからも開始する（予備試験ではプロモーターは
全てｐＢＲ３２２由来のベクターに挿入している：それ
らのプラスミドは切断して常に３５０ヌクレオチドの
“ｂｌａ”転写物と大腸菌ファージＴ５プロモーターか
らの種々の長さの転写物を生成する。）。塩濃度が上が
るに伴ない、プロモーターの効率はｖｅｇと大腸菌ファ
ージＴ５プロモーターの間ではっきりと分かれる。図６
の結果が生菌中でも成り立つかどうか調べるため大腸菌
ファージＴ５プロモーター、或いは大腸菌ファージＴ７
のＡ１プロモーターがベクターｐ２５* ＲＢＳ ＩＩ
（図３）のＰG25 プロモーターの代わりとなり、Ｂ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ中でＣＡＴ合成を確認できる。 【００８１】実施例 ７ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25 と可動性リボゾ
ーム結合部位−合成ＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ、９Ａとを
含有するベクターｐ６０２／１８の構築 【００８２】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＤＳ５／Ｒ
ＢＳ ＩＩ、９Ａを制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ Ｉ
およびＸｂａ Ｉで完全１μｇ／ｍｌのエチジウムブロ
ミド含有１％低温融解アガロースゲルで電気泳動にかけ
て分画する。電気泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で確認
し、およそ１．０Ｋｂの下の方のバンドを切り出す。Ｄ
ＮＡ断片をアガロースより精製する。 【００８３】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ２５* Ｒ
ＢＳ ＩＩを同じように制限酵素Ｘｈｏ ＩおよびＸｂ
ａ Ｉで完全消化し、１μｇ／ｍｌエチジウムブロミド
含有の１％低温融解性アガロースゲルで分画する。蛍光
でＤＮＡバンドを確認し、およそ４．６Ｋｂの上のバン
ドを切り出してアガロースより精製する。 【００８４】（ＩＩＩ） 実施例７（Ｉ）および（Ｉ
Ｉ）で調製したＤＮＡ断片の等モル量を結合し、結合生
成物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコンピー
テント細胞に導する。１０μｇ／ｍｌのカナマイシンお
よび１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに耐性な形
質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、１．０Ｋｂの
Ｘｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片の存在を分析する。確認さ
れたプラスミドをｐ６０２／１８と命名した。ｐ６０２
／１８の構築を図７に図示する。 【００８５】（ＩＶ） プラスミドｐ６０２／１８を含
有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／ｍ
ｌクロラムフェニコール含有Ｌ−ブロス中で培養し、培
養物により生成された全たん白質をＳＤＳ／ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により分析する。大腸菌ファージ
プロモーターＰN25 とリボゾーム結合部位をコードする
合成ＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ、９Ａ、とが利用されたこ
とは、ＲＢＳ ＩＩ、９Ａ、の近接に始まり、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ｃａｔ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで終了する
融合ＣＡＴたん白の合成により確認される。分析結果は
図９に示す。 【００８６】実施例 ８ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25 とリボゾーム結
合部位をコードする可動性合成ＤＮＡ配列ＲＢＳ Ｉ
Ｉ、３Ａ＋５Ａを含むベクターｐ６０２／１９の構築 【００８７】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＤＳ５／Ｒ
ＢＳ ＩＩ、３Ａ＋５Ａを制限エンドヌクレアーゼＸｈ
ｏ ＩおよびＸｂａ Ｉで完全消化し、１μｇ／ｍｌの
エチジウムブロミドを含む１％低温融解アガロースゲル
の電気泳動により分画する。電気泳動後、ＤＮＡバンド
を蛍光により検出し、およそ１．０Ｋｂの下のバンドを
切り出す。本断片をアガロースより精製する。（ＩＩ）
２μｇのプラスミドｐ２５* ＲＢＳ ＩＩを同様に制
限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａ Ｉで完全消化し、１μｇ
／ｍｌのエチジウムブロミド含有の１％低温融解アガロ
ースゲルの電気泳動で分画する。ＤＮＡバンドを蛍光に
より検出し、およそ４．７Ｋｂの上部バンドを切り出し
てアガロースより精製する。 【００８８】（ＩＩＩ） 実施例８の（Ｉ）および（Ｉ
Ｉ）で精製したＤＮＡ断片を等モル量ずつ結合し、結合
生成物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコンピ
ーテント細胞に導入する。１０μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンおよび１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールに耐性
な形質転換株よりプラスミドＤＮＡを精製し、１．０Ｋ
ｂのＸｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片の存在を確認する。確
認できたプラスミドＤＮＡをｐ６０２／１９と命名し
た。ｐ６０２／１９の構築を図７に示す。 【００８９】実施例 ９ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25 およびリボゾー
ム結合部位をコードする可動性ＤＮＡ配列ＲＢＳ ＩＩ
を含有するベクターｐ６０２／２０の構築 【００９０】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＤＳ８／Ｒ
ＢＳ ＩＩを制限酵素Ｘｈｏ ＩおよびＸｂａ Ｉで完
全消化した後、１μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドを含
む１％低温融解アガロースゲルの電気泳動で分画する。
電気泳動後ＤＮＡバンドを蛍光で検出し、下のおよそ
２．０Ｋｂのバンドを切り出す。次にその断片をアガロ
ースより精製する。 【００９１】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ２５* Ｒ
ＢＳ ＩＩを同じように制限酵素Ｘｈｏ ＩおよびＸｂ
ａ Ｉで完全消化した後、１μｇ／ｍｌのエチジウムブ
ロミド含有の１％低温融解アガロースゲル電気泳動にて
分画する。ＤＮＡバンドを蛍光で検出し、上のおよそ
４．７Ｋｂのバンドを切り出し、アガロースより精製す
る。 【００９２】（ＩＩＩ） 実施例９の（Ｉ）および（Ｉ
Ｉ）で調製したＤＮＡ断片の等モル量を結合し、結合生
成物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコンピー
テント細胞に導入する。１０μｇ／ｍｌのカナマイシン
および１０μｇ／ｍｌのトリメトプリムに耐性を示す形
質転換株よりプラスミドＤＮＡを精製し、２．０Ｋｂの
Ｘｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片の存在を分析する。そのよ
うな性質が確認されたプラスミドＤＮＡをｐ６０２／２
０と命名した。ｐ６０２／２０の構築を図８に示す。 【００９３】（ＩＶ） プラスミドｐ６０２／２０を含
有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／ｍ
ｌのカナマイシンを含むＬ−ブロス中で培養し、生成す
る全たん白質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析する。大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25
とリボゾーム結合部位をコードする合成ＤＮＡ配列ＲＢ
Ｓ ＩＩの利用はＲＢＳ ＩＩの近接から開始し、ｄｈ
ｆｒ遺伝子の天然の翻訳停止コドンで終了する融合ＤＨ
ＦＲたん白の合成により確認できる。分析結果を図９に
示す。 【００９４】実施例 １０ 大腸菌ファージＴ５プロモーターＰN25 とリボゾーム結
合部位をコードする可動性合成ＤＮＡ配列ＲＢＳ Ｉ
Ｉ、３Ａ＋５Ａを含有するベクターｐ６０２／２１の構
築 【００９５】（Ｉ） ２μｇのプラスミドｐＤＳ８／Ｒ
ＢＳ ＩＩ、３Ａ＋５Ａを制限エンドヌクレアーゼＸｈ
ｏ ＩおよびＸｂａ Ｉで完全消化した後、１μｇ／ｍ
ｌのエチジウムブロミドを含む１％低温融解アガロース
ゲルの電気泳動にかけて分画する。電気泳動後ＤＮＡバ
ンドを蛍光で検出し、下のおよそ２．０Ｋｂのバンドを
切り出してアガロースから精製する。 【００９６】（ＩＩ） ２μｇのプラスミドｐ２５* Ｒ
ＢＳ ＩＩを同様に制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａ Ｉ
で完全消化し、消化物を１μｇ／ｍｌのエチジウムブロ
ミド含有１％低温融解アガロースゲルで分画する。電気
泳動後、ＤＮＡバンドを蛍光で検出して下のおよそ２．
０Ｋｂのバンドを切り出し、アガロースより精製する。 【００９７】（ＩＩＩ） 実施例１０、（Ｉ）および
（ＩＩ）により精製したＤＮＡ断片を等モル量結合し、
結合生成物をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株のコ
ンピーテント細胞に導入する。１０μｇ／ｍｌのカナマ
イシンおよび１０μｇ／ｍｌのトリメトプルムに耐性な
形質転換株よりプラスミドＤＮＡを単離し、２．０Ｋｂ
のＸｈｏ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ断片の存在を分析する。性質
が確認されたプラスミドＤＮＡをｐ６０２／２１と命名
した。ｐ６０２／２１の構築を図８に図示する。 【００９８】（ＩＶ） プラスミドｐ６０２／２１を含
有するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのコロニーを１０μｇ／ｍ
ｌカナマイシン含有のＬ−ブロス中で培養し、合成され
た全たん白質をＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析する。大腸菌ファージＴ５のプロモーターＰ
N25 とリボゾーム結合部位をコードする合成ＤＮＡ配列
ＲＢＳ ＩＩ、３Ａ＋５Ａの有効性はＲＢＳ ＩＩ、３
Ａ＋５Ａのすぐ近接より開始し、ｄｈｆｒ遺伝子の天然
の停止コドンで停止した融合ＤＨＦＲたん白の合成で確
認される。分析の結果は図９に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】基本的なＥ．ｃｏｌｉ／Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ
シャトルベクターｐ６０２／５の構築を示す模式図であ
る。 【図２】一般の発現ベクターｐ６０２／７およびｐ６０
２／２５、ならびにベクターｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉ
およびｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩの構築を示す模式図
である。 【図３】ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ、ｐ２５ ＲＢＳ
ＩＩおよびｐ２５* ＲＢＳＩＩの構築を示す模式図で
ある。 【図４】発現ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ、ｐ２５ Ｒ
ＢＳ ＩＩおよびｐ２５* ＲＢＳ ＩＩを含有するＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株で生産される全たん白
質を示す電気泳動パターンである。 【図５】ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ、ｐ２５ ＲＢＳ
ＩＩおよびｐ２５* ＲＢＳＩＩを含有するＢ．ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ中で生産されるＣＡＴたん白質合成を示す模
式図である。 【図６】表１に示したプロモーターのインビトロ系転写
解析を示す電気泳動パターンである。 【図７】シャトルベクターｐ６０２／１８およびｐ６０
２／１９の構築を示す模式図である。 【図８】シャトルベクターｐ６０２／２０およびｐ６０
２／２１の構築を示す模式図である。 【図９】プラスミドｐ６０２／１８、ｐ６０２／１９、
ｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１を含有するＢ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株により生産される全たん
白質を示す電気泳動パターンである。
シャトルベクターｐ６０２／５の構築を示す模式図であ
る。 【図２】一般の発現ベクターｐ６０２／７およびｐ６０
２／２５、ならびにベクターｐ６０２／７ ＲＢＳ Ｉ
およびｐ６０２／７ ＲＢＳ ＩＩの構築を示す模式図
である。 【図３】ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ、ｐ２５ ＲＢＳ
ＩＩおよびｐ２５* ＲＢＳＩＩの構築を示す模式図で
ある。 【図４】発現ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ、ｐ２５ Ｒ
ＢＳ ＩＩおよびｐ２５* ＲＢＳ ＩＩを含有するＢ．
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株で生産される全たん白
質を示す電気泳動パターンである。 【図５】ベクターｐ２５ ＲＢＳ Ｉ、ｐ２５ ＲＢＳ
ＩＩおよびｐ２５* ＲＢＳＩＩを含有するＢ．ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ中で生産されるＣＡＴたん白質合成を示す模
式図である。 【図６】表１に示したプロモーターのインビトロ系転写
解析を示す電気泳動パターンである。 【図７】シャトルベクターｐ６０２／１８およびｐ６０
２／１９の構築を示す模式図である。 【図８】シャトルベクターｐ６０２／２０およびｐ６０
２／２１の構築を示す模式図である。 【図９】プラスミドｐ６０２／１８、ｐ６０２／１９、
ｐ６０２／２０およびｐ６０２／２１を含有するＢ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ ＢＲ１５１株により生産される全たん
白質を示す電気泳動パターンである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:125）
(56)参考文献 Ｇｅｎｅ，26（1983），ｐ．313−315
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｍ
ｐ．，48（1983），ｐ．233−244
Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．，12（1984），ｐ．3585−601
(58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 51/90
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．原核または真核性ポリペプチドの製造方法であっ
て、（ａ）宿主を、転写の下流方向に、大腸菌ファージ
Ｔ５またはＴ７プロモーター、式、 【化１】を有するリボソーム結合部位−コード合成ＤＮＡ配列、
前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、およびＥ．
ｃｏｌｉ由来ｔ0 、Ｔ１、Ｔ２またはＴ７ターミネータ
ーを有してなるグラム陽性菌発現調節ＤＮＡ配列を含む
発現ベクターにより形質転換し；そして（ｂ）該形質転
換体を適当な生育条件下で培養し、誘導されるポリペプ
チドを培養物から単離することを含んでなるポリペプチ
ドの製造方法。 ２．ベクターが、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓの株において複写可能なプラスミド性シャトルベク
ターである特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．シャトルベクターが、ｐ２５ＲＢＳ Ｉである特許
請求の範囲第２項に記載の方法。 ４．シャトルベクターが、ｐ２５ＲＢＳ ＩＩである特
許請求の範囲第２項に記載の方法。 ５．シャトルベクターが、ｐ２５* ＲＢＳ ＩＩである
特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ６．シャトルベクターが、ｐ６０２／１８である特許請
求の範囲第２項に記載の方法。 ７．シャトルベクターが、ｐ６０２／１９である特許請
求の範囲第２項に記載の方法。 ８．シャトルベクターが、ｐ６０２／２０である特許請
求の範囲第２項に記載の方法。 ９．シャトルベクターが、ｐ６０２／２１である特許請
求の範囲第２項に記載の方法。 １０．ポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼである特許請求の範囲
第１項〜７項のいずれか一つに記載の方法。 １１．ポリペプチドが、マウスジヒドロ葉酸還元酵素で
ある特許請求の範囲第１項、８項または９項のいずれか
一つに記載の方法。
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| US6146848A (en) * | 1998-07-23 | 2000-11-14 | The Hong Kong University Of Science & Technology | Bacterial expression system |
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| US7618799B2 (en) | 2007-01-31 | 2009-11-17 | Dow Global Technologies Inc | Bacterial leader sequences for increased expression |
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| SG11202002989SA (en) | 2017-10-27 | 2020-05-28 | Pfenex Inc | Bacterial leader sequences for periplasmic protein expression |
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｕｍｐ．，４８（１９８３），ｐ．２３３−２４４ |
| Ｇｅｎｅ，２６（１９８３），ｐ．３１３−３１５ |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１２（１９８４），ｐ．３５８５−６０１ |
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