JP2554459B2 - β−ウロガストロン遺伝子、対応プラスミド組換体及び対応形質転換体 - Google Patents

β−ウロガストロン遺伝子、対応プラスミド組換体及び対応形質転換体

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、β−ウロガストロン遺伝子、対応プラスミ
ド組換体及び対応形質転換体に関する。
β−ウロガストロンは、ヒトの唾液線等で合成される
ポリペプチドホルモンであり（例えばHeitz et al.Gu
t,19,408〜413（1978）参照）、その一次構造は下記配
列のアミノ酸53個からなり、分子内に３個のジスルフイ
ド結合を有する（H.Gregory et al.Int.J.Peptide P
rotein Res.,９,107〜118（1977）参照）。
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg 尚、本明細書において、アミノ酸の略号は、下記のも
のを示す。
Asn:アスパラギン、Ser:セリン Asp:アスパラギン酸、Glu:グルタミン酸 Cys:スシテイン、Pro:プロリン Leu:ロイシン、His:ヒスチジン Gly:グリシン、Tyr:チロシン Val:バリン、Met:メチオニン Ila:イソロイシン、Ala:アラニン Lys:リジン、Gln:グルタミン Arg:アルギニン、Trp:トリプトフアン Phe:フエニルアラニン β−ウロガストロンは、胃酸分立抑制、細胞生長促進
等の生理活性を有する（Elder et al,Gut,16,887〜89
3（1975）参照）。従つて、β−ウロガストロンは、潰
瘍及び創傷の治療薬として有用である。
従来技術 現在、β−ウロガストロンの製造は、これがヒト尿中
に少量排泄されることから、尿から抽出、分離、精製す
ることにより行なわれている。しかしながら、この方法
では量的に多くのものを得るのが困難であること、多種
成分からの精製であるため高純度のものを得るのが困難
であること等の問題点がある。従つて、β−ウロガスト
ロンを大量にしかも高純度で製造することが要望されて
いる。
解決手段 本発明者は、上記現状に鑑み、鋭意研究した結果、β
−ウロガストロン遺伝子を設計、合成し、ベクターに組
み込み、形質転換し、発現させるという一連の遺伝子工
学的手法を用いることにより、上記要望に十分対処でき
ることを見出し、本発明を完成するに至つた。
発明の構成及び効果 本発明は、特定の塩基配列であるβ−ウロガストロン
遺伝子、 上記β−ウロガストロン遺伝子の上流に、該遺伝子の
発現を制御するプロモーター及びSD配列を連結したもの
をプラスミドベクターに挿入したプラスミド組換体、並
びに β−ウロガストロン遺伝子を発現し得る上記プラスミ
ド組換体を、宿主細胞に形質転換させた形質転換体に係
る。
本発明における宿主細胞としては、特に限定されない
が、例えば大腸菌、枯草菌、シュードモナス、酵母等を
挙げることができ、之等の内特に大腸菌が好ましい。
前記β−ウロガストロンのアミノ酸配列に従い形質転
換体内で発現されるに適切な遺伝子の塩基配列の設計
は、下記基準により行なつた。
（１）宿主細胞、特に大腸菌により用いられる頻度が高
いトリヌクレオチドコドンを選択使用する。
（２）遺伝子内及びその両端に特定の制限酵素認識部位
を持たせ、任意のその部位を操作し、他の遺伝子との連
結、プラスミドベクターへの挿入が行なわれ易い様にす
る。
（３）合成した遺伝子を集合、連結させる場合に、目的
とする連結状態とは異なる遺伝子の連結がないか又は最
小限度にできる様にする。
（４）β−ウロガストロンが融合蛋白質として発現する
場合、不要な融合物を容易に切り離せる手段がある様に
する。
上記基準を考慮してβ−ウロガストロン遺伝子の構成
部分として選択された好ましい塩基配列の具体例（遺伝
子Ｉとする）を下記に示す。
遺伝子Ｉ 尚、本明細書において、塩基の略号は、Ａがアデニ
ン、Ｇがグアニン、Ｃがシトシン、Ｔがチミンをそれぞ
れ示す。
上記遺伝子Ｉは、β−ウロガストロンのアミノ酸配列
に対応する本発明β−ウロガストロン遺伝子である。
上記遺伝子Ｉを用いて実際にβ−ウロガストロンを発
現させる場合には、発現に必要なプロモーター、SD配
列、ベクター等との連結を考慮して、上記遺伝子の前後
に制限酵素認識部位を付加する必要がある。制限酵素認
識部位としては、特に限定されず、任意のもので良い。
上記遺伝子Ｉの前後に開始コドン、終止コドン及び制
限酵素認識部位を付加したものの具体例（遺伝子IIとす
る）を該認識部位と共に下記に示す。
尚、上記において制限酵素の略号は、下記のものを示
す。
E:EooR I、Ta:Taq I Bg:BgI II、S:Sau3A I Mb:Mbo I、Hf:Hinf I Ba:BamH I、Hd:Hind III Ml:Mlu I、Th:Tha I 上記遺伝子IIを構築するに当つては、遺伝子IIを前半
部と後半部に分けて行なうのが有利である。その具体例
について説明する。
まず、遺伝子IIの塩基配列に従い、且つ前半部の最後
に制限酵素認識部位を付加することを考慮して、塩基数
が11個、13個又は15個のオリゴヌクレオチド（Ａ−１〜
Ａ−16及びＢ−１〜Ｂ−16の合計32個）を合成する。次
に、これを４〜６個集合、連結させてブロツク（ブロツ
ク１〜ブロツク７の合計７個）とする。各オリゴヌクレ
オチド及び各ブロックを下記に示す。
次に、ブロック１〜３を連結してサブユニツトＡを、
ブロツク４〜７を連結してサブユニツトＢを構築する。
各サブユニツトを下記に示す。
サブユニツトＡは、遺伝子IIの前半部の最後に制限酵
素BamH I認識部位を付加したものであり、サブユニツト
Ｂは、遺伝子IIの制限酵素Hind III認識部位以降の後半
部である。
前記各オリゴヌクレオチドは、公知の方法により合成
することができる。一例として、固相法による合成の概
略を以下に述べる（例えばH.Ito等、Nucleic Acids R
esearch,10,1755〜1769（1982）参照）。
即ち、固相法によるオリゴヌクレオチドの合成は、ポ
リスチレン樹脂に担持されたヌクレオシドに順次モノヌ
クレオチド又はジヌクレオチドをカツプリングさせて所
定の塩基配列とすることにより行なわれる。
ヌクレオシド担持樹脂の作製には、例えばバイオラド
ラボラトリーズ社製の１％架橋ポリスチレン樹脂「Ｓ−
X1」（200〜400メツシユ）を使い、Ｎ−（クロロメチ
ル）フタルイミドをトリフルオロメタンスルホン酸触媒
下反応させ、次にヒドラジンと反応させてアミノメチル
化ポリスチレン樹脂を得る。これのアミノ基にコハク酸
をスペーサーとして５′水酸基とアミノ基を保護したヌ
クレオシドをつなぐことによりヌクレオシド担持樹脂を
得る。
一方モノヌクレオチド、ジヌクレオチドの合成は種々
の方法が知られている（例えばC.Broka等、Nucleic Ac
ids Research,８,5461〜5471（1980）参照）。例え
ば、モノヌクレオチドは、ｏ−クロロフエニルリン酸ジ
クロリデート、トリアゾール及び５′−OH基をジメトキ
シトリチル基（DMTr）で保護したヌクレオシドをトリエ
チルアミン存在下に反応させて得られるモノトリアゾラ
イドに、１−メチルイミダゾールを触媒としてβ−シア
ノエタノールを反応させ、反応物をシリカゲルのカラム
クロマトグラフイーにかけて２〜５％のメタノールを含
んだクロロホルムで溶出して完全に保護されたモノヌク
レオチドを収率70〜80％で得ることができる。
次に、ジヌクレオチドは、上記で得られる完全に保護
されたモノヌクレオチドをベンゼンスルホン酸等の酸で
処理して５′−OH基をフリーにし、これを先ほど得たモ
ノトリアゾライドと反応させた後、反応物をシリカゲル
カラムクロマトグラフイーにかけ、２〜５％のメタノー
ルを含んだクロロホルムで溶出して完全に保護されたジ
ヌクレオチドを60〜80％の収率で得ることができる。
オリゴヌクレオチドの固相合成は、例えばBachem社製
DNA合成機を用いて行なうのが有利である。先に得たヌ
クレオチド担持樹脂を反応管に入れ、ジクロロメタン−
イソプロパノール（85:15）で洗浄後、臭化亜鉛（1M）
のジクロロメタン−イソプロパノール溶液を加えて５′
位のジメトキシトリチル基をはずす。溶液の着色がなく
なるまで数回行なう。ジクロロメタン−イソプロパノー
ル（85:15）で洗浄後更に残つているZn2+を除去するた
めに酢酸トリエチルアンモニウム（0.5M）のジメチルホ
ルムアミド溶液で洗浄し、更にテトラヒドロフランで洗
浄後窒素ガスを数分通して樹脂を乾燥させる。別途、完
全に保護されたジヌクレオチド又はモノヌクレオチドを
ピリジンに溶かしトリエチルアミンを加えて、振りまぜ
て室温で数時間放置した後、溶液を減圧留去し、内容物
をピリジンで数回共沸させてトリエチルアンモニウム塩
にしておく。これをメシチレン−スルホニル−５−ニト
ロトリアゾール（0.3M）（MSNT、縮合剤）のピリジン溶
液に溶かし、先ほど乾燥させた樹脂に加え、60分間室温
で反応させる。反応終了後反応液を除き、ピリジンで洗
浄後ジメチルアミノピリジン（0.1M）のテトラヒドロフ
ラン−ピリジン溶液と無水酢酸の混合液中で５分間放置
し、未反応の水酸基をマスクする。最後に樹脂をピリジ
ンで洗浄し固相合成法の１サイクルが終了する。１サイ
クルで１個又は２個鎖長を伸ばすことが出来る。同様の
操作を繰り返し所定の長さになるまでモノヌクレオチド
又はジヌクレオチドを順次縮合させることにより完全に
保護されたオリゴヌクレオチドを樹脂に担持された状態
で得ることができる。
得られた樹脂にテトラメチルグアニジウム−２−ピリ
ジンアルドキシメート（0.5M）のピリジン−水（90:1
0）溶液を加えて40℃で１時間放置する。そしてパスツ
ールピペツトに綿プラグをつめたものを通して樹脂を分
別し樹脂をピリジンとエタノールで交互に洗浄し、洗浄
液を液と合わせて減圧下40℃で濃縮する。残留物を10
mMトリエチルアンモニウム・２炭酸塩水溶液（TEAB）に
溶かしエーテルで洗浄する。水層をセフアデツクスＧ−
50カラムクロマトグラフイーにかけ10mM TEAB溶液で抽
出する。各フラクシヨンの吸光度を260nmで測定し、一
番最初に溶出してきたピークを含むフラクシヨンを濃縮
する。残渣を例えば高速液体クロマトグラフイーを用い
て単一ピークになるまで分取精製する。このようにして
精製されたオリゴヌクレオチドは、５′−末端がまだジ
メトキシトリチル基で保護されているので、80％酢酸水
溶液で15分間処理して脱ジメトキシトリチル化後、再度
高速液体クロマトグラフイー等を用いて単一ピークにな
るまで精製する。
上記固相法によるオリゴヌクレオチドの合成の概略を
下記製造行程式に示す。
かくして精製されたオリゴヌクレオチドは、ホモクロ
マトグラフイーによる２次展開法及びマキサム・ギルバ
ート法により各々の塩基配列を確認した後、ブロツク、
サブユニツトの作成に用いる。
２次展開法による塩基配列の確認は、Wu等の方法〔E.
Jay,R.A.Bambara,R.Padmanabhan and R.Wu,Nucleic
Acids Res.,１,331（1974）〕により行なうことができ
る。
この方法は、まずオリゴヌクレオチドを凍結乾燥した
のに、蒸留水を加えて溶かし約0.1μg/μとなるよう
にする。この一部をとりγ−32P−ATPとT4ポリヌクレオ
チドキナーゼにより５′端を32Pでラベルし、次いで蛇
毒フオスフオジエステラーゼによる部分分解を行なう。
これを酢酸セルロース膜にスポツトし、一次元目として
電気泳動を行なうことによつて塩基の違いによる分離を
行なつた後、ジエチルアミノエチルセルロース（DEAEセ
ルロースプレート）に移行させ、ホモミツクスチヤーと
呼ばれるRNAの限定分解物で二次元目の展開を行なう
（この操作をホモクロマトラフイーと称する）ことによ
つてオリゴヌクレオチドの鎖長による分離を行なうもの
である。さらにオートラジオグラフイーによつてオリゴ
ヌクレオチドの塩基配列を５′端から読みとるものであ
る。このような方法で確認しにくい場合には、必要に応
じて、マキサム・ギルバート法を用いて解析する（A.M.
Maxam and W.Gilbert、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,74,
560（1977）,A.M.Maxam and W.Gilbert,Methods in
Enzymol.,Vol65,p499,Academic Press 1980）。
これは化学的分解法とも呼ばれるもので、塩基に特異
的な反応を用いてその塩基の位置で切断されるように
し、電気泳動によつて現われたバンドにより順次５′あ
るいは３′側から配列を読むものである。塩基に特異的
な反応としては、グアニンが硫酸ジメチルにより特異的
にメチル化され、グアニンとアデニンが共に酸により脱
プリン反応すること、及びチミンとシトシンがヒドラジ
ンによる反応において低塩条件では両者共反応するが、
高塩条件ではヒドラジンはシトシンとのみ反応すること
を利用する。以上の４種の塩基に対する反応終了後、ピ
ペリジンと反応させて分解、置換、β−脱離等の反応に
よりその塩基の位置でのDNA鎖の切断が起こる。ポリア
クリルアミドゲルによる電気泳動を上記４種の反応物に
ついて行ない生じたバンドがどの反応において生じるか
によつて塩基組成を読みとることができる。
次に各オリゴヌクレオチドを連結する。即ち、オリゴ
ヌクレオチドを正しく連結させるためにサブユニツトＡ
に対応する前記Ａ−１〜Ａ−16の16種のオリゴヌクレオ
チドを第１図に示すようにＡ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ
−14、Ａ−15及Ａ−16からなるブロツク１とＡ−４、Ａ
−５、Ａ−６、Ａ−11、Ａ−12及びＡ−13からなるブロ
ツク２並びにＡ−７、Ａ−８、Ａ−９及びＡ−10からな
るブロツク３の３組に分けて連結し、正しく結合したと
思われる大きさのものを分離して後、これらをさらに連
結して、サブユニツトＡを得る。詳細に述べるとＡ−１
〜Ａ−16の16種のオリゴヌクレオチドの５′端の一部を
γ−32P−ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて32
Pラベル後ATPで残りの５′端のOHをリン酸化する。次い
で上記３組のブロツクごとにT4DNAリガーゼとATPを用い
て４℃で一晩置くことによつて連結したものを得、これ
を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なうことに
よつて分離し、これをさらに４℃にて一晩T4DNAリガー
ゼとATPを用いて連結する。Ａ−１及びＡ−９の５′末
端は制限酵素の認識部位のため回転対称体となつており
ダイマー構造をとりうる。従つて、最終的に得られたＡ
−１〜Ａ−16の連結物を制限酵素のEcoR IとBamH Iを用
いて切断し、サブユニツトＡを得る。これは一部32Pが
入つており、又量的にも少ないため、第１図に示す様
に、ベクターとしてpBR322をEcoR IとBamH Iで切断しこ
れにサブユニツトＡを組込む形でpUG1というプラスミド
組換体を作成する。サブユニツトＢでもサブユニツトＡ
と同様に前記Ｂ−１〜Ｂ−16の16個のオリゴヌクレオチ
ドを第２図のように４組のブロツクに分けて連結し、こ
れらをさらに連結する。これを制御酵素のHind IIIとBa
mH Iを用いて切断し、サブユニツトＢを得る。この場合
もサブユニツトＡと同じ理由で、第２図の通り、pBR322
をHind IIIとBamH Iで切断し、これにサブユニツトＢを
組込む形でpUG2というものを作成する。
さらに第３図のように、pUG1をHindb IIIIとSal Iで
切断し、これにpUG2から同じ制限酵素で取り出したもの
を組込んでβ−ウロガストロンの構造遺伝子をもつpUG3
を作成する。
pUG1、pUG2及びpUG3はそれぞれベクターであるpBR322
にβ−ウロガストロンの構造遺伝子の前半部であるサブ
ユニツトＡ、後半部であるサブユニツトＢ及び全構造遺
伝子を組込んだものである。これらのプラスミドはカル
シウム法による形質転換法〔E.Lederberg,S.Cohen,J.Ba
cteriol.,119,1072（1974）〕によつて大腸菌HB101株に
入れて大量に増やすことが出来る。
pUG1、pUG2及びpUG3が宿主中に存在するかどうかの確
認は、さらにアルカリ抽出法によつてプラスミドを分取
したあとpUG1とpUG2についてはベクターpBR322上には存
在しないBgl IIの認識部位があるかどうかで判断出来
る。又pUG2とpUG3は同じくpBR322上にないMlu Iで切断
されるかどうかによつても判断出来る。アルカリ抽出法
について説明すると、大腸菌を37℃で培養後集菌し、リ
ゾチームを働かせて外膜を溶かし、0.2N水酸化ナトリウ
ム、１％ラウリル硫酸ナトリウム混液でDNAを変性さ
せ、3Mの酢酸ナトリウムpH4.8で中和したときに、染色
体由来のDNAは変性したままであるが核外プラスミドは
もとに戻るという性質を利用してプラスミドをとる方法
である。大量に高純度のプラスミドを得る場合には、こ
れをさらに塩化セシウムと臭化エチジウムによる密度勾
配超遠心分離及びバイオゲル（Biogel）A50mカラムを通
すことによりRNAと分離出来る。
かくして、β−ウロガストロン遺伝子が得られる。
次に、β−ウロガストロン遺伝子を宿主細胞に形質転
換して発現させる方法について述べる。宿主細胞として
は、公知のものをいずれも使用できるが、大腸菌を用い
るのが好ましい。
β−ウロガストロン遺伝子を、大腸菌を用いて発現さ
せる様式としては、β−ウロガストロンを直接発現させ
る形、β−ラクタマーゼ等の異種タンパクとの融合タン
パクとして発現させる系等を挙げることができる。
β−ウロガストロン遺伝子を直接発現させるために
は、該遺伝子を働かせるためのプロモーター及びSD配列
を該遺伝子の上流に導入する必要がある。プロモーター
としては、特に限定されないが、発現性の高いタイプの
もの例えばαフアージの左向きのプロモーターであるλ
PL、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子の上流にあるla
c UV5等が好ましい。プロモーターとしてλPLを用いた
場合には、SD配列としては、特に限定されないが、AGGA
の４塩基配列を使用するのが好ましい。又、プロモータ
ーとしてlac UV5を用いた場合は、SD配列としてはlac U
V5とセツトとなつて存在しているものをそのまま利用す
るか、それを化学合成したものを用いるのが好ましい。
本発明におけるβ−ウロガストロン遺伝子直接発現系
として、λPL−SD配列−β−ウロガストロン遺伝子を用
いる場合について述べる。
この場合には、λPLは強力なプロモーターではあるが
〔J.Hedgpeth等,Molecular and General Genetics,1
63,197〜203（1978）〕、λPLプロモーターを組み込ん
だプラスミド単独では宿主の大腸菌に対して致死作用を
示すため致死作用を示さない条件で大腸菌を増殖させた
後に、λPLを働かせる必要がある。一方、λフアージ中
の遺伝子であるCI857は、λPLのオペレーターに作用す
るCIリプレツサーの温度感受性突然変異であり、低温
（30℃前後以下）においては、CIリプレツサーがλPLの
オペレーターに結合してプロモーターとしての活性を完
全に抑制するため大腸菌の増殖が可能となる。従つて、
この状態下で培養し、増殖させた後、高温（37℃以上）
にすることにより（ヒートインダクシヨンという）、CI
リプレツサーを変性失活させ、λPLプロモーターがはじ
めて働く状態とすることができる。また、pSC101等のst
ringentな複製機構をもつプラスミドとpBR322等のrelax
edな複製機構をもつプラスミドは不和合性を示すことな
く、同一大腸菌体内に共存し得る。
以上の点を考慮して、テトラサイクリン耐性を示すプ
ラスミドベクターpSC101にCI857遺伝子を組み込んだ
（その上流にlac UV5プロモーターを配してCI857が効率
的に発現するようにした）プラスミドpGH37を構築し、
それを大腸菌（HB101株）に入れて形質転換させたもの
（ECI−２株）を、β−ウロガストロン発現ベクターの
宿主として用いることが適切であると考えられた。
本発明によれば、λPL−SD配列−β−ウロガストロン
遺伝子を、例えばpBR322に組み込んで得られるβ−ウロ
ガストロン発現ベクターを用いてECI−２株を形質転換
することにより、大腸菌中に有用な２種のプラスミドを
保持させた所謂Two Plasmid Systemが完成される。
これにより、例えば30℃で培養した時点ではpGH37か
らのCIリプレツサーが第２のプラスミドに挿入している
λPLのオペレーターに結合することにより大腸菌自身の
増殖は可能となる。この状態で十分に増殖させた後、例
えば40℃に昇温させ培養すると、CIリプレツサーが失活
しオペレーターから解離するためλPLプロモーターが働
きだしてβ−ウロガストロンが発現されるようになる。
類似の考え方がフイブロブラストインターフエロン、
SV−40スモールｔ抗原等の発現に適用されたことはある
が、これらの例ではCI857遺伝子をになうのは宿主染色
体中に組み込まれたλ−フアージのDNAであり、換言す
れば、所謂λ溶原菌を宿主として用いたものである。
〔R.Derynck et al,Nature,287,193〜197（1980）、
C.Derom et al.Gene,17,45〜54（1982）、K.Kupper
et al,Nature,289,555〜559（1981）〕 それに対して、本発明の系では、テトラサイクリン耐
性を示す別のプラスミドに、CI857遺伝子をになわせて
いるので、宿主染色体中に組み込まれたλフアージが誘
発されて増殖するという危険性もなく、また菌株の管理
も容易であるという利点がある。勿論β−ウロガストロ
ン発現系に応用されたのは、はじめてである。
次に、β−ラクタマーゼ遺伝子の一部とβ−ウロガス
トロン遺伝子を連結し、β−ウロガストロン遺伝子を融
合タンパクとして発現させる場合について述べる。この
方法の利点としては、大腸菌内のプロテアーゼにより融
合タンパクが分解されにくいため結果的にβ−ウロガス
トロンが保護されること、融合タンパクが大腸菌内のペ
リプラズム層に移行蓄積し〔S.J.Chan et al,Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,78,5401〜5405（1981）〕活つ局在す
るために分離精製が容易になること等が挙げられる。
具体的には、β−ラクタマーゼ遺伝子中にある適当な
制限酵素切断部位に、融合タンパクからβ−ウロガスト
ロンを酵素で切り出して取り出すことができる様な酵素
切断部位となり得る塩基性アミノ酸２個をコードする遺
伝子を挿入した後、β−ウロガストロン遺伝子を連結す
れば良い。
上記において、塩基性アミノ酸２個の配列としては、
−Lys−Arg−又は−Arg−Lys−が好ましい。また、この
アミノ酸配列を認識してβ−ウロガストロンを融合タン
パクから切り出すための酵素としては、例えばカリクレ
イン、トリプシン等が挙げられる。更に、β−ラクタマ
ーゼ遺伝子を切断する制限酵素としては、例えばXmn
I、Hinc II、Sca I、Pvu I、Pst I、Bgl I、Ban I等が
挙げられる。
本発明により、上記の様に組み合わされたβ−ラクタ
マーゼ−β−ウロガストロン組換えプラスミドは、大腸
菌内で大量の融合タンパクを発現することができる。
上記発現系の確認は、遺伝子の塩基配列を直接マキサ
ム・ギルバート法で分析する方法、ミニプレパレーシヨ
ンやマツピング法による遺伝子挿入やその方向の確認
〔H.C.Birnboim等、Nucleic Acids Research,７,1513
〜1523（1979）〕、β−ウロガストロンに対するラジオ
イムノアツセイ等によつて行なうことができる。
かくして得られる本発明の形質転換体からは、これを
常法に従い培養することにより、所望のβ−ウロガスト
ロンを大量にしかも高純度で採取することができる。
実 施 例 以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明す
る。
実施例 １ β−ウロガストロン遺伝子の構築 ヌクレオシド担持樹脂の作製 １％架橋ポリスチレン樹脂〔バイオラドラボラトリー
ズ社製「Ｓ−X1」（200〜400メツシユ）〕をＮ−（クロ
ロメチル）フタルイミド（2.41g）、トリフルオロメタ
ンスルホン酸（0.22ml）及びジクロロメタン（50ml）と
共に室温で２時間かきまぜる。反応終了後、樹脂を別
し、ジクロロメタン、エタノール、メタノールで順次洗
浄し、減圧乾燥した後、５％のヒドラジンのエタノール
溶液（50ml）と一晩加熱還流を行なつた。別した樹脂
をエタノール、ジクロロメタン、メタノールで順次洗浄
した後減圧乾燥した。以上の操作により得られたアミノ
メチル化ポリスチレン樹脂（2.5g）、５′−ｏ−ジメト
キシトリチルヌクレオシドのモノコハク酸エステル（0.
756mM）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（1.23mM）
及びジメチルアミノピリジン（1mM）をジクロロメタン
（30ml）に加え室温で一晩放置した。別した樹脂をジ
クロロメタン、メタノール、ピリジンで順次洗浄した
後、ピリジン−無水酢酸（90:10）に浸し、室温で30分
間放置した。得られたヌクレオチド担持樹脂を別し、
ピリジン、ジクロロメタンで洗浄後減圧乾燥し、固相合
成反応に使用した。
ジヌクレオチドの合成 完全に保護されたTAの塩基配列のジヌクレオチドの合
成を例に具体的な操作を述べる。５′水酸基をジメトキ
シトリチル（DMTr）基で、アミノ基をベンゾイル基で保
護したアデノシン（13.14g）とトリアゾール（6.34g）
を無水ジオキサンに溶かし、氷冷下8.35mlのトリエチル
アミンを加えた後ｏ−クロルフエニルリン酸ジクロリデ
ート（6.86g）を10分間で滴下し、その後室温で2.5時間
かきまぜた。
生じたトリエチルアミン塩酸塩を過して除き、液
を約2/3に濃縮し、β−シアノエタノール（3.6g）と１
−メチル−イミダゾール（4.8g）を加えて室温で３時間
かきまぜた後、反応液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチ
ルに溶かし0.1Mリン酸−ナトリウム水溶液で３回、水で
２回洗つた後、減圧濃縮し、粗生成物19.96gを得た。そ
れをシリカゲルカラムクロマトグラフイーにかけ、クロ
モホルム−メタノール（98:2）で抽出することにより精
製した。この精製操作を繰り返すことにより完全に保護
されたアデノシンモノヌクレオチド15.12gを得た。この
ようにして得られたアデノシンモノヌクレオチド7.81g
を2gベンゼンスルホン酸のクロロホルム−メタノール
（70:30）溶液に加えて氷冷下20分間かきまぜた。炭酸
水素ナトリウム水溶液で中和後分離したクロロホルム層
を水で洗い、減圧濃縮して7.11gの洗生成物を得た。こ
のものをシリカゲルカラムクロマトグラフイーにかけク
ロロホルム−メタノール（97:3）で溶出して4.31gの
５′水酸基がフリーとなつたアデノシンモノヌクレオチ
ドを得た。
５′水酸基をジメトキシトリチル基で保護したチミジ
ン（1.64g）とトリアゾール（0.95g）を21mlの無水ジオ
キサンに溶かし、トリエチルアミン（1.25ml）を加えて
後、氷冷下かきまぜながらｏ−クロルフエニルリン酸ジ
クロリデート（0.69ml）を５分間で滴下し、その後室温
で１時間かきまぜた。反応終了後、生じたトリエチルア
ミン塩酸塩を別し、液に1Mピリジン水溶液1.1mlを
加えて10分間攪拌後、上記で得た５′水酸基フリーのア
デノシンモノヌクレオチド（1.17g）のジオキサン溶液
（10ml）と１−メチルイミダゾール（0.72ml）を加えて
室温で３時間かきまぜた。反応終了後、減圧濃縮して得
られた残渣を酢酸エチルに溶かし0.1Mリン酸−ナトリウ
ム水溶液、次いで水で洗つた後、減圧濃縮し2.39gの粗
生成物を得た。これをシリカゲルカラムクロマトグラフ
イーにかけクロロホルム−メタノール（98:2）で溶出
し、2.39gの完全に保護されたダイマーTAを得た。
オリゴヌクレオチドの合成 オリゴヌクレオチドＡ−１、即ちウンデカヌクレオチ
ドAATTCGAAGATの固相合成に関して述べる。
別途調製したヌクレオシドＴを担持した樹脂40mgを反
応管に入れ、ジクロロメタン−イソプロパノール（85:1
5）で３回洗浄後、臭化亜鉛（1M）のジクロロメタン−
イソプロパノール溶液で５′位のジメトキシトリチル基
をはずした。この操作を溶液に着色がなくなるまで数回
行なつた。ジクロロメタンで洗浄後更に残つているZn2+
を除去するために酢酸トリエチルアンモニウム（0.5M）
のジメチルホルムアミド溶液で洗浄し、テトラヒドロフ
ランで洗つて後、窒素ガスを数分通して樹脂を乾燥させ
た。
別途調製した完全に保護されたジヌクレオチドGA50mg
をピリジン（1ml）に溶かしトリエチルアミン（1mg）を
加えて、振りまぜて室温で数時間放置した後、溶液を減
圧留去し、内容物をピリジンで数回共沸させてトリエチ
ルアンモニウム塩にしておく。これをメシチレン−スル
ホニル−５−ニトロトリアゾール（0.3M）のピリジン溶
液0.3mlに溶かし、先ほど乾燥させた樹脂に加え、60分
間室温で反応させた。反応終了後、反応液を除き、ピリ
ジンで洗浄後、ジメチルアミノピリジン（0.1M）のテト
ラヒドロフラン−ピリジン溶液（0.8ml）と無水酢酸
（0.2ml）の混合液中で５分間放置し、未反応の水酸基
をマスクした。最後に樹脂をピリジンで洗浄し固相合成
法の１サイクルが終了した。１サイクルで２個鎖長を伸
ばすことが出来る。同様の操作を繰り返しジヌクレオチ
ドAA、CG、TT、AAを順次縮合させることによりすべて保
護されたウンデカヌクレオチドAATTCGAAGATを樹脂に担
持された状態で得た。
得られた樹脂20mgにテトラメチルグアニジウム−２−
ピリジンアルドキシメート（0.5M）のピリジン−水（9
0:10）溶液0.6mlを加えて40℃で１時間放置した。これ
をパルスツールピペツトに綿プラグをつめたものに通し
て樹脂を分別し、樹脂をピリジンとエタノールで交互に
洗浄し、洗浄液を液と合わせて減圧下40℃で濃縮し
た。残留物を10mMトリエチルアンモニウム・２炭酸塩水
溶液（TEAB）2mlに溶かしエーテルで３回洗浄した。水
層をセフアデツクスＧ−50カラム（２×100cm）にか
け、10mM TEAB溶液で溶出した。各フラクシヨンの吸光
度を260nmで測定し、一番最初に溶出してきたピークを
含むフラクシヨンを濃縮した。残渣を高速液体クロマト
グラフイー（ポンプ：ウオーターズ社製6000A型、検出
器:440型デイテクター）により単一ピークになるまで分
取精製した。高速液体クロマトグラフイーのカラムはμ
−Bondapak C18（ウオーターズ社製）を用い、溶出溶
媒は（５→40％）アセトニトリル−0.1M酢酸トリエチル
アンモニウム水溶液で勾配溶出した。このようにして精
製されたウンデカヌクレオチドは、５′末端がまだジメ
トキシトリチル基で保護されているので、80％酢酸水溶
液で15分間処理して脱ジメトキシトリチル化後再度高速
液体クロマトグラフイーにより単一ピークになるまで精
製した。高速液体クロマトグラフイーのカラムはμ−Bo
ndapak C18（ウオーターズ社製）で（５→25％）アセ
トニトリル−0.1M酢酸トリエチルアンモニウム水溶液で
勾配溶出した。
以下同様にしてＡ−２〜16及びＢ−１〜16のオリゴヌ
クレオチドを合成した。
上記で得たＡ−１〜16及びＢ−１〜16の収率及び収量
を第１表及び第２表に示す。
オリゴヌクレオチドの固相合成における縮合反応の収
率は、各サイクルで脱離させたジメトキシトリタノール
の量より換算した。ジメトキシトリタノールの量は、60
％過塩素酸−エタノール（60:40）溶液中での500nmにお
ける吸光度を測定することにより求めた。固相合成は40
mgの樹脂（ヌクレオチド含有量0.10mM/g樹脂）を使つ
た。最終段階の一段階前までの収率は下記第１表の通り
であつた。
尚、最後のサイクル終了後、目的のオリゴヌクレオチ
ドを樹脂よりはずしてから脱保護を行なつてジメトキシ
トリメタノールが反応混合物に含まれた状態で減られる
ので、ジメトキシトリタノールだけの吸光度の測定が不
可能で最終段階を含んだ縮合反応の全収率を求めること
は困難である。
また、固相合成完了後の樹脂20mgを用いて、オリゴヌ
クレオチドを樹脂より切断し、脱保護、精製を行なつた
ときの各オリゴヌクレオチドの収量を下記第２表に示し
た。
収量は、最終精製物の吸光度を260nmで測定しヌクレ
オチドの塩基の吸光度の和より換算して求めた。尚、オ
リゴヌクレオチドの合成においては、収率は実際上問題
とされず、純度が問題となる。従つて、精製の各段階で
ピークの中央部のみ分取を行なうので、収率としては低
くなり最終生成物の全収率は１〜２％であつた。
オリゴヌクレオチド塩基配列の確認 Wu等によるホモクロマトグラフイーを使つた二次展開
法により分析を行なつた。以下、オリゴヌクレオチドＡ
−３を例として述べる。
オリゴヌクレオチドＡ−３ ５μｇを蒸留水50μに
溶かし、この溶液７μに、250mMトリス・塩酸（pH7.
6）、50mM塩化マグネシウム、10mMスペルミン、50mMジ
チオスレイトール（DTT）の混合液を６μ、次いでγ
−32P−ATP水溶液（アマルシヤム社製「PB10168」）を
0.5μ及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造
（株）製No.2020A）を0.5μ、さらに蒸留水16μを
加えて合わせて30μとした。これを37℃の水浴中に60
分放置し、オリゴヌクレオチドの５′末端を32Pでラベ
ルした。100℃の湯浴に２分間浸漬して反応を停止し、
全量を５μ程度まで濃縮した後、20cm×20cmに切つた
DEAEセルロースプレート（マチエレー−ナーゲル社製）
にスポツトし、ホモミツクスチヤーIII（シグマ社製「Y
east RNA Type VI」を10gとり、5M水酸化カリウム水
溶液８μ、水42mlと共に37℃で24時間振りまぜて分解
後、1N塩酸で中和し、210gの尿素を溶かした後全量を50
0mlとし−20℃に保存する。使用時に溶かし、過して
用いる）を用いて70℃で展開した（これをホモクロマト
グラフイーと称する）。展開は、キシレンシアノールF
F、オレンジＧ及び酸性フクシンの各0.1％水溶液をマー
カーとしてスポツトし、キシレンシアノールFFの青色マ
ーカーが約10cm程度上がるまで行なつた。乾燥後、プレ
ートをポリ塩化ビニリデンフイルムで包みオートラジオ
グラムをとつた。感光時間は室温で約15分間で充分であ
つた。Ｘ線フイルムを現像し32Pラベルされたオリゴヌ
クレオチドのスポツトの位置をトレーシングペーパーに
移しとり、これをもとにしてさらにDEAEセルロースプレ
ート上に印をつけた。スポツト位置のDEAEセルロースを
かきとり、エタノール洗浄後TEAE緩衝液（トリエチルア
ミンジカーボネートの1M水溶液、トリエチルアミンを水
中に炭酸ガスを通じながら少しずつ滴下して溶かしたも
の）で溶出した。濃縮器で乾燥し、TEAE緩衝液を除いた
後、カウントを測定し、1000cpm/μとなるように蒸留
水に溶かした。これを７μずつ0.4ml容のチユーブ３
本にとり、250mMトリス・塩酸（pH8.0）、50mMの塩化マ
グネシウムを２μずつと蛇毒フオスフオジエステラー
ゼ（ベーリンガーマンハイム山之内（株）製No.10826
0）を水に溶かして0.1μg/μ、0.2μg/μ及び0.5μ
g/μとしたもの１μずつをそれぞれ反応チユーブ１
本ずつに加えて37℃にて30分間反応させた。反応停止は
5mM EDTA二ナトリウム水溶液（pH7.0）を５μ加えた
後に100℃の湯浴に２分間浸漬することにより行ない、
この一部をとつてDEAEセルロースプレートにスポツトし
たホモミツクスチヤーＶ又はVI（シグマ社製「Yeast R
NA Type VI」10gを5M水酸化カリウム水溶液10mlの水40
mlと共に24時間振りまぜて分解したものがＶで、48時間
振りまぜて分解したものがVIであり、どちらも分解後1N
塩酸で中和し、210gの尿素を溶かした後、全量500mlと
し−20℃に保存する。使用時に溶かし、過して用い
る。）を用いてホモクロマトグラフイーを行ないオート
ラジオグラフイーにより部分分解か完全に行なわれてい
るかどうかを確認した。
オリゴヌクレオチドＡ−３の場合、11個のスポツトが
見られ、部分分解がうまくいつたことが確認された。確
認後その１μをとり、7M尿素水溶液95mlに酢酸5mlと
ピリジン0.5mlを加えたものでしめらせた酢酸セルロー
ス膜（マチエレー−ナーゲル社製、50cm×36cmのものを
二つに切り25cm×36cmとし、一端より10cmの位置に鉛筆
で線を引いておく）の鉛筆で線を引いた中央にスポツト
した。その両端に、キシレンシアノールFF、オレンジＧ
及び酸性フクシンの各0.1％の水溶液をマーカーとして
0.5μ程度スポツトした。これを酢酸、ピリジン水溶
液中で電気泳動し、キシレンシアノールFFの青色マーカ
ーとオレンジＧの黄色マーカーのスポツトが約10cm程度
移動距離の差を生じた時点で止めた（1800Vで約45
分）。ドライヤーで乾燥し、DEAEセルロースプレート
（20cm×20cm）の一端から1.5cmの位置に線を引いたも
のに、酢酸セルロース膜の下端を合わせてのせた。上か
ら蒸留水で湿らせたワツトマン3MMペーパー（2.5cm×20
cmに切つたもの）５〜６枚をのせさらにガラス板と約2k
gの重しを乗せて約40分放置してオリゴマーの部分分解
物をDEAEセルロースプレート上に移行させた。酢酸セル
ロース膜及びワツトマン3MMペーパーをとり除き、DEAE
プレートを蒸留水で約10cm程度展開後、ホモミツクスチ
ヤーVIを入れた展開槽に移して70℃で約２時間展開し
た。展開後、乾燥させ、一次元目の原点、青色マーカ
ー、黄色マーカーの位置及び二次元目の青色マーカー、
黄色マーカーの位置に32Pラベル水溶液をスポツトして
乾燥した。ポリ塩化ビニリデンフイルムで包みオートラ
ジオグラフイーを行ない、Ｘ線フイルムを現像して解析
した。
Ａ−３については第４図のようになり５′側よりGATT
CTGAGATGと確認した。
Ａ−１、Ａ−２、Ａ−４〜Ａ−16及びＢ−１〜Ｂ−16
についても同様に解析して所定の塩基配列になつている
ことを確認した。
更に、各オリゴヌクレオチドの塩基配列を、マキサム
・ギルバート法によつても解析した。以下、オリゴヌク
レオチドＡ−６を例として述べる。
オリゴヌクレオチドＡ−６ 10μｇを蒸留水100μ
に溶かし、その７μをとつてＡ−３の場合と同様にし
て５′32Pラベルしたものを得た。これを30μの蒸留
水に溶かし、４本の1.5ml容のエツペンドルフチユーブ
に５μ×２本、10μ×２本と分けて入れた。５μ
とつたうちの１本はグアニンの反応を行なうもので、DM
S緩衝液（50mMカコジル酸ナトリウム（pH8.0）、1mM E
DTAニナトリウム）を200μ加え、硫酸ジメチルを１μ
加えて20℃で30分反応させた。次いで、DMS反応停止
液（1.5M酢酸ナトリウム（pH7.0）、1Mメルカプトエタ
ノール、100μg/ml tRNA）50μと冷エタノール750μ
を加えて氷浴中に５分置き、DNAを沈澱させた。遠心
分離して上清を捨て、ただちに0.3M酢酸ナトリウム水溶
液250μを加えて溶かした後、再び冷エタノール750μ
を加えて０℃で５分放置してDNAを沈澱させた。遠心
分離して上清を捨て、沈澱を70％エタノールで２回洗浄
した。
グアニンとアデニンの反応は、10μ入れたチユーブ
に蒸留水30μを入れ、Ｍ酢酸10μを加えて、45℃に
て90分間反応させた。次いでHz反応停止液（0.3M酢酸ナ
トリウム、0.1mM EDTA二ナトリウム、50μg/ml tRN
A）200μと冷エタノール750μを加えて氷浴中に５
分間置き、DNAを沈澱させた。遠心分離し上清を捨て、
ただちに0.3M酢酸ナトリウム水溶液250μを加えて溶
かした後、再びエタノール750μを加えて０℃に５分
間置くことによりDNAを沈澱させた。遠心分離して上清
を捨て沈澱を70％エタノールにて２回洗浄した。
チミンとシトシンの反応は、10μ入れたチユーブに
蒸留水10μを加え、またシトシンのみの反応は５μ
入れたチユーブに5M塩化ナトリウム水溶液15μを加
え、どちらも30μのヒドラジンを加えた後、45℃で40
分間反応させた。反応終了後は、グアニンとアデニンの
反応の場合と同様の操作を行なつた。
以上のようにして、塩基の修飾を行なつた後、1Mピペ
リジン水溶液100μを加えて、90℃で30分間反応させ
た。氷中にて急冷後、濃縮器にて吸引乾燥した。次に完
全にピペリジンを除去するために蒸留水50μずつ２
回、30μずつ２回、20μずつ２回繰返して溶解、吸
引乾燥し、ピペリジンの臭いがなくなるまで繰返した。
４種のチユーブのカウントを測定し、グアニン：グアニ
ン＋アデニン：チミン＋シトシン：シトシンの比が1:2:
2:1となるように色素液（80％ホルムアミド（H+型及びO
H-型混合イオン交換樹脂で脱塩したもの）、1mM EDTA
二ナトリウム、10mM水酸化ナトリウム、0.1％キシレン
シアノール、0.1％ブロムフエノールブルー）を加え、9
0℃にて２分加熱後急冷し、ゲル電気泳動を行なつた。
ゲルは12.5％ポリアクリルアミド、50％尿素のゲルを、
予備泳動を１時間以上行なつてから用いた。泳動終了後
ゲルをポリ塩化ビニリデンフイルムで包み、オートラジ
オグラフイーを行なつた。−80℃、一晩感光後現像し
て、Ａ−６が５′側よりTCTGCACGACGGTの塩基配列をし
ていることを確認した。
他のオリゴヌクレオチドＡ−１〜Ａ−５、Ａ−７〜Ａ
−16及びＢ−１〜Ｂ−16も同様にして所定の塩基配列を
有することが確認された。
オリゴヌクレオチドブロツク及びサブユニツトの造成 次に、オリゴヌクレオチドのオリゴマーブロツクを造
成するために第１図に示すような手順でオリゴヌクレオ
チドブロツクおよびサブユニツトを造成した。さらに詳
細に述べれば以下の通りである。
まず、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−14、Ａ−15及び
Ａ−16を、それぞれ約５μｇずつ1.5ml容のエツペンド
ルフチユーブに秤量した。蒸留水を50μ加えて約0.1
μg/μとなるように溶かした。この６種の水溶液を10
μずつ（DNAとしては１μｇずつ）別の６本のエツペ
ンドルチユーブに各々とり、別に用意した250mMトリス
・塩酸（pH7.6）、50mM塩化マグネシウム、10mMスペル
ミン、50mM DTTとなるように調製した混液６μ、次
いでγ−32P−ATP水溶液（アマルシヤム社製）0.5μ
及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造（株）製）0.
5μ、蒸留水13μを加えて30μとし、37℃で30分
反応させた後、30mM ATP水溶液を１μずつ添加して
さらに30分反応させた。100℃２分間加熱することによ
つて反応を停止させ、氷中にて急冷した。このようにし
て５′端をリン酸化したＡ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−
14、Ａ−15及びＡ−16を各々10μずつ別の１本の1.5m
l容のエツペンドルフチユーブにとり、250mMトリス・塩
酸水溶液（pH7.6）を40μ、50mM塩化マグネシウムを4
0μ及び蒸留水35μを加えて175μとし、90℃にて
２分間加熱した。加熱後自然冷却し、室温までもどした
後に、200mM DTT水溶液10μ、20mM ATP水溶液10μ
及びT4DNAリガーゼ（（株）ニツポンジーン製）５μ
（100ユニツト）を加えて４℃にて一晩反応させ、Ａ
−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−14、Ａ−15及びＡ−16が連
結されたオリゴヌクレオチドのブロツク１を造成した。
Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ａ−11、Ａ−12及びＡ−13
のブロツク２も同様に造成した。
Ａ−７、Ａ−８、Ａ−９及びＡ−10のブロツク３につ
いては同様にして５′端をリン酸化後、夫々10μずつ
とり、250mMトリス・塩酸水溶液（pH7.6）を40μ、50
mM塩化マグネシウムを40μ及び蒸留水55μを加えて
総量を175μとし90℃にて２分間加熱した。加熱後自
然冷却し室温までもどした後に200mM DTT水溶液10μ
、20mM ATP水溶液10μ及びT4DNAリガーゼ（（株）
ニツポンジーン製）５μ（100ユニツト）を加えて４
℃にて一晩反応させ連結させた。
上記各操作により連結させた各ブロツクに２倍容のエ
タノールを加え、−80℃で30分放置することによりDNA
を沈澱させ、12.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行ない、オートラジオグラフイーによりブロツク１につ
いては72b.p.及び36b.p.の位置のバンドを、ブロツク２
については36b.p.の位置のバンドを、ブロツク３につい
ては48b.p.及び24b.p.の位置のバンドをそれぞれ切り出
し、10mMトリス・塩酸（pH7.6）、10mM EDTA二ナトリ
ウム水溶液を加え室温にて一晩放置して溶出させた。遠
心分離して上清を分離し、フエノールを加えてよく振り
まぜた後遠心して下層を捨て、さらにフエノールを加え
て同様の操作を２回繰返した後、セフアデツクスＧ−50
を充填した直径1cm、長さ20cmのカラムを通してフエノ
ールとアクリルアミドを除き、次いで200μまで濃縮
後、２倍容のエタノールを加えて−80℃で30分放置させ
て沈澱させた。
得られた３種のオリゴヌクレオチドのブロツクを合わ
せて50mMトリス・塩酸（pH7.6）、10mM塩化マグネシウ
ム、20mM DTT、1mM ATPの混液としてT4DNAリガーゼ５
μ（100ユニツト）を加え４℃で一晩放置して連結さ
せた。２倍容のエタノールを加えて−80℃、30分置いて
沈澱させ、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行な
いオートラジオグラフイーにより96b.p.と192b.p.のバ
ンドを切り出し10mMトリス・塩酸（pH7.6）、10mM EDT
A二ナトリウム水溶液を加え室温にて一晩放置して溶出
させた。遠心分離して上清を分離しフエノールを結えて
よく振りまぜた後遠心して下層を捨て、さらにフエノー
ルを加えて同様の操作を２回繰返した後、セフアデツク
スＧ−50カラムを通した後、濃縮して２倍容のエタノー
ルを加えて、−80℃、30分放置によりDNAを沈澱させ
た。これをEcoR IとBamH Iで切断してサブユニツトＡが
得られた。
同様にして第２図に示すように、Ｂ−１、Ｂ−２、Ｂ
−15及びＢ−16を連結させてブロツク４を、Ｂ−３、Ｂ
−４、Ｂ−13及びＢ−14を連結させてブロツク５を、Ｂ
−５、Ｂ−６、Ｂ−11及びＢ−12を連結させてブロツク
６を、またＢ−７、Ｂ−８、Ｂ−９及びＢ−10を連結さ
せてブロツク７を造成し、各ブロツクの26b.p.及び52b.
p.のバンドを分取し、さらにこれらを同様にして連結さ
せて104b.p.と208b.p.としたものを得、これをHind III
とBamH Iで切断した。このようにしてサブユニツトＢが
得られた。
オリゴヌクレオチドサブユニツトの形質転換及びプラ
スミドの分析 第１図に示す様に、pBR322をEcoR IとBamH Iで切断
し、アルカリフオスフアターゼ（宝酒造（株）製）で
５′側のＰをはずしてもとの状態にもどらないようにし
た後、これにサブユニツトＡを合わせ、50mMトリス・塩
酸（pH7.6）、10mM塩化マグネシウム、20mM DTT、1mM
ATPの混液としてT4DNAリガーゼ５μを加えて４℃に
て一晩放置して連結させた。２倍容のエタノールを加え
て−80℃に30分置いて沈澱させ、遠心分離して沈澱を乾
燥後、蒸留水100μに溶かした。かくして、サブユニ
ツトＡをpBR322に組み込んだプラスミドpUG1が得られ
た。
このプラスミドpUG1を、カルシウム法による形質転換
法により大腸菌HB101株に導入した。
即ち、宿主とする大腸菌HB101株を50mlのLB培地（１
％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、0.5％塩化ナト
リウム）で37℃で培養し、610nmの吸光度が0.25に達し
たら40mlの培養液を遠心チユーブに移し、４℃、6000rp
mで10分間遠心分離して上澄をすて、沈澱を20mlの氷冷
した0.1M塩化マグネシウムに懸濁し、再び同じ条件で遠
心分離して上澄をすてた。沈澱を20mlの氷冷した0.1M塩
化カルシウム、0.05M塩化マグネシウム液に懸濁した。
１時間氷冷した後、遠心分離して上澄をすて、沈澱を2m
lの氷冷した0.1M塩化カルシウム、0.05M塩化マグネシウ
ム液に懸濁させた。この懸濁液200μに10μの上記p
UG1水溶液を加え、１時間氷冷した後、43.5℃の水浴で3
0秒間加温した。その後2.8mlのLB培地を加え37℃で１時
間培養し、アンピシリン50μg/ml添加LB平面培地にシヤ
ーレ一枚当り200μをまいて37℃で一晩培養した。生
育してきたコロニーをさらにアンピシリン50μg/ml添加
のLB平面培地とテトラサイクリン20μg/ml添加のUB平面
培地の両方に植菌して37℃で一晩培養し、アンピシリン
にのみ耐性のものを分離して、形質転換株を得た。
次に、この株をアルカリ抽出法により小スケールでプ
ラスミドを分取し、Bgl IIの切断部位が存在するものを
選んだ。これをさらに大量の培地で培養し、同じくアル
カリ抽出法によりプラスミドpUG1を分取した。
次に、得られたpUG1中に組み込まれているサブユニツ
トＡの塩基配列を、EcoR I切断サイト及びBamH I切断サ
イトの二方向から解析した。まず、EcoR IとBamH Iでそ
れぞれ別々に切断したものを用意した。EcoR Iで切断し
たものについては、アルカリフオスフアターゼデ５′端
のＰを除いた後、γ−32P−ATPとT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて５′32Pラベルした。次いで、EcoR Iで
切断して５′32PラベルしたものをSal Iで切断して約38
0b.p.のフラブメントを５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で分離した。又、BamH Iで切断したものについて
は、同様に５′32Pラベルした後Pst Iで切断して約860
b.p.のフラグメントを同様に分離した。切り出したゲル
をつぶし、10mMトリス・塩酸（pH7.6）、10mM EDTA二
ナトリウム混液を加えて室温で一晩おいて溶出させた。
遠心分離して上清を分離し、フエノールを加えて振りま
ぜた後遠心して下層を捨て、さらにフエノールを加えて
同様の操作を２回繰返した後、セフアデツクスＧ−50カ
ラムを通し、フエノールとアクリルアミドを除去した。
液を濃縮し２倍容のエタノールを加えて、−80℃、30分
置くことによりDNAを沈澱させ、70％エタノールで２回
洗浄後乾燥させた。蒸留水30μに溶かし、オリゴヌク
レオチドの分析のところで述べたマキサム・ギルバート
法によりDNA塩基配列の分析を行なつた。但し化学的修
飾のための条件は、オリゴヌクレオチドの場合とは異な
り、グアニンの反応では23℃で４分間、グアニンとアデ
ニンの反応では0.5M酢酸を用い水30μを加える代わり
に１μg/μのtRNA水溶液11μと水19μを加えた。
又反応時間も45℃で20分間とした。チミンとシトシンの
反応及びシトシンのみの反応は、23℃で７分間行なつ
た。上記以外の条件はオリゴヌクレオチドの場合と同様
とした。電気泳動は、分析する塩基数によつて12.5％ポ
リアクリルアミド、50％尿素ゲルで５′端から30塩基程
度まで、又８％ポリアクリルアミド、50％尿素ゲスで泳
動時間を長くすることによりそれ以上の塩基数を読むこ
とが出来た。
解析結果を参考写真１及び２に示す。レーン１〜４は
EcoR I−Sal Iフラグメント、レーン５〜８はBamH I−P
st Iフラグメントについての結果である。レーン１及び
５はグアニンの反応物、２及び６はグアニン＋アデニン
の反応物、３及び７はチミン＋シトシンの反応物、４及
び８はシトシンの反応物をそれぞれ示す。参考写真２
は、参考写真１と同じ試料をゲル濃度を変えて電位泳動
した結果であつて高分子量側（参考写真１上部に相当す
る）を拡大したものである。このようにして、サブユニ
ツトＡの塩基配列を確認できた。
同様にしてサブユニツトＢとpBR322を、それぞれHind
IIIとBamH Iで切断し、大きい方のフラグメントを電気
泳動で分離した後のものと連結して、サブユニツトＢを
pBR322に組み込んだプラスミドpUG2を得た。これを用い
て、同様にしてHB101株を形質転換し、アンピシリンに
のみ耐性のコロニーを選んだ。該コロニーより同様にプ
ラスミドを分取し、Bgl IIの切断部位の有無及びMlu I
の切断部位の有無をしらべ両方とも存在するものを選ん
だ。大量に培養してプラスミドpUG2を分取して、pUG2中
のサブユニツトＢの塩基配列を、二方向から解析した。
即ち、Hind IIIとBamH Iとでそれぞれ切断し、それぞ
れ５′32Pラベルした後、Hind IIIで切断したものにつ
いてはSal Iで、又BamH Iで切断したものについてはPst
Iで切断して、それぞれ380b.p.と890b.p.のフラグメン
トを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し
た。同様にして、両方ともマキサム・ギルバート法によ
り分析した。
解析結果を参考写真３に示す。レーン１〜４はHind I
II−Sal Iフラグメント、レーン５〜８は同じ試料をゲ
ル濃度を変えて電気泳動した結果であつて、高分子量側
（レーン１〜４の上部に相当する）を拡大したものであ
る。各レーンの反応物は参考写真１の場合と同様のこと
を示す。このようにしてサブユニツトＢの塩基配列を確
認できた。
次に、第３図に示す様に、pUG1をHind IIIとSal Iで
切断し大きい方のフラグメントを、バイオゲル1.5mカラ
ムを通して分取した。又、pUG2をHind IIIとSal Iで切
断し電気泳動によつて小さい方のフラグメントを分取し
た。両者を合わせ、T4DNAリガーゼで連結してサブユニ
ツトＡ＋Ｂであるβ−ウロガストロン遺伝子をpBR322に
組み込んだプラスミドpUG3を得た。これを用いて、大腸
菌HB101株を形質転換した。この場合も同様にして、ア
ンピシリンにのみ耐性であつてMlu Iの切断部位を持つ
プラスミドを有するコロニーを選び、大量培養してプラ
スミドpUG3を分取した。そして、pUG3中のβ−ウロガス
トロン遺伝子の塩基配列を二方向から解析した。即ち、
EcoR I及びBamH Iでそれぞれ切断したものを５′32Pラ
ベルし、EcoR Iで切断し32PラベルしたものについてはS
al Iで切断して約550b.p.のフラグメントを分取し、Bam
H Iで切断し32PラベルしたものについてはPst Iで切断
して900b.p.のフラグメントを分取した。それぞれマキ
サム・ギルバート法によりDNA塩基配列の解析を行なつ
た。
解析結果を参考写真４に示す。レーン１〜４はBamH I
−Pst Iフラグメントについての結果である。レーン５
〜８は同じ試料をゲル濃度を変えて電気泳動した結果で
あつて、高分子量側（レーン１〜４の上部に相当する）
を拡大したものである。各レーンの反応物は参考写真１
と同様のことを示す。この解析により、β−ウロガスト
ロン遺伝子の塩基配列を確認できた。
β−ウロガストロン発現ベクタープラスミドの構築 λPLプロモーターを使用した発現ベクター λフアージの左向きプロモーターλPLを利用して、β
−ウロガストロンを発現させた実施例について以下に具
体的に述べる。
まず、λPL発現プラスミドの宿主である大腸菌HB101
株由来のECI−２株の造成、λフアージの変異株である
λCI857S7のDNAからのλPLプロモーターを含むDNA断片
のクローニング及び発現プラスミドの構築について述
べ、次いでλPLプロモーターによりβ−ウロガストロン
の遺伝子を宿主ECI−２株中で発現させたことについて
述べる。
（ａ） ECI−２株の造成 ECI−２株は、IC857遺伝子を発現するプラスミドpGH3
7を保有させた大腸菌HB101株である。
pGH37は第５図に示すようにして造つた。即ちまず、
λCI857S7DNAをBgl IIで切断した。その際に生じるDNA
5′側末端の一本鎖部分を分解して平滑末端とするため
に、SIヌクレアーゼを用いた。200mM塩化ナトリウム、3
0mM酢酸ナトリウム、5mM硫酸亜鉛（pH4.5）の反応溶液1
00ml中にBgl IIで切断したλCI857S7DNA1μｇとS1ヌク
レアーゼ200ユニツトを含む条件で20℃、30分間反応さ
せた。このようにして得られた平滑末端DNA断片から1.0
％アガロースゲル電気泳動によりCI857の全構造遺伝子
を有する2385塩基対の断片を単離した。この断片をプラ
スミドpGL101のPvu II切断部位に挿入して、lacUV5プロ
モーター支配下にCI857遺伝子を発現するプラスミドpGH
36を造成した。次いで、pGH36をEcoR IとPst Iの２種の
制限酵素で切断し、得られた1193塩基対の断片をプラス
ミドpSC101のEcoR IとPst Iの両切断部位の間に挿入し
てプラスミドpGH37を作成した。
次に、大腸菌HB101株をpGH37を用いて既に述べた方法
で形質転換して得られた株の１つをECI−２と命令し
た。この株はテトラサイクリン耐性でCI857遺伝子を発
現し、しかもpBR322などから由来した他のプラスミドを
形質転換により共存させることができる。従つて、以後
λPL発現プラスミドの宿主としてECI−２株を用いた。
（ｂ） λPLプロモーターのクローニングと発現プラス
ミドの造成 まず、λCI8577DNAをEcoR IとSal Iで切断してλPLプ
ロモーター、CI857遺伝子、λPRプロモーターの領域を
含む5925塩基対の断片をとり、これをプラスミドpBR322
のEcoR IとSal I切断部位間に挿入して、プラスミドpGH
25を造成した。
次いで、pGH25をBamH Iで切断し、同様にBamH Iで切
断したpBR322と結合してpGH34を造成した。
続いてpGH34をAva I及びBgl IIで切断後、S1ヌクレア
ーゼで約4500塩基対の平滑末端を有する断片とし、これ
をT4DNAリガーゼで環状にしてプラスミドpGH35を造成し
た。
一連の操作の概略を第６図に示す。
次に、pGH35をHpa Iで切断し、アダプターとしてSD配
列を保有する合成オリゴヌクレオチドＣ−１−１とＣ−
１−２を結合し、さらにBamH Iで切断したプラスミドpM
C1403を結合してプラスミドpEG−２を造成した。pEG−
２はアンピシリン耐性遺伝子を持ち、又λPLプロモータ
ー支配で合成オリゴヌクレオチドＣ−１−１、Ｃ−１−
２上のSD配列を利用し、同じく合成オリゴヌクレオチド
上の開始コドンからβ−ガラクトシダーゼが翻訳される
ように組み立てたものである。
アダプターＣ−１−１及びＣ−１−２は、下記の構造
のものである。
プラスミドpEG2は、宿主ECI−２中でβ−ガラクトシ
ダーゼを実際に発現することがMillerの方法（Miller,
J.（1972）“Experiment in Molecular Genetics"Ne
w York,Cold Spring Harbor Laboratory pp352−3
55）により確かめられた。この方法は、合成基質ONPG
（オルトニトロフエニルガラクトシド）がβ−ガラクト
シダーゼにより分解されて黄色のニトロフエノールを生
成する呈色反応を利用して酵素量を定量するものであ
る。該Millerの方法をより具体的に以下に説明する。61
0nmでの吸光度を測定した供試菌の培養液0.1mlを1.9ml
のアツセイバツフア（0.1Mリン酸ナトリウムpH7.0、1mM
硫酸マグネシウム、0.1M β−メルカプトメタノール）
と混和し、0.1mlのトルエンを加えて15秒間激しく攪拌
して、膜透過性を高めた後、アスピレーターでトルエン
を蒸散させる。これに0.2mlONPG溶液（400mgONPGを100m
lのアツセイバツフアーに溶解）を加え、黄色に着色す
るまで一定時間30℃で振盪する。次いで1M炭酸ナトリウ
ム0.5mlを加えて酵素反応を停止させ、420nmと550nmの
吸光度を測定する。
610nmでの吸光度を1.0として換算した菌液1ml中のβ
−ガラクトシダーゼ活性は、次式により算出される。
t:反応時間（min） v:供試菌の反応系に加えた量（0.1ml） OD610:供試菌の610nmにおける吸光度 その結果、pEG2を保有するECI−２株を30℃で培養し
た時には、β−ガラクトシダーゼ活性は98ユニツトであ
つたものが30℃で前培養した後42℃で１時間培養を行う
と、λPLプロモーターが活性化されてβ−ガラクトシダ
ーゼ活性は9637ユニツトとなつた。これにより、pEG2に
おいて、λPLプロモーター以下β−ガラクトシダーゼま
での配列が正しく連結されていることが証明された。
次にpEG2はBgl IIによる切断点を２ケ所に有するがβ
−ガラクトシダーゼのSD配列の直後に存在するBgl IIサ
イトみが必要で他方はむしろ不要であるためBamH Iで切
断し再結合することにより、約770塩基対のBamH I断片
を除去したpEK28を造成した。このpEK28の造成によりλ
PLプロモーター系の発現プラスミドが完成したものであ
る。
一連の操作の概略を第７図に示す。
（ｃ） β−ウロガストロン前半部とβ−ガラクトシダ
ーゼ融合遺伝子の発現 まず、β−ウロガストロン前半部とβ−ガラクトシダ
ーゼとの融合遺伝子を有するプラスミドpUG101を次のよ
うにして造成した。即ち、β−ウロガストロン前半部の
みがクローニングされたpUG1とβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を有するpMC1403をそれぞれBamH Iで切断後、結合
してpUG101を造成した。このプラスミドでは、β−ウロ
ガストロン前半部とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が同一
のフレームで結合しているので、これが発現すると両者
のアミノ酸配列が連結したいわゆる融合タンパクとして
発現するものである。
そこで、これをλPLプロモーター支配で発現させるた
めに、pUG101とpEK28とをそれぞれBgl IIで切断した。
Bgl IIによつて切断すると という形の５′末端がとび出したDNA断片が得られるが
これを基質として大腸菌DNAポラメラーゼの大フラグメ
ント（Klenowフラグメント）で反応させると４種のヌク
レオチド存在下で のように、対応するヌクレオチド（GATC）が付加された
平滑末端を生じる。ここでもし、ヌクレオチドとしてdG
TPのみ加えれば、ｄグアノシンのみ付加されて で反応が止まる。次に、S1ヌクレアーゼを用いて単鎖部
分を分解すると の形の平滑末端が得られる。同様にしてdGTPとdATPを加
えてKlenow反応を行なつた後、S1ヌクレアーゼで分解す
ると が得られ、dGTPとdATPとdTTPを加えてKlenow反応を行な
つた後にS1ヌクレアーゼで分解すると が得られる。またKlenow反応を行なわずにS1ヌクレアー
ゼにより分解のみを行なうと、 となる。すなわち、 を基質としてKlenow反応の際添加するヌクレオチドの種
類とS1ヌクレアーゼ反応との組み合わせにより、長さが
１塩基対ずつ異なる５種類の平滑末端が得られることに
なる。
ここで、Klenow反応及びS1ヌクレアーゼ反応の条件は
下記の通りである。
＊Klenow反応条件……リン酸カリウム緩衝液（pH7.4）4
0mM、β−メルカプトエタノール1mM、塩化マグネシウム
10mM、ATP1mM及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸各
1mMの反応液50μ中に基質のDNA1μｇと酵素（Klenow
フラグメント）１ユニツトを含む条件で12℃、30分間反
応させる。
＊S1ヌクレアーゼ反応条件……200mM塩化ナトリウム、3
0mM酢酸ナトリウム、5mM硫酸亜鉛（pH4.5）の反応溶液1
00μ中に、基質のDN1μｇと酵素200ユニツトを含む条
件で20℃、30分間反応させる。
そこで、pEK38とpUG101をそれぞれBal IIで切断した
あと、それぞれKlenow反応とS1ヌクレアーゼ反応を組み
合せて行ない、各々５種類ずつの平滑末端を有する断片
を得た。これらの両者を組み合せることにより第３表に
示すように、SD配列と、融合タンパクの開始コドンの間
の塩基数と配列が互いに異なる21通りの組み合わせが可
能である。
実際には、このようにして得たDNA断片を、次にSal I
で切断したのち、pUG101からはβ−ウロガストロン前半
部とβ−ガラクトシダーゼの融合タンパクの遺伝子を含
むフラグメントを、pEK28からはλPLプロモーターを含
むフラグメントを単離して、これらを第３表に示した組
み合わせでT4DNAリガーゼにより結合した。
その結果、第４表に示したNo.の融合タンパクを発現
する組み換え体が得られた。これらについて、発現した
融合タンパクの示すβ−ガラクトシダーゼ活性をMiller
の方法で測定した。その結果、第４表に示したようにい
ずれも比較的高い発現量を示したが、特にpUG103、pUG1
04、pUG117等が高い発現量を示すことが明らかになつ
た。
次に、pUG103とpUG117からβ−ウロガストロンを発現
するベクターの造成について述べる。pUG103とpUG117
を、それぞれHind IIIとPvu IIで切断してλPLプロモー
ターからβ−ウロガストロン前半部遺伝子までの配列を
含む1.2kbのフラグメントを分離した。また、pUG2をEco
R Iで切断して4.1kbのフラグメントを得た。両者をT4DN
Aリガーゼで結合して、大腸菌ECI−２株をすでに記した
方法で形質転換して、β−ウロガストロン遺伝子前半部
と後半部とが結合して全β−ウロガストロン遺伝子がλ
PLプロモーター支配で発現するプラスミドpUG103−Ｅ、
pUG117−Ｅを保有する組み換え体を得た。
上述の一連の操作の概略を第８図に示す。
融合タンパク発現ベクター プラスミドpBR322上に存在するβ−ラクタマーゼ遺伝
子とβ−ウロガストロン遺伝子とを連結することによ
り、β−ウロガストロンを融合タンパクとして発現させ
た。実施例について以下に具体的に述べる。
β−ラクタマーゼ遺伝子発現の供与体 pBRH02は、pBR322をAva IとPvu IIで切断し、Klenow
処理後、T4DNAリガーゼで結合して得た欠失体で、アン
ピシリン耐性（ApR）と、ラトラサイクリン耐性（TcR）
をマーカーとして保有する。pBRH03は、pBR325をAva I
とHind IIIで切断し、Klenow処理後結合して得た欠失体
であつて、マーカーとしてApR及びクロラムフエニコー
ル耐性（CmR）を保有する。これらのプラスミドを第９
図に示す。
β−ウロガストロン遺伝子供与体 記述の如く造成したpUG3を、Mbo IIで切断した結果、
13種類のDNA断片が得られた。これらのDNA断片は、大き
さの順にＡからＭと名付けられた。これを第10図に示
す。これらDNA断片のうちＨ断片は、β−ウロガストロ
ン遺伝子Ｎ端のアスパラギンをコードするヌクレオチド
からはじまり、終止コドンの下流16塩基までの179塩基
対か成り、β−ウロガストロンの全構造遺伝子を保有し
ていた。次にこのＨ断片を単離するために６％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行ない、断片を分離して精製
した。
アダプター アダプターとして下記第５表に示されているオリゴヌ
クレオチド（合成法は既述）を用いた。即ち、これらの
アダプターは発現した融合タンパクからβ−ウロガスト
ロンを酵素的に分離するためにLys−Arg又はArg−Lysの
２連の塩基性アミノ酸をコードするように設計して合成
し、以下の操作に用いた。
β−ラクタマーゼとβ−ウロガストロン融合タンパク
発現プラスミドの塩基配列 （１）Lys−Argで連結されたβ−ラクタマーゼとβ−ウ
ロガストロンとの融合タンパク発現系 β−ラクタマー
ゼ−β−ウロガストロン融合タンパク発現ベクターの組
み立てに当り、アダプターの結合を確認するために、ア
ダプターを含む領域に制限酵素認識部位が生成されるよ
うにして行なつた。
pUG2301〜2303の造成 pBRH02をXmn Iで37℃で３時間完全に切断した後、３
μｇのベクターと約0.1μｇの179b.p.β−ウロガストロ
ンフラグメント及びアダプターとしてＥ−１とＥ−２を
約１μｇずつ（５′端非リン酸化）、１段階で12℃、15
時間で結合を行ない発現ベクターであるプラスミドを得
た。HB101を前述と同様にして形質転換した。
得られた499個のTcRコロニーのうち、168個（33.7
％）がApSであつた。それらについてミニプレパレーシ
ヨンを行ない、プラスミドDNAの大きさを調べたとこ
ろ、ベクターより約200b.p.大きく、β−ウロガストロ
ン遺伝子が挿入されていると考えられるものが13個あつ
た。これらすべてはMln Iサイトを持つていた。これら
についてHinf Iにて切断し、1.5％アガロースゲル電気
泳動にてβ−ウロガストロン遺伝子挿入の方向性を調べ
た。そのうち３個は約1050b.p.と約800b.p.のフラグメ
ントが生じたので、β−ウロガストロンがβ−ラクタマ
ーゼと同じ方向へ挿入されたものと考えられ、pUG2301
〜pUG2303と名付けられた。上記操作を第11図に示す。
pUG2101〜2105の造成 プラスミドベクターとしてpBR322を用いた。pBR322は
β−ラクタマーゼ遺伝子中に唯一のPvu Iサイトを持
つ。で述べた方法に準じて、アダプターとしてＥ−１
及びＥ−５を用い発現ベクターを造成した。これを第12
図に示す。
得られた1626個のTcRコロニーについてAp感受性を調
べたところ、31個（1.9％）がApSであつた。TcR、ApS22
コロニーについてミニプレパレーシヨンを行ない、Mlu
Iにて切断し、β−ウロガストロン遺伝子の挿入を調べ
た。20個がMlu Iサイトを持つていた。方向性はHinf I
及びBamH Iによる切断にて夫々調べられ、pUG2101〜pUG
2105はβ−ラクタマーゼ遺伝子と同方向にβ−ウロガス
トロン遺伝子が挿入されていることがわかつた。
pUG2701〜2703の造成 ベクターにpBR322を、アダプターにＥ−７とＥ−８を
用い、と同様の操作にて発現プラスミドを造成した。
これを第13図に示す。
217個のTcRコロニーが得られ、そのうちの106個（48.
8％）がApSだつた。25個についてミリプレパレーシヨン
を行ない、そのうちベクターよりも約200b.p.大きい８
個にβ−ウロガストロン遺伝子が層されていると考え、
その方向性がBamH Iによる切断によつて調べられた。こ
の結果３個がβ−ラクタマーゼと同方向にβ−ウロガス
トロン遺伝子が挿入されていると考えられ、pUG2701〜2
703と名付けられた。
上記により得られたpUG2301が産生するβ−ラクタ
マーゼの一部とβ−ウロガストロンとの融合タンパクの
一次構造を、塩基配列と対応して下記に示す。
同様に、上記により得られたpUG2101が産生する融
合タンパクの一次構造を、下記に示す。
同様に、上記により得られたpUG2701が産生する融
合タンパクの一次構造を下記に示す。
pUG2101、pUG2301及びpUG2701においてβ−ウロガス
トロンの遺伝子がアダプターを介してpBR322のβ−ラク
タマーゼ遺伝子の目的とした位置に組み込まれているか
どうかを塩基配列から解析した。即ちMlu Iで切断し、
５′32Pラベル後pUG2101においてはEcoR I及びPst Iで
二次切断し、５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動とオ
ートラジオグラフイーによつて５′32Pラベルされた721
b.p.と224b.p.のフラグメントを分取した。pUG2301にお
いてはBamH Iで二次切断し、同様にして452b.p.と87b.
p.のフラグメントを分取した。pUG2701においてはEcoR
IとPst Iで二次切断し、同様にして610b.p.と335b.p.の
フラグメントを分取した。
以上のようにして得られたフラグメントをマキサム・
ギルバート法により解析した。解析結果を参考写真５に
示す。参考写真５においてレーン１〜４はpUG2101のMlu
I−Pst Iフグラメント（224b.p.）、レーン５〜８はpU
G2101のMlu I−EcoR Iフラグメント（721b.p.）、レー
ン９〜12はpUG2301のMlu I−BamH Iフラグメント（452
b.p.）レーン13〜16はpUG2701のMlu I−Pst Iフラグメ
ント（335b.p.）及びレーン17〜20はpUG2701のMlu I−E
coR Iフラグメント（610b.p.）についての結果である。
レーン１、５、９、13及び17はグアニンの反応物、レー
ン２、６、10、14及び18はグアニン＋アデニンの反応
物、レーン３、７、11、15及び19はチミン＋シトシンの
反応物並びにレーン４、８、12、16及び20はシトシンの
反応物をそれぞれ示す。また参考写真中で「｝」で示し
た部分がアダプターである。
（２） Arg−Lysで連結されたβ−ラクタマーゼとβ−
ウロガストロンとの融合タンパク発現系 pUG1102及び1105の造成 β−ラクタマーゼ−β−ウロガストロン融合タンパク
の発現ベクターとして、pBR322のApR遺伝子に一か所だ
け存在するPvu I制限酵素サイトにβ−ウロガストロン
遺伝子を挿入したものを造成した。これを第14図に示
す。
pBR322を、Pvu Iにて37℃、３時間切断し、その一部
をアガロースゲル電気泳動で調べ完全に切断されている
ことを確かめてから、アダプターＤ−１−３とＤ−３−
２を12℃、15時間の条件で結合した。結合終了後、１％
アガロースゲル電気泳動にてDNAフラグメントを単離し
た。続いて、β−ウロガストロンフラグメントと、ベク
ターをほぼ5:1のモル比で混合し、12℃、15時間で結合
を行なつた。結合後、前述の方法でHB101を形質転換
し、TcRを指標としてコロニーを選択した。
71個のTcR形質転換体が得られ、それぞれAp感受性を
調べたところ20個（28.2％）がAp感受性であつた。この
20個のApSコロニーからDNAを調製し、β−ウロガストロ
ン遺伝子挿入の有無を、Mlu I制限酵素サイトの有無に
より調べた。20個のうち５個のみMlu Iサイトが存在
し、β−ウロガストロン遺伝子が挿入されていた。挿入
の方向性はHinf IにてDNA切断後、1.5％アガロースゲル
電気泳動にて調べられ、そのうち２個（pUG1102とpUG11
05）が正方向に挿入されていた。
pUG1004、1201及び1301の造成 においてPvu Iの代わりにPst I、Hinc II及びXmn I
を用い同様にしてpUG1004、pUG1201及びpUG1301の夫々
を得た。これらを第15図、第16図及び第17図に示す。
実施例 ３ β−ウロガストロン発現の確認 前記によつて構築された発現プラスミドを大腸菌HB10
1株又はECI−２株に形質転換したものを、下記方法にて
培養後抽出し、ラジオイムノアツセイで発現の有無を確
認した。
（１）β−ウロガストロン遺伝子組換え微生物の培養及
び抽出 （ａ）λPLプロモーターを使用した発現系 発現プラスミドpUG103E又はpUG117−Ｅを保有する大
腸菌ECI−２を１のLB倍地で、それぞれ２本、25℃で
培養し、１本は660nmの吸光度が0.3になつたときに42
℃、１時間ヒートインダクシヨンを行ない、他の１本は
そのまま25℃で吸光度が0.4になるまで培養した。集菌
後PBS液〔137mM塩化ナトリウム、2.7mM塩化カリウム、
8.1mMリン酸二ナトリウム、1.5mMリン酸−カリウム（pH
7.0）〕にて洗浄後、菌体を原液の３％量のPBS液に懸濁
し、氷冷しながら超音波細胞破壊器（大缶製作所製、52
02型）にて菌体を破壊（100Wで30秒間を３回）した。次
に超遠心（40000gで１時間）を行なつて細胞残渣を除い
た。上清を0.01N酢酸水溶液中で透析し、凍結乾燥を行
ない、以後のラジオイムノアツセイ（以下、RIAとい
う）に供した。
（ｂ）融合タンパクの発現系 pUG1004、1301、2101、2303又は2703を保有する大腸
菌HB101株をテトラサイクリン50μg/mlを含むLB倍地で3
7℃にて前培養を行ない、同じ培地に1:100の割合で希釈
し、660nmの吸光度が0.4になるまで振盪培養した。集菌
し、PBS液により洗浄の後、菌体を原液の３％量のPBS液
に懸濁し、氷冷しながら超音波細胞破壊器（大缶製作所
製5202型）にて、菌体破壊（100W、30秒で３回）を行な
つた。次に超音心（40000g、１時間）を行なつて細胞残
渣を除いた。上清を0.01N酢酸水溶液中透析し、凍結乾
燥を行ない、RIAに供した。
また、融合タンパクがペリプラズムへ蓄積することを
確認するために、オスモテイツクシヨツクによるペリプ
ラズム画分の抽出を行なつた。即ち、S.J.Chanらの方法
〔Chan,S.J.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,78,5401
−5405（1981）〕に従つて、ペリプラズム画分の抽出を
行なつた。LB培地にて行なつた前培養の菌液を新鮮なＥ
培地（リン酸二カリウム10g、リン酸水素アンモニウム
ナトリウム3.5g、硫酸マグネシウムウ７水塩0.2g、クエ
ン酸2g、グルコース2g、Ｌ−プロリン0.23g、ｌ−ロイ
シン39.5mg、チアミン16.85mg及びテトラサイクリン塩
酸塩20mgを水に溶解して１としたもの）を用いて1:10
0に希釈し、37℃で660nmの吸光度が0.4になるまで振盪
培養した。集菌（6000rpm、10分）した後、10mMトリス
・塩酸（pH8.0）、30mM塩化ナトリウム混液にて２回洗
浄し、菌体1gに対し80mlの20％シヨ糖−30mMトリス・塩
酸（pH8.0）に再懸濁した。即座にEDTA二ナトリウムを
最終濃度1mMになるように加えロータリーシエイカーに
て10分間、180回転で振盪（24℃）を行なつた後、遠心
分離（13000g、１分）により集菌し、等量の蒸留水に再
懸濁した。氷中に静置し、時々攪拌を行ない約10分後、
遠心分離（13000g、１時間）を行ない、上清をペリプラ
ズム画分（Ｏ−Sup）として回収した。ペレツトについ
ては、10mMトリス・塩酸（pH8.0）、30mM塩化ナトリウ
ム混液に懸濁し、上記超音波破壊により、菌体内タンパ
ク画分（Ｏ−Ppt）を得た。これらのサンプルをPIAに供
した。
（２）ラジオイムノアツセイ （ａ）RIA系の確立 精製ヒトβ−ウロガストロンを抗原として、家兎を免
疫し抗血清を作成した。β−ウロガストロン300μｇを
蒸留水0.2mlに溶解後、50％ポリビニルピロリドン液1.5
mlを加え室温で２時間攪拌した。コンプリート・フロイ
ンド・アジユバンド2.0mlを加えて乳化し、家兎３匹の
胸部に皮下注射した。２週間毎に免疫を４回くり返した
後、さらに50μｇの抗原を静注し、３日後に全採血を行
ない、血清を分離した。
次にアツセイに用いる抗血清の希釈倍率を求めるタイ
トレーシヨンカーブ、アツセイ条件を最適化するためイ
ンキユベーシヨン時間、抗体結合標識抗原（バウンド）
と遊離標識抗原（フリー）の分離方法等の検討を加え、
下記RIA測定条件を設定した。
即ち、0.5％のウシ血清アルブミン（BSA）、140mM塩
化ナトリウム、25mM EDTA二ナトリウムを含むリン酸緩
衝液（10mM、pH7.4）を希釈液として用いた。希釈液400
μ、測定試料又は標準ヒトβ−ウロガストロン100μ
、抗ヒトβ−ウロガストロン血清100μを加えて４
℃にて24時間インキユベートした後125I標識ヒトβ−ウ
ロガストロン100μ（約5000cpm）を加えた。更に４℃
にて48時間インキユベートした後、第２抗体（抗家兎γ
−グロブリンヤギ血清）（1:20）100μ、正常家兎血
清（1:200）100μ、５％ポリエチレングリコールを含
む10mMPBS液900μを加えて４℃にて３時間インキユベ
ートした。次に3000rpmで30分間遠心分離し、上清を除
き沈澱物をカウントした。標準ヒトβ−ウロガストロン
より得られた標準曲線より試料中のヒトβ−ウロガスト
ロン免疫活性物の含量を求めた。
（ｂ）組み換え微生物中のβ−ウロガストロン生産性の
確認 λPLプロモーターを使用した発現系のRIAの結果を第
６表に示す。
融合タンパクの発現系のRIAの結果を第７表に示す。
Ｏ−Sup及びＯ−Pptについての結果を第８表に示す。
第６表及び第７表より、β−ウロガストロンを直接発
現するλPLプロモーター系及び融合タンパクとして発現
する系のいずれも大腸菌によりβ−ウロガストロン活性
を発現していることが確認された。また第８表より融合
タンパクの場合には、発現したβ−ウロガストロン活性
のほとんどが、ペリプラズムに局在していることが確認
された。
本発明のプラスミドpUG3を大腸菌HB101に保持させた
微生物は、HB101〔pUG3〕として通商産業省工業技術院
微生物工業技術研究所（微工研）に寄託されており、そ
の受託番号は微工研条寄第543号（FERM BP−543）であ
る。またプラスミドpGH37を大腸菌HB101に保持させた微
生物は、ECI−２として同微工研に、受託番号微工研条
寄第542号（FERM BP−542）として寄託されている。
【図面の簡単な説明】
第１図は、オリゴヌクレオチドＡ−１〜Ａ−16からサブ
ユニツトＡを造成し、それをpBR322に組み込んでpUG1を
得る行程を示すものである。第２図は、同様にしてサブ
ユニツトＢを組み込んだpUG2を得る行程を示すものであ
る。第３図は、pUG1とpUG2からpUG3を得る行程を示すも
のである。第４図は、オリゴヌクレオチドＡ−３の塩基
配列を、ホモクロマトグラフイーを使つた二次展開法に
より分析した結果を示すものである。 第５図は、pGH37を得る行程を示すものである。第６図
は、pGH35を得る行程を示すものである。第７図は、pEK
38を得る行程を示すものである。第８図はpUG102〜pUG1
22、pUG103−Ｅ及びpUG117−Ｅを得る行程を示すもので
ある。第９図は、pBRH02及びpBRH03を得る行程を示すも
のである。第10図は、pUG3のMbo II切断DNA断片を示
し、そのうちＨ断片（179b.p.）はβ−ウロガストロン
遺伝子を含むことを示すものである。第11図は、pUG230
1〜pUG2303を得る行程を示すものである。第12図は、PU
G2101〜PUG2105を得る行程を示すものである。第13図
は、pUG2701〜pUG2703を得る行程を示すものである。第
14図は、pUG1102及びpUG1105を得る行程を示すものであ
る。第15図は、pUG1004を得る行程を示すものである。
第16図は、pUG1201を得る行程を示すものである。第17
図は、pUG1301を得る行程を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 河本 尚一 赤穂市坂越3218番地の12 アース製薬株 式会社内 (72)発明者 西村 昭 赤穂市松原町９―14 (72)発明者 松代 愛三 吹田市青山台４丁目15番12号 (56)参考文献 欧州特許46039（ＥＰ，Ａ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記塩基配列であるβ−ウロガストロン遺
    伝子。
  2. 【請求項２】β−ウロガストロン遺伝子の前後に開始コ
    ドン、終止コドン及び制限酵素認識部位を付加した下記
    塩基配列をする特許請求の範囲第１項に記載の遺伝子。
  3. 【請求項３】下記塩基配列 であるβ−ウロガストロン遺伝子の上流に、該遺伝子の
    発現を制御するプロモーター及びSD配列を連結したもの
    をプラスミドベクターに挿入したプラスミド組換体。
  4. 【請求項４】β−ウロガストロン遺伝子とプロモーター
    及びSD配列との間又は（及び該遺伝子の下流に、更に他
    の遺伝子を連結した特許請求の範囲第３項に記載のプラ
    スミド組換体。
  5. 【請求項５】他の遺伝子がβ−ラクタマーゼ遺伝子であ
    る特許請求の範囲第４項のプラスミド組換体。
  6. 【請求項６】プロモーターがλPL又はlacUV5である特許
    請求の範囲第３〜５項のいずれかに記載のプラスミド組
    換体。
  7. 【請求項７】プラスミドベクターがpBR322である特許請
    求の範囲第３〜６項のいずれかに記載のプラスミド組換
    体。
  8. 【請求項８】下記塩基配列 であるβ−ウロガストロン遺伝子の上流に、該遺伝子の
    発現を制御するプロモーター及びSD配列を連結したもの
    をプラスミドベクターに挿入したプラスミド組換体を、
    宿主細胞に形質転換させた形質転換体。
  9. 【請求項９】宿主細胞が大腸菌である特許請求の範囲第
    ８項に記載の形質転換体。
  10. 【請求項１０】宿主細胞がTcR遺伝子及びCI857遺伝子を
    挿入されているプラスミド組換体を保持している特許請
    求の範囲第８項又は第９項に記載の形質転換体。
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AU44111/85A AU599003B2 (en) 1984-07-02 1985-06-24 Novel beta-urogastrone gene, corresponding recombinant plasmids, corresponding transformants and preparation thereof and of beta-urogastrone
CA000485007A CA1304023C (en) 1984-07-02 1985-06-24 .beta.-UROGASTRONE GENE, CORRESPONDING RECOMBINANT PLASMIDS, CORRESPONDING TRANSFORMANTS AND PREPARATION THEREOF AND OF .beta.-UROGASTRONE
DK291885A DK291885A (da) 1984-07-02 1985-06-27 Beta-urogastron-gen, tilsvarende rekombinant-plasmider, tilsvarende transformanter og fremstilling deraf og af beta-urogastron
SE8503228A SE8503228L (sv) 1984-07-02 1985-06-28 Ny beta-urogastron-gen
NL8501880A NL192116C (nl) 1984-07-02 1985-06-28 Beta-urogastron-genen, overeenkomstige recombinant plasmiden, overeen- komstige transformanten en de bereiding ervan en van beta-urogastron.
IT8505195A IT1210142B (it) 1984-07-02 1985-07-01 Nuovo gene beta-urogastrone, corrispondenti plasmidi ricombinanti, corrispondenti trasformanti e metodo per lapreparazione di questi e del beta-urogastrone.
KR1019850004708A KR920009543B1 (ko) 1984-07-02 1985-07-01 β-유로가스트론 유전자, 상응하는 재조합 플라스미드, 상응하는 형질전환체 및 그의 제조방법, 및 β-유로가스트론의 제조방법
GB8516591A GB2162851B (en) 1984-07-02 1985-07-01 Novel b-urogastrone gene, corresponding recombinant plasmids, corresponding transformants and preparations thereof and of b-urogastrone.
CH2812/85A CH670654A5 (ja) 1984-07-02 1985-07-01
FR858510072A FR2566799B1 (fr) 1984-07-02 1985-07-02 Gene de la b-urogastrone et sous-unites, plasmides et transformants correspondants et leur preparation, procede pour la production de b-urogastrone
DE19853523634 DE3523634A1 (de) 1984-07-02 1985-07-02 Ss-urogastron-gen, rekombinant-plasmide, transformanten, deren herstellung und herstellung von ss-urogastron

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6814380B2 (en) 2002-06-07 2004-11-09 Asteer Co., Ltd. Bumper reinforcement

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4870008A (en) * 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
GB8507666D0 (en) * 1985-03-25 1985-05-01 Wellcome Found Epidermal growth factor production
US4743679A (en) * 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
US5366081A (en) 1987-08-26 1994-11-22 United States Surgical Corporation Packaged synthetic absorbable surgical elements
US5306289A (en) 1987-08-26 1994-04-26 United States Surgical Corporation Braided suture of improved characteristics
US5226912A (en) 1987-08-26 1993-07-13 United States Surgical Corporation Combined surgical needle-braided suture device
US5472702A (en) * 1987-08-26 1995-12-05 United States Surgical Corporation Sterilization of growth factors
US5222978A (en) 1987-08-26 1993-06-29 United States Surgical Corporation Packaged synthetic absorbable surgical elements
GB2210618B (en) * 1987-10-08 1991-10-16 British Bio Technology Synthetic egf gene
IL89673A0 (en) * 1988-03-24 1989-09-28 Oncogen Novel polypeptides having growth factor activity and nucleic acid sequences encoding the polypeptides
US5102789A (en) * 1989-03-15 1992-04-07 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
US5359831A (en) 1989-08-01 1994-11-01 United States Surgical Corporation Molded suture retainer
CA2059245C (en) * 1991-02-08 2004-07-06 Michael P. Chesterfield Method and apparatus for calendering and coating/filling sutures
EP0652954B1 (en) * 1993-04-26 2001-06-20 Dae Woong Pharmaceutical Co., Ltd. A novel gene vector coding human epidermal growth factor and process for preparing the same
US5904716A (en) * 1995-04-26 1999-05-18 Gendler; El Method for reconstituting cartilage tissue using demineralized bone and product thereof
US20090192554A1 (en) 2008-01-29 2009-07-30 Confluent Surgical, Inc. Bioabsorbable block copolymer

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK339781A (da) * 1980-08-05 1982-02-06 Searle & Co Syntetisk gen
FR2488557A1 (fr) * 1980-08-13 1982-02-19 Ducellier & Cie Dispositif de basculement des projecteurs d'un vehicule automobile
US4532207A (en) * 1982-03-19 1985-07-30 G. D. Searle & Co. Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase
WO1983004030A1 (en) * 1982-05-06 1983-11-24 Applied Molecular Genetics, Inc. The manufacture and expression of genes for urogastrone and polypeptide analogs thereof

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6814380B2 (en) 2002-06-07 2004-11-09 Asteer Co., Ltd. Bumper reinforcement

Also Published As

Publication number Publication date
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KR920009543B1 (ko) 1992-10-19
GB2162851A (en) 1986-02-12
NL8501880A (nl) 1986-02-03
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DE3523634A1 (de) 1986-01-09
CA1304023C (en) 1992-06-23
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DE3523634C2 (ja) 1993-07-08

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