JP2561060B2 - 改良型ｒｎアーゼｔ１ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な改良型ＲＮアーゼ
Ｔ１、さらに詳しくは、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ
末端から４５番目のチロシンをトリプトファンに置換し
てその活性を向上させた改良型ＲＮアーゼＴ１、該改良
型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列、該ＤＮ
Ａ配列を含有する組み換えＤＮＡ発現ベクター、該ベク
ターで形質転換した宿主細胞、ならびに該改良型ＲＮア
ーゼＴ１の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】リボヌクレアーゼＴ１(ＥＣ３.１.２７.
３、以下ＲＮアーゼＴ１という)はコウジカビ、アスペ
ルギルス・オリザエ(Ａspergillus oryzae)が産生する
菌体外リボ核酸分解酵素であり、極めて厳密な基質特異
性を有し、１本鎖のリボ核酸およびリボヌクレオチド中
のグアノシン３'−リン酸部分のホスホジエステル結合
のみを選択的に切断する。この極めて厳密なグアニン特
異性の故に、ＲＮアーゼＴ１はＲＮＡの構造解析におい
て極めて重要な役割を果たしている。

【０００３】このＲＮアーゼＴ１の１次構造は既に決定
されており、この酵素がアミノ酸残基１０４個からな
り、分子内に２個のジスルフィド結合を有する、図１に
示したようなポリペプチドであることが知られている
(文献１および２)。またＸ線結晶構造解析により、この
ＲＮアーゼＴ１の塩基認識部位が、アミノ末端から４２
〜４５番目の位置に存在するＴyr⁴²−Ａsn⁴³−Ａsn⁴⁴−
Ｔyr⁴⁵配列であることも知られている(文献３、４およ
び５)。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、ＲＮＡ
の構造解析に有用なこのＲＮアーゼＴ１を修飾して、さ
らに有用な酵素を得るべく種々検討を行なった結果、天
然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から４５番目のチロシ
ンをトリプトファンに置換することにより、その活性を
向上させうることを見い出し本発明を完成するに至っ
た。すなわち本発明は、天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ
末端から４５番目のチロシンをトリプトファンに置換し
た改良型ＲＮアーゼＴ１を提供するものである。更に本
発明は、該改良型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮ
Ａ配列、該ＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ発現ベ
クター、該ベクターで形質転換した宿主細胞、ならびに
該改良型ＲＮアーゼＴ１の製造方法を提供するものであ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の改良型ＲＮアー
ゼＴ１は以下のようにして製造することができる。始め
に、改良型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列
を含有し、かつ５'側にＢglII部位および３'側にＳalＩ
部位を有するＢglII−ＳalＩフラグメントを調製する。
このフラグメントの５'側には、ＢglII部位を作製する
ためＴで始まるコドンたとえば今回の場合Ｐheに対応す
るＴＴＣと、後に融合蛋白からの切断に必要なＭetに対
応するコドンＡＴＧを、ＲＮアーゼＴ１をコ−ドしてい
るＤＮＡ配列の前に入れた。また３'側には、ペプチド
鎖の合成を停止させるために２種類の停止コドンＴＡ
Ａ、ＴＡＧを、ＲＮアーゼＴ１をコ−ドしているＤＮＡ
配列の後に入れた。このフラグメントの全ＤＮＡ配列お
よび該ＤＮＡ配列がコードしているアミノ酸配列を以下
の配列式１に示す。尚、天然型ＲＮアーゼＴ１を所望の
場合には、４５番目のアミノ酸残基に対応するコドンＴ
ＧＧおよびその相補的な配列ＣＣＡをそれぞれＴＡＴお
よびＡＴＡに置換すればよい(これにより４５番目のア
ミノ酸ＴrpがＴyrに換わる)。

【化２】

【化３】

【０００６】このＤＮＡフラグメントの調製は、たとえ
ば以下のようにして行なうことができる。すなわち、全
ＤＮＡ配列をいくつかのオリゴヌクレオチド単位に分割
し、各オリゴヌクレオチドをリン酸トリエステル法ある
いはホスファイト法等の既知の方法(文献６および７)に
よって合成する。次いで、得られたオリゴヌクレオチド
を図２に示したようにしてライゲートし(文献６および
１０)、３'側にＳalＩ部位、５'側にＢglII部位を有す
る目的のＤＮＡフラグメントを得ることができる。

【０００７】次に、上記ＢglII−ＳalＩフラグメントを
組み込んだ組み換えＤＮＡ発現ベクターを図３のように
して構築する。すなわち、プラスミドpＧＨ−Ｌ９をＢg
lIIおよびＳalＩ制限酵素で消化し、得られたフラグメ
ントと、上記のＢglII−ＳalＩフラグメントをライゲー
トしてプラスミドpＴ４５Ｗを得る。ここで用いるプラ
スミドpＧＨ−Ｌ９は大腸菌(Ｅscherichia coli、以下
Ｅ.コリと称する)trpプロモーター、ヒト成長ホルモン
(以下hＧＨと称する)およびアンピシリン耐性遺伝子(Ａ
p^r)を含有し、このhＧＨ遺伝子の５'側から２／３の位
置にＢglII部位およびhＧＨ遺伝子の３'側にＳalＩ部位
を有している(このhＧＨ遺伝子のＢglII部位より上流側
がコードしているアミノ酸配列をhＧＨのＡＢ部分、下
流側がコードしているアミノ酸配列をhＧＨのＣ部分と
称する)。従って、得られるプラスミドpＴ４５Ｗは、メ
チオニンを介してhＧＨのＡＢ部分と改良型ＲＮアーゼ
Ｔ１とが結合した融合タンパク質を発現する。ＲＮアー
ゼＴ１分子はメチオニンを含有していないので、この融
合タンパク質を、後に、メチオニンのＣ末端部で特異的
に切断させる臭化シアンを作用させることにより、融合
タンパク質から分離することができる。尚、上記プラス
ミドpＴ４５Ｗの構築にプラスミドpＧＨ−Ｌ９を用いた
のは、Ｅ.コリtrpプロモーターによるＲＮアーゼＴ１遺
伝子の直接発現がうまくいかず、一方hＧＨの合成遺伝
子がＥ.コリtrpプロモーターの制御下で安定かつ効率的
に発現されるという知見に基づいている。プラスミドp
ＧＨ−Ｌ９は、大腸菌ＨＢ−１０１に導入されて工業技
術院微生物工業研究所に寄託されており(寄託日:昭和６
１年１１月２２日、ＦＥＲＭ p−９０５８)、プラスミ
ドpＧＨ−Ｌ９の供給源として利用することができる。

【０００８】次いで、常法によりプラスミドpＴ４５Ｗ
をアンピシリン感受性の大腸菌、たとえばＥ.コリＨＢ
１０１(Ｆ^-,hsdＳ２０{rＢ^-,mＢ^-},recＡ１３,ara−１
４,proＡ２,lacＹ１,galＫ２,rpsＬ２０(Ｓm^r),xyl−
５,mtl−１,supＥ４４,λ^-)に導入し、アンピシリン含
有培地で形質転換体を選択する。この形質転換体をアン
ピシリンを含有する適当な増殖培地で増殖させ、プラス
ミドpＴ４５Ｗを取り出し、このプラスミドが正しい塩
基配列を有していることをジデオキシ法(文献１４)によ
り確認する。この様にして確認されたプラスミドpＴ４
５Ｗを含有する形質転換体、即ち大腸菌ＨＢ−１０１／
pＴ４５Ｗは工業技術院微生物工業研究所に寄託されて
いる(寄託日:昭和６１年１１月２２日、ＦＥＲＭ p−９
０５７)。

【０００９】上記形質転換体を増殖させ、適当なＯＤ
₆₆₀値となった時に３−インドールアクリル酸を加える
ことにより、融合タンパク質を発現させる。融合タンパ
ク質発現量の測定は、hＧＨのＡＢ部分とＲＮアーゼＴ
１との融合タンパク質が、完全なhＧＨの５％の効率で
抗体によって認識されるという知見に基づいて行なっ
た。すなわち、菌体を集め、常法によりこれを溶菌し、
ＤＮアーゼＩ処理した後、ファデバス(Ｐhadebas)hＧＨ
ＰＲＩＳＴキットによるhＧＨのラジオイムノアッセ
イによって、融合タンパク質の定量を行なう(文献１
１)。

【００１０】融合タンパク質からのＲＮアーゼＴ１の切
り出しは、既述したように、メチオニンに特異的な臭化
シアンを用いて行なう。臭化シアンによる切断反応終了
後の溶液をＮＨ₄ＨＣＯ₃に対して透析した後酵素活性を
測定する。すなわち、この溶液に、５' 水酸基を[γ³²
−Ｐ]ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼでラベル
した基質³²pＧpＣを加えて反応させ、ホモクロマトグラ
フィー法(文献1２)によって³²pＧpの初期生成量を測定
し、これを時間に対してプロットし、その傾きから初速
度を求めることによって酵素活性測定を行なう。測定結
果を後記表１に示すが、本発明の改良型ＲＮアーゼＴ１
は天然型ＲＮアーゼＴ１に比べてその活性が４２％高い
ことがわかった。

【００１１】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明する。実施例で使用したポリヌクレオチドキナー
ゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＢglIIおよびＳalＩ制限酵素は
(株)宝酒造より入手した。ＤＮアーゼＩはベーリンガー
・マンハイム社より入手した。リゾチームはシグマ社よ
り入手した。基質pＧpＣは、オーツカ等の方法(文献８)
に従ってジヌクレオチドＧpＣを合成した後、その５'水
酸基をポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化して調製し
た(文献９)。

【００１２】実施例１ オリゴデオキシヌクレオチドの
合成 Ａ．ＭＵ１０およびＭＬ１０以外のオリゴデオキシヌク
レオチドの固相法による合成 Ａ−１．ヌクレオシド樹脂の合成 以下のフロ−チャ−ト１に示すようにしてヌクレオシド
樹脂１０を合成した。

【化４】

【化５】

【００１３】１） ３'−{５'−Ｏ−ジメトキシトリチ
ル−(デオキシリボヌクレオシド)}モノサクシネート
(７)の合成 ３'−(５'−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジニル)モノサ
クシネ−トの合成例を示す。ジメトキシトリチルチミジ
ン２.７２g(５mモル)をピリジンと共沸した後、塩化メ
チレン２０mlに溶解し、無水コハク酸７５０mg(７.５m
モル)および４−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)９
１６mg(７.５mモル)を加えて２時間撹拌した。ＴＬＣ(
ＣＨＣl₃:ＭeＯＨ＝２０:１) で原料の消失を確認し、
０.５Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄(pＨ５)(２０ml×２回)で洗浄した
後、水洗(２０ml×２回)し溶媒を留去した。精製はＣ１
８シラン化シリカゲルカラムにより行なった。収量 ３.
１４g(４.８８mモル)、収率９７.５％。

【００１４】２) ペンタクロロフェニル３'−{５'−Ｏ
−ジメトキシトリチル−(デオキシリボヌクレオシド)}
サクシネ−トの合成 ペンタクロロフェニル３'−(５'−Ｏ−ジメトキシトリ
チル チミジニル)サクシネ−トの合成例を示す。ジメト
キシトリチルチミジニルモノサクシネ−ト３.１４g(４.
９mモル)をＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド３４.１mlに溶
解し、ペンタクロロフェノ−ル１.４３g(５.４mモル)と
Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド１.５１g(７.
３mモル)を加えて室温で一晩撹拌した。ＴＬＣ(ＣＨＣl
₃:ＭeＯＨ＝１０:１)で反応の完結を確認した後、沈澱
を濾別し溶媒を留去した。残査にベンゼン１５mlを加え
て析出する不溶物を濾別した後、ベンゼンを留去した。
この残査をクロロホルム１５mlに溶解し、n−ペンタン
中に滴下して粉末化した。収量３.８９g(４.３５mモ
ル)、収率８９.２％。

【００１５】３) ヌクレオシド樹脂(１０)の合成 チミジン−ポリスチレン樹脂(Ｎ・Ｔ)の合成例を示す。
アミノメチル化ポリスチレン(９、１％ ジビニルベンゼ
ン、ＮＨ₂:０.２０mモル／g)２.５g(０.５mモル)をＮ,
Ｎ−ジメチルホルムアミド１５mlに懸濁し、ペンタクロ
ロフェニル３'−(５'−Ｏ−ジメトキシトリチル チミジ
ニル)サクシネ−ト１.３４g(１.５mモル)とトリエチル
アミン０.２３ml(１.１５mモル)を加えて一晩振盪し
た。反応液を濾過し、樹脂をＮ,Ｎ−ジメチルホルムア
ミド(２０ml×２回)およびピリジン(２０ml×２回)で洗
浄した後、０.１Ｍ ４−ジメチルアミノピリジンのピリ
ジン溶液４.５mlと無水酢酸０.５mlを加えて１０分間振
盪した。反応液を濾過し、樹脂をピリジン(２０ml×３
回)、ジクロロメタン(２０ml×３回)およびエ−テル(２
０ml×３回)で順次洗浄後乾燥させた。

【００１６】ヌクレオシドの定量は、チミジン−ポリス
チレン樹脂１０mgに２％ベンゼンスルホン酸の塩化メチ
レン−メタノ−ル(７:３ v／v)溶液２mlを加えて１分間
振盪し、反応液の１／１００をとって溶媒を留去した
後、残査にＨＣlＯ₄−ＥtＯＨ(３:２ v／v)３mlを加
え、λ＝５００nmにおける吸光度を測定することにより
行なった。以上、塩基がチミンであるヌクレオシドにつ
いて記載したが、他の塩基を持つヌクレオシド樹脂の場
合も同様の方法で調製した。

【００１７】Ａ−２．オリゴデオキシヌクレオチドの合
成 Ａ−１で得たヌクレオシド樹脂２０〜３０mg(３〜５μ
モル)に対し下記の表１の操作を繰り返すことにより行
なった。工程１〜５で、塩化メチレン−メタノ−ル(７:
３ v／v)中の２％ベンゼンスルホン酸により５'水酸基
の保護基であるジメトキシトリチル基を除去し、次に工
程６〜９で、常法により合成したダイマ−ブロックまた
はモノマ−を樹脂に対して３〜４当量用いて縮合した。
縮合剤メシチレンスルホニルニトロトリアゾリドは樹脂
に対して１５〜２０当量用い、縮合反応は、４０℃で２
０分間、３０℃で３０分間、室温(２０〜２５℃)で４０
分間行なった。縮合させた後、前記フローチャートの工
程１０〜１２で未反応の５'−水酸基を、４−ジメチル
アミノピリジン触媒下、無水酢酸でキャッピングを行な
った。この一連の操作を目的鎖長に達するまで行なっ
た。(フロ−チャ−ト１の化合物番号１１〜１３参照)。

【表１】 工程 処 理 試 剤 ま た は 溶 媒 量 反応時間 操作回数 １ ＣＨ₂Ｃl₂−ＭeＯＨ(７:３) ２ml ０.５分 ３ ２ ２％ ＢＳＡ ２ml １分 １ [ＣＨ₂Ｃl₂−ＭeＯＨ(７:３)中] ３ ＣＨ₂Ｃl₂−ＭeＯＨ(７:３) ２ml ０.５分 １ ４ ２％ ＢＳＡ ２ml １分 １ [ＣＨ₂Ｃl₂−ＭeＯＨ(７:３)中] ５ ＣＨ₂Ｃl₂−ＭeＯＨ(７:３) ２ml ０.５分 ２ ６ ピリジン ２ml ０.５分 ３ ７ ピリジン ０.３ml 共蒸発 １ ８ ダイマー・ブロック(３−４eq.) ２０−３０mg 共蒸発 １ (ピリジン中) ／０.３ml ９ ＭＳＮＴ(１５−２０eq.) ２０−３０mg ２０分 １ (ピリジン中) ／０.３ml (４０℃) 10 ピリジン ２ml ０.５分 ２ 11 ０.１Ｍ ＤＭＡＰ(ピリジン中) １.８ml ３分 １ Ａc₂Ｏ ０.２ml 12 ピリジン ２ml ０.５分 ３

【００１８】Ａ−３．オリゴデオキシヌクレオチドの樹
脂からの切り出し、脱保護、精製および同定 目的鎖長に達したヌクレオチド樹脂をジオキサンで洗浄
した後、０.５Ｍ １,１,３,３−テトラメチルグアニジ
ウム−syn−ピリジン−２−アルドキシメ−トのジオキ
サン−水(９:１)溶液１mlを加え、３０℃で一晩振盪し
た。溶液を濾過した後、樹脂を５０％ピリジン水で洗浄
した。濾液と洗液を留去し、残査にピリジン０.５mlと
アンモニア水(２８％ ＮＨ₄ＯＨ)１０mlを加えて封管
し、５５℃で５時間加熱した後、溶媒を留去し、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフィ−により精製した。目的物
を含むフラクションについて溶媒を留去した後、８０％
酢酸１mlを加えた。２０分後溶媒を留去し、水で共沸を
行なった。残査を水３mlに溶解し、酢酸エチル(３ml×
３回)でトリタノ−ルを抽出除去した後、水層を留去し
た。得られた完全脱保護遺伝子断片をＣ１８ＨＰＬＣに
より分析分取を行なった。更にこれをイオン交換ＨＰＬ
Ｃにより分析し、不純物が認められる時は分取し、ＨＰ
ＬＣで単一ピ−クとなるまで精製を行なった。精製した
遺伝子断片は二次元ホモクロマトグラフィ−(Ｍobility
Shift Analysis)および５'−末端分析によりその塩基
配列が正しいことを確認した。

【００１９】Ｂ．オリゴデオキシヌクレオチド ＭＵ１
０およびＭＬ１０の合成 原料となる４種のホスホアミダイトはヌクレオシドの塩
基部のアミノ基を常法により保護した後、文献７の方法
に従ってアミデ−ト体としたものを用いた。オリゴヌク
レオチドの合成はアプライド・バイオシステム社のＤＮ
Ａシンセサイザ−(Ｍodel ３８０Ａ)を用いて行なっ
た。脱保護は５'水酸基の保護基であるジメトキシトリ
チル基以外の保護基についてＤＮＡシンセサイザ−中で
行い、以後、上記Ａ−３と同様にしてオリゴヌクレオチ
ドの精製、同定を行なった。

【００２０】実施例２ 改良型ＲＮアーゼＴ１をコード
しているＤＮＡ配列を含有するＢglII−ＳalＩフラグメ
ントの調製 Ａ．５'リン酸化 Ｕ１、Ｌ２１以外の各オリゴヌクレオチド０.１ＯＤ(≒
７５０pモル、５μg)を、５０mＭ トリス・ＨＣl(pＨ
８.０)、１０mＭ ＭgＣl₂、１０mＭ β−ＭＥ、１mＭ
スペルミン緩衝液中、１０μモルのＡＴＰと６Ｕのポリ
ヌクレオチドキナーゼを加えて１０μlとし、３７℃で
１時間反応させ、５'水酸基をリン酸化した(Ｕ１とＬ２
１の５'水酸基は制限酵素部位となっているので、先に
リン酸化してから結合反応を行なうとダイマーになるた
め、結合反応を行なってからリン酸化を行なった)。反
応後９０℃で３分間加熱して酵素を失活させた。

【００２１】Ｂ．セグメントの調製 Ｕ１、Ｌ２１および５'リン酸化したオリゴヌクレオチ
ドを、図２に示した各セグメント(Ｉ〜IV)の構成要素ご
とに１本のチューブに集めて混和し、６６mＭトリス・
ＨＣl(pＨ７.６)、６.６mＭ ＭgＣl₂、０.５mＭ ＡＴＰ
緩衝液１５０μlとなるようにして９０℃で３分間熱処
理を行ない、直ちに氷につけて急冷した。１０分後再び
７５℃に加熱してから室温(２０℃〜２５℃)まで１〜２
時間かけて放冷し、アニーリングを行なった。この後１
５℃で１０分間保った後、β−ＭＥを１０mＭになるよ
うに加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを３０Ｕ加え、１５℃で
１２〜１５時間反応させた(セグメントIIIについては反
応の収率を上げるため２つに分けそれぞれをアニーリン
グさせ、２〜３時間結合反応を行なわせた後、１つに混
和した)。反応後、６５℃で５分間加熱して酵素を失活
させ、続いてエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。
１０％ＰＡＧＥ(ポリアクリルアミド電気泳動、サイズ
(０.１×２０×２０cm)、ＣＶ１７５Ｖ、３〜４時間)を
行ない、目的の鎖長のセグメントのバンド部から電気溶
離によりＤＮＡを回収し、フェノール処理、エタノール
沈澱を行ない、各セグメント１５〜２５μg(２２５〜３
７５pモル)を得た。

【００２２】Ｃ．ＢglII−ＳalＩフラグメントの調製 各セグメントを３.３μg(５０pモル)用いて前述の緩衝
液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを１５Ｕ加えて結合反応を行
なった。この際アニーリングは行なわず、２０℃で１２
〜１５時間反応させた。反応後６５℃で５分間処理し、
エタノール沈澱後、５％ＰＡＧＥ(サイズ ０.１×２０
×２０cm)を行なった。ＲＮアーゼＴ１遺伝子の鎖長に
対応する部分のバンドを電気溶離により回収し、フェノ
ール処理、エタノール沈澱を行なった。さらに前述の条
件下、６Ｕのポリヌクレオチドキナーゼを用いてフラグ
メントの両５'末端部をリン酸化して、改良型ＲＮアー
ゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列を含有するＢglII−
ＳalＩフラグメント約１μg(３.８pモル)を得た。

【００２３】実施例３ プラスミドpＴ４５Ｗの構築 改良型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列を含
有する組み換えＤＮＡ発現ベクター、プラスミドpＴ４
５Ｗは、イケハラ等の方法(文献６および１０)に従い、
以下のようにして調製した(図３参照)。緩衝液{２０mＭ
トリス・ＨＣl(pＨ７.６)、７mＭ ＭgＣl₂、１０mＭ
β−ＭＥ、１７５mＭ ＮaＣl}１００μl中のプラスミド
pＧＨ−Ｌ９(１０μg)を、３７℃で３時間、ＢglIIおよ
びＳalＩ制限酵素それぞれ２０単位で消化した。この溶
液をフェノール抽出し、次いでエーテル洗浄することに
よって制限酵素を除去した。次いでＢglII−ＳalＩ消化
フラグメントをエタノール沈殿させ、１０mＭトリス−
ＨＣl(pＨ７.５)および１mＭのＥＤＴＡ溶液５０μlに
溶解した。このＢglII−ＳalＩフラグメント(０.６７p
モル)と実施例２で調製したＢglII−ＳalＩフラグメン
ト(２〜５pモル)を、２０℃で一晩、Ｔ４ ＤＮＡリガ
ーゼ(１．２単位)を用いてライゲートした(合計容量２
０μl)。この溶液をフェノール抽出した後、ＤＮＡをエ
タノール沈殿させ、得られた沈殿ペレットをＥ.コリの
形質転換に用いた。

【００２４】実施例４ Ｅ.コリＨＢ１０１の形質転換 モリソン等の方法(文献１５)により予め調製したコンピ
テントな細胞１００μlおよび実施例３で調製したベク
ターＤＮＡ溶液１０μlを混合し、１時間放置した後、
４２℃で７５秒間処理し、室温で５分間放置した。これ
にＬＢ培地９００μlを加え、３７℃で１時間培養し
た。これを集菌し、ＬＢ培地１００μlに懸濁し、寒天
培地[１.５％(w／v)寒天、ＬＢ、４０μg／mlアンピシ
リン]にまいて３７℃で一晩培養した。次いで、形質転
換体を２０μg／mlのアンピシリンを含有するＭ９−カ
ザミノ酸培地で増殖させた。菌体を集めて溶菌し、プラ
スミドを回収した。ジデオキシ法(文献１４)によってこ
のプラスミドの塩基配列を調べ、ＢglII−ＳalＩフラグ
メントを含有していることを確認し、このプラスミドを
pＴ４５Ｗと命名した。

【００２５】実施例５ 融合タンパク質の発現および粗
酵素の調製 Ａ．融合タンパク質の発現 ０.２％(重量／容量)カザミノ酸および４０μg／mlアン
ピシリンを含有するＭ９培地[５.５g／ＬのＮa₂ＨＰ
Ｏ₄、３g／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、５g／ＬのＮaＣl、１g／Ｌ
のＮＨ₄Ｃl、０.４％(重量／容量)のブドウ糖、１mＭの
ＭgＳＯ₄、および０.１mＭのＣaＣl₂]５ml中、３７℃で
約１５時間、実施例４で調製したＥ.コリＨＢ１０１の
形質転換体、Ｅ.コリＨＢ１０１／pＴ４５Ｗを前培養し
た。次いで、この前培養液１.５mlを、上記のカザミノ
酸およびアンピシリン含有のＭ９培地５０mlに加え、３
７℃で振盪培養した。１〜１.５時間後、ＯＤ₆₆₀＝０.
０１〜０.０２となった時にＩＡＡ(３−インドールアク
リル酸)を終濃度が４０μg／mlになるように加え、hＧ
ＨのＡＢ部分と改良型ＲＮアーゼＴ１の融合タンパク質
の発現を誘導し、さらに７時間培養した。

【００２６】Ｂ．融合タンパク質発現量の測定 集菌後、菌体をＴＥＮ[１０mＭトリス−ＨＣl(pＨ８.
０)、１mＭのＥＤＴＡおよび０.１ＭのＮaＣl]で洗浄
し、次いで、５０mＭトリス−ＨＣl(pＨ８.０)、５０m
ＭのＥＤＴＡ、１５％(重量／容量)シュクロースおよび
０.０２５％(重量／容量)ＳＤＳからなる溶液にリゾチ
ームを１mg／mlになるように加えた溶液中に入れて、０
℃で３０分間放置した。次いで、９００μlの１５０mＭ
トリス−ＨＣl(pＨ７.５)、２８０mＭ ＭgＣl₂、４mＭ
ＣaＣl₂および１００μlの１mg／mlＤＮアーゼＩを加え
て、０℃で３０分間放置し、その後凍結乾燥した。これ
を用いて、ファデバスhＧＨ ＰＲＩＳＴキットによるh
ＧＨのラジオイムノアッセイにより、融合タンパク質の
発現量を測定した(文献１１)。その結果、融合タンパク
質の発現量は、Ｍ９培地１００mlあたり１８.９μg、全
タンパク質あたり０.３１％であることがわかった。

【００２７】Ｃ．改良型ＲＮアーゼＴ１の融合タンパク
質からの切り出し 実施例５−Ｂで得た凍結乾燥物を用いて改良型ＲＮアー
ゼＴ１の切り出しを行なった。７０％ギ酸および１０m
Ｍの２−メルカプトエタノールの溶液に臭化シアンを５
mg／mlとなるように加えた。この溶液にタンパク質を３
mg／mlになるように加え、４℃で２４時間反応させた。
反応後、５０〜１０mＭのＮＨ₄ＨＣＯ₃に対して透析を
行ない、ギ酸およびＢrＣＮを除き、液が中性であるこ
とを確認してこれを活性測定用の粗酵素とした。

【００２８】Ｄ．ＲＮアーゼＴ１活性の測定 ５'水酸基を[γ−³²Ｐ]ＡＴＰとポリヌクレオチドキナ
ーゼでラベルした基質³²pＧpＣの濃度を１５０μＭ、改
良型ＲＮアーゼＴ１の濃度を０.５ng／μl(４５.１nＭ)
にし、トリス−ＨＣl(pＨ７.５)およびＥＤＴＡの濃度
をそれぞれ５０mＭおよび１mＭにした全量２０μlの溶
液を３７℃で反応させた。反応開始から０、２、５、１
０、１５および３０分後に３μlづつＤＥＡＥ−セルロ
ースプレートにスポットし、ホモミックスVIを用いてホ
モクロマトグラフィー(文献１２)を行なった。Ｘ線フイ
ルムを感光させ、それをもとにしてプレートの各スポッ
ト部分を切り取ってバイアルに入れ、液体シンチレーシ
ョンカウンターによって放射能を測定した。³²pＧpの生
成量を時間に対してプロットし、その傾きから初速度を
求めた。得られた結果を、天然型ＲＮアーゼＴ１につい
て同様に試験して得た結果と合わせ表２に示す。

【表２】 供試酵素 初 速 度 相対活性 （pモル／分／μl） （％） 天然型ＲＮアーゼＴ１ ３.５ ±０.４ １００ 改良型ＲＮアーゼＴ１ ４.９７±０.４７ １４２

【００２９】引用文献 １．タカハシ(Ｋ.Ｔakahashi)、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol．Ｃhem.)、２４
０、２１１７(１９６５) ２．タカハシ(Ｋ.Ｔakahashi)、ジャーナル・オブ・バ
イオケミストリー(Ｊ.Biochem．)、９８、８１５(１９
８５) ３．ハイネマン等(Ｕ.Ｈeinemann et al.)、ネイチャ
ー(Ｎature)、２９９、２７(１９８２) ４．スギオ等(Ｓ.Ｓugio et al.)、ＦＥＢＳレターズ
(ＦＥＢＳ Ｌett.)、１８１、１２９(１９８５) ５．スギオ等(Ｓ.Ｓugio et al.)、ＦＥＢＳ Ｌet
t.、１８３、１１５(１９８５) ６．イケハラ等(Ｍ.Ｉkehara et al.)、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サンエ
ンシーズ・米国( Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)、８
１、５９５６(１９８４) ７．バロン等(Ａ.Ｄ.Ｂarone
et al.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucl
eic Ａcids Ｒes.)、１２、４０５１(１９８４) ８．オーツカ等(Ｅ.Ｏhtsuka et al.)、テトラヘドロ
ン(Ｔetrahedron)、４０、４７(1９８４) ９．リチャードソン(C.C.Ｒichardson)、Ｐroc.Ｎatl.
Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ、５４、１５８(１９６５) 10．イケハラ等(Ｍ.Ｉkehara et al.)、Ｐroc．Ｎatl.
Ａcad.Ｓci.、８３、４６９５(１９８６) 11．ゲーデル等(Ｄ.Ｖ.Ｇoeddel et al．)、Ｎatur
e、２８１、５４４(１９７９) 12．ジェイ等(Ｅ.Ｊay et al.)、Ｎucleic Ａcids
Ｒes.、１、３３７(１９７４) 13．草間慶一、トレーサー実験法(上)(生化学実験講座
６)、日本生化学会編、東京化学同人、２０１(１９７
７) 14．サンガー等(Ｆ.Ｓanger et al.)、Ｐroc．Ｎatl.
Ａcad.Ｓci.、７４、５４６３(１９７７) 15．モリソン等(Ｐ.Ａ.Ｍorrison et al．)、メソッ
ズ・エンザイモル(Ｍethods Ｅnzymol．)、６８、３２
６(１９７９）

【図面の簡単な説明】

【図１】 天然型ＲＮアーゼＴ１の１次構造を示す模式
図である。

【図２】 改良型ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮ
Ａ配列を含有するＢglII−ＳalＩフラグメント調製の工
程図である。

【図３】 組み換えＤＮＡ発現ベクター、プラスミドp
Ｔ４５Ｗ構築の工程図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から
   ４５番目のチロシンをトリプトファンに置換した改良型
   ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 以下の塩基配列： 【化１】 で示される請求項１に記載のＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から
   ４５番目のチロシンをトリプトファンに置換した改良型
   ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列を含有する
   組み換えＤＮＡ発現ベクター。
4. 【請求項４】 プラスミドpＴ４５Ｗである請求項３に
   記載のベクター。
5. 【請求項５】 天然型ＲＮアーゼＴ１のアミノ末端から
   ４５番目のチロシンをトリプトファンに置換した改良型
   ＲＮアーゼＴ１をコードしているＤＮＡ配列を含有する
   組み換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌細胞。
6. 【請求項６】 Ｅ.コリＨＢ１０１／pＴ４５Ｗである請
   求項５に記載の細菌細胞。