CH670654A5

CH670654A5 -

Info

Publication number: CH670654A5
Application number: CH2812/85A
Authority: CH
Inventors: Shigemasa Aoki; Hideo Ohgai; Akio Horinaka; Hiroshi Hiramatsu; Syoichi Koumoto; Akira Nishimura; Aizo Matsushiro
Original assignee: Earth Chemical Co
Priority date: 1984-07-02
Filing date: 1985-07-01
Publication date: 1989-06-30
Also published as: DK291885D0; SE8503228L; FR2566799B1; DE3523634C2; KR920009543B1; DK291885A; NL8501880A; FR2566799A1; GB2162851A; AU4411185A; DE3523634A1; JP2554459B2; GB8516591D0; IT8505195A0; KR860001186A; AU599003B2; IT1210142B; JPS6115691A; GB2162851B; NL192116B

Description

BESCHREIBUNG Die Erfindung betrifft ein neues ß-Urogastron-Gen, entsprechende rekombinante Plasmide, entsprechende Trans-65 formanten und deren Herstellung sowie die Herstellung von ß-Urogastron.

ß-Urogastron ist ein Polypeptid-Hormon, das in den Speicheldrüsen des Menschen usw. synthetisiert wird (vgl.

5

670 654

beispielsweise Heitz et al., Gut, 19,408—413 (1978)). Es weist eine 53 Aminosäuren in der nachfolgenden Sequenz umfassende Primärstruktur auf (vgl. Gregory et al., Int. J. Peptide Protein Res., 9,197-118 (1977)).

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg

In der nachfolgenden Beschreibung werden Aminosäuren durch die folgenden Symbole dargestellt:

Ser: Serin

Glu: Glutaminsäure

Pro: Prolin

His: Histidin

Tyr: Tyrosin Met: Methionin

Ala: Alanin

Gin: Glutamin

Trp: Tryptophan

Asn: Asparagin

Asp: Asparaginsäure

Cys: Cystein

Leu: Leucin

Gly: Glycin

Val: Valin

Ile: Isoleucin

Lys: Lysin

Arg: Arginin

Phe: Phenylalanin

ß-Urogastron weist physiologische Aktivitäten wie die Unterdrückung der Sekretion von Magensäure und die Förderung des Zellenwachstums auf (vgl. Eider et al., Gut, 16, 887—893 (1975)), und es ist daher bei der Behandlung von Geschwüren und Wunden von Nutzen.

Da ß-Urogastron in kleineren Mengen im menschlichen Urin exkretiert wird, wird diese Verbindung zur Zeit durch Extraktion aus Urin, Trennung und Reinigung hergestellt. Dieses Verfahren führt jedoch zum Problem, dass grosse Mengen der Verbindung nicht leicht erhalten werden können, weil die Verbindung eine mindere Komponente des menschlichen Urins ist.

Andererseits beschreibt die veröffentlichte Europäische Patentanmeldung Nr. 0 046 039 einen Versuch zum Herstellen von ß-Urogastron mit Hilfe eines gentechnischen Verfahrens unter Verwendung eines synthetischen ß-Urogastron-Gens. Die vorstehend genannte Publikation beschreibt zwar ein Gen mit einer spezifischen Nukleotidsequenz, sie lehrt je-5 doch nicht, ob es andere Gene gibt, die fähig sind, nach einem ähnlichen Verfahren ß-Urogastron auszudrücken, und sie erwähnt auch nicht ein solches Gen mit einer besonderen Nukleotidsequenz.

Eine grosse Anzahl von Nukleotidsequenzen können für io die Aminosäuresequenz von ß-Urogastron codieren. Nicht-destoweniger ist es schwierig vorauszusehen, welches dieser Gene fähig ist, nach einem gentechnischen Verfahren ß-Urogastron auszudrücken, oder welches Gen zur Anwendung in gentechnischen Verfahren am meisten geeignet ist. 15 Daher sind viele Experimente und erfinderische Bemühungen nötig, um die am meisten geeignete Nukleotidsequenz zu bestimmen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues ß-Urogastron-Gen zu schaffen, das in der Nukleotidsequenz von dem in 20 der vorgenannten Publikation beschriebenen Gen vollständig verschieden ist und fähig ist, nach einem gentechnischen Verfahren ß-Urogastron auszudrücken, ferner ein Gen zu schaffen, das zum Ausdrücken von ß-Urogastron nach gentechnischen Verfahren geeignet ist, sowie neue, dem neuen ß-25 Urogastron-Gen entsprechende rekombinante Plasmide und Transformanten zu schaffen, und schliesslich ein Verfahren zu schaffen, das die Herstellung von ß-Urogastron in beträchtlichen Mengen und mit einem hohen Reinheitsgrad unter Verwendung des neuen Gens nach einem gentechni-30 sehen Verfahren ermöglicht.

Diese und andere Aufgaben der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.

Die Erfinder haben viele Experimente ausgeführt und gefunden, dass ein Gen I mit der nachfolgenden Nukleotidse-35 quenz die Aufgabe der Erfindung löst.

Gen I:

A

T

A

G

C

G

A

T

C

T

G

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T

G

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A

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A

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C

A

5?

Die Buchstaben stehen für die Purin- und Pyrimidin-Basen, welche die Nukleotidsequenz bilden. Die hier für die Basen verwendeten Symbole bedeuten folgendes: A ist Adenin, G ist Guanin, C ist Cytosin und T ist Thymin.

65 Das Gen I ist vollständig neu und an sich nicht naheliegend. Es wird durch Bestimmung der spezifizierten Nukleotidsequenz unter einer sehr grossen Anzahl von möglichen Nukleotidsequenzen erhalten.

670 654

Das Gen I hat folgende kennzeichnende Eigenschaften:

(1) ß-Urogastron kann auf sehr vorteilhafte Weise nach gentechnischen Verfahren ausgedrückt werden.

(2) Die Trinukleotid-Codons, welche das Gen I bilden, sind alle für Wirtszellen annehmbar, und dies insbesondere für Escherichia Coli, das leicht und gefahrlos erhältlich ist, was einen hohen Ausdrucksgrad gewährleistet.

(3) Spezifische Restriktionsenzym-Erkennungsstellen können innerhalb des Gens und an dessen beiden Enden vorgesehen werden, und die Erkennungsstellen können wie gewünscht manipuliert werden, um die Kupplung mit anderen Genen und die Insertion in den Plasmidvektor zu erleichtern.

(4) Zur Herstellung des Gens I können dessen bildende Oligonukleotide zu Blöcken und die Blöcke zu Untereinheiten leicht, wie gewünscht und im wesentlichen frei von unerwünschten Kupplungen gekuppelt werden.

(5) Beim Ausdrücken von ß-Urogastron als fusioniertes Protein sind Mittel vorhanden, mit welchen ein unnötiger Teil leicht entfernt werden kann, um das gewünschte ß-Urogastron zu ergeben.

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Wenn ß-Urogastron tatsächlich unter Verwendung des Gens I auszudrücken ist, können Restriktionsenzym-Erkennungsstellen am vorderen und/oder am hinteren Ende des Gens vorgesehen werden, um die Kupplung mit den für das 5 Ausdrücken benötigen Promotor, Shine-Dalgarno-Sequenz (nachstehend gelegentlich als «SD-Sequenz» bezeichnet), Vektor usw. zu gewährleisten. Zudem kann, wenn erforderlich, ein Start-Codon und/oder ein Stop-Codon beziehungsweise aufwärts und abwärts vom Gen vorgesehen werden, io Die Wahl von Erkennungsstellen, Start-Codon und Stop-Codon ist nicht besonders eingeschränkt, es können die gewünschten Arten eingesetzt werden.

Im nachstehenden wird ein Beispiel eines Gens mit einer expandierten Sequenz (im nachstehenden als «Gen II» be-15 zeichnet) angegeben. Dieses Gen umfasst eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle und ein Start-Codon, die aufwärts vom Gen I angeordnet sind, sowie ein Stop-Codon und eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle, die abwärts vom Gen I angeordnet sind, wobei die Erkennungsstellen und die Co-20 dons in der angegebenen Reihenfolge angeordnet sind und das Gen II ausserdem andere Restriktionsenzym-Erkennungsstellen umfasst.

Gen II:

■15

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A A[G_ TTC

Ta

A T C

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T G A C

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10

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30 T C T AGA

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T G T A C A

CTG GAG

50 C A C G T G

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G G T C C A

60 70 - 80

GTT T G C A T G TAC A T[_C G AI A G C T T T G

C A A A C G TAC A T G T AG El T T C G A A A C

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T G T A A C T G T G T A ACA T T G ACA CAT

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7

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A T C TAG

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CGC G C G

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150 T G G ACC

T G G ACC

160

S

Stop-Codon

170

B|A A T T G C G T T A A TAG T G A AIG A T C T

C T T A A C G C A ATT A T C ACT T C T AGA

1

Bg (S)

G

C C T AG

Ba

Die Symbole, die in der vorstehenden Sequenz die Restriktionsenzyme darstellen, haben folgende Bedeutung:

E: EcoRI Bg: Bglll Mb MboII Ba: BamHI Ml: Mlul

Ta: Taql S: Sau3AI Hf: Hinfl Hd: Hindlll Th: Thal

Die vorliegende Erfindung betrifft das ß-Urogastron-Gen gemäss Anspruch 1 sowie, gemäss den abhängigen Ansprüchen, vom erfindungsgemässen ß-Urogastron-Gen abgeleitete Gene und Gen-Untereinheiten, ein erfindungsge-mässes Gen aufweisende rekombinante Plasmide, ein rekombinantes Plasmid aufweisende Transformanten, Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids und eines Transformanten, und ein Verfahren zur Herstellung von ß-Urogastron.

Bei der synthetischen Herstellung des Gens I oder II ist es von Vorteil, das Gen I oder II als in eine vordere und eine hintere Hälfte unterteiltes Gen aufzubauen. Beispielsweise ist es möglich, eine Untereinheit herzustellen, welche die vordere Hälfte der Nukleotidsequenz des Gens I oder II aufweist, und eine andere Untereinheit herzustellen, welche die 30 hintere Hälfte der Nukleotidsequenz davon aufweist, da es etwa in seiner Mitte geteilt ist, und diese beiden Untereinheiten des Gens I oder II untereinander zum Gen I oder II zu kuppeln. Die Untereinheit, welche die vordere Hälfte der Nukleotidsequenz des Gens II aufweist, kann auch noch eine 35 Restriktionsenzym-Erkennungsstelle an ihrem hinteren Ende aufweisen, und eine andere Untereinheit, welche die hintere Hälfte der Nukleotidsequenz des Gens II aufweist, kann auch noch eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle an ihrem vorderen Ende aufweisen, und diese beiden Unter-40 einheiten werden untereinander zum Gen II gekuppelt.

Im einzelnen kann zum Zwecke der Illustration die erstgenannte Untereinheit eine Untereinheit A sein, welche die vordere Hälfte des Gens II umfasst und an ihrem hinteren Ende mit einer Restriktionsenzym(BamHI)-Erkennungsstel-45 le versehen ist, und die letztgenannte Untereinheit eine Untereinheit B sein, welche die hintere Hälfte des Gens II umfasst und an ihrem vorderen Ende mit einer Restriktions-enzym(HindIII)-Erkennungsstelle versehen ist. Diese Untereinheiten werden nachstehend angegeben:

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Untereinheit A:

A

T

C

G

A

G

A

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C

T

G

C

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C T A

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Untereinheit B:

8

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G

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A

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A

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G

A

C

T

G

C

T

Die Untereinheiten A und B werden beispielsweise wie folgt synthetisiert. Oligonukleotide mit 11,13 oder 15 Basen werden synthetisiert (A-l bis A-16 und B-l bis B-16, d. h. 32 Oligonukleotide). Danach werden 4 bis 6 dieser Oligonu-

Block 1 :

kleotide zusammengefügt und zu Blöcken gekuppelt (Block 25 1 bis Block 7, d. h. 7 Blöcke). Diese Oligonukleotide und Blöcke werden nachstehend angegeben.

(A-l) (A-2) (A-3)

5' AATTCGAAGAT CTGCATGAATAGC GATTCTGAGTG 3"

3' GCTTCTAGACGTA CTTATCGCTAA GACTCACGGGTGA 5'

(A-16) (A-l5) (A-14)

Block 2;

(A-4) (A-5) (A-6)

5 ' CCCACTGTCTCAC GATGGCTATTG TCTGCACGACGGT 3'

3' CAGAGTGCTAC CGATAACAGACGT GCTGCCACAAA 5'

(A-13) (A-12) (A-ll)

Block 3 :

(A-7) (A-8)

51 GTTTGCATGTA CATCGAAGCTTCG 31

3* CGTACATGTAGCT TCGAAGCCTAG 5'

(A-10) (A-9)

Block 4:

(B-l) (B-2)

5 ' AGCTTTGGATA AATACGCGTGTAACT 3 '

3' AACCTATTTATGC GCACATTGACACA 5'

(B-16) (B-15)

Block 5:

(B-3) (B-4)

5 ' GTGTAGTGGGT TATATCGGTGAACGC . 3' 3' TCACCCAATATAG CCACTTGCGACAG 5'

(B-14) (B-13 )

9

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Block 6:

(B-5) (B-6)

5 ' TGTCAATACCG TGATCTGAAATGGTG 3'

3' TTATGGCACTAGA CTTTACCACCCTT 5'

(B-12) (B-ll)

Block 7:

(B-7) (B-8)

5' GGAATTGCGTT AATAGTGAAGATCTG 3

3' AACGCAATTATCA CTTCTAGACCTAG 5

(B-10) (B-9)

Anschliessend werden die Blöcke 1 bis 3 miteinander zur Untereinheit A und die Blöcke 4 bis 7 miteinander zur Untereinheit B gekuppelt.

Die vorliegende Erfindung wird nun in ihren Einzelheiten unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen und Photographien beschrieben.

Fig. 1 zeigt schematisch die Synthese eines Oligonukleo-tids nach dem Festphasen-Verfahren;

Fig. 2 zeigt ein Verfahren zum Kuppeln der Oligonukleotide A-l bis A-16 zu einer Untereinheit A und zum Einführen der Untereinheit in ein von Escherichia Coli abgeleitetes Plasmid pBR322, um ein rekombinantes Plasmid pUGl zu ergeben;

Fig. 3 zeigt ein ähnliches Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Plasmids pUG2 durch Einführen einer Untereinheit B in ein Plasmid pBP322;

Fig. 4 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids pUG3 aus pUGl und pUG2;

Fig. 5 zeigt das durch Analyse der Nukleotidsequenz des Oligonukleotids A-3 mit Hilfe von zweidimensionaler Fraktionierung durch Elektrophorese und Homochromatogra-phie erreichte Resultat;

Fig. 6 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids pGH37;

Fig. 7 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids pGH35;

Fig. 8 zeigt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids pEK28;

Fig. 9 zeigt Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Plasmide pUG102 bis pUG122 sowie der rekombinanten Plasmide pUG103-E bis pUGl 17-E;

Fig. 10 zeigt Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Plasmide pBRH02 und pBRH03;

Fig. 11 zeigt ein Abbild der MboII-Restriktion von pUG3, das ein H-Fragment (179 Basenpaare) umfasst, welches das vorliegende ß-Urogastron-Gen enthält;

Fig. 12 zeigt ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Plasmide pUG2301 und pUG2303;

Fig. 13 zeigt ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Plasmide pUG2101 und pUG2105;

Fig. 14 zeigt ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Plasmide pUG2701 und pUG2703;

Fig. 15 zeigt ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Plasmide pUGl 102 und pUGl 105;

Fig. 16 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Plasmids pUG1004;

Fig. 17 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Plasmids pUG1201;

Fig. 18 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Plasmids pUG1301;

Die Photographien 1 bis 5 zeigen jeweils Analysenresultate für Nukleotidsequenzen von im Beispiel nach dem Ma-

xam-Gilbert-Verfahren erhaltenen rekombinanten Plasmiden.

Die Verfahrensweisen zur Bildung des erfindungsgemäs-sen Gens II sind an sich bekannt. Die Oligonukleotide zur Bildung des Gens II können nach bekannten Verfahren hergestellt werden, beispielsweise nach dem im nachstehenden kurz beschriebenen Festphasen-Verfahren (vgl. beispielsweise H. Ito et al., Nucleic Acids Research, 10,1755 —1769 (1982)).

Wenn das Festphasen-Verfahren verwendet wird, wird das Oligonukleotid wie in Fig. 1 dargestellt synthetisiert, indem nacheinander Mononukleotide oder Dinukleotide mit einem auf einem Polystyrolharz befestigten Nukleosid gekuppelt werden, um die vorbestimmte Nukleotidsequenz zu ergeben.

Das Harz, auf welchem das Nukleosid befestigt ist, kann beispielsweise unter Verwendung eines partiell vernetzten Polystyrolharzes hergestellt werden, indem N-(Chlorome-thyl)-phthalimid mit dem Harz und das Produkt mit Hydra-zin umgesetzt wird, um aminomethyliertes Polystyrolharz zu ergeben, und danach mit dessen Aminogruppe ein Nukleosid gekuppelt wird, dessen 5'-Hydroxylgruppe frei und dessen Aminogruppe geschützt ist, wobei Bernsteinsäure als Intervallbildner verwendet wird.

Andererseits sind verschiedene Verfahren bekannt, um Mononukleotide oder Dinukleotide herzustellen (vgl. beispielsweise C. Broka et al., Nucleic Acids Research, 8, 5461 — 5471 (1980)). Beispielsweise kann ein Mononukleotid hergestellt werden, indem o-Chlorophenylphosphorodichlo-ridat, Triazol und ein Nukleosid, dessen 5'-Hydroxylgruppe mit einer Dimethoxytritylgruppe (DMTr) geschützt ist, in Gegenwart von Triethylamin umgesetzt werden, danach das erhaltene Monotriazolid mit ß-Cyanoethanol in Gegenwart von 1-Methylimidazol als Katalysator umgesetzt wird und das Reaktionsprodukt in einer Silicagel-Kolonnenchromato-graphie mit Chloroform-Methanol eluiert wird. Dieses Verfahren liefert ein vollständig geschütztes Mononukleotid.

Ein Dinukleotid kann hergestellt werden, indem das vorstehend erhaltene, vollständig geschützte Mononukleotid mit Benzolsulfonsäure oder einer ähnlichen Säure behandelt wird, um das Mononukleotid mit einer freien 5'-Hydroxyl-gruppe zu ergeben, dieses mit dem vorstehend erwähnten Monotriazolid umgesetzt wird und das Reaktionsprodukt in einer Silicagel-Kolonnenchromatographie mit Chloroform-Methanol eluiert wird. Dieses Verfahren liefert ein vollständig geschütztes Dinukleotid.

Die Festphasen-Synthese von Oligonukleotiden wird mit Vorteil durchgeführt, indem ein Agens zur DNA-Synthese verwendet wird, beispielsweise dasjenige von Bachem Inc. in den USA zu beziehende Agens zur DNA-Synthese. Das Harz, auf welchem das Nukleosid befestigt ist, wird in ein Reaktionsgefäss eingegeben und mit Dichloromethan-

25

30

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55

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Isopropanol gewaschen, und es wird dem Harz eine Lösung von Zinkbromid in Dichloromethan-Isopropanol beigegeben, um die Dimethoxytritylgruppe in der 5'-Stellung abzuspalten. Diese Verfahrensweise wird mehrmals wiederholt, bis die Färbung der Lösung verschwindet. Das Harz wird mit Dichloromethan-Isopropanol und dann mit einer Lösung von Triethylammoniumacetat in Dimethylformamid gewaschen, um verbleibendes Zn2+ zu entfernen, danach mit Tetrahydrofuran gewaschen und zum Trocknen einem Strom von Stickstoffgas während einiger Minuten ausgesetzt. Unabhängig davon wird das vollständig geschützte Mononukleotid oder Dinukleotid in Pyridin gelöst, worauf Triethylamin beigegeben wird, und die resultierende Lösung wird geschüttelt, dann bei Raumtemperatur während einiger Stunden stehengelassen und danach unter vermindertem Druck eingedampft. Das resultierende Triethylammonium-salz wird in Pyridin gelöst und zum Trocknen mehrere Male unter Verwendung von Pyridin azeotropisch eingedampft.

Das Salz des Nukleotids wird in einer Lösung von Mesi-tylensulfonyl-5-nitrotriazol (MSNT, ein Kondensationsreagens) in Pyridin gelöst. Die resultierende Lösung wird dem getrockneten Harz beigegeben und bei Raumtemperatur stehengelassen. Der flüssige Teil der Reaktionsmischung wird entfernt und der Harzteil mit Pyridin gewaschen und dann zum Maskieren der nicht umgesetzten Hydroxylgruppen in Tetrahydrofuranpyridin unter Verwendung von Dimethyl-aminopyridin als Katalysator mit Essigsäureanhydrid umgesetzt. Schliesslich wird das Harz mit Pyridin gewaschen, womit ein Zyklus der Festphasen-Synthese vollzogen ist. Ein Zyklus verlängert die Nukleotidsequenz um 1 oder 2 Kettenlängen. Die vorstehende Verfahrensweise wird wiederholt, um nacheinander Mononukleotide oder Dinukleotide mit dem Harz bis zur gewünschten Länge zu kuppeln, womit ein auf dem Harz befestigtes, vollständig geschütztes Oligonu-kleotid erhalten werden kann.

Dem resultierenden Harz wird ein Lösung von Tetrame-thylguanidin-2-pyridinaldoximat in Pyridin-Wasser beigegeben und die Mischung wird unter Erhitzung stehengelassen. _ Das Harz wird dann wegfiltriert und wechselweise mit Pyridin und Ethanol gewaschen. Die Waschflüssigkeit und das Filtrat werden zusammengegeben und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wird in einer wässrigen Lösung von Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) gelöst und dann mit Ether gewaschen. Die wässrige Lösung wird einer Kolonnenchromatographie mit Sephadex G-50 unter Verwendung von Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) als Elutionsmittel unterzogen. Die Fraktionen werden gesam-. melt und die optische Dichte jeder Fraktion wird bei 260 nm gemessen. Es wird eine Fraktion konzentriert, welche die erste Elutionsspitze enthält. Das Konzentrat wird gereinigt, beispielsweise durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigchroma-tographie, bis eine einzige Spitze erhalten wird. Beim so erhaltenen Oligonukleotid ist das 5'-Ende noch immer durch eine Dimethoxytrityl-Gruppe geschützt, so dass das Produkt mit einer wässrigen Lösung von Essigsäure behandelt wird, um die Schutzgruppe abzuspalten, und dann wiederum durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatrographie oder dergleichen gereinigt wird, bis eine einzige Spitze erhalten wird.

Die gewünschten Oligonukleotide werden nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt, dann nach einem zweidimensionalen Fraktionierungsverfahren unter Verwendung von Elektrophorese und Homochromatogra-phie und/oder vom Maxam-Gilbert-Verfahren einzeln auf das Vorhandensein der Nukleotidsequenz untersucht, und danach zur Herstellung von Blöcken und Untereinheiten verwendet.

Das zweidimensionale Fraktionierungsverfahren zum Untersuchen der Nukleotidsequenz kann nach der Verfahrensweise von Wu et al. (E. Jay, R. A. Bambara, R. Pad-manabhan und R. Wu, Nucleic Acids Res., 1,331 (1974)) durchgeführt werden.

Um dieses Verfahren einzusetzen, wird das lyophilisierte Oligonukleotid bis auf eine Konzentration von etwa 0,1 ]ig/ jj.1 in destilliertes Wasser gelöst. Ein Teil dieser Lösung wird mit y-32P-ATP und Xt-Polynukleotidkinase behandelt, um das 5'-Ende mit 32P zu markieren, und es wird dann teilweise mit Schlangengift-Phosphodiesterase digeriert. Das Produkt wird auf eine Folie von Celluloseacetat getupft und der Elektrophorese für die erste dimensionale Entwicklung unterzogen, um das Produkt nach den unterschiedlichen Basen zu trennen. Die entwickelten Produkte werden auf eine Platte von Diethylaminoethylcellulose (DEAE Cellulose) übertragen und unter Verwendung einer «Homomischung» genannten Lösung von teilweise hydrolysiertem RNA der zweiten dimensionalen Entwicklung unterzogen (diese Verfahrensweise wird als «Homochromatographie» bezeichnet). Auf diese Weise wird das Oligonukleotid entsprechend der Kettenlänge getrennt. Danach wird die Nukleotidsequenz des Oligonukleotids vom 5'-Ende ausgehend autoradiographisch gelesen.

Wenn es schwierig ist, die Sequenz nach diesem Verfahren zu untersuchen, wird nach Bedarf das Maxam-Gilbert-Verfahren angewendet. (A. M. Maxam und W. Gilbert,

Proc. Nati. Acad. Sei., USA. 74, 560 (1977); A. M. Maxam und W. Gilbert, Methods in Enzymol., Band 65, S. 499, Academic Press 1980).

Dieses Verfahren, welches auch chemisches Zersetzungsverfahren genannt wird, verwendet eine Reaktion, die für eine bestimmte Base spezifisch ist, um das Oligonukleotid an der Stelle der Base zu spalten, und die von der Elektrophorese entwickelten Bänder werden benutzt, um die Sequenz ausgehend vom 5'- oder 3'-Ende zu lesen. Die basenspezifische Reaktionen sind folgende. Guanin wird spezifisch durch Di-methylsulfat methyliert. Guanin und Adenin erfahren eine Depurinations-Reaktion in Gegenwart einer Säure. Thymin und Cytosin reagieren beide mit Hydrazin bei einer niedrigen Salzkonzentration, bei einer hohen Salzkonzentration reagiert aber nur Cytosin mit Hydrazin. Nach dem vollständigen Ablauf der Reaktionen für die vier Basen wird jede Reaktionsmischung mit Piperidin umgesetzt, um die im Ring geöffneten Basen abzuspalten und die ß-Elimination von beiden Phosphaten aus dem Zucker zu katalysieren, schliesslich wird die DNA-Kette an der Stelle dieser Base gespalten. Die resultierenden Reaktionsmischungen werden jeweils der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen, um die Nukleotidsequenz zu bestätigen, je nachdem, welche der Reaktionen jedes Band erzeugt hatte.

Anschliessend werden die Oligonukleotide unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase gekuppelt, wie in Fig. 2 dargestellt wird. Zur Erreichung einer korrekten Kupplung werden die 16 der Untereinheit A entsprechenden Oligonukleotide A-l bis A-16 in drei Gruppen unterteilt und miteinander gekuppelt, d. h. Block 1 umfassend A-l, A-2, A-3, A-14, A-15 und A-16, Block 2 umfassend A-4, A-5, A-6, A-l 1, A-12 und A-13, und Block 3 umfassend A-7, A-8, A-9 und A-10, wie in Fig. 2 dargestellt. Mittels Elektrophorese werden die Blöcke 1 bis 3 erhalten, welche die korrekten Sequenzen aufweisen, und sie werden dann miteinander zur Untereinheit A gekuppelt.

Mehr im einzelnen betrachtet werden einige der 5'-Enden der 16 Oligonukleotide A-l bis A-16 unter Verwendung von y-32P-ATP und T4-Polynukleotidkinase mit 32P markiert, und die Hydroxylgruppen der übrigbleibenden 5'-Enden werden mit ATP phosphoryliert. Zur Bildung jedes der drei

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Blöcke werden die Oligonukleotide unter Verwendung von T4-DNA-Ligase aneinandergefügt und gekuppelt, und das Produkt wird der Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unterzogen, um den gewünschten Block zu isolieren. Die drei so erhaltenen Blöcke werden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase gekuppelt, um die Untereinheit A zu ergeben. Obwohl in der Kupplungsreaktion eine Dimerstruktur produziert werden kann, wird diese mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI leicht gespalten, um die Untereinheit A zu ergeben. Anschliessend wird, wie in Fig. 2 ersichtlich, ein bekannter Plasmidvektor, pBR322, der von Escherichia Coli abgeleitet leicht erhältlich ist, mit EcoRI und BamHI gespalten, und die Untereinheit A wird in den Vektor inseriert, um ein rekombinantes Plasmid pUGl zu ergeben.

Die gleiche Verfahrensweise wie im vorstehenden wird auch in bezug auf die Untereinheit B verfolgt. Wie im Falle der Untereinheit A werden die 16 Oligonukleotide B-l bis B-16 in vier Gruppen unterteilt und miteinander gekuppelt, wie in Fig. 3 dargestellt, und die Blöcke werden miteinander gekuppelt, um die Untereinheit B zu ergeben. Das gegebenenfalls erzeugte Dimer wird mit den Restriktionsenzymen Hindlll und BamHI gespalten, um die Untereinheit B zu ergeben. Ein Plasmidvektor, pBR322, wird mit Hindlll und BamHI gespalten und die Untereinheit B wird in den Vektor inseriert, um ein rekombinantes Plasmid pUG2 zu ergeben, wie in Fig. 3 ersichtlich ist.

Wie nun Fig. 4 zeigt, wird pUGl mit Restriktionsenzymen Hindlll und Sali gespalten und ein von pUG2 mit Hilfe derselben Restriktionsenzyme entferntes Fragment wird in pUGl inseriert, um ein rekombinantes Plasmid pUG3 herzustellen, das ein strukturelles ß-Urogastron-Gen (Gen II) aufweist.

pUGl, pUG2 und pUG3 sind rekombinante Plasmide, von denen jedes pBR322 und die Untereinheit A, welche die vordere Hälfte des strukturellen ß-Urogastron-Gens ist, sowie die Untereinheit B, welche die hintere Hälfte des Gens ist, also das ganze strukturelle Gen umfasst. Diese rekombinanten Plasmide können in grossen Mengen vermehrt werden, nämlich durch Einführung in einen Wirt wie der Stamm HB 101 von Escherichia Coli, welcher bekannt und nach dem Calcium-Verfahren als Transformations-Verfahren leicht erhältlich ist (E. Lederberg und S. Cohen, J. Bacteriol., 119, 1072 (1975)).

Ob pUGl, pUG2 und pUG3 im Wirt wie beispielsweise im Stamm HB 101 von Escherichia Coli vorhanden sind,

kann mit den folgenden Verfahren untersucht werden. Nachdem die Plasmide durch alkalisches Extraktionsverfahren gesammelt worden sind, werden pUGl und pUG2 auf das Vorhandensein der auf dem Vektor pBR322 nicht vorhandenen BglH-Erkennungsstelle untersucht. Auf gleiche Weise werden pUG2 und pUG3 darauf untersucht, ob sie mit Mlul gespalten werden können, das auf pBR322 nicht vorhanden ist.

Nach dem alkalischen Extraktionsverfahren werden das Plasmid beherbergende Escherichia Coli inkubiert, die Zellen werden dann gesammelt und der Wirkung von Lysozym ausgesetzt, um die Zellenwand aufzulösen. Eine Mischung von Natriumhydroxid und Natriumlaurylsulfat wird verwendet, um die Zelle zu zerstückeln und dann das DNA zu denaturieren, danach wird mit Natriumacetatpuffer neutralisiert. Zu diesem Zeitpunkt bleibt das chromosomale DNA denaturiert, das Plasmid jedoch, das aus extra-chromosoma-len DNA besteht, bildet wieder die anfängliche doppelketti-ge Form. Unter Verwendung dieser Eigenschaften werden Plasmide gesammelt. Danach werden zur Reinigung der Plasmide diese einer Dichtegradient-Ultrazentrifugation mit Cäsiumchlorid und Ethidiumbromid unterzogen und dann durch eine 50-m-Kolonne von Biogel A durchgeführt, um

RNA zu entfernen. Somit können Plasmide in grossen Mengen mit hoher Reinheit erhalten werden. Auf diese Weise kann das erfindungsgemässe ß-Urogastron-Gen (Gen II) erhalten werden.

Nun wird das Verfahren zum Einführen des ß-Urogastron-Gens in die Wirtszellen beschrieben.

Die erfindungsgemäss zu verwendenden Wirtszellen sind nicht besonders eingeschränkt und es ist irgendeine der bekannten Wirtszellen verwendbar, beispielsweise die von Escherichia Coli, Bacillus, Pseudomonas, Hefen usw., unter welchen die Zellen Escherichia Coli bevorzugt werden.

Das Ausdrücken des ß-Urogastron-Gens unter Verwendung von Escherichia Coli umfasst ein System zum direkten Ausdrücken des ß-Urogastron-Gens und ein System, in welchem es als mit ß-Lactamase oder mit einem anderen davon verschiedenen Protein fusioniertes Protein ausgedrückt wird.

Zum direkten Ausdrücken des ß-Urogastron-Gens ist es erforderlich, in das rekombinante Plasmid aufwärts vom ß-Urogastron-Gen einen Promotor und eine Shine-Dalgarno-Sequenz einzuführen. Während der Promotor nicht besonders eingeschränkt ist, sind die vorteilhaften Promotoren solche, die einen hohen Grad von Ausdruck gewährleisten, wie beispielsweise WPL, welcher der linksgerichtete Promotor vom A.-Phag ist, lac UV5, welcher aufwärts vom ß-Galactosi-dase-Gen von Escherichia Coli liegt, usw. Wenn als Promotor WPl verwendet wird, ist die Shine-Dalgarno-Sequenz nicht besonders eingeschränkt, es ist jedoch von Vorteil, die vier-Basen-Sequenz von AGGA zu verwenden. Wenn andererseits als Promotor lac UV5 verwendet wird, ist es vorteilhaft, die abwärts vom lac UV5-Promotor liegende oder die chemisch synthetisierte Shine-Dalgarno-Sequenz zu verwenden.

Das System zum direkten Ausdrücken des ß-Urogastron-Gens wird nun mit Bezugnahme auf den Fall beschrieben, in welchem ein ^PL-Shine-Dalgarno-Sequenz-ß-Urogastron-Gen verwendet wird.

Obwohl XPL ein starker Promotor ist (J. Hedgpeth et al., Molecular and General Genetics, 163,197—203 (1978)), hat der voll aktivierte Promotor X.PL eine lethale Wirkung auf die Wirtszelle Escherichia Coli, so dass ein Bedarf besteht, die Zelle unter Bedingungen, die frei sind von lethaler Wirkung, vermehren zu lassen, und danach die Funktion von AJ?l auszulösen. Andererseits ist cI857, ein Gen innerhalb des A.-Phags, eines der mutierten Gene des cI-Repressors, das auf den Operator für X.Pl einwirkt. Bei tiefen Temperaturen > (bis zu etwa 30 °C) kuppelt sich cI857 mit dem Operator, um die Aktivität von XPL als Promotor vollständig zu inhibieren, was folglich die Vermehrung von Escherichia Coli erlaubt. Somit können sich die Wirtszellen in diesem Zustand vermehren und sie werden danach auf eine hohe Temperatur (nicht unter 37 °C) gebracht, womit die Funktion von X,Pl ausgelöst wird. Zudem sind die Plasmidvektoren mit einem energischen Replikationsmechanismus, wie pSCIOl, das bekannt und leicht erhältlich ist, und die Plasmidvektoren mit einem lockeren Replikationsmechanismus, wie pBR322, untereinander nicht inkompatibel, sondern sie können innerhalb derselben Zelle von Escherichia Coli koexistieren.

Dementsprechend ist es geeignet, ein rekombinantes Plasmid pGH37 aufzubauen, in welchem ein Gen cI857 in einen gegen Tetracyclin resistenten Plasmidvektor pSCIOl (mit zum wirksamen Ausdrücken von cI857 aufwärts davon angeordnetem lac UV5 Promotor) eingeführt wird, wie in Fig. 6 ersichtlich, und das rekombinante Plasmid in Escherichia Coli (Stamm HB101) einzuführen, um einen Transformanten (Stamm ECI-2) zu erhalten, der als Wirt für den Vektor zum Ausdrücken von ß-Urogastron unter der Kontrolle des Promotors X.Pl verwendbar ist.

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Erfindungsgemäss wird das À.PL-Shine-Dalgarno-Sequenz-ß-Urogastron-Gen beispielsweise in pBR322 eingeführt, um einen ß-Urogastron ausdrückenden Vektor zu ergeben, der zur Transformation des Stammes ECI-2 verwendet wird, wodurch ein sogenanntes Zwei-Plasmid-System geschaffen wird, in welchem zwei nützliche Plasmide in einer Zelle von Escherichia Coli koexistieren.

Bei diesem System kuppelt sich der durch pGH37 codierte cI857-Repressor mit dem Operator für den XPL-Promotor auf dem zweiten Plasmid, wenn die Zelle beispielsweise bei 30 °C kultiviert wird, was die Vermehrung der Zelle erlaubt. Nachdem die Zelle sich in diesem Zustand voll vermehrt hat, wird die Temperatur beispielsweise auf 40 °C erhöht, worauf der cI857-Repressor vom Operator dissoziiert wird, was die Aktivität des XPL-Promotors zum Ausdrücken von ß-Uroga-stron ermöglicht.

Obwohl ein ähnliches Konzept auf das Ausdrücken von Fibroblasten-Interferon, SV-40-Small-t-Antigen usw. angewandt wurde, wird in diesen Fällen als Wirt ein A,-Lysogen verwendet, bei welchem das DNA eines das cI857-Gen tragenden X-Phags in das Chromosom des Wirts eingeführt wird (R. Derynck et al., Nature, 287,193 —197 (1980); C. Derom et al., Gene, 17,45—54 (1982); K. Küpper et al., Nature, 289, 555-559 (1981)).

Mit dem erfindungsgemässen System wird jedoch das Gen cI857 in ein anderes Plasmid eingeführt, das gegen Tetracyclin resistent ist. Dementsprechend weist dieses System die Vorteile auf, dass es unwahrscheinlich ist, dass das in das Chromosom des Wirts eingeführte X,-Phag zur Vermehrung induziert wird, und dass der Stamm leicht unter Kontrolle zu halten ist. Natürlich wird das Zwei-Plasmid-System zum ersten Mal für Systeme zum Ausdrücken von ß-Urogastron verwendet.

Bei einem anderen System wird ein Teil irgendeines anderen Protein-Gens wie ein ß-Lactamase-Gen mit dem ß-Urogastron-Gen gekuppelt, um das ß-Urogastron-Gen als fusioniertes Protein auszudrücken. Dieses Verfahren bietet den Vorteil, dass das fusionierte Protein auf die Zersetzung durch die Protease innerhalb von Escherichia Coli weniger empfindlich ist, wodurch ein Schutz für ß-Urogastron geboten wird. Ein weiterer Vorteil ist, dass das fusionierte Protein in der Zelle von Escherichia Coli zum Periplasma wandert und sich dort ansammelt (S. J. Chan et al., Proc. Nati. Acad. Sei., USA, 78, 5401—5405 (1981)), dort örtlich vorhanden und daher leicht zu trennen und zu reinigen ist.

In weiteren Einzelheiten ausgedrückt, ein für zwei basische Aminosäuren codierendes Gen, das eine Abspaltstelle zum Entfernen von ß-Urogastron aus dem fusionierten Protein durch Abspalten mit einem Enzym hefern kann, wird in das ß-Lactamase-Gen an einer geeigneten Abspaltstelle für ein Restriktionsenzym inseriert, und es wird ein ß-Urogastron-Gen mit dem ß-Lactamase-Gen gekuppelt.

Vorzugsweise ist die Sequenz der zwei basischen Aminosäuren -Lys-Arg- oder -Arg-Lys-. Beispiele von Enzymen zur Erkennung der Sequenz von Aminosäuren zum Abspalten von ß-Urogastron aus dem fusionierten Protein sind Kallikrein, Trypsin usw. Beispiele von Restriktionsenzymen zum Abspalten des ß-Lactamase-Gens sind XmnI, HincII, Seal, Pvil, Pstl, Bgll, Banl usw.

Das so hergestellte ß-Lactamase-ß-Urogastron-rekom-binante Plasmid kann innerhalb von Escherichia Coli ein fusioniertes Protein für eine Mengenproduktion ausdrücken. Das resultierende fusionierte Protein wird mit Kallikrein oder dergleichen behandelt, wodurch ß-Urogastron erhalten werden kann.

Das Ausdruckssystem kann durch direkte Analyse der Nukleotidsequenz des Gens mit dem Maxam-Gilbert-Verfahren, durch Bestätigung der Insertion des Gens und seiner Richtung nach dem Mini-Herstellungsverfahren oder Abbildverfahren (H. C. Birnboim et al., Nucleic Acids Research, 7,1513 —1523 (1979)), oder noch durch Radioimmu-noassay auf ß-Urogastron untersucht werden.

Der so erhaltene erfindungsgemässe Transformant wird nach dem herkömmlichen Verfahren kultiviert, so dass ß-Urogastron in grossen Mengen von hoher Reinheit gesammelt werden kann.

Die Erfindung wird nachstehend in weiteren Einzelheiten unter Bezugnahme auf das folgende Beispiel beschrieben, wobei die Erfindung in keiner Weise auf dieses Beispiel eingeschränkt ist.

Beispiel

1) Herstellung des das Nukleosid befestigenden Harzes

Verschiedene Nukleosid befestigende Harze wurden nach dem folgenden Verfahren hergestellt.

Eine Menge von 1 Gew.-% vernetztes Polystyrolharz «S-Xl» (ein Produkt der Biorad Laboratories, USA, mit einer einem Sieb mit 0,074 bis 0,037 mm lichter Maschenweite entsprechenden Teilchengrösse) wurde mit 2,41 g N-(Chloromethyl)-phthalimid, 0,22 ml Trifhioromethansulfon-säure und 50 ml Dichloromethan unter Rührung während 2 Stunden bei Raumtemperatur gemischt. Nach Ablauf der Reaktion wurde das Harz ausfiltriert, nacheinander mit Dichloromethan, Ethanol und Methanol gewaschen, unter reduzierten Druck getrocknet und dann im Rückfluss mit 50 ml einer 5 Gew.-%igen Lösung von Hydrazin in Ethanol über Nacht erhitzt. Das Harz wurde ausfiltriert und nacheinander mit Ethanol, Dichloromethan und Methanol gewaschen, und dann unter reduzierten Druck getrocknet. Die Mischung von mit dem vorstehenden Verfahren erhaltenem aminomethyliertem Polystyrolharz (2,5 g), 0,75 mM Mono-bernsteinsäureester von 5'-o-Dimethoxytritylnukleosid, 1,23 mM Dicyclohexylcarbodiimid und 1 mM Dimethyl-aminopyridin wurde unter Zugabe von 30 ml Dichloromethan bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Das Harz wurde ausfiltriert, nacheinander mit Dichloromethan, Methanol und Pyridin gewaschen, dann in Pyridin-Essigsäu-reanhydrid (90 :10 im Volumenverhältnis) eingetaucht und bei Raumtemperatur während 30 Minuten stehengelassen. Das erhaltene, Nukleosid befestigende Harz wurde ausfiltriert, mit Pyridin und Dichloromethan gewaschen und zur Verwendung in der Reaktion der Festphasen-Synthese unter reduzierten Druck getrocknet.

2) Synthese des Dinukleotids

Als Beispiel wird die Synthese eines vollständig geschützten Dinukleotids mit der Basen-Sequenz TA beschrieben. Adenosin (13,14 g), dessen 5'-Hydroxylgruppe mit einer Di-methoxytritylgruppe (DMTr) und dessen Aminogruppe mit einer Benzoylgruppe geschützt war, sowie 6,34 g Triazol wurden in wasserfreies Dioxan gelöst. Unter Eiskühlung wurden der Lösung 8,35 ml Triethylamin beigegeben, dann wurden 6,86 g o-Chlorophenylphosphorodichloridat der Mischung tropfenweise über 10 Minuten verteilt beigegeben und die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur während 2,5 Stunden gerührt.

Das gebildete Triethylamin-Hydrochlorid wurde ausfiltriert, das Filtrat auf etwa 2/3 seines Volumens konzentriert und es wurden 3,6 g ß-Cyanoethanol sowie 4,8 g 1-Methyl-imidazol dem Konzentrat unter Rührung bei Raumtemperatur während 3 Stunden beigegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, dreimal mit 0,1 M wässri-ger Natriumdiphosphatlösung und zweimal mit Wasser gewaschen und danach unter reduziertem Druck konzentriert,

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was 19,96 g Rohprodukt ergab. Das Produkt wurde unter Verwendung von Chloroform-Methanol (98 : 2 im Volumenverhältnis) als Elutionsmittel durch Silicagel-Kolon-nenchromatographie gereinigt. Die Verfahrensweise für die Reinigung wurde wiederholt, um 15,12 g vollständig geschütztes Adenosin-Mononukleotid zu ergeben.

Das so erhaltene Adenosin-Mononukleotid (7,81 g) wurde einer 2 Gew.-%igen Lösung von Benzolsulfonsäure in Chloroform-Methanol (70 : 30 im Volumenverhältnis) beigegeben und die Mischung wurde unter Eiskühlung während 20 Minuten gerührt und danach mit einer wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Die abgeschiedene Chloroform-Schicht wurde mit Wasser gewaschen und unter reduziertem Druck konzentriert, was 7,11 g Rohprodukt ergab. Das Produkt wurde der Silicagel-Kolonnenchro-matographie unterzogen und mit Chloroform-Methanol (97: 3 im Volumenverhältnis) eluiert, um 4,31 g Adenosin-Mononukleotid mit einer freien 5'-Hydroxylgruppe zu ergeben.

Thymidin (1,64 g), dessen 5'-Hydroxylgruppe mit einer Dimethoxytritylgruppe (DMTr) geschützt war, sowie 0,95 g Triazol wurden in 21 ml wasserfreies Dioxan gelöst, der Lösung wurden 1,25 ml Triethylamin beigegeben, dann wurden 0,69 ml o-Chlorophenylphosphorodichloridat der Mischung tropfenweise über 5 Minuten verteilt unter Rührung und Eiskühlung beigegeben. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Das in der Reaktion gebildete Triethylamin-Hydrochlorid wurde ausfiltriert und das Filtrat wurde während 10 Minuten mit 1,1 ml wässriger Pyridinlösung (IM) gerührt. Der Lösung wurde eine Lösung von 1,17 g des wie vorstehend beschrieben erhaltenen Adenosin-Mononukleotids mit einer freien 5'-Hy-droxylgruppe in Dioxan (10 ml) sowie 0,72 ml 1-Methyl-imidazol beigegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 3 Stunden gerührt. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, mit 0,1 M wässriger Natriumdiphosphatlösung und dann mit Wasser gewaschen und danach unter reduziertem Druck konzentriert, was 2,39 g Rohprodukt ergab. Das Produkt wurde der Sili-cagel-Kolonnenchromatographie unterzogen und mit Chloroform-Methanol (98 : 2 im Volumenverhältnis) eluiert, um 2,39 g vollständig geschütztes Dinukleotid TA zu ergeben.

Nach dem gleichen Verfahren wie vorstehend wurden verschiedene Nukleotiden hergestellt.

3) Synthese von Oligonukleotiden

Es wird nun die Festphasen-Synthese des Oligonukleo-tids A — 1, d. h. das Undecanukleotid AATTCGAAGAT beschrieben.

Ein nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren 1) hergestelltes Harz (40 mg) mit darauf gebundenem Nukleosid T wurde in ein Reaktionsgefass eingegeben, dreimal mit Dichloromethan-Isopropanol (85 : 15 im Volumenverhältnis) gewaschen und dann mit einer Lösung (IM) von Zink-bromid in Dichloromethan-Isopropanol behandelt, um die Dimethoxytritylgruppe (DMTr) in der 5'-Stellung abzuspalten. Diese Verfahrensweise wurde mehrmals wiederholt, bis die Färbung der Lösung verschwunden war. Das Harz wurde mit Dichloromethan und dann zum Entfernen des übrigbleibenden Zn2+ mit einer Lösung von Triethylammonium-acetat (0,5 M) in Dimethylformamid, anschliessend noch mit Tetrahydrofuran gewaschen und dann getrocknet, indem Stickstoffgas während einigen Minuten durch das Reakti-onsgefäss durchgeleitet wurde.

Das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren 2) hergestellte, vollständig geschützte Dinukleotid GA (50 mg) wurde in 1 ml Pyridin gelöst, mit 1 ml Triethylamin geschüt670 654

telt und dann bei Raumtemperatur während einigen Stunden stehengelassen. Die Lösung wurde dann unter reduziertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit Pyridin mehrmals azeotropisch eingedampft, um das Nukleotid zu einem Triethylammoniumsalz zu konvertieren. Das Salz wurde in 0,3 ml einer Lösung von Mesitylensulfonyl-5-nitrotriazol (0,3 M) in Pyridin gelöst. Die Lösung wurde dem getrocknetem Harz beigegeben und die Umsetzung erfolgte bei Raumtemperatur während 60 Minuten. Der flüssige Teil wurde aus der Reaktionsmischung ausfiltriert und der Feststoffteil wurde mit Pyridin gewaschen und dann während 5 Minuten in einer Mischung von 0,2 ml Essigsäureanhydrid und 0,8 ml einer Lösung von Dimethylaminopy-ridin (0,1 M) in Tetrahydrofuran-Pyridin stehengelassen, um die nicht umgesetzte Hydroxylgruppe zu maskieren. Schliesslich wurde das Harz mit Pyridin gewaschen, womit ein Zyklus der Festphasen-Synthese vollständig abgelaufen war. Ein Zyklus verlängert die Nukleotidkette um 2 Basenlängen. Die gleiche Verfahrensweise wie im vorstehenden wurde wiederholt, um nacheinander die Dinukleotide AA, CG, TT und AA mit dem resultierenden Nukleotid durch Kondensation zu kuppeln, womit das vollständig geschützte, auf das Harz befestigte Undecanukleotid AATTCGAAGAT hergestellt worden war.

Das erhaltene Harz (20 mg) wurde bei 40 °C während einer Stunde mit 0,6 ml einer Lösung von Tetramethylguani-din-2-pyridinaldoximat (0,5 M) in Pyridin-Wasser (90 :10 im Volumenverhältnis) stehengelassen. Das Harz wurde dann durch eine mit Baumwolle gestopfte Pasteur-Pipette durchgeführt und dadurch ausfiltriert. Das Harz wurde wechselweise mit Pyridin und Ethanol gewaschen. Die Waschlösung und das Filtrat wurde miteinander vereinigt und bei 40 °C unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in 2 ml einer wässrigen Lösung von Triethylammoniumbicarbonat (TEAB, 10 mM) gelöst. Die Lösung wurde dreimal mit Ether gewaschen. Die wässrige Phase wurde auf eine Kolonne (2 x 100 cm) von Sephadex G-50 geladen und mit 10 mM einer Lösung von Triethylammoniumbicarbonat (TEAB) eluiert. Die Fraktionen wurden auf die Absorption bei 260 nm untersucht. Die Fraktion, welche die erste Elutionsspitze enthielt, wurde konzentriert. Der Rückstand wurde der Hochgeschwindigkeits-Flüssigchro-matographie (Pumpe Typ 6000A; Detektor Typ 440; Produkte der Waters Associates, USA) unterzogen, um eine gereinigte, eine einzige Spitze aufweisende Fraktion zu ergeben. Die zur Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie verwendete Kolonne war vom Typ |i-Bondapak C]8 (ein Produkt der Waters Associates, USA), und als Elutionsmittel zur Gradientenelution (5 — > 40 Vol.-%) wurde eine Lösung von Triethylammoniumacetat (0,1 M) in Acetonitril-Wasser verwendet. Das so gereinigte Undecanukleotid hatte noch immer ein mit einer Dimethoxytritylgruppe geschütztes 5'-Ende, so dass die Verbindung mit einer 80 Vol.-%igen wässrigen Lösung von Essigsäure während 15 Minuten behandelt wurde, um die Dimethoxytritylgruppe abzuspalten, und dann wiederum durch Hochgeschwindigkeits-Flüssig-chromatographie gereinigt wurde, bis eine einzige Spitze erhalten wurde. Zu diesem Zweck wurde dieselbe Kolonne wie im vorangehenden verwendet, und als Elutionsmittel zur Gradientenelution (5 — > 25 Vol.-%) wurde eine Lösung von Triethylammoniumacetat (0,1 M) in Acetonitril-Wasser verwendet.

Auf gleiche Weise wie im vorangehenden wurden die Oligonukleotide A-2 bis A-16 und B-l bis B-16 synthetisiert.

Die Tabelle 1 zeigt die Ausbeute an jedem Oligonukleotid. Die Bestimmung erfolgte unter Verwendung von 20 mg

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des aus der Festphasen-Synthese resultierende Harzes, Ab- Die Ausbeute wurde aus der Bestimmung der Absorp-

spalten des Oligonukleotids vom Harz und anschliessendes tion des gereinigten Endprodukts bei 260 nm und der Sum-

Abspalten der Schutzgruppe und Reinigung. me der Absorptionswerte für die Nukleotidbasen berechnet.

Tabelle 1

A-l

80 Hg

A-5

140 (ig

A-9

100 (ig

A-13

50 [ig

B-l

60 (ig

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100 (ig

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B-13

130 Hg

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120 Hg

A-6

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A-10

90 Hg

A-14

40 Hg

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100 Hg

B-6

90 Hg

B-10

100 Hg

B-l 4

60 Hg

A-3

90 Hg

A-7

80 Hg

A-ll

110 Hg

A-15

60 Hg

B-3

50 Hg

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130 Hg

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110 Hg

B-l 5

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50 Hg

A-8

90 Hg

A-12

40 Hg

A-16

150 Hg

B-4

90 Hg

B-8

100 Hg

B-l 2

110 Hg

B-16

50 Hg

4) Untersuchung der Sequenz der Oligonukleotid-Basen Die Sequenz wurde nach dem im vorstehenden erwähnten Verfahren der zweidimensionalen Fraktionierung mit Hilfe der Elektrophorese und Homochromatographie von Wu et al. untersucht.

Es wurde gefunden, dass jedes der Oligonukleotide A-l bis A-16 und B-l bis B-16 die erwartete Nukleotidsequenz aufwies. Fig. 5 zeigt das mit der Analyse des Oligonukleotids A-3 erhaltene Resultat, wobei gefunden wurde, dass A-3 vom 5'-Ende her gelesen die Sequenz GATTCTGAGTG aufwies.

Die Nukleotidsequenz jedes der Oligonukleotide wurde auch nach dem im vorstehenden erwähnten Maxam-Gilbert-Verfahren untersucht.

Es wurde bestätigt, dass jedes der Oligonukleotide A-l bis A-16 und B-l bis B-16 die erwartete Nukleotidsequenz aufwies.

5) Bildung der Oligonukleotid-Blöcke und der Untereinheiten Die Blöcke und Untereinheiten wurden nach dem in Fig. 2 dargestellten und im nachstehenden beschriebenen Verfahren hergestellt.

Zunächst wurden etwa 5 jig von jedem der Oligonukleotide A-l, A-2, A-3, A-14, A-15 und A-16 in destilliertem Wasser (50 jj.1) gelöst, um eine Lösung mit einer Konzentration von etwa 0,1 ng/nlzu ergeben. Die sechs verschiedenen wässrigen Lösungen wurden einzeln jeweils in einer Menge von 10 jal (1 ng berechnetes DNA) in je eines von sechs Ep-pendorf-Gläsern eingegeben. Eine 250 mM TRIS-HC1 (pH 7,6), 50 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Spermin und 50 mM DTT enthaltende Mischlösung (6 (il) wurde in jedes Glas eingegeben und dann wurden 0,5 (il einer wässrigen Lösung von y-32P-ATP (ein Produkt der Amersham International Ltd., UK), 0,5 |il von Tj-Polynukleotidkinase (ein Produkt der Takara Shuzo Co., Ltd., JP) und 13 (il destilliertes Wasser beigegeben, um 30 (il der Mischung zu ergeben. Die Mischung wurde während 30 Minuten bei 37 °C und dann nach Zugabe von 1 jj.1 einer wässrigen 30-mM-Lösung von ATP während weiteren 30 Minuten umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 100 °C während 2 Minuten beendet. Die Reaktionsmischung wurde mit Eis schnell gekühlt. Die auf solche Weise ein phosphoryliertes 5'-Ende aufweisenden Oligonukleotide A-l, A-2, A-3, A-14, A-15 und A-16 wurden einzeln in Mengen von 10 jj.1 in je ein 1,5-ml-Eppendorf-Glas eingegeben. In dieses Glas wurden dann 40 (il einer wässrigen 250-mM-Lösung von TRIS —HCl (pH 7,6), 40 (Ü einer 50-mM-Lösung von Magnesiumchlorid und 35 (il destilliertes Wasser eingegeben, um eine Gesamtmenge von 175 (il zu ergeben. Die Mischung wurde während 2 Minuten auf 90 °C erhitzt, dann allmählich auf Raumtemperatur gekühlt. Nach Zugabe von 10 |il einer 200-mM-Lösung von DTT, 10 (il einer wässrigen 20-mM-Lösung von

ATP und 5 p.1 (100 Einheiten) von T4-DNA-Ligase (ein Produkt der Nippon Gene Co., Ltd., JP) wurde die Mischung über Nacht bei 4 °C umgesetzt, um den Block 1 von gekuppelten Oligonukleotiden A-l, A-2, A-3, A-14, A-15 und A-20 16 zu ergeben.

Auf ähnliche Weise wurden die Blöcke 2 und 3 durch die Kupplung von A-4, A-5, A-6, A-l 1, A-12 und A-13 und durch die Kupplung von A-7, A-8, A-9 und A-10 gebildet.

Der Reaktionsmischung mit den so gebildeten Blöcken 25 wurde zweimal deren Volumen an Ethanol beigegeben und dann wurde die Mischung bei —80 °C während 30 Minuten stehengelassen, um DNA auszufällen. Anschliessend wurden eine Elektrophorese auf einem 12,5 Gew.-%igen Polyacryl-amid-Gel und eine Autoradiographie durchgeführt. Dies 30 ergab Bänder auf den Positionen von 72 und 36 Basenpaaren für den Block 1, ein Band auf der Position von 36 Basenpaaren für den Block 2 und Bänder auf den Positionen von 48 und 24 Basenpaare für den Block 3.

Anschliessend wurde jeses Band ausgeschnitten und dazu 35 eine Mischung von 10-mM-TRIS-HCl (pH 7,6), und einer wässrigen Lösung von 10-mM-EDTA (TRIS-EDTA) beigegeben. Die Mischung wurde dann zur Extraktion bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Die resultierende Mischung wurde zentrifugiert, der Überstand wurde 40 abgeschieden, mit Phenol, das mit TRIS-EDTA gesättigt worden war, durchgeschüttelt und schliesslich zentrifugiert, um die untere Schicht abzuscheiden. Die gleiche Verfahrensweise wurde zweimal mit Phenol, das mit TRIS-EDTA gesättigt worden war, wiederholt. Schliesslich wurde die obere 45 Schicht durch eine mit Sephadex G-50 beschichtete Kolonne von 1 cm Durchmesser und 20 cm Länge durchgeführt, um Phenol und Acrylamid zu entfernen. Das Eluat wurde dann auf 200 (il konzentriert und danach bei — 80 °C während 30 Minuten in Gegenwart von zweimal dem Volumen des Kon-50 zentrats an Ethanol stehengelassen, um DNA auszufällen.

Die drei erhaltenen Blöcke wurden miteinander gekuppelt. Zur Mischung wurden 50 mM TRIS-HC1 (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid, 20 mM DTT, 1 mM ATP und 5 (il (100 Einheiten) von TrDNA-Ligase beigegeben. Zur 55 Kupplung wurde die resultierende Mischung bei 4 °C über Nacht stehengelassen. Der Mischung wurde zweimal deren Volumen an Ethanol beigegeben und sie wurde dann bei —80 °C während 30 Minuten stehengelassen, um DNA auszufällen. Anschliessend wurden eine Elektrophorese auf ei-6o nem 8 Gew.-%igen Polyacrylamid-Gel und eine Autoradiographie durchgeführt. Dies ergab Bänder auf den Positionen von 96 und 192 Basenpaaren. Jedes Band wurde ausgeschnitten und dazu TRIS-EDTA beigegeben. Die Mischung wurde dann zur Extraktion bei Raumtemperatur über Nacht 65 stehengelassen. Die Mischung wurde zentrifugiert, um den Überstand abzuscheiden, der Überstand wurde mit Phenol, das mit TRIS-EDTA gesättigt worden war, durchgeschüttelt und die untere Schicht wurde abgeschieden. Die gleiche Ver-

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fahrensweise wurde zweimal mit Phenol, das mit TRIS-EDTA gesättigt worden war, wiederholt. Die obere Schicht wurde durch eine mit Sephadex G-50 beschichtete Kolonne durchgeführt, das Eluat wurde konzentriert und dann wurde dem Konzentrat zweimal sein Volumen an Ethanol beigegeben und es wurde bei — 80 °C während 30 Minuten stehengelassen, um DNA auszufällen. Das resultierende Produkt wurde mit EcoRI und BamHI gespalten, um die Untereinheit A zu ergeben.

Die gleiche Verfahrensweise wie im vorstehenden wurde wiederholt, wie in Fig. 3 dargestellt, um die Oligonukleotide B-l, B-2, B-15 und B-16 zum Block 4, die Oligonukleotide B-3, B-4, B-l3 und B-l4 zum Block 5, die Oligonukleotide B-5, B-6, B-l 1 und B-12 zum Block 6 und die Oligonukleotide B-7, B-8, B-9 und B-10 zum Block 7 zu kuppeln. Die 26 und 52 Basenpaaren entsprechenden Blöcke wurden gesammelt und auf gleiche Weise gekuppelt, um Produkte mit 104 und 208 Basenpaaren zu ergeben, die mittels Hindlll und BamHI gespalten wurden. Somit wurde die Untereinheit B erhalten.

6) Klonen der Untereinheiten und Analyse der rekombinanten Plasmide

Mit Bezug auf Fig. 2, es wurde pBR322 durch EcoRI und BamHI gespalten, und die Phosphatgruppen wurden von den 5'-Enden durch alkalische Phosphatase (ein Produkt der Takara Shuzo Co., Ltd., JP) abgespalten, um die Rückkehr zum Ausgangszustand zu verhindern. Daraufhin wurden das so gespaltene und dephosphorylierte pBR322 und die Untereinheit A bei 4 °C über Nacht in einer Mischung von 50 mM TRIS-HC1 (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid, 20 mM DTT und 1 mM ATP unter Zugabe von 5 |il Xj-DNA-Ligase stehengelassen, wodurch sie miteinander gekuppelt wurden. Der Reaktionsmischung wurde zweimal ihr Volumen an Ethanol beigegeben und dann wurde die Mischung zur Fällung bei —80 °C während 30 Minuten stehengelassen. Die Mischung wurde dann zentrifugiert, der Niederschlag wurde getrocknet und in 100 (il destilliertes Wasser gelöst, womit ein Plasmid pUGl erhalten wurde, bei welchem die Untereinheit A in pBR322 inseriert Worden war.

Der Stamm HB 101 von Escherichia Coli wurde mit dem Plasmid pUGl nach dem Calcium-Verfahren transformiert.

Der als Wirt dienende Stamm HB101 wurde bei 37 °C in 50 ml LB-Kulturmedium (1 Gew.-% Bactotrypton, 0,5 Gew.-% Hefeextrakt und 0,5 Gew.-% Natriumchlorid) kultiviert. Als die Absorption bei 610 nm 0,25 erreichte, wurde ein Anteil von 40 ml der Kulturbrühe in ein Zentrifu-gierrohr übertragen und bei 6000 Umdrehungen pro Minute während 10 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde beseitigt, der Niederschlag in 20 ml einer eisgekühlten Lösung von 0,1 M Magnesiumchlorid suspendiert, die Suspension unter den gleichen Bedingungen wieder zentrifugiert und der Überstand beseitigt. Der Niederschlag wurde in 20 ml einer eisgekühlten Lösung von 0,1 M Calciumchlorid und 0,05 M Magnesiumchlorid suspendiert und während 1 Stunde eisgekühlt. Die Suspension wurde zentrifugiert, der Überstand beseitigt, der Niederschlag in 2 ml einer eisgekühlten Lösung von 0,1 M Calciumchlorid und 0,05 M Magnesiumchlorid suspendiert. Einem Anteil von 200 p.1 der Suspension wurden 10 jj.1 einer wässrigen Lösung von pUGl beigegeben und die Mischung wurde während 1 Stunde eisgekühlt und dann in einem Wasserbad auf 43,5 °C während 30 Sekunden erhitzt. Daraufhin wurden der Mischung 2,8 ml des LB-Kulturmediums beigegeben, worauf eine Inkubation bei 37 °C während 1 Stunde erfolgte. Die Kultur wurde dann auf eine 50 |ig/ml Ampicillin enthaltende LB-Platte in einer Menge von 200 |xl/Glas gestrichen und über Nacht bei 37 QC

der Inkubation unterzogen. Die wachsenden Kolonien wurden durch weitere Transplantation auf eine 50 jj.g/ml Ampicillin enthaltende LB-Platte und auch auf eine 20 |ig/ml Tetracyclin enthaltende LB-Platte untersucht und über Nacht bei 37 °C der Inkubation unterzogen. Die nur gegen Ampicillin resistenten Kolonien wurden abgeschieden, um eine transformierte Zelle zu ergeben. Plasmide wurden im kleinen Massstab aus der Zelle nach dem alkalischen Extraktionsverfahren gewonnen und auf das Vorhandensein einer Spaltstelle für Bglll untersucht. Eine der das Plasmid mit der Spaltstelle für Bglll beherbergenden Zellen wurde in grossem Massstab kultiviert, um ein gereinigtes, auf gleiche Weise nach dem alkalischen Extraktionsverfahren gewonnenes Plasmid zu ergeben.

Die Nukleotidsequenz der in das resultierende pUGl inserierten Untereinheit A wurde nach dem im vorangehenden erwähnten Maxam-Gilbert-Verfahren auf beiden Strängen analysiert.

Die Photographien 1 und 2 zeigen die Resultate der Analyse. Die Bahnen 1 bis 4 sind das Resultat der Elektrophorese für das EcoRI-Sall Fragment und die Bahnen 5 bis 8 dasjenige für das BamHI-Pstl Fragment. Die Bahnen 1 und 5 zeigen die Reaktionsprodukte für Guanin, die Bahnen 2 und 6 die Reaktionsprodukte für Guanin+Adenin, die Bahnen 3 und 7 die Reaktionsprodukte für Thymin+Cytosin, und die Bahnen 4 und 8 die Reaktionsprodukte für Cytosin. Die Photographie 2 zeigt die mit den gleichen Proben wie im vorstehenden erreichten Resultate, wobei ein Bereich auf der Seite des höheren Molekulargewichts (entsprechend dem oberen Teil der Photographie 1) vergrössert ist. Auf diese Weise wurde die Nukleotidsequenz der Untereinheit A bestätigt.

Mit Bezug auf Fig. 3, es wurde das Plasmid pBR322 durch Hindlll und BamHI gespalten und das grössere Fragment durch Elektrophorese isoliert und mit der Untereinheit B gekuppelt. Somit wurde auf gleiche Weise wie im Falle von pUGl ein Plasmid pUG2 erhalten, bei welchem die Untereinheit B in pBR322 inseriert worden war. Unter Verwendung des resultierenden Plasmids pUG2 wurde der Stamm HB 101 transformiert und es wurden die nur gegen Ampicillin resistenten Kolonien selektiert. Plasmide wurden aus den Kolonien gesammelt und dann auf das Vorhandensein einer Spaltstelle für Bglll und einer Spaltstelle für Mlul untersucht. Die das Plasmid mit den beiden Spaltstellen beherbergenden Zellen wurde selektiert. Eine der selektierten Zellen wurde in grossem Massstab kultiviert, um ein gereinigtes Plasmid pUG2 zu ergeben. Die Nukleotidsequenz der Untereinheit B in pUG2 wurde nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren auf beiden Strängen analysiert.

Die Photographie 3 zeigt die Resultate der Analyse. Die Bahnen 1 bis 4 zeigen das mit dem Hindlll-Sall Fragment erreichte Resultat. Die Bahnen 5 bis 8 zeigen das mit der gleichen Probe erreichte Resultat, wobei ein Bereich auf der Seite des höheren Molekulargewichts (entsprechend dem oberen Teil der Bahnen 1 bis 4) vergrössert ist. Jede Bahn zeigt dasselbe Reaktionsprodukt wie in der entsprechenden Bahn in Photographie 1. Auf diese Weise wurde die Nukleotidsequenz der Untereinheit B bestätigt.

Mit Bezug auf Fig. 4, es wurde pUGl durch Hindlll und Sali gespalten und ein grösseres Fragment mit einer 1,5-m-Kolonne von Biogel isoliert. pUG2 wurde durch Hindlll und Sali gespalten und dann der Elektrophorese unterzogen, um ein kleineres Fragment zu erhalten. Die beiden Fragmente wurden miteinander kombiniert und zur Kupplung mit T4-DNA-Ligase behandelt, womit ein Plasmid pUG3 erhalten wurde, bei welchem die Untereinheiten A plus B, d. h. das ß-Urogastron-Gen, in pBR322 inseriert worden waren. Unter Verwendung des resultierenden Plasmids pUG3 wur5

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de der Stamm HB 101 von Escherichia Coli transformiert. Der Transformant wurde unter dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung mit der Hinterlegungsnummer FERM BR-543 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-Chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305-JP, am 22. Juni 1984 hinterlegt.

Auch im vorangehenden Falle wurden die das Plasmid pUG3 beherbergenden, nur gegen Ampicillin resistenten, eine Spaltstelle für Mlul aufweisenden Zellen selektiert. Eine der selektierten Zellen wurde in grossem Massstab kultiviert, um ein gereinigtes Plasmid pUG3 zu ergeben. Die Nukleotidsequenz des ß-Urogastron-Gens in pUG3 wurde nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren auf beiden Strängen analysiert.

Die Photographie 4 zeigt die Resultate der Analyse. Die Bahnen 1 bis 4 zeigen das mit dem BamHI-Pstl Fragment erreichte Resultat. Die Bahnen 5 bis 8 zeigen das mit der gleichen Probe erreichte Resultat, wobei ein Bereich auf der Seite des höheren Molekulargewichts (entsprechend dem oberen Teil der Bahnen 1 bis 4) vergrössert ist. Jede Bahn zeigt dasselbe Reaktionsprodukt wie in der entsprechenden Bahn in Photographie 1. Die Analyse bestätigte die Nukleotidsequenz des ß-Urogastron-Gens.

7) Den Ausdrucksvektor inserierender Promotor IPl

Zum Ausdrücken von ß-Urogastron wurde der Promotor A.Pl, der linksgerichtete Promotor vom A,-Phag, wie im nachstehenden beschrieben verwendet.

Zunächst wird die Herstellung eines vom Stamm HB 101 von Escherichia Coli abgeleiteten Stammes ECI-2 beschrieben. ECI-2 diente als Wirt für A.PL ausdrückende Plasmide. Dann wird die Klonierung eines DNA-Fragments beschrieben werden, das den Promotor WPl enthält, der aus dem DNA von ICI857S7, eines Mutanten des X-Phags, gewonnen wurde. Anschliessend wird das Ausdrücken des ß-Urogastron-Gens durch den Promotor 1PL im Wirtsstamm ECI-2 beschrieben werden.

7-1) Bildung des Stammes ECI-2

Der Stamm ECI-2 ist Escherichia Coli HB 101 und beherbergt ein Plasmid pGH37 zum Ausdrücken eines CI857-Gens.

pGH37 wurde nach dem in Fig. 6 dargestellten Verfahren hergestellt. Zunächst wurde DNA aus XCI857S7 durch Bglll gespalten. Dann wurden an der Spaltstelle die kohäsi-ven Enden unter Verwendung von Sl-Nuklease digeriert. 1 Hg von dem durch Bglll gespaltenen DNA aus A.CI857S7 wurden während 30 Minuten in 100 jil einer 200 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumacetat und 5 mM Natriumchlorid enthaltenden wässrigen Lösung (pH 4,5) mit 200 Einheiten von Sl-Nuklease bei 20 °C umgesetzt. Die so erhaltenen, mit abgestumpften Enden versehenen DNA-Fragmente wurde der Elektrophorese mit 1,0 Gew.-%igem Aga-rose-Gel unterzogen, um davon ein Fragment mit 2385 Basenpaaren zu isolieren, welches das gesamte strukturelle Gen CI857 aufwies. Das Fragment wurde in die PvuII Spaltstelle von Plasmiden pGLlOl inseriert, um ein Plasmid pGH36 herzustellen, welches das Gen CI857 unter der Kontrolle eines Promotors, lac UV5, ausdrückt. Anschliessend wurde pGH36 durch zwei Restriktionsenzyme, EcoRI und Pstl, ge-5 spalten, um ein Fragment mit 1193 Basenpaaren zu ergeben, welches in ein Plasmid pSCIOl zwischen den Spaltstellen für EcoRI und Pstl inseriert wurde, um ein Plasmid pGH37 zu bilden.

Anschliessend wurde der Stamm HB101 von Escherichia io Coli mit pGH37 nach dem vorstehend erwähnten Calcium-Verfahren transformiert. Einer der resultierenden Stämme wurde ECI-2 genannt. Der Stamm ECI-2 wurde unter dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung mit der Hinterlegungsnummer FERM BR-i5 542 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industriai Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-Chome, Yatabe-machi Tsubuka-gun, Ibaraki-ken 305-JP, am 22. Juni 1984 hinterlegt. Dieser Stamm ist gegen Tetracyclin resistent, drückt das 2o Gen CI857 aus und erlaubt das gleichzeitige Vorhandensein, durch Transformation, von anderen, beispielsweise von pBR322 abgeleiteten Plasmiden. Aus diesen Gründen wurde in der Folge der Stamm ECI-2 als Wirt für A.Pl ausdrückende Plasmide verwendet.

25

7-2) Klonierung des Promotors A-Pl und Herstellung von ausdrückenden Plasmiden

Wie in Fig. 7 dargestellt wird, wurde pGH35 als erstes gebildet. DNA aus X,CI857S7 wurde durch EcoRI und Sali 30 gespalten, um ein Fragment mit 5925 Basenpaaren zu ergeben, das sowohl den Promotor A,PL und das Gen CI857 als auch den Promotor ÄPr umfasste. Das Fragment wurde in ein Plasmid pBR322 zwischen den Spaltstellen für EcoRI und Sali inseriert, um ein Plasmid pGH25 zu bilden. 3s Anschliessend wurde pGH25 durch BamHI gespalten und mit einem auf gleiche Weise durch BamHI gespaltenen pBR322 gekuppelt, um pGH34 zu bilden.

Danach wurde pGH34 durch Aval und Bglll gespalten und anschliessend durch Sl-Nuklease zu einem mit abge-40 stumpften Enden versehenen Fragment von etwa 4500 Basenpaaren verarbeitet. Das Fragment wurde durch T4-DNA-Ligase im Kreis geschlossen, um ein Plasmid pGH35 zu bilden.

Anschliessend wurde pEK28 gebildet, wie in Fig. 8 dar-45 gestellt. Synthetische, eine Shine-Dalgarno-Sequenz umfassende und die nachstehend angegebene Nukleotidsequenz aufweisende Oligonukleotide C-l-1 und C-l-2 als Adapter wurden mit dem Fragment gekuppelt, welches durch Spalten von pGH35 durch Hpal erhalten wurde. Die 50 Zusammensetzung wurde weiter mit dem durch BamHI gespaltenen Plasmid pMC1403 gekuppelt, um das Plasmid pEG2 zu bilden. pEG2 umfasst zwei Gene der Ampicillin-Resistenz und drückt unter der Kontrolle des Promotors XPl ein von pMC1403 abgeleitetes ß-Galactosidase-Gen aus, wo-55 bei es ein Start-Codon sowie die im Adapter enthaltene Shine-Dalgarno-Sequenz verwendet.

Die Fragmente C-l-1 und C-l-2 weisen die folgende Nukleotidsequenz auf.

60

Shi ne-Dalgarno-Sequens

Start-Codon

C-l-i C-l-2

U -T 7

A G G A A C AG A T C T A T G

TCCTTGTCTAGATACCTAG

Bgl II

17

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Um das Ausdrücken von ß-Galactosidase in dem das Plasmid pEG2 beherbergenden Wirt ECI-2 zu bestätigen, wurde das Verfahren von Miller verwendet (J. Miller, «Experiments in Molecular Genetics», Cold Spring Harbor La-boratory, New York (1972), S. 352 — 355). Dieses Verfahren basiert auf der Reaktion von ß-Galactosidase mit einem synthetischen Substrat (o-Nitrophenylgalactosid), welche eine gelbe Verbindung o-Nitrophenol freisetzt. Das Verfahren von Miller wird näher beschrieben. Eine Menge von 0,1 ml der Kultur einer Bakterienprobe, deren Absorption bei 610 nm gemessen wurde, wird mit 1,9 ml eines Assay-Puffers (0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0; 1 mM Magnesiumsulfat; 0,1 M ß-Mercaptoethanol) gemischt und während 15 Sekunden mit 0,1 ml Toluol fest geschüttelt, um die Permeabilität der Bakterienprobe zu erhöhen. Anschliessend wird das Toluol mittels eines Aspirators verdampft. Nach Zugabe von 0,2 ml der Lösung von o-Nitrophenylgalactosid (Lösung von 400 mg o-Nitrophenylgalactosid in 100 ml des Assay-5 Puffers) wird die Mischung bei 30 °C der Inkubation unterzogen, bis sich eine gelbe Färbung entwickelt, worauf 0,5 ml von 1 M Natriumcarbonat beigegeben werden, um die Enzymreaktion zu stoppen. Die Absorption der Reaktionsmischung wird bei 420 nm und 550 nm bestimmt, io Die Aktivität von ß-Galactosidase wird entsprechend der nachstehenden Gleichung in Einheiten von 1 ml der flüssigen Kultur definiert, wobei die Absorption bei 610 nm gleich 1,0 gesetzt wird.

Aktivität von 0D42O ~ 1 s 75 * DD55D

ß-Gal actosi dase = x 1000

(Einheiten) t >•: v x wobei t = Inkubationszeitdauer (Minuten)

v = dem Reaktionssystem beigegebene Probenmenge OD6io= Absorption der Probe bei 610 nm

Dieses Verfahren zeitigte folgende Resultate. Wenn der das pEG2 beherbergende Stamm ECI-2 bei 30 °C der Inkubation unterzogen wurde, betrug die Aktivität von ß-Galac-tosidase 98 Einheiten. Wenn jedoch die Kultur weiter während 1 Stunde bei 42 °C der Inkubation unterzogen wurde, wurde der Promotor 1PL aktiviert, was zur Folge hatte, dass die Aktivität von ß-Galactosidase nun 9637 Einheiten betrug. Dies bestätigt, dass die Sequenz vom Promotor ÄJPl zur ß-Galactosidase in der erwarteten Reihenfolge vorliegt.

Obwohl pEG2 zwei Spaltstellen für Bglll aufweist, wird nur die Spaltstelle für Bglll benötigt, die sofort nach der Shine-Dalgarno-Sequenz der ß-Galactosidase liegt, während die andere Stelle unerwünscht ist. Entsprechend wurde das Plasmid durch BamHI gespalten und wieder gekuppelt, um ein Fragment mit etwa 770 Basenpaaren zu entfernen. Die Bildung von pEK28, eines ausdrückenden Plasmids unter Verwendung des Promotors AJPl, war damit abgeschlossen.

7-3) Ausdrücken des fusionierten Gens der vorderen Hälfte von ß-Urogastron und Ausdrücken der ß-Galactosidase Fig. 9 zeigt schematisch die Reihe von Verfahrensweisen, die nachstehend beschrieben werden.

Ein Plasmid pUGlOl mit einem fusionierten Gen der vorderen Hälfte von ß-Urogastron und mit ß-Galactosidase wurde auf folgende Weise gebildet. Insbesondere wurden pUGl, das ein fusioniertes Gen der vorderen Hälfte von ß-Urogastron aufweist, und pMC1403, das ein ß-Galactosida-se-Gen aufweist, durch BamHI gespalten und dann zur Bildung von pUGlOl gekuppelt. Bei diesem Plasmid sind die vordere Hälfte des ß-Urogastron-Gens und das ß-Galactosi-dase-Gen in derselben Struktur gekuppelt. Entsprechend drückt das Plasmid die Aminosäurensequenzen der beiden als fusioniertes Protein aus.

Zum Ausdrücken mit diesem Plasmid unter der Kontrolle des Promotors A,Pl wurden pUGlOl und pEK28 beide durch Bglll gespalten.

Die Spaltung durch Bglll ergibt ein DNA-Fragment mit einem herausragenden 5'-Ende in der Form a \

... TCTAG

Wenn jedoch das DNA-Fragment mit einem grossen Fragment von DNA-Polymerase-I aus Escherichia Coli (Klenow-Fragment) in Gegenwart der vier Arten von De-25 oxyribonukleotidtriphosphaten dGTP, dATP, dTTP und dCTP umgesetzt wird, so wird durch Auffüllen der entsprechenden Nukleotiden ein stumpfes Ende erhalten, indem ein Ende in der in der Form

30

AGATC TCTAG

gebildet wird. Wenn nur dGTP als Nukleotidkomponente 35 beigegeben wird, wird wegen der Beendigung der Reaktion ein Ende in der Form

/... AG

[... TCTAG

gebildet. Wenn nun Sl-Nuklease verwendet wird, um den übrigbleibenden einzelnen Strang zu digerieren, wird ein stumpfes Ende in der Form

45

AG TC

so gebildet. Auf gleiche Weise, wenn in der Klenow-Reaktion dGTP und dATP beigegeben werden und dann mit Sl-Nuklease digeriert wird, wird ein Ende in der Form

55

AGA TCT

gebildet. Wenn die Klenow-Reaktion unter Beigabe von dGTP, dATP und dTTP durchgeführt und anschliessend mit 60 Sl-Nuklease digeriert wird, wird ein Ende in der Form

/. . . AGAT I... TCTA

65

gebildet. Wenn schliesslich nur mit Sl-Nuklease digeriert wird, ohne die Klenow-Reaktion durchzuführen, wird ein Ende in der Form

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18

a gebildet. Somit werden fünf Arten von stumpfen Enden mit voneinander um ein Basenpaar verschiedenen Längen gebildet, wenn ein DNA-Fragment mit einem Ende in der Form

. . ag \

.. tctag)

der Klenow-Reaktion unter Verwendung von verschiedenen Nukleotiden und/oder der Reaktion mit Sl-Nuklease unterzogen wird.

Die Klenow-Reaktion und die Reaktion mit Sl-Nuklease wurden unter folgenden Bedingungen durchgeführt.

*** Klenow-Reaktion:

In 50 |il eines 40 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,4), 1 mM ß-Mercaptoethanol und 10 mM Magnesiumchlorid enthaltenden Reaktionsmediums wurde 1 Hg DNA als Substrat mit 1 mM von jedem der Deoxyribonukleotidtriphos-phate bei 12 °C während 30 Minuten in Gegenwart von 1 Einheit des Enzyms (Klenow-Fragment) und von 1 mM von ATP umgesetzt.

*** Sl-Nuklease-Reaktion:

In 100 h1 eines 200 mM Natriumchlorid, 30 mM Na-triumacetat und 5 mM Zinksulfat (pH 4,5) enthaltenden Reaktionsmediums wurde 1 |ig DNA als Substrat mit 200 Einheiten des Enzyms bei 20 °C während 30 Minuten umgesetzt.

pEK28 und pUGlOl wurden beide durch Bglll gespalten und danach verschiedenen Kombinationen der Klenow-Reaktion und der Sl-Nuklease-Reaktion unterzogen, was Fragmente mit 5 Arten von stumpfen Enden ergab. In Kombination damit ergeben die beiden Arten dieser Fragmente 21 voneinander in der Anzahl und in der Sequenz der zwischen der Shine-Dalgarno-Sequenz und dem Start-Codon des fusionierten Proteins angeordneten Nukleotide verschiedene Kombinationen, wie in Tabelle 2 ersichtlich ist.

In der Tat wurden die so erhaltenen DNA-Fragmente durch Sali gespalten, um Fragmente zu isolieren, die das Gen enthielten, welches für das aus der vorderen Hälfte von ß-Urogastron und aus ß-Galactosidase von pUGlOl fusionierte Protein codiert, sowie Fragmente zu isolieren, welche 20 den Promotor Ä,PL aus pEK28 enthielten. Diese Fragmente wurden durch T4-DNA-Ligase in den in Tabelle 2 angegebenen Kombinationen gekuppelt.

Folglich wurden die in Tabelle 3 aufgeführten rekombinante Plasmide erhalten. Die ß-Galactosidase-Aktivität der 25 ausgedrückten fusionierten Proteine wurde nach dem Verfahren von Miller bestimmt. Tabelle 3 zeigt, dass alle Plasmide einen ziemlich hohen Wert der ß-Galactosidase-Aktivität ausdrückten. Insbesondere wurden mit pUG103, pUG104 und pUG117 bemerkenswerte Resultate erreicht.

30

Tabelle 2

Nucleotidsequenz aufwärts vom Start-Codon (ATG) ATCTGC- GATCTGC-

Nucleotidsequenz abwärts von der SD-Sequenz (AGGA)

-ACA

-ACAG

-ACAGA

-ACAGAT

-ACAGATC

-ACAATCTGC- (pUG105)

-ACAGAATCTGC- (pUGl 13) -ACAGATATCTGC- (pUG117) -ACAGATCATCTGC- (pUG121)

-ACAGATCTGC- (pUG106) -ACAGGATCTGC- (pUGllO) -ACAGAGATCTGC- (pUG114) -ACAGATGATCTGC- (pUG118) -ACAGATCGATCTGC- (pUG122)

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Nucleotidsequenz aufwärts vom Start-Codon (ATG) TGC- CTGC-

TCTGC-

-ACATGC-

(pUG102)

-ACAGTGC-

(pUG107)

-ACAGATGC-

(pUGlll)

-ACAGATTGC-

(pUG115)

-ACACTGC-

(pUG103)

-ACAGCTGC-

(pUG108)

-ACAGACTGC-

(pUG112)

-ACAGATCCTGC-(pUG119)

-ACATCTGC-(pUG104) -ACAGTCTGC-(pUG109)

-ACAGATTCTGC-(pUG116)

-ACAGATCTCTGC-(pUG120)

Nucleotidsequenz abwärts -ACA von der SD-Sequenz

-ACAG -ACAGA -ACAGAT -ACAGATC

Als nächstes wurde ein Vektor zum Ausdrücken von ß-Urogastron aus pUG103 und pUG117 hergestellt. Das Plasmid (pUG103 oder pUGl 17) wurde durch Hindlll und Pvu-II gespalten, um ein Fragment von 1,2 Kb (Kb = Kilo Basenpaare) zu ergeben, welches den sich vom Promotor A.Pl bis zur vorderen Hälfte des ß-Urogastron-Gens erstreckenden Bereich enthielt. Ausserdem wurde pUG2 durch EcoRI

gespalten, mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt und durch Hindlll gespalten, um ein Fragment von 4,1 Kb zu ergeben. Die beiden Fragmente wurden durch Tt-DNA-Ligase ge-65 kuppelt und der Stamm ECI-2 von Escherichia Coli wurde nach dem vorstehend erwähnten Calcium-Verfahren transformiert, um einen Rekombinanten zu ergeben, welcher zum Ausdrücken der Kombination der vorderen Hälfte und der

19

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Tabelle 3

Anzahl der Nucleotide Recombinantes ß-Galactosidase zwischen der SD-Sequenz Plasmid (Einheiten)

und dem Start-Codon

6

pUG102

1674

7

pUG103

2533

7

pUG107

2260

8

pUG104

2802

8

pUG108

1835

9

pUG105

1018

9

pUG109

1942

10

pUG106

973

11

pUGllO

1764

11

pUG113

1950

11

pUG119

1862

12

pUG114

946

12

pUG117

2332

12

pUG120

1374

13

pUG118

2041

13

pUG121

1678

14

pUG122

1814

hinteren Hälfte des ß-Urogastron-Gens, d. h. des gesamten ß-Urogastron-Gens unter der Kontrolle des Promotors Ä.Pl, das Plasmid pUG103-E oder pUGl 17-E enthielt.

8) Vektor zum Ausdrücken des fusionierten Proteins Wie nachstehend beschrieben, wurden ein auf dem Plasmid pBR322 vorhandenes ß-Lactamase-Gen und ein ß-Urogastron-Gen miteinander gekuppelt, um ß-Urogastron als fusioniertes Protein auszudrücken.

8-1) Donator des ß-Lactamase-Gens Durch Spaltung von pBR322 durch Aval und PvuII und anschliessende Klenow-Reaktion und Kupplung durch T4-DNA-Ligase wird pBRH02 erhalten. Dieses Plasmid weist als Markierer Gene für die Resistenz gegen Ampicillin (ApR) und gegen Tetracyclin (TcR) auf. Durch Spaltung von pBR325 durch Aval und Hindlll und anschliessende Klenow-Reaktion und Kupplung wird pBRH02 erhalten, welches als Markierer Gene für die Resistenz gegen Ampicillin (ApR) und gegen Chloramphenicol (CmR) aufweist. Fig. 10 zeigt diese Plasmide.

8-2) Donator des ß-Urogastron-Gens Das wie bereits beschrieben gebildete pUG3 wurde durch MboII gespalten, um 13 Arten von DNA-Fragmenten zu ergeben, die wie in Fig. 11 dargestellt in der Reihenfolge ihrer Grösse «A» bis «M» benannt wurden. Unter diesen Fragmenten wurde gefunden, dass das H-Fragment, anfangend mit einem für Asparagin codierenden Nukleotid beim N-Terminus von ß-Urogastron und endend mit 16 Basen abwärts vom Stop-Codon, aus 179 Basenpaaren zusammengesetzt war und das gesamte strukturelle ß-Urogastron-Gen aufwies. Um das H-Fragment zu isolieren, wurden die Fragmente der Elektrophorese mit einem 6 Gew.-%igen Poly-acrylamid-Gel unterzogen, und dann wurde das Fragment gereinigt.

8-3) Adapter

Zum Bilden von Adaptern wurden die in Tabelle 4 aufgeführten Oligonukleotide nach dem gleichen Verfahren hergestellt, wie im vorangehenden beschrieben wurde. Diese

Adapter wurden so gestaltet, dass sie dafür codieren, dass das basische Aminosäurenpaar von Lys-Arg oder Arg-Lys das ß-Urogastron-Gen vom ausgedrückten fusionierten Protein enzymatisch abspaltet.

Tabelle 4

Adapter 5 ' Ende 3 ' Ende

D-l-3

CCGTAAG

D-1-4

TTACGG

D-2-1

CGTAAG

D-2-2

TTACG

D-3-2

TTACGGAT

D-4-2

TTACGTGCA

E-l

CGCTAAACGG

E-2

CGTTTAGCG

E-3

GACAAACGG

E-4

CGTTTGTC

E-5

CGTTTAGCGAT

E-6

CGTTTGTCTGCA

E-7

CGGCTAAACGG

E-8

CGTTTAGCCG

E-9

CAAACGG

E-10

CGTTTG

8-4) System zum Ausdrücken des fusionierten Proteins von durch Lys-Arg gekuppelten ß-Lactamase und ß-Urogastron

Ein Vektor zum Ausdrücken von dem aus ß-Lactamase und ß-Urogastron fusionierten Protein wurde so gebildet, dass eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz in dem einen Adaptor enthaltenden Bereich erzeugt wird.

8-4-a) Bildung von p2301 bis pUG2303 Es wurde das in Fig. 12 angegebene Verfahren angewandt. Das Plasmid pBRH02 wurde durch Wirkung von XmnI bei 37 CC während 3 Stunden vollständig gespalten.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

670 654

20

Daraufhin wurden, in einem einzigen Schritt von 15 Stunden bei 12 CC, 3 ng des Vektors, etwa 0,1 Hg des ß-Urogastron-Fragments von 179 Basenpaaren und jeweils etwa 1 Hg von als Adapter dienenden E-1 und E-2 (mit nicht phosphory-lierten 5'-Enden) gekuppelt, um Plasmide als Ausdrucksvektoren zu ergeben. Der Stamm HB101 wurde unter Verwendung der Plasmide nach dem Calcium-Verfahren transformiert.

Von den 499 erhaltenen TcR-Kolonien waren deren 168 (33,7%) Aps-Kolonien. Diese Kolonien wurden nach dem Miniherstellungsverfahren auf die Grösse des Plasmid-DNA untersucht. 13 Plasmide waren etwa 200 Basenpaare grösser als der Vektor und es wurde betrachtet, dass ein ß-Uroga-stron-Gen darin inseriert war. Alle davon, welche eine Spaltstelle für Mlul aufwiesen, wurden durch Hinfl gespalten und durch Elektrophorese mit einem 1,5 Gew.-%igen Agarose-Gel auf die Orientierung der Insertion des ß-Uroga-stron-Gens untersucht. Drei der untersuchten ergaben Fragmente von etwa 1050 Basenpaaren und etwa 800 Basenpaaren. Dies zeigte an, dass das ß-Urogastron-Gen mit der gleichen Orientierung wie die ß-Lactamase inseriert war. Diese drei Plasmide wurde pUG2301 bis pUG2303 benannt.

8-4-b) Bildung von pUG2101 bis pUG2105

Es wurde das in Fig. 13 angegebene Verfahren angewandt. Das Plasmid pBR322 wurde als Plasmidvektor mit einer einzigen Spaltstelle für Pvul im ß-Lactamase-Gen verwendet. Nach dem in 8-4-a) beschriebenen Verfahren wurde unter Verwendung von als Adapter dienenden E-1 und E-5 ein Ausdrucksvektor gebildet.

Als die 1626 erhaltenen TcR-Kolonien auf die Ap-Empfindlichkeit untersucht wurden, wurde gefunden, dass deren 31 (1,9%) Aps-Kolonien waren. Das Miniherstellungsverfahren wurde auf 22 Kolonien TcR und Aps angewandt und die Plasmide durch Spaltung durch Mlul auf die Insertion des ß-Urogastron-Gens untersucht. Es wurde ge-5 funden, dass 20 Plasmide eine Spaltstelle für Mlul aufwiesen. Die Orientierung wurde durch Spaltung durch Hinfl oder BamHI untersucht. Es wurde gefunden, dass die Plasmide pUG2101 bis pUG2105 ein darin inseriertes ß-Uroga-stron-Gen mit der gleichen Orientierung wie das ß-Lactama-io se-Gen aufwiesen.

8-4-c) Bildung von pUG2701 bis pUG2703

Nach dem gleichen Verfahren wie in 8-4-a) wurden unter Verwendung Von pBR322 als Vektor und von E-7 und E-8 15 als Adapter Ausdrucksplasmide gebildet, wie in Fig. 14 dargestellt.

Von den 217 erhaltenen TcR-Kolonien waren deren 106 (48,8%) Aps-Kolonien. Das Miniherstellungsverfahren wurde auf 25 dieser Kolonien angewandt. 8 dieser Plasmide waren etwa 200 Basenpaare grösser als der Vektor und wiesen ein darin inseriertes ß-Urogastron-Gen auf, so dass diese 8 Plasmide durch BamHI gespalten und auf die Orientierung des Gens untersucht wurden. In der Folge wurden gefunden, dass in drei Plasmiden das ß-Urogastron-Gen mit der gleichen Orientierung wie die ß-Lactamase inseriert war, diese drei Plasmide wurde pUG2701 bis pUG2703 benannt.

Das nach der vorstehenden Verfahrensweise 8-4-a) erhaltene Plasmid pUG2301 erzeugt ein fusioniertes Protein eines 30 Teiles von ß-Lactamase und ß-Urogastron. Die erwartete Sequenz von Aminosäuren und die entsprechende Nukleotidsequenz werden nachstehend angegeben.

Met Ser

ATG AGT

Ala Leu

GCC CTT

Phe Cys

TTT TG C

Pro Glu

C CA GAA

Asp Ala

GAT GCT

Arg Val

CGA GTG

Leu Asn

CT C AAC

Ile GI il

ATT CAA

I le Pro

ATT CCC

L eu P po

CTT CCT

Thr Leu

A CG CTG

Glu Asp

GAA GAT

Gly Tyr

GGT TAC

Ser Gly

AGC GGT

His Phe

CAT TTC

Phe Phe

TTT TTT

Val Phe

GTT TTT

Val Lys

GTG AAA

Gin Leu

CAG TTG

Ile Glu

ATC GAA

Lys I le

AAG ATC

A rg Val

CGT GTC

Ala Ala

G C G G C A

Ala His

GCT CAC

Val Lys

GTA AAA

Gly Ala

GGT GCA

Leu Asp

CTG GAT

Leu Glu

CTT GAG

21 670 654

Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Ala

AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGC GCT

Lvs Arg Asn Ser Asp Ser Glu Cys

AAA CGG AAT AGC GAT TCT GAG TGC

Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys

CCA CTG TCT CAC GAT GGC TAT TGT

Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr CTG CAC GAC GGT GTT TGC ATG TAC

Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala ATC GAA GCT TTG GAT AAA TAC GCG

Cys Asn Cys Vai Val Gly Tyr lie TGT AA C TGT GTA GTG GGT TAT ATC

Gyl Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp GGT GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT

Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg (stop) CTG AAA TGG TGG GAA TTG CGT T AA

TAGTGAAGATCTGGATCCGTTTAGCGTTTTCCA ATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGC

GCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAG

CAACTCGGTCGCCGCATAC

Auf gleiche Weise erzeugt das nach der vorstehenden Verfahrensweise 8-4-b) erhaltene Plasmid pUG2101 ein fusioniertes Protein mit der nachstehenden Primärstruktur.

Met Ser Ile Gin His Phe Arg Val ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT GT C

Ala L eu

GCC CTT

Phe Cys

TTT TGC

Ile Pro

ATT CCC

L eu P ro

CTT C CT

Phe Phe

TTT TTT

Val Phe

GTT TTT

Ala Ala

GCG GCA

Ala His

GCT CAC

670 654 22

Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys C CA GAA A CG CTG GTG AAA GTA AAA

Asp Ala Glu Asp

GAT GCT GAA GAT

Arg Val Gly Tyr

CGA GTG GGT TAC

Leu Asn Ser Gly

CTC AAC AGC GGT

Ser Phe Arg Pro

AGT TTT CGC CCC

Pro Met Met Ser

CCA ATG ATG AGC

Leu Leu Cys Gly

CTG CT A TGT GGC

Arg Val Asp Ala

CGT GTT GAC GCC

Leu Gly Arg Arg

CTC GGT CGC CGC

Gin Asn Asp I le

CAG AAT GAC TTG

Pro Val Thr Glu

CCA GTC ACA GAA

Asp Gly Met Thr

GAT GGC ATG ACA

Cys Ser Ala Ala

TGC AGT GCT GCC

Asp Asn Thr Ala

GAT AAC ACT GCG

Gin Leu Gly Ala

CAG TTG GGT GCA

Ile Glu Leu Asp

ATC GAA CTG GAT

Lys Ile Leu Glu

AAG ATC CTT GAG

Glu Glu Arg Phe

GAA GAA CGT TTT

Thr Phe Lys Val

ACT TTT AAA GTT

Ala Val Leu Ser

GCG GTA TT A TCC

Gly Gin Glu Gin

GGG CAA GAG CAA

Ile His Tyr Ser

ATA CAC TAT TCT

Val Glu Tyr Ser

GTT GAG TAC T CA

Lys His Leu Thr

AAG CAT CTT ACG

Val Arg Glu Leu

GTA AGA GAA TTA

I le Thr Met Ser

ATA ACC ATG AGT

Ala Asn Leu Leu

GCC AAC TTA CTT

Leu CTG

Ser AGC

H is CAC

Gly GGT

Leu TTG

Val GTA

Cys TGT

T rp TGG

Thr ACA

Asp GAT

Val GTT

Asp GAT

Val GTG

Gin CAA

Glu GAA

Thr ACG

Ser TCT

Gly GGC

Cys TGC

Lys AA A

Gly GGT

Tyr TAC

Leu TTG

I le ATC

Glu GAG

Tyr TAT

Met ATG

Tyr TAC

Tyr TAT

Arg CGT

Ala GCT

Cys TGC

Cys TGT

T yr TAC

Ala GCG

I le ATC

Asp GAT

Lys A A A

Pro CCA

Leu CTG

I le ATC

Cys TGT

Gly GGT

Leu CTG

Arg CGG

Leu CTG

His CAC

GI u GAA

Asn AAC

GI u GAA

Lys A A A

Asn AAT

Ser TCT

Asp GAC

Ala GCT

Cys TGT

Arg CGC

T rp TGG

(stop)

T AA TAGTGAAGATC

TGGATCCGTTTAGCGATCGGAGGACCGAAGG AGCTAACCGCTTT TTT G C A C A

Auf gleiche Weise erzeugt das nach der vorstehenden Verfahrensweise 8-4-c) erhaltene Plasmid pUG2701 ein sioniertes Protein mit der nachstehenden Primärstruktur.

Met Ser Ile Gin His Phe Arg Val ATG AGT ATT CAA CAT TTC CGT GTC

Ala L eu

GCC CTT

Phe Cys

TTT TGC

Pro Glu

CCA GAA

Ile Pro

ATT CCC

Leu Pro

CTT C CT

Thr Leu

ACG CTG

Phe Phe

TTT TTT

Val- Phe

GTT TTT

Val Lys

GTG AAA

Ala Ala

GCG G C A

Ala His

GCT CAC

Val Lys

GTA AAA

670 654 24

Asp Ala Glu Asp Gin Leu Gly Ala GAT GCT GAA GAT GAG TTG GGT GCA

Arg Val Gly Tyr Ile Glu Leu Asp

CGA GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT

Leu Asn Ser Gly Lys I le Leu Glu

CTC AAC AGC GGT AAG ATC CTT GAG

Ser phe Arg Pro Glu Glu Arg phe

AGT TTT CGC CCC GAA GAA CGT TTT

Pro Met Met Ser Thr phe Lys Val

CCA ATG ATG AGC ACT TTT AAA GTT

Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser

CTG CTA TGT GGC GCG GTA TTA TCC

Arg Val Asp Ala Gly Gin Glu Gin

CGT GTT GAC GCC GGG CAA GAG CAA

Leu Gly Arg Arg Ile His Tyr Ser

CTC GGT CGC CGC ATA CAC TAT TCT

Gin Asn Asp Ile Val Glu Ser Ala

CAG AAT GAC TTG GTT GAG TCG GCT

Lys Arg Asn Ser Asp Ser Glu Cys

AAA CGG AAT AGC GAT TCT GAG TGC

Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys

CCA CTG TCT CAC GAT GGC TAT TGT

Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr

CTG CAC GAC GGT GTT TGC ATG TAC

Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala

ATC GAA GCT TTG GAT AAA TAC GCG

Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr Ile

TGT AAC TGT GTA GTG GGT TAT ATC

25 670 654

Gly Glu Arg Cys Gin Tyr Arg Asp GGT GAA CGC TGT CAA TAC CGT GAT

Leu Lys Trp Trp Glu Leu Arg (stop) CTG AAA TGG TGG GAA TTG CGT TAA

TAGTGAAGATCTGGATCCGTTTAGCCGACTCAC

CAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGAT

Die für die fusionierten Proteine in den Plasmiden pUG2101, pUG2301 und pUG2701 codierende Nukleotidsequenz wurde nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren analysiert.

Die Photographie 5 zeigt die Resultate der Analyse. Die Bahnen 1 bis 4 zeigen das mit dem Mlul-Pstl Fragment (224 Basenpaare) von pUG2101 erreichte Resultat, die Bahnen 5 bis 8 das mit dem MluI-EcoRI Fragment (721 Basenpaare) von pUG2101, die Bahnen 9 bis 12 das mit dem Mlul-BamHI Fragment (452 Basenpaare) von pUG2301, die Bahnen 13 bis 16 das mit dem Mlul-Pstl Fragment (335 Basenpaare) von pUG2701 und die Bahnen 17 bis 20 das mit dem MluI-EcoRI Fragment (610 Basenpaare) von pUG2701 erreichte Resultat. Die Bahnen 1, 5, 9,13 und 17 zeigen die Reaktionsprodukte für Guanin, die Bahnen 2,6,10, 14 und 18 die Reaktionsprodukte für Guanin+Adenin, die Bahnen 3, 7,11,15 und 19 die Reaktionsprodukte für Thymin + Cytosin, und die Bahnen 4, 8, 12, 16 und 20 die Reaktionsprodukte für Cytosin. Der mit «}» markierte Teil ist ein Adapter.

8-5) System zum Ausdrücken des fusionierten Proteins von durch Lys-Arg gekuppelten ß-Lactamase und ß-Urogastron

8-5-a) Bildung von pUGl 102 und pUGl 105

Ein ß-Urogastron-Gen wurde in das ß-Lactamase-Gen von pBR322 an dessen einziger Restriktionsenzym-Erken-nungsstelle für Pvul inseriert, um Vektoren zum Ausdrücken des fusionierten Proteins von ß-Lactamase und ß-Uroga-stron zu ergeben, wie in Fig. 15 dargestellt.

Das Plasmid pBR322 wurde durch Wirkung von Pvul bei 37 °C während 3 Stunden gespalten. Einige der Plasmide wurden durch Elektrophorese mit einem 1 Gew.-%igen Agarose-Gel untersucht, um zu bestätigen, dass sie vollständig gespalten worden waren. Die Adaptoren D-l-3 und D-3-2 wurde bei 12 °C während 15 Stunden mit dem Fragment gekuppelt und das gekuppelte Produkt wurde dann der Elektrophorese mit einem 1 Gew.-%igen Agarose-Gel unterworfen, um ein DNA-Fragment zu isolieren. Anschliessend wurden das ß-Urogastron-Fragment und der Vektor miteinander in einem Molarverhältnis von etwa 5 : 1 gemischt und bei 12 °C während 15 Stunden gekuppelt. Nach der Kupplung wurde der Stamm HB 101 mit dem resultierenden Plasmid transformiert und die Kolonien in bezug auf TcR selektiert.

71 der mit TcR transformierten Kolonien wurden erhalten und auf ihre Aps-Empfindlichkeit untersucht. Plasmid-DNA wurde aus 20 Aps-Kolonien (28,2%) hergestellt und dann auf das Vorhandensein einer Restriktionsenzym-Erkennungsstelle für Mlul untersucht, um die Insertion des ß-Urogastron-Gens zu bestätigen. Es wurde gefunden, dass

5 der 20 Plasmide eine Spaltstelle des ß-Urogastron-Gens für 20 Mlul aufwiesen. Das DNA wurde durch Hinfl gespalten und dann einer Elektrophorese mit einem 1,5 Gew.-%igen Agarose-Gel unterzogen, um die Orientierung der Insertion des ß-Urogastron-Gens zu untersuchen. Zwei der Plasmide, nämlich pUGl 102 und pUGl 105, wiesen Gene in der richti-25 gen Orientierung auf.

8-5-b) Bildung von pUG1004, pUG1201 und pUG1301 Die Verfahrensweise nach 8-5-a) wurde unter Verwendung von Pstl, HincII und XmnI anstelle von Pvul wieder-30 holt, um pUG1004, pUG1201 und pUG1301 zu ergeben, wie in Fig. 16, 17 und 18 dargestellt wird.

9) Bestätigung des Ausdrückens von ß-Urogastron Die so gebildeten Ausdrucksplasmide wurden verwendet, 35 um Escherichia Coli HB 101 oder ECI-2 zu transformieren, und die Zellen wurden nach dem folgenden Verfahren kultiviert, anschliessend extrahiert und einem Radioimmunoas-say unterzogen, um das Ausdrücken zu bestätigen.

40 9-1) Kultivierung von mit einem ß-Urogastron-Gen versehenen rekombinanten Mikroorganismen und Extraktion des Proteins

9-1-a) Ausdruckssystem unter Verwendung vom 45 Promotor XPL

Der das Ausdrucksplasmid pUG103-E beherbergende Stamm ECI-2 und derselbe das Ausdrucksplasmid pUGl 17-E beherbergende Stamm wurden jeweils in zwei Kolben, die je 1 Liter von LB-Kulturmedium enthielten, bei 25 °C kulti-50 viert. Als die Kultur in einem der Kolben eine Absorption von 0,3 bei 660 nm aufwies, wurde die Kultur einer Wärmeinduktion bei 42 °C während 1 Stunde unterzogen. Die im anderen Kolben befindliche Kultur wurde kontinuierlich der Inkubation bei 25 °C unterzogen, bis die Absorption 0,4 betrug. Die Zellen jedes Kolbens wurden gesammelt, mit einem PBS-Puffer (137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 8,1 mM Natriumdiphosphat und 1,5 mM Natriummonophosphat, pH 7,0) gewaschen, dann in einer Menge des PBS-Puffers, die 3 Vol.-% der Originalmenge der Kultur 60 entsprach, wieder suspendiert und schliesslich unter Eiskühlung durch Beschallung mit einem Schallgerät Typ 5202 (ein Produkt der Ohtake Works Co., Ltd., JP) zerstört (dreimal während 30 Sekunden bei 100 W). Der von den Zellentrümmern durch Ultrazentrifugation (bei 40 000 g während 1 65 Stunde) getrennte Überstand wurde gegenüber einer wässrigen 0,01-N-Lösung von Essigsäure dialysiert und das Dialy-sat wurde lyophilisiert und dann einem Radioimmunoassay (RIA) unterzogen.

670 654

26

9-1-b) System zum Ausdrücken des fusionierten Proteins

Ein die Plasmide pUG1004, pUG1301, pUG2101, pUG2303 oder pUG2703 beherbergender Stamm Escherichia Coli HB101 wurde in einem 50 |xg/ml Tetracyclin enthaltenden Kulturmedium bei 37 °C der Inkubation unterzogen, dann im Volumenverhältnis 1 : 100 mit dem gleichen Medium verdünnt und kultiviert, bis er eine Absorption von 0,4 bei 660 nm aufwies. Die Zellen wurden gesammelt, mit PBS-Puffer gewaschen, dann in einer Menge des PBS-Puffers, die 3 Vol.-% der Originalmenge der Kultur entsprach, wieder suspendiert und schliesslich unter Eiskühlung durch Beschallung mit demselben Schallgerät zerstört (dreimal während 30 Sekunden bei 100 W). Der von den Zellentrümmern durch Ultrazentrifugation (bei 40 000 g während 1 Stunde) getrennte Überstand wurde gegenüber einer wässrigen 0,01-N-Lösung von Essigsäure dialysiert, lyophilisiert und dann einem Radioimmunoassay unterzogen.

Um die Ansammlung von fusionierten! Protein im Peri-plasm zu bestätigen, wurde eine periplasmische Fraktion nach dem Verfahren von S. J. Chan et al hergestellt (Chan, S. J. et al., Proc. Nati. Acad. Sei., USA, 78, 5401 - 5405 (1981)). Ein Teü der Kultur wurde im Volumenverhältnis 1 :100 mit einem frischen E-Kulturmedium (1 Liter wässri-ger Lösung von 10 g Kaliumdiphosphat, 3,5 g Natriumam-moniumhydrogenphosphat, 0,2 g Magnesiumsulfat-Hepta-hydrat, 2 g Citronensäure, 2 g Glucose, 0,23 g L-Prolin, 39,5 g L-Leucin, 16,85 mg Thiamin und 20 mg Tetracyclin-Hydrochlorid) verdünnt und dann bei 37 °C kultiviert, bis eine Absorption von 0,4 bei 660 nm erreicht wurde. Die Zellen wurden gesammelt (6000 Umdrehungen pro Minute, 10 Minuten) und zweimal mit einer Mischung von 10 mM TRIS-HC1 (pH 8,0) und 30 mM Natriumchlorid gewaschen. Die Zellen (1 g) wurden wieder in 80 ml von 20 Gew.-%igem Sucrose mit 30 mM TRIS-HC1 (pH 8,0) suspendiert, worauf EDTA der Suspension bis zu einer Konzentration von 1 mM beigegeben wurde. Die Mischung wurde in einem Rotationsschüttler bei 180 Umdrehungen pro Minute während 10 Minuten (24 °C) geschüttelt und dann zentrifugiert (13 000 g, 10 Minuten), um die Zellen zu sammeln, die dann in 80 ml destilliertes Wasser wieder suspendiert wurden. Die Suspension wurde im Eis während 10 Minuten unter gelegentlicher Rührung stehengelassen und dann zentrifugiert (13 000 g, 10 Minuten). Der Überstand wurde als periplasmische Fraktion (O-Sup) gesammelt. Die Pastille wurde in einer Mischung von 10 mM TRIS-HC1 (pH 8,0) und 30 mM Natriumchlorid suspendiert und mit demselben Schallgerät wie im vorangehenden behandelt, um eine cytoplasmische Fraktion (O-Ppt) zu ergeben. Diese Proben wurden dem Radioimmunoassay unterzogen.

9-2) Radioimmunoassay

9-2-a) Durchführung des Radioimmunoassays

Kaninchen wurden mit gereinigtem humanem ß-Urogastron als Antigen immunisiert, um Antiserum zu ergeben. Das ß-Urogastron (300 [ig) wurde in 0,2 ml destilliertes Wasser gelöst, der Lösung wurde 1,5 ml einer 50-%igen Lösung von Polyvinylpyrrolidon beigegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 2 Stunden gerührt. Der Mischung wurde kompletter Freundsche Zusatz (2,0 ml) beigegeben, um eine Emulsion zu ergeben, die drei Kaninchen in ihrem Brustteil subkutan injiziert wurde. Nach Wiederholung der Immunisierung viermal pro Woche jede zweite Woche wurden ausserdem 50 (ig des Antigens intravenös injiziert, das Vollblut wurde 3 Tage später gesammelt und das Serum abgeschieden.

Dann wurden im Hinblick auf die Titrationskennlinie zur Bestimmung des Verdünnungsgrades des Antiserums für den Assay, auf die Inkubationsdauer zur Optimierung der Assay-Bedingungen, auf das Verfahren zur Trennung des gebundenen radiomarkierten Antigens vom freien radiomarkierten Antigen usw. die nachfolgenden Bedingungen für das s Radioimmunoassay bestimmt.

Die verwendete Verdünnungslösung war ein Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,4), das 0,5 Gew.-% Rinderserum-Albumin, 140 mM Natriumchlorid und 25 mM Dinatrium-EDTA enthielt. Die Verdünnungslösung (400 |il) sowie io 100 (xl der Proben- oder Standard-Lösung von humanem ß-Urogastron und 100 |il des anti-humanen ß-Urogastron-Serums wurden gemischt. Nach einer Inkubation der Mischung bei 4 °C während 24 Stunden wurden der Mischung 100 jj.1 von mit 125I markierter humaner ß-Urogastron-15 Lösung (etwa 5000 Impulse pro Minute = cpm) beigegeben. Nach einer weiteren Inkubation der Mischung bei 4 °C während 48 Stunden wurden der resultierenden Mischung 100 jj.1 eines zweiten Antikörpers (Anti-Kaninchen-y-Globulin-Ziegenserum in 20-facher Verdünnung mit PBS-Puffer), 20 100 (il normalen Kaninchenserums (in 200-facher Verdünnung mit PBS-Puffer) und 900 nl von 5 Gew.-% Polyethy-lenglykol enthaltendem 10 mM PBS-Puffer beigegeben und dann wurde die Inkubation 4 °C während 3 Stunden weitergeführt. Die Kultur wurde während 30 Minuten bei 3000 25 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, der Überstand abgeschieden und der Niederschlag gezählt. Der Gehalt der Probe an immunoreaktiver Substanz als humanes ß-Urogastron wurde aus der Standardkennlinie unter Verwendung von humanem Standard-ß-Urogastron bestimmt.

30

9-2-b) Bestätigung der ß-Urogastron-Produktivität des rekombinanten Mikroorganismus

Tabelle 5 zeigt das Resultat des auf das Ausdruckssystem durchgeführten Radioimmunoassays unter Verwendung 35 vom Promotor XPl.

Tabelle 5

Ausdrucksplasmid

40

W ärmeinduktion

Menge produzierten ß-Urogastrons (ng/1 Kultur)

pUG103-E

Ja

450,2

pUG103-E

Nein

3,2

pUGU7-E

Ja

388,4

« pUG117-E

Nein

3,2

Vergleich

(pBR322)

Ja nicht feststellbar

50

Tabelle 6 zeigt das Resultat des auf das Ausdruckssystem des fusionierten Proteins durchgeführten Radioimmunoassays.

55 Tabelle 6

Ausdrucksplasmid

Menge produzierten ß-Urogastrons (Hg/1 Kultur)

60 pUG1004 pUG1301 pUG2101 pUG2301 pUG2701

729.6

650.7 31,3

125,2 119,2

65

Tabelle 7 zeigt die Lokalisation des ausgedrückten fusionierten Proteins.

27

670 654

Tabelle 7

Ausdrucksplasmid Menge produzierten ß-Urogastrons (Hg/1 Kultur)

Periplasmische Cytoplasmische

Fraktion (O-Sup) Fraktion (O-Ppt)

pUG1004 326,0 4,0

pUG1301 347,4 2,8

pUG2101 79,9 10,2

pUG2301 118,8 4,1

pUG2701 65,7 3,6

Die Tabellen 5 und 6 zeigen, dass das System zum direkten Ausdrücken von ß-Urogastron mit dem Promotor A.Pl und das System zum Ausdrücken der Verbindung als fusioniertes Protein beide eine ß-Urogastron-Immunoreaktivität in Escherichia Coli ausdrückten. Tabelle 7 zeigt, dass im Falls le vom fusionierten Protein die ausgedrückte ß-Urogastron-Immunoreaktivität nahezu vollständig im Periplasma lokalisiert ist.

30

35

40

45

50

55

60

S

10 Blatt Zeichnungen

Claims

670 654

2

PATENTANSPRÜCHE 1. ß-Urogastron-Gen mit der folgenden Nukleotidsequenz:

A

\

T

A

G

C

G

A

T

T

C

T

G

A

G

T

G

r
C.

C

K

r

T

r

T

T

A

T

C

G

C

T

A

A

G

A

C

T

C

A

C

G

G

G

T

G

A

C

T

C

T

C

A

C

G

A

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C

A-

G

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C

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C

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C

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C

T

A

G

A

C

T

T

T

T

G

G

T

G

G

G

A

A

T

T

G

C

G

T

3'

f

A

C

C

A

C

C

C

T

T

T

T

C

G

C

A

5'

1
2. Gen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine jeweils am vorderen und/oder hinteren Ende der Nucleotidse-quenz gemäss Anspruch 1 angeordnete Restriktionsenzym-Erkennungsstelle.
3. Gen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch aufwärts von der Nucleotidsequenz gemäss Anspruch 1 angeordnete Restriktionsenzym-Erkennungsstelle und Start-Codon und/

5'

3 '

oder abwärts von der Nucleotidsequenz angeordnete Stop-Codon und Restriktionsenzym-Erkennungsstelle, wobei die Codons und die Erkennungsstellen in der vorgenannten Rei-30 henfolge angeordnet sind.
4. Gen nach Anspruch 3 mit der folgenden Nukleotidsequenz:

5 -1,1

A A T T C G A A G A T C T G C A T G A A T A G C GC TTC TAG A C G TAC TT A T C G

20 T G C A C G

C C A G G T

CTG G A C

30 T C T A G A

C A C G T G

T G T A C A

CTG G A C

50 C A C G T G

G A C CTG

G G T C C A

60 GTT C A A

T G C A C G

A T G TAC

TAC A T G

70 A T C TAG

G A A C T T

G C T C G A

80 T T G A A C

10

GAT T C T GAG C T A AGA C T C

40

GAT G G C TAT C T A C C G ATA

90 100

GAT A A A TAC G C G T G T A AC T G T G T A C T A T T T A T G CGC A CA T T G AC A CAT

110 120

G T G G G T TAT A T C G G T G A A CGC T G T CAC C C A ATA TAG CCA C T T G C G ACA

130 140 150

C A A TAC C G T GAT CTG A A A T G G T G G GTT A T G G C A C T A GAC T T T ACC ACC

3

670 654

160 170

GAA T T G C G T TA A TAG TG A C T T A AC G C A ATT A T C ACT

A G A T C T

T C T AGA

G 3'

C C T A G 5'
5. Gen als Untereinheit für ein ß-Urogastron-Gen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es etwa die vordere Hälfte der im Anspruch 1 definierten Nukleotidsequenz aufweist.
6. Gen nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass

A

A

T

T

C G

A

A

G

G C

T

T

C

G

A

T

T

C T

G

A

G

C

T

A

A

G A

C

T

C

G

A

T

G

G C

T

A

T

C

T

A

C

C G

A

T

A

G

T

T

T

G C

A

T

G

C

A

A

A

C G

T

A

C

3 '

C

T

A

G

5'
8. Gen als Untereinheit für ein ß-Urogastron-Gen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es etwa die hintere Hälfte der im Anspruch 1 definierten Nukleotidsequenz aufweist.
9. Gen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass

10

es an seinem hinteren Ende eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle aufweist.
7. Gen nach Anspruch 6 mit der folgenden Nukleotidsequenz:

15

T

G

C

A

T

G

A

A

T

A

G

C

A

C

G

T

A

C

T

T

A

T

C

G

C

C

A

C

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G

T

C

T

C

A

C

G

G

T

G

A

C

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G

A

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G

C

T

G

C

A

C

G

A

C

G

G

T

G

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C

G

T

G

C

T

G

C

C

A

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T

C

G

A

A

G

C

T

T

C

G

T

A

G

C

T

T

C

G

A

A

G

C

es an seinem vorderen Ende eine Restriktionsenzym-Erken-35 nungsstelle aufweist.
10. Gen nach Anspruch 9 mit der folgenden Nukleotidsequenz:

A T C TAG

T G C A C G

T G T A C A

TAC A T G

G

A

T

C

T

A

G

T

G

C

A

C

C

A

A

G

T

T

G

A

A

C

T

T

G

C

C

T

A A A

T T T

G G T

C C A

TAC

A T G

T T G A A C

A G

TAC A T G

TAT ATA

C G T G C A

C G T G C A

3'

5'

G C G CGC

A T C TAG

GAT C T A

T A A ATT

T G T

A C A

G G T

C C A

CTG

G A C

T A G

A T C

5 ' A 3 '

A A C

T T G

G A A

C T T

A A A

T T T

T G A ACT

G C T

TOT A C A

CGC G C G

T G G ACC

A G A T C T

T T G A A C

G T \ C A T

T G T A C A

T G G ACC

T C T AGA
11. Rekombinantes Plasmid, welches ein Gen nach Anspruch 4 aufweist.
12. Verfahren zur Herstellung des rekombinanten Plasmids nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch die Insertion des Gens nach Anspruch 7 und des Gens nach Anspruch 10 an einer Insertionsstelle eines Plasmidvektors.
13. Rekombinantes Plasmid mit einem ß-Urogastron-

Gen nach Anspruch 4 und ferner mit einem aufwärts von diesem Gen darin angeordnetem Promotor zur Kontrolle der Expression des Gens und mit einer mit dem Promotor 65 verbundenen Shine-Dalgarno-Sequenz.
14. Rekombinantes Plasmid mit der Sequenz der vierten und folgenden Basenpaare des ß-Urogastron-Gens nach Anspruch 4, nämlich

670 654

4

5' A A T A G C 3' T T A T C G

GAT C T A

T C T AGA

GAG C T C

T G C A C G

C C A G G T

CTG G A C

T C T A G A

C A C G T G

GAT C T A

G G C C C G

TAT A T A

T G T A C A

CTG G A C

C A C G T G

G A C CTG

G G T C C A

GTT C A A

T G C A C G

A T G TAC

TAC A T G

A T C TAG

G A A C T T

G C T C G A

T T G A A C

GAT C T A

A A A T T T

TAC A T G

G C G CGC

T G T A C A

A A C T T G

T G T A C A

G T A C A T

G T G C A C

G G T C C A

TAT ATA

A T C TAG

G G T C C A

G A A C T T

CGC G C G

T G T A C A

C A A GTT

TAC A T G

C G T G C A

GAT C T A

CTG G A C

A A A T T T

T G G ACC

T G G ACC

G A A C T T

T T G A A C

C G T G C A

T A A ATT

TAG A T C

T G A ACT

AGA T C T

T C T AGA

G C

CT AG

3' 5"

und mit darin aufwärts von diesem Gen angeordneter Kombination eines Promotors, einer Shine-Dalgarno-Sequenz und eines anderen Gens.
15. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte andere Gen ein ß-Lacta-mase-Gen ist.
16. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor 1PL oder lac UV5 ist.
17. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass der PlasmidVektor pBR322 ist.
18. Transformant, umfassend eine Wirtszelle mit einem rekombinanten Plasmid nach einem der Ansprüche 11,13 und 14.
19. Transformant nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Plasmid das rekombinante Plasmid nach Anspruch 13 ist.
20. Transformant nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das rekombinante Plasmid das rekombinante Plasmid nach Anspruch 14 ist.
21. Transformant nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet. dass die Wirtszelle Escherichia Coli ist.

45
22. Transformant nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirtszelle mit einem ein TcR-Gen und ein cI857-Gen aufweisenden rekombinanten Plasmid transformiert ist.

so 23. Verfahren zum Herstellen eines Transformanten nach Anspruch 18 durch Transformation einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Plasmid nach einem der Ansprüche 11, 13 und 14.
24. Verfahren zur Herstellung von ß-Urogastron, ge-55 kennzeichnet durch Kultivieren des Transformanten nach Anspruch 18 und Sammeln des ausgedrückten ß-Uroga-strons.

60