DE3523634C2 - - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist das in den Ansprüchen 1 bis 10 angegebene β-Urogastron-Gen, die entsprechenden Rekombinant-Plasmide nach den Ansprüchen 11 und 13 bis 17 sowie das Verfahren zu deren Herstellung und Anspruch 12, die entsprechenden Trans­ formanten nach den Ansprüchen 18 bis 22, deren Herstellung nach Anspruch 23 und die Herstellung von β-Urogastron nach Anspruch 24.

β-Urogastron ist ein Polypeptidhormon, das in den Speicheldrüsen, z. B. des Menschen, synthetisiert wird (siehe z. B. Heitz et al., Gut, 19, 408-413 (1978)). Seine Primär­ struktur umfaßt 53 Aminosäuren mit der folgenden Sequenz (siehe H. Gregory et al., Int. J. Peptide Protein Res., 9, 107-118 (1977)).

Für die Aminosäuren werden hier die folgenden Symbole ver­ wendet:

β-Urogastron ist physiologisch wirksam, z. B. unterdrückt es die Sekretion von Magensäure und es fördert Zellwachstum (siehe Elder et al., Gut, 16, 887-893 (1975)). Es ist daher bei der Behandlung von Ulcus und Wunden einsetzbar.

β-Urogastron wird in geringen Mengen im menschlichen Urin ausgeschieden. Deshalb wird die Verbindung zur Zeit durch Extraktion, Abtrennung und Reinigung aus Urin gewonnen. Dieses Verfahren ist jedoch aufwendig, weil große Mengen der Verbindung so nicht leicht gewonnen werden können, da die Verbindung nur in geringen Mengen im menschlichen Urin vor­ liegt.

Aus der Europäischen Offenlegungsschrift 00 46 039 ist es bekannt, mit Hilfe eines β-Urogastron-Gens Urogastron durch ein gentechnisches Verfahren herzustellen. Es ist zwar ein Gen mit einer bestimmten Nucleotid-Sequenz beschrieben, aber nicht offenbart, ob es andere Gene gibt, die nach einem ähnlichen Verfahren β-Urogastron exprimieren können, und es ist auch kein solches Gen mit einer bestimmten Nucleotid- Sequenz beschrieben.

Theoretisch kann eine große Anzahl von Nucleotid-Sequenzen für die Aminosäuresequenz von β-Urogastron codieren. Trotzdem ist es nicht sicher, welches dieser Gene β-Urogastron mit Hilfe eines gentechnischen Verfahrens exprimieren kann, oder welches Gen besonders geeignet für die Anwendung der gentechnischen Verfahren ist. Daher sind viele Versuche und erfinderische Anstrengungen notwendig, um die günstigste Nucleotid-Sequenz zu finden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues β-Urogastron-Gen zur Verfügung zu stellen, das in seiner Nucleotid-Sequenz vollkommen verschieden von dem in der Europäischen Offenlegungsschrift 00 46 039 beschriebenen Gen ist, und das mit Hilfe von gentechnischen Verfahren β-Urogastron exprimieren kann.

Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Gen zur Verfügung zu stellen, das für die Expression von β-Urogastron durch gentechnische Verfahren besonders geeignet ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, neue Rekombinant-Plasmide und Transformanten, entsprechend dem neuen β-Urogastron-Gen zur Verfügung zu stellen.

Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das mit Hilfe des neuen Gens unter Verwendung von gentechnischen Verfahren die Herstellung größerer Mengen von β-Urogastron mit hoher Reinheit ermöglicht.

Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlich.

Nach vielen Versuchen wurde das Gen I mit der folgenden Nucleotid-Sequenz gefunden, das die Ziele der Erfindung verwirklicht.

Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotid-Sequenz ausmachen. Die hier verwendeten Basensymbole sind die folgenden: A steht für Adenin, G für Guanin, C für Cytosin und T für Thymin.

Gen I ist hinsichtlich seiner DNA-Sequenz neu und nicht nahe­ liegend. Es wurde durch Bestimmung einzelner Nucleotid-Sequenzen einer großen Anzahl von möglichen Nucleotid-Sequenzen erhalten.

Gen I hat die folgenden Eigenschaften:

• (1) β-Urogastron kann unter Verwendung gentechnischer Verfahren sehr vorteilhaft exprimiert werden.
• (2) Die Codons des Gens I sind für die üblichen Wirtszellen verträglich, besonders für Escherichia coli (E. coli), so daß eine hohe Expressionsrate möglich ist.
• (3) Spezifische Restriktionsenzym-Erkennungsstellen können innerhalb des Gens und an beiden Enden zur Verfügung gestellt werden. Diese Stellen können nach Wunsch verändert werden, um die Verknüpfung mit anderen Genen und die Insertion in den Plasmidvektor zu erleichtern.
• (4) Zur Herstellung von Gen I können entsprechende Oligo­ nucleotid-Sequenzen zu Blöcken und die Blöcke leicht zu Untereinheiten verknüpft werden, die im wesentlichen frei von unerwünschten Verknüpfungen sind.
• (5) Nach Expression von β-Urogastron als Fusionprotein werden die nicht notwendigen Abschnitte entfernt, so daß man das gewünschte β-Urogastron erhält.

Wenn β-Urogastron unter Verwendung von Gen I exprimiert werden soll, können Restriktionsenzym-Erkennungsstellen im Hinblick auf die Verknüpfung mit dem Promotor, der Shine- Dalgarno-Sequenz (nachstehend als "SD-Sequenz" bezeichnet), dem Vektor und dergl., die für die Ex­ pression gebraucht werden, am Anfang und/oder Ende des Gens zur Verfügung gestellt werden. Darüber hinaus können, falls erforderlich, ein Startcodon und/oder ein Stopcodon stromaufwärts bzw. stromabwärts vom Gen zur Verfügung gestellt werden. Die Erkennungsstellen, das Startcodon und das Stopcodon sind nicht auf bestimmte Sequenzen beschränkt, aber es können bestimmte Sequenzen ganz gezielt eingesetzt werden.

Nachstehend ist ein Beispiel eines Gens mit einer verlängerten Sequenz (nachstehend als "Gen II" bezeichnet) beschrieben, das eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle und ein Startcodon stromaufwärts von Gen I und ein Stopcodon und eine Restriktions-Erkennungsstelle stromabwärts von Gen I enthält. Die Erkennungsstellen und Codons sind in der beschriebenen Reihenfolge angeordnet. Gen II schließt noch weitere Restriktions-Erkennungsstellen ein.

Gen II

Die Symbole für die Restriktionsenzyme in der vorstehenden Sequenz haben die folgende Bedeutung:

E:
EcoRI,
Bg:	BglII,
Mb:	MboII,
Ba:	BamHI,
Ml:	MluI,
Ta:	TaqI,
S:	Sau3AI,
Hf:	HinfI,
Hd:	HindIII,
Th:	ThaI

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf den Gen I und Gen II be­ schränkt, sondern schließt auch verwandte Gene ein, die in der Nucleotid-Sequenz im wesentlichen mit diesen identisch sind, und die für β-Urogastron codieren.

Bei der Synthese der Gene I oder II ist es zweckmäßig, die Gene I oder II in zwei Abschnitten, der vorderen und der hinteren Hälfte, zu kontruieren. Es ist z. B. möglich, eine Untereinheit aus der vorderen Hälfte der Nucleotid-Sequenz der Gene I oder II und eine andere Untereinheit aus der hinteren Hälfte der Nucleotid-Sequenz, die dabei etwa in der Mitte geschnitten wird, herzustellen, und diese zwei Untereinheiten der Gene I oder II zu den Genen I oder II zu verknüpfen. Die Untereinheit, die aus der vorderen Hälfte der Nucleotid-Sequenz des Gens II besteht, kann eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle am Ende besitzen, und eine andere Untereinheit, die aus der hinteren Hälfte der Nucleotid-Sequenz von Gen II besteht, kann eine Restriktionsenzym- Erkennungsstelle am Anfang besitzen. Diese Untereinheiten werden dann zum Gen II verknüpft.

Genauer ausgesrückt heißt das: die erste Untereinheit kann eine Untereinheit A sein, die aus der vorderen Hälfte von Gen II besteht und eine Restriktionsenzym (BamHI)-Erkennungs­ stelle an ihrem Ende besitzt. Die zweite Untereinheit kann eine Untereinheit B aus der hinteren Hälfte von Gen II sein, die eine Restriktionsenzym (HindIII)-Erkennungsstelle an ihrem Anfang besitzt. Diese Untereinheiten sind nachstehend gezeigt.

Untereinheit A Untereinheit B

Die Untereinheiten A und B werden beispielsweise in folgender Weise synthetisiert. Zunächst werden Oligonucleotide mit 11, 13 oder 15 Basen synthetisiert (A-1 bis A-16 und B-1 bis B-16, d. h. 332 Oligonucleotide). Als nächstes werden 4 bis 6 dieser Oligonucleotide zusammengebracht und zu Blöcken verknüpft (Block 1 bis Block 7, d. h. 7 Blöcke). Diese Oligonucleotide und Blöcke sind nachstehend gezeigt.

Dann werden die Blöcke 1 bis 3 zur Untereinheit A verknüpft und die Blöcke 4 bis 7 zur Untereinheit B.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend ausführlich unter Bezug auf die Zeichnungen und Fotos be­ schrieben.

Fig. 1 zeigt schematisch die Synthese eines Oligo­ nucleotids durch das Festphasenverfahren.

Fig. 2 zeigt ein Verfahren zur Verknüpfung der Oligo­ nucleotide A-1 bis A-16 zur Untereinheit A und zur Einführung der Untereinheit in das Plasmid pBR322 zur Gewinnung des Rekombinant- Plasmids pUG1.

Fig. 3 zeigt ein ähnliches Verfahren zur Herstellung des Rekombinant-Plasmids pUG2 durch Einführung der Untereinheit B in das Plasmid pBR322.

Fig. 4 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des Rekombinant- Plasmids pUG3 aus pUG1 und pUG2.

Fig. 5 zeigt das Ergebnis der Nucleotidsequenzanalyse von Oligonucleotid A-3 durch zweidimensionale Fraktionierung, bestehend aus Elektrophorese und Homochromatographie.

Fig. 6 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des Rekombinant- Plasmids pGH37.

Fig. 7 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des Rekombinant- Plasmids pGH35.

Fig. 8 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des Rekombinant- Plasmids pEK28.

Fig. 9 zeigt Verfahren zur Herstellung der Rekombinant- Plasmide pUG102 bis pUG122 und der Rekombinant-Plasmide pUG103-E und pUG117-E.

Fig. 10 zeigt Verfahren zur Herstellung der Rekombinant-Plasmide pBRH02 und pBRH03.

Fig. 11 zeigt die MboII-Restriktionskarte von pUg3 einschließlich des H-Fragments (179 Bp), das das β-Urogastron-Gen enthält.

Fig. 12 zeigt ein Verfahren zur Herstellung der Rekombinant-Plasmide pUG2301 bis pUG2303.

Fig. 13 zeigt ein Verfahren zur Herstellung der Rekombinant-Plasmide pUG2101 bis pUG2105.

Fig. 14 zeigt ein Verfahren zur Herstellung der Rekombinant-Plasmide pUG2701 bis pUG2703.

Fig. 15 zeigt ein Verfahren zur Herstellung der Rekombinant-Plasmide pUG1102 und pUG1105.

Fig. 16 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des Rekombinant-Plasmids pUG1004.

Fig. 17 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des Rekombinant-Plasmids pUG1201.

Fig. 18 zeigt ein Verfahren zur Herstellung des Rekombinant-Plasmids pUG1301.

Die Fig. 19 bis 23 zeigen Analyseergebnisse der Nucleotidsequenzen von Rekombinant-Plasmiden, die z. B. nach Maxam und Gilbert erhalten wurden.

Die Verfahren zur Konstruktion des erfindungsgemäßen Gens II sind bekannt. Die Oligonucleotide zur Herstellung von Gen II können durch bekannte Verfahren hergestellt werden, z. B. durch das nachstehend kurz beschriebene Festphasenverfahren (siehe z. B. H. Ito et al., Nucleic Acids Research, 10, 1755-1769 (1982)).

Beim Festphasenverfahren werden die Oligonucleotide, wie in Fig. 1 gezeigt, durch aufeinanderfolgende Kupplung von Mononucleotiden oder Dinucleotiden an ein an Polystyrolharz gebundenes Nucleosid synthetisiert, wobei eine festgelegte Nucleotidsequenz entsteht.

Das Nucleosidträgerharz kann z. B. unter Verwendung eines teilweise quervernetzten Polystyrolharzes durch Umsetzen mit N-(Chlormethyl)-phthalimid hergestellt werden. Das Produkt ergibt mit Hydrazin ein aminomethyliertes Poly­ styrolharz, an dessen Aminogruppe ein Nucleosid mit einer freien 5′-Hydroxylgruppe und einer geschützten Aminogruppe, unter Verwendung von Bernsteinsäure als Arm, gebunden wird.

Zur Herstellung von Mononucletiden oder Dinucleotiden sind verschiedene Verfahren bekannt (siehe z. B. C. Broka et al., Nucleic Acids Research, 8, 5461-5471 (1980)). Ein Mononucleotid kann z. B. durch Umsetzen von o-chlorphenyl­ phosphodichloridat, Triazol und einem Nucleosid mit einer mit einer Dimethoxytritylgruppe (DMTr) geschützten 5′-Hydroxylgruppe in Gegenwart von Triäthylamin hergestellt werden. Das Monotriazolid wird mit β-Cyanoäthanol in Gegenwart von 1-Methylimidazol als Katalysator umgesetzt und das Reaktionsprodukt an einer Kieselgelsäule, mit choroform- Methanol als Elutionsmittel, gereinigt. Dieses Verfahren ergibt ein vollständig geschütztes Mononucleotid.

Ein Dinucleotid kann durch Behandlung des vorstehend erhaltenen vollständig geschützten Mononucleotids mit Benzol­ sulfonsäure oder einer ähnlichen Säure hergestellt werden, wobei zunächst das Mononucleotid mit der freien 5′-Hydroxylgruppe entsteht. Dieses wird mit dem vorstehend erhaltenen Monotriazolid umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wird an einer Kieselgelsäule, mit Chloroform-Methanol als Elutionsmittel, gereinigt. Dieses Verfahren ergibt ein vollständig geschütztes Dinucleotid.

Die Festphasensynthese von Oligonucleotiden wird zweckmäßig mit Hilfe eines DNA-Synthesizers durchgeführt. Das vorstehend erhaltene Nucleosidträgerharz wird in ein Reaktionsgefäß ge­ geben und mit Dichlormethan-Isopropanol gewaschen. Dann wird eine Lösung von Zinkbromid in Dichlormethan-Isopropanol zum Harz zugegeben, um die Dimethoxytritylgruppe in der 5′-Stellung zu entfernen. Dieses Verfahren wird mehrmals wiederholt, bis die Lösung farblos ist. Das Harz wird zunächst mit Dichlormethan-Isopropanol und dann mit einer Lösung von Triäthylammoniumacetat in Dimethylformamid gewaschen, um noch vorhandene Zinkionen zu entfernen. Danach wird das Produkt mit Tetrahydrofuran gewaschen und einige Minuten im Stickstoffstrom getrocknet.

Das vollständig geschützte Dinucleotid oder Mononucleotid wird in Pyridin gelöst und mit Triäthylamin versetzt. Die erhaltene Lösung wird geschüttelt, mehrere Stunden bei Raum­ temperatur stehengelassen und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene Triäthylammoniumsalz wird in Pyridin gelöst und zum Trocknen mehrmals mit Pyridin azeotrop eingedampft. Das Nucleotidsalz wird in einer Lösung von Mesitylensulfonyl-5-nitrotriazol (MSNT, Kondensations­ reagens) in Pyridin gelöst. Die erhaltene Lösung wird zu dem getrockneten Harz gegeben und bei Raumtemperatur stehengelassen. Der Überstand des Reaktionsgemischs wird entfernt, das Harz mit Pyridin gewaschen und dann in Tetrahydrofuran- Pyridin mit Essigsäureanhydrid unter Verwendung von Dimethyl­ aminopyridin als Katalysator umgesetzt, um die nicht umgesetzte Hydroxylgruppe zu schützen. Schließlich wird das Harz zur Vervollständigung eines Festphasensynthese-Zyklus mit Pyridin gewaschen. Ein Zyklus verlängert die Nucleotid- Sequenz um eine oder zwei Kettenlängen. Das vorstehend be­ schriebene Verfahren wird wiederholt, um nach und nach bis zur gewünschten Länge Mononucleotide oder Dinucleotide an das Harz zu kuppeln. Auf diese Art und Weise wird ein vollständig geschütztes Oligonucleotid, gebunden an das Harz, erhalten.

Eine Lösung von Tetramethylguanidin-2-pyridinaldoximat in Pyridin-Wasser wird zu dem Harz gegeben und das Gemisch unter Erwärmen stehengelassen. Das Harz wird dann abfiltriert und abwechselnd mit Pyridin und Äthanol gewaschen. Die Waschlösung und die Filtrate werden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert. Das Konzentrat wird in einer wäßrigen Lösung von Triäthylammoniumbicarbonat (TEAB) gelöst und anschließend mit Äther gewaschen. Die wäßrige Lösung wird an einer Sephadex G-50-Säule, mit einer TEAB-Lösung als Elutionsmittel, chromatographiert. Die Fraktionen werden gesammelt und die organische Dichte jeder Fraktion bei 260 nm wird gemessen. Die Fraktion, die das erste Eluat­ maximum enthält, wird konzentriert. Das Konzentrat wird z. B. durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie gereinigt, bis man ein einziges Maximum erhält. Bei dem so erhaltenen Oligonucleotid ist das 5′-Ende immer noch durch eine Dimethoxytritylgruppe geschützt. Daher wird das Produkt zur Entfernung der Schutzgruppe mit einer wäßrigen Lösung von Essigsäure behandelt, wiederum gefolgt von einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie oder ähnlichem, bis ein einziges Maximum erhalten wird.

Die gewünschten Oligonucleotide werden durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt und dann einzeln auf ihre Nucleotidsequenz durch zweidimensionale Fraktionierung, nämlich Elektrophorese und Hochchromatographie, und (oder) nach Maxam-Gilbert geprüft. Anschließend werden sie zur Herstellung der Blöcke und Unterein­ heiten eingesetzt.

Die zweidimensionale Fraktionierung zur Prüfung der Nucleotid­ sequenz kann nach Verfahren von Wu et al., (E. Jay, R. A. Bambara, R. Padmanabhan und R. Wu, Nucleic Acids Res., 1, 331 (1974)) durchgeführt werden. Die lyophilisierten Oligonucleotide werden in destilliertem Wasser in einer Konzentration von etwa 0,1 µg/µl gelöst. Ein Teil dieser Lösung wird zur Markierung des 5′-Endes mit ³²P mit γ-³²P-ATP und T₄ Polynucleotidkinase behandelt und dann mit Schlangengift-Phosphodiesterase partiell verdaut. Das Produkt wird auf eine Celluloseacetatfolie aufgebracht und in der ersten Dimension im elektrischen Feld getrennt, wobei die Trennung nach dem Unterschied in den Basen erfolgt. Nach der Elektrophorese werden deren Produkte auf eine Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose)-Platte gegeben und in der zweiten Dimension unter Verwendung einer Lösung von teilweise hydrolysierter RNA (Homogemisch) getrennt. Dieses Verfahren wird Homochromatographie genannt. Dabei werden die Oligonucleotide nach ihrer Kettenlänge getrennt. Danach kann die Nucleotidsequenz des Oligonucleotids mit Hilfe der Autoradiographie gelesen werden, wobei am 5′-Ende begonnen wird.

Wenn die Prüfung der Sequenz mit diesem Verfahren schwierig ist, kann auch das Maxam-Gilbert-Verfahren benutzt werden (A. M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560 (1977); A. M. Maxam und W. Gilbert, Methods in Enzymol., Bd. 65, S. 499, Academic Press 1980).

Das Verfahren, das auch als chemisches Abbauverfahren bezeichnet wird, benutzt eine für eine bestimmte Base spezifische Reaktion, um das Oligonucleotid an der Position der Base zu spalten. Die Banden, die bei einer anschließenden Elektrophorese erhalten werden, dienen zum Ablesen der Sequenz vom 5′- oder vom 3′-Ende her. Die basenspezifischen Reaktionen sind die folgenden. Guanin wird spezifisch durch Dimethylsulfat methyliert. In Gegenwart einer Säure werden Guanin und Adenin depuriniert. Thymin und Cytosin reagieren beide mit Hydrazin bei einer niedrigen Salzkonzentration, aber nur Cytosin reagiert auch bei einer hohen Salzkonzentration mit Hydrazin. Nach der vollständigen Reaktion der vier Basen, wird jedes Reaktionsgemisch mit Piperidin versetzt, um ringgeöffnete Basen abzuspalten und um die β-Eliminierung beider Phosphate von der Desoxyribose zu katalysieren. Schließlich wird der DNA-Stang bei dieser Base gepalten.

Die erhaltenen Reaktionsmischungen werden elektrophoretisch auf einem Polyacrylamid-Gel getrennt, um die Nucleotidsequenzen festzustellen, die durch die einzelnen Reaktionen entstanden sind.

Als nächstes werden die Oligonucleotide unter Verwendung einer T₄ DNA-Ligase, wie in Fig. 2 gezeigt, verknüpft. Zur richtigen Verknüpfung werden die zur Untereinheit A gehörenden 16 Oligonucleotide A-1 bis A-16 in drei Ab­ schnitten verknüpft, d. h. Block 1 bestehend aus A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 und A-16, Block 2 bestehend aus A-4, A-5, A-6, A-11, A-12 und A-13, und Block 3 bestehend aus A-7, A-8, A-9 und A-10, wie in Fig. 2 gezeigt. Durch Elektrophorese werden die Blöcke 1 bis 3 mit den richtigen Sequenzen erhalten und weiter zur Untereinheit A verknüpft.

Im einzelnen werden einige der 5′-Enden der 16 Oligonucleotide A-1 bis A-16 mit Hilfe von γ-³²P-ATP und T₄ Polynucleotidkinase mit ³²P markiert und und die Hydroxylgruppen der verbleibenden 5′-Enden mit ATP phosphoryliert. Zur Bildung der drei Blöcke werden die Oligonucleotide zusammen­ gebracht und mit Hilfe der T₄ DNA-Ligase verknüpft. Das Produkt wird auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und der gewünschte Block isoliert. Die so erhaltenen drei Blöcke werden mit Hilfe der T₄ DNA-Ligase zur Untereinheit A verknüpft. Zwar kann in der Verknüpfungsreaktion eine dimere Struktur entstehen, aber diese kann leicht mit Hilfe der Restriktionsenzyme EcoRI und BamHI zur Untereinheit A gespalten werden. Anschließend wird, wie in Fig. 2 dargestellt, ein üblicher Plasmidvektor, pBR322, mit EcoRI und BamHI gespalten und die Untereinheit A wird in den Vektor eingeführt, wobei das Rekombinant-Plasmid pUG 1 erhalten wird.

Nach dem gleichen Verfahren wird auch die Untereinheit B hergestellt. Wie im Fall der Untereinheit A werden die 16 Oligonucleotide B-1 bis B-16 in vier Abschnitten, wie in Fig. 3 gezeigt, verknüpft und die Blöcke werden zur Untereinheit B verknüpft. Falls ein Dimer entsteht, wird es durch die Restriktionsenzyme HindIII und BamHI zur Untereinheit B gespalten. Ein Plasmidvektor, pBR322, wird mit HindIII und BamHI gespalten und die Untereinheit B in den Vektor eingeführt, wobei das Rekombinant-Plasmid pUG2, wie in Fig. 3 dargestellt ist, erhalten wird.

Daraufhin wird, wie in Fig. 4 gezeigt, pUG1 mit den Restriktions­ enzymen HindIII und SalI gespalten und ein aus pUG2 mit Hilfe der gleichen Restriktionsenzyme herausge­ schnittenes Fragment in pUG1 eingeführt, wobei das Rekombinant- Plasmid pUG3 mit dem β-Urogastron-Strukturgen (Gen II) entsteht.

pUg1, pUG2 und pUG3 sind Rekombinant-Plasmide, die jeweils pBR322 und die Untereinheit A, nämlich die vordere Hälfte des β-Urogastron-Strukturgens, die Untereinheit B, nämlich die hintere Hälfte des Gens, oder das gesamte Strukturgen enthalten. Diese Rekombinant-Plasmide können in großen Mengen durch Einführung in einen üblichen Wirt, z. B. E. coli, wie E.-coli-Stamm HB101, der bekannt und leicht zugänglich ist, mit Hilfe der Calciummethode als Transformationsmethode, hergestellt werden (E. Lederberg und S. Cohen, J. Baceriol., 119, 1072 (1974)).

Ob pUG1, pUG2 und pUG3 im Wirt, wie dem E.-coli-Stamm HB191 vorhanden sind, kann mit Hilfe der folgenden Verfahren geprüft werden. Nach der Gewinnung der Plasmide nach dem Alkaliextraktionsverfahren, werden pUG1 und pUG2 auf die Anwesenheit der BglII-Erkennungsstelle, die nicht auf dem Vektor pBR322 vorhanden ist, geprüft. In ähnlicher Weise wird geprüft, ob pUG2 und pUG3 durch MluI, dessen Er­ kennungsstelle nicht auf pBR322 vorhanden ist, gespalten werden können.

Gemäß dem Alkaliextraktionsverfahren, wird E.-coli, das das Plasmid enthält, inkubiert. Die Zellen werden geerntet und mit Lysozym versetzt, um die Zellwand aufzulösen. Ein Gemisch von Natronlauge und Natriumlaurylsulfat wird zur Zerstörung der Zellen und zur Denaturierung der DNA einge­ setzt, die dann wieder mit Natriumacetatpuffer neutralisiert wird. Die chromosomale DNA bleibt dabei denaturiert, während das Plasmid als extrachromosomale DNA seine anfängliche Doppelstrangform behält. Die Plasmide werden aufgrund dieser Eigenschaften gewonnen. Die Plasmide werden zur Reinigung einer Dichtegradienten-Ultrazentrifugation mit Cäsium­ chlorid und Ethidiumbromid unterworfen und dann zur Ent­ fernung der RNA über eine Biogel A 50 m Säule gegeben. So können Plasmide mit hoher Reinheit und in großen Mengen erhalten werden. Auf diese Weise kann auch das erfindungs­ gemäße β-Urogastron-Gen (Gen II) erhalten werden.

Als nächstes wird das Verfahren zur Einführung des β-Urogastron- Gens in die Wirtszellen beschrieben.

Es gibt für die Erfindung keine Einschränkung hinsichtlich der zu verwendenden Wirtszellen. Jede der bekannten Wirtszellen kann benützt werden, z. B. E. coli, Bacillus, Pseudomonas oder Hefen. Vorzugsweise wird E. coli eingesetzt.

Zu den Möglichkeiten der Expression des β-Urogastron-Gens mit Hilfe von E. coli gehört einmal die direkte Expression von β-Urogastron. Ein anderes Verfahren ist die Expression als Fusionsprotein mit β-Lactamase ooder einem anderen Protein.

Zur direkten Expression des β-Urogastron-Gens ist es notwendig, stromaufwärts vom β-Urogastron-Gen eine Expressions­ kontroll-Sequenz, d. h. einem Promotor und eine SD-Sequenz, in das Rekombinant-Plasmid einzuführen.

Es gibt keine Einschränkung hinsichtlich des zu verwendenden Promotors, aber wünschenswert sind Promotoren, die eine hohe Expressionsrate ermöglichen, wie z. B. λP_L, der links­ seitige Promotor des λ-Phagen, lac UV5, der sich stromaufwärts vom β-Galactosidase-Gen von E. coli befindet.

Wenn λP_L als Promotor eingesetzt wird, gibt es keine Einschränkung für die SD-Sequenz, aber vorzugsweise wird die Vierbasensequenz AGGA verwendet.

Wenn lac UV5 als Promotor eingesetzt wird, wird vorzugsweise die SD-Sequenz, die stromabwärts von lac UV-Promotor liegt, oder die chemisch synthetisierte Sequenz verwendet.

Das Verfahren zur direkten Expression des β-Urogastron-Gens ist am Beispiel λP_L-SD-Sequenz-β-Urogastron-Gen be­ schrieben.

Obwohl λP_L ein starker Promotor ist (J. Hedgpeth et al., Molecular and General Genetics, 163, 197-203 (1978)), hat der vollständig aktivierte λP_L-Promotor eine letale Wirkung auf die Wirtszellen E. coli. Es ist deshalb notwendig, die Zellen zunächst unter für die Zelle nicht letalen Bedingungen zu vermehren und erst danach den λP_L-Promotor wirken zu lassen. Andererseits ist CI857, ein Gen innerhalb des λ-Phagen, eines der mutierten Gene des CI-Repressors, das auf den Operator für λP_L einwirkt. Bei niedrigen Temperaturen (bis zu etwa 30°C) bindet der CI857 Repressor an den Operator und hemmt vollständig die Aktivität von λP_L als Promotor, und erlaubt damit die Vermehrung von E. coli.

Die Wirtszellen können sich daher unter diesen Bedingungen vermehren und werden dann auf eine Temperatur von mindestens 37°C gebracht, so daß der λP_L-Promotor aktiv werden kann. Dar­ überhinaus sind Plasmidvektoren, wie z. B. der bekannte und leicht zugängliche Vektor PSC101, mit strikten Replikations­ mechanismen und solche, wie z. B. pBR322, mit relaxierten Replikationsmechanismen nicht unverträglich, sondern können nebeneinander in derselben E.-coli-Zelle vorkommen.

Es ist daher günstig, ein Rekombinant-Plasmid pGH37 herzustellen, in dem ein CI857-Gen in einen tetracyclin-resistenten Plasmidvektor pSC101 (mit dem stromaufwärts gelegenen lac UV5 Promotor zur wirksamen Expression von CI857), siehe Fig. 6, eingeführt ist. Wenn dann das Rekombinant-Plasmid in E. coli (z. B. Stamm HB101) eingeführt wird, erhält man eine Transformante (Stamm-ECI-2), die als Wirt für den Vektor zur Expression von β-Urogastron unter der Kontrolle des λP_L-Promotors eingesetzt werden kann.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das λP_L-SD-Sequenz- β-Urogastron-Gen z. B. in pBR322 eingeführt, wobei ein β-Urogastron- Expressionsvektor erhalten wird, der für die Transformation des Stammes ECI-2 verwendet wird. Man erhält dabei ein sogenanntes Zweiplasmid-System, in dem zwei nützliche Plasmide nebeneinander in einer E.-coli-Zelle vorliegen.

In diesem System bindet der im pGH37-Plasmid codierte CI857-Repressor an den Operator für den λP_L-Promotor auf dem zweiten Plasmid, wenn die Zellen z. B. bei 30°C kultiviert werden und erlaubt so die Vermehrung der Zellen. Nachdem die Zellen sich unter diesen Bedingungen vollständig vermehrt haben, wird die Temperatur auf z. B. 40°C erhöht. Daraufhin löst sich der CI857-Repressor vom Operator und der λP_L-Promotor kann damit die Expression von β-Urogastron bewirken.

Für die Expression von z. B. Fibroblasten-Interferon oder SV-40 Small t-Antigen wurde ein ähnliches Konzept verwendet. In diesen Fällen wird aber ein λ-Lysogen als Wirt verwendet, in dem die ein CI857 Gen tragende DNA des λ-Phagen in das Wirtschromosom eingeführt wurde (R. Derynck et al., Nature, 287, 193-197 (1980), C. Derom et al., Gene, 17, 45-54 (1982), K. Küpper et al., Nature, 289, 555-559 (1981)).

Mit dem System der vorliegenden Erfindung wird jedoch das CI857-Gen in ein unterschiedliches tetracyclin-resistentes Plasmid eingeführt. Daher hat das vorliegende System den Vorteil, daß keine Möglichkeit besteht, daß der λ-Phage, der in das Wirtschromosom eingeführt wurde, in die Vermehrung eingreift. Damit kann der Stamm leicht kontrolliert werden. Dieses Zweiplasmid-System wird zum ersten Mal zur Expression von β-Urogastron verwendet.

Gemäß einem anderen System wird ein Abschnitt irgendeines anderen Protein-Gens, wie z. b. des β-Lactamase-Gens, mit dem β-Urogastron-Gen verknüpft, um das β-Urogastron-Gen als ein Fusionsprotein zu exprimieren. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß das Fusionsprotein weniger leicht durch die Proteasen in E. coli angegriffen werden kann und so das β-Urogastron schützt. Ein anderer Vorteil ist, daß das Fusionsprotein in das Periplasma der E.-coli-Zelle wandert und sich dort anreichert (S. J. Chan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 5401-5405 (1981)). Es ist daher leicht abzutrennen und zu reinigen.

Im einzelnen wird eine DNA-Sequenz in das β-Lactamase-Gen an einer zweckmäßigen Restriktions-Erkennungsstelle eingeführt, die für zwei basische Aminosäuren codiert. Diese beiden Aminsäuren liefern eine Schnittstelle zur Abspaltung von β-Urogastron aus dem Fusionsprotein. Das β-Urogastron- Gen wird ann mit dem β-Lactamase-Gen verknüpft.

Die Sequenz der zwei basischen Aminosäuren ist vorzugsweise -Lys-Arg- oder -Arg-Lys-. Beispiele für Enzyme, die diese Aminosäuresequenz erkennen und β-Urogastron vom Fusionsprotein abspalten können, sind Kallikrein und Trypsin. Restriktionsenzyme, die das β-Lactamase-Gen spalten können, sind z. B. XmnI, HincII, ScaI, PvuI, PstI, BglI oder BanI.

Das so hergestellte β-Lactamase-β-Urogastron-rekombinant­ plasmid kann in E. coli das Fusionsprotein in größeren Mengen exprimieren. Das erhaltene Fusionsprotein wird z. B. mit Kallikrein behandelt, wobei man β-Urogastron erhält.

Das Expressionssystem kann direkt durch Bestimmung der Nucleotid­ sequenz des Gens nach der Methode von Maxam und Gilbert geprüft werden. Dabei wird die Insertion des Gens und seine Richtung durch die Minipräparation oder Mapping-Methode bestätigt (H. C. Birnboim et al., Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979)) oder durch ein Radioimmunoassay für β-Urogastron.

Die so erhaltene Transformante der vorliegenden Erfindung wird nach üblichen Verfahren vermehrt, wobei große Mengen von Urogastron mit hoher Reinheit erhalten werden können.

Die vorliegende Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel ausführlich beschrieben. Dieses beschränkt aber die Erfindung in keiner Weise.

Beispiel 1. Herstellung des Nucleosid-Trägerharzes

Verschiedene Nucleosid-Trägerharze werden nach dem folgenden Verfahren hergestellt.

1 Gewichtsprozent quer-vernetztes Polystyrolharz "S-X1" (hergestellt von BIO.RAD Laboratories, USA; Korngröße 200 bis 400 mesh; 35-75 µm) wird mit 2,41 g N-(chlormethyl)-phthalimid, 0,22 ml Trifluormethansulfonsäure und 50 ml Dichlormethan gemischt und 2 Stunden bei Reaktionstemperatur gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wird das Harz abfiltriert, nacheinander mit Dichlormethan, Äthanol und Methanol gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und dann unter Rückfluß über Nacht mit 50 ml einer 5 Gew.-% Lösung von Hydrazin in Äthanol erhitzt. Das Harz wird abfiltriert, nacheinander mit Äthanol, Dichlormethan und Methanol gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet. Ein Gemisch des nach dem vorstehenden Verfahren erhaltenen aminomethylierten Polystyrolharzes (2,5 g), 0,75 mM Bernsteinsäureester des 5′-o-Dimethoxytritylnucleosids, 1,23 mM Dicyclohexylcarbodimid und 1 mM Dimethylaminopyridin wird nach Zusatz von 30 ml Dichlormethan über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Harz wird abfiltriert, nacheinander mit Dichlormethan, Methanol und Pyridin gewaschen, in Pyridin-Essigsäureanhydrid (Volumenverhältnis 90 : 10) eingegeben und bei Raumtemperatur 30 Minuten stehengelassen. Das Nucleosidträgerharz wird abfiltriert, mit Pyridin und Dichlormethan gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und so in die Festphasensynthesereaktion eingesetzt.

2. Synthese eines Dinucleotids

Als Beispiel wird die Synthese des vollständig geschützten Dinucleotids mit der Basensequenz TA beschrieben. 13,14 g Adenosin, dessen 5′-Hydroxylgruppe mit einer Dimethoxy­ tritylgruppe (DMTr) und dessen Aminogruppe mit einer Benzoylgruppe geschützt sind, sowie 6,34 g Triazol werden in wasserfreiem Dioxan gelöst. Unter Eiskühlung werden 8,35 ml Tri­ äthylamin zugegeben und dann innerhalb von 10 Minuten 6,86 g o-Chlorphenylphosphodichloridat zu dem Gemisch zugetropft. Das erhaltene Gemisch wird 21/2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt.

Das entstandene Triäthylamin-hydrochlorid wird abfiltriert und das Filtrat auf etwa 2/3 seines Volumens konzentriert. Das Konzentrat wird mit 3,6 g β-Cyanoäthanol und 4,8 g 1-Methylimidazol versetzt und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, dreimal mit 0,1 M wäßriger Lösung von zweibasischem Natriumphosphat und zweimal mit Wasser gewaschen und dann unter vermindertem Druck konzentriert. Es werden 19,96 g des Rohprodukts erhalten. Das Produkt wird durch Chromatographie an einer Kieselgel-Säule unter Verwendung von Chloroform- Methanol (Volumenverhältnis 98 : 2) als Elutionsmittel gereinigt. Das Reinigungsverfahren wird wiederholt. Es werden 15,12 g des vollständig geschützten Adenosin­ mononucleotids erhalten.

7,81 g des erhaltenen Adenosinmononucleotids werden zu einer Lösung (2 Gewichtsprozent) von Benzolsulfonsäure in chloroform-Methanol (Volumenverhältnis 70 : 30) gegeben und das Gemisch wird unter Eiskühlung 20 Minuten gerührt. Dann wird mit einer wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat neutralisiert. Die abgetrennte Chloroformschicht wird mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck konzentriert. Es werden 7,11 g des Rohprodukts erhalten. Das Produkt wird auf eine Kieselgelsäule gegeben und mit Chloroform-Methanol (Volumenverhältnis 97 : 3) eluiert. Es werden 4,3 g Adenosin­ mononucleotid mit einer freien 5′-Hydroxylgruppe er­ halten.

1,64 g Thymidin, dessen 5′-Hydroxylgruppe mit einer Dimeth­ oxytritylgruppe geschützt ist, und 0,95 g Triazol werden in 21 ml wasserfreiem Dioxan gelöst und mit 1,25 ml Triäthylamin versetzt. 0,69 ml o-Chlorphenylphosphodichloridat werden innerhalb von 5 Minuten unter Rühren und Eiskühlung tropfenweise dem Gemisch zugesetzt. Das Gemisch wird dann 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Das entstandene Triäthylamin- hydrochlorid wird abfiltriert und das Filtrat 10 Minuten mit 1,1 ml einer 1 M wäßrigen Lösung von Pyridin gerührt. 1,17 g Adenosinmononucleotid mit einer freien 5′-Hydroxylgruppe, das wie vorstehend beschrieben hergestellt war, werden in 10 ml Dioxan gelöst und zur obigen Lösung zugegeben. Danach werden 0,72 ml 1-Methylimidazol zugesetzt und das Gemisch wird bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird unter vermindertem Druck konzentriert, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und die Lösung mit einer wäßrigen Lösung von 0,1 M zweibasischem Natriumphosphat und dann mit Wasser gewaschen. Nach dem Konzentrieren unter vermindertem Druck erhält man 2,39 g des Rohprodukts. Das Produkt wird auf eine Kieselgelsäule gegeben und mit Chloroform-Methanol (Volumen­ verhältnis 98 : 2) eluiert. Es werden 2,39 g des vollständig geschützten Dinucleotids TA erhalten.

Nach dem gleichen Verfahren werden verschiedene andere Nucleotide hergestellt.

3. Synthese eines Oligonucleotids

Es wird hier die Festphasensynthese des Oligonucleotids A-1, d. h. des Undecanucleotids AATTCGAAGAT beschrieben.

40 mg Harz, an das das Nucleosid T angehängt ist, und das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren 1 hergestellt wurde, werden in ein Reaktionsgefäß gegeben, dreimal mit Dichlormethan-Isopropanol (Volumenverhältnis 85 : 15) gewaschen und dann mit einer Lösung von 1 M Zinkbromid in Dichlormethan-Isopropanol zur Entfernung der Dimethoxy­ tritylgruppe in der 5′-Stellung behandelt. Dieses Verfahren wird mehrmals wiederholt, bis die Lösung farblos ist. Das Harz wird mit Dichlormethan und dann zur Entfernung der verbliebenen Zinkionen mit einer Lösung von 0,5 M Tri­ äthylammoniumacetat in Dimethylformamid gewaschen. Nach weiterem Waschen mit Tetrahydrofuran wird es getrocknet, indem mehrere Minuten Stickstoff durch das Reaktionsgefäß geleitet wird.

50 mg des vollständig geschützten Dinucleotids GA, das nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren 2 hergestellt wurde, werden in 1 ml Pyridin gelöst, mit 1 ml Triäthylamin geschüttelt und dann einige Stunden bei Raumtemperatur stehen­ gelassen. Anschließend wird die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mehrmals mit Pyridin azeotrop eingedampft, um das Triäthylammoniumsalz des Nucleotids zu erhalten. Das Salz wird in 0,3 ml einer 0,3 M Lösung von Mesitylen-sulfonyl-5-nitrotriazol in Pyridin gelöst. In diese Lösung wird das getrocknete Harz eingerührt und nach einer Umsetzungszeit von 60 Minuten bei Raumtemperatur der Überstand vom Reaktionsgemisch abfiltriert. Die feste Phase wird mit Pyridin gewaschen und dann 5 Minuten in einem Gemisch von 0,2 ml Essigsäureanhydrid und 0,8 ml einer 0,1 M Lösung von Dimethylaminopyridin in Tetrahydrofuran-Pyridin zur Maskierung der nicht umgesetzten Hydroxylgruppe stehengelassen. Schließlich wird das Harz mit Pyridin gewaschen, womit ein Cyclus der Festphasen­ synthese vollendet ist. Ein Cyclus verlängert die Nucleotidkette um zwei Basenlängen. Das gleiche Verfahren, wie es vorstehend beschrieben wurde, wird wiederholt, um nach und nach die Dinucleotide AA, CG, TT und AA durch Kondensation an das entstandene Nucleotid anzuknüpfen. Man erhält schließlich, gebunden an das Harz, das vollständig geschützte Undecanucleotid AATTCGAAGAT.

20 mg des erhaltenen Harzes werden 1 Stunde bei 40°C mit 0,6 ml einer 0,5 M Lösung von Tetramethylguanidin-2- pyridinaldoximat in Pyridin-Wasser (Volumenverhältnis 90 : 10) stehengelassen. Das Harz wird dann mit Hilfe einer mit Watte gestopften Pasteur-Pipette abfiltriert und ab­ wechselnd mit Pyridin und Äthanol gewaschen. Die Waschlösung und das Filtrat werden vereinigt und bei 40°C unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in 2 ml einer wäßrigen Lösung von Triäthylammoniumbicarbonat (TEAB, 10 mM) gelöst und dreimal mit Äther gewaschen. Die wäßrige Phase wird auf eine Sephadex G50-Säule 2×100 cm) gegeben und mit 10 mM TEAB eluiert. Die Ab­ sorption der Fraktionen bei 260 nm wird gemessen und die Fraktion, die das erste Elutionsmaximum enthält, wird konzentriert. Der Rückstand wird durch Hochgeschwindigkeits­ flüssigkeitschromatographie (Pumpe: Modell 6000A, Detektor: Modell 440, Hersteller: Waters Associates, USA) gereinigt, bis eine Fraktion mit einem einzigen Maximum erhalten wird.

Als Säule für die Hochgeschwindigkeitsflüssigkeits­ chromatographie wird eine µ-Bondapak-C₁₈-Säule (Hersteller: Waters Associates, USA) und als Elutionsmittel für die Gradientenelution (5→40 Volumenprozent) eine 0,1 M wäßrige Lösung von Triäthylammoniumacetat in Acetonitril verwendet. Das 5′-Ende des soweit gereinigten Undeca­ nucleotids ist noch mit einer Dimethoxytritylgruppe ge­ schützt. Zur Entfernung der Dimethoxytritylgruppe wird die Verbindung 15 Minuten mit einer wäßrigen Lösung von Essigsäure (80 Volumenprozent) behandelt und dann wieder durch Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromato­ graphie gereinigt, bis ein einzelnes Maximum erhalten wird. Es wird die gleiche Säule, wie sie vorstehend beschrieben ist, benutzt und für die Gradientenelution (5→25 Volumen­ prozent) wird eine 0,1 M wäßrige Lösung von Triäthyl­ ammoniumacetat in Acetonitril eingesetzt.

In der gleichen, vorstehend beschriebenen, Weise werden die Oligonucleotide A-2 bis A-16 und B-1 bis B-16 synthe­ tisiert.

Tabelle I zeigt die Ausbeute der einzelnen Oligonucleotide. Sie wird bestimmt, indem von 20 mg des nach der Fest­ phasensynthese erhaltenen Harzes das Oligonucleotid ab­ getrennt, die Schutzgruppe entfernt und das Oligonucleotid gereinigt wird.

Die Ausbeute wird mit Hilfe der Absorptionsmessung des Endproduktes bei 260 nm aus der Summe der Absorptionswerte der Nucleotidbasen berechnet.

Tabelle I

4. Prüfung der Oligonucleotidbasensequenz

Die Sequenz wird gemäß der vorstehend beschriebenen zwei­ dimensionalen Fraktionierung durch Elektrophorese und Homochromatographie nach Wu et al. geprüft.

Die Oligonucleotide A-1 bis A-16 und B-1 bis B-16 haben alle die erwartete Nucleotidsequenz. Fig. 5 zeigt das Analysenergebnis von Oligonucleotid A-3. A-3 hat danach die vom 5′-Ende her gelesene Sequenz GATTCTGAGTG.

Die Nucleotidsequenz aller Oligonucleotide wird auch nach der Methode von Maxam und Gilbert geprüft. Auch damit werden die erwarteten Nucleotidsequenzen von A-1 bis A-16 und B-1 bis B-16 bestätigt.

5. Herstellung der Oligonucleotidblöcke und Untereinheiten

Die Blöcke und Untereinheiten werden nach dem in Fig. 2 gezeigten, nachstehend genau beschriebenen, Verfahren hergestellt.

Zunächst werden jeweils etwa 5 µg der Oligonucleotide A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 und A-16 in 50µl destilliertem Wasser gelöst, so daß die Lösung eine Konzentration von etwa 0,1 µg/µl hat. Jeweils 10 µl (1 µg, berechnet als DNA) dieser sechs verschiedenen wäßrigen Lösungen werden einzeln in sechs Eppendorf-Gefäße gegeben. 6 µl eines Gemischs aus 250 mM Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Spermin und 50 mM DTT werden in jedes Gefäß gegeben, außerdem noch 0,5 µl einer wäßrigen Lösung von γ-³²P-ATP, 0,5 µl T₄-Polynucleotidkinase und 13 µl destilliertes Wasser. Das End­ volumen beträgt damit 30 µl. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 37°C und nach Zugabe von 1 µl einer wäßrigen Lösung von 30 mM ATP weitere 30 Minuten umgesetzt. Die Reaktion wird durch 2minütiges Kochen bei 100°C beendet und das Reaktionsgemisch schnell mit Eis gekühlt. Jeweils 10 µl der Oligonucleotide A-1, A-2, A-3, A-14, A-15 und A-16, deren 5′- Ende nun phosphoryliert ist, werden in neue 1,5 ml Eppendorf-Gefäße gegeben. Jedes Gefäß wird mit 40 µl einer wäßrigen Lösung von 250 mM Tris-HCl (pH 7,6), 40 µl 50 mM Magnesium­ chlorid und 35 µl destilliertem Wasser versetzt, so daß das Gesamtvolumen 175 µl beträgt. Das Gemisch wird 2 Minuten auf 90°C erhitzt und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Nach Zugabe von 10 µl einer wäßrigen Lösung von 20 mM ATP und 5 µl (100 Einheiten) T₄-DNA-Ligase, wird das Gemisch über Nacht bei 4°C umgesetzt. Dabei entsteht Block 1, verknüpft aus den Oligonucleotiden A-1, A-2, A-3, A-15 und A-16.

Die Blöcke 2 und 3 werden in ähnlicher Weise durch die Ver­ knüpfung von A-4, A-5, A-6, A-11, A-12 und A-13 und durch die Verknüpfung von A-7, A-8, A-9 und A-10 hergestellt.

Zu dem so hergestellten Reaktionsgemisch der Blöcke wird das zweifache Volumen Äthanol zugesetzt und das Gemisch wird 30 Minuten zur Ausfällung der DNA bei -80°C stehengelassen. Anschließend werden eine Elektrophorese auf einem 12,5-gewichtsprozentigen Polyacrylamidgel und eine Autoradiographie durchgeführt. Es werden für den Block 1 Banden in den Positionen 72 Bp (Basenpaar) und 36 Bp, für den Block 2 eine Bande in der Position 36 Bp und für den Block 3 Banden in den Positionen 48 Bp und 24 Bp erhalten. Anschließend wird jede Bande ausgeschnitten und in ein Gemisch aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) und eine wäßrige Lösung von 10 mM EDTA (Tris-EDTA) gegeben. Das Gemisch wird zur Extraktion über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Es wird sodann zentrifugiert und der Überstand abgetrennt. Dieser wird kräftig mit Phenol, gesättigt mit Tris-EDTA, geschüttelt und dann zur Entfernung der unteren Schicht zentrifugiert. Das gleiche Verfahren wird zweimal mit dem mit Tris-EDTA ge­ sättigten Phenol wiederholt. Schließlich wird die obere Schicht über eine Säule (1×20 cm) von Sephadex G-50 gegeben, um das Phenol und Acrylamid zu entfernen. Das Eluat wird dann auf 200 µl konzentriert und nach Zugabe des zweifachen Volumens Äthanol zur Ausfällung der DNA 30 Minuten bei -80°C stehengelassen.

Die drei Blöcke werden zusammengegeben und mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid, 20 mM DTT, 1 mM ATP und 5 µl (100 Einheiten) T₄-DNA-Ligase versetzt. Das Gemisch wird zur Verknüpfung über Nacht bei 4°C stehengelassen. An­ schließend wird das 2fache Volumen Methanol zugesetzt und das Gemisch zur Ausfällung der DNA 30 Minuten bei -80°C stehengelassen. Es folgt eine Elektrophorese in einem 8gewichtsprozentigen Polyacrylamidgel und eine Autoradiographie, wobei Banden bei 96 Bp und 192 Bp erhalten werden. Alle Banden werden ausgeschnitten, in Tris-EDTA gegeben und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur zur Extraktion stehengelassen. Das Gemisch wird dann zur Abtrennung des Überstands zentrifugiert, und der Überstand kräftig mit Tris-EDTA und gesättigtem Phenol geschüttelt. Die untere Schicht wird verworfen. Das Ganze wird zweimal mit Tris- EDTA gesättigtem Phenol wiederholt. Die obere Schicht wird über eine Sephadex G-50-Säule gegeben. Das Eluat wird konzentriert. Zum Konzentrat wird das zweifache Volumen Äthanol gegeben und das Gemisch bei -80°C 30 Minuten zur Ausfällung der DNA stehengelassen. Die Spaltung des Pro­ dukts mit EcoRI und BamHI ergibt die Untereinheit A.

Wie in Fig. 3 gezeigt, wird das gleiche Verfahren zur Verknüpfung der Oligonucleotide B-1, B-2, B-15 und B-16 zu Block 4, von B-3, B-4, B-13 und B-14 zu Block 5, von B-5, B-6, B-11 und B-12 zu Block 6 und von B-7, B-8, B-9 und B-10 zu Block 7 wiederholt. Die erhaltenen Blöcke von 26 Bp und 52 Bp werden in ähnlicher Weise zu Blöcken von 104 Bp und 208 Bp verknüpft. Durch Spaltung mit HindIII und BamHI wird die Untereinheit B erhalten.

6. Clonierung der Untereinheiten und Analyse der Rekombinant- Plasmide

Wie in Fig. 2 gezeigt, wird das Plasmid pBR322 mit EcoRI und BamHI gespalten und die Phosphatgruppen werden mit alkalischer Phosphatase von den 5′-Enden abgespalten, um den Aus­ gangszustand nicht wieder herzustellen. Das gespaltene und dephosphorylierte pBR322-Plasmid und die Untereinheit A werden über Nacht bei 4°C in einem Gemisch von 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid, 20 mM DTT und 1 mM ATP unter Zusatz von 5 µl T₄-DNA-Ligase stehengelassen. Dabei erfolgt die Verknüpfung. Das zweifache Volumen Äthanol wird zu dem Gemisch zugesetzt und das Ganze 30 Minuten bei -80°C zur Ausfällung der DNA stehengelassen. Das Gemisch wird dann zentrifugiert, der Niederschlag getrocknet und in 100 µl destilliertem Wasser aufgenommen. Man erhält so das Plasmid pUG1, in dem die Untereinheit A in pBR322 einge­ führt ist.

Der E.-coli-Stamm HB101 wird mit Hilfe der Calciummethode mit dem Plasmid pUG1 transformiert.

Der als Wirt dienende Stamm HB101 wird bei 37°C in 50 ml LB-Kulturmedium (1 Gewichtsprozent Bactotrypton, 0,5 Ge­ wichtsprozent Hefeextrakt und 0,5 Gewichtsprozent Natriumchlorid) kultiviert. Wenn die Absorption bei 610 nm den Wert 0,25 erreicht, werden 40 ml der Kulturflüssigkeit in einen Zentrifugenbecher gegeben und bei 6000 UpM · 10 Minuten bei 0°C zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen, der Niederschlag in 20 ml eiskalter 0,1 M Magnesiumchloridlösung suspendiert und die Suspension unter den gleichen Bedingungen noch einmal zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Der Niederschlag wird in 20 ml einer eiskalten Lösung von 0,1 M Calciumchlorid und 0,05 M Magnesiumchlorid suspendiert und 1 Stunde in Eis gekühlt. Die Suspension wird zentrifugiert, der Überstand verworfen und der Niederschlag in 2 ml einer eiskalten Lösung von 0,1 M Calciumchlorid und 0,05 M Magnesiumchlorid suspendiert. Zu 200 µl der Suspension werden 10 µl einer wäßrigen Lösung von pUG1 zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde in Eis gekühlt und dann in einem Wasserbad 30 Sekunden auf 43,5°C erwärmt. Dann werden 2,8 ml LB-Kulturmedium zum Gemisch zugegeben und es wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Kultur wird dann in einer Menge von 200 µl pro Platte auf eine LB-Platte mit 50µg/ml Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die wachsenden Kolonien werden geprüft, indem sie auf eine LB-Platte mit 50 µl/ml Ampicillin und auf eine LB-Platte mit 20 µl/ml Tetracyclin überimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert werden. Nur die gegen Ampicillin resistenten Kolonien werden zur Gewinnung der transformierten Zellen abgetrennt.

Plasmide werden in geringer Menge mit Hilfe der alkalischen Extraktionsmethode aus den Zellen gewonnen und auf die Anwesenheit einer BglII-Schnittstelle geprüft. Eine der Zellen, die das Plasmid mit der BglII-Schnittstelle enthält, wird in großem Maßstab kultiviert und das Plasmid pUG1 in ähnlicher Weise mit Hilfe der alkalischen Extraktions­ methode gewonnen.

Die Nucleotidsequenz der in das pUG1-Plasmid eingeführten Untereinheit A wird in beiden Strängen nach der Methode von Maxam und Gilbert bestimmt.

Fig. 19 und 20 zeigen die Analysenergebnisse. Die Spalten 1 bis 4 sind das Ergebnis der Elektrophorese des EcoRI-SalI-Fragments, die Spalten 5 bis 8 das des BamHI- PstI-Fragments. Die Spalten 1 und 5 zeigen die Reaktions­ produkte für Guanin, die Spalten 2 und 6 die Reaktionsprodukte für Guanin und Adenin, die Spalten 3 und 7 zeigen die Reaktionsprodukte für Thymin und Cytosin und die Spalten 4 und 8 zeigen die Reaktionsprodukte für Cytosin. Fig. 20 gibt die Ergebnisse wieder, die mit denselben Proben, wie vorstehend erhalten werden, wobei ein Gebiet höheren Molekulargewichts (entsprechend des oberen Teils von Fig. 19) vergrößert ist. Damit ist die Nucleotid­ sequenz der Untereinheit A bestätigt.

Wie in Fig. 3 gezeigt, wird das Plasmid pBR322 mit HindIII und BamHI gespalten, das größere Fragment durch Elektrophorese isoliert und mit der Untereinheit B verknüpft. Damit wird das Plasmid pUG2, in dem die Unter­ einheit B in pBR322 eingeführt ist, in ähnlicher Weise wie pUG1 erhalten. Mit dem Plasmid pUG2 wird der Stamm HB101 transformiert und nur die gegen Ampicillin resistenten Kolonien werden selektiert.

Plasmide werden von den Kolonien gewonnen und auf die An­ wesenheit einer BglII-Schnittstelle und einer MluI-Schnittstelle geprüft. Die Zellen, die das Plasmid mit beiden Schnittstellen enthalten, werden selektiert. Eine der selektierten Zellen wird in großem Maßstab kultiviert und so das gereinigte Plasmid pUG2 erhalten. Die Nucleotidsequenz der in pUG2 eingeführten Untereinheit B wird auf beiden Strängen nach der Maxam-Gilbert-Methode geprüft.

Fig. 21 zeigt die Analysenergebnisse. Die Spalten 1 bis 4 zeigen das Ergebnis, das mit dem HindIII-SalI-Fragment erhalten wird. Die Spalten 5 bis 8 zeigen das mit den gleichen Proben erhaltene Ergebnis, wobei ein Gebiet höheren Molekulargewichts (entsprechend des oberen Teils der Spalten 1 bis 4) in einem vergrößerten Maßstab gezeigt wird. Jede Spalte zeigt das in Fig. 19 entsprechende Reaktions­ produkt. Damit wird die Nucleotidsequenz der Unterein­ heit B bestätigt.

Wie in Fig. 4 gezeigt, wird pUG1 mit HindIII und SalI gespalten und das größere Fragment über eine Biogel 1,5 m Säule abgetrennt. pUG2 wird mit HindIII und SalI gespalten und das kleinere Fragment durch Elektrophorese gewonnen. Die zwei Fragmente werden zusammengegeben und zur Verknüpfung mit T₄-DNA-Ligase behandelt. Dabei erhält man das Plasmid pUG3, in das die Untereinheiten A und B, also das β-Urogastron-Gen, in pBR322 eingeführt sind. Der E.-coli-Stamm HB101 wird mit dem Plasmid pUG3 transformiert. Die Transformante ist nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, am 22. Juni 1984 mit der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-543 hinterlegt worden.

Auch in diesem Fall werden die Zellen, die das nur gegen Ampicillin resistente und eine MluI-Spaltstelle besitzende Plasmid pUG3 enthalten, selektiert. Eine der selektierten Zellen wird in großem Maßstab kultiviert und so das gereinigte Plasmid pUG3 erhalten. Die Nucleotidsequenz des β-Urogastron-Gens in pUG3 wird auf beiden Strängen nach der Maxam-Gilbert-Methode bestimmt.

Fig. 22 zeigt die Analysenergebnisse. Die Spalten 1 bis 4 zeigen das Ergebnis, das mit dem BamHI-PstI-Fragment erhalten wurde. Die Spalten 5 bis 8 zeigen das mit den gleichen Proben erhaltene Ergebnis, wobei ein Gebiet höheren Molekulargewichts (entsprechend des oberen Teils der Spalten 1 bis 4) in einem vergrößerten Maßstab gezeigt ist. Die Reaktionsprodukte der einzelnen Spalten entsprechen den Reaktionsprodukten von Fig. 19. Die Analyse bestätigt die Nucleotidsequenz des β-Urogastron-Gens.

7. Expressionsvektor mit λP_L-Promotor

Der λP_L-Promotor, linksseitiger Promotor des λ-Phagens, wird zur Expression von β-Urogastron verwendet, was nachstehend ausführlich beschrieben ist.

Zunächst wird die Herstellung des Stammes ECI-2 aus dem E.-coli-Stamm HB101 beschrieben. ECI-2 dient als Wirt für λP_L-Expressionsplasmide. Als nächstes wird die Clonierung eines DNA-Fragments mit dem λP_L-Promotor aus der DNA des λCI857S₇, einer Mutante des λ-Phagens, und der Aufbau der Expressionsplasmide aus der clonierten DNA gezeigt. Schließlich wird die Expression des β-Urogastron-Gens im Wirtsstamm ECI-2 durch den λP_L-Promotor beschrieben.

7-1) Herstellung des Stammes ECI-2

Der Stamm ECI-2 ist der E.-coli-HB101-Stamm mit dem Plasmid pGH37 zur Expression des CI857-Gens.

pGH37 wird nach dem in Fig. 6 gezeigten Verfahren hergestellt. Zunächst wird die DNA von λCI857S₇ mit BglII geschnitten, und dann werden die überstehenden Enden der Spaltstelle mit S1-Nuclease verdaut. 1 µg der mit BglII gespaltenen DNA von λCI857S₇ wird mit 200 Einheiten SI-Nuclease 30 Minuten bei 20°C in 100 µl einer wäßrigen Lösung (ph 4,5) aus 200 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumacetat und 5 mM Zinksulfat umgesetzt. Die so erhaltenen DNA-Fragmente haben glatte Enden und werden auf einem 1gew.-%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Es wird ein Fragment aus 2385 Bp mit dem gesamten CI857-Strukturgen erhalten. Das Fragment wird in die PvuII-Schnittstelle des Plasmids pGL101 eingeführt, so daß das Plasmid pGH36 entsteht, das das CI857-Gen unter der Kontrolle eines Promotors, lac UV5, exprimiert. Anschließend wird pGH36 mit zwei Restriktionsenzymen, EcoRI und PstI, geschnitten, so daß ein Fragment mit 1193 Bp erhalten wird, das in das Plasmid pSC101 zwischen den EcoRI- und PstI-Schnittstellen eingeführt wird. Man erhält so das Plasmid pGH37.

Anschließend wird der E.-coli-Stamm HB101 nach der vorstehend beschriebenen Calciummethode mit pGH37 transformiert. Einer der erhaltenen Stämme wird mit ECI-2 bezeichnet. Der Stamm ECI-2 ist nach dem Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, am 22. Juni 1984 mit der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-542 hinterlegt worden. Dieser Stamm ist tetracyclin- resistent, exprimiert das CI857-Gen und erlaubt durch Transformation das gleichzeitige Vorhandensein anderer, z. B. von pBR322 abstammender, Plasmide. Demgemäß wird der Stamm ECI-2 als Wirt für λP_L-Expressionsplasmide verwendet.

7-2) Clonierung des λP_L-Promotors und Herstellung der Expressionsplasmide

Wie in Fig. 7 gezeigt, wird als erstes pGH35 hergestellt. Die DNA von λCI857S₇ wird mit EcoRI und SalI geschnitten, wobei ein Fragment von 5925 Bp erhalten wird, auf dem sich der λP_L-Promotor und das CI857-Gen, wie auch der λP_R-Promotor, befinden. Das Fragment wird in das Plasmid pBR322 zwischen den EcoRI- und SalI-Schnittstellen eingeführt, wobei das Plasmid pGH25 entsteht. Als nächstes wird pGH25 mit BamHI geschnitten und mit dem ebenfalls mit BamHI geschnittenen pBR322-Plasmid verknüpft, wobei das Plasmid pGH34 entsteht.

Anschließend wird pGH34 mit AvaI und BglII geschnitten und dann mit S1-Nuclease behandelt, wobei ein Fragment mit glatten Enden von etwa 4500 Bp entsteht. Das Fragment wird mit T₄-DNA-Ligase zum Ring geschlosseen, so daß das Plasmid pGH35 erhalten wird.

Als nächstes wird, wie in Fig. 8 gezeigt, das Plasmid pEK28 konstruiert. Die synthetischen Oligonucleotide C-1-1 und C-1-2 dienen als Adapter, die eine SD-Sequenz besitzen und die nachstehend gezeigte Nucleotid-Sequenz haben. Sie werden mit dem Fragment, das durch Schneiden von pGH35 mit HpaI erhalten wird, verknüpft. Dieser Bausatz wird weiter mit dem mit BamHI geschnittenen Plasmid pMC1403 verknüpft, wobei das Plasmid pEG2 erhalten wird. Das pEG2-Plasmid hat zwei für Ampicillin-Resistenz codierende Gene und exprimiert das von pMC1403 stammende β-Galactosidase-Gen unter der Kontrolle des λP_L-Promotors. Es benutzt sowohl das Startcoden als auch die SD-Sequenz auf dem Adapter.

Die Frequenz C-1-1 und C-1-2 haben die folgende Nucleotid- Sequenz:

Die Methode von Miller wird zur Feststellung der β-Galactosidase- Expression in dem das Plasmid pEG2 enthaltenden Wert ECI-2 eingesetzt (Miller, J. [1972], "Experiments in Molecular Genetics", New York, Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 352-355). Die Methode beruht auf der Umsetzung von β-Galactosidase mit dem synthetischen Substrat ONPG (o-Nitrophenylgalactosid), wobei die gelbe Verbindung o-Nitrophenol freigesetzt wird. Die Methode von Miller wird hier ausführlich beschrieben. 0,1 ml Kulturlösung einer Bakterienprobe, deren Absorption bei 610 nm gemessen wurde, wird mit 1,9 ml Testpuffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, 1 mM Magnesiumsulfat und 0,1 M β-Mercaptoäthanol gemischt und 15 Sekunden kräftig mit 0,1 ml Toluol geschüttelt, um die Permeabilität der Bakterienprobe zu erhöhen. Das Toluol wird dann mit einer Saugvorrichtung abgezogen. Nach Zugabe von 0,2 ml ONPG-Lösung (400 mg ONPG, gelöst in 100 ml Testpuffer) wird das Gemisch bei 30°C inkubiert, bis eine Gelbfärbung auftritt. Dann wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 0,5 ml 1-M-Natriumcarbonat gestoppt. Die Absorption des Reaktionsgemisches wird bei 420 und 550 nm gemessen.

Die Aktivität der β-Galactosidase wird durch die Einheiten in 1 ml der Kulturflüssigkeit gemäß der folgenden Gleichung definiert, in der die Absorption bei 610 nm als 1,0 gerechnet wird.

t: Inkubationszeit (Minuten),
v: Menge der zum Reaktionssystem zugesetzten Bakterienprobe (0,1 ml),
OD₆₁₀: Absorption der Bakterienprobe bei 610 nm.

Bei Durchführung der vorstehend beschriebenen Methode erhält man die folgenden Ergebnisse. Wenn der das Plasmid pEG2 enthaltende ECI-2-Stamm bei 30°C inkubiert wird, erhält man eine β-Galactosidaseaktivität von 98 Einheiten. Wenn jedoch die Kultur noch eine weitere Stunde bei 42°C inkubiert wird, wird der λP_L-Promotor aktiviert, und man erhält eine β-Galactosidaseaktivität von 9637 Einheiten. Dies bestätigt, daß die Sequenz von λP_L-Promotor zur β-Galactosidase in der gewünschten Reihenfolge angeordnet ist.

Obwohl das Plasmid pEG2 zwei BglII-Schnittstellen hat, ist nur die unmittelbar hinter der SD-Sequenz von β-Galactosidase gelegene BglII-Schnittstelle notwendig, die andere Stelle ist dagegen unerwünscht. Demgemäß wird das Plasmid mit BamHI geschnitten und wieder verknüpft unter Entfernung eines Fragments von etwa 770 Bp. Die Konstruktion von pEK28, ein Expressionsplasmid mit dem λP_L-Promotor, ist damit vollständig.

7-3) Expression des aus der vorderen Hälfte des β-Urogastron-Gens und des β-Galactosidase-Gens fusionierten Gens

Fig. 9 zeigt schematisch die Abfolge der Reaktion, die nachstehend beschrieben wird.

Das Plasmid pUG101, das ein fusioniertes Gen aus der vorderen Hälfte des β-Urogastron-Gens und des Gens der β-Galactosidase besitzt, wird in folgender Weise konstruiert. Im einzelnen werden pUG1, welches die vordere Hälfte des β-Urogastron- Gens enthält, und pMC1403, das das β-Galactosidase-Gen enthält, mit BamHI geschnitten und dann zum Plasmid pUG101 verknüpft. In diesem Plasmid sind die vordere Hälfte des β-Urogastron-Gens und das β-Galactosidase-Gen in gleichen Ableserahmen verknüpft. Demgemäß exprimiert das Plasmid die Aminosäuresequenz der zwei Gene als Fusionsprotein.

Zur Expression mit diesem Plasmid unter der Kontrolle des λP_L-Promotors werden die Plasmide pUG101 und pEK28 jeweils mit BglII geschnitten.

Das Schneiden mit BglII ergibt ein DNA-Fragment mit überstehenden 5′-Enden in der Form von

Wenn jedoch das DNA-Fragment mit einem großen Fragment der E.-coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment), in Anwesenheit der vier Desoxyribonucleotid-triphosphate dGTP, dATP, dTTP und dCTP umgesetzt wird, erhält man ein glattes Ende, in dem mit den entsprechenden Nucleotiden aufgefüllt wurde. Die Enden lauten dann

Wenn nur dGTP als Nucleotid zugesetzt wird, erhält man aufgrund der begrenzten Reaktionsmöglichkeiten die Enden

Wenn S1-Nuclease zur Verdauung des verbleibenden Einzelstrangs eingesetzt wird, erhält man ein glattes Ende in der Form von

Ebenso erhält man, wenn dGTP und dATP in der Klenow-Reaktion zugesetzt werden und anschließend eine Verdauung mit S1-Nuclease durchgeführt wird, die Enden

Wenn die Klenow-Reaktion durch Zufügung von dGTP, dATP und dTTP, gefolgt von einer Verdauung von S1-Nuclease, ausgeführt wird, erhält man

Wenn dagegen nur eine Verdauung mit S1-Nuclease ohne Klenow-Reaktion erfolgt, erhält man

Wenn also ein DNA-Fragment mit den Enden

der Klenow-Reaktion unter Verwendung verschiedener Nucleotide und/oder einer S1-Nuclease-Verdauung unterworfen wird, so werden fünf verschiedene Arten von glatten Enden erhalten, die sich um eine Basenpaarlänge unterscheiden.

Die Klenow-Reaktion und die S1-Nuclease-Reaktion werden folgendermaßen durchgeführt.

Klenow-Reaktion

1 µg Substrat-DNA wird mit jeweils 1 mM Desoxyribonucleotid- triphosphat 30 Minuten bei 12°C in Gegenwart von einer Enzymeinheit (Klenow-Fragment) und 1 mM ATP in 50 µl Reaktionsmedium umgesetzt. Das Reaktionsmedium besteht aus 40 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 1 mM β-Mercaptoäthanol und 10 mM Magnesiumchlorid.

S1-Nuclease-Reaktion

1 µg DNA-Substrat und 200 Enzymeinheiten werden 30 Minuten bei 20°C in 100 µl Reaktionsmedium umgesetzt. Das Reaktionsmedium besteht aus 200 mM Natriumchlorid, 30 mM Natriumacetat und 5 mM Zinksulfat (pH 4,5).

pEK28 und pUG101 werden jeweils mit BglII geschnitten und dann verschiedenen Kombinationen der Klenow-Reaktion und der S1-Nuclease-Reaktion unterworfen, so daß Fragmente mit fünf verschiedenen Arten von glatten Enden entstehen. Die zwei Fragmentarten ergeben, wenn man sie kombiniert, 21 Kombinationen, die sich voneinander in der Zahl und der Sequenz der Nucleotide zwischen der SD-Sequenz und dem Startcodon des Fusionsproteins unterscheiden. Sie sind in Tabelle II aufgelistet.

Die so erhaltenen DNA-Fragmente werden mit SalI geschnitten, wobei aus pUG101 Fragmente entstehen, die das für das Fusionsprotein aus der vorderen Hälfte des β-Urogastron-Gens und das β-Galactosidase-Gen codierende Gen enthalten. Aus pEK28 entstehen den λP_L-Promotor enthaltende Fragmente. Diese Fragmente werden durch T₄-DNA-Ligase zu Kombinationen verknüpft, wie sie in Tabelle II gezeigt sind.

Dadurch erhält man Rekombinant-Plasmide, wie sie in Tabelle III gezeigt sind. Die β-Galactosidaseaktivität der exprimierten Fusionsproteine wird nach der Millerschen Methode gemessen. Tabelle III zeigt, daß alle Plasmide einen relativ hohen Stand an β-Galactosidaseaktivität haben. Besonders die Plasmide pUG103, pUG104 und pUG117 erreichen bemerkenswerte Ergebnisse.

Tabelle II

Tabelle II - Fortsetzung

Tabelle III

Als nächstes wird ein Vektor zur Expression von β-Urogastron aus pUG103 oder pUG117 hergestellt. Das Plasmid (pUG103 oder pUG117) wird mit HindIII und PvuII geschnitten, so daß ein Fragment von 1,2 kBp erhalten wird, das den Bereich vom λP_L-Promotor bis zur vorderen Hälfte des β-Urogastron-Gens enthält. Weiterhin wird pUG2 mit EcoRI geschnitten, die Schnittstellen werden mit dem Klenow-Fragment ergänzt und mit HindIII geschnitten, wodurch ein Fragment von 4,1 kBp erhalten wird. Die zwei Fragmente werden mit T₄-DNA-Ligase verknüpft und der E.-coli-Stamm ECI-2 damit nach der vorstehend beschriebenen Calciummethode transformiert. Es wird eine Rekombinante gewonnen, die das Plasmid pUG103-E oder pUG117-E zur Expression der Kombination aus vorderer und hinterer Hälfte des β-Urogastron-Gens, d. h. das gesamte β-Urogastron-Gen, unter der Kontrolle des λP_L-Promotors enthält.

8. Vektor zur Expression des Fusionsproteins

Das β-Lactamase-Gen auf dem Plasmid pBR322 und das β-Urogastron- Gen zur Expression von β-Urogastron als Fusionsprotein werden miteinander verknüpft. Dieses Verfahren wird nachstehend beschrieben.

8-1) Donor des β-Lactamase-Gens

pBRH02 wird durch Schneiden von pBR322 mit AvaI und PvuII, gefolgt von der Klenow-Reaktion und Verknüpfung durch T₄- DNA-Ligase erhalten. Dieses Plasmid besitzt Gene für Ampicillinresistenz (Ap^R) und Tetracyclinresistenz (Tc^R) als Marker. pBRH03 wird durch Schneiden von pBR325 mit AvaI und HindIII, gefolgt von der Klenow-Reaktion, und Verknüpfung erhalten, und besitzt Gene für Ap^R und Chloramphenicolresistenz (Cm^R) als Marker. Fig. 10 zeigt diese Plasmide.

8-2) Donor des β-Urogastron-Gens

pUG3 wird, wie schon beschrieben, hergestellt und mit MboII geschnitten. Es werden 13 verschiedene Arten von DNA-Fragmenten erhalten, die mit A bis M in der Reihenfolge ihrer Größe bezeichnet werden, wie das in Fig. 11 gezeigt ist. Unter diesen DNA-Fragmenten ist das H-Fragment, das aus 179 Basenpaaren besteht. Es beginnt mit einem Nucleotid, das für Asparagin am N-terminalen Ende von β-Urogastron codiert, und endet mit 16 Basen stromabwärts vom Stopcodon. Das Fragment umfaßt damit das gesamte Strukturgen von β-Urogastron. Zur Isolierung des H-Fragments werden die Fragmente auf einem 6gew.-%igen Polyacrylamidgel elektrophoretisch getrennt, und das Fragment wird gereinigt.

8-3) Adapter

Als Adapter werden die in Tabelle IV aufgeführten Oligonucleotide nach dem vorher beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Sequenz der Adapter codiert für das basische Aminosäurepaar Lys-Arg oder Arg-Lys, so daß β-Urogastron enzymatisch aus dem exprimierten Fusionsprotein abgespalten werden kann.

Tabelle IV

D-1-3

CCGTAAG

D-1-4

TTACGG

D-2-1

CGTAAG @

D-2-2

TTACG @

D-3-2

TTACGGAT @

D-4-2

TTACGTGCA @

E-1

CGCTAAACGG @

E-2

CGTTTAGCG @

E-3

GACAAACGG @

E-4

CGTTTGTC @

E-5

CGTTTAGCGAT @

E-6

CGTTTGTCTGCA @

E-7

CGGCTAAACGG @

E-8

CGTTTAGCCG @

E-9

CAAACGG @

E-10

CGTTTG

8-4) System zur Expression des Fusionsproteins aus β-Lactamase und β-Urogastron, verbunden durch Lys-Arg

Ein Vektor zur Expression des β-Lactamase-β-Urogastron- Fusionsproteins wird in der Weise hergestellt, daß er in dem Bereich, der den Adapter enthält, eine Restriktionsenzym- Erkennungssequenz bekommt.

8-4-a) Konstruktion von pUG2301 bis pUG2303

Das in Fig. 12 gezeigte Verfahren wird durchgeführt. Das Plasmid pBRH02 wird innerhalb von 3 Stunden bei 37°C vollständig mit XmnI geschnitten. Anschließend werden 3 µg des Vektors, etwa 0,1 µg des β-Urogastronfragments aus 179 Basenpaaren und jeweils etwa 1 µg E-1 und E-2 (mit nicht- phosphorylierten 5′-Enden) als Adapter in einem einzigen Schritt bei 12°C innerhalb von 15 Stunden verknüpft, so daß Plasmide als Expressionsvektoren erhalten werden. Der Stamm HB101 wird mit den Plasmiden mit HIlfe der Calciummethode transformiert.

Von den 499 erhaltenen Tc^R-Kolonien sind 168 (33,7%) Kolonien Ap^S. Diese Kolonien werden durch Minipräparation auf die Größe der Plasmid-DNA geprüft. 13 Plasmide sind etwa 200 Basenpaaare größer als der Vektor, und es wird angenommen, daß sie das β-Urogastron-Gen enthalten. Alle, die eine MluI-Schnittstelle haben, werden mit HinfI geschnitten und die Orientierung der Insertion des β-Urogastrongens mit Hilfe einer Elektrophorese auf einen 1,5gew.- %igen Agarosegel überprüft. Drei der geprüften Plasmide ergeben Fragmente von etwa 1050 Basenpaaren und etwa 800 Basenpaaren. Das zeigt, daß das β-Urogastron-Gen in der gleichen Orientierung wie das β-Lactamase-Gen eingeführt ist. Diese drei Plasmide werden mit pUG2301 bis pUG2303 bezeichnet.

8-4-b) Konstruktion von pUG2101 bis pUG2105

Das in Fig. 13 gezeigte Verfahren wird durchgeführt. Das Plasmid pBR322 wird als Vektor mit einer einzigen PvuI-Schnittstelle im β-Lactamase-Gen verwendet. Gemäß dem in 8-4-a beschriebenen Verfahren wird ein Expressionsvektor unter Verwendung von E-1 und E-5 als Adapter konstruiert.

Bei der Prüfung der 1626 erhaltenen Tc^R-Kolonien auf Ap- Empfindlichkeit erweisen sich 31 Kolonien (1,9%) als Ap^S. Mit 22 Tc^R- und Ap^S-Kolonien wird eine Minipräparation durchgeführt, und die Plasmide werden durch Schneiden mit MluI auf Insertion des β-Urogastron-Gens geprüft. 20 Plasmide mit einer MluI-Schnittstelle werden gefunden. Die Orientierung wird durch Schneiden mit HinfI oder BamHI geprüft. Es wurde festgestellt, daß die Plasmide pUG2101 bis pUG2105 ein β-Urogastron-Gen in der gleichen Orientierung wie das β-Lactamase-Gen enthalten.

8-4-c) Konstruktion von pUG2701 bis pUG2703

Expressionsplasmide werden nach dem gleichen Verfahren wie in 8-4-a) mit pBR322 als Vektor und E-7 und E-8 als Adapter konstruiert. Der Verlauf ist in Fig. 14 gezeigt.

Von den 217 erhaltenen Tc^R-Kolonien sind 106 Kolonien (48,8%) Ap^S. Mit 25 dieser Kolonien wird eine Minipräparation durchgeführt. 8 Plasmide enthalten etwa 200 Basenpaare mehr als der Vektor und scheinen das β-Urogastrongen zu enthalten. Diese 8 Plasmide werden daher mit BamHI geschnitten, und die Orientierung des Gens wird geprüft. Dabei werden drei Plasmide gefunden, die das β-Urogastron-Gen in der gleichen Orientierung wie das β-Lactamase-Gen enthalten. Sie werden mit pUG2701 bis 2703 bezeichnet.

Das nach dem Verfahren von 8-4-a) erhaltene Plasmid pUG2301 produziert ein Fusionsprotein mit einem Anteil der β-Lactamase und β-Urogastron. Die vorausgesagte Aminosäurefrequenz und die entsrechende Nucleotidsequenz sind nachstehend gezeigt.

In ähnlicher Weise produziert das nach dem Verfahren 8-4-b) erhaltene Plasmid pUG2101 ein Fusionsprotein mit der folgenden Primärstruktur:

In ähnlicher Weise produziert das nach dem Verfahren 8-4-c) erhaltene Plasmid pUG2701 ein Fusionsprotein mit folgender Primärstruktur.

Die Nucleotid-Sequenzen, die in den Plasmiden pUG2101, pUG2301 und pUG2701 für die Fusionsproteine codieren, werden nach der Maxam-Gilbert-Methode analysiert.

Fig. 23 zeigt die Analysenergebnisse. Dabei zeigen die Spalten 1 bis 4 das mit dem MluI-PstI-Fragment (224 Basenpaare) von pUG2101 erhaltene Ergebnis. Die Spalten 5 bis 8 zeigen die mit dem MluI-EcoRI-Fragment (721 Basenpaare) von pUG2101 erhaltenen Banden. Die Spalten 9 bis 12 ergeben sich aus dem MluI-BamHI-Fragment (452 Basenpaare) von pUG2301. Die Spalten 13 bis 16 zeigen das mit dem MluI-PstI-Fragment (335 Basenpaare) von pUG2701 erhaltene Ergebnis und die Spalten 17 bis 20 ergeben sich aus dem MluI-EcoRI-Fragment (610 Basenpaare) von pUG2701. Die Spalten 1, 5, 9, 13 und 17 zeigen die Reaktionsprodukte für Guanin, die Spalten 2, 6, 10, 14 und 18 die für Guanin plus Adenin, die Spalten 3, 7, 11, 15 und 19 die Reaktionsprodukte für Thymin und Cytosin, und die Spalten 4, 8, 12, 16 und 20 schließlich die Reaktionsprodukte für Cytosin. Der mit "}" gekennzeichnete Abschnitt ist ein Adapter.

8-5) System zur Expression des Fusionsproteins aus β-Lactamase und β-Urogastron, verbunden durch Arg-Lys 8-5-a) Herstellung von pUG1102 und pUG1105

Wie in Fig. 15 gezeigt, wird das β-Uroggastron-Gen in das β-Lactamase-Gen von pBR322 an seiner einzigen PvuI-Restriktionsstelle eingeführt, so daß Vektoren zur Expression des Fusionsproteins aus β-Lactamase und β-Urogastron erhalten werden.

Das Plasmid pBR322 wird innerhalb von 3 Stunden bei 37°C mit PvuI geschnitten. Einige der Plasmide werden einer 1gew.-%igen Agarosegelelektrophorese unterworfen, um festzustellen, ob sie vollständig geschnitten sind. Die Adapter D-1-3 und D-3-2 werden innerhalb von 15 Stunden bei 12°C an das Fragment geknüpft und das Verknüpfungsprodukt dann zur Isolierung eines DNA-Fragmentes auf einem 1gew.-%igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend werden das β-Urogastronfragment und der Vektor in einem molaren Verhältnis von etwa 5 : 1 zusammengegeben und innerhalb von 15 Stunden bei 12°C verknüpft. Nach der Verknüpfung wird der Stamm HB101 mit dem erhaltenen Plasmid transformiert, und die Kolonien werden im Bezug auf Tc^R selektiert.

71 Tc^R-transformierte Kolonien werden erhalten und auf Ap- Empfindlichkeit geprüft. Von 20 Ap^S-Kolonien (28,2%) wird Plasmid-DNA hergestellt und dann auf die Anwesenheit einer MluI-Restriktionsstelle geprüft, um die Insertion des β-Urogastron-Gens zu bestätigen. Fünf dieser 20 Plasmide besitzen die MluI-Schnittstelle des β-Urogastron-Gens. Die DNA wird mit HinfI geschnitten, und die Fragmente werden durch eine 1,5gew.-%ige Agarosegel-Elektrophorese aufgetrennt, um die Orientierung der Insertion zu prüfen. Zwei der Plasmide, nämlich pUG1102 und pUG1105, enthalten das Gen in der richtigen Orientierung.

8-5-b) Herstellung von pUG1004, pUG1201 und pUG1301

Das in 8-5-a) beschriebene Verfahren wird mit PstI, HincII und XmnI anstelle von PvuI wiederholt, wobei pUG1004, pUG1201 und pUG1301, wie in den Fig. 16, 17 und 18 gezeigt, erhalten werden.

9. Betätigung der Expression von β-Urogastron

Die so konstruierten Expressionsplasmide werden zur Transformation der E.-coli-Stämme HB101 oder ECI-2 verwendet. Die Zellen werden nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren kultiviert und dann extrahiert. Zur Bestätigung der Expression wird ein Radioimmunassay durchgeführt.

9-1) Kultur der Rekombinant-Mikroorganismen mit dem β-Urogastron- Gen und Extraktion der Proteine 9-1-a) Expressionssystem unter Verwendung des λP_L-Promotors

Der das Expressionsplasmid pUG103-E enthaltende Stamm ECI-2, sowie der gleiche das Expressionsplasmid pUG117-E enthaltende Stamm werden jeweils bei 25°C in zwei Flaschen, die je einen Liter LB-Kulturmedium enthalten, kultiviert. Wenn die Kultur in einer der Flaschen einen Absorptionswert von 0,3 bis 660 nm erreicht, wird die Kultur durch Erhöhen der Temperatur auf 42°C für 1 Stunde induziert. Die Kultur in der anderen Flasche wird weiter bei 25°C inkubiert, bis die Absorption einen Wert von 0,4 erreicht. Die Zellen jeder Flasche werden dann geerntet, mit PBS-Puffer (137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 8,1 mM zweibasisches Natriumphosphat und 1,5 mM einbasisches Natriumphosphat (pH 7,0)) gewaschen und in PBS-Puffer in 3 Volumenprozent des ursprünglichen Kulturvolumens aufgenommen. Die Zellen werden dann unter Eiskühlung durch Ultraschall aufgeschlossen (100 Watt, 3·30 Sekunden). Der Überstand wird von den Zellresten durch Ultrazentrifugation (40 000 g, 1 Stunde) abgetrennt und gegen eine 0,01 n wäßrige Essigsäurelösung dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert und anschließend in Radioimmunassay (nachstehend als "RIA" bezeichnet) getestet.

91-b) System zur Expression des Fusionsproteins

Der E.-coli-Stamm HB101, der die Plasmide pUG1004, 1301, 2101, 2303 und 2703 enthält, wird bei 37°C in einem Kulturmedium mit 50 µg/ml Tetracyclin vorinkubiert. Dann wird mit dem gleichen Medium auf ein Volumenverhältnis von 1 : 100 verdünnt und kultiviert, bis die Absorption bei 660 nm den Wert von 0,4 erreicht. Die Zellen werden geerntet, mit PBS-Puffer gewaschen, in PBS-Puffer in 3 Volumenprozent des ursprünglichen Kulturvolumens aufgenommen und unter Eiskühlung mit dem vorstehend erwähnten Gerät ultrabeschallt (100 W, 3mal 30 Sekunden). Der Überstand wird von den Zellresten durch Ultrazentrifugation (40 000 g, 1 Stunde) abgetrennt, gegen eine 0,01 N wäßrige Essigsäurelösung dialysiert, lyophilisiert und im RIA getestet.

Um die Anreicherung des Fusionsproteins in Periplasma festzustellen, wird die periplasmatische Fraktion gemäß S. J. Chan et al. (Chan, S. J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 5401-5405 [1981]) hergestellt. Ein Teil der Kultur wird mit frischem E-Kulturmedium (1 Liter einer wäßrigen Lösung von 10 g zweibasischem Kaliumphosphat, 3,5 g Natriumammoniumhydrogenphosphat, 0,2 g Magnesiumsulfat-heptahydrat, 2 g Citronensäure, 2 g Glukose, 0,23 g L-Prolin, 39,5 mg L-Leucin, 16,85 mg Thiamin und 20 mg Tetracyclin-hydrochlorid) auf ein Volumenverhältnis von 1 : 100 verdünnt, dann bei 37°C kultiviert, bis die Absorption bei 660 nm einen Wert von 0,4 erreicht. Die Zellen werden geerntet (6000 UpM, 10 Minuten) und zweimal mit einem Gemisch aus 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 30 mM Natriumchlorid gewaschen. 1 g Zellen werden wieder in 80 ml 20% (w/v) Saccharose-, 30 mM Tris-HCl (pH 8,0) aufgenommen und EDTA bis zu einer Konzentration von 1 mM zur Suspension zugegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten (24°C) auf einem Rundschüttler bei 180 U/min geschüttelt und dann zentrifugiert (13 000 g, 10 Minuten). Die so gewonnenen Zellen werden in 80 ml destilliertem Wasser wieder aufgenommen. Die Suspension wird 10 Minuten in Eis unter gelegentlichem Rühren stehengelassen und dann zentrifugiert (13 000 g, 10 Minuten). Der Überstand wird als periplasmatische Fraktion (O-Sup) bezeichnet, Das Pellet wird in einem Gemisch von 10 mM Tris- HCl (pH 8,0) und 30 mM Natriumchlorid aufgenommen und mit dem vorstehend erwähnten Gerät ultrabeschallt. Dabei wird die cytoplasmatische Fraktion (O-Ppt) erhalten. Diese Proben werden im RIA getestet.

9-2) Radioimmunassay 9-2-a) Aufbau des RIA-Systems

Zur Gewinnung des Antiserums werden Kaninchen mit gereinigtem menschlichem β-Urogastron als Antigen immunisiert. 300 µg β-Urogastron werden in 0,2 ml destilliertem Wasser gelöst, dann werden 1,5 ml einer 50prozentigen Polyvinylpyrrolidonlösung zugegeben, und das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Eine Emulsion aus dem Gemisch und aus 2,0 ml komplettem Freundschen Adjuvans wird subkutan in den Brustbereich von 3 Kaninchen gespritzt. Die Immunisierung wird viermal alle 2 Wochen wiederholt, und dann werden noch einmal 50 µg Antigen intravenös verabreicht. 3 Tage danach wird das Blut geammelt und das Serum abgetrennt.

Die Bedingungen für den RIA-Test werden dann bestimmt im Hinblick auf die Titration zur Bestimmung der Antiserumverdünnung im Test, die Inkubationszeit zur Optimierung der Testbedingungen, das Verfahren zur Abtrennung des gebundenen radioaktiv markierten Antigens (gebunden) vom freien radioaktiv markierten Antigen (frei) und dergl.

Die eingesetzte Verdünnungslösung ist ein Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,4), der 0,5% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA), 140 mM Natriumchlorid und 25 mM Dinatrium-EDTA enthält.

400 µl Verdünnungslösung, 100 µl Probe oder ein Standard von menschlichem Urogastron und 100 µl Antiserum gegen das menschliche β-Urogastron werden zusammengegeben. Nach 24stündiger Inkubation des Gemischs bei 4°C werden 100 µl mit ¹²⁵J- markiertem menschlichem β-Urogastron (etwa 5000 cpm) zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation von 48 Stunden bei 4°C werden 100 µl des zweiten Antikörpers (anti-Kaninchen-γ- Globulin-Ziegenserum, 20fach mit PBS-Puffer verdünnt), 100 µl normales Kaninchenserum (200fach mit PBS-Puffer verdünnt) und 900 µl 10 mM PBS-Puffer mit 5% (w/v) Polyäthylenglykol zugesetzt und noch einmal 3 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Kultur wird 30 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert, der Überstand wird abgetrennt und der Niederschlag gezählt. Der Anteil des immunreaktiven menschlichen β-Urogastrons in der Probe wird aus der Standardkurve, die mit Hilfe des menschlichen β-Urogastronstandards aufgestellt wurde, bestimmt.

9-2-b) Bestätigung der β-Urogastronproduktivität der rekombinanten Mikroorganismen

Tabelle V zeigt die Ergebnisse des RIA-Testes, der mit dem Expressionssystem unter Verwendung des λP_L-Promotors durchgeführt wurde.

Tabelle V

Tabelle VI zeigt die Ergebnisse des RIA-Tests, der mit den Systemen zur Expression des Fusionsproteins durchgeführt wurde.

Tabelle VI
Expressionsplasmid
Produzierte Menge an β-Urogastron
(µg/l Kultur)
pUG1004
729,6
pUG1301	650,7
pUG2101	31,3
pUG2301	125,2
pUG2701	119,2

Tabelle VII zeigt die Lokalisierung des exprimierten Fusionsproteins.

Tabelle VII

Die Tabellen V und VI machen deutlich, daß sowohl das λP_L-Promotor-System zur direkten Expression von β-Urogastron als auch das System zur Expression der Verbindung als Fusionsprotein immunreaktives β-Urogastron in E. coli exprimieren. Tabelle VII zeigt, daß im Falle des Fusionsproteins das exprimierte immunreaktive β-Urogastron fast ausschließlich im Periplasma lokalisiert ist.

Claims (24)

1. β-Urogastron-Gen, gekennzeichnet durch folgende Nucleotid-Sequenz:

2. Untereinheit des Gens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Untereinheit aus der vorderen Hälfte der Nucleotid-Sequenz nach Anspruch 1 besteht und daß diese etwa in der Hälfte geschnitten ist.

3. Untereinheit des Gens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Untereinheit aus der hinteren Hälfte der Nucleotid-Sequenz nach Anspruch 1 besteht, und daß diese etwa in der Hälfte geschnitten ist.

4. Gen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jeweils eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle am Anfang und/oder am Ende des Gens angefügt ist.

5. Gen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle und ein Startcodon stromaufwärts vom Gen und/oder ein Stopcodon und eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle stromabwärts vom Gen besitzt.

6. Gen nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch folgende Nucleotid-Sequenz:

7. Untereinheit des Gens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Untereinheit aus der ersten Hälfte der in Anspruch 6 beschriebenen Nucleotid-Sequenz, die etwa in der Mitte geschnitten wurde, besteht, und daß die Untereinheit eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle am Ende ihrer Sequenz besitzt.

8. Untereinheit nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch folgende Nucleotid-Sequenz:

9. Untereinheit des Gens nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Untereinheit aus der hinteren Hälfte der in Anspruch 6 beschriebenen Nucleotid-Sequenz besteht, die etwa in der Mitte geschnitten wurde, und daß die Untereinheit eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle am Anfang ihrer Sequenz besitzt.

10. Untereinheit nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch die folgende Nucleotid-Sequenz:

11. Rekombinant-Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es das Gen nach Anspruch 6 enthält.

12. Verfahren zur Herstellung des Rekombinant-Plasmids nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Untereinheit nach Anspruch 8 und die Untereinheit nach Anspruch 10 an einer geeigneten Insertionsstelle eines geeigneten Plasmidvektors eingeführt werden.

13. Rekombinant-Plasmid, gekennzeichnet durch einen Plasmidvektor, in den das β-Urogastron-Gen nach Anspruch 6 und stromaufwärts vom β-Urogastron-Gen ein Promotor zur Kontrolle der Genexpression und eine an den Promotor gebundene SD-Sequenz eingeführt sind.

14. Rekombinant-Plasmid, gekennzeichnet durch einen Plasmidvektor, der die Sequenz des vierten und der folgenden Basenpaare des β-Urogastron-Gens nach Anspruch 6 und eine Kombination eines Promotors, einer SD-Sequenz und eines anderen darin stromaufwärts vom β-Urogastron-Gen eingeführten Gens besitzt.

15. Rekombinant-Plasmid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das andere Gen ein β-Lactamase-Gen ist.

16. Rekombinant-Plasmid nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor der λP_L- oder lac- UV5-Promotor ist.

17. Rekombinant-Plasmid nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmidvektor pBR322 ist.

18. Transformante, gekennzeichnet durch eine Wirtszelle, die ein zur Expression des β-Urogastron-Gens nach Anspruch 1 fähiges Rekombinant-Plasmid enthält.

19. Transformante nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Rekombinat-Plasmid nach Anspruch 13 enthält.

20. Transformante nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie das Rekombinant-Plasmid nach Anspruch 14 enthält.

21. Transformante nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle E. coli ist.

22. Transformante nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszelle mit einem Rekombinant-Plasmid mit einem Tc^R-Gen und einem CI857-Gen transformiert worden ist.

23. Verfahren zur Herstellung einer Transformante, dadurch gekennzeichnet, daß eine Wirtszelle mit einem zur Expression des β-Urogastron-Gens nach Anspruch 1 fähigen Rekombinant-Plasmid transformiert wird.

24. Verfahren zur Herstellung von β-Urogastron, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Transformante nach Anspruch 18 züchtet und das exprimierte β-Urogastron isoliert.