DE2848052A1 - Synthetische dna und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
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Description
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GJ-JÜ ΜΟίβΟΗκΝ 40
GJ-JÜ ΜΟίβΟΗκΝ 40
153/243
Genentech, Inc., San Francisco, California/ V.St.A.
Synthetische DNA und Verfahren zu ihrer Herstellung
1. Mikrobielle Rekombinations-Clonbildungsträger aus heterologer
DNA, die den Code für die Expression von Säugerhormon (zum Beispiel Somatostatin) liefert, und anderen Polypeptiden
einschließlich Plasmiden für die Transformation von bakteriellen Wirten. Letzere umfassen ein Regulon,
das zu dem des Wirts in seinem untransformierten Zustand
homolog ist, in Lesephase mit dem Strukturgen für die heterologe DNA.
2. Clonbildungsträger, die den Code für die mikrobielle Expression eines Proteins aus (a) einem Polypeptidhapten
und zusätzlichem Protein von zur übertragung von Immunogenität auf das Produkt der Expression ausreichender
Größe, wobei das Produkt zur Weiterbildung von Antikörpern zum Hapten für Prüfzwecke oder bei der
Herstellung von Vaccinen verwendet werden kann, und (b) einem angestrebten Polypeptidprodukt und zusätzlichem
Protein, von welchem das angestrebte Produkt gespalten v/erden kann, liefern.
3. Verfahren zur Herstellung von synthetischen Strukturgenen, die den Code für die Expression von Säugerpolypeptiden in
mikrobiellen Clonbildungssytemen liefern.
.. & ~
2 ■':',': Ό
Genetische Information befindet sich auf dem Desoxyribonucleinsäure-Doppelstrang
("DNA" oder "Gene") in Form der Reihenfolge, in der der eine spezifische Information, den Code, liefernde
DNA-Strang die charakteristischen Basen seiner sich wiederholenden Nucleotxdbestandteile darbietet. Die "Merkmalsauslösung"
oder "-ausbildung" der spezifischen oder codierten Information zur Bildung von Polypeptiden erfolgt in einem
zweiteiligen Prozeß. Entsprechend den Befehlen bestimmter Regulationsbereiche (Regulationsgene oder "Regulone") im
Gen kann RNA-Polymerase zur Bewegung entlang dem den Code
liefernden Strang veranlaßt werden, wobei Matrizen-RNA
(m-RNA) oder Messenger-RNA (Ribonucleinsäure) in einem als
Transkription oder "Herstellung einer Arbeitskopie" bezeichneten Prozeß gebildet wird. In einer anschließenden Translations
"-Stufe verwandeln die Ribosomen der Zelle in Verbindung mit der im Cytoplasma löslichen Ribonucleinsäure, der t-RNA
oder Transfer-RNA, die Botschaft oder Information der m-RNA in Polypeptide. Zu der Information, die m-RNA von DNA transkribiert,
gehören auch Signale für den Beginn und die Beendigung der Ribosomenübertragung sowie für die Identität und
Sequenz der Aminosäuren, aus denen das Polypeptid besteht. Der codierende DNA-Strang enthält lange Sequenzen von Nucleotid-Tripletts,
die als Codierungseinheiten oder "Codone" bezeichnet werden, weil die charakteristischen Basen der Nucleotide
in jedem einzelnen Triplett oder Codon spezifische Informationsbits zum Code beitragen. Beispielsweise ergeben
3 als ATG (Adenin-Thymin-Guanin) bezeichnete Nucleotide ein m-RNA-Signal, das als "beginne mit der Übertragung" verstanden
wird, während Beendigungscodone TAG, TAA und TGA als "beendige die übertragung"- verstanden werden. Zwischen den
Beginn- und Beendigungscodonen liegen die sogenannten Strukturgene,
deren Codone die schließlich übertragene Aminosäuresequenz bestimmen oder definieren. Diese Definition verläuft
nach dem allgemein gesicherten "genetischen Code" (vgl. z.B. J. D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W. A. Benjamin
Inc., N.Y., 3. Aufl. 1976), der die Codone für die verschiedenen Aminosäuren umschreibt. Der genetische Code ist in dem
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Sinn degeneriert, daß verschiedene Condone die gleiche Aminosäure ergeben können, aber insofern genau als es für jede Aminosäure
ein Codon oder mehrere Codone für diese Säure und keine andere gibt. So beinhalten beispielsweise alle der Codone TTT,
TTC, TTA und TTG, wenn als solche gelesen, die Information für Serin und keine andere Aminosäure. Während der Transkription
muß die richtige Reihenfolge oder der richtige Ableserahmen aufrecht erhalten werden. In diesem Zusammenhang ist zum Beispiel
zu bedenken, was geschieht, wenn die die Arbeitskopie erzeugende RNA-Polymerase verschiedene Basen als den Anfang
eines Codons (unterstrichen) in der Sequenz ....GCTGGTTGTAAG....
liest:
• · · GCT GGT TGT AAG . . . —V . . . Ala-Gly-Cys-Lys . .
... G CTG GTT GTA AG . . . —> ... Leu-Val-Leu . . .
... GC TGG TTG TAA A . . . —^ ... Trp-Leu-(STOP).
Das schließlich erzeugte Polypeptid hängt dann in ausschlaggebender
Weise von der räumlichen Beziehung des Strukturgens zu dem Regulon ab.
Ein besseres Verständnis des Prozesses der genetischen Expression oder Merkmalsausbildung soll durch die Definition bestimmter
Genbestandteile gefördert werden:
Operon - ein Gen aus Strukturgen oder -genen für die PoIypeptidsynthese
und dem Regulationsbereich ("Regulon"), der diese Synthese regelt.
Promoter - ein Gen innerhalb des Regulons, womit RNA-Polymerase
eine Verbindung zum Beginn der Transkription eingehen muß.
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ID-
Operator - ein Gen, mit dem Repressorprotein eine Verbindung
eingeht und dadurch die Bindung von RNA-Polymerase an dem
benachbarten Promoter verhindert.
Induktor - eine Substanz, die Repressorprotein entaktiviert,
indem sie den Operator freisetzt und eine Verbindung der RNA-Polymerase mit dem Promoter ermöglicht und damit den
Beginn der Transkription einleitet.
Catabolitaktivatorprotein ("CAP")-Bindungsstelle - ein Gen,
das zyklisches Adenosinmonophosphat("c AMP")- vermitteltes
CAP bindet und üblicherweise gleichfalls für die Einleitung der m-Trankription erforderlich ist. Die CAP-Bindungsstelle
kann in besonderen Fällen unnötig sein. Beispielsweise beseitigt eine Promotermutation in dem Laktoseoperon des
Phagen /L plac UV5 die Notwendigkeit von cAMP und CAP für
die Expression; J. Beckwith et al, J. Mol. Biol. 69,
ISS-16O (1972).
Promoter-Qperator-System - wie hier gebraucht, ein brauchbarer
Regelbereich eines Operon hinsichtlich des Vorhandenseins oder Fehlens einer CAP-Bindungsstelle oder der Fähigkeit,
Information für Repressorproteinexpression zu liefern.
Zur Definition und für den Gebrauch in der nachfolgenden Erörterung von Rekombinations-DNA werden noch folgende
Begriffe erläutert:
Clonbildungsträger - nicht aus Chromosomen stammende doppelsträngige
DNA enthaltend ein intaktes "Replicon", so daß der Träger verdoppelt wird, wenn es durch einen Prozeß
der "Transformation" in einen einzelligen Organismus ("Mikrobe") eingebracht wird. Ein so transformierter
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Organismus wird als "Transformant" bezeichnet.
Plasmid - für die vorliegenden Zwecke ein Clonbildungsträger,
der aus Viren oder Bakterien stammt, wobei es sich bei den letzteren um "bakterielle Plasmide" handelt.
Komplementärität - durch die Basensequenzen von DNA-Einzelsträngen,
die die Bildung von doppelsträngiger DNA durch Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen auf den
betreffenden Strängen ermöglichen, übertragene Eigenschaft. Adenin (A) paßt komplementär zu Thymin (T), während Guanin
(G) komplementär zu Cytosin (C) ist.
Die Fortschritte auf dem Gebiet der Biochemie in den letzten Jahren haben zu der Konstruktion von "Rekombinat.ions"-Clonbildungsträgern
geführt, worin beispielsweise Plasmide, die exogene DNA enthalten, gebildet werden. In besonderen Fällen
kann der Rekombinationspartner "heterologe" DNA enthalten, worunter DNA verstanden wird, die Informationen für Polypeptide
liefert, die normalerweise von dem Organismus nicht erzeugt werden, der einer Transformation durch den Rekombinationsträger
zugänglich ist. So werden Plasmide unter Bildung von linearer DNA mit verbindbaren Enden oder Termini
gespalten. Diese werden mit einem exogenen Gen mit verbindbaren Termini unter Bildung einer biologisch funktionsfähigen
Gruppe mit einem intakten Replicon und einer angestrebten phänotypischen Eigenschaft verbunden. Die. Rekombinationsgruppe wird durch Transformation in einen Mikroorganismus
eingebracht, und Transformanten werden isoliert und mit dem Ziel zur Clonbildung gebracht, große Populationen zu erhalten, die
zur Expression der neuen genetischen Information fähig sind.
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-■ ORIGINAL INSPECTED
-j<r- 2 6-'>-■ 3'b 2
Methoden und Mittel zur Ausbildung von Rekombinationsclonbildungsträgern
und zur Transformation von Organismen mit denselben sind in der Literatur ausführlich beschrieben, vgl. z.B.
H. L. Heynecker et al, Nature 263, 748-752 (1976); Cohen et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 69, 2110 (1972); ibid., 70, 1293
(1973); ibid., 7O, 3240 (1973); ibid., 71, 1030 (1974); Morrow et al, Proc. Nat. Acad. Sei, USA 71, 1743 (1974); Novick,
Bacteriological Rev., 33, 210 (1969); Hershfield et al, Proc. Soc. Nat. Acad. Sei. USA 71, 3455 (1974) and Jackson et al,
ibid. 69, 2904 (1972). Eine verallgemeinerte Darstellung dieses Gegenstands gibt S. Cohen in Scientific American 233, 24
(1975). Außerdem wird auf den DTV-Atlas zur Biologie, 2. Auflage,
Deutscher Taschenbuchverlag, München, 1968, Nachr. Chem. Tech. Lab. 26, 349 (1978) und die dort genannten Literaturstellen,
Molekular-Biologie, Umschau-Verlag Frankfurt a. M., 1967, Pflanzenphysiologie von Dieter Hess, VTB, E. Ulmer GmbH Stuttgart,
1976 und Grundlagen der Biochemie, Otto Müller, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1978, verwiesen. Alle diese Veröffentlichungen
bilden Teil der vorliegenden Beschreibung.
Es gibt verschiedene bekannte Arbeitsweisen für die DNA-Rekombination,
wobei aneinander angrenzende Enden einzelner DNA-Bruchstücke oder Fragmente auf die eine oder andere Weise
zur Erleichterung der Bindung zugeschnitten werden. Der Ausdruck Bindung oder Verbindung bezieht sich auf die Ausbildung
von Phosphodiester-Bindungen zwischen angrenzenden Nucleotiden, meist mit Hilfe des Enzyms T4-DNA-Ligase. So können unempfindliche
Enden direkt miteinander verbunden werden. Fragmente mit komplementären Einzelsträngen an ihren angrenzenden Enden können
stattdessen aber auch durch Wasserstoffbindung aktiviert werden,
die die jeweiligen Enden für eine anschließende Verbindung in eine geeignete Lage bringt. Solche Einzelstränge, die als Bindeenden
oder Cohäsivtermini bezeichnet werden, können durch das Anfügen von Nucleotiden an unempfindliche Enden unter Verwendung
von terminaler Transferase und manchmal einfach durch
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Abzwicken eines Strangs eines unempfindlichen Endes mit einem
Enzym, wie /V-Exonuclease, ausgebildet werden. Wiederum kann
man sich, und dies ist das üblichste, Restriktionsendonucleasen bedienen, die Phosphodiesterbindungen in und um bestimmte
Sequenzen von Nucleotiden mit einer Länge von etwa 4 bis 6 Basenpaaren spalten. Viele Restrxktxonsendonucleasen
und ihre Erkennungsstellen sind bekannt, wobei die sogenannte EcoRI-Endonuclease die am häufigsten angewandte ist. Restrxktxonsendonucleasen,
die doppelsträngige DNA bei rotationssymmetrischen "Palindromen" spalten, lassen Cohäsivtermini zurück.
Somit kann ein Plasmid oder ein anderer Clonbildungsträger
unter Bildung von Termini gespalten werden, die jeweils die Hälfte der Erkennungsstellen der Restriktionsendonuclease
aufweisen. Ein mit der gleichen Restriktionsendonuclease erhaltenes Spaltprodukt von exogener DNA weist zu den Plasmidtermini
komplementäre Enden auf. Wie weiter unten noch gezeigt, kann synthetische DNA mit Cohäsivtermini stattdessen
auch für den Einbau in den gespaltenen Träger vorgesehen werden. Zur Unterdrückung der Wiedervereinigung der Cohäsivtermini
des Trägers während der Einfügung von exogener DNA können die Termini mit alkalischer Phosphatase aufgeschlossen werden, was
zu einer Molekularselektion von Enden für den Einbau des exogenen Fragments führt. Der Einbau eines Fragments mit einer
bezüglich anderer Merkmale des Trägers richtigen Orientierung kann eine Unterstützung erfahren, wenn sich das Fragment auf
Träger-DNA befindet, die durch zwei verschiedene Restriktionsendonucleasen
herausgeschnitten worden ist und selbst Termini aufweist, die jeweils die Hälfte der Erkennungssequenz der verschiedenen
Endonucleasen darstellen.
Weitgespannte Bemühungen auf dem Gebiet der Rekombinations-DNA-Forschung
in den letzten Jahren haben nur zu wenigen Ergebnissen geführt, die sich direkt praktisch verwerten lassen. Dies hat
sich besonders im Fall mißglückter Versuche gezeigt, durch •"synthetische DNA" codierte Polypeptide und dergleichen auszu-
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bilden, unabhängig davon, ob die synthetische DNA in üblicher Weise Nucleotid um Nucleotid aufgebaut oder durch Rücktranskription
aus isolierter in-RNA (komplementäre oder "cDNA") erhalten worden ist. In dieser Beschreibung wird angegeben,
was allem Anschein nach die erste Expression eines funktioneilen Polypeptidprodukts aus einem synthetischen Gen darstellt,
wobei auch damit zusammenhängende Entwicklungen mitgeteilt werden, die allgemeinere Anwendbarkeit verheißen. Das
Produkt, auf das Bezug genommen wird, ist Somatostatin (US-PS 3 904 594) , ein Inhibitor der Sekretion von Wachstumshormon,
Insulin und Glucagon, dessen Wirkungen seine Anwendung bei der Behandlung von Acromegalie, akuter Pankreatitis und von insulinabhängigem
Diabetes begründen (vgl,, R. Guillemin et al, Annual
Rev. Med. 27, 379, 1976). Das Somatostatinmodell läßt eindeutig
die Anwendbarkeit der hier beschriebenen neuen Entwicklungen auf mehreren wichtigen Gebieten erkennen, wie dies auch aus den
beigefügten Zeichnungen und der weiteren Beschreibung hervorgeht.
Die beigefügten Zeichnungen erläutern Zusammenhänge, in welchen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung Anwendung
finden, d.h. die Expression des Hormons Somatostatin durch bakterielle Transformanten mit Rekombinationsplasmiden, sowie
die Erzeugung von Humaninsulin.
Figur 1
Schematische Darstellung des Prozesses; Das durch chemische
DNA-Synthese hergestellte Gen für Somatostatin wird an das ß-Galactosidase-Gen von E. coli auf dem Plasmid pBR322 angelagert.
Nach Transformation in E. coli dirigiert das Rekombinationsplasmid
die Synthese eines Vorläuferproteins, das in vitro durch Bromcyan spezifisch an den Methioninresten unter
Bildung von aktivem Säugerpolypeptxdhormon gespalten werden kann. Mit A, T, C und G werden die charakteristischen Basen
(Adenin, Thymin, Cytosin und Guanin) der Desoxyrxbonucleotide in dem codierenden Strang des Somatostatingens bezeichnet.
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Figur 2
Schematische Struktur eines synthetischen Gens, dessen Codierstrang
(d.h. der "obere" Strang) Codone für die Aminosäuresequenz von Somatostatin (wie angegeben) aufweist.
Figur 3
Schematische Erläuterung der bevorzugten Methode zum Aufbau von Nucleotidtrimeren, die zum Aufbau von synthetischen Genen
eingesetzt werden. Bei der angewandten üblichen Bezeichnung für die Darstellung von Nucleotiden in Figur 3 befindet sich
das 5'-0H links und das 3'-0H rechts, zum Beispiel
HO.
OH
Figur 4
Fließschema für den Aufbau eines Rekombxnationsplasmids (zum Beispiel pS0M11-3), das zur Ausbildung eines Somatostatin
("SOM") enthaltenden Proteins fähig ist, ausgehend von dem Stammplasmid pBR322. Das ungefähre Molekulargewicht eines jeden
Plasmids wird in Dalton ("d") angegeben. Ap bzw. Tc bezeichnen
Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz, und Tc bedeutet Tetracyclinempfindlichkeit infolge der Herausnahme
eines Teils des Tc -Gens. Die Verhältnisse der Orte der verschiedenen, für Restriktionsendonuclease spezifischen Spaltstellen
auf den Plasmiden zueinander sind angegeben (zum Beispiel EcoRI, Baml, etc.).
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Es sind die Nucleotidsequenzen der Schlüsselteile von zwei Plasmiden dargestellt sowie die Richtung der Messenger-RNA-("itiRNA")-Transkription,
die stets von dem 5'-Ende des Codierstrangs ausgeht. Die Restriktionsendonuclease-Substratstellen sind wie dargestellt. Jede wiedergegebene Sequenz enthält
sowohl die Steuerelemente des Iac-(Lactose)-Operons, als auch Codone zur Expression der Aminosäuresequenz von Somatostatin
(kursiv). Die Aminosäuresequenzzahlen für ß-Galactosidase
("ß-gal") stehen in Klammern.
Wie weiter unten noch näher ausgeführt, sind in diesen Figuren die Ergebnisse vergleichender Radxoxmunprüfungsversuche
dargestellt, die die Somatostatinaktivität des durch die Rekombinationsplasmide
ausgebildeten Produkts zeigen.
Figur 9
Schematische Struktur von synthetischen Genen, deren codierende Stränge Codone für die Aminosäuresequenz des A- und B-Strangs
von Humaninsulin aufweisen.
Figur 10
Fließschema für den Aufbau eines Rekombinationsplasmids, das
zur Expression der.B-Kette von Humaninsulin fähig ist.
1. Herstellung von Genen, die den Code für heterolöge
Polypeptide liefern
Den Code für ein beliebiges Polypeptide mit bekannter Aminosäuresequenz
liefernde DNA kann durch Auswahl der Codone nach dem genetischen Code hergestellt werden. Zur Erleichterung
der Reinigung und dergleichen werden Oligodesoxyribonucleotidfragmente aus beispielsweise etwa 11 bis 16 Nucleotiden gesondert
zubereitet und dann in der gewünschten Reihenfolge
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angeordnet. Man bereitet also erste und zweite Reihen von Oligodesoxyribonucleotidfragmenten von zweckmäßiger Größe.
Die Verbindung der ersten Reihen in der richtigen Sequenz führt zu einem DNA-Codierstrang zur Polypeptidexpression
(vergleiche z. B. Figur 2, Fragmente A, B7 C und D). Die
zweiten Reihen führen nach entsprechender Verbindung in der richtigen Reihenfolge zu einem Strang, der zu dem
Codierstrang komplementär ist (zum Beispiel Figur 2, Fragmente E, F, G und H). Die Fragmente der jeweiligen Stränge
überlappen vorzugsweise derart, daß die Komplementarität ihre Selbstanordnung über Wasserstoffbindung der Cohäsivtermini
von Fragmentblöcken begünstigt. Nach dieser Anordnung bzw. diesem Aufbau wird das Strukturgen durch Verbinden oder Verknüpfen
in der üblichen Weise fertiggestellt.
Die Degeneration oder Entartung des genetischen Codes ermöglichst beträchtliche Freiheit bei der Wahl von Codonen
für eine gegebene Aminosäuresequenz. Für die erfindungsgemäßen
Zwecke wird jedoch die Codonwahl durch drei Überlegungen erleichtert. Erstens werden Codone und Fragmente ausgewählt,
und die Zusammenstellung der Fragmente erfolgt stufenweise, um eine unzulässige Komplementarität der Fragmente
untereinander zu vermeiden, abgesehen von den Fragmenten, die in dem angestrebten Gen nebeneinander liegen. Zweitens
werden an AT-Basenpaaren (z. B. etwa fünf oder mehr) reiche Sequenzen vermieden, insbesondere, wenn ihnen eine an GC-Basenpaaren
reiche Sequenz vorangeht, wodurch eine vorzeitige Beendigung der Transkription vermieden wird. Drittens besteht
wenigstens ein größerer Teil der gewählten Codone aus solchen, die für die Expression von mikrobiellen Genomen (vgl. zum
Beispiel W. Fiers, et al, Nature 260, 500, 1976) bevorzugt sind.
Als für die Expression von mikrobiellen Genomen bevorzugte Codone werden die folgenden bezeichnet:
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Bevorzugte Bedeutung von | Stellung C |
(von links A |
Codonen | dritte Stellung (3'-Ende) (von oben nach unten) |
|
erste Stellung (5'-Ende) (von oben nach unten) |
zweite T |
... | ._. | nach rechts) G |
T |
phe | ser | tyr | cys | C | |
T | phe | Stop | A | ||
leu | ser | Stop | Stop | G | |
pro | his | trp | T | ||
leu | pro | his | arg | C | |
leu | pro | gin | arg | A | |
leu | pro | gin | G | ||
C | thr | asn | T | ||
ile | thr | asn | C | ||
ile | ser | A | |||
thr | lys | G | |||
A | met (Start) |
ala | asp | — — _ | T |
val | asp | gly | C | ||
val | glu | A | |||
val | ala | glu | G | ||
G | val | : | |||
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Im Fall von Somatastin am stärksten bevorzugt sind folgende Aminosäure-(Codon)-beziehungen des Strukturgens: gly (GGT);
cys (TGT); lys (AAG; trp (TGG); ala (GCT, GCG); asn (AAT,
AAC); phe (TTC, TTT); thr (ACT, ACG); und ser (TCC, TCG).
Wenn das Strukturgen eines angestrebten Polypeptide in einen
Clonbldungsträger zur Expression als solches eingeführt werden soll, wird dem Gen ein "Start"-Codon (zum Beispiel ATG) vorangestellt,
und ihm folgen unmittelbar ein oder mehrere Beendigungs- oder Stop-Codone (vergleiche Figur 2). Die Aminosäuresequenz
eines bestimmten Polypeptids kann jedoch, wie unten beschrieben, mit weiterem Protein ausgebildet werden, das ihr
vorangeht und/oder folgt. Wenn der Verwendungszweck des Polypeptids Spaltung des weiteren Proteins erfordert, werden entsprechende
Spaltstellen neben der Polypeptid-weiteres Protein-Codon-Bindung eincodiert. So ist beispielsweise in Figur 1
das Produkt der Expression ein Vorläufer-Protein aus Somatostatin und dem größten Teil des ß-Galactosidase-Polypeptids.
In diesem Fall ist ATG zum Codieren für den Start der Translation nicht erforderlich, weil die Ribosomenkonstruktion des
zusätzlichen ß-gal-Proteins das Somatostatxnstrukturgen durchliest.
Der Einbau des ATG-Signals ergibt jedoch den Code für
die Erzeugung von Methionin, eine Aminosäure, die durch Bromcyan spezifisch gespalten wird, woraus sich eine einfache Methode
zur Umwandlung von Vorläuferprotein in das erstrebte Polypeptid ergibt.
Figur 2 erläutert ein weiteres bevorzugtes Merkmal für heterologe DNA, die zur Rekombination verwendet werden soll,
d.h. daß Cohäsivtermini vorgesehen sind, die vorzugsweise einen der beiden Stränge einer Restriktionsendonuclease-Erkennungsshelle
umfassen. Aus den oben erörterten Gründen werden die Termini vorzugsweise dazu bestimmt, nach Rekombination
einzelne verschiedene Erkennungsstellen hervorzurufen.
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Nachdem die beschriebenen Entwicklungen als in Verbindung mit dem Somatostatinmodell erfolgreich verlaufend nachgewiesen
wurden, wird anerkannt werden, daß eine heterologe DNA-Codierung für praktisch jede bekannte Aminosäuresequenz
mutatis mutandis angewandt werden kann. So sind die beschriebenen und noch zu beschreibenden Arbeitsweisen mutatis mutandis
auf die Erzeugung von Polyaminosäuren, wie Polyleucin
und Polyalanin, Enzymen, Serumproteinen und analgetischen
Polypeptiden, wie ß-Endorphinen anwendbar, die Schmerzschwellen ect. beeiflussen können. Die erzeugten Polypeptide
sind vorzugsweise als solche Säugerhormone oder Zwischenprodukte dafür. Zu solchen Hormonen gehören u. a. Somatostatin,
Humaninsulin, Human- und Rinderwachstumshormon, Iuteinisierendes
Hormon, ACTH und Pankreaspolypeptid. Zu den Zwischenprodukten gehören u. a. Humanvorproinsulin, Humanproinsulin
und die A- und B-Ketten von Humaninsulin. Außer in vitro hergestellter DNA kann die heterologe DNA cDNA enthalten,
die bei der Rücktranskription von mRNA gebildet wird, vergleiche z. B. Ullrich et al, Science 196, 1313, 1977.
2. Rekombinationsstoffe mit einem Code für die Expression
von Vorläuferprotein
Bei dem in Figur 1 schematisch dargestellten Prozeß liefert die Expression ein Vorläuferprotein, das durch ein spezifisches
heterologes Strukturgen (Somatostatin) codiertes Polypeptid und außerdem Protein (das einen Teil des ß-Galactosidaseenzyms
enthält) umfaßt. Eine selektive Spaltstelle neben der Somatostatin-Aminosäuresequenz
ermöglich eine nachfolgende Abtrennung des angestrebten Polypeptids von überflüssigem Protein.
Der erläuterte Fall ist für eine große Gruppe von Arbeitsweisen repräsentativ, die durch die Erfindung erschlossen
worden sind.
In den meisten Fällen wird die Spaltung außerhalb der replikativen
Umgebung des Plasmids oder anderen Trägers, beispielsweise nach Gewinnung der mikrobiellen Kultur bewirkt. Auf
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diese Weise kann eine temporäre Konjugation von kleinen Polypeptiden
mit überflüssigem Protein erstere, zum Beispiel gegen einen in vivo erfolgenden Abbau durch endogene Enzyme,
schützen» Gleichzeitig bringt das zusätzliche Protein gewöhnlich das angestrebte=Polypeptid um seine Bioaktivität während
der extracellulären Spaltung, wodurch die biologische Gefahrlosigkeit des Vorgangs erhöht wird. In besonderen Fällen
ist es natürlich zweckmäßig, die Spaltung innerhalb der Zelle zu bewirken. Beispielsweise können mit DNA mit einem
Code für Enzyme, die Insulinvorläufer in die aktive Form überführen, Clonbildungsträger ausgebildet werden, die mit
einer anderen DNA mit einem Code für die Expression der Vorläuferform zusammenarbeiten.
In einem bevorzugten Fall fehlen dem bestimmten angestrebten Polypeptid innere Spaltstellen entsprechend demjenigen, das zum
Abwerfen von überflüssigem Protein verwendet wird, doch können, wie ohne weiteres ersichtlich, auch dann, wenn diese Bedingung
nicht erfüllt ist, konkurrierende Reaktionen das angestrebte Produkt liefern, wenn auch in geringerer Ausbeute. Wenn das angestrebte
Produkt methioninfrei sein soll, dann erweist sich eine Bromcyanspaltung beim Methionin neben der angestrebten Sequenz
als hoch wirksam. In entsprechender Weise können arginin- und lysinfreie Produkte, zum Beispiel mit Trypsin oder Chymotrypsin
bei arg-arg, lys-lys oder ähnlichen Spaltstellen neben der
angestrebten Sequenz enzymatisch gespalten werden. Falls bei der Spaltung beispielsweise unerwünschtes Arginin an das angestrebte
Produkt gebunden bleibt, kann es durch CarboxypeptidaseaufSchluß
entfernt werden. Bei Verwendung von Trypsin zur Spaltung bei arg-arg können Lysinstellen innerhalb des angestrebten
Polypeptids vorher geschützt werden, beispielsweise mit Maleinsäure- oder Citraconsäureanhydrid. Die beispielsweise erörterten
Spaltarbeitsweisen sind lediglich repräsentative Varianten der vielen verschiedenen Möglichkeiten, die für den Fachmann
aufgrund der hier angegebenen Lehre offensichtlich sind.
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c4 J52
Abspaltbares Protein kann am C- oder N-Ende eines bestimmten Polypeptids oder sogar innerhalb des Polypeptids selbst ausgebildet
werden, wie dies bei der Einschlußsequenz, durch die sich Proinsulin und Insulin voneinander unterscheiden, der
Fall ist. Wiederum kann der verwendete Träger den Code für die. Expression von Protein mit sich wiederholenden Sequenzen
des angestrebten Polypeptids liefern, die jeweils durch selektive Spaltstellen voneinander getrennt sind. Es ist jedoch
besonders bevorzugt, wenn Codone für überflüssiges Protein vor dem Strukturgen des angestrebten Produkts übertragen werden,
wie bei dem in den Figuren erläuterten Fall. In allen Fällen soll für die Aufrechterhaltung des passenden Ableserahmens
in Bezug auf das Regulon gesorgt werden.
3. Expression von Iitimumogenen
Die Fähigkeit, sowohl ein spezifisches Polypeptid als auch überflüssiges Protein auszubilden, ergibt ein brauchbares
Mittel für die Erzeugung von immunogenen Substanzen. PoIypeptid-"Haptene"
(d.h. Substanzen, die spezifisch durch Antikörper und ähnliche Stoffe gebundene Determinanten enthalten,
aber gewöhnlich zu klein sind, um eine Immunwirkung hervorzurufen)
können als Konjugate mit zusätzlichem Protein ausreichender
Größe für eine Immunogenität ausgebildet werden. Das ß-gal-Somatostatin-Konjugat, dessen Herstellung hierin
beschrieben ist, ist tatsächlich von immunogener Größe und kann deshalb Antikörper erzeugen, die das Somatostatinhapten
binden. Proteine mit mehr als 100 Aminosäuren, meist mit mehr als 200 Aminosäuren, zeigen immunogenen Charakter.
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Wie vorstehend beschrieben hergestellte Konjugate können zur
Bildung von Antikörpern verwendet werden, die sich in Radioimmun- oder anderen Prüfungen auf das Hapten und auch für die
Erzeugung von Vaccinen eignen. Im folgenden wird ein Beispiel für die letztgenannte Anwendung gegeben. Bromcyan- oder andere
Spaltprodukte von viralem Mantelprotein ergeben Oligopeptide,
die sich an Antikörper binden, der selbst zu dem Protein wird. Erhält sie die Aminosäuresequenz eines solchen
Oligopeptidhaptens, kann daher heterologe DNA als Konjugat mit weiterem Protein ausgebildet werden, das Immunogenität
beisteuert. Solche Konjugate können als Vaccinen verwendet
werden, die geringere Nebenwirkungen zeigen, als sie mit der Verwendung von Mantelprotein selbst zur Erzielung von Immunität
verbunden sind.
4. Die Kontrollelemente
In Figur 1 ist ein Prozeß dargestellt, bei welchem ein Transformantorganismus
ein Polypeptidprodukt aus heterologer DNA ausbildet, die unter die Kontrolle eines Regulons "homolog" zu dem
Organismus in seinem nicht umgewandelten oder untransformierten Zustand gebracht worden ist. Chromosomen-DNA von lactoseabhängigem
E. coli enthält als ein Lactose- oder "lac"-Operon, das den LactoseaufSchluß
u.a. durch Bildung des Enzyms ß-Galactosidase vermittelt. In dem erläuterten Fall werden die lac-Kontrollelemente
aus einem Bakteriophagen, λ_ plac 5, erhalten, der für E. coli
infektiös ist. Das lac-Operon des Phagen war seinerseits durch überführung aus der gleichen bakteriellen Species erhalten worden,
daher die "Homologie". Homologe Regulone, die sich zur Verwendung in dem beschriebenen Verfahren eignen, können stattdessen
auch aus für den Organismus nativer Plasmid-DNA stammen.
Die Einfachheit und Wirksamkeit des lac-Promoter-Operator-Systems
begründen seine Verwendung in dem beschriebenen System genauso wie seine Fähigkeit, von IPTG (Isopropylthio-ß-D-galactosid)
induziert zu werden. Selbstverständlich können
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284-JQ52
auch andere Operone oder Teile davon verwendet werden, zum
Beispiel A. -Promoter-Operator, Arabinose-Operon (phi 80 dara)
oder die Colicin El-, Galactose-, alkalische Phosphatase- oder
Tryptophan-Operone. Aus dem letzteren, (d. h. "Tryp-Operon")
stammende Promoter-Operatoren können 100-proζentige Repression
während der Induktion (mit Indolacrylsäure) und Gewinnung vermitteln.
5. Plasmidaufbau, allgemein
Die Einzelheiten des in Figur 4 schematisch erläuterten Prozesses ergeben sich aus dem weiter unten folgenden experimentellen
Teil. Bei diesem Punkt ist es jedoch von Nutzen, einige der zum Aufbau des Rekombinationsplasmids der bevorzugten Ausführungsform
angewandten Arbeitsweisen kurz zu erörtern.
Bei der Clonbildung und Expression des synthetischen Somatostatingens
werden zwei Plasmide verwendet. Jedes Plasmid hat eine EcoRI-Substrat-Stelle bei einem anderen Bereich des ß-Galactosidase-Strukturgens
(vgl. Figur 4 und 5). Die Einfügung des synthetischen Somatostation-DNA-Fragments in die EcoRI-Stellen
dieser Plasmide bringt die Expression der genetischen Information in das Fragment ein, das sich unter der Kontrolle der
lac-Op'eron-Kontrollelemente befindet. Nach der Einfügung des
Somatostatinfragments in diese Plasmide sollte die Translation zu einem Somatostatinpolypeptid führen, dem entweder 10 Aminosäuren
(pS0M1) oder praktisch die gesamte ß-Galactosidase-üntereinheitsstruktur
(pS0M11-3) vorangestellt ist.
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284cü52
Das Schema des Plasmidaufbaus beginnt mit dem Plasmid pBR322,
einem wohldefinierten Clonbildungsträger. Die Einführung der
lac-Elemente in dieses Plasmid erfolgt durch Einfügung eines
Haelll-Restriktions-Endonucleasefragments (203 Nucleotide),
das den Iac-Promoter, die CÄP-Bindungsstelle, den Operator,
die Ribosomenbindungsstelle und die ersten 7 Aminosäurecodone
des ß-Galactosidase-Strukturgens aufweist. Das Haelll-Fragment
stammt aus A- plac5 DNA. Das EcoRI-gespaltene pBR322-"Plasmid,
dessen Termini mit T4 DNA-Polymersase und Desoxyribonucleotidtriphosphaten
wieder hergestellt worden waren, wird stumpfendig mit dem Haelll-Fragment verbunden, wodurch EcoRI-Termini
an den Einfügungspunkten erzeugt werden. Durch Verbinden dieser Haelll- und wiederhergestellten EcoRI-Termini werden die
EcoRI-Restriktionsstellen (vergleiche Figur 4 und 5) an jedem
Terminus erzeugt. Transformanten von E. coli RR1 mit dieser DNA werden auf einem 5-Brom-4-chlor-incolylgalactosid-(X-gal)-Madium
auf Resistenz gegen Tetracyclin (Tc) und Ampicillin (Ap) selektioniert. Auf diesem Indikatormedium können Kolonien,
die für die Synthese von ß-Galactosidase aufgrund der erhöhten Anzahl von lac-Operatoren, die Repressor titrieren,
verantwortlich sind, durch ihre blaue Farbe identifiziert werden. Zwei Orientierungen des Haelll-Fragments sind möglich,
aber sie werden aufgrund der asymmetrischen Lage einer Hha-Restriktionsstelle in dem Fragment unterschieden. Das
Plasmid pBH10 wird weiter modifiziert, wodurch die zu dem lac-Operator(pB20) distale EcoRI-Endonuclease-Stelle eliminiert
wird.
Die acht chemisch synthetisierten Oligodesoxyrxbonucleotide
32 (Figur 2) werden an den 5'-Termini mit f_ P/~gamma-ATP durch
Polynucleotidkinase markiert und mit T4 DNA-Lignase verbunden.
Durch Wasserstoffbindung zwischen den überlappenden Fragmenten erfolgt eine Selbstanordnung des Somatostatingens und schließlich
eine Polymerisation zu großen Molekülen infolge der cohäsiven Restriktionsstellentermini. Die Ligaturprodukte werden
mit EcoRI-BamHI-Restrxktionsendonucleasen behandelt, wodurch
das Somatostatingen, wie in Figur 2 dargestellt, erzeugt wird.
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Das synthetische Somatostatingenfragment mit EcoRI- und
Baml-Termini wird an das pBH20-Plasmid gebunden, das mit den
EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonucleasen und alkalischer Phosphatase vorbehandelt worden ist. Die Behandlung mit alkalischer
Phosphatase führt zu einer Molekularselektion von Plasmiden mit dem eingefügten Fragment. Mit dieser gebundenen
DNA erhaltene ampicillinresistente Transformanten werden hinsichtlich
Tetracyclinempfindlichkeit aussortiert, und mehrere werden bezüglich der Einfügung eines EcoRI-BamHI-Fragments
passender Größe untersucht.
Beide Stränge der EcoRI-BamHI-Fragmente von Plasmiden aus
zwei Clonen werden einer Nucleotxdsequenzanalyse, beginnend mit den BamHI- und EcoRI-Stellen, unterworfen. Die Sequenzanalyse
wird bis in die lac-Regelelemente ausgedehnt. Die
lac-Fragmentsequenz erweist sich als intakt, und in einem Fall werden die Nucleotidsequenzen pSOM1 beider Stränge unabhängig
voneinander bestimmt, wobei jede die in Figur 5A angegebene Sequenz ergibt.
Das EcoRI-Pst-Fragment des pSOM1-Plasmids mit dem lac-regelnden
Element wird entfernt und durch das EcoRI-Pst-Fragment von pBR322 ersetzt, wodurch das Plasmid pSOM11 erzeugt wird.
Das EcoRI-Fragment von/Vplac , das den lac-Operonkontrollbereich
und den größten Teil des ß-Galactosidase-Strukturgens aufweist, wird in die EcoRI-Stelle von pSOM11 eingefügt. Zwei
Orientierungen des EcoRI-lac-Fragments von A. plac sind zu
erwarten. Eine davon würde den richtigen Ableserahmen bis in das Somatostatingen hinein behalten und die andere nicht. Die
Analyse von für sich allein isolierten Clonen auf Somatostatin aktivität ergibt dann Clone, die das richtig orientierte Gen
enthalten, und einer dieser Clone wird als pSOM11-3 bezeichnet.
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,ORlGlMAL INSPECTED
6. Der Mikroorganismus
Als mögliche Organismen für die Transformation sind verschiedene einzellige Mikroorganismen vorgeschlagen worden, beispielsweise
Bakterien, Fungi und Algen. Dabei handelt es sich um solche einzelligen Organismen, die in Kulturen oder durch
Fermentation gezüchtet werden können. Bakterien sind größtenteils die für das Arbeiten damit am besten geeigneten Organanismen.
Zu einer Transformation zugänglichen Bakterien gehören Enterobacteriaceae, zum Beispiel Stämme von Escherichia coli
und Salmonella; Bacillaceae, wie Bacillus subtitis; Pneumococcus; Streptococcus und Haemophilus influenzae.
Der für die im folgenden beschriebenen experimentellen Arbeiten gewählte Organismus ist E. coli, Stamm RR1, Genotyp:
Pro Leu Thi Rn Mn rec A Str Lac y . E. coli RR1 wird aus
Jd Jd
E. coli HB101 (H. W. Boyer et al, J. Mol. Biol. (1969) 41,
459-472) durch Paarung mit E. coli K12 Stamm KL16 als Hfr-Donor,
vgl. J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972) /Kulturen von Coli RR1
und E. Coli RR1 (pBR322) sind bei der American Type Culture
Collection ohne irgendwelche Beschränkung hinsichtlich der Zugänglichkeit hinterlegt worden und haben die ATCC-Nummern
3/343 und 3/344 erhalten/.
Der Somatostatin erzeugende Organismus ist gleichfalls hinterlegt worden (ATCCNr. 31447).
Im Fall von Humaninsulin werden A- und B-Ketten-Gene in E. coli K-12 Stamm 294 (Ende A, thi", hsr~, hsm,+), ATCC Nr. 31446 ge-
κ.
clont, und dieser Organismus wird zur Expression der A-Kette
E. coli K-12 Stamm 294 /pIAV, ATCC Nr.31448 verwendet. Die
B-Kette von Humaninsulin wird zuerst in einem Derivat von HB101, d. h. E. coli K-12 Stamm D1210, ein lac+ (X0O+Z^+),
ausgebildet, und dieser B-Gen enthaltender Organismus ist gleichfalls hinterlegt worden (ATCC Nr. 31449). Das B-Gen
kann aber auch in den zuerst genannten Organismus, d. h. Stamm 294, eingeführt und davon ausgebildet werden.
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26£' 052
Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung weiter erläutert.
Beispiel 1 I. Somatostatin
1. Aufbau von Somatostatingenfragmenten
Zuerst werden acht Oligodesoxyribinucleotide, die in Figur 2
mit A bis H bezeichnet sind, nach der modifizierten Triestermethode
von K. Itakura et al, J. Am. Chem. Soco 97, 7327 (1975)
aufgebaut. Im Fall der Fragmente C, E und H wird jedoch eine verbesserte Arbeitsweise angewandt, wobei zunächst vollständig
geschützte Trimere als Grundeinheiten für den Aufbau längerer Oligodesoxyribonucleotxde hergestellt werden. Die verbessserte
Arbeitsweise ist schematisch in Figur 3 dargestellt, worin B Thymin, N-benzoyliertes Adenin, N-benzoyliertes Cytosin oder
N-isobutyraliertes Guanin bedeutet. Unter Bezugnahme auf Figur 3 verläuft mit einem Überschuß von I (2 mmolar) die Kupplungsreaktion II (1 mmolar) mit Hilfe eines starken Kupplungsreagens
2, 4, 6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid (TPSTe, 4 mmolar; 2)
in 60 Minuten nahezu vollständig. Nach Entfernung der 5'-Schutzgruppe
mit einer 2-prozentigen Benzolsulfonsäurelösung kann das
5'-Hydroxydimere V durch einfache Lösungsmittelextraktion mit
wäßriger NaHCO3-Lösung in CHCl von einem Überschuß des 3'-Phosphodiestermonomeren
IV abgetrennt werden. Der vollständig geschützte Trimerblock wird danach aus dem 5'-Hydroxydimeren V,
I (2 mmolar) und TPSTe (4 mmolar) hergestellt und durch Chromatographie an Kieselgel nach B. T. Hunt et al, Chem. and Ind.
1868 (1967) isoliert. Die Ausbeuten der nach der verbesserten Arbeitsweise hergestellten Trimeren sind in Tabelle II angegeben.
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284.052
Tabelle II
Sequenz
TTT
TTT
GGA
AGA
ATC
CCT
ACA
ACC
CGT
Ausbeute
81 %
75 %
41 %
49 %
71 %
61 %
63 %
65 %
51 % Sequenz
ATG
GCC
CCA
CAA
TTA
CAT
CCC
AAC
GAT
Ausbeute 69 % 61 % 72 %
72 % 71 % 52 %
73 %
59 %
60 %
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28Λ.
Die acht Oligodesoxyribonucleotxde werden nach der Entfernung aller
Schutzgruppen durch Hochdruckflüssigchromatographie an Permaphase AAX (R.A. Henry et al J. Chrom. Sei. II, 358 (1973)) gereinigt.
Die Reinheit jedes Oligomeren wird durch Homochromatographie an Dünnschicht-DEAE-Cellulose und auch durch Gelelektrophorese
in 20-prozentiger Acrylamidplatte nach Markieren der Oligomeren
32
mit /gamma- IP/-ATP in Gegenwart von Polynucleotid-Kinase kontrolliert.
Aus jedem DNA-Fragment wird ein markiertes Hauptprodukt erhalten.
2. Verknüpfung und Acrylamidgelanalyse von Somatostatin-DNA
Die 5'-OH-Termini der chemisch synthetisierten Fragmente A
bis H werden getrennt mit T4-Polynucleotid-Kinase phosphory-
32
liert. Zur Phosphorylierung wird / P_/-gamma-ATP verwendet, wodurch die Reaktionsprodukte autoradiographisch verfolgt werden können, obwohl, wie ersichtlich, auch unmarkiertes ATP verwendet werden kann, wenn eine Autoradiographie weggelassen wird.
liert. Zur Phosphorylierung wird / P_/-gamma-ATP verwendet, wodurch die Reaktionsprodukte autoradiographisch verfolgt werden können, obwohl, wie ersichtlich, auch unmarkiertes ATP verwendet werden kann, wenn eine Autoradiographie weggelassen wird.
32
Unmittelbar vor der Kinasereaktion werden 25 uCi /_gamma- P/ATP
(etwa 1500 Ci/mmolar) (Maxam and Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sei.
USA, 74, 1507 (1977)) in 0,5 ml Eppendorf-Rohren zur Trockne
eingedampft. 5 Mikrogramm Fragment werden mit zwei Einheiten T4-DNA-Kinase (Hydroxylapatitfraktion, 2500 Einheiten/ml;
27) in 70 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl31. 5 mm Dithiothreitol
in einem Gesamtvolumen von 150 μΐ 20 Minuten bei 37 0C inkubiert.
Zur Gewährleistung maximaler Phosphorylierung der Fragmente für Verknüpfungszwecke werden 10 μΐ einer Mischung aus
70 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl-/ 5 mm Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und zwei Einheiten DNÄ-Kinase zugegeben, und
die Inkubation noch weitere 20 Minuten bei 7 0C fortgesetzt.
Die Fragmente (250 ng/μΐ) werden ohne v/eitere Behandlung bei
-20 °C aufgehoben. Jeweils 1,25 μg der mit Kinase versehenen
Fragmente A, B, E und F werden in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ in 20 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl2, 10 mm Dithiothreitol,
0,5 mm ATP und 2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Hydroxylapatitfraktion, 4OO Einheiten/ml; 27) während 16 Stunden bei 4 0C
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28/..
verknüpft. Die Fragmente C, D, G und H werden unter vergleichbaren
Bedingungen verknüpft. Proben von jeweils 2 ml werden zur Analyse durch Elektrophorese auf einem 10-prozentigen PoIyacrylamidgel
und anschließend durch Autoradiographie (H. L. Heyneker et al, Nature 263, 748 (1976) entnommen, wobei
nicht umgesetzte DNA-Fragmente durch rasch wanderndes Material dargestellt werden und die monomere Form der verknüpften Fragmente
mit Bromphenolblau (BPB) wandert. Aufgrund der kohäsiven Enden der verknüpften Fragmente A, B, E und F sowie der verknüpften
Fragmente C, D, G und H erfolgt auch eine gewisse Dimerisierung. Diese Dimeren stellen das am langsamsten wandernde
Material dar und können durch Restriktionsendonuclease Eco RI bzw. Bam HI gespalten werden. Die zwei Halbmoleküle
(verknüpftes A + B + E + F und verknüpftes C + D + G + H) werden in einer weiteren Verknüpfungsstufe verbunden, die
16 Stunden bei 4 0C in einem Endvolumen von 150 μΐ durchgeführt
wird. Zur Analyse wird 1 Mikroliter entnommen. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten auf 65 0C erwärmt, wodurch die
T4-DNA-Ligase entaktiviert wird. Die Wärmebehandlung hat auf das Wanderungsbild der DNA-Mischung keinen Einfluß. Dem Reaktionsgemisch
wird für die Spaltung der multimeren Formen der Somatostatin-DNA in 30 Minuten bei 37 ° ausreichende Restriktionsendonuclease
BairiHI zugesetzt. Nach Zugabe von NaCl auf
100 mMol wird die DNA mit EcoRI-Endonuclease aufgeschlossen.
Der RestriktxonsendonucleaseaufSchluß wird durch Phenol-Chloroform-
Extraktion der DNA beendet. Das Somatostatin-DNA-Fragment wird durch präparative Elektrophorese auf einem 10-prozentigen
Polyacrylamidgel von nichtumgesetzten und teilweise verknüpften DNA-Fragmenten befreit. Die das Somatostatin-DNA-Fragment
enthaltende Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA wird durch Zerschneiden des Gels in kleine Stücke
und Extraktion mit Elutionspuffer (0,5 m Ammoniumacetat, 10 mm MgCl2, 0,1 mm EDTA, 0,1 % SDS) über Nacht bei 26 0C
eluiert. Die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol gefällt, zentrifugiert, in 200 μΐ 10 mm Tris-HCl pH 7,6 wieder gelöst und
gegen den gleichen Puffer dialysiert, wodurch eine Somatostatin-DNA-Konzentration
von 4 μg/ml erhalten wird.
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3. Aufbau von Rekombinationspiasmiden
In Figur 4 ist schematisch die Art und Weise dargestellt, in der das Somatostatingen enthaltende Rekombinationsplastimde
aufgebaut werden, weshalb in Verbindung mit der folgenden Erörterung darauf Bezug genommen wird.
A. Das Stammplasmid pBR 322
Das für die experimentelle Somatostatinclonbildung gewählte
Plasmid ist pBR322, ein kleines Plasmid (Molekulargewicht etwa 2,6 Megadalton) mit gegen die Antibiotika Ampicillin (Ap)
und Tetracyclin (Tc) resistenten Genen. Wie in Figur 4 angegeben, weist das ampicillinresistente Gen eine Spaltstelle
für die Restriktionsendonuclease Pst I und das tetracyclinresistente Gen eine entsprechende Stelle für Restriktionsendonuclease
Bam HI auf, und eine Eco RI-Stelle befindet sich zwischen den Apr und TCr-Genen. Das Plasmid pBR322 stammt aus
pBR313, einem 5,8 Megadalton AprTcrColimm-Plasmid (R. L. Rodriquez
et al, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology
5, 471-77 (1976), R. L. Rodriques et al, Construction and Characterization of Cloning Vehicles, in Molecular Mechanisms
in the Control of Gene Expression, S. 471-77, Academic Press, Inc. (1976) . Das Plasmid pBR322 und die Art seiner Gewinnung
sind ausführlich in F. Bolivar et al, "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning
System", Gene (November 1977) beschrieben.
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- w- 284c 052
B. Aufbau des Plasmids pBH1O
5 Mikrogramm Plasmid pBR322-DNA werden mit 10 Einheiten
der Restriktionsendonuclease EcoRI in 100 millimolarer Tris-HCl
pH 7,6, 100 millimolarem NaCl, 6 millimolarem MgCl2 bei 37 0C
30 Minuten lang aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch Phenol-Chloroform-Extraktion
beendet; die DNA wird dann mit 2 1/2 Volumina Ethanol gefällt und in 50 μΐ T4 DNA Polymerase-Puffer
wieder suspendiert (67 mm Tris-HCl pH 8,8, 6,7 mm MgCl2, 16,6 mm
(NH4J9SO4, 167 μg/ml Rinderserumalbumin, je 50 μπι der einzelnen
^E £ TE
dNTP; A. Panet et al, Biochem. 12, 5045 (1973)). Die Reaktion
wird durch Zugabe von zwei Einheiten T4 DNA-Polymerase eingeleitet.
Nach 30 Minuten langem Inkubieren bei 37 0C wird die Reaktion durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion der DNA beendet,
worauf mit Ethanol gefällt wird. 3 Mikrogramm Λ. plac DNA
(Shapiro et al Nature 224, 768 (1969)) werden 1 Stunde bei 37 0C mit dem Restriktionsenzym Haelll (3 Einheiten) in
6 mm Tris-HCl pH 7,6, 6 mm MgCl2, 6 mm ß-Mercaptoethanol in
einem Gesamtvolumen von 20 μΐ aufgeschlossen. Die Reaktion
wird durch 10 Minuten langes Erwärmen auf 65 0C abgebrochen.
Die pBR322-behandelte DNA wird mit der Haelll-aufgeschlossenen
/\. plac -DNA vermischt und in einem Gesamtvolumen von 30 ml mit
1,2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Hydroxylapatitfraktion; A. Panet et al, supra) in 20 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl-, 10 mm
Dithiothreitol, 0,5 mm ATP in 12 Stunden bei 12 0C stumpfendig
verknüpft. Die verknüpfte DNA-Mischung wird gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert und zur Transformation von E. coli
Stamm RRl verwendet. Transformanten werden hinsichtlich Tetracyclin-
und Ampicillin-Resistenz auf Minimalmediumplatten ausgewählt, die 40 μg/ml S-Brom^-chlor-incolylgalactosid- (X-gal) Medium
(J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York, 1972) enthalten. Zur Synthese von
ß-Galactosidase fähige Kolonien werden durch ihre blaue Farbe identifiziert. Nach der Durchsicht von 45 unabhängig voneinander
isolierten blauen Kolonien erweisen sich drei davon als zwei EcoRI-Stellen enthaltende Plasmid-ENA, die durch
etwa 200 Basenpaare voneindaner getrennt sind. Die Lage eines
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asymmetrisch angeordneten Hhal-Fragments in dem HaeIII-lac-Kontrollfragment,
b.p. 203, (W. Gilbert et al, in Protein-Ligand Interactions, H. Sand und G. Blauer, Herausgeber (De
Gruyter, Berlin (1975) S. 193-210) ermöglicht die Bestimmung der Orientierung des Haelll-Fragments, nun ein EcoRI-Fragment,
in diesen Plasmiden. Es zeigt sich, daß das Plasmid pBH10 das Fragment in der angestrebten Orientierung trägt, d. h. die
Iac-Transkription geht in das Tcr Gen des Plasmids ein=
C. Aufbau des Plasmids pBH20
Plasmid pBH10 wird dann modifiziert, um die zu dem iac-Operator
distale EcoRI-Stelle zu eliminieren. Dies wird durch die bevorzugt
verlaufende EcoRI-Endonucleasespaltung an der distalen Seite unter teilweisem Schutz durch RNA-Polymerase der anderen
EcoRI-Stelle bewirkt, die sich zwischen dem Tcr- und dem lac-Promoter
befindet, zwischen denen nur etwa 40 Basenpaare angeordnet sind. 5 μg DNA werden nach Bindung der RKFA-Polymerase
mit einer Einheit EcoRI in einem Gesamtvolumen von 10 μΐ
10 Minuten bei 37 0C aufgeschlossen. Die Reaktion wird durch
10 Minuten langes Erwärmen auf 65 0G abgebrochen. Die EcoRI-Cohäsivtermini
werden mit SI Nuclease in 25 mm Na-acetat pH 4,5, 300 mm NaCl, 1 mm ZnCl3 5 Minuten lang bei 25 0C aufgeschlossen.
Die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA bis 10 mm und Tr is-HCl pH 8 (bis 50 mm) abgebrochen. Die DNA wird mit Phenol-Chloroform
extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 100 μΐ T4-DNA-Verknüpfungspuffer wieder suspendiert. Nach Zugabe
von 1 μΐ T4 DNA-Ligase wird die Mischung 12 Stunden bei 12 0C
inkubiert. Die verknüpfte DNA wird in Ξ. coli Stamm RR1
transformiert und Ap Tc -Transformanten werden auf X-gal-Antibiotikummedium
selektioniert. Durch Restriktionsenzymanalyse von DNA aus 10 isolierten blauen Kolonien ergibt sich,
daß diese Clone Plasmid-DNA mit einer EcoRI-Stelle enthalten.
Sieben dieser Kolonien haben die EcoRI-Stelle, die sich zwischen dem Iac- und Tcr-Promotor befindet, behalten. Die Nucleotidsequenz
von der EcoRI-Stelle bis in den lac-Regelbereich eines dieser Plasmide, pBH20, wird bestätigt gefunden. Dieses
Plasmid wird dann zur Clonbildung des Somatostatingens verwendet.
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_ 29-- ^ ^ '■■ -; -' 5 2
D. Aufbau von Plasmid pSOM 1
20 Mikrogramm Plasmid pBH20 werden mit Restriktionsendonuclease
EcoRI und BamHI in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ vollständig
aufgeschlossen. Nach Zugabe von bakterieller alkalischer Phosphatase (0,1 Einheit von Worthington BAPF) wird die Inkubation
1O Minuten bei 65 0C fortgesetzt. Die Reaktion wird
durch Phenol-Chloroform-Extraktion beendet, und die DNA wird mit 2 Volumen Ethanol gefällt, zentrifugiert und in 50 μΐ
10 mm Tris-HCl pH 7,6, 1 mm EDTA gelöst. Die alkalische Phosphatasebehandlung verhindert mit guter Wirkung eine
Selbstverknüpfung der EcoRI-BamHI-behandelten pBH20-DNA,
aber kreisförmige Rekombinationsplasmide, die Somatostatin-DNA enthalten, können auch nach Verknüpfung noch ausgebildet
werden. Da E. coli RRl durch linerare Plasmid-DNA nur mit sehr
geringer Wirksamkeit transformiert wird, enthält der größte Teil der Transformanten Rekombinationsplasmide. 50 Mikroliter Somatostatin-DNA
(4 μg/Inl) werden mit 25 ml der BamHI-EcoRI alkalische
Phosphatase-behandelter pBH20 DNA in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ, enthaltend 20 mm Tris-HCl pH 7,6, 10 mm MgCl2, 10 mm
Dithiothreitol, 0,5 mm ATP und 4 Einheiten T4 DNA-Ligase bei 22 0C verknüpft. Nach 10, 20 und 30 Minuten werden dem Reaktionsgemisch
weitere 40 ng Somtostatin-DNA zugesetzt (die allmähliche Zugabe von Somatostatin-DNA kann die Verknüpfung
mit dem Plasmid anstelle einer Selbstverknüpfung begünstigen). Die Verknüpfungsreaktion wird noch 1 Stunde fortgesetzt, worauf
die Mischung gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6 dialysiert wird. Bei einem Vergleichsversuch wird BamHI-, EcoRI-, alkalische Phosphadase-behandete
pBH20-DNA unter vergleichbaren Bedingungen, aber in Abwesenheit von Somatostatin DNA verknüpft. Beide Präparate
werden ohne weitere Behandlung zum Transformieren von E. coli RRl verwendet. Die Transformationsversuche werden in einem
P3-physikalischen Behältergerät National Institutes of Health, USA, Recombinant DNA Research Guidelines, 1976)
durchgeführt. Transformanten werden auf Platten aus Minimalmedium , das 20 μg/ml Ap und 40 μg/ml X-gal enthält, selektioniert.
Es werden 10 Transformanten, von denen alle Tc-empfindlich
sind, isoliert. Zur Bezugnahme werden sie als pS0M1, pS0M2,
284üO52
etc. ... pSOM 10 bezeichnet. Bei dem Vergleichsversuch werden
keine Transformanten erhalten. Vier der 10 Transformanten enthalten
Plasmide mit sowohl einer EcoRI- als auch einer BamHI-Stelle.
Die Größe des kleinen EcoRI,BamHI-Fragments dieser Rekombxnatxonsplasmxde ist in allen 4 Fällen der Größe der
in vitro hergestellten Somatostatin-DNA vergleichbar. Basensequenzanalyse
nach Maxam und Gilbert Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74,
560 (1977) ergibt, daß das Plasmid pS0M1 das gewünschte Somatostatin-DNA-Fragment
als Einfügung enthält.
Die DNA-Sequenanalyse des Clons mit Plasmid pS0M1 läßt erwarten,
daß damit ein Somatostatin enthaltendes Peptid erzeugt wird.
Somatostatinradioimmumaktivität läßt sich jedoch in.Extrakten
von Zellkörnern oder überstehenden Kulturflüssigkeiten nicht nachweisen. Die Gegenwart von Somatostatin läßt sich auch nicht
nachweisen, wenn die wachsende Kultur direkt zu 70-prozentiger Ameisensäure und Bromcyan gegeben wird. Es ist beobachtet worden,
daß E. coli RRl-Extrakte exogenes Somatostatin sehr rasch abbauen.
Das Fehlen von Somatostatinaktivitat in Clonen, die Plasmid pS0M1
enthalten, kann sehr wohl eine Folge eines intracellulären Abbaus durch endogene proteolytische Enzyme sein. Plasmid pSOM 1 wird
daher zum Aufbau eines Plasmids verwendet, das den Code für ein Vorläuferprotein liefert, das Somatostatin enthält und groß
genug ist, um einem proteolytischen Abbau zu wiederstehen.
E. Der Aufbau der Plasmide pSOM 11 und pSOM 11-3
Es wird ein Plasmid aufgebaut, worin das Somatostatingen am
C-Terminus des ß-Galactosidasegens angeordnet werden kann, das die Translation in Phase hält. Das Vorhandensein einer
EcoRI-Stelle nahe dem C-Terminus dieses Gens und die verfügbare
Aminosäuresequenz dieses Proteins (B. Polisky et al, Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 73, 3900 (1976), A.V. Fowler et al,
ibid 74, 1507 (1976), A.I.Bukhari et al, Nature New Biology 243, 238 (1973) und K.E. Langley, J. Biol. Chem. 250, 2587
(1975)) ermöglichen die Einführung des EcoRI, BamHI-Somatostatingens
in die EcoRI-Stelle unter Aufrechterhaltung des richtigen
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284
48052
Iieserahmens. Zum Aufbau eines solchen Plasmids werden 50 μg
pSOMI-DNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Psti in einem
Gesamtvolumen von 100 μΐ aufgeschlossen. Ein präparatives
5-prozentiges Polyacrylamidgel wird zur Abtrennung des großen Pst-EcoRI-Fragments verwendet, das das Somatostatingen des
kleinen Fragments mit den lac-Regelelementen aufweist. Die
große Bande wird aus dem Gel ausgeschnitten, und die DNA wird
durch Aufteilen des Gels in kleine Stücke und Extraktion bei
65 "C über Nacht eluiert. In vergleichbarer Weise werden 50 μg
des Plasmids pBR322 DNA mit Pstl- und EcoRI-Restruktionsendonuclease
aufgeschlossen, und die beiden erhaltenen DNA-Fragmente werden durch präparative Elektrophorse auf einem 5-prozentigen
Polyacrylamidgel gereinigt. Das kleine Pstl-EcoRI-Fragment von
pBR322 (1 μg) wird mit dem großen Pstl-EcoRI-DNA-Fragment
(5 μg} aus pSOMT in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ mit einer
Einheit T4-DNA-Ligase in 12 Stunden bei 12 0C verknüpft. Das
Verknüpfungsgemisch wird zum Transformieren von E. coli RRI verwendet, und Transformanten werden auf X-gal-Medium auf
Ampicillinresistenz selektioniert. Erwartungsgemäß ergeben nahezu alle der Apr-Transformanten (95 %) weiße Kolonien
(kein lac-Operator) auf X-gal-Indikatorplatten. Das erhaltene
Plasmid, pSOMi1, wird für den Aufbau des Plasmids pS0M11-3
verwendet. Eine Mischung aus 5 μg pS0Mi1-DNA und 5 μg
c -DNA wird mit 10 Einheiten EcoRI 30 Minuten bei
37 0C aufgeschlossen. Der RestriktionsendonucleaseaufSchluß
wird durch Pheno!-Chloroform-Extraktion beendet. Die DNA wird
dann mit Ethanol gefällt und in 50 μΐ T4-DNA-Ligase-Puffer
erneut suspendiert. Eine Einheit T4-DNA-Ligase wird zu der Mischung gegeben, worauf 12 Stunden bei 12 0C inkubiert wird.
Die Verknüpfungsmischung wird gegen 10 mm Tris-HCl pH 7,6
dialysiert und zum Transformieren von E. coli, Stamm RRl, verwendet.
Transformanten werden auf X-gal-Platten, die Ampicillin
enthalten, auf Apr selektioniert und auf wesentliche ß-Galactosidaseerzeugung
ausgelesen. Etwa 2 % der Kolonien sind blau (pSOMH-1, 11-2 etc.). Restriktionsenzymanalyse von
aus diesen Clonen erhaltener Plasmid-DNA ergibt, daß alle
Plasmide ein neues EcoRI-Fragment von etwa 4,4 Megadalton
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aufweisen, das die Iac-Operon-Regelsteilen und den größten Teil
des ß-Galactosidasegens aufweist. Da zwei Orientierungen des EcoRI-Fragments möglich sind, wird die asymmetrische Lage einer
Hindlll-Restrictionsstelle dazu benutzt festzustellen, welche
dieser Kolonien dieses EcoRI-Fragments mit fortschreitender lac-Transkription bis in das Somatostatingen aufweist.Hindlll-BamHI-DoppelaufSchlüsse
zeigen, daß nur die Clone, die die Plasmide pSOM11-3, pSOMH-5, pSOM11-6 und pSOMH-7 aufweisen,
das EcoRI-Fragment in dieser Orientierung enthalten.
4. Radioimmumprüfung auf Somatostatinaktivität
Die standartisierte Radioimmumprüfung (RIA); auf Somatostatin
(A. Arimura et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975))
wird durch Verringerung des Prüfvolumens und durch Verwendung
11
von Phosphatpuffer modifiziert. Tyr -Somatostatin wird unter
Anwendung einer Chloramin-T-Arbeitsweise (ibid.) iodiert. Für
die Prüfung auf Somatostatin wird die Probe, gewöhnlich in 70-prozentiger Ameisensäure, die 5 mg/ml Bromcyan enthält,
in einem konischen Polypropylenrohr (Q, 7 mlf Sarstedt) über
feuchtem KOH im Vakuum getrocknet. Nach Zugabe von 20 Mikroliter
PBSA-Puffer (75 mm NaCl; 75 mm Natriumphosphat, pH 7,2?
1 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,2 mg/ml Natriumazid) werden
125
40 μΐ eines / J/-Somatostatin-nCocktailsir und 20 yd. einer 1000-fachen Verdünnung von Kaninchenantisomatostatxnimmunserum S39 (VaIe et al, Metabolism 25, 1491 (1976)) in PBSA zugegeben. Der /125J/-Somatostatin-Cocktail enthält je Milliliter PBSA-Puffer 250 μg normales Kaninchen-gamma-Globulin (Antibodies r Inc.), 1500 Einheiten Proteaseinhibitor ("Trasylol", Calbioehem.) und ca. 100 000 Zählungen / J/Tyr -Somatostatin. Nach wenigstens 16 Stunden bei Zimmertemperatur werden O,333 ml Ziegen-Antikaninchen-gamma-Globulin (Antibodies, Inc-, P=O-,03) in PBSA-Puffer zu den Proberöhrchen gegeben. Die Mischung wird
40 μΐ eines / J/-Somatostatin-nCocktailsir und 20 yd. einer 1000-fachen Verdünnung von Kaninchenantisomatostatxnimmunserum S39 (VaIe et al, Metabolism 25, 1491 (1976)) in PBSA zugegeben. Der /125J/-Somatostatin-Cocktail enthält je Milliliter PBSA-Puffer 250 μg normales Kaninchen-gamma-Globulin (Antibodies r Inc.), 1500 Einheiten Proteaseinhibitor ("Trasylol", Calbioehem.) und ca. 100 000 Zählungen / J/Tyr -Somatostatin. Nach wenigstens 16 Stunden bei Zimmertemperatur werden O,333 ml Ziegen-Antikaninchen-gamma-Globulin (Antibodies, Inc-, P=O-,03) in PBSA-Puffer zu den Proberöhrchen gegeben. Die Mischung wird
2 Stunden bei 37 0C inkubiert, auf 5 °C abgekühlt und dann bei
10 000 χ g 5 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit
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wird entfernt, und das Korn wird in einem gamma-Zähler gezählt.
Mit der verwendeten Menge an Antiserum werden 20 % der Zählungen ohne unmarkiertes konkurrierendes Somatostatin gefällt. Der
Hintergrund mit unendlichem Somatostatin (200 ng) macht gewöhnlich 3 % aus. Die Hälfte der maximalen Konkurrenz wird mit 10 pg
Somatostatin erhalten. Vor/versuche mit Extrakten von E. coli
Stamm RRl (Empfängerstamm) ergaben, daß weniger als 10 pg Somatostatin in Gegenwart von 16 μg oder mehr bromcyanbehandeltem
bakteriellen Protein ohne weiteres erkennbar sind. Mehr als 2 μg Protein aus mit Ameisensäure behandelten bakteriellen
Extrakten wirken sich durch Verstärkung des Hintergrunds etwas störend aus, aber diese Störung wird durch Bromcyanspaltung
weitgehend kompensiert. Rekonstruktionsversuche zeigen, daß Somatostatin in mit Bromcyan behandelten Extrakten stabil
ist.
A. Konkurrenz durch bakterielle Extrakte
Die Stämme E. coli RRl (pS0M11-5) und E. coli RRl (pS0M11-4)
werden in Luria-Brühe bei 37 0C bis 5 χ 10 Zellen/ml gezüchtet.
Nach Zugabe von IPTG bis auf 1 mm wird die Züchtung noch 2 Stunden fortgesetzt. Aliquote Anteile von je 1 ml werden in einer
Eppendorf-Zentrifuge einige Sekunden zentrifugiert, und die Körner werden in 500 μΐ 70-prozentiger Ameisensäure, die
5 mg/ml Bromcyan enthält, suspendiert. Nach etwa 24 Stunden bei Zimmertemperatur werden die aliquoten Anteile mit Wasser
auf das 1O-fache verdünnt, und die in Figur 6 angegebenen
Volumina werden dreimal auf Somatostatin geprüft. In Figur 6 bedeutet "B/B " das Verhältnis von in Gegenwart
° 125
der Probe gebundenem /_ J/-Somastostatin zu dem in Abwesenheit
von konkurrierendem Somatostatin gebundenem. Jeder Punkt entspricht dem Durchschnitt von drei Rohren. Der Proteingehalt
der unverdünnten Proben wird mit 2,2 mg/ml für E. coli RRl (pS0M11-5) und mit 1,5 mg/ml für E. coli RRl
(pSOM-4) bestimmt.
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1 284^052
B. Das Auslesen von pSOMI1-Clonen auf Somatostatin
Wie oben in Verbindung mit Figur 6 beschrieben werden mit
Bromcyan behandelte Extrakte von 11 Clonen (pSOMII-2,
pSOMH-3, etc.) hergestellt. Dreimal 30 Mikroliter jedes
Extrakts werden zur Radioimmunprüfung entnommen, deren Ergebnisse in Figur 7 erscheinen. Der Bereich der Prüfpunkte
ist angegeben. Die Werte für picogramm Somatostatin sind von einer Standardkurve abgelesen, die als Teil des gleichen
Versuchs erhalten wurde.
Die oben angegebenen Ergebnisse der Radioimmunprüfung können folgendermaßen zusammengefaßt werden: Im Gegensatz zu den Ergebnissen
der Versuche mit pSOMI zeigen vier Clone (pSOM11-3,
11-5, 11-6 und 11-7) ohne weiteres nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität
(Figuren 6 und 7). Restriktionsfragmentanalyse
ergibt, daß pSOM11-3, pSOM11-5, pSOM11-6 und pSOM11-7
die gewünschte Orientierung des lac-Operon aufweisen, wohingegen pSOMi1-2 und 11-4 die entgegengesetzte Orientierung zeigen.
Es besteht somit eine einwandfreie Beziehung zwischen der richtigen Orientierung des lac-Operon und der Erzeugung von Somatostatin-Radioimmunaktivität.
C. Wirkungen von IPTG-Induktion und CNBr-Spaltunq auf positive und negative Clone
Die Ausgestaltung des Somatostatinplasmids läßt darauf schließen, daß die Synthese von Somatostatin unter der Kontrolle des lac-Operon
steht. Das Iac-Repressorgen ist nicht in dem Plasmid
enthalten, und der Empfänger- oder Rezipientenstamm (E. coli RRl) enthält das Wildtyp-Chromosomen-lac-Repressorgen, das nur
10 bis 20 Repressormoleküle je Zelle (15) erzeugt. Die Anzahl der Plasmidkopien (und damit die Anzahl an lac-Operatoren) beläuft
sich auf etwa 20 bis 30 pro Zelle, so daß eine vollständige Repression unmöglich ist. Wie aus der folgenden Tabelle III
hervorgeht, wird die Aktivität von Somatostatin in E. coli RRl
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(pSOMH-3) durch IPTG, einem Induktor des lac-Operons, erhöht.
Wie erwartet ist der Grad der Induktion gering und liegt zwischen dem 2,4- bis 7-fachen. Im Versuch 7 (Tabelle III) wird U."Aktivität,
ein Maß der ersten 92 Aminosäuren von ß-Galactosidase gleichfalls um einen Faktor von 2 induziert. In mehreren Versuchen kann
eine nachweisbare Somatostatinradioimmunaktivität vor der Bromcyanspaltung des gesamten cellularen Proteins nicht festgestellt
werden. Da das bei der Radioimmunprüfung verwendete Antiserum S 39 ein freies N-terminales Alanin erfordert, ist
vor der Bromcyanspaltung eine Aktivität nicht zu erwarten.
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Tabelle III
Somatostatinradioimmunaktivltät
LB = Luriabrühe
IPTG = Isopropylthiogalactosid
CNBr = Bromcyan
SS = Soinatostatin
Protein wird nach der Methode von Bradford, Anal. Biochem. 72,
248 (1976) bestimmt.
IPTG CNBr
Versuch Stamm Medium 1 rnmolar 5 mg/ml pg SS/^g Protein
Versuch Stamm Medium 1 rnmolar 5 mg/ml pg SS/^g Protein
< 0,1 12
< 0,4 15 12
61 8
< 0,1 71 62
250 320
< 0,1 24 10
1 | 11-2 | LB + | + |
11-3 | LB + | + | |
11-4 | LB + | + | |
11-5 | LB + | + | |
2 | 11-3 | LB + | + |
11-3 | LB + | - | |
3 | 11-3 | LB + | + |
11-3 | LB | + | |
11-3 | LB + | - | |
4 | 11-3 | LB + | + |
11-3 | VB + Glycerin*+ | + | |
5 | 11-3 | LB + Glycerin + | + |
6 | 11-3 | LB + | + |
11-2 | LB + | + | |
7 | 11-3 | LB + | + |
11-3 | LB | + |
*Vogel-Bonner-Minimalmedium plus Glycerin
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D. Gelfiltration von mit Bromcyan behandelten Extrakten
Mit Ameisensäure und Bromcyan behandelte Extrakte der positiven Clone (pSOM 11-3, 11-5, 11-6 und 11-7) werden vereinigt,
(Gesamtvolumen 250 μΐ), getrocknet und in 0,1 ml 50-prozentiger
Essigsäure wieder suspendiert. Nach Zugabe von /_ H/Leucin wird
die Probe auf eine 0,7 χ 47 cm-Säule aus Sephadex G-50 in 50-prozentiger Essigsäure aufgebracht. Aliquote Anteile von
jeweils 50 Mikroliter der Kolonnenfraktionen werden auf Somatostatin geprüft. Vereinigte negative Clonextrakte (11-2, 11-4
und 11-11) werden genauso behandelt. Die Ergebnisse sind der Figur 8 zu entnehmen. Auf der gleichen Säule wird bekanntes
Somatostatin (Beckman Corp.) wie angegeben (SS) eluiert. In diesem System wird Somatostatin von ausgeschlossenen großen
Peptiden und vollständig eingeschlossenen kleinen Molekülen gut getrennt. Nur Extrakte von für Somatostatin positiven
Clonen zeigen Radioimmunaktivität in den Säulenfraktionen, und diese Aktivität wird in der gleichen Position
wie chemisch synthetisiertes Somatostatin eluiert.
Die Daten für den Beweis der Synthese eines Polypeptids mit der Somatostatxnamxnosauresequenz sind wie folgt zusammenzufassen:
(1) Somatostatinradioimmunaktivität liegt vor in E. coli-Zellen
mit dem Plasmid pS0M11-3, das ein Somatostatingen mit
erwiesener richtiger Sequenz enthält und die richtige Orientierung des lac-EcoRI-DNA-Fragments hat. Zellen mit dem verwandten
Plasmid pSOM11-2, das das gleiche Somatostatingen enthält, aber
eine entgegengesetzte Orientierung des lac-EcoRI-Fragments hat, erzeugen keine nachweisbare Somatostatinaktivität.
(2) Wie aufgrund des Gesaltungsschemas vorherzusehen, ist bis zur Bromcyanbehandlung des Zellextrakts eine nachweisbare
Somtostatxnradioimmunaktxvität nicht zu beobachten.
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(3) Die Somatostatinaktivität steht unter der Kontrolle des
lac-Operons, was durch Induktion durch IPTG, einen Induktor des
lac-Operons, nachgewiesen wird.
(4) Die Somatostatinaktivität ergibt auf Sephadex G-50 ein gemeinsames Chromatogramm mit bekanntem Somatostatin.
(5) Die DNA-Sequenz des geclonten Somatostatingens ist richtig.
Wenn die Translation nicht in Phase ist, wird ein Peptid gebildet, das sich in jeder Stellung von Somatostatin unterscheidet.
Es wird eine Radioimmunaktivität festgestellt, die anzeigt, daß ein dem Somatostatin nahestehendes Peptid gebildet
worden ist, und die Translation muß in Phase sein. Da Translation in Phase erfolgt, bestimmt der genetische Code, daß ein
Peptid mit der genauen Sequenz von Somatostatin gebildet wird.
(6) Schließlich inhibieren die obigen Proben von E. coli
RRl(pSOM11-3)-Extrakt die Freisetzung von Wachstumshormon aus
Hypophysenzellen von Ratten, wohingegen parallel und mit identischer Proteinkonzentration hergestellte Proben von E. coli
RRl(pSOM11-2) keine Wirkung auf Wachstumshormonfreisetzung
ausüben.
Die Stämme mit dem EcoRI-lac-Operon-Fragment (pSOM11-2, pSOM11-3,
etc.) trennen sich hinsichtlich des Plasmidphänotyps. Beispielsweise
ist nach etwa 15 Generationen etwa die Hälfte der E. coli RRl(pSOM11-3)-Kultur für ß-Galactosidase verantwortlich, d. tu
weist den lac-Operator auf, und etwa die Hälfte hiervon ist ampicillinresistent. Für Somatostatin positive (pSOM11-3) und
negative (pSOM11-2) Stämme sind unbeständig, und deshalb rührt
der Wachstumsnachteil vermutlich von der Überproduktion der großen aber unvollständigen und inaktiven Galactosidase her. Die Ausbeute
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an Somatostatin schwankt von 0,001 bis 0,03 % des gesamten
cellularen Proteins (Tabelle I), vermutlich infolge der Selektion
von Kulturzellen mit Plasmiden mit einem fehlenden lac-Bereich. Die höchsten Ausbeuten an Somatostatin werden mit Präparaten
erzielt, bei deren Herstellung das Wachstum von einer einzigen ampicillinresistenten richtunggebenden oder konstitutiven Kolonie
ausgegangen ist. Selbst in diesen Fällen haben 30 % der Zellen bei der Gewinnung oder Ernte Verluste an lac-Bereichen. Lagerung
in gefrorenem Zutand (Lyophilisierung) und Wachstum bis zur Gewinnung aus einer einzigen derartigen Kolonie ist daher
für das beschriebene System angezeigt. Ausbeuten können beispielsweise durch Verwendung von Bakterienstammen erhöht werden,
die lac-Repressor überproduzieren, so daß eine Expression
von Vorläuferprotein vor Induktion und Ernte praktisch völlig unterdrückt wird. Wie bereits erörtert, kann aber auch ein
Tryptophan- oder anderes Operatorpromotersystem angewandt werden, das gewöhnlich vollständig unterdrückt ist.
In dem rohen Extrakt, der beim Aufbrechen der Zellen in zum Beispiel einer Eaton-Presse erhalten wird, ist das ß-Galactosidase-Somatostatinvorläuferprotein
unlöslich und findet sich in dem Korn der ersten Zentrifugierung mit geringer Geschwindigkeit.
Die Aktivität kann in 70-prozentiger Ameisensäure, 6m Guanidiniumhydrochlorid oder 2-prozentigem Natriumdodecylsulfat gelöst werden.
Vorzugsweise wird jedoch der Rohextrakt aus der Eaton-Presse mit 8m Harnstoff extrahiert und der Rückstand mit Bromcyan
gespalten. Bei den anfänglichen Versuchen ist Somatostatinaktivität aus E. coli Stamm RRl (pSOM 11-3) durch Alkoholextraktion
des gespaltenen Produkts und Chromatographie an Sephadex G-50 in 50-prozentiger Essigsäure etwa 100-fach angereichert
worden. Wird das Produkt erneut an Sephadex G-50 chromatographiert
und dann einer Hochdruckflüssigchromatographie unterworfen, kann praktisch reines Somatostatin erhalten werden.
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-to- 2840052
Die oben beschriebenen Arbeitsweisen werden als nächstes auf die Erzeugung von Humaninsulin angewandt. So werden die Gene
für die Insulin B Kette (104 Basenpaare) und für die Insulin A Kette (77 Basenpaare) aus der Aminosäuresequenz der Humanpolypeptide
jeweils mit einzelsträngigen Kohäsivtermini für die EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonuclease und jeweils für
die getrennte Einführung in pBR322-Plasmide bestimmt, gestaltet.
Die synthetischen Fragmente, Deca- bis Pentadecanucleotide, werden durch die Blockphosphotriestermethode unter
Verwendung von Trinucleotiden als Baublöcke synthetisiert und schließlich mit einer Hochleistungsflüssigchromatographie
(HPLC) gereinigt. Die synthetischen Gene für Humaninsulin A- und B-Ketten werden dann getrennt in Plasmid pBR322 zur Clonbildung
gebracht. Die synthetischen Gene werden dann in Clonform
an E. coli-ß-Galactosidasegen wie oben angelagert, wodurch
eine wirksame Transkription und Translation und ein stabiles Vorläuferprotein erhalten wird. Insulinpeptide werden vom
ß-Galactosidasevorläufer gespalten, durch Radioimmunprüfung
nachgewiesen und gereinigt. Insulinradioimmunprüfungsaktivität wird dann durch Vermischen der E. coli-Produkte erzeugt.
1. Ausgestaltung und Synthese von Humaninsulingenen
Die für Humaninsulin aufgebauten Gene sind in Figur 9 dargestellt.
Die Gene für Humaninsulin, B-Kette und Α-Kette, werden aus der Aminosäuresequenz von Humanpolypeptiden gestaltet. Die
5'-Enden jedes Gens haben einsträngige kohäsive Termini für die
EcoRI- und BamHI-Restriktionsendonuclease für die richtige Einfügung jedes Gens in das Plasmid pBR322. In die Mitte des B-Ketten-Gens
für die Aminosäuresequenz Glu-Ala wird eine Hindlll-Endonuclease-Erkennungsstelle
eingebaut, um Verbreitung und Nachweis jeder Hälfte des Gens gesondert vor dem Aufbau des
gesamten B-Kettengens zu ermöglichen. Die B-Ketten- und A-Ketten-Gene werden so gestaltet, daß sie von 29 verschiedenen
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ORfGlNAL
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Oligodesoxyribonucleotiden, vom Decameren bis zu den Pentadecameren,
aufgebaut werden. Jeder Pfeil bezeichnet das Fragment, das durch die verbesserte Phosphotriestermethode synthetisiert
wird, H1 bis H8 und B1 bis B12 für das B-Kettengen und A1 bis
A11 für das A-Kettengen.
2. Chemische Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden
Die für die Synthese von Oligodesoxyribonucleotiden angewandten Materialien und Methoden sind im Wesentlichen die in Itakura,
K. et al (1975) J. Biol. Chem. 250, 4592 und Itakura, K. et al (1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327 beschriebenen, mit Ausnahme
der folgenden Modifikationen:
a) Die vollständig geschützten Mononucleotide 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-p-chlorphenyl-ß-cyanethyl-phosphate
werden aus den Nucleosidderivaten unter Verwendung des monofunktioneilen
Phosphorylierungsmittels p-Chlorphenyl-ß-cyanethyl-phosphorochloridat
(1,5 Moläquivalente) in Acetonitril in Gegenwart von 1-Methylimidazol, Van Boom, J. H. et al (1975) Tetrahedron 31,
2953, synthetisiert. Die Produkte werden in großem Maßstab (100 bis 300 g) durch präparative Flüssigchromatographie
(Prep 5OO LC, Waters Associates) isoliert.
b) Unter Anwendung der Lösungsmittelextraktionsmethode /Hirose, T. et al (1978) Tetrahedron Letters, 2449/ werden
32 bifunktionelle Trimere (vergleiche Tabelle IV) in einem Maßstab von 5 bis 10 mm und 13 Trimere, 3 Tetramere und
4 Dimere als 3'-Terminusblöcke in einem Maßstab von 1 mMol
synthetisiert. Die Homogenität der vollständig geschützten Trimeren wird durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel
in zwei Methanol/Chloroform-Lösungsmittelsystemen: Lösungsmittel a 5 % Vol./Vol. und Lösungsmittel b 10 % Vol./Vol.
(vgl. Tabelle IV) kontrolliert. Ausgehend von diesen verschiedenen Verbindungen werden 29 Oligodesoxyribonucleotide mit
definierter Sequenz synthetisiert, 18 für das B-Ketten- und 11 für das A-Ketten-Gen.
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Als Grundeinheiten für den Aufbau von Polynucleotiden werden zwei Arten von Trimerblöcken, d. h. die bifunktionellen Trimerblöcke
von Tabelle IV und entsprechende an der 3'-Hydroxygruppe
durch eine Anisoylgruppe geschützte 3'-Terminus-Trimere
verwendet. Das bifunktionelle Trimere wird mit einer Mischung aus Pyridin, Triethylamin und Wasser (3:1:1, Vol./Vol.)
zu der entsprechenden 3'-Phosphodxesterkomponente und mit
2 % Benzolsulfonsäure zu der entsprechenden 5'-Hydroxykomponente
hydrolysiert. Der bereits erwähnte 3'-Terminus-Block
wird mit 2-prozentiger Benzolsulfonsäure behandelt, wodurch die entsprechende 5'-Hydroxylverbindung gebildet wird. Die Kupplungsreaktion eines Überschusses des 3'-Phosphodiestertrimeren (1,5
Moläquivalente) mit der 5'-Hydroxylkomponente (1 Moläquivalent)
in Gegenwart von 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid
(TPSTe, 3 bis 4 Äquivalente) ist nach drei Stunden nahezu vollständig abgelaufen. Zur Entfernung des Überschusses des 3'-Phosphodiesterblocks
wird das Reaktionsgemisch durch eine kurze Kiesigelsäule auf einem Sinterglasfilter geleitet. Die Säule
wird zuerst mit CHCl3 zum Eluieren einiger Nebenprodukte und
des Kupplungsreagens und dann mit CHCl_.:MeOH (95:5 Vol./Vol.),
worin nahezu das gesamte, vollständig geschützte Oligomere eluiert wird, gewaschen. Unter diesen Bedingungen bleibt der
eingesetzte 3'-Phosphodiesterblock-Reaktionsteilnehmer in der
Säule. In entsprechender Weise werden Blockkupplungen wiederholt, bis die gewünschte Länge aufgebaut ist.
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Tabelle IV
Synthese von Trimerbaublöcken
Verbin | Ausbeute ** | a. | Rf : Reinheit*** | (%) | zugegen in | |
Nr. | dung* | (%) | 0,15 | b. | 93 | (siehe Fig. 9) |
1. | AAG | 47 | 0,25 | 0,40 | 95 | B5,B6 |
2. | AAT | 49 | 0.28 | 0^52 | 93 | Hl7Al,A6 |
3. | AAC | 52. | 0.27 | 0,55 | 91 | E5,B6,A2,A8 |
4. | ■ ACT | 43 | 0,33 | 0T53 | 96 | B4,B5,A6 |
5. | ACC | 5δ | 0,18 | 0.60 | 90 | B7 |
6. | ACG | 39 | -0y10 | 0,45 | 89 | H5,B7 |
7. | AGG | 45 | 0,.14 ■ | 0,26 | 96 | H6/H7,B9 |
8. | AGT | 33- | 0,19 | 0,40 | 92 | B9,A2,A11 |
9. | AGC | 50 | 0,24 | 0,48 | 91 | H8,B1,A5,A1Q |
10. | AGA | 48 | 0,26 | 0.50 | 95 | A9, |
11. | TTC | 44 | 0,11 | 0,52 | 94 | B4,B7,A3 |
12. | TTC | 49 | 0,24 | 0,31 | 96 | H37H57A27A37A5 |
13. | TCT | 58 | 0,28 | 0,49 | 92 | A4 |
14. | TCA | 45 | 0,12 | 0,53 | 91 | Η1,Η2,Η4,Α1 |
15. | TCG | 39 | 0,10 | 0,34 | 87 | A2 |
16. | TGG | 32 | 0,18 | 0,28 | 93 | H3,A1,A1Q |
17. | TGC- | 51 | 0,12 | 0,47 | 94 | H67B2,A4,A77A3 |
18. | TGA | 46 | 0,22 | 0.37 | 90 | H7 |
19. | TAC | 61 | 0,17 | 0,50 | 95 | B4,A11 |
20. | TAA | • 55 | 0,30 | 0,44 | 97 | B5,A1O |
21. | CCT | 53 | 0,25 | 0,55 | 92 | HS7HA7BlO |
22. | CAC | 47 | 0,25 | 0,51 | 93 | A3 |
23. | CAA | 58 | 0,28 | 0,51 | 92 | H2,H6,H87A7 |
24. | CTT | 41 | • 0,27 | 0,54 | 93 | B2,B9,A4 |
25. | CGA | 40 | 0,25 | 0,52 | 89 | A7 |
26. | CGT | 75 | 0,09 | 0,50 | 90 | E27K47B37B1 |
27. | GGT | 35 | 0,18 | 0,25 | 93 | B3 |
23. | GTT | 46 | 0,25 | 0,45 | 95 | B2 |
29. | GTA | 38 | 0,15 | 0,50 | 88 | •B67B8,A6 |
30. | GAA | 39 | 0,22 | 0.39 | 89 | H77B37B87A5 |
31. | GAT | 52 | 0,14 | 0,49 | 93 | BlO7A9 |
32. | GCA | 42 | 0,39 | A9 |
* vollständig geschützte Trxdesoxynucleotide; 5-0 9-Dimethoxytrityl-3'-p-chlorphenyl-ß-cyanethylphosphpat
** Gesamtausbeute, bezogen auf die 5'-Hydroxylmonomeren
*** Aufgrund der HPLC-Analyse
Θ09819/0879
284-052
Während der Oligonucleotidsynthese wird ausgiebig von der
Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) Gebrauch gemacht, und zwar für die Analyse von a) jedem Trimer- und Tetramerblock,
b) den als Zwischenprodukte auftretenden Fragmenten (Hexamere, Nonamere und Decamere), c) der letzten Kupplungsreaktion und d) zur Reinigung der Endprodukte. Für die HPLC
wird ein Spectra-Physics 35OOB Flüssgchromatograph verwendet. Nach Entfernung aller Schutzgruppen mit konzentriertem NH.OH
bei 50 0C (6 Stunden) und 80-prozentiger Essigsäure bei Zimmertemperatur
(15 Minuten) werden die Verbindungen an einer Permaphase AAX (DuPont) /Van Boom, J. et al (1977) J. Chromatography
131, 169/ Säule (1 m . 2 mm) unter Anwendung eines
linearen Gradienten des Lösungsmittels B (0,05m KH„P0. - 1,0m
KCl, pH 4,5) in Lösungsmittel A (O,O1m KH2PO4, pH 4,5) analysiert.
Der Gradient verläuft folgendermaßen: Es wird mit Puffer A begonnen, und dann werden 3 % Puffer B in der Minute
angewandt. Die Elution wird bei 60 0C mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 2 ml/Minute durchgeführt. Auch die Reinigung der 29 End-Oligonucleotide wird an Permaphase AAX unter den
gleichen oben angegebenen Bedingungen durchgeführt. Die Materialien mit dem gewünschten Peak werden vereinigt, durch Dialyse
entsalzt und lyophilisiert. Nach Markieren der 5'-Termini
32
mit (gamma- P)ATP unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase wird die Homogenität jedes Oligonucleotids durch Elektrophorese auf einem 20-prozentigen Polyacrylamidgel kontrolliert.
mit (gamma- P)ATP unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase wird die Homogenität jedes Oligonucleotids durch Elektrophorese auf einem 20-prozentigen Polyacrylamidgel kontrolliert.
3. Anordnung und Clonbildung von B-Kettengen und A-Ketten-Gen
Das Gen für die B-Kette von Insulin weist eine EcoRI-Restriktionsstelle
am linken Ende, eine Hindlll-Stelle in der Mitte und eine BamHI-Stelle am rechten Ende auf. Dadurch ist
es möglich, beide Hälften, die linke EcoRI-Hindlll-Hälfte (BH)
und die rechte Hindlll-BamHI-Hälfte (BB), in dem gut geeigneten
Clonbildungsträger pBR322 getrennt zu clonen und nach Feststellung
ihrer Sequenzen zu dem vollständigen B-Gen zu verbinden (Figur 10). Die BB-Hälfte wird durch Verknüpfen aus 10 Oligodesoxyribonucleotiden,
in Figur 9 mit B1 bis B10 bezeichnet,
909819/0879
284 V 052
zusammengestellt, die durch chemische Phosphotriestersynthese gebildet wurden. B1 und B1O sind nicht phosphoryliert, wodurch
eine unerwünschte Polymerisation dieser Fragmente über ihre Cohäsivenden (Hindlll und BamHI) vermieden wird. Nach Reinigung
durch präparative Acrylamidgelelektrophorese und Elution der größten DNA-Bande wird das BB-Fragment in das mit Hindlll
und BamHI gespaltene Plasmid pBR322 eingefügt. Etwa 50 % der von der DNA stammenden ampicillinresistenten Kolonien sind
tetracyc Unempfindlich, was zeigt, daß ein Nichtplasmid-Hindlll-BamHI-Fragment
eingeführt worden ist. Die kleinen HindllI-BamHI-Fragmente aus vier dieser Kolonien (pBB1O1 bis
pBB1O4) erweisen sich bei der Sequenzprüfung als richtig gestaltet.
Das BH-Fragment wird in entsprechender Weise hergestellt und in mit EcoRI- und Hindlll-Restriktionsendonuclease gespaltenes
pBR322 eingefügt. Plasmide aus drei ampicillinresistenten, tetracyclinempfxndlichen Transformanten (pBH1 bis pBH3) werden
analysiert. Dabei wird festgestellt, daß die kleinen EcoRI-Hindlll-Fragmente die erwartete Nucleotidsequenz aufweisen.
Das A-Kettengen wird aus drei Teilen zusammengestellt. Die vier linken, vier mittleren und vier rechten Oligonucleotide
(vergleiche Figur 9) werden gesondert verknüpft, dann vermischt und verknüpft (die Oligonucleotide A1 und A12 sind
unphosphoryliert). Das zusammengestellte A-Kettengen wird phosphoryliert, durch Gelelektrophorese gereinigt und in
pBR322 an den EcoRI-BamHI-Stellen geclont. Die EcoRI-BarnHI-Fragmente
von zwei ampicillinresistenten, tetracyclinempfxndlichen
Clonen (pA1O, pA11) enthalten die angestrebte A-Gensequenz.
909819/0879
284-052
4. Aufbau von Plasmiden zur Expression von A- und B-Insulingenen
Figur 10 zeigt den Aufbau des lac-Insulin B Plasraids (pIB1). Die
Plasmide pBH1 und PBB1O1 werden mit EcoRI- und Hindlll-Endonuclease
aufgeschlosen. Das kleine BH-Fragment von pBH1 und das große Fragment
von pBB1O1 (enthaltend das BB-Fragment und den größten Teil von pBR322) werden durch Gelelektrophorese gereinigt, vermischt
-τι 5 und xn Gegenwart von mit EcoRI gespaltenen A- plac verknüpft.
Das Megadalton-EcoRI-Fragment von Λ. plac enthält den lac-Regelbereich
und den größten Teil des ß-Galactosidase-Strukturgens.
Die Konfiguration der Restriktionsstellen gewährleistet die richtige Verbindung von BH an BB. Das lac-EcoRI-Fragment kann
sich in zwei Orientierungen einfügen; deshalb hat nur eine Hälfte der nach Transformation erhaltenen Clone die angestrebte
Orientierung. Die Orientierung von 10 ampicillinresistenten ß-Galactosidase bildenden Clonen wird durch Restriktionsanalyse kontrolliert. Fünf dieser Kolonien enthalten die
gesamte B-Gensequenz und den richtigen Leserahmen aus dem ß-Galactosidasegen in das B-Kettengen. Eine Kolonie, pIB1,
wird für anschließende Versuche ausgewählt.
Bei einem vergleichbaren Versuch wird das 4,4-Megadalton-
lac-Fragment /\_plac an der EcoRI-Stelle in das pAi1-Plasmid
eingeführt, wodurch pIA1 erhalten wird. Letzteres erweist sich als mit pIB1 identisch mit der Ausnahme, daß
das B-Gen-Fragment durch das A-Gen-Fragment ersetzt ist. Die DNA-Sequenzanalyse zeigt, daß die korrekten A- und
B-Kettengensequenzen in pIA1 bzw. pIBi erhalten geblieben sind.
5. Expression
Die Stämme mit den in richtiger Weise an ß-Galactosidase gebundenen Isulingenen erzeugen beide große Mengen eines
Proteins mit der Größe von ß-Galactosidase. Etwa 20 % des
909819/0879
28A8G52
gesamten Zellproteins bestehen aus diesem ß-Galactosidase-Insulin
A- oder B-Ketten-Hybrid. Die Hybridproteine sind unlöslich und finden sich in dem ersten bei geringer Geschwindigkeit
erhaltenen Korn, worin sie etwa 50 % des Proteins ausmachen.
Zum Nachweis der Expression der Insulin-Α- und -B-Ketten wird eine Radioimmunprüfung (RIA) angewandt, die auf der Bildung
von vollständigem Insulin aus den gesonderten Ketten beruht. Die Insulinbildungsmaßnahmen von Katsoyannis et al (1967) Biochemistry
6, 2642-2655, ergeben, angepaßt an ein Prüfvolumen von
27 Mikroliter, eine sehr gut geeignete Prüfung. Nach Vermischen und Bildung von S-sulfonierten Derivaten der Insulinketten wird
ohne weiteres nachweisbare Insulinaktivität erhalten. Die getrennten S-sulfonierten Ketten von Insulin reagieren nach Reduktion
und Oxidation nicht merklich mit dem verwendeten Antiinsulin-Antikörper.
Für die Insulinbildungsprüfung wird das ß-Galactosidase-A- oder
B-Ketten-Hybridprotein teilweise gereinigt, mit Bromcyan gespalten und in S-sulfonierte Derivate übergeführt.
Der Nachweis dafür, daß die richtige Expression von chemisch synthetisierten Genen für Humaninsulin erzielt worden ist,
kann folgendermaßen zusammengefaßt werden:
a) Radioimmunaktivität ist für beide Ketten nachgewiesen worden.
b) Die nach Clonbildung und Plasmidaufbau erhaltenen DNA-Sequensen
sind direkt als der Gesaltung entsprechend nachgewiesen worden. Da Radioimmunaktivität erhalten wird, muß die Translation
in Phase sein. Der genetische Code bestimmt daher, daß Peptide mit der Sequenz von Humaninsulin erzeugt werden.
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- SAr-
284?ΰ52
c) Nach der Bromcyanspaltung verhalten sich die E. coli-Produkte
in drei verschiedenen chromatographischen Systemen, bei denen die Trennung auf verschiedenen Prinzipien beruht (Gelfiltration, Ionenaustausch und Umkehrphasen-HPLC) als Insulinketten.
d) Die von E. coli erzeugte A-Kette ist durch HPLC in einem
kleinen Maßstab gereinigt worden und hat die richtige Aminosäurezusammensetzt .
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Leerseite
Claims (1)
153/243
Patentansprüche
1. Verfahren zur Erzeugung eines spezifischen Polypeptide
durch Expression eines heterologen Strukturgens hierfür in einem mikrobiellen Rekombinationsclonbildungsträger, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen
in Lesephase mit einer DNA-Sequenz ist, die den Code für ein anderes Protein als dieses Polypeptid liefert, und daß
damit die Expression ein Vorläuferprotein ergibt, das die Aminosäuresequenz des Polypeptids und außerdem zusätzliches Protein
mit einer selektiven Spaltstelle neben der Aminosäuresequenz des angestrebten Poiypeptids aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das zusätzliche Protein überflüssig ist und nach der Expression das Vorläuferprotein an dieser Stelle gespalten
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das überflüssige Protein eine oder mehrere
der Aminosäuresequenz des Polypeptids entsprechende Aminosäuresequenzen aufweist und daß alle Aminosäuresequenzen des Polypeptids
in dem Vorläuferprotein durch selektive Spaltstellen voneinander getrennt sind.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Spaltung in einem System bewirkt wird, das sich außerhalb der replicativen Umgebung des Clonbildungsträgers
befindet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn
zeichnet , daß das Polypeptid keine vergleichbaren selektiven Spaltstellen aufweist.
909819/0879
ORIGINAL INSPECTED
ORIGINAL INSPECTED
153/243 -
-λ- 284-052
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß der Aminosäuresequenz des Polypeptids
Argenin und Lysin fehlen, und die selektive Spaltstelle durch Chymotrypsin oder Trypsin gespalten wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn
zeichnet, daß der Aminosäuresequenz des Polypeptids Arginin fehlt, die selektive Spaltstelle durch Chymotrypsin oder
Trypsin gespalten wird und in der Aminosäuresequenz etwa vorhandenes Lysin vorher gegen Spaltung geschützt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekenn
zeichnet , daß das Polypeptid methioninfrei ist, und
die Spaltung mit Bromcyan bewirkt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2,5 und 8,
dadurch gekennzeichnet, daß als Träger ein bakterielles Plasmid verwendet wird.
1O. Verfahren nach Anspruch 2 oder 5, dadurch gekennzeichnet , daß als Träger ein bakterielles
Plasmid verwendet wird und das spezifische Polypeptid ein Säugerhormon oder ein Zwischenprodukt dafür ist.
11. Verfahren zur Erzeugung eines spezifischen Säuger-Polypeptidhormons
oder Zwischenprodukts dafür nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem Strukturgen
eines oder mehrere Beendigungscodone angeschossen und vorangestellt werden und es in Lesephase mit einer DNA-Sequenz
mit dem Code für ein anderes Protein als das Polypeptid steht, die Expression ein Vorläuferprotein aus der Aminosäuresequenz
des Polypeptids und zusätzlichem Protein mit einer selektiven
§09819/0879 .
INSPECTED
153/243 '5T3V 284
Spaltstelle neben der Aminosäuresequenz des angestrebten PoIypeptids
ergibt und die Spaltung in einem System außerhalb der replikativen Umgebung des Plasmids bewirkt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet
, daß ein Vorläuferprotein verwendet wird, dem die Bioaktivität des Hormons fehlt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet
, daß Somatostatin, Insulin, Humanwachstumshormon oder Rinderwachtumshormon hergestellt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet
, daß als Mittel zur selektiven Spaltung Bromcyan verwendet und als Spaltprodukt ein methioninfreies
Produkt erhalten wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet
, daß als Spaltprodukt Somatostatin erhalten wird.
,16. Mikrobieller Rekombinationsclonbildungsträger mit einem
Regulon, einem Strukturgen, das den Code für die Aminosäuresequenz des herzustellenden Polypeptids liefert, und einem
oder mehreren Beendigungscodonen, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die den Code für zusätzliches
Protein liefert und zwischen dem Regulon und Beendigungscodon(en) ohne Veränderung des Leserahmens des Strukturgens angeordnet
ist, wodurch sich aus der Expression ein Vorläuferprotein mit der· Aminisäuresequenz des herzustellenden Polypeptids
und der von zusätzlichem Protein ergibt, wobei das zusätzliche Protein neben der Aminosäuresequenz des herzustellenden
Polypeptids eine selektive Spaltstelle aufweist.
k -ORpNAL INSPEQlED
153/243
17. Träger nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet
, daß das auszubildende Polypeptid keine vergleichbaren selektiven Spaltstellen umfaßt.
18. Bakterielles Plasmid nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten
Elemente folgende Sequenz aufweisen: (Regulon) - (Codone für zusätzliches Protein) - (Codone für zu bildendes Polypeptid)
- (Beendigungscodon(e)).
19. Plasmid nach Anspruch 18, dadurch gekenn
zeichnet, daß die Spaltstelle Methionin ist.
20. Plasmid nach Anspruch 19 für die Herstellung von
Somatostatin.
21. Als Plasmid nach Anspruch 18 pSOMl.
22. Als Plasmid nach Anspruch 18 pSOMll.
23. Aus einem oder mehreren Bakterien mit Plasmiden nach
Anspruch 16 oder 18 geclonte Transformantenkultur, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Glieder
zur Expression des Vorläuferproteins fähig sind.
24. Bakterielle Kultur nach Anspruch 23, enthaltend E. coli
RR1 (pSOMl).
25. Bakterielle Kultur nach Anspruch 23, enthaltene E. coli RR1 (pSOMl1).
ORIGINAL INSPECTED
153/243 - 5
-Ö-- 2840052
26. Verfahren zur Herstellung einer ein Polypeptishapten
aufweisenden immunogenen Substanz, dadurch gekennzeichnet
, daß
(a) ein mikrobieller Rekombinationsclonbildungsträger mit einem heterologen Strukturgen für das Hapten und in Lesephase
damit einer DNA-Sequenz, die den Code für zusätzliches Protein mit einer Größe liefert, die zum Immunogenmachen des
Produkts der DNA-Expression ausreicht, ausgebildet wird und daß
(b) Expression eines Konjugatpolvpeptxds aus im wesentlichen
der Aminosäuresequenz des Haptens und des zusätzlichen Proteins bewirkt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die bewirkte Expression ein
Produkt mit über etwa 100 Aminosäuren ergibt.
28. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet , daß die bewirkte Expression ein
Produkt mit über etwa 200 Aminosäuren ergibt.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , daß als Hapten, dem Immunogenität
verliehen wird, Somatostation verwendet wird.
30. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet , das als Hapten, dem Immunogenität
verliehen wird, ein solches mit der Aminosäuresequenz eines Spaltprodukts von viralem Mantelprotein verwendet wird,
wobei das Spaltprodukt spezifisch durch Antikörper gebunden ist, der dem Mantelprotein entspricht.
909 819/0879
153/243
31. Mikrobieller Rekombinationsclonbildungsträger mit
einem Regulon , einem Strukturgen, das den Code für die
Aminosäuresequenz eines Polypeptidhäptens liefert, und einem oder mehreren Beendigungscodonen nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die den Code für zusätzliches Protein liefert und zwischen dem Regulon und dem oder den Beendigungscodon(en) angeordnet
ist, ohne den Leserahmen des Strukturgens zu ändern, und ein Konjugatprotein, das im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz des Haptens und zusätzlichem Protein besteht, dessen Umfang dem Konjugat als Folge der Expression Immunogenität verleiht.
einem Regulon , einem Strukturgen, das den Code für die
Aminosäuresequenz eines Polypeptidhäptens liefert, und einem oder mehreren Beendigungscodonen nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch eine DNA-Sequenz, die den Code für zusätzliches Protein liefert und zwischen dem Regulon und dem oder den Beendigungscodon(en) angeordnet
ist, ohne den Leserahmen des Strukturgens zu ändern, und ein Konjugatprotein, das im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz des Haptens und zusätzlichem Protein besteht, dessen Umfang dem Konjugat als Folge der Expression Immunogenität verleiht.
909819/0879
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