NO855217L - Fremgangsmaate for fremstilling av et immunogent materiale omfattende et polypeptidhapte. - Google Patents
Fremgangsmaate for fremstilling av et immunogent materiale omfattende et polypeptidhapte.Info
- Publication number
- NO855217L NO855217L NO855217A NO855217A NO855217L NO 855217 L NO855217 L NO 855217L NO 855217 A NO855217 A NO 855217A NO 855217 A NO855217 A NO 855217A NO 855217 L NO855217 L NO 855217L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dna
- somatostatin
- gene
- plasmid
- ecori
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 43
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 36
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 104
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 claims description 90
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 claims description 85
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 83
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 claims description 78
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 claims description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 42
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 41
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 37
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 28
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 22
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 94
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 85
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 41
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 31
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 26
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 20
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 15
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 15
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 15
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 14
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 13
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 13
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 9
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 9
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 9
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 9
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 9
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 9
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 9
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 8
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 7
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 7
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150076489 B gene Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 5
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 5
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N ensulizole Chemical compound N1C2=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C2N=C1C1=CC=CC=C1 UVCJGUGAGLDPAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229920009537 polybutylene succinate adipate Polymers 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000028391 RNA cap binding Human genes 0.000 description 3
- 108091000106 RNA cap binding Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N benzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 SRSXLGNVWSONIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940092714 benzenesulfonic acid Drugs 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- AVWFEPDJDKSISU-UHFFFAOYSA-N C(C)(C)C1=C(C(=CC(=C1)C(C)C)C(C)C)S(=O)(=O)N1N=NN=[C-]1 Chemical compound C(C)(C)C1=C(C(=CC(=C1)C(C)C)C(C)C)S(=O)(=O)N1N=NN=[C-]1 AVWFEPDJDKSISU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 2
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N (z)-3-(1h-indol-3-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(\C=C/C(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-WAYWQWQTSA-N 0.000 description 1
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYIRBZOAKBEYEJ-UHFFFAOYSA-N 2-(1,3-dimethyl-2,6-dioxopurin-7-yl)ethyl 2-[1-methyl-5-(4-methylbenzoyl)pyrrol-2-yl]acetate Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(=O)C(N1C)=CC=C1CC(=O)OCCN1C(C(=O)N(C)C(=O)N2C)=C2N=C1 TYIRBZOAKBEYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZZEIDCCKIXHOOP-UHFFFAOYSA-N 2-[2,3-bis(2-aminoethyl)pyridin-4-yl]ethanamine;hydrate Chemical compound O.NCCC1=CC=NC(CCN)=C1CCN ZZEIDCCKIXHOOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 3-methylfuran-2,5-dione Chemical class CC1=CC(=O)OC1=O AYKYXWQEBUNJCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 75976-10-2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=C(O)C=C1 HFDKKNHCYWNNNQ-YOGANYHLSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010072454 CTGCAG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 description 1
- 239000000055 Corticotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 108700020473 Cyclic AMP Receptor Proteins 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000000114 Pain Threshold Diseases 0.000 description 1
- 102000018886 Pancreatic Polypeptide Human genes 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033647 Pancreatitis acute Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101000983124 Sus scrofa Pancreatic prohormone precursor Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 201000003229 acute pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N indoleacrylic acid Natural products C1=CC=C2C(C=CC(=O)O)=CNC2=C1 PLVPPLCLBIEYEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037040 pain threshold Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010050934 polyleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000004262 preparative liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/655—Somatostatins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Genetisk informasjon er innkodet på dobbeltrådet deoksyribonukleinsyre ("DNA" eller "gener") etter den rekkefolge i hvilken den DNA-kodende tråden presenterer de karakteristiske basene i trådens repeterende nukleotidkomponenter. "Uttrykkingen" av den innformede informasjonen slik at det dannes polypeptider innbefatter en todelt prosess. Ifolge påbud fra visse kontrollområder ("reguloner") langs genet,
vil RNA-polymerase bevege seg langs den kodende tråden, slik at det dannes såkalt "budbringer-RNA" (ribonukleinsyre) i en prosess som vanligvis kalles "transkribsjon". Ved den etter-følgende "oversettelsestrinnet" vil cellens ribosomer sammen med overforings-RNA omdanne nevnte mRNA-"budskap" til polypeptider. I den informasjon som mRNA transkriberer fra DNA inngår også signaler for start og avslutning av den robosomale oversettelsen, såvel som identitet og rekkefolge av aminosyrene som utgjor selve polypeptidet. Den DNA-kodende tråden består av lange sekvenser av nukleotidtripletter som kalles "kodoner" fordi de karakteristiske baser som finnes i nukleo-tidene i hver triplett eller kodon innkoder spesifikke deler
av informasjonen. F.eks. vil 3 nukleotider avlest som ATG
(adenin-tymin-guanin) resultere i et mRNA-signal som kan tol-kes som "start oversettelse", mens avslutnings kodonene TAG, TAA og TGA blir tolket som "stopp oversettelse". Mellom start-og stoppkodonene ligger det såkalte strukturelle genet, hvis kodoner definerer den aminosyresekvens som blir oversatt til slutt. Denne definisjonen er den man kjenner fra den vel-kjente "genetiske koden" (se f.eks. J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene V/.A. Benjamin Inc., N.Y. 3. utgave 1976)
som "beskriver kodonene for de forskjellige aminosyrene. Den Jféhetiske koden er degenerert i den forstand at forskjellige kodoner kan gi den samme aminosyren, men presis idet at for hver aminosyre så er det én eller flere kodoner og ingen andre. Således vil f.eks. alle kodonene TTT, TTC, TTA og TTG når de avleses som sådanne, innkode for serin og ingen annen aminosyre. Under transkribsjonen må det opprettholdes en passende avlesningsfase eller avlesningsramme. La oss f.eks. se hva som skjer når den transkriberende RNA-polymerasen avleser forskjellige baser ved begynnelsen av et kodon (understreket) i rekkefblgen ... GCTGGTTGTAAG ...:
Det polypeptid som til slutt vil bli fremstilt, vil være helt avhengig av romforholdet på den strukturelle gene med hensyn til regulonet.
En klarere forståelse av fremgangsmåten som inngår
i den såkalte genetiske uttrykkingen vil lettere kunne frem-
gå når man har definert visse komponenter i genene:
Operon -- Et gene som består av strukturelle gener for polypeptiduttrykk og har et kontrollområde ("regulon") som regulerer dette uttrykk.
Promotor — Et gene i regulonet hvor RNA-polymerasen må binde seg for å få startet transkribsjonen.
Operator — Et gene til hvilket man kan binde et såkalt undertrykkende protein, slik at man hindrer RNA-polymerase å binde seg til en tilstotende promotor.
Induser — Et stoff som deaktiverer undertrykkende protein og frigjbr operatoren og derved muliggjor at RNA-polymerase kan binde seg til promotor og fortsette transkribsjonen.
Katabolittaktivator<p>rotein ( " CAP") - bindeposis. jon Et gen som binder syklisk adenosinmonofosfat ("c AMP") - formid-lende CAP, som også vanligvis er nddvendig for å starte transkribsjonen. Den CAP-bindende posisjonen kan i visse tilfeller være unddvendig. Således vil f.eks. en promotormutasjon i laktoseoperonet i fagen^i plac UV5 eliminere behovet for CAMP
(j^ CAP for uttrykking. J. Beckwith et al., J. Mol. Biol 69,
ISS-160 (1972).
Promotor- operatorsystem — Slik det er definert her så er dette et opererbart kontrollområde på en operon, med eller uten hensyn til hvorvidt det inngår i en CAP-bindende posisjon eller er istand til å kode inn et uttrykk for undertrykkende protein.
For å lette diskusjonen og beskrivelsen i det etterfolgende når det gjelder* rekombinert DNA, så har man fdlgende definisjoner: Klonebærende element Ikke-kromosomalt dobbelttrådet DNA som innbefatter en intakt "replikon" slik at elementet blir repetert når det plaseres inne i en éncellet organisme ("mikrobe") ved en såkalt "transformasjons"-prosess. En organisme som blir omformet på denne måten kalles ofte en "transformant".
Plasmid - I denne sammenheng defineres dette som et klonende element som er avledet fra virus eller bakterie, og i det sistnevnte tilfelle betegnes det ofte som "bakterie-plasmider".
Komplementaritet — En egenskap som tilveiebringes av basesekvenser i et enkelttrådet DNA som muliggjor dannel-sen av dobbelttrådet DNA gjennom hydrogenbinding mellom de komplementære baser på de respektive trådene. Adenin (A) er et komplement til tymin (T), mens guanin (G) komplementerer cytosin (C).
Biokjemisk forskning i de senere år har fort til konstruksjon av såkalte "rekombinerte" klonende elementer hvor f.eks. plasmider kan fremstilles slik at de inneholder eksogent DNA. I visse tilfeller kan rekombinanten innbefatte "heterologt" DNA, dvs. DNA som utkoder polypeptider som vanligvis ikke fremstilles av den organismen som er fdlsom overfor transformasjon ved hjelp av såkalte rekombinerte elementer. Plasmidene er således spaltet slik at de gir linært DNA med såkalte sammenslutningsbare sluttposisjoner. Disse bindes til et eksogent gen med lignende sammensluttbare sluttposisjoner slik at man får en biologisk funksjonell forbindelse med et intakt replikon med en fordnsket fenotypisk egenskap. Den rekombinerte forbindelsen innsettes så i en mikroorganisme ved transformasjon og transformerte organismer blir deretter isolert og klonet med den hensikt at man oppnår store populasjon-er som er istand til å uttrykke den nye genetiske Informasjon. Fremgangsmåter og anordning for å danne rekombinerte klonede elementer og omdanne eller transformere organismer med slike elementer, er meget omtalt i litteraturen. Se f.eks. H. L. Heynecker et al, Nature 263, 748 - 752 (1956); Cohen et al, Proe. Nat. Acad. Sei. USA 69,''2110 (1972); samme, 70, 1293
(1973); samme, 70, 3240 (1973); samme, 71, 1030 (1974); Morrow et al, Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 71, 1743 (1974);
Novick, Bacteriological Rev., 33, 210 (1969)J Hershfield et al, Proe. Soc. Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. 71, 3455 (1974) og... Jackon et al, ibid, 69, 2904 (1972). En generell diskusjon av emnet er skrevet av S. Cohen, Scieriti-fic American 233, 24
(1975). Ovennevnte publikasjoner inngår her som referanser.
Det er en rekke teknikker som er tilgjengelige for DNA-rekombinering hvor tilstotende ender av separate DNA-fragmenter justeres på en eller annen måte for derved å lette sammenbinding. Denne sammenbindingen refererer seg til dannel-sen av fosfodiesterbindinger mellom tilstotende nukleotider, vanligvis ved hjelp av enzymet T4 DNA ligase. Således kan butte ender direkte sammenbindes. Alternativt kan fragmenter som inneholder komplementære enkelttråder som nær sine tilstotende ender sammenbindes ved hjelp av hydrogenbindinger som så vil plasere de respektive endene for etterfblgende sammenbinding. Slike enkelttråder som her betegnes som sammenbundne avslutningsposisjoner eller termini, kan dannes ved tilsetning av nukleotider til butte ender ved å bruke terminal transferase, i visse tilfeller kun ved å bryte ned en tråd med en butt ende med et enzym såsom A -eksonuklease. Den mest vanlige teknikken er å bruke såkalte begrensende endonukleaser som spalter fosfodiesterbindingene i og omkring en enestående sekvens av nukleotider, vanligvis av en lengde på fra 4-6 basepar. Mange begrensende endonukleaser pg deres gjenkjennende posisjoner er kjente, og mest vanlig er det å bruke såkalt Eco RI-endonuklease. Begrensende endonukleaser vil spalte dobbelttrådet DNA ved rotasjonsmessig symmetriske •j^lindromer" og vil således etterlate seg sammenbundne termini. Således kan et plasmid eller et annet klonende element spaltes, hvorved man får termini som hver innbefatter halvparten av den gjenkjennende posisjonen for den begrensende endonukleasen. Et spaltet produkt av eksogent DNA oppnådd med den samme begrensende endonukleasen vil ha ender som er komplementære til de man finner i plasmiden.'Alternativt kan man tilveiebringe syntetisk DNA som innbefatter sammenbundne termini som kan innsettes i dét spaltede element. For å ned-
sette sammenbinding av elementets sammenbundne termini for man får innsatt eksogent DNA, så kan nevnte termini nedbrytes med alklisk fosfatase, hvorved man får molekylær seleksjon for lukkinger som innbefatter de eksogene fragmenter. Innbe-fatning av et fragment med passende orientering i forhold til de andre aspekter på elementet, kan bédres når fragmentet supplerer et klonende DNA som er bearbeidet av to forskjellige begrensende endonukleaser, og når det selv innbefatter termini som altså utgjor halvparten av de gjenkjennende posisjoner man hadde i de forskjellige endonukleaser.
Skjont det har vært utfort intensiv forskning i
de senere år med rekombinert DNA, så er det få resultater som umiddelbart har fort til praktiske fremgangsmåter. Dette har spesielt vist seg i forbindelse med en rekke forsok på å uttrykke polypeptider og lignende ved hjelp av koding ved såkalt "syntetisk DNA", enten man nå har konstruert nukleotid for nukleotid på vanlig måte eller oppnådd det ved såkalt revers traiskribsjon fra isolert in RNA (komplementær eller "cDNA"). I foreliggende oppfinnelse er det beskrevet en fremgangsmåte som muliggjor tilsynelatende for forste gang, at man kan få fremstilt et funksjonelt polypeptidprodukt fra et syntetisk gen, og en slik fremgangsmåte kan ha stor' anvendelse. Det produkt man her refererer til er somatostatin (Guillemin U.S.P. 3.904.594), en hemmer for sekresjonen av veksthormon, såsom insulin og glukagon, og effektene av nevnte somatostatin tyder på at det kan brukes ved behandlingen av akromelagi, akutt pankreatitis og insulin-avhengig sukkersyke. Se R. Guillemin et al, Annual Rev. Med 27, 379 (1976). Somatostatinmodellen viser klart at fremgangsmåten har vid anvendbarhet på
rekke forskjellige måter, noe som vil fremgå av de vedlagte tegninger og den etterfølgende detaljerte beskrivelse.
De vedlagte tegninger illustrerer et felt hvor foretrukne anvendelser av. oppfinnelsen kan komme til uttrykk, f.eks. i uttrykking av hormonet somatostatin ved hjelp av omdannede bakterier som inneholder rekombinerte plasmider. Fig. 1. Skjematisk oppsetning av prosessen: genet for somatostatin fremstilt ved kjemisk DNA-syntese, fes-tes til E. coli P-galaktosidasegenet på plasmiden pBR322. Etter transformering over i E. coli vil den rekombinerte plasmiden styre syntesen av et forloperprotein som spesielt kan spaltes in vitro ved metioninresidua ved hjelp av cyanogenbromid, hvorved man får et aktivt pattedyrpolypeptidhormon. A, T, C og G angir de karakteristiske baser (henholdsvis adenin, tymin, cytosin og guanin) i deoksyribonukleotidene i den kodende tråden i somatostatingenet. Fig. 2. En skjematisk struktur av et syntetisk gen hvis kodende tråd (dvs. den "ovre" tråd) består av kodoner for aminosyresekvensen i somatostatin (gitt). Fig. 3. Skjematisk illustrasjon av en foretrukken fremgangsmåte for konstruksjon av de nukleotidtrimerer som brukes.under konstruksjonen av syntetiske gener. På fig. 3 har man brukt den vanlige fremgangsmåte for å illustrere nukleotider, dvs. 5' OH er til venstre, mens 3' OH er til hbyre, f. eks.
Fig. U . Dette er et prosessdiagram for konstruksjonen av et rekombinert plasmid (f.eks. pSOMll-3) som er istand til å uttrykke et somatostatin ("SOM")-holdig protein, hvor man begynner med plasmidet pBR322. På fig. 4 er de omtrent-lige molekylvekter for hvert enkelt plasmid angitt i dalton ('d"). Apr og Tcr henholdsvis betegner gener for ampicillin og tetracyklinresistens, mens Tc<s>betegner tetracyklinfolsom-het på grunn av at man har fjernet en del av genet Tc . De relative posisjoner for forskjellige spesifikke spaltnings-stillinger for begrensende endonuklease på plasmidene er angitt (f.eks. Eco RI, Barn I, etc).
Fig. 5A og 5B. Her. er nukleotidesekvensen for to viktige deler av to plasmider angitt, såvel som retningen for transkribsjonen for det overforende RNA ("mRNA"), som alltid starter fra 5'-enden på den kodende tråden. Begrensende endonukleasesubstratposisjoner er også vist. Hver angitt sekvens inneholder både kontrollelementene for lak (laktose)-operonet, og kodonene for uttrykking av aminosyresekvensen i somatostatin (kursiv). Aminosyresekvensnummerne
for B-galaktosidase ("p-gal") er angitt i parenteser.
Fig. 6 - 8. Som mer detaljert beskrevet i den eksperimentelle diskusjonen, så angir disse figurer resultatene fra sammenlignende radioimmun-proveeksperimenter som viser somatostatinaktiviteteri på produktet fremstilt ved hjelp av de rekombinerte plasmider.
Fig. 9. Skjematisk struktur på syntetiske gener
hvis kodende tråder består av kodoner for aminosyresekvenser for A- og B-trådene i menneskeinsulin.
Fig. 10. Prosessdiagram for konstruksjonen av et rekombinert plasmid som er istand til å uttrykke B-kjeden i menneskeinsulin.
Detaljert beskrivelse
1. Fremstilling av gener som koder for heterologt nolyneptid
DNA-koding for ethvert polypeptid med kjent aminosyresekvens kan fremstilles ved at man velger kodonet ifolgeden genetiske koden. For å lette rensingen, så kan f.eks. oligodeoksyribonukleotidfragmenter, på f.eks. fra 11 - 16 nukleotider, fremstilles separat og så settes sammen i den for-dnskede sekvens. Man fremstiller således en forste og en annen serie av oligodeoksyribonukleotidfragmenter av hensikts-messig stdrrelse. Den fbrste serien som når den er satt sam- ijfsn i passende sekvens, vil gi en DNA-kodende tråd for poly-peptiduttrykking (se f.eks. fig. 2, fragmentene A, B, C og D). Den andre serien vil på lignende måte når den er satt sammen på en passende måte, gi en tråd som er komplementær til den kodende tråden (f.eks. fig. 2, fragmentene E, F, G og H). ■ Fragmentene for de respektive trådene bor fortrinnsvis over-lappe hverandre slik at deres komplementaritet fremmer en selvsammensetning via hydrogenbindinger på de sammenbindende avslutningsposisjoner på* fragmentblokkene. Etter sammensetningen kan det konstruerte genet avsluttes på vanlig kjent måte.
Degenerasjonen av den genetiske koden gir relativt stor frihet med hensyn til valg av kodoner for enhver gitt aminosyresekvens. For det foreliggende formål imidlertid, var det tre betraktninger som ble lagt'til grunn ved valg av kodon. For det fbrste ble kodoner og fragmenter valgt og satt sammen på en'slik måte at man unngikk for stor komplementaritet på fragmentene, unntatt for fragmenter som stotte inntil hverandre i det ferdige gen. For det andre unngikk man sekvenser som var rike på AT-basepar (f.eks. fem eller mer), spesielt når man hadde en sekvens som var rik på GC-basepar, noe som ble gjort for å unngå en for tidlig avslutning av transkribsjonen. For det tredje velger man en storre mengde kodoner av den type som er foretrukket ved uttrykkingen av mikrobielle genomer (se f.eks. W. Fiers et al, Nature 260, 500 (1976)). For det foreliggende formål har man definert det fblgende som kodoner "foretrukket for uttrykkingen av mikrobielle genomer":
I forbindelse med somatostatin er det mest foretrukne aminosyre (kodon)-forholdet i det strukturelle gen fSigende: gly (GGT), cys (TGT), lys (AAG), trp (TGG), ala (GCT, GCG), asn (AAT, AAC), phe (TTC, TTT), thr (ACT, ACG) og ser (TCC,
TCG).
Når det strukturelle genet for et foronsket polypeptid skal innsettes i et klonende element for uttrykking som sådan, så vil genet folge etter et "start"-kodon (f.eks. ATG) og umiddelbart fdlges av én eller flere avslutnings-eller stopp-kodoner (se fig. 2). Som nevnt nedenfor imidlertid, så kan aminosyresekvensen for et spesielt polypeptid uttrykkes med ytterligere protein som går foran og/eller folger etter. Hvis bruken av polypeptidet krever en avspalt-ning av det ytterligere protein, så kan passende spaltnings-posisjoner kodes inn for den posisjon hvor hovedpolypeptidet og det ytterligere protein henger sammen. Som vist på fig. 1 som et eksempel, er det uttrykte produkt der et forloperprotein som inneholder både somatostatin og størstedelen av (3-galaktosideasepolypeptidet. Her er ATG ikke nodvendig for innkoding for derved å få en start på oversettelsen, ettersom den ribosomale konstruksjonen på det tilstotende p-gal-aktosideaseproteinet gjor at det leses direkte over i somatostatingenet. En inkorporering av ATG-signalet vil imidler- t^-d kode for fremstilling av metionin, en aminosyre som spesielt spaltes lett av -cyanogenbromid, hvorved man får en lett fremgangsmåte for å omdanne forldperproteinet til det for-ønskede polypeptid.
Fig. 2 viser også et eksempel på et trekk som er foretrukket i heterologt DNA som siden skal brukes for rekombinering, dvs. at man tilveiebringer sammenbindende avslutningsposisjoner eller termini, fortrinnsvis slik at disse inngår en begrensende endonuklease-gjenkjennelsesposisjon på én av de to trådene. Som nevnt ovenfor bor nevnte termini eller a^slutningsposisjoner fortrinnsvis utformes slik at de skaper henholdsvis forskjellige gjenkjennelsesposisjoner ved rekombinering.
Skjdnt det som er angitt ovenfor har vist seg å gi
fint resultat med somatostatinmodellen, så er det underfor-
stått at heterolog DNA-koding kan brukes også for nesten en-
hver kjent aminosyresekvens, mutatis mutandis. Således er den teknikk som er beskrevet ovenfor og som vil bli mer detaljert beskrevet i det etterfølgende, også anvendbar mutatis mutandis, for fremstillingen av poly(amino)syrer, såsom poly-leucin og polyalanin, enzymer, serumproteiner, smertestillen-
de polypeptider såsom (3-endorfiner, som modulerer smerte-terskeler etc. Det er mest foretrukket at man fremstiller polypeptider som vil være pattedyrhormoner eller mellomprodukter for slike. Blant slike hormoner kan f.eks. nevnes somatostatin, menneskeinsulin, veksthormoner for mennesker og kveg, leutiniserende hormon, ACTH, pankreaspolypeptid etc. Mellomprodukter innbefatter f.eks. preproinsulin for mennesker, proinsulin for mennesker, A- og B-kjedene for menneskeinsulin osv. I tillegg til DNA fremstilt in vitro, så kan det hetero-loge DNA også innbefatte cDNA som er et resultat av en revers transkribsjon fra mRNA. Se f.eks. Ullrich et al, Science 196, 1313 (1977).
2. Rekombinert koding for uttrykking av forloperprotein
I den fremgangsmåte som skjematisk er vist på fig. 1, vil uttrykkingen gi et forloperprotein som inneholder både et polypeptid utkodet ved hjelp av et spesifikt heterologt strukturelt gen (somatostatin) og ytterligere protein (bestående av &&■ del av P-galaktosidaseenzymet). En selektiv spaltingsposi-sjon nær somatostatinaminosyresekvensen muliggjør en etter-følgende separasjon av det foronskede polypeptid fra det over-flødige protein. Det tilfelle som er vist er representativt for en rekke fremgangsmåter som er muliggjort ved den teknikk som her er beskrevet.
Mest vanlig vil spaltingen utfores utenfor det re-pliserende miljo for plasmiden eller for et annet element, f.-eks. etter at man har hostet den mikrobielle kulturen. På denne måten så vil en temporær konjugering av små polypeptider med overflddig protein bevare det fbrstnevnte mot f.eks. en in vivo-nedbrytning med endogene enzymer. Samtidig vil det overflødige protein vanligvis ta noe av bioaktiviteten fra det foronskede polypeptid mens man venter på den ekstra-cellulære spaltingen, med den effekt at man" oker biosikkerheten på fremgangsmåten. I visse tilfeller kan det selvsagt være onskelig å utfore spaltingen-inne i cellen. Således kan man tilveiebringe klonende elementer med DNA-koding for enzymer som danner insulinforloperne til den aktive form og som oper-erer samtidig med annet DNA kodet for uttrykking av forloper-formen.
I foretrukne tilfeller vil det spesielle foronskede polypeptid mangle interne spaltingsposisjoner som tilsvarer de man anvender for å kvitte seg med overflodig protein, og i de tilfeller hvor denne betingelse ikke er oppfylt, så vil man altså få konkurrerende reaksjoner som dog vil gi det foronskede produkt, dog i mindre utbytte. I de tilfeller hvor
det foronskede produkt er metionin-fritt, så har det vist seg å være meget effektivt å utfore spaltingen ved hjelp av cyanogenbromidspalting ved metionin som stbter inntil den forønskede sekvens. På lignende måte kan arginin- og lysin-frie produkter enzymatisk spaltes med f.eks. trypsin eller'chymotrypsin ved arg-arg, lys-lys eller lignende spaltingsposisjoner inntil den foronskede sekvens. I de tilfeller hvor spaltingen etter-later seg f.eks. uønsket arginin festet til det forønskede produkt, så kan dette fjernes ved karboksypeptidase-nedbrytning. Når man bruker trypsin for å spalte ved arg-arg, så kan lysin-posisjoner inne i det foronskede polypeptid forst beskyttes,
f.eks. ved maleihsyre eller citrakoninsyreanhydrider. De spaltingsteknikker som her er "beskrevet er kun angitt som eksempler.
Spaltbart protein kan uttrykkes inntil enten Celler N-terminalene på et spesifikt polypeptid, eller endog inne i polypeptidet selv, noe som er tilfelle i den sekvens som skiller proinsulin og insulin. Det element som brukes for kodingen kan igjen uttrykke et.protein som består av gjen-tatte sekvenser av det forbnakede polypeptid, som så hver kan skilles ved selektive spaltingsposisjoner. Det er imidlertid mest foretrukket at kodoner for overflbdig protein vil være oversatt på forhånd i det strukturelle genet for det foronskede produkt, noe som er vist på figurene. I ethvert tilfelle må man være forsiktig slik at man opprettholder en passende avlesningsramme i forhold til regulonet. ■■-
2. Uttrykking av immunogener
Evnen til å uttrykke både et spesifikt polypeptid
og overflbdig protein gjor det mulig å fremstille immunogen-iske stoffer. Polypeptid-"haptene" (dvs. stoffer som inneholder determinanter som er spesielt bundet ved hjelp av antistoffer o.l., men vanligvis for små til å utlbse en immunolo-gisk reaksjon) kan uttrykkes som konjugater med ytterligere protein i tilstrekkelig stbrrelse til at man får immunogenitet. Det B-gal-somatostatin-konjugat som her er fremstilt som et eksempel, er i virkeligheten av immunogenisk stbrrelse og kan forventes å frembringe antistoffer som vil binde soma-tostatinhaptenet. Proteiner som inneholder over 100 aminosyrer, vanligvis over 200 slike, vil ha immunogenisk karakter.
Konjugater fremstilt på den forannevnte måte kan brukes for å utlbse antistoffer som kan brukes under radio-immunologiske prover eller andre prover for haptenet; og alternativt ved fremstillingen av vaksiner. Man vil i det etter-følgende beskrive et eksempel på sistnevnte anvendelse. Cyanogenbromid - eller andre spaltingsprodukter av viralt beleggende protein vil gi oligopeptider som vil binde antistoff ut-lbst av proteinet selv. Hvis man derfor har gitt aminosyresekvensen for et slikt oligopeptidhapten, kan man fblgelig uttrykke heterologt DMA som et konjugat med ytterligere protein s^.m gir immunogenitet. Bruken av slike konjugater som vaksiner skulle forventes å gi mindre sidereaksjoner som vanligvis folger bruken av selve det beleggende protein for å
få immunitet.
4. Kontrollelementene
Fig. 1 viser en fremgangsmåte hvor en transformer-ende organisme uttrykker polypeptidprodukt fra heterologt DNA som er bragt under kontroll av et regulon "homologt" til organismen i dens uomdannede 'tilstand. Således vil laktose-avhengig E. coli-kromosomalt DNA bestå av et laktose eller
. "lak" operon som styrer laktosenedbrytning, f.eks. ved å
utlbse enzymet B-galaktosidease. I det spesielle tilfellet som er vist vil lak-kontrollelementene være oppnådd fra en bakterofag 7\plak 5, som er ineffektiv overfor E. coli. Fagens lak-operon er på sin side avledet ved transduksjon fra den samme bakteriearten, fblgelig "homogoliteten". Homologe reguloner som egner seg for bruk i den beskrevne fremgangs-
måte kan alternativt avledes fra plasmidisk DNA som er opp-rinnelig i organismen.
Enkelheten og effektiviteten for det angitte lak-fremmer-operatorsystem gjor det enkelt å bruke i det system som er beskrevet ovenfor, noe som også er tilbelle med dets evne til å bli indusert av IPTG (isopropyltio-B-D-galaktosid). Selvsagt kan man også bruke andre operoner eller deler av
disse, f.eks. lamda-fremmer-operator, arabinose-operon (fi 80 dara), eller colicin El, galaktose, alkalisk fosfatase eller tryptofan-operoner. Fremmer-operatorer avledet fra sist-
nevnte (dvs. "tryp-operon") kan forventes å gi 100% undertrykking mens man avventer induksjon (med indolakrylsyre) og etterfølgende innhbstning.
5. Generell plasmidkonstruksjon
Detaljene i den fremgangsmåte som skjematisk er
vist på fig. 4 vil fremgå av den etterfølgende eksperimentelle del. Det kan imidlertid på dette punkt være nyttig kort å diskutere de forskjellige teknikker som brukes under konstruksjon av rekombinert plasmid i den foretrukne utfbrelse.
Kloningen og uttrykkingen av det syntetiske somatostatingenet bruker to plasmider. Hvert plasmid har en EcoRI- substratposisjon i et forskjellig område på 6-galaktosidase-s&rukturgenet (se fig. 4 og 5). Innsettingen av det syntetiske somatostation-DNA-fragment i EcoRI-posisjonen i disse plasmider vil fblgelig bringe uttrykkingen av den genetiske informasjonen man har i dette fragment, under kontroll av de lak-operon-kontrollerende elementer. Etter at man har innsatt somatostatinfragmentet i disse plasmider, så skulle en oversettelse resultere i et somatostatinpolypeptid som foran seg enten har 10 aminosyrer (jp.SOMl) eller i virkeligheten hele B-galaktosidase-underenhetstrukturen (pS0Mll-3).
Selve plasmidkonstruksjonen starter med plasmid pBR322, et velkarakterisert klonende element. En introduk-sjon av lak-elementer i dette plasmid ble utfort ved å inn-sette et Haelll-begrensende endonukleasefragment (203 : nukleotider) som bar med seg lak-fremmeren, ,.CAP-bindeposisjonen, operatoren, ribosombindeposisjonen og de. fdrste 7 aminosyre-kodonene i det B-galaktosidase-strukturelle gen. Nevnte Haelll-fragment ble avledet fra 7\plak 5 DNA. Det EcoRI-spaltede PBR322-plasmid som hadde sine termini reparert med T4 DNA-polymerase og -deoksyribonukleotid-trifosfater, ble ende mot ende bundet til Haelll-fragmentet slik at man skapte EcoRI-termini ved innsetningspunktene. En sammenfdyning av disse HaellL og reparerte EcoRI-termini gir EcoRi-begrensende posisjoner (se fig. 4 og 5) -ved hver enkelt terminus. Transformanter av E. coli RR1 med denne DNA ble så valgt for re-sistens mot tetracycline (Tc) og ampicillin (Ap) på et medium av 5-brom-4-klor-incolylgalaktosid (X-gal). På dette indika-tormedium kunne man identifisere kolonier som var istand til å syntetisere 6-galaktosidase på grunn av et dkende antall titrerende repressorer for lak-operatorer, på grunn av kolo-nienes blå farge. Det er to mulige orienteringer på, Haelll-fragmentet, men disse kan skilles ved en asymmetrisk plaser-
ing av en Hha-begrensende posisjon på fragmentet. Plasmid pBHIO ble ytterligere modifisert slik at man eliminerte en EcoRI-endonukleaseposisjon distalt i forhold til lak-operatoren (pBH20).
De åtte kjemisk syntetiserte oligodeoksyribonukleotidene (fig. 2) ble merket ved nevnte 5'-termini med ( D p)-a-ATP ved polynukleotid-kinase og ble bundet sammen med T4 DNA- Ligase. Gjennom hydrogenbinding mellom de overlappende fragmenter vil somatostatingenet sette seg sammen selv og even-tuelt polymerisere seg til storre molekyler på grunn av de kohesive restriksjonsposisjonstermini. De sammenbundne produkter ble behandlet med EcoRI-og BamHI-begrensende endonukleaser for å utvikle det somatostatingen som er angitt på fig. 2.
Det syntetiske somatostatingenefragment med EcoRI-og Baml-termini ble bundet ti»I pBH20-plasmiden på forhånd behandlet med EcoRI- og BamHI-begrensende endonukleaser og alkalisk fosfatase. Behandlingen med alkalisk fosfatase gir molekylær seleksjon for plasmider som bærer det innsatte fragment. Ampicillin-resistente transformanter oppnådd med dette sammenbundne DNA ble undersokt for tetracyclinfblsom-het og flere ble undersokt med hensyn til innsettelsen av et EcoRi- BamHI-fragment av passende storrelse.-
Begge tråder av Ecp_RI-BamHI-fragmentene av plasmider fra to kloner ble analysert med hensyn til nukleotidsekvens-analyse idet man startet ut fra BarnHI-og EcoRI-posisjonene. Sekvensanalysen ble forlenget over de lak-kontrollerende elementer, og lak-fragmentsekvensen var intakt, og i ett tilfelle, pSOMl, så ble nukleotidsekvensen i begge tråder undersokt uavhengig av hverandre og hver ga den sekvens som er angitt på fig. 5A.
EcoRI- Pst-fragmentet i pSOMl-plasmiden med det lak-regulerende eller -kontrollerende element, ble fjernet og erstattet med EcoRI- Pst-fragment av pBR322 slik at man fikk plasmiden pSOMll. EcoRI-fragmentet fra\plak 5, som bar det lak-operon-kontrollerende området og mesteparten av det nevnte B-galaktosidase-strukturelle gen, ble innsatt i EcoRI-posisjonen i plasmiden pSOMll. Man forventet to orienteringer av Eco RI-lak-fragmentet i>plak 5. En av disse orienteringer ville gi passende avlesningsramme over i somatostatingenet, den andre ikke. Analyser av uavhengig isolerte kloner for somatostatin-aktivitet kunne så identifisere de kloner som inneholdt det passende orienterte gen, og av disse så fant man klonen som hadde betegnelsen pSOMll-3-
6. Mikroorganisme
Forskjellige encellede mikroorganismer har vært fore- slått som kandidater for transformasjon, såsom bakterier, sopp og alger. Dvs. de encellede organismer som kan dyrkes i kul-
tur eller under fermenteringsbetingelser. Bakterier er i de fleste tilfeller den mest hensiktsmessige organisme å arbeide • med. Bakterier som lar seg transformere innbefatter arter i familien Enterobacteriaceae, såsom forskjellige raser av Escherichia coli og Salmonella, familien Bacillaceae, såsom Bacillus subtilis, Pneumococcus, Streptococcus og Haemophilus influenzae..
Den spesielle organisme som ble valgt for somatostatin-undersokelsen som er mer detaljert beskrevet i det etter-følgende, var E. coli, rase RR1, genotype: Pro~Leu~Thi~RB~MB
rec A<+>Str<r>Lac y". E. coliRRI er"avlédet av E. coli HB101
(H.W. Boyer et al, J. Mol. Biol. (1969) 41; 459 - 472) ved
å krysse den med E. coli K12 rase KL16 som Hfr-donoren. Se J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Kulturer av både E. coli RR1 og
E. coli RR1 (pBRj522) er blitt levert den amerikanske type kultur kolleksjon uten begrensninger med hensyn til anvend-
else, og har henholdsvis fått ATCC nr. 31.343 og 31.344.
Den somatostin-produserende organisme er på lig-
nende måte levert under ATCC nr. 31.447.
I forbindelse med menneskeinsulin, ble A- og B-kjede-gener klonet i E. coli K-12 rase 294 (ende A, thi~, hsr",
hsmk<+>), ATCC nr. 31.446, og den organisme som ble brukt under uttrykkelse av A-kjeden er E. coli K-12 rase 294 (pIAl),
ATCC nr. 31.448. B-kjeden i menneskeinsulin ble forst ut-
trykt som et derivat av HB101, dvs. E. coli K-12 rase D1210
enlak<+>(i(°1o+z^y+), og den B-geneholdige organismen er på lignende måte levert under nr. ATCC 31.449. Alternativt kan B-genet innsettes i og uttrykkes fra den organismen som ble
nevnt forst, dvs. rase 294. Eksperimentell del
I. Somatostatin
1. Konstruksjon av somatostatingenefragmenter
Åtte oligodeoksyribonukleotider henholdsvis merket
A til og med H på fig. 2 ble forst konstruert, prinsipielt ved den modifiserte triestermetode som er beskrevet av K. Ita kura et al, J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975). I forbindelse med fragmentene C, E og H brukte man imidlertid en forbedret teknikk hvor fullt beskyttede trimerer forst fremstilles som basisenheter for oppbygning til lengre oligodeoksyribonukleo--tider. Den bedrede teknikk er skjematisk angitt på fig. 3, hvor B er tymin, N-benzoylert adenin, N-benzoylert cytosin eller N-isobutyrulert guanin. Som angitt på fig.'3 ble et overskudd av I (2 mmol) koblet med forbindelsen II (1 mmol)
i lopet av 60 minutter ved hjelp av et sterkt koplingsmiddel, nemlig 2,4,6-triisopropylbenzensulfonyltetrazolid (TPSTe,
4 mmol, 2). Etter fjerning av den 5'-beskyttende gruppe med 2% benzensulfonsyreopplbsning, så kunne 5'-hydroksyldimeren V utskiJ.es fra et overskudd av 3'-fosfodiestermonomeren IV ved enkel opplosningsmiddelekstraksjon med vandig NaHCO^-opplds-ning i CHCl^. Den fullt beskyttede trimerblokken ble fremstilt suksessivt fra 5'-hydroksyldimer V, I (2 mmol) og TPSTe (4 mmol) og isolert ved hjelp av kromatografi på silisiumdioksydgel slik det er beskrevet av B. T. Hunt et al, Chem. and Ind. , 1967, 1868 (1967).. Utbyttene av trimerer fremstilt ved hjelp av denne forbedrede teknikk, er angitt i tabell II.
De åtte oligodeoksyribonukleotidene etter fjerning av alle beskyttende grupper, ble renset ved hbytrykks væskekromatografi på "Permaphase AAX" (R.A. Henry et al, J. Chrom. Sei. II, 358 (1973))- Renheten av hver oligomer ble undersokt ved homokromatografi på tynnsjikt DEAE-cellulose og dessuten ved gelelektroforese i 20% akrylamidstykker etter merking av oåigomerene med ( X-^P)-ATP i nærvær av polynukleotidkinase.
Man fikk bare ett merket produkt fra hvert DNA-fragment.
2. Sammenbinding og akrylamidgelanalyse av somatostatin DNA -
5'-OH-termini på de kjemiske syntetiserte fragment-
er A til og med H ble separat fosforylert med T4-polynukleotidkinase. { J P)-(f-ATP ble brukt under fosforyleringen slik at reaksjonsproduktene kunne undersokes autoradiografisk,
skjont det er forstått at man også kan bruke umerket ATP.
Like for kinasereaksjonen ble 25 uCi av {)(-^2P)ATP (ca.
1500 Ci/mmol) (Maxam and Gilbert, Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 74, 1507 (1977)) fordampet til tdrrhet i 0,5 ml Eppendorfror. 5 mikrogram av fragmentet ble inkubert med 2 enheter T4-DNA-kinase (hydroksylapatittfraksjon, 2500 enheter/ml, 27), i 70 mmol tris-HCl pH 7,6, 10 mmol MgCl^, 5.. mmol ditiotreitol i et totalt volum på 150<y>ul i 20 minutter ved 37°C. For å
sikre maksimal fosforylisering av fragmentene for den senere sammenbindende reaksjonen, ble 10^ul av en blanding bestående av 70 mmol tris-HCl pH 7,6, 10 mmol MgCl2, 5 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP og to enheter DNA-kinase tilsatt og inkuberingen fortsatt i ytterligere 20 minutter ved 7°C. Fragmentene (250 nanog/^ul) ble lagret ved -20°C uten ytterligere behandling. Kinaserte fragmenter A, B, E og F (1,25 yug hver) ble bundet sammen i et totalt volum på 50<y>ul i 20 mmol tris-HCl pH 7,6,
10 mmol MgC^, 10 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP og 2 enhet-
er T4-DNA-ligase (hydroksylapatittfraksjon, 400 enheter/ml,
27) i 16 timer ved 4°C. Fragmentene C, D, G og H ble bundet sammen under lignende betingelser. Prover på 2<y>ul ble fjer-
net for analyse ved elektroforese på 10% polyakrylamidgel fulgt av autoradiografi (H.L. Heyneker et al, Nature 263, 748
(1976)) hvor de uomsatte DNA-fragmenter er representert ved
raskt vandrende materiale og hvor den monomeriske formen av de sammenbundne fragmenter vandrer sammen med bromfenolblått (BPB). Det skjer også en viss dimerisering på grunn av de kohesive ender på de sammenbunde fragmenter A, B, E og F, og på de sammenbundne fragmenter C, D, G og H. Disse dimerer er det som vandrer langsomst, og kan spaltes ved begrensende endonuklease EcoRI og BamHI, henholdsvis.
De to halve molekylene (sammenbundet A + B + E + F cfg sammenbundet C + D + G + H) ble forenet ved et ytterligere sammenbindingstrinn utfort i et sluttvolum på 150^ul ved 4°C i 16 timer. 1 mikroliter ble fjernet for analyse. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 15 minutter ved 65°C for å inak-tivere nevnte T4-DNA-ligase. Varmebehandlingen påvirker ikke vandringsmonsteret på DNA-blandingen. Tilstrekkelig begrensende endonuklease BamHI ble tilsatt reaksjonsblandingen for å spalte multimeriske former ^av nevnte somatostatin DNA i lb'pet av 30 minutter ved 37°C. Etter tilsetningen av NaCl til 100 mmol, ble DNA reagert med EcoRI-endonuklease. Den begrensende endonukleasereaksjonen ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon av DNA. Somatostatin-DNA-fragmentet ble renset fra uomsatt og delvis sammenbundne DNA-fragmenter ved preparativ elektroforese på en 10% polyakrylamidgel.
Det båndet som inneholdt somatostatin DNA-fragmentet ble skåret ut av gelen og DNA ble eluert ved å kutte gelen opp i små stykker og ekstrahere DNA med en elueringsbuffer (0,5 mol ammoniumacetat, 10 mmol MgCl2, 0,1 mmol EDTA, 0,1% SDS) over natten ved 65°C. DNA ble så utfelt med 2 volumer etanol, sentrifugert og gjenopplbst i 200^ul 10 mmol tris-HCl, pH 7,6, og dialysert mot den samme buffer hvorved man fikk en somatostatin DNA-konsentrasjon på 4^ug/ml.
3. Konstruksjon av rekombinerte plasmider
Fig. 4 viser skjematisk hvordan man konstruerer rekombinerte plasmider som innbefatter somatostatingenet,
og det vil i den etterfolgende beskrivelsen bli henvist til denne tegningen.
. A. Parenteralt plasmid t) BR322
Det' plasmid som ble valgt for den eksperimentelle somatostatin-kloningen var pBR322, et lite (molekylvekt ca. 2,6 megadalton) plasmid som. hadde resistensgener mot anti-biotika ampicillin (Ap) og tetracycline (Tc. Som vist på fig. 4 innbefatter ampicillinresistensgenet en spaltnings-posisjon for den begrensende endonukleasen Pstl, og tetra-cyclineresistensgenet innbefatter en lignende posisjon for begrensende endonuklease BamHI, og en EcoRI-posisjon er plasert mellom Ap<r->og TC<r->genene. Plasmidet pBR322 er avledet fra pBR313, et 5,8 megadalton Ap<r>Tc<r>Col<imm->plasmid (R.L. Rodriquez et al, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Bio- i°gy 5, 471 - 77 (1976), R.L. Rodriquez et al, Construction and Characterization of Cloning Vehicles, i Molecular Mecha-nlsms in the Control of Gene Expression, side 471 - 77, Academic Press, Inc. (1976)). Plasmid pBR322 er beskrevet mer detaljert i F. Bolivar et.al, "Construction and Char-..acterization of New Cloning Vehicles II.A Multipurpose Cloning System", Gene (november 1977).
B. Konstruksjon av plasmid pBHIO
5 mikrogram av plasmid pBR322 DNA ble reagert med
10 enheter av den begrensende endonukleasen EcoRI i 100 mmol
tris-HCl, pH 7,6, 100 mmol NaCl, 6 mmol MgCl2, ved 37°C i
30 minutter. Reaksjonen ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon; DNA-en ble.så utfelt med 2,5 volumer etanol og resuspendert i 50^ul T4-DNA-polymerasebuffer (67 mmol tris-HCl, pH 8,8, 6,7 mmol MgCl2, 16,6 mmol(NH^)2S0^, 167/Ug/ml storfeserumalbumin, 50^um hver av de angitte dNTP,(A. Panet et al, Biochem. 12, 5045 (1973)). Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 2 enheter T4-DNA-polymerase. Etter inkubering i 30 minutter ved 37°C ble reaksjonen avsluttet ved fenol-klorof orm-ekstraks jon av DNA fulgt av utfelling med etanol. 3 mikrogram >\plak<5->DNA (Shapiro et al Nature 224, 768 (1969)) ble brutt ned i 1 time ved 37°C med det begrensende enzym Haelll (3 enheter) i 6 mmol tris-HCl, pH 7,6, 6 mmol MgCl2, 6 mmol B-merkaptoetanol i et sluttvolum på 20/ul. Reaksjonen ble stoppet ved oppvarming i 10 minutter ved 65 C. pBR322-behandlet DNA ble blandet med den Haelll-reagerte Aplak -DNA og ende mot ende bundet sammen i et sluttvolum på 30^ul med 1,2 enheter T4-DNA-ligase (hydroksylapatittfraksjon, A. Panet et al, supra) i 20 mmol tris-HCl, pH 7,6, 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP i 12 timer ved 12°C. Den reagerte DNA-blanding ble dialysert mot 10 mmol tris-HCl,
pH 7,6, og brukt for omdannelse eller transformering av E. coli-rase RR1. Transformanter ble valgt for tetracycline- og ampi-cillinresistens på minimumsmediumplater inneholdende 40^ug/ml5-brom-4-klor-indolylgalaktosid (X-gal)-medium (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972)). Kolonier som kunne brukes for syntesen av S-galaktosidase ble identifisert ved sin blå farge. Etter undersdkelse av 45 uavhengig isolerte blå kolonier ble 3 av
,dem funnet å inneholde plasmid DNA som hadde to Eco RI-posisjoner atskilt med ca. 200 basepar. Posisjonen på et asymmetrisk plasert Hhal-fragment i det 203 b.p. Haell-lak-kontrol-lerrende fragment (W. Gilbert et al i Protein-Ligand Inter-actions, H. Sand and G. Blauer, Eds. (De Gruyter, Berlin
(1975) side 193 - 210) muliggjor en bestemmelse av orienteringen på HaellI-fragmentet, nå et EcoRI-fragment i disse plasmider. Man kunne påvise at plasmid pBHIO hadde dette fragment i den foronskede orientering, dvs. at lak-transkribsjonen går over i Tc<r->genet i plasmiden.
C. Konstruksjon av plasmid pBH20
Plasmid pBHIO ble deretter modifisert for å elimi-
nere EcoRI-posisjonen distalt i forhold til lak-operatoren.
Dette ble utfort ved selektiv EcoRI-endonuklease-spalting
ved den distale posisjon, noe som innbefatter delvis beskyt-telse ved hjelp av RNA-polymerase av den andre EcoRI-posisjonen, som er lokalisert mellom nevnte Tc<r->og lak-promotorene, som bare ligger ca. 40 basepar fra hverandre. Etter binding med RNA-polymerase ble DNA (5/Ug) reagert med EcoRI (1 enhet)
i et sluttvolum på 10 /ul i 10 minutter ved 37°C. Reaksjon-
en ble stoppet ved oppvarming til 65 oC i 10 minutter. De
• EcoRI-kohesive termini ble reagert med Sl-nuklease i 25 mmol Na-acetat, pH 4,5, 300 mmol NaCl, 1 mmol ZnCl2ved 25°C i
5 minutter. Reaksjonsblandingen ble stoppet ved tilsetning av EDTA (10 mmol til slutt) og tris-HCl, pH 8, (50 mmol til slutt). DNA-en ble fenol-kloroform-ekstrahert, etanol-utfelt og re-'suspendert i 100<y>ul T4-DNA-sammenbindingsbuffer. T4-DNA-
ligase (1/ul) ble tilsatt, og blandingen inkubert ved 12°C
i 12 timer. Det sammenbundne DNA ble transformert i E. coli-rase RRI og Ap<r>Tc<r->transformantene ble utvalgt på et X-gal-anti-biotikamedium. Begrensende enzymanalyse av DNA utvalgt fra 10 isolerte blå kolonier viste at disse kloner bar plasmid-DNA med én EcoRI-posisjon. 7 av disse koloniene hadde beholdt EcoRI-posisjonen plasert mellom lak-operatoren og Tc<r->promotor-en. Nukleotidsekvensen fra EcoRI-posisjonen og over i den lak-regulerende delen av én av disse plasmider, nemlig pBH20, kunne bekreftes. Plasmiden ble deretter brukt for å klone somatostatingenet.
D, . Konstruksjon av plasmid pSOM 1
20 mikrogram av plasmidet pBH20 ble reagert til fullstendighet med begrensende endonukleaser EcoRI og BamHI 1 et sluttvolum på 50^ul. Bakteriell- alkalisk fosfatase ble tilsatt (0,1 enhefWorthington BAPF"), og inkuberingen ble fortsatt i 10 minutter ved 65°C. Reaksjonene ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstrasjon, og DNA utfelt med 2 volumer etanol, sentrifugert og opplost i 50^ul 10 mmol tris-HCl, pH 7,6, 1 mmol EDTA. Den alkaliske fosfatase-behandlingen vil effektivt hindre selvsammenbinding av EcoRIy og BamHI-behandlet pBH20-DNA, men sirkulære rekombinerte plasmider som inneholder somatostatin DNA kan dog dannes ved sammenbinding. Ettersom E. coli RR1 blir omformet med meget lav effektivitet av det lineære plasmid DNA, så vil hovedmengden av transformantene inneholde rekombinerte plasmider. 50 mikroliter somatostatin DNA (4<y>ug/ml) ble bundet sammen med 25^ul av BamHI, EcoRI, alkalisk fosfatase-behandlet pBH20-DNA i et totalt volum på 50^ul inneholdende 20 mmol tris-HCl, pH 7,7, 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP og 4 enheter t4-DNA-ligase ved 22°C. Etter 10, 20
og 30 minutter ble ytterligere somatostatin DNA (40 nanogram) tilsatt reaksjonsblandingen (gradvis tilsetning av somatostatin DNA begunstiger sammenbinding til plasmidets fremfor en selvsammenbinding). Sammenbinding ble fortsatt i 1 time fulgt av en dialyse av blandingen mot 10 mmol tris-HCl, pH 7,6. I et kontrolleksperiment ble BamHI, EcoRI, alkalisk fosfatase-behandlet pBH20-DNA bundet sammen i fravær av somastotatin DNA under tilsvarende betingelser. Begge preparater ble brukt uten ytterligere behandling for transformering av E. coli RR1. Transformeringseksperimentet ble utfort i et såkalt "P3-apparat" (National Institutes of Health, U.S.A., Recombinant DNA Research Guidelines, 1976). Transformantene ble utvalgt på minimums-mediumplater inneholdende 20^ug/ml<*>Ap og 40 ^ug/ml X-gal. Det ble isolert 10 transformanter som alle var sensitive overfor Tc. Av hensiktsmessighetsgrunner ble disse betegnet pSOMl, pS0M2 etc. til pSOMlO. Under kon-trolleksperimentet oppnådde man ingen transformanter. 4 av de 10 transformantene inneholdt plasmider med både en EcoRI-posis jon og en BamHI-posisjon. Stbrrelsen på det lille EcoRI-,
BamHI-fragmentet i disse rekombinerte plasmider var i alle fire tflfell ene lik stdrrelsen på det in vitro-fremstilte somatostatin DNA. Basesekvensanalyse ifolge Maxam and Gilbert Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 74, 560 (1977) viste at plasmiden
pSOMl hadde, fått innsatt det foronskede somatostation DNA-fragment.
DNA-sekvensanalysen av klonen som bar plasmiden pSOMl forutsa at den skulle produsere et peptid bestående av somatostatin. Imidlertid «kunne ingen somatostation-radio-immunitets-aktivitet påvises i ekstrakter av celleklumper eller kulturvæsker, heller ikke kunne man påvise et nærvær av somatostation når en voksende kultur ble tilsatt direkte til 70% maursyre og cyanogenbromid. Man har kunnet observere at E. coli RRl-ekstrakter meget raskt nedbryter eksogen somatostatin. Fraværet av somatostatinaktivitet i kloner som bærer plasmid pSOM 1 kunne derfor være et resultat av intra-cellulær nedbrytning ved hjelp av endogene protéolytiske enzymer. Plasmid pSOM 1 ble folgelig brukt for å konstruere en plasmid som koder for et forloperprotein som innbefatter somatostatin og som er tilstrekkelig stort til at man kan for-vente at det skal være resistent overfor proteolytisk nedbrytning.
E. Konstruksjon av plasmidene pSOM 11 og pSOM 11- 5
Det ble konstruert et plasmid hvor somatostatingenet kunne plaseres ved C-terminus på B-galaktosidasegenet, idet man holdt oversettelsen i fase. Nærværet av en EcoRI-posisjon nær nevnte C-terminus i dette gen og den tilgjengelige aminosyresekvensen i dette protein (B. Polisky et al, Proe. Nat. Acad. Sei., U.S.A. 73, 3900 (1976), A.V. Fowler et al, Id., 74, 1507 (1976), A.I. Bukhari et al, Nature New Biology 243, 238 (1973) og K.E. Langley, J. Biol. Chem. 250,
2587 (1975)) muliggjorde en innsettelse av EcoRI BamHI-somatostatingenet i EcoRI-posisjonen samtidig som man opprettholdt en riktig avlesningsramme. For konstruksjon av en slik plasmid, ble pSOM 1 DNA (50<y>ug) brutt ned med de begrensende enzymer EcoRI og Pstl i et sluttvolum på 100<y>ul. En preparativ 5% polyakrylamidgel ble1 brukt for å skille det store Pst- EcoRI-fragment som bærer somatostatingenet fra det mindre
fragmentet som bærer de lak-kontrollerende elementene. Det sto-^5båndet ble, skåret ut av gelen og DNA-eluert ved å skjære gelen opp i mindre stykker og ekstrahere DNA ved 65°C over natten. På lignende måte ble plasmid pBR322 DNA (50^ug) nedbrutt med Pstl- og EcoRI-begrensende endonukleaser, og de to resulterende DNA-fragmenter renset ved preparativ elektroforese på en 5% polyakrylamidgel. Det mindre Pstl- EcoRI-fragment fra pBR322 (l^ug) ble bundet sammen med det store Pstl- EcoRI DNA-fragment (5^ug) fra pSOM 1 i et sluttvolum
på 50/ul med 1 enhet av T4-DNA-ligase ved 12°C i 12 timer. Den sammenbundne blandingen ble brukt for å transformere
E. coli RRI, og transformanter ble utvalgt med hensyn til ampicillin-reåstens på X-gal-medium. Som ventet ga nesten alle AP -transformantene (95%) hvite kolonier (ingen lak-oerator) på X-gal-indikatorplater. Det resulterende plasmid pSOM 11 ble brukt for konstruksjon av plasmid p SOM 11-3.
En blanding av 5/Ug pSOM 11 DNA og 5/Ug /\ pl ak -DNA ble nedbrutt med EcoRI (10.enheter i 3o minutter ved 37°C). Den begrensende endonukleasereaksjonen ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon. DNA ble så etanol-utfelt og resuspendert i T4-DNA-ligasebuffer (50/ul). 1 enhet T4-DNA-ligase ble tilsatt blandingen og inkubering utfort i 12 timer ved 12°C. Blandingen med de sammenbundne fragmenter ble dialysert mot 10 mmol tris-HCl, pH 7,6, og brukt for å transformere E. coli-rase RRI. Transformanter ble utvalgt for Ap<r>på X-gal-plater inneholdende ampicillin og undersokt for mulighet for B-galaktosidaseproduksjon. Ca. 2% av koloniene var blå (pSOM 11-1, 11-2 etc). En analyse av begrensende enzym fra plasmid-DNA oppnådd fra disse kloner viste at alle plasmidene bar' et nytt EcoRI-fragment på ca. 4,4 megadalton, som bærer de lak-operon-kontrollerende posisjonene og mesteparten av B-galaktosidasegenet. Ettersom det er mulig med to orienteringer på EcoRi-fragmentet, ble den asymmetriske plaseringen på en Hindlll-begrensende.posisjon brukt for å bestemme hvilke av disse kolonier som bar dette Ec£RI-fragment med en lak-transkribsjon som gikk over i somatostatingenet.
En HindIII- Bam HI-dobbelnedbrytning indikerte at bare de kloner som bar plasmidene pSOM 11-3, pSOM 11-5, pSOM 11-6
og pSOMll-7 inneholdt EcoRI-fragmentet i denne orientering.
4^_ Radioimmunprove for somatostatinaktivitet ' Den kjente standard radioimmunprove (RI) for somastotatin (A. Arimura et al, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975) ble modifisert ved å senke prbvevolumet og ved å bruke f osf atbuf f er. Tyr^-somatostatin ble jodisert ved å
bruke en kloramin-T-fremgangsmåte (Id.). Vor å undersoke for somatostatin ble prbven vanligvis i 70% maursyre inneholdende 5 mg cyanogenbromid pr. ml torket i et konisk poly-propylenrdr (0,7 ml, Sarstedt) over fuktig KOH under vakuum. 20 mikroliter PBSA-buffer (75 mmol NaCl, 75 mmol natrium-fosfat, pH 7,2, 1 mg/ml av storfeserumalbumin, og 0,2 mg/ml natriumazid) ble tilsatt fulgt av 40^ul av en (12-^I )-somatostatin-"cocktail" og 20^ul av en 1000-gangers fortynning i PBSA av kanin-antisomatostatin-immunitetsserum S39 (Vale et al, Metabolism 25, 1491 (1976)). Nevnte (<125>I)-somatostatin-cocktail inneholdt pr. ml PBSA-buffer: 250^ug normalt kanin-gammaglobulin (Antibodies, Inc.), 1500 entheter protease-inhibitor ("Trasylol", Calbiochem) og ca. 100.000 "counts" av jTyr^-somatostatin. Etter minst 16 timer ved romtemperatur tilsatte man 0,333 ml geit-anti-kanin-gammaglobu-lin (Antibodies, Inc., P = 0,03) i PBSA-buffer til prove-rorene. Blandingen ble inkubert i 2 timer ved 37°C, av-kjolt til 5°C og så sentrifugert ved 10.000 ganger g i 5 minutter. Den overliggende væske ble fjernet og bunnfallet tellet i en gammateller. Med den mengde antiserum som ble brukt ble 20% av "the counts" utfelt uten umerket konkurrerende somatostatin. Bakgrunnen med somatostatin (200 nanogram) var vanligvis 3%. En halvmaksimal konkurranse ble oppnådd med 10 pg somatostatin. Initielle eks-prementer med ekstrakter av E. coli-rase RRI (den mottagende rasen) indikerte at mindre enn 10 pg somatostatin kunne lett påvises i nærvær av 16<y>ug eller mer av det cyanogenbromid-behandlede, bakterielle protein. Mer enn 2 yug protein fra de maursyre-behandlede bakterielle ekstrakter forstyrret til en viss grad ved å oke bakgrunnen, men cyanogenbromidspalting ville i hby grad redusere denne forstyrrelse. Rekon-struksjonseksperimenter viste at somatostatin er stabilt i cyanogen-bromid-behandlede ekstrakter.
A j_ Konkurranse ved hjelp av bakterieekstrakter
f Rasene E. coli RRI (pSOM 11-5) og E. coli RRI CpSOMll-4) ble dyrket ved 37°C til et antall av 5 x IO<8>
celler pr. ml i Luriamedium. Deretter ble IPTG tilsatt til 1 mmol og veksten fortsatte i. 2 timer. 1-ml prover ble sentrifugert i et par sekunder i en Eppendorf-sentrifuge og bunnfallet ble suspendert i 500<y>ul 70% maursyre inneholdende 5 mg cyanogenbromid pr. ml. Etter ca. 24 timer ved romtemperatur ble provene fortynnet 10 ganger i vann og de volumer som er angitt på fig. 6A ble undersokt i tre paraleller for somatostatin. På fig. 6A er "B/B0" forholdet mellom (<1>25l)-somatostatin bundet i nærvær av proven i forhold til det som er bundet i fravær av konkurrerende somatostatin. Hver punkt er et middel av tre paralleller. Proteininnholdet i de ufor-tynnede prover ble bestemt til 2,2^ug/ml for E. coli RRI (pSOMll-5) og 1,5 mg/ml for E. coli RRI (pSOM-4).
B. Forste undersokelse av pSOMll- kloner for somatostatin
Cyanogenbromid-behandlede ekstrakter av 11 kloner (pSOMll-2, pSOMll-3 etc.) ble gjort som beskrevet ovenfor i forbindelse med fig. 6A. 30 mikroliter av hvert ekstrakt ble brukt i tre paralleller for en radioimmunitetsprove, og resultatene er angitt på fig. 6B. Variasjonsområdet for provepunktene er angitt. Verdiene for picogram-somatostatin ble avlest fra en standardkurve oppnådd som en del av det
samme eksperimentet.
De radioimmunprSveresultater som er beskrevet så
langt kan summeres på folgende måte. I motsetning til resultatene fra eksperimentene med pSOMl, få fant man at 4 kloner (pSOMll-3, 11-5, 11-6 og 11-7) hadde en lett påvisbar somatostatin-radioimmunaktivitet, fig. 6A og 6B. En analyse av begrensende fragmenter viste at pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6
og pSOMll-7 hadde den foronskede orienteringen på lak-operonet, mens pSOMll-2 og 11-4 hadde motsatt orientering. Det er således en fullstendig korrelasjon mellom korrekt orientering på lak-operonet og produksjonen av somatostatin-radioimmunaktivitet.
C. Effekter av IPRG-induksjon og CNBr-spalting på positive
og negative kloner
Utformingen på somatostatin-plasmidet forutsier at syntesen av somatostatin skulle være under kontroll av lak-«peronet. Lak-undertrykkergenet er ikke inkludert i plasmidet og den mottagende rasen (E. coli RRI) inneholder bare kromosomalt lak-undertrykkergen av den vilde typen som gir bare fra 10 - 20 undertrykkermolekyler pr. celle (15). Plas-midkopitallet (og derfor antallet lak-operatorer) er ca. 20 - .30 pr. celle, slik at en fullstendig undertrykking er umulig. Som vist i tabell III i det etterfølgende så ble den spesifikke aktiviteten for somatostatin i E. coli RRI (pSOMll-3) oket ved IPTG, en induserende forbindelse for lak-operonet. Som ventet var induksjonsnivået lavt, varierende fra 2,4 - 7 ganger. I eksperiment 7 (tabell III) ble også cc-aktiviteten, et mål for de forste 92 aminosyrene i B-galaktosidase, også oket med en faktor på 2. I flere eksperimenter var det slik at man ikke kunne påvise noe somatostatin-radiimmunakti-. vitet for cyanogenbromidspalting av det totale cellulære protein. Ettersom det antiserum som er brukt ved radioimmum-proven, nemlig S 39, krever et fritt N-terminalt alanin, så er det ikke forventet noen aktivitet for cyanogenbromid-spaltingen.
T a b e 1 1 III
Somatostatin- radioimmun- spesifikk aktvitet Forkortelser: Luriamedium, LB, isopropyltiogalaktosid, IPTG, cyanogenbromid, CNBr, somatostatin, SS.
Protein ble målt ved den fremgangsmåte som er angitt av Brad-ford, Anal. Biochem. 72, 248 (1976).
D. Gelfiltrering av cyanogenbromid- behandlede ekstrakter
Maursyre og cyanogen-behandlede ekstrakter av positive kloner (pSOM 11-3, 11-5, 11-6 og 11-7) ble slått sammen, (totalt volum 250<y>ul), torket og resuspehdert i 0,1 ml 50% eddiksyre. (^H)leucin ble tilsatt og proven påsatt en 0,7 x 47 cm kolonne av "Sephadex G-50"i 50% eddiksyre. Prover på 50 mikroliter av kolonnefraksjonene ble undersokt for somatostatin. Sammenslåtte negative kloneekstrakter (11-2, 11-4 og 11-11) ble behandlet identisk. Resultatene fremgår av fig.
5C. På samme kolonne er kjente somatostatineluater (Beckman Corp.) angitt (SS). I dette system er somatostatin vel skilt fra eksluderte storre peptider og fullt inkluderte mindre molekyler. Bare ekstrakter av kloner som var positive for somatostatin viste radioimmunaktivitet i kolonnefraksjonene og denne aktivitet vil elueres i samme posisjon som kjemisk syntetisert somatostatin.
Oppsummering av aktivitetsinformasjon
De data som fastslår en syntese av et polypeptid inneholdende en somatostatin-aminosyresekvens kan angis på folgende måte: (1) Somatostatin-radioimmunaktivitet er til-stede i E. coli-celler med plasmiden pSOMll-3, som inneholder et somatostatingen som har en riktig sekvens og har riktig orientering av lak- EcoRI-DNA-fragmentet. Celler med denne nærstående plasmid pSOMll-2, som har samme somatostatingen, men motsatt orientering på lak- EcoRI-fragmentet, gir ingen påvisbar somatostatin-aktivitet: (2) Som forutsatt på grunn av sammensetningen kunne man ikke påvise noen somatostatin-radioimmunaktivitet for etter en cyanogenbromid-behandling av celleekstraktet; (3) Somatostatin-aktiviteten er under kontroll av lak-operonet, noe som kunne påvises ved en indu-sering med IPTG, en induserende forbindelse for lak-operonet;
(4) Somatostatin-aktiviteten vil utkromatograferes samtidig
med kjent somatostatin på "Sephadex G-50"; (5) DNA-sekven-sen i det klonede somatostatingen er korrekt. Hvis oversettelsen er ute av fase, så vil man få fremstilt et peptid som er forskjellig fra somatostatin i hver eneste posisjon. Radioimmunaktivitet kan påvises som indikerer at et peptid nærstående til somatostatin blir fremstilt, og oversettelsen må således være i fase. Ettersom oversettelsen skjer i fase, vil den genetiske koden gjore at man får fremstilt et peptid med ndyaktig samme sekvens som i somatostatin; (6) til slutt kan det angis at de ovennevnte prover av E. coli RRI (pSOMll-3)-ekstrakter hemmer frigjoringen av voksehormoner fra rotte-hypofyseceller, mens prover av E. coli RRI (pSOMll-2) fremstilt helt parallelt og med samme proteinkonsentrasjon ikke hadde noen effekt på veksthormonfrigjdringen.
Stabilitet, utbytte og rensing av somastotatin
De raser som bærer EcoRI-lak-operonfragmentet (pSOMll-2, pSOMll-3 etc.) skiller seg med hensyn til plasmidets fenotype. Etter 15 generasjoner vil således bare halvparten av E. coli RRI (pSOMll-3)-kulturen være intakt for fremstilling av B-galaktosidase, dvs. at den har lak-operatoren, og av disse kolonier var ca. halvparten ampicillin-resistent. Raser som var positive (pSOMll-3) og negative (pSOM-11-2) for somatostatin var ustabile, og vekstuskjev-heten antar man folgelig kommer at der produseres for meget av ufullstendigi og inaktiv galaktosidase. Utbyttet av somatostatin varierte fra 0,001 til 0,03% av det totale cellulære protein (tabell l) antagelig et resultat av seleksjonen for celler i kultur med plasmider med et uttrbket lak-område. De hbyeste utbytter av somatostatin fikk man fra preparater hvor veksten var startet ut fra en enkelt ampicillin-resistent koloni. Selv i slike tilfeller, ville 30% av cellene ved inn-ijf&sting ha utelukkelser i lak-området. Lagring i frossen tilstand _lyofilisering) og vekst for innhøsting av en enkelt slik koloni kan fblgelig brukes. Utbyttet kan ogsådkes ved - f.eks. å bruke bakterieraser som overproduserer lak-under-trykker slik at uttrykningen av forldperproteinet i alt vesentlig blir totalt undertrykket, for induksjon og innhbsting. Alternativt, som nevnt tidligere, kan man også bruke et tryptofan eller et annet openator-promotor-system som vanligvis er totalt undertrykket.
I det rå ekstrakt som oppstår fra en cellenedbryt-ning, f.eks. i en Eaton-presse, så vil G-galaktosidase-somatostatinforldperproteinet være uoppldselig og ble funnet i et forste bunnfall fremstilt ved lav sentrifugeringshas-tighet. Aktiviteten kan opploseliggjor i. 70% maursyre, 6-molar guanididiumhydroklorid eller 2% natriumdodecylsulfat. Mest foretrukket ble imidlertid råekstraktet fra Eaton-pressen ekstrahert med 8-molar urea og residuet spaltet med cyanogenbromid. I innledende eksperimenter ble somatostatin-aktiviteten avledet fra E. coli-rase RRI (pSOMll-3) anriket ca. 100 ganger ved alkoholekstraksjon av det spaltede produkt og etterfblgende kromatografi på "Sephadex G-50" i 50% eddiksyre. Når produktet igjen ble kromatografert på "Sephadex G-50" og så underkastet hbytrykks-væskekromatografi, fikk man i alt vesentlig rent somatostatin.
II. Menneskeinsulin
Den teknikk som tidligere er blitt beskrevet ble således provet for fremstilling av menneskeinsulin. Således ble genene for insulin B-kjede (104 basepar) og for insulin A-kjede (77 basepar) utformet fra aminosyresekvensen i menne-skepolypeptidene, hvert med enkelttrådete kohesive terminii for EcoRIx og BamHI-begrensende endonukleaser og hver enkelt utformet for separat innsetning i pBR322-plasmider. De syntetiske fragmenter, deca- til pentadeca-nukleotider ble syntetisert ved den såkalte blokk-fosfotriestermetoden idet man brukte trinukleotider som byggeblokker ot til slutt renset med hbytrykks-væskekromatografi (HPLC). De syntetiske gener for menneskeinsulinets A- og B-kjeder ble så klonet separat
inn i plasmid pBR322. De klonede syntetiske gener ble festet % il et E. coli B-galaktasidasegen som beskrevet tidligere hvorved man fikk en effektiv transkribsjon, oversettelse og et stabilt forloperprotein. Insulinpeptider ble spaltet fra B-galaktasidaseforloperen, påvist ved radioimmunitetsprdver og deretter resnet. Insulin-radioimmunitetsprdve-aktiviteter ble så utviklet ved blanding med E. coli-produkter.
1. Utforming og syntese av menneskeinsulingener
De gener som ble konstruert for menneskeinsulin er vist på fig. 9. Genene for menneskeinsulin, B-kjede og A-kjede, ble utformet fra aminosyresekvensene i menneskepoly-peptider. 5'-endene i hvert gen har en enkelttrådet kohesiv termini for EcoRI- og BamHI-begrensende endonukleaser, for å få en korrekt innsetning av hvert gen i plasmid pBR322. En Hindlll-endonukleasegjenkjennende posisjon ble inkorporert i midten av B-k jedegenet- for aminosyresekvensen Glu-Ala for å lette sammensetning og verifisering av hver halvpart av genet separat for man konstruerte hele B-kjedegenet. B-kjede-og A-kjedegenet ble utformet slik at det ble bygget opp fra 29 forskjellige oligodeoksyribonukleotider, varierende fra deca-mer til pentadecamerer. Hver pil indikerer det fragment som ble syntetisert ved den forbedrede fosfotriestermetoden, Hl til H8 og Bl til B12 for B-kjedegenet og Al til All for A-kjedegenet.
2. Kjemisk syntese av oligodeoksyribonukleotider
Materialer og metoder for syntese av oligodeoksyribonukleotider var i alt vesentlig som beskrevet av Itakura, K. et al (1975) J. Biol. Chem. 250, 4592 og Itakura, K. et al
(1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327, bortsett fra disse modi-fikasjoner: a) De helt beskyttelde mononukleotider, 5'-0-di-metoksytrityl-3'-p-klorfenyl-B-cyanoetyl-fosfater ble synte-tisert fra nukleosidderivatene ved å bruke et monofunksjonelt fosforyleringsmiddel, dvs. p-klorfenyl-B-cyanoetyl-fosforo-kloridat (1,5-molar ekvivalent) i acetonitril i nærvær av 1-metyl-imidazol Van Boom, J. H. et al (1975) Tetrahedron el, 2953. Produktene ble isolert i stor skala (100 - 300 g) ved preparativ væskekromatografi (Prep 500 LC, Waters Associates). b) Ved å bruke opplosningsmiddelekstraksjonsmetoden
(Hirose, T. et al (1978) Tetrahedron Letters, 2449) ble 32 % ifunksjonelle trimerer syntetisert (se tabell IV) i 5 - 10 mmol-skala, og 13 trimerer, 3 tetramerer og 4 dimerer som 3'-terminusblokker i 1 mmol-skala. Homogeniteten på de fullt beskyttede trimerer ble undersokt ved tynnsjiktkromatografi på silisiumdioksydgel i 2 metanol/kloroform-opplosningsmiddel-systemer: opplosningsmiddel a, 5% volum/volum og opplosningsmiddel b, 10% volum/volum (se tabell IV). Ut fra disse for-bindelser syntetiserte man 29 oligodeoksyribonukleotider med definert sekvens, 18 for B-kjeden og 11 for A-kjedegenet.
Basisenhetene som ble brukt for å konstruere poly-nukleotidene var 2 typer av trimerblokk, dvs. de bifunksjonelle trimerblokkene som er angitt i tabell IV og de tilsvarende 3'-terminus-trimerer beskyttet med en anisoylgruppe ved 3'-hydroksygruppen. Den bifunksjonelle trimeren ble hyd-rolysert til den tilsvarende 3<1->fosfodiesterkomponenten med en blanding av pyridin-trietylamin-vann (3:1:1 volum/volum) og dessuten til den tilsvarende 5'-hydroksylkomponenten med 2% benzensulfonsyre. Nevnte 3<1->terminusblokk ble behandlet med 2% benzensulfonsyre slik at man fikk den tilsvarende 5'-hydroksylforbindelsen. Koplingsreaksjonen mellom et overskudd av nevnte 3'-fosfodiestertrimer (1,5-molar ekvivalent) og med 5'-hydroksylkomponenten (1-molar ekvivalent) i nærvær av fra 3-4 ekvivalenter av 2,4,6-triisopropylbenzensulfonyltetrazolid (TPSTe) var nesten fullstendig i lopet av 3 timer. For å fjerne overskuddet av 31 —fosfodiesterblokk—reaktanten ble reaksjonsblandingen fort gjennom en kort silisiumdioksyd-gelkolonne satt på på et sintrert glassfilter. Kolonnen ble vasket forst med CHCl^for å eluere noen sideprodukter og koplingsmidlet, og deretter med CHCl^:MeOH (95:5 volum/volum) hvor nesten alt av den fullt beskyttede oligomer ble eluert. Under disse betingelser ble den ladede 3'-fosfodiesterblokk-reaktanten tilbake i kolonnen. På lignende måte ble blokk-koplinger gjentatt inntil man fikk den foronskede mengde.
Hoytrykksvæskekromatografi (HPLC) ble brukt under oligonukleotidsyntesen for a) analyse av hver trimer og tetramerblokk, b) analyse av *de intermediære fragmenter (heksamerer, monamerer og decamerer), c) analyse av siste koplingsreaksjon og d) rensing av sluttproduktet. Kromato-grafien ble utfort ved å bruke en "Spectra-Physics 3500B" væskekromatograf. Etter fjerning av alle beskyttende grupper med konsentrert NH^OH ved 50°C (6 timer) og 80% AcOH ved romtemperatur (15 minutter), ble forbindelsene analysert på en "Permaphase AAX"(DuPont) (Van Boom, J. et al (1977) J. Chromatography 131, 169) kolonne (1 m x 2mm) ved å bruke en lineær gradient av opplosningsmiddel B (0,05 molar KHgPO^- 1,0 molar KC1, pH 4,5) i opplosningsmiddel A (0,01 molar K^PO^, pH 4,5). Gradienten ble dannet ved å starte med buffer A og påsette 3% av buffer B pr. minutt. Elueringen ble utfort ved 60°C med en hastighet på 2 ml pr. minutt. Rensingen av de 29 ferdige oligonukleotidene ble også utfort på "Permaphase AAX" under de samme betingelser som angitt ovenfor. Den foronskede topp ble slått sammen, avspaltet ved dialyse og lyofilisert. Etter merking av nevnte 5'-termini med (V- p)ATP ved å bruke T4-polynukleotidkinase, ble homogeniteten på hvert oligonukleotid undersokt ved elektroforese på en 20% polyakrylamidgel. 3. Sammensetning og kloning av B- kjedegen på A- kjedegenet
Genet for B-kjeden i insulin ble utformet slik at man hadde en EcoRI-begrensende posisjon på den venstre enden, en Hindlll-posisjon i midten og BamHI-posisjonen i den hdyre enden. Dette ble gjort slik at begge halvdelene, dvs. den venstre EcoRI- Hindlll-halvparten (BH) og den hoyre Hindlll-BamHI-halvdelen (BB) kunne separat klones på et hensikts-messig klonende element pBR322 og etter at deres sekvenser var blitt verifisert, bindes sammen slik at man fikk et
.komplett B-gen (fig. 10). BB-halvparten ble satt sammen ved Sammenbinding av 10 oligodeoksyribonukleotider, merket Bl
til B10 på fig. 9, fremstilt ved fosfotriester-kjemisk syntese. Bl og B10 var ikke fosforylert^hvorved man eliminerte-uonsket polymerisering av disse fragmenter gjennom deres kohesive ender (HindiII'og BamHI). Etter rensing ved preparativ akrylamidgel-elektroforese og eluering av det stdrste DNA-båndet, ble BB-fragmentet innsatt i plasmid pBR322 som
var blitt spaltet med HindiII og BamHI. Ca. 50% av de ampit licinresistente kolonier avledet fra nevnte DNA var folsomme for tetracycline, noe som indikerte at et ikke-plasmid HindiII-BamHI-fragment var blitt innsatt. De små Hindlll- BamHI-fragmentene fra fire av disse koloniene (pBBlOl - pBB104) ble undersokt for sin sekvens og funnet å være korrekte.
BH-fragmentet ble fremstilt'på lignende måte og innsatt i pBR322 som var blitt spaltet med EcoRI-og Hindlll-begrensende endonukleaser. Plasmider fra tre ampicillin-resistente og tetracycline-fblsomme transformanter (pBHl - pBH3) ble analysert. Man fant at de småe EcoRI-HindiII-fragmentene hadde den foronskede og forventede nukleotidsekvens.
A-kjedegenet ble satt sammen i tre deler. De venstre fire, de midtre fire og de hoyre fire oligonukleotidene (se fig. 9) ble bundet sammen separat, deretter blandet og bundet sammen (oligonukleotidene Al til Al2 var ufosforylert). Det sammensatte A-kjedegenet ble fosforylert, renset ved gelelektroforese og klonet i pBR 322 ved EcoRI-BamHI-posisjonene. EcoRI- Bam-HI-fragmentene fra to ampicillinresistente og tetra-cyclinfdlsomme kloner (pA10, pAll) inneholdt den foronskede
.A-genesekvens.
4. Konstruksjon av plasmider for uttrykking av A- og B-insulingener
Fig. 10 illustrerer konstruksjonen av- lak-insulin-B-plasmidet (pIBl). Plasmidene pBHl og pBBlOl ble nedbrutt med EcoRI- og HindiII-endonukleaser. Det lille BH-fragmentet fra pBHl og det store fragmentet fra pBBlOl (inneholdende BB-fragmentet og mesteparten av pBR322) ble renset ved gelelektroforese, blandet og bundet sammen i nærvær av Eco_RI-spaltet
" X plak 5. Megadalton- EcoRI-fragment et av A plak 5 inneholder lak-kontrollerende område'og hovedmengden av det S-galaktosi-
dase-strukturelle gen. Konfigurasjonen på de begrensende<p>osisjoner sikrer korrét sammenbindin<g>av BH til BB. lak-EcoRI-fra<g>mentet kan innsettes i to orienteringer, således
at bare halvparten av klonene etter transformeringen skulle ha den foronskede orienteringen. Orienteringen på 10 ampicillinresistente, (3-galaktosidase-kloner ble undersokt ved begrensende analyse. 5 av disse kolonier inneholdt hele B-genesekvensen og den korrekte avlesningsrammen fra B-galaktosidasegenet over i B-kjedegenet. En av disse, nemlig pIBl, ble valgt for de etterfdlgende eksperimenter.
I et lignende eksperiment ble 4,4 megadalton lak-fragmentet fra ^ plak 5 innfort i pAll-plasmidet ved EcoRI-posis jonen slik at man fikk pIAl. Nevnte pIAl er identisk med pIBl bortsett fra at A-genefragmentet er erstattet med B-genefragmentet. DNA-sekvensanalyse viste at man hadde
■fått opprettholdt de korrekte A- og B-kjedegenesekvensene i pIAl og pIBl henholdsvis.
' 5. Uttrykking
Trådene som inneholder insulingener korrekt bundet til B-galaktosidase vil begge produsere store mengder av et protein med storrelse som B-galaktosidase. Ca. 20% av det totale cellulære protein var denne B-galaktosidase-insulin A- eller B-kjedehybrid. Hybridproteinene er uoppløselige og ble funnet i forste bunnfall fremstilt ved lav sentrifugerings-hastighet, hvor de utgjor ca. 50% av proteinet.
For å påvise uttrykkingen av insulin A- og B-kjedene brukte man en radioimmunoproove (RIA) basert på rekonstituering av det fullstendige insulin fra de separate kjeder. Man tilpasset den insulinrekonstitueringsfremgangs-måte som er beskrevet av Katsoyannis et al (1967) Biochemistry 6, 2642 - 2655 til et prdvevolum på 27 mikroliter, noe som gir en godt egnet prove. Lett påvisbar insulinaktivitet ble oppnådd etter blanding og rekonstituering av S-sulfonerte derivater av insulinkjedene. De separate S-sulfonerte kjeder av insulin vil ikke reagere etter reduksjon og oksydasjon med det anti-insulin-antistoff som ble brukt.
Når man skal bruke denne rekonstitueringsprove,
må man delvis rense 6-galaktosidase-A- eller B-kjedehybrid-
proteinet, spalte det med cyanogenbromid og danne S-sul-Ifonerte derivater.
Beviset for at man har oppnådd korrekt uttrykking fra kjemisk syntetiserte gener for menneskeinsulin kan summeres på fdlgende måte: a) Radioimmunaktivitet er påvist for begge kjeder, b) De DNA-sekvenser man har oppnådd etter kloning og plasmidkonstruksjon kan direkte verifiseres til å være korrekt slik de er blitt utformet. Siden man oppnår radioimmunaktivitet må oversettelsen være i fase. Folgelig vil den genetiske kode forutsi at peptidene har den samme sekvens som i menneskeinsulin. c) E. coli-produktene vil etter cyanogenbromid-spalting opptre som insulinkjeder i tre forskjellige kromatografiske systemer som skiller på forskjellige prinsipper (gelfiltrering, ioneutbytning og reversert fase-hoytrykksvæskekromatografi. d) E. coli-produsert A-kjede er blitt renset i mindre skala ved hoytrykksvæskekromatografi og har den korrekte aminosyresammensetning.
Claims (5)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av et immunogent materiale omfattende et polypeptid-hapten, karakterisert ved at man
a) tilveiebringer en rekombinant mikrobiell kloningsvektor inneholdende et heterologt strukturelt gen for haptenet og, i leseramme dermed, en DNA-sekvens som koder for en annen aminosyresekvens med tilstrekkelig størrelse til å gjøre produktet DNA-ekspresjon-immunogent;
og
b) bevirker ekspresjon av et konjugat-polypeptid som består vesentlig av haptenets aminosyresekvens og den andre aminosyresekvensen.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekspresjonsproduktet omfatter mer enn 100 aminosyrer.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at ekspresjonsproduktet omfatter mer enn 200 aminosyrer.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at haptenet, hvorpå immunogenisitet gis, er somatostatin.
5. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kra-vene 1-4, karakterisert ved at haptenet hvorpå immunogenisitet gis, har aminosyresekvensen til et spaltningsprodukt av viralt b^eleg^pr^otein, hvilket spaltningsprodukt er spesifikt bundet av antistoff som er hevet til nevnte beleggprotein.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US84959177A | 1977-11-08 | 1977-11-08 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO855217L true NO855217L (no) | 1979-05-09 |
Family
ID=25306071
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO783723A NO158880C (no) | 1977-11-08 | 1978-11-06 | Fremgangsmaate for fremstilling av et spesifikt pattedyrhormon. |
NO855217A NO855217L (no) | 1977-11-08 | 1985-12-20 | Fremgangsmaate for fremstilling av et immunogent materiale omfattende et polypeptidhapte. |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO783723A NO158880C (no) | 1977-11-08 | 1978-11-06 | Fremgangsmaate for fremstilling av et spesifikt pattedyrhormon. |
Country Status (28)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0001930B1 (no) |
JP (2) | JPS54145289A (no) |
AT (1) | AT373280B (no) |
BE (1) | BE871782A (no) |
BG (1) | BG38166A3 (no) |
CA (2) | CA1166983A (no) |
CH (1) | CH656640A5 (no) |
DD (1) | DD145928A5 (no) |
DE (2) | DE2848052A1 (no) |
DK (1) | DK493878A (no) |
ES (1) | ES474849A1 (no) |
FI (1) | FI783366A (no) |
GB (1) | GB2008123B (no) |
GR (1) | GR72861B (no) |
HK (1) | HK87284A (no) |
IE (1) | IE47890B1 (no) |
IL (1) | IL55890A (no) |
IT (1) | IT1100089B (no) |
KE (1) | KE3449A (no) |
MY (1) | MY8500760A (no) |
NL (1) | NL7811041A (no) |
NO (2) | NO158880C (no) |
NZ (1) | NZ188837A (no) |
PH (1) | PH20642A (no) |
PL (1) | PL210784A1 (no) |
PT (1) | PT68756A (no) |
SE (1) | SE7811458L (no) |
ZA (1) | ZA786305B (no) |
Families Citing this family (48)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4411994A (en) * | 1978-06-08 | 1983-10-25 | The President And Fellows Of Harvard College | Protein synthesis |
US4565785A (en) * | 1978-06-08 | 1986-01-21 | The President And Fellows Of Harvard College | Recombinant DNA molecule |
IE48385B1 (en) * | 1978-08-11 | 1984-12-26 | Univ California | Synthesis of a eucaryotic protein by a microorganism |
US6270955B1 (en) | 1978-12-22 | 2001-08-07 | Biogen, Inc. | Pharmaceutical compositions and methods for producing antibodies to hepatitis b virus and kits and methods for detecting antibodies to hepatitis b virus |
IL60184A (en) * | 1979-05-31 | 1984-05-31 | Schering Ag | Process for the specific cleavage of protein sequences from proteins |
US4342832A (en) * | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
DE3001928A1 (de) * | 1980-01-19 | 1981-08-06 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus |
US6455275B1 (en) | 1980-02-25 | 2002-09-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | DNA construct for producing proteinaceous materials in eucaryotic cells |
CA1200773A (en) * | 1980-02-29 | 1986-02-18 | William J. Rutter | Expression linkers |
US4350764A (en) * | 1980-03-10 | 1982-09-21 | The Regents Of The University Of California | Microbiological synthesis of beta endorphin |
DE3110031A1 (de) * | 1980-03-17 | 1982-01-07 | President And Fellows Of Harvard College, Cambridge, Mass. | Verschmolzene gene, ihre herstellung und verwendung derselben |
IL62552A0 (en) | 1980-04-03 | 1981-06-29 | Biogen Nv | Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon-like polypeptides |
FI83662C (fi) * | 1980-07-17 | 1991-08-12 | Scripps Clinic Res | Diagnostik antikropp och foerfarande foer dess framstaellning. |
IE52122B1 (en) * | 1980-08-25 | 1987-06-24 | Univ California | Somatostatin or somatostatin precursors |
US6692941B1 (en) | 1980-08-26 | 2004-02-17 | The Regents Of The University Of California | Bovine growth hormone |
US5525484A (en) * | 1981-01-16 | 1996-06-11 | Genome Therapeutics Corp. | Recombinant DNA means and method for producing rennin, prorenin and pre-prorennin |
NZ199722A (en) * | 1981-02-25 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Dna transfer vector for expression of exogenous polypeptide in yeast;transformed yeast strain |
WO1982003088A1 (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-16 | Corp Cetus | Vaccines |
US5137721A (en) * | 1981-03-09 | 1992-08-11 | Cetus Corporation | Employing strains of E. coli expressing non-indigenous adhesins and toxoids of E. coli |
US5254463A (en) * | 1981-09-18 | 1993-10-19 | Genentech, Inc. | Method for expression of bovine growth hormone |
JPS5863395A (ja) * | 1981-10-13 | 1983-04-15 | Suntory Ltd | アルフア・ネオ・エンドルフインの製造法 |
CA1338705C (en) * | 1981-10-22 | 1996-11-12 | Roy Curtiss Iii | Vaccines obtained from antigenic gene products of recombinant genes |
US4532207A (en) * | 1982-03-19 | 1985-07-30 | G. D. Searle & Co. | Process for the preparation of polypeptides utilizing a charged amino acid polymer and exopeptidase |
US4880911A (en) * | 1982-03-19 | 1989-11-14 | G. D. Searle & Co. | Fused polypeptides and methods for their detection |
GB2121054B (en) * | 1982-05-25 | 1986-02-26 | Lilly Co Eli | Cloning vectors for expression of exogenous protein |
SE8300693L (sv) * | 1983-02-09 | 1984-08-10 | Sven Lofdahl | Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta |
EP0123928A3 (en) * | 1983-03-31 | 1986-02-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | Recombinant dna coding for a polypeptide displaying milk clotting activity |
DE3314812A1 (de) * | 1983-04-23 | 1984-10-25 | Battelle-Institut E.V., 6000 Frankfurt | Mittel zum antigen/antikoerper-nachweis |
US4703004A (en) * | 1984-01-24 | 1987-10-27 | Immunex Corporation | Synthesis of protein with an identification peptide |
US5082775A (en) * | 1984-05-11 | 1992-01-21 | Berlex Laboratories, Inc. | Efficient process for isolating insoluble heterologous protein using non-ionic detergents |
US5489529A (en) * | 1984-07-19 | 1996-02-06 | De Boer; Herman A. | DNA for expression of bovine growth hormone |
GB8422238D0 (en) * | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
JPS61264000A (ja) * | 1985-03-21 | 1986-11-21 | イミユネツクス コ−ポレイシヨン | 標識ペプチドによるタンパク質の合成 |
GB8509289D0 (en) * | 1985-04-11 | 1985-05-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Production of somatostatin |
IL75553A (en) * | 1985-06-18 | 1993-07-08 | Yeda Res & Dev | Dna sequence coding for a cholinesterase-like peptide, peptides produced by cells containing said dna and antibodies thereto |
GB8515686D0 (en) * | 1985-06-20 | 1985-07-24 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Production of-human atrial natriuretic polypeptide |
EP0440311A1 (en) * | 1985-06-20 | 1991-08-07 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | A process for the production of alpha-human atrial natriuretic polypeptide |
FR2599380A1 (fr) * | 1986-05-29 | 1987-12-04 | Centre Nat Rech Scient | Vecteur d'exportation de proteines chez escherichiacoli, bacteries transformees et procede pour la preparation de proteines |
DK175535B1 (da) * | 1987-03-04 | 2004-11-29 | Daiichi Suntory Pharma Co Ltd | Fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cysteinholdigt peptid |
DE3805150A1 (de) * | 1987-04-11 | 1988-10-20 | Hoechst Ag | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von polypeptiden |
EP0394409B1 (en) | 1988-09-02 | 1997-06-11 | The Rockefeller University | Macrophage-derived inflammatory mediator (mip-2) |
US5218093A (en) * | 1989-03-01 | 1993-06-08 | Allelix Biopharmaceuticals, Inc. | EGF variants and pharmaceutical use thereof |
JPH0436185A (ja) * | 1990-03-28 | 1992-02-06 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 融合抗原ポリペプチド |
JPH07108232B2 (ja) * | 1990-10-09 | 1995-11-22 | エム・ディ・リサーチ株式会社 | ペプチド又は蛋白質の製造方法 |
JPH04315084A (ja) * | 1991-04-12 | 1992-11-06 | Kawasaki Heavy Ind Ltd | 航空機の対地衝突防止システム |
EP0752853B1 (en) | 1993-03-10 | 2005-09-21 | Smithkline Beecham Corporation | Human brain phosphodiesterase |
US6316004B1 (en) * | 1993-06-22 | 2001-11-13 | T. Tikhonenko | Chimeric somatostatin containing protein and encoding DNA, plasmids of expression, method for preparing chimeric protein, strain-producers, immunogenic composition, method for increasing the productivity of farm animals |
US6087128A (en) | 1998-02-12 | 2000-07-11 | Ndsu Research Foundation | DNA encoding an avian E. coli iss |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0513630A (ja) * | 1991-07-05 | 1993-01-22 | Furukawa Electric Co Ltd:The | ヒートパイプ式半導体冷却器 |
-
1978
- 1978-11-06 AT AT0793578A patent/AT373280B/de active
- 1978-11-06 FI FI783366A patent/FI783366A/fi not_active Application Discontinuation
- 1978-11-06 NL NL7811041A patent/NL7811041A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-11-06 NO NO783723A patent/NO158880C/no unknown
- 1978-11-06 GB GB7843444A patent/GB2008123B/en not_active Expired
- 1978-11-06 DE DE19782848052 patent/DE2848052A1/de not_active Withdrawn
- 1978-11-06 IE IE2192/78A patent/IE47890B1/en unknown
- 1978-11-06 CH CH11417/78A patent/CH656640A5/de not_active IP Right Cessation
- 1978-11-06 BE BE1009121A patent/BE871782A/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-11-06 DK DK493878A patent/DK493878A/da not_active Application Discontinuation
- 1978-11-06 JP JP13721678A patent/JPS54145289A/ja active Granted
- 1978-11-06 GR GR57591A patent/GR72861B/el unknown
- 1978-11-06 NZ NZ188837A patent/NZ188837A/xx unknown
- 1978-11-06 DE DE7878300597T patent/DE2862496D1/de not_active Expired
- 1978-11-06 BG BG7841309A patent/BG38166A3/xx unknown
- 1978-11-06 EP EP78300597A patent/EP0001930B1/en not_active Expired
- 1978-11-06 SE SE7811458A patent/SE7811458L/xx unknown
- 1978-11-06 ES ES474849A patent/ES474849A1/es not_active Expired
- 1978-11-06 IL IL55890A patent/IL55890A/xx unknown
- 1978-11-06 CA CA000315864A patent/CA1166983A/en not_active Expired
- 1978-11-07 PT PT68756A patent/PT68756A/pt unknown
- 1978-11-07 IT IT29519/78A patent/IT1100089B/it active
- 1978-11-07 DD DD78208917A patent/DD145928A5/de unknown
- 1978-11-08 PH PH21777A patent/PH20642A/en unknown
- 1978-11-08 PL PL21078478A patent/PL210784A1/xx unknown
- 1978-11-08 ZA ZA00786305A patent/ZA786305B/xx unknown
-
1984
- 1984-04-27 CA CA000453083A patent/CA1221324A/en not_active Expired
- 1984-09-13 KE KE3449A patent/KE3449A/xx unknown
- 1984-11-08 HK HK872/84A patent/HK87284A/xx unknown
-
1985
- 1985-12-20 NO NO855217A patent/NO855217L/no unknown
- 1985-12-30 MY MY760/85A patent/MY8500760A/xx unknown
-
1988
- 1988-07-12 JP JP63173625A patent/JPH0657154B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO855217L (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et immunogent materiale omfattende et polypeptidhapte. | |
DK173092B1 (da) | Rekombinant plasmid, fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet, bakterie indeholdende plasmidet, samt fremgangsmåde til f | |
NO783724L (no) | Syntetisk dna samt fremgangsmaate til dets fremstilling | |
US4366246A (en) | Method for microbial polypeptide expression | |
US4704362A (en) | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression | |
US4425437A (en) | Microbial polypeptide expression vehicle | |
US4356270A (en) | Recombinant DNA cloning vehicle | |
US5221619A (en) | Method and means for microbial polypeptide expression | |
US4431739A (en) | Transformant bacterial culture capable of expressing heterologous protein | |
US5583013A (en) | Method and means for microbial polypeptide expression | |
US5643758A (en) | Production and purification of a protein fused to a binding protein | |
AU626521B2 (en) | Production and purification of a protein fused to a binding protein | |
US4563424A (en) | Method and means for somatostatin protein conjugate expression | |
US4571421A (en) | Mammalian gene for microbial expression | |
Ohsuye et al. | Expression of chemically synthesized α-neo-endorphin gene fused to E. coli alkaline phosphatase | |
US4812554A (en) | Somatostatin peptide conjugate | |
JPS61149089A (ja) | Dna塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
US5420020A (en) | Method and means for microbial polypeptide expression | |
NO875114L (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et forloeperpolypeptid inneholdende et spesifikt polypeptid. | |
CA1259043A (en) | Method and means for microbial polypeptide expression | |
KR840002091B1 (ko) | 폴리펩티드의 미생물 발현을 위해 암호화된 구조 유전자의 제조방법 | |
KR840002090B1 (ko) | 폴리펩티드 헵텐을 함유하는 면역성 물질인 폴리펩티드를 제조하는 방법 | |
CA1340003C (en) | Method and means for microbial polypeptide expression | |
KR840002106B1 (ko) | 세균숙주의 형질전환에 적합한 재조합 클로닝 베히클의 제조방법 | |
KR840002107B1 (ko) | 재조합 미생물 클로닝 베히클로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법 |