DK173092B1 - Rekombinant plasmid, fremgangsmåde til fremstilling af plasmidet, bakterie indeholdende plasmidet, samt fremgangsmåde til f - Google Patents

Description

1 DK 173092 B1

Opfindelsen angår et hidtil ukendt plasmid som angivet i krav 1, en fremgangsmåde til dets fremstilling, som angivet i krav 9, bakterie transformeret med plasmidet, bakteriekultur omfattende de transformerede bakterier, samt en fremgangsmåde til frem-5 stilling af et funktionelt pattedyrpolypeptid eller et mellemprodukt for dette som angivet i krav 12.

Genetisk information er indkodet på dobbeltstrenget.-deoxyri-bonucleinsyre ("DNA" eller "gener”) i henhold til den række-10 følge, hvori DNA-kodningsstrengen udviser de karakteristiske baser i dens gentagne nucleotidkomponenter. nUdtrykkelse" af den indkodede information til dannelse af polypeptider indebærer en todelt^ proces. Ifølge diktaterne fra visse kontrolområder ("reguloner") i genet kan RNA-polymerase bringes til at 15 bevæge sig langs kodningsstrengen og danne mRNA (bud-rLbonu-cleinsyre)ved en proces, som kaldes "transcription". I et efterfølgende "translations"-trin overfører cellens riboso-mer i samvirke med transfer-RNA mRNA-"budskabet" til polypeptider. Inkluderet i den information, mRNA transcrxberer 20 fra DNA, er signaler for starten og afslutningen af ribosomal-translation, såvel som identiteten og sekvensen af de aminosyrer, som udgør polypeptidet. DNA-kodningsstrengen består af lange sekvenser af nucleotid-tripletter kaldet "codoner", fordi de karakteristiske baser i nucleotiderne i hver tri-25 plet eller codon indkoder specifikke informationsbidder.'F.eks. resulterer 3 nucleotider aflæst som ATG (adenin-thymin-guanin) i et mRNA-signal fortolket som "start translation" ,·τ medens af-slutningscodonerne TAG, TAA og TGA fortolkes "stop translation" , Mellem start-og-stopbodoneme ligger det såkaldte 30 strukturgen, hvis codoner .definerer den endeligt translate-rede aminosyresekvens. Denne definition skrider frem ifølge den veldokumenterede "genetiske kode" (f.eks. J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W.A. Benjamin Inc., N. Y., 3rd ed. 1976), som beskriver eodoneme for de forskellige 35 aminosyrer. Den genetiske kode er degenereret i den forstand, at forskellige codoner kaxi give den samme aminosyre, men præcis på den måde, at der for hver aminosyre er en eller flere Codoner, som ikke gælder nogen anden. Således koder f.eks. alle codonerne TTT, TTC, TTA og TTG, når de aflæses som sådanne, for serin og ingen anden aminosyre. Under trans- 2 DK 173092 B1 criptionen må den rigtige aflæsningsfase eller aflæsningsramme opretholdes. Betragt f.eks. hvad der sker, når RNA-polymerasen aflæser forskellige baser som begyndelsen af en codon (understreget) i sekvensen . . . GCTGGTTGTAAG . . .: 5 ... GCT GGT TGT AAG . . . . . . Ala-Gly-Cys-Lys . . .

... G CTG GTT GTA AG . ___^ . . . Leu-Val-Leu . . .

. . . GC TGG TTG TAA A . Trp-Leu-(STOP).

Det endeligt producerede polypeptid afhænger da vitalt af 10 det rumlige forhold mellem strukturgenet og regulonet:

En klarere forståelse af processen for genetisk udtrykkel se vil fremgå, når først visse genkomponenter er defineret: 15 Operon - et gen bestående af strukturgen(er) for polypep- tidudtrykkelse og kontrolområdet ("regulon"), som regulerer denne udtrykkelse.

Promotor - et gen indenfor regulonet, hvortil RNA-polymera-20 sen må bindes til start af transcription.

Operator - et gen, hvortil repressorprotein kan bindes og således forhindre binding af RNA-polymerase på den nærliggende promotor.

25

Induktor - et stof, som deaktiverer repressorprotein og således frigør·'. operatoren og tillader RNA-polymerase at bindes til promotoren og begynde transcription.

30 Catabolit-Aktivator-Protein ("CAP”)-Bindingssted -

Et gen, som binder cyclisk adenosinmonophosphat( "camp" ) -formidlet CAP, og som også almindeligvis kræves til start af transcription. CAP-bindingsstedet kan i særlige tilfælde 35 være unødvendigt. F.eks. eliminerer en promotormutation i lactoseoperonet hos phagen ^ plac UV5 kravet om cAMP og CAP for udtrykkelse. J. Beckwith et al, J. Mol. Biol. 69, ISS-160 (1972).

3 DK 173092 B1

Promotor-Operator-System - i denne beskrivelse et operabelt kontrolområde i et operon med eller uden hensyn til dets inkludering af et CAF-bindingssted eller kapacitet til at kode for repressorprotein-udtrykkelse.

5

Som yderligere definition til brug ved den efterfølgende omtale af rekombinant-DNA, defineres følgende:

Kloningsmedium - Ikke-kromosomal dobbeltstrenget DNA bestå 10 ende af et intakt "replicon", således at mediet repliceres, når det anbringes inden i en encellet organisme ("mikroorganisme") ved en "transformations"-proces. En sålédes transformeret organisme kaldes en "transformant".

15 Plasmid - Til de foreliggende formål et kloningsmedium afledt af virus eller bakterier, hvor de sidstnævnte kaldes "bakterieplasmider".

Komplementaritet - En egenskab tilført af basesekvenserne 20 i enkeltstrenget DNA, som tillader dannelse af dobbeltstrenget DNA ved hydrogenbinding mellem komplementære baser på de respektive strenge. Adenin (A) komplementerer thymin (T), medens guanin (G) komplementerer cytosin (C).

25 Fremskridt indenfor.biokemien i de senere år har ført til konstruktionen af "rekombinant"-kloningsmedier, hvori f.eks. plasmider bringes til at indeholde exogen DNA. I særlige tilfælde kan rekombinanten indeholde "heterolog" DNA, hvorved menes DNA, som koder for polypeptider, der almindelig-30 vis ikke produceres af den organisme, som er modtagelig for transformation ved hjælp af rekombinantmediet. Således spaltes plasmider til lineær DNA med forbindelige termini. Disse bindes til et exogent gen med forbindelige termini til dannelse af en biologisk funktionel enhed med et intakt re-35 plicon og en ønsket fænotypisk egenskab. Rekombinantenheden indsættes i en mikroorganisme ved transformation, og trans-formanter isoleres og klones med det formål at opnå store populationer, som er i stand til at udtrykke den nye gene- DK 173092 B1 4 tiske information. Fremgangsmåder og midler til dannelse af rekombinant-kloningsmedier og transformering af organismer med dem er blevet vidt og bredt rapporteret i litteraturen.

Se f'.eks H.L. Heynecker et al. Nature 265. 748-752 (1976); 5 Cohen et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA £2., 2110 (1972); ibid., 22, 1293 (1973); ibid., 22» 3240 (1973); ibid., 21* 1030 (1974); Morrow et al, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 21* 1743 (1974); Novick, Bacteriological Rev., 22, 210 (1969); Hershfield et al. Proc. Soc. Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. J£l, 10 3455 (1974) og Jackon et al, ibid. .£9» 2904 (1972). En ge nerel omtale af emnet findes i S. Cohen, Scientific American 233, 24 (1975). Disse og andre publikationer, som er nævnt i denne beskrivelse, henvises der til som reference.

15 En lang række former for teknik er til rådighed for DNA- rekombination, ifølge hvilke tilstødende ender af separate DNA-fragmenter tilpasses på en eller anden måde for at lette sammenbinding. Den sidstnævnte betegnelse henviser til dannelsen af phosphodiesterbindinger mellem tilstødende iucle-20 otider, oftest ved medvirken af enzymet T4-DNA-ligase. Således kan stumpe ender direkte sammenbindes. Alternativt drages der nytte af fragmenter Indeholdende komplementære enkeltstrenge ved deres tilstødende ender ved hydrogenbinding, som anbringer de respektive ender i stilling til ef-25 terfølgende sammenbinding. Sådanne enkeltstrenge, betegnet som kohæsive termini, kan dannes ved tilføjelse af nucleo-tider til stumpe ender under anvendelse af terminal transferase, og somme tider simpelthen ved at tygge en streng af en stump ende tilbage med et enzym, såsom 7\ -exonuclease, 30 Igen, og mest almindeligt, kan der gribes til restriktions-endonucleaser, som spalter phosphodiesterbindinger i og omkring enestående sekvenser af nucleotider med en længde på omkring 4-6 basepar. Mange restriktionsendonucleaser og deres genkendelsessteder er kendte, og den såkaldte Eco RI 35 endonuclease er den mest udbredt anvendte. Restriktionsendonucleaser, som spalter dobbeltstrenget DNA ved rotations- 5 DK 173092 B1 symmetriske "palindromer" efterlader kohæs i ve termini. Således kan et plasmid eller et andet kloningsmedium spaltes så det efterlader termini, der omfatter det halve af restriktions- endonuclease-genkendelsesstedet. Et spaltnings-5 produkt af exogen DNA opnået med den samme restriktions-endonuclease vil have ender, som er komplementære med enderne af plasmid-terminieme. Alternativt kan der, som anført nedenfor, sørges for syntetisk DNA omfattende kohæsive termini til indsætning i det spaltede medium. For at mod-10 virke gensamling af mediernes kohæs i ve termini før indsætning af exogent DNA, kan terminierne fordøjes med alkalisk phosphatase, hvilket giver molekylær udvælgelse til fordel for. lukninger,der inkorporerer det exogene fragment. Inkorporering af et fragment med den rigtige orientering i for-15 hold til andre sider af mediet kan fremmes, når fragmentet indplanter medie-DNA udskåret af to forskellige restrik-tions-endonucleaser, og i sig selv omfatter termini, som henholdsvis udgør halvdelen af de forskellige endonucleasers genkendelsessekvens, 20

Trods et vidtrækkende arbejde i de seneste år indenfor re-kombinant-DNA-forskning er der kun fremkommet få resultater med umiddelbar og praktisk anvendelighed. Dette har især vist sig i tilfælde af mislykkede forsøg på at udtrykke po-25 lypeptider og lignende kodet ved hjælp af ”syntetisk DNA”, hvad enten det var konstrueret nucleotid for nucleotid på den konventionelle. måde. .eller opnået ved omvendt transcription fra isoleret RNA (komplementært eller "cDNA") . I

Den kendte teknik illustreret ved et foredrag af Dr. Hey-30 necker holdt den 11..oktober 1977 slår fast, at stabilitet over for nedbrydning af et udtrykt mammalt protein opnås gennem en fusion til β-gal, samt en forøgelse af den fusionerede β-gal del. Den foreliggende opfindelse viser, at der kan opnås overraskende gode resultater ved 35 at reducere andelen af den stabilitetstilførende fusionsdel til praktisk taget nul.

I denne ansøgning beskrives, hvad der anses for at repræsentere den første udtrykkelse af et funktionelt polypeptidpro-dukt ud fra et syntetisk gen, sammen med beslægtede udvik- 6 DK 173092 B1 linger, som lover udbredt anvendelse. Det produkt, der henvises til, er somatostatin (US 3-904-594), en inhibitor for sekretionen af væksthormon, insulin og glucagon, hvis virkninger antyder dets anvendelse til behandling af acromegali, 5 akut-pancreatitis og insulin- afhængig-di abete s; se R. Guille-min et al., Annual Rev. Med. 27, 379 (1976). Soraatostatin-modellen viser klart anvendeligheden af de nye udviklinger, som er beskrevet her, på talrige og nyttige fronter som det vil fremgå af de ledsagende tegninger og mere klart af den 10 følgende mere detaljerede beskrivelse.

Tegningerne viser én sammenhæng, hvori foretrukne udførelsesformer af opfindelsen finder anvendelse, dvs. udtrykkeIse af hormonet somatostatin ved hjælp af bakterietransformanter 15 indeholdende rekombinant-plasmider.

Fig. 1 er et skematisk diagram over processen: genet for somatostatin, fremstillet ved kemisk DNA-syntese, sammensmeltes med E. coli β-galactosidase-genet på plasmidet 20 pBR322. Efter transformationen ind i E. coli dirigerer re- kombinant-plasmidet syntesen af et forstadie-protein, som kan spaltes specifikt in vitro ved methionin-rester ved hjælp af cyanbromid til opnåelse af aktivt pattedyr-polypeptid-hormon. A, T, C og G angiver deoxyribonucleotidernes karak-25 teristiske baser (henholdsvis adenin, thymin, cytosin og gua-nin) i somatostatingenets kodningsstreng.

Fig. 2 viser en skematisk struktur af et syntetisk gen, hvis kodningsstreng (dvs. den "øvre") består af codoner for amino-30 syresekvensen i somatostatin (givet).

Fig. 3 er et belysende skema over en foretrukken fremgangsmåde til konstruktion af nucleotid-trimere anvendt ved konstruktion af syntetiske gener. I den konventionelle nota-35 tion, der anvendes til at afbilde nucleotider i fig. 3, er 5T OH til venstre og 3' OH til højre, f.eks.

i.

5' 3’ HO^ DK 173092 B1 7

Fig. 4 er et arbejdsdiagram over konstruktionen af et re-kombinant-plasmid (f.eks. pSOMll-3), som er i stand til at udtrykke et somatostatin ("SOM'O-holdigt protein, begyndende med moderplasmidet pBR322. I fig. 4 er den tilnærmede 5 molekylvægt for plasmid angivet i dalton ("d"). Apr og Tcr angiver gener for henholdsvis ampicillin- og tetracyclin-resistens, medens Tcs angiver tetracyclin-følsomhed resulterende fra afskæring af en del af Tcr- genet. De relative positioner af forskellige restriktions-endonucelase-speci-10 fikke spaltningssteder på plasmiderne er afbildet (f.eks.

Eco RI, Bam I osv.).

I fig. 5A og 5B er afbildet nucelotidsekvenserne af nøgledele af to plasmider ligesom retningen af mRNA-transcription, 15 som uvægerligt skrider frem fra 5'-enden af kodningsstrengen. Restriktions-endonihclease-substratsteder er som vist. Hver afbildet sekvens indeholder både kontrolelementerne af lac (lactose)-operonet og codoner til udtrykkelse af somatosta-tlns amino syresekvens (kursiv). Amino syre sekvens tall ene for 20 β-gålactosidase ("p-gal") er i kantet parentes.

Som nærmere beskrevet i den nedenstående forsøgsomtale, af-bilder fig. 6-8 resultaterne af komparativ radioimmunoprøv-ningseksperimenter, som viser produktets somatostatinaktivi-25 tet udtrykt ved rekombinant-plasmiderne.

Fig. 9 viser en skematisk struktur af syntetiske gener, hvis kodningsstrenge omfatter codoner for aminosyresekvenserne i A- og B-strengene af humant insulin.

30

Fig. 10 er et arbejdsdiagram for konstruktionen af et rekom-binant-plasmid, som er i stand til at udtrykke B-kæden af humant insulin.

35 DK 173092 B1 8 1. Fremstilling af gener, som koder for heterologt polypeptid_

DNA, som koder for ethvert polypeptid af kendt aminosyre-5 sekvens, kan fremstilles ved udvælgelse af codoner ifølge den genetiske kode. Med henblik på lettere rensning osv. fremstilles oligodeoxyribonucleotid-fragmenter med f.eks. fra omkring 11 til omkring 16 nucleotider separat og samles derpå i den ønskede sekvens. Således fremstilles en 10 første og en anden række oligodeoxyribonucleotid-fragmenter af hensigtsmæssig størrelse. Den første række giver, når den samles i rigtig sekvens, en DNA-kodningsstreng for po-lypeptidudtrykkelse (se f.eks. fig. 2, fragmenterne A, B, C

og D), Den anden række giver, når den ligeledes samles i 15 rigtig sekvens, en streng, som er komplementær med kodningsstrengen (f.eks. fig. 2, fragmenterne E, F, G og H). Fragmenterne af de respektive strenge overlapper fortrinsvis således, at komplementaritet fremmer deres selvsamling ved hjælp af hydrogenbinding af de kohæsive termini af frag-20 mentblokke. Efter samlingen fuldendes strukturgenet ved sammenbinding på konventionel måde.

Degenerationen af den genetiske kode tillader væsentlig frihed i valget af codoner for enhver given amino syresekvens.

25 Til de foreliggende formål blev codonvalget imidlertid med fordel ledet af tre overvejelser. For det første udvalgtes codoner og fragmenter, og der frembragtes fragmentsamling, således at man undgik ufordelagtig komplementaritet af fragmenterne med hverandre, undtagen for fragmenter op til hin-30 anden i det ønskede gen. For det andet undgås sekvenser rige på AT-basepar (f.eks. 5 eller mere), især når der forud for dem er en sekvens rig på GC-basepar, for at undgå for tidlig afslutning af transcriptionen. For det tredie er i det mindste hovedparten af de valgte codoner sådanne, som foretræk-35 kes ved udtrykkeisen af mikrobielle genomer (se f.eks,, V. Fiers et al. Nature 260. 500 (1976). Med henblik på de vedføjede krav defineres de følgende som codoner, DK 173092 B1 9 ’’der foretrækkes til udtrykkelse af mikrobielle genomer".:

Foretrukken tildeling af codoner 5 Første position Anden position Tredie position (5'-enden) (læst på tværs) (3T-enden) (læst nedad)_T C A G_(læst nedad )

phe — cys T

phe ser tyr --- C

T

10 leu --- Stop Stop A

--- ser Stop trp G

leu pro his arg T

leu pro his arg C

C leu pro gin --- A

15 pro gin --- G

ile thr asn --- T

ile thr asn ser C

20 met thr lys --- G

(start)

val ala asp gly T

val --- asp --- C

n

25 val --- glu --- A

val ala glu --- G

I tilfælde af somatostatin er det mest foretrukne aminosyre-30 codon-forhold i strukturgenet som følger: gly (GGT), cys (TGT), lys (AAG), trp (TGG), ala (GOT), asn (AAT,AAC), phe (TTC, TTT), thr (ACT, ACG) og ser (TCC, TCG).

35 Hvor strukturgenet for et ønsket polypeptid skal indsættes i et kloningsmedium til udtrykkelse som sådant, går der forud for genet en "starf'-codon (f.eks. ATG), og umiddelbart DK 173092 B1 10 5 efter genet følger en eller flere afslutnings-eller "stop1'-codoner (se fig. 2). Imidlertid kan, som beskrevet nedenfor, et bestemt polypeptids aminosyresekvens udtrykkes med yderligere protein forud for og/eller efter den. Hvis den påtænkte anvendelse af polypeptidet kræver fraspaltning af 10 det yderligere protein, kodes for passende spaltningssteder op til samlingen af codoneme for polypeptidet og det yderligere protein. Således er udtrykkelsesproduktet i fig. 1 som et eksempel et forstadie-protein bestående af både somatostatin og den største del af β-galactosidase-polypeptidet.

15 Her er ATG ikke nødvendigt til at kode for starten af translationen, fordi ribosomal konstruktion af det yderligere j$-gal-protein aflæses igennem ind i somatostatin-strukturgenet. Inkorporering af ATG-signalet koder imidlertid for fremstillingen af methionin, en aminosyre, som specifikt 20 spaltes af cyanbromid, hvilket giver en let metode til omdannelse af forstadie-proteinet til det ønskede polypeptid.

Fig. 2 exemplificerer også et yderligere træk, som foretrækkes ved heterolog DNA beregnet til rekombinant anvendelse, 25 dvs. tilvejebringelsen af kohæsive termini, fortrinsvis bestående af en af de to strenge af et restriktions-endonu-clease-genkendelsessted. Af tidligere omtalte grunde udformes terminierne henholdsvis til skabelse af forskellige re-_ spektive genkendelsessteder ved rekombination.

30

Selv om de beskrevne udviklinger her er blevet påvist at være gennemførlige med somatostatinmodellen, vil det indses, at heterolog DNA, som koder for praktisk taget enhver kendt aminosyresekvens, kan anvendes efter de nødvendige ændringer. 35 Således er den i det foregående og efterfølgende omtalte teknik efter de nødvendige ændringer anvendelig til fremstilling af polyaminosyrer, såsom polyleucin og polyalanin, enzymer, serumproteiner, analgetiske polypeptider, såsom β-endorphiner, som modulerer smertetærskler osv. Mest fore-trukkent vil de sådanne fremstillede polypeptider være pattedyrhormoner eller mellemprodukter herfor. Blandt sådanne DK 173092 B1 11 kan f.eks. nævnes somatostatin, humant insulin, humant og bovint væksthormon, luteiniseringshormon, ACTH, pancreas-polypeptid osv. Mellemprodukter inkluderer f.eks. humant præproinsulin, humant proinsulin, A- og B-kæderne af humant in-5 sulin osv. Foruden DNA fremstillet in vitro kan den heterologe DNA omfatte cDNA resulterende fra omvendt transcription ud fra mRNA. Se f.eks. Ullrich et al. Science 196. 1313 (1977).

10 2. Rekombinanter, som koder for udtrykkeisen af forstadie- proteln_

Ved den fremgangsmåde, som skematisk er afbildet i fig. 1, giver udtrykkelse et forstadieprotein omfattende både et poly- 15 peptid kodet for et specifikt heterologt strukturgen (somatostatin) og yderligere protein (omfattende en del af β-galactosidase-enzymet). Et selektivt spaltningssted op til so-matostatin-aminosyresekvensen tillader efterfølgende adskillelse af det ønskede polypeptid fra overflødigt protein. Det 20 belyste tilfælde er repræsentativt for en stor klasse af procedurer, som muliggøres af den heri beskrevne teknik.

25 30 35 DK 173092 B1 12 5 Mest almindeligt vil spaltningen blive frembragt udenfor plasmidet eller et andet mediums replikative miljø, som f.eks. efter indhøstning af den mikrobielle kultur. På denne måde kan midlertidig konjugation af små polypeptider med overflødigt protein bevare disse overfor f.eks. in 10 vivo nedbrydning på grund af endogene enzymer. Samtidig vil det yderligere protein almindeligvis berøve det ønskede polypeptid bioaktivitet indtil den extracellulære spaltning med den virkning, at procedurens biosikkerhed forhøjes. I særlige tilfælde kan det selvfølgelig vise 15 sig ønskeligt at frembringe spaltning inden i cellen.

F.eks. kunne kloningsmedier forsynes med DNA, som koder for enzymer, der omdanner insulin-forstadier til den aktive form, arbejdende i rækkefølge med anden DNA, som koder for udtrykning af forstadie-formen.

20 I det foretrukne tilfælde mangler det bestemte polypeptid indre spaltningssteder svarende til det, der anvendes til at afskære overflødigt protein, selv om det vil indses, at hvor den betingelse ikke tilfredsstilles, vil konkur-25 rencereaktioner alligevel give det ønskede produkt, om end i lavere udbytte. Hvor det ønskede produkt er methio-ninfrit, har cyanbromidspaltning ved methionin op til den ønskede sekvens vist sig meget effektiv. Ligeledes kan arginin- og lysinfrie produkter spaltes enzymatisk med 30 f.eks. trypsin eller chemotrypsin ved arg-arg, lys-lys eller lignende spaltningssteder til den ønskede sekvens.

I det tilfælde, hvor spaltning f.eks. efterlader uønsket arginin knyttet til det ønskede produkt, kan det fjernes ved carboxypeptidase-fordøjelse. Når trypsin anvendes 35 til at spalte ved arg-arg, kan lysinsteder inden for det ønskede polypeptid først beskyttes, f.eks. med maleinsy-re- eller citraconsyreanhydrider. Den spaltningsteknik, som her er omtalt som eksempel, er kun repræsentativ for de mange varianter, som vil være nærliggende for fagmanden i lyset af denne beskrivelse.

13 DK 173092 B1

Fraspalteligt protein kan udtrykkes op til enten C- eller N-terminalen af et specifikt polypeptid eller endog inden i polypeptidet selv, som i tilfælde af den inkluderede sekvens, som skelner mellem proinsulin og insu-5 lin. Igen kan det anvendte medium kode for udtrykkelse af protein bestående af gentagne sekvenser af det ønskede polypeptid, som hver adskilles af selektive spaltningssteder. Mest foretrukkent vil der imidlertid trans-lateres codoner for overflødigt protein forud for struk-10 turgenet for det ønskede produkt, som i det i figurerne illustrerede tilfalde. I hvert fald må man sørge for at opretholde den rigtige aflæsningsramme i forhold til regulonet.

15 3. Udtrykkelse af immunogener

Evnen til at udtrykke både et specifikt polypeptid og overflødigt protein giver nyttige redskaber for fremstillingen af immunogene stoffer. Polypeptid^haptener" 20 (d.v.s. stoffer indeholdende determinanter specifikt bundet af antistoffer og lignende, men almindeligvis for små til at udløse et immunt svar) kan udtrykkes som konjugater med yderligere protein af tilstrækkelig størrelse til at tilføre lmmunogenicitet. Faktisk er det her 25 som eksempel fremstillede β-gal-somatostatin-konjugat af immunogen størrelse og kan forventes at frembringe antistoffer, som binder somatostatin-haptenet. Proteiner bestående af over 100 aminosyrer, mest almindeligt over 200 aminosyrer, udviser immunogen karakter.

30

Konjugater fremstillet på den ovenfor beskrevne måde kan anvendes til at frembringe antistoffer, som er nyttige ved radioimmunprøvning eller andre prøvninger for haptenet, og alternativt ved fremstilling af vacciner. I det 35 følgende skal beskrives et eksempel på den sidstnævnte anvendelse. Cyanbromid- eller andre spaltningsprodukter 14 DK 173092 B1 af viralt kappeprotein vil give oligopeptider, som bindes til antistof dannet imod proteinet selv. Givet amino-syresekvensen af et sådant oligopeptidhapten, kan heterolog DNA for dette udtrykkes som et konjugat med yder-5 ligere protein, der tilfører immunogenicitet. Anvendelse af sådanne konjugater som vacciner kunne forventes at formindske sidereaktioner, der ledsager anvendelsen af kappeproteinet selv til at tilføre immunitet.

10 4. Kontrolelementerne

Fig. 1 afbilder en fremgangsmåde, hvorved en transfor-mantorganisme udtrykker polypeptidprodukt ud fra heterolog DNA bragt under kontrol af et regulon "homologt11 15 med organismen i dens utransformerede tilstand. Således omfatter lactoseafhængig E. coli kromosom-DNA et lactose- eller "lac,,-operon, som formidler lactosenedbryd-ning ved bl. a. at indarbejde enzymet β-galactosidase.

I det bestemte viste tilfælde opnås lac-kontrolelemen-20 terne ud fra en bakteriophag, J\plac 5, som er ineffektiv for E. coli. Phagens lac-operon blev på sin side afledt ved transduktion ud fra den samme bakterieart, derfor "homologien". Homologe reguloner, som er egnet til anvendelse ved den angivne fremgangsmåde, kan alternativt 25 afledes fra plasmid-DNA nativt for organismen.

Simpelheden og effektiviteten af lac-promotor-operator-systemet tilskynder til dets anvendelse i de her beskrevne systemer, ligesom dets evne til at induceres af IPTG 30 (isopropylthio-p-D-galactosid). Selvfølgelig kunne andre operoner eller dele deraf ligesåvel anvendes, f.eks. λ -promotor-operator, arabinose-operon (phi 80 dara) eller colicin-El-, galactose-alkalisk phosphatase- eller tryptophan-operonerne. Promotor-operatorer afledt af den 35 sidstnævnte (d.v.s. "tryp-operon") ville forventes at tilføre 100% undertrykkelse indtil induktion (med indol-acrylsyre) og indhøstning.

15 DK 173092 B1 5. Plasmidkonstruktion generelt

Detaljerne i den fremgangsmåde, som er belyst skematisk i fig. 4, fremgår af den nedenstående forsøgssektion.

5 På dette tidspunkt er det imidlertid nyttigt kort at omtale forskellige former for teknik, der anvendes til konstruktion af rekombinant-plasmidet i den foretrukne udførelsesform.

10 Kloningen og udtrykkeisen af det syntetiske somatostatin-gen anvendte to plasmider. Hvert plasmid har et EcoRI-substratsted i et forskelligt område af β-galactosidase-strukturgenet (se fig. 4 og 5)· indsættelsen af det syntetiske somatostatin-DNA-fragment i disse plasmiders 15 EcoRI-steder bringer udtrykkeisen af den genetiske information i dette fragment under kontrol af de lac-ope-ron-kontrollerende elementer. Efter indsættelsen af somatostatin-fragmentet i disse plasmider, skulle translation resultere i et somatostatin-polypeptid, som for-20 udgås énten af 10 aminosyrer (pSOMl) eller af praktisk taget hele β-galactosidase-under enhedsstrukturen (pSOMll-3).

Plasmidkonstruktionsskemaet starter med plasmidet 25 pBR322, et velkarakteriseret kloningsmedium. Indførelse af lac-elementeme i dette plasmid blev gennemført ved indsætning af et Haelll-begrænsnings-endonuclease-frag-ment (203 nucleotider) bærende lac-promotoren, CAP-bindingsstedet, operatoren, ribosom-bindingsstedet og 30 de første 7 aminosyrecodoner af β-galactosidase-strukturgenet. Haelll-fragmentet blev aflédt fra Aplac5-DNA.

Det EcoRI-spaltede PBR322-plasmid, som fik sine termini repareret med T4-DNA-polymerase og deoxyribunucleotid-triphosphater, blev stump-ende-forbundet til Haelll-35 fragmentet til dannelse af EcoRI-termini ved indsættelses-punkterne. Sammenslutning af disse Haelll- og repareret DK 173092 B1 16 -EcoRI-termini skaber EcoRI-restriktionsstedet (se fig.

4 og 5) ved. hver terminus. Transformanter af E. coli RR1 med denne DNA blev udvalgt til prøvning for resistens over for tetracyclin (Tc) og ampicillin (Ap) på 5-brom-5 4-chlor-incolylgalactosid (X-gal)-medium. På dette indikatormedium identificeres kolonier med konstitution for syntesen af β-galactosidase på grund af det fornyede antal lac-operatorer som titrerer repressoren, ved deres blå farve. To orienteringer af Haelll-fragmentet 10 er mulige, men disse blev skelnet ved den asymmetriske anbringelse af et Hha-restriktionssted i fragmentet.

Plasmidet pBHlO blev yderligere modificeret for at fjerne EcoRI-endonuclease-stedet fjernest fra lac-ope-ratoren (pBH20).

15

De otte kemisk synthetiserede oligodeoxyribonucleotider (fig. 2) blev mærket ved 5'-terminierne med [^2Ρ]-#-ΑΤΡ ved hjælp af polynucleotid-kinase og forbundet med T4-DNA-ligase. Ved hjælp af hydrogenbinding mellem de overlap-20 pende fragmenter samles somatostatin-genet selv og polymer! ser er til sidst til større molekyler på grund af de kohaesive restriktionssted-termini. De sammenbiindne produkter blev behandlet med EcoRI- og BamHI-restrik-tions-endonucleaser for at danne somatostatin-genet som 25 afbildet i fig. 2.

Det syntetiske somatostatin-gen-fragment med EcoRI- og BamHI-termini blev forbundet til pBH20-plasmidet, som i forvejen var behandlet med EcoRI- og BamHI-restriktions-30 endonucleaserne og alkalisk phosphatase. Behandlingen med alkalisk phophatase giver en molekylær udvælgelse for plasmider bærende det indsatte fragment. Ampicillin-re-sistente transformanter opnået med dette forbundne DNA blev sigtet for tetracyclin-følsomhed, og flere blev 35 undersøgt for indsættelsen af et EcoRI-BamHI-fragment af den passende størrelse.

17 DK 173092 B1

Begge strenge af EcoRI-BamHI-fragmenterne af plasmider fra to kloner blev analyseret ved nucleotidsekvensana-lyse startende fra BamHI- og EcoRI-stederne. Sekvensanalysen blev udstrakt til de lac-kontrollerende ele-5 menter; lac-fragment-sekvensen var intakt og i et tilfælde, pSOMl, blev nucleotidsekvensen af begge strenge bestemt uafhængigt, og hver gav den sekvens, som er afbildet i fig. 5A.

10 EcoRI-Pst-fragmentet af pSOMl-plasmidet med dét lac-kontrollerende element blev fjernet og erstattet med EcoRI-Pst-fragmentet af pBR322 til dannelse af plas-midet pSOMll. EcoRI-fragmentet af plac5, bærende lac-operon-kontrolområdet og det meste af β-galactosida-15 se-strukturgenet, blev indsat i EcoRI-stedet af pSOMll.

To orienteringer af EcoRI-lac-fragmentet i Jvplac^ blev forventet. En af disse orienteringer ville opretholde den rigtige aflæsningsramroe i somatostatin-genet, den anden ville ikke. Analyse af uafhængigt isolerede 20 kloner for somatostatin-aktivitet identificerede derefter kloner indeholdende det rigtigt orienterede gen, hvoraf klonen betegnet pSOMll-3 var en.

6. Mikroorganismen 25

Forskellige encellede mikroorganismer er blevet foreslået som kandidater for transformation, såsom bakterier, svampe og alger, d.v.s. de encellede organismer, som er i stand til at dyrkes i kulturer eller ved gæ-30 ring. Bakterier er som oftest de mest hensigtsmæssige organismer at arbejde med. Bakterier, som er følsomme for transformation, inkluderer medlemmer af Enterobac-teriaceæ, såsom stammer af Escherichia coli og Salmonella, Bacillaceæ, såsom Bacillus subtilis, Pneumo-35 coccus, Streptococcus og Haemophilus influenzae. Dep bestemte organisme, som blev valgt til det i det følgen- 18 DK 173092 B1 de omtalte somatostatinarbejde, var E. coli stamme RR1, genotype: Pro~Leu"Thi" Rb“Mb réc A+ Strr Lac y”. E. coli RR1 er afledt fra E. coli HB101 (H.W. Boyer et al., J. Mol. Biol. (1969) 41, 459-472) ved parring med 5 E. coli L12 stamme KL16 som Hfr donoren. Se J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Kulturer af både E. coli RR1 og E. coli RR1 (pBR322) er blevet deponeret i the American Type Culture Collection uden begrænsning jn.h.t. ad-10 gang» henholdsvis ATCC No. 31343 og No. 31344 (deponeret d.

8. november 1977 i henhold til Budapest-traktaten). Den somatostatin-producerende organisme er ligeledes blevet deponeret, ATCC No. 31447 (deponeret d. 28. oktober 1978 i henhold til Budapest-traktaten).

15 _ I tilfælde af humant insulin, blev A- og B-kæde-générne klonet i E. coli K-12 stamme 294 (end A, thi", hsr”, hsmk+), ATCC No. 31446, og denne organisme anvendt til udtrykkelse af A-kæden (E.coli K-12 stamme 294 pIAl, 20 ATCC No. 31448) (deponeret d. 28. oktober 1978 i henhold til Budapest-traktaten). B-kæden af humant insulin blev først udtrykt i et derivat af HB101, d.v.s. E. coli k-12 stamme D1210 a lac+ (i^o+z+y+), og denne B-gen-holdige organisme er ligeledes blevet deponeret (ATCC No. 31449) 25 (deponeret d. 28. oktober 1978 i henhold til Budapest- traktaten) . Alternativt kan B-genet indsættes i og udtrykkes fraden førstnævnte organisme, d.v.s. stamme 294.

FORSØG

30

I. .SOMATOSTATIN

1. Konstruktion af somatostatin-gen-fragmenter 35 Otte oligodeoxyribonucleotider mærket henholdsvis A-H i fig. 2 blev først konstrueret, hovedsageligt ved denne modificerede triester-metode beskrevet af K. Ita-kura et al., J. Am. Chem. Soc. 97. 7237 (1975). Imidlertid måtte der i tilfældet med fragmenterne C, E og H gribes til en forbedret teknik, hvorved der først 19 DK 173092 B1 fremstilles fuldt beskyttede trimere som grundenhed for bygning af længere oligodeoxyribonucleotider. Den forbedrede teknik er skematisk afbildet i fig. 3» hvori B er thymin, N-benzoyleret adenin, N-benzoyle-5 ret cytosin eller N-isobutyryleret guanin. I korthed og med henvisning til fig. 3 gik koblingsreaktionen med II (1 mmol) med et overskud af I (2 mmol) næsten til ende i løbet af 60 minutter ved hjælp af et kraftigt koblingsreagens, 2,4,6-triisopropylbenzensulfonyl-10 tetrazolid (TPSTe, 4 mmol; 2). Efter fjernelse af den 51-beskyttende gruppe med 2% benzensulfonsyreopløsning, kunne 5 '-hydroxy-dimer en V adskilles fra et overskud af 3'-phosphodiester-monomer IV ved simpel opløsningsmiddelekstraktion med vandig NaHCO^-opløsning i CHCl-j.

15 Den fuldt beskyttede trimer-blok blev fremstillet successivt ud fra 5*-hydroxy-dimeren V, I (2 mmol) og TPSTe (4 mmol) og isoleret ved chromatographi på sili-cagel som i B. T. Hunt et al., Chem. and Ind, 1967, 1868 (1967). Udbytterne af trimerer fremstillet ifølge 20 den forbedrede teknik er anført i Tabel II.

TABEL II

Udbytter af fuldt beskyttede trimere 25

Sekvens Udbytte Sekvens Udbytte TTT 81% ATG 69% TTT 75% GCC 61% GGA 41% CCA 72% AGA 49% C AA 72% ATC 71% TTA 71% ™ CCT 61% CAT 72% 30 ACA 63% CCC 73% ACC 65% AAC 59% C GT 51% GAT 60%

De otte oligodeoxyribonucleotider blev efter fjernelse 35 af alle beskyttende grupper renset ved højtryksvæske-chromatografi på Permaphase AAX (R. A. Henry et al.

DK 173092 B1 20 ;T. Chrom. Sci. II, 358 (1973)). Renheden af hver oligomer blev undersøgt ved homochromatografi på tyndtlags-DEAE-cellulose og også ved gelelektroforese i 2096 acryl-.amidplade efter mærkning af oligomererne med l*-32p]-5 ATP i nærvær af polynucleotid-kinase. Et mærket hovedprodukt blev opnået udfra hvert DNA-fragment.

2. Sammenbinding og acrylamidgel-analyse af somato-statin DNA_ 10 5'-OH-terminierne af de kemisk syntetiserede fragmenter A-H blev hver for sig phosphoryleret med T4-poly-nucleotid-kinase. [32pJ- ATP blev anvendt ved phos- phoryleringen, således at reaktionsprodukter kunne 15 kontrolleres autoradiografisk, selv om det vil indses at umærket ATP ville tjene lige så godt, hvis man gav afkald på autoradiografi. Lige før kinasereaktionen blev 25 /uCi [)(-3¾ATP (ca. 1500 Ci/mMol) (Maxam and

Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 74, 1507 (1977)) 20 inddampet til tørhed i 0,5 ml Eppendorf-glas. Fem /ug fragment blev inkuberet med 2 enheder af T4-DNA-kinase (hydroxylapatitfraktion, 2500 enh./ml; 27), i 70 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgC^» 5 mM dithiothreitol i et totalvolumen på 150 ^ul i 20 min. ved 37°C. For at sik-25 re maximal phosphorylering af fragmenterne til sammenbindingsformål tilsattes 10 ^ul af en blanding bestående af 70 mM Tris-HCl pH 7,6 lOmM MgCl2, 5 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP og 2 enheder DNA-kinase, og inkubationen fortsattes i yderligere 20 min. ved 7°C. Fragmenter-30 ne (250 ng/^ul) blev opbevaret ved -20°C uden yderligere behandling. Kinasebehandlede fragmenter A, B, E og F (1,25 ^ug hver) blev sammenbundet i et totalvolumen på 50 yUl i 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgC^, 10 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP og 2 enheder T4-DNA-ligase 35 (hydroxylapatit-fraktion, 400 enh./ml; 27), i 16 timer ved 4°C. Fragmenterne C, D, G og H blev sammenbundet DK 173092 B1 21 under lignende betingelser. Prøver på 2 ^ul blev udtaget til analyse ved elektroforese på en 1090 polyacryl-amidgel efterfulgt af autoradiografi (H.L. Heyneker et al., Nature 265. 748 (1976)) hvorved ureagerede DNA-5 fragmenter repræsenteres ved hurtigt migrerende materia-1¾ og hvor den monomere form af de sammenbundne fragmenter migrerer med bromphenolblåt (BPB). Nogen dimerisering sker også på grund af de kohæsive ender af de sammenbundne fragmenter A, B, E og F og af de sammen-10 bundne fragmenter C, D, G og H. Disse dimere repræsenterer det langsomst migrerende materiale og kan spaltes ved hjælp af begrænsnings-endonuclease henholdsvis Eco RI og Barn HI.

15 De to halve molekyler (sammenbundet A+B+E+Fog sammenbundet C + D + G + H)blev forenet ved et yderligere sammenbindingstrin udført i et endeligt volumen på 150 ^ul ved 4°C i 16 timer. En mikroliter blev udtaget til analyse. Reaktionsblandingen blev opvarmet 20 til 65°C i 15 min. for at inaktivere T4-DNA-ligasen.

Varmebehandlingen påvirker ikke DNA-blandingens migre-ringsmønster. Der sattes tilstrækkeligt restriktions-endonuclease BamHI til reaktionsblandingen til at spalte de multimere former af somatostatin-DNA’en i 30 min.

25 ved 37°C. Efter tilsætning af NaCl til 100 mM blev DNAfen fordøjet med EcoRI-endonuclease. Restriktions-endonu-clease-nedbrydningeme blev afsluttet ved phenol/chloroform^ ekstraktion af DNA'en. Somatostatin-DNA-fragmentet blev renset fra ureagerede og delvis sammenbundne DNA-30 fragmenter ved præparativ elektroforese på en 10% poly-acrylamidgel. Båndet indeholdende somatostatin-DNA-fragmentet blev udskåret fra gelen, og DNA’en elueret ved udskæring af gelen i små stykker og ekstraktion af DNA’en med elueringspuffer (0,5 M ammoniumacetat, 10 mM 35 MgCl2, 0,1 mM EDTA, 0,1# SDS) natten over ved 65°C.

DK 173092 B1 22 DNA'en blev udfældet med to volumener ethanol, centrifugeret, genopløst i 200 yrul 10 mM Tris-HCl pH 7,6 og dialyseret over for den samme puffer, hvilket resulterede i en somatostatin-DNA-koncentration på 4 ^ug/ml.

5 3. Konstruktion af rekombinant.-plasmi.der

Fig. 4 viser skematisk den måde, hvorpå rekombinant-plasmider omfattende somatostatin-genet blev konstru-10 eret, og kan henvises til i forbindelse med den følgende mere detaljerede forklaring.

A. Udgangs-plasmidet nBR522 15 Det plasmid, der valgtes til eksperimentel somatosta-tin-kloning, var pBR3?2, et lille (molekylevægt ca.

2,6 megadalton) plasmid bærende resistensgener over for antibioticaene ampicillin (Ap) g tetracyclin (Tc) .

Som angivet i fig. 4 inkluderer ampicillinresistens-20 genet et spaltnings sted for restriktions-endonuclea-*-sen Pst I, tetracyclinresistens-genet inkluderer et lignende sted for restriktions-endonucleasen Bam Hl, og et Eco RI-sted er anbragt mellem Apr og Tcr-generne. Plasmidet pBR322 er afledt fra pBR313> et 5,8 megadal-25 ton Ap^c^Col^^-plasmid, (R. L. Rodriquez et al., ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology 471-77 (1976), R. L. Rodriquez et al., Construction and Characterization of Cloning Vehicles, i Molecular Mechanisms in the Control of Gene Expression, 30 side 471-77, Academic Press, Inc. (1976)). Plasmidet pBR322 er karakteriseret og dets afledningsmåde fuldt beskrevet i F. Bolivar et al., "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning System”, Gene (November 1977).

35 DK 173092 B1 23

B. Konstruktion af plasmidet pBHlO

Fem /Ug plasmid-pBR322-DNA blev nedbrudt med 10 enheder af restriktions-endonucleasen EcoRI i 100 mM Tris- 5 HC1 pH 7,6, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl2 ved 37°C i 30 minutter. Reaktionen blev afsluttet ved phenol-chloroform ekstraktion; DNA’en blev derpå udfældet med to et halvt volumen ethanol og gensuspenderet i 50 /ul T4-DNA-po-lymerase - puffer (67 mN Tris-CLl pH 8,8, 6,7 mM MgCl2, 10 16,6 mM (NH^)2S0^, 167 /Ug/ml bovint serumalbumin, 50 /um af hver af dNTP’erne; A. Panet et al., Biochem. 12.

5045 (1973). Reaktionen blev startet ved tilsætning af to enheder T4 DNA-polymerase. Efter inkubation ved 37°C i 30 min. blev reaktionen afsluttet ved phenol/chloro-15 form-ekstraktion af DNA'en efterfulgt af udfældning med ethanol. 3 /Ug λ plac^-DNA (Shapiro et al., Nature 224, 768 (1969) blev fordøjet i en time ved 37°C med begrænsnings-enzymet Haelll (3 enheder) i 6 mM Tris-HCl pH 7,6, 6 mM MgCl2, 6 mM Æ-merc.aptoethanol i et slutvolumen 20 på 20 /Ul. Reaktionen blev standset ved opvarmning til 65°C i 10 min. Det pBR322-behandlede DNA blev blandet med det HaellI-fordøjede λ plac^-DNA og stump-endesammenbundet i et slutvolumen på 30 /Ul med 1,2 enheder T4-DNA-ligase (hydroxylapatit-fraktion; A. Panet et al., 25 ovenfor) i 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgClo, 10 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP i 12 timer ved 12°C. Den sammenbundne DNA-blanding blev dialyseret over for 10 mM Tris-HCl pH 7,6 og anvendt til transformation af E. coli stamme RR1. Transformanter blev udvalgt for 30 tetracyclin- og ampicillin-resistens på minimal-mediumplader indeholdende 40 /Ug/ml 5-brom-4-chlor-incolyl-galactosid-(X-gal)-medium (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972)). Kolonier med en konstitution på syntesen af 35 fa -galactosidase blev identificeret ved deres blå 24 DK 173092 B1 farve. Efter sigtning af 45 uafhængigt isolerede "blå kolonier fandtes tre af dem at indeholde plasmid-DNA bærende to EcoRI-steder adskilt af ca. 200 basepar. Positionen af et asymmetrisk anbragt Hhal-fragment i 5 203 basepars Haelll lac-kontrolfragmentet (W. Gil bert et al., in Protein-Ligand Interactions, H. Sand and G. Blauer, Eds, De Gruyter, Berlin, (1975) side 193-210) tillader bestemmelsen af orienteringen af Haell-fragmentet, nu et EcoRI-fragment, i disse plas-10 mider. Plasraidet pBHlO fandtes at bære fragmentet i den ønskede orientering, d.v.s. lac-transcriptionen går ind i plasmidets Tcr-gen.

C. Konstruktion af olasmidet pBH2Q 15

Plasmidet pBHlO blev dernæst modificeret til at eliminere EcoRI-stedet fjernest fra lac-operatoren. Dette gennemførtes ved preferentiel EcoRI-endonuclease-spaltning ved det fjerneste sted involverende delvis beskyt-20 telse med RNA-polymerase af det andet EcoRI-sted loka-liseret mellem Tc og lac-promotorerne, som kim er omkring 40 basepar fra hinanden. Efter binding af RNA-polymerase, blev DNA»en (5 ^ug) fordøjet med EcoRI (1 enhed) i et slutvolumen på 10 ^ul ved 37°C i 10 min. Re-25 aktionen blev standset ved opvarmning til 65°C i 10 min. De kohæsive EcoRI-termini blev fordøjet med Sl-nuclease i 25 mM Na-acetat pH 4,5, 300 mM NaCl, 1 mM ZnCl2 ved 25°C i 5 minutter. Reaktionen blev standset ved tilsætning af EDTA (10 mM slutkoncentration) og 30 Tris-HCl pH 8 (50 mM slutkoncen tration) DNA’en blev ekstraheret med phenol-chloroform, fældet med ethanol og gensuspenderet i 100 yul T4 DNA-sammenbindingspuffer.

Der tilsattes T4-DNA-ligase (1 ^ul), og blandingen blev inkuberet ved 12°C i 12 timer. Det sammenbundne DNA blev 35 transformeret i E. coli stamme RR1, og AprTcr-transforman-terne blev udvalgt på X-gal-antibiotisk medium. Restrik- DK 173092 B1 25 tionsenzymanalyse af DNA sigtet fra 10 isolerede blå kolonier afslørede, at disse kloner bar plasmid-DNA med ét EcoRI-sted. Syv af disse kolonier havde bevaret EcoRI-stedet anbragt mellem lac- og Tcr-promotorerne.

5 Nucleotidsekvensen fra EcoRI-stedet ind i lac-kontrol-området for et af disse plasmider, pBH20, blev bekræftet. Dette plasmid blev derefter anvendt til at klone somatostatin-genet.

10 D, Kondbruktlon af plasmidet bSOMl

Tyve yrug af plasmidet pBH20 blev fordøjet helt med restriktions-endonucleaserne EcoRI og BamHI i et slut- volumen på 50 ^ul. Der tilsattes bakteriel alkalisk 15 phosphatase (0,1 enhed Worthington BAPF) og inkubationen fortsattes i 10 min. ved 65°C. Reaktionerne blev afsluttet ved phenol-chloroform-ekstraktion, og DNA*en blev udfældet med 2 volumener ethanol, centrifugeret og opløst i 50 yrul 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA. Be-20 handlingen med alkalisk phosphatase forhindrer effektivt selvsammenbinding af den EcoRI, BamHI-behandlede pBH20-DNA, men cirkulære rekombinant plasmider indeholdende somatostatin-DNA kan stadig dannes ved sammenbinding. Eftersom E. coli RR1 transformeres med meget 25 lav effektivitet af lineær plasmid-DNA, vil hovedparten af transformanterne indholde rekombinant-plasmider.

Halvtreds ^ul somatostatin-DNA (4 yug/ml) blev sammenbundet med 25 yu.l af dem BamHI, EcoRI, alkalisk phos-phatase-behandlede pBH20-DNA i et totalvolumen på 30 50 yul indeholdende 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgC^, 10 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP og 4 enheder T4-DNA-ligase ved 22°C. Efter 10, 20 og 30 minutter sattes yderligere somatostatin-DNA (40 ng) til reaktionsblandingen (den gradvise tilsætning af somatostatin-DNA kan 35 favorisere sammenbinding til plasmidet frem for selv- 26 DK 173092 B1 sammenbinding). Sammenbindingen fortsattes i en time efterfulgt af dialyse af blandingen over for 10 mM Tris-HCl pH 7,6. Ved et kontrolforsøg blev nu BamHI EcoRI, alkalisk phosphatase-behandlet pBH20-DNA sam-5 menbundet i fravær af somatostatin-DNA under lignende betingelser. Begge præparater blev anvendt uden yderligere rensning til at transformere E. coli RR1. Transformationsforsøgene blev udført i et stort PJ fysisk indeslutningsanlæg (National Institutes of Health, 10 U.S.A., Recombinant DNA Research Guidelines, 1976).

Transformanter blev udvalgt på minimal-raedium-plader indeholdende 20 ^ug/ml Ap og 40 ^ug/ml X-gal. Ti transformanter, som alle var følsomme for Tc, blev isoleret. Til reference blev disse betegnet pSOMl, pS0M2 ..

15 ..... pSOM 10. Ved kontrolforsøget blev der ikke opnået nogen transformanter. Fire ud af de ti transformanter indeholdt plasmider med både EcoRI-sted og et BamHI-sted. Størrelsen af det lille EcoRI, BamHI-fragment af disse rekombinant-plasmider svarede i alle fire 20 tilfælde til størrelsen af det in vitro fremstillede somatostatin-DNA. Basesekvens-analyse ifølge Maxam and Gilbert, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 24, 560 (1977) afslørede, at plasmidet pSOMl havde det ønskede somatostatin- DNA-fragment insat.

25 DNA-sekvens-analysen af klonen bærende plasmidet pSOMl forudsiger, at det skulle producere et peptid omfattende somatostatin. Imidlertid er der ikke blevet sporet nogen radioimmun somåtostatin-aktivitet i ekstrakter af 30 cellepiller eller kultursupernatanter, og der er heller ikke sporet tilstedeværelse af somatostatin, når den groende kultur sættes direkte til 7096 myresyre og cyan-bromid. E. coli RR1 ekstrakter er blevet observeret at ledbryde exogent somatostatin meget hurtigt. Fraværet 35 af somatostatin-aktivitet i kloner bærende plasmidet pSOMl kunne vel skyldes intracellulær nedbrydning på 27 DK 173092 B1 grund af endogene proteolytiske enzymer. Plasmidet pSOMl blev derfor anvendt til at konstruere et plasmid, som koder for et forstadie-protein omfattende somatostatin og tilstrækkeligt stort til at kunne forventes 5 at modstå proteolytisk nedbrydning.

E. Konstruktionen af plasmiderne pSOMll og pSOMll-5

Der blev konstrueret et plasmid, hvori somatostatin-10 genet kunne anbringes ved den C-terminale ende af galactosidasegenet, idet translationen holdtes i fase. Tilstede-rørelsen af et EcoRI-sted nær ved den C-terminale ende af dette gen og den tilgængelige aminosyresekvens af dette protein (B. Polisky et al., Proc.

15 Nat. Acad. Sci. U.S.A. 22» 3900 (1976). A. V. Fowler et al., samme 74, 1507,(1976), A. I. Bukhari et al.,

Nature New Biology 243, 238 (1973) og K.E. Langley,e J. Biol. Chem. 2£0, 2587 (1975)) tillod indsættelse af EcoRI, BamHI-somatostatin-genet i EcoRI-stedet un-20 der opretholdelse af den rigtige aflæsningsramme.

DK 173092 B1 28

Til konstruktionen af et sådant plasmid blev pSOMl-DNA (50 /Ug) nedbrudt med restriktions-enzymerne EcoRI og PstI i et slutvolumen på 100 /ul. En præparativ 5% polyacrylamidgel anvendtes til at adskille 5 det store Pst-EcoRI-fragment, som bærer sornatostatingenet, fra det lille fragment, som bærer lac-kontrol-elementerne. Det store bånd blev skåret fra gelen, og DNA'en blev elueret ved udskæring af gelen i små stykker og ekstraktion af DNA’en ved 65°C natten over.

10 På lignende måde blev plasmid-pBR322 DNA (50 yug) nedbrudt med PstI- og EcoRI-restriktions-endonucleaser, og de to resulterende DNA-fragmenter renses ved præparativ elektrophorese på en 5% polyacrylamidgel. Det lille pstl-EcoRI-fragment fra pBR322 (1 /Ug) blev 15 sammenbundet med det store Pstl-EcoRI-DNA-fragment (5 /ug) fra pSOMl i et slutvolumen på 50 /ul med en enhed T4-DNA-ligase ved 12°C i 12 timer. Den sammen-bundne blanding blev anvendt til at transformere E. coli RR1, og transformanter udvalgtes efter am-20 picilin-resistens på X-gal-medium. Som forventet gav næsten alle Apr-transformanterne (9590 hvide kolonier (ingen lac-operator) på X-gal-indikatorplader. Det resulterende plasmid, pSOMll, anvendtes ved konstruktionen af plasmidet pS0Mll-3. En blanding af 5 yug 25 pSOMll-DNA og 5 /ug >\ plac^-DNA blev nedbrudt med

EcoRI (10 enheder i 30 min. ved 37°C). Restriktions-endonuclease-nedbrydningen blev afsluttet ved phenol-chloroform-ekstraktion. DNA'en blev derpå udfældet med ethanol og gensuspenderet i T4 DNA-ligase-puffer 30 (50 /ul). Der sattes T4-DNA-ligase (1 enhed) til blan dingen, og den blev inkuberet ved 12°C i 12 timer.

Den sammenbundne blanding blev dialyseret over for 10 mM Tris-HCl pH 7,6 og anvendt til at transformere E.coli stamme RR1. Transformanter blev udvalgt for 35 Apr på X-gal-plader indeholdende ampicilin og sigtet 29 DK 173092 B1 for konstitution til β-galactosidase-produktion. Ca.

2% af kolonierne var blå (pSOMll-l, 11-2 osv.). Begrænsnings- enzym- analyse af plasmid-DNA opnået fra disse kloner afslørede, at alle plasmideme fra et 5 nyt EcoRI-fragment på tilnærmelsesvis 4,4 megadalton, som bærer lac-operon-kontrolstederne og det meste af β-galactosidase-genet. Fordi to orienteringer af EcorRI-fragmentet er mulig, blev den asymmetriske anbringelse af et Hindlll-begrænsningssted anvendt til 10 at bestemme, hvilken af disse kolonier, som bar dette EcoRI-fragment med lac-transskription fortsættende ind i somatostatingenet. Dobbelte Hindlll-BamHI-nedbryd-ninger angav, at kun klonerne bærende plasmideme pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6 og pSOMll-7 indeholdt 15 EcoRI-fragmentet i denne orientering.

4. Radioimmunprøvning for somatostatin-aktivitet

Standard-radioimmunprøvningerne (RIA) for somatosta-20 tin (A. Arimura et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med.

148. 784 (1975)) blev modificeret ved nedsættelse af prøvningsvolumenet og anvendelse af phosphatpuffer.

Tyr^-somatostatin blev ioderet under anvendelse af en chloramin-T-procedure. (Id.) til prøvning for 25 somatostatin blev prøven, sædvanligvis i 70% myresyre indeholdende 5 mg/ml cyanbromid, tørret i et konisk polypropylenglas (0,7 ml, Sarstedt) over fugtigt KOH under vakuum. Der tilsattes 20 yul PBSA-puffer (75 mM NaCl, 75 mM natriumphosphat, pH 7,2, 30 1 mg/ml bovint serumalbumin og 0,2 mg/ml natriumazid) efterfulgt af 40 yul af en -somatostatin- "cocktail" og 20 ^ul af en 1000-gange fortynding i PBSA af kanin-antisomatostatin-immunserum S39 (Vale et al, Metabolism 2£, 1491» 1976).1.1^ ij -somatosta-35 tin-cocktailen indeholdt per ml PBSA-puffer: 250 ^ug ,n DK 173092 B1 normalt kanin-gammaglobulin (Antibodies, Inc.)» 1500 enheder protease-inhibitor ('•Trasylol1', Calbiochem) og omkring 100 000 tællinger [12^ΐ] Tyr^-somatostatin.

Efter mindst 16 timer ved stuetemperatur sattes 0,335 ml 5 gede-anti-kanin-gammablobulin (Antibodies, Inc. P=0,03) i PBSA-puffer til prøveglassene. Blandingen blev inkuberet i 2 timer ved 37°C, afkølet til 5°C, derpå centrifugeret ved 10 000 x G i 5 minutter. Supematanten blev fjernet, og pillen talt i en gammatæller. Med den 10 anvendte mængde antiserum blev 20% af tællingerne udfældet uden noget umærket konkurrence-somatostatin. Baggrunden ved uendeligt somatostatin (200 ng) var sædvanligvis 3%. Halvdelen af maksimal konkurrence blev opnået ved 10 pg somatostatin. Begyndelsesforsøg med 15 ekstrakter af E. coli stamme RR1 (modtagerstammen) angav, at mindre end 10 pg somatostatin let kunne spores i nærvær af 16 ^ug eller mere cyanbromid-be-handlet bakterieprotein. Mere end 2 yug protein fra myresyre-behandlede bakterieekstrakter forstyrrede 20 noget ved at forøge baggrunden, men cyanbromid-spalt-ning reducerede i høj grad denne forstyrrelse. Rekonstruktionsforsøg viste, at somatostatin er stabilt i cyanbromid-behandlede ekstrakter.

25 A. Konkurrence fra bakterieekstrakter

Stammerne E. coli RR1 (pS0Mll-5) og E. coli RR1 (pSOMll- 4) blev dyrket ved 37°C til 5 x 10® celler/ml i Luria-væske. Derpå tilsattes IPTG til 1 mM og dyrkningen 3Q fortsattes i 2 timer. 1 ml aliquots blev centrifugeret i nogle få sekunder i en Eppendorf-centrifuge, og pillerne blev suspenderet i 500 yul 70% myresyre indeholdende 5 mg/ml cyanbromld. Efter omkring 24 timer ved stuetemperatur blev aliquots fortyndet 10 35 gange i vand, og de i fig. 5 angivne voluminer blev „ DK 173092 B1 31 prøvet in triplo for somatostatin. I fig. 6 er 125 ”B/B " forholdet mellem I -somatostatin bundet i o nærvær af prøven og det, som er bundet i fravær af konkurrerende somatostatin. Hvert punkt er gennemsnit-5 tet af tre glas. De ufortyndede prøvers proteinindhold blev bestemt til 2,2 mg/ml for E. coli RR1 (pSOMll- 5) og 1,5 mg/ml for E. coli RR1 (pSOM-4).

B. Begyndelsessigtningen af pSOMll-kloner for soma- 10 tostatin

Cyanbromid-behandlede eksstrakter af 11 kloner (pSOMll-2, pSOMll-3, osv.) blev fremstillet som beskrevet ovenfor for tilfældet i fig. 6. 30^,ul af hvert ekstrakt 15 blev udtaget in triplo til radioimmunprøvning, hvis resultater fremgår af fig. 7. Området af prøvningspunkter er angivet. Værdierne for pg somatostatin blev aflæst fra en standardkurve opnået som en del af det samme forsøg.

20

De hidtil beskrevne radioimmunprøvningsresultater kan sammenfattes som følger. I modsætning til resultaterne af forsøg med pSOMl, fandtes fire kloner (pSOMll-3, 11-5, 11-6 og 11-7) at have let skelnelig 25 somatostatin-radioimmunoaktivitet, fig. 6 og 7. Be-grænsnings-fragmentanalyse afslørede, at pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6 og pSQMll-7 havde den ønskede 0-rientering af lac-operonet, medens pSOMll-2 og pSOMll-4 havde den modsatte orientering. Således er der en 30 perfekt korrelation mellem den korrekte orientering af lac-operonet og frembringelsen af somatostatin-radioimmunaktivitet.

C. Virkninger af IPTG-induktion og CNBr-spaltning på 35 positive og negative kloner_ DK 173092 B1 32

Udformningen af somatostatin-plasmidet forudsiger» at syntesen af somatostatin ville være under kontrol af lac-operonet. Lac-repressorgenet er ikke inkluderet i plasmidet, og modtagerstammen (E. coli RRl) 5 indeholder det chromosomale lac-repressorgen af vild type, som kun producerer 10-20 repressormolekyler per celle (15). Plasmid-kopitallet (og derfor antallet af lac-operatorer) er tilnærmelsesvis 20-30 per celle, så fuldstændig repression er umulig. Som vist i tabel 10 III nedenfor forøges den specifikke aktivitet af somatostatin i E. coli RRl (pSOMll-3) af IPTG, en induk-tor for lac-operonet. Som forventet var induktionsniveauet lavt, varierende fra 2,4 til 7 gange. I forsøg 7 (tabel III) blev α-aktivitet, et mål for de 15 første 92 aminosyrer af p-galactosidase, også induceret med en faktor på 2. I flere forsøg kan der ikke spores nogen målelig somatostatin-radioimmunaktivitet før cyanbromid-spaltning af det totale cellulære portein. Eftersom det ved radioimmunprøvningen anvend-20 te antiserum, S 39, kræver et frit N-terminalt alanin, blev der ikke forventet nogen aktivitet før cyanbromid-spaltning.

Tabel III 25

Specifik radioimmun somatostatin-aktivltet

Forkortelser: Luria-væske, LB, isopropylthiogalactosid, IPTG, cyanbromid, CNBr, somatostatin, SS.

30 Protein blev målt ved metoden beskrevet af Bradford,

Anal. Biochem. 72, 248, (1976).

__ DK 173092 B1 35

Forbøg IPTG CNBr nr. ' Stamme Medium 1 mtl 5 mg/ml pg SS/ug protein 1 11-2 LB + + < 0.1 5 11-3 LB + + 12 11-4 LB + + < 0,4 11-5 LB + + 15 2 11-3 LB + + 12 11-3 LB + - < 0,1 3 11-3 LB + + 61 11-3 LB - + 8 11-3 LB + - < 0.1 10 4 11-3 LB + + 71 11-3 VB + glycerol* + + 62 5 11-3 LB + glycerol + + 250 6 11-3 LB + + 320 11-2 LB + + < 0,1 7 11-3 LB + + 24- 11-3 LB - + 10 15---- *Vogel-Bonner-rainimalmedium plus glycerol.

20 D. Gelfiltrering af cyanbromid-behandlede ekstrakter

Myresyre- og cyanbromid-behandlede ekstrakter af de positive kloner (pSOM 11-3, 11-5, 11-6 og 11-7) blev hældt 25 sammen (totale volumen 250 /ul), tørret og gensuspen deret i 0,1 ml 50?é eddikesyre. Der tilsattes L^H^leu-cin, og prgven blev påsat en 0,7 x 47 cm søjle af "Sephadex®G-50” i 50% eddikesyre. 50 ^ul aliquots af søjlefraktioneme blev prøvet for somatostatin. Sam-30 menhældte negative klonekstrakter (11-2, 11-4 og 11-11) blev behandlet identisk. Resultaterne fremgår af fig.

8. På den samme søjle elueres kendt somatostatin (Beckman Corp.) som vist (SS). I dette system adskilles somatostatin godt fra ekskluderede store peptider 35 og fuldt inkluderede små molekyler. Kun ekstrakter af kloner positive for somatostatin udviste radioimmun-aktivitet i søjlefraktionerne, og denne aktivitet elu- 34 DK 173092 B1 eres i samme position som kemisk syntetiseret somatostatin .

Sammenfatning af aktivitetinformation 5

De data, som fastslår syntesen af et polypeptid indeholdende somatostatin-aminosyresekvensen, sammenfattes som følger: (1) Somatostatin-radioimmunaktivitet er til stede i E. coli celler med plasmidet pS0Mll-3, 10 der indeholder et somatostatingen af bevist ‘Rorrékt sekvens og har den korrekte orientering af lac-EcoRI-fragmentet. Celler med det beslægtede plasmid pSOMll-2, som har det samme somatostatingen, men en modsat orientering af lac-EcoRI-fragmentet, producerer ingen 15 påviselig somastotatin-aktivitet. (2) Som forudsagt ved udformningen af proceduren, iagttages ingen påviselig somatostatinradioimmun-aktivitet, før efter cyanbromid-behandling af celleekstrakten. (3) Soma-tostatin-aktiviteten er under kontrol af lac-operonet 20 som påvist ved induktion af IPTG, en induktor for lac-operonet. (4) Somatostatin-aktiviteten co-chromato-graferer med kendt somatostatin på "Sephadex G-50".

(5) Det klonede somatostatingens DNA-sekvens er korrekt.

Hvis translationen er ude af fase, vil der fremstil-25 les et peptid, som er forskelligt fra somatostatin ved hver position. Der spores radioimmunaktivitet, som viser, at der er fremstillet et peptid nært beslægtet med somatostatin, og translationen må altså være i fase. Eftersom translationen sker i fase, dik-30 terer den genetiske kode, at der fremstilles et peptid med den nøjagtige sekvens som somatostatin. (6)

Endelig inhiberer de ovennævnte prøver af E. coli RR1 (pS0Mll-3)-ekstrakt frigørelsen af væksthormon fra rottehypofyseceller, medens prøver af E. coli 35 RR1 (pSOMll-2) fremstilles parallelt og med identisk DK 173092 B1 35 proteinkoncentration ikke har nogen virkning på frigørelsen af væksthormon.

Stabilitet, udbytte og rensning af somatostatin 5

Stammerne bærende EcoRI-lac-operon-fragmentet (pSOMll-2, pS0Mll-3 osv.) segregerer med hensyn til plasmid-fænotypen. For eksempel var efter omkring 15 generationer ca. halvdelen af E. coli RR1 (pS0Mll-3) kulturen 10 konstitutiv for β-galactosidase, dvs. lac-operatoren, og af disse var omkring halvdelen ampicilin-resisten-te. Stammer positive (pSOMll-3) og negative (pSOMll-2) for somatostatin er ustabile, og derfor stammer vækstulempen sandsynligvis fra overproduktionen af den sto-15 re, men ufuldstændige og inaktive galactosidase. Udbyttet af somatostatin har varieret fra 0,001 til 0,03% af det totale cellulære protein (tabel I), sand-synligivs som resultat af udvælgelsen efter celler i kulturen, som har plasmider med et ødelagt lac-område.

20 De højeste udbytter af somatostatin har været fra præparater, hvor væksten var startet fra en enkelt ampicilin-resistent konstitutiv koloni. Selv i disse tilfælde havde 30% af cellerne ved indhøstning ødelæggelser af lac-området. Opbevaring i frossen tilstand 25 (lyofilisering) og vækst til indhøstning fra en enkelt sådan koloni er derfor indiceret for det beskrevne system. Udbytterne kan forøges ved f.eks. at gribe til bakteriestammer, som overproducerer lac-repressor, således at udtrykningen af forstadie-protein er i 30 hovedsagen fuldstændig undertrykt før induktion og indhøstning. Alternativt kan der som tidligere omtalt anvendes et tryptofan- eller operator-promotor-system, som almindeligvis er totalt undertrykt.

35 I den rå ekstrakt resulterende fra cellebrydning i f.eks. en Eaton-presse er β-galactosidase-somatostatin- _ DK 173092 B1 36 forstadie-proteinet uopløseligt og findes i den første lavhastighedscentrifugeringspille. Aktiviteten kan solubiliseres i 70# myresyre, 6M guanidium-hydrochlo-rid eller 2# natriumdodecylsulfat. Mest foretrukkent 5 ekstraheres den rå ekstrakt fra Eaton-pressen imidlertid med 8M urinstof, og remanensen spaltes med cyan-bromid. Ved begyndelsesforsøg ersomatostatin-aktivi-teten afledt fra E. coli stamme RR1 (pS0Mll-3) blevet beriget tilnærmelsesvis 100 gange ved alkoholekstraktion 10 af spaltningsproduktet og chromatografi på "Sephadex'S) G-50" i 50# eddikesyre. Når produktet igen chromato-graferes på "Sephadex® G-50” og derpå underkastes højtryksvæskechromatografi, opnås i det væsentlige rent somatostatin.

15 II. Humant insulin

Den i det foregående beskrevne teknik blev dernæst anvendt til produktion af humant insulin. Således blev 20 generne for insulin-B-kæde (104 basepar) og for insulin- A-kæde (77 basepar) udformet ud fra aminosyre-sekvensen af de humane polypeptider, hver med enkeltstrengede kohæsive termini for EcoRI- og BamHI-restrik-tions-endonucleaserne og hvert udformet til indsættelse 25 separat i pBR322-plasmider. De syntetiske fragmenter, deca- til pentadeca-nucleotider, blev syntetiseret ved blok-phosphotriester-metoden under anvendelse af tri-nucleotider som byggeblokke og_endeligt renset ved høj-tryksvæskechromatografi (HPLC). De syntetiske gener 30 for A- og B-kæden af humant insulin blev derpå klonet separat i plasmidet pBR322. De klonede syntetiske gener blev sammensmeltet med et E. coli-p-galactosida-se-gen som før for at give effektiv transskription, translation og et stabilt forstadieprotein. Insulin-35 peptider blev spaltet fra β-galactosidase-forstadiet, DK 173092 B1 37 sporet ved radioimmunprøvning og renset. Insulin-ra-dioimmunprøvnings-aktivitet blev derpå frembragt ved blanding af E. coli-produkterne.

5 1. Udformning og syntese af gener for humant insulin

De konstruerede gener for humant insulin er afbildet i fig. 9. Generne for B-kæden og A-kæden af humant insulin blev udformet fra amino syre-sekvenserne af de 10 humane polypeptider. 5'-enderne af hvert gen har enkeltstrengede kohaesive termini for EcoRI- og BamHI-.res friktion s-endonucleaserae til den korrekte indsættelse af hvert gen i plasmidet pBR322. Et Hindlll-endonuclease-genkendelsessted blev inkorporeret i midten af B-15 kæde-genet for aminosyre-sekvensen Glu-Ala for at tillade udvidelse og verificering af hver halvdel af genet separat før konstruktionen af hele B-kæde-genet.

B-kæde- og A-kæde-geneme blev udformet til at bygges ud fra 29 forskellige oligodeoxyribonucleotider, varie-20 rende fra decamere til pentadecamere. Hver pil angiver fragmentet syntetiseret ved den forbedrede phosphotri-ester-metode, H1-H8 og B1-B10 for B-kæden-genet og Al-Al 2 for A-kæde-genet.

25 2. Kemisk syntese af oligodeoxyribonucleotider

Materialer og metoder til syntese af oligodeoxyribonucleotider var i hovedsagen dem, som er beskrevet af Itakura, K. et al (1975) J. Biol. Chem. 250. 4592 og 30 Itakura, K. et al (1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327 undtagen disse modifikationer; a) De fuldt beskyttede mononucleotider, 5'-0-dimethoxy-trityl-3'-p-chlorphenyl-p-cyanethylphosphater, blev 35 syntetiseret ud fra nucleosid-derivaterne under anven- DK 173092 B1 38 delse af det monofunktionelle phosphoryleringsmiddel p-chlorphenyl-p-cyanethylphosphorochloridat (1,5 molær ækvivalent) i acetonitril i nærvær af 1-methylimidazol (Von Boom, J.H. et al, )1975) Tetrahedron 31, 2953).

5 Produkterne blev isoleret i stor målestok (100-300 g) ved præparativ væskechromatografi (Prep 500 LC, Waters Associates).

b) Ved anvendelse af opløsningsmiddel-ekstraktionsme-10 toden (Hirose, T. et al (1978) Tetrahedron Letters, 2449) blev der syntetiseret 32 bifunktionelle trimere (se tabel IV) i 5-10 mmol-målestok, og 13 trimere, 3 tetramere og 4 dimere som 3’-terminus blokkene i 1 mmol-målestok. Homogeniteten af de fuldt beskyttede 15 trimere blev undersøgt ved tyndtlagschromatografi på silicagel i 2 methanol/chloroform-opløsningsmiddel-systemer: opløsningsmiddel a, 5 volumen-# og opløsningsmiddel b, 10 volumen-# (se tabel IV). Ud fra denne samling af forbindelser blev der syntetiseret 29 oli-20 godeoxyribonucleotider med defineret sekvens, 18 for B-kæde-genet og 12 for A-kæde-genet.

Grundenhederne, som anvendtes til at konstruere poly-nucleotideme, var to typer af trimer-blokke, dvs. de 25 bifunktionelle trimer-blokke i tabel IV og tilsvarende 3'-terminus-trimere beskyttet af en anisoyl-gruppe i 3’-hydroxygruppen. Den bifunktionelle trimere blev hydrolyseret til den tilsvarende 3 *-phosphodiester-komponent med en blanding af pyridin/triethylamin/ 30 vand i volumenforholdet 3:1:1 og også til den tilsvarende 51-hydroxyl-komponent med 2# benzensulfonsyre.

Den før omtalte 3’-terminus-blok blev behandlet med 2# benzensulfonsyre for at give det tilsvarende 5f-hydroxy. Koblingsreaktionen af et overskud af 3’-35 phosphodiester-trimeren (1,5 molært ækvivalent) med DK 173092 B1 39 den i mellemtiden opnåede 5'-hydroxyl-komponent (1 molært ækvivalent) i nærvær af 2,4,6-triisopropylbenzen-sulfonyltetrazolid (TPSTe, 3-4 ækvivalenter) var næsten fuldstændig.'! løbet af 3 timer. For at fjerne 5 overskuddet af 3'-phosphodiester-blok-reaktanten blev reaktionsblandingen sendt igennem en kort silicagel-søjle opbygget på et sinter glasfilter. Søjlen blev vasket, først med CHCl^ for at eluere nogle biprodukter og koblingsreagenset og derpå med CHCl^/CH^OH 10 (volumenforhold 95s5)» hvorved næsten al den fuldt beskyttede oligomer blev elueret. Under disse betingelser forblev den ladede 3'-phosphodiester-blok-reaktant i søjlen. På lignende måde gentoges blokkoblinger, indtil den ønskede længde var konstrueret.

15 DK 173092 B1 40

Tabel IV

Syntese af trimer-byggeblokke

Nr. udbyttexx Rf Renheji*^ I fig. 9 _delse_iXi__ b. (%)_til stede i: 1. AAG 47 0,15 0,40 93 B5,B6 2. AAT 49 0,25 0y52 95 Hl,Al,A6 3» AAC 52. 0,28 0,55 93 HS,B6,A2,A8 4- ACT 43 0,27 0,53 91 B4,B5,A6 5. ACC 56 0,33 0,60 96 B7 6. ACG 39 0,18 0,45 90 H5,B7 7. AGG 45 0,10 0,26 89 H6,B7,B9

8. AGT 33 0,14 0,40 96 B9,A2,AU

9. AGC 50 0,19 0,48 92 H8,3l,A5,AlO

10. AGA 48 0,24 0,50 91 A9, 11. TTC 44 0,26 0,52 95 B4,B7,A3 12. TTC 49 0,11 0,31 94 H3,E5,A2,A3,A5 13. TCT 58 0,24 0,49 96 A4 14. TCA 45 0,28 0,53 92 Hl,E2,H4,Al 15. TCG 39 0,12 0,34 91 A2 16. TGG 32 0,10 0,28 87 H3,A1,A10 17. TGC 51 0,18 0,47 93 H6,B2,A4,A7,A8 18. TGA 46 0,12 0,37 94 H7 19. TAC 61 0,22 0,50 90 B4,A11 20. TAA 55 0,17 0,44 95 B5,A10 21. CCT 53 0,30 0,55 97 H3,H4,B10 22. CAC 47 0,25 0,51 92 A3 23. C AA 58 0,25 0,51 93 H2,H6,H8,A7 24. CTT 41 0,28 0,54 92 B2,39,A4 25. CGA 40 0,27 0,52 93 A7 26. CGT 75 0,25 0,50 39 32,54,83,31 27. GGT 35 0,09 0,26 90 B3 28. GTT 46 0,18 0,45 93 B2 29. GTA 38 0,25 0,50 95 S6,B8,A6 30. GAA 39 0,15 0,39 88 H7,33,38,A5 31. GAT 52 0,22 0,49 89 B10,A9 32. GCA 42 0,14 0,39 93 A9 xfuldt beskyttede trideoxynucleotider, 5-09-dimethoxy-trityl-3’-p-chlorphenyl-p-cyanethylphosphat.

xxudbyttet var det samlede udbytte beregnet ud fra 5’-hydroxylmonomererne.

xxx baseret på HPLC-analyse.

DK 173092 B1 41 Højydelsesvæskechromatografi (HPLC) anvendtes udstrakt under oligonucleotidsyntesen til a) analyse af hvert trimer-og tetramerblok, b) analyse af mellemproduktfragmenterne (hexamere, nonamere og decamere), c) analyse af den sidste 5 koblingsreaktion og d) rensning af slutprodukterne. HPLC blev gennemført ved anvendelse af en Spectra-Physics 3500B liquid chromatograph. Efter fjernelse af alle beskyttende grupper med koncentreret NH^OH ved 50°C (6 timer) og 8090 eddikesyre ved stuetemperatur (15 min.), blev forbindelserne 10 analyseret på en "Permaphase AAX"-søjle (DuPont) [Van Boom, J. et al. (1977) J. Chromatography 131, 169·] (1 m x 2mm) under anvendelse af en lineær gradient af opløsningsmiddel B (0,05M KH2P0^ -1,0M KCl,pH 4,5) i opløsningsmiddel A (Ο,ΟΙΜ KH2P0^, pH 4,5)· Gradienten blev dannet begyndende 15 med puffer A og under påføring af 396 puffer B per minut.

Elueringen gennemførtes ved 60°C med indstrømningshastighed på 2 ml per minut. Rensningen af de 29 endelige oligonucleo-tider blev også gennemført på "Permaphase AAX" under de samme betingelser som angivet ovenfor. Det ønskede maximum 20 blev hældt sammen, afsaltet ved dialyse og lyophiliseret.

Efter mærkning af 5' -terminierne med (γ-^Ρ) ATP under anvendelse af T^-polynucleotid-kinase, blev homogeniteten af hvert oligonucleotid kontrolleret ved elektrophorese på en 209é polyacrylamidgel.

25

Samling og kloning af B-tode-genet og A-kæde-genet

Genet for B-kæden af insulin blev udformet til at have et EcoRI-restriktionssted på den venstre ende, et Hindlll-sted 30 i midten og et BamHI-sted ved den højre ende. Dette blev gjort således, at begge halvdele, den venstre EcoRI-Hindlll-halvdel (BH) og den højre Hindlll-BamHi-halvdel (BB), kunne klones separat i det hensigtsmæssige kloningsmedium pBR322 og, efter at deres sekvenser var blevet verificeret, samlet 35 til dannelse af det fuldstændige B-gen (fig. 10). BB-halv-delen blev samlet ved sammenbinding ud fra 10 oligodeoxyri-bonucleotider, mærket BI-BIO i fig, 9, fremstillet ved kemisk DK 173092 B1 42 phosphotriestersyntese. Bl og BIO blev ikke phosphoryleret, hvorved man eliminerede uønsket polymerisation af disse fragmenter gennem deres kohæsive ender (Hindlll og BamHI). Efter rensning ved præparativ acrylamidgel-electrophorese 5 og eluering af de største DNA-bånd, blev BB-fragmentet indsat i plasmidet pBR322, som var blevet spaltet med Hindlll og BamHI. Omkring 30% af de ampicillinresistente kolonier fra DNA'en var følsomme for tetracyclin, hvilket viser, at der var blevet indsat et ikke-plasmid-Hindlll-10 BamHI-fragment. De små Hindlll-BamHI-fragmenter fra fire af disse kolonier (pBB101-pBB104) blev sekvenéundersøgt og fandtes at være korrekte som udformet.

BH -fragmentet blev fremstillet på lignende måde og indsat 15 i pBR322, som var blevet spaltet med EcoRI- og Hindlll-re striktions-endonucleaser. Plasmider fra tre ampicillinre-sistente, tetracyclinfølsomme transformanter (pBHl-pBH3) blev analyseret. De små EcoRI-Hindlll-fragmenter fandtes at have den forventede nucleotidsekvens.

20 A-kæde-genet blev samlet i tre dele. De fire venstre-, fire midt- og fire højre- oligonucleotider (se fig 9) blev sammenbundet separat, derpå blandet og sammenbundet (oligonucleo-tiderne Al og A12 var uphosphorylerede). Det samlede A-kæde-25 gen blev phosphoryleret, renset ved gelelectrophorese og^ klonet i pBR322 ved EcoRI-BamHi-stederne. EcoRI-BamHI-fragmenterne fra to ampicillinresistente, tetracyclinfølsomme kloner (pAlO, pAll) indeholdt den ønskede A-gen-sekvens.

30 4. Konstruktion af plasmider til udtrykkelse af A- og B- insulin-gener

Fig. 10 belyser konstruktionen af lac-insulin-B-plasmidet (pIBl). Plasmiderne pBHl og pBBlOl blev nedbrudt med EcoRI-35 og Hindlll-endonucleaser. Det lille BH-fragment af pBHl og det store fragment af pBBlOl (indeholdende BB-fragmentet og det meste af pB322) blev renset ved gelelectrophorese, v 43 DK 173092 B1 blandet og sammenbundet 1 nærvær af EcoRI-spaltet \ plac*\ c

Megadalton EcoRI-fregmentet af Λ plac^ Indeholder lac-kon-trolområdet og hovedparten af β-galgctosidase-strukturgenet. Konfigurationen af restriktionsstederne sikrer korrekt sam-5 ling af BH til BB. Lac-EcoRI-fragmentet kan indsættes i to orienteringer; således skulle kun halvdelen af de efter transformation opnåede kloner have den ønskede orientering. Orienteringen af de ampicillinresistente, β-galactosidase-konstitutive kloner blev kontrolleret ved restriktionsana-10 lyse. Fem af disse kolonier indeholdt hele B-gen-sekvensen og den korrekte aflæste ramme fra β-galactosidase-genet ind-i B-kæde-genet. En koloni, PIBI, blev udvalgt til efterfølgende forsøg.

15 Ved lignende forsøg blev 4,4 megadalton lac-fragmentet fra X 5 placr indført i pAll-plasmidet ved EcoRI-stedet til opnåelse af pIAl. pIAl er identisk med pIBl, undtagen at A-gen-fragmentet er indført i stedet for B-gen-fragmentet.

DNA-sekvensanalyse viste, af de korrekte A- og B-kæde-se-20 kvenser var bevaret i henholdsvis pIAl og pIBl.

5. Udtrvkning

Stammerne, som indeholder insulingenerne korrekt knyttet til 25 β-galactosidase, producerer begge store mængder af et protein af samme størrelse som β-galactosidase. Tilnærmelsesvis 20# af det totale cellulære protein var denne β-galactosi-dase-insulin A- eller B- kæde-hybrid. Hybridproteinerne er uopløselige og fandtes i den første lavhastighedspille, hvor 30 de udgør omkring 50# af proteinet.

For at spore udtrykkeisen af insulin-A- og -B-kæder anvendtes en radioimmunprøvning (RIA) baseret på rekonstitutionen af fuldstændigt insulin i separate kæder. Insulin-rekonstitu-35 tions-proceduren beskrevet af Katsoyannis et al (1967) Bio chemistry 6, 2642 -2655, tilpasset et 27-mikroliters prøvningsvolumen, gav en meget velegnet prøvning. Let sporbar DK 173092 B1 44 insulinaktivitet opnås efter blanding og rekonstitutering af S-sulfonerede derivater af insulinkæderne. De separate S-sulfonerede kæder af insulin reagerer ikke væsentligt efter reduktion og oxidation, med det anvendte anti-insulin-anti-5 stof.

For at anvende rekonstitutionsprøvningen blev β-galactosi-dase-A- eller B-kæde-hybrid-proteinet delvis renset, spaltet med cyanbromid og omdannet til S-sulfonerede derivater.

10

Beviset for, at der er opnået udtrykkelse fra kemisk syntetiserede gener for humant insulin, kan sammenfattes som følger: a) radioimmunaktivitet er blevet sporet for begge kæder; b) DNA-sekvenserne opnået efter kloning og plasmidkonstruk-15 tion er blevet direkte verificeret at være korrekte som udformet; eftersom der opnås radioimmunaktivitet, må translationen være i fase; derfor dikterer den genetiske kode, at der er produceret peptider med sekvenserne i humant insulin; c) E.coli produkterne opfører sig efter cyanbromid-spalt-20 ning som insulinkæder i tre forskellige chromatografiske systemer, som adskiller efter forskellige principper (gelfiltrering, ionbytning og omvendt-fase-HPLC); d) den E.coli-producerede A-kæde er blevet renset i lille målestok ved HPLC og har den korrekte aminosyresammensætning.

Claims (12)

1. Rekombinant plasmid, til anvendelse i en fremgangsmåde til fremstilling af et pattedyrpolypeptid, hvilket plasmid er egnet til transformation af en bakteriel vært, hvilket plas- 5 mid omfatter et homologt regulon og heterologt DNA, hvor det heterologe DNA koder for et ønsket funktionelt pattedyrpolypeptid eller mellemprodukt, der ikke nedbrydes af endogene proteolytiske enzymer, har et startcodon foran og ét eller flere afslutnings- eller stopcodoner umiddelbart bagefter og 10 ikke foran og/eller bagefter har DNA, der koder for yderligere protein, og er anbragt i rigtig aflæsningsramme med det homologe regulon mellem regulonet og afslutnings-codonerne, hvorved det resulterende udtrykkelsesprodukt efter translation af transkriptionsproduktet af den heterologe DNA 15 i en egnet bakterie er det ønskede direkte udtrykte pattedyrpolypeptid i udvindelig form.

2. Rekombinant plasmid ifølge krav 1, hvori regulonet er i hovedsagen identisk med et regulon, som almindeligvis er til stede i bakterieværtens kromosomale DNA.

3. Rekombinant plasmid ifølge krav l eller 2, hvori den heterologe DNA omfatter cDNA.

4. Rekombinant plasmid ifølge krav l eller 2, hvori den heterologe DNA omfatter DNA afledt fra organisk syntese.

5. Rekombinant plasmid ifølge et hvilket som helst af de 25 forudgående krav, hvori plasmidet er et bakterielt plasmid.

6. Rekombinant plasmid ifølge ethvert af de forudgående krav, kendetegnet ved, at regulonet omfatter Echericia coli lac- eller Echericia coli tryptophan-promotor-operator-systemet.

7. Rekombinant plasmid ifølge ethvert af de forudgående krav, hvori den heterologe DNA koder for et funktionelt pattedyr- DK 173092 B1 46 polypeptid som sådant, og der umiddelbart foran den heterologe DNA, som koder for pattedyrpolypeptidet, er en trans-lationsstartcodon.

8. Rekombinant plasmid ifølge ethvert af kravene 1-6, hvori 5 pattedyrpolypeptidet er et pattedyrhormon eller et mellemprodukt for dette.

9. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant plasmid ifølge ethvert af de forudgående krav, hvorved en længde af dobbeltstrenget DNA, som omfatter et intakt replicon og i 10 rækkefølge (a) et regulon til styring af transskription og translation i en bakteriel vært og (b) et restriktionsendo-nuclease-genkendelsessted, behandles med en egnet restrik-tionsendonuclease til dannelse af et DNA-fragment, som omfatter repliconet og regulonet, og der dertil i rigtig af-15 læsningsramme med regulonet ligeres heterolog DNA, som koder for et funktionelt pattedyrpolypeptid eller mellemprodukt for dette, der ikke nedbrydes af endogene proteolytiske enzymer, har en startcodon foran og en eller flere afslutnings- eller stopcodoner umiddelbart bagefter og ikke foran og/eller 20 bagefter har DNA, er koder for yderligere protein, og har en terminal nucleotidgruppering, der er ligerbar til det nævnte DNA-fragment, til dannelse af det rekombinante plasmid.

10. Bakterie, som er transformeret med et rekombinant plasmid ifølge ethvert af kravene 1-8.

11. Bakteriekultur, som omfatter transformerede bakterier ifølge krav 10.

12. Fremgangsmåde til bakteriel produktion af et funktionelt pattedyrpolypeptid eller mellemprodukt for dette, som omfatter dyrkning af en bakteriekultur ifølge krav 11 så der 30 frembringes udtrykkelse af polypeptidet eller mellemproduktet i udvindelig form, og udvinding af polypeptidet eller mellemproduktet .