NO783722L - Rekombinant-plasmid samt fremgangsmaate til dets fremstilling - Google Patents

Description

Genetisk informasjon er.innkodet på dobbeltrådet deokstyribonukleinsyre ("DNA" eller "gener") etter den rekke-.folge i hvilken den DNA-kodende tråden presenterer de karakteristiske basene i trådens repeterende nukleotidkomponenter. "Uttrykkingen" av den innformede informasjonen slik at det dannes polypeptider innbefatter en todelt prosess. Ifolge påbud fra visse kontrollområder ("reguloner") langs genet,

vil RNA-polymerase bevege seg langs den kodende tråden, slik at det dannes såkalt "budbringer-RNA" (ribonukleinsyre) i en prosess som vanligvis kalles "transkribsjon". Ved den etter-følgende "oversettelsestrinnet" vil cellens ribosomer sammen

med overforings-RNA omdanne nevnte mRNA-"budskap" til polypeptider. I den informasjon som mRNA transkriberer fra DNA inngår også signaler for start og avslutning av den robosomale oversettelsen, såvel som identitet og rekkefolge av aminosyrene som utgjor selve polypeptidet. Den DNA-kodende tråden består av lange sekvenser av nukleotidtripletter som kalles "kodpner" fordi de karakteristiske baser som finnes i nukleo-tidene i hver triplett eller kodon innkoder spesifikke deler av informasjonen. F.eks. vil 3 nukleotider avlest som ATG.

(adenin-tymin-guanin)•resultere i et mRNA-signal som.kan tol-kes som "start oversettelse", mens avslutnings'kodonene TAG, TAA og TGA blir tolket som "stopp oversettelse". Mellom start-og stoppkodonene ligger det såkalte strukturelle genet, hvis kodoner definerer den aminosyresekvens som blir oversatt til slutt. Denne definisjonen er den man kjenner fra den vel-kjente "genetiske koden", (se f.eks. J.D. Watsoh, Molecular Biology of the Gene W.A. Benjamin Inc., N.Y. 3. utgave 1976)

som beskriver kodonene for de forskjellige aminosyrene. Den genetiske koden er degenerert i den forstand at forskjellige kodoner kan gi den samme aminosyren, men presis idet at for hver aminosyre så er det én eller flere kodoner og ingen andre. Således vil f.eks. alle kodonene TTT, TTC, TTA og TTG når dé avleses som sådanne, innkode for serin og ingen annen aminosyre. Under transkribsjonen må det opprettholdes en passende avlesningsfase eller avlesningsramme. La oss f.eks. se hva som skjer når den transkriberende RNA-polymerasen avleser forskjellige baser ved begynnelsen av et kodon (understreket) i rekkefolgen ... GCTGGTTGTAAG ...:

Det polypeptid som til slutt vil bli fremstilt, vil være helt avhengig av romforholdet på den strukturelle gene med hensyn til regulonet.

En klarere forståelse av fremgangsmåten som Inngår

i den såkalte genetiske uttrykkingen vil lettere kunne frem-

gå når man har. definert visse komponenter i genene:

Operon -- Et gene som består av strukturelle gener for polypeptiduttrykk og har et kontrollområde ("regulon") som regulerer dette uttrykk.

Promotor'— Et gene i regulonet hvor RNA-polymerasen må binde seg for å få startet transkribsjonen.

Operator — Et gene til hvilket man kan binde et såkalt undertrykkende protein, slik at man hindrer RNA-polymerase å binde seg til en tilstotende promotor.

Induser — Et stoff som deaktiverer undertrykkende protein og frigjor operatoren og derved muliggjor at RNA-polymerase kan binde seg til promotor og fortsette transkrib-■ sjonen.

Katabolittaktivatorprotein (" CAP")- bindeposisjon --Et gen som binder syklisk adenosinmonofosfat ("c AMP") - formid-'lende CAP, som også vanligvis er nodvendig for å starte transkribsjonen. Den CAP-bindende posisjonen kan i visse tilfeller være unodvendig. Således vil f.eks. en promotormutasjon i laktoseoperonet i fagenA plac UV5 eliminere behovet for CAMP og CAP for uttrykking. J. Beckwith et al., J.- Mol. Biol 69, ISS-160 (1972).

Promotor- operatorsystem Slik det er definert .her så er dette et opererbart kontrollområde på en operon, med eller uten hensyn til hvorvidt det inngår i en CAP-bindende posisjon eller er istand til å kode inn et uttrykk for undertrykkende protein.

For å lette diskusjonen og beskrivelsen i det etterfølgende når det gjelden rekombinert DNA, så har man fdlgende definisjoner: Klonebærende element Ikke-rkromosomalt dobbelttrådet DNA som innbefatter, en intakt "replikon" slik at elementet blir repetert når det plaseres inne i en éncellet organisme ("mikrobe") ved en såkalt "transformasjons"-prosess. - En organisme som blir omformet på denne måten kalles ofte en "transformant".

Plasmid - I denne sammenheng .defineres dette som et klonende element som er avledet fra virus eller bakterie, og i det sistnevnte tilfelle betegnes det ofte som "bakterie-plasmider".

Komplementaritet -- En egenskap som tilveiebringes av basesekvenser i et enkelttrådet DNA som muliggjor dannel-sen av dobbelttrådet DNA gjennom hydrogenbinding mellom de komplementære baser på de respektive trådene. Adenin (A) er et komplement til tymin (T), mens.guanin (G) komplementerer cytosin (C).

Biokjemisk forskning i de senere år har fort til konstruksjon av såkalte "rekombinerte" klonende elementer hvor f.eks. plasmider kan fremstilles slik at de inneholder eksogent DNA. I visse.tilfeller kan rekombinanten innbefatte

."heterologt" DNA, dvs. DNA som utkoder polypeptider- som vanligvis ikke fremstilles av den organismen som er fblsom overr for transformasjon ved hjelp av såkalte rekombinerte elementer. Plasmidene er således spaltet slik at de gir linært DNA med såkalte sammenslutningsbare sluttposisjoner. Disse bindes til et eksogent gen med lignende sammensluttbare sluttposisjoner slik at man får en biologisk funksjonell forbindelse méd et intakt replikon med en foronsket fenotypisk egenskap. Den

rekombinerte forbindelsen innsettes så i. en mikroorganisme ved transformasjon og transformerte organismer blir deretter isolert og klonet med den hensikt at man oppnår, store populasjon-er som er istand til å uttrykke den nye genetiske informasjon. Fremgangsmåter og anordning for å danne rekombinerte klonede elementer og omdanne eller transformere organismer med slike elementer, er meget omtalt i litteraturen. Se f.eks. H. L. Heynecker et al, Nature 263, 748 - 752 (1956); Cohen et al,

.Proe. Nat. Acad., Sei. USA 69,* 2110 (1972); samme, 70, 1293

(1973); samme, 70, 3240 (1973); samme, 71, 1030 (1974); Morrow et al, Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 71, 1743 (1974); Novick, Bacteriological Rev., 33, 210 (1969)', Hershfield et al, Proe. Soc. Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. 71, 3455 (1974) og._ Jackon et al, ibid, 69, 2904 (1972). En generell diskusjon av emnet er skrevet av S. Cohen, Scientific American 233, 24

(1975). Ovennevnte publikasjoner inngår her som referanser.

Det er en rekke teknikker som er tilgjengelige for DNA-rekombinering hvor tilstøtende ender av separate DNA-fragmenter justeres på en eller annen måte for derved'å lette sammenbinding. Denne sammenbindingen refererer seg til dannel-sen av fosfodiesterbindinger mellom tilstøtende nukleotider, vanligvis ved hjelp av enzymet T4 DNA ligase. Således kan butte ender direkte sammenbindes. Alternativt kan fragmenter som inneholder komplementære enkelttråder som nær sine tilstotende ender sammenbindes ved hjelp av hydrogenbindinger som så vil plasere de respektive endene for etterfølgende sammenbinding. Slike enkelttråder som her betegnes som sammenbundne avslutningsposisjoner eller termini, kan dannes ved tilsetning av nukleotider til butte ender ved å bruke terminal transferase, i visse tilfeller kun ved å bryte ned en tråd med en butt ende med et enzym såsom A -eksonuklease. Den mest vanlige teknikken er å bruke såkalte begrensende endonukleaser som spalter fosfodiesterbindingene i og omkring en enestående sekvens av nukleotider, vanligvis av en lengde på fra 4-6 basepar. Mange begrensende endonukleaser pg deres gjenkjennende posisjoner er kjente, og mest vanlig er det å bruke såkalt Eco RI-endonuklease. Begrensende endonukleaser vil spalte dobbelttrådet DNA ved rotasjonsmessig symmetriske "palindromer" og vil således etterlate seg sammenbundne termini. Således kan et plasmid eller ét annet klonende element spaltes, hvorved man får termini som hver innbefatter halvparten av den gjenkjennende posisjonen for den begrensende endonukleasen. Et spaltet produkt av eksogent DNA oppnådd med den samme begrensende endonukleasen vil ha ender som ér komplementære til de man finner i plasmiden. Alternativt kan man tilveiebringe syntetisk DNA som innbefatter sammenbundne

termini som kan innsettes i det spaltede element. For å ned-sette sammenbinding av elementets sammenbundne termini for man får innsatt eksogent DNA, så kan nevnte termini nedbrytes med alklisk fosfatase, hvorved man får molekylær seleksjon for lukkinger som innbefatter' de eksogene fragmenter. Innbe-fatning av et fragment med passende orientering i forhold til de andre aspekter på elementet, kan bedres når fragmentet supplerer et klonende DNA som er bearbeidet av to forskjellige begrensende endonukleaser, og når det selv innbefatter termini som altså utgjor halvparten av de gjenkjennende posisjoner man hadde i de forskjellige endonukleaser.

Skjont det har vært utfort intensiv forskning i

de senere år med rekombinert DNA, så er det få resultater som umiddelbart har fort til praktiske fremgangsmåter. Dette har spesielt vist seg i forbindelse med en rekke forsok på å uttrykke polypeptider og lignende ved hjelp av koding ved såkalt "syntetisk DNA", enten man nå har konstruert nukleotid for nukleotid på vanlig måte eller oppnådd det ved såkalt revers transkribs jon fra isolert in RNA (komplementær eller "cDNA"). I foreliggende oppfinnelse er det beskrevet en fremgangsmåte som muliggjbr tilsynelatende for forste gang, at man kan få fremstilt et funksjonelt polypeptidprodukt fra et syntetisk gen, og en slik fremgangsmåte kan ha stor- anvendelse.

Det produkt man her refererer til er somatostatin (Guillemin U.S.P. 3-904.594), en hemmer for sekresjonen av veksthormon, såsom insulin og glukagon, og effektene av nevnte somatostatin tyder på at det kan brukes ved behandlingen av akromelagi, akutt pankreatitis og insulin-avhengig sukkersyke. Se R.

Guillemin et al, Annual Rev. Med 27, 379 (1976). Somatostatinmodellen viser klart at fremgangsmåten har vid anvendbarhet på en rekke forskjellige måter, noe som vil fremgå av de vedlagte tegninger og den etterfølgende detaljerte beskrivelse.

De vedlagte tegninger illustrerer et felt hvor foretrukne anvendelser av oppfinnelsen kan komme til uttrykk, f.eks. i uttrykking av hormonet somatostatin ved hjelp av omdannede bakterier som inneholder rekombinerte plasmider. Fig. 1. Skjematisk oppsetning av prosessen: genet for somatostatin fremstilt ved kjemisk DNA-syntese, fes-tes til E. coil [3-galaktosidasegenet på plasmiden pBR322. Etter transformering over i E. coli vil den.rekombinerte plasmiden styre syntesen av et forlbperprotein som spesielt kan spaltes in vitro ved metioninresidua ved hjelp av cyanogenbromid, hvorved man får et aktivt pattedyrpolypeptidhormon. A, T, C og G angir de karakteristiske baser (henholdsvis adenin, tymin, cytosin og guanin)'i deoksyribonukleotidene i den kodende tråden i somatostatingenet.. Fig.. 2. En skjematisk struktur av et syntetisk gen hvis kodende tråd (dvs. den "ovre" tråd) består av kodoner for aminosyresekvensen i somatostatin (gitt). Fig. 3. Skjematisk illustrasjon av en foretrukken fremgangsmåte for konstruksjon.av de nukleotidtrimerer som brukes under konstruksjonen av syntetiske gener. På fig. 3 har man brukt den vanlige fremgangsmåte for å illustrere nukleotider, dvs. 5' OH er til venstre, mens 3' OH er til hbyre, f.eks. Fig. 4.- Dette er et prosessdiagram for konstruksjonen av et rekombinert plasmid (f.eks. pSOMll-3) som er istand til å uttrykke et somatostatin ("SOM")-holdig protein, hvor man begynner med plasmidet pBR322. På fig. 4 er de omtrent-lige molekylvekter for hvert enkelt plasmid angitt i dalton ('d"). Ap og Tc henholdsvis betegner gener for ampicillin og tetracyklinresistens, mens Tc<s>betegner tetracyklinfblsom-het på grunn av at man har fjernet en del av genet Tcr. De. relative posisjoner for forskjellige spesifikke spaltnings-stillinger for begrensende endonuklease på plasmidene er angitt (f.eks. Eco RI, Barn I, etc). Fig. 5A og 5B. Her er nukleotidesekvensen for to Viktige deler av to plasmider angitt, såvel som retningen for transkribsjonen for det overforende RNA ("mRNA"), som alltid starter fra 5'-enden på den kodende tråden. Begrensende endonukleasesubstratposisjoner er også vist. Hver angitt sekvens inneholder både kontrollelementene for lak (laktose)-operonet, og kodonene for uttrykking av aminosyrese kvensen i somatostatin (kursiv). Aminosyresekvensnummerne for (3-galaktosidase ("P-gal") er angitt i parenteser. Fig. 6- 8. Som mer detaljert beskrevet i den eksperimentelle diskusjonen, så angir disse figurer resultatene fra sammenlignende radioimmun-prbveeksperimenter som viser somatostatinaktiviteten på produktet fremstilt ved hjelp av de rekombinerte plasmider. Fig. 9. Skjematisk struktur på syntetiske gener hvis kodende tråder består av kodoner for aminosyresekvenser for A- og B-trådene i menneskeinsulin. Fig. 10. Prosessdiagram for konstruksjonen av et rekombinert plasmid som er istand til å uttrykke B-kjeden i menneskeinsulin.

Detaljert beskrivelse

1. Fremstilling av gener som koder for heterologt polypeptid

DNA-koding for ethvert polypeptid med kjent aminosyresekvens kan fremstilles ved at man velger kodonet ifblge den genetiske koden. For å lette rensingen, så kan f.eks. oligodeoksyribonukleotidfragmenter, på f.eks. fra 11 - 16 nukleotider, fremstilles separat og så settes sammen i den forbnskede sekvens. Man fremstiller således en fbrste og en annen serie av oligodeoksyribonukleotidfragmenter av hensikts-messig stbrrelse. Den fbrste serien som når den er satt sam men i passende sekvens, vil gi en DNA-kodende tråd for poly-peptiduttrykking (se f.eks. fig. 2, fragmentene A, B, C og D). Den andre serien vil på lignende måte når den er satt sammen

på en passende måte, gi en tråd som er komplementær til den kodende tråden (f. eks. fig. 2, fragmentene E, F, G og H).-Fragmentene for de respektive trådene bor fortrinnsvis over-lappe hverandre slik at deres komplementaritet fremmer en selvsammensetning'via hydrogenbindinger på de sammenbindende avslutningsposisjoner på fragmentblokkene. Etter sammensetningen kan det konstruerte genet avsluttes på vanlig kjent måte.

Degenerasjonen av den genetiske koden gir relativt stor frihet med hensyn til valg av kodoner for enhver gitt aminosyresekvens. For det foreliggende formål.imidlertid, var det tre betraktninger som ble lagt til grunn ved valg av kodon. For det forste ble kodoner og fragmenter valgt og satt sammen på en slik måte at man unngikk for stor komplementaritet på fragmentene, unntatt for fragmenter som stotte inntil hverandre i det ferdige gen. For det. andre unngikk man sekvenser som var rike på AT-basepar (f.eks. fem eller mer), spesielt når man hadde en sekvens som var rik på GC-basepar, noe som ble gjort for å unngå en for tidlig avslutning av transkribsjonen. For det tredje velger man en storre mengde kodoner av den type som er foretrukket ved uttrykkingen av mikrobielle genomer (se f.eks. ¥.-Fiers et al, Nature 260, 500 (1976)). For det foreliggende formål har man definert det folgende som- kodoner "foretrukket for uttrykkingen av mikrobielle genomer":

I forbindelse med somatostatin er det mest foretrukne aminosyre (kodon)-forholdet i det strukturelle gen folgende:. gly (GGT), cys (TGT), lys (AAG), trp (TGG), ala (GCT, GCG), asn (AAT, AAC), phe (TTC, TTT), thr (ACT, ACG) og ser (TCC,

TCG) .

Når det strukturelle genet for et forbnsket polypeptid skal innsettes i et klonende element for uttrykking som sådan, så vil genet folge etter et "start"-kodon (f.eks. ATG) og umiddelbart fblges av én eller flere avslutnings-eller stopp-kodoner (se fig. 2). Som nevnt nedenfor imidlertid, så kan aminosyresekvensen for et spesielt polypeptid uttrykkes med ytterligere protein som går foran og/eller folger etter. Hvis bruken av polypeptidet krever en avspalt-ning av det ytterligere protein, så kan passende spaltnings-posisjoner kodes inn for den posisjon hvor hovedpolypeptidet . og det ytterligere protein henger sammen. Som vist på fig. 1 som et eksempel, er det uttrykte produkt der et forlbperp.ro-tein som inneholder både somatostatin og stbrstedelen av |3-galaktosideasepolypeptidet. Her er ATG ikke nbdvendig for innkoding for derved å få en start på oversettelsen, ettersom den ribosomale konstruksjonen på det tilstbtende p-gal-aktosideaseproteinet gjor at det leses direkte over i somatostatingenet. En inkorporering av ATG-signalet vil imidier- tid kode for fremstilling av metionin, en aminosyre som spesielt spaltes lett av cyanogenbromid, hvorved man får en lett fremgangsmåte for å omdanne forlbperproteinet til det for-ønskede polypeptid.

Fig. 2 viser også et eksempel på et trekk som er foretrukket i heterologt DNA som siden skal brukes for rekombinering, dvs. åt man tilveiebringer sammenbindende avslutningsposisjoner eller termini, fortrinnsvis slik at disse inngår en begrensende endonuklease-gjenkjennelsesposisjon på én av de to trådene. Som nevnt ovenfor bor nevnte termini

eller awslutningsposisjoner fortrinnsvis utformes slik at de skaper henholdsvis forskjellige gjenkjennelsesposisjoner ved rekombinéring.

Skjbnt det som er angitt ovenfor har vist seg å gi fint resultat med somatostatinmodellen, så er det underfor-stått at heterolog DNA-koding kan brukes også for nesten enhver kjent aminosyresekvens, mutatis mutandis. Således er den teknikk som er beskrevet ovenfor og som vil bli mer detaljert beskrevet i det etterfølgende, også anvendbar mutatis mutandis, for fremstillingen av poly(amino)syrer, såsom poly-leucin og polyalanin, enzymer, serumproteiner, smertestillen-de polypeptider såsom 6-endorfiner, som modulerer smérte-terskeler etc. Det er mest foretrukket at man fremstiller polypeptider som vil være pattedyrhormoner eller mellomprodukter for slike. Blant slike .hormoner kan f.eks. ■ nevnes somatostatin, menneskeinsulin, veksthormoner for mennesker og kveg, leutiniserende'hormon, ACTH, pankreaspolypeptid etc. Mellomprodukter innbefatter f.eks. preproinsulin for mennesker, proinsulin for mennesker, A- og B-kjedene- for menneskeinsulin osv. I tillegg til DNA fremstilt in vitro, så kan det heterologe DNA også innbefatte cDNA som er et resultat av-en revers transkribsjon fra mRNA. Se f.eks. Ullrich et al, Science 196, 1313 (1977).

2. Rekombinert koding for uttrykking av forlbperprotein

I den fremgangsmåte som skjematisk er vist på fig. 1, vil uttrykkingen gi et forlbperprotein som inneholder både et polypeptid utkodet ved hjelp av et spesifikt heterologt struk-turelt gen (somatostatin) og ytterligere protein (bestående av en del av (3-galaktosidaseenzymet). En selektiv spaltingsposi-sjon nær somatostatinaminosyresekvensen muliggjbr en etter-følgende separasjon av det forbnskede polypeptid fra det over-flødige protein. Det tilfelle som er vist er representativt for en rekke fremgangsmåter som er muliggjort ved den teknikk som her er beskrevet.

Mest vanlig vil spaltingen utfores utenfor det re-pliserende miljb for plasmiden eller for et annet element, f.eks. etter at'man har hostet den mikrobielle kulturen. På denne måten så vil en temporær konjugering av små polypeptider med overflbdig protein bevare det fbrstnevnte mot f.eks. en in vivo-nedbrytning med .endogene enzymer. Samtidig vil det overflbdige protein vanligvis ta noe av bioaktiviteten fra det forbnskede polypeptid mens man venter på den ekstra-cellulære spaltingen, med den effekt at man oker' biosikkerheten

på fremgangsmåten. I visse tilfeller kan det selvsagt være bnskelig å utfore spaltingen inne i cellen. Således kan man tilveiebringe klonende elementer med DNA-koding for enzymer som danner insulinforlbperne til den aktive form og som oper-erer samtidig med annet DNA kodet for uttrykking av forlbper-formen.

I foretrukne tilfeller vil det spesielle forbnskede polypeptid mangle interne spaltingsposisjoner som tilsvarer de man anvender for å kvitte seg med overflbdig protein, og i de tilfeller hvor denne betingelse ikke er oppfylt, så vil man altså få konkurrerende reaksjoner som dog vil gi det forbnskede produkt, dog i mindre utbytte. I de tilfeller hvor det forbnskede produkt er metionin-fritt, så har det vist seg å være meget effektivt å utfore spaltingen ved hjelp av cyanogenbromidspalting ved metionin som stbter inntil den forbnskede sekvens. På lignende måte kan arginin- og lysin-frié produkter enzymatisk spaltes med f.eks. trypsin eller chymotryptin ved arg-arg, lys-lys eller lignende spaltingsposisjoner inntil den forbnskede sekvens. I de- tilfeller hvor spaltingen etter-later seg f.eks. ubnsket arginin festet til det forbnskede produkt, så kan dette fjernes ved karboksypeptidase-nedbrytning. Når man bruker,trypsin for å spalte ved arg-arg, så kan lysin-posisjoner inne i det forbnskede polypeptid forst beskyttes, f.eks. ved maleinsyre eller citrakoninsyreanhydrider. De spaltingsteknikker som her er beskrevet er kun angitt som eksempler.

Spaltbart protein kan uttrykkes inntil enten Celler N-terminalene på et spesifikt polypeptid, eller endog inne i polypeptidet selv, noe som er tilfelle i den sekvens som skiller proinsulin og insulin. Det element som brukes for kodingen kan igjen uttrykke et protein som. består av gjen-tatte sekvenser av det forønskede polypeptid, som så hver kan skilles ved selektive spaltingsposisjoner. Det er imidlertid mest foretrukket at kodoner for overflodig.protein vil være

oversatt på forhånd i det strukturelle genet for det forønsk-ede produkt, noe som er vist på figurene. I ethvert tilfelle må man være forsiktig slik at man opprettholder en passende avlesningsramme i forhold til regulonét.

2. Uttrykking av immunogener

Evnen til å uttrykke både et spesifikt polypeptid og overflodig protein gjor det mulig å fremstille immunogen-iske stoffer. Polypeptid-"haptene" (dvs. stoffer som inneholder determinanter som er spesielt bundet ved hjelp av antistoffer o.l., men vanligvis for små til å utløse- en immunolo-gisk reaksjon) kan uttrykkes som konjugater med ytterligere protein i tilstrekkelig størrelse til at man får immunogenitet. Det- p-gal-somatostatin-konjugat som her er fremstilt som et eksempel, er i virkeligheten av immunogenisk storrelse og kan forventes å frembringe antistoffer som vil binde soma-tostatinhaptenet. Proteiner som inneholder over 100 aminosyrer, vanligvis over 200 slike, vil ha immunogenisk karakter.

Konjugater fremstilt på den forannevnte.måte kan brukes for å utlose antistoffer som kan brukes under radio-immunologiske prover eller andre prover for haptenet; og alternativt ved fremstillingen av vaksiner. Man vil i det etter-følgende beskrive et eksempel på sistnevnte anvendelse. Cyanogenbromid - eller andre spaltingsprodukter av viralt beleggende protein vil gi oligopeptider som vil binde antistoff ut-løst av proteinet selv.. Hvis man derfor har gitt aminosyresekvensen for et, slikt oligopeptidhapten, kan man følgelig uttrykke heterologt DNA som et konjugat med ytterligere protein som gir immunogenitet. Bruken av slike konjugater som vaksiner skulle forventes å gi mindre sidereaksjoner som vanligvis folger bruken av selve det beleggende protein for å

få immunitet.

4. Kontrollelementene

Fig. 1 viser en fremgangsmåte hvor en transformer-ende organisme uttrykker polypeptidprodukt fra heterologt DNA som er bragt under kontroll av et regulon "homologt" til organismen i dens uomdannede -tilstand. Således vil laktose-avhengig E. coli-kromosomalt DNA bestå av et laktose eller "lak" operon som styrer laktosenedbrytning, f.eks. ved å utlose enzymet (3-galaktosidease. I det spesielle tilfellet som er vist vil lak-kontrollelementene være oppnådd fra en bakterofag plak 5, som _er ineffektiv overfor E. coli. Fagens lak-operon er på sin side avledet ved 1 transduksjon fra den samme bakteriearten, følgelig "homogoliteten". Homologe reguloner som egner seg for bruk i den beskrevne fremgangsmåte kan alternativt avledes fra plasmidisk DNA som er opp-rinnelig i organismen.

Enkelheten og effektiviteten for det angitte lak-fremmer-operatorsystem gjor det enkelt å bruke i det system som er beskrevet ovenfor, noe som også er tilbelle med dets evne til å bli indusert av IPTG (i.sopropyltio-|3-D-galaktosid). Selvsagt kan man også bruke andredperoner eller deler av disse, f.eks. lamda-fremmer-operator, arabinose-operon (fi 80 dara), eller colicin El, galaktose, alkalisk fosfatase eller tryptofan-operoner. Fremmer-operatorer avledet fra sistnevnte (dvs. "tryp-operon") kan forventes å gi 100% undertrykking mens man avventer induksjon (med indolakrylsyre) og etterfølgende innhdstning.

5. Generell plasmidkonstruksjon

Detaljene i den fremgangsmåte som skjematisk er.

vist på fig. 4 vil fremgå av den etterfølgende eksperimentelle del. Det kan imidlertid på dette punkt være nyttig kort å diskutere de forskjellige teknikker som brukes under konstruksjon av rekombinert plasmid i den foretrukne utførelse.

Kloningen og uttrykkingen av det syntetiske somatostatingenet bruker to plasmider. Hvert plasmid har en EcoRI- substratposisjon i et forskjellig område på B-galaktosidase- ■ strukturgenet (se fig. 4 og 5). Innsettingen av det syntetiske somatostation-DNA-fragment i EcoRI-posisjonen i disse plasmider vil folgelig bringe uttrykkingen av den genetiske informasjonen man har i dette fragment, under kontroll av de lak-operon-kontrollerende elementer. Etter at man har innsatt somatostatinfragmentet i disse plasmider, så skulle en oversettelse resultere i et somatostatinpolypeptid som foran seg enten har 10 aminosyrer (jpSOMl) eller i virkeligheten

hele (3-galaktosidase-underenhetstrukturen (pS0Mll-3).

Selve plasmidkonstruksjonen starter med plasmid pBR322, et velkarakterisert klonende element. En introduk-sjon av lak-elementer i dette plasmid ble utfort ved å inn-sette et Haelll-begrensende endonukleasefragment (203 : nukleotider) som bar med seg lak-fremmeren,,CAP-bindeposisjonen, operatoren, ribosombindeposisjonen og de fbrste 7 aminosyre-kodonene i det B-galaktosidase-strukturelle gen. Nevnte Haelll-fragment ble avledet fra A plak 5 DNA. Det EcoRI-spaltede PBR322-plasmid som hadde sine termini reparert med T4 DNA-polymerase og -deoksyribonukleotid-trifosfater, ble ende mot ende bundet til HaelII-fragmentet slik at man skapte EcoRI-termini ved innsetningspunktene. En sammenfbyning av disse Haelll'og reparerte EcoRI-termini gir EcoRi-begrensende posisjoner (se fig. 4 og 5) -ved hver enkelt terminus. Transformanter av E. coli RR1 med denné DNA ble så valgt for re-sistens mot tetracycline (Tc) og ampicillin (Ap) på et medium av 5-brom-4-klor-incolylgalaktosid (X-gal). På dette indika-tormedium kunne man identifisere kolonier som var istand til å syntetisere B-galaktosidase på grunn av et bkende antall titrerende repressorer for lak-operatorer, på grunn av kolo-nienes blå farge. Det er to mulige orienteringer på.Haelll-fragmentet, men disse kan skilles ved en asymmetrisk plaser-ing av en Hha-begrensende posisjon på fragmentet. Plasmid pBHIO ble ytterligere modifisert slik at man eliminerte en EcoRI-endonukleaseposisjon distalt i forhold til lak-operatoren (pBH20).

De åtte kjemisk syntetiserte oligodeoksyribonukleotidene (fig. 2) ble merket y.ed nevnte 5'-termini med ( p)-ct-ATP ved polynukleotid-kinase og ble bundet sammen med T4 DNA- ligase. Gjennom hydrogenbinding mellom de overlappende fragmenter vil somatostatingenet sette seg sammen selv og even-tuelt polymerisere seg til storre molekyler på grunn av de kohesive restriksjonsposisjonstermini. De sammenbundne produkter ble behandlet med EcoRI-og BamHI-begrensende endonukleaser for å utvikle det somatostatingen som er angitt på fig. 2.

Det syntetiske somatostatingenefragment med EcoRI-og Baml-termini ble bundet tri pBH20-plasmiden på forhånd behandlet med EcoRI- og BamHI-begrensende endonukleaser og alkalisk fosfatase. Behandlingen med alkalisk fosfatase gir molekylær seleksjon for plasmider som bærer det innsatte fragment. Ampicillin-resistente transformanter oppnådd med

■ dette sammenbundne DNA ble undersokt for tetracyclihfolsom-het og flere ble undersokt med hensyn til innsettelsen av et EcoRi- BamHI-fragment av passende storrelse.

Begge tråder av EcoRI- BamHI-fragmentene av plasmider fra to kloner ble analysert med hensyn til nukleotidsekvens-analyse idet man startet ut fra BamHI- og EcoRI-posisjonene. Sekvensanalysen ble forlenget over de lak-kontrollerende elementer, og lak-fragmentsekvensen var intakt, og i ett tilfelle, pSOMl, så ble nukleotidsekvensen i begge tråder undersokt uavhengig av hverandre og hver ga den sekvens som er angitt på fig. 5A.

EcoRI-Pst-fragmentet i pSOMl-plasmiden med det lak-regulerende eller -kontrollerende element, ble fjernet og erstattet med EcoRI- Pst-fragment av pBR322 slik at man fikk plasmiden pSOMll. EcoRI-fragmentet fraAplak 5, som bar det lak-operon-kontrollerende området og mesteparten av det nevnte B-galaktosidase-strukturelle gen, ble innsatt i EcoRI-posisjonen i plasmiden pSOMll. Man forventet to orienteringer av Eco RI-lak-fragmentet i }\ plak 5. En av disse orienteringer ville gi passende avlesningsramme over i somatostatingenet, den andre ikke. Analyser av uavhengig isolerte kloner for somatostatin-aktivitet kunne så identifisere de kloner som inneholdt det passende orienterte gen, og av disse så fant man klonen som hadde betegnelsen pSOMll-3.

6. Mikroorganisme.

Forskjellige encellede mikroorganismer har vært fore- slått som kandidater for transformasjon, såsom bakterier, sopp

■og alger. Dvs. de encellede organismer som kan dyrkes i kultur eller under fermenteringsbetingelser. Bakterier er i de fleste- tilfeller den mest hensiktsmessige organisme å arbeide med. Bakterier som lar seg transformere innbefatter arter i familien Enterobacteriaceae, såsom forskjellige raser av Escherichia coli og Salmonella, familien Bacillaceae, såsom Bacillus subtil!s, Pneumocoecus, Streptococcus og Haemophilus influenzae.

Den spesielle organisme som ble valgt for somato-'statin-undersokelsen som er mer detaljert beskrevet i det etter-følgende, var E. coli, rase .RR1, genotype: Pro-Leu~Thi~Rg_Mg rec A<+>Str<r>Lac y". E. coliRRI er"avlédet av. E..' coli HB101 '(H.W.-Boyer et al, J. Mol. Biol. (1969) 41, 459 - 472) ved å krysse den med E. coli K12 rase KL16 som Hfr-donoren. Se J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New York, 1972). Kulturer av både E. coli.RRl og

E. coli RR1 (pBR322) er blitt levert den amerikanske type kultur kolleksjon uten begrensninger med hensyn til anvendelse, og.har henholdsvis fått ATCC nr. 31-543 og 31.344.

Den somatostin-produserende organisme er på lignende måte levert under ATCC rir. 31.447.

I forbindelse med menneskeinsulin, ble A- og B-kjede-gener klonet i .E. coli K-12 rase 294 (ende A, thi<->,- hsr", hsm^+), ATCC nr. 31.446, og den organisme som ble brukt under uttrykkelse av A-kjeden er E. coli K-12 rase 294 (pIAl), ATCC nr. 31.448. B-kjeden i menneskeinsulin ble forst ut-trykt som et derivat av HB101, dvs. E. coli K-12 rase D1210

en lak<+>(i^o<+>z^y<+>), og den B-geneholdige organismen er på lignende måte levert under nr. ATCC 31.449. Alternativt kan B-genet innsettes i og uttrykkes fra den organismen- som ble nevnt forst, dvs. rase 294. " '. Eksperimentell del

I. Somatostatin

1. Konstruksjon av somatostatingenefragmenter

Åtte oligodeoksyribonukleotider henholdsvis merket

A til og med H på fig. 2 ble forst konstruert, prinsipielt ved den modifiserte triestermetode som er beskrevet av K. Ita-

kura et al, J. Am. Chem. Soc. 97, 7327 (1975). I forbindelse med fragmentene C, E og H brukte man imidlertid en forbedret teknikk hvor fullt beskyttede trimerer forst fremstilles som basisenhéter for oppbygning til lengre oligodeoksyribonukleotider. Den bedrede teknikk er skjematisk angitt på fig. 3, hvor B er tymin, N-benzoylert adenin, N-benzoylert cytosin eller N-isobutyrulert guanin. Som angitt påfig. 3 ble. et overskudd av I (2 mmol) koblet med forbindelsen II (1 mmol)

i lopet av 60 minutter ved hjelp av et sterkt koplingsmiddel, nemlig .2,4,6-triisopropylbenzensulfonyltetrazolid (TPSTe, 4 mmol, 2). Etter fjerning av den 5'-beskyttende gruppe med

2% benzensulfonsyreopplbsnihg, så kunne 5<1->hydroksyldimeren V utski3.es fra et overskudd av 3'-fosfodiestermonomeren IV ved enkel opplbsningsmiddelekstraksjon med vandig NaHCO-^-opplos-ning i CHCl^. Den fullt beskyttede trimerblokken ble fremstilt suksessivt fra 5'-hydroksyldimer V, I (2 mmol) og TPSTe (4 mmol) og isolert ved hjelp av kromatografi på silisiumdioksydgel slik det er beskrevet av B. T. Hunt et al, Chem.. and Ind.', 19<6>?, 1868 (1967). Utbyttene av trimerer fremstilt ved hjelp av denne forbedrede teknikk, er angitt i tabell II.

De åtte oligodeoksyribonukleotidene etter fjerning av alle beskyttende grupper, ble renset ved hoytrykks væskekromatografi på "Permaphase AAX" (R.A. Henry et al, J. Chrom. Sei. II, 358 (1973)). Renheten av hver oligomer ble undersokt ved homokromatografi på tynnsjikt DEAE-cellulose og dessuten ved gelelektroforese i 20% akrylamidstykker.etter merking av oligomerene med ( X- P)-ATP i nærvær av polynukleotidkinase. Man fikk bare ett merket produkt fra hvert DNA-fragment. 2. Sammenbinding og akrylamidgelanalyse av somatostatin DNA , 5'-OH-termini på de kjemiske syntetiserte fragment-~ er A til og med H ble separat fosforylert med T4-polynukleotidkinase. ( J P)-^-ATP ble brukt under fosforyleringen slik at reaksjonsproduktene kunne undersokes autoradiografisk, skjont det er forstått at man også kan bruke umerket ATP.. Like for kinasereaksjonen ble 25 uCi av (/-^2P)ATP (ca. 1500 Ci/mmol) (Maxam and Gilbert, Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A.-74, 1507 (1977)) fordampet til torrhet i 0,5 ml Eppendorfrbr. 5 mikrogram av fragmentet ble inkubert med 2 enheter T4-DNÅ-kinase (hydroksylapatittfraksjon, 2500 enheter/ml, 27), i

70 mmol tris-HCl pH 7,6, 10 mmol MgCl^, 5 mmol ditiotreitol

i et totalt volum på 150^ul i 20 minutter ved 37°C. For å sikre maksimal fosforylisering av fragmentene for den senere ' sammenbindende reaksjonen, ble 10^ul av en. blanding bestående av 70 mmol tris-HCl pH 7,6, 10 mmol MgCl2, 5 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP og to enheter DNA-kinase tilsatt og inkuberingen fortsatt i ytterligere 20 minutter ved 7°C. Fragmentene (250 nanog/^ul) ble lagret ved -20°C uten ytterligere behandling. • Kinaserte fragmenter A, B, E og F (1,25/Ug hver) ble bundet sammen i et totalt volum på 50^ul i 20 mmol tris-HCl pH 7,6,, 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP og 2 enheter T4-DNA-ligase (hydroksylapatittfraksjon, 400 enheter/ml, 27) i 16 timer ved 4°C. Fragmentene C, D, G og H ble bundet

sammen under lignende betingelser. Prover på 2<y>ul ble fjernet for analyse ved elektroforese på 10% polyakrylamidgel fulgt av autoradiografi (H.L. Heyneker et al, Nature 263, 748

(1976)) hvor de uomsatte DNA-fragmenter er representert ved raskt vandrende materiale og hvor den monomeriske formen av de sammenbundne fragmenter vandrer sammen med bromfenolblått (BPB). Det skjer også en viss dimerisering på. grunn av de kohesive ender på de sammenbunde fragmenter A, B, E og F, og på de sammenbundne fragmenter C, D, G og H. Disse dimerer er det som vandrer langsomst, og kan.spaltes ved begrensende endonuklease EcoRI og BamHI, henholdsvis.

De to halve molekylene (sammenbundet A + B + E + F og sammenbundet C + D + G + H) ble forenet ved et ytterligere sammenbindingstrinn utfort i et sluttvolum på 150^ul ved 4°C i 16 timer. 1 mikroliter ble fjernet for analyse. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet i 15 minutter ved 65°C for å inak-tivere nevnte T4-DNA-ligase. Varmebehandlingen påvirker ikke, vandringsmdnsteret på DNA-blandingen. Tilstrekkelig begrensende endonuklease BamHI ble tilsatt reaksjonsblandingen for å spalte multimeriske former vav nevnte somatostatin DNA i ldpet av 30 minutter ved 37°C. Etter tilsetningen av NaCl til 100 mmol, ble DNA reagert med EcoRI-endonuklease. Den begrensende endonukleasereaksjonen ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon av DNA. Somatostatin-DNA-fragmentet ' ble renset fra uomsatt og delvis sammenbundne DNA-fragmenter ved preparativ elektroforese på en 10% polyakrylamidgel.

Det båndet som inneholdt somatostatin DNA-fragmentet. ble skåret ut av gelen og DNA ble eluert ved å kutte gelen opp i små stykker og ekstrahere DNA'med en elueringsbuffer (0,5 mol ammoniumacetat, 10 mmol.MgCl2, 0,1 mmol EDTA*, 0,1% SDS) over natten ved 65°C. DNA ble.så utfelt med 2 volumer etanol, sentrifugert og gjenoppldst i 200<y>ul 10 mmol tris-HCl, pH 7,6, og dialysert mot den samme buffer hvorved man fikk en somatostatin DNA-konsentrasjon på 4^ug/ml.

3. Konstruksjon av rekombinerte plasmider

Fig. 4 viser skjematisk hvordan man konstruerer rekombinerte plasmider som innbefatter somatostatingenet,

og det vil i den etterfølgende beskrivelsen bli henvist til denne tegningen.

A. Parenteralt plasmid pBR522

Det plasmid som ble valgt for den eksperimentelle somatostatin-kloningen var pBR322, et lite (molekylvekt ca. 2,6 megadalton) plasmid som hadde resistensgener mot anti-biotika ampicillin (Ap) og tetracycline (Tc. Som vist på

fig. 4 innbefatter ampicillinresistensgenet en spaltnings-posisjon for den begrensende endonukleasen Pstl, og tetra-cyclineresistensgenet innbefatter en lignende posisjon for begrensende endonuklease BamHI, og en EcoRI-posisjon er plasert mellom Ap<r->og TC<r->genene. Plasmidet pBR322 er avledet fra pBR313, et 5,8 megadalton Ap<r>Tc<r>Col<imm->plasmid (R.L. Rodriquez et al, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Bio-

logy 5, 471 - 77 (1976), R.L.. Rodriquez et-al, Construction and Characterization of Cloning Vehicles, i Molecular Mecha-nisms in the Control of Gene Expr.es si on, side 471 - 77, Academic Press, Inc. (1976)). Plasmid pBR322 er beskrevet: ■ mer detaljert i F. Bolivar et al, "Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II.A Multipurpose Cloning System", Gene (november 1977).

B. Konstruksjon av plasmid pBHIO

5 mikrogram av plasmid pBR322 DNA ble reagert med 10 enheter av den begrensende endomikleasen EcoRI i 100 mmol tris-HCl, pH 7,6, .100 mmol NaCl, 6 mmol MgCl2, ved 37°C i 30 minutter. Reaksjonen.ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon; DNA^en ble så utfelt med 2,5 volumer etanol og resuspendert i 50 ^ul T4-DNA-polymerasebuffer (67 mmol-tris-HCl,. pH 8,8, 6,7 mmol MgCl2, 16,6 mmol (NH^SO^, 167 /Ug/ml storfeserumalbumin, 50 ^um hver av de angitte dNTP,(A. Panet et al,'Biochem. 12, 5045 (1973)). Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 2 enheter T4-DNA-polymerase. ' Etter inkubering i 30 minutter ved 37°C ble reaksjonen avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon av DNA fulgt av utfelling med etanol. 3 mikrogram 7\plak<5->DNA (Shapiro et al Nature 224, 768 (1969))

ble.brutt ned i 1 time ved 37 C med,det begrensende enzym Haelll (3 enheter) i 6 mmol tris-HCl, pH 7,6, 6 mmol MgCl2,

6 mmol 8-merkaptoetanol i et sluttvolum på 20/ul.. Reaksjonen ble stoppet ved oppvarming i 10 minutter ved 65 oC. pBR322-behandlet DNA ble blandet medden Haelll-reagerte Aplak 5-DNA og ende mot ende bundet sammen i et sluttvolum på 30 y-ul med

1,2 enheter T4-DNA-ligase (hydroksylapatittfraksjon, A. Panet et al, supra) i 20 mmol tris-HCl, pH 7,6, 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP i 12 timer ved 12°C. Den reagerte DNA-blanding ble dialysert mot 10 mmol tris-HCl,

pH 7,6, og brukt for omdannelse eller transformering av E. coli-rase RR1.- Transformanter ble.valgt for tetracycline- og ampi-cillinresistens på minimumsmediumplater'inneholdende 40^ug/ml 5-brom-4-klor-indolylgalaktosid.(X-gal)-medium (J.H. Miller,

Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor,- New York, 1972)). Kolonier som kunne brukes for syntesen av B-galaktosidase ble identifisert ved sin blå farge. Etter undersøkelse av 45 uavhengig isolerte blå kolonier ble 3 av dem funnet å inneholde plasmid DNA som hadde to EcoRI-posisjoner atskilt med ca. 200 basepar. Posisjonen på et asymmetrisk plasert Hhal-fragment i det 203 b.p. Haell-lak-kontrol-lerrende fragment (¥. Gilbert et al i Protein-Ligand Inter-actions, H. Sand and G. Blauer, Eds. (De Gruyter, Berlin

(1975) side 193 - 210) muliggjor en bestemmelse av orienteringen på HaeIII-fragmentet, nå•et EcoRI-fragment i disse plasmider. Man kunne påvise at plasmid pBHIO hadde dette fragment i den foronskede orientering, dvs. at lak-transkribsjonen går over i Tc -genet i plasmiden.

C. Konstruksjon av plasmid pBH20

Plasmid pBHIO ble deretter modifisert for å eliminere EcoRI-posisjonen distalt i forhold til lak-operatoren. Dette ble utfort ved selektiv EcoRI-endonuklease-spalting

ved den distale posisjon, noe som innbefatter delvis beskyt-telse ved hjelp av RNA-polymerase av den andre EcoRI-posisjonen, som er lokalisert mellom nevnte Tc - og lak-promotorene, som bare ligger ca. 40 basepar fra hverandre. Etter binding med RNA-polymerase ble DNA (5- /Ug) reagert med EcoRI (1 enhet)

i et sluttvolum på 10/ul i 10 minutter ved 37°C. Reaksjon-

eri ble stoppet ved oppvarming til 65 oC i 10 minutter. De EcoRI-kohesive termini ble reagert med Sl-nuklease i 25 mmol Na-acetat, pH 4,5, 300 mmol NaCl, 1 mmol ZnCl2ved 25°C i

5 minutter. Reaksjonsblandingen ble stoppet ved tilsetning av EDTA (10 mmol til slutt) og tris-HCl, pH 8, (50 mmol til slutt).. DNA-en ble fenol-kloroform-ekstrahert, etanol-utfelt og resuspendert i 100^ul T4-DNA-sammenbindingsbuffer. T4-DNA-ligase (1/.ul) ble tilsatt, og blandingen inkubert ved 12°C

i 12 timer. Det sammenbundne DNA ble transformert i E. coli-rase RRI og Ap<r>Tc<r->transformantene ble utvalgt på et X-gal-anti-biotikamedium. Begrensende enzymanalyse av DNA utvalgt fra 10 isolerte blå kolonier viste at disse kloner bar plasmid-

DNA med én EcoRI-posisjon. 7 av disse koloniene hadde beholdt EcoRI-posisjonen plasert mellom lak-operatoren og Tc r-promotor-.en. Nukleotidsekvensen fra EcoRI-posisjonen og over i den lak-regulerende delen av én av disse plasmider, nemlig pBH20, kunne bekreftes. Plasmiden ble deretter brukt for å klone somatostatingenet.

D. Konstruksjon av plasmid pSOM 1

20 mikrogram av plasmidet pBH20 ble reagert til fullstendighet med begrensende endonukleaser EcoRI og BamHI

i et sluttvolum på 50^ul. Bakteriell alkalisk fosfatase ble tilsatt (0,1. enhet"Worthington BAPF"), og inkuberingen ble fortsatt i 10 minutter ved 65°C Reaksjonene ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstrasjon, og DNA utfelt med 2. volumer etanol, sentrifugert og opplost i 50^ul 10 mmol

tris-HCl, pH 7,6, 1 mmol EDTA. Den alkaliske fosfatase-behandlingen vil effektivt hindre selvsammenbinding av EcoRITog BamHI-behandlet pBH20-DNA, men sirkulære rekombinerte plasmider som inneholder somatostatin DNA kan dog dannes ved sammenbinding. Ettersom E. coli RR1 blir omformet med meget lav effektivitet av det lineære plasmid DNA, så vil hovedmengden av transformantene inneholde rekombinerte plasmider.

50 mikroliter somatostatin DNA (4^ug/ml) ble bundet sammen med 25/ul av BamHI, EcoRI, alkalisk fosfatase-behandlet ' pBH20-DNA i et totalt volum på 50^ul inneholdende 20 mmol tris-HCl, pH 7,7, 10 mmol MgCl2, 10 mmol ditiotreitol, 0,5 mmol ATP og 4 enheter t4-DNA-ligase ved 22°C. Etter 10, 20

og 30 minutter ble ytterligere somatostatin DNA (40 nanogram) tilsatt reaksjonsblandingen (gradvis tilsetning av somatostatin DNA begunstiger sammenbinding til plasmidets fremfor

en selvsammenbinding). Sammenbinding ble fortsatt i 1 time fulgt av en dialyse av blandingen mot 10 mmol tris-HCl, pH

7,6. I et kontrolleksperiment ble BamHI, EcoRI, alkalisk fosfatase-behandlet pBH20-DNA bundet sammen i fravær av somastotatin DNA under tilsvarende betingelser. Begge preparater ble brukt uten ytterligere behandling for transformering av E. coli RR1. Transformeringséksperimentet ble utfort i et såkalt "P3-apparat<n>(National Institutes of Health, U.S.A., Recombinant DNA Research Guidelines, 1976). Transformantene ble utvalgt på minimums-mediumplater inneholdende 20 yug/ml<A>Ap og 40^ug/ml X-gal. Det ble isolert 10 transformanter som alle var sensitive overfor Tc. Av hensiktsmessighetsgrunner ble disse betegnet pSOMl, pS0M2 etc. til pSOMlO. Under kon-, trolleksperimentet oppnådde man ingen transformanter. 4 av de 10 transformantene inneholdt plasmider med både en EcoRI-posisjon og en BamHI-posisjon. Storrelsen på det lille EcoRI-,

BamHI-fragmentet i disse rekombinerte plasmider var i alle fire tilfellene lik storrelsen på det in vitro-fremstilte somatostatin DNA. Basesekvensanalyse ifolge Maxam and Gilbert Proe. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 74, 560 (1977) viste at plasmiden pSOMl hadde fått innsatt det foronskede somatostation DNA-fragment.

DNA-sekvensanalysen av klonen som bar plasmiden pSOMl forutsa at den skulle produsere et peptid bestående av somatostatin. Imidlertid «kunne ingen somatostation-radio-immunitets-aktivitet påvises i ekstrakter av celleklumper eller kulturvæsker, heller ikke kunne man påvise et nærvær av

somatostation når en voksende kultur ble tilsatt direkte til 70% maursyre og cyanogenbromid. Man har kunnet observere at E. coli RRl-ekstrakter meget raskt nedbryter eksogen somatostatin. Fraværet av spmatostatinaktivitet i kloner som bærer plasmid pSOM 1 kunne derfor være et resultat av intra-cellulær nedbrytning ved hjelp av endogene proteolytiske enzymer. Plasmid pSOM 1 ble folgelig brukt for å konstruere en plasmid som koder for et forloperprotein som innbefatter somatostatin og som er tilstrekkelig stort til at man kan for-vente at det skal være resistent overfor proteolytisk nedbrytning.

E. Konstruksjon av plasmidene pSOM 11 og pSOM 11- 5

Det ble konstruert et plasmid hvor somatostatingenet kunne plaseres ved C-terminus på B-galaktosidasegenet, idet man holdt oversettelsen i fase. Nærværet av en EcoRI-posisjon nær. nevnte C-terminus i dette gen og den tilgjengelige aminosyresekvensen i dette protein (B. Polisky et al, Proe. Nat. Acad. Sei., U^S.A. 73, 3900 (1976), A.V. Fowler et al, Id., 74, 1507 (1976), A.I. Bukhari et al, Nature New Biology 243, 238 (1973) og K.E. Langley, J. Biol.. Chem. 250, 2587 (1975)) muliggjorde en innsettelse av EcoRI BamHI-somatostatingenet i EcoRI-posisjonen samtidig som man opprettholdt en riktig avlesningsramme. For konstruksjon av en slik plasmid, ble pSOM 1 DNA (50 ^ug) brutt ned med de begrensende enzymer EcoRI og Pstl i et sluttvolum på 100 yul. En preparativ 5% polyakrylamidgel ble brukt for å skille det store Pst- EcoRI-fragment som bærer somatostatingenet fra det mindre fragmentet som bærer de lak-kontrollerende elementene. Det store båndet ble,, skår et ut av gelen og DNA-eluert ved å skjære gelen opp i mindre stykker og ekstrahere DNA ved 65°C over natten. På lignende måte ble plasmid pBR322 DNA (50/Ug) nedbrutt med PstI- og EcoRI-begrensende endonukleaser, og de to resulterende DNA-fragmenter renset ved preparativ elektroforese på en 5%'polyakrylamidgel.. Det mindre Pstl- EcoRI-' fragment fra pBR322 (1. /ug) ble bundet sammen med det store Pstl- EcoRI DNA-fragmént (5/.ug) fra pSOM 1 i et sluttvolum på 50/ul med 1 enhet av T4-DNA-ligase ved 12°C i 12 timer. Den sammenbundne blandingen ble brukt for å transformere

E. coli RRI, og transformanter ble utvalgt med hensyn til ' ampicillin-resLstens på X-gal-medium. Som ventet ga nesten alle AP<r->transformantene (95%) hvite kolonier (ingen lak-oerator) på X-gal-indikåtorplater. Det resulterende plasmid pSOM 11 ble brukt for konstruksjon av plasmid p SOM 11-3.

En blanding av 5/Ug pSOM 11 DNA og 5/Ug >\ plak -DNA ble nedbrutt med EcoRI (10 enheter i'3o minutter ved 37°C). Den begrensende endonukleasereaksjonen ble avsluttet ved fenol-kloroform-ekstraksjon. DNA ble så etanol-utfelt og resuspendert i T4-DNA-ligasebuffer (50/ul). 1 enhet T4-DNA-ligase ble tilsatt blandingen og inkubering utfort i 12 timer ved 12°C. Blandingen med de sammenbundne fragmenter ble dialysert mot 10 mmol tris-HCl, pH 7,6, og brukt for å transformere E. coli-rase RRI. Transformanter ble utvalgt for Ap<r>på X-gal-plater inneholdende ampicillin og undersokt for mulighet for B-galaktosidaseproduksjon. Ca. 2% av koloniene var blå (pSOM 11-1,. 11-2 etc). En analyse av begrensende enzym fra plasmid-DNA oppnådd fra disse kloner viste at. alle plasmidene bar et nytt EcoRI-fragment, på ca. 4,4 megadalton, som bærer de lak-operon-kontrollerende posisjonene og mesteparten av • B-galaktosidasegehet.. Ettersom det er mulig med to orienteringer på EcoRi-fragmentet, ble den asymmetriske plaseringen på en HindiII-begrensende posisjon brukt for å bestemme hvilke av disse kolonier som ..bar dette EcoRI-fragment med en lak-transkribsjon som gikk over i somatostatingenet. En' HindIII- Bam. HI-dobbelnedbrytning indikerte at bare de kloner som bar plasmidene pSOM 11-3, pSOM 11-5, pSOM 11-6.

og pSOMll-7 inneholdt EcoRI-fragmentet i denne orientering.

4. Radioimmunprove for somatostatinaktivitet

Den kjente standard radioimmunprove (RI) for somastotatin (A. Arimura et al, Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975) ble modifisert ved å senke prbvevolumet og ved å bruke fosfatbuffer. Tyr<11->somatostatin ble jodisert0ved å. bruke en kloramin-T-fremgangsmåte (Id.). For å undersoke for somatostatin ble proven vanligvis i 70% maursyre inneholdende .5 mg cyanogenbromid pr. ml torket i et konisk poly-propylenrbr (0,7 ml, Sarstedt) over fuktig KOH under vakuum.

20 mikroliter PBSA-buffer-(75 mmol NaCl, 75 mmol natrium-fosfat, pH 7,2, 1 mg/ml av storfeserumalbumin, og 0,2 mg/ml natriumazid) ble tilsatt fulgt av 40/ul av en (^"<2>^I)-somatostatin-"cocktail" og 20/ul av en lOOO-gangers fortynning i PBSA av kanin-antisomatostatin-immunitetsserum S39 (Vale et al, Metabolism 25, 1491 (1976)). Nevnte (<125>I)-somatostatin-cocktail inneholdt pr. ml PBSA-buffer: 250 /ug normalt kanin-gammaglobulin (Antibodies, Inc.), 1500 entheter protease-inhibitor ("Trasylol", Calbiochém) og ca. 100.000 "counts"

av (12^I)Tyr1"*"-somatostatin. Etter minst 16 timer ved romtemperatur tilsatte man 0,533 ml geit-anti-kanin-gammaglobu-lin (Antibodies, Inc., P = 0,03) i PBSA-buffer til prove-rorene. Blandingen ble inkubert i 2 timer ved 37°C, av-kjolt til 5°C og så sentrifugert ved 10.000 ganger g i 5 minutter. Den overliggende væske ble fjernet og bunnfallet tellet i en gammateller. Med den mengde antiserum

som ble brukt ble 20% av "the counts" utfelt uten umerket konkurrerende somatostatin. Bakgrunnen med somatostatin (200 nanogram) var vanligvis 3%. En halvmaksimal kon^-kurranse ble oppnådd med 10 pg somatostatin. Initielle eks-prementer med ekstrakter av E. coli-rase RRI (den mottagende rasen) indikerte at mindre enn 10 pg somatostatin kunne lett påvises i- nærvær av 16^ug eller mer av det cyanogenbromid-behandlede, bakterielle protein. Mer enn 2/ug protein fra de maursyre-behandlede bakterielle ekstrakter forstyrret til en.viss grad ved å oke bakgrunnen, men cyanogenbromidspalting ville i hby grad redusere denne forstyrrelse. Rekon-struksjonseksperimenter viste at somatostatin er stabilt i cyanogen-bromid-behandlede ekstrakter.

A. Konkurranse ved hjelp av bakterieekstrakter

Rasene E. coli RRI (pSOM 11-5) og E. coli RRI (pSOMll-4) ble dyrket ved 37°C til et antall av 5 x IO<8>

celler pr. ml i Luriamedium. Deretter ble IPTG tilsatt til 1 mmol og veksten fortsatte i. 2 timer. 1-ml prover ble sentrifugert i et par sekunder i en Eppendorf-sentrifuge og bunnfallet ble suspendert i 500/ul 70% maursyre inneholdende 5 mg cyanogenbromid pr. ml. Etter ca. 24 timer ved romtemperatur ble provene fortynnet 10 ganger i vann og de volumer som ér angitt på fig. 6A ble undersokt i tre paraleller for somatostatin. På fig. 6A er "B/Bo" forholdet mellom (<1>25I)-somatostatin bundet i nærvær av proven i forhold til det som er bundet i fravær av konkurrerende somatostatin. Hver punkt er et middel av tre paralleller. Proteininnholdet i de ufor-tynnede prover ble bestemt til 2,2/Ug/ml for E. coli RRI (pSOMll-5) og 1,5 mg/ml for E. coli RRI (pSOM-4).

B. Forste undersokelse av pSOMll- kloner for somatostatin

Cyanogenbromid-behandlede ekstrakter av 11 kloner (pSOMll-2, pSOMll-3 etc.) ble gjort som beskrevet ovenfor i forbindelse med fig. 6A. 30 mikroliter av hvert ekstrakt

ble brukt i tre paralleller for en rådioimmunitetsprove, og resultatene er angitt på fig. 6B. Variasjonsområdet for provepunktene er angitt. Verdiene for picogram-somatostatin ble avlest fra en standardkurve oppnådd som en del av det samme eksperimentet.

De radioimmunproveresultater som er beskrevet så langt kan summeres på folgende måte. I motsetning" til resultatene fra eksperimentene med pSOMl, få fant man at 4 kloner (pSOMll-3, 11-5, 11-6. og 11-7) hadde en lett påvisbar somatostatin-radioimmunaktivitet, fig. 6A og 6B. En analyse av begrensende fragmenter viste at pSOMll-3, pSOMll-5, pSOMll-6

og pSOMll-7 hadde den foronskede orienteringen på lak-operonet, mens pSOMll-2 og 11-4 hadde motsatt orientering. Det er således en fullstendig korrelasjon mellom korrekt orientering på lak-operonet og produksjonen av somatostatin-radioimmunaktivitet.

C. Effekter av IPRG-induksjon og CNBr-spalting på positive

og negative kloner

Utformingen på somatostatin-plasmidet forutsier at syntesen av somatostatin skulle være under kontroll av lak-operonet. Lak-undertrykkergenet er ikke inkludert i plasmidet og den mottagende rasen (E. coli RRI) inneholder bare

krompsomalt lak-undertrykkergen av den vilde typen som gir bare fra 10 - 20 undertrykkermolekyler pr. celle (15). Plas-midkopitallet (og derfor antallet lak-operatorer)• er ca. 20 - 30 pr. celle, slik at en fullstendig undertrykking er umulig. Som vist i tabell III i det etterfolgeride så ble den spesifikke aktiviteten for somatostatin i E. coli RRI (pSOMll-3) bket ved IPTG, en induserende forbindelse for lak-operonet. Som ventet var induksjonsnivået lavt, varierende fra 2,4 -

7 ganger. I•eksperiment 7 (tabell III) ble også a-aktiviteten, et mål for de forste' 92 aminosyrene i B-galaktosidase, også bket med en faktor på 2. I flere eksperimenter var det slik.at man ikke kunne påvise noe somatostatin-radiimmunakti-vitet for cyanogenbromidspalting av det totale cellulære protein. Ettersom det antiserum som er brukt ved radioimmum-prbven, nemlig S 39, krever et fritt N-terminalt alanin, så er det ikke forventet noen aktivitet fbr cyanogenbromid-spaltingen.

D. Gelfiltrering av cyanogenbromid- behandlede ekstrakter

Maursyre og cyanogen-behandlede ekstrakter av positive kloner (pSOM 11-3, 11-5, 11-6 og 11-7) ble slått sammen, (totalt volum 250/ul), torket og resuspendert i 0,1 ml 50% eddiksyre. (^H)leucin ble tilsatt og proven påsatt en 0,7 x 47 cm kolonne av "Sephadex G-50"i 50% eddiksyre. Prover på 50 mikroliter av kolonnefraksjonene ble undersokt for somatostatin. Sammenslåtte negative kloneekstrakter (11-2, 11-4 og 11-11) ble behandlet identisk. Resultatene fremgår av fig.

5C. På samme kolonne er kjente somatostatineluater (Beckman Corp.) angitt (SS). I dette system er somatostatin vel skilt

fra eksluderte storre peptider og fullt inkluderte mindre molekyler. Bare ekstrakter av kloner som var positive for somatostatin viste radioimmunaktivitet i kolonnefraksjonene og denne aktivitet vil elueres i samme posisjon som kjemisk syntetisert somatostatin. Oppsummering av aktivitetsinformasjon

De data som fastslår en syntese av et polypeptid inneholdende en somatostatin-aminosyresekvens kan angis på fblgende måte: (l) Somatostatin-radioimmunaktivitet er til-

stede i E. coli-celler med plasmiden pSOMll-3, som inneholder et somatostatingen som har en riktig sekvens og har riktig orientering av lak-EcoRI-DNA-fragmentet. Celler med denne nærstående plasmid pSOMll-2, som har samme somatostatingen,

men motsatt orientering på lak- ÉcoRI-fragmentet, gir ingen påvisbar somatostatin-aktivitet: (2) Som forutsatt på grunn av sammensetningen kunne man ikke påvise noen somatostatin-radioimmunaktivitet for etter en cyanogenbromid-behandling av celleekstraktet; (3) Somatostatin-aktiviteten er under kontroll av lak-operonet, noe som kunne påvises ved en indu-sering med IPTG, en induserende forbindelse for lak-operonet;

(4) Somatostatin-aktiviteten vil utkromatograferes samtidig

med kjent, somatostatin på "Sephadex G-50"; (5) DNA-sekven-sen i det klonede somatostatingen er korrekt. Hvis oversettelsen er ute av fase, så vil man få fremstilt et peptid som er forskjellig fra somatostatin i hver eneste posisjon. Radioimmunaktivitet kan påvises som indikerer at et peptid nærstående til somatostatin blir fremstilt, og oversettelsen må således være i fase. Ettersom oversettelsen skjer i fase, vil den genetiske koden gjore at man får fremstilt et peptid med.noyaktig samme sekvens som i somatostatin; (6) til slutt kan det angis at de ovennevnte prover av E. coli RRI (pSOMll-3)-ekstrakter hemmer frigjoringen av voksehormoner fra rotte-hypofyseceller, mens prover av E. coli RRI (pSOMll-2) fremstilt helt parallelt og med samme.proteinkonsentrasjon ikke hadde noen effekt på veksthormonfrigjbringen.

Stabilitet, utbytte og rensing av somastotatin

De raser som bærer EcoRI-lak-operonfragmentet (pSOMll-2, pSOMll-3 etc.) skiller seg med hensyn til plasmidets fenotype. Etter 15 generasjoner vil således bare halvparten av E. coli RRI (pSOMll-3)-kulturen være intakt for fremstilling av B-galaktosidase,. dvs. at den har lak-operatoren, og av disse kolonier var ca. halvparten ampicillin-resistent. Raser som var positive (pSOMll-3) og negative (pSOM-11-2) for somatostatin var ustabile, og vekstuskjev-heten antar man fblgelig kommer at der produseres for meget av ufullstendige og inaktiv galaktosidase. Utbyttet av somatostatin varierte fra 0,001 til 0,03% av det totale cellulære protein (tabell 1) antagelig et resultat av seleksjonen for celler i kultur med plasmider med et uttroket lak-område. De hbyeste utbytter av somatostatin fikk man fra preparater hvor veksten var startet ut fra en enkelt ampicillin-resistent koloni.. Selv i slike tilfeller, ville 30%" av cellene ved inn-høsting ha utelukkelser ilak-området. Lagring i frossen tilstand _lypfilisering) og vekst for innhøsting av en enkelt slik koloni kan følgelig brukes. Utbyttet kan også bkes ved - f.eks. å bruke bakterieraser som overproduserer lak-under-trykker slik at uttrykningen av forlbperproteinet i alt vesentlig blir totalt undertrykket for induksjon og innhosting. Alternativt, som nevnt tidligere, kan man også bruke et tryptofan eller et annet oper-ator-promotor-system som vanligvis er totalt undertrykket.

I det rå ekstrakt som oppstår fra en cellenedbryt-ning, f.eks. i en Eaton-presse, så vil B-galaktosidase-somatostatinforlbperproteinet være uoppløselig bg ble funnet i et fbrste bunnfall fremstilt ved lav sentrifugeringshas-tighet. Aktiviteten kan bpplbseliggjbr i 70% maursyre, 6-

molar guanididiumhydroklørid eller 2% natriumdodecylsulfat. Mest foretrukket ble imidlertid råekstraktet fra Eaton-

pressen ekstrahert med 8-molar urea og residuet spaltet med cyanogenbromid. I innledende eksperimenter ble somatostatin-aktiviteten avledet fra E. coli-rase RRI (pSOMll-3) anriket

ca. 100 ganger ved alkoholekstraksjon av det spaltede produkt

og etterfølgende kromatografi på "Sephadex G-50" i 50% eddiksyre. Når produktet igjen ble kromatografert på."Sephadex G-50" og så underkastet hbytrykks-væskekromatografi, fikk man i alt vesentlig rent somatostatin.

II. Menneskeinsulin

Den teknikk som tidligere er blitt beskrevet ble således provet for fremstilling av menneskeinsulin. Således ble genene for insulin B-kjede (104 basepar) og for insulin A-kjede (77 basepar) utformet fra aminosyresekvensen i menne-sképolypeptidene, hvert med enkelttrådete kohesive terminii for EcoRI- og BamHI-begrensende endonukleaser og hver enkelt utformet for separat innsetning i pBR322-plasmider. De syntetiske fragmenter, deca- til pentadeca-nukleotider ble syntetisert ved den såkalte blokk-fosfotriestermetoden idet man brukte trinukleotider som byggeblokker ot til slutt renset med hbytrykks-væskekromatografi (HPLC). De syntetiske gener for menneskeinsulinets A- og B-kjeder ble så klonet separat inn i plasmid pBR322. De klonede syntetiske gener ble festet til et E. coli B-galaktasidasegen som beskrevet tidligere hvorved man fikk en effektiv transkribsjon, oversettelse og et stabilt forlbperprotein. Insulinpeptider ble spaltet fra - B-galaktasidaseforlbperen, påvist ved radioimmunitetsprover

og deretter resnet. Ins.ulin-radioimmunitetsprbve-aktiviteter ble så utviklet ved blanding med E. coli-produkter.

1. Utforming og syntese av menneskeinsulingener

De gener som ble konstruert for menneskeinsulin er vist på fig.: 9. Genene for menneskeinsulin, B-kjede og A-kjede, ble utformet fra aminosyresekvensene i menneskepoly-peptider. 5'-endene i hvert gen har en enkelttrådet kohesiv

termini for EcoRI- og BamHI-begrensende endonukleaser, for å

o få en korrekt innsetning av hvert gen i plasmid pBR322. En Hindlll-endonukleasegjenkjennende posisjon ble inkorporert i midten av B-kjedegenet for aminosyresekvensen Glu-Ala for å lette sammensetning og verifisering av hver halvpart av genet separat for man konstruerte hele B-kjedegenet. B-kjede-og A-kjedegenet ble utformet slik at det ble bygget opp fra,29 forskjellige oligodeoksyribonukleotider, varierende fra deca-mer til pentadecamerer. Hver pil indikerer det fragment som ble syntetisert ved den forbedrede fosfbtriestermetoden, Hl til H8 og Bl til B12 for B-kjedegenet og AI til All for A-kjedégenet.

2. Kjemisk syntese av oligodeoksyribonukleotider

Materialer og metoder for syntese av oligodeoksyribonukleotider var i alt vesentlig som beskrevet av Itakura, K. et al (1975) J, Biol. Chem. 250, 4592 og Itakura, K.-et al

(1975) J. Amer. Chem. Soc. 97, 7327, bortsett fra disse modi-fikasjoner: a) De helt beskyttelde mononukleotider, 5'-0-di-metoksytrityl-3'-p-klorfenyl-B-cyanoetyl-fosfater bie syntetisert fra nukleosidderivatene ved å bruke et monofunksjonelt fosforyleringsmiddel, dvs. p-klorfenyl-B-cyanoetyl-fosforo-kloridat (1,5-molar ekvivalent) i acetonitril i nærvær av 1-metyl-imidazol Van Boom, J. H. et al (1975) Tetrahedron el, 2953. Produktene ble isolert i stor skala (100 - 300 g) ved preparativ væskekromatografi (Prep 500 LC, Waters Associates). b) Ved å bruke opplbsningsmiddelekstraksjonsmetoden

(Hirose, T. et al (1978) Tetrahedron Letters, 2449) ble 32 bifunksjonelle trimerer syntetisert (se tabell IV) i 5 - 10 mmol-skala, og 13 trimerer, 3 tetramerer og 4 dimerer som 3'-terminusblokker i 1 mmol-skala. • Homogeniteten på de fullt beskyttede trimerer ble undersokt ved tynnsjiktkromatografi på silisiumdioksydgel i 2 metanol/kloroform-opplbsningsmiddel-systemer: oppldsningsmiddel a, 5% volum/volum og opplosningsmiddel b, 10% volum/volum (se tabell IV). Ut fra disse for-bindelser syntetiserte man 29 oligodeoksyribonukleotider

med definert sekvens, 18 for B-kjeden og 11 for A-kjedegenet.

Basisenhetene som ble brukt for å konstruere poly-nukleotidene var 2 typer av trimerblokk, dvs. de bifunksjonelle trimerblokkene som er angitt i tabell IV og de tilsvarende 3'-terminus-trimerer beskyttet med en anisoylgruppe ved 3'-hydroksygruppen. Den bifunksjonelle trimeren ble hyd-rolysert til den tilsvarende 3'-fosfodiesterkomponenten med en blanding av pyridin-trietylamin-vann (3:1:1 volum/volum) og dessuten til den tilsvarende 5'-hydroksylkomponenten med 2% benzensulfonsyre. Nevnte 3<1->terminusblokk ble behandlet med 2% benzensulfonsyre slik at man fikk den tilsvarende 5'-hydroksylforbindelsen. Koplingsreaksjonen mellom et overskudd av nevnte 3'-fosfodiestertrimer (1,5-molar ekvivalent) og med 5'-hydroksylkomponenten (1-molar ekvivalent) i nærvær av fra 3-4 ekvivalenter av 2,4,6-triisopropylbenzensulfonyltetrazolid (TPSTe) var nesten fullstendig i lopet av 3 timer. For å fjerne overskuddet av 3'-fosfodiesterblokk-reaktanten ble reaksjonsblandingen fort gjennom en kort silisiumdioksyd-gelkolonne satt på på et sintrert glassfilter. Kolonnen ble vasket forst med CHCl^for å eluere noen sideprodukter og koplingsmidlet, og deretter med CHCl^:Me0H (95:5 volum/volum) hvor nesten alt av den fullt beskyttede oligomer ble eluert. Under disse betingelser ble den ladede 3'-fosfodiesterblokk-reaktanten tilbake i kolonnen. På lignende måte ble blokk-kop],-inger gjentatt inntil man fikk den foronskede'mengde.

K Fullt beskyttet' trideoksynukleotider,. 5-09-dimetoksytri-tyl-3*-p-klorfenyl-p-cyanoetylfosfat.

Utbyttet er det totale utbytte beregnet ut fra 5'-hydrok-sylmonomerene.

<***>Basert på HPLC-analyse.•■

Hoytrykksvæskekromatografi (HPLC) ble brukt under oligonukleotidsyntesen for a) analyse av hver trimer og tetramerblokk, b) analyse av *de intermediære fragmenter (heksamerer, monamerer og decamerer), c) analyse av siste koplingsreaksjon og- d) rensing av sluttproduktet. Kromato-grafien ble utfort ved å bruke en "Spectra-Physics 3500B"

væskekromatograf. Etter fjerning av alle beskyttende grupper med konsentrert NH^OH ved 50°C (6 timer) og 80% AcOH ved romtemperatur.(15 minutter), ble forbindelsene analysert på en "Permaphase ÅAX"(DuPont) (Van Boom, J. et al (1977) J. Chromatography 131, 169) kolonne- (1 m x 2mm) ved å bruke en lineær gradient- av opplosningsmiddel B (0,05 molar K^PO^- 1,0 molar KC1, pH 4,5) i opplosningsmiddel A (0,01 molar KHgPO^, pH 4,5). Gradienten ble dannet ved å starte med buffer A og.påsette 3% av buffer B pr. minutt. Elueringen ble utfort ved 60°C med en hastighet på 2 ml pr. minutt. Rensingen av de 29 ferdige oligonukleotidene ble også utfort

på "Permaphase AAX" under.de samme betingelser som angitt ovenfor. Den foronskede topp ble slått sammen, avspaltet ved dialyse og'lyofilisert. Etter merking av nevnte. 5'-termini med ( Y - -zpp)ATP ved å bruke T4-polynukleotidkinase,

ble homogeniteten på hvert oligonukleotid-undersokt ved elektroforese på en 20% polyakrylamidgel.

5» Sammensetning og kloning av B- kjedegen på A- kjedegenet Genet for B-kjeden i insulin ble utformet.slik at man hadde en EcoRI-begrensende posisjon på den venstre enden, en Hindlll-posisjon i midten og BamHI-posisjonen i den hoyre enden. Dette ble gjort slik at begge halvdelene, dvs. den venstre EcoRI- HindIII-halvparten (BH) og den hbyre Hindlll-BamHI-halvdelen- (BB) kunne separat klones på et hensikts-messig klonende, element pBR322 og etter at deres sekvenser var blitt verifisert, bindes sammen slik at man fikk et

komplett B-gen (fig. 10). BB-halvparten ble satt sammen ved sammenbinding av 10 oligodeoksyribonukleotider, merket Bl til B10 på fig. 9, fremstilt ved fosfotriester-kjemisk syntese. Bl og B10 var ikke fosforylert, hvorved man eliminerte-uonsket polymerisering av disse fragmenter gjennom deres kohesive ender (HindiII og BamHI). Etter rensing ved preparativ akrylamidgel-elektroforese og eluering av det stbrste DNA-båndet, ble BB-fragmentet innsatt i plasmid pBR322 som var blitt spaltet med Hindlll-' og BamHI. Ca. 50% av de amp il-licinresistente kolonier avledet fra nevnte DNA var fblsomme for tetracycline, noe som indikerte at et ikke-plasmid Hindlll-BamHI-fragment var blitt innsatt. De små Mndlll-BamHI-fragmentene fra fire av disse koloniene (pBBlOl - pBBl04). ble undersokt for sin sekvens og funnet å være korrekte.

BH-fragmentet ble fremstilt på lignende måte og innsatt i pBR322 som var blitt spaltet med EcoRI- og HindiII-begrensende endonukleaser. Plasmider fra tre ampicillin- ,

■resistente og tetracycline-folsomme transformanter (pBHl -

pBH3) ble analysert. Man fant at de småe EcoRI- Hindlll-fragmentene hadde den forbnskede og forventede nukleotidsekvens. .A-kjedegenet ble satt sammen i tre deler.'De venstre fire, de midtre fire og de hbyre fire oligonukleotidene (se fig. 9) ble bundet sammen separat, deretter blandet og bundet sammen (oligonukleotidene Al til Al2 var ufosforylert). Det sammensatte A-kjedegenet ble fosforylert, renset ved gelelektroforese og klonet i pBR 322 ved EcoRI- BamHI-posisjonene. EcoRI-Bam-HI-fragmentene fra to ampicillinresistente og tetra-cyclinfolsomme kloner (pA10, pAll) inneholdt den forbnskede A-gehesekvens.

4. Konstruksjon av plasmider for uttrykking av A- og B-insulingener

Fig. 10 illustrerer konstruksjonen av1 lak-insulin-B-plasmidet (pIBl). Plasmidene pBHl og pBBlOl ble nedbrutt med EcoRI- og Hindlll-endonukleaser. Det lille BH-fragmentet fra pBHl og det store fragmentet fra pBBlOl (inneholdende BB-fragmentet og mesteparten av pBR322) ble renset ved gelelektroforese, blandet og bundet sammen i nærvær av EcoRI-spaltet

plak 5. Megadalton- EcoRI-fragmentet av A plak 5 inneholder lak-kontrollerende område' . og hovedmengden av det 6-galaktosi-

dase-strukturelle gen. Konfigurasjonen på de begrensende posisjoner sikrer korrét sammenbinding av BH til BB.'lak-EcoRI-fragmentet kan innsettes i to orienteringer, således

at bare halvparten av klonene etter transformeringen skulle ha den forbnskede orienteringen. Orienteringen på 10 ampicillinresistente, 8-galaktosidase-kloner ble undersokt ved begrensende analyse. 5 av disse kolonier inneholdt hele B-genesekvensen og den korrekte avlesningsrammen fra 8-galak-'tosidasegenet over i B-kjedegenet. En av disse, nemlig pIBl, ble valgt for de etterfølgende eksperimenter.

I et lignende eksperiment ble 4,4 megadalton lak-fragmentet fra }\plak 5 innfort i pAll-plasmidet ved EcoRI-posis jonen slik at man fikk pIAl. Nevnte pIAl er identisk med pIBl bortsett fra at A-genefragmentet er erstattet med B-genefragmentet. DNA-sekvensanalyse 'viste at man hadde

fått opprettholdt de korrekte A- og B-kjedegenesekvensene i pIAl og pIBl henholdsvis.

5. Uttrykking

Trådene som inneholder insulingener korrekt bundet til B-galaktosidase vil begge produsere store mengder av et protein med storrelse som B-galaktosidase. Ca. 20% av det totale cellulære protein var denne B-galaktosidase-insulin

A- eller B-kjedehybrid. Hybridproteinene er uoppløselige og ble funnet i fbrste bunnfall fremstilt ved lav sentrifugerings-hastighet, hvor de utgjor ca. 50% av proteinet.

For å påvise uttrykkingen av insulin A- og B-kjedene brukte man en radioimmunoprobve (RIA) basert på rekonstituering av det fullstendige insulin fra de separate kjeder. Man tilpasset den insulinrekonstitueringsfremgangs-måte som er beskrevet av Katsoyannis et al (1967) Biochemistry 6, 2642 - 2655 til et prbvevolum på 27 mikroliter, noe som gir en godt egnet prove. Lett påvisbar insulinaktivitet ble oppnådd etter blanding og rekonstituering av S-sulfonerte

derivater av insulinkjedene. De separate S-sulfonerte kjeder av insulin vil ikke reagere etter reduksjon og oksydasjon

med det anti-insulin-antistoff som ble brukt.

Når man skal bruke, denne rekonstitueringsprbve,

må man delvis rense B-galaktosidase-A- eller 'B-kjedehybrid-

proteinet, spalte det med cyanogenbromid og danne S-sulfonerte derivater.

Beviset for at man har oppnådd korrekt uttrykking fra kjemisk syntetiserte gener for menneskeinsulin kan summeres på fblgende måte: a) Radioimmunaktivitet er påvist for begge kjeder, b) De DNA-sekvenser man har oppnådd etter kloning og plasmidkonstruksjon kan direkte verifiseres til å være korrekt slik de er blitt utformet. Siden man oppnår radioimmunaktivitet må oversettelsen være i fase. FSlgelig vil den genetiske kode forutsi at peptidene har den samme sekvens som i menneskeinsulin. c) E. coli-produktene vil etter cyanogenbromid-spalting opptre som insulinkjeder

i tre forskjellige kromatografiske systemer som skiller på forskjellige prinsipper (gelfiltrering, ioneutbytning og reversert fase-hoytrykksvæskekromatografi. d) E. coli-produsert A-kjede er blitt renset i mindre skala ved hbytrykks-væskekromatografi og har den korrekte aminosyresammensetning.

Claims (10)

1. Rekombinert plasmid egnet for transformering, eller omdannelse av en bakterievert og som i denne kan brukes som et klonende elementjkarakterisert vedat nevnte plasmid inneholder: (a) et regulon homologt til bakterieverten i dets uomdannede tilstand; og (b) i avlesende fase med regulonet et DNA-element , som koder for aminosyresekvensen for et heterologt polypeptid slik at de bakterier som er omdannet av plasmiden er istand til å uttrykke nevnte aminosyrefrekvens i en inn-vinnbar form.

2. Bakterieplasmid, karakterisert ved å.være som i krav 1.

3. Plasmid ifolge krav 2, karakterisert ved at dens regulon er i alt vesentlig identisk til et regulon som vanligvis er- tilstede i bakterivertens kromo-somale DNA.

4. Plasmid ifolge krav 2, karakterisert ved at det innbefatter promotor-operatorsystemet for et operon valgt fra gruppen bestående av E. coli lak-operon og E. coli tryptofanoperon.

5.. Plasmid ifolge krav 3, karakterisert ved at det heterologe polypeptid er et pattedyrhormon eller et mellomprodukt for et slikt hormon.

6. Plasmid ifolge krav 4, karakterisert ved at det heterologe polypeptid er et pattedyrhormon eller en intermediær forbindelse for et slikt hormon.

7. Plasmid ifolge krav 6, karakterisert ved at det heterologe polypeptid er valgt fra gruppen bestående av menneske-preproinsulin, menneske-proinsulin, A-kjeden for menneskeinsulin, B-kjeden for menneskeinsulin, menneske- eller storfeveksthormon, leutiniserende hormon, ACTH samt pankreatisk polypeptid.

8. Plasmid ifolge krav 6, karakterisert ved at det heterologe polypeptid er et pattedyrhormon.

9. Plasmid ifolge krav 6, karakterisert ved at det heterologe polypeptid er somatostatin.

10. Plasmid, ifolge krav 9, karakterisert ved at regulonet innbefatter promotor-operator-systemet for E.. coli lak-operonet.