KR840002107B1 - 재조합 미생물 클로닝 베히클로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

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Description

재조합 미생물 클로닝 베히클로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법

제1도는 본원 공정의 도식적인 개요이다.

제2도는 합성유전자의 도식적인 구조이다.

제3도는 합성유전자를 만드는데 사용되는 뉴클레오티드 트리머를 만드는 바람직한 방법에 대한 도해이다.

제4도는 재조합 플라스미드를 만드는 유동도이다.

제5a도 및 제5b도는 두 플라스미드의 가장 중요한 부분의 뉴클레오티드 서열이다.

제6도 내지 제8도는 방사성 면역 비교검정실험에 대한 결과이다.

제9도는 사람 인슐린의 A 및 B가닥의 아미노산 서열에 대한 코돈(codon)으로 암호나선이 이루어진 합성유전자의 도식적인 구조이다.

제10도는 사람 인슐린의 B가닥을 표현할 수 있는 재조합 플라스미드의 구조에 관한 유동도이다.

본 발명은 재조합 미생물 클로닝 베히클로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

유전정보는 DNA암호나선이 반복되는 뉴클레오티드 성분의 특정염기를 나타내는 순서에 따라 이중나선의 데옥시리보핵산(DNA 또는 유전자)상에 암호화되어 있다. 폴리펩티드를 만들기 위한 암호화된 정보의 "발현"은 두 부분으로 된 공정을 수반한다. 유전자에 존재하는 어떤 조절부분(레귤론, (regulons)의 명령에 따라서 RNA폴리머라제가 암호나선을 따라 이등하여 소위 "복사(transcription)" 공정에서 전령(messenger) RNA(리보핵산)를 형성한다. 후속 "해독(translation)" 단계에서, 트랜스퍼(transfer) RNA와 연결된 세포의 리보좀이 m-RNA의 "전달문"을 폴리펩티드로 전환시킨다. 리보좀의 해독의 개시와 종료 뿐만 아니라폴리펩티드를 만드는 아미노산 본체 및 결합서열(sequence)에 대한 신호들이 DNA로부터 m-RNA가 복사한 정보에 포함되어 있다.

DNA암호가닥은 "코돈(codon)"이라고 불리는 3개의 뉴클레오티드의 긴 서열로 이루어져 있는데 각 트리플렛트(triplet) 또는 코돈에서 뉴클레오티드의 특정염기가 유전정보의 특이한 비트를 암호화하기 때문이다. 예를 들면, ATG(아데닌-티민-구아닌)라고 읽어지는 3개의 뉴클레오티드는 "개시해독"으로 해석되는 m-RNA신호가 되며 한편 종료 코돈 TAG, TAA 및 TGA는 "중지해독"으로 해석이 된다. 개시와 중지코돈사이에 소위 구조유전자가 위치하고 있는데 이 구조유전자의 코돈은, 결국 해독되는 아미노산 결합서열을 규정짓는다. 이러한 규정은, 각종 아미노산에 대한 코돈을 기술한, 확립된 "유전암호"(예를들어, J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, W.A. Benjamin Inc., N.Y. 제 3판, l976)에 따라 진행시킨다.

유전암호는, 여러개의 다른 코돈들이 같은 아미노산을 만들 수 있다는 의미에서 볼 때 하챦은 것이지만, 각 아미노산의 경우, 하나 이상의 코돈이 그 아미노산외에 다른 아미노산을 만들 수 없는 경우에는 정확하다. 따라서, 예를들면, TTT, TTC, TTA 및 TTG모두는 세린의 코돈이며 다른 아미노산을 만들지 않는다. 복사하는 동안, 적당한 판독면 또는 판독대가 유지되어야 한다.

예를들면, ...GCTGGTTGTAAG...의 결합서열에서 RNA폴리머라제 복사자가 다음과 같이 밑줄친 코돈의 시작으로 각기 다른 염기들을 판독할 경우 어떤 일이 일어날지 생각해 보라.

결국 생성되는 폴리펩티드는 레귤론에 대한 구조유전자의 공간적인 관계에 따라 달라진다.

본 발명의 유전적 발현공정을 보다 명확히 이해하기 위하여 유전자의 각성분에 대해 정의를 내린다.

오페론(Operon)···폴리펩티드 발현을 위한 구조유전자 및 그 표현을 조절하는 조절부분(레귤론)으로 구성된 유전자

프로모터(Promoter)···복사개시를 위해 RNA폴리머라제가 결합해야 하는 레귤론에 존재하는 유전자

오퍼레이터(Operator·‥리프레서(repressor) 단백질이 결합된 유전자로, 그렇게 하므로써 RNA폴리머라제가 인접한 프로모터상에 결합하는 것을 막는다.

유도물질(Inducer)…리프레서 단백질을 비활성화시키는 물질로, 오퍼레이터를 유리시키고RNA폴리머라제를 프로모터에 결합시켜 복사를 시작하게 한다.

분해활성단백질("CAP")의 결합위치…CAP를 매개할 뿐만 아니라 복사개시에 통상 필요한 시클릭 아데노신 모노포스페이트("CAMP")와 결합하는 유전자. CAP결합위치는 불필요한 특수한 경우가 있다. 예를들면 파아지入 plac UV5의 락토오즈 오페론에서의 프로모터 돌연변이는 발현하기 위해 CAMP와 CAP를 필요로하지 않는다.

참조문헌 : J. Beckwith등J. Mol. Bio1. 69,ISS-160(1972).

프로모터-오퍼레이터 시스템…CAP결합위치 또는 리프레서 단백질발현에 대한 암호능에 관계가 있거나 관계가 없이 작용할 수 있는 오페론의 조절부분.

또한 재조합 DNA에 대한 설명을 하기 위해 하기 정의를 내린다.

클로닝 베히클(cloning vehicle)…단세포 유기체(미생물) 내에서 존재했을 때 "형질전환"에 의해 베히클이 복제되는 완전한 리플리콘(replicon)으로 구성된 비염색체성 이중나선 DNA. 이렇게 형질전환된 유기체를 "전환체"라고 부른다.

플라스미드(plasmid)…비루스나 박테리아로부터 유도된 클로닝 베히클로, 후자를 "박테리아성 플라스미드"라 한다.

보족성(complementarity)…각 나선상에서 보족염기 사이에서 수소결합에 의해 이중나선 DNA를 형성하게 하는 단일나선 DNA의 염기서열에 의한 성질. 아데닌(A)은 티민(T)과 보족하는 한편 구아닌(G)은 시토닌(C)과 보족한다.

최근 생화학의 발전으로, 예를 들면 플라미드가 외부 DNA를 함유하도록 만들어진 재조합 클로닝 베히클을 만들 수 있게 되었다. 특별한 경우, 재조합체는 "이질성"를 포함할 수 있는데 이는 폴리펩티드에 대한 암호가 통상 재조합 베히클에 의한 형질전환에 민감한 유기체에 의해 생성되지 않는 DNA를 의미한다. 따라서, 플라스미드는 결합될 수 있는 말단부분을 가지는 선상 DNA를 제공하기 위하여 분해된다. 이들은 결합될 수 있는 말단을 갖는 외부의 유전자와 결합되어 완전한 리플리콘에게 생물학적으로 작용하는 부위와 원하는 형질표현성을 제공해 준다. 재조합 부위는 형질전환에 의해 미생물안으로 삽입되고 형질전환체는 새로운 유전정보를 발현할 수 있는 많은 수의 개체를 얻기 위한 목적으로 분리하여 증식시킨다. 재조합 클로닝 베히클을 형성하고 이들로 유기체를 형질전환시키는 방법과 수단은 하기 문헌에 널리 보고되어 있다.

예를들어, H.L. Heynecker등,Nature 263,748-752 (1976); Cohen등Proc. Nat. Acad. Sci.USA69,2110(1972);ibib., 70,1293(l973);ibid, 70,3240(1973); ibid, 7l, 1030(1974); Morrow등Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 71,1743(1974); Novick,Bacteriological Rev., 33,210(1969); Hershfield등,Proc. Soc. Nat'1. Acad. Sci. U.S.A. 71,3545(1974); 및 Jackonibid. 69, 2904(1972). 이 논제에 관한 일반적인 검토가 S. Cohen의Scientific American 233, 24(1975)에 기재되어 있다. 본 명세서에 언급된 상기 문헌들과 다른 간행물들은 참고로 삽입한 것이다.

DNA재조합에 여러가지 기법을 사용할 수가 있는데 이 방법에 따라 결합을 쉽게 하기 위하여 다른 DNA분절의 인접한 말단들을 한 방법 또는 다른 방법으로 연결시킨다. 후자는 인접한 뉴클레오티드사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 것을 말하며 대부분의 경우에 효소 T₄DNA리가제(ligase)라는 매개에 의해 형성된다. 이렇게 하여 블런트(blunt) 말단들이 직접 연결된다. 이와는 달리, 인접한 말단에 보족단일나선을 포함하는 분절들은 후속결합을 위한 각 말단에 위치하는 수소결합에 의해 유리해진다. 그러한 단일나선(접착성 말단으로 칭함)은 말단 트랜스퍼라제를 사용하여 블런트말단에 뉴클레오티드를 가하여 생성하며 때때로, 간단히 λ-엑소뉴클레아제와 같은 효소로 블런트 말단의 한 나선을 잘라버림으를써 생성시킬 수 있다. 대부분의 경우, 4 내지 6개 염기쌍정도 길이의 뉴클레오티드의 독특한 결합서열의 내부 및 주위의 포스포디에스테르결합을 끊는 제한 엔도뉴클레아제를 쓰게 된다. 많은 제한 엔도뉴클레아제 및 그들의 작용부위가 알려져 있는데, 소위 Eco RI엔도뉴클레오아제가 가장 널리 이용된다. 회전적으로 대칭인 팰린드로움(palin-dromes)에서 이중나선 DNA를 분해시키는 제한 엔도뉴클레아제는 결합성 말단을 남긴다. 그러므로 플라스미드 또는 다른 클로닝 베히클이 분해되어 각각 제한 엔도뉴클레아제 작용부위의 절반을 함유하는 말단을 남긴다.

동일한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 수득된 외생적 DNA의 분해 생성물은 플라스미드 말단의 것들과 보족적인 말단을 갖게 된다. 이와는 달리, 결합성 말단을 갖는 합성 DNA는 분해된 베히클내에 삽입될 수 있다. 외생적 DNA의 삽입중 베히클의 결합성 말단이 재결합자(rejoinder)를 방해하기 위하여 말단을 알카리성 포스파타제에 온침시켜 외생적 분절의 삽입을 폐쇄시키기 위한 분자선택을 할 수 있다. 베히클의 다른면에 관해 적당한 방위를 갖는 분절의 삽입은 그 분절이 각각 2개의 상이한 제한 엔도뉴클레아제의 인식서열의 반으로 구성된 말단으로 이루어졌을 때 증강될 수 있다.

최근 이러한 재조합 DNA에 대한 광범위한 연구에도 불구하고 직접적이고 실용적인 적용에 관한 연구성과는 거의 없다. 통상적인 방법으로 뉴클레오티드에 의해 뉴클레오티드를 만들거나 또는 분리된inRNA (보족 또는 "cDNA")로부터 역복사로 수득되든지 간에 "합성 DNA"에 의해 암호화된 플리펩티드 등을 발현하고자 하는 시도가 실패한 경우에 특히 연구성과가 없다는 것을 알 수 있다.

이러한 적용분야에서, 광범위한 적용을 할 수 있는 관련된 발전과 함께 합성유전자로부터 작용성 폴리펩티드 생성물을 처음으로 발현하는 것에 대해 기술한다. 언급된 생성물은 선단비대증, 급성췌장염, 인슐린의존성 당뇨병 치료에 효과가 있는, 성장 호르몬의 분비억제제인 소마토스타틴, (GuilleminU.S.P.3,904, 594) 인슐린 및 글루카곤이다. 참조 R. Guillemin등Annual Rev. Med. 27,379(1976). 소마토스타틴은 하기 설명과 도면에서 나타나는 바와 같이, 여러가지 면에서 새로운 발전에 대한 응용가능성을 명백히 보여준다.

첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 실시 태양의 응용에서 하나의 예로 설명한 것인데, 즉, 재조합 플라스미드를 함유한 세균성형질환체에 의해 소마토스타틴 호르몬을 발현시키는 것을 나타낸 것이다.

제1도는 본원 공정의 도시적인 개요이다. 화학적 DNA합성에 의해 만들어진 소마토스타틴에 대한 유전자를 플라스미드 pBR322상에서 이, 콜리(E. coli)의 β-갈락토시다제 유전자에 융합시킨다. 이. 콜리에 형질전환시킨 후 재조합 플라스미드가 시험관내에서 시아노겐 브로마이드에 의해 메티오닌 잔기에서 특이하게 분해될 수 있는 전구체 단백질의 합성을 지시한다. A,T,C 및 G는 소마토스타틴 유전자의 암호나선에 있는 데옥시리보뉴클레오티드의 특정염기(각각, 아데닌, 티민, 시토신 및 구아닌)를 나타낸다.

제2도는 암호나선(즉, "상부"나선) 소마토스타틴의 아미노산 서열에 대한 코돈으로 이루어진 합성 유전자의 도식적인 구조이다.

제3도는 합성 유전자를 만드는데 사용되는 뉴클레오티드 트리머를 만드는 바람직한 방법에 대해 도식적으로 설명한 것이다. 제3도에서 뉴클레오티드를 묘사하는데 통상적으로 사용되는 표시법에서 5'OH는 왼쪽에, 3'OH는 오른쪽에 있다. 예를들면,

제4도는 모(parental) 플라스미드 pBR322로 시작하여 단백질을 함유한 소마토스타틴("SOM")을 발현할수 있는 재조합 플라스미드(예를들면, pSOM11-3)의 제조에 대한 유동도이다. 제4도에서 각 플라스미드의 대략적인 분자량은 달톤("d")으로 표시되었다.

Ar^r및 Tc^r은 각각 임피실린과 테트라사이클린에 내성인 유전자를 나타내는 반면에 Tc^s는 Tc^r유전자의 한 부분이 잘려진 결과 테트라사이클린에 감수성인 것을 나타낸다. 플라스미드상에서 각종 제한 엔도뉴클레아제 특이 분해의 상대 위치가 도시되어 있다(예를들면,EcoRI,BamI, 등).

제5a도 및 제5b도는 두 플라스미드의 가장 중요한 부분에 대한 뉴클레오티드 서열이 암호나선의 5'말단으로부터 일정하게 진행되는 전령 RNA(mRNA)의 복사 방향으로 나타나 있다. 제한 엔도뉴클레아제 기질의 위치는 나타난 바와 같다. 각각 표시된 서열은 1ac(락토즈) 오페론이 조절요소와 소마토스타틴(italics)의 아미노산 서열 발현을 위한 코돈을 함유한다.β-갈락토시다제("β-gal")에 대한 아미노산 서열수는 괄호 안에 있다.

제6도 내지 제8도는 재조합 플라스미드에 의해 발현된 생성물의 소마토스타틴 활성을 증명해 주는 방사성면역비교검정 실험의 결과를 나타내며 "실험"부분에서 더 상세히 기술되어 있다.

제9도는 A와 B 나선으로 구성된 사람 인슐린의 아미노산 서열을 위한 코돈으로 암호나선이 이루어진 합성유전자의 도식적인 구조이다.

제10도는 사람 인슐린의 B체인을 발현할 수 있는 재조합 플라스미드의 구조에 대한 도식이다.

1. 이종 폴리펩티드에 대한 유전암호의 제조

공지 아미노산 서열의 어떤 폴리펩티드에 대한 DNA암호는 유전암호에 따라 코돈을 선택하므로써 제조될 수 있다.

정제 등을 용이하게 하기 위하여, 예를들어, 약 11 내지 약 16개의 뉴클레오티드로 이루어진 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 따로 제조한 다음 원하는 서열로 붙여 모은다. 그러므로 편리한 크기의 올리고데옥시리보뉴클레오티드 분절의 첫번째와 두번째 시리즈를 제조한다. 적당한 서열로 결합시켰을 때 첫번째 시리즈는 폴리펩티드 발현에 대한 DNA암호나선이 된다(예를들어, 제2도의 분절 A,B,C 및 D참조). 두번째 시리즈를 마찬가지로 적당한 서열로 결합시켰을 때 암호나선에 보족하는 나선이 생성된다(예를들어, 제2도의 분절 E,F,G 및 H). 각 나선들의 분절들은 분절블록의 결합성 말단의 수소결합에 의한 그들 자체의 회합을 보족성이 촉진시킬 수 있도록 바람직하게 겹쳐진다. 회합된 다음 통상의 방법으로 결합시켜 구조유전자를 완성시킨다.

유전암호의 변성은 어떤 주어진 아미노산 서열에 대한 코돈의 선택을 자유롭게 한다. 그러나 본 발명의 목적을 위해 코돈을 선택하는데 다음 세가지를 고려하면 유리하다. 첫째, 코돈과 분절을 선택하고 분절의 부당한 보족설을 피하기 위하여 의도된 유전자 내에서 서로 인접한 분절을 제외하고는 분절을 회합시킨다. 둘째로, 복사가 미리 종료되는 것을 피하기 위하여, 특히 GC염기쌍이 많은 서열이 진행될 때 AT염기쌍이 많은 서열(예를들면 5개이상)은 피한다. 세째로, 적어도 선택된 코돈의 대부분은 미생물 게놈(genome)을 발현하는데 바람직 한 코돈이다(예를들어, W. Fiers 등Nature 260, 500(1976)참조). 특허청구의 범위에서 "미생물 게놈의 발현에 바람직한" 코돈으로서 하기와 같이 정의한다.

[표 1]

가장 바람직하게는 소마토스타틴의 경우 구조유전자의 아미노산(코돈)관계는 다음과 같다.

글리신(GGT); 시스테인(TGT); 리신(AAG); 트립토판(TGC); 알라닌(GCT, GCG); 아스파라긴(AAT, AAC); 페닐알라닌(TTC, TTT); 트레오닌(ACT, ACG); 및 세린(TCC, TCG)

원하는 폴리펩티드의 구조 유전자가 발현될 클로닝 베히클에 삽입되면, 유전자는 "개시"코돈(예, ATG)에 의해서 진행되고 즉시 하나 이상의 "종료"코돈에 의해 작용을 멈추게 된다(제2도 참조). 그러나, 후술하는 바와 같이, 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열은 그 앞이나 또는 그 뒤에 부가된 단백질과 함께 표현될 수 있다. 폴리펩티드를 의도적으로 사용하고자 할 때, 부가 단백질을 분해시킬 필요가 있다면, 폴리펩티드부가 단백질 코돈 접합부분에 대해 적당한 분해 위치를 암호화시킨다. 그러므로, 예를 들면 제1도에서 발현생성물이 소마토스타틴과 대부분의 β-갈락토시다제 폴리펩티드를 함유하는 단백질 전구체이다. ATG는 부가 β-gal단백질의 리보좀 구조가 소마토스타틴 구조유전자를 판독하기 때문에 해독을 시작하기 위해 암호화할 필요가 없다. 전구체 단백질로부터 원하는 폴리펩티드로 전환시키는 간편한 방법으로 브롬화 시아노겐에 의해 특이하게 끊어지는 아미노산인 메티오닌 생성을 위해 ATG암호를 넣어 준다.

제2도는 재조합을 위해 의도된 이종 DNA에서 바람직한 특징을 예로 든 것인데 즉, 결합성 말단의 제공에 관한 것으로 바람직하게는 제한 엔도뉴클레아제 인식부위에 두 나선 중 하나를 함유한다. 전술한 바와같은 이유로 말단은 재조합 후에 각기 다른 인식 부위를 만들도록 고안하는 것이 바람직하다.

여기에서 기술하고 있는 발전은 소마토스타틴 모델을 가지고 성공적인 것으로 판명되었지만, 이는 실제로 어떠한 공지의 아미노산 서열에 대해서도 이종 DNA암호를 서로 사용할 수 있음을 이해하게 될 것이다. 그러므로, 전술한 그리고 후술할 기술을 서로 준용하여 폴리아미노산(예, 폴리루이신 및 폴리알라닌), 효소, 혈청단백질, 진통성 폴리펩티드(예, 동통의 역치를 완화시켜 주는 β-엔돌핀) 등을 제조할 수 있다. 가장 바람직하게는 그렇게 하여 제조된 폴리펩티드가 포유동물의 호르몬 또는 그의 중간체들이다. 그러한 호르몬중에는 예를들어, 소마토스타틴, 사람의 인슐린, 사람과 송아지의 성장호르몬, 황체 호르몬, ACTH, 췌장의 폴리펩티드 등이 언급되어 있다. 그 중간체로는 예를 들어, 사람의 프리프로인슐린, 사람의 프로인슐린, 사람 인슐린의 A 및 B체인 등이 포함된다. 시험관내에서 만들어진 DNA외에 이종 DNA는 mRNA로부터 역복사한 결과 생성된 cDNA릍 함유할 수 있다. 예를들어, Ullrich 등의Science 196,1313(1977)참조.

2. 전구체 단백질의 발현을 위한 재조합체 암호

제1도에서 보는 바와 같이, 발현에 의해 생성된 전구체 단백질은 특이한 이종 구조유전자(소마토스타틴)및 부가단백질(β-갈락토시다제 효소의 일부를 함유)로 이루어져 있다. 소마토스타틴의 아미노산 서열에 인접한 선택적 분해부위는 이어서 불필요한 여분의 단백질로부터 원하는 폴리펩티드를 분리시킨다. 묘사된 경우는 여기에서 기술한 기법에 의해 이용되는 많은 종류의 방법중에서 대표적인 것이다.

가장 흔하게는, 예를들면 미생물 배양에 이어서 플라스미드 또는 기타 베히클의 복사환경의 외부에서 분해시킬 수 있다. 이러한 경우 여분의 불필요한 단백질을 갖는 작은 폴리펩티드의 일시적인 결합이 예를들면, 엔도지너스(endogenous) 효소에 의한 생체내 분해에 대해 그대로 보전될 수도 있다. 동시에 부가 단백질은 통상, 공정중 생체 안정성을 높이면서 세포밖 분해중에 원하는 폴리펩티드의 생체활성을 상실한 것이다. 물론 특별한 경우, 세포내에서 분해되는 것이 바람직할 수 있다. 예를들어, 클로닝 베히클은 전구체 형태의 발현을 위해 암호화된 다른 DNA와 함께 작용하는 인슐린 전구체를 형성형태로 전환시키는 효소에 대한 DNA암호를 가질 수 있다.

바람직한 경우에는, 비록 그 상태가 만족스럽지 않을 경우 경쟁반응에 의해 원하는 생성물이 낮은 수율로 제조된다는 것을 이해하지만, 원하는 특정 폴리펩티드는 불필요한 여분의 단백질을 제거하는데 이용되는 것과 상응하는 내부절단위치가 없다. 원하는 생성물이 메티오닌을 가지지 않는 경우 시안화브롬으로 원하는 서열에 접한 부분에 위치하는 메티오닌을 끊는 방법은 대단히 효과적이다. 마찬가지로 알기닌-및 리신이 없는 생성물 예를들면 트립신 또는 키모트립신을 이용해서 원하는 서열에 인접해 있는 알기닌-알기닌, 리신-리신 등의 결합에서 효소적으로 분해시킬 수 있다. 분해물이 남는 경우, 예를들어 원치 않은 알기닌이원하는 생성물에 붙어 있을 경우, 카복시펩티다제를 사용하여 제거할 수 있다.

트립신을 써서 알기닌-알기닌 결합을 끊을 경우 원하는 폴리펩티드 내에 있는 리신이 먼저 보호되어야 하는데 이때는 말레산 무수물이나 시트라콘산 무수물을 사용한다. 여기에서 예로 언급한 분해기법은 이 분야에서 적용되는 많은 방법 중 대표적인 것일 뿐이다.

프로인슐린과 인슐린을 구분하는 서열을 포함하는 경우처럼 특이한 폴리펩티드의 C-말단 또는 N-말단이거나 또는 폴리펩티드 그 자체 내에 인접하게 분해성 단백질을 발현시킬 수도 있다. 또한, 사용된 베히클은 선택적 분해 위치로 각각 분리된, 원하는 폴리펩티드의 반복서열로 이루어진 단백질을 발현하기 위해 암호화할 수 있다. 그러나, 가장 바람직하게는 도면들에 나타난 경우에서처럼 불필요한 여분의 단백질에 대한 코돈이 원하는 생성물의 구조 유전자보다 먼저 해독한다. 모든 경우에 있어서 레귤론(regulon)에 관련된 적당한 판독대를 유지시켜야 한다.

3. 면역원의 발현

특이한 폴리폡티드와 불필요한 단백질 모두를 발현할 수 있는 능력은 면역성의 물질을 만드는데 유용한 수단이 된다. 폴리펩티드는 "헵텐(hapten)"(즉, 항체등에 특이하게 결합하지만 통상 너무작아 면역반응을 일으키지 않는 결정자를 함유하는 물질)을 면역성을 나타내기에 충분한 크기의 부가 단백질과 연합하여 나타낼 수 있다. 사실, 여기서 예로든 방법으로 생성된 β-갈락토시다제 소마토스타틴 결합물질은 면역성을 나타낼 수 있는 크기이며 소마토스타틴 헵텐을 결합하는 항체를 만들 수 있을 것으로 예상된다. 100개 이상 가장 흔하게는 200개 이상의 아미노산을 함유하는 단백질이 면역성을 나타낸다.

상술한 방법으로 제조된 결합물은 헵텐에 대한 방사성 면역법 또는 기타 검정 및 백신을 만드는데 사용되는 항체를 일으키는데 사용될 수 있다. 후자에 대한 적용방식의 예를 다음에 기술한다. 바이랄(viral) 코트단백질의 시아노겐 브로마이드-또는 기타 분해생성물은 항체와 결합하여 단백질 자체가 증가된 올리고펩티드르 생성한다. 그러한 올리고펩티드 헵텐에 대한 아미노산 서열이 주어지면, 이종 DNA는 면역성을 가지는 부가단백질과의 결합물로서 발현될 수 있다. 백신과 같은 결합물을 사용하면 면역성을 주기 위해 코트단백질 그 자체를 사용하는 부작용을 줄일 수 있다.

4. 조절인자

제1도는 형질전환체 유기체가, 형질전환되지 않은 상태에서 유기체에 동종인 레귤론 조절하에 가져온 이종 DNA로부터 폴리펩티드 생성물을 발현하는 공정을 그리고 있다. 따라서 락토오즈-의존성 콜리의 크로모좀 DNA는 그 중에서도 효소 β-갈락토시다제를 사용하여 락트오즈 소화를 중개하는 락토오즈 또는 "lac"오페론을 함유한다. 특별한 경우에, 락크(lac) 조절인자들은 이 콜리에 대해 감염되기 쉬운 박테리오파아지 λplac 5로부터 수득된다. 바꾸어 말하면, 파아지의 1ac오페론은 같은 종의 박테리아로부터 형질도입에의해 유래되었기 때문에 "동종''이다. 본 발명의 공정에서 사용하기 적당한 동종레귤론은 유기체 본래의 플라스미드성 DNA로부터 유래될 수도 있다.

IPTG(이소프로필티오-β-D-갈락토시다제)에 의해 그 능력이 유도될 수 있는 것과 같이, 락크 프로모터-오퍼레이터 시스템의 단순성과 효율성 때문에 우리가 기술하는 시스템에 그 시스템의 사용을 권장한다. 물론, 그의 다른 오페론이나 부분도 또한 사용할 수 있는데, 예를들면, 람다 프로모터-오퍼레이터, 아라비노스 오페론(phi 80 dara) 또는 콜리친 El, 갈락토오즈, 알칼리성 포스파타제 또는 트립토판 오페론 등이다. 후자(즉, 트립토판 오페론)로부터 얻어지는 프로모터-오퍼레이터는 인돌아크릴산으로 유도하고 수확하는 동안 100%억제를 나타낸다.

5. 플라스미드의 일반적인 제조

제4도에서 도시적으로 설명된 공정의 상세한 설명은 후술한 실험부분에 나와있다. 그러나, 여기에서, 바람직한 실시태양의 재조합 플라스미드를 제조하는데 사용되는 여러가지 기술에 대해 간단히 검토할 필요가 있다.

합성 소마토스타틴 유전자의 클로닝과 발현을 위해 2개의 플라스미드를 사용하였다. 각 플라스미드는 β-갈락토시다제 구조 유전자의 각각 다른 부위에 EcoRI기질 위치를 갖는다(제4도 및 제5도 참조). 이들 플라스미드의EcoRI위치에 합성 소마토스타틴 DNA분절을 삽입하면, 락크 오페론 조절인자의 조절하에 그 분절에 유전정보를 발현시킨다. 소마토스타틴 분절을 이 플라스미드에 삽입한 다음 해독해보면 전체 β-갈락토시다제 소단위 구조(pSOMl1-3)이거나 10개의 아미노산(pSOMl) 이전에 소마토스타틴 폴리펩티드가 생겼다.

플라스미드 제조계획은 잘 특정지워진 클로닝 베히클인 플라스미드 pBR322로부터 시작된다. 이 플라스미드에 락크 인자의 도입은 락크 프로모터, CAP결합위치, 오퍼레이터, 리보조옴결합위치 및 β-갈락토시다제 구조유전자의 처음 7개 아미노산코돈을 운반하는HaeIII제한 엔노뉴클레아제 분절(203뉴클레오티드)을 삽입시켜 수행하였다.HaeIII분절은 λplac 5 DNA로부터 수득했다.EcoRI-분해된 pBR322플라스미드(T₄DNA폴리머라제 및 데옥시리보뉴클레오티드트리포스페이트로 복구된 말단을 갖는다)는HaeIII분절과 블런트-말단 결합시켜 삽입점에서EcoRI말단을 생성시킨다. 이와같은HaeIII과 복구된 EcoRI말단을 결합시켜 각 말단에EcoRI제한부위를 생성시킨다(제4도 및 제5도 참조). 이 DNA로 형질전환된 이 콜리 RR1형질전환체는 5-브로모-4-클로로-인콜릴갈락토시드(X-gal) 배지상에서 테트라사이클린(Tc) 및 암피실린(Ap)에 대해 내성인 것으로 선택하였다. 이러한 지시 배지상에서, 리프레서릍 적정하는 락크 오퍼레이터의 수가 증가함에 따라 β-갈락토시다제의 합성에 대한 콜로니 형성이 그들의 청색에 의해 확인된다. HaeIII분절의 2가지 방향이 가능하며 이들은 분절의Hha제한 위치의 비대칭 위치에 의해 구별되었다. 플라스미드 pBHl0은 락크 오퍼레이터(pBH20)의 말단부위에 있는EcoRI엔도뉴클레아제를 제거하도록 더욱 변형시켰다.

화학적으로 합성된 8개의 올리고데옥시리보뉴클레오티드(제2도)는 5'말단에서 폴리뉴클레오티드 키나제에 의해 [³²p]-r-ATP로 표식하고 T₄DNA리카제와 결합시켰다. 중복된 분절 사이에 수소결합에 의해 소마토스타틴 유전자는 스스로 회합하며 결합성 제한위치 말단 때문에 결국 고분자로 중합된다. 결합된 생성물은EcoRI 및BamHI제한 엔도뉴클레아제로 처리하여 제2도에서 나타난 바와 같이 소마토스타틴 유전자를 제조하였다.

EcoRI 및BamHI말단을 갖는 합성 소마토스타틴 유전자 분절은,EcoRI 및 BamHI제한 엔도뉴클레아제 및 알카리성 포스파제로 미리 처리한 pBH20플라스미드와 결합시켰다. 알카리성 포스파타제로 처리하면 삽입된 분절을 운반하는 플라스미드에게 분자선택성을 제공한다. 이 결합된 DNA로 수득된 암피실린-내성형질전환체는 테트라사이클린 감수성에 대해 스크린시키고 몇개를 적당한 크기의EcoRI-BamHI분절의 삽입에 대한 실험을 하였다.

2개의 클론(clone)으로부터 얻어진 플라스미드의EcoRI-BamHI분절들의 2나선들을,BamHI 및EcoRI 위치로부터 시작하는 뉴클레오티드 서열분석에 의해 분석하였다. 서열분석은 락크-조절인자에게까지 적용시켰고, 락크 분절서열은 완전하였으며 pSOM1경우에, 두 나선의 뉴클레오티드 서열이 서로 무관하게 측정되어 각각 제5A도에 나타난 서열을 갖는다.

락크-조절인자와 함께 pSOM1플라스미드EcoRI-Pst분절을 제거하고 pBR322의EcoRI-Pst분절로 대치시켜 플라스미드 pSOM11을 제조하였다. 락크 오페론 조절부위와 대부분의 β-갈락토시다제 구조유전자를 운반하는 λplac 5의EcoRI분절을 pSOM11의EcoRI에 삽입하였다. λplac⁵의EcoRI락크 분절의 두가지 방향성이 기대되었다. 이들 방향성 중 하나는 소마토스타틴 유전자에 적당한 판독대를 유지시키고 다른 하나는 그렇지 않다. 서로 무관하게 분리된, 소마토스타틴 활성을 나타내는 클론을 분석한 결과 적당한 방향성 유전자를 함유하는 클론들임을 확인하였는데 이중에서 pSOMl1-3으로 표시되는 클론은 하나였다.

6. 미생물

박테리아, 진균류 및 조류등과 같은 각종 단세포 미생물들이 형질전환이 이용되어 왔다. 그것은 배양물 또는 발효물에서 성장할 수 있는 단세포 유기체이기 때문이다. 박테리아가 이용하기에 가장 편리하다. 형질전환에 민감한 박테리아는 예를들어 대장균 및 살모넬라와 같은 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실라세(Bbcillaceae), 뉴모코커스(Pneumococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus) 및 하에모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza e)등이다.

다음에 언급할 실험적 작업을 위해 선택된 특정 유기체는 이 콜리 균주 RRl, 인자형 : Pro-Leu-Thi-R_B-M_BrecA⁺Str^rLacy^-이었다. 이. 콜리 RR1은 Hfr공여체로서 이. 콜리 Kl2균주 KL16을 사용하여 교미시켜 이. 콜리 HBl01(H.W Boyer등J. Mol. Biol.(1969)41,459-472참조)로부터 생성된 것이다. J.H. Miller의Experime nts in Molecular Genetics(Cold Spring Harbor, New York, l972)참조. 이. 콜리 RR1과 이. 콜리 RRl(pBR322)의 배양물은 분양의 제한없이 ATCC(America n Type Culture Collection)에 기탁되었고 기탁번호는 각각 31343 및 31344이다.

사람 인슐린의 경우, A, B나선의 유전자는 이. 콜리 K-12균주 294(A말단, thi^-, hsr^-, hsm_k ⁺)에 의해 수득되며 이 유기체는 A나선(이. 콜리 K-12균주 294[pIA1]의 발현에 사용된다. 사람 인슐린의 B나선은 HBl01의 유도체, 즉, 이. 콜리 K-12균주 D1210 lac⁺(i^Qo+z^ty+)에서 커음으로 발현되었으며 그 B유전자를 함유한 유기체도 마찬가지로 기탁되어 있다. 이와는 달리 B유전자는 먼저말한 균주 294에 삽입되어서 발현될 수 있다.

실험

I. 소마토스다틴

1. 소마토스타틴 유전자 분절의 제조

제2도에서 각각 A내지 H로 표시한 8개의 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 먼저 제조하는데 주로 k. Itakura 등의J. Am. Chem. Soc. 97,7327(1g75)의 수정된 트리에스테르 방법에 의해 제조되었다. 그러나 분절 C,E 및 H의 경우 더 긴 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 만들기 위한 기본단위로 충분히 보호된 트리머를 먼저 제조하는 개량법을 써야 했다. 개량법은 제3도에 도식적으로 나타나 있는데 이 때 B는 티민, N-벤조일화된 아데닌, N-벤조일화된 시토신 또는 N-이소부틸화된 구아닌이다. 요약하면, 그리고 제3도를 참고로 하면, 과량의 I(2밀리몰)과 II (1밀리몰)의 커플링 반응은 강력한 커플링 시약인 2,4,6-트리이소프로필 벤젠설포닌테트라졸리드(TPSTe, 4밀리몰 : 2)의 도움으로 60분 이내에 거의 완결되었다. 2%벤젠설폰산 용액으로 5'-보호기를 제거한 후 CHCl₃에서 수용성 NaHCO₃용액으로 간단한 용매추출을 하여 과량의 3'-포스포디에스테르 모노머IV로부터 5'-하이드록실 다이머(V)를 분리시킬 수 있다. 완전히 보호된 트리머 블럭은 5'-하이드록실다이머 V, I(2밀리몰) 및 TPSTe(4밀리몰)로부터 성공적으로 만들고 실리카겔상에서 크로마토그라피로 분리시켰다(B.T. Hunt 등의Chem. and Ind.(1967) 1868 참조). 개량법에 의해 제조된 트리머의 수율은 표 II에 나와 있다.

[표 2]

완전히 보호된 트리머의 수율

모든 보호기들을 제거한 다음 8개의 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 Permaphase AAX상에서 고압액체 크로마토그라피에 의해 정제하였다(R.A. Henry등J. Chrom. Scis. II, 358(1973)참조). 각 올리고머의 순도를 박층 DEAE-셀룰로즈상에서 호모크로마토그라피하거나 폴리뉴클레오티드 키나제 존재하에 올리고머를 [r-³²p]-ATP로 표식한 후 20%아크릴아미드 슬라브에서 겔-전기영동법으로 검사하였다. 각 DNA분절로부터 하나의 표식된 주생성물을 수득하였다.

2. 소마토스타틴 DNA의 결합 및 아크릴아미드겔 분석

화학적으로 합성된 분절 A내지 H의 5'OH말단은 T₄폴리뉴클레오티드 키나제로 별도로 인산화시켰다. [³²p]-r-ATP를 인산화에 사용하여 반응 생성물이 방사선 도표에 검출될 수 있게 하였다. 카나제와 반응시키기 직전에 [r-³²p]ATP의 25uCi(약 1500Ci/밀리몰)를 0.5ml의 에펜돌프(Eppendorf)관에서 증발건조시켰다. (Maxam 및 Glbert,Proc. Nat, Acad. Sci. U.S.A.74, 1507(1977)참조).

5마이크로그램의 분절을 70밀리몰의 Tris-HC1 pH 7.6, 10밀리몰의 MgC1₂, 5밀리몰 디티오트레이톨 중에서 T₄DNA키나제 2단위(하이드록실아파타이트 획분, 2500단위/ml; 27)와 함께 총부피 150μl로 하여 37℃에서 20분동안 배양시켰다. 결합시킬 목적으로 분절을 최대로 인산화하기 위하여 70밀리몰의 Tris-HCl pH 7.6, 10밀리몰의 MgC1₂, 5밀리몰의 디티오트레이톨, 0.5밀리몰의 ATP 및 두 단위 DNA키나제로 구성된 혼합물 10μl를 가하고 7℃에서 20분간 더 배양시켰다. 분절들(250ng/μl)을 더 처리하지 않고 -20℃에 저장시켰다.

인산화된 분절 A,B,E 및 F(각각 1.25μg)를 20밀리몰의 트리스-HC1 pH7.6, 10밀리몰의 MgC1₂, 10밀리몰의 디티오트레이톨, 0.5밀리몰의 ATP 및 2단위의 T₄DNA리가제(하이드록실아파타이트획분, 400단위/ml; 27) 중에서 총부피를 50μl로 하여 4℃에서 16시간동안 결합시켰다. 분절 C,D,G 및 H도 비슷한 조건에서 결합시켰다. 시료 2μl를 취하여 10%폴리아크릴아미드 겔상에서 전이영동법으로 분석하고 이어서 자동방사능법 (H.L. HeynekerNature등263, 748(1976)참조)으로 분석하는데 이 자동방사능법 에서는 미반응된 DNA분절들이 빨리 이동하는 물질로 나타나고 결합된 분절의 모노머형태는 브로모페놀 청색염료(BPB)와 함께 이동한다. 결합된 분절 A,B,E 및 F 그리고 결합된 분절 C,D,G 및 H의 결합성 말단 때문에 이중합화(dimerization)가 종종 일어난다. 이들 이중합체(dimer)가 가장 천천히 이동하는 물질로 나타나며 각각 제한 엔도뉴클레아제EcoRI와BamHI에 의해 분해될 수도 있다.

두 개의 절반분자(결합될 A+B+E+F와 결합된 C+D+G+H)는 최종부피 150μ1에서 4℃로 16시간에 걸친 추가결합 단계에 의해 결합되었다. 반응 혼합물을 T₄DNA리가제를 불활성화시키기 위해서 65℃에서 15분 동안 가열하였다. 열처리는 DNA혼합물의 이동 패턴에 영향을 주지 않는다. 반응 혼합물에 충분한 엔도뉴클레아제 BamHI를 가하여 37℃에서 30분 내에 소마토스타틴 DNA의 다중체를 분해시켰다. NaC1을 100밀리몰이 되도록 가한 후에 DNA를 EcoRI엔도뉴클레아제로 작용시켰다.

제한 엔도뉴클레아제의 작용은 DNA를 페놀-클로로포름으로 추출하여 종료되었다. 소마토스타틴 DNA분절은 10%폴리아크릴아미드겔상의 예비전기영동 법에 의해 미반응 및 부분적으로 결합된 DNA분절들로부터 정제시켰다. 소마토스타틴 DNA분절을 함유하는 밴드를 겔로부터 잘라내고 DNA를 겔을 작은 조각으로 자르고 65℃에서 하룻밤 용출완충액(0.5몰 암모늄 아세테이트, 10밀리몰 MgCl₂, 0.1밀리몰 EDTA, 0.1%)SDS)으로 DNA를 추출하므로써 용출시켰다. DNA를 2배 부피의 에탄올로 침전시키고, 원심분리한 다음 pH 7.6의 10밀리몰 트리스-HCl 200μ1에 재용해시키고 같은 완충액에 투석시켜 4μg/ml의 농도를 가진 소마토스타틴 DNA를 얻었다.

3. 재조합 플라스미드의 제조

제4도는 소마토스타틴 유전자로 구성된 재조합플라스미드가 제조되는 방법을 도식적으로 나타내며 하기에 더욱 상세히 기술한다.

A. 모(母)플라스미드 pBR322

소마토스타틴 클로닝 실험을 위해 선택된 플라스미드는 pBR322이었으며 이는 항생물질 암피실린(Ap)과 테트라사이클린(Tc)에 내성인 유전자를 가진 작은(분자량 약2.6메가달톤)플라스미드이다. 제4도에 표시한 바와같이, 암피실린 내성 유전자는 제한 엔도뉴클레아제 Pst I에 대한 분해위치를 함유하고 테트라사이클린내성 유전자는 제한 엔도뉴클레아제BamHI에 대한 비슷한 위치를 함유하며EcoRIa위치는 Ap^r및 Tc^r인자사이에 위치한다. 플라스미드 pBR322는 5.8메가달톤의 Ap^rTc^rCol^imm플라스미드인 pBR313으로부터 생긴 것이다(R.L. RodriquezICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology5, 471-77(1g76); R.L. Rodriquez등, Constructi on and Characterization of Cloning Vehicles, inMolecular Mechanismsin the Control of Gene Ex- Pression,등페이 471-77, Academic Press, Inc.(1976)참조). 플라스미드, pBR322는 특성을 나타내며 그의 유도방법이 F. Bolivar등의 "Constru ction and Characterization of New Cloning Vehicless II. A Multipurpose Cloning System",Gene(1977년 11월)에 상세히 기술되어 있다.

B. 플라스미드 pBHl0의 제조

플라스미드 pBR322 DNA 5마이크로그램을 100밀리몰의 트리스-HCl pH 7.6, 100밀리몰의 NaCl, 6밀리몰의 MgC1₂중에서 37℃에서 30분동안 제한 엔도뉴클레아제EcoRI 10단위와 작용시켰다. 페놀-클로로포름 추출에 의해 반응을 종결시킨 다음 DNA를 2배 반 부피의 에탄올로 침전시키고 50μl의 T₄DNA폴리머라제 완충액 (67밀리몰의 트리스-HlCpH 8.8, 6.7밀리몰의 MgCl₂, 16.6밀리몰 (NH₄)₂So₄, 167μg/ml의 송아지 혈청 알부민, dNTP's의 각각 50μM; A. Panet등의Biochem.12, 5045(1973)참조)에 재현탁시켰다. 2단위의 T₄DNA폴리머라제를 가하여 반응을 시작시켰다. 37℃에서 30분간 배양시킨 후 DNA를 페놀-클로로포름으로 추출하여 반응을 종결시키고 이어서 에탄올로 침전시켰다. 3마이크로그램의 λplac⁵DNA(Shapiro등의 Nature 224, 768(1969)참조)를 37℃에서 1시간동안 제한 효소HaeIII(3단위)과 함께 6밀리몰의 트리스-HCl. pH 7.6, 6밀리몰의 MgC1₂, 6밀리몰의 β-메르캅토에탄올 중에서 최종부피를 20μ1로 하여 작용시켰다. 65℃에서 10분동안 가열시키므로써 반응을 중단시켰다.

pBR322처리된 DNA를HaeIII에 침지된 λplac⁵DNA와 혼합하고 20밀리몰의 트리스-Hcl pH7.6, 10밀리몰의 MgCl₂, 10밀리몰의 디티오트레이톨 0.5밀리몰의 ATP에서 최종부피를 30μl로 하여 12℃에서 12시간동안 1.2단위의 T₄DNA리가제(하이드록실아파타이트 획분 : A. Panet등의 상기문헌 조)와 블런트 말단 결합을 하였다. 결합된 DNA혼합물을 10밀리몰 트리스 HC1 pH 7.6에 대해 투석시키고 이. 콜리 균주 RR1의 형질전환에 사용하였다. 형질전환체는 40μg/ml의 5-브로모-4-클로로-인돌릴갈락토시드(X-gal)배지를 함유하는 최소평판 배지상에서 테트라사이클린과 암피실린에 대해 내성인 것으로 선택했다(J.H. Miller Experiments in Molecular Genetics(Cold Spring Harbor, New York 1972)참조). β-갈락토시다제의 합성에 구성성분인 콜로니는 그의 청색에 의해 확인되었다. 45개의 각각 분리된 청색 콜로니를 선별한 후 그중 3개는, 약 200개의 염기쌍에 의해 분리된 2개의EcoRI위치를 갖는 플라스미드 DNA를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 203 b.p. HaeIII락크조절분절내에 비대칭적으로 존재하는HhaI분절의 위치는 이들 플라스미드내에서HaeIII분절(EcoRI분절이 됨)의 방향성을 결정하게 한다(W. Gibert등의 Protein-Ligand Interactions, H. Sand 및 G. Blauer, Eds.(De Gruyter, Berlin, 1675)페이지 193-210참조).

플라스미드 pBHl0은 원하는 방향, 즉 락크복사가 플라스미드의 Tc^r유전자 쪽으로 이루어지는 분절을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

C. 플라스미드 pBH20의 제조

플라스미드 pBH10은 락크 오퍼레이터에서 가장 멀리 떨어진EcoRI위치를 제거하여 변형시켰다. 이것은 약 40개의 염기쌍 정도로만 떨어져 있는 Tc^r과 락크 프로모터 사이에 존재하는 다른EcoRI위치의 RNA폴리머라제에 의해 부분적으로 보호한 가장 먼 위치에서EcoRI엔도뉴클레아제의 선별분해에 의해 수행하였다. RNA폴리머라제를 결합시킨 후 DNA(5μg)를 37℃에서 10분동안 총부피를 10μl로 하여EcoRI(1단위)와 작용시켰다. 65℃에서 10분동안 가열하여 반응을 중단시켰다.EcoRI결합성 말단을 25℃에서 5분동안 25밀리몰의 Na-아서테이트 pH 4.5, 300밀리몰의 NaCl, 1밀리몰의 ZnCl₂에서 S1뉴클레아제와 작용시켰다. 반응혼합물에 EDTA(최종농도 10밀리몰)와 트리스-HCl pH 8(최종농도 50밀리몰)을 가하여 반응을 중단시켰다. DNA를 페놀-클로로포름으로 추출시키고, 에탄올로 침전시킨 다음 100μl의 T₄DNA결합완충액에 재현탁시켰다. T₄DNA리가제(1μl)를 가하고 혼합물을 12℃에서 12시간동안 배양시켰다. 결합된 DNA를 이.콜리 균주 RR1에 형질전환시켰다. Ap^rTc^r형질전환체를 X-gal항생배지상에서 선택하였다. 10개의 분리된 청색콜로니로부터 선별된 DNA의 제한효소에 대해 분석한 결과 이들 콜로니들이 하나의EcoRI위치와 함께 플라스미드 DNA를 갖는다는 것을 알았다. 이들 콜로니중 7개는 락크와 Tc^r프로모터 사이에 위치한EcoRI위치를 보유하였다. 이들 플라스미드의 하나인 pBH20의 락크-조절부위안에EcoRI위치로부터의 뉴클레오티드 서열은 확인되었다. 이 플라스미드는 다음에 소마토스타틴 유전자를 증식(clone)하는데 사용되었다.

D. 플라스미드 pSOM1의 제조

20마이크로그램의 플라스미드 pBH20을 최종부피 500μl로 하여 제한 엔뉴클레아제EcoRI 및BamHI와 작용시켰다.

박테리아성 알칼리성 포스파타제를 가하고 (worthington BAPF 0.1단위), 65℃에서 10분동안 배양시켰다. 페놀-클로로포름으로 추출하여 반응을 종결시켰다. DNA를 2배 부피의 에탄올로 침전시키고, 원심분리한 다음 50μl의 10밀리몰 트리스-HC1 pH 7.6, 1밀리몰 EDTA에 용해시켰다. 알칼리성 포스파라제 처리는EcoRI,BamHI 처리된 pBH20 DNA의 자가 결합을 효과적으로 방지하지만 소마토스타틴 DNA를 함유하는 환상 재조합 플라스미드는 아직도 결합후 형성될 수 있다. 이. 콜리 RR1은 선상 플라스미드 DNA에 의해 매우 낮은 효율로 형질전환되기 때문에 형질전한체의 대부분이 재조합 플라스미드를 함유할 것이다. 5마이크로리터의 소마토스다틴 DNA(4μg/ml)를 20밀리몰의 트리스-HCl pH 7.6, 10밀리몰의 MgCl₂, 10밀리몰의 디티오트레이톨, 0.5밀리몰의 ATP 및 4단위인 T₄DNA리가제를 함유하는 총부피 50μ1증에서 25μ1의BamHI,EcoRI, 알칼리성 포스파라제-처리된 pBH20 DNA와 22℃에서 결합시켰다. 10, 20 및 30분후에 부가의 소마토스타틴 DNA(40ng)를 반응 혼합물에 가했다(소마토스타틴 DNA를 점차적으로 가하면 자가-결합 이상으로 플라스미드에 결합을 잘한다).

1시간동안 계속 결합시키고 혼합물을 10밀리몰의 트리스-HCl pH 7.6에 대해 투석하였다. 대조 시험에서는,BamHI,EcoRI 알칼리성 포스파타제-처리된 pBH20 DNA를 비슷한 조건하에 소마토스타틴 DNA부재하에 결합시켰다. 두제제 모두 더이상 처리하지 않고 이. 콜리 RR1을 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환 실험은 p³물리적 봉쇄설비에서 실시하였다(National Institutes of Health, U.S.A. Recombinant DNA Research Guidelines, 1976참조). 형질전환체는 20μg/ml Ap와 40μg/ml X-gal을 함유하는 최소 평판배지상에서 선택하였다. 모두 Tc에 민감한 10개의 형질전환체를 분리하였다. 참고로 이들을 pSOMl, pSOM2, ...pSOMl0으로 표시하였다. 대조실험에서는 형질전환체가 하나도 얻어지지 않았다. l0개의 형질전환체 중 4개는EcoRI 위치와BamHI위치를 모두 갖는 플라스미드를 함유하였다. 이들 재조합 프라스미드의 작은EcoRI,BamHI분절의 크기는 4경우 모두 실험관 내에서 제조된 소마토스타틴 DNA의 크기와 비슷했다.

Maxam 및 Gilbert의Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560(1977)에 따른 염기서열의 분석한 결과 플라스미드 pSOM1은 원하는 소마토스타틴 DNA분절이 삽입되었음이 밝혀졌다.

플라스미드 pSOM1을 운반하는 클론의 DNA서열에 대한 분석을 하면 소마토스타틴을 함유하는 펩티드를 생성할 수 있다는 것을 알 수 있다. 그러나, 세포 추출물이나 배양상등액에서 소마토스타틴의 방사성 면역활성은 검출되지 않았고 배양물을 직접 70%포름산과 시아노겐 브로마드에 가했을 때도 소마토스타틴의 존재는 검출되지 않았다. 이. 콜리 RR1추출물은 외인성 소마토스타틴을 매우 빨리 분해시킨다는 것이 관찰되었다. 플라스미드 pSOM1을 가진 클론에서 소마토스타틴 활성은 없다는 것은 내인성 단백질 가수분해 효소에 의해 세포내 분해의 결과인 것이다. 플라스미드 pSOM1은 소마토스타틴을 함유하는 전구체 단백질에 대한 플라스미드 암호를 제조하는데 사용되며 이는 단백질 가수분해를 막을만큼 충분히 크다.

E. 플라스미드 pSOMl1과 pSOM11-3의 제조

플라스미드는 소마토스타틴 유전자가 단계적으로 해독을 하면서 β-갈락토시다제 유전자의 C-말단에 위치할 수 있도록 제조하였다. 이 유전자의 C-말단 근처에 있는EcoRI위치와 이 단백질의 유용한 아미노산 서열(B. Polisky등의Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 73,3900(1976); A.V. Fowler 등의 Id. at 74, 1507(1976); A.I. Bukhari 등의Nature New Bio1ogy 243, 238(1973) 및 K.E. Langley,J. Biol. Chem. 250,2587(l975)참조)이 있기 때문에 적당한 판독대를 유지하면서EcoRI,BamHI 소마토스타틴 유전자를EcoRI위치에 삽입시킬 수 있었다.

그러한 플라스미드를 제조하기 위하여 pSOMl DNA(50μg)을 최종부피로 l00μl하여 제한효소EcoRI 및PstI와 작용시켰다.

락크-조절인자를 가진 소분절로부터 소마토스타틴 유전자를 가진 커다란 Pst-EcoRI분절을 분리시키는데 예비 5%폴리아크릴아미드겔을 사용하였다. 커다란 밴드를 겔에서 잘라낸 다음, 겔을 소편으로 자르고 65℃에서 하룻밤 동안 DNA를 추출하여 DNA를 용출시켰다. 비슷한 방법으로 플라스미드 pBP322 DNA(50μg)를PstI 및EcoRI제한 엔도뉴클레아제와 작용시키고 생성된 2개의 DNA분절을 5%폴리아크릴아미드 겔상에서 예비전기영동에 의해 정제시켰다. pBR322로부터 부득된 작은PstI-EcoRI분절을, 12℃에서 12시간동안 1단위의 T₄DNA리가제와 함께, 최종부피 50μ1로 하여, pSOM1로부터 수득된 커다란PstI-EcoRI DNA분절(5μg)과 결합시켰다.

이. 콜리 RR1를 형질전환시키는데 결합된 혼합물을 사용하였고 형질환체는 X-gal배지상에서 암피실린에 내성인 것으로 선택하였다. 예상한 바대로, 대부분의 Ap^r형질전환체(95%)가 지시판상에서 흰색 콜로니(락크 오퍼레이터가 없음)을 나타냈다.

생성된 플라스미드 pSOM11은 플리스미드 pSOM11-3의 제조에 사용되었다. 5μg의 pSOM11 DNA와 5μg의 λpIac⁵DNA의 혼합물을 37℃에서 30분동안 10단위의EcoRI와 작용시켰다.

페놀-클로로포름 추출에 의해 제한 엔도뉴클레아제 작용을 종결시켰다. 그런 다음 DNA를 에탄올로 침전시키고 T4DNA리가제 완충액 50μl에 재현탁시켰다. 1단위의 T4 DNA리가제를 혼합물에 가하고 12℃에서 12시간동안 배양하였다. 결합된 혼합물을 10밀리몰의 트리스-HCl pH 7.6에 대해 투석하고 이. 콜리 균주 RR1을 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환체는 암피실린을 함유하는 X-ga1배지상에서 Ap^r인 것으로 선택하고 β-갈락토시다제 생산에 사용하기 위해 선별했다. 콜로니의 약 2%가 청색(pSOM11-1, 11-2등)이었다. 이들 콜로니로부터 수득된 플라스미드 DNA의 제한효소분석을 한 결과 모든 플라스미드가 약4.4메카달톤의 새로운EcoRI분절을 가졌으며 이 분절은 락크 오페론조절 위치와 대부분의 β-갈락토시다제 유전자를 갖는 것을 알았다. 이EcoRI분절은 2가지 방향성이가능하기 때문에HindIII제한 위치의 비대칭위치는 이들 콜로니 중에서 어느 것이 소마토스타틴 유전자 내에서 락크 복사를 진행시키면서 이EcoRI분절을 운반분하는지를 결정하는데 사용하였다.HindIII-BamHI이중작용은 플라스미드 pSOM11-3, pSOM11-5, pSOM11-6 및 pSOM11-7을 가진 클론들만 이 방향성의EcoRI분절을 함유한다는 것을 말해 주었다.

4. 소마토스타틴 활성에 대한 방사성 면역 검정

소마토스타틴에 대한 표준방사성 면역검정법(RIA) [A. Arimura등Proc. Soc. Exp. Biol Med148, 784(1975)참조]은 검정부피를 줄이고 인산 완충용액을 사용하여 변형시킨 것이다. Tyr¹¹소마토스타틴은 클로라민 T공정을 사용하여 요오드화시켰다. 소마토스타틴을 분석하기 위하여 통상 5mg/ml의 시아노겐 브로마이드를 함유하는 70% 포름산 중의 시료를 원추형의 폴리프로필렌관(0.7ml, Sarstedt)에서 진공하에 축축한 KOH상에서 건조시켰다. PBSA완충용액(75mM NaC1; 75mM나트륨 포스페이트, pH 7.2; lmg/ml의 송아지 혈청 알부민; 0.2mg/ml나트륨 아자이드) 20μl를 가한 다음 [¹²⁵I]소마토스타틴 "혼합물" 40μl와 1,000배로 희석한 토끼의 항 소마토스타틴 면역혈청 S39(vale등, Metabolism 25, 1491(1976) 참조) 20μl를 가했다. [¹²⁵I]소마토스타틴 혼합물은 PBSA완충용액 ml당 250μg의 정상 토끼의 감마글로부린(Antibodies, Ind.) 1500단위의 단백질 분해효소 억제제("Trasylol", Calbiochem) 및 약 100,000수의 [¹²⁵I]Tyr¹¹소마토스타틴을 함유하였다. 실온에서 16시간이상 지난 후, PBSA완충용액의 염소 항-토끼 감마글로부린(Antibodies, Inc., p=0.03) 0.333ml을 시료관에 가했다. 혼합물을 37℃에서 2시간동안 배양하고, 5℃로 냉각한다음 5분동안 10,000Xg에서 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 펠렛을 감마 카운터로 세었다. 사용된 항혈청 양과 함께 카운트의 20%가, 표식되지 않은 경쟁 소마토스타틴 없이 침전하였다. 무수한 소마토스타틴(200ng)과 함께 배경은 통상 3%이었다. 소마토스타틴이 10pg일 때 가장 경쟁이 심했다. 이. 콜리 균주 RR1(수용균주)의 추출물을 사용한 초기실험에 의하면, 16μg이상의 시아노겐 브로마이드-처리된 박테리아성 단백질 존재하에 10pg이하의 소마토스타틴을 쉽게 검출할 수 있었다. 포름산-처리된 박테리아성 추출물로부터 2μg이상의 단백질이 있으면 배경의 증가로 다소 방해를 받지만 시아노겐 브로마이드 분해가 이러한 방해를 상당히 감소시켰다. 재제조실험으로 소마토스타틴이 시아노겐 브로마이드 처리된 추출물에서 안정된다는 것을 알았다.

A. 박테리아성 추출물에 의한 경쟁

균주 이. 콜리 RR1(pSOM11-5) 및 이.콜리 RR1(pSOM11-4)을 루리아(Luria)배지에서, 37℃에서 5×10⁸세포/ml가 될 때까지 성장시켰다. 그런 다음 IPTG를 가하여 1밀리몰을 만들고 2시간 동안 계속 성장시켰다. 1ml씩의 수액들을 에펜돌프 원심분리기에서 수초동안 원심분리시키고 폘렛들을 5mg/m1의 시아노겐 브로마이드를 함유하는 70%포름산 500μl에 현탁시켰다. 실온에서 24시간 지난 후, 수액들을 물로 10배 희석시키고 제6A도에 표시된 용량을 취하여 소마토스타틴에 대해 3증으로 검정했다. 제6A도에서 "B/Bo"는 시료존재하의 [¹²⁵I] 소마토스타틴의 범위와 경쟁하는 소마토스타틴 부재하의 그 범위와의 비율이다. 각점은 3개 관의 평균이다. 희석되지 않은 시료의 단백질 함량은 이. 콜리 RR1(pSOM11-5) 경우에는 2.2mg/ml이고, 이. 콜리 RRI(pSOM-4)의 경우에는 1.5mg/ml이었다.

B. 소마토스타틴을 위한 pSOM11 클론의 초기선별

11클론들(pSOM11-2, pSOM11-3등)의 시아노겐 브로마이드-처리된 추출물을, 제6A도의 경우에 대해 상술한 바와 같이, 만들었다. 30마이크로리터의 각 추출물을 취하여 방사성 면역검정을 3중으로 실시하였다(그 결과는 제6B도에 나와 있다).

검정 분석점의 범위가 표시되어 있다. 소마토스타틴의 피코그램(pg)에 대한 값은 같은 실험의 부분으로 얻어진 표본 곡선으로부터 읽었다.

이렇게 하여 수득된 방사성면역검정의 결과는 하기와 같이 요약될 수 있다. pSOM1에 대한실험결과와 달리, 4개의 클론들(pSOM11-3, 11-5, 11-6 및 11-7)이 쉽게 감지할 수 있는 소마토스타틴 방사성 면역활성을 가졌음을 알아냈다(제6A도 및 제6B도). 제한 분절을 분석한 결과 pSOM11-3, pSOM11-5, pSOM11-6 및 pSOM11-7은 락크 오페론의 원하는 방향성을 갖는 반면에 pSOM11-2 및 pSOM11-4는 반대 방향성을 갖는다는 것을 알았다. 그러므로, 락크 오페론의 정확한 방향성과 소마토스타틴 방사성면역활성의 생성사이에 완벽한 상호관계가 있는 것이다.

C. 양성 및 음성클론상에서 IPTG유도와 CNBr분해의 효과

소마토스타틴 플라스미드의 모양으로 보아, 소마토스타틴은 락크오페론의 조절하에 합성된다는 것을 예견할 수 있다. 락크 리프레서 유전자는 플라스미드에 포함되지 않으며 수용균주(이. 콜리 RR1)는 세포당 10내지 20리프레서 분자만을 생성하는 야생성 크로모조말 락크 리프레서 유전자를 함유한다. 플라스미드 복사수(따라서 이는 락크 오퍼레이터의 수도 된다)는 세포당 약 20 내지 30이며 따라서 완전한 억제는 불가능하다. 표 III에 나타난 바와 같이, 이. 콜리 RR1(pSOM11-3)에서의 소마토스타틴의 특이한 활성은 IPTG(락크 오페론의 유도물질임)에 의해 증가되었다. 예상한 것처럼 유도율은 매우 낮았으며, 2.4 내지 7배정도로 다양하다. 실험 7(표 III)에서 β-갈락토시다제의 처음 92개의 아미노산을 측정한 활성도도 역시 두가지 인자에 의해 유도되었다. 몇가지 실험에서 소마토스타틴 방사성 면역활성은 전체 세포의 단백질을 시아노겐브로마이드로 분해하기 전에 검출할 수 없었다. 방사성 면역검정에서 사용된 항혈청인 S39는 유리된 N-말단의 알라닌을 필요로 하므로 시아노겐 브로마이드로 분해하기 전에는 활성을 기대할 수 없었다.

[표 III]

소마토스타틴 방사성면역 특이활성

약자 : 루리아 배지(LB); 이소프로필티오갈락토시드(IPTG); 시아노겐 브로마이드(CNBr); 소마토스타틴 (SS)

단백질은 Bradford의Anal. Biochem.72, 248(1976)의 방법에 의해 측정되었다.

*보겔-보너(Vogel-Bonner) 최소배지 +글리세롤

D. 시아노겐 브로마이드로 처리한 추출물의 겔여과

양성 클론(pSOM11-3, 11-5, 11-6 및 11-7)의 포름산과 시아노겐으로 처리한 추출물을 모으고(총부피 250μl), 건조시킨 다음 50%초산 0.1ml에 재현탁시켰다. [³H] 루이신을 가하고 시료를 50%초산 중에서 세파덱스 G-50의 0.7×47cm컬럼에 적용시켰다. 컬럼 획분의 50마이크로리터씩의 수액들을 소마토스타틴에 대해 검정하였다. 음성 클론 추출물(11-2, 11-4 및 11-11)을 모아서 동일하게 처리했다. 결과는 제5C도에 나와 있다. 동일한 컬럼상에서 공지의 소마토스타틴(Beckman Corp.)을 지시된 바와 같이 (SS) 용출한다. 이러한 시스템에서, 소마토스타틴은 배제된 큰 펩티드들로부터 잘 분리되어 작은 분자들을 함유한다. 소마토스타틴에 대해 양성인 클론의 추출물만이 컬럼 획분에서 방사성 면역활성을 나타냈으며 이 활성은 화학적으로 합성된 소마토스타틴과 같은 위치에서 용출되었다.

[활성정보의 요약]

소마토스타틴 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드의 합성에 대한 데이타는 다음과 같이 요약된다.

(1) 소마토스타틴 방사성면역활성은 플라스미드 pSOM11-3을 갖는 이. 콜리 세포에 존재하며 이 플라스미드는 올바른 서열의 소마토스타틴 유전자를 함유하고 락크EcoRI DNA분절의 올바른 방향성을 갖는다. 관련된 플라스미드 pSOM11-2(이는 동일한 소마토스타틴 유전자를 갖고 있으나 락크EcoRI분절의 반대 방향성을 갖는다)를 가진 세포들은 감지될 만한 소마토스타틴 활성을 나타내지 않는다.

(2) 도표로 전술한 바와 같이 세포 추출물을 시아노겐 브로마이드로 처리하기 전까지는 소마토스타틴 방사성 면역 활성이 나타나지 않는다.

(3) 소마토스타틴 활성은, 락크 오페론의 유도물질인 IPTG에 의해 유도된 것에 의해 증명된 바와 같이 락크 오페론의 조절을 받는다.

(4) 소마토스타틴 활성은 세파덱스 G-50상에서 공지의 소마토스타틴과 함께 공(co)-크로마토그라피한다.

(5) 증식된 소마토스타틴 유전자의 DNA서열은 올바르다. 만일 단계적으로 해독이 되지 않으면 각 지점에서 소마토스타틴과 다른 펩티드가 만들어질 것이다. 방사성 면역 활성이 나타난다는 것은 소마토스타틴과 밀접한 관계를 가진 펩티드가 만들어진다는 사실을 뜻하며 해독이 제대로 이루어져야 한다. 해독이 올바로 일어나기 때문에 유전암호가 소마토스타틴의 올바른 결합서열을 가지는 펩티드를 형성할 수 있게 지시한다.

(6) 마지막으로 상기 이. 콜리 RR1(pSOM11-3) 추출물의 시료는 쥐의 뇌하수체 세포로부터 성장호르몬의 유리를 억제하는 반면에 나란히 제조된 이. 콜리 RR1(pSOM11-2)의 시료(동일한 단백질 농도를 지님)는 성장호르몬의 유리에 영향을 주지 않는다.

[소마토스타틴의 안정도, 수율 및 정제]

EcoRI락크 오페론 분절(pSOM11-2, pSOM11-3등)을 가진 균주를 플라스미드 페노타입에 대해 분리한다. 예를 들어, 약 15세대를 지난 후에 이. 콜리 RR1(pSOM11-3) 배양물의 약 절반이 β-갈락토시다제의 구성요소이었으며 즉, 락크 오퍼레이터를 지니며 이들 중 약 절반이 암피실린에 내성을 나타냈다. 소마토스타틴에 대해 양성인 균주(pSOM11-3)와 음성인 균주(pSOM11-2)는 불안정하므로 성장의 결점은 크지만 불완전하고 불활성인 갈락토시다제를 과잉생성하는데서 오는 것이다.

소마토스타틴의 수율은 총세포 단백질에 대해 0.001 내지 0.03%로 다양하며(표 I) 이는 락크 부위가 제거된 플라스미드를 가진 배양물에서 세포를 선택한 결과인 것 같다. 암피실린에 내성이고 구성 요소인 단일 콜로니로부터 성장하기 시작하는 제제의 경우 가장 높은 수율로 소마토스타틴을 얻었다. 이러한 경우에서조차도 수확시 30%의 세포가 락크 부위가 없었다.

냉동상태(동결건조)에서의 보존과 그러한 단일 콜로니로부터 성장이 기술된 시스템에 대해 지시된다. 수율은, 예를들면 전구체 단백질의 발현을 유도 및 수확하기 전에 완전히 억제시키도록 락크 리프레서를 과잉 생성하는 박테리아성 균주에 의해 증가시킬 수 있다. 이와는 달리, 전술한 바와 같이 트립토판 또는 통상 완전히 억제되는 다른 오퍼레이터-프로모터 시스템을 사용할 수도 있다.

예를들어 이톤 프레스(Eaton Press)에서 세포를 분쇄하여 생성된 불순한 추출물에서 β-갈락토시다제-소마토스타틴 전구체 단백질은 불용이고 낮은 원심분리속도의 처음 펠렛에서 발견된다. 활성도는 70% 포름산, 6몰의 구아니디듐 하이드로클로라이드 또는 2% 나트륨 도데실 설페이트에 용해될 수 있다. 그러나, 가장 바람직하게는 이톤 프레스로부터의 불순한 추출물을 8M의 우레아로 추출하고 잔사를 시아노겐 브로마이드로 분해시킨다.

최초 실험에서, 이. 콜리 균주 RR1(pSOM11-3)으로부터 유래된 소마토스타틴 활성은 분해생성물을 알코올로 추출하고 50%초산에서 세파덱스 G-50상에서 크로마토그라피시켜 약 100배 강화시켰다. 생성물을 세파덱스 G-50상에서 다시 크로마토그라피하고 고압 액체 크로마토그라피하여 상당히 순수한 소마토스타틴을 수득할 수 있다.

II. 사람의 인슐린

전술한 기술들은 사람의 인슐린을 제조하는데 사용하였다. 따라서 인슐린 B체인(104염기쌍)과 인슐린 A체인(77염기쌍)에 대한 유전자들을 사람의 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 고안되었으며 각각EcoRI 및BamHI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일나선 결합성 말단을 가지며 각각 pBR322 플라스미드 내로 별도로 삽입할 수 있도록 고안되었다. 합성 분절인 10 내지 15개짜리 뉴클레오티드는 빌딩 블록으로서 트리뉴클레오티드를 사용하는 블록 포스포트리에스테르 방법으로 합성되며, 고압액체 크로마토그라피(HPLC)로 정제하였다. 사람의 인슐린 A 및 B체인을 합성하는 유전자는 플라스미드 pBR322에서 따로따로 증식되었다. 증식된 합성 유전자를 효율적인 복사, 해독, 그리고 안정한 전구체 단백질을 만들기 전에 이.콜리 β-갈락토시다제 전구체로부터 분해되었고 방사성 면역 분석법으로 검출한 다음 정제되었다.

인슐린 방사성 면역검정의 활성은 이. 콜리 생성물을 혼합하여 발생시켰다.

1. 사람 인슐린 유전자의 고안과 합성

사람 인슐린을 구성하는 유전자들은 제9도에 표시되어 있다. 사람 인슐린의 A 및 B체인에 대한 유전자는 사람 폴리펩티드의 아미노산 서열로부터 고안되었다. 각 유전자의 5'-말단은 각 유전자가 플라스미드 pBR322에 정확히 삽입되게 하기 위해 EcoRI 및 BamHI제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일나선 결합성 말단을 갖는다. HindIII엔도뉴클레아제 인식위치를 B체인 인자 모두가 구성되기 전에 아미노산 서열 Glu-Ala에 대한 B체인 유전자의 중간부분에 삽입시켜 유전자의 각 전반을 확대하고 확인할 수 있게 하였다. B체인 및 A체인 유전자들은 10개 내지 15개까지의 서로 다른 29개의 올리고데옥시리보뉴클레오티드로부터 구성되도록 고안했다. 각 화살표는 개량된 포스포트리에스테르 방법에 의해 분절을 나타내는데 H1내지 H8 및 B1 내지 B12는 B체인 유전자에 대한 것이고 A1 내지 A11은 A체인 유전자에 관한 것이다.

2. 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 화학적 합성

올리고데옥시리보뉴클레오티드 합성을 위한 물질 및 방법들은 Itakura, k.등의J. Bio1. Chem.250, 4592(1975) 및 Itakura, k.등의J. Amer. Chem. Soc.,97, 7327(1975)에 기재된 것과 거의 동일하다.

(a) 완전히 보호된 모노뉴클레오티드인 5'-O-디메톡시트리틸-3'-p-클로로페닐-β-시아노에틸 포스페이트는 1-메틸 이미다졸 존재하에 아세토니트릴 중에서 단일작용성 인산화제인 p-클로로페닐-β-시아노에틸 포스포로클로리데이트(1.5몰당량)를 사용하여 뉴클레오시드 유도체로부터 합성되었다(Van Boom, J.H.등의 Tetradron 31, 2953(1975)참조). 생성물은 예비 액체 크로마토그라피(Prep 500LC, Waters Associates)에 의해 대규모(100 내지 300g)로 분리시켰다.

(b) 용매 추출법 (Hirose, T.등의 Tetrahedron Letters, 2449(1978)참조)에 의해 32개의 이작용성 (bifunctional) 트리머를 5 내지 10밀리몰 규모로 합성하였고(표 IV참조), 13개의 트리머, 3개의 테트라머 및 4개의 다이머(3'말단블럭으로서)를 1밀리몰 규모로 합성하였다. 완전히 보호된 트리머의 동종성은 실리카겔 상에서 2가지의 메탄올/클로로포름용매계(용매 a는 5% v/v이고 용매 b는 10% v/v이다)에서 박층 크로마토그라피하여 조사했다(표 IV참조). 이러한 화합물로부터 출발하여 규정된 서열의 올리고데옥시리보뉴클레오티드 29개를 합성하였는데 18개는 B체인 유전자에 대한 것이고 11개는 A체인 유전자에 관한 것이다.

[표 IV]

* 완전히 보호된 트리데옥시뉴클레오티드; 5'-O-디메톡시트리틸-3'-p-클로로페닐-β-시아노에틸 포스페이트

** 수율은 5'-하이드록실모노머로부터 계산된 총수율이었다.

*** HPLC분석을 기준으로 했음.

폴리뉴클레오티드를 구성하는데 사용된 기본단위는 2가지 형태의 트리머인데 즉, 표 IV의 이 작용성 트리머 블럭과 3'-하이드록시에서 아니소일 그룹에 의해 보호된 상응하는 3'-말단 트리머이었다. 이 작용성 트리머는 피리딘-트리에틸아민-물(3 : 1 : 1 v/v)의 혼합물에 의해 상응하는 3'-포스포디에스테르 성분으로 가수분해 되었으며 2%벤젠설폰산에 의해서는 상응하는 5'-하이드록실 성분으로도 가수분해되었다. 전술한 3'-말단 블럭을 2%벤젠설폰산으로 처리하여 상응하는 5'-하이드록실을 수득했다.

그러나, 과량의 3'-포스포디에스테르 트리머(1.5몰당량)와 5'-하이드록실 성분(1몰당량)과의 커플링 반응은 2,4,6-트리이소프로필벤젠설포닐 테트라졸리드(TPSTe, 3 내지 4당량) 존재하에 거의 3시간 이내에 완결시켰다. 과잉의 3'-포스포디에스테르 블럭반응물을 제거하기 위하여, 반응 혼합물을 규화된 유리여과기상에 설치된 짧은 실리카겔 컬럼을 통과시켰다. 약간의 부산물과 커플링 시약을 용출시키기 위해 컬럼을 처음에는 CHCl₃로 세척하고, 다음에는 완전히 보호된 올리고머 대부분을 용출시키는 CHCl₃: MeOH(95 : 5 v/v)로 세척하였다. 이러한 조건에서 전하를 띤 3'-포스포디에스테르 블럭 반응물만 컬럼에 남았다. 유사하게 원하는 길이가 될 때까지 블럭 커플링을 반복하였다.

고압액체 크로마토그라피(HPLC)는 올리고뉴클레오티드 합성동안 널리 사용되는데 즉, a) 각 트리머와 테트라머의 분석, b) 중간체 분절의 분석(헥사머, 노나머 및 데카머), c) 마지막 커플링 반응의 분석 및 d)최종생성물의 정제에 사용된다.

HLPC는 Spectra-Physics 3500B 액체 크로마토그래프를 사용하여 수행했다. 50℃에서 농 NH₄OH로 6시간, 실온에서 80% AcOH로 15분동안 처리하여 모든 보호기를 제거한 후 Permaphase AAX(듀퐁)컬럼(1m×2mm)상에서 용매 A(0.01M KH₂PO₄, pH 4.5) 중에서 용매 B(0.05M KH₂PO₄-1.0M KCl, pH 4.5)의 선상농도 구배를 사용하여 화합물을 분석하였다[Van Boon, J. 등의J. Chromatography 131, 169(1977)참조]. 농도구배는 완충액 A로 시작하어 매분당 3%의 완충액 B를 적용시켜 이룩했다. 용출은 60℃에서 매분당 2m1의 유출속도로 수행했다. 29개의 최종 올리고뉴클레오티드의 정제도 상술한 바와 같은 조건에서 Per AAX maphase상에서 수행했다. 원하는 피크물질을 모아서 투석에 의해 염을 제거한 다음 동결건조시켰다. T₄폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 5'말단을 (r-³²p)ATP로 표식한 후 20% 폴리아크릴 아미드 겔에서 전기영동법으로 각 올리고뉴클레오티드의 동종성을 조사했다.

3. B체인 유전자와 A체인 유전자의 회합과 클로닝

인슐린의 B체인에 대한 유전자는, 왼쪽말단에는EcoRI제한위치를, 중간에는HindIII위치를, 그리고 오른쪽 말단에는BamHI위치를 갖도록 고안하였다. 이것은 왼쪽의EcoRI-HindIII반쪽(BH)과 오른쪽의HindIII-BamHI반쪽(BB)이 모두 편리한 클로닝 베히클 pBR322에서 따로따로 증식될 수 있으며 그들의 서열이 확인된 후 결합하여 완벽한 B유전자를 이루었다(제10도 참조). BB반쪽은 제9도에서 B1 내지 Bl0 으로 표식되고, 포스포트리에스테르 화학 합성에 의해 만들어진 10개의 올리고데옥시리보뉴클레오티드로부터 결합에 의해 회합되었다. B1 내지 B10은 인산화된 것이 아니므로 그들의 결합성 말단(HindIII 및BamHI)에 의한 이들 분절의 원하지 않는 중합을 줄일 수 있다. 예비 아크릴아미드겔 전기영동법으로 정제하고 가장 큰 DNA밴드를 용출시킨 후 BB분절을HindIII과BamHI로 분해된 플라스미드 pBR322에 삽입시켰다.

DNA로부터 유도된 암피실린 내성 콜로니의 약 50%가 테트라사이클린에 대해 민감했으며 이는 비플라스미드HindIII-BamHI분절들을 나열해 본 결과 고안된 것과 동일함을 알았다.

BH분절을 비슷한 방법으로 제조하여EcoRI 및HindIII제한 엔도뉴클레아제로 분해된 pBR322에 삽입시켰다. 3개의 암피실린 내성, 테트라사이클린 감수성 형질전환체(pBH1 내지 pBH3)로부터 얻은 플라스미드를 분석했다.EcoRI-HindIII의 작은 분절들은 예상했던 뉴클레오시드 서열을 갖는다는 것을 알았다.

A체인 유전자는 세 부분으로 이루어져 있다. 왼쪽에 4개, 중간에 4개 그리고 오른쪽이 4개의 올리고뉴클레오티드(제9도 참조)를 따로 따로 결합시킨 다음 혼합하고 이들을 결합시켰다(올리고뉴클레오티드 A1 및 A12는 인산화되지 않았음). 화합된 A체인 유전자를 인산화시키고 겔 전기영동에 의해 정제시킨 다음EcoRI-BamHI 위치에서 pBR322에 클론시켰다. 2개의 암피실린에 내성이고 테트라사이클린에 민감한 2개의 클론(pA10, pA11)으로부터 수득된EcoRI-BamHI분절들은 목적하는 A유전자 서열을 포함하였다.

4. A와 B인슐린 유전자의 발현을 위한 플라스미드의 제조

제10도는 락크-인슐린 B플라스미드(pIBl)의 제조를 설명하고 있다. 플라스미드 pBH1과 pBB101을EcoRI 및HindIII엔도뉴클레아제와 작용시켰다. pBH1의 작은 BH분절과 pBB101의 큰 분절(BB분절과 대부분의 pBR322를 함유하는)을 겔 전기 영동에 의해 정제하고, 혼합한 다음EcoRI-분해된 λplac⁵존재하에 결합시켰다. λplac⁵의 메가달톤 EcoRI분절은 락크 조절부위와 대부분의 β-갈락토시다제 구조 유전자를 함유한다. 제한 위치의 구성은 BH가 BB와 제대로 결합하도록 해준다. 락크EcoRI분절은 2개의 방향으로 삽입할 수 있다. 그러므로 형질변환후에 수득된 클론의 절반만이 원하는 방향성을 가진다. 암피실린에 내성이고 β-갈락토시다제 구성요소인 10개의 클론의 방향성을 제한 : 분석에 의해 조사하였다. 이들 콜로니중 5개는 완전한 B유전자 서열과 β-갈락토시다제 유전자로부터 B체인 유전자로 정확한 판독대를 함유하였다. 다음 실험용으로 pIB1하나만을 선택하였다.

비슷한 실험에서, λplac⁵로부터 얻은 4.4메가달톤의 락크분절을EcoRI위치에서 pAII플라스미드에 도입시켜 pIA1을 제조했다. pIAl은 pIB1과 동일한데 단지 A유전자 분절이 B유전자분절로 대치된 것만 다르다. DNA서열 분석결과 정확한 A 및 B체인 유전자 서열이 각각 pIA1 및 pIB1에 들어 있다는 것을 알았다.

5. 발현

β-갈락토시다제에 정확하게 부착된 인슐린 유전자를 함유하는 균주들은 α-갈락토시다제 크기의 단백질을 대량 생성한다. 총 세포단백질의 약 20%가 이 α-갈락토시다제-인슐린 A또는 B체인 하이브리드(hybrid)이었다. 하이브리드 단백질은 불용성이고 낮은 속도의 첫번째 폘롓에서 발견되었으며 이 팰렛에서 하이브리드 단백질은 총 단백질의 약 50%를 차지한다.

인슐린 A 및 B체인의 발현을 탐지하기 위하여, 본 발명에서는 각 체인들로부터 완전한 인슐린의 재조성에 근거를 둔 방사성면역검정(RIA)을 사용하였다. 27-마이크로리터의 검정부피를 적용시킬 수 있는 Katsoyannis등의 Biochemistry 6, 2642-2655(1967)의 인슐린 재조성 과정은 매우 적당한 검정법이다. 쉽게 검출할 수 있는 인슐린 활성은 인슐린 체인의 S-설폰화된 유도체를 혼합하고 재조성한 후에 나타난다. 인슐린의 각 S-설폰화된 체인들은, 환원 및 산화후에, 사용된 항-인슐린 항체와 현저한 반응을 일으키지 않는다.

재조성 검정을 하기 위하여 β-갈락토시다제-A 또는 B체인 하이브리드 단백질을 부분적으로 정제하고 시아노겐 브로마이드로 분해한 다음 S-설폰화된 유도체를 만들었다.

사람 인슐린에 대한 화학적으로 합성된 유전자를 올바르게 만들었다는 증거는 다음과 같이 요약할 수 있다.

(a) 방사성 면역 활성이 두체인 모두에서 검출되었다.

(b) 클로닝과 플라스미드 조성 후에 수득된 DNA서열이 고안한 대로 맞다는 것을 직접 확인되었다. 방사성 면역활성이 얻어졌으므로 해독은 제대로 된 것임에 틀림없다. 그러므로 유전암호는 사람 인슐린의 서열을 가진 펩티드가 생성되고 있음을 탐지한다.

(c) 시아노겐 브로마이드 분해 후에 이. 콜리 생성물들은 각각 다른 원리에 따라 분리되는 3가지의 상이한 크로마토그라피시스템(겔 여과법, 이온교환 및 역상 HPLC)에서 인슐린 체인으로서 작용한다.

(d) 이·콜리로 생성된 A체인은 HPLC에 의해 소규모로 정제되었고 올바른 아미노산 조성을 갖는다.

Claims (1)

1. DNA서열을 제1아미노산 서열에 대해 암호화한 이종 유전자를 함유하도록 선택하고, 이 DNA서열을 제2아미노산 서열에 대해 암호화한 코돈과 함께 판독대에 위치시키고, 상기 두 아미노산 서열에 대해 암호화한 상기 DNA 서열을 발현시켜 상기 제1아미노산 서열에 인접한 선택적 절단위치를 갖는 폴리펩티드를 제조함을 특징으로 하는 재조합 미생물 클로닝 베히클로부터 폴리펩티드를 제조하는 방법.

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