NL8401781A - Werkwijze voor het activeren van promotoren van bacterien. - Google Patents

Description

' , ' i

Werkwijze voor het activeren van promotoren van bacteriën.

De genen van het Vir gebied van het Ti plasmide van A. tumefaciens, welke essentieel zijn voor de virulentie eigenschappen van de bacterie, komen niet of nauwelijks tot expressie wanneer de bacteriën gekweekt worden op standaard synthetische media.

5 Dit berust op het feit, dat de /behorende promotor gebieden van de genen niet voldoende worden geactiveerd.

Gevonden werd, dat voor een goede activering de bacteriën in contact dienen te zijn met een al dan niet verwonde plant of stoffen die uit planten afkomstig zijn. De hier beschreven 10 inductie van een promotor van virC treedt niet alleen op in A. tumefaciens, maar ook indien de promotor is ingebouwd in E. coli, een bacterie die zeer weinig verwant is met A. tumefaciens.

Deze of soortgelijke promotoren komen ook voor op andere Ti plas-mides, op Ri plasmides (uit A.rhizogenen), op het sym-plasmide van 15 Rhizobium en mogelijk ook in andere plant-gerelateerde micro-orga-nismen. Deze ontdekking maakt het nu mogelijk om, door dergelijke promotoren in te bouwen vddr bepaalde genen, deze genen conditioneel tot expressie te laten komen. Deze uitvinding is toepasbaar op een breed scala van micro-organismen. De promotor zou bijvoorbeeld 20 toegepast kunnen worden bij de constructie van Pseudomonas stammen die allen in contact met planten overgaan tot de productie van si-deroforen (sideroforen zijn stoffen die door bescherming tegen plantpahtogenen opbrengst verhogend werken). Ook kan in dit verband gedacht worden aan andere eiwitten die men door daarvoor geschikte 25 micro-organismen laat produceren ter bescherming, groeibevordering en produktverhoging van een gewas dat op welke wijze dan ook met het betreffende micro-organismen in contact wordt gebracht. De bescherming kan aldus gericht zijn op het bewerkstelligen van resistentie tegen landbouwchemicalien insecten, pathogenen, koude, 30 droogte en verzilting ("zout" resistentie). Tevens biedt dit type promotoren mogelijkheden voor de op elk gewenst moment te starten productie in batch cultures van stoffen die schadelijk of anderszins groeibelemmerend zijn voor de producerende micro-organismen of cellen.

8401781 - 2 -

Agrobacterium tumefaciens is in staat om cellen van de meeste bedektzadige planten van nieuwe erfelijke eigenschappen te voorzien. Deze transformatie leidt bij dicotyle planten tot tumoren. Bij geen der monocotyle planten treedt 5 tumorvorming op maar wel zijn, zoals recent gevonden is, een aantal monocotyle soorten te transformeren door A. tumefaciens (Ned. octrooiaanvrage 8401048). De genen die verantwoordelijk zijn voor deze transformatie zijn gelegen op het tumor inducerende (Ti) plasmide, dat aanwezig is in virulente stammen. 10 (Van Larebeke et al., Nature (London) 252, 169-170 (1974);

Zaenen et al., J.Mol.Biol. 86, 109-127 (1974). Twee gebieden op het Ti plasmide zijn essentieel voor tumorinductie. De T-regio is het gedeelte van Ti plasmide dat wordt overgedragen naar de plantecel, daar in het kern DNA geïntegreerd wordt, 15 en dat genen bevat die verantwoordelijk zijn voor het tumor-karakter van de getransformeerde plantecel (Chilton et al.,

Cell _11_, 263-271 (1977); Ooms et al., Gene _14, 33-50 (1981).

Naast het T-gebied is nog een tweede gebied op het Ti plasmide essentieel voor de virulentie eigenschappen van 20 de_bacterie (Ooms et al., J.Bacteriol., 144, 82-91 (1980);

Garfinkel et al., J.Bacteriol. 144, 732-743 (1980). Mutaties in dit Vir (virulentie)-gebied geven aanleiding tot avirulentie of gastheer specifieke verzwakte virulentie. In het Vir-gebied zijn een 7-tal loei benoemd (vir A,B,C,D,E,F en O).

25 Mutanten in deze loei zijn allen complementeerbaar in trans door de in de natuur voorkomende genen, aanwezig op klonen of R'plasmiden (Hllle et al., Plasmid 7, 107-118 (1982); Klee et al., J.Bacteriol. 150, 327-331 (1982). Dit is een aanwijzing dat de producten van deze genen binnen de bacterie hun functie uit-30 oefenen.

De verkregen resultaten tonen aan dat de virulen-tiegenen van het Ti plasmide niet tot expressie komen wanneer de bacteriën op standaard media worden gekweekt, maar dat zij, 8401781 - 3 - zowel in A. tumefaciens als in de daarmee geheel niet verwante E. coli, aangezet worden door stoffen die door planten worden uitgescheiden. Uitscheiding van deze stoffen vindt ook plaats in afwezigheid van de micro-organismen.

5 Om de activiteit van de virulentie genen te kunnen detecteren werd gebruik gemaakt van lacZ plasmides. Het promotor-gebied van virC (Een promotor ligt vddr het gedeelte van een gen dat in een peptideketen wordt vertaald. Een promotor bevat alle signalen die nodig zijn voor de expressie van een gen) 10 werd gekloneerd voor het lacZ gen van E. coli dat zelf geen promotorstructuur meer bevatte. Plasmide pMP30 (zie fig. Ij bevat het complete lacZ gen zonder promotor. LacZ kodeert voor het enzym β-galactosidase. De activiteit van dit enzym kan eenvoudig gedetecteerd worden op indicator media met de 15 chroraofoor 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-B-D-galactopyranoside (afgekort X-gal). Afbraak van X-gal door het enzym geeft een blauw gekleurd afbraakproduct. Omdat het lacZ gen in pMP30 geen promotor bevat, vertoont een E. coli Lac met dit plasmide geen β-galactosidase activiteit. In de unieke HindlII site van 20 pMP30 werd een 2.6 kbp HindlII fragment gekloneerd met daarop gelegen het promotor gebied en een gedeelte van het structurele gen van virc. De oriëntatie van het 2.6 kbp fragment in het resulterende plasmide pMP31 is zodanig, dat de promotor van virC gericht is naar lacZ (fig. 1).

25 Een E. coli del.lac stam met het plamide pMP31 vertoonde op agarplaten met X-gal een zwakke maar significante blauwkleuring na 60 uur incubatie. Een E. coli del.lac stam is een stam waarin het E. coli eigen lac-gen is gedeleteerd.

In vloeibare media werd geen β-galactosidase activiteit 30 gedetecteerd. De plasmides pMP30 en pMP31 kunnen zich niet handhaven in A. tumefaciens. Om de plasmides op hun activiteit in A. tumefaciens te kunnen testen werden cointegraten geconstrueerd met het plasmide R772, een conjugatief plasmide met 3401781 v." Kt - 4 - een breed gastheerbereik. De cointegraten van pMP30 en pMP31 met R772 werden respectievelijk pMP32 en pMP33 genoemd. Agrobacterium stammen met pMP32 of pMP33 vertonen geen (3-galacto-sidase activiteit, ook niet wanneer naast deze plasmides het 5 Ti plasmide aanwezig is. Onder standaard omstandigheden komt virC dus niet of nauwelijks tot expressie in A. tumefaciens of E. coli.

De mogelijkheid dat de virulentie genen pas onder invloed van plantestoffen tot expressie komen werd getest door 10 E. coli (pMP31) en A. tumefaciens (pMP33) te groeien in de aanwezigheid van exudaten van dicotyle en monocotyle plante- soorten. Voor de bereiding van exudaten werden pas ontkiemde zaden of wortelweefsel, na wassen met synthetische groeimedia voor E. coli of A. tumefaciens, 4-5 uur geïiicubeerd in dezelfde 15 media (1 tot 3 zaden per ml medium; 0.1 gr wortelweefsel per ml medium). Na filtratie, om planteresten kwijt te raken, werden 7 de exudaten geinoculeerd met bacteriën (5X10 bacteriën per ml) * en 16 uur bij 29°C geincubeerd in de aanwezigheid van 120 yug.ml X-gal. De daarna gemeten blauwkleuring is een maat voor de 20 3-galactosidase activiteit onder regie van de virC promotor.

Zoals te zien is in tabel 1, bleken exudaten van dicotyle zowel als van sommige monocotyle planten in staat tot sterke inductie van de virC promotor, leidend tot aanzienlijke 3-galactosidase activiteiten. Verrassenderwijze werd dit inducerend effect 25 ook gevonden in E. coli stammen.

Exudaten van monocotylen gaven resultaten afhankelijk van de gebruikte plantesoort. Allium cepa (ui) exudaat gaf inductie van de virC promotor vergelijkbaar met de inductie door exudaten van dicotyle planten, terwijl exudaten van Zea mays (mais) 30 nauwelijks inductie te zien gaven. Tevens bleek dat de induce rende stof ook uitgescheiden werd door al getransformeerde plantecellen. Controle experimenten met E. coli (pMP30) en A. tumefaciens (pMP32) gaven geen of zeer zwakke 3-galactosidase 8401781 . » - 5 - activiteiten te zien in de aanwezigheid van planteexudaten.

De zeer zwakke activiteit van A. tumefaciens (pMP32) trad ook op wanneer geen plasmides met lacZ aanwezig waren en is dus het gevolg van endogene B-galactosiöase activiteit van 5 A. tumefaciens.

Uit deze resultaten werd geconcludeerd dat de promotor van virC onder standaard condities niet werkzaam is, maar dat deze sterk geactiveerd wordt door een stof (stoffen) die uitgescheiden wordt (worden) door dicotyle en 10 monocotyle planten. Dit is de eerste maal dat een bacterie promotor beschreven wordt, die onder invloed van in de plant normaal voorkomende stoffen wordt geactiveerd. Dat deze stof of stoffen ook door tumorweefsel wordt uitgescheiden stemt overeen met recente resultaten, welke er op wijzen dat ook 15 tumorweefsel transformeerbaar is door A. tumefaciens (Van

Slogteren et al., Nature, submitted (1984).

Een begin is gemaakt met de karakterisering van het inducerende agens van de virC promotor zoals dat voorkomt in het exudaat van de erwt. In de aanwezigheid van een aantal 20 laag-moleculaire stoffen, die in exudaat verwacht kunnen worden, werd geen inductie gevonden van de virC promotor in E. coli (tabel 2). De inducerende stof (of stoffen) bleek hittelabiel.

Na 15 min. incubatie bij 55°C van de exudaten was het inducerende effect op de virC promotor volledig verdwenen.

25 Behandeling van de exudaten met RNase, DNase, phospholipase A2 en phospholipase D hadden geen effect op de inducerende activiteit van het exudaat. Behandeling van het exudaat met de -1 eiwitsplitsende enzymen pronase en trypsine (20 yug.ml ) had daarentegen tot gevolg dat de inducerende activiteit volledig 30 verdween. De behandeling met deze enzymen had geen invloed op de capaciteit tot inductie van de lac genen in de stam E. coli F'lac+:del (lac-pro) (tabel 3).

Dialyse van het erwteexudaat door membranen met een poriegrootte 34 0 1 7 8 1

C' V

* - 6 - die moleculen met een massa kleiner dan 7 kD doorlaten, gaven geen verlies van de inducerende activiteit te zien. Deze resultaten geven aan dat het inducerende agens een eiwitcomponent bevat en een molecuulgrootte heeft boven 7 kD.

5 Aangetoond werd, dat de virulentiegenen van het

Ti-plasmide van A. tumefaciens niet tot expressie komen wanneer de bacterie in standaard media gegroeid worden, maar dat ze geïnduceerd worden wanneer ze in contact komen met de plant of met plantestoffen. Deze vondst is van fundamenteel weten-10 schappelijk belang omdat ze cpeningen biedt om de functie van de virulentiegenen bij het proces van tumor inductie en transformatie nader op te helderen. Daarnaast biedt deze vondst mogelijkheden om de promotoren van dergelijke genen te gebruiken voor biotéchnologische toepassingen. Het gegeven dat inductie 15 van de virC promotor niet alleen in Agrobacterium optreedt, maar ook in een ver van Agrobacterium af staande bacterie als E. coli, maakt dit type promotor geschikt voor gebruik in een breed scala van bacteriën of micro-organismen het algemeen die interactie vertonen met planten. Bacteriële processen 20 die ten nutte zijn voor de plant, maar schadelijk zijn voor de bacterie zelf, kunnen specifiek aangeschakeld worden op de plaats waar zij hun functie moeten uitoefenen.

8401781 - 7 - TABEL 1

Inductie van de virC promotor onder invloed van planteexudaten.

5 E.coli_ A.tumefaciens geen bact.

ρΜΡ31 pMP30 pMP33 pMP32 (+virC) (-virC) (+virC) (-virC)

Exudaten -:--- 10 Pisum sativum ++ + _+

Vicia hirsuta ++ - nd nd - 1)

Daucus carota ++ - + .

Nicotiana plum-^ ++ - nd nd - baginifolia 15 Allium cepa ++ - + _+ -

Zea mays - - +/^ i

Minimaal medium - _+ - : Wortel cultures van met A. rhizogenes géinfecteerde weefsels 20 S401 73 1 - 8 - TABEL 2

Invloed van een aantal laag-moleculaire stoffen op de inductie van de virC promotor

Geteste stoffen Inductie virC

in E.coli del. lac (pMP31) aminozuren 0.3 % casaminoacids -1 vitamines 400 ng.ml pantotheenzuur nicotinezuur p-aminobenzoëzuur pyridoxine thiamine -1 suikers 6,6 mg.ml arabinose, lactose galactose, sorbitol mannitol, xylose melibiose, cellobiose myo-inositol -1 plantehormonen 6.5 ^ug.ml kinetine naphtaleen azijnzuur 84 0 1 7 8 1 - 9 - TABEL 3

Behandeling van exudaten met enzymen en de invloed hiervan op de inductie van de virc promotor

Behandeling van inductie virC inductie van lacZ in exudaten met promotor controle F'lac+:del (lac-pro) RNase + + DNase + + phospholipase A2 + + phospholipase D + + -1 pronase (20 ,ug.ml ) ' -1 trypsine (20 ^ug.ml ) - +

3 4 0 1 7 8 T

Claims (4)

1. Werkwijze voor het activeren van genen in micro-organismen, met het kenmerk, dat men niet als zodanig in de natuur voorkomende genen activeert door contact met planten of met de activering veroorzakende stof of stoffen al dan niet aan-5 wezig in plantendelen of plantenexudaten, waarbij de gebruikte genen bestaan uit één of meer eiwitcoderende gedeelten van één of meer natuurlijke genen en/of één of meer synthetisch vervaardigde DNA-sequenties, die voor één of meer eiwitten coderen, en een pro-motorgebied, dat afkomstig is van één van de genen, die van nature 10 voorkomen in micro-organismen en dat van zodanige aard is, dat respektievelijk het tot stand brengen of achterwege laten van bovengenoemd contact het mogelijk maakt het kunstmatig geconstrueerde gen of de genen respektievelijk te activeren of juist de activiteit van het gen of de genen tot stilstand te brengen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat bacteriën worden gebruikt die voorzien zijn van één of meer genen die kunstmatig geconstrueerd zijn en wel zodanig, dat zij bestaan uit het van nature voorkomende promotor-gebied van het virC-gen afkomstig uit het Ti-plasmide van Agro-20 bacterium of daarmee wat betreft hun activering vergelijkbare promotorgebieden afkomstig uit andere plantgeassocieerde bacteriën, en één of meer willekeurige natuurlijk voorkomende of synthetisch vervaardigde DNA-sequenties, die coderen voor eiwitten.

3. Micro-organisme met genen als gedefinieerd 25 in conclusie 1 of 2.

4. Werkwijze voor de behandeling van gewassen, met het kenmerk, dat men ze behandelt met micro-organismen volgens conclusie 3, die de voor de behandeling gewenste eiwitten of chemicaliën produceren. 30 8401781