DE2712615A1 - Verfahren zur herstellung von filamentoesen phagen als vektor fuer synthetische rekombinate - Google Patents

Verfahren zur herstellung von filamentoesen phagen als vektor fuer synthetische rekombinate

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DE2712615A1 DE19772712615 DE2712615A DE2712615A1 DE 2712615 A1 DE2712615 A1 DE 2712615A1 DE 19772712615 DE19772712615 DE 19772712615 DE 2712615 A DE2712615 A DE 2712615A DE 2712615 A1 DE2712615 A1 DE 2712615A1
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

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Description

SCHERING AG
Gewerblicher Rechtsschutz
271261b
Die Erfindung betrifft den neuen Hybrid-Phagen M 13 mp 1 (ATCC Nr. 3127^-B ), ein Verfahren zur Herstellung dieses Hybridphagen sowie dessen Verwendung zur Synthese von Arzneimitteln.
Es sind bisher zwei Vektor-Systeme bekanntgeworden, mit denen prokaryotische und eukaryotische DNA's in E.coli kloniert werden können, und zwar Plasmide der Col E 1-Familie oder pSC 101 und das Bakteriophagen-X-Genom (vgl. M.So, R.Gill und S.Falkow (1975) Mol. Gen.Genet. ΙΛ2, 239-2^9)·
Nach D.A. Marvin et al. /Bacteriol.Rev. 33_i 172-209 (I969)/ wird die einzelsträ) gige Phagen-DNA nach Infektion der Wirtszelle durch den Phagen in eine doppelsträngige vertwistete Form (RF I) umgewandelt und bis zu 3OO Kopien/pro Zelle amplifiziert. Die Phagen produzierenden Zellen werden durch die Infektion nicht abgetötet und können sich weiterhin vermehren. Das Wachstum einer durch einen filamentösen Phagen infizierten Bakterienzelle wird geringfügig verzögert, diese Verzögerung führt zur Bildung von "trüben plaques", womit infizierte Bakterien schnell und ohne Selektionsdruck erkannt werden können.
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Vorstand: Dr. Herbert Asmis · Or. Christian Bruhn · Hans-Jürgen Hamann Postanschrift: SCHERING AG · D-1 Berlin 65 · Postfach 65 0311 Dr. Heinz Hannse · Karl Otto Mittelstenscheid · Dr. Horst WiUeI Postscheck-Konto: Berlin-West 1175-101. Bankleitzahl 10010010
Vorsitzender des Aulsichtsrats: Dr. Eduard v. Schwartzkoppen Berliner Commerzbank AG. Berlin, Konto-Nr. 109 7006 00. Bankleitzahl 100 400 Sitz der Gesellschaft- Berlin und Bergkamen Berliner Disconto-Bank AG, Berlin. Konto-Nr. 241/5008, Bankleitzahl 100 70000 Handelsregister: AG Charlottenburg 93 HRB 283 u. AG Kamen HRB 0061 5erline/. Handels-Gesellschaft - Frankfurter Bank -. Berlin, Konto-Nr. 14-362, Bankleitzahl 10020200
M FM IV 36718
SCHERING AG
* Gewerblicher Rechtsschutz
2712b Ib
Obwohl einige Verfahren zur Klonierung von DNA /vgl. M.So, R.Gill und S.Falkow (1975) Mol.Gen.Genet. lA2_, 239-2497 bekannt sind, ist es bisher nicht gelungen, DNA auch in filamentösen Phagen zu klonieren. Daß eine DNA-Klonierung in filamentösen Phagen mit den Mitteln des augenblicklichen Standes der Technik nicht möglich ist, geht aus dem nachstehenden Versuch hervor. Wenn man z.B. eine doppelsträngige ringförmige DNA des filamentösen Phagen M 13 wie bei den Plasmiden mit dem Restriktionsenzym Hind II einmal schneidet, die einzige Hind II-Erkennungsstelle als Rezeptor für ein DNA-Fragment, das die Information für die Inaktivierung des Antibiotikums Kanamycin enthält, verwendet und Escherichia coli nach bekannten Verfahren /vgl. M.So, R.Gill und S.Falkow (1975) Mol. Gen.Genet. 142, 239-2497 mit diesem in-vitro-Produkt transformiert, so isoliert man Kanamycin-resistente Phagen, die instabil und in Gegenwart eines Helfer-Phagens nicht vermehrt v/erden können. Diese Hybridphagen büßen nach kurzer Zeit ihre Lebensfähigkeit ein.
Es war deshalb nicht zu erwarten, daß filamentöse Phagen als Vektoren zur Klonierung von DNA verwendet werden können. Durch Anwendung eines neuen Verfahrens konnte eine Stelle im Phagen-Genom gefunden werden, die für die in-vitro-Rekombination oder Klonierung von DNA geeignet ist und zu stabilen Hybridphagen führt. Darüber hinaus
803838/0A89
Vorsfind: Dr. Herbert Asmis ■ Dr. Christian Brunn ■ Hans-Jürgen Hamann Postanschrift: SCHERING AG · D-1 Berlin 65 · Postfach 65 0311 Dr. Heinz Hanns« ■ Karl Otto Mittelstenscheid ■ Dr. Horst Witzel Postscheck-Konto: Berlin-West 1175-101. Bankleitzahl 100 10010
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SCHERING AG
Gewerblicher Rechtsschutz
2712b
zusätzlichen
kann von den Hybrid-Phagen die Expression von* Peptiden nachgewiesen werden, wozu der Ausgangsphage nicht in der Lage ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit den neuen Hybrid-Phagen M 13 mp 1 (ATCC Nr. 31274-B ), der durch die Abbildung 1 mit seinen physikalischen und genetischen Merkmalen charakterisiert wird.
/Bei den nachstehend genannten Enzymen Bsu I und Hind II handelt es sich um Restriktions-Endonucleasen, die eingehend beschrieben werden in
• Bron, S., Murray, K. & Trautner, T.A. (1975) Mol. Gen. Genet. 3A3, 13-23; und
Phillipsen, P., Streeck, R.E. & Zachau, H.G. (197*0 Eur.J. Biochem. 45, V79-488J;
Die physikalische Ordnung der Bsu I Fragmente wird außerhalb des Kreises angegeben. Auf die einzelnen Fragmente wird durch große Buchstaben hingewiesen,und die Hind II-Spaltstelle wird als Nullpunkt der Karte gewählt. Innerhalb des Kreises wird die Genordnung
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Vorstand: Dr. Herbert Asm is ■ Dr. Christian Brunn - Hans-Jürgen Hamann Postanschrift: SCHERING AQ ■ D-I Bertin 65 - Postfach 65 0311 Dr. Heinz Hannse ■ Karl Otto Mittelstenscheid · Dr. Horst Witzel Postscheck-Konto: Berlin-West 1175-101. Bankleitzahl 100 10010
Vorsitzender des Aufsichlsrats: Dr. Eduard v. Scii.vartzkoppen Berliner Commerzban!< AG. Berlin. Konto-Nr. 103 700500. Bankleitzahl 100 400 Sitz der Gesellschaft: Berlin und Bergkamen Berliner Disconto-Sank AG. Berlin. Konto-Nr. 241/5003. Bankleitzahl 100 700 Handelsregister: AG Charlottenburg 93 HRB 283 u. AG Kamen HRB 0061 Kont'^Nf 14 3ö2 ^"w h? ~ Frankiurter Bank "■ 8erlin.
$4 FH IV IWlS
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Gewerblicher Rechtsschulz
271261b
durch römische Zahlen angegeben. "X" stellt das "X Protein" in dem Gen II und I.R. die intergenetische Begion mit der Startstelle für die Replikation dar. Die Positionen der fünf G und der drei A Promotoren werden durch lange Stricto wiedergegeben. Eine Karteneinheit entspricht der Länge von 6^00 BasenpaarJ Die Karteneinheiten werden wiedergegeben als Abstand von der Hind II-Spaltstelle per Länge des M 13 Wildtyp RF. Die Richtung der Transkription verläuft auf der genetischen Karte entgegen dem Uhrzeiger /vgl. L.Edens et al. (1976) Eur. J. Biochem. 70, 577-587./. Das eingesetzte lac-Fragment wird auf einem Außenkreissegraent mit derselben Skaleneinteilung wie der Innenkreis dargestellt. Seine Orientierung wurde durch das Spaltmuster von M I5 mp I und M 13 Wildtyp RF mit Bsu I bzw. Hpa II geklärt:
I' : Teil des lac-Repressorgens
ρ : Iac promotor
ο : lac operator
Z1(α) : α-Region der ß-Galaktosidase.
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Vorstand: Dr. Herbert Asmis ■ Dr. Christian Brunn · Hans-Jürgen Hamann Postanschrift: SCHERING AG · D-1 Berlin 65 · Postfach 65 0311 Dr. Heinz Hannse ■ Karl OBo Mittolslenscheid · Dr. Horst V.itzol Postscheck-Konto: Cerlin-West 1175-101. BanklsiUahl 100 10010
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2 7 12b i b
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, auf dem Phagengenom eine Stelle zu finden, die für den Lebenszyklus des Phagen nicht essentiell ist. Durch die erfindungsgemäße Verwendung des Restriktionsenzyms Bsu I ist es gelungen, die DNA des filamentb'sen Phagen M 13 RF statistisch zu spalten und dabei unter vielen essentiellen Spaltstellen auch eine nicht essentielle Spaltstelle ( G 0.08, vgl. die Genkarte auf der Zeichnung) zu finden. Die Reaktion wird durch an sich bekannte Haßnahmen gestoppt, z.B. durch Zugabe eines Denaturierungsmittels, vorzugsweise mit 1% SDS. Die Reaktionsprodukte werden durch Gel-Elektrophorese, vorzugsweise mit Agarosegelen, fraktioniert. Die verwendete Menge an Restriktionsenzym kann dabei so dosiert werden, daß auf den Agarosegelen z.B. hauptsächlich das linearisierte vollständige RF Molekül wiedergefunden wird. Diese Klasse von Molekülen werden mit dem Gel herausgeschnitten und von kleineren Fragmenten oder Partialverdauungsprodukten abgetrennt. Die auf diese Weise erhaltene lineare DNA-Sequenz des Phagen stellt das Ausgangsmaterial für den Einbau der Fremd-DNA mit der regulatorischen Region dar. Zur Abtrennung von der Agarose wird die DNA einer Gleichgewichtszentrifugation, z.B. in Kaliumiodid (Dichte 1,4-1,OgZmI), unterworfen, das Salz herausdialysiert und die DNA mit Alkohol gefällt.
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Die Verknüplung der mit Bsu I linearisierten RF DNA mit dem nach dem Verfahren von A.Landy et al. /(1971O Molec. gen. Genet. 133, 273-281/ aus Λ plac DNA durch Verdauung mit Hind II Endonuklease gewonnenen lac Hind II Fragment erreicht man mit T. DNA Ligase. Die Reaktion wird in einem Ligasepuffer /4θ-6θ m M NaCl, 8-12 m M MgCl2, 10 m M DTT (ß-Mercaptoäthanol), 0,3-2 m M ATP, 20-80 m M Tris-HCl ρ H 7,2-7,8Jbei einem Volumen bis 100 μΐ und einer T. DNA-Ligase-Endkonzentration von z.B. 8 η M bei 1V-15 C über eine Zeit von 7-^8 Std., vorzugsweise bei 12,5 in 16 Std. durchgeführt.
Durch Heteroduplex-Kartierung und durch Restriktionsenzym-Analyse kann gezeigt werden, daß die in-vitro-Einführung der Fremd-DNA an einer Stelle des Phagen-Genoms erfolgt, die weder die Sequenz eines Struktur-Gens unterbricht, noch Startstellen der Transkription für die Phagen-spezifischen Proteine beeinträchtigt.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Herstellung des Hybridphagen M 13 mp 1 (ATCC Nr. 3127^-B ), dadurch gekonnzeichnet, daß in die durch statistische Spaltung von filamentösen Phagen gefundenen, die Lebensfähigkeit des Phagen-Genoms jedoch
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nicht beeinträchtigenden Spaltstellen in vitro zusätzliche DNA eingebaut wird und die eingebaute DNA unter der Kontrolle'einer gleichseitig eingebauten regulatorischen Region des Laktose Operons steht.
Es wurde außerdem gefunden, daß filamentöse Phagen, wenn sie als Hybridphagen vorliegen, überraschend gut zu Synthesezwecken,z.B. von Arzneimitteln, eingesetzt werden können, wenn man mit ihnen Wirtszellen infiziert. Unter Arzneimittel sollen solche mit Peptid- oder Proteincharakter, wie z.B. die Proteohormone Insulin, Glukagon oder Antigene, Antikörper usw. verstanden werden. Besonders bevorzugt sollen Proteohormone sein.
Unter Wirtszellen versteht man alle in der Publikation von D.A.Marvin et al. /Bacteriol. Rev. 33_, 172-209 (1969)/ bereits beschriebenen Stämme, wie z.B. E.-coli-Bakterien, Pseudomonen, Salmonellen u.a.
Der erfindungsgemäß hergestellte Phage M 1) mp 1 weist nun gegenüber den bereits bekannten filamentösen Phagen folgende Vorteile auf:
Dem Bakterienchromosom des E.coli Stammes 7I-I8 (ATCC Nr. 3127*0 z.B. fehlt die Information für den Laktose Stoffwechsel. Stattdessen
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befindet sich auf einem Episom in der Zelle - dieses ist für die Infektion von filaraentösen Phagen notwendig - das Laktose Operon mit folgenden Modifikationen. Das erste Strukturgen des Laktose Operons, das die Information für die ß-Galaktosidase trägt, besitzt eine Deletion. Die Bakterienzelle produziert zwar ein stabiles Rumpfprotein, dem die Aminosäuren 11 - ^l fehlen,das aber keine Enzymaktivität mehr besitzt. Ferner führt eine Mutation zur Überproduktion von lac-Repressor, der die Expression der Strukturgene reprimiert.
Wird E.coli 71 - 18 mit einem filamentösen Phagen infiziert, so bleibt die Produktion der Rumpf-ß-Galaktosidase nach Derepression durch Zusatz von IPTG (Isopropylthiogalaktosid), ein allosterischer Effektor des lac-Repressors, erhalten und ß-Galaktosidaseaktivität wird nach wie vor nicht nachgewiesen.. Erfolgt jedoch Infektion mit H 13 jip l, so wird von der in vitro eingebauten DNA nach Derepression mit IPTG ein Proteinfragment der ß-Galaktosidase übersetzt, das die oben beschriebene Rumpf-ß-Galaktosidase intrazistronisch komplementieren kann. Enzymaktivität der ß-Galaktosidase wird durch Hydrolyse von Xgal (5-Brom-*t-chlor-indolyl-ß-D-galaktosid), einer farblosen Verbindung zu 5-Brom-1t-chlor-indigo, einen tiefblauen Farbstoff, angezeigt. Während nach Infektion von E.coli 71-18 mit filamentösen
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Vorstand: Dr. Herbert Asmis · Dr. Christiart Brunn · Hans-Jürgen Hamann Postanschrift: SCHERING AG ■ D-1 Berlin 65 ■ Postlach 650311 Dr. Heinz Hannse · Kerl Otto Mittelstenscheid ■ Or. Horst WiUeI Postscheck-Konto: Berlin-West 1175-101. B«nklcitzaht 10010010
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Phagen Kolonien nach dem Aussähen auf Indikatorplatten (mit Zusatz von Xgal und IPTG) farblos bleiben, färben sich M 13 mp 1 infizierte Kolonien tiefblau. Ohne den Zusatz von IPTG bleiben M 13 nip I infizierte Kolonien ebenfalls farblos, d.h. Transkription der eingebauten DNA vom lac-Promotor wird spezifisch abgeschaltet.
Diese Ergebnisse zeigen, daß filamentÖGe Phagen durch das beschriebene Verfahren in vitro zusätzliche DNA aufnehmen können und daß von der eingebaut en DNA unter der Kontrolle der regulatorischen Region des
.wird,
Laktose Operons ein Peptid produziert*, das die Wirtszellen nicht
besitzen.
Das Ausgangs lac Hind II Fragment wird nach der Vorschrift aus A.Landy, E.Olchowski und W. Ross (197^) Molec. gen. Genet. 133, 273-281 hergestellt.
Folgende Materialien werden hierfür und in den Ausführungsbeispielen benötigt:
DNA des Iac Operons (z.B. >-plac DNA), M 13 RF DNA, die Restriktionsenzyme Hind II und Bsu I, T, DNA Ligase, den E.coli K 12 Stamm 7I-I8
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"/l3
Vorstand: Dr. Herbert Asmis ■ Or. Christian Bruhn · Hans-Jürgen Hamann Dr. Heinz Hannse ■ Karl Otto Mittelstenscheid ■ Dr. Horst Witzel Vorsitzender des Aulsichtsrats: Dr. Eduard v. Schwartzkoppen Sitz der Gesellschaft: Berlin und Bergkamen Handelsregister: AG Charlottenburg 93 HRB 283 u. AG Kamen HRB 0061 Postanschrift: SCHERING AG ■ 0-1 Berlin 65 · Postfach 650311 Postscheck-Konto: Berlin-West 1175-101. Bankleitzahl 10010010 Berliner Commerzbank AG, Berlin. Konto-Nr. 108 7006 00. Bankleitzahl 100 4C0 Berliner Disconto-Bank AG. Berlin. Konto-Nr. 241/5008. Bankleitzahl 100 700 00 Berliner Handels-Gesellschaft - Frankfurter Bank -, Berlin. Konto-Nr. 14-362, Bankleitzahl 100 202 00
S4 FH IV 35718
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(lac_ pro , F1 lac_ I9 Za M15 pro+ ), Isopropylthxogalaktosid (IPTG), S-Brom-'t-chlor-indolyl-ß-D-galaktosid (Xgal), Iac Repressor.
lac-Hind II-Fragment
Ca 200 μg >plac DNA werden mit Hind II Endonuklease verdaut und die Reaktion durch einen Hitzeschritt (10 Min. 60 C) beendet. Dem Reaktionsgemisch werden 20 μg Iac Repressor zugesetzt, und die Lösung langsam durch Nitrozellulosefilter (Porengröße 0,45 μ) filtriert. Filtergebundene DNA wird durch eine IPTG-haltige Lösung (ImM) eluiert, phenolisiert, mit Alkohol gefällt und das Präzipitat in 50 μΐ TES Puffer (20 mM NaCl1 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8.0) aufgenommen.
Der neue Hybridphage M 13 mp 1 wurde am I7. März 1977 bei der American Type Culture Collection in 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md/USA unter der ATCC-Mr. 3127^-B hinterlegt. Der Escherichia-Stamm 7I-I8 wurde ebenfalls am I7. März 1977 unter der ATCC-Nr. 3127*f dort hinterlegt.
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Vorstand: Df. Herbert Asmis · Dr. Christian Bruhn ■ Hans-JOrqen Hamann Postanschritt: SCHERING AG ■ D-1 Berlin 65 ■ Postfach 65 03 It
Dr. Hemz Hannse ■ Karl OUo Mitlclstenschoid ■ Dr. Horst WiUeI Postscheck-Konto: Berlin-West 1175-101. Bankleitzahl 100 10010
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Beispiel I^
Hybridphage 13 M mp 1 (ATCC Nr. 3127^-B) Die M 13 RF DNA (20 μg) wird mit Restriktionsenzym Bsu I bei Raumtemperatur behandelt und die Reaktion durch Zugabe von 1% SDS gestoppt. Die Reaktionsprodukte werden durch Agarosegele elektrophoretisiert. Die Menge des Enzyms wird darauf abgestimmt, daß auf den Agarosegelen hauptsächlich das linearisierte vollständige RF Molekül wiedergefunden wird. Diese Klasse von Molekülen v/erden mit dem Gel herausgeschnitten und von kleineren Fragmenten oder Partialverdauprodukten abgetrennt. Die DNA wird von der Agarose durch Gleichgewichtszentrifugation in Kaliumiodid (Dichte 1.5 g/ml) getrennt, das Salz herausdialysiert und die DNA mit Alkohol gefällt. Nach Resuspension in 50 μΐ TES Puffer werden 2 μζ mit Bsu linearisierte RF DNA und 0.5 μg des lac Hind II Fragments im Ligasepuffer (66 mM NaCl, 10 mM MgCl3, 10 mM DTT, 0.5 mM ATP, 50 mM Tris-HGl pH 7.5) auf ein Volumen von 100 μΐ verdünnt und T. DNA Ligase (1 μΐ, 8nM Endkonzentration) dem Gemisch zugegeben. Die Ligasereaktion wird bei 12.5°C für 16 Stunden durchgeführt.
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Gewerblicher Rechtsschutz - 15 -
271261b
B e i s ρ i e 1
Verifizierung des Hybridphagen in der Bakterienzelle ( Identifizierung des Hybridphagen durch Expression des α-Fragments der ß-Galaktosidase)
Das Reaktionsgeraxsch mit dem Hybridphagen M 13 mp 1 (ATCG Nr. 3127^-B) wird auf 30 mM CaCl gebracht und rait CaCl2 (30 mM) gewaschene exponentiell wachsende E.coli 7I-I8 (ATCC Nr. 31274) bei Eistemperatur gemischt. Nach einer
i Stunde werden die Zellen für 2 Min. bei *f2°C behandelt. Die Zellen werden im Anschluß mit IPTG (l mM), Xgal (^O μg/ml) und 5 ml Topagar versetzt und auf Standard-Nährmedium plattiert. Die Agarplatte wird für Zh Stunden bei 37°C bebrütet. Blaue Kolonien oder blaue trübe Plaques werden aus dem Agar steril entnommen und auf Einzelkolonien ausgesät.
../16
809838/0489
Vorstand: Dr. Herbert Asmi3 · Dr. Christian Brunn · Hans-Jürgen Hamann Postanschrift: SCHERING AQ · D-I Berlin 65 ■ Postlach 65 0311 Df. Heinz Hannvs · KaH Otto Miltelstenscheid . Df. Horst Wilzel Postscheck-Konto: Berlin-West 1175-101. Bankleitzahl 100 10010
Vorsitzender des Aufsichtsrats: Dr. Eduard v. Schwartzkoppen Berliner Commerzbank AG. Berlin. Konto-Nr. 108 7005 CO. Bankleilzahl 10ü 400
Sitz der Gesellschaft: Berlin und Bergkimen Berliner Oisconto-Bank AG. Eerlin. Konto-Nr.241/5008. Bankleitzahl 100 700
Handelsregister: AG Charloüenburg 83 HRB 283 U. AG Kamen HRB 0061 Berliner Handels-Gssellschaft - Frankfurter Bank -, Berlin,
Konlo-Nr. 14-352, Bankleitzahl 100 202 00
S4 FH IV Λ57Ι5
L e
e r s e i t e

Claims (1)

  1. SCHERING AG
    Gewerblicher Rechtsschutz
    'Ai Mr1 Ib
    Berlin, den 18. März 1977
    Verfahren zur Herstellung von filamentösen Phagen als Vektor für synthetische Rekombinajfte/
    Patentansprüche
    1. Kybridphage M 13 mp 1 (ATCC Nr. 3127*f-B)
    2. Verfahren zur Herstellung des Hybridphagen M 13 mp 1 (ATCC Nr. dadurch gekennzeichnet, daß in die durch statistische Spaltung von filamentösen Phagen-DNA gefundenen, die Lebensfähigkeit des Phagen-Genoms jedoch nicht beeinträchtigenden Spaltstellen in vitro zusätzliche DNA eingebaut wird.
    3. Verfahren zur Herstellung des Hybridphagen M 13 nip I (ATCC Nr. 3127^-B) gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in vitro eingebaute DNA unter der Kontrolle einer gleichzeitig eingebauten regulatorischen Region des Laktose Operons steht.
    809838/0489
    Vorstznd: Dr. Herbert Asmij Dr. Christian Brunn - Ham-Jürgen Harnann Postanschrift: SCHcRINQ AG ■ D-1 Borlin 65 ■ Postlach C5 0311 Dr. Hei.-u Hu.inse · Karl Otto Mitfjlstenscheid · Or. Horst Witzcl Pos'.scheck-Konto: Berlin-West 1175-101, Binkleitzahl 100 1C010
    Vorsitzender daä Aulsichtsrnts: Dr. Eduard v. Schwarlzkoppen Berliner Cominerzhank AG. Berlin. Konto-Nr. 103 70C6 00. Dankleitzahl 1C0WJ00
    Sitz dar G35.>llschaft: Berlin und BorqVamen Borlinsr Oisconto-Bank ACi. Bsrlin. Konto-Nr. 211/5008. BanKleitzahi 100 700 CO
    Ilandilsrcg.itar: AG Charlottanburg 93 HHB233 u. AG Kamen ΗΠΒ 0061 KontS^Nr^14 M^BanWöftTahl iöoawoo" ~'
    ORIGINAL INSPECTED
    SCHERING AG
    Gewerblicher Rechtsschutz
    2 7 I 2 b j
    *f. Verwendung von filamentösen Phagen zur Synthese von Arzneimitteln, vorzugsweise Arzneimittel vom Peptid- oder Prot exncharalct er, dadurch gekennzeichnet, daß man Wirtszellen infiziert.
    5. Verwendung des Hybridphagen M 13 rap I (ATCC Nr. 3127^-B ) zur
    Synthese von Arzneimitteln, vorzugsweise Arzneimittel vom Peptid- oder Proteincharakter, dadurch gekennzeichnet, daß man Wirtszellen infiziert.
    6. Verwendung des Hybridphagen M 13 nip 1 (ATCC Nr. 3127^-B ) zur
    Synthese von Arzneimitteln gemäß Anspruch 5i dadurch gekennzeichnet, daß man Escherichia coli-Bakterien infiziert.
    7. Verwendung des Hybridphagen M 13 mp 1 (ATCC Nr. 3127^-B ) gemäß Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen
    Insulin oder Derivate des Insulins herstellen.
    8. Verwendung des Hybridphagen M 13 mp 1 (ATCC Nr. 3127^-B )
    gemäß Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen Antigene und Antikörper herstellen.
    809838/0489
    Vorstand: C*. Herbert Asmis · Dr. Christian Brunn ■ Hans-Jürgen Hamann Postanschrift: SCHERING AG · D-1 Berlin 65 · Postfach 65 0311 Dr. Heinz Hannse ■ Karl Otto MittelMenschüid · Dr. Horst Witze! Postschück-Konto: Berlin-West 1175-101, Bankleitzahl 100 10010
    Vorsitzender des Aufiichtsrats: Dr. Eduard v. Schwartzkoppen Berliner Commerzbank AG. Berlin. Konto-Nr. 108 7006 00. Bankleitzahl 100 400
    Sitz dsr Gasellschaft: Berlin und Bergkamen Berliner Disconto-Bank AG. Berlin. Konto-Nr. 241/5U08. Bankleitzahl 100 700
    Handelsregister: AG Charlottenburg 93 HR3 283 u. AG Kamen HRB 006t Konto-^r U^i'^nuiluaM 1W 20200 *' "'
    SCHERING AG
    Gewerblicher Rechtsschutz
    27 1 2b 1 b
    9. Verwendung des Hybridphagen M 13 mp 1 (ATCC Nr.
    gemäß Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen das α-Fragment der ß-Galaktosidase herstellen.
    809838/0489
    Vorstand: Df. Herber! Asmis ■ Dr. Christian Brunn ■ Harn-Jürgen Hamann Postanschrift: SCHERING AG - D-1 Berlin 65 - Postfach 65 03 ti Dr. Hoini Hannse Karl Otto Mittelstenscheid ■ Dr. Horst V/.tzel Postscheck-Konto: Berlin-West 1175-101, Bankleitzahl 100 10010
    Vorsitzender des Aulsichtsratä: Dr. Eduard v. Schwartzkoppen Berliner Commerzbank AG, Berlin, Konto-Nr. 108 7006 CO. Bankleitzahl 100 400
    Sitz «Sei Gasellschalt: Berlin und Bergkamen Berliner Disconto-Bank AG. Borlin. Konto-Nr. 241/5008. Bmkleitzahl 100 7CO CO
    Handelsregister: AG Charioltsnburg 93 HR3 203 u. AG Kamen HR3 0061 Berliner Handäls-Gesellschalt - Frankfurter Bank -.Berlin.
    Konto-Nr. 14-3β2. Bankleitzahl 100 20200
    U FH IV J57ia
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