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Diese Erfindung betrifft ein Polypeptid,
das eine Calpain-inhibierende Aktivität aufweist, insbesondere ein
solches Polypeptid, in das eine Zelladhäsionsaktivität eingeführt wurde.
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Mit den jüngsten Fortschritten in der
Molekularbiologie ist man im Begriff, die Mechanismen, durch die Zellen
und die extrazelluläre
Matrix aneinander haften, auf molekularem Niveau zu verstehen. Von
den extrazellulären
Matrixproteinen war Fibronectin (FN) das erste, von dem festgestellt
wurde, dass es eine für
die Zelladhäsion
wesentliche Sequenz enthält.
Somit wurde von Ruoslahti et al. (Nature, 309, 30–33, 1984)
festgestellt, dass die Arg-Gly-Asp-Ser-Sequenz (RGDS) in der Zellbindungsdomaine
von FN für
die Zelladhäsion
wesentlich ist. Für
die Zelladhäsion
wird der RGD-Teil dieser Sequenz benötigt und eine Substitution
mit anderen Aminosäuren
kann nicht ohne Verlust von Zelladhäsionsaktivität ausgeführt werden,
jedoch kann Serin zum Beispiel gegen Threonin, Alanin, Cystein oder
Valin ohne Verlust von Aktivität
ersetzt werden. Wird jedoch mit Prolin oder Lysin substituiert,
ist die Aktivität
verloren. Andere Proteine als FN, die die Sequenz RGS enthalten, umfassen
Thrombin, Vitronectin, von Willebrand Faktor, Fibrinogen, Collagen,
Discoidin I, ë-Phagen
Rezeptor und andere. Es wurde vorgeschlagen, dass die RGD-Sequenz
eng mit Proteinfunktionen zusammenhängt (Ruoslahti et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5985–5988,
1984). Es ist jedoch nicht sicher, ob die RGD-Sequenz diesen Molekülen Zelladhäsionsaktivität verleiht.
Obwohl zum Beispiel Fibrinogen die RGDS-Sequenz aufweist, weist
es keine Zelladhäsionswirkungen
auf Fibroblasten auf.
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Ein weiteres Beispiel für ein Zelladhäsionsprotein
ist zusätzlich
zu den vorstehend genannten Laminin. Laminin ist ein Glycoprotein
mit hohem Molekulargewicht, das in der Membranbasis gefunden wird
und es weist gegenüber
einer Vielfalt von Zellen im Epithelium Zelladhäsionsaktivität auf. Es
wurde berichtet (Graf et al., Cell, 48, 989–996, 1987), dass die kleinste
mit der Zelladhäsion
zusammenhängende
Sequenz Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) ist. Laminin weist ebenfalls
die RGD-Sequenz auf, jedoch ist nicht bekannt, ob die Sequenz mit
der Zelladhäsionsaktivität zusammenhängt.
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Weiterhin ist bekannt, dass die Glu-Ile-Leu-Asp-Val
(EILDV) Sequenz in der IIICS Domäne
von FN mit der Adhäsion
von Lymphzellen und Melanomzellen zusammenhängt.
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Eine Technik, durch die ein synthetisches
Polypeptid an ein Polypeptid, das von FN stammt, am N-Ende des Tumornekrosefaktors
(TNF) gebunden werden kann, ist veröffentlicht worden (offengelegte
japanische Patentanmeldung Nr. 297399/88). Das mit TNF gebundene
Polypeptid ist ein Teil der Sequenz der Zellbindungsdomäne von FN
und es enthält
die Sequenz RGDS. Das synthetische Polypeptid, das als Ergebnis
der Verwendung der Technik erhalten wird, weist eine stärkere Aktivität zur Verursachung
von Tumornekrose als TNF auf. In dieser Technik sind jedoch zwei
funktionale Polypeptide durch die Verwendung von Gentechnologie
gebunden und die Ergebnisse zeigen nicht, dass die RGDS-Sequenz innerhalb
des TNF-Moleküls
die Zelladhäsionsaktivität aufweist.
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Wäre
es möglich,
einem eine Calpain-inhibierende Aktivität aufweisenden Polypeptid Zelladhäsionsaktivität zu verleihen,
so wäre
es möglich,
die Affinität
zwischen Zellen und Polypeptid zu erhöhen. Ist dies möglich, wäre die Technik
in der Entwicklung neuer Arzneimittelabgabesysteme, Depotpräparate und
so weiter sehr nützlich.
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Das Ziel dieser Erfindung ist es,
eine Technik zur Verfügung
zu stellen, durch die Polypeptiden, die eine Calpain-inhibierende
Aktivität
aufweisen, Zelladhäsionsaktivität verliehen
werden kann, ohne deren ursprüngliche
Funktion zu verändern.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein künstliches
Polypeptid, das eine Calpain- inhibierende
Aktivität aufweist,
und das Moleküls,
von dem ein Peptid eingeführt
worden ist, das Zelladhäsionsaktivität aufweist.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls eine auf der Gentechnologie basierende
Technik für
die Einführung
von DNA, die ein Peptid mit Zelladhäsionsaktivität kodiert,
in DNA, die das Polypeptid kodiert, und die Verwendung eines Plasmidvektors,
der die DNA trägt,
um Wirtszellen zu transformieren, so dass sie dann das Polypeptid
exprimieren.
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Die Erfinder dieser Erfindung haben
diese Erfindung durch die Einführung
eine Peptids, das Zelladhäsionsaktivität aufweist,
in eine geeignete Region des Polypeptids, das keine Zelladhäsionsaktivität aufweist, unter
Erzeugung eines funktionalen Polypeptids mit Zelladhäsionsaktivität ausgeführt.
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Die Erfinder schoben die Sequenz
RGDS in das aktive Fragment von Calpastatin wie folgt ein.
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Die DNA-Sequenz, die RGDS entspricht,
wurde in Übereinstimmung
des Leserahmens in die kodierende Region eines Plasmid eingeschoben,
das ein Fragment exprimiert, das die I Domäne von menschlichem Calpastatin
umfaßt,
und die resultierende DNA wurde in E. coli eingeführt. Die
biologische Aktivität
des durch die Rekombinanten exprimierten Polypeptids wurde bewertet.
Es wurde sowohl Calpastatinaktivität als auch Zelladhäsionsaktivität festgestellt.
Calpastatin ist ein endogener Proteaseinhibitor, der Calpain (EC
3.4.22.17), eine Ca-abhängige
neutrale Protease, spezifisch inhibiert. Calpastatin kann in der
Behandlung einer Vielfalt von krankhaften Störungen verwendbar sein, die
durch übermäßige Calpainaktivität oder verminderte
Calpastatinaktivität
verursacht werden, wie zum Beispiel Bluthochdruck, Muskeldystrophie,
Katarakte, usw. Wird Calpastatin Zelladhäsionsaktivität verliehen,
kann dessen pharmakologische Wirkungen gesteigert werden.
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Das vorstehende Beispiel der Insertion
der Sequenz RGDS in das Polypeptid zeigt, dass es jetzt möglich ist,
funktionale Polypeptide herzustellen, die sowohl die Calpain-inhibierende
Funktion des Polypeptids vor der Modifikation, als auch ebenfalls
Zelladhäsionsaktivität aufweisen.
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Diese Erfindung wird nachstehend
genau erklärt
werden.
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Die Sequenz, die in das Polypeptid
eingeschoben werden soll, enthält
vorzugsweise mindestens die Sequenz RGD. Die unmittelbar an der
C-terminalen Seite der RGD-Sequenz
befindliche Aminosäure
kann jede Aminosäure
außer
Lysin (K), Prolin (p) oder Hydroxyprolin (HyP) sein. Es scheint
keinen Codenamen mit einem Buchstaben zu geben. Es gibt keine spezielle
Einschränkung,
bis auf die, dass sich die Aminosäure unmittelbar an der N-terminalen
Seite der Sequenz RGD befindet. Die Insertionsstelle kann jede in
dem Polypeptid bevorzugte Stelle sein, es ist jedoch am besten,
dass die Stelle eine ist, an der eine solche Insertion nicht den
Verlust der ursprünglichen
Calpain-inhibierenden Funktion des Polypeptids verursacht. Es wird
ebenfalls bevorzugt, dass die Sequenz RGD an eine Stelle eingeschoben
wird, an der die tertiäre
Struktur leicht durch Zellrezeptoren erkannt werden kann. Es ist
erforderlich, dass das Gen für
das Polypeptid, in das die Sequenz RGD eingeschoben werden soll,
von einem Plasmid getragen wird, das bei Einführung in den Wirt exprimiert werden
kann. Die der Sequenz RGD entsprechende DNA-Sequenz wird in die kodierende Region
des Plasmids so eingeschoben, dass der Leserahmen übereinstimmt,
und durch die Expression des Polypeptids durch den Wirt kann das
Polypeptid, das die RGD-Sequenz enthält, hergestellt werden.
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Die Insertion der Sequenz RGD in
Calpastatin wird genauer erklärt.
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Calpastatin ist ein einkettiges Protein,
das vier Domänen
I–IV,
die jeweils aus 120 bis 140 Aminosäuren bestehen, und eine Domäne L an
der N-terminalen Seite enthält.
Die Domainen I–IV
inhibieren unabhängig voneinander
jeweils Calpain, jedoch ist die Domäne L inaktiv. Die cDNA von
menschlichem Calpastatin wurde kloniert und verschiedene Fragmente
wurden in Expressionsvektoren eingeschoben; dann wurde in E. coli
ein Expressionssystem errichtet. In dieser Erfindung wurden das
Expressionsplasmid PHCSd42, das ein Peptid exprimiert, das aus 133
Aminosäuren
(hier HCSd42 genannt) besteht, und das größten Teil der Domäne I von menschlichem
Calpastatin und einen Teil der Domäne L auf dessen N-terminalen
Seite enthält,
und das Expressionsplasmid pHCSd421, das ein Peptid exprimiert (HCSd421),
das aus 96 Aminosäuren
besteht, wobei es nicht die C-terminalen 37 Aminosäuren von
HCSd42 aufweist, als Beispiele verwendet. Die Plasmide wurde durch
die Schritte, die nachstehend und in der offengelegten japanischen
Patentanmeldung Nr. 283300/89 und in der japanischen Patentanmeldung
Nr. 126648/89 beschrieben sind, aufgebaut.
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Zuerst wurden zwei cDNA Klone von
menschlichem Calpastatin, ës131
und ëcs19
verknüpft,
wodurch sich eine cDNA ergab, die den größten Teil der Domäne L und
die gesamte Region der Domänen
I–IV kodiert. Die
erhaltene cDNA wurde dann zum Aufbau eines Expressionsplasmids pHCS121
durch Verknüpfung
an der NcoI-EcoRI-Stelle
eines Expressionsvektors pUC119N verwendet. Die dieses Plasmid tragende
Zellen des Stammes E. coli JM109/pHCS121 wurden im Fermentationsforschungsinstitut
der Behörde
für industrielle Wissenschaft
und Technologie unter FERM P-9989 hinterlegt (japanische offengelegte
Anmeldung Nr. 28330/90).
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In die EcoRI-SaII-Stelle des Plasmids
pHCS121 wurde ein Transkriptionsterminator eingeschoben und die
den Domänen
II–IV
entsprechende Region wurde unter Verwendung von SacI-XbaI gestrichen,
woraus sich das Plasmid pHCS82 ergab. Die Restriktionsstellen AvaIII
und ClaI wurden in die der L Dömäne entsprechenden
Region eingeführt,
woraus sich PHCS83 ergab. Dann wurde ein Stoppcodon in die der Domäne I am C-Ende
entsprechenden Stelle eingeschoben, woraus sich pHCS84 ergab. Das
AvaIII-SaII-Fragment von pHCS84 wurde mit der PstI-SaII-Stelle von
pTV119N verbunden und ein großer
Teil des 5' Endes
der der Domäne
L entsprechenden Region wurde unter Verwendung von Nuclease entfernt.
Das erhaltene Plasmid wurde wieder an der NcoI-Stelle geschlossen,
woraus sich pHCSd42 ergab. Zellen von E. coli 545 ð HR/pHCSd42, die
dieses Plasmid tragen, wurden im Fermentationsforschungsinstitut
der Behörde
für industrielle
Wissenschaft und Technologie unter FERM P-10649 hinterlegt. Ein
weiteres Stoppcodon wurde stromaufwärts von dem Stoppcodon von
pHCSd42 eingeschoben, woraus sich pHCSd421 ergab (japanische Patentanmeldung Nr.
126648/89).
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Die Aminosäuresequenz und die DNA-Sequenz
von HCSd42 sind in 1 gezeigt und
diejenigen von HCSd421 sind in 2 gezeigt.
Die Stelle des Insertion der RGD-Sequenz sollte nahe der Moleküloberfläche sein
und sie sollte an einer Stelle liegen, die für die Expression der Calpastatinaktivität nicht
wesentlich ist. Ist die dreidimensionale Struktur des Moleküls nicht
bekannt, können
Modelle, wie zum Beispiel das Chou-Fasman Modell zur Vorhersage
der Sekundärstruktur
aus der Primärstruktur
in Betracht gezogen werden. Gestützt auf
diese Überlegungen
können
geeignete Stellen zur Insertion gewählt werden. Die ortsspezifische
Mutagenese ist ein wirksames Verfahren zur Verwendung bei der Insertion.
Da pHCSd42 und pHCSd421 von PTV119N als Vektor sind, der Einzelstrang-DNA
erzeugen kann, ist es leicht Einzelstrang-DNA bei der Herstellung
als Matrize zu verwenden. Das heißt, ein Plasmid wird dazu veranlasst,
sich in Gegenwart von Desoxyuridin (dU) in einem Wirt, der dU nicht
abbauen kann, zu replizieren und durch Infektion mit Helfer-Phage
wird Einzelstrang-DNA, die dU eingebaut hatte, erzeugt, die gereinigt
wird und als Matrize verwendet wird. Dazu getrennt wird DNA synthetisiert,
die die zu den Basissequenzen komplementäre DNA-Sequenz an den Insertionsstellen
an dem 5' Ende und
dem 3' Ende der
DNA-Sequenz, die der RGD-Sequenz
entspricht, enthält, (die
komplementären
Sequenzen sind jeweils 8–10
Basen lang) und als Primer in der Synthese von Doppelstrang-DNA
in Gegenwart von DNA-Polymerase verwendet wird. Diese DNA wird zum
Transformieren von Wirtszellen verwendet, die dU abbauen können. Dann
wird der gewünschte
Klon von den erhaltenen Transformanten ausgewählt; damit das Auswählen einfacher
wird, sollte der Primer in geeigneter Weise ausgelegt sein, so dass
durch die Insertion der DNA-Sequenz, die RGD entspricht, eine Restriktionsstelle
erzeugt wird und so dass schon vorhandene Stellen verschwinden.
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Die auf diese Weise erhaltenen Transformanten
werden kultiviert und die Expression des gewünschten Polypeptids wird eingeleitet.
Danach werden die bakteriellen Zellen zerrissen und die zerrissenen
Zellen werden bei 100°C
während
ungefähr
10 Minuten erhitzt, worauf die Suspension zentrifugiert wird und
der Überstand
auf Calpastatinaktivität
geprüft
wird. Der Calpastatinassay kann durch das Verfahren von Murakami
et al. (J. Biochem., 90, 1809–1816,
1981) ausgeführt
werden. Falls Expression des Polypeptids mit Calpastatinaktivität festgestellt
wird, kann das gewünschte
Produkt einfach durch Behandlung des Überstands mittels Chromatographie,
wie zum Beispiel DEAE Ionenaustauscherchromatographie gereinigt
werden. Die Zelladhäsionsaktivität des erhaltenen
Polypeptids kann durch das vorstehend beschriebene Verfahren bewertet
werden. Durch dieses Verfahren ist es möglich, ein neues Polypeptid
mit sowohl Calpastatinaktivität
als auch Zelladhäsionsaktivität zu erhalten.
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Die Insertion der RGD-Sequenz, die
Zelladhäsionsaktivität aufweist,
in ein Polypeptid ist erklärt
worden. Es ist jedoch ebenfalls möglich, dasselbe Verfahren zur
Insertion einer anderen als der RGD-Sequenz in ein Polypeptid zu
verwenden, wobei das multifunktionale Polypeptid dieser Erfindung
erhalten werden kann.
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Diese Erfindung wird weiterhin unter
Bezugnahme auf die Beispiele erklärt werden, jedoch soll diese Erfindung
nicht als auf diese Beispiele eingeschränkt betrachtet werden.
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Beispiel 1
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Herstellung eine Calpastatin ähnlichen
Polypeptids HCSd342, das die RGDS-Sequenz enthält:
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(1-1). Aufbau des Plasmids
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Einzelstrang-DNA, in der manche der
Tymindine gegen dU ersetzt worden waren, wurde von dem Plasmid pHCSd42,
das HCSd42 exprimiert, unter Verwendung eines handelsüblichen
Mutagenesekits, Mutan K (Takara Shuzo) hergestellt. Das von dem
Hersteller empfohlene Verfahren wurde befolgt. Anschließend wurde
pHCSd42 zum Transformieren von E. coli BW313 (dut–,
ung–)
verwendet und die transformierten Zellen wurden während ungefähr 5 Stunden
auf 2 × YT
Medium kultiviert. Dann wurde eine 1% Beimpfung des neuen Mediums
(5 ml × 10
Röhrchen)
durchgeführt.
Gleichzeitig wurde die Zellen mit Helfer Phage M13K07 infiziert und
30 Minuten bei 37°C
stehengelassen. Dann wurde die Kultivierung über Nacht in Gegenwart von
70 μg/ml Kanamycin
fortgesetzt. Zum Kulturüberstand
wurde einviertel Volumen 20% PEG, das 2,5 M NaCl enthielt, gegeben
und kräftig
gemischt, danach wurde die Mischung 30 Minuten bei 4°C stehengelassen
und der Niederschlag wurde erhalten. Der Niederschlag wurde in 1
ml TE gelöst
und mit Phenol behandelt. Ethanolfällung wurde zweimal durchgeführt und
der Niederschlag wurde in 30 μl
Wasser gelöst.
Die Ausbeute betrug ungefähr
90 μg. Getrennt
dazu wurde die folgende DNA-Sequenz (mit 33 Basen) zur Verwendung
als Primer zur Induktion der Mutagenese für die Insertion der RGD-Sequenz
zwischen K80 und der P81 der
Aminosäuresequenz
von HCSd42 synthetisiert.
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Die Sequenzen (I) und (III) entsprechen
hier der +Kette von pHCSd42 und die Sequenz (III) ist die Sequenz,
die die RGDS-Sequenz kodiert. Das G an der C-terminalen Seite von RGDSG wurde so
hinzugefügt, dass
das Mutantenplasmid leicht ausgewählt werden konnte und es ist
möglich,
den gewünschten
Klon durch Aufbau einer einmalig vorkommenden AccIII-Stelle zu erkennen.
Der Primer wurde auf einer DNA-Synthesevorrichtung (Applied Biosystems)
synthetisiert und dann mittels HPLC gereinigt. Dann wurde 0,2 μg (20 pmol) des
5' Endes der DNA
in einen Primer zur Verwendung in der Mutagenese durch Phosphorylierung
in Gegenwart von Polynukleotidkinase und ATP überführt. Als Matrize wurden 0,04–1 pmol
(4 μl) der
vorher hergestellten dU enthaltenden Einzelstrang-DNA verwendet;
diese wurde mit 4 pmol (4 μl)
Primer in einem Annealingpuffer annealed. Dann wurden 2 μl des annealten
Produkts mit 25 μl
Verlängerungspuffer,
1 μl DNA-Ligase
von E. coli und 1 μl
T4DNA-Polymerase gemischt und die Mischung wurde 2 Stunden bei 25°C inkubiert,
um die Synthese von Doppelstrangketten zu gestatten. Nach Hinzufügen von
3 μl 0,2
M EDTA zu der Reaktionsmischung wurde die Reaktion durch Erhitzen
der Reaktionsmischung während
5 Minuten bei 65°C
abgebrochen und 3 μl
Reaktionsmischung wurde zum Transformieren von E. coli BMH71-18mutS verwendet.
Die erhaltenen Transformanten (12 Klone) wurden auf LB Nährlösung kultiviert
und ihre Plasmid-DNA wurde extrahiert und mit SaII und anschließend AccIII
gespalten, woraus sich ein Klon ergab, das Fragmente mit 3,38 kb
und 1,24 kb aufwies. Dieses Plasmid wurde pHCSd342 genannt und die
darin eingeschobene Basensequenz der DNA wurde analysiert und es
wurde festgestellt, dass es die gewünschte Mutation war.
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(1-2). Herstellung eines
Calpastatin ähnlichen
Polypeptids durch E. coli, in dem die RGDSG-Sequenz eingeschoben
wurde.
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Das im Abschnitt (1-1) erhaltene
Plasmid pHCSd342 wurde zum Transformieren von E. coli JM109 Zellen
in der üblichen
Weise verwendet. Die Transformanten wurden E. coli JM109/pHCSd342
genannt und im Fermentationsforschungsinstitut der Behörde für industrielle
Wissenschaft und Technologie unter FERMBP-2719 hinterlegt.
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Die Transformanten wurden unter Schütteln bei
37°C in
1 l L-Medium kultiviert; als das Wachstum das logarithmische Stadium
erreichte, wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 2 mM hinzugefügt und die
Kultivierung wurde während
der nächsten
15 Stunden fortgesetzt. Nach Kultivierung wurden die Zellen auf
0°C abgekühlt und
NaN3 wurde zu einer Endkonzentration von
0,02% zugegeben und untergemischt, bevor die Zellen geerntet wurden.
Der Überstand
wurde verworfen und die Zellen wurden mit 40 ml N-Puffer (20 mM MES
(2-(N-Morpholin)ethansulfonsäure (pH-Wert
5,5)), der 1 mM EDTA, 4 μM
PMSF und 5 mM 2-Mercaptoethanol enthielt) gewaschen und zentrifugiert.
Das Zellpellet wurde in 40 ml N-Puffer suspendiert, zu dieser Suspension
wurde Lysozym zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugegeben
und die Suspension wurde bei 0°C
während
10 Minuten inkubiert. Als nächstes
wurden die Zellen mit Ultraschallwellen zerrissen und die Suspension
wurde während
20 Minuten mit 16000 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wurde bei 90 °C
während 10
Minuten erhitzt. Der Überstand
wurde während
20 Minuten bei 12000 × g
zentrifugiert und dieser Überstand wurde
gesammelt. Dieser wärmebehandelte Überstand
wurde durch eine achtzig Millimeter DEAE-Toyopearl 650 M Säule gegeben
(Tosoh Corp.), die mit 50 mM NaCl Puffer, pH-Wert 5,5, der 20 mM
MBS, 1 mM EDTA und 4 μM
PMSF enthielt, äquilibriert
worden war.
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Die Säule wurde zuerst mit 350 ml
des vorstehenden Puffers gewaschen und dann wurde mit 1000 ml desselben
Puffers eluiert, wobei NaCl in einem linearem Konzentrationsgradienten
von 50 bis 200 mM enthalten war. Die Calpastatinaktivität der erhaltenen
Fraktionen wurde durch Messung ihrer Calpaininhibition gemessen
(Kitahara et al., J. Biochem. 95, 1759, 1984). Die Probe wurde mit
2 μl (0,4
E) Calpain, 40 μl
2% Casein und 6 mg/ml Cystein gemischt und Wasser wurde zugegeben,
um ein Volumen von 180 μl
zu erreichen. Die Mischung wurde bei 30°C 20 Minuten erhitzt. Dann wurde
20 μl 50
mM Calciumchlorid zugegeben und die Mischung wurde 20 Minuten bei
30°C inkubiert.
Darauf wurden 200 μl
5% TCA zum Abbruch der Reaktion zugegeben und die Reaktionsmischung
wurde während
10 Minuten bei 10000 × g
zentrifugiert. Der Überstand
wurde gesammelt und seine Extinktion wurde bei 280 nm gemessen.
Aus diesem Ergebnis wurde die Calpaininhibition berechnet. Die Calpain
inhibierenden Fraktionen wurden mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert
und die gereinigten Fraktionen wurden gegen Wasser dialysiert und
gefriergetrocknet. Auf diese Art wurde ungefähr 1 mg Produkt erhalten. Dieses
Produkt war ein Calpastatin ähnliches
Polypeptid, bei dem die RGDSG-Sequenz zwischen K80 und
P81 des HCSd42-Polypeptids eingeschoben
war. Es wurde HCSd342 genannt.
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Beispiel 2
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Herstellung eines Calpastatin ähnlichen
Polypeptids HCSd4210, in das die RGDS-Sequenz eingeschoben wurde:
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Zur Insertion der RGDS-Sequenz zwischen
G35 und P36 des
Calpastatin ähnlichen
Polypeptids HCSd42, das durch pHCSd42 kodiert wurde, wurde die folgende
DNA zur Verwendung bei der Induktion der Mutation synthetisiert.
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Der unterstrichene Teil ist die DNA,
die der einzuschiebenden RGDS-Sequenz entspricht. Die mit Sternchen
markierten Basen bilden eine NotI-Stelle, obwohl die Plasmidsequenz
des ursprünglichen
Plasmids geändert
ist, sind die entsprechenden Aminosäuren unverändert.
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Es wurden dieselben Verfahren wie
in Beispiel 1 verwendet, um ein Mutantenplasmid pHCSd4210 zu erhalten,
das HCSd4210 mit der NotI-Stelle als Index exprimierte. Danach wurde
E. coli JM109/pHCSd4210, das dieses Plasmid trug, kultiviert und
das die RGDS-Sequenz enthaltende Calpastatin ähnliche Polypeptid HCSd4210
wurde erhalten.
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Beispiel 3
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Herstellung des Calpastatin ähnlichen
Polypeptids HCSd427, in das die RGDS-Sequenz eingeschoben wurde:
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Zur Insertion der RGDS-Sequenz zwischen
S120 und A121 des
Calpastatin ähnlichen
Polypeptids HCSd42, das durch pHCSd42 kodiert wurde, wurde die folgende
DNA zur Verwendung bei der Induktion der Mutation synthetisiert.
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Der unterstrichene Teil ist die DNA,
die der einzuschiebenden RGDS-Sequenz entspricht. Die mit Sternchen
markierten Basen bilden eine NruI-Stelle, obwohl die Sequenz des
ursprünglichen
Plasmids geändert
ist, sind die entsprechenden Aminosäuren unverändert.
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Es wurden dieselben Verfahren wie
in Beispiel 1 verwendet, um ein Mutantenplasmid pHCSd427 zu erhalten,
das HCSd427 mit der NruI-Stelle als Index exprimierte. Danach wurde
E. coli JM109/pHCSd427, das dieses Plasmid trug, kultiviert und
das die RGDS-Sequenz enthaltende Calpastatin ähnliche Polypeptid HCSd427
wurde erhalten.
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Beispiel 4
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Herstellung des Calpastatin ähnlichen
Polypeptids HCSd4211, in das die RGDSG-Sequenz eingeschoben wurde:
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Ausgehend von pHCSd42 wurde die Deletionsmutante
pHCSd421 hergestellt. Das Herstellungsverfahren wurde in der japanischen
Patentanmeldung Nr. 126648/89 offenbart. pHCSd421 kodiert das Calpastatin ähnliche
Polypeptid, das durch pHCSd42 kodiert wurde, wobei die 37 Aminosäuren auf
der C-terminalen Seite wegelassen wurden und 96 Aminosäuren in
dem Polypeptid übrig
blieben. Einzelstrang-DNA wurde von pHCSd421 durch das in Beispiel
1 verwendete Verfahren hergestellt. Danach wurde ein Primer mit
derselben Sequenz wie der in der Mutagenese in Beispiel 1 verwendete
Primer zur Insertion der RGDSG-Sequenz zwischen K80 und
P81 verwendet. Das Verfahren war genau dasselbe
wie in Beispiel 1. Das Plasmid pHCSd4211, das das Calpastatin ähnliche
Polypeptid HCSd4211 exprimierte, in das die RGDSG-Sequenz eingeschoben worden
war, wurde erhalten. Dieses Plasmid pHCSd4211 wurde zum Transformieren
von E. coli JM109 Zellen in der üblichen
Weise verwendet. Die transformieren Zellen wurden E. coli JM109/pHCSd4211
genannt und im Fermentationsforschungsinstitut der Behörde für industrielle
Wissenschaft und Technologie unter FERMBP-2720 hinterlegt. Die Transformanten
wurden durch die Verfahren von Beispiel 1 kultiviert und HCSd4211
wurde aus einem Zellextrakt gereinigt.
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Beispiel 5
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Messung der Zelladhäsionsaktivität der Calpastatin ähnlichen
Polypeptide.
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Die Zelladhäsionsaktivität der die
RGDS-Sequenz enthaltenden Polypeptide, die in den Beispielen 1–4 erhalten
wurden, wurde unter Verwendung von BHK-Zellen gemessen.
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1. Herstellung von Proben.
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Die Proben wurden in 0,1 M NaHCO3 gelöst
und einer 400 μl
der gelösten
Probe wurde jeweils in eine Vertiefung einer Flachbodenplatte (Terumo)
mit 24 Vertiefungen gegeben und über
Nacht bei 4°C
zum Adsorbieren stehengelassen. Die Vertiefungen wurden mit PBS
gewaschen und dann wurde 500 μl
PBS, das 1% BSA enthielt, zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platte
wurde bei Raumtemperatur während
3–4 Stunden
inkubiert und die Vertiefungen wurden mit PBS gewaschen, bevor sie
in dem Zelladhäsionsaktivitätsassay
verwendet wurden.
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2. Herstellung von Zellsuspensionen.
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Subkulturen von BHK-Zellen wurden
mit PBS, das 0,25% Trypsin und 0,02% EDTA enthielt, bei 37°C während 2
Minuten zum Ablösen
der Zellen von der Platte behandelt und die Zellen wurden in 10
ml einer 1 : 1 Mischung aus eiskaltem Dulbeccos modifiziertem Eagles
(DME) Medium und HEPES physiologischer Salzlösung (137 mM NaCl und 3 mM
KCl in 20 mM HEPES Puffer, pH-Wert 7,1) suspendiert. Die Suspension
wurde zentrifugiert und der Überstand
wurde verworfen. Die Zellen wurden in 10 ml einer eiskalten Mischung
aus DME-Medium und HEPES physiologischer Salzlösung suspendiert, die 1 mg
Sojobohnen-Trypsininhibitor (STI)
enthielt. Die Suspension wurde zentrifugiert und der Niederschlag
wurde in einer eiskalten Mischung aus DME und HEPES physiologischer
Salzlösung
gewaschen, die kein STI enthielt. Diese Zellen wurden in derselben
Mischung mit einer Konzentration von 5 × 105 bis
1 × 106/ml suspendiert.
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3. Zelladhäsionsaktivitätsassay
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Zu jeder Vertiefung der Patte, an
die die Proben veranlasst wurden, zu haften, wurde 300 μl Zellsuspension
gegeben und die Platte wurde bei 37°C während 1 Stunde inkubiert. Dann
wurden die Vertiefungen dreimal mit einer Mischung aus DME-Medium und HEPES
bei 37°C
gewaschen und die nicht anhaftenden Zellen wurden entfernt. Die übrigen Zellen
wurden mit einer 4% Formalinlösung
in PBS fixiert und die Zellformen wurden mikroskopisch untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
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[Wirkungen der Erfindung]
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Wie vorstehend beschrieben, stellt
diese Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, mit dem einem Polypeptid,
das eine Calpain-inhibierende Aktivität aufweist, Zelladhäsionsaktivität verliehen
werden kann. Mit dieser Erfindung ist es möglich, die Affinität zwischen
den Zellen und dem Polypeptid zu erhöhen, wodurch die Arzneimittelwirkung
verstärkt
wird.
