DE3855449T2 - DNS-Klone von menschlichem Thrombomodulin - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung betrifft humanes Thrombomodulin und insbesondere den cDNS-Klon, der das gesamte humane Thrombomodulin darstellt.
- Thrombomodulin ist ein Thrombin bindendes Glykoprotein an der Endothelzelloberfläche, das Thrombin in einen Protein C- Aktivator umwandelt. Aktiviertes Protein C wirkt dann als Antikoagulans durch die Inaktivierung von zwei regulatorischen Proteinen des Gerinnungssystems, nämlich der Faktoren Va und VIIIa. Die letzteren beiden Proteine sind für die Funktion von zwei Koagulationsproteasen wesentlich, nämlich den Faktoren IXa und Xa. Daher spielt Thrombomodulin eine aktive Rolle bei der Bildung von Blutgerinnseln in vivo und kann als direktes oder indirektes Antikoagulans wirken.
- Thrombomodulin wurde aus Kaninchen (Esmon et al., J. Biol. Chem. 257, 859-864 (1982)), Rindern (Suzuki et al., Biochim. Biophys. Acta 882, 343-352 (1986); Jakubowski et al., J. Biol. Chem. 261, 3876-3882 (1986)), der menschlichen Lunge (Maruyama et al., J. Clin. Invest. 75, 987-991 (1985)) und der menschlichen Plazenta (Salem et al., J. Biol. Chem. 259, 12246-12251 (1984)) gereinigt. Das Humanprotein hat eine scheinbare Mr = 75 000 (nicht reduziert), die eine charakteristische Verschiebung zu Mr = 100 000 bei der Reduktion mit 2-Mercaptoethanol aufweist. Die immunhistochemische Untersuchung von Gewebeschnitten zeigte, daß Thrombomodulin im Endothel von Arterien, Venen, Kapillaren und Lymphgewebe weit verbreitet ist (Maruyama et al., J. Cell Biol. 101, 363-371 (1985)).
- Neuere Fortschritte in der Biochemie und rekombinanten DNS- Technologie ermöglichten die Synthese von spezifischen Proteinen, beispielsweise Enzymen, unter regulierten Bedingungen unabhängig vom Organismus, aus dem sie normalerweise isoliert werden. Diese biochemischen Syntheseverfahren verwenden Enzyme und subzelluläre Komponenten der Proteinsynthesesysteme lebender Zellen, entweder in vitro in zellfreien Systemen oder in vivo in Mikroorganismen. In jedem Fall ist das Hauptelement das Vorsehen einer Desoxyribonudeinsäure (DNS) mit spezifischer Sequenz, welche die Informationen enthält, die zur Spezifizierung der gewünschten Aminosäuresequenz erforderlich sind. Eine derartige spezifische DNS-Sequenz wird als Gen bezeichnet. Die Codierbeziehung, durch die eine Desoxyribonucleotidsequenz zur Spezifizierung der Aminosäuresequenz eines Proteins verwendet wird, ist wohlbekannt und funktioniert gemäß einer Gruppe von Grundprinzipien; siehe beispielsweise Watson, Molecular Biology of the Gene, 3. Aufl., Benjamin-Cummings, Menlo Park, Calif., 1976.
- Ein kloniertes Gen kann zur Spezifizierung der Aminosäuresequenz von durch in vitro Systeme synthetisierten Proteinen verwendet werden. RNS-gesteuerte Proteinsynthesesysteme sind im Stand der Technik etabliert. Doppelsträngige DNS kann induziert werden, Boten-RNS (mRNS) mit anschließender hochgenauer Translation der RNS-Sequenz in Protein in vitro zu erzeugen.
- Nun ist es möglich, spezifische Gene oder Teile hievon aus höheren Organismen, wie Menschen und Tieren, zu isolieren, und die Gene oder Fragmente in Mikroorganismen, wie Bakterien oder Hefen, zu transferieren. Das transferierte Gen wird repliziert und propagiert, wenn sich der transformierte Mikroorganismus repliziert. Demgemäß wird der transformierte Mikroorganismus mit der Fähigkeit versehen, das gewünschten Protein oder Gen, für das er codiert, beispielsweise ein Enzym, herzustellen, und er überträgt dann diese Fähigkeit an seine Nachkommen; siehe beispielsweise Cohen und Boyer, US-A-4 237 224 und 4 468 464.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die vollständige Codiersequenz des cDNS-Klons, der das gesamte humane Thrombomodulin darstellt, entwickelt.
- Die Thrombomodulin-Proteinsequenz enthält eine Aminoterminale Ligandenbindungsdomäne aus 223 Aminosäuren mit der Sequenz von Glu 22 bis Asp 244, wie in Fig.3 der Zeichnungen gezeigt.
- Die EGF-Homologieregion besteht aus 6 tandemwiederholten EGF-ähnlichen Domänen. Die Organisation von Thrombomodulin ist ähnlich jener des Rezeptors für Liporotein mit geringer Dichte (LDL), und das Protein ist homolog zu einer großen Anzahl anderer Proteine, die auch EGF-ähnliche Domänen enthalten, einschließlich Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Faktor XII, Protein C, Gewebeplasminogenaktivator und Urokinase. Die Homologie zwischen Aminosäuresequenzen der Proteinsegmente, für die das LDL-Rezeptorgen codiert, und einigen Proteinen des Blutgerinnungssystems wurde bisher von Südhof et al., Science 228, 815- 822 (1985), beschrieben.
- Es gibt fünf potentielle N-Glykosylierungsstellen im Thrombomodulinprotein mit der Sequenz Asn-X-Ser/Thr, worin X eine beliebige der 20 häufigsten Aminosäuren sein kann. Diese Stellen liegen an den Aminosäurepositionen Asn 47, Asn 115, Asn 116, Asn 382 und Asn 409. Eine Glykosylierung kann auch im Serin/Threonin-reichen Segment auftreten, das 8 Hydroxyaminosäuren unter seinen 34 Resten enthält. Diese OH-Stellen können mit O-gebundenen Kohlenhydratketten glykosyliert sein, wie in der entsprechenden Domäne des LDL-Rezeptors (Russell et al., Cell 37, 577-585 (1984)).
- Die ursprüngliche Quelle des genetischen Materials zur Entwicklung der Thrombomodulin-cDNS waren menschliche Nabelvenen- Endothelzellen. Derartige Zellen sind leicht aus menschlichen Gewebequellen nach der Geburt durch herkömmliche chirurgische Verfahren erhältlich. Das Primärgewebe kann im wesentlichen durch etablierte Methodologie kultiviert werden, wie von Jaffe et al., J. Clin. Invest. 52, 2745-2756 (1973), und Jaffe, Transplantation Proc. 12(3), Supp. 1, 49-53 (1980), beschrieben.
- Kurz gesagt wurde eine menschliche Nabelvenen-Endothelzellen-cDNS-Bibliothek im Expressionsvektor λgt11 durch affinitätsgereinigtes polyklonales Kaninchen-anti-Human-Thrombomodulin-IgG gescreent. Unter 7 Millionen unabhängig gescreenten Rekombinanten exprimierten 12 positive ein Protein, das sowohl von diesem polyklonalen Antikörper als auch von einem monoklonalen Mäuse-Antikörper gegen humanes Thrombomodulin-IgG erkannt wird. Der hier verwendete λ9t11 (lac5 nin5 c1857 S100) ist ein wohlbekannter und allgemein erhältlicher Lambdaphagen-Expressionsvektor. Seine Konstruktion und Restriktionsendonucleasekarte sind von Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198 (1983), beschrieben. Seine Verwendung beim Screening von menschlichen Plazenta- und Endothelzellen-cDNS-Bibliotheken ist von Ye et al., J. Biol. Chem. 262, 3718-3725 (1987), beschrieben.
- Thrombomodulin wurde aus menschlicher Plazenta zur Homogenität gereinigt, und tryptische Peptide wurden unter Verwendung eines Gasphasen-Sequenzers isoliert und sequenziert. Die von einem Peptid erhaltene Sequenz,
- ANCEYQCQPLNQTSYLCVCAEGFAP,
- stimmte genau mit jener überein, die aus der cDNS-Sequenz des Isolats, λHTm15, vorhergesagt wurde, wodurch bestätigt wurde, daß sie für humanes Thrombomodulin codiert. Northern Blotting mit diesem cDNS-Insert als Sonde identifizierte eine einzelne 3,7 kb MRNS-Art in der menschlichen Plazenta- und Endothelzellen-poly(A) &spplus;RNS.
- Obwohl die Beschreibung mit Ansprüchen endet, die den Gegenstand der vorliegenden Erfindung besonders hervorheben und eindeutig beanspruchen, wird angenommen, daß die Erfindung durch die folgende detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung in Verbindung mit den beigeschlossenen Zeichnungen besser verständlich wird, in denen kurz gefaßt:
- Fig.1 eine graphische Darstellung ist, welche die chromatographischen Elutionsprofile zeigt, die aus vollständigen tryptischen Verdauen von reduziertem, alkylierten Thrombomodulin erhalten werden. Darstellung (a) zeigt die Trennung durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC); Darstellung (b) zeigt die Trennung durch Anionenaustauschchromatographie; und Darstellung (c) zeigt die Trennung eines Pools von Darstellung (b), der durch Umkehrphasen-HPLC getrennt wurde;
- Fig.2 die Restriktionsenzymkarte des gesamten Thrombomodulin-cDNS-Klons λHTm15 und von zwei anderen Isolaten zeigt, die teilweise Thrombomodulin-cDNS-Sequenzen darstellen, λHTm10 und λHTm12;
- Fig.3 die Nucleotidsequenz der menschlichen Thrombomodulin- cDNS und die Aminosäuresequenz des Thrombomodulin-Proteins zeigt. Die 3693 bp cDNS des Klons λHTm15 in Fig.2 ist in die Darstellungen (a) und (b) in Fig.3 geteilt;
- Fig.4 die Aminosäuresequenzen von sechs tandemwiederholten EGF-ähnlichen Domänen in Thrombomodulin in Fig.3 zeigt;
- Fig.5 den Northern Blot der mRNS aus kultivierten Zellen zeigt, die mit dem Thrombomodulin-cDNS-Insert von λHTm10 in Fig.2 sondiert wurden;
- Fig.6 die Chromosomenlokalisation des humanen Thrombomodulin-Gens auf Nitrocellulosefiltern zeigt; und
- Fig.7 eine schematische Darstellung ist, welche die Strukturdomänen von humanem Thrombomodulin zeigt.
- Hier wird die biochemische Standard-Nomenklatur verwendet, wobei die Nucleotidbasen als Adenin (A), Thymin (T), Guanin (G) und Cytosin (C) bezeichnet sind. Entsprechende Nucleotide sind beispielsweise Desoxyguanosin-5'-triphosphat (DGTP). Aminosäuren sind wie folgt entweder durch Abkürzungen mit drei Buchstaben oder einem Buchstaben angegeben:
- Der Zweckmäßigkeit halber sind wie folgt bestimmte Restriktionsendonudeasen auch durch Abkürzungen mit einem Buchstaben in Fig.2 angegeben:
- BamH I = B
- Hind III = H
- Kpn 1 = K
- Pst I = P
- Sma I = S Dies sind allgemein erhältliche Restruktionsendonucleasen mit den folgenden Restriktionssequenzen und (mit Pfeilen angegeben) Spaltungsmustern:
- Zur detaillierteren Erläuterung spezifischer bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung wurden als Beispiele die folgenden Labor-Vorbereitungsarbeiten durchgeführt
- Materialien: Desoxy-7-deazaguanosin-5'-triphosphat wurde von Boehringer Mannheim erhalten. P-markierte Desoxyribonudeotide und Desoxyadenosin-5'[α-³&sup5;S]thiotriphosphat wurden von Amersham Radiochemicals erhalten. TPCK-Trypsin wurde von Cooper Biomedical, Malvern, PA, erhalten. Ziegen-anti-Kaninchen- IgG und Ziegen-anti-Maus-IgG, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, wurden von Promega Biotec erhalten. RNS-Größenstandards wurden von Bethesda Research Laboratories erhalten.
- Antikörper gegen humanes Thrombomodulin: Ein monoklonaler Antikörper gegen humanes Thrombomodulin wurde isoliert, wie früher von Maruyama und Majerus, J. Biol., Chem. 260, 15432- 15438 (1985), beschrieben. Polyklonale Antikörper wurden gemäß dem Verfahren von Vaitukaitus, Methods Enzymol. 73, 46-52 (1981), hergestellt, indem 50 µg humanes Thrombomodulin jedem von zwei männlichen Kaninchen injiziert wurden. Serum und gereinigtes IgG wurden hergestellt und auf die Inhibierung der Thrombomodulin-funktionellen Wirksamkeit getestet, wie von Salem et al., J. Biol. Chem. 259, 12246-12251 (1984), beschrieben. Polyklonales IgG wurde affinitätsgereinigt, indem 2,3 mg gereinigtes IgG auf eine Thrombomodulin-Affigel-15-Säule (165 µg Thrombomodulin/4 ml Affigel-15), äquilibriert mit 50 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), pH 7,5, 150 mM NaCl, aufgebracht wurden. Nach dem Waschen mit demselben Puffer wurde gebundenes IgG mit 200 mM Glycin, pH 3,0, eluiert und sofort gegen 50 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, dialysiert. Die Ausbeute an Antikörper betrug 35 µg.
- Humanes Thrombomodulin wurde gereinigt, wie früher von Salem et al., supra, beschrieben, außer daß die Ionenaustauschchromatographie durch Immunoaffinitätschromatographie auf polyklonalem anti-Thrombomodulin-IgG-Affigel-10 ersetzt wurde (Ishii und Majerus, J. Clin. Invest. 76, 2178-2181 (1985)). 1,0 bis 1,3 mg Thrombomodulin wurde durch Ultrafiltration in einem Microprodicon (Bio-Molecular Dynamics, Beaverton, Oregon) auf 1 mg/ml konzentriert und bei -20ºC in 90 % Aceton ausgefällt. Der Niederschlag wurde unter einem Stickstoffstrom getrocknet und in 0,4 M Tris-HCl, 0,1 % (M/V) Natriumdodecylsulfat, pH 8,8, erneut gelöst. 2-Mercaptoethanol wurde auf 0,15 M zugesetzt und die Probe 30 min lang bei 37ºC inkubiert. Jodacetamid wurde auf 0,25 M zugesetzt und die Probe 30 min lang bei 25ºC im Dunklen inkubiert, dann wurde 2-Mercaptoethanol auf 0,3 M zugesetzt. Die Probe wurde erneut mit 90 % Aceton bei -20ºC ausgefällt und unter Stickstoff getrocknet, dann in 0,5 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,5, erneut gelöst. Alternativ dazu wurde in einer unterschiedlichen Zubereitung nach der anfänglichen Ausfällung Thrombomodulin in 6 M Guanidin, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,8, erneut gelöst und ein 5-facher Molüberschuß von Dithiothreitol gegenüber Cystin zugesetzt, gefolgt von 30 min Inkubieren unter Stickstoff bei 50ºC.
- Der pH wurde mit HCl auf 8,0 eingestellt, ein 5-facher Molüberschuß von Jodacetamid zugesetzt und die Probe 40 min lang bei 25ºC inkubiert. Überschüssiges Jodacetamid wurde mit einem 3-fachen Molüberschuß von 2-Mercaptoethanol umgesetzt und die Probe gegen 0,5 M Ammoniumbicarbonat, pH 8,5, dialysiert. N-Tosyl-L-phenylalaninchlorrnethylketon (TPCK)-trypsin wurde zugesetzt (1/100, M/V), und Proben wurden 24 h lang bei 37ºC inkubiert, dann lyophilisiert. Die tryptischen Peptide wurden entweder direkt auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule oder zuerst auf eine Mono-Q-Anionenaustauschersäule (5 x 50 mm, Pharmacia), gefolgt von einer Umkehrphasen-HPLC-Säule, aufgebracht. Die Mono-Q-Säule wurde auf einem Varian 500-HPLC-System in 20 mM Tris-HCl, pH 9,0, äquilibriert und mit einem linearen 0 bis 1 M NaCl Gradienten bei 1 ml/min 60 min lang eluiert. Der Abfluß wurde auf ein Absorptionsvermögen bei 215 nm überwacht. Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet, wie in der detaillierten Beschreibung in Fig.1 nachstehend angegeben.
- Proben wurden auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule (Unimetrics- Knauer, Licosorb RP-8, 5 µm), äquilibriert mit 0,1 % Trifluoressigsäure, aufgebracht und mit einem Gradienten von 0 bis 15 % (V/V) Acetonitril in 0,1 % Trifluoressigsäure 10 min lang eluiert, dann bis 40 % (V/V) Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure 75 min lang bei 0,7 ml/min. Der Abfluß wurde auf ein Absorptionsvermögen bei 215 nm überwacht. Einzelne Peaks wurden vereinigt, unter einem Stickstoffstrom nahezu zur Trockene eingedampft und unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 470A-Gasphasen-Proteinsequenzers sequenziert (Hunkapiller et al, Methods Enzymol. 91, 399-413 (1983); Hunkapiller und Hood, ibid., 486-493).
- Isolierung von cDNS-Klonen für humanes Thrombomodulin: Die humane Nabelvenen-Endothelzellen-cDNS-Bibiothek in λgt11, Verfahren zum Screenen von cDNS-Bibliotheken mit Antikörpern, Herstellung und Verwendung synthetischer Oligonudeotide und cDNS- Restriktionsfragmentsonden, Plaque-Reinigung des λ-Phagen und Herstellung von λ-Phagen-DNS waren wie früher von Ye et al., J. Biol. Chem. 262, 3718-3725 (1987), beschrieben, außer daß der Ziegen-anti-Kaninchen- oder Ziegen-anti-Maus-Detektionsantikörper mit alkalischer Phosphatase konjugiert wurde (Blake et al., Anal. Biochem. 136, 175-179 (1984)). Das affinitätsgereinigte Kaninchen-anti-Human-Thrombomodulin wurde bei einer Konzentration von 011 µg/ml verwendet. Das monoklonale Mäuse-anti-Human- Thrombomodulin wurde bei einer Konzentration von 2 pg/ml verwendet.
- DNS-Seguenzanalyse: DNS-Restriktionsfragmente wurden in die wohlbekannten und allgemein erhältlichen Vektoren pUC18, pUC19, M13mp18 oder M13mp19 subkloniert, wie früher von Ye et al., supra, beschrieben. Die Nucleotidsequenz wurden an beiden Strängen durch das Didesoxy-Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977), unter Verwendung von Desoxyadenosin-5'[α-³&sup5;S]thiotriphosphat und Puffer-Gradientengelen (Biggin et al., ibid., 80, 3963-3965 (1983)) bestimmt. Deletionen wurden unter Verwendung von Exonudease III erzeugt (Henikoff, Gene(Amst.) 28, 351-359 (1984)). Zurückbleibende Lücken wurden durch Sequenzierung mit synthetischen Oligonucleotid-Primern aufgefüllt. Desoxyguanosin-5'-triphosphat (DGTP) in der Sequenzierungsreaktion wurde durch Desoxy-7-deazaguanosin-5'-triphosphat ersetzt, um die Genauigkeit der Sequenzierung in G-C-reichen Regionen zu erhöhen (Mizusawa et al., Nucleic Acids Res. L4, 1319-1324 (1986)). Die wenigen anhaltenden Kompressionen wurden mittels Durchführung von Elektrophorese an 6 % (M/V) Acrylamid-Gelen, enthaltend 7 M Harnstoff und 40 % (V/V) Formamid, getrennt.
- Northern Blot-Analyse: Poly(A)+RNS wurde aus menschlicher ausgereifter Plazenta, menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen, HepG2-Zellen und auch aus U937-Zellen hergestellt, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von Phorbol-12-myristat-13-acetat kultiviert wurden, wie früher von Ye et al., supra, beschrieben. RNS wurde aus menschlichem Gehirn hergestellt. Elektrophorese durch Agarose in Anwesenheit von Formaldehyd, Transfer zu Nitrocellulose und Hybridisierung wurden wie früher von Ye et al., supra, beschrieben durchgeführt. Für jede Quelle, die kein Hybridisierungssignal für humanes Thrombomodulin ergab, bestätigte eine Kontroll-Hybridisierung entweder mit Human-γ-actin (Gunning et al., Mol. Cell Biol. 3, 787-195 (1983)) oder menschlicher Gewebefaktor-cDNS (Scarpati et al., Fed. Proc., im Druck (1987)), daß RNS effizient transferiert wurde.
- Chromosomenlokalisierung des menschlichen Thrombomodulin- Gens: Menschliche Chromosomen-Suspensionen wurden durch das Verfahren von Sillar und Young, J. Hist. Cytochem. 29, 74 (1981) hergestellt, mit den allgemein erhältlichen Chromophoren Hoechst 33258 und Chromomycin A3 angefärbt, unter Verwendung eines dualen Laserflußcytometers sortiert, an cDNS-Sonden hybridisert, und Signale wurden durch Methodologie wie früher von Murray et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 142(1), 141-146 (1987), beschrieben detektiert; siehe auch Bartholid et al., Methods Enzymol., im Druck (1987). Das cDNS-Insert von λHTm10 wurde mit Klenow-Fragment (DNS Polymerase 132, großes Fragment) (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 132, 6-10 (1983)) auf eine spezifische Aktivität von ≥ 10&sup9; cpm/µg markiert. Zwei komplette Filtersätze der 22 Autsomen sowie beider Geschlechtschromosome wurden untersucht, sowie Southern Blots von humaner Genom-DNS, verdaut mit EcoRI (Chomczynski und Qasba, Biochem. Biophys. Res. Commun. 122, 340-344 (1984)).
- Comduteranalyse der Sequenzen: Die menschliche Thrombomodulin-Proteinsequenz wurde mit allen Einträgen in der NBRF- Proteinsequenz-Datenbank (Georgetown University, Washington, DC, Ausgabe 11.0, 4. Dezember 1986) mit den Computerprogrammen SEARCH (Dayhoff et al., Methods Enzymol. 91, 524-545 (1983)) und FASTP (Lipman und Pearson, Science 227, 1435-1441 (1985)) verglichen. Die Nucleotidsequenz des cDNS-Isolats λHTm15 wurde mit allen Einträgen in der Genbank Gensequenz-Datenbank (BBN Laboratories Inc., Cambridge, MA, Ausgabe 48.0, 16. Februar 1987) mit dem Programm FASTN (Lipman und Pearson, supra) verglichen. Die Anordnung von EGF-ähnlichen Domänen in Thrombomodulin und anderen Proteinen, einschließlich einer Teilsequenz von Rinder-Thrombomodulin (Jackman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8834-8838d (1986)), wurde mit den Programmen RELATE und ALIGN (Dayhoff et al., supra) durchgeführt. Die Nucleotid- Sequenzen von humanem und Rinder-Thrombomodulin wurden unter Verwendung des Programms NUCALN (Wilbur und Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 726-730 (1983)) angeordnet. Hydropathie- oder Hydrophilie-Profile des humanen Thrombomodulin-Vorläufers wurden durch die Verfahren von Hopp und Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 3824-3828 (1981), und Kyte und Doolittle, J. Mol. Biol. 157, 105-132 (1982), berechnet.
- Die Ergebnisse der obigen Labor-Vorarbeiten, die zur vollständigen Codiersequenz des das gesamte humane Thrombomodulin darstellenden cDNS-Klons führen, werden durch die folgende detaillierte Beschreibung der Fig.1 bis 7 der Zeichnungen weiter anhand von Beispielen erläutert.
- Fig.1 zeigt die Trennung tryptischer Peptide von Thrombomodulin in drei Darstellungen a, b und c wie folgt: (a) Ein vollständiger tryptischer Verdau von reduziertem, alkylierten Thrombomodulin wurde hergestellt und auf einer Licosorb RP-8- Säule chromatographiert, wie oben beschrieben. 700 µg Protein wurden injiziert und 1 min (0,7 ml) Fraktionen gesammelt. Die durchgehende Linie ( ) zeigt das Absorptionsvermögen bei 215 nm, und die strichlierte Linie (---) zeigt % Acetonitril im Säulen-Puffer. Der mit dem Pfeil (O) markierte Peak entspricht dem Peptid T-R1. (b) Ein vollständiger tryptischer Verdau von Thrombomodulin wurde hergestellt und auf einer Mono-Q-Säule chromatographiert, wie oben beschrieben. Nach der Injektion von 700 µg Protein wurden 1 ml Fraktionen gesammelt. Die durchgehende Linie ( ) zeigt das Absorptionsvermögen bei 215 nm, und die strichlierte Linie (---) zeigt die Leitfähigkeit des Säulen- Puffers. Der Grenzpuffer hatte eine Leitfähigkeit von 41 mmho. Die durch den Balken angegebenen Fraktionen wurden vereinigt (T-M1) für eine weitere Reinigung auf einer Umkehrphasensäule, wie in Darstellung c gezeigt. (c) Die vereinigte Probe T-M1 von Darstellung b wurde auf einer Licosorb RP-8-Säule chromatographiert, wie in Darstellung a. Das nach ungefähr 55 min eluierende Dublett ergab die Peptide T-M1-R1 und T-M1-R2, und der einzelne Peak nach ungefähr 102 min ergab T-M1-R3.
- Fig.1 zeigt daher die Ergebnisse der Herstellung und Sequenzierung tryptischer Peptide von humanem Thrombomodulin, wobei Thrombomodulin aus menschlicher Plazenta zur Homogenität gereinigt, reduziert und carboxyamidomethyliert und mit Rinder- Trypsin verdaut wurde. Die erhaltene Komplex-Mischung von Peptiden wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Darstellung a) getrennt, wobei das Peptid T-R1 erhalten wurde. Nachfolgende tryptische Verdaue wurden zuerst durch Anionenaustauschchromatographie getrennt, und Pools der einzelnen Peaks wurden durch Umkehrphasenchromatographie weiter getrennt. Beispielsweise ergab Pool T-M1 aus einer Mono-Q-Säule (Darstellung b) die homogenen Peptide T- M1-R1, T-M1-R2 und T-M1-R3 nach Umkehrphasenchromatographie (Darstellung c). Ein anderes Peptid wurde unter Verwendung ähnlicher Verfahren wie oben beschrieben isoliert. Die Teilsequenzen von fünf Peptiden, die insgesamt 62 Aminosäurereste enthielten, wurden bestimmt.
- Fig.2 zeigt die Restriktionskarte von Thrombomodulin-cDNS- Isolaten. Die 5'- und 3'-Enden der Restriktionskarte sind markiert. Ausgewählte Restriktionsstellen, die beim Subklonieren der cDNS-Inserts zur Sequenzierung nützlich waren, sind gezeigt: BamHI, B; HindIII, H; KpnI, K; PstI, P; SmaI, S. Die dünnen Segmente bezeichnen nicht-codierende Sequenzen, und das dicke Segment bezeichnet den offenen Leserahmen, der für Thrombomodulin codiert. Der Teil der Sequenz, der in jedem der cDNS-Isolate λHTm10, λHTm12 und λHTm15 enthalten ist, ist mit den dünnen nicht ausgefüllten Balken angegeben. Der Maßstab ist in Kilobasen (kb).
- Fig.2 zeigt daher die Ergebnisse des Screenings einer Endothelzellen-λgt11-cDNS-Bibliothek und Charakterisierung rekombinanter Proteine, wobei die cDNS-Bibliothek mit affinitätsgereinigtem Kaninchen-anti-Human-Thrombomodulin-IgG gescreent wurde. Unter den 7 x 10&sup6; gescreenten unabhängigen rekombinanten Klonen exprimierten 12 ein Fusionsprotein, das sowohl vom polyklonalen Antikörper als auch von einem monoklonalen Antikörper gegen humanes Thrombomodulin erkannt wurde. Die cDNS-Inserts der 12 Isolate wurden in pUC19 zur weiteren Charakterisierung subkloniert. Die Länge der Inserts lag im Bereich von 1,2 kb bis 1,7 kb. Obwohl alle 12 Isolate anfänglich durch dieselben polykloanlen und monoklonalen Antikörper selektiert wurden, fielen sie durch Kreuzhybridisierung in drei nicht miteinander zusammenhängende Gruppen mit einem, zwei oder neun Mitgliedern. Repräsentanten jeder Gruppe wurden zum Vergleich mit einer unabhängig bestimmten Proteinsequenz sequenziert. Die 5'-Sequenz eines Isolats der Gruppe mit zwei Mitgliedern, λHTm10, codierte genau für die Sequenz des Peptids T-R1. Ähnlich codierte die 5'- Sequenz des zweiten Mitglieds dieser Hybridisierungsgruppe, λHTm12, für die Peptide T-M1-R1 und T-MO-R1, und die 3'-Sequenzen beider Isolate überlappten einander, wodurch bestätigt wurde, daß sie für Thrombomodulin codierten.
- Das cDNS-Insert des Klons λHTm10 wurde für das Screening von 1 x 10&sup6; Rekombinanten aus der Endothelzellen-cDNS-Bibliothek durch Plaque-Hybridisierung verwendet. 90 positive Klone wurden detektiert, und die Hälfte hievon wurde Plaque-gereinigt. 45 Klone wurden dann erneut mit einer Oligonucleotid-Sonde gescreent, die dem 5'-Ende des Klons λHTm12 entsprach. 9 positive Klone wurden detektiert, und unter ihnen enthielten 4 Klone einen poly(A)-Schwanz, wie durch Hybridisierung an eine Oligo(dt)-Sonde bestimmt. Die Restriktionsanalyse zeigte, daß diese 4 Klone λHTm15 das größte cDNS-Insert aus 3,7 bp enthielten. Die Beziehung der drei cDNS-Isolate, λHTm10, λHTm12 und λHTm15, zur Restriktionskarte der gesamten Thrombomodulin-cDNS ist in Fig.2 gezeigt.
- Fig.3 zeigt die Nucleotid- und translatierte Aminosäuresequenz von humanem Thrombomodulin-cDNS-Isolat λHTm15. Nucleotide und Aminosäuren sind rechts numeriert. Nucleotid 1 wurde dem ersten Rest des cDNS-Inserts zugeordnet, und Aminosäure 1 wurde dem ersten Methionin des offenen Leserahmens zugeordnet, der für die Thrombomodulin-Peptidsequenzen codiert. Potentielle N-gebundene Glykosylierungsstellen sind mit ausgefüllten Kreisen ( ) bezeichnet. Sequenzen, die mit jener übereinstimmen, die für tryptische Peptide von Thrombomodulin bestimmt wurde, sind durch fette Linien darüber markiert. Die 6 EGF-ähnlichen Wiederholungen sind unterstrichen und numeriert. Potentielle Polyadenylierungs- oder Verarbeitungssignale AATAAA sind durch fettes Unterstreichen bezeichnet. Die in λHTm10 dargestellte Sequenz enthält die Nucleotide 1208-2403, und λHTm12 enthält die Nucleotide 671- 2142.
- Nucleotidsequenz von Thrombomodulin-cDNS-Isolaten: Das cDNS-Insert von λHTm12 (1,5 kb) wurde an beiden Strängen vollständig sequenziert. Das cDNS-Insert von λHTm15 (3,7 kb) wurde zumindest an einem Strang sequenziert, und jene Regionen an den 5'- und 3'-Enden, die mit λHTm12 nicht überlappten, wurden an beiden strängen sequenziert. Daher wurde die vollständige Sequenz zumindest einmal an beiden Strängen bestimmt. Die Codiersequenz von Thrombomodulin hat einen äußerst hohen G+C Gehalt von 68 %, der die Sequenzierung aufgrund häufiger Kompressionen schwierig machte. Alle wurden unter Verwendung von Desoxy-7-deazaguanosin-5'-triphosphat anstelle von DGTP getrennt, außer einer kurzen Sequenz zwischen den Nucleotiden 395-405. Diese Sequenz wurde eindeutig an beiden Strängen unter Verwendung von Sequenzierungsgelen, enthaltend 40 % (V/V) Formamid zusätzlich zu Harnstoff, getrennt. Im Gegensatz zum hohen G+C Gehalt der Codiersequenz hat die 3'-Nicht-Codiersequenz nur 43 % G+C.
- Die Nucleotid- und translatierte Aminosäuresequenz von λHTm15 ist in Fig.3 gezeigt. Das erste ATG-Codon tritt am Nucleotid 147 auf, eingebettet in einer Sequenz, die mit der vorgeschlagenen optimalen Sequenz zur Initiation durch eukaryotische Ribosomen, ACCATGG, übereinstimmt (Kozak, Cell L4, 283- 292 (1986)). Die vorhergehenden 146 Nucleotide der vorgeschlagenen 5'-Nicht-Codiersequenz haben kein Terminationscodon im gleichen Leserahmen wie das ATG-Codon. Dieses vorgeschlagene Initiator-Codon beginnt einen offenen Leserahmen von 1725 Nucleotiden, gefolgt vom TGA-Terminationscodon und 1779 weiteren Nucleotiden der 3'-Nicht-Codiersequenz vor einem poly(A)-Schwanz aus 40 Nucleotiden. Es gibt vier potentielle Polyadenylierungs- oder Verarbeitungssignale mit der Sequenz AATAAA (Proudfoot und Brownlee, Nature 252, 359-362 (1981)), wobei das letzte 21 Nucleotide vor dem poly(A)-Schwanz beginnt.
- Es gibt einen einzigen Nucleotid-Unterschied zwischen λHTm12 und λHTm15 am Nucleotid 1564, das ein T bei λHTm12 und ein C bei λHTm15 ist. Dies ändert die codierte Aminosäuresequenz von Ala-473 auf Val. Dies könnte auf eine Nucleotidsequenz- Polym6rphie zurückzuführen oder das Ergebnis eines Fehlers bei der DNS-Replikation während der cDNS-Klonierung sein.
- Fig.4 zeigt die Anordnung der EGF-ähnlichen Wiederholungen von humanem Thrombomodulin. Die EGF-ähnlichen Wiederholungen von Thrombomodulin sind mit 1 bis 6 numeriert, wie in Fig.3. Die untere Linie ist die Sequenz der dritten EGF-ähnlichen Domäne des humanen EGF-Vorläufers, der Reste 401-436 (Bell et al., 1986), einer repräsentativen Sequenz zum Vergleich. Bindestriche (-) bezeichnen eingeführte Lücken zur Optimierung der Anordnung. In zwei oder mehreren der ausgerichteten Sequenzen identische Reste sind mit Kästchen versehen.
- Aminosäureseguenz von Thrombomodulin und Homologie zu anderen Proteinen: Die cDNS-Sequenz codiert für ein Protein aus 575 Aminosäuren mit einer berechneten Mr = 60 328. Es gibt fünf potentielle N-Glykosylierungsstellen mit der Sequenz Asn-X-Ser/Thr (Fig.3). Die Amino-terminalen 21 Reste sind hydrophob mit den Charakteristika eines tryptischen Signalpeptids (von Heijne, Eur. J. Biochem. 133, 17-21 (1983), J.Mol. Biol. 184, 99-105 (1985)), und die vorhergesagte Spaltungsstelle durch Signalpeptidase liegt zwischen Ala-21 und Glu-22. Der übrige Teil der Proteinsequenz enthält die Sequenz der aus humanem Plazentra-Thrombomodulin isolierten fünf tryptischen Peptide (Fig.3).
- Das Signalpeptid wird gefolgt von einer relativ Cysteinarmen Domäne aus 223 Aminosäuren und einer Cystein-reichen Region aus 236 Resten, die aus sechs EGF-ähnlichen Tandemwiederholungen aus jeweils 40 Resten bestehen. Die Anordnung dieser EGF-Wiederholungen mit einer repräsentativen Domäne aus dem humanen EGF-Vorläufer (Bell et al., Nucleic Acids Res. 14, 8427-8446 (1986)) ist in Fig.4 gezeigt. Die Amino-terminalen und EGF Homologieregionen werden sequentiell von einer Serin/Threoninreichen Domäne aus 34 Aminosäuren, einem hydrophoben Segment aus 23 Aminosäuren, das die Plasmidmembran überspannen kann, und einem vorgeschlagenen cytoplasmatischen Schwanz aus 38 Aminosäuren gefolgt.
- Die Aminosäuresequenz von Thrombomodulin wurde mit allen Sequenzen in der NBRF Proteinsequenz-Datenbank verglichen, und die Nucleotidsequenz von λHTm15 wurde mit allen Einträgen in der Genbank Gensequenz-Datenbank verglichen, wie oben angegeben. Abgesehen von EGF-ähnliche Domänen enthaltenden Proteinen zeigten keine Protein- oder DNS-Sequenzen eine signifikante Ähnlichkeit mit humanem Thrombomodulin.
- Fig.5 zeigt den Northern Blot von RNS aus kultivierten Zellen, die mit Thrombomodulin-cDNS sondiert wurden. Das cDNS- Insert von λHTm10 wurde zum Sondieren eines Northern Blots verwendet, wie oben beschrieben. Die Banden enthalten 10 µg (Plazenta) oder 5 µg (Endothel) poly(A)+RNS. Die Positionen von RNS-Standards sind rechts in absteigender Reihenfolge angegeben: 9,49, 7,46, 4,40, 2,37 und 1,35 kb. Die interpolierte Größe der Thrombomodulin-mRNS beträgt 3,7 kb.
- Größenauftreten von Thrombomodulin-mRNS in Geweben und kultivierten Zellen: Die Verteilung von mRNS für humanes Thrombomodulin wurde durch Northern Blotting untersucht (Fig.5). Eine einzelne mRNS-Art aus 3,7 kb wurde in menschlicher Plazenta- und Endothelzellen-poly(a)+RNS detektiert. Thrombomodulin-mRNS wurde in poly(A)+RNS aus menschlichen Hepatom-Hepg2-Zellen oder der Monocyten U937-Zellinie nicht detektiert. Außerdem wurde keine Hybridisierung mit 10 µg menschlicher Gehirn-poly(A)+RNS detektiert (Daten nicht gezeigt).
- Fig.6 zeigt die Chromosomenlokalisation des menschlichen Thrombomodulin-Gens. Die Zeichen 1-22, X und Y auf den Nitrocellulosefiltern geben das in jedem Fleck vorliegende menschliche Chromosom an, das mit strichlierten Kreisen umgeben ist.
- Chromosomenlokalisation des Thrombomodulin-Gens: Das Insert von λHTm10 wurde an menschliche Chromosomen hybridisiert, die durch Fluoreszenz-aktivierte Flußsortierung gereinigt wurden. Zwei komplette Sätze von 22 Autosomen und die X- und Y-Chromosomen wurden getestet, wobei beide Signale nur mit Chromosom 20 ergaben (Fig.6).
- Die Figur zeigt die Strukturdomänen von humanem Thrombomodulin. Die Organisation von Thrombomodulin ist schematisch dargestellt, wobei der Amino-Terminus (NH&sub2;) und Carboxy-Terminus (COOH) des Proteins markiert sind. Potentielle N-Glykosylierungsstellen sind angegeben (Y). Hydroxyaminosäuren in der Serin/Threonin-reichen Domäne und der cytoplasmatische Schwanz sind angegeben (-OH). Cysteinreste in der transmembranen und cytop]3asmatischen Domäne sind ebenfalls angegeben (C).
- Der hier definierte cDNS-Klon λHTm15 kann zum Klonieren der humanen Thrombomodulin-DNS in eukaryotischen sowie prokaryotischen Wirtszellen durch herkömmliche rekombinante DNS-Technologie verwendet werden, wie sie für die Synthese verschiedener anderer biologisch aktiver Proteine eingesetzt wurde; siehe beispielsweise die kurze Übersicht von Miller und Baxter, Drug Devel. Res. 1, 435-454 (1981). Da die prokarytischen Wirtszellen, z.B. E. coli, üblicherweise nicht glykosylieren, können verschiedenste neue humane Thrombomodulin-Derivate durch die Expression in derartigen Wirtszellen erzeugt werden. Es ist auch klar, daß die Erfindung humanes Thrombomodulin einschließt, aus dem Sequenzen, die für die humane Thrombomodulin-Aktivität nicht erforderlich sind, abgespaltet wurden, beispielsweise die Signalsequenzen oder das N-terminale Methionyl.
- Das Thrombomodulin kann zur Verabreichung an Menschen durch herkömmliche Mittel verwendet werden, vorzugsweise in Formulierungen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln oder Trägern. Der bevorzugte Verabreichungsweg ist parenteral, insbesondere intravenös. Die intravenöse Verabreichung von humanem Thrombomodulin in Lösung mit normaler physiologischer Kochsalzlösung, menschlichem Albumin und anderen derartigen Verdünnungsmitteln und Trägern dient als Beispiel. Andere geeignete Formulierungen des aktiven humanen Thrombomodulins in pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln und Trägern in therapeutischer Dosierungsform können durch Bezugnahme auf allgemeine Texte in der Pharmazie hergestellt werden, wie beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Hrg. Arthur Osol, 16. Aufl., 1980, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania.
Claims (4)
1. Humanes Thrombomodulin-Proteinfragment, welches die
Aminoterminale Ligandenbindungsdomäne aus 223 Aminosäuren mit der
Sequenz von Glu 22 bis Asp 244, wie in Fig.3 der Zeichnungen
gezeigt, umfaßt.
2. Humanes Thrombomodulin-Proteinfragment nach Anspruch 1,
welches die EGF-Homologieregion aus 236 Aminosäuren mit der
Sequenz von Cys 245 bis Cys 480, wie in Fig.3 der Zeichnungen
gezeigt, enthält.
3. Humanes Thrombomodulin-Proteinfragment nach Anspruch 2,
welches das Serin/Threonin-reiche Segment aus 34 Aminosäuren mit
der Sequenz von Asp 481 bis His 514, wie in Fig.3 der
Zeichnungen gezeigt, enthält.
4. Humanes Thrombomodulin-Proteinfragment nach Anspruch 31
welches die Membranüberspannungsdomäne aus 23 Aminosäuren mit
der Sequenz von Ser 515 bis Cys 537, wie in Fig.3 der
Zeichnungen gezeigt, enthält.
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