DE69839123T2

DE69839123T2 - Prostattumor polynukleotid- und antigenzusammensetzungen

Info

Publication number: DE69839123T2
Application number: DE69839123T
Authority: DE
Inventors: Reiner San Carlos LAUS; Michael H. Redwood City SHAPERO; Larisa Atherton TSAVALER
Original assignee: Dendreon Corp
Current assignee: Dendreon Corp
Priority date: 1997-08-20
Filing date: 1998-08-18
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2018-08-19
Also published as: NZ503404A; EP1005549B1; US6194152B1; EP1005549A2; ES2301208T3; HK1029139A1; WO1999009166A3; CA2300364A1; ATE386117T1; DE69839123D1; AU9021898A; AU744875B2; CA2300364C; WO1999009166A2; JP2001514889A; JP4234319B2

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue codierende Sequenzen und Peptide, die von Prostatatumoren stammen, und in vitro-Verfahren zum Nachweisen des Vorliegens solcher Tumorzellen.
Hintergrund der Erfindung
Das Prostatakarzinom ist eine Form von Krebs, die in den Vereinigen Staaten jährlich bei etwa 250.000 Männer auftritt, so dass es sich um eine der häufigsten Krebserkrankungen bei Amerikanern handelt. Außerdem ist es in diesem Land bei Männern die zweitwichtigste Ursache von Todesfällen, die mit Krebs zusammenhängen. Während sich die Fünfjahres-Überlebensraten für Prostatakarzinom innerhalb der letzten Jahrzehnte im Allgemeinen verbessert haben, hat die Behandlung für die fortgeschrittene, metastatische Form der Krankheit keine signifikanten Fortschritte gemacht.
Deshalb zählen ein früher Nachweis und eine frühe Behandlung von Prostatakrebs immer noch zu den effektivsten Maßnahmen, um eine weitere Ausbreitung dieser Krankheit und die Mortalität durch diese Krankheit zu verhindern. Zwar wurde eine Reihe von Proteinantigenen entdeckt, die für maligne Tumoren charakteristisch sind, jedoch erwiesen sich Prostatatumoren nicht als besonders reiche Quellen von Zielantigenen, die für einen Nachweis und/oder eine Immuntherapie der Krankheit wie eine passive Immuntherapie verwendet werden könnten.
Deshalb wäre es nützlich, ein oder mehrere Krankheits-spezifische Moleküle oder Antigene bereitzustellen, die für einen frühen Nachweis von Prostatakrebs eingesetzt werden können. Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Nucleotidsequenz und entsprechende exprimierte Antigene bereit, die für die Diagnose von Prostatakarzinom geeignet sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine beliebige Form eines RNA- oder DNA-Moleküls sein kann und das insbesondere im Bereich von diagnostischen Nachweisverfahren eingesetzt werden kann. Das hier beschriebene Nucleinsäuremolekül wurde auf Grundlage dessen identifiziert, dass es ausschließlich in Prostatatumor-Gewebeproben vorliegt. Das Molekül eignet sich somit zum Nachweisen des Vorliegens von Prostatatumorzellen in einer Gewebeprobe oder in einer Körperflüssigkeitsprobe.
In einer Ausführungsform enthält das Polynucleotid der Erfindung eine Region, die Sequenzidentität zu der Sequenz von SEQ ID NO: 14 aufweist, oder es ist zu solchen codierenden Nucleinsäuresequenzen komplementär.
In einer anderen Ausführungsform wird das Polynucleotid der Erfindung unter hohen Stringenzbedingungen mit der Sequenz von SEQ ID NO: 14 oder dem Komplement davon hybridisieren.
Im Allgemeinen wird das Polynucleotid eine Länge von weniger als etwa zehn Kilobasen aufweisen. Die Erfindung schließt das angesprochene Polynucleotid ein. Die Beschreibung betrifft auch Fragmente des Polynucleotids der vorliegenden Erfindung. In einem anderen damit zusammenhängenden Aspekt umfasst die Erfindung RNA-Moleküle, die durch Translation der vorstehenden Nucleinsäuresequenz gebildet werden.
Die isolierte Nucleinsäuresequenz kann die cDNA-Insertionen von drei pCR2.1-Plasmidvektoren (Invitrogen, San Diego, Ka.) umfassen. Die drei Clone, die zusammen die vollständige SP 1–4-Sequenz (SEQ ID NO: 14) ergeben, werden mit pCR2.1/SP 1–4 (5'-RACE, SEQ ID NO: 27), pCR2.1/SP 1–4 (3'-RACE, SEQ ID NO: 28) und pCT2.1/SP 1–4 (SEQ ID NO: 29) bezeichnet. Die ungefähren Längen der Plasmidinsertionen sind 1700, 3850 bzw. 350 Basenpaare. Die Vektoren, die am 6. August 1998 als ATCC 98828, 98829 und 98827 hinterlegt wurden, schließen die Nucleotidsequenzen, die SEQ ID NO: 15 codieren, ein.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung einen Vektor bereit, der eine DNA umfasst, welche ein Prostatatumorantigen codiert. Außerdem wird eine Wirtszelle bereitgestellt, die einen solchen Vektor umfasst. Die Wirtszellen können z. B. CHO-Zellen, E. coli-Zellen, Insektenzellen oder Hefen sein. Weiterhin wird ein Verfahren zum Herstellen von Prostatatumorantigenen bereitgestellt, welches das Züchten von Wirtszellen unter Bedingungen, die für die Expression eines Prostatatumorantigens geeignet sind, und das Gewinnen des Prostatatumorantigens aus der Zellkultur umfasst.
Außerdem können isolierte Nucleinsäuremoleküle, die eine DNA umfassen, welche Prostatatumorantigene codiert, eingesetzt werden und stellen einen Teil der vorliegenden Erfindung dar. In einem Aspekt umfasst die isolierte Nucleinsäure eine DNA, welche ein Prostatatumorantigen codiert, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 15 aufweist, oder sie ist komplementär zu einer solchen codierenden Nucleinsäuresequenz, und sie bleibt unter hohen Stringenzbedingungen stabil an sie gebunden. Solche Peptide sind in diagnostischen Tests und auch in Antigenzusammensetzungen wie in Peptidimpfstoffen, die zum Induzieren von humoralen oder zellulären Immunantworten eingesetzt werden, nützlich.
Weiterhin stellt die Erfindung chimäre Moleküle bereit, die ein Prostatatumorantigen oder eine extrazelluläre Domäne davon umfassen, das/die an ein heterologes Polypeptid oder eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist. Ein Beispiel eines solchen chimären Moleküls umfasst ein Prostatatumorantigen, das an ein heterologes Polypeptid fusioniert ist, welches die immunogenen Eigenschaften des Antigens steigert.
Die Beschreibung betrifft auch Fragmente des Prostatatumorantigens.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen oder mehrere Antikörper, die spezifisch an ein Prostatatumorantigen oder eine extrazelluläre Domäne davon binden. Der Antikörper kann fakultativ ein monoclonaler Antikörper sein. In einem anderen Aspekt schließt die Erfindung einen Antikörper ein, der für ein Prostatatumorantigen spezifisch ist. Der Antikörper kann diagnostisch und therapeutisch eingesetzt werden, insbesondere in der Behandlung von bösartigen Erkrankungen, welche die Prostata betreffen. Diejenigen Verfahren können angewendet werden, bei denen Antisense- oder codierende Sequenz-Polynucleotide zum Modulieren der Expression von Prostatatumorantigen eingesetzt werden oder bei denen Antikörper eingesetzt werden, die für ein Prostatatumorantigen spezifisch sind.
Außerdem stellen diagnostische Verfahren zum Nachweisen eines Prostatatumorantigens in spezifischen Gewebeproben und zum Nachweisen von Expressionsraten eines Prostatatumorantigens in Geweben einen Teil der Erfindung dar.
Weiterhin hat das vorstehend angesprochene Polynucleotid in verschiedenen Nucleinsäure-basierten Nachweistests einen besonderen Nutzen. Tests, die als Beispiel dienen, schließen in situ-Hybridisierungstests und PCR-basierte Tests ein.
Die Erfindung stellt auch in vitro-Verfahren für die Diagnose einer Prostatatumor-verbundenen Krankheit in einem Individuum bereit. Das Vorliegen eines Prostatatumorantigens in einem Gewebe aus einem ersten Individuum wird gemessen und mit einem Gewebe aus einem zweiten, nicht betroffenen Individuum verglichen. Wenn ein Prostatatumorantigen in dem ersten Individuum und nicht in dem zweiten Individuum nachgewiesen wird, hat das erste Individuum ein Risiko für eine Prostatatumor-verbundene Krankheit.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Sequenz eines von einem Prostatatumor stammenden Polynucleotids, die hier als SEQ ID NO: 1 identifiziert wurde.
2 zeigt die Sequenz eines von einem Prostatatumor stammenden Polynucleotids, die hier als SEQ ID NO: 2 identifiziert wurde.
3 zeigt die Sequenz eines von einem Prostatatumor stammenden Polynucleotids, die hier als SEQ ID NO: 3 identifiziert wurde.
4 zeigt die Sequenz eines von einem Prostatatumor stammenden Polynucleotids, die hier als SEQ ID NO: 4 identifiziert wurde.
5 zeigt die Sequenz eines von einem Prostatatumor stammenden Polynucleotids, die hier als SEQ ID NO: 5 identifiziert wurde.
6 zeigt die Sequenz eines von einem Prostatatumor stammenden Polynucleotids, die hier als SEQ ID NO: 6 identifiziert wurde.
7 zeigt die Sequenz eines von einem Prostatatumor stammenden Polynucleotids, die hier als SEQ ID NO: 7 identifiziert wurde.
8 zeigt die Sequenz eines von einem Prostatatumor stammenden Polynucleotids, die hier als SEQ ID NO: 8 identifiziert wurde.
Die 9A bis 9C zeigen die Sequenzen von drei Peptiden, die von SEQ ID NO: 5 stammen, als SEQ ID NO: 9 (9A), SEQ ID NO: 10 (9B) und SEQ ID NO: 11 (9C).
10 zeigt die Sequenz eines von einem Prostatatumor stammenden Polynucleotids der Erfindung, die hier als SEQ ID NO: 14 identifiziert wurde.
11 zeigt die Sequenz eines von SEQ ID NO: 14 hergeleiteten Polypeptids, die hier als SEQ ID NO: 15 identifiziert wurde. Die vorausgesagte untranslatierte 5'- und 3'-Region von SEQ ID NO: 14 ist jeweils in Kleinbuchstaben dargestellt, das offene Leseraster von den Positionen 43 bis 3227 ist in Großbuchstaben angegeben, und das ursprüngliche partielle cDNA-Fragment (SEQ ID NO: 29) ist unterstrichen dargestellt.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Nucleotidsequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität zu einem Polypeptid hat, das durch die Nucleotide 43 bis 3327 von SEQ ID NO: 14 codiert wird, wobei die Nucleotidsequenz für Prostatatumoren einzigartig ist, wie durch eine bevorzugte Expression solcher Sequenzen in Prostatatumor-Gewebeproben gezeigt wurde. Diese Sequenz, die Sequenzvarianten und verlängerte Sequenzen davon einschließt, eignet sich für diagnostische Tests von Körperflüssigkeiten oder Biopsiegewebe zum Nachweisen des Vorliegens von Tumorzellen. Außerdem sind die durch das DNA-Molekül exprimierten Proteine und Peptide in der vorliegenden Erfindung enthalten und können in diagnostischen Tests sowie zum Entwickeln pharmakologischer Strategien verwendet werden, mit denen gegen die Krankheit vorgegangen werden kann, einschließlich Immuntherapie, z. B. die Verwendung von Antikörpern, welche spezifisch auf Tumorzellen gerichtet sind.
1. Definitionen
Der wie hier verwendete Begriff „Polypeptid" bezieht sich auf eine Verbindung, die aus einer Einzelkette von Aminosäureresten besteht, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Der wie hier verwendete Begriff „Protein" kann ein Synonym des Begriffs „Polypeptid" sein, oder er kann sich zusätzlich noch auf einen Komplex von zwei oder mehr Polypeptiden beziehen.
Aminosäurereste werden hier durch ihre herkömmlichen Ein-Buchstaben-Bezeichnungen angegeben: A, Alanin; C, Cystein; D, Asparaginsäure; E, Glutaminsäure; F, Phenylalanin; G, Glycin; H, Histidin; I, Isoleucin; K, Lysin; L, Leucin; M, Methionin; N, Asparagin; P, Prolin; Q, Glutamin; R, Arginin; S, Serin; T, Threonin; V, Valin; W, Tryptophan; Y, Tyrosin.
Der wie hier verwendete Begriff „Prostatatumorantigen" umfasst die native Sequenz von Prostatatumorantigenen und Polypeptidvarianten davon. Das Prostatatumorantigen kann aus einer Vielzahl von Quellen wie aus menschlichen Gewebetypen oder aus einer anderen Quelle isoliert werden, oder es kann durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden.
Eine „native Sequenz des Prostatatumorantigens" umfasst ein Polypeptid, das die gleiche Aminosäuresequenz wie ein aus der Natur stammendes Prostatatumorantigen aufweist. Eine solche native Sequenz des Prostatatumorantigens kann aus der Natur isoliert werden, oder sie kann durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt werden. Der Begriff „native Sequenz des Prostatatumorantigens" umfasst spezifisch natürlich vorkommende, verkürzte oder ausgeschiedene Formen eines Prostatatumorantigens (z. B. lösliche Formen, die z. B. die Sequenz einer extrazellulären Domäne enthalten), natürlich vorkommende Variantenformen (z. B. alternativ gespleißte Formen) und natürlich vorkommende allele Varianten eines Prostatatumorantigens.
„Prozent (%) Aminosäure-Sequenzidentität", bezogen auf die hier identifizierten Aminosäuresequenzen, ist hier als der Prozentsatz von Aminosäureresten in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in der nativen Sequenz identisch sind, nachdem die Sequenzen so aneinander ausgerichtet und gegebenenfalls Lücken eingeführt wurden, dass die maximale prozentuale Sequenzidentität erreicht wird, wobei irgendwelche konservative Substitutionen nicht als Teil der Sequenzidentität angesehen werden.
Der wie hier verwendete Begriff „Polypeptidsequenz-Variante" bezieht sich auf ein aktives Prostatatumorantigen, das mindestens etwa 80% Aminosäure-Sequenzidentität mit dem Prostatatumorantigen zeigt, welches die hergeleitete Aminosäuresequenz aufweist, wie in 11 (SEQ ID NO: 15) für ein Prostatatumorantigen mit vollständiger nativer Sequenz dargestellt ist. Solche Prostatatumorantigen-Varianten schließen z. B. Polypeptide ein, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus der Sequenz, die in 11 (SEQ ID NO: 15) dargestellt ist, angefügt oder deletiert sind.
Der Begriff „Fragment" bedeutet, wenn er sich auf ein Prostatatumorantigen bezieht, ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche gleich ist wie ein Teil, der nicht jedoch wie die gesamte, Aminosäuresequenz des Prostatatumorantigens, wobei es entweder im Wesentlichen die gleich biologische Funktion oder Aktivität wie das Prostatatumorantigen beibehält oder wobei es mindestens eine der Funktionen oder Aktivitäten des Prostatatumorantigens beibehält; z. B. ein Fragment, das die Fähigkeit beibehält, an einen Rezeptor zu binden, oder ein Fragment, das die immunologische Aktivität des Prostatatumorantigens beibehält. Das Fragment kann mindestens etwa 100 bis 200 aneinander angrenzende Aminosäurereste des Prostatatumorantigens, mindestens etwa 20 bis 100 aneinander angrenzende Aminosäurereste, mindestens etwa 10 bis 20 aneinander angrenzende Aminosäurereste oder mindestens etwa 9 bis 10 aneinander angrenzende Aminosäurereste des Prostatatumorantigens einschließen.
„Isoliert" bedeutet, wenn dieser Begriff zur Beschreibung der verschiedenen, hier offenbarten Polypeptide verwendet wird, dass ein Polypeptid, das identifiziert wurde, auch von einer Komponente seiner natürlichen Umgebung abgetrennt und/oder daraus gewonnen wurde.
„Biologisch aktiv" oder „biologische Aktivität" bezieht sich für die Zwecke hier auf (eine) Form(en) des Prostatatumorantigens, welche die biologischen und/oder immunologischen Aktivitäten des nativen oder natürlich vorkommenden Prostatatumorantigens beibehält (beibehalten).
Der wie hier verwendete Begriff „Nucleinsäure" bezieht sich entweder auf DNA oder RNA oder auf Moleküle, die sowohl Desoxy- als auch Ribonucleotide enthalten. Die Nucleinsäuren schließen genomische mRNA, DNA, cDNA, genomische DNA und Oligonucleotide ein, einschließlich Sense- und Antisense-Nucleinsäuren. Der Begriff „Nucleinsäure" bezieht sich auch auf Fragmente des Polynucleotids der vorliegenden Erfindung mit einer Länge von mindestens etwa 300 bis 600 Nucleotiden, mit einer Länge von etwa 150 bis 300 Nucleotiden, mit einer Länge von etwa 30 bis 150 Nucleotiden oder mit einer Länge von etwa 27 bis 30 Nucleotiden. Solche Nucleinsäuren können auch Modifikationen im Ribosephosphat-Grundgerüst enthalten, wodurch die Stabilität und die Halbwertszeit solcher Moleküle in physiologischen Umgebungen gesteigert werden.
Die Nucleinsäure kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, oder sie kann Anteile von sowohl einer doppelsträngigen als auch einer einzelsträngigen Sequenz enthalten. Die Darstellung eines Einzelstrangs definiert auch die Sequenz des anderen Strangs und schließt somit auch das Komplement der Sequenz ein.
Der wie hier verwendete Begriff „Polynucleotid" bezieht sich auf ein polymeres Molekül, das ein Grundgerüst aufweist, welches Basen trägt, die zu einer Wasserstoffbindung mit typischen Polynucleotiden in der Lage sind, wobei das Polymergrundgerüst die Basen in einer Weise präsentiert, so dass eine solche Wasserstoffbindung in einer Sequenz-spezifischen Weise zwischen dem polymeren Molekül und einem typischen Polynucleotid (z. B. einzelsträngiger DNA) ermöglicht wird. Solche Basen sind typischerweise Inosin, Adenosin, Guanosin, Cytosin, Uracil und Thymidin. Polymere Moleküle schließen doppel- und einzelsträngige Ribonucleinsäuren (RNA) und Desoxyribonucleinsäuren (DNA) ein und können Polymere einschließen, die Grundgerüst-Modifikationen wie Methylphosphonat-Bindungen aufweisen.
Der wie hier verwendete Begriff „rekombinante Nucleinsäure" bezieht sich auf eine Nucleinsäure, die ursprünglich in vitro im Allgemeinen durch die Manipulation von Nucleinsäure durch Endonucleasen gebildet wurde, in einer Form, die in der Natur normalerweise nicht gefunden wird.
Nucleinsäure-Untereinheiten werden hier durch ihre herkömmliche Basenbezeichnungen angegeben; T, Thymin; A, Adenosin; C, Cytosin; G, Guanin, U, Uracil; variable Positionen werden durch herkömmliche IUPAC-Abkürzungen bezeichnet: W, A oder T/U; R, A oder G; S, C oder G; K: G oder T/U (37 CFR. §1.822).
„Prozent (%) Nucleinsäure-Sequenzidentität", bezogen auf die hier identifizierte Prostatatumorantigen-Sequenz, ist hier als der Prozentsatz von Nucleotiden in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nucleotiden in der offenbarten Prostatatumorantigen-Sequenz identisch sind, nachdem die Sequenzen so aneinander ausgerichtet und gegebenenfalls Lücken eingeführt wurden, dass die maximale prozentuale Sequenzidentität erreicht wird. Ein Alignment, um die prozentuale Nucleinsäure-Sequenzidentität zu bestimmen, kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z. B. unter Verwendung einer öffentlich verfügbaren Computersoftware wie ALIGN- oder Megalign-(DNASTAR)Software. Der Fachmann kann geeignete Parameter für die Messung des Alignments bestimmen, einschließlich beliebiger Algorithmen, die erforderlich sind, um ein maximales Alignment über die Längen der Sequenzen, die miteinander verglichen werden, zu erreichen.
Der Begriff „Vektor" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die neue Nucleinsäuren aufnehmen und diese neuen Sequenzen in einem geeigneten Wirt vermehren kann. Vektoren schließen rekombinante Plasmide und Viren ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Der Vektor (z. B. ein Plasmid oder ein rekombinantes Virus), der die Nucleinsäure der Erfindung umfasst, kann in einem Träger, z. B. einem Plasmid, komplexiert mit einem Protein, einem Plasmid, komplexiert mit Lipid-basierten Nucleinsäure-Transduktionssystemen, oder anderen nicht-viralen Trägersystemen, vorliegen.
Der Begriff „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer funktionell verbundenen codierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryonten geeignet sind, schließen z. B. einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, und eine Ribosomenbindungsstelle ein. Von eukaryontischen Zellen ist bekannt, dass sie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden.
Die Begriffe „Polymerasekettenreaktion" und „PCR" beziehen sich auf ein Verfahren zum Amplifizieren einer oder mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen, wobei (i) Oligonucleotid-Primer, welche die Enden der zu amplifizierenden Sequenzen bestimmen, an einzelsträngige Nucleinsäuren in einer Testprobe angelagert werden, (ii) eine Nucleinsäure-Polymerase die 3'-Enden der angelagerten Primer verlängert, wodurch ein Nucleinsäurestrang hergestellt wird, der zu der Nucleinsäure, an welche die Primer angelagert wurden, in der Sequenz komplementär ist, (iii) die resultierende doppelsträngige Nucleinsäure denaturiert wird, so dass zwei einzelsträngige Nucleinsäuren erhalten werden, und (iv) die Arbeitsschritte von Primer-Anlagerung, Primer-Verlängerung und Produkt-Denaturierung ausreichend häufig wiederholt werden, so dass einfach identifizierte und gemessene Mengen der durch die Primer definierten Sequenzen erzeugt werden. Die aufeinanderfolgenden Schritte der Anlagerung, der Verlängerung und der Denaturierung werden gesteuert, indem man die Temperatur des Reaktionsbehälters, normalerweise in Form eines sich wiederholenden Zyklus variiert. Die Anlagerung und die Verlängerung werden typischerweise zwischen 40 und 80°C ausgeführt, wohingegen für die Denaturierung Temperaturen zwischen etwa 80 und 100°C erforderlich sind. Typischerweise wird ein „Thermozykler" wie Perkin Elmer Modell 9600 verwendet, um die Reaktionen zu regulieren.
Der Begriff „Antikörper" wird in seinem weitesten Sinn angewendet und schließt spezifisch einzelne monoclonale anti-Prostatatumorantigen-Antikörper (einschließlich Agonisten, Antagonisten und neutralisierender Antikörper) und Anti-Prostatatumorantigen-Antikörper-Zusammensetzungen mit Polyepitop-Spezifität ein.
Der wie hier verwendete Begriff „monoclonaler Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern erhalten wurde, d. h., die einzelnen Antikörper, welche die Population ausmachen, sind identisch, mit der Ausnahme von möglichen, natürlich vorkommenden Mutationen, die in kleineren Mengen vorliegen können.
II. Identifizierung von Prostatatumor-spezifischen DNA-Molekülen
Prostatakrebs-spezifische Gene können durch verschiedene Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, isoliert werden, wodurch ein Nachweis von Unterschieden in der Genexpression zwischen zwei oder mehr Quellen von Nucleinsäuren, z. B. einer unterschiedlichen Expression als Antwort auf die zeitliche Entwicklung, eine Krankheit und/oder einen mitogenen Stimulus, möglich ist.
Eine „isolierte" Prostatatumorantigen-codierende Nucleinsäure ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von mindestens einer Verunreinigung, mit der sie normalerweise assoziiert ist, abgetrennt ist. Eine isolierte Prostatatumorantigen-codierende Nucleinsäure liegt anders vor als in der Form oder in dem Zusammenhang, in welchem sie in der Natur gefunden wird, und unterscheidet sich deshalb von solchen Prostatatumorantigen-codierenden Nucleinsäuren, wie sie in natürlichen Zellen vorliegen.
Unter Verwendung des Differential-Display oder verschiedener subtraktiver Hybridisierungsstrategien kann mRNA, die von verwandten Zelltypen stammt, verglichen werden, wodurch qualitative und quantitative Unterschiede in spezifischen mRNA-Spezies bereitgestellt werden können.
Das Differential-Display (DD) nutzt zwei unterschiedliche Typen von Primern, um verschiedene Fraktionen der mRNA-Pool-Bestandteile zu doppelsträngigen cDNA-Fragmenten umzuwandeln. Diese Fragmente werden elektrophoretisch aufgetrennt, wodurch ein Expressionsprofil-„Strichcode” bereitgestellt wird. Der erste Primer wird allgemein als der „verankerte" Primer bezeichnet. Die meisten verankerten Primer nutzen eine Gruppe von 10 bis 12 dTs, um eine Anlagerung mit dem Poly(A⁺)-Schwanz der mRNAs zu erreichen. Die Erststrang-cDNA-Synthese erfolgt vom verankerten Primer ab, wodurch eine Verankerung an dem 3'-Ende des Transkripts erfolgt. Verankerte Primer nutzen entweder eine oder zwei Nicht-dt-Basen, um eine Anlagerung des verankerten Primers an eine Untergruppe von mRNAs innerhalb des mRNA-Pools zu erreichen. Einzelbasen-verankerte Primer erzeugen drei verschiedene Fraktionen, entsprechend dem Vorliegen von entweder C, G oder T unmittelbar stromaufwärts der Poly(A⁺)-Region. Wenn man davon ausgeht, dass 10.000 bis 15.000 verschiedene Arten von mRNA vorliegen, kann man erwarten, dass jeder Einzelbasen-verankerte Primer etwa 3.000 bis 5.000 verschiedene Erststrang-cDNAs erzeugt. Es gibt zwölf verschiedene Zweibasenpaar-Kombinationen, die unmittelbar stromaufwärts der Poly(A⁺)-Region möglich sind, wobei jede eine bedeutend kleinere Untergruppe des mRNA-Pools als bei Einzelbasen-Permutationen darstellt. Jeder Zweibasen-verankerte Primer selektiert theoretisch etwa 1/12 (8%) der mRNA-Pool-Bestandteile oder etwa 800 bis 1.200 verschiedene Erststrang-cDNAs. Verankerte Primer, die zwei Nicht-dt-Basen nutzen, um den mRNA-Pool „auszusortieren" („cull"), stellen eine Zahl von cDNA-Fragmenten bereit, die eher zu handhaben ist.
Nachdem die Erststrang-Synthese vollständig abgelaufen ist, werden Aliquots der Reaktionslösungen einer exponentiellen (bi-direktionellen) Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Amplifikation unterworfen, wobei der ursprüngliche verankerte Primer in Kombination mit einem zweiten Stromaufwärts- oder „willkürlichen" Primer verwendet wird. Willkürliche Primer enthalten Sequenzen, die so konstruiert sind, dass sie sich an Stellen stromaufwärts des verankerten Primers anlagern, wodurch die Erststrang-cDNA in eine oder mehrere verkürzte cDNA-Fragmente umgewandelt wird. Die RNA-Proben, die verglichen werden sollen, dienen in reversen Transkriptionsreaktionen als Matrizen für die Erststrang-cDNA-Synthese, wobei ein Satz von zwölf verschiedenen Oligo(dT)-verankerten 3'-Primern eingesetzt wird. Die in den RT-Reaktionen hergestellten cDNAs werden sodann in doppelt durchgeführten DD-PCR-Reaktionen eingesetzt, wobei die gleichen verankerten 3'-Primer, die in den RT-Reaktionen verwendet wurden, in paarweisen Kombinationen mit vier verschiedenen willkürlichen 5'-Primern eingesetzt werden. Jede RNA-Probe wird durch 48 Primerpaar-Kombinationen amplifiziert. Die doppelten DD-PCR-Proben werden auf nebeneinanderliegende Bahnen eines hochauflösenden denaturierenden Gels aufgetragen, wobei Proben aus unterschiedlichen RNAs, die mit den gleichen verankerten und willkürlichen Primerpaaren amplifiziert wurden, in aufeinanderfolgenden Bahnen zusammen gruppiert werden. Die Gele werden einer Autoradiographie unterworfen, und Banden, die in den von Prostatatumor stammenden Proben, nicht jedoch in Kontrollproben (wie in normalem Prostatagewebe oder HeLa-Zellproben) erscheinen, werden für die weitere Bearbeitung ausgewählt. In Abschnitt IV werden Einzelheiten der experimentellen Verfahren bereitgestellt, die in den Experimenten verwendet wurden, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden.
Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden beim Vergleich einer RNA aus einem von Prostatatumor stammenden Gewebe mit einer RNA aus einem normalen Prostatagewebe oder aus HeLa-Zellproben 54 einmalige DD-Produkte identifiziert. Die entsprechenden Banden wurden aus den Gelen ausgeschnitten, wieder durch PCR amplifiziert, Gel-gereinigt und die 5'-Enden einer DNA-Sequenzierung durch zyklische Sequenzierung unterworfen.
Eine subtraktive Hybridisierung, gefolgt von einer oder mehreren Runden von PCR-Amplifikation der erhaltenen Sequenzen nach der Subtraktion, eignet sich für die Isolierung von Nucleinsäuren, die vorzugsweise z. B. in einem kranken Gewebe, nicht jedoch in dem normalen gesunden Gewebe, oder in einem bestimmten Gewebetyp und nicht in einem anderen, exprimiert werden.
Wie in den Beispielen 3A und B beschrieben, wurde eine Prostatatumor-spezifische partielle cDNA-Sequenz identifiziert, indem eine subtraktive Hybridisierungsstrategie und PCR-Amplifikation eingesetzt wurden, wobei die entsprechende vollständige Sequenz durch schnelle Amplifikation von cDNA-Enden [RACE, Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8998–9002 (1988)] unter Verwendung eines einzelnen Gen-spezifischen Oligonucleotid-Primers identifiziert wurde.
Die Sequenzen wurden mit veröffentlichten Datenbanken verglichen, wie in Beispiel 2 beschrieben, und acht neue mRNAs/cDNAs, hier als SEQ ID NO: 1 bis 4 und 6 bis 8 dargestellt, wurden durch die Differential-Display-Methode erhalten, zusammen mit einer zusätzlichen, mit SP 1–4 (SEQ ID NO: 14) bezeichneten Sequenz, die durch subtraktive Hybridisierung erhalten wurde. Für eine der durch die Differential-Display-Methode erhaltenen Sequenzen, SEQ ID NO: 5, wurde außerdem gefunden, dass sie ein gewisses Ausmaß an Homologie mit der Thioredoxin-Reductase aufwies; dies erfolgte gemäß Verfahren, die in Beispiel 2 ausführlich behandelt sind.
A. Identifizierung von Prostatatumor-spezifischen DNA-Sequenzvarianten und Peptiden
Die vorliegenden Erfindung umfasst, zusätzlich zu DNA-Molekülen, welche die hier angegebenen spezifischen Sequenzen aufweisen, Sequenzvarianten, verlängerte Sequenzen und Peptide, die von solchen Sequenzen hergeleitet sind. Dieser Abschnitt beschreibt, wie diese verschiedenen Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert werden.
1. DNA-Sequenzvarianten
a. Sequenzidentität und spezifische Hybridisierung
Eine Polynucleotidsequenz-„Variante” codiert eine Aminosäuresequenz-„Variante", die sich durch eine oder mehrere Aminosäuren von der Referenz-Polypeptidsequenz unterscheidet.
Sequenzvarianten schließen Polynucleotidsequenzen ein, die mindestens etwa 80% Nucleinsäure-Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens etwa 85% Nucleinsäure-Sequenzidentität, stärker bevorzugt mindestens etwa 90% Nucleinsäure-Sequenzidentität und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95 bis 98% Nucleinsäure-Sequenzidentität mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 14 aufweisen.
Eine Sequenzidentität bedeutet im Zusammenhang mit einer Nucleinsäure, die ein Prostatatumorantigen codiert, identische Nucleinsäuren an den entsprechenden Positionen in den zwei Sequenzen, die verglichen werden. Sequenzvergleiche werden unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie nachstehend in Abschnitt IIB ausführlich dargestellt.
Ein funktionelles Maß für die Sequenzidentität, das alternativ auch verwendet werden kann, um die Ähnlichkeit von Sequenzen festzustellen, ist die Fähigkeit eines bestimmten Nucleotidmoleküls, mit einem zweiten Nucleotid unter definierten Bedingungen zu hybridisieren. Eine „Hybridisierung" schließt einen beliebigen Prozess ein, durch den sich ein Strang einer Nucleinsäure mit einem komplementären Strang durch Basenpaarung vereinigt. Somit bezieht sich der Begriff, genau genommen, auf die Fähigkeit des Komplements der Testsequenz, an die Testsequenz zu binden, oder umgekehrt.
Die Nucleinsäure-Ähnlichkeit kann durch Hybridisierungstudien bestimmt werden. Somit werden z. B. Nucleinsäuren, die unter hoher Stringenz mit den in den 1 bis 8 und 14 dargestellten Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, oder das Komplement davon, als ein Prostatatumorantigen-Gen angesehen. Hohe Stringenzbedingungen sind auf dem Fachgebiet bekannt; ein Beispiel von solchen Bedingungen umfasst eine Hybridisierung bei etwa 65°C in etwa 5 × SSPE und Waschbedingungen bei etwa 65°C in etwa 0,1 × SSPE. Vgl. Maniatis et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Aufl., (1989), und Ausubel, F. M., et al., Hrsg., „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc., Copyright (c) 1987, 1988, 1989, 1990, durch Current Protocols, beide sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen.
Hybridisierungsbedingungen beruhen auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nucleinsäure-Bindungskomplexes oder der Sonde und werden typischerweise durch den Grad der „Stringenz" der Bedingungen, unter welchen die Hybridisierung gemessen wird, klassifiziert. (Ausubel et al., 1990). Z. B. erfolgt eine „maximale Stringenz" typischerweise bei etwa Tm –5°C (5% unter der Tm der Sonde); eine „hohe Stringenz" etwa bei 5 bis 10°C unter der Tm; eine „mittlere Stringenz" bei etwa 10 bis 20°C unter der Tm der Sonde; und eine „niedrige Stringenz" bei etwa 20 bis 25°C unter der Tm. Funktionell können maximale Stringenzbedingungen eingesetzt werden, um Sequenzen zu identifizieren, die eine genaue Identität oder eine annähernd genaue Identität mit der Hybridisierungssonde aufweisen; während hohe Stringenzbedingungen verwendet werden, um Sequenzen zu identifizieren, die eine Sequenzidentität von etwa 80% oder mehr mit der Sonde aufweisen.
2. Degeneration des genetischen Codes
Sequenzvarianten schließen auch Nucleinsäuremoleküle ein, welche das gleiche Peptid codieren, das durch die hier beschriebenen Tumor-spezifischen Nucleinsäuremoleküle codiert wird. Wenn der codierende Rahmen der verschiedenen identifizierten Nucleinsäuremoleküle bekannt ist, z. B. durch Homologie zu bekannten Genen oder durch Verlängerung der Sequenz, wie in den nachstehenden Teilen B oder C beschrieben, ist es somit so zu verstehen, dass als Ergebnis der Degeneration des genetischen Codes eine Reihe von codierenden Sequenzen hergestellt werden kann. Z. B. codiert das Triplett CGT die Aminosäure Arginin. Arginin wird alternativ durch CGA, CGC, CGG, AGA und AGG codiert. Deshalb ist es so zu verstehen, dass solche Substitutionen in der codierenden Region unter die Sequenzvarianten fallen, welche durch die vorliegende Erfindung abgedeckt sind. Eine beliebige oder alle dieser Sequenzvarianten können in gleicher Weise, wie hier für die identifizierten parentalen Sequenzen der SEQ ID NOs: 1 bis 8 beschrieben, genutzt werden.
Weiterhin ist es so zu verstehen, dass solche Sequenzvarianten mit der parentalen Sequenz unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren können, dies muss jedoch nicht der Fall sein. Dies wäre z. B. möglich, wenn die Sequenzvariante für jede der durch das parentale Nucleotid codierten Aminosäuren ein anderes Codon einschließt. Solche Varianten werden trotzdem spezifisch berücksichtigt und sind in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind auch Sequenzen eingeschlossen, die zu mindestens 80% mit solchen, durch Degeneration entstandenen Sequenzvarianten identisch sind.
Obwohl Nucleotidsequenz-Varianten vorzugsweise in der Lage sind, mit den hier angegebenen Nucleotidsequenzen unter Bedingungen mäßig hoher oder hoher Stringenz zu hybridisieren, bestehen in einigen Situationen Vorteile, wenn Varianten, die auf der Degeneration des Codes beruhen, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden. Z. B. können Codons selektiert werden, um die Rate zu erhöhen, mit der die Expression des Peptids in einem bestimmten prokaryontischen oder eukaryontischen Organismus erfolgt, und zwar gemäß der optimalen Codonpräferenz, die durch den bestimmten Wirtsorganismus vorgegeben wird. Alternativ kann es wünschenswert sein, eine RNA zu produzieren, die längere Halbwertszeiten aufweist als die durch die angegebenen Sequenzen produzierte mRNA.
3. Verlängerte Polynucleotidsequenzen
Hier angegebene Polynucleotidsequenzen können unter Verwendung verschiedener Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verlängert werden, um Stromaufwärts-Sequenzen wie Promotoren und regulatorische Elemente nachzuweisen. Z. B. stellt die „Restriktionsstellen"-Polymerasekettenreaktion ein direktes Verfahren dar, das universelle Primer nutzt, um unbekannte Sequenzen, die angrenzend an eine bekannte Sequenz liegen, zu erhalten. Zuerst wird eine genomische DNA in Gegenwart eines Primers, der auf eine Linkersequenz gerichtet ist, und eines Primers, der für die bekannte Region spezifisch ist, amplifiziert. Die amplifizierten Sequenzen werden einer zweiten Runde PCR mit dem gleichen Linker-Primer und einem anderen spezifischen Primer, der innerhalb des ersten liegt, unterworfen. Die Produkte jeder PCR-Runde werden mit einer geeigneten RNA-Polymerase transkribiert und unter Verwendung einer reversen Transkriptase sequenziert.
Genauso kann ein Verfahren, das als „inverse PCR" bekannt ist, verwendet werden, um Sequenzen unter Verwendung divergenter Primer, die auf einer bekannten Region basieren, zu amplifizieren oder zu verlängern. Die Primer können unter Verwendung von Standardsoftware für die Primeranalyse, z. B. GeneWorks (Oxford Biomolecular Systems, Ka.), konstruiert werden, so dass sie eine Länge von mindestens 15 Nt. aufweisen, mit einem GC-Gehalt von 50% oder mehr, und sich an die Zielsequenz bei Temperaturen von etwa 68 bis 72°C anlagern. Für das Verfahren ist die Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme erforderlich, um ein geeignetes Fragment in der bekannten Region eines Gens zu erzeugen. Danach wird das Fragment durch Ligierung zirkularisiert und als eine PCR-Matrize verwendet. Alternativ können angrenzende und vollständige Sequenzen und insbesondere Intron/Exon-Übergänge unter Verwendung eines Kits wie „PROMOTER-FINDER" (Clontech Labs, Palo Alto, Ka.) identifiziert werden. Bei diesem Kit werden PCR, ineinander geschachtelte („nested") Primer und spezifische Banken eingesetzt, um in der genomischen DNA zu walken.
Bevorzugte Banken zum Durchmustern nach vollständigen cDNAs sind solche, die nach der Größe selektiert wurden, so dass größere cDNAs eingeschlossen sind. Zufallsgeprimte Banken sind bevorzugt, da sie mehr Sequenzen enthalten, welche die 5'- und Stromaufwärts-Regionen von Genen einschließen. Genomische Banken sind für eine Verlängerung in die untranslatierte regulatorische 5'-Region nützlich. Vorzugsweise werden solche Banken aus den Tumorzellen von Interesse wie den hier als Beispiel genannten Prostatatumorzellen erzeugt.
Eine Analyse der Größe und Sequenz von vollständigen Sequenzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, kann durch Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden, wie automatische Sequenzierungsverfahren, Gel-Größenanalyse und Kapillar-Elektrophorese.
Wenn die vollständige Sequenz identifiziert ist, ist es so zu verstehen, dass weitere Regionen der vollständigen Sequenz verwendet werden können, um Hybridisierungssonden und/oder Tumor-Nachweisreagenzien gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen. Genau gesagt, wenn eine partielle oder vollständige Sequenz bekannt ist, wird es dadurch möglich, weit verfügbare Datenbanken zu durchsuchen, um zu bestimmen, ob die fragliche Sequenz möglicherweise in anderen Arten oder Geweben, insbesondere in Tumorgeweben, Homologien hat. Beispiele von Homologien, die auf den aktuellen Sequenzen beruhen, sind hier in Beispiel 2 dargestellt.
Die vollständige Sequenz kann auch verwendet werden, um eine rekombinante Nucleinsäure zu konstruieren, die in einen Vektor eingefügt und für die Expression des codierten Polypeptids verwendet wird, wie im nachstehenden Teil D diskutiert wird.
Es ist so zu verstehen, dass eine rekombinante Nucleinsäure, sobald sie hergestellt und wieder in eine Wirtszelle oder in einen Organismus eingeführt wurde, sich nicht-rekombinant replizieren wird, und zwar unter Verwendung der zellulären Maschinerie der Wirtszelle, und dass solche Nucleinsäuren, die einmal rekombinant erzeugt wurden, obwohl sie anschließend nicht-rekombinant repliziert werden, für die Zwecke der Erfindung immer noch als rekombinant angesehen werden.
4. Polypeptid-Varianten
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die native Sequenz des Prostatatumorantigens eine reife oder vollständige native Prostatatumorantigen-Sequenz, welche die Aminosäuren 1 bis 1095 von 11 (SEQ ID NO: 15) umfasst. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist die native Prostatatumorantigen-Sequenz eine extrazelluläre Domäne des vollständigen Prostatatumorantigens. Gegebenenfalls wird das Prostatatumorantigen durch Expression des Polypeptids erhalten oder kann erhalten werden, das durch die cDNA-Insertion der Vektoren pCR2.1/SP 1–4 (5'-RACE, SEQ ID NO: 27), pCR2.1/SP 1–4 (3'-RACE, SEQ ID NO: 28) und pCT2.1/SP 1–4 (SEQ ID NO: 29), hinterlegt am 6. August 1998 als ATCC 98828, 98829 und 98827, codiert wird.
Normalerweise wird eine Prostatatumorantigen-Variante mindestens etwa 80% Aminosäure-Sequenzidentität, vorzugsweise mindestens etwa 85% Aminosäure-Sequenzidentität, stärker bevorzugt mindestens etwa 90% Aminosäure-Sequenzidentität und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95 bis 98% Aminosäure-Sequenzidentität mit der in 11 (SEQ ID NO: 15) dargestellten Aminosäuresequenz aufweisen.
Eine Sequenzähnlichkeit im Zusammenhang mit einem Prostatatumorantigen bedeutet eine Sequenzähnlichkeit oder -Identität, wobei eine Identität bevorzugt ist. Identisch bedeutet in diesem Zusammenhang identische Aminosäuren an den entsprechenden Positionen in den zwei Sequenzen, die miteinander verglichen werden. Eine Ähnlichkeit schließt in diesem Zusammenhang Aminosäuren, die identisch sind, und diejenigen Aminosäuren, die ähnlich (funktionell äquivalent) sind, ein. Diese Ähnlichkeit oder Identität wird unter Verwendung von Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, bestimmt, z. B. durch das „Best Fit"-Sequenz-Programm, beschrieben von Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12: 387–395 (1984), das BLASTP- oder BLASTX-Programm [Altshul et al., Methods in Enzymology 266: 460–480 (1990), Nucl. Acids Res. 25: 3389–3402 (1997)], vorzugsweise unter Verwendung der Standard-Einstellungen („default settings"). Das Alignment kann die Einführung von Lücken in die Sequenzen, die aneinander ausgerichtet werden sollen, einschließen. Außerdem ist es für Sequenzen, die entweder mehr oder weniger Aminosäuren als das relevante native Protein enthalten, so zu verstehen, dass der Prozentsatz der Ähnlichkeit aufgrund der Anzahl von ähnlichen oder identischen Aminosäuren, bezogen auf die Gesamtzahl von Aminosäuren, bestimmt wird. Ein Alignment zwecks der Bestimmung der prozentualen Aminosäure-Sequenzidentität kann auf verschiedene Arten erreicht werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z. B. unter Verwendung von öffentlich verfügbarer Computersoftware, wie der Software LALIGN oder Megalign (DNASTAR) mit Default-Parametern. Das LALIGN-Programm liegt in der FASTA-Version 1.7-Folge von Sequenzvergleichs-Programmen vor (Pearson et al., 1988; Pearson, 1990; Programm verfügbar von William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, VA).
Der Fachmann kann geeignete Parameter zum Messen des Alignment bestimmen, einschließlich Auswählen eines Algorithmus (z. B. „Best Fit" oder „BLASTX"), der erforderlich ist, um ein maximales Alignment über die Sequenzen, die verglichen werden, zu erreichen [vgl. auch Pearson et al., Methods in Enzymol. 266: 227–258 (1996)].
Außerdem sind in der Definition von Prostatatumorantigenen der vorliegenden Erfindung Aminosäuresequenz-Varianten eingeschlossen. Diese Varianten fallen in eine oder mehrere von drei Klassen: Substitutions-, Insertions- oder Deletions-Varianten. Diese Varianten werden normalerweise durch positionsspezifische Mutagenese von Nucleotiden in der das Prostatatumorantigen codierenden DNA hergestellt, indem eine Kassetten- oder PCR-Mutagenese oder andere Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden, wodurch eine DNA erzeugt wird, welche die Variante codiert, und indem danach die DNA in einer rekombinanten Zellkultur exprimiert wird. Jedoch können Prostatatumorantigen-Variantenfragmente mit bis zu etwa 100 bis 150 Resten auch durch eine in vitro-Synthese unter Verwendung eingeführter Verfahren hergestellt werden. Aminosäuresequenz-Varianten sind durch die vorher festgelegte Natur der Variation gekennzeichnet, ein Merkmal, das sie von einer natürlich vorkommenden allelen oder Interspezies-Variation der Aminosäuresequenz des Prostatatumorantigens unterscheidet. Die Varianten zeigen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität wie das natürlich vorkommende Analogon, wobei jedoch auch Varianten ausgewählt werden können, die modifizierte Charakteristika aufweisen, wie nachstehend noch ausführlicher beschrieben wird.
Eine „Substitution" kommt durch das Ersetzen eines/einer oder mehrerer Nucleotide oder Aminosäuren durch andere Nucleotide bzw. Aminosäuren zustande.
Eine „Insertion" oder „Addition" ist diejenige Änderung in einer Nucleotid- oder Aminosäuresequenz, die im Vergleich zu der natürlich vorkommenden Sequenz zum Zufügen eines oder mehrerer Nucleotide bzw. Aminosäurereste geführt hat.
Eine „Deletion" ist als eine Änderung in entweder der Nucleotid- oder der Aminosäuresequenz definiert, in welcher eine oder mehrere Nucleotide bzw. Aminosäurereste fehlen.
Während die Stelle oder Region für die Einführung einer Aminosäuresequenz-Variation vorher festgelegt ist, muss die Änderung selbst nicht vorher festgelegt sein. Um z. B. die Leistungsfähigkeit einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, kann eine Zufallsmutagenese an dem Zielcodon oder der Zielregion durchgeführt werden, und die exprimierten Prostatatumorantigen-Varianten können sodann auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivität durchgemustert werden. Verfahren zum Herstellen von Substitutionen an vorher festgelegten Stellen in einer DNA, welche eine bekannte Sequenz aufweist, sind bekannt, z. B. die M13-Primer-Mutagenese oder PCR-Mutagenese. Das Screening der Mutanten kann direkt durch PCR erfolgen, oder es kann nach der Expression der modifizierten Sequenz unter Verwendung von Tests für das Prostatatumorantigen, z. B. durch Antikörper-Nachweistests, durchgeführt werden.
Bei Aminosäure-Substitutionen handelt es sich typischerweise um solche Substitutionen einzelner Reste; Insertionen betreffen üblicherweise eine Größenordnung von etwa 1 bis 20 Aminosäuren, wobei jedoch auch wesentlich größere Insertionen toleriert werden können. Deletionen liegen im Bereich von etwa 1 bis etwa 20 Resten, jedoch können Deletionen in einigen Fällen auch viel größer sein.
Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder eine beliebige Kombination davon können verwendet werden, um schließlich ein endgültiges Derivat zu erhalten. Im Allgemeinen werden diese Änderungen an einigen wenigen Aminosäuren durchgeführt, um die Veränderung des Moleküls möglichst klein zu halten. Jedoch können unter bestimmten Umständen auch größere Änderungen toleriert werden.
Aminosäure-Substitutionen können das Ergebnis des Austauschens einer einzigen Aminosäure durch eine andere Aminosäure, welche ähnliche strukturelle und/oder chemische Eigenschaften besitzt, sein, wie ein Austauschen eines Leucinrestes durch einen Serinrest, d. h. konservative Aminosäure-Austausche. Insertionen oder Deletionen können gegebenenfalls im Bereich von 1 bis 5 Aminosäuren liegen.
Die Variation, die bei einer Beibehaltung der biologischen Aktivität erlaubt ist, kann bestimmt werden, indem Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in der Sequenz systematisch hergestellt und die resultierenden Varianten dann auf Aktivität getestet werden. Die Genexpression kann durch immunologische Verfahren wie immunhistochemische Färbung von Zellen oder Gewebeschnitten und Testen von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten gemessen werden, wodurch die Expression des Genprodukts direkt quantitativ bestimmt wird. Antikörper, die für eine immunhistochemische Färbung und/oder für einen Test von Gewebeproben oder Flüssigkeitsproben geeignet sind, können entweder monoclonale oder polyclonale Antikörper sein, und sie können gegen ein natives Prostatatumorantigen, ein synthetisches Peptid, basierend auf den hier bereitgestellten DNA-Sequenzen, oder gegen ein heterologes Fusionsprotein, welches ein Prostatatumor-spezifisches Antikörperepitop einschließt, hergestellt werden. Beispiele von Prostatakrebsantigenen mit diagnostischem Nutzen in Antikörper-basierten Tests schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Prostata-spezifisches Antigen (PSA, US-Patent Nr. 5 710 007 ; 5 614 372 ; 5 672 480 und andere), Prostata-spezifisches Membranantigen (PSMA, US-Patent Nr. 5 538 866 ) und menschliches glanduläres Kallikrein der Prostata (HK-2, US-Patent Nr. 5 516 639 ). Für diese Moleküle wurden zahlreiche diagnostische Tests entwickelt, die auf verschiedenen unterschiedlichen Techniken basieren, welche vom Fachmann routinemäßig eingesetzt werden.
Wenn kleine Änderungen in den Merkmalen des Prostatatumorantigens gewünscht werden, werden Substitutionen im Allgemeinen gemäß bekannten „konservativen Substitutionen" durchgeführt.
Eine „konservative Substitution" bezieht sich auf die Substitution einer Aminosäure in einer bestimmten Klasse durch eine Aminosäure in der gleichen Klasse, wobei eine Klasse durch gemeinsame physikalisch-chemische Eigenschaften von Aminosäure-Seitenketten definiert ist und hohe Substitutionshäufigkeiten in homologen Proteinen in der Natur vorkommen (wie bestimmt werden kann z. B. durch eine Standard-Dayhoff-Häufigkeits-Austausch-Matrix („Dayhoff frequency exchange matrix”) oder BLOSUM-Matrix). Sechs allgemeine Klassen von Aminosäure-Seitenketten, eingeteilt, wie vorstehend beschrieben, schließen ein: Klasse I (Cys); Klasse II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Klasse III (Asn, Asp, Gln, Glu); Klasse IV (His, Arg, Lys); Klasse V (Ile, Leu, Val, Met); und Klasse VI (Phe, Tyr, Trp). Z. B. ist eine Substitution eines Asp für einen anderen Rest der Klasse III wie Asn, Gln oder Glu eine konservative Substitution.
Eine „nicht-konservative Substitution" bezieht sich auf die Substitution einer Aminosäure in der einen Klasse durch eine Aminosäure aus einer anderen Klasse; z. B. die Substitution eines Ala, eines Klasse-II-Restes, durch einen Klasse-III-Rest wie Asp, Asn, Glu oder Gln.
Wesentliche Änderungen in Funktion oder immunologischer Identität werden durchgeführt, indem Substitutionen ausgewählt werden, die „nicht-konservative Substitutionen" darstellen. Z. B. können Substitutionen durchgeführt werden, die signifikanter das Folgende beeinflussen: die Struktur des Polypeptid-Grundgerüsts im Bereich der Änderung, z. B. die α-Helix- oder β-Faltblatt-Struktur, die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder den Umfang der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen man im Allgemeinen erwartet, dass sie die größten Änderungen in den Eigenschaften des Polypeptids erzeugen, sind diejenigen, in welchen (a) ein hydrophiler Rest, z. B. Seryl oder Threonyl, für (oder durch) einen hydrophoben Rest, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert wird; (b) ein Cystein oder Prolin für (oder durch) einen anderen Rest substituiert wird; (c) ein Rest, der eine elektropositive Seitenkette besitzt, z. B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, für (oder durch) einen elektronegativen Rest, z. B. Glutamyl oder Aspartyl, substituiert wird; oder (d) ein Rest, der eine umfangreiche Seitenkette aufweist, z. B. Phenylalanin, für (oder durch) einen Rest, der keine Seitenkette aufweist, z. B. Glycin, substituiert wird.
Prostatatumorantigen-Varianten zeigen typischerweise die gleiche qualitative biologische Aktivität und werden die gleiche Immunantwort auslösen wie das natürlich vorkommende Analogon, wobei jedoch Varianten gegebenenfalls auch so ausgewählt werden können, dass die Eigenschaften des Prostatatumorantigens modifiziert werden. Z. B. können Glycosylierungsstellen und insbesondere eine oder mehrere O-gekoppelte oder N-gekoppelte Glycosylierungsstellen verändert oder entfernt werden. Für den Fachmann wird es selbstverständlich sein, dass Aminosäure-Änderungen möglicherweise post-translationale Prozesse des Prostatatumorantigens verändern können, wie Verändern der Zahl oder Position von Glycosylierungsstellen oder Ändern der Membran-Verankerungs-Eigenschaften.
Die Variationen können unter Verwendung von Verfahren durchgeführt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie Oligonucleotid-vermittelte (positionsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scanning und PCR-Mutagenese. An der clonierten DNA können eine positionsgerichtete Mutagenese [Carter et al., Nucl. Acids Res. 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10: 6487 (1987)], eine Kassetten-Mutagenese [Wells et al., Gene 34: 315 (1985)], eine Restriktionsselektions-Mutagenese [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317: 415 (1986)] oder andere bekannte Verfahren durchgeführt werden, um die Prostatatumorantigen-codierende DNA-Variante herzustellen.
Außerdem sind in der Definition von Prostatatumorantigen-Proteinen andere verwandte Prostatatumorantigen-Proteine eingeschlossen. Somit können Sonden- oder degenerierte Polymerasekettenreaktions-(PCR-)Primersequenzen eingesetzt werden, um andere verwandte Proteine zu finden. Geeignete Sonden- oder Primersequenzen können entworfen werden für: die gesamte oder einen Teil der Prostatatumorantigen-Sequenz oder -Sequenzen außerhalb der codierenden Region. Wie auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, weisen bevorzugte PCR-Primer eine Länge von etwa 15 bis etwa 35 Nucleotiden auf, wobei diejenigen mit etwa 20 bis etwa 30 bevorzugt sind, und sie können gegebenenfalls Inosin enthalten. Die Bedingungen für die PCR-Reaktion sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt.
B. Modifikationen von Prostatatumorantigenen
Kovalente Modifikationen eines Prostatatumorantigens sind im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Ein Typ einer kovalenten Modifikation schließt das Umsetzen von zielgerichtet angesteuerten Aminosäureresten eines Prostatatumorantigens mit einem organischen Derivatisierungsmittel ein, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N- oder C-terminalen Resten eines Prostatatumorantigen-Polypeptids zu reagieren. Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist z. B. für die Vernetzung eines Prostatatumorantigens mit einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder Oberfläche geeignet. Üblicherweise eingesetzte Vernetzungsmittel schließen z. B. 1,1,-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, z. B. Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester wie 3,3'- Dithiobis(succinimidylpropionat), bifunktionelle Maleinimide wie Bis-N-maleimido-1,8-octan, und Mittel wie Methyl-3-[(p-azidophenyl)dithio]propioimidat, ein.
Andere Modifikationen schließen die Desamidierung von Glutaminyl- und Asparaginylresten zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten, die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, die Methylierung der "-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten [T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, S. 79–86 (1983)], die Acetylierung des N-terminalen Amins und die Amidierung einer beliebigen C-terminalen Carboxylgruppe ein.
Ein weiterer Typ einer kovalenten Modifikation eines Prostatatumorantigen-Polypeptids, der im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist, umfasst das Verändern des nativen Glycosylierungsmusters des Polypeptids, nämlich das Modifizieren einer nativen Sequenz des Prostatatumorantigen-Polypeptids durch Deletieren eines oder mehrerer Kohlenhydratreste aus der nativen Sequenz des Prostatatumorantigen-Polypeptids und/oder durch Anfügen eines oder mehrerer Kohlenhydratreste daran.
Das Anfügen von Glycosylierungsstellen an ein Prostatatumorantigen-Polypeptid kann durch Verändern der Aminosäuresequenz davon erreicht werden. Die Veränderung kann z. B. durch das Anfügen eines oder mehrerer oder die Substitution durch einen oder mehrere Serin- oder Threoninreste an der nativen Sequenz des Prostatatumorantigen-Polypeptids erfolgen (für O-gekoppelte Glycosylierungsstellen). Die Aminosäuresequenz des Prostatatumorantigens kann gegebenenfalls durch Änderungen auf DNA-Ebene verändert werden, insbesondere durch Mutieren der DNA, welche das Prostatatumorantigen-Polypeptid codiert, an vorher ausgewählten Basen, so dass Codons erzeugt werden, die dann in die gewünschten Aminosäuren translatiert werden.
Ein weiteres Verfahren zum Erhöhen der Zahl von Kohlenhydratresten auf dem Prostatatumorantigen-Polypeptid besteht in einer chemischen oder enzymatischen Kopplung von Glycosiden an das Polypeptid. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet beschrieben, z. B. in WO 87/05330 , veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin und Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. S. 259–306 (1981).
Die Entfernung von Kohlenhydratresten, die auf dem Prostatatumorantigen-Polypeptid vorliegen, kann chemisch oder enzymatisch oder durch eine Mutations-Substitution von Codons, welche Aminosäurereste codieren, die als Ziele für die Glycosylierung dienen, erreicht werden. Außerdem können Kohlenhydratreste durch eine enzymatische Spaltung unter Verwendung einer Vielzahl von Endo- und Exo- Glycosidasen, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987), beschrieben, oder durch chemische Deglycosylierungsverfahren entfernt werden, die z. B. in Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 (1987), und Edge et al., Anal. Biochem. 118: 131 (1981), beschrieben sind.
Ein weiterer Typ einer kovalenten Modifikation eines Prostatatumorantigens umfasst die Bindung des Antigens an ein nicht-proteinartiges Polymer, z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, wie z. B. in US-Patent Nr. 4 791 192 angegeben.
C. Codierte Polypeptid-Antigene
1. Expression von Prostatatumorantigenen
Die hier beschriebenen Polynucleotidsequenzen können in rekombinanten DNA-Molekülen eingesetzt werden, welche die Expression der entsprechenden Polypeptide in geeigneten Wirtszellen steuern. Wie vorstehend angesprochen, hat die Degeneration des genetischen Codes zur Folge, dass auch andere DNA-Sequenzen, welche im Wesentlichen die gleiche oder eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz codieren, für die Clonierung und Expression der identifizierten Polypeptide eingesetzt werden können. Diejenigen Codons, die von einem bestimmten Wirt bevorzugt werden, können ausgewählt und in die natürlich vorkommenden Nucleotidsequenzen substituiert werden, um die Rate und/oder die Effizienz der Expression zu steigern.
Die Nucleinsäure (z. B. cDNA oder genomische DNA), welche das gewünschte Prostatatumorantigen-Polypeptid codiert, kann für die Clonierung (Amplifikation der DNA) oder für die Expression in einen replizierbaren Vektor eingefügt werden. Das Polypeptid kann dann in einem beliebigen von verschiedenen Expressionssystemen gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, rekombinant exprimiert werden (Ausubel et al., 1990).
Geeignete Wirtszellen schließen Hefen, Bakterien, Archaebakterien, Pilze und Insekten- und tierische Zellen, einschließlich Säugerzellen, z. B. primäre Zellen, einschließlich Stammzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Knochenmark-Stammzellen, ein. Insbesondere schließen diese ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Mikroorganismen wie Bakterien, die mit einem rekombinanten Bakteriophagen, mit Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert sind, und Hefen, die mit Hefeexpressionsvektoren transformiert sind. Außerdem sind Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Insektenvirus (wie Baculovirus) infiziert sind, und Säuger-Expressionssysteme eingeschlossen.
Die Nucleinsäuresequenz, die exprimiert werden soll, kann durch eine Vielzahl von Verfahren in den Vektor eingefügt werden. Im Allgemeinen wird die DNA unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, in eine geeignete Restriktionsendonuclease-Stelle eingefügt. Vektorkomponenten schließen im Allgemeinen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf einen oder mehrere Bestandteile von einer Signalsequenz, einem Replikationsursprung, einem oder mehreren Markergenen, einem Enhancerelement, einem Promotor und einer Transkriptions-Terminationssequenz. Die Konstruktion geeigneter Vektoren, welche eine oder mehrere dieser Komponenten enthalten, erfolgt unter Verwendung von herkömmlichen Ligierungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
Die Prostatatumorantigen-Proteine der vorliegenden Erfindung werden hergestellt, indem eine Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, welcher eine ein Prostatatumorantigen-Protein codierende Nucleinsäure enthält, unter den geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, so dass die Expression des Proteins induziert oder ausgelöst wird. Die Bedingungen, die für die Expression des Prostatatumorantigen-Proteins geeignet sind, werden mit der Wahl des Expressionsvektors und der Wirtszelle variieren und können durch den Fachmann anhand von Routineexperimenten einfach bestimmt werden. Z. B. wird es bei Verwendung konstitutiver Promotoren im Expressionsvektor erforderlich sein, das Wachstum und die Proliferation der Wirtszelle zu optimieren, während bei Verwendung eines induzierbaren Promotors die geeigneten Wachstumsbedingungen für die Induktion nötig sind. Außerdem ist in einigen Ausführungsformen der Zeitpunkt der Ernte wichtig. Z. B. sind die in der Insektenzell-Expression verwendeten Baculovirus-Systeme lytische Viren, und somit kann die Auswahl des Erntezeitpunkts einen kritischen Punkt für die Produktausbeute darstellen.
Ein Wirtszellstamm kann nach seiner Fähigkeit ausgewählt werden, die Expression der eingefügten Sequenzen zu regulieren und das exprimierte Protein in der gewünschten Art und Weise zu prozessieren. Solche Modifikationen des Proteins schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung. Auch eine posttranslationale Prozessierung, die eine „Präpro"-Form des Proteins spaltet, kann für eine korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion wichtig sein. Z. B. weisen Wirtszellen wie CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293, WI38 usw. eine spezifische zelluläre Maschinerie und charakteristische Mechanismen für solche post-translationale Aktivitäten auf und können so ausgewählt werden, dass die korrekte Modifikation und Prozessierung des eingeführten fremden Proteins sichergestellt werden. Von besonderem Interesse sind Drosophila melanogaster-Zellen, Saccharomyces cerevisiae und andere Hefen, E. coli, Bacillus subtilis, SF9-Zellen, C129-Zellen, 293-Zellen, Neurospora-, BHK-, CHO-, COS- und HeLa-Zellen, Fibroblasten-, Schwanoma-Zelllinien, immortalisierte Säuger-Myeloid- und Lympoid-Zelllinien, Jurkat-Zellen, menschliche Zellen und andere primäre Zellen.
Die Nucleinsäure muss „funktionell verbunden" werden, indem sie mit einer anderen Nucleinsäuresequenz in einen funktionellen Zusammenhang gebracht wird. Z. B. ist eine DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader mit einer DNA für ein Polypeptid funktionell verbunden, wenn sie als ein Präprotein exprimiert wird, welches an der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist mit einer codierenden Sequenz funktionell verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist mit einer codierenden Sequenz funktionell verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass die Translation erleichtert wird. Im Allgemeinen grenzen „funktionell verbundene" DNA-Sequenzen aneinander an, und im Fall eines sekretorischen Leaders liegen sie aneinander angrenzend und in Lesephase vor. Dagegen müssen Enhancer nicht angrenzend vorliegen. Die Kopplung wird durch eine Ligierung an geeigneten Restriktionsstellen erreicht. Wenn keine solchen Stellen vorliegen, werden die synthetischen Oligonucleotid-Adaptoren oder Linker gemäß der herkömmlichen Praxis eingesetzt.
Promotorsequenzen codieren entweder konstitutive oder induzierbare Promotoren. Die Promotoren können entweder natürlich vorkommende Promotoren oder Hybridpromotoren sein. Hybridpromotoren, welche Elemente von mehr als einem Promotor kombinieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt und können in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Der Expressionsvektor kann zusätzliche Elemente umfassen, z. B. kann der Expressionsvektor zwei Replikationssysteme aufweisen, wodurch es ermöglicht wird, dass er in zwei Organismen aufrechterhalten werden kann, z. B. in Säuger- oder Insektenzellen für die Expression und in einem prokaryontischen Wirt für die Clonierung und Amplifikation.
Sowohl Expressions- als auch Clonierungsvektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, welche den Vektor in die Lage versetzt, sich in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien, Hefen und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2:-Plasmidursprung ist für Hefen geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Clonierungsvektoren in Säugerzellen geeignet.
Weiterhin enthält der Expressionsvektor für die Integration von Expressionsvektoren mindestens eine Sequenz, die zu dem Wirtszellgenom homolog ist, und vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, welche das Expressionskonstrukt flankieren. Der Vektor, der eingebaut wird, kann zu einem spezifischen Locus in der Wirtszelle hingesteuert werden, indem die geeignete homologe Sequenz ausgewählt wird, die dann in den Vektor eingefügt wird. Konstrukte zum Einbauen von Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Vorzugsweise enthält der Expressionsvektor ein Gen eines selektierbaren Markers, so dass die Selektion von transformierten Wirtszellen möglich wird. Selektionsgene sind auf dem Fachgebiet bekannt und werden entsprechend der verwendeten Wirtszelle verschieden sein.
Expressions- und Clonierungsvektoren werden typischerweise ein Selektionsgen enthalten, das auch als ein selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typische Selektionsgene codieren Proteine, welche (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mangelerscheinungen beheben oder (c) kritische Nährstoffe liefern, die aus komplexen Medien nicht verfügbar sind, z. B. das Gen, welches D-Alanin-Racemase codiert, für Bacilli.
Wirtszellen, die mit einer Nucleotidsequenz, welche ein Prostatatumorantigen codiert, transformiert sind, können unter Bedingungen gezüchtet werden, die für die Expression und Gewinnung des codierten Proteins aus einer Zellkultur geeignet sind. Das durch eine rekombinante Zelle produzierte Protein kann ausgeschieden werden, es kann membrangebunden vorliegen oder intrazellulär enthalten sein, abhängig von der verwendeten Sequenz und/oder dem verwendeten Vektor. Wie dem Fachmann geläufig sein wird, können Expressionsvektoren, die Polynucleotide enthalten, welche das Prostatatumorantigen codieren, zusammen mit Signalsequenzen konstruiert werden, welche die Sekretion des Prostatatumorantigens durch eine prokaryontische oder eukaryontische Zellmembran hindurch steuern.
Das gewünschte Prostatatumorantigen-Polypeptid kann nicht nur direkt rekombinant, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, welches eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid sein kann, das eine spezifische Spaltstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids aufweist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der Prostatatumorantigen-codierenden DNA sein, die in den Vektor eingefügt wird. Die Signalsequenz kann eine prokaryontische Signalsequenz sein, die z. B. aus der Gruppe von alkalischer Phosphatase-, Penicillinase-, Ipp- oder hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern ausgewählt ist. Für eine Hefesekretion kann die Signalsequenz z. B. der Hefe-Invertase-Leader, alpha-Faktor-Leader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktor-Leader, wobei der letztere im US-Patent Nr. 5 010 182 beschrieben ist) oder saure Phosphatase-Leader, der C. albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362 179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das Signal, beschrieben in WO 90/13646 , veröffentlicht am 15. November 1990, sein. In der Säugerzell- Expression können zur Steuerung der Sekretion des Proteins Säuger-Signalsequenzen wie Signalsequenzen von ausgeschiedenen Polypeptiden aus der gleichen oder einer verwandten Art und außerdem virale sekretorische Leader verwendet werden.
Gemäß dem gewählten Expressionssystem wird die codierende Sequenz in einen geeigneten Vektor eingefügt, für den seinerseits das Vorliegen von bestimmten charakteristischen „Kontrollelementen" oder „regulatorischen Sequenzen" erforderlich sein kann. Geeignete Konstrukte sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt (Ausubel et al., 1990) und in vielen Fällen von kommerziellen Anbietern wie Invitrogen (San Diego, Ka.), Stratagene (La Jolla, Ka.), Gibco BRL (Rockville, MD) oder Clontech (Palo Alto, Ka.) verfügbar.
a. Expression in bakteriellen Systemen
Die Transformation von Bakterienzellen kann unter Verwendung eines induzierbaren Promotors wie des hybriden lacZ-Promotors des Phagemids „BLUESCRIPT" (Stratagene, La Jolla, Ka.) oder „pSPORT1" (Gibco BRL, Rockville, MD) erreicht werden. Außerdem kann eine Reihe von Expressionsvektoren für die Verwendung in Bakterienzellen ausgewählt werden, um spaltbare Fusionsproteine zu produzieren, die einfach nachgewiesen und/oder gereinigt werden können, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf „BLUESCRIPT" (β-Galactosidase; Stratagene, La Jolla, Ka.) oder pGEX (Glutathion-S-Transferase; Promega, Madison, WI).
Ein geeigneter bakterieller Promotor ist eine beliebige Nucleinsäuresequenz, die in der Lage ist, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Stromabwärts-(3')-Transkription der codierenden Sequenz des Prostatatumorantigen-Gens in mRNA in Gang zu setzen. Ein bakterieller Promotor hat eine Transkriptions-Initiations-Region, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz liegt. Diese Transkriptions-Initiations-Region schließt typischerweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Initiations-Stelle ein. Sequenzen, welche Stoffwechselenzyme codieren, stellen besonders gut geeignete Promotorsequenzen bereit. Beispiele schließen Promotorsequenzen, die von Zuckermetabolisierenden Enzymen stammen, wie Galactose, Lactose und Maltose, und Sequenzen ein, die von biosynthetischen Enzymen stammen, wie Tryptophan. Außerdem können Promotoren aus einem Bakteriophagen eingesetzt werden und sind auf dem Fachgebiet bekannt. Weiterhin sind auch synthetische Promotoren und hybride Promotoren geeignet; z. B. ist der tac-Promotor ein Hybrid aus den trp- und lac-Promotorsequenzen. Außerdem kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren von nicht-bakteriellem Ursprung einschließen, welche die Fähigkeit besitzen, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription in Gang zu setzen. Auch eine effiziente Ribosomenbindungsstelle ist wünschenswert.
Der Expressionsvektor kann auch eine Signalpeptidsequenz einschließen, welche die Sekretion des Prostatatumorantigen-Proteins in Bakterien bewirkt. Die Signalsequenz codiert typischerweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, welche die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuern, wie auf dem Fachgebiet bekannt ist. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum ausgeschieden, der zwischen der inneren und äußeren Membran der Zelle liegt (Gram-negative Bakterien). Außerdem kann der bakterielle Expressionsvektor ein Gen für einen selektierbaren Marker enthalten, wodurch die Selektion von Bakterienstämmen, die transformiert wurden, möglich gemacht wird. Geeignete Selektionsgene schließen Arzneistoff-Resistenz-Gene wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin und Tetracyclin ein. Selektierbare Marker schließen auch biosynthetische Gene wie diejenigen in den Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthesewegen ein.
Wenn große Mengen von Prostatatumorantigen gebraucht werden, z. B. für die Induktion von Antikörpern, können Vektoren wünschenswert sein, die eine Expression mit hoher Expressionsrate von Fusionsproteinen, die einfach gereinigt werden können, steuern. Solche Vektoren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf multifunktionelle E. coli-Clonierungs- und Expressionsvektoren wie BLUESCRIPT^® (Stratagene, La Jolla, Ka.), in welchen die Prostatatumorantigen-codierende Sequenz in den Vektor im Raster mit Sequenzen für das aminoterminale Met und die anschließenden sieben Reste von β-Galactosidase ligiert werden kann, so dass ein Hybrid-Protein produziert wird; pIN-Vektoren [Van Heeke und Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503–5509 (1989)]; pET-Vektoren (Novagen, Madison, WI); und dergleichen.
Expressionsvektoren für Bakterien schließen die verschiedenen, vorstehend angeführten Komponenten ein und sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispiele schließen Vektoren für Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus cremoris und Streptococcus lividans u. a. ein. Bakterielle Expressionsvektoren werden in bakterielle Wirtszellen transformiert, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie Calciumchlorid-vermittelte Transfektion, Elektroporation und dergleichen.
b. Expression in Hefen
Hefeexpressionssysteme sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Expressionsvektoren für Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans und C. maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis und K. lactis, Pichia guillerimondii und P. pastoris, Schizosaccharomyces pombe und Yarrowia lipolytica ein. Beispiele von geeigneten Promotoren zur Verwendung in Hefewirten schließen die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase [Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980)] oder andere glycolytische Enzyme [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry 17: 4900 (1978)] wie Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructo-Kinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase, Alpha-Faktor, den ADH2/GAPDH-Promotor, Glucokinase-Alkoholoxidase und PGH ein. [Vgl. z. B. Ausubel et al., 1990; Grant et al., Methods in Enzymology 153: 516–544 (1987)].
Andere Hefepromotoren, die induzierbar sind und den zusätzlichen Vorteil haben, dass die Transkription durch Wachstumsbedingungen gesteuert wird, schließen die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem Stickstoffstoffwechsel assoziiert sind, Metallothionein, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme ein, die für die Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind. Außerdem sind geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung in der Hefeexpression in EP 73 657 beschrieben. Selektierbare Hefe-Marker schließen ein: ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7, wodurch eine Resistenz gegenüber Tunicamycin verliehen wird; das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, welches eine Resistenz gegenüber G418 verleiht; und das CUP1-Gen, welches es möglich macht, dass die Hefe in Gegenwart von Kupferionen wachsen kann.
Hefe-Expressionsvektoren können für die intrazelluläre Produktion oder Sekretion eines Prostatatumorantigens aus der DNA, die das Prostatatumorantigen von Interesse codiert, konstruiert werden. Z. B. können ein ausgewähltes Signalpeptid und der geeignete konstitutive oder induzierbare Promotor für eine direkte intrazelluläre Expression des Prostatatumorantigen-Polypeptids an geeigneten Restriktionsstellen in das selektierte Plasmid eingefügt werden. Für eine Sekretion des Prostatatumorantigens kann eine DNA, welche das Prostatatumorantigen-Polypeptid codiert, zusammen mit einer DNA, welche den Promotor, die sekretorische Signal/Leader-Sequenz des Hefe-α-Faktors und Linker-Sequenzen (falls erforderlich) codiert in das ausgewählte Plasmid für die Expression des Prostatatumorantigen-Polypeptids cloniert werden.
Sodann können Hefezellen mit den vorstehend beschriebenen Expressionsplasmiden transformiert und in einem geeigneten Fermentationsmedium gezüchtet werden. Das durch eine solche transformierte Hefe produzierte Protein kann anschließend durch Fällung mit 10% Trichloressigsäure eingeengt und nach der Trennung durch SDS-PAGE und Färbung der Gele mit Coomassie-Blau-Färbung analysiert werden.
Danach kann das rekombinante Prostatatumorantigen aus dem Fermentationsmedium durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, isoliert und gereinigt werden.
c. Expression in Säugersystemen
Die Prostatatumorantigen-Proteine können in Säugerzellen exprimiert werden. Säuger-Expressionssysteme sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Retrovirusvektor-vermittelte Expressionssysteme ein. Säuger-Wirtszellen können mit einem beliebigen von einer Reihe von unterschiedlichen Virus-basierten Expressionssystemen transformiert werden, wie Adenovirus, wobei die codierende Region in einen Adenovirus-Transkriptions/Translationskomplex, der aus dem späten Promotor und einer dreiteiligen Leadersequenz besteht, ligiert werden kann. Die Insertion in eine nicht-essentielle E1- oder E3-Region des Virusgenoms führt zu einem lebensfähigen Virus, der in der Lage ist, das Polypeptid von Interesse in infizierten Wirtszellen zu exprimieren.
Ein bevorzugtes Expressionsvektorsystem ist ein Retrovirus-Vektorsystem, wie es allgemein in PCT/US97/01019 und PCT/US97/01048 beschrieben ist.
Geeignete Säuger-Expressionsvektoren enthalten einen Säuger-Promotor, der eine beliebige DNA-Sequenz ist, die in der Lage ist, an Säuger-RNA-Polymerase zu binden und die Stromabwärts-(3'-)Transkription einer codierenden Sequenz für ein Prostatatumorantigen-Protein in mRNA in Gang zu setzen. Ein Promotor wird eine Transkriptions-Initiations-Region, die üblicherweise proximal zum 5'-Ende der codierenden Sequenz platziert ist, und eine TATA-Box, wobei eine aus 25 bis 30 Basenpaaren bestehende, stromaufwärts der Transkriptionsstelle liegende Region verwendet wird, besitzen. Man geht davon aus, dass die TATA-Box die RNA-Polymerase II so steuert, dass sie die RNA-Synthese an der korrekten Stelle beginnt. Außerdem wird ein Säuger-Promotor noch ein Stromaufwärts-Promotorelement (Enhancerelement) aufweisen, das typischerweise innerhalb von 100 bis 200 Basenpaaren stromaufwärts der TATA-Box liegt. Ein Stromaufwärts-Promotorelement bestimmt die Rate, mit der die Transkription initiiert wird, und kann in beiden Richtungen wirken. Besonders geeignet zur Verwendung als Säuger-Promotoren sind die Promotoren aus Säugervirus-Genen, da die Virusgene häufig stark exprimiert werden und ein breites Wirtsspektrum aufweisen.
Beispiele schließen Promotoren ein, die erhalten werden aus den Genomen von Viren wie Polyoma-Virus, Geflügelpocken-Virus ( UK 2 211 504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie Adenovirus 2), Rinder-Papillom-Virus, Vogelsarkom-Virus, Zytomegalie-Virus, Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und Affenvirus 40 (SV40), aus heterologen Säuger-Promotoren, z. B. dem Actin-Promotor oder einem Immunglobulin-Promotor, und aus Hitzeschock-Promotoren, mit der Maßgabe, dass solche Promotoren mit den Wirtszellsystemen kompatibel sind.
Die Transkription einer DNA, welche ein Prostatatumorantigen-Polypeptid codiert, durch höhere Eukaryonten kann gesteigert werden, indem eine Enhancersequenz in den Vektor eingefügt wird. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA mit üblicherweise etwa 10 bis 300 bp, die auf einen Promotor so wirken, dass seine Transkription gesteigert wird. Inzwischen sind zahlreiche Enhancersequenzen aus Säugergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise wird man jedoch einen Enhancer aus einem Virus von eukaryontischen Zellen einsetzen. Beispiele schließen den SV40-Enhancer, den Enhancer des frühen Zytomegalie-Virus-Promotors, den Polyom-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und den Adenovirus-Enhancer ein. Der Enhancer ist vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor positioniert.
Im Allgemeinen sind die Transkriptions-Terminations- und Polyadenylierungssequenzen, die durch Säugerzellen erkannt werden, regulatorische Regionen, die 3' zum Translations-Stoppcodon liegen, und somit flankieren sie, zusammen mit den Promotorelementen, die codierende Sequenz. Der 3'-Terminus der reifen mRNA wird durch positionsspezifische post-translationale Spaltung und Polyadenylierung gebildet. Beispiele von Transkriptions-Terminations- und Polyadenylierungs-Signalen schließen diejenigen ein, die von SV40 stammen.
Eine langfristige Produktion von rekombinanten Proteinen mit einer hohen Ausbeute kann in einem stabilen Expressionssystem erreicht werden. Für diesen Zweck können Expressionsvektoren verwendet werden, die virale Replikationsursprünge oder endogene Expressionselemente und ein Gen für einen selektierbaren Marker enthalten. Geeignete Vektoren, die selektierbare Marker zur Verwendung in Säugerzellen enthalten, sind im Handel einfach verfügbar und dem Fachmann bekannt. Beispiele solcher selektierbaren Marker schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Herpes-simplex-Virus-Thymidin-Kinase und Adenin-Phosphoribosyl-Transferase zur Verwendung in tk- bzw. hprt-Zellen.
Die Verfahren zum Einführen von exogener Nucleinsäure in Säugerzellen und auch in andere Wirte sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind entsprechend der verwendeten Wirtszelle verschieden. Die Verfahren schließen die Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Fällung, Polybrene-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Virusinfektion, Einkapselung des Polynucleotids (der Polynucleotide) in Liposomen und die direkte Mikroinjektion der DNA in Kerne ein.
d. Expression in Insektenzellen
Prostatatumorantigen-Polypeptide können auch in Insektenzellen hergestellt werden. Expressionsvektoren für die Transformation von Insektenzellen und insbesondere Baculovirus-basierte Expressionsvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. In einem solchen System wird die Prostatatumorantigen-codierende DNA stromaufwärts eines innerhalb eines Baculovirus-Expressionsvektors enthaltenen Epitop-Tag fusioniert. Autographa californica-Kernpolyedervirus (AcNPV) wird als ein Vektor eingesetzt, um fremde Gene in Spodoptera frugiperda Sf9-Zellen oder in Trichoplusia-Larven zu exprimieren. Die Prostatatumorantigen-codierende Sequenz wird in eine nicht-essentielle Region des Virus wie das Polyhedrin-Gen cloniert und unter die Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gestellt. Eine erfolgreiche Insertion einer Prostatatumorantigen-codierenden Sequenz wird das Polyhedrin-Gen inaktivieren und ein rekombinantes Virus produzieren, dem die Hüllprotein-Umhüllung fehlt. Anschließend werden die rekombinanten Viren eingesetzt, um S. frugiperda-Zellen oder Trichoplusia-Larven zu infizieren, in welchen das Prostatatumorantigen dann exprimiert wird [Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1994); Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3224–3227 (1994)].
Geeignete Epitop-Tags für die Fusion an die Prostatatumorantigen-codierende DNA schließen Poly-His-Tags und Immunglobulin-Tags (wie Fc-Regionen von IgG) ein. Eine Vielzahl von Plasmiden kann eingesetzt werden, einschließlich kommerziell verfügbarer Plasmide wie pVL1393 (Novagen, Madison, WI). Kurz gesagt wird die Prostatatumorantigen-codierende DNA oder der gewünschte Teil der Prostatatumorantigen-codierenden DNA durch PCR mit Primern, die zu den 5'- und 3'-Regionen komplementär sind, amplifiziert. Der 5'-Primer kann flankierende Restriktionsstellen einbauen. Danach wird das PCR-Produkt mit den gewählten Restriktionsenzymen gespalten und in einen Expressionsvektor subcloniert.
Ein rekombinantes Baculovirus wird durch die gemeinsame Transfektion des vorstehenden Plasmids und BaculoGold^TM-Virus-DNA (Pharmingen, San Diego, Ka.) in Spodoptera frugiperda-(„Sf9"-)Zellen (ATCC CRL 1711) erzeugt, indem Lipofectin (kommerziell verfügbar von Gibco-BRL, Rockville, MD) eingesetzt oder andere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden. Das Virus wird am Tag 4 bis 5 der Kultur in Sf9-Zellen bei 28°C produziert und für weitere Amplifikationen eingesetzt. Die Verfahren werden durchgeführt, wie in O'Reilley et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratry Manual, Oxford University Press (1994), noch weiter beschrieben ist.
Sodann können Extrakte aus den mit dem rekombinanten Virus infizierten Sf9-Zellen, wie in Rupert et al., Nature 362: 175–179 (1993), beschrieben, hergestellt werden.
Alternativ können die exprimierten, mit einem Epitop-Tag versehenden Prostatatumorantigen-Polypeptide durch Affinitätschromatographie gereinigt werden, oder die Reinigung eines mit einem IgG-Tag (oder Fc-Tag) versehenen Prostatatumorantigen-Polypeptids kann z. B. unter Verwendung chromatographischer Verfahren, einschließlich Protein-A- oder Protein-G-Säulenchromatographie, durchgeführt werden.
D. Bestimmung der Genexpression
Die Genexpression kann in einer Probe direkt bestimmt werden, z. B. durch Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. Southern-Blot-Verfahren zum DNA-Nachweis, Northern-Blot-Verfahren zur Bestimmung der Transkription von mRNA, Dot-Blot-Verfahren (DNA oder RNA) oder in situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde, die auf den hier bereitgestellten Sequenzen basiert. Alternativ können Antikörper in Tests zum Nachweisen von Nucleinsäuren wie spezifischen Doppelsträngen, einschließlich DNA-Doppelstränge, RNA-Doppelstränge, und DNA-RNA-Hybrid-Doppelstränge oder DNA-Protein-Doppelstränge, eingesetzt werden. Solche Antikörper können markiert sein, und der Test kann ausgeführt werden, indem der Doppelstrang an eine Oberfläche gebunden wird, so dass bei Bildung eines Doppelstrangs an der Oberfläche sodann durch das Vorliegen des an den Doppelstrang gebundenen Antikörpers nachgewiesen werden kann.
Alternativ kann die Genexpression durch eine immunhistochemische Färbung von Zellen oder Gewebeschnitten und einen Test von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten gemessen werden, wodurch die Expression von Prostatatumorantigenen direkt bestimmt wird. Antikörper, die für solche immunologische Tests geeignet sind, können entweder monoclonale oder polyclonale Antikörper sein, und sie können gegen eine native Sequenz des Prostatatumorantigens, basierend auf den hier bereitgestellten Sequenzen, hergestellt werden.
1. Reinigung des exprimierten Proteins
Exprimierte Prostatatumorantigen-Polypeptide können nach der Expression unter Verwendung eines von einer Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, gereinigt oder isoliert werden. Das geeignete Verfahren wird jeweils davon abhängig sein, welche anderen Komponenten in der Probe vorliegen. Verunreinigende Komponenten, die durch Isolierung oder Reinigung entfernt werden, sind Stoffe, welche typischerweise diagnostische oder therapeutische Verwendungen des Polypeptids stören würden, und können Enzyme, Hormone und andere gelöste Stoffe einschließen. Der (die) Reinigungsschritt(e) wird (werden) z. B. von der Art des verwendeten Herstellungsprozesses und dem bestimmten hergestellten Prostatatumorantigen-Polypeptid abhängen.
Ein Prostatatumorantigen-Polypeptid oder -Protein kann aus dem Kulturmedium oder aus Lysaten von Wirtszellen gewonnen werden. Wenn es membrangebunden vorliegt, kann es aus der Membran unter Verwendung einer geeigneten Detergenslösung (z. B. Triton-X 100) oder durch enzymatische Spaltung freigesetzt werden. Alternativ können die Zellen, die für die Expression von Prostatatumorantigen-Polypeptiden verwendet werden, durch verschiedene physikalische oder chemische Verfahren wie Zyklen von Einfrieren/Auftauen, Beschallung, mechanischer Aufschluss oder durch die Verwendung von zelllysierenden Mitteln aufgeschlossen werden.
Beispiele von Reinigungsverfahren schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Ionenaustausch-Säulenchromatographie; Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel oder eines Kationen-Austauscherharzes wie DEAE; Gelfiltration, unter Verwendung von z. B. Sephadex G-75; Protein-A-Sepharose-Säulen zur Entfernung von Verunreinigungen, wie IgG; Chromatographie unter Verwendung von metallchelatbildenden Säulen, um Epitop-Tag-Formen des Prostatatumorantigen-Polypeptids zu binden; Ethanol-Fällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; und Ammoniumsulfat-Fällung. Im Allgemeinen wird ein isoliertes Prostatatumorantigen-Polypeptid durch mindestens einen Reinigungsschritt hergestellt. Z. B. kann das Prostatatumorantigen-Protein unter Verwendung einer Standard-anti-Prostatatumorantigen-Antikörper-Säule gereinigt werden. Außerdem können Ultrafiltrations- und Dialyseverfahren in Verbindung mit einer Protein-Anreicherung eingesetzt werden (vgl. z. B. Scopes, R., „Protein Purification", Springer-Verlag, NY, 1982). Das erforderliche Ausmaß der Reinigung wird variieren, und zwar abhängig von der Verwendung des Prostatatumorantigens. In einigen Fällen wird keine Reinigung erforderlich sein.
Sobald die Prostatatumorantigen-Proteine und -Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung exprimiert und wie erforderlich gereinigt sind, können sie in verschiedenen Anwendungen, wie nachstehend noch ausführlich angegeben, verwendet werden.
2. Markierung des exprimierten Proteins
Die Nucleinsäuren, Proteine und Antikörper der Erfindung können markiert sein. Mit markiert ist hier gemeint, dass eine Verbindung mindestens ein/e daran gekoppelte/s Element, Isotop oder chemische Verbindung aufweist, wodurch der Nachweis der Verbindung ermöglicht wird. Im Allgemeinen fallen Markierungen in drei Klassen: a) Isotopen-Markierungen, die radioaktive oder schwere Isotope sein können; b) Immunmarkierungen, die Antikörper oder Antigene sein können; und c) farbige oder fluoreszierende Farbstoffe. Die Markierungen können in die Verbindung an einer beliebigen Position eingebaut werden, so dass die biologische Aktivität oder die Eigenschaft der Verbindung, die nachgewiesen wird, nicht gestört wird.
3. Prostatatumorantigen-Fusionsproteine
Die Prostatatumorantigene der vorliegenden Erfindung können auch in einer Weise modifiziert werden, so dass chimäre Moleküle gebildet werden, welche ein Prostatatumorantigen umfassen, das an ein anderes heterologes Polypeptid oder an eine andere heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist. Der hier verwendete Begriff „Fusionsprotein" bezieht sich auf ein chimäres Polypeptid, welches ein Prostatatumorantigen-Polypeptid oder eine Domänen-Sequenz davon umfasst, das/die an ein „Targeting-Polypeptid" fusioniert ist. Das Targeting-Polypeptid hat ausreichend viele Reste, um das zielgerichtete Hinsteuern zu einem bestimmten Zelltyp oder Rezeptor zu erleichtern, es ist jedoch auch kurz genug, so dass es nicht die biologische Funktion des Prostatatumorantigen-Polypeptids stört. Das Targeting-Polypeptid ist außerdem vorzugsweise ziemlich einmalig, so dass das Fusionsprotein nicht wesentlich mit anderen Zelltypen oder Rezeptoren kreuzreagiert. Geeignete Targeting-Polypeptide haben im Allgemeinen mindestens etwa zehn Aminosäurereste und üblicherweise zwischen etwa zehn und etwa 500 Aminosäurereste. Bevorzugte Targeting-Polypeptide haben etwa 20 bis etwa 200 Aminosäurereste.
Das Fusionsprotein kann auch eine Fusion eines Prostatatumorantigens mit einem Tag-Polypeptid umfassen, welches ein Epitop bereitstellt, an das ein anti-Tag-Antikörper selektiv binden kann. Das Epitop-Tag wird im Allgemeinen am Amino- oder Carboxy-Ende des Prostatatumorantigens positioniert. Solche mit einem Epitop-Tag versehenen Formen eines Prostatatumorantigens können unter Verwendung eines Antikörpers gegen das Tag-Polypeptid nachgewiesen werden. Außerdem macht es die Bereitstellung des Epitop-Tag möglich, das Prostatatumorantigen einfach zu reinigen, indem eine anti-Tag-Antikörper- oder ein anderer Typ von Affinitätsmatrix verwendet wird, die an das Epitop-Tag bindet. Alternativ kann das Fusionsprotein eine Fusion eines Prostatatumorantigens mit einem Immunglobulin oder einer bestimmten Region eines Immunglobulins umfassen. Für eine bivalente Form des chimären Moleküls könnte eine solche Fusion mit der Fc-Region eines IgG-Moleküls oder z. B. GM-CSF vorliegen. Bevorzugte Fusionsproteine schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Moleküle, welche eine immunologische Zielsteuerung des Prostatatumorantigens erleichtern.
Das Prostatatumorantigen-Fusionsprotein kann für verschiedene andere Zwecke unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Z. B. kann für die Erzeugung von Antikörpern, wenn das gewünschte Epitop klein ist, ein partielles oder vollständiges Prostatatumorantigen-Protein mit einem Trägerprotein fusioniert werden, so dass ein Immunogen gebildet wird. Alternativ kann das Prostatatumorantigen-Protein als ein Fusionsprotein hergestellt werden, um die Fähigkeit des Antigens zu steigern, zelluläre und/oder humorale (Antikörper-basierte) Immunantworten zu stimulieren, oder dies kann auch aus anderen Gründen erfolgen.
E. Anti-Prostatatumorantigen-Antikörper
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung anti-Prostatatumorantigen-Antikörper bereit. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung schließen polyclonale, monoclonale, humanisierte, bispezifische und Heterokonjugat-Antikörper ein.
1. Polyclonale Antikörper
Die anti-Prostatatumorantigen-Antikörper der vorliegenden Erfindung können polyclonale Antikörper sein. Verfahren zum Herstellen polyclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Solche polyclonalen Antikörper können in einem Säuger z. B. nach einer oder mehreren Injektionen eines immunisierenden Mittels und vorzugsweise eines Adjuvans hergestellt werden. Typischerweise werden/wird das immunisierende Mittel und/oder Adjuvans in den Säuger durch eine Reihe von subkutanen oder intraperitonealen Injektionen injiziert. Das immunisierende Mittel kann ein Prostatatumorantigen oder ein Fusionsprotein davon einschließen. Es kann günstig sein, das Antigen an ein Protein zu konjugieren, von dem bekannt ist, dass es in dem Säuger, der immunisiert wird, immunogen ist. Beispiele solcher immunogenen Proteine schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf KLH („keyhole limpet hemocyanin), Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin und Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor. Adjuvantien schließen z. B. Freundsches komplettes Adjuvans und MPL-TDM-Adjuvans (Monophosphoryl-Lipid-A, synthetisches Trehalosedicorynomycolat) ein. Der Fachmann kann das Protokoll für die Immunisierung aufgrund von Standardprotokollen oder durch Routineexperimente bestimmen.
2. Monoclonale Antikörper
Alternativ können die anti-Prostatatumorantigen-Antikörper monoclonale Antikörper sein. Monoclonale Antikörper können durch Hybridome produziert werden, wobei eine Maus, ein Hamster oder ein anderes geeignetes Wirtstier mit einem immunisierenden Mittel immunisiert wird, um Lymphocyten zu induzieren, die Antikörper produzieren oder die in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, welche spezifisch an das immunisierende Mittel binden [Köhler und Milstein, Nature 256: 495 (1975)]. Alternativ können die Lymphocyten in vitro immunisiert werden.
Das immunisierende Mittel wird typischerweise das Prostatatumorantigen oder ein Fusionsprotein davon einschließen. Im Allgemeinen werden Milzzellen oder Lymphknotenzellen verwendet, wenn als Quellen Nicht-Mensch-Säuger gewünscht sind, oder es werden periphere Blutlymphocyten („PBLs") eingesetzt, wenn Zellen menschlichen Ursprungs gewünscht sind. Die Lymphocyten werden mit einer immortalisierten Zelllinie unter Verwendung eines geeigneten Fusionierungsmittels wie Polyethylenglykol fusioniert, wodurch eine Hybridomzelle hergestellt wird [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, S. 59–103 (1986)]. Im Allgemeinen sind immortalisierte Zelllinien transformierte Säugerzellen, z. B. Myelomzellen, die von Ratte, Maus, Rind oder Mensch stammen. Die Hybridomzellen werden in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, das vorzugsweise einen oder mehrere Stoffe enthält, welche das Wachstum oder das Überleben von nicht-fusionierten immortalisierten Zellen hemmen. Wenn z. B. den parentalen Zellen das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT) fehlt, wird das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) enthalten, Stoffe, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
Bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind diejenigen, die effizient fusionieren, eine stabile Antikörper-Produktion auf hohem Niveau liefern und empfindlich gegenüber einem Medium, wie HAT-Medium, sind. Stärker bevorzugte immortalisierte Zelllinien sind murine oder menschliche Myelomlinien, die z. B. aus der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, erhalten werden können. Außerdem wurden menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelom-Zelllinien für die Produktion von menschlichen monoclonalen Antikörpern beschrieben [Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, S. 51–63 (1987)].
Das Kulturmedium (Überstand), in welchem die Hybridomzellen gezüchtet werden, kann auf das Vorliegen von monoclonalen Antikörpern, die gegen ein Prostatatumorantigen gerichtet sind, getestet werden. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoclonalen Antikörpern, die in dem Hybridomüberstand vorliegen, durch Immunfällung oder durch einen in vitro-Bindungstest wie Radioimmuntest (RIA) oder enzymeverbundenen Immunadsorptions-Assay (ELISA), bestimmt. Geeignete Verfahren und Tests sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Bindungsaffinität des monoclonalen Antikörpers kann z. B. durch die Scatchard- Analyse von Munson und Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980), bestimmt werden.
Nachdem die gewünschten Antikörper-produzierenden Hybridomzellen identifiziert wurden, können die Zellen durch Verfahren der Grenzwert-Verdünnung cloniert und durch Standardverfahren gezüchtet werden [Goding, 1986]. Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen z. B. Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium und RPMI-1640-Medium. Alternativ können die Hybridomzellen in vivo als Aszitesflüssigkeit in einem Säugetier gezüchtet werden.
Die monoclonalen Antikörper, die durch selektierte Clone ausgeschieden werden, können aus dem Kulturmedium oder aus der Aszitesflüssigkeit durch Immunglobulin-Reinigungsverfahren isoliert oder gereinigt werden, die durch den Fachmann routinemäßig eingesetzt werden, wie z. B. Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gel-Elektrophorese, Dialyse oder Affinitäts-Chromatographie.
Die monoclonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinations-Verfahren wie diejenigen, die im US-Patent Nr. 4 816 567 beschrieben sind, hergestellt werden. Die DNA, welche die monoclonalen Antikörper der Erfindung codiert, kann aus den Prostatatumorantigen-spezifischen Hybridomzellen isoliert und sequenziert werden, indem z. B. Oligonucleotid-Sonden eingesetzt werden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene zu binden, welche die schweren und leichten Ketten von murinen Antikörpern codieren. Sobald die DNA isoliert ist, kann sie in einen Expressionsvektor eingefügt werden, der sodann in Wirtszellen wie Affen-COS-Zellen, Ovarzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) oder Myelomzellen, die ansonsten kein Immunglobulin-Protein produzieren, transfiziert wird, so dass die Synthese von monoclonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zustande kommt. Außerdem kann die DNA modifiziert werden, z. B. indem die codierende Sequenz für die konstanten Domänen der menschlichen schweren und leichten Kette anstelle der homologen murinen Sequenzen substituiert wird [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851–6855 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604–608 (1984); Takeda et al., Nature 314: 452–454 (1985)] oder indem an die Immunglobulin-codierende Sequenz die gesamte oder ein Teil der codierenden Sequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kovalent gekoppelt wird. Das Nicht-Immunglobulin-Polypeptid kann für die konstanten Domänen eines Antikörpers der Erfindung substituiert werden, oder es kann für die variablen Domänen einer bestimmten Antigenkombinations-Stelle eines Antikörpers der Erfindung substituiert werden, wodurch ein chimärer bivalenter Antikörper erzeugt wird.
Die Antikörper können auch monovalente Antikörper sein. Verfahren zum Herstellen von monovalenten Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Herstellen monovalenter Antikörper sind z. B. in vitro-Verfahren geeignet. Die Spaltung von Antikörpern zur Erzeugung von Fragmenten davon, insbesondere Fab-Fragmenten, kann unter Verwendung von Routineverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, erreicht werden.
3. Humanisierte Antikörper
Die anti-Prostatatumorantigen-Antikörper der Erfindung können weiterhin humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper umfassen. Der Begriff „humanisierte Antikörper" bezieht sich auf die humanisierten Formen von Nicht-Mensch-(z. B. murinen)Antikörpern, die chimäre Antikörper, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie Fv, Fab, Fab', (F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende partielle Sequenzen von Antikörpern) sind, die einen gewissen Anteil der von einem Nicht-Mensch-Antikörper stammenden Sequenz enthalten. Humanisierte Antikörper schließen menschliche Immunglobuline ein, in welchen Reste aus einer Komplementaritäts-bestimmenden Region (CDR) des menschlichen Immunglobulins durch Reste aus einer CDR einer Nicht-Mensch-Art wie Maus, Ratte oder Kaninchen, welche die gewünschte Bindungsspezifität, -Affinität und -Kapazität aufweisen, ersetzt sind. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von mindestens einer, und im Allgemeinen zwei, variablen Domänen umfassen, in welchen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen denjenigen eines Nicht-Mensch-Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen diejenigen einer humanen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper wird im optimalen Fall auch mindestens einen Teil einer konstanten Immunglobulin-Region (Fc) umfassen, typischerweise diejenige eines menschlichen Immunglobulins [Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593–596 (1992)].
Verfahren zum Humanisieren von Nicht-Mensch-Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper eine oder mehrere Aminosäuren auf, die aus einer Quelle, die Nicht-Mensch ist, eingeführt wurden, so dass er einem menschlichen Antikörper noch ähnlicher ist, während bei ihm immer noch die ursprüngliche Bindungsaktivität des Antikörpers erhalten bleibt. Verfahren zum Humanisieren von Antikörpern werden in Jones et al., Nature 321: 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323–327 (1988); und Verhoeyen et al., Science 239: 1534–1536 (1988), noch ausführlicher beschrieben.
Solche „humanisierten" Antikörper sind chimäre Antikörper, wobei im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer Nicht-Mensch-Art substituiert wurde.
4. Heterokonjugat-Antikörper
Auch Heterokonjugat-Antikörper, die zwei kovalent gekoppelte Antikörper umfassen, liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung. Heterokonjugat-Antikörper können in vitro unter Verwendung bekannter Verfahren der chemischen Proteinsynthese, einschließlich solcher Verfahren, an denen Vernetzungsmittel beteiligt sind, hergestellt werden. Z. B. können Immuntoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bildung einer Thioetherbindung hergestellt werden.
5. Bispezifische Antikörper
Bispezifische Antikörper haben Bindungsspezifitäten für mindestens zwei verschiedene Antigene. Solche Antikörper sind monoclonal und vorzugsweise human oder humanisiert. Die eine der Bindungsspezifitäten eines bispezifischen Antikörpers der vorliegenden Erfindung betrifft ein Prostatatumorantigen, und die andere betrifft vorzugsweise ein Zelloberflächen-Protein oder einen Rezeptor oder eine Rezeptor-Untereinheit.
Verfahren zum Herstellen von bispezifischen Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt, und im Allgemeinen beruht die rekombinante Herstellung von bispezifischen Antikörpern auf der gemeinsamen Expression von zwei schwere Immunglobulinkette/leichte Immunglobulinkette-Paaren in Hybridomzellen, wobei die zwei schweren Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen [Milstein und Cuello, Nature 305: 537–539 (1983)]. In Anbetracht dessen, dass die zufällige Anordnung von schweren und leichten Immunglobulinketten dazu führt, dass durch die Hybridome möglicherweise zehn verschiedene Antikörpermoleküle produziert werden, ist für die Reinigung des korrekten Moleküls üblicherweise eine Art von Affinitätsreinigung, z. B. eine Affinitäts-Chromatographie, erforderlich.
III. Nutzen
A. Polynucleotide
Für Polynucleotidsequenzen (oder das Komplement davon), welche Prostatatumorantigen-Polypeptide codieren, gibt es verschiedene Anwendungsmöglichkeiten, einschließlich der Verwendung als Hybridisierungs-Sonden, in der Chromosomen- und Genkartierung und in der Erzeugung von Antisense-RNA und -DNA. Außerdem eignen sich Prostatatumorantigen-codierende Nucleinsäuren möglicherweise als Ziele für eine pharmazeutische Intervention, z. B. für die Entwicklung von DNA-Impfstoffen, und für die Herstellung von Prostatatumorantigen-Polypeptiden durch Rekombinationsverfahren, wie hier beschrieben wird. Das hier beschriebene Polynucleotid, einschließlich Sequenzvarianten davon, kann in diagnostischen Tests, insbesondere zum Nachweisen von Tumorzellen, eingesetzt werden. Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die beschriebene Sequenz zurzeit als spezifisch für Prostatatumorzellen angesehen wird, wobei sie jedoch auch für andere Tumorzellen charakteristisch sein kann. Demgemäß werden in vitro-Diagnoseverfahren beschrieben, die darauf beruhen, das Vorliegen solcher Polynucleotide in Körperflüssigkeiten oder Gewebeproben nachzuweisen.
Beispiele von Nucleinsäure-basierten diagnostischen Tests gemäß der vorliegenden Erfindung schließen Hybridisierungstests, z. B. in situ-Hybridisierung, und PCR-basierte Tests ein. Polynucleotide, einschließlich verlängerter Polynucleotide, Sequenzvarianten und Fragmente davon, wie hier beschrieben, können eingesetzt werden, um Hybridisierungssonden oder PCR-Primer für die Verwendung in solchen Tests zu erzeugen. Solche Sonden und Primer werden in der Lage sein, Polynucleotidsequenzen, einschließlich genomischer Sequenzen, nachzuweisen, die den hier beschriebenen, tumorspezifischen Polynucleotiden ähnlich oder die dazu komplementär sind.
Hybridisierungssonden können z. B. dazu verwendet werden, eine in situ-Hybridisierung an Gewebeproben wie fixierten oder gefrorenen Gewebeschnitten, die auf mikroskopischen Objektträgern präpariert wurden, oder an suspendierten Zellen durchzuführen. Kurz gesagt lässt man eine markierte DNA- oder RNA-Sonde unter kontrollierten Bedingungen an ihre DNA- oder RNA-Zielprobe in dem Gewebeschnitt auf einem präparierten mikroskopischen Objektträger binden. Im Allgemeinen werden für diesen Zweck dsDNA-Sonden verwendet, die aus der DNA von Interesse bestehen, die in einen Plasmid- oder Bakteriophagen-DNA-Vektor cloniert ist, wobei jedoch auch ssDNA- oder ssRNA-Sonden verwendet werden können. Die Sonden sind im Allgemeinen Oligonucleotide mit einer Länge von etwa 15 bis 40 Nucleotiden. Alternativ können die Sonden Polynucleotid-Sonden sein, die durch Primerverlängerung mit PCR-Random-Priming oder in vitro-Transkription von RNA aus Plasmiden (Ribo-Sonden) erzeugt werden. Diese letzteren Sonden weisen typischerweise eine Länge von mehreren 100 Basenpaaren auf. Die Sonden können durch ein beliebiges von verschiedenen Verfahren, einschließlich fluoreszierender Tags, Enzyme oder radioaktiver Einheiten, gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, markiert werden. Das bestimmte Nachweisverfahren wird dem Typ der Markierung entsprechen, die auf der Sonde verwendet wird (z. B. Autoradiographie, Nachweis mit Röntgenstrahlen, fluoreszierende oder visuelle mikroskopische Analyse, wie es geeignet ist). Die Reaktion lässt sich in situ noch verstärken, indem immuncytochemische Verfahren eingesetzt werden, die gegen die verwendete Markierung des Nachweismoleküls gerichtet sind, wie Antikörper, die gegen eine Fluorescein-Einheit, die auf einer fluoreszierend markierten Sonde vorliegt, oder gegen Avidin oder Markerenzyme (Peroxidase, alkalische Phosphatase) gerichtet sind. Spezifische Markierungs- und in situ-Nachweisverfahren finden sich z. B. in Howard, G. C., Hrsg., Methods in Nonradioactive Detection, Appleton & Lange, Norwalk, CT, (1993), das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
In einem bevorzugten in vitro-Test zum Nachweisen von Prostatatumorzellen werden das vorliegende Polynucleotid oder Fragmente davon als Primer in einem PCR-basierten Test verwendet. Gemäß dem in vitro-Test werden Nucleinsäuren, die in einer Testgewebe- oder Zellprobe vorliegen, durch Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert, wobei zwei Primer verwendet werden, die aus mindestens 15 Nucleotiden bestehen, welche von SEQ ID NO: 14 hergeleitet sind, einschließlich Primer, die von Varianten und/oder Verlängerungen solcher Sequenzen stammen, die hier beschrieben sind. Amplifikationsprodukte werden in der Probe durch ein Verfahren, das für die bestimmte Markierung geeignet ist, die zum Markieren der Amplifikationsprodukte verwendet wird, gemäß Verfahren, die in US-Patent Nr. 4 683 195 beschrieben sind, nachgewiesen. Für die Verwendung in PCR-Nachweisverfahren wie PCR-in situ-Hybridisierung werden PCR-Primer so ausgewählt, dass sie eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden und vorzugsweise eine Länge von etwa 15 bis 30 Nucleotiden aufweisen, wobei sie aus dem DNA-Molekül von Interesse gemäß Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, ausgewählt werden. Zwar können solche Primer innerhalb der hier als SEQ ID NO: 14 angegebenen Sequenz ausgewählt werden, es kann jedoch außerdem wünschenswert sein, Sequenzen auszuwählen, welche die längeren Nucleotidsequenzen umfassen, die gemäß dem vorstehenden Abschnitt IIA2 identifiziert wurden. Vorzugsweise werden die Sonden so ausgewählt, dass die zwei Hybridisierungsstellen einen Abstand voneinander von etwa 100 bis 1000 Nucleotiden (gelegentlich von bis zu etwa 10.000 Nucleotiden) aufweisen.
Die PCR-in situ-Hybridisierung von Gewebeschnitten und/oder Zellproben stellt ein hochempfindliches Nachweisverfahren für seltene Zelltypen in fixierten Zell- oder Gewebeproben bereit. Das Nachweisverfahren mittels PCR-in situ-Hybridisierung wird gemäß den Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt, z. B. Nuovo, G. J., „PCR in situ Hybridisation: Protocols and Applications", Raven Press, NY, 1992; US-Patent Nr. 5 538 871 , die beide hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind.
Kurz gesagt wird eine Zellprobe (Gewebe auf einem mikroskopischen Objektträger, abzentrifugierte Zellsuspension) unter Verwendung eines üblichen Fixierpräparats wie gepuffertes Formalin, Formaldehyd oder dergleichen fixiert. Nach der Fixierung ist eine Proteinase- oder Detergensbehandlung bevorzugt, um die Zellpermeabilität für Reagenzien zu erhöhen. Die PCR-Reaktion wird in situ durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von zwei Primern durchgeführt. Wie vorstehend beschrieben, werden die Primer so konstruiert, dass die hier beschriebene Nucleotidsequenz und insbesondere die als SEQ ID NO: 14 beschriebene Sequenz selektiv amplifiziert wird. Das Amplifikations-Reaktionsgemisch enthält, zusätzlich zu der Zielnucleotidprobe und den Primern, eine thermostabile DNA-Polymerase wie eine Polymerase, die von Thermus aquaticus stammt (Taq-Polymerase, US-Patent Nr. 4 889 818 ), und eine ausreichende Menge der vier Standard-Desoxyribonucleotide (dNTPs), von denen eines oder mehrere markiert sein können, um den Nachweis zu erleichtern. Das Reaktionsgemisch wird mehreren Runden eines Thermozyklus unterworfen, wodurch mehrere Kopien (Amplifikationsprodukte) der Ziel-Nucleotidsequenz produziert werden. Danach werden die Amplifikationsprodukte in der Probe nachgewiesen, indem z. B. radioaktiv markierte Amplifikationsprodukte nachgewiesen werden.
Hybridisierungssonden und PCR-Primer können auch aus den genomischen Sequenzen ausgewählt werden, welche den vollständigen Proteinen entsprechen, die gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, einschließlich Promotor, Enhancerelemente und Introns des Gens, welches das natürlich vorkommende Polypeptid codiert.
Nucleotidsequenzen, welche ein Prostatatumorantigen-Polypeptid codieren, können auch zum Konstruieren von Hybridisierungssonden für die Kartierung des Gens, welches das Prostatatumorantigen codiert, und für die genetische Analyse von Individuen eingesetzt werden. Die hier bereitgestellten Nucleotidsequenzen können auf ein Chromosom und spezifische Regionen eines Chromosoms unter Verwendung bekannter Verfahren kartiert werden, wie in situ-Hybridisierung, Kopplungsanalyse gegen bekannte chromosomale Marker und Hybridisierungs-Screening mit Banken. Kurz gesagt können Sequenzen auf Chromosomen kartiert werden, indem PCR-Primer (vorzugsweise 15 bis 25 bp) aus der Prostatatumorantigen-cDNA hergestellt werden. Die Computeranalyse der untranslatierten 3'-Region wird eingesetzt, um Primer schnell zu selektieren, die nicht mehr als ein Exon in der genomischen DNA überspannen, wodurch der Amplifikationsprozess verkompliziert würde. Danach werden diese Primer für das PCR-Screening von somatischen Zellhybriden, welche einzelne menschliche Chromosomen enthalten, eingesetzt. Nur diejenigen Hybride, die das dem Primer entsprechende menschliche Gen enthalten, werden ein amplifiziertes Fragment ergeben.
Die PCR-Kartierung von somatischen Zellhybriden stellt ein schnelles Verfahren dar, um eine bestimmte DNA einem bestimmten Chromosom zuzuweisen. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung kann mit den gleichen Oligonucleotid- Primern anhand von Anordnungen („panels") von Fragmenten aus spezifischen Chromosomen oder Pools von großen genomischen Clonen in analoger Art und Weise eine Sublokalisierung erreicht werden. Andere Kartierungsstrategien, die einfach eingesetzt werden können, um auf das jeweilige Chromosom zu kartieren, schließen eine in situ-Hybridisierung, ein Vorscreening mit markierten, durchflusssortierten Chromosomen und eine Vorselektion durch Hybridisierung zur Konstruktion Chromosomen-spezifischer cDNA-Banken ein.
Individuen, die Variationen des Gens oder Mutationen in dem Gen, welches ein Prostatatumorantigen der vorliegenden Erfindung codiert, enthalten, können auf DNA-Ebene durch eine Vielzahl von Verfahren nachgewiesen werden. Nucleinsäuren, die für die Diagnose eingesetzt werden, können aus Zellen eines Patienten erhalten werden, einschließlich z. B. Gewebebiopsie- und Autopsiematerial. Die genomische DNA kann direkt für den Nachweis eingesetzt werden, oder sie kann vor der Analyse enzymatisch unter Verwendung von PCR amplifiziert werden [Saiki et al., Nature 324: 163–166 (1986)]. Für den gleichen Zweck kann auch RNA oder cDNA eingesetzt werden. Als Beispiel können PCR-Primer, die zu der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung komplementär sind, verwendet werden, um Mutationen im Gen der vorliegenden Erfindung zu identifizieren und zu analysieren. Deletionen und Insertionen können durch eine Änderung in der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich zu dem normalen Genotyp nachgewiesen werden.
Punktmutationen können durch Hybridisieren amplifizierter DNA mit radiomarkierter RNA der Erfindung oder alternativ mit radiomarkierten Antisense-DNA-Sequenzen der Erfindung identifiziert werden. Sequenzänderungen an spezifischen Positionen können auch durch Nucleaseschutztests wie RNase- und S1-Schutz oder das chemische Spaltungsverfahren [z. B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397–4401 (1985)], oder durch Unterschiede in den Schmelztemperaturen aufgedeckt werden. Außerdem können „molekulare Leuchfeuer" („molecular beacons") [Kostrikis et al., Science 279: 1228–1229 (1998)], haarnadelförmige, einzelsträngige synthetische Oligonucleotide-enthaltende Sondensequenzen, die zu der Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung komplementär sind, eingesetzt werden, um Punktmutationen oder andere Sequenzänderungen nachzuweisen und weiterhin Expressionsraten von Prostatatumorantigenen zu überwachen.
Außerdem können Polynucleotide, welche ein Prostatatumorantigen codieren, oder Komplemente solcher Polynucleotide für therapeutische Zwecke eingesetzt werden. Die Expression eines Prostatatumorantigens kann durch die Antisense-Technik reguliert werden, wobei die Genexpression durch komplementäre Polynucleotide, d. h. Antisense-DNA oder RNA, gesteuert wird, so dass 5'- oder regulatorische Regionen des Gens, welches das Prostatatumorantigen codiert, gesteuert werden. Z. B. wird der 5'-codierende Teil der Polynucleotidsequenz, welche das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, eingesetzt, um ein Antisense-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa zehn bis 40 Basenpaaren zu konstruieren. Bevorzugt sind Oligonucleotide, die von der Transkriptions-Startstelle z. B. zwischen den Positionen –10 und +10 der Startstelle hergeleitet sind. Ein Antisense-DNA-Oligonucleotid wird so konstruiert, dass es zu einer Region des Gens komplementär ist, die an der Transkription beteiligt ist [Lee et al., Nucl. Acids Res. 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988); und Dervan et al., Science 251: 1360 (1991)], so dass es die Transkription und die anschließende Produktion des Prostatatumorantigens stört oder verhindert. Ein Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert mit der mRNA in vivo und blockiert die Translation des mRNA-Moleküls in das Prostatatumorantigen-Protein [Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991)]. Die Antisense-Konstrukte können durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, auf eine Weise an Zellen verabreicht werden, so dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann.
Die beschriebenen therapeutischen Polynucleotide können in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger eingesetzt werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung und ein/en pharmazeutisch verträglichen/s Träger oder Excipiens. Ein solcher Träger schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon. Die Formulierung wird gemäß dem Verabreichungsverfahren gewählt.
Prostatatumorantigen-Polypeptide sowie außerdem Agonist- oder Antagonist-Polypeptide, welche die biologische Aktivität davon regulieren, können eingesetzt werden, indem solche Polypeptide in vivo exprimiert werden (d. h. durch „Gentherapie"). Dazu können Zellen eines Patienten verändert werden, indem ein Polynucleotid (DNA oder RNA), welches ein solches Polypeptid codiert, ex vivo eingebaut wird und anschließend die so veränderten Zellen an einen Patienten verabreicht werden. Solche Behandlungsverfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Z. B. können Zellen durch die Verwendung eines Retroviruspartikels, welches eine ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codierende RNA enthält, verändert werden.
Alternativ können Zellen in vivo durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verändert werden, so dass die Expression eines Polypeptids erfolgt. Beispielsweise kann eine produzierende Zelle, die in der Lage ist, ein Retroviruspartikel, welches eine ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codierende RNA enthält, zu produzieren, an einen Patienten verabreicht werden, so dass Zellen und Expression verändert werden, wobei beide Schritte in vivo erfolgen. Das Expressionsvehikel zum Verändern von Zellen kann auch ein anderes als ein Retrovirus sein, z. B. ein Adenovirus, das eingesetzt werden kann, um Zellen in vitro oder in vivo zu verändern, so dass die anschließende in vivo-Verabreichung in einem geeigneten Übertragungsvehikel erfolgen kann [vgl. z. B. Griscelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 6367–6372 (1998)].
B. Polypeptide
Genauso bildet die Kenntnis der vollständigen und in einigen Fällen der partiellen Nucleotidsequenzen, die hier beschrieben sind, die Grundlage für ein Identifizieren der verschiedenen Polypeptide, welche durch die hier beschriebenen Nucleotide codiert sind. Solche Polypeptid-Antigene oder immunogene Fragmente davon können z. B. eingesetzt werden, um in einem Wirtsorganismus eine Immunantwort (humorale oder zelluläre) zu induzieren, für den Zweck, in dem Organismus vorliegende Tumorzellen zu vernichten, oder um die Produktion von polyclonalen und/oder monoclonalen Antikörpern für die Therapie oder für die Verwendung in diagnostischen Kits zu stimulieren. Für das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann es verschiedene Anwendungsmöglichkeiten geben, einschließlich der Verwendung zum Herstellen von Impfstoffen gegen tumorspezifische Antigene. Solche Impfstoffe können so formuliert werden, dass sie in dem Zielorganismus eine humorale (Antikörper) oder eine zelluläre Immunantwort produzieren. Im Allgemeinen können Impfstoffzusammensetzungen produziert werden, indem vollständige Polypeptide oder antigene Peptide eingesetzt werden, wobei die letzteren im Allgemeinen an einen immunogenen Träger konjugiert sind, wobei Zusammensetzungen, welche die zelluläre Immunität stimulieren, gemäß Verfahren produziert werden können, wie sie in der gleichzeitig anhängigen US-Anmeldung Nr. 08/579 823 der gleichen Anmelder beschrieben sind.
Außerdem können Polypeptide gemäß der Erfindung in Nachweisverfahren wie in Radioimmuntest- und ELISA-basierten diagnostischen Tests Verwendung finden. Solche Polypeptide können auch eingesetzt werden, um Antikörper zu produzieren, welche in solchen Tests als Reagenzien eingesetzt werden sollen. Der Aufbau und die Optimierung solcher Tests kann durch einen Fachmann, der an der Entwicklung von Tests arbeitet, erfolgen.
Weiterhin bezieht sich die Beschreibung auf ein Verfahren zum Identifizieren eines Rezeptors für ein Prostatatumorantigen. Das Gen, welches einen Prostatatumorantigen-Rezeptor codiert, kann durch zahlreiche Verfahren identifiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie z. B. Liganden-Panning und FACS-Sortierung [Coligan et al., Current Protocols in Immunol. 1 (2), Kapitel 5 (1991)]. Eine Expressionsclonierung kann eingesetzt werden, wobei eine polyadenylierte RNA aus einer Zelle, die auf Prostatatumorantigen anspricht, hergestellt wird und sodann eine aus dieser RNA erzeugte cDNA-Bank in Pools aufgeteilt wird und für die Transfektion von COS-Zellen oder anderen Zellen, welche nicht auf das Prostatatumorantigen ansprechen, verwendet wird. Anschließend werden die transfizierten Zellen, welche auf Glasobjektträgern gezüchtet werden, mit dem markierten Prostatatumorantigen in Kontakt gebracht. Das Prostatatumorantigen kann durch eine Vielzahl von Verfahren markiert werden, einschließlich Iodierung oder Einschluss einer Erkennungsstelle für eine positionsspezifische Proteinkinase. Nach der Fixierung und Inkubation werden die Objektträger einer autoradiographischen Analyse unterworfen. Positive Pools werden identifiziert und Subpools hergestellt und unter Verwendung eines sich wiederholenden Subpooling und eines erneuten Screening-Verfahrens wieder transfiziert, wodurch schließlich irgendwann ein einzelner Clon erhalten wird, der den mutmaßlichen Rezeptor codiert.
Als alternative Vorgehensweise für die Identifizierung eines Rezeptors kann ein markiertes Prostatatumorantigen mit Zellmembran- oder Extraktpräparaten, welche ein Rezeptormolekül exprimieren, durch Photoaffinität gekoppelt werden. Das vernetzte Material wird durch PAGE aufgetrennt und gegen einen Röntgenfilm exponiert. Sodann kann ein markierter Komplex, welcher den Prostatatumorantigen-Rezeptor enthält, ausgeschnitten, in Peptidfragmente aufgetrennt und einer Protein-Mikrosequenzierung unterworfen werden. Die aus der Mikrosequenzierung erhaltene Aminosäuresequenz kann dann für die Konstruktion eines Satzes von degenerierten Oligonucleotid-Sonden eingesetzt werden, mit denen eine cDNA-Bank durchgemustert wird, und auf diese Weise kann das Gen, welches einen mutmaßlichen Rezeptor codiert, identifiziert werden.
Die Beschreibung betrifft auch Verfahren zum Identifizieren von Molekülen wie synthetischen Arzneistoffen, Antikörpern, Peptiden oder anderen Molekülen, welche eine modulierende Wirkung auf die Aktivität des Prostatatumorantigens ausüben, z. B. Agonisten oder Antagonisten des Prostatatumorantigen-Rezeptors.
Wenn ein Prostatatumorantigen an ein anderes Protein bindet, z. B. wenn das Prostatatumorantigen als ein Rezeptor fungiert, kann das Prostatatumorantigen in Tests eingesetzt werden, um andere Proteine oder Moleküle zu identifizieren, die möglicherweise an der Wechselwirkung der Bindung beteiligt sind. Durch solche Verfahren können Inhibitoren der Bindungs-Wechselwirkung zwischen Rezeptor/Ligand identifiziert werden. Außerdem können Proteine, die an solchen Bindungs-Wechselwirkungen beteiligt sind, eingesetzt werden, um nach Peptid- oder kleinen Molekül-Inhibitoren oder Agonisten der Bindungs-Wechselwirkung zu screenen.
Screeningtests können so entworfen werden, dass man damit Verbindungen findet, welche die biologische Aktivität eines nativen Prostatatumorantigens oder eines Rezeptors für ein solches Prostatatumorantigen modulieren. Bevorzugte Screeningtests werden für ein Hochdurchsatz-Screening von chemischen Banken geeignet sein, so dass sie besonders gut zum Identifizieren von Arzneistoffkandidaten, die als kleine Moleküle vorliegen, eingesetzt werden können. Kleine Moleküle, die hier gemeint sind, schließen synthetische organische oder anorganische Verbindungen ein. Die Tests können in einer Vielzahl von Formaten durchgeführt werden, einschließlich Protein-Protein-Bindungstests, biochemischer Screeningtests, Immuntests und Zell-basierter Tests, die alle auf dem Fachgebiet ausführlich beschrieben sind.
C. Antikörper
Das Prostatatumorantigen-Polypeptid kann auch zur Erzeugung von Antikörpern eingesetzt werden, wobei jedoch das Prostatatumorantigen-Polypeptid mindestens ein Epitop oder eine Determinante mit der in einer der 9A bis 9C oder 11 dargestellten vollständigen Proteinsequenz gemeinsam haben muss. Mit „Epitop" oder „Determinante" ist hier ein Teil eines Proteins gemeint, der einen Antikörper erzeugen und/oder daran binden kann. Somit werden in den meisten Fällen Antikörper, welche gegen ein kleineres Prostatatumorantigen-Polypeptid hergestellt wurden, in der Lage sein, an das vollständige Protein zu binden. Es ist bevorzugt, dass das Epitop einmalig ist; d. h., Antikörper, die gegen das einmalige Epitop erzeugt werden, zeigen gegenüber anderen Antigenen nur eine geringe oder keine Kreuzreaktivität. Mit anderen Worten binden die Antikörper der Erfindung spezifisch an Prostatatumorantigene. Mit „spezifisch binden" ist hier gemeint, dass die Antikörper an das Protein mit einer Bindungskonstante im Bereich von mindestens 10⁶ bis 10⁸ M binden, wobei der Bereich von 10⁷ bis 10⁹ M bevorzugt ist.
Die anti-Prostatatumorantigen-Antikörper der vorliegenden Erfindung können verschiedene Verwendungsmöglichkeiten haben, z. B. können sie in diagnostischen Tests auf das Vorliegen von Prostatatumorantigen eingesetzt werden, wie zum Nachweisen der Expression in spezifischen Zellen, Geweben und/oder Serum. Verschiedene diagnostische Tests, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, können eingesetzt werden, wie kompetitive Bindungstests, direkte oder indirekte Sandwich-Tests und Immunfällungs-Tests, die entweder in heterogenen oder homogenen Phasen durchgeführt werden [Zola, „Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", CRC Press, Inc., 147–158 (1987)]. Die in solchen diagnostischen Tests eingesetzten Antikörper können mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein.
Die nachweisbare Markierung sollte in der Lage sein, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren. Z. B. kann die nachweisbare Markierung ein Radioisotop wie ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S oder ¹²⁵I, eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rhodamin oder Luciferin oder ein Enzym wie alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettich-Peroxidase sein. Zum Konjugieren des Antikörpers an die nachweisbare Markierung kann ein beliebiges Verfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, eingesetzt werden, einschließlich der Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry 13: 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40: 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30: 407 (1982), beschrieben sind.
Anti-Prostatatumorantigen-Antikörper können für die Affinitäts-Reinigung von Prostatatumorantigenen aus einer rekombinanten Zellkultur oder aus natürlichen Quellen geeignet sein. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen ein Prostatatumorantigen an einem geeigneten Träger wie einem Sephadex-Harz oder einem Filterpapier immobilisiert, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Danach wird der immobilisierte Antikörper mit einer Probe in Kontakt gebracht, die das Prostatatumorantigen enthält, das gereinigt werden soll, und anschließend wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, wodurch im Wesentlichen das gesamte Material mit Ausnahme des Prostatatumorantigens, welches an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, aus der Probe entfernt wird. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel gewaschen, wodurch das Prostatatumorantigen von dem Antikörper freigesetzt wird.
Die Prostatatumor-Antikörper der vorliegenden Erfindung sind in der Lage, die biologische Funktion des Prostatatumorantigens, mit welchem sie spezifisch reagieren, zu reduzieren oder zu eliminieren. Das heißt, durch die Zugabe von entweder polyclonalen oder vorzugsweise monoclonalen anti-Prostatatumorantigen-Antikörpern zu Zellen, welche Prostatatumor-Rezeptoren umfassen, kann die mit dem Vorliegen eines Prostatatumors assoziierte Pathologie reduziert oder eliminiert werden. Im Allgemeinen ist eine Abnahme der Aktivität von mindestens 50% bevorzugt, wobei eine Abnahme von mindestens etwa 75% stärker bevorzugt ist, von mindestens 85 bis 90% besonders bevorzugt ist und von etwa 95 bis 100% ganz besonders bevorzugt ist.
Anti-Prostatatumor-Antikörper-Zusammensetzungen können in geeigneten Modellen der Krankheit getestet werden, um Spezifität, Effizienz und Gewebemetabolismus zu bestätigen und Dosierungen zu bestimmen, wobei Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, eingesetzt werden können.
Anti-Prostatatumor-Antikörper-Zusammensetzungen können über eine beliebige von verschiedenen Routen und durch ein beliebiges von verschiedenen Verfahren verabreicht werden, die so gestaltet sind, dass eine gleichmäßige und voraussagbare Konzentration des Antikörpers am Zielgewebe bereitgestellt wird. Die Antikörperzusammensetzungen können alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln wie stabilisierenden Verbindungen und/oder in Kombination mit anderen pharmazeutischen Mitteln wie Arzneistoffen oder Hormonen verabreicht werden. Der therapeutische Wert kann erreicht werden, indem ein oder mehrere, für ein Prostatatumorantigen spezifische Antikörper verabreicht werden. Solche Antikörper können dafür geeignet sein, die Wechselwirkung eines Tumorantigens mit seinem Rezeptor zu verhindern.
Für die therapeutische Anwendung ist ein menschlicher oder humanisierter monoclonaler Antikörper bevorzugt. Der Antikörper wird typischerweise als eine sterile Lösung durch iv-Injektion in einer Menge zwischen etwa 1 bis 15 mg/kg Körpergewicht des Individuums verabreicht, wobei jedoch auch andere parenterale Verabreichungsrouten geeignet sein können. Welche Behandlungsschemata geeignet sind, wird von der Affinität des bestimmten ausgewählten Antikörpers, der ausgewählten Verabreichungsroute, der Dosis und dem Zustand des Patienten abhängen. Diese Parameter können durch den Praktiker anhand von Routineexperimenten einfach bestimmt werden. In einer als Beispiel dienenden Anwendung kann der Antikörper eingesetzt werden, um Tumorwachstum zu hemmen, wobei der Antikörper so lange an die Stelle des Tumors verabreicht werden sollte, bis eine therapeutische Verbesserung zu sehen ist.
Eine therapeutische Zusammensetzung zur Verwendung in dem Behandlungsverfahren kann den Antikörper in einer sterilen Injektionslösung, den Antikörper in einem oralen Transportvehikel oder das Polypeptid in einer zerstäubten Form einschließen, die alle gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers und ein/en pharmazeutisch verträglichen/s Träger oder Excipiens. Ein solcher Träger schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen davon.
IV. Material und Methoden
A. Differential-Display-Nachweiskit und Primer
Ein kommerzieller Differential-Display-Nachweiskit, „HIEROGLYPH mRNA Profile System" (GENOMYX Corp., Foster City, Ka.), wurde eingesetzt, um Polynucleotide zu identifizieren, die für Prostatatumorzellen spezifisch sind. Dieses System ist so konstruiert, dass cDNA-Fragmente mit einer Länge von bis zu 1,2 bis 1,5 kb produziert werden, wobei eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit zwischen doppelten Proben besteht. Die verankerten HIEROGLYPH-Primer bauen eine 17 Nt. große, von T7-NA-Polymerase-Promotor stammende Stelle (ACGACTCACTATAGGGC, SEQ ID NO: 12) ein, so dass eine gerichtete Sequenzierung vom 3'-Ende des ursprünglichen mRNA-Transkripts möglich wird, ohne dass eine Fragment/Vektor-Subclonierung erforderlich wäre. Die Kernanelierenden Sequenzen der in dem HIEROGLYPHE-System verwendeten willkürlichen 5'-Primer haben eine Länge von zehn Basen. 20 verschiedene willkürliche Stromaufwärts-Primer werden eingesetzt. Willkürliche Primer (ARPs) bauen ein 16-Nt.-Segment der universellen reversen (148) 24-Nt.-Primersequenz, ACAATTTCACACAGCA, (SEQ ID NO: 13), von M13 ein, wodurch eine gerichtete Sequenzierung vom 5'-Ende des ursprünglichen Transkripts aus möglich wird. Jeder ARP hat somit eine Länge von 26 Nt..
B. Anreicherung von subtraktiver Prostata-cDNA
„Hochangereicherte" subtraktive Prostata-cDNA wurde durch Verfahren hergestellt, die im cDNA Subtraction Kit von Clontech Laborstories (Palo Alto, Ka.) ausführlich beschrieben sind. Kurz gesagt wurde eine Tester-cDNA aus normaler menschlicher Prostata-PolyA⁺-RNA hergestellt; die cDNA-Population, welche die gewebespezifischen Sequenzen von Interesse enthielt. Eine Driver-cDNA wurde aus einem Gemisch von PolyA⁺-RNA hergestellt, die aus zehn verschiedenen Geweben, einschließlich Milz, Thymus, Gehirn, Herz, Niere, Leber, Lunge, Ovar, Plazenta und Skelettmuskel, zubereitet worden war. Anschließend wurden die subtraktive Hybridisierung und die primäre PCR unter Verwendung dieser zwei Populationen durchgeführt.
C. Clonierung von Prostatatumor-spezifischen Nucleinsäuren
Alle Clonierungsverfahren wurden mit kommerziell verfügbaren Kits gemäß den durch den Hersteller bereitgestellten Protokollen durchgeführt. Die subtraktive Prostata-DNA wurde mit dem „Clontech PCR-Select cDNA Subtraction Kit" (Clontech, Palo Alto, Ka.) erzeugt. Die Subclonierungsverfahren erfolgten mit dem „TA Cloning Kit" (Invitrogen, Carlsbad, Ka.).
Beispiel 1
Molekulare Clonierung von Genen aus Prostatatumorzellen
Die mRNA-Expressionsmuster von einer normalen Prostata, von der Prostatakarzinom-Zelllinie LNCaP (ATCC CRL 1740; American Type Culture Collection; Rockville, MD) und von HeLa-Zellen wurden durch Differential-Display (DD) unter Verwendung des vorstehend beschriebenen HIEROGLYPH mRNA Profile System verglichen. Alle Verfahren wurden im Wesentlichen, wie in den als Packungsbeilage bereitgestellten Anweisungen des Herstellers, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind, beschrieben, durchgeführt. Kurz gesagt wurde DNA-freie Gesamt-RNA aus Zelllinien unter Verwendung des SNAP Total RNA-Kits (Invitrogen, San Diego, Ka.) isoliert. RNA aus Prostatagewebe wurde kommerziell von Clontech, Inc. (Palo Alto, Ka.), erhalten und mit RNAse-freier DNAse behandelt, um genomische DNA-Verunreinigungen zu entfernen. Qualitativ wies die RNA mindestens ein OD260/OD280-Verhältnis von größer als 1,8 auf. Durch elektrophoretische Analyse wurde bestimmt, dass die RNA intakt war.
Erststrang-cDNA-Kopien der RNA-Transkripte wurden erzeugt, indem eine kommerziell verfügbare Transkriptase („SUPERSCRIPT", Life Technologies, Rockville, MD) und 3'-„verankerte” Primer, bereitgestellt im HIEROGLYPH-Kit, eingesetzt wurden. Die Reaktion wurde eine Stunde bei 42°C durchgeführt. Danach wurde die revers transkribierte RNA einer Amplifikation durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unterworfen, wobei doppelte Reaktionen mit paarweisen Kombinationen von zehn verankerten 3'- und vier willkürlichen 5'-Primern eingesetzt wurden. Die verankerten Primer waren zu denjenigen identisch, die in der reversen Transkriptase-Reaktion verwendet wurden. Außerdem lagen in den Reaktionsgemischen AMPLITAQ-DNA-Polymerase und [α-³³P]-dATP vor. Vier PCR-Zyklen wurden bei 46°C und 25 Zyklen bei 60°C durchgeführt. Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese auf einem 4,5% und/oder einem 6% HR-1000-Gel aufgetrennt, worauf eine Autoradiographie der resultierenden Gele folgte.
20 Primer-Kombinationen wurden von jeder der drei mRNA-Quellen in doppelten Experimenten getestet, wodurch insgesamt 120 PCR-Reaktionen zustande kamen. Die DD-PCR-Fragmente, die durch das Screeningschema erzeugt wurden, wurden durch Gelelektrophorese auf 33 (61-cm-Gelen unter Verwendung der GenomyxLR- und HR-1000-Gele) analysiert. Autoradiogramme der Gele wurden auf Banden analysiert, die spezifisch nur in der Prostatakarzinom-Zelllinien-Probe LnCaP, nicht jedoch in dem HeLa-Karzinom oder in der normalen Prostata exprimiert werden. Insgesamt 54 DD-Produkte wurden identifiziert, die diese Kriterien erfüllten; die Banden wurden aus den Gelen ausgeschnitten und erneut durch PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden anhand einer Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt und die 5'-Enden einer DNA-Sequenzierung durch eine zyklische Sequenzierung mit Didesoxy-Terminatoren unterworfen. Die Sequenz für alle 54 Fragmente wurde erhalten. Die 54 Fragmente zeigten 35 verschiedene mRNA-Transkripte, die mit täglich auf den neuesten Stand gebrachten Ausgaben der Datenbanken von GenBank, Genbank EST Division und EMBL verglichen wurden. Insgesamt acht mRNAs/cDNAs wurden gefunden, die neu waren, wie durch das Fehlen einer signifikanten Datenbank-Übereinstimmung mit BLASTN- oder TBLASTX-Algorithmen gezeigt wurde (Beispiel 2, SEQ ID NO: 1 bis 4, 6 bis 8). SEQ ID NO: 5 wurde durch dieses Verfahren als ein neues Mitglied der Thioredoxin-Reductase-Genfamilie identifiziert.
Beispiel 2
Screening von selektierten Nucleotidsequenzen
A. Sequenzidentität-Screening von SEQ ID NO: 1 bis 8
Die Nucleotidsequenzen wurden mit dem BLASTN- und TBLASTX-Algorithmus gegen die Ausgaben der NCBI Entrez NR- (6. Mai 1997; 309920 Sequenzen) und NCBI Entrez EST-Datenbank (6. Mai 1997; 10155474 Sequenzen) gescreent. Für die SEQ ID NOs: 1 bis 4 und 6 bis 8 wurde gefunden, dass sie keine signifikante Sequenzähnlichkeit mit irgendwelchen bekannten Sequenzen aufwiesen. Für die SEQ ID NO: 5 wurde gefunden, dass sie durch BLASTN eine wesentliche Homologie (etwa 78%) zu einem nicht-charakterisierten Maus-EST aufwies. Außerdem wurde für die von SEQ ID NO: 5 hergeleiteten Aminosäuresequenzen, die hier als SEQ ID NOs: 9 bis 11 enthalten sind, bestimmt, dass sie eine Homologie durch TBLASTX mit Teilen von Maus- und Mensch-Thioredoxin-Reductase aufwiesen; dies legt nahe, dass die nachgewiesene Nucleotidsequenz ein neues Mitglied der Thioredoxin-Reductase-Genfamilie codiert.
B. Sequenzidentitäts-Screening von SP 1–4-Sequenzen
Die SP 1–4-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 14) wurde mit den BLASTN- und TBLASTX-Algorithmen gegen die Ausgaben der NCBI Entrez NR- und NCBI Entrez EST-Datenbank (1. Juli 1998) gescreent. Für die SEQ ID NO: 14 und partielle Sequenzen davon wurde gefunden, dass sie eine Sequenzidentität von weniger als etwa 45 % mit einer beliebigen bekannten Nucleinsäuresequenz aufwiesen. Für die hergeleitete SP 1–4-Aminosäuresequenz, SEQ ID NO: 15, wurde gefunden, dass sie eine Sequenzidentität von weniger als etwa 30% mit jeglichen bekannten Polypeptiden über die gesamte Länge der Sequenz aufwies, wobei der BLASTP-Algorithmus bei der Suche, bei der die Aminosäuren 1 bis 1095 von SEQ ID NO: 15 mit der „nicht-redundanten Genbank CDS Translationen + PDB + SwissProt + Spupdate + PIR"-Datenbank am 1. Juli 1998 verglichen wurden, verwendet wurde; dies legt nahe, dass die SP 1–4-Nucleotidsequenz ein neues Protein codiert.
Beispiel 3
Molekulare Clonierung von menschlicher SP 1–4-cDNA
A. Isolierung einer ursprünglichen partiellen cDNA-Insertion Menschliche subtraktive Prostata-cDNA, hoch angereichert auf Prostata-spezifische partielle cDNA-Sequenzen, wurde unter Verwendung des folgenden Primerpaars:
auf einem Perkin-Elmer GeneAmp 9600 Cycler elf Zyklen mit dem folgenden thermocyclischen Profil amplifiziert: 94°C für 10 Sek.; 68°C für 30 Sek.; 72°C für 5 Min.. Hierauf folgte eine weitere Runde bei 72°C für 5 Min.. Die Produkte wurden in den Clonierungsvektor pCR2.1 TA (Invitrogen, San Diego, Ka.) cloniert und sodann wurde E. coli damit transformiert. Einzelne Ampicillin-resistente bakterielle Transformanten wurden durch PCR unter Verwendung des folgenden Primerpaars auf das Vorliegen einer Insertion durchgemustert:
wobei das folgende Thermozyklus-Profil verwendet wurde: 94°C für 15 Sek.; 55°C für 30 Sek.; 72°C für 1 Min.. Hierauf folgte eine weitere Runde bei 72°C für 6 Min.. Die ursprüngliche SP 1–4-Insertion in dem Plasmid pCR2.1 (SEQ ID NO: 29) wurde unter Verwendung des M13-reversen Primers (SEQ ID NO: 18) und des M13–20-Primers (SEQ ID NO: 19) auf einem ABI 373 DNA Sequencer sequenziert. Die ursprüngliche SP 1–4-Insertion (SEQ ID NO: 29) entspricht den Nucleotiden 1534 bis 1875 von SEQ ID NO: 14. Die DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung von Sequencer 3.0 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) analysiert.
B. Isolierung der vollständigen SP 1–4-cDNA
Marathon-cDNA wurde aus der normalen menschlichen Prostata-PolyA⁺-RNA hergestellt, um sowohl eine 5'- als auch eine 3'-Schnellamplifikation von cDNA-Enden [RACE, Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8998–9002 (1988), Clontech Laborstories, Palo Alto, Ka.] durchzuführen. Die 5'-RACE wurde mit dem folgenden Primerpaar durchgeführt:
Die 3'-RACE wurde mit dem folgenden Primerpaar durchgeführt:
Das thermocyclische Profil für alle RACE-Reaktionen war: 94°C für 15 Sek.; 68°C für 4 Min., für 30 Zyklen unter Verwendung von Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontech Laborstories, Palo Alto, Ka.). 5'- und 3'-RACE-Produkte von etwa 4 kb bzw. 1,6 kb wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese isoliert, in den Vektor pCR2.1 TA (Invitrogen, San Diego, Ka.) ligiert und kompetente Escherichia coli-Zellen damit transformiert. Einzelne Ampicillin-resistente Bakterienkolonien wurden durch PCR auf das Vorliegen einer Insertion durchgemustert, mit dem folgenden Primerpaar:
für die 5'-RACE-Produkte, und mit dem folgenden Primerpaar:
für die 3'-RACE-Produkte, wobei das folgende Profil für den Thermozyklus verwendet wurde: 94°C für 15 Sek.; 55°C für 30 Sek.; 72°C für 1 Min., für 35 Zyklen, gefolgt von einer weiteren Runde bei 72°C für 6 Min.. Die PCR-Produkte wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt, und einzelne bakterielle Transformanten wurden in Flüssigkultur (Luria-Brühe, angereichert mit Ampicillin, 100 μg/ml) gezüchtet, anschließend erfolgte die Herstellung von Plasmid-DNA. Die vollständige DNA-Sequenz von einzelnen RACE-Produkten wurde durch automatische Fluoreszenz-Sequenzierung unter Verwendung eines ABI 373 DNA-Sequenziergeräts zusammen mit kundenspezifischen DNA-Primern und dem Primer Island Transposition Kit (Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, Ka.) bestimmt.
Die gesamte 5668 Basenpaare große Nucleotidsequenz, bezeichnet mit SP 1–4-cDNA, ist in 10 dargestellt (SEQ ID NO: 14). Die Sequenz enthält ein einzelnes offenes Leseraster mit einer offensichtlichen Translations-Initiationsstelle an den Nucleotidpositionen 43 bis 45 [Kozak et al., Nucl. Acids Res. 12: 3873–3893 (1984)] mit einem Stoppcodon an den Nucleotidpositionen 3328 bis 3330 (10).
Das vollständige SP 1–4-Protein (SEQ ID NO: 15), dargestellt in 11, hat eine Länge von 1095 Aminosäuren. Wichtige Regionen der Aminosäuresequenz des SP 1–4-Proteins schließen die Transmembran-Regionen, entsprechend den Aminosäuren 732–748, 846–876, 681–703, 789–805, 944–971, 820–837 bzw. 999–1015, und potentielle N-Glycosylierungsstellen, beginnend an den Aminosäuren 6, 75, 247, 308, 812, 925, 1041 bzw. 1063, ein. Die Clone pCR2.1/SP 1–4 (5'-RACE, SEQ ID NO: 27) und pCR2.1/SP 1–4 (3'-RACE, SEQ ID NO: 28) wurden bei ATCC hinterlegt und mit den ATCC-Hinterlegungsnummern 98829 bzw. 98829 bezeichnet.
Beispiel 4
Expression von menschlichem SP 1–4
A. RT-PCR
Eine Erststrang-cDNA-Synthese wurde unter Verwendung von menschlichen PolyA⁺-RNAs und dem SMART PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech Laborstories, Palo Alto, Ka.) durchgeführt. Das Primerpaar:
wurde eingesetzt, um die Expression zu erreichen, wobei ein thermocyclisches Profil von 94°C für 15 Sek.; 65°C für 15 Sek.; 72°C für 30 Sek. (30 Zyklen) verwendet wurde, worauf eine zusätzliche Runde bei 72°C für 6 Min. folgte. Die Amplifikationsprodukte wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese aufgetrennt und durch Ethidiumbromid-Färbung und UV-Licht sichtbar gemacht.

Wie in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt wird, wurden zahlreiche Proben amplifiziert und eine SP 1–4-spezifische mRNA-Expression wurde durch RT-PCR in Hoden- und Prostatagewebe eindeutig nachgewiesen, und außerdem noch in einer kolorektalen Adenokarzinom-Zelllinie (SW 480), einer Melanom-Gewebeprobe (G361) und in LNCaP, wobei es sich um eine Prostatakarzinom-Zelllinie handelt. Tabelle 1

Probe	PCR-Produkt
Milz	neg.
Brustdrüse	Spur
Plazenta	neg.
Niere	neg.
Leber	neg.
Lunge	neg.
Hoden	+
SW480 (kolorektales Adenokarzinom)	+
G361 (Melanom)	+
LNCaP	+
Prostata	++
PC3	neg.
DU145	neg.
Skelettmuskel	neg.
Knochenmark	neg.
Gehirn	neg.
Herz	neg.
A549 (Lungenkarzinom)	neg.
Pankreas	neg.
Darm	neg.
Thymus	Spur

B. Nucleinsäure-Hybridisierung
Die ursprüngliche Insertion, die aus der subtraktiven Bank isoliert wurde, wurde als eine Hybridisierungssonde für die Northern-Blot- und RNA-Dot-Blot-Analyse verwendet. Das Fragment wurde mittels Zufallsprimer mit ³²P-dCTP markiert, auf einer G-50-Mikrospin-Säule gereinigt und unter Verwendung von ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech Laborstories, Palo Alto, Ka.) zwei bis vier Stunden bei 68°C an die Filter hybridisiert. Die Filter wurden nacheinander in 2 × SSC [1 × SSC = 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrat], 0,1% SDS, bei Raumtemperatur für 30 Min., 0,5 × SSC, 0,1% SDS, bei Raumtemperatur für 30 Min. und 0,5 ×, 0,1% SDS, bei 65°C für 30 Min. gewaschen. Anschließend wurde eine Autoradiographie für eine Stunde bis einen Tag bei –70°C unter Verwendung eines Kodak-XAR-Films und eines einzelnen Verstärkerschirms durchgeführt.

Die Ergebnisse der menschlichen RNA-Dot-Blot- und Northern-Blot-Analyse von zahlreichen Geweben, sowohl erwachsenen als auch fetalen Ursprungs, wie in den nachstehenden Tabellen 2 bzw. 3 dargestellt, zeigen, dass SP 1–4-spezifische mRNA vorzugsweise in Prostatagewebe exprimiert wird. Tabelle 2

Probe	SP 1–4-Signal	Probe	SP 1–4-Signal
Ganzes Gehirn	neg.	Speicheldrüse	neg.
Amygdala	neg.	Brustdrüse	neg.
Nucleus caudatus	neg.	Niere	Spur
Cerebellum	neg.	Leber	neg.
Hirnrinde	neg.	Dünndarm	neg.
Frontallappen	neg.	Milz	neg.
Hippocampus	neg.	Thymus	neg.
Medulla oblongata	neg.	periphere Leukocyten	neg.
Okzipitallappen	neg.	Lymphknoten	neg.
Putamen	neg.	Knochenmark	neg.
Substantia nigra	neg.	Appendix	neg.
Temporallappen	neg.	Lunge	neg.
Thalamus	neg.	Luftröhre	neg.
Nucleus subthalamicus	neg.	Plazenta	neg.
Rückenmark	neg.	fetales Gehirn	neg.
Herz	neg.	fetales Herz	neg.
Aorta	neg.	fetale Niere	neg.
Skelettmuskel	neg.	fetale Leber	neg.
Kolon	neg.	fetale Milz	neg.
Blase	neg.	fetaler Thymus	neg.
Uterus	neg.	fetale Lunge	neg.
Prostata	++++	Pankreas	neg.
Magen	neg.	Hypophyse	neg.
Hoden	Spur	Nebenniere	neg.
Ovar	neg.	Schilddrüse	neg.

Tabelle 3

Probe	SP 1–4-Transkripte
HL-60	neg.
HeLa	neg.
K562	neg.
Molt-4	neg.
Burkitt-Lymphom	neg.
kolorektales Adenokarzinom SW480	neg.
Lungenkarzinom A549	neg.
Melanom G361	+
Skelettmuskel	neg.
Uterus	neg.
Kolon	neg.
Dünndarm	neg.
Blase	neg.
Herz	neg.
Magen	neg.
Prostata	+++++

Die Erfindung wurde hier zwar mit Bezug auf spezifische Verfahren und Ausführungsformen beschrieben, es ist jedoch so zu verstehen, dass verschiedene Modifikationen und Änderungen durchgeführt werden können, ohne dass von der Erfindung abgewichen wird.
Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu einem Polypeptid hat, das codiert wird durch die Nucleotide 43–3327 der SEQ ID NO: 14, wobei % Identität berechnet wird unter Verwendung des LALIGN-Programms, das gefunden wird in der FASTA-Version 2.0-Programmfolge, unter Verwendung eines Default-Parameters mit der BLOSUM50 Matrix, einem ktup von 2 und einem Gap-Penalty von –12/–2.
Isoliertes Polynucleotid, das unter hohen Stringenzbedingungen an die Nucleotide 43–3327 der Sequenz der SEQ ID NO: 14 hybridisiert, oder das entsprechende Komplement.
Isoliertes Polynucleotid, das im Wesentlichen aus den Nucleotiden 43–3327 der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 14 besteht, oder das entsprechende Komplement.
Isoliertes Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polynucleotid ein RNA-Molekül ist.
Vektor, umfassend die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
Vektor, umfassend die Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4 funktionell verknüpft mit Kontrollsequenzen, die durch eine mit diesem Vektor transformierte Wirtszelle erkannt werden.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 5 oder 6.
Verfahren zur Herstellung eines Prostatatumorantigenpolypeptids, umfassend: (a) das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 7 unter Bedingungen, die zur Expression des Prostatatumorantigenpolypeptids geeignet sind; und (b) das Gewinnen des Prostatatumorantigenpolypeptids aus der Zellkultur.
Isoliertes Prostatatumorantigenpolypeptid, das mindestens 80% Aminosäuresequenzidentität zu den Aminosäureresten 1 bis 1095 der 11 (SEQ ID NO: 15) hat, wobei % Identität berechnet wird unter Verwendung des LALIGN-Programms, das gefunden wird in der FASTA-Version 2.0-Programmfolge, unter Verwendung eines Default-Parameters mit der BLOSUM50 Matrix, einem ktup von 2 und einem Gap-Penalty von –12/–2.
Isoliertes Prostatatumorantigenpolypeptid, umfassend die Aminosäurereste 1 bis 1095 der 11 (SEQ ID NO: 15).
Chimäres Molekül, umfassend ein Prostatatumorantigenpolypeptid nach Anspruch 10, das an eine heterologe Aminosäuresequenz fusioniert ist.
Antikörper, der spezifisch an das Prostatatumorantigenpolypeptid nach Anspruch 10 bindet.
In vitro-Verfahren zum Nachweis der Expression eines Prostatatumorantigens in einem Individuum, umfassend: (a) Messen der Expression des Prostatatumorantigens in einem Gewebe von einem ersten Individuum, wobei das Prostatatumorantigen die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 15 hat; und (b) Vergleich dieser Expression mit der Expression des Prostatatumorantigens in einem Gewebe von einem zweiten, nicht betroffenen Individuum, wobei, wenn die Expression des Prostatatumorantigens des ersten Individuums höher ist als die Expression des Prostatatumorantigens des zweiten Individuums, das erste Individuum ein Risiko für eine Prostatatumorantigen-verbundene Erkrankung hat.
Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen in einer Gewebeprobe, umfassend: (a) Amplifizieren der Nucleinsäuren, die aus der Probe gewonnen wurden, mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung zweier Primer, wobei die Primer so konstruiert sind, dass sie selektiv die Sequenz der SEQ ID NO: 14 amplifizieren; und (b) Nachweis des Vorliegens von Amplifikationsprodukten, die mindestens einer dieser Sequenzen oder amplifizierter Teilbereiche davon entsprechen.