DE69302234T2

DE69302234T2 - Menschliches Prohibitin und Prohibitin kodierende DNS

Info

Publication number: DE69302234T2
Application number: DE69302234T
Authority: DE
Inventors: Yusuke Nakamura; Takaaki Sato
Original assignee: Eisai Co Ltd; Cancer Institute
Current assignee: Cancer Institute; Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 1992-01-24
Filing date: 1993-01-19
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2013-01-20
Also published as: EP0578909A1; US5463026A; EP0578909B1; JPH05271294A; DE69302234D1; US5599707A; US5401635A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein humanes Prohibitin, ein dafür kodierendes Gen, einen Antikörper gegen humanes Prohibitin und ein Genanalyseverfahren, bei dem ein Teil des Gens als Sonde verwendet wird.

Beschreibung des Stands der Technik

Es ist seit langem bekannt, daß die Mutation von Zellgenen eine wichtige Rolle bei Krebs spielt. Kürzliche Fortschritte in der Gentechnik haben es möglich gemacht, spezielle DNAs zu amplifizieren und Genmutationen in Krebszellen zu analysieren. Dadurch wurde ein Beitrag für eine erhebliche Entwicklung auf dem Gebiet der Krebsforschung geleistet.
Derzeit werden Onkogene, von denen man annimmt, daß sie an der malignen Transformation von Zellen und der abnormalen Proliferation von Krebszellen beteiligt sind, analysiert und identifiziert. Die Anzahl der auf diese Weise aufgeklärten ankogene beträgt derzeit einige 10. Andererseits hat sich das Forschungsinteresse in diesen letzten Jahren auf Tumor- Suppressorgene, die den Funktionen der Onkogene entgegenwirken, konzentriert. Der Grund hierfür ist ein Bericht darüber, daß Fusionszellen, die durch Fusion von Krebszellen mit normalen Zellen erhalten worden sind, keine tumorerzeugenden Eigenschaften aufweisen und sich wie normale Zellen verhalten, was die Existenz eines Gens, das zur Unterdrückung von Krebs in normalen Zellen befähigt ist, nahelegt.
Bisher wurden aber nur etwa 10 Gene als Kandidaten für Tumor- Suppressorgene vorgeschlagen, einschließlich das Gen Rb von Retinoblastom (vgl. Friend, S. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 84 (1987), S. 9095), Gen p53 von Kolonkrebs (vgl. Lane, D.P. et al., Nature, Bd. 278 (1979), S. 261) und Gen WT von Wilms-Tumor (vgl. Call, K. M. et al., Cell, Bd. 60 (1990), S. 509. 1991 klonierten Nuell, M. J. et al., eine cDNA für ein Protein-Prohibitin mit einer antiproliferativen Aktivität aus Ratten-Hepatozyten. Ferner berichteten sie, daß bei Injektion einer synthetischen mRNA von Ratten-Prohibitin in Fibroblasten und HeLa-Zellen das Fortschreiten des Zellproliferationszyklus in das S-Stadium verhindert wurde, und daß die Injektion eines synthetischen Antisense- Oligonucleotids die Entwicklung zum S-Stadium induzierte (vgl. Mol. Cell. Biol., Bd. 11 (1991), S. 1372). Somit wiesen sie auf die Möglichkeit hin, daß es sich um einen antiproliferativen Faktor handeln könnte. Außerdem haben White et al., (Genomics, Bd. 11 (1991), S. 228-230) das humane Prohibitin-Gen dem Chromosom 17 zugeordnet und als einen DNA-Polymorphismus identifiziert.
Jedoch ist ein humanes Prohibitin-Gen immer noch vollständig unbekannt und dessen Aufklärung für die Aufdeckung des Mechanismus der malignen Transformation und der Proliferation von Zellen auf dem molekularen Niveau sowie für die Diagnose und Behandlung von Krebs erforderlich.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues humanes Prohibitin, eine dafür kodierende DNA und ein Reagens zur Genanalyse unter Verwendung dieser Bestandteile bereitzustellen.

Beschreibung der Erfindung

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Unter diesen Umständen erhielten die Erfinder ein PCR-Produkt Kettenreaktion (RT-PCR) unter Verwendung eines synthetischen oligonucleotids mit einem Gehalt an einem Teil einer Ratten- Prohibitin-cDNA-Sequenz als Primer und humaner HepatozytenmRNA als Matrize. Unter Verwendung des erhaltenen PCR- Produkts als Sonde beim Screening einer cDNA-Bibliothek konnten die Erfinder erfolgreich ein humanes Prohibitih-Gen isolieren. Analysenergebnisse über die Struktur ergaben, daß es sich bei diesem Gen um eine DNA mit einem Gehalt an einer neuen humanen Prohibitin-cDNA aus 816 Basen (Sequenz ID Nr. 1) handelte, die für 272 Aminosäuren (Sequenz ID Nr. 1) kodiert. Wenn ferner ein Prohibitin-Gen von humanen Brustkrebszellen analysiert wurde, wurden überraschenderweise mehrere Mutationen im Exon 4 festgestellt, was es nahelegt, daß es sich beim erfindungsgemäßen Gen um ein neues Tumor- Suppressorgen handelt. Auf der Basis dieser Befunde wurde die Erfindung fertiggestellt.
Demgemäß werden erfindungsgemäß ein humanes Prohibitin mit einer durch die Sequenz ID Nr. 1 wiedergegebenen Aminosäuresequenz, ein Peptid, das eine partielle Struktur des humanen Prohibitins enthält oder aus dieser besteht, eine für das humane Prohibitin kodierende cDNA, eine durch die Sequenz ID Nr. 1 wiedergegebene DNA, welche die für das menschliche Prohibitin kodierende cDNA enthält, ein Teil der DNA, eine Intron-DNA eines humanen Prohibitin-Gens, das durch die Sequenz ID Nr. 2 wiedergegeben ist und ein Teil der Intron-DNA. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren und ein Reagens für die Human-Prohibitin-Genanalyse bereit, wobei ein Teil der DNA-Sequenz der Sequenz ID Nr. 1 als Basensequenz für einen Primer dient. Ferner werden erfindungsgemäß bereitgestellt: Ein Protein, bei dem es sich um ein Analoges für das humane Prohibitin handelt, nämlich ein mutiertes Prohibitin, ein Peptid, das eine partielle Struktur des Proteins enthält oder daraus besteht, eine für das mutierte Prohibitin kodierende cDNA, eine sich auf humanes Prohibitin beziehende DNA mit einer Mutation, beispielsweise eine DNA, die in humanem Brustkrebsgewebe bestätigt worden ist, ein Teil der DNA, eine Intron-DNA des mutierten humanen Prohibitin-Gens und ein Teil der Intron- DNA. Es ist ferner zu erwarten, daß die Mutanten für die Krebsdiagnose anwendbar sind. Ferner werden erfindungsgemäß bereitgestellt: Eine Wirtszelle oder Wirtszellen, die durch ein inseriertes Plasmid oder einen inserierten Vektor mit der erfindungsgemäßen cDNA (d. h. die für das humane Prohibitin kodierende cDNA oder die für das mutierte Prohibitin kodierende cDNA) transformiert worden sind, und ein anti- Prohibitin-Antikörper gegen das humane Prohibitin oder ein partielles Strukturfragment davon, d. h. ein Peptid, das eine partielle Struktur des humanen Prohibitins enthält oder daraus besteht, als ein Antigen. Erfindungsgemäß werden bereitgestellt eine Aminosäuresequenz, die für humanes Prohibitin kodiert und aus der durch die Sequenz ID Nr. 1 wiedergegebenen Aminosäuresequenz besteht, und ein Primer mit einem Gehalt an einer DNA-Sequenz, die aus einem Teil der durch die Sequenz ID Nr. 1 wiedergegebenen DNA-Sequenz besteht, sowie ein Primer mit einem Gehalt an einer DNA- Sequenz, die aus einem Teil der Intron-DNA-Sequenz in der durch die Sequenz ID Nr. 2 wiedergegebenen Basensequenz besteht.
Nachstehend wird das Wesen der vorliegenden Erfindung näher wiedergegeben.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

(1) Herstellung einer doppelsträngigen DNA entsprechend der RNA von humanem Prohibitin

Die Herstellung des für humanes Prohibitin kodierenden Gens kann folgendermaßen durchgeführt werden.
Eine Messenger-RNA (mRNA) wird aus einem humanen Organ abgetrennt. Sodann wird eine komplementäre DNA (cDNA) durch reverse Transkription der mRNA hergestellt. Anschließend wird eine doppelsträngige DNA synthetisiert.
Die humane Prohibitin-mRNA läßt sich aus humanen Geweben, wie Leber, Herz und Lunge, die aus medizinischen Gründen entnommen worden sind, erhalten. Die RNA wird beispielsweise gemäß dem Guanidin-thiocyanat-Verfahren (vgl. Chirgwin, J. M., et al., Biochemistry, Bd. 18 (1979), S. 5294) aus humanen Geweben extrahiert. Anschließend wird die erhaltene RNA einer Flüssigchromatographie unter Verwendung einer oligo (dT)- Cellulose-Säule zur Präparation der mRNA unterworfen. Unter Verwendung der auf diese Weise erhaltenen mRNA als Matrize und von Oligonudeotiden von zwei Teilen der cDNA- Basensequenz von Ratten-Prohibitin als Primer werden eine einzelstrangige cDNA und anschließend eine doppelsträngige cDNA unter Verwendung einer reversen Transkriptase oder des Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens (PCR), beispielsweise gemäß dem Verfahren von Gubler, U., et al. (vgl. Gene, Bd. 25 (1983), S. 263) oder gemäß dem Verfahren von Frohman, A., et al. (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 85 (1988), S. 8998) synthetisiert.
Die auf diese Weise erhaltene doppelsträngige cDNA wird nach einem bekannten Verfahren in ein Plasmid oder einen Phagen inseriert. Als Beispiele für Vektoren, in die die cDNA inseriert werden kann, lassen sich pBluescript II SK, pBR322 und λgt11 erwähnen, obgleich jeder beliebige Vektor hierfür verwendet werden kann, sofern er in den Wirtszellen aufrechterhalten, repliziert und amplifiziert wird. Als ein Beispiel für das Verfahren zur Insertion der cDNA in das Plasmid läßt sich das Verfahren von Maniatis, J. et al., (vgl. Molecular doning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 239 (1982)) erwähnen.
Der auf diese Weise erhaltene Plasmid- oder Phagenvektor wird sodann in einen geeigneten Wirt, wie Escherichia coli, transfiziert. Als Beispiele für den als Wirt verwendeten E. coli-Stamm lassen sich E. coli HB101 und E. coli JM109 erwähnen. Wenn es sich bei dem Vektor der cDNA um ein Plasmid handelt, kann der Vektor in den Wirtszellen gemäß dem Calciumchlorid-Verfahren oder dem Calciumchlorid/Rubidiumchlorid-Verfahren aufrechterhalten werden. Wenn es sich beim Vektor der cDNA um einen Phagen handelt, kann andererseits der Vektor in den Wirtszellen beispielsweise durch das in vitro-Packverfahren aufrechterhalten werden (vgl. Molecular doning, Coldspring Harbor Laboratory, S. 249 (1982)). Nach Inkubation und Proliferation des Transformanten wird die rekombinante DNA des Plasmids oder des Phagen gemäß einem herkömmlichen Verfahren (vgl. Molecular doning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)) isoliert und mit einem Restriktionsenzym zur Analyse der Basensequenz der cDNA verdaut. Die Basensequenz wird gemäß dem Maxam-Gilbert- Verfahren (vgl. Maxam, A. M. und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 74 (1977), S. 560) oder nach dem Didesoxyverfahren (vgl. Messing, J. et al., Nucl. Acids Res., Bd. 9 (1981), S. 309) bestimmt.

(2) Bestätigung der vollständigen Struktur von humanem Prohibitin-Gen

Da die gemäß dem vorstehend erwähnten Verfahren erhaltene cDNA nicht für die vollständige Länge des humanen Prohibitin- Proteins kodiert, wird die vollständige Struktur des humanen Prohibitin-Gens unter Verwendung von humanen DNA-Bibliotheken analysiert.
Unter Verwendung einer humanen fötalen Hirn-cDNA-Bibliothek und einer humanen Chromosomen-Bibliothek kann ein cDNA-Klon durch das Kolonien-Hybridisierungsverfahren (vgl. Gene, Bd. 10 (1980), S. 63) oder nach dem Plaque- Hybridisierungsverfahren (vgl. Science, Bd. 196 (1977), S. 180) herausgefischt werden, wobei das gemäß dem vorerwähnten Verfahren erhaltene RT-PCR-Produkt als Sonde verwendet wird. Der auf diese Weise geklonte Transformant enthält eine cDNA, die für die vollständige Aminosäuresequenz von humanem Prohibitin oder für eine partielle Aminosäuresequenz davon kodiert. Die Basensequenzen dieser cDNAs wurden nach dem gleichen Verfahren, wie es vorstehend beschrieben worden ist, analysiert. Gegebenenfalls können dann, wenn ein Teil der cDNA, deren Basensequenz bestimmt worden ist, synthetisiert worden ist, und eine cDNA durch das Primer- Erweiterungsverfahren (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 76 (1979), S. 731) unter Verwendung des Teils der cDNA als Primer neu synthetisiert worden ist, das Klonieren der rekombinanten cDNA und die Analyse ihrer Basensequenz auf die vorstehend beschriebene Weise durchgeführt werden. Um die Struktur der chromosomalen DNA von humanem Prohibitin aufzuklären, wird ein Genomklon durch Screening einer humanen Chromosomen-Cosmid-Bibliothek unter Verwendung der vorerwähnten cDNA als Sonde isoliert. Anschließend werden die Basensequenzen dieser cDNAs mit denen der Genomklone, deren Strukturen bereits bestimmt worden sind, verglichen. Auf diese Weise läßt sich die Intron-Exon-Verbindung analysieren.
Schließlich wird die DNA, die die humane Prohibitin-cDNA enthält, die durch die Sequenz ID Nr. 1 wiedergeben ist, bestimmt. Die Aminosäuresequenz von humanem Prohibitin wird aus der Sequenz ID Nr. 1 abgeleitet. Die Sequenz ID Nr. 2 stellt die Exon-DNA der Exons 4 und 5 und die Intron-DNA um die Exons 4 und 5 dar. Humanes Prohibitin besteht aus 272 Aminosäuren und unterscheidet sich von Ratten-Prohibitin strukturell an einer Stelle, nämlich der Aminosaure in der Position 107, wobei sich bei menschlichem Prohibitin an dieser Stelle Phenylalanin befindet, während bei Ratten- Prohibitin sich an der entsprechenden Stelle Tyrosin befindet.

(3) Rekombinanter Expressionsvektor für humanes Prohibitin und Transformanten davon

Die gemäß dem vorerwähnten Verfahren erhaltene humane Prohibitin-cDNA wird in einen entsprechenden Vektor inseriert, der dann in geeignete Wirtszellen transfiziert wird, wodurch man einen Transformanten erhält. Dieser wird anschließend auf herkömmliche Weise inkubiert, wodurch man aus der Kultur eine große Menge an humanem Prohibitin erhält.
Ein rekombinanter Expressionsvektor läßt sich durch Verknüpfung der für humanes Prohibitin kodierenden cDNA mit der Flußabwärtsseite eines Promotors eines Vektors, der sich für die Expression eines humanen Prohibitins eignet, konstruieren, wobei ein bekanntes Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen und DNA-Ligase herangezogen wird. Beispiele für einen hierfür geeigneten Vektor sind die Plasmide pBR322 und pUC18 aus E. coli; Plasmid pUB110 aus Bacillus subtilis; Plasmid pRB15 aus Hefe; die Bakteriophagen λgt10 und λgt11; sowie SV40, wobei aber beliebige Vektoren, die zur Replikation und Amplifikation in einem Wirt befähigt sind, ohne Beschränkungen hierfür verwendet werden können. In ähnlicher Weise gibt es bezüglich des Promotors und des Terminators keine speziellen Beschränkungen, sofern sie beim verwendeten Wirt zur Expression der für humanes Prohibitin kodierenden Basensequenz befähigt sind. Je nach Art des Wirts können beliebige geeignete Kombinationen hierfür ausgewählt werden.
Als für humanes Prohibitin kodierende cDNA können beliebige DNAs verwendet werden, sofern sie für das humane Prohibitin- Protein kodieren. Hierfür eignet sich auch ein durch chemische Synthese hergestelltes künstliches Produkt.
Ferner ist die Basensequenz der DNA (cDNA) nicht auf die in der Sequenz ID Nr. 1 wiedergegebene Basensequenz beschränkt, sofern das exprimierte Protein die physiologische Aktivität von Prohibitin aufweist. Es kann nämlich die DNA eine Basensequenz aufweisen, die einer partiellen Substitution, Deletion, Insertion oder einer Kombination davon unterworfen worden ist.
Anschließend wird der auf diese Weise erhaltene rekombinante Expressionsvektor in einen Wirt transfiziert, beispielsweise nach dem Verfahren der kompetenten Zellen (vgl. J. Mol. Biol., Bd. 53 (1970), S. 154)., dem Protoplasten-Verfahren (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 75 (1978), S. 1929), dem Calciumphosphat-Verfahren (vgl. Science, Bd. 221 (1983), S. 551), dem in vitro-Packverfahren (vgl. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 72 (1975), S. 581) oder dem Virus-Vektor- Verfahren (vgl. Cell, Bd. 37 (1984), S. 1053), wodurch man einen Transformanten erhält. Als Wirt können E. coli, Bacillus subtilis, Hefen oder tierische Zellen verwendet werden. Der auf diese Weise erhaltene Transformant wird sodann in einem geeigneten Medium, das je nach dem verwendeten Wirt ausgewählt wird, inkubiert. Die Inkubation wird üblicherweise bei einer Temperatur von 20 bis 45ºC in einem pH-Bereich von 5 bis 8 und ggf. unter Belüften und Rühren durchgeführt. Humanes Prohibitin kann aus der Kultur durch entsprechende Kombination bekannter Trenn- und Reinigungstechniken abgetrennt und gereinigt werden. Beispiele für derartige Verfahren sind das Aussalzen, die Lösungsmittelfällung, die dialytische Gelfiltration, die Elektrophorese, die Ionenaustauschchromatographie, die Affinitätschromatographie und die Umkehrphasen-Hochleistungs- Flüssigchromatographie.
Bei Injektion in Zellen durch das Mikroinjektionsverfahren weist das auf diese Weise erhaltene humane Prohibitin eine Suppressionswirkung auf die Proliferation der Zellen auf.

(4) Antikörperherstellung

Das als Antigen verwendete Prohibitin kann eine vollständige Struktur aufweisen oder es kann sich um ein Fragment oder ein Peptid mit einer partiellen Struktur davon handeln. Aus der vollständigen Aminosäuresequenz von humanem Prohibitin kann nämlich ein Fragment oder ein Teilpeptid ausgewählt werden. Das Fragment oder Peptid läßt sich durch ein chemisches syntheseverfahren, durch die vorstehenden Genrekombinationstechniken oder durch Abbau von natürlichen Substanzen erhalten.
Zur Herstellung eines Antigen-Trägerprotein-Komplexes können verschiedene Kondensationsmittel, z. B. Glutaraldehyd, Carbodiimid und aktivierte Maleinimidester, verwendet werden. Beim Trägerprotein kann es sich um die gemäß dem Stand der Technik üblicherweise eingesetzten Produkte handeln, wie Rinderserumalbumin, Thyroglobulin und Hämocyanin Üblicherweise wird ein Kupplungsverfahren herangezogen, bei dem das Antigen und der Träger in einem Verhältnis von 1:1 bis 1:5 eingesetzt werden können.
Beispiele für zu immunisierende Tiere sind Mäuse, Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen. Die Impfung kann durch subkutane, intramuskuläre oder intraperitoneale Verabreichung vorgenommen werden. Das Antigen kann in Form eines Gemisches mit komplettem Freund-Adjuvans oder inkomplettem Freund- Adjuvans verabreicht werden. Die Verabreichung wird üblicherweise alle 2 bis 5 Wochen durchgeführt.
Ein polyklonaler Antikörper, z. B. ein antihumaner Prohibitin-Antikörper kann durch Entnahme von Blut aus einem immunisierten Tier und durch Abtrennen des Serums hergestellt werden. Der Antikörper kann nach beliebigen bekannten Verfahren gereinigt werden. Beispielsweise läßt er sich leicht durch eines der folgenden Verfahren reinigen: Ammoniumsulfat-Fraktionierung, PEG-Fraktionierung und Ethanol-Fraktionierung, sowie Anwendung von Anionenaustauschern oder von Affinitätschromatographie.
Ein monoklonaler Antikörper läßt sich nach einem bekannten Verfahren herstellen. Beispielsweise lassen sich Antikörper bildende Zellen aus der Milz oder den Lymphknoten eines immunisierten Tiers mit Myelomzellen verschmelzen und sodann in Form von Hybridomen isolieren. Myelomzellen der Maus, der Ratte oder des Menschen können dazu herangezogen werden. Es ist bevorzugt, Zellen einzusetzen, die die gleiche Herkunft wie die Antikörper bildenden Zellen aufweisen, wobei aber auch heterogene Zellen in einigen Fällen verfügbar sind.
Zellen lassen sich nach bekannten Verfahren verschmelzen, beispielsweise gemäß dem Verfahren von Köhler und Milstein (vgl. Nature, Bd. 256 (1975), S. 495). Beispiele für einen Fusionspromotor sind Polyethylenglykol und Sendai-Virus. Im allgemeinen können Zellen durch Umsetzung der Antikörper bildenden Zellen mit den Myelomzellen in einem Zahlenverhältnis von 1:1 bis 10:1 für etwa 1 bis etwa 10 Minuten bei einer Temperatur von 20 bis 40ºC und vorzugsweise von 30 bis 37ºC in 20 bis 50% Polyethylenglykol-Lösung (durchschnittliches Molekulargewicht 1000-4000) verschmolzen werden.
Verschiedene immunochemische Verfahren können zum Screening der den antihumanen Prohibitin-Antikörper bildenden Hybridome herangezogen werden. Beispiele hierfür sind die ELISA-Technik (enzymgebundener Immosorptionstest) unter Verwendung einer mit humanem Prohibitin beschichteten Mikroplatte und der EIA- Test (Enzym-Immunoassay) unter Verwendung einer mit Antiimmunoglobulin-Antikörper beschichteten Mikroplatte. Unter Anwendung dieser immunochemischen Verfahren lassen sich die Vertiefungen, die den gewünschten Antikörper bilden, bestimmen.
Aus diesen Vertiefungen wird ein Klon durch Klonierung, beispielsweise durch Grenzverdünnungsanalyse, erhalten. Die Hybridome werden üblicherweise einem Screening unterworfen und in einem Medium fur tierische Zellen (beispielsweise RPMI 1640) mit einem Gehalt an 10 bis 20% fötalem Kälberserum, das mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) versetzt ist, gezüchtet.
Der auf diese Weise erhaltene Klon wird in die Bauchhöhle einer BALB/C-Maus, der vorher Pristan verabreicht worden ist, transplantiert. Nach 10 bis 14 Tagen wird eine Probe des an monoklonalem Antikörper reichen Aszites als Material, aus dem der Antikörper gereinigt wird, gewonnen. Alternativ kann die durch Inkubieren des Klons erhaltene Kultur als Material zur Reinigung des Antikörpers herangezogen werden. Der monoklonale Antikörper kann nach den vorstehend erwähnten Verfahren zur Reinigung von Immunoglobulin gewonnen werden.
Es wird angenommen, daß die immunologischen Tests unter Verwendung dieser Antikörper die Identifikation und die Bestimmung von humanem Prohibitin in biologischen humanen Proben ermöglichen und daß sich diese Antikörper für Krebsdiagnosemittel eignen.
Die immunologische Bestimmung von humanem Prohibitin kann gemäß einem beliebigen bekannten Verfahren durchgeführt werden, wozu das Verfahren mit fluoreszierendem Antikörper, das passive Agglutinationsverfahren und das Verfahren mit enzymmarkiertem Antikörper gehören. Der erfindungsgemäße monoklonale Antikörper kann einer der Klassen IgG, IgA und IGM angehören. Ferner können die Fab'- oder Fab-Fraktion, die durch Entfernen des Fc'- oder Fc-Bereichs dieses Antikörpers erhalten worden sind, oder Polymere davon verwendet werden. Ferner kann auch ein chimärer Antikörper davon eingesetzt werden.

(5) Genanalyse von humanem Krebsgewebe

Die erfindungsgemäß bereitgestellte Analyse von humanem Prohibitin-Gen in bezug auf das Auftreten von Mutationen kann durchgeführt werden, indem man in geeigneter Weise Basensequenzen von geeigneten Stellen des Gens auswählt und die synthetischen Oligonudeotide hierfür als Primer verwendet.
Das humane Prohibitin-Gen weist eine analoge Struktur wie das Gen Cmh3 (vgl. Eveleth, D. D. et al., Nucleic Acids Res., Bd. 14 (1986), S. 6169 und das Gen NFL (vgl. Hall, A., Cell, Bd. 61 (1990), S. 921) auf. Als Selektionsstellen für die Primer können beliebige Stellen des humanen Prohibitin-Gens ausgewählt werden, beispielsweise der cDNA-Teil, der Intron- Teil oder deren Verbindungsstelle; zweckmäßigerweise wird aber die Basensequenz für den Primer aus einem Basensequenzteil ausgewählt, wo die strukturelle Analogie mit dem Gen Cmh3 gut konserviert ist, nämlich der Exon-4-Teil oder die vor oder nach dem Exon-4-Teil befindlichen Intron- Teile. Das als Primer einzusetzende Oligonucleotid kann aus einigen bis einigen 10 Basen, vorzugsweise 10 bis 30 Basen und insbesondere 15 bis 25 Basen bestehen.
Als biologische Probe, die der Genanalyse zu unterziehen ist, können normale humane Gewebe und verschiedene humane Krebsgewebe eingesetzt werden. Die DNA des verwendeten Gewebes kann beispielsweise gemäß dem Verfahren von Sato, T., et al. (vgl. Cancer Res., Bd. 50 (1990), S. 7184) extrahiert und präpariert werden.
Die Erfinder führten zunächst eine Genanalyse an humanen Brustkrebszellen durch. Ein Oligonucleotid mit der Basensequenz 5'-GTA.CTC.CAG.CCT.AGG.CAA.C-3' an den Positionen 134-152 in der Sequenz ID Nr. 2, d. h. ein im Exon 4 des erfindungsgemäßen humanen Prohibitin-Gens befindlicher Intron-Teil, und ein weiteres Oligonucleotid mit dem Antisense-Code 5'-CAG.GAA.ACT.AGC.AGC.CAC.AT-3', der Basensequenz in den Positionen 491-510 in der Sequenz ID Nr. 2, d. h. ein im Exon 4 des erfindungsgemäßen humanen Prohibitin-Gens befindliches Intron-Teil, wurden als Primer verwendet. Humane Brustkrebsgewebe (26 Proben), die aus medizinischen Gründen entnommen worden waren, wurden gemäß dem PCR-Verfahren unter Verwendung der beiden vorerwähnten Primer zur Amplifikation des gewünschten humanen Prohibitin- Gens behandelt. Anschließend wurden Wirtszellen, die mit einem Plasmid mit dem inserierten humanen Prohibitin-Gen transformiert worden waren, nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Bildung von Klonen inkubiert. Es wurden Mutationen beobachtet, wie die Ergebnisse der in Tabelle 1 aufgeführten Basensequenzanalyse zeigen. Zu den Mutationen gehören solche im Exon-4-Teil, beispielsweise eine Mutation von CGC am Kodon 105 zu CAC, nämlich eine Mutation von Arginin zu Histidin (Probe Nr. 342), eine Deletion von 2 Basen im Kodon 90-92 (Probe Nr. 120) und eine Mutation im Kodon 88 (Probe Nr. 139).
Diese Faktoren legen es nahe, daß das erfindungsgemäße humane Prohibitin-Gen die charakteristische Beschaffenheit eines Tumor-Suppressor-Gens aufweist und somit in enger Beziehung zur malignen Transformation und zur Proliferation von Zellen steht, wodurch ein Verfahren zur Diagnose von humanem Brustkrebs bereitgestellt wird.
Erfindungsgemäß werden ein neues humanes Prohibitin und eine dafür kodierende cDNA bereitgestellt. Ferner ermöglicht die vorliegende Erfindung die qualitative und quantitative Analyse von humanem Prohibitin in einer biologischen Probe durch eine immunologische Technik unter Verwendung eines antihumanen Prohibitin-Antikörpers und die Genanalyse einer biologischen Probe nach dem PCR-Verfahren unter Verwendung einiger Oligonudeotide und einer partiellen Basensequenz des humanen Prohibitin-Gens als Primer. Der anti humane Prohibitin-Antikörper und das Oligonucleotid mit einer partiellen Basensequenz des humanen Prohibitin-Gens eignen sich als klinische diagnostische Reagentien. Ferner besteht die Möglichkeit, humanes Prohibitin als Arzneistoff einzusetzen. Somit stellt es ein wertvolles Reagens für Untersuchungen dar. Außerdem ermöglicht es das Auffinden eines mutierten humanen Prohibitin-Gens in einem humanen Brustkrebsgewebe und eines dafür kodierenden Proteins, das Gen oder das Protein in einer biologischen Probe quantitativ zu bestimmen, wodurch ein neues diagnostisches Verfahren für humanen Brustkrebs bereitgestellt werden kann. Auf der Basis der für Prohibitin angenommenen Funktionen sind diese Wirkungen nicht auf Brustkrebs beschränkt.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion von pcDH unter Verwendung des Vektors pcD.
Fig. 2 zeigt das Verfahren zur Konstruktion von pBEPH.
Fig. 3 zeigt ein Verfahren zur Konstruktion von pYTSPH.

Beispiele

Zur ausführlicheren Erläuterung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Beispiele, die keine Beschränkung darstellen sollen, vorgelegt.

Beispiel 1

(1) Präparation von mRNA

1 g einer humanen Leber, die aus medizinischen Gründen entnommen worden war, wurde in 10 ml einer Lösung von 4 M Guanidiniumthiocyanat, 0,5% N-Lauroylsarcosin-natrium, 25 mM Natriumcitrat (pH-Wert 7,0), 1 M Mercaptoethanol und 0,1% Antiform (Sigma) suspendiert und anschließend mit dem Gerät Polytron homogenisiert. Das erhaltene Homogenisat wurde über eine 5,7 M wäßrige Cäsiumchloridlösung mit einem Gehalt an 0,1 M EDTA geschichtet und 36 Stunden bei 25ºC und 26 000 U/min unter Verwendung einer Ultrazentrifuge (SRP28 SA Rotor, Hitachi) zentrifugiert, um die RNA in Form von Pellets zu gewinnen.
Die auf diese Weise erhaltene RNA wurde in 10 mM Tris-HCl- Pufferlösung (pH-Wert 7,4) gelöst. Nach Zugabe von Ethanol ließ man das Gemisch 1 Stunde bei -70ºC stehen. Sodann wurde das Gemisch zentrifugiert, und die auf diese Weise ausgefällte RNA wurde in 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4) gelöst. Sodann wurde 0,5 M KCl zugegeben.
Das erhaltene Gemisch wurde sodann in eine oligo(dT)- Cellulose-Säule (20 mm Durchmesser und 150 mm Höhe), die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, gegossen. Nach gründlichem Waschen mit 0,5 M KCl und 10 mM Tris-HCl wurde die mRNA mit einer 10 mM wäßrigen Lösung von Tris-HCl eluiert.
500 µg der mRNA aus humaner Leber wurden sodann über 15 ml einer Saccharoselösung mit einem Konzentrationsgradienten von 10 bis 28% und einem Gehalt an 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 0,2 M NaCl und 1 mM EDTA geschichtet und 16 Stunden bei 20ºC und 26 000 U/min unter Verwendung einer Ultrazentrifuge (SRP 28 Rotor, Hitachi) zentrifugiert.
Sodann wurde der Inhalt des Zentrifugenröhrchens vom Boden aus in 500 µl-Portionen fraktioniert. Die einzelnen Fraktionen wurden mit Ethanol versetzt, wodurch die mRNA ausgefällt wurde.

(2) Herstellung von partieller humaner Prohibitin-cDNA

Gemäß dem RT-PCR-Verfahren wurde eine partielle humane Prohibitin-cDNA synthetisiert. Primer für das RT-PCR- Verfahren wurden unter Verwendung der Basensequenzen innerhalb eines Bereichs, der zwischen der Ratten-Prohibitin- cDNA-Sequenz (angegeben von Nuell, M. J. et al.) und dem Gen Cmh3 von Drosophila konserviert war, hergestellt:
rechter Primer (3'): 5'-TCACCCTCAGCAGAGATGAT-3';
linker Primer (5'): 5'-CGCTCTCGACCACGTAATGT-3'.
Das Verfahren umfaßt die Vereinigung von 0,1 µg der Humanleber-mRNA, einem PCR-Puffer, dNTPs, DTT und 25 pmol des 3'-Oligonucleotid-Primers, die 5-minütige Inkubation des Gemisches bei 65ºC, die Zugabe von 40 Einheiten RNA-sin und 200 Einheiten M-MLV-RT (Moloney-Mäuseleukämie-Virus-reverse- Transkriptase: BRL), Einstellen des Gesamtvolumens auf 25 µl, 90-minütiges Inkubieren des Gemisches bei 42ºC, Zugabe von PCR-Puffer, dNTPs, 75 pmol 3'-Oligonucleotid-Primer und 100 pmol 5'-Oligonucleotid-Primer zum Reaktionsgemisch unter Einstellung des Gesamtvolumens auf 100 µl und Durchführen der PCR.
Die PCR-Bedingungen beinhalten einen Zyklus von 2-minütigem Anelieren bei 55ºC, 2-minütiger Erweiterung bei 72ºC und 1- minütiger Denaturierung bei 94ºC. Dieser Zyklus wird zur Amplifikation der DNA 35 mal wiederholt. Man erhält ein Produkt mit 444 bp.

(3) Insertion in pBSKII und Transformation

Das vorstehende RT-PCR-Produkt wurde an einem 1,2%-Agarosegel unter Bildung eines DNA-Fragments von 444 bp der Elektrophorese unterzogen. Dieses DNA-Fragment wurde der endständigen Reparatur mit Klenow-Enzym unterzogen und endständig mit T4-Ribonucleotid-kinase phosphoryliert. Anschließend wurde das so behandelte DNA-Fragment mit pbluescript II SK (-), das mit Eco RV gespalten und anschließend mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war, unter Verwendung von T4-Ligase verknüpft. Der auf diese Weise erhaltene Vektor wurde in E. coli HB 101 transfiziert, um das E. coli zu transformieren. Die Klone H1, H2 und H3 wurden in den erhaltenen Transformanten selektiert. Die Basensequenzen dieser Klone wurden durch das Didesoxyverfahren (Pharmacia AB, T7-Sequenzierungskit) bestimmt. Dabei wurde festgestellt, daß der Klon H3 eine hochgradige Homologie mit Ratten-Prohibitin aufwies.

(4) Identifikation von humanem Prohibitin-cDNA-Klon

Herstellung einer Sonde:

Der vorstehende Klon H3 wurde mit BamHI und HindIII gespalten. Aus einem 1,2%-Agarosegel erhielt man ein DNA- Fragment von 444 bp. Nach Einführung von γ-³²p-CTP auf herkömmliche Weise unter Verwendung von Klenow-Enzym wurde dieses DNA-Fragment als Sonde verwendet.

Identifikation eines cDNA-Klons:

Ein Filter (etwa 3,5 x 10&sup5; Klone) wurde durch Übertragen von Phagen-DNAS aus einer fötalen humanen Hirn-cDNA-Bibliothek (CLONTECH) hergestellt und durch das DNA- Hybridisierungsverfahren unter Verwendung der vorerwähnten Sonde einem Screening unterworfen. Man erhielt zwei positive- Klone. Nach Bestimmung der Basensequenzen dieser beiden cDNAs wurde in ihnen die gleiche Basensequenz wie in H3 gefunden, was bestätigt, daß die vollständige DNA-Sequenz der DNA- Sequenz entspricht, die die für humanes Prohibitin gemäß der Darstellung durch Sequenz ID Nr. 1 kodierende cDNA-Sequenz enthält.
E. coli HB101 pBPH, das durch pbluescript II 5K (-) mit dieser inserierten cDNA transformiert worden war, wurde beim Fermentation Research Institute of the Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM P- 12714 am 21.1.1992 hinterlegt. Anschließend wurde die Hinterlegung am 26.3.1992 in eine internationale Hinterlegung unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3808 umgewandelt.

Identifizierung eines Genom-Klons:

Ein Filter wurde durch Übertragung von Kolonien-DNAs von einer humanen Genomcosmid-Bibliothek, die durch ein herkömmliches Verfahren hergestellt worden war, und gemäß dem DNA-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung der vorerwähnten Sonde einem Screening unterzogen. Es wurden vier positive Klone erhalten. Bei Bestimmung der Basensequenzen dieser vier Cosmid-DNAs unter Verwendung eines auf der Basis der Sequenz von H3 hergestellten Primers wurde festgestellt, daß einer dieser Klone einen Teil der gleichen Basensequenz wie H3 beinhaltete. Als Ergebnis einer Analyse auf Intron- Exon-Verbindungen auf der Basis eines Vergleichs zwischen dieser Basensequenz mit der Basensequenz der cDNA wurde bestätigt, daß sich die Exons in folgenden Positionen in der DNA-Basensequenz der Sequenz ID Nr. 1 befanden: Exon 1 in den Positionen 1-23; Exon 2 in den Positionen 24-138; Exon 3 in den Positionen 139-300; Exon 4 in den Positionen 301-443; 561-656; und Exon 7 in den Positionen 657-1020. Die Sequenz ID Nr. 2 zeigt die Basensequenz der mit den Exons 4 und 5 des humanen Prohibitin-Gens gekuppelten Intron-Teile, wobei die Aminosäure-Nummern in den Teilen der Exons 4 und 5 entsprechend der Sequenz ID Nr. 1 zugeordnet sind.

Beispiel 2

Expression von cDNA in COS7-Zellen:

Der Vektor pcD (vgl. Okayama, H. und P. Berg, Mol. Cell Biol., Bd. 3 (1983), S. 280) weist den DNA- Replikationsinitiationspunkt des Virus SV40 und einen frühen Promotor auf. Wenn cDNA diesem Promotor auf der Flußabwärtsseite inseriert wird und sodann in eine Zelle vom Stamm COS7 (vgl. Y. Glutzman, Cell, Bd. 23 (1981), S. 175), die das T-Antigen von SV40 bildet, transfiziert wird, wird dieses rekombinante Plasmid amplifiziert und es erfolgt eine vorübergehende und intensive Expression von cDNA.
Ein BamHI-XhoI-Fragment mit dem vollständigen kodierenden Bereich wurde aus pBSPH, bei dem es sich um ein cDNA-Klon von voller Länge handelte, ausgeschnitten und mit dem Vektor pcDVl (vgl. F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 74 (1977), S. 5463, der mit XhoI + HindIII gespalten worden war, unter Verwendung von DNA-Ligase verbunden, wodurch man pcDPH erhielt (vgl. Fig. 1).
Durch diesen Vorgang wurde die cDNA flußabwärts vom Promotor in der korrekten Orientierung inseriert.
Die Plasmid-DNA von PCDPH wurde hergestellt und in COS7- Zellen gemäß dem DEAE-Dextran-Verfahren transfiziert (vgl. T. Yokota et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 82 (1985), S. 68). Die auf diese Weise transformierten Zellen bildeten nach etwa 1 Tag humanes Prohibitin in ihren Zellen.

Beispiel 3

Expression von humanem Prohibitin in einem Säugetierzellenstamm:

Das in Beispiel 2 erhaltene pcDPH und pSV&sub2;-dhfr (vgl. S. Subramani, R. Mulligan und P. Berg, Mol. Cell. Biol., Bd. 1 (1981), S. 854) wurden in BHK-Zellen (ATCC, CRL 1632 tk-ts13, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) durch das Elektroporationsverfahren (Bio-Rad Co., Gene Pulser 0,4 kV/0,4 cm, 500 µF, 10-15 msec, 2-fach) oder das Calciumphosphat-Verfahren (Pharmacia AB, Kit Cell Phect) kotransfiziert. Durch Screening mit 250 mM Methotrexat (MTX) wurden MTX-resistente Klone erhalten.
Diese Klone bildeten in ihren Zellen humanes Prohibitin.
Ferner wurden pcDPH, pSV&sub2;-dhfr und pSV&sub2;-neo (vgl. P. J. Southern & P. Berg, J. Mol. Appl. Gent., Bd. 1 (1982), S. 327) in CHO-K1-Zellen (ATCC CCL 61) gemäß dem Calciumphosphat-Verfahren (vgl. Kao, F. T. und T. T. Puck, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 60 (1981), S. 1275) kotransfiziert. Durch Screening mit 1 mg/ml G-418 wurde ein neoresistenter Klon erhalten. Dieser Klon wurde ferner in einem Medium mit einem Gehalt an 5 µM MTX inkubiert, wodurch man einen humanes Prohibitin bildenden Klon in den Zellen erhielt.

Beispiel 4

Herstellung von humanem Prohibitin durch E. coli

(1) Herstellung eines Expressionsplasmids

Eine für das humane Prohibitin-Protein kodierende DNA wurde aus pBPH hergestellt und zwischen dem Promotor PL des λ- Phagen und dem Terminator rrnB von E. coli inseriert, wodurch das Expressionsplasmid pBEPH konstruiert wurde (vgl. Fig. 2).
-pPl-λ (Pharmacia AB) mit dem Promotor PL des λ-Phagen wurde mit EcoRI und HpaI geschnitten, um ein Fragment von 470 bp mit dem Promotor PL zu erhalten. Anschließend wurde mit HaeIII geschnitten, um ein Fragment von etwa 265 bp mit dem Promotor zu erhalten. Dieses Fragment und ein weiteres DNA- Fragment der folgenden synthetischen SD-Sequenz:
5'-TTA.ACA.ACT.AAG.GGT.ATC.GAC.AAT.G-3'
3'-AAT.TGT.TGA.TTC.CCA.TAG.CTG.TTA.C-5'
wurden ferner mit pBR322 verknüpft, das durch Spalten von pBPH mit NlaIII, Behandeln mit T4-DNA-Polymerase und sodann Spalten des auf diese Weise erhaltenen humanen Prohibitin- cDNA-Fragments mit EcoRI und BalI erhalten worden war. Man erhielt pBEPH.

Beispiel 5

Expression in Hefe:

Um einen Expressionsvektor von humanem Prohibitin in einer Hefe zu konstruieren, wurde der Vektor pYTS für die heterogene Genexpression in Hefen mit dem Restriktionsenzym BAMHI an seiner Klonierungsstelle verdaut, und die Spaltungsstelle wurde mit T4-DNA-Polymerase stumpfendig gemacht. Das vorstehende PBPH wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI-XhoI verdaut, wodurch man den humanen Prohibitin-Genteil des pBPH erhielt. Der auf diese Weise erhaltene humane Prohibitin-Genteil wurde abgetrennt und unter Verwendung eines Agarosegels mit niedrigem Schmelzpunkt gereinigt. Nach Abstumpfen der Restriktionsenzym-Spaltungsstellen mit T4-DNA-Polymerase wurde die mit T4-DNA-Polymerase behandelte Vektor-pYTS-DNA damit unter Verwendung von T4-DNA-Ligase verknüpft, wodurch man das Konstrukt pYTS-PH erhielt (vgl. Fig. 3).
Das Plasmid pYTS-PH wurde durch das Lithiumacetat-Verfahren (vgl. Ito et al., J. Bacteriol., Bd. 153 (1983), S. 163) in Saccharomyces cerevisiae AH22 zur Durchführung einer Transformation transfiziert. Man erhielt einen Klon mit pYTS- PH. Beim Plasmid pYTS handelte es sich um einen heterogenen Genexpressionsvektor von Sandwich-Struktur mit dem Promotor PH05, der mit saurer Phosphatase der induzierten Expression unterliegen konnte, und einem Terminator von GAP (Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase), bei dem es sich um einen Transkriptionsterminationsfaktor handelte, flußabwärts von der Klonierungsstelle.
Die Expression von humanem Prohibitin in der Hefe S. cerevisiae AH22 mit pYTS-PH wurde auffolgende Weise durchgeführt. Der Klon wurde in 10 ml Minimalmedium gemäß Burkholder et al. mit einem Gehalt an 20 µg/ml Histidin und 0,15% KH&sub2;PO&sub4; bei 30ºC gezüchtet, bis die Inkubation eine stationäre Phase erreichte. Anschließend wurde der Klon auf 100 ml Burkholder-Medium mit einem Gehalt an 0,15% KCl anstelle von 0,15% KH&sub2;PO&sub4; übertragen. Der Promotor PH05 wurde 48 Stunden bei 30ºC zur Expression induziert, wobei mit Phosphorsäure gesteuert wurde.
Nach 48-stündiger Durchführung der induzierten Expression bei 30ºC unter Steuerung mit Phosphorsäure wurde die Hefe durch Zentrifugation gewonnen und in 10 ml 1,2 M Sorbit/50 mM KH&sub2;PO&sub4;-50 mM Na&sub2;PO&sub4;-Puffer (pH-Wert 7,2) suspendiert. Sodann wurden 100 µl einer Lösung von 500 µg/ml Zymolyae 100 T (Seikagaku) zugegeben, und die Hefe wurde 1 Stunde bei 37ºC lysiert. Nach der Hefelysis wurden die Zellpellets in 1 mM PMSF-50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5)-10 mM EDTA-1% SDS gelöst und 30 Minuten bei 15 000 U/min zentrifugiert. Sodann wurde ein Zellextrakt aus dem Überstand gewonnen und der Elektrophorese an SDS-PAGE unterworfen. Nach Färben mit Coomassie-Blau wurde in der Hefe im Überschuß gebildetes humanes Prohibitin mit 30 KDa, d. h. dem angenommenen Molekulargewicht, nachgewiesen. Ferner wurde durch Western- Blotting-Technik unter Verwendung eines humanen Prohibitin- Antikörpers bestätigt, daß es sich bei diesem Protein um humanes Prohibitin handelte.

Beispiel 6

Analytisches Experiment mit Brustkrebsgewebe-Gen

(1) Verfahren zur Extraktion von DNA aus Brustkrebsgewebe

Um Mutationen im humanen Prohibitin-Gen bei Brustkrebs festzustellen, wurde DNA aus Tumoren und normalen Geweben von Patienten mit Brustkrebs extrahiert.
Aus medizinischen Gründen entnommene Brustkrebsgewebe und normale Gewebe wurden mit flüssigem Stickstoff eingefroren und unter Verwendung von Mörser und Pistill fein zermahlen, wobei flüssiger Stickstoff portionsweise zugegeben wurde, um ein feines Pulver zu erhalten. Sodann wurde das Pulver in ein Röhrchen mit einem Gehalt an 4 ml Lösung (10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 8,5) übertragen, wobei mit flüssigem Stickstoff gekühlt wurde. Nach gründlichem Rühren wurden 0,35 ml Protease K (10 mg/ml) und 0,4 ml 10% SDS zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden oder länger bei 37ºC stehengelassen, wobei gelegentlich gerührt wurde.
Sodann wurden 4 ml eines Gemisches aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde langsam bei 37ºC über Nacht mit einem Schüttler gerührt. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 3000 U/min wurde der Überstand mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig auf ein neues Röhrchen übertragen. Sodann wurden 4 ml eines Gemisches aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde langsam 2 Stunden bei 37ºC auf einem Schüttler gerührt. Nach 20- minütigem Zentrifugieren bei 3000 U/min wurde der Überstand in ein neues Röhrchen übertragen. Sodann wurden 4 ml eines Gemisches aus Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde langsam mit einem Schüttler gerührt. Nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 8000 U/min wurde der Überstand in ein neues Röhrchen übertragen. Das vorstehende Verfahren wurde so lange wiederholt, bis in der Zwischenschicht keine weiße denaturierte Proteinschicht mehr festgestellt wurde.
Sodann wurde eine äquivalente Menge Isopropylalkohol zum Überstand gegeben, wodurch DNA ausgefällt wurde. Bei Ausfällung von weißen suspendierten Bestandteilen (DNA) wurde der Niederschlag mit einer siliconisierten Pasteur-Pipette in ein Eppendorf-Röhrchen übertragen. Wenn nur eine geringe Menge an Niederschlag erhalten wurde, wurde die DNA durch 10- minütiges Zentrifugieren bei 8000 U/min gefällt. Die gewonnene DNA wurde mit 70% Ethanol gespült. Das Ethanol wurde verworfen. Den Überstand ließ man mehrere Stunden bei Raumtemperatur stehen, wobei der Alkohol verdampfte. Die auf diese Weise extrahierte DNA wurde für die Analyse des Prohibitin-Gens herangezogen.

(2) Analyse auf Mutationen des Prohibitin-Gens in Brustkrebsgeweben

Um Mutationen im Prohibitin-Gen in Brustkrebsgeweben nachzuweisen, wurde die Basensequenz des Exons 4, die eine hohe Homologie mit dem Gen Cmh3 von Drosophila aufwies, bestimmt.
Zunächst war es erforderlich, das Exon 4 nach dem PCR- Verfahren zu amplifizieren. Als Ergebnis der Strukturanalyse der erfindungsgemäßen humanen Prohibitin-cDNA und des Cosmidklons von Chromosom-Human-Prohibitin wurden Intron-Exon-Verbindungen gemäß den Angaben in Sequenz ID Nr. 2 bestätigt. Auf der Grundlage dieser Sequenz wurden zwei Primer mit den folgenden Basensequenzen, bei denen es sich um partielle Basensequenzen der beiden Introns vor und nach dem Exon 4 handelte, als Primer für PCR hergestellt:
5'-GTA.CTC.CAG.CCT.AGG.CAA.C-3' (Sense-Code der Basen in den Positionen 134-152 in der Sequenz ID Nr. 2); und
5'-CAG.GAA.ACT.AGC.AGC.CAC.AT-3' (ein Antisense-Code der Basen in den Positionen 491-510 in der Sequenz ID Nr. 2).
Unter Verwendung dieser Primer wurde eine Region mit dem Exon 4 zunächst nach dem PCR-Verfahren amplifiziert. Das PCR- Produkt wurde mit Polynucleotid-kinase und T4-DNA-Polymerase behandelt und sodann in die EcoRV-Stelle von pbluescript II SK (-), das mit cIp vorbehandelt worden war, subkloniert. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch in E. coli transfiziert, und eine Plasmid-DNA wurde hergestellt. Unter Verwendung von Primern mit Basensequenzen von weiteren inneren Teilen im Vergleich mit den bei der PCR-Methode eingesetzten Primern (nämlich ein Primer mit einem Sense- Codeteil der Basen in den Positionen 197-214 in der Sequenz ID Nr. 2 und ein weiterer Primer mit einem Antisense-Codeteil der Basen in den Positionen 421-437 in der Sequenz ID Nr. 2) wurde die DNA-Basensequenz der Plasmid-DNA in beiden Richtungen bestimmt.
Als Ergebnis des Vergleichs und der Prüfung der Basensequenzen der Exons 4 in den Prohibitin-Chromosomen von normalen Geweben und Krebsgeweben wurde eine Mutation in den Tumorgewebeproben Nr. 136, 432, 120 und 218 festgestellt, wie in Tabelle 1 dargelegt ist. Tabelle 1 Probe Nr. Alter LOH* Kodon Basenmutation Aminosäure Rahmen-Verschiebung * Verlust der heterozygotischen Beschaffenheit im 17. Chromosom.
In den Fällen von anderen Exons läßt sich eine Mutation auf ähnliche Weise durch Konstruktion entsprechender Primer aus der durch Sequenz ID Nr. 2 wiedergebenen Basensequenz nachweisen. Ferner lassen sich Abnormalitaten in der Basensequenz beispielsweise unter Verwendung des Rnase- Schutzverfahrens oder des SSCP-Verfahrens, die bekannt sind, nachweisen.

Beispiel 7

Herstellung des polyklonalen Antikörpers

Auf der Basis der in Sequenz ID Nr. 1 beschriebenen humanen Prohibitin-Aminosäuresequenz wurden fünf Peptide mit den Aminosäuresequenzen in den Positionen 69-87, 110- 118, 140- 158, 175-197 und 200-221 als Antigene ausgewählt. Die einzelnen Peptide wurden unter Verwendung eines automatischen Festphasen-Peptidsynthesegerätes hergestellt. Die einzelnen erhaltenen Peptide wurden mit einem Trägerprotein-Keyhole- Limpet unter Verwendung eines aktivierten Maleinimidesters als Kondensationsmittel zu einem Komplex verarbeitet, wodurch man ein Immunogen erhielt. Diese Komplexe wurden mit komplettem Freund-Adjuvans vermischt. Kaninchen wurden damit subkutan in Abständen von 2 Wochen insgesamt 5 mal geimpft, um Antikörper herzustellen.
Die Bildung eines Antikörpers wurde durch ELISA bestätigt, wobei die einzelnen Antigen-Peptide an einer Mikroplatte immobilisiert wurden und die Serumproben und ein Antikaninchen-Immunoglobulin-Antikörper, der mit Meerrettichperoxidase markiert war, zugegeben wurden.
Die Reaktivitäten der auf diese Weise erhaltenen Antikörper gegen verschiedene Proben wurden untersucht. Zunächst wiesen die einzelnen Antikörper beim vorstehenden ELISA-Test eine Reaktivität gegen die einzelnen synthetischen Antigen-Peptide auf. Ferner zeigten die einzelnen Antikörper eine positive Reaktion bei der Western-Blotting-Analyse, wobei das hümäne Prohibitin verwendet wurde, das durch Inkubation von E. coli nach Transformation mit einem Plasmid mit einem Gehalt an humaner Prohibitin-cDNA exprimiert worden war.
Normale humane Gewebe, humane Krebsgewebe und humane Krebszellenstämme wurden jeweils mit 1% CHAPS-Phosphatlösung homogenisiert. Die extrahierte Lösung wurde nach dem Western- Blotting-Verfahren analysiert. Dabei zeigte ein Antikörper gegen ein Peptid mit der in Sequenz ID Nr. 1 beschriebenen Aminosäuresequenz in den Positionen 200-221 als Antigen positive Reaktionen gegen normale humane Gewebe von Leber und Submucosanerv, eine negative Reaktion gegen Submucosanerv- Krebsgewebe und eine positive Reaktion gegen einen gezüchteten Krebszellenstamm (humaner Brustkrebs MX-1).
Diese Ergebnisse zeigen, daß der erfindungsgemäße Antikörper zur Bestätigung und Bestimmung von Prohibitin in biologischen Proben eingesetzt werden kann.

Sequenzuste

Sequenz ID Nr.: 1
Sequenzlänge: 1020
Sequenztyp: Nucleinsäure
Strangtyp: doppelt
Topologie: linear
Molekültyp: cDNA zu mRNA

Originalquellen

Organismus: Homo sapiens
Bibliothek: Humane fötale Hirn-cDNA-Bibliothek

Merkmale

Merkmalschlüssel: Peptid
Stellung: 23..839
Zur Ermittlung des Merkmals herangezogenes Verfahren: S (Analogie mit einer bekannten Sequenz oder einer Konsensussequenz) Sequenzbeschreibung
Sequenz ID Nr.: 2
Sequenzlänge: 850
Sequenztyp: Nucleinsäure
Strangtyp: doppelt
Topologie: linear
Molekültyp: genomische DNA

Originalquellen

Organismus: Homo sapiens
Bibliothek: Humane Chromosomen-Bibliothek

Merkmale

Merkmalschlüssel: Intron, Exon
Zur Ermittlung des Merkmals herangezogenes Verfahren: E (experimentell) Sequenzbeschreibung

Claims

1. Humanes Prohibitin mit folgender Aminosäuresequenz

Aminosäuresequenz

2. Peptid mit einer partiellen Struktur des humanen Prohibitins nach Anspruch 1, wobei das Peptid die Aminosäure Phenylalanin in der Position entsprechend Phe 107 enthält.

3. DNA entsprechend der folgenden DNA-Sequenz, die eine für humanes Prohibitin kodierende cDNA enthält:

DNA-Sequenz

4. Teil der DNA nach Anspruch 3, wobei der Teil der DNA ein Kodon enthält, das für Phenylalanin in einer Position entsprechend den Nudeotiden 269-271 kodiert.

5. Intron-DNA eines humanen Prohibitin-Gens, bestehend aus der folgenden Basensequenz:

Basensequenz

6. Teil der Intron-DNA nach Anspruch 5.

7. Für humanes Prohibitin kodierende cDNA, die aus der in Anspruch 3 beschriebenen DNA-Sequenz besteht.

8. Wirtszelle, transformiert mit einem Plasmid, das in der Wirtszelle exprimiert werden kann und in das die cDNA nach Anspruch 7 inseriert worden ist.

9. Antikörper gegen das humane Prohibitin nach Anspruch 1 als Antigen.

10. Antikörper gegen das Peptid, das die Aminosäuresequenz der Positionen 200-221 nach Anspruch 1 umfaßt.

11. Verfahren zur humanen Prohibitin-Gen-Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der in Anspruch 3 beschriebenen DNA-sequenz als eine Basensequenz für einen Primer bei der Prüfung eines humanen Prohibitin-Gens auf das Auftreten einer Mutation verwendet wird.

12. Verfahren für die humane Prohibitin-Gen-Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der Intron-DNA- Sequenz der in Anspruch 5 beschriebenen Basensequenz als Basensequenz für einen Primer bei der Prüfung eines humanen Prohibitin-Gens auf das Auftreten einer Mutation verwendet wird.

13. Verfahren für die humane Prohibitin-Gen-Analyse nach Anspruch 12, wobei ein Oligonucleotid mit der Basensequenz 134-152 der in Anspruch 5 beschriebenen Basensequenz und ein weiteres Oligonucleotid mit dem Antisense-Code der Positionen 491-510 der in Anspruch 5 beschriebenen Basensequenz als Primer verwendet werden.

14. Reagens für die humane Prohibitin-Gen-Analyse zur Verwendung als Primer bei der Prüfung eines humanen Prohibitin-Gens auf das Auftreten einer Mutation, dadurch gekennzeichnet, daß die Basensequenz des Primers aus der in Anspruch 4 beschriebenen DNA-Sequenz besteht.

15. Reagens für die humane Prohibitin-Gen-Analyse zur Verwendung als Primer bei der Prüfung eines humanen Prohibitin-Gens auf das Auftreten einer Mutation, dadurch gekennzeichnet, daß die Basensequenz des Primers aus einem Teil der Intron-DNA-Sequenz in der in Anspruch 5 beschriebenen Basensequenz besteht.

16. Reagens für die humane Prohibitin-Gen-Analyse nach Anspruch 15, wobei es sich bei den als Primern verwendeten Reagentien um ein Oligonucleotid mit der Basensequenz der Positionen 134-152 der in Anspruch 5 beschriebenen Basensequenz und um ein weiteres Oligonucleotid mit dem Antisense-Code der Positionen 491-510 der in Anspruch 5 beschriebenen Basensequenz handelt.

17. cDNA nach Anspruch 7, mit der Ausnahme, daß das Kodon GTC, das Kodon für Valin, in der Aminosäureposition 88 zu GCC, dem Kodon für Alanin, mutiert ist.

18. Mutiertes humanes Prohibitin, kodiert durch die cDNA nach Anspruch 17.

19. cDNA nach Anspruch 7, mit der Ausnahme, daß das Kodon CGC, das Kodon für Arginin, in der Aminosäureposition 105 zu CAC, dem Kodon für Histidin, mutiert ist.

20. Mutiertes humanes Prohibitin, kodiert durch die cDNA nach Anspruch 19.

21. DNA, bestehend aus der in Anspruch 3 beschriebenen DNA- Sequenz, mit der Ausnahme, daß CA im Kodon CACAC in den Basenpositionen 320-324 fehlt.

22. DNA bestehend aus der in Anspruch 5 beschriebenen Basensequenz, mit der Ausnahme, daß die Base C in der Basenposition 409 zu T mutiert ist.

23. Polypeptid nach Anspruch 2, mit der Ausnahme, daß mindestens eine von Phe 107 abweichende Aminosäure mutiert ist, zugefügt ist oder fehlt.

24. DNA nach Anspruch 4, mit der Ausnahme, daß mindestens eine Base mutiert ist, zugefügt ist oder fehlt und die DNA ein Kodon zum Kodieren für Phenylalanin in einer den Nudeotiden 269-271 entsprechenden Position enthält.

25. DNA, bestehend aus der in Anspruch 5 beschriebenen Intron-DNA-Sequenz, mit der Ausnahme, daß mindestens eine Base mutiert ist, zugefügt ist oder fehlt, oder ein Teil der DNA.

26. Wirtszelle, transformiert mit einem Plasmid, das in der Wirtszelle exprimiert werden kann und in das die cDNA nach Anspruch 17 inseriert worden ist.

27. Wirtszelle, transformiert durch ein Plasmid, das in der Wirtszelle exprimiert werden kann und in das die cDNA nach Anspruch 19 inseriert worden ist.

28. Wirtszelle, transformiert durch ein Plasmid, das in der Wirtszelle exprimiert werden kann und in das eine cDNA, die aus der Gruppe der in Anspruch 24 beanspruchten DNAs ausgewählt ist, inseriert worden ist.

29. Nucleinsäuresequenz, kodierend für humanes Prohibitin, bestehend aus der Aminosäuresequenz nach Anspruch 1.

30. Primer, enthaltend eine DNA-Sequenz, bestehend aus der DNA-sequenz nach Anspruch 4.

31. Primer, enthaltend eine DNA-Sequenz, bestehend aus einem Teil der Intron-DNA-Sequenz in der in Anspruch 5 beschriebenen Basensequenz.