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Hintergrund
der Erfindung
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Die
auf 50,000 bis 100,000 geschätzten
Gene, die über
die menschlichen Chromosomen verteilt sind, bieten eine enorme Aussicht
für das
Verständnis,
die Diagnose und die Behandlung menschlicher Erkrankungen. Darüber hinaus
finden Sonden, die zur spezifischen Hybridisierung an über das
menschliche Genom verteilte Genloci in der Lage sind, bei der Erstellung
hochaufgelöster
Chromosomenkarten und bei der Identifizierung von Personen Anwendung.
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In
der Vergangenheit war die Charakterisierung auch nur eines einzelnen
menschlichen Gens ein mühevolles
Verfahren, das jahrelange Anstrengungen erforderte. Neuere Entwicklungen
auf den Gebieten der Klonierungsvektoren, der DNA-Sequenzierung
und der Computertechnologie kamen zusammen, um die Geschwindigkeit,
mit der menschliche Gene isoliert, sequenziert, kartiert und charakterisiert
werden können,
außerordentlich
zu beschleunigen. Klonierungsvektoren, wie beispielsweise künstliche
Hefechromosomen (yeast artificial chromosomes; YACs) und künstliche
Bakterienchromosomen (bacterial artificial chromosomes; BACs), sind
in der Lage, DNA-Inserts, die hinsichtlich der Länge von 300 bis 1000 Kilobasen
(kb) bzw. 100-400 kb reichen, aufzunehmen, wobei sie so die Manipulierung
und Beschaffung von DNA-Sequenzen, die auf menschlichen Chromosomen über große Abstände verteilt
sind, erleichtern. Automatisierte DNA-Sequenzierungsmaschinen ermöglichen
die schnelle Sequenzierung von menschlichen Genen. Bioinformatische
Software ermöglicht
den Vergleich von Nukleinsäure-
und Proteinsequenzen, wobei so die Charakterisierung menschlicher
Genprodukte unterstützt
wird.
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Gegenwärtig werden
zwei verschiedene Ansätze
zur Identifizierung und Charakterisierung der über das menschliche Genom verteilten
Gene verfolgt. In einem Ansatz werden große Fragmente genomischer DNA
isoliert, kloniert und sequenziert. Potenziell offene Leserahmen
in diesen genomischen Sequenzen werden unter Verwendung bioinformatischer
Software identifiziert. Dieser Ansatz führt jedoch zur Sequenzierung langer
Strecken menschlicher, kein Protein kodierender DNA, um die über das
Genom verteilten Protein kodierenden Sequenzen zu finden. Über die
erforderliche umfangreiche Sequenzierung hinausgehend kann die bioinformatische
Software die erhaltenen genomischen Sequenzen falsch charakterisieren.
Auf diese Weise kann die Software Falschpositive, in denen nicht
kodierende DNA fälschlicherweise
als kodierende DNA charakterisiert wird, oder Falschnegative, in
denen kodierende DNA fälschlicherweise
als nicht kodierende DNA bezeichnet wird, erzeugen.
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Ein
alternativer Ansatz nimmt zur Identifizierung und Charakterisierung
menschlicher Gene einen direkteren Weg. In diesem Ansatz werden
aus isolierten Boten-RNAs (mRNAs), die menschliche Proteine kodieren,
komplementäre
DNAs (cDNAs) synthetisiert. Unter Verwendung dieses Ansatzes wird
eine Sequenzierung nur für
DNA ausgeführt,
die aus Protein kodierenden Abschnitten des Genoms abgeleitet worden
ist. Oftmals werden nur kurze cDNA-Strecken sequenziert, um so Sequenzen
zu erhalten, die als Expressed Sequence Tags (ESTs) bezeichnet werden.
Diese ESTs können
anschließend
verwendet werden, um erweiterte cDNAs zu isolieren und aufzureinigen,
die Sequenzen umfassen, die zu den EST-Sequenzen benachbart sind. Die
erweiterten cDNAs können
die vollständige
EST-Sequenz umfassen, die verwendet wurde, um sie zu erhalten oder
sie können
nur einen Teil der EST-Sequenz umfassen, die verwendet wurde, um
sie zu erhalten. Darüber
hinaus können
die erweiterten cDNAs die vollständig
kodierende Sequenz des Gens enthalten, von dem das EST abgeleitet
worden war, oder alternativ können
die erweiterten cDNAs Abschnitte der kodierenden Sequenz des Gens
enthalten, von dem das EST abgeleitet worden war. Es wird dabei
erkannt, dass mehrere erweiterte cDNAs vorliegen können, die
die EST-Sequenz
als Ergebnis alternativen Spleißings
oder als Ergebnis der Aktivität
alternativer Promotoren umfassen.
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In
der Vergangenheit wurden diese kurzen EST-Sequenzen oft aus cDNA-Bibliotheken auf
Grundlage von Oligo-dT erhalten. Entsprechend korrespondieren sie
hauptsächlich
mit der 3' untranslatierten
Region der mRNA. Zum Teil ist das Übergewicht an aus mRNA 3'-Enden abgeleiteten
EST-Sequenzen eine Folge der Tatsache, dass herkömmliche Techniken zum Erlangen
von cDNAs für
die Isolierung von aus mRNA 5'-Enden abgeleiteten
cDNA-Sequenzen nicht richtig geeignet sind (Adams et al., Nature
377:3-174, 1996; Hillier et al., Genome Res. 6:807-828, 1996).
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Darüber hinaus
entsprechen in den beschriebenen Fällen, in denen längere cDNA-Sequenzen
erhalten wurden, die beschriebenen Sequenzen typischerweise den
kodierten Sequenzen und umfassen nicht die vollständige 5' untranslatierte
Region der mRNA, von der die cDNA abgeleitet ist. Solche unvollständigen Sequenzen
könnten
das erste Exon der mRNA nicht umfassen, insbesondere in den Fällen, in
denen das erste Exon kurz ist. Darüber hinaus könnten sie
einige Exons nicht umfassen, oftmals kurze Exons, die stromaufwärts der
Spleißingstellen
liegen. Es besteht deshalb ein Bedarf, Sequenzen zu erhalten, die
von den mRNA 5'-Enden
abgeleitet sind.
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Während viele
von den menschlichen Chromosomen abgeleitete Sequenzen praktische
Anwendung finden, sind Ansätze,
die auf der Identifizierung und Charakterisierung derartiger chromosomaler
Sequenzen basieren, die ein Proteinprodukt kodieren, insbesondere
für diagnostische
und therapeutische Verwendungen relevant. Von den 50,000 – 100,000
Protein kodierenden Genen sind sowohl die Gene, die Proteine kodieren, die
von der Zelle, in der sie synthetisiert werden, sekretiert werden,
als auch die sekretierten Proteine selbst als mögliche therapeutische Mittel
besonders wertvoll. Solche Proteine spielen bei der Kommunikation
von Zelle zu Zelle oftmals beteiligt sind und können für die Erzeugung einer klinisch
relevanten Reaktion in ihren Zielzellen verantwortlich sein.
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Tatsächlich finden
gegenwärtig
mehrere sekretorische Proteine, einschließlich Gewebeplasminogenaktivator,
G-CSF, GM-CSF, Erythropoietin, humanes Wachstumshormon, Insulin,
Interferon-α,
Interferon-β,
Interferon-γ und
Interleukin-2 klinische Verwendung. Diese Proteine werden verwendet,
um einen breiten Bereich von Zuständen einschließlich akutem
Myokardinfarkt, akuter ischämischer
Apoplexie, Anämie,
Diabetes, Wachstumshormonmangel, Hepatitis, Nierenkrebs, Chemotherapie,
einschließlich
Neurotropenie, und Multipler Sklerose zu behandeln. Aus diesen Gründen stellen
erweiterte cDNAs, die sekretierte Proteine oder Abschnitte davon
kodieren, eine besonders wertvolle Quelle therapeutischer Mittel
dar. Es besteht deshalb ein Bedarf zur Identifizierung und Charakterisierung
von sekretierten Proteinen und den sie kodierenden Nukleinsäuren.
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Über ihren
eignen therapeutischen Nutzen hinausgehend, umfassen sekretorische
Proteine an ihren Aminotermini kurze Peptide, die ihre Sekretion
lenken, wobei diese Peptide als Signalpeptide bezeichnet werden.
Diese Signalpeptide werden durch die Signalsequenzen kodiert, die
an den 5'-Enden
der kodierenden Gensequenzen, die die sekretierten Proteine kodieren,
lokalisiert sind. Da diese Signalpeptide die extrazelluläre Sekretion
eines beliebigen Proteins mit dem sie operativ verknüpft sind,
lenken, können
die Signalsequenzen ausgenutzt werden, um die effiziente Sekretion
eines beliebigen Proteins durch operative Verknüpfung der Signalsequenz mit
einem Gen, das das Protein kodiert, für das Sekretion erwünscht ist,
zu lenken. Darüber hinausgehend
können
auch Teile der Signalsequenzen verwendet werden, um den intrazellulären Import
eines Peptids oder eines Proteins von Interesse zu lenken. Dies
kann sich in Strategien zur Gentherapie als vorteilhaft erweisen,
in denen es erwünscht
ist, ein bestimmtes Genprodukt an Zellen abzugeben, die sich von
den Zellen unterscheiden, in denen das Genprodukt erzeugt wird.
Signalpeptide kodierende Signalsequenzen finden auch in Techniken
zur Vereinfachung der Proteinreinigung Anwendung. In solchen Anwendungen
erleichtert die extrazelluläre
Sekretion des gewünschten
Proteins die Reinigung durch Verringerung der Zahl unerwünschter
Proteine, aus denen das gewünschte
Protein selektiert werden muss, in hohem Maße. Es besteht hier deshalb
ein Bedarf, die 5'-Abschnitte
der Gene für
sekretorische Proteine, die Signalpeptide kodieren, zu identifizieren
und zu charakterisieren.
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Die öffentlichen
Daten zur Anzahl menschlicher Gene, für die die Promotoren und stromaufwärts liegenden
regulatorischen Regionen identifiziert und charakterisiert worden
sind, sind recht beschränkt.
Teilweise mag dies auf den Schwierigkeiten bei der Isolierung solcher
regulatorischer Sequenzen beruhen. Stromaufwärts liegende regulatorische
Sequenzen, wie beispielsweise Bindestellen für Transkriptionsfaktoren, sind
typischerweise zu kurz, um als Sonden zur Isolierung von Promotoren
aus humanen Genombibliotheken verwendet zu werden. In letzter Zeit
wurden einige Ansätze
entwickelt, um menschliche Promotoren zu isolieren. Einer von ihnen
besteht in der Herstellung einer CpG-Insel Bibliothek (Cross, et
al., Nature Genetics 6:236-244, 1994). Der zweite besteht in der
Isolierung menschlicher genomischer DNA-Sequenzen, die Spel-Bindungsstellen
enthalten, durch Verwendung eines Spel-Bindungsproteins (Mortlock
et al., Genome Res., 6:327-335, 1996). Aufgrund mangelnder Spezifität oder mangelndem
Umfang unterliegen beide Ansätze Beschränkungen.
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Die
vorliegenden 5'-ESTs
können
verwendet werden, um stromaufwärts
liegende regulatorische Regionen, die sowohl die Lokalisierung,
das Entwicklungsstadium, die Geschwindigkeit und die Menge an Proteinsynthese
als auch die Stabilität
von mRNA kontrollieren, effizient zu identifizieren und zu isolieren
(Theil, BioFactors 4:87-93, 1993). Sobald sie einmal identifiziert
und charakterisiert worden sind, können diese regulatorischen
Regionen in der Gentherapie oder in Protein-Reinigungsschemen verwendet
werden, um die gewünschte
Menge an und die gewünschten
Lokalisierungen von Proteinsynthese zu erhalten, oder um die Synthese
unerwünschter
Genprodukte zu hemmen, zu verringern oder zu verhindern.
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Darüber hinaus
können
ESTs, die die 5'-Enden
von sekretorischen Proteingenen enthalten, Sequenzen umfassen, die
als Sonden zur Chromosomenkartierung und zur Identifizierung von
Personen nützlich
sind. Es besteht deshalb ein Bedarf, die Sequenzen zu identifizieren
und zu charakterisieren, die stromaufwärts von den 5' kodierenden Gensequenzen,
die sekretorische Proteine kodieren, liegen.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft gereinigte, isolierte oder rekombinante
ESTs, die Sequenzen umfassen, die von den authentischen 5'-Enden ihrer korrespondierenden
mRNAs abgeleitet wurden. Der Ausdruck „korrespondierende mRNA" betrifft die mRNA,
die die Matrize in der cDNA-Synthese darstellte, die das 5'-EST erzeugte. Diese
Sequenzen werden im Folgenden hierin als „5'-ESTs" bezeichnet. Wie hierin verwendet, erfordert
der Begriff „gereinigt" keine absolute Reinheit;
vielmehr ist er als relative Definition gedacht. Einzelne 5'-EST-Klone, die aus
einer cDNA-Bibliothek isoliert wurden, wurden herkömmlich bis
zur elektrophoretischen Homogenität aufgereinigt. Die aus diesen
Klonen erhaltenen Sequenzen konnten weder aus der Bibliothek noch
aus menschlicher Gesamt-DNA
direkt erhalten werden. Die cDNA-Klone als solche kommen nicht natürlich vor,
werden aber vielmehr durch Manipulation einer teilweise gereinigten
natürlich
vorkommenden Substanz (Boten-RNA) erhalten. Die Umwandlung der mRNA
in eine cDNA-Bibliothek umfasst die Erzeugung einer synthetischen
Substanz (cDNA) und reine einzelne cDNA-Klone können durch klonale Auswahl
aus der synthetischen Bibliothek isoliert werden. Daher führt die
Erzeugung einer cDNA-Bibliothek
aus Boten-RNA und nachfolgender Isolierung einzelner Klone aus der
Bibliothek zu einer etwa 104 bis 104 fachen Reinigung der nativen Botschaft.
Die Reinigung von Ausgangsmaterial oder natürlichem Material um wenigstens
eine Größenordnung,
vorzugsweise zwei oder drei Größenordnungen
und am stärksten
bevorzugt um vier oder fünf Größenordnungen,
ist ausdrücklich
umfasst.
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Wie
hierin verwendet, erfordert der Ausdruck „isoliert", dass das Material aus seiner ursprünglichen Umgebung
(z.B. die natürliche
Umgebung, wenn es natürlich
vorkommt) entfernt wird. Beispielsweise gilt ein natürlich vorkommendes
Polynukleotid, das in einem lebendigen Tier vorliegt, als nicht
isoliert, während
das gleiche Polynukleotid, das von einem Teil oder von allem des
im natürlichen
System koexistierenden Materials abgetrennt ist, als isoliert gilt.
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Wie
hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „rekombinant", dass das 5'-EST benachbart zu einer „Rückgrat" Nukleinsäure ist,
zu der es in seiner natürlichen
Umgebung nicht benachbart ist. Zusätzlich stellen die 5'-ESTs 5 oder mehr
der Zahl der Nukleinsäureinserts
in einer Population von Nukleinsäurerückgratmolekülen dar,
um als „angereichert" zu gelten. Rückgratmoleküle der vorliegenden
Erfindung umfassen Nukleinsäuren,
wie beispielsweise Expressionsvektoren, selbstreplizierende Nukleinsäuren, Viren,
integrierende Nukleinsäuren
und andere Vektoren oder Nukleinsäuren, die verwendet werden,
um ein Nukleinsäureinsert
von Interesse zu erhalten oder zu manipulieren. Vorzugsweise stellen
die angereicherten 5'-ESTs
15% oder mehr der Zahl an Nukleinsäureinserts in der Population
rekombinanter Rückgratmoleküle dar.
Stärker
bevorzugt stellen die angereicherten 5'-ESTs 50 oder mehr der Zahl an Nukleinsäureinserts
in der Population rekombinanter Rückgratmoleküle dar. In einer stark bevorzugten
Ausführungsform
stellen die angereicherten 5'-ESTs 90%
oder mehr der Zahl an Nukleinsäureinserts
in der Population rekombinanter Rückgratmoleküle dar.
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„Stringente", „moderate" und „schwache" Hybridisierungsbedingungen
sind wie in Beispiel 29 bestimmt.
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Soweit
nicht anders angegeben, ist eine „komplementäre" Sequenz vollständig komplementär.
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Daher
sind 5'-ESTs in
cDNA-Bibliotheken, in welchen ein oder mehrere 5'- ESTs
5% oder mehr der Zahl an Nukleinsäureinserts in den Rückgratmolekülen ausmachen, „angereicherte
rekombinante 5'-ESTs", wie hierin bestimmt.
Ebenso sind 5'-ESTs
in einer Population von Plasmiden, in denen eines oder mehrere erfindungsgemäße 5'-ESTs insertiert
worden sind, so dass sie 5% oder mehr der Zahl an Inserts im Plasmidrückgrat darstellen, „angereicherte
rekombinante 5'-ESTs", wie hierin bestimmt.
Jedoch sind 5'-ESTs
in cDNA-Bibliotheken, in welchen 5'-ESTs weniger als 5% der Zahl an Nukleinsäureinserts
in der Population an Rückgratmolekülen ausmachen,
wie beispielsweise Bibliotheken, in welchen Rückgratmoleküle mit 5'-EST selten sind, keine „angereicherten
rekombinanten 5'-ESTs".
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Die
vorliegende Erfindung betrifft insbesondere 5'-ESTs, die aus Genen abgeleitet wurden,
die sekretierte Proteine kodieren. Wie hierin verwendet, ist ein „sekretiertes" Protein ein Protein,
das, wenn es in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert wird, über oder
durch eine Membran transportiert wird, wobei der Transport als Ergebnis
von Signalpeptiden in der Aminosäuresequenz
des Proteins umfasst ist. „Sekretierte" Proteine umfassen
ohne Beschränkung
Proteine, die vollständig
(z.B. lösliche
Proteine) oder teilweise (z.B. Rezeptoren) aus der Zelle, in der
sie exprimiert werden, sekretiert werden. „Sekretierte" Proteine umfassen
auch ohne Einschränkung
Proteine, die über
die Membran des endoplasmatischen Retikulums hinweg transportiert
werden.
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Derartige
5'-ESTs umfassen
Nukleinsäuresequenzen,
die Signalsequenzen genannt werden, die Signalpeptide kodieren,
die die extrazelluläre
Sekretion von Proteinen lenken, die durch Gene kodiert werden, die von
den 5'-ESTs abgeleitet
sind. Im Allgemeinen sind die Signalpeptide an den Aminotermini
sekretierter Proteine lokalisiert.
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Sekretierte
Proteine werden durch Ribosomen, die mit dem „rauhen" endoplasmatischen Retikulum verbunden
sind, translatiert. Im Allgemeinen werden sekretierte Proteine kotranslational
zur Membran des endoplasmatischen Retikulums überführt. Die Verbindung des Ribosoms
mit dem endoplasmatischen Retikulum während der Translation sekretierter
Proteine wird durch das Signalpeptid vermittelt. Das Signalpeptid
wird typischerweise nach seinem kotranslationalen Eintritt in das
endoplasmatische Retikulum abgespalten. Nach der Abgabe an das endoplasmatische
Retikulum können
sekretierte Proteine den Golgi-Apparat durchlaufen. Im Golgi-Apparat
können
die Proteine posttranslationalen Modifizierungen unterzogen werden,
bevor sie in sekretorische Vesikel eintreten, die sie über die
Zellmembran hinweg transportieren.
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Die
hierin beschriebenen 5'-ESTs
weisen einige wichtige Anwendungen auf. Zum Beispiel können sie verwendet
werden, um cDNA-Klone zu erhalten und zu exprimieren, die die vollständigen proteinkodierenden Sequenzen
der korrespondierenden Genprodukte umfassen, einschließlich der
authentischen Translationsstartstellen, die aus den 5'-Enden der kodierenden
mRNA-Sequenzen abgeleitet sind, aus denen die 5'-ESTs abgeleitet sind. Diese cDNAs werden
im Folgenden als „Volllängen-cDNAs" bezeichnet. Diese
cDNAs können auch
DNA umfassen, die aus mRNA-Sequenzen, die stromaufwärts zur
Translationsstartstelle liegen, abgeleitet sind. Die Volllängen-cDNA-Sequenzen
können
verwendet werden, um die Proteine zu exprimieren, die mit den 5'-ESTs korrespondieren.
Wie oben diskutiert, sind sekretierte Proteine therapeutisch wichtig.
Daher können
die Proteine, die aus den cDNAs exprimiert werden, bei der Behandlung
oder bei der Kontrolle einer Vielfalt von humanen Zuständen nützlich sein.
Die 5'-ESTs können auch
verwendet werden, um die korrespondierende genomische DNA zu erhalten.
Der Ausdruck „korrespondierende
genomische DNA" betrifft
die genomische DNA, die die mRNA kodiert, aus der das 5'-EST abgeleitet wurde.
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Alternativ
können
die 5'-ESTs verwendet
werden, um erweiterte cDNAs, die Abschnitte des sekretierten Proteins
kodieren, zu erhalten und zu exprimieren. Die Abschnitte können die
Signalpeptide der sekretierten Proteine oder die reifen Proteine,
die erzeugt werden, wenn das Signalpeptid abgespalten wird, umfassen. Die
Abschnitte können
auch Polypeptide mit wenigstens 10 aufeinander folgenden Aminosäuren, die
durch die erweiterten cDNAs oder Volllängen-cDNAs kodiert werden,
umfassen. Alternativ können
die Abschnitte wenigstens 15 aufeinander folgende Aminosäuren, die
durch die erweiterten cDNAs oder Volllängen-cDNAs kodiert werden,
umfassen. In einigen Ausführungsformen
können
die Abschnitte wenigstens 25 aufeinander folgende Aminosäuren, die
durch die erweiterten cDNAs oder Volllängen-cDNAs kodiert werden,
umfassen. In anderen Ausführungsformen
können
die Abschnitte wenigstens 40 Aminosäuren, die durch die erweiterten
cDNAs oder Volllängen-cDNAs
kodiert werden, umfassen.
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Antikörper, die
die vollständigen
sekretierten Proteine, die durch die erweiterten cDNAs oder Volllängen-cDNAs
oder Fragmente davon mit wenigstens 10 aufeinander folgenden Aminosäuren, mit
wenigstens 15 aufeinander folgenden Aminosäuren, mit wenigstens 25 aufeinander
folgenden Aminosäuren
oder mit wenigstens 40 aufeinander folgenden Aminosäuren, kodiert
werden, spezifisch erkennen, können
ebenfalls erhalten werden, wie es weiter unten beschrieben wird.
Antikörper,
die spezifisch das reife Protein erkennen, das erzeugt wird, wenn
das Signalpeptid abgespalten wird, können ebenfalls erhalten werden,
wie es weiter unten beschrieben wird. In ähnlicher Weise können auch
Antikörper,
die spezifisch die Signalpeptide erkennen, die durch die erweiterten
cDNAs oder Volllängen-cDNAs
kodiert werden, erhalten werden.
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In
einigen Ausführungsformen
umfassen die erweiterten cDNAs, die unter Verwendung der 5'-ESTs erhalten wurden,
die Signalsequenz. In anderen Ausführungsformen können die
erweiterten cDNAs, die unter Verwendung der 5'-ESTs
erhalten wurden, die vollständige
kodierende Sequenz für
das reife Protein umfassen (d.h. das Protein, das erzeugt wird,
wenn das Signalpolypeptid abgespalten wird). Darüber hinaus können die erweiterten
cDNAs, die unter Verwendung der 5'-ESTs erhalten wurden, regulatorische
Regionen umfassen, die stromaufwärts
der Translationsstartstelle oder stromabwärts des Stoppkodons liegen
und die die Menge, Lokalisierung oder das Entwicklungsstadium der
Genexpression lenken.
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Wie
oben diskutiert, sind sekretierte Proteine therapeutisch wichtig.
Daher können
die Proteine, die von den erweiterten cDNAs oder Volllängen-cDNAs,
die unter Verwendung der 5'-ESTs
erhalten wurden, exprimiert werden, bei der Behandlung oder Kontrolle
einer Vielfalt von humanen Zuständen
nützlich
sein.
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Die
5'-ESTs (oder cDNAs
oder genomische DNAs, die davon erhalten wurden) können in
forensischen Verfahren eingesetzt werden, um Personen zu identifizieren,
oder in diagnostischen Verfahren, um Personen mit genetischen Erkrankungen
zu identifizieren, die aus einer abnormalen Expression der Gene
herrühren,
die mit den 5'-ESTs
korrespondieren. Darüber
hinaus ist die vorliegende Erfindung bei der Erstellung einer hochaufgelösten Karte
der menschlichen Chromosomen nützlich.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren zur Sekretion, die
in der Lage sind, die Sekretion eines Proteins von Interesse zu
lenken. Solche Vektoren können
in Strategien zur Gentherapie verwendet werden, in welchen es wünschenswert
ist, ein Genprodukt in einer Zelle zu erzeugen, das an eine andere
Stelle im Körper
abgegeben werden soll. Vektoren zur Sekretion können auch die Reinigung von
gewünschten
Proteinen erleichtern.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Vektoren zur Expression, die
in der Lage sind, die Expression eines insertierten Gens in einer
gewünschten
räumlichen
oder temporären
Weise oder in einem gewünschten Maß zu lenken.
Solche Vektoren können
Sequenzen umfassen, die stromaufwärts von den 5'-ESTs liegen, wie beispielsweise Promotoren
oder stromaufwärts
liegende regulatorische Sequenzen.
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Schließlich kann
die vorliegende Erfindung auch zur Gentherapie verwendet werden,
um genetische Erkrankungen zu kontrollieren oder zu behandeln. Signalpeptide
können
mit heterologen Proteinen fusioniert werden, um deren extrazelluläre Sekretion
zu lenken.
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Bakterienklone,
die Bluescript-Plasmide mit Inserts enthalten, die das 5'-EST gemäß SEQ ID No: 38 aufweisen,
werden gegenwärtig
bei 80°C
in 4% (v/v) Glycerin in den Laboratorien des Erfinders unter den
Bezeichnungen gelagert, die neben der SEQ ID No aufgeführt sind.
Die Inserts können
aus den hinterlegten Materialien durch Anzucht der entsprechenden
Klone in einem geeigneten Medium gewonnen werden. Anschließend kann
die Bluescript-DNA unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren
zur Plasmidisolierung, wie beispielsweise alkalische Lyse von Minipreps
oder alkalische Lyse im Großmaßstab als
Verfahren zur Plasmidisolierung, isoliert werden. Wenn gewünscht, kann
die Plasmid-DNA mittels Zentrifugation auf einem Cäsiumchloridgradienten,
Größenausschlusschromatografie
oder Anionenaustauschchromatografie weiter angereichert werden.
Die unter Verwendung dieser Verfahren erhaltene Plasmid-DNA kann
anschließend unter
Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardklonierungstechniken
manipuliert werden. Alternativ kann eine PCR mit Primern, die hinsichtlich
beider Enden der EST-Insertion konzipiert sind, durchgeführt werden.
Das mit dem 5'-EST
korrespondierende PCR-Produkt kann anschließend unter Verwendung von dem Fachmann
vertrauten Standardklonierungstechniken manipuliert werden.
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Signalpeptid mit der Sequenz
der Aminosäuren –17 bis –1 gemäß SEQ ID
No: 39.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Signalsequenz,
die ein erfindungsgemäßes Signalpeptid
kodiert. Vorzugsweise weist die Signalsequenz die Sequenz der Nukleotide
232 bis 282 gemäß SEQ ID
No: 38 auf.
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Ein
noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine gereinigte
und isolierte Nukleinsäure,
die eine erfindungsgemäße Signalsequenz
umfasst, die operativ mit einer Nukleinsäuresequenz verknüpft ist,
die ein Protein kodiert, für
das Sekretion erwünscht
ist.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der eine
erfindungsgemäße Signalsequenz
umfasst, die operativ mit einem Promotor verknüpft ist. Ferner umfasst der
Vektor vorzugsweise Klonierungsstellen. Vorzugsweise umfasst der
Vektor ferner eine Nukleinsäuresequenz,
die ein Protein kodiert, für das
Sekretion erwünscht
ist und welche im Leserahmen mit der Signalsequenz insertiert ist.
Vorzugsweise ist der Vektor ein Vektor zur Sekretion oder ein Vektor
zur Gentherapie.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Fusionsprotein,
das durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder
einen erfindungsgemäßen Vektor
kodiert wird, umfassend das erfindungsgemäße Signalpeptid.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des
erfindungsgemäßen Signalpeptids
oder des erfindungsgemäßen Vektors
zum Lenken der extrazellulären
Sekretion eines Polypeptids oder zur Vereinfachung der Proteinreinigung
eines gewünschten
Polypeptids. Vorzugsweise ist das Polypeptid ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung eines sekretierten Proteins, umfassend den Schritt des
Insertierens eines Gens, das ein nicht sekretiertes Protein kodiert,
im Leserahmen mit einer erfindungsgemäßen Signalsequenz in einen
Vektor, so dass das Protein, das durch das insertierte Gen kodiert
wird, von der transkribierten mRNA exprimiert wird. Vorzugsweise
umfasst das Verfahren ferner den Schritt: Einführen des Vektors in eine Wirtszelle,
in Gewebe oder einen nicht menschlichen Organismus.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur
Herstellung eines sekretierten Proteins, umfassend den Schritt:
Einführen
eines erfindungsgemäßen Vektors
in eine Wirtszelle, in Gewebe oder in einen nicht menschlichen Organismus.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren ferner den Schritt:
Isolierung des sekretierten Proteins. Vorzugsweise umfasst der Schritt
zur Isolierung des sekretierten Proteins die Reinigung des sekretierten
Proteins aus dem Überstand.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1 stellt
eine Zusammenfassung eines Verfahrens zum Erlangen von cDNAs dar,
die daraufhin ausgewählt
wurden, dass sie die 5'-Enden
der mRNAs enthalten, von denen sie abgeleitet wurden.
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2 zeigt
die Verteilung von Von Heijne Scores für 5'-ESTs in jeder der hierin beschriebenen
Kategorien und die Wahrscheinlichkeit, dass diese 5'-ESTs ein Signalpeptid
kodieren.
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3 fasst
ein allgemeines Verfahren zusammen, das verwendet wird, um erweiterte
cDNAs, die Sequenzen enthalten, die zu 5'-ESTs benachbart sind, zu klonieren
und zu sequenzieren.
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4 (Beschreibung
von Promotorstrukturen, isoliert aus Signal-Tag 5'-ESTs) stellt eine schematische Beschreibung
von isolierten Promotoren bereit und die Art und Weise, wie sie
mit den korrespondierten 5'-Tags
zusammengesetzt sind.
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Ausführliche Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsform
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Tabelle
IV zeigt eine Analyse der 43 Aminosäuren, die am N-Terminus aller
menschlicher SwissProt Proteine lokalisiert sind, um die Häufigkeit
Falsch-positiver oder Falsch-negativer unter Verwendung von hierin beschriebenen
Techniken zur Signalpeptididentifizierung zu bestimmen.
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Tabelle
V zeigt die Verteilung von 5'-ESTs
in jeder hierin beschriebenen Kategorie und die Zahl von 5'-ESTs in jeder Kategorie
mit einem gegebenen Mindest-Von Heijnes Score.
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Tabelle
VI zeigt die Verteilung von 5'-ESTs
in jeder hierin beschriebenen Kategorie hinsichtlich des Gewebes,
aus dem die 5'-ESTs
der korrespondierenden mRNA erhalten wurden.
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Tabelle
VII beschreibt die Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, die in
jedem dieser Promotoren vorliegen.
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I. Allgemeine Verfahren
zum Erlangen von 5'-ESTs,
die aus mRNAs mit intakten 5'-Enden
abgeleitet sind
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Um
die hierin beschriebenen 5'-ESTs
zu erhalten, müssen
mRNAs mit intakten 5'-Enden
erhalten werden. Gegenwärtig
gibt es zwei Ansätze
zum Erhalt solcher mRNAs mit intakten 5'-Enden, wie sie weiter unten beschrieben
werden: Entweder chemisch (1) oder enzymatisch (2).
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1. Chemische Verfahren
zum Erlangen von mRNAs mit intakten 5'-Enden
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Einer
dieser Ansätze
ist ein chemisches Modifikationsverfahren, das die Derivatisierung
der mRNA 5'-Enden
und die Selektion der derivatisierten mRNAs umfasst. Die 5'-Enden eukaryotischer
mRNAs weisen eine Struktur auf, die als „Cap" bezeichnet wird, das an Position 7
ein methyliertes Guanosin besitzt. Dieses Cap wird an die erste
transkribierte Base der mRNA durch eine 5',5'-Triphosphatbindung
angefügt.
In einigen Beispielen ist das 5'-Guanosin
sowohl an Position 2 als auch Position 7 methyliert. In seltenen
Fällen
ist das 5'-Guanosin
an den Positionen 2, 7 und 7 trimethyliert. Beim chemischen Verfahren
zum Erlangen von mRNAs mit intakten 5'-Enden wird das 5'-Cap spezifisch derivatisiert und an
eine reaktive Gruppe auf einem immobilisierten Träger gekoppelt.
Diese spezifische Derivatisierung basiert auf der Tatsache, dass
nur die Ribose, die mit dem methylierten Guanosin am 5'-Ende der mRNA verknüpft ist,
und die Ribose, die mit der Base am 3'-Terminus der mRNA verknüpft ist,
2',3'-cis-Diole besitzen.
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Gegebenenfalls
kann das 2',3'-cis-Diol der 3'-terminalen Ribose
chemisch modifiziert, substituiert, umgewandelt oder entfernt werden,
wobei nur die Ribose, die mit dem methylierten Guanosin am 5'-Ende der mRNA mit
einem 2',3'-cis-Diol verknüpft ist,
zurückbleit.
Eine Vielfalt an Techniken zur Entfernung des 2',3'-cis-Diols an der 3'-terminalen Ribose
stehen zur Verfügung.
Beispielsweise kann kontrollierte alkalische Hydrolyse verwendet
werden, um mRNA-Fragmente zu erzeugen, in welchen die 3'-terminale Ribose
ein 3'-Phosphat,
ein 2'-Phosphat
oder ein (2'-3')-Cyclophosphat ist.
Anschließend
kann das Fragment, das die ursprüngliche
3'-Ribose umfasst,
durch Chromatografie an einer Oligo-dT-Säule aus dem Gemisch entfernt
werden. Alternativ kann eine Base, die kein 2',3'-cis-Diol aufweist, unter
Verwendung einer RNA-Ligase, wie beispielsweise T4-RNA-Ligase, an das 3'-Ende der mRNA angefügt werden.
Beispiel 1 beschreibt weiter unten ein Verfahren zur Ligation eines
Nukleosiddiphosphats an das 3'-Ende
von Boten-RNA.
-
BEISPIEL 1
-
Ligation des Nukleosiddiphosphats
pCp an das mRNA 3'-Ende
-
Ein μg RNA wurde
in einem Reaktionsmedium von insgesamt 10 μl in Gegenwart von 5 U T4 Phagen-RNA-Ligase in dem vom Hersteller
bereitgestellten Puffer (Gibco-BRL), 40 U des RNase-Inhibitors RNasin
(Promega) und 2 μl 32pCp (Amersham #PB 10208) inkubiert. Die
Inkubation wurde bei 37°C
für 2 Stunden
oder über
Nacht bei 7-8°C
durchgeführt.
-
Im
Anschluss an die Modifizierung oder Entfernung des 2',3'-cis-Diols an der
3'-Ribose kann das 2',3'-cis-Diol, das am
5'-Ende der mRNA
vorliegt, unter Verwendung von Reagenzien, wie beispielsweise NaBH4, NaBH3CN oder Natriumperjodat,
oxidiert werden, wobei das 2',3'-cis-Diol in einen
Dialdehyd umgewandelt wird. Beispiel 2 beschreibt die Oxidation
des 2',3'-cis-Diols am 5'-Ende der mRNA mit Natriumperjodat.
-
BEISPIEL 2
-
Oxidation eines 2',3'-cis-Diols am mRNA
5'-Ende mit Natriumperjodat
-
0,1
OD-Einheiten des entweder mit einem Cap versehenen Oligoribonukleotids
mit 47 Nukleotiden (einschließlich
des Caps) oder eines Oligoribonukleotids mit 46 Nukleotiden ohne
Cap wurden wie im Folgenden beschrieben behandelt. Die Oligoribonukleotide
wurden durch in vitro-Tanskription unter Verwendung des Transkriptionskits „AmpliScribe
T7" (Epicentre Technologies)
hergestellt. Wie unten gezeigt, enthielt die DNA-Matrize für das RNA-Transkript
ein einzelnes Cytosin. Um die RNA ohne Cap zu synthetisieren, nahmen alle
vier NTPs an der in vitro-Transkriptionsreaktion teil. Um die RNA
mit Cap zu erhalten, wurde GTP durch ein Analogon des Caps, m7G(5')ppp(5')G, ersetzt. Diese
von der Polymerase erkannte Verbindung wurde am 5'-Ende des entstehenden
Transkripts während
der Initiation der Transkription eingebaut, wurde aber während des
Verlängerungsschritts
nicht eingebaut. Folglich enthielt die sich ergebende RNA an ihrem
5'-Ende ein Cap. Die
Sequenzen der durch die in vitro-Transkription erzeugten Oligoribonukleotide
waren:
+Cap:
5'm7GpppGCAUCCUACUCCCAUCCAAUUCCACCCUAACUCCUCCCAUCUCCA
C-3' (SEQ ID NO:
1)
–Cap:
5'-pppGCAUCCUACUCCCAUCCAAUUCCACCCUAACUCCUCCCAUCUCCAC-3' (SEQ ID NO: 2)
-
Die
Oligoribonukleotide wurden in 9μl
Acetatpuffer (0,1 M Natriumacetat, pH 5,2) und 3μl frisch hergestelltem 0,1 M
Natriumperjodatlösung
gelöst.
Das Gemisch wurde für
1 Stunde im Dunkeln bei 4°C
oder bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Reaktion durch
Zugabe von 4 μl
10%igem Ethylenglycol gestoppt. Das Produkt wurde mit Ethanol präzipitiert,
in wenigstens 10 μl
Wasser oder einem geeigneten Puffer resuspendiert und gegen Wasser
dialysiert.
-
Die
sich ergebenden Aldehydgruppen können
anschließend
mit Molekülen,
die eine reaktive Amingruppe aufweisen, wie beispielsweise Hydrazin-,
Carbazid-, Thiocarbazid- oder Semicarbazidgruppen, gekoppelt werden,
um die Anreicherung der 5'-Enden
von mRNAs zu erleichtern. Moleküle
mit reaktiven Amingruppen, die zur Verwendung bei der Selektion
von mRNAs mit intakten 5'-Enden geeignet sind,
umfassen Avidin, Proteine, Antikörper,
Vitamine, Liganden, die zur spezifischen Bindung an Rezeptormoleküle fähig sind,
oder Oligonukleotide. Beispiel 3 weiter unten beschreibt die Kopplung
des sich ergebenden Dialdehyds an Biotin.
-
BEISPIEL 3
-
Kopplung des Dialdehyds
am 5'-Ende der Transkripte
mit Biotin
-
Das
in Beispiel 2 erhaltene Oxidationsprodukt wurde in 50 μl Natriumacetat
bei einem pH zwischen 5 und 5,2 und 50 μl frisch hergestellter 0,02
M Lösung
von Biotinhydrazid in einem Methoxyethanol/Wassergemisch (1:1) der
Formel
gelöst.
-
In
der in diesen Experimenten verwendeten Verbindung ist n = 5. Jedoch
wird erkannt, dass auch andere, kommerziell erhältliche Hydrazide verwendet
werden können,
wie beispielsweise Moleküle
der obigen Formel, in denen n zwischen 0 und 5 variiert. Das Gemisch
wurde anschließend
für 2 Stunden
bei 37°C
inkubiert, mit Ethanol präzipitiert
und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Beispiel 4 zeigt die
Spezifität
der Biotinylierungsreaktion.
-
BEISPIEL 4
-
Spezifität der Biotinylierung
von Transkripten mit Caps
-
Die
Spezifität
der Biotinylierung für
mRNAs mit Caps wurde durch Gelelektrophorese der im Folgenden beschriebenen
Proben beurteilt:
- Probe 1. Das in vitro-Transkript mit 46
Nukleotiden und ohne Cap, das wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde,
und mit 32pCp markiert ist, wie es in Bespiel
1 beschrieben wird.
- Probe 2. Das in vitro-Transkript mit 46 Nukleotiden und ohne
Cap, das wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, mit 32pCp markiert ist, wie es in Beispiel 1
beschrieben wird, und in einer Oxidationsreaktion gemäß Beispiel
2 umgesetzt und den Biotinylierungsbedingungen gemäß Beispiel
3 unterzogen wurde.
- Probe 3. Das in vitro-Transkript mit 47 Nukleotiden und Cap,
das wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt wurde, und mit 32pCp markiert ist, wie es in Beispiel 1
beschrieben wird.
- Probe 4. Das in vitro-Transkript mit 47 Nukleotiden und Cap,
wie in Beispiel 2 beschrieben, mit 32pCp
markiert, wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt mit der Oxidationsreaktion
aus Beispiel 2 und den Biotinylierungsbedingungen aus Beispiel 3
unterzogen.
-
Die
Proben 1 und 2 zeigten identische Wandergeschwindigkeiten, was zeigt,
dass RNAs ohne Cap nicht oxidiert und biotinyliert wurden. Probe
3 wanderte langsamer als die Proben 1 und 2, während Probe 4 die langsamste
Wanderung zeigte. Der Unterschied bezüglich der RNA-Wanderung in
den Proben 3 und 4 zeigt, dass die RNAs mit Cap spezifisch biotinyliert
wurden.
-
In
einigen Fällen
können
mRNAs mit intakten 5'-Enden
durch Binden des Moleküls,
das eine reaktive Aminogruppe enthält, an einen geeigneten Festphasenträger, wie
beispielsweise die Innenseite des Gefäßes, das die mRNAs enthält, magnetische
Beads, chromatografische Matrizen oder Nylon- oder Nitrozellulosemembranen
angereichert werden. Beispielsweise kann, wenn das Molekül mit reaktiver
Amingruppe Biotin ist, der Festphasenträger an Avidin oder Streptavidin
gekoppelt werden. Alternativ kann, wenn das Molekül mit der reaktiven
Amingruppe ein Antikörper
oder ein Rezeptorligand ist, der Festphasenträger an das verwandte Antigen
oder den verwandten Rezeptor gekoppelt werden. Schließlich kann
der Festphasenträger
ein komplementäres
Oligonukleotid umfassen, wenn das Molekül mit reaktiver Amingruppe
ein Oligonukleotid umfasst.
-
Die
mRNAs mit intakten 5'-Enden
können
im Anschluss an das Anreicherungsverfahren von der Festphase freigesetzt
werden. Beispielsweise können
die mRNAs von der Festphase durch einfaches Erhitzen auf 95°C in 2% SDS
freigesetzt werden, wenn der Dialdehyd an Biotinhydrazid gekoppelt
ist und die Festphase Streptavidin umfasst. In einigen Verfahren
kann das Molekül
mit reaktiver Amingruppe im Anschluss an die Anreicherung auch von
dem mRNAs mit intakten 5'-Enden
abgespalten werden. Beispiel 5 beschreibt das Einfangen biotinylierter
mRNA mit streptavidinbeschichteten Beads und die Freisetzung der
biotinylierten mRNAs von den Beads nach der Anreicherung.
-
BEISPIEL 5
-
Einfangen und Freisetzung
biotinylierter mRNAs unter Verwendung stregtavidinbeschichteter
Beads
-
Die
streptavidinbeschichteten magnetischen Beads wurden gemäß den Herstellerangaben
(CPG Inc., USA) hergestellt. Die biotinylierten mRNAs wurden einem
Hybridisierungspuffer zugegeben (1,5 M NaCl, pH 5-6). Nach Inkubation
für 30
Minuten wurde das ungebundene und nicht biotinylierte Material entfernt.
Die Beads wurden einige Male in Wasser mit 1% SDS gewaschen. Die
so erhaltenen Beads wurden bei 95°C
für 15 Minuten
in Wasser, das 2% SDS enthielt, inkubiert. Beispiel 6 zeigt die
Effizienz mit der biotinylierte mRNAs von den streptavidinbeschichteten
Beads gewonnen wurden.
-
BEISPIEL 6
-
Effizienz
der Gewinnung biotinylierter mRNAs
-
Die
Effizienz des Gewinnungsverfahrens wurde wie folgt beurteilt. Wie
oben beschrieben, wurden RNAs mit Cap mit 32pCp
markiert, oxidiert, biotinyliert und an streptavidinbeschichtete
Beats gebunden. Anschließend
wurden die gebundenen RNAs für
5, 15 oder 30 Minuten bei 95°C
in Gegenwart von 2% SDS inkubiert.
-
Die
Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese auf 12%igen Polyaclamidgelen
unter denaturierenden Bedingungen (7 M Harnstoff) analysiert. Die
Gele wurden Autoradiografie unterzogen. Während dieser Manipulation wurden
die Hydrazonbindungen nicht reduziert.
-
Sobald
die Inkubationszeiten in 2% SDS anstiegen, wurden steigende Mengen
an Nukleinsäuren
gewonnen, was zeigt, dass biotinylierte mRNAs effizient gewonnen
wurden.
-
In
einem alternativen Verfahren zum Erlangen von mRNAs mit intakten
5'-Enden wurde ein Oligonukleotid,
das derivatisiert worden war, um eine reaktive Amingruppen zu erhalten,
spezifisch an mRNAs mit einem intakten Cap gekoppelt. Vorzugsweise
wird das 3'-Ende
der mRNA vor dem Schritt, bei welchem die Aldehydgruppen mit dem
derivatisierten Oligonukleotid verbunden werden, wie oben beschrieben
blockiert, um so zu verhindern, dass das derivatisierte Oligonukleotid
mit dem mRNA 3'-Ende
verbunden wird. Beispielsweise kann pCp unter Verwendung von T4
RNA-Ligasen am mRNA 3'-Ende,
wie in Beispiel 1 beschrieben wird, angebracht werden. Wie oben
diskutiert, ist die Blockierung des mRNA 3'-Endes jedoch ein optionaler Schritt. Derivatisierte
Oligonukleotide können,
wie in Beispiel 7 beschrieben, hergestellt werden.
-
BEISPIEL 7
-
Derivatisierung von Oligonukleotiden
-
Ein
am 3'-Ende phosphoryliertes
Oligonukleotid wurde durch Behandlung mit einer wässrigen
Hydrazinlösung
oder einer Dihydrazidlösung
der Formel H2N(R1)NH2 bei
etwa 1 bis 3 M und bei pH 4,5 bei einer Temperatur von 8°C über Nacht
in ein 3'-Hydrazid
in 3' umgewandelt.
Die Inkubation wurde in Gegenwart eines wasserlöslichen Mittels vom Carbodiimidtyp
bei einer Endkonzentration von 0,3 M durchgeführt, wie beispielsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimid.
-
Das
derivatisierte Oligonukleotid wurde anschließend von den anderen Mitteln
und Produkten unter Verwendung von Standardtechniken zur Isolierung
von Oligonukleotiden abgetrennt.
-
Wie
oben diskutiert, können
die mRNAs zur Anreicherung behandelt werden, um die 3'-OH-Gruppen zu entfernen,
die daran vorliegen können.
Dies kann durch enzymatische Ligation von Sequenzen, denen ein 3'-OH fehlt erreicht
werden, wie beispielsweise pCp wie es in Beispiel 1 beschrieben
wird. Alternativ können die
3'-OH-Gruppen durch
alkalische Hydrolyse entfernt werden, wie es in Beispiel 8 weiter
unten beschrieben wird.
-
BEISPIEL 8
-
Entfernung von mRNA 3'-OH-Gruppen unter
Verwendung alkalischer Hydrolyse
-
In
einem Gesamtvolumen von 100 μl
0,1 N Natriumhydroxid wurden 1,5 μg mRNA
für 40
bis 60 Minuten bei 4°C
inkubiert. Die Lösung
wird mit Essigsäure
neutralisiert und mit Ethanol präzipitiert.
-
Im
Anschluss an die optionale Entfernung der 3'-OH-Gruppen werden die Diolgruppen an
die mRNA 5'-Enden
der mRNAs oxidiert, wie es in Beispiel 9 weiter unten beschrieben
wird.
-
BEISPIEL 9
-
Oxidation von mRNA Diolen
-
Bis
zu 1 OD-Einheit RNA wurde in 9 μl
Puffer (0,1 M Natriumacetat, pH 6-7) oder in Wasser und 3μl frisch
hergestellter 0,1 M Natriumperjodatlösung gelöst. Die Reaktion wurde für 1 h in
der Dunkelheit bei 4°C oder
bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurde
die Reaktion durch Zugabe von 4 μl
10% Ethylenglycol gestoppt. Danach wurde das Gemisch für 15 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ethanolpräzipitation wurde das Produkt
in wenigstens 10 μl
Wasser oder einem geeigneten Puffer resuspendiert und gegen Wasser
dialysiert.
-
Im
Anschluss an die Oxidation der Diolgruppen an den mRNA 5'-Enden wurde das
derivatisierte Oligonukleotid mit den sich ergebenden Aldehyden
verbunden wie es in Beispiel 10 beschrieben wird.
-
BEISPIEL 10
-
Ligation von
mRNA Aldehyden an derivatisierte Oligonukleotide
-
Die
oxidierte mRNA wurde in saurem Medium, wie beispielsweise 50 μl Natriumacetat,
pH 4-6, gelöst. 50 μl einer Lösung des
derivatisierten Oligonukleotids wurde zugegeben, um ein mRNA:derivatisiertes
Oligonukleotidverhältnis
von 1:20 zu erhalten. Das Gemisch wurde mit einem Borhydrid reduziert
und für
2 h bei 37°C
oder über
Nacht (14 h) bei 10°C
inkubiert. Das Gemisch wurde anschließend mit Ethanol präzipitiert,
in 10 μl
oder mehr Wasser oder einem geeigneten Puffer resuspendiert und
gegen destilliertes Wasser dialysiert. Wenn gewünscht, kann das sich ergebende
Produkt unter Verwendung von Acrylamidgelelektrophorese, HPLC-Analyse
oder anderen herkömmlichen
Techniken analysiert werden.
-
Im
Anschluss an das Anbringen des derivatisierten Oligonukleotids an
die mRNAs kann eine reverse Transkriptionsreaktion, wie in Beispiel
11 weiter unten beschrieben, durchgeführt werden.
-
BEISPIEL 11
-
Reverse Transkription
von mRNAs, die an derivatisierte Oligonukleotide ligiert sind
-
Ein
Oligodeoxyribonukleotid wurde wie im Folgenden beschrieben derivatisiert.
Drei OD-Einheiten eines Oligodeoxyribonukleotids der Sequenz 5'ATCAAGAATTCGCACGAGACCA
TTA3' (SEQ ID NO:
3) mit 5'-OH- und
3'-P-Enden wurde in 70 μl 1,5 M Hydroxybenzotriazollösung, pH
5,3, hergestellt in Dimethylformamid/Wasser (75:25), das 2 μg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)
carbodiimid enthielt, gelöst.
Das Gemisch wurde für
2 h 30 min bei 22°C
inkubiert und anschließend
zweimal in LiClO4/Aceton präzipitiert.
Das Pellet wurde in 200 μl
0,25 M Hydrazin resuspendiert und bei 8°C 3 bis 14 h inkubiert. Im Anschluss
an die Hydrazinreaktion wurde das Gemisch zweimal in LiClO4/Aceton präzipitiert.
-
Die
revers zu transkribierenden Boten-mRNAs wurden aus Plazentablöcken mit
Seitenlängen
von 2 cm extrahiert, die bei –80°C gelagert
worden waren. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung herkömmlicher
Techniken auf Grundlage von sauerem Phenol extrahiert. Oligo-dT-Chromatografie
wurde eingesetzt um die mRNAs zu reinigen. Die Integrität der mRNAs
wurde durch Northern-Blot überprüft.
-
Die
Diolgruppen von 7 μg
der Plazenta mRNAs wurden, wie oben in Beispiel 9 beschrieben, oxidiert. Das
derivatisierte Oligonukleotid wurde, wie in Beispiel 10 oben beschrieben,
mit den mRNAs verbunden mit der Ausnahme, dass der Präzipitierungsschritt
durch einen Ausschlusschromatografieschritt ersetzt wurde, um die
derivatisierten Oligodeoxyribonukleotide, die nicht mit mRNAs verbunden
worden waren, zu entfernen. Die Ausschlusschromatografie wurde wie
folgt durchgeführt:
Zehn
ml Ultrogel AcA34 (BioSepra#230151) Gel, ein Gemisch aus Agarose
und Acrylamid, wurde in 50 ml einer Lösung aus 10 mM Tris, pH 8,0,
300 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,05% SDS equilibriert. Man ließ sich das Gemisch
absetzen. Der Überstand
wurde entfernt und das Gel wurde in 50 ml Puffer resuspendiert.
Dieses Verfahren wurde 2 oder 3 Mal wiederholt.
-
Ein
Glaskügelchen
(Durchmesser 3 mm) wurde in eine 2 ml Einwegpipette (Länge 25 cm)
eingeführt. Die
Pipette wurde mit der Gelsuspension befüllt, bis sich die Höhe des Gels
bei 1 cm vom oberen Ende der Pipette aus stabilisierte. Die Säule wurde
anschließend
mit 20 ml des Equilibrierungspuffers (10 mM Tris HCl pH 7,4, 20
mM NaCl) equilibriert.
-
Zehn μl der mRNA,
die mit dem derivatisierten Oligonukleotid umgesetzt worden waren,
wurden in 39 μl
10 mM Harnstoff und 2 μl
Glycerin-blau Puffer gemischt, wobei der Glycerin-blau Puffer durch
Auflösen
von 5 mg Bromphenolblau in 60% Glycerin (v/v) und Leiten des Gemischs über einen
Filter mit 0,45 μm
Durchmesser hergestellt worden waren.
-
Anschließend wurde
die Säule
mit Oligonukleotid gekoppelten mRNAs beladen. Sobald diese eingedrungen
waren, wurde Equilibrierungspuffer zugegeben. Anschließend wurden
hundert μl
Fraktionen gesammelt. Derivatisierte Oligonukleotide, die nicht
an mRNA angebracht worden waren, traten in Fraktion 16 und späteren Fraktionen
auf. Die Fraktionen 3 bis 15 wurden deshalb vereinigt und mit Ethanol
präzipitiert.
-
Um
zu bestimmen, ob das derivatisierte Oligonukleotid tatsächlich mit
mRNA verknüpft
war, wurde ein Zehntel der vereinigten Fraktionen zweifach auf einer
Nylonmembran aufgetragen und unter Verwendung herkömmlicher
Techniken mit einer radioaktiven Sonde hybridisiert. Die bei diesen
Hybridisierungen eingesetzte 32P markierte
Sonde war ein Oligodeoxyribonukleotid der Sequenz 5'TAATGGTCTCGT GCGAATTCTTGAT3' (SEQ ID NO: 4),
das sich zum derivatisierten Oligonukleotid antikomplementär verhielt.
Ein nach Audioradiografie beobachtetes Signal zeigte, dass das derivatisierte
Oligonukleotid tatsächlich
mit der mRNA verbunden worden war.
-
Die
verbleibenden neun Zehntel der mRNAs, die mit dem derivatisierten
Oligonukleotid reagiert hatten, wurden wie im Folgenden beschrieben,
revers transkribiert. Eine reverse Transkription wurden mit Reverser
Transkriptase nach den Anweisungen des Herstellers und 50 pmol Nonameren
mit willkürlichen
Sequenzen als Primern durchgeführt.
-
Um
sicher zu stellen, dass die reverse Transkription über die
Capstruktur hinweg ausgeführt
wurde, wurden zwei Arten von Experimenten durchgeführt.
-
Im
ersten Ansatz wurde nach der durch alkalische Hydrolyse erreichten
Entfernung der RNA aus den cDNA:RNA-Heteroduplexen, die aus der
reversen Transkriptionsreaktion erhalten worden waren, ein Teil
der sich ergebenden einzelsträngigen
cDNAs auf einer positiv geladenen Membran aufgetragen und unter
Verwendung herkömmlicher
Verfahren an eine 32P markierte Sonde mit
identischer Sequenz zu der des derivatisierten Oligonukleotids hybridisiert.
Kontrollspots, die 1 pmol, 100 fmol, 50 fmol, 10 fmol und 1 fmol
eines Kontrolloligodeoxyribonukleotids mit einer Sequenz, die zu
der des derivatisierten Oligonukleotids identisch war, enthielten,
waren ebenfalls umfasst. Die von den cDNA enthaltenden Spots erhaltenen
Signale zeigten, dass etwa 15 fmol des derivatisierten Oligonukleotids
revers transkribiert worden waren. Diese Ergebnisse zeigen, dass
die reverse Transkription über
ein Cap hinweg durchgeführt
werden kann und sie zeigen insbesondere, dass Reverse Transkriptase
die 5'-P-P-P-5'-Bindung des Caps
eukaryotischer Boten-RNAs überquert.
-
Im
zweiten Typ von Experiment wurden die einzelsträngigen cDNAs, die aus der obigen
Erststrangsynthese erhalten worden waren, als Matrize für PCR-Reaktionen verwendet.
Zwei Reaktionstypen wurden ausgeführt. Als erstes wurde eine
spezifische Amplifikation der mRNAs für Alphaglobin, Dehydrogenase, pp15
und Elongationsfaktor E4 unter Verwendung der folgenden Paare an
Oligodeoxyribonukleotid-Primern durchgeführt.
-
Alphaglobin
-
- GLO-S: 5'CCG
ACA AGA CCA ACG TCA AGG CCG C3' (SEQ
ID NO:5)
- GLO-As: 5'TCA
CCA GCA GGC AGT GGC TTA GGA G 3' (SEQ
ID NO:6)
-
Dehydrogenase
-
- 3 DH-S: 5'AGT
GAT TCC TGC TAC TTT GGλ TGG
C3' (SEQ ID NO:7)
- 3 DH-As: 5'GCT
TGG TCT TGT TCT GGA GTT TAG A3' (SEQ
ID NQ:8)
-
pp15
-
- PP 15-S: 5'TCC
AGA ATG GGA GAC AAG CCA ATT T3' (SEQ
ID NO:9)
- PP 15-s: 5'AGG
GAG GAG GAA ACA GCG TGA GTC C3' (SEQ
ID NO:10)
-
Elongationsfaktor E4
-
- EFA1-S: 5'ATG
GGA AAG GAA AAG ACT CAT ATC ATC A3 (SEQ ID NO:11)
- EF1A-As: 5'AGC
AGC AAC AAT CAG GAC AGC ACA G3' (SEQ
ID NO:12)
-
Als
zweites wurden unspezifische Amplifikationen mit den Antisense Oligodeoxyribonukleotiden
der oben beschriebenen Paare und einem Primer, der aus der Sequenz
des derivatisierten Oligodeoxyribonukleotids (5'-ATCAAGAATTCGCACGAGACCATTA-3' (SEQ ID NO: 13)
abgeleitet worden war, durchgeführt.
-
Ein
Zwanzigstel der folgenden RT-PCR-Produktproben wurden auf einem
1,5% Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt.
- Probe
1: Die Produkte einer PCR-Reaktion unter Verwendung der Globinprimer
gemäß SEQ ID
NO: 5 und 6 in Gegenwart von cDNA.
- Probe 2: Die Produkte einer PCR-Reaktion unter Verwendung der
Globinprimer gemäß SEQ ID
NO: 5 und 6 in Abwesenheit zugegebener cDNA.
- Probe 3: Die Produkte einer PCR-Reaktion unter Verwendung der
Dehydrogenase-Primer gemäß SEQ ID
NO: 7 und 8 in Gegenwart von cDNA.
- Probe 4: Die Produkte einer PCR-Reaktion unter Verwendung der
Dehydrogenase-Primer gemäß SEQ ID
NO: 7 und 8 in Abwesenheit zugegebener cDNA.
- Probe 5: Die Produkte einer PCR-Reaktion unter Verwendung der
pp15-Primer gemäß SEQ ID
NO: 9 und 10 in Gegenwart von cDNA.
- Probe 6: Die Produkte einer PCR-Reaktion unter Verwendung der
pp15-Primer gemäß SEQ ID
NO 9 und 10 in Abwesenheit zugegebener cDNA.
- Probe 7: Die Produkte einer PCR-Reaktion unter Verwendung der
EIF4-Primer gemäß SEQ ID
NO: 11 und 12 in Gegenwart von zugegebener cDNA.
- Probe 8: Die Produkte einer PCR-Reaktion unter Verwendung der
EIF4-Primer gemäß SEQ ID
NO: 11 und 12 in Abwesenheit zugegebener cDNA.
-
Eine
Bande mit der für
das PCR-Produkt erwarteten Größe wurde
nur in den Proben 1, 3, 5 und 7 beobachtet und zeigt somit das Vorliegen
der korrespondierenden Sequenz in der cDNA-Population an.
-
Es
wurden auch PCR-Reaktionen mit den Antisense Oligonukleotiden der
Globin- und Dehydrogenase-Primer (SEQ ID NO: 6 und 8) und einem
Oligonukleotid, dessen Sequenz der des derivatisierten Oligonukleotids
entsprach, durchgeführt.
Das Vorliegen von PCR-Produkten mit der erwarteten Größe in den
Proben, die den obigen Proben 1 und 3 entsprachen, zeigte, dass
das derivatisierte Oligonukleotid mit mRNA verknüpft worden war.
-
Die
obigen Beispiele fassen das chemische Verfahren zur Anreicherung
von mRNAs für
solche mRNAs, die intakte 5'-Enden
aufweisen, zusammen, wie es in 1 dargestellt
ist. Weitere Einzelheiten, die die chemischen Ansätze zum
Erlangen solcher mRNAs betreffen, werden in der internationalen
Anmeldung Nr. WO 96/34981, veröffentlicht
7. November 1996, offenbart. Strategien, die auf den oben beschriebenen
chemischen Modifikationen der 5'-Capstruktur
beruhen, können
verwendet werden, um cDNAs zu erzeugen, die darauf hin selektiert
wurden, dass sie die 5'-Enden
der mRNAs, von denen sie abgeleitet wurden, umfassen. In einer Version
derartiger Verfahren werden die mRNA 5'-Enden wie oben beschrieben modifiziert.
Danach wird eine reverse Transkriptionsreaktion durchgeführt, um
einen Primer, der komplementär
zum mRNA 5'-Ende
ist, zu verlängern.
Einzelsträngige
RNAs werden entfernt, um eine Population von cDNA/mRNA-Heteroduplexen
zu erhalten, in denen die mRNA ein intaktes 5'-Ende umfasst. Die sich ergebenden Heteroduplexe
können
auf einer festen Phase, die mit einem Molekül beschichtet ist, das zur
Wechselwirkung mit dem zur Derivatisierung des mRNA 5'-Endes verwendeten
Moleküls
in der Lage ist, eingefangen werden. Danach werden die Stränge der
Heteroduplexe getrennt, um einzelsträngige Erststrang-cDNAs zu gewinnen,
die das mRNA 5'-Ende
umfassen. Die Zweitstrang-cDNA-Synthese kann anschließend unter
Verwendung herkömmlicher Techniken
fortgeführt
werden. Beispielsweise können
die in WO 96/34981 oder in Carninci et al., Genomics 37:327-336,
1996, offenbarten Verfahren verwendet werden, um cDNAs zu selektieren,
die die Sequenz umfassen, die vom 5'-Ende der kodierenden mRNA Sequenz abgeleitet
ist.
-
Im
Anschluss an die Ligation des Oligonukleotid-Tags an das 5'-Cap der mRNA wird
eine reverse Transkriptionsreaktion ausgeführt, um einen Primer, der zu
der mRNA komplementär
ist, zum 5'-Ende
der mRNA hin zu verlängern.
Im Anschluss an die Entfernung der RNA-Komponente aus dem sich ergebenden
Heteroduplex unter Verwendung von Standardtechniken, wird die cDNA-Zweitstrangsynthese
mit einem Primer durchgeführt,
der komplementär
zum Oligonukleotid-Tag ist.
-
2. Enzymatische Verfahren
zum Erlangen von mRNAs mit intakten 5'-Enden
-
Andere
Techniken zur Selektion von cDNAs, die über das 5'-Ende der mRNA, von der sie abgeleitet sind,
hinaus erweitert sind, sind vollständig enzymatisch. Einige Versionen
dieser Techniken werden in Dumas Milne Edwards J.B. (Doktorarbeit
der Paris VI Universität,
Le clonage des ADNc complets: difficultes et perspectives nouvelles.
Apports pour l'etude
de la regulation des l'expression
de la tryptophane hydroxylase de rat, 20. Dezember 1993),
EP 0,625,572 und Kato et
al., Gene 150:243-250, 1994, offenbart.
-
In
Kürze,
in derartigen Ansätzen
wird isolierte mRNA mit alkalischer Phosphatase behandelt, um die Phosphatgruppen,
die an den 5'-Enden
unvollständiger
mRNAs ohne Cap vorliegen, zu entfernen. Im Anschluss an dieses Verfahren
wird das bei Volllängen-mRNAs
vorliegende Cap mit einem Cap entfernendem Enzym, wie beispielsweise
T4-Polynukleotidgenase oder Tabaksäure-Pyrophosphatase enzymatisch
entfernt. Ein Oligonukleotid, das entweder ein DNA-Oligonukleotid
oder DNA-RNA-Hybridoligonukleotid mit RNA an seinem 3'-Ende sein kann,
wird anschließend
unter Verwendung von T4-RNA Ligase an das Phosphat, das am 5'-Ende der mRNA ohne
Cap vorliegt, ligiert. Das Oligonukleotid kann eine Schnittstelle
umfassen, um das Klonieren der cDNAs im Anschluss an deren Synthese
zu erleichtern. Beispiel 12 weiter unten beschreibt ein enzymatisches
Verfahren, das auf der Doktorarbeit von Dumas basiert.
-
BEISPIEL 12
-
Enzymatischer Ansatz zum
Erlangen von 5'-ESTs
-
Zwanzig
Mikrogramm PolyA+ RNA wurden unter Verwendung
von Phosphatase aus Rinderdarm (Calf Intestinal Phosphatase) (Biolabs)
dephosphoryliert. Nach einer Phenolchloroformextraktion wurde die
mRNA Capstruktur unter Verwendung von Tabaksäure-Pyrophosphatase (gereinigt
wie von Shinshi et al., Biochemstry 15:2185-2190, 1976 beschrieben)
hydrolysiert und ein hemi 5'-DNA/RNA-3'-Oligonukleotid mit
einem unphosphorylierten 5'-Ende,
einem Adenosinribophosphatabschnitt am 3'-Ende und einer EcoRI-Stelle nahe dem
5'-Ende wurde unter
Verwendung der T4 RNA-Ligase (Biolabs) an die 5'-P-Enden
der mRNA ligiert. Oligonukleotide, die zur Verwendung in diesem
Verfahren geeignet sind, weisen vorzugsweise eine Länge von 30
bis 50 Basen auf. Oligonukleotide mit einem unphosphorylierten 5'-Ende können durch
Zugabe eines Fluorochroms an das 5'-Ende synthetisiert werden. Die Einbeziehung
eines Adenosinribophosphatabschnitts am 3'-Ende der Oligonukleotide steigert die
Effizienz der Ligation. Es wird erkannt, dass das Oligonukleotid
außer EcoRI
andere Klonierungsstellen enthalten kann.
-
Im
Anschluss an die Ligation der Oligonukleotide an das Phosphat, das
am 5'-Ende der mRNA
ohne Cap vorliegt, wird die Erst- und Zweitstrang-cDNA-Synthese unter Verwendung
herkömmlicher
Verfahren oder unter Verwendung der Verfahren, die in
EP 0,625,572 und Kato et al., supra
und Dumas Milne Edwards, supra offenbart sind, ausgeführt. Die
sich ergebende cDNA kann anschließend in Vektoren ligiert werden,
wie beispielsweise solche Vektoren, die in Kato et al., supra offenbart
sind oder andere dem Fachmann bekannte Nukleinsäurevektoren, wobei Techniken
verwendet werden, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989 beschrieben sind.
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II. Erlangen und Charakterisieren
der erfindungsgemäßen 5'-ESTs
-
Die
hierin beschriebenen 5'-ESTs
wurden unter Verwendung der vorausgehend genannten chemischen und
enzymatischen Ansätze
zur Anreicherung von mRNAs im Hinblick auf mRNAs mit intakten 5'-Enden erhalten,
wie es weiter unten beschrieben wird.
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1. Erlangen von 5'-ESTs unter Verwendung
von mRNAs mit intakten 5'-Enden
-
Zuerst
wurden mRNAs hergestellt, wie es in Beispiel 13 weiter unten beschrieben
wird.
-
BEISPIEL 13
-
Herstellung von mRNA mit
intakten 5'-Enden
-
Menschliche
Gesamt-RNAs bzw. PolyA+-RNAs, die aus 29
verschiedenen Geweben abgeleitet waren, wurden von LABIMO bzw. CLONTECH
bezogen und verwendet, um 44 cDNA-Bibliotheken zu erstellen, wie es
im Folgenden beschrieben wird. Die bezogene RNA war entweder aus
Zellen oder Geweben unter Verwendung von saurer Guanidiumthiocyanat-Phenol-Chloroformextraktion
isoliert worden (Chomczyniski und Sacchi, Analytical Biochemstry
162:156-159, 1987). Um die ribosomale RNA zu entfernen wurde PolyA+ RNA aus Gesamt-RNA (LABIMO) über zwei
Durchläufe
von Oligo-dT-Chromatografie isoliert, wie es von Aviv und Leder, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412, 1972 beschrieben wird.
-
Die
Qualität
und Integrität
der PolyA+-RNAs wurden überprüft. Es wurden mit einer Globinsonde
hybridisierte Northern Blots verwendet, um zu bestätigen, dass
die mRNAs nicht degradiert waren. Verunreinigung der PolyA+-mRNAs durch ribosomale Sequenzen wurde
unter Verwendung von Northern Blots und einer Sonde, die aus der
Sequenz von 28S rRNA abgeleitet war, überprüft. mRNA-Präparationen
mit weniger als 5% rRNAs wurden zur Herstellung einer Bibliothek
verwendet. Um die Herstellung von Bibliotheken mit RNAs zu vermeiden,
die mit exogenen Sequenzen verunreinigt waren (prokaryotisch oder
aus Pilz), wurde das Vorliegen bakterieller 16S ribosomaler Sequenzen
oder zweier stark exprimierter mRNAs aus Pilz unter Verwendung von
PCR untersucht.
-
Im
Anschluss an die Herstellung der mRNAs wurden die oben beschriebenen
chemischen und/oder die enzymatischen Verfahren zur Anreicherung
solcher mRNAs, die intakte 5'-Enden
aufweisen, verwendet, um 5'-ESTs aus verschiedenen
Geweben zu erhalten. In beiden Ansätzen wurde ein Oligonukleotid-Tag
an die mRNA 5'-Enden
angebracht. Der Oligonukleotid-Tag trug eine EcoRI-Stelle in sich,
um spätere
Klonierungsverfahren zu erleichtern. Um die Verarbeitung einzelsträngiger und
doppelsträngiger
cDNA, die bei der Erstellung der Bibliotheken erhalten wurde, zu
erleichtern, wurde die gleiche Nukleotidsequenz verwendet, um das ligierte
Oligonukleotid sowohl für
den chemischen als auch den enzymatischen Ansatz zu konzipieren.
Trotzdem war das im chemischen Verfahren verwendete Tag ein Oligodeoxyribonukleotid,
das mit dem Cap der mRNA verknüpft
war, wohingegen in der enzymatischen Ligation das Tag ein chimäres hemi 5'-DNA/RNA3'-Oligonukleotid war,
das an das 5'-Ende
von mRNA ohne Cap ligiert wurde, wie in Beispiel 12 beschrieben
wird.
-
Bevor
die Erststrangsynthese durchgeführt
wurde, wie es in Beispiel 14 beschrieben wird, wurde im Anschluss
an das Anbringen des Oligonukleotid-Tags an die mRNA durch entweder
chemische oder enzymatische Verfahren die Integrität der mRNA
durch Ausführung
eines Northern Blots mit 200 bis 500 ng mRNA untersucht, wobei eine
zum Oligonukleotid-Tag komplementären Sonde verwendet wurde.
-
BEISPIEL 14
-
cDNA-Synthese unter Verwendung
von mRNA-Matrizen mit intakten 5'-Enden
-
Für die mRNAs,
die unter Verwendung sowohl chemischer als auch enzymatischer Verfahren
mit Oligonukleotid-Tags verknüpft
worden waren, wurde die Erststrang-cDNA-Synthese unter Verwendung
der Superscript II (Gibco BRL) oder der Rnase H Minus M-MLV (Promega)
Reversen Transkriptase mit willkürlichen Nonameren
als Primern durchgeführt.
Um die internen EcoRI-Stellen in der cDNA vor Verdau bei späteren Verfahrensschritten
zu schützen,
wurde für
die Erststrangsynthese methyliertes dCTP verwendet. Nach Entfernung
von RNA durch alkalische Hydrolyse wurde die Erststrang-cDNA unter
Verwendung von Isopropanol präzipitiert,
um verbliebene Primer zu entfernen.
-
Sowohl
für die
chemischen als auch die enzymatischen Verfahren wurde der cDNA-Zweitstrang
mit einem Klenow-Fragment unter Verwendung eines Primers entsprechend
dem 5'-Ende des
ligierten Oligonukleotids synthetisiert, wie es in Beispiel 12 beschrieben
wird. Der Primer ist vorzugsweise 20-25 Basen lang. Methyliertes
dCTP wurde auch zur Zweitstrangsynthese verwendet, um während des
Klonierungsverfahrens die internen EcoRI-Stellen in der cDNA vor
Verdau zu schützen.
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Im
Anschluss an die cDNA-Synthese wurden die cDNAs in pBlueScript-Vektoren kloniert,
wie es in Beispiel 15 weiter unten beschrieben wird.
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BEISPIEL 15
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Klonierung von cDNAs,
die aus mRNA mit intakten 5'-Enden
abgeleitet sind, in BlueScript
-
Im
Anschluss an die Zweitstrangsynthese wurden die Enden der cDNA mit
T4 DNA-Polymerase (Biolabs) geglättet
und die cDNA wurde mit EcoRI verdaut. Da während der cDNA-Synthese methyliertes
dCTP verwendet worden war, stellte die im Tag vorliegende EcoRI-Stelle
die einzige hemi methylierte Stelle dar und war demzufolge die einzige
Stelle, die einem EcoRI-Verdau zugänglich war. Die cDNA wurde
anschließend unter
Verwendung von Ausschlusschromatografie (AcA, Biosepra) größenfraktioniert
und die Fraktionen, die cDNAs mit mehr als 150 bp entsprachen, wurden
vereinigt und mit Ethanol präzipitiert.
Die cDNA wurde direkt in die Smal- und EcoRI-Enden des Phagemid
pBlueScript-Vektors (Stratagene) kloniert. Das Ligationsgemisch wurde
in Bakterien elektroporiert und unter geeigneten antibiotischen
Auswahlbedingungen vermehrt.
-
Klone,
die den angefügte
Oligonukleotid-Tag enthielten, wurden selektiert, wie es in Beispiel
16 weiter unten beschrieben wird.
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BEISPIEL 16
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Selektion
von Klonen mit daran angebrachtem Oligonukleotid-Tag
-
Die
wie oben beschrieben hergestellten Plasmid-DNAs enthaltenden 5'-EST-Bibliotheken wurden gereinigt (Qiagen).
Eine positive Selektion der Klone mit Tag wurde wie folgt durchgeführt. In
Kürze,
in diesem Selektionsverfahren wird die Plasmid-DNA unter Verwendung
der Gen II-Endonuklease des Phagen F1 in Kombination mit einer Exonuklease
(Chang et al., Gene 127:95-8, 1993), wie beispielsweise Exonuklease
III oder T7 Gen 6 Exonuklease, in eine einzelsträngige DNA umgewandelt. Die
sich ergebende einzelsträngige DNA
wurde anschließend
unter Verwendung paramagnetischer Beads, wie von Fry et al., Biotechniques, 13:124-131,
1992 beschrieben, aufgereinigt. In diesem Verfahren wird die einzelsträngige DNA
mit einem biotinylierten Oligonukleotid, das eine Sequenz entsprechend
dem 3'-Ende des
in Beispiel 13 beschriebenen Oligonukleotids aufweist, hybridisiert.
Der Primer weist vorzugsweise eine Länge von 20-25 Basen auf. Klone,
die eine zum biotinylierten Oligonukleotid komplementäre Sequenz
umfassen, wurden durch Inkubation mit Streptavidin beschichteten
magnetischen Beads eingefangen, wobei sich daran eine magnetische
Selektion anschloss. Nach dem Einfangen der positiven Klone wurde
die Plasmid-DNA von den magnetischen Beads abgelöst und unter Verwendung einer
DNA-Polymerase, wie beispielsweise der von Amersham Pharmacia Biotech erhältlichen
ThermoSequenase in doppelsträngige
DNA umgewandelt. Alternativ können
Protokolle, wie beispielsweise das im Gene Trapper Kit, der von
Gibco BRL bezogen werden kann, beschriebene verwendet werden. Die
doppelsträngige
DNA wurde anschließend
in Bakterien elektroporiert. Unter Verwendung von Dot Blot Analyse
wurde der Prozentanteil positiver Klone mit dem 5'-Tag Oligonukleotid
dahingehend abgeschätzt, dass
er sich typischerweise zwischen 90 und 98% bewegt.
-
Im
Anschluss an die Elektroporation wurden die Bibliotheken in 384-Mikrotiterplatten
(MTP) angeordnet. Für
zukünftige
Bedürfnisse
wurde eine Kopie der MTP eingelagert. Anschließend wurden die Bibliotheken in
96 MTP überführt und
wie unten beschrieben sequenziert.
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BEISPIEL 17
-
Sequenzierung
von Inserts in selektierten Klonen
-
Die
Plasmidinserts wurden zuerst durch eine PCR-Reaktion in PE 9600
Thermocyclern (Perkin-Elmer, Applied Biosystems Divison, Foster
City, CA) unter Verwendung von Standard-SETA-A- und SETA-B-Primern (Genset
SA), AmpliTaqGold (Perkin-Elmer), dNTPs (Boehringer), Puffer und
von der Perkin-Elmer
Corporation empfohlenen Zyklusbedingungen amplifiziert.
-
Anschließend wurden
die PCR-Produkte unter Verwendung automatischer ABI Prism 377 Sequenzierer
(Perkin-Elmer) sequenziert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden
unter Verwendung von PE 9600 Thermocyclern mit Standardfarbstoffprimerchemie
und ThermoSequenase (Amersham Pharmacia Biotech) durchgeführt. Die
verwendeten Primer waren wie jeweils geeignet entweder T7 oder 21
M13 (erhältlich
von Genset SA). Die Primer waren mit den JOE-, FAM-, ROX- und TAMRA-Farbstoffen
markiert. Die für
die Sequenzierungsreaktionen verwendeten dNTPs und ddNTPs wurden
von Boehringer bezogen. Sequenzierungspuffer, Reagenzienkonzentrationen
und Zyklusbedingungen waren wie von Amersham empfohlen.
-
Im
Anschluss an die Sequenzierungsreaktion wurden die Proben mit Ethanol
präzipitiert,
in Formamidladepuffer aufgenommen und auf ein standardmäßiges 4%
Acrylamidgel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde für 2,5 Stunden
bei 3000 V an einem ABI 377 Sequenzierungsgerät durchgeführt und die Sequenzdaten wurden
gesammelt und unter Verwendung der ABI Prism DNA Sequencing Analysis
Software, Version 2.1.2 analysiert.
-
2. Computeranalyse der
erhaltenen 5'-ESTs:
Einrichtung von NetGene und SignalTag Datenbanken
-
Die
Sequenzdaten der 44 wie oben beschrieben hergestellten cDNA-Bibliotheken wurden
auf eine proprietäre
Datenbank übertragen,
wo Schritte zur Qualitätskontrolle
und Validierung durchgeführt
wurden. Ein proprietärer
Base-Caller, der
unter einem Unix-System arbeitet, kennzeichnete automatisch fehlerverdächtige Scheitelwerte,
wobei die Form der Scheitel, die Auflösung zwischen den Scheiteln
und der Rauschpegel berücksichtigt
wurden. Der proprietäre
Base-Caller führte
auch einen automatischen Abgleich durch. Jeder Abschnitt mit 25
oder weniger Basen und mehr als 4 fehlerverdächtigen Scheitelwerten wurde
als unzuverlässig eingestuft
und verworfen. Sequenzen, die dem Klonierungsvektor oder Ligationsoligonukleotiden
entsprachen, wurden automatisch von den EST-Sequenzen entfernt.
Die sich ergebenden EST-Sequenzen
können
an ihrem 5'-Ende
jedoch 1 bis 5 Basen enthalten, die zu den oben erwähnten Sequenzen
zählen.
Wenn Bedarf entsteht, können
sie auf Grundlage einer Fall zu Fall Unterscheidung einfach entfernt
werden.
-
Im
Anschluss an die oben beschriebene Sequenzierung wurden die 5'-EST-Sequenzen in NetGeneTM eingegeben, wobei es sich um eine proprietäre Datenbank
handelt, die wie unten beschrieben zur Speicherung und Manipulierung
aufgerufen wurde. Der Fachmann erkennt, dass die Daten auf einem
beliebigen Medium, das von einem Computer gelesen werden kann und
auf das ein Computer zugreifen kann, gespeichert und manipuliert
werden können.
Computerlesbare Medien umfassen magnetisch, optisch oder elektronisch
lesbare Medien. Beispielsweise kann das computerlesbare Medium sowohl
eine Hard Disc, eine Floppy Disc, ein magnetisches Band, CD-ROM,
RAM oder ROM als auch andere dem Fachmann bekannte Medientypen sein.
-
Zusätzlich können die
Daten in einer Vielfalt von Datenverarbeitungsprogrammen in unterschiedlichen Formaten
gespeichert und manipuliert werden. Zum Beispiel können die
Sequenzdaten als Text in einer Wortverarbeitungsdatei, wie beispielsweise
Microsoft WORD oder WORDPERFECT oder als eine ASCII-Datei in einer Vielzahl
von dem Fachmann bekannten Datenbankenprogrammen, wie beispielsweise
DB2, SYBASE oder ORACLE, gespeichert werden.
-
Das
computerlesbare Medium, auf dem die Sequenzinformation gespeichert
ist, kann sich in einem Personal-Computer, einem Netzwerk, einem
Server oder anderen, dem Fachmann bekannten Computersystemen befinden.
Der Computer oder das andere System umfasst vorzugsweise das oben
beschriebene Speichermedium und einen Prozessor für einen
Zugriff auf und die Manipulation der Sequenzdaten. Sobald die Sequenzdaten
gespeichert worden sind, können
sie manipuliert werden und durchsucht werden, um diejenigen gespeicherten
Sequenzen zu finden, die eine gewünschte Nukleinsäuresequenz
enthalten oder die ein Protein mit einer bestimmten funktionalen
Domäne
kodieren. Beispielsweise kann die gespeicherte Sequenzinformation
mit anderen bekannten Sequenzen verglichen werden, um Homologien,
Motive, die eine biologische Funktion implizieren, oder strukturelle
Motive zu identifizieren.
-
Programme,
die verwendet werden können,
um die gespeicherten Sequenzen zu durchsuchen oder zu vergleichen,
umfassen die MacPattern (EMBL), BLAST und BLAST2 Programmserien
(NCBI), einfache lokale Alignment Suchprogramme für Nukleotid-
(BLASTN) und Peptid- (BLASTX) Vergleiche (Altschule et al., J. Mol.
Biol. 215:403, 1990) sowie FASTA (Pearson und Lipman, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85:2444, 1988). Die BLAST Programme erweitern anschließend die
Alignments auf Grundlage bestimmter Abgleich- und Fehlabgleichkriterien
(match- and mismatch criteria).
-
Motive,
die unter Verwendung der oben und den in Beispiel 28 beschriebenen
Programmen entdeckt werden können,
umfassen Sequenzen, die Leucin-Zipper, Helix-Turn-Helix-Motive,
Glycosylierungsstellen, Ubiquitinierungsstellen, Alphahelices und
Betafaltblätter,
Signalpeptide kodierende Signalsequenzen, die die Sekretion der
kodierten Proteine lenken, Sequenzen, die mit der Regulation von
Transkription in Zusammenhang stehen, wie beispielsweise Homeoboxen,
saure Abschnitte, enzymatisch aktive Stellen, Substratbindungsstellen
und enzymatische Spaltstellen kodieren.
-
Bevor
die cDNAs in der NetGeneTM Datenbank nach
Sequenzmotiven von Interessen durchsucht wurden, wurden von mRNAs
abgeleitete cDNAs, die nicht von Interesse waren, identifiziert
und von weiteren Überlegungen
ausgeschlossen, wie es in Beispiel 18 weiter unten beschrieben wird.
-
BEISPIEL 18
-
Ausschluss unerwünschter
Sequenzen von weiteren Überlegungen
-
5'-ESTs in der NetGeneTM-Datenbank, die von unerwünschten
Sequenzen abgeleitet waren, wie beispielsweise Transfer-RNAs, ribosomale
RNAs, mitochondrielle RNAs, prokaryotische RNAs, RNAs aus Pilzen, Alu-Sequenzen,
L1-Sequenzen oder Repeatsequenzen, wurden unter Verwendung der FASTA- und BLASTN-Programme
mit den in Tabelle 1 aufgelisteten Parametern identifiziert.
-
Um
die tRNAs kodierenden 5'-ESTs
von weiteren Überlegungen
auszuschließen,
wurden die 5'-EST-Sequenzen
mit den Sequenzen 1190 bekannter tRNAs, die aus EMBL Version 38
erhalten wurden, verglichen, von denen 100 menschlich waren. Der
Vergleich wurde unter Verwendung von FASTA für beide Stränge der 5'-ESTs durchgeführt. Sequenzen mit mehr als
80 Homologie über
mehr als 60 Nukleotide hinweg wurden als tRNAs identifiziert. Von
den 144.341 durchmusterten Sequenzen wurden 26 als tRNAs identifiziert
und von weiteren Überlegungen
ausgeschlossen.
-
Um
die rRNAs kodierenden 5'-ESTs
von weiteren Überlegungen
auszuschließen,
wurden die 5'-EST-Sequenzen
mit den Sequenzen 2497 bekannter rRNAs, die aus EMBL Version 38
erhalten wurden, verglichen, von denen 73 menschlich waren. Der
Vergleich wurde unter Verwendung von BLASTN für beide Stränge der 5'-ESTs mit dem Parameter S = 108 durchgeführt. Sequenzen
mit mehr als 80% Homologie über Strecken,
die länger
als 40 Nukleotide waren, wurden als rRNAs identifiziert. Von den
144.341 durchmusterten Sequenzen wurden 3.312 als rRNAs identifiziert
und von weiteren Überlegungen
ausgeschlossen.
-
Um
die mtRNAs kodierenden 5'-ESTs
von weiteren Überlegungen
auszuschließen,
wurden die 5'-EST-Sequenzen
mit den Sequenzen zweier bekannter mitochondrieller Genome, für die die
vollständige
genomische Sequenz zur Verfügung
steht, und allen Sequenzen, die von diesen mitochondriellen Genomen
transkribiert werden, einschließlich
tRNAs, rRNAs und mRNAs, in der Summe 38 Sequenzen, verglichen. Der
Vergleich wurde unter Verwendung von BLASTN für beide Stränge der 5'-ESTs mit dem Parameter S = 108 durchgeführt. Sequenzen
mit mehr als 80% Homologie über
Strecken, die länger
als 40 Nukleotide waren, wurden als mtRNAs identifiziert. Von den
144.341 durchmusterten Sequenzen wurden 6.110 als mtRNAs identifiziert und
von weiteren Überlegungen
ausgeschlossen.
-
Sequenzen,
die von exogenen Kontaminanten herrühren könnten, wurden von weiteren Überlegungen durch
Vergleich der 5'-EST-Sequenzen
mit Version 46 der EMBL-Abteilungen für Bakterien und Pilze unter Verwendung
von BLASTN mit dem Parameter S = 144 entfernt. Alle Sequenzen mit
mehr als 90% Homologie über
wenigstens 40 Nukleotide hinweg wurden als exogene Kontaminanten
identifiziert. Von den 42 untersuchten cDNA-Bibliotheken betrug
der durchschnittliche Prozentanteil darin enthaltener prokaryotischer
Sequenzen und darin enthaltener Pilzsequenzen 0,2% bzw. 0,5%. Von
diesen Sequenzen konnte nur eine als pilzspezifische Sequenz identifiziert
werden. Die anderen waren entweder Pilzsequenzen oder prokaryotische
Sequenzen mit Homologien zu Wirbeltiersequenzen oder umfassten Repeatsequenzen,
die während
des elektronischen Vergleichs nicht maskiert worden waren.
-
Zusätzlich wurden
die 5'-ESTs mit
6093 Alu-Sequenzen und 1115 L1-Sequenzen
verglichen, um 5'-ESTs
zu maskieren, die derartige Repeatsequenzen enthielten. 5'-ESTs, die THE- und
MER-Repeats, SSTR-Sequenzen oder Satelliten, Mikrosatelliten oder
telomerische Repeats umfassten, wurden ebenfalls von weiteren Überlegungen
ausgeschlossen. Im Durchschnitt enthielten 11,5% der Sequenzen in
den Bibliotheken Repeatsequenzen. Von diesen 11,5% enthielten 7%
Alu-Repeats, 3,3% enthielten L1-Repeats und die übrigen 1,2% wurden von den
anderen durchmusterten Typen repetitiver Sequenzen abgeleitet. Diese
Prozentangaben stehen in Übereinstimmung
mit denen, die in von anderen Gruppen hergestellten cDNA-Bibliotheken nachgewiesen
wurden. Beispielsweise enthielten die cDNA-Bibliotheken von Adams
et al. in Abhängigkeit
von der zur cDNA-Bibliothek-Herstellung verwendeten RNA-Quelle zwischen
0% und 7,4% Alu-Repeats (Adams et al., Nature 377:174, 1996).
-
Die
Sequenzen derjenigen 5'-ESTs,
die nach der Entfernung unerwünschter
Sequenzen zurück
blieben, wurden mit den Sequenzen bekannter menschlicher mRNAs verglichen,
um die Fehlerfreiheit der oben beschriebenen Sequenzierungsverfahren
festzustellen.
-
BEISPIEL 19
-
Messen der
Sequenzierungsfehlerfreiheit durch Vergleich mit bekannten Sequenzen
-
Um
ferner die Fehlerfreiheit des oben beschriebenen Sequenzierungsverfahrens
zu bestimmen, wurden die 5'-EST-Sequenzen,
die von bekannten Sequenzen abgeleitet waren, identifiziert und
mit den ursprünglich
bekannten Sequenzen verglichen. Als Erstes wurde bezüglich der
5'-ESTs eine FASTA-Analyse mit Überhängen, die
kürzer
als 5 bp waren, an beiden Enden durchgeführt, um diejenigen 5'-ESTs zu identifizieren,
die mit einem Eintrag in der öffentlichen
Human mRNA Datenbank übereinstimmen.
Die 6655 5'-ESTs,
die mit einer bekannten menschlichen mRNA übereinstimmten, wurden anschließend mit
ihrer verwandten mRNA abgeglichen und eine dynamische Programmierung
wurde verwendet, um Substitutionen, Insertionen und Deletionen in
die Liste der zu erkennenden „Fehler" aufzunehmen. Fehler,
die in den letzten 10 Basen der 5'-EST-Sequenzen
auftraten, wurden ignoriert, um eine Eibeziehung von störenden Klonierungsstellen
bei der Analyse der Sequenzierungsfehlerfreiheit zu vermeiden.
-
Die
Analyse offenbarte, dass die Sequenzen, die in der NetGeneTM-Datenbank
enthalten waren, eine Fehlerfreiheit von mehr als 99,5% aufwiesen.
-
Um
die Effizienz zu bestimmen, mit der das obige Selektionsverfahren
cDNAs selektiert, die die 5'-Enden
ihrer korrespondierenden mRNAs umfassen, wurde die folgende Analyse
durchgeführt.
-
BEISPIEL 20
-
Bestimmung der Effizienz
der 5'-EST-Selektion
-
Um
die Effizienz zu bestimmen, mit der die oben beschriebenen Selektionsverfahren
5'-ESTs isolierten,
die Sequenzen nahe am 5'-Ende
der mRNAs umfassten, aus denen sie abgeleitet waren, wurden die
Sequenzen der 5'-EST-Enden, die von
den Genen für
die Untereinheit α des
Elongationsfaktors 1 und der schweren Kette von Ferritin abgeleitet
waren, mit denen bekannter cDNA-Sequenzen
dieser Gene verglichen. Da die Transkriptionsstartstellen beider
Gene gut charakterisiert sind, können
sie verwendet werden, um den Prozentanteil abgeleiteter 5'-ESTs zu bestimmen,
die die authentischen Transkriptionsstartstellen umfassten.
-
Für beide
Gene umfassten tatsächlich
mehr als 95% der erhaltenen 5'-ESTs Sequenzen, die
nahe am oder stromaufwärts
des 5'-Endes der
korrespondierenden mRNAs lagen.
-
Um
die Analyse zur Verlässlichkeit
der Isolierungsverfahren für
5'-ESTs aus ESTs
in der NetGeneTM-Datenbank auszuweiten,
wurde zum Vergleich eine ähnliche
Analyse unter Verwendung einer Datenbank durchgeführt, die
aus menschlichen mRNA-Sequenzen zusammengestellt worden war, wobei
die menschlichen mRNA-Sequenzen aus der GenBank-Datenbank Version
97 entnommen worden waren. Die 5'-Enden von
mehr als 85% der aus mRNAs abgeleiteten 5'-ESTs, die in der GenBank-Datenbank
enthalten waren, waren nahe der 5'-Enden der bekannten Sequenz lokalisiert.
Da einige der mRNA-Sequenzen,
die in der GenBank-Datenbank zur Verfügung stehen, von genomischen
Sequenzen abgeleitet sind, wird eine Übereinstimmung am 5'-Ende mit diesen
Sequenzen als interne Übereinstimmung
gerechnet. Daher unterschätzt
das hier verwendete Verfahren die EST-Ausbeuten für ESTs,
die die authentischen 5'-Enden
ihrer korrespondierende mRNAs umfassen.
-
Die
oben hergestellten EST-Bibliotheken umfassten mehrere 5'-ESTs, die von der
gleichen mRNA abgeleitet waren. Die Sequenzen solcher 5'-ESTs wurden miteinander
verglichen und die längsten
5'-ESTs für jede mRNA
wurden identifiziert. Überlappende
cDNAs wurden zu kontinuierlichen Sequenzen (Contigs) angeordnet.
Die sich ergebenden kontinuierlichen Sequenzen wurden anschließend mit öffentlichen
Datenbanken verglichen, um ihre Ähnlichkeit
mit bekannten Sequenzen zu beurteilen, wie in Beispiel 21 weiter
unten beschrieben wird.
-
BEISPIEL 21
-
Kopieren der 5'-ESTs und Berechnung
der Neuheitsindices für
cDNA-Bibliotheken
-
Für jede sequenzierte
EST-Bibliothek wurden die Sequenzen über das 5'-Ende
in Clustern zusammengefasst. Jede Sequenz in der Bibliothek wurde über BLASTN2
(direkter Strang, Parameter S = 107) mit den anderen verglichen.
ESTs mit Segmentpaaren von hohem Scorewert (high scoring segment
pairs) (HSPs), die wenigstens 25 bp lang waren, 95% identische Basen
aufwiesen und näher
als 10 bp von jedem EST 5'-Ende begannen,
wurden gruppiert. Die längste
Sequenz, die im Cluster nachgewiesen wurde, wurde als Vertreter der
Gruppe herangezogen. Anschließend
wurde eine Gesamtclusterbildung zwischen den Bibliotheken durchgeführt, was
zur Bestimmung von Super-Contigs führte.
-
Um
die Ausbeute an neuen Sequenzen innerhalb der EST-Bibliotheken zu
bestimmen, wurde eine Neuheitsrate (NR) als: NR = 100 X (Zahl der
neuen einmaligen Sequenzen, die in der Bibliothek nachgewiesen werden/Gesamtzahl
der Sequenzen aus der Bibliothek) bestimmt. Typischerweise bewegte
sich die Neuheitsrate in Abhängigkeit
vom Gewebe, aus denen die EST-Bibliothek erhalten wurde, zwischen
10% und 41%. Für die
meisten Bibliotheken wurde die statistische Sequenzierung von 5'-EST-Bibliotheken
fortgesetzt, bis die Neuheitsrate 20% erreichte.
-
Im
Anschluss an die oben beschriebene Charakterisierung wurde die 5'-EST-Kollektion in NetGeneTM durchmustert,
um die diejenigen ESTs zu identifizieren, die potentielle Signalsequenzen
trugen, wie es in Beispiel 22 weiter unten beschrieben wird.
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BEISPIEL 22
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Identifizierung potentieller
Signalsequenzen in 5'-ESTs
-
Die
5'-ESTs in der NetGeneTM-Datenbank wurden durchmustert, um diejenigen
5'-ESTs zu identifizieren,
die einen ununterbrochenen offenen Leserahmen (ORF) aufweisen, der
länger
als 45 Nukleotide ist, mit einem ATG-Kodon beginnt und bis zum Ende des ESTs
reicht. Etwa die Hälfte
der cDNA-Sequenzen
in NetGeneTM enthielt einen derartigen ORF.
Die ORFs dieser 5'-ESTs
wurden anschließend
unter Verwendung leicht abgeänderter
von Von Heijne (Nucleic Acids Res. 14:4683-4690, 1986) offenbarten
Verfahren durchsucht, um mögliche
Signalmotive zu identifizieren. Für diejenigen 5'-EST-Sequenzen, die
einen wenigstens 15 Aminosäuren
langen Abschnitt mit einem Score von wenigstens 3,5 in der Von Heijne
Signalpeptid-Identifizierungsmatrix kodierten, wurden in Betracht
gezogen, ein Signalpeptid zu enthalten. Solche 5'-ESTs, die mit einer bekannten menschlichen
mRNA oder einer EST-Sequenz übereinstimmten
und ein 5'-Ende
mehr als 20 Nukleotide stromabwärts
des bekannten 5'-Ende
aufwiesen, wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Die verbleibenden
cDNAs, die eine Signalsequenz enthielten, wurden in eine Datenbank,
die als SignalTagTM bezeichnet wird, aufgenommen.
-
Um
die Fehlerfreiheit des obigen Verfahrens zur Identifizierung von
Signalsequenzen zu bestätigen, wurde
die Analyse aus Beispiel 23 durchgeführt.
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BEISPIEL 23
-
Bestätigung der Fehlerfreiheit zur
Identifizierung möglicher
Signalsequenzen in 5'-ESTs
-
Die
Fehlerfreiheit des obigen Verfahrens zur Identifizierung von Signalsequenzen,
die Signalpeptide kodieren, wurde durch Anwenden des Verfahrens
auf 43 Aminosäuren,
die am N-Terminus aller menschlichen SwissProt-Proteine lokalisiert
sind, beurteilt. Der computerberechnete Von Heijnes-Score für jedes
Protein wurde mit der bekannten Eigenschaft des Proteins, ein sekretiertes
oder nicht sekretiertes Protein zu sein, verglichen. Auf diese Weise
konnte die Zahl der nicht sekretierten Proteine mit einem Score
höher als
3,5 (Falschpositive) und die Zahl der sekretierten Proteine mit
einem Score niedriger als 3,5 (Falschnegative) berechnet werden.
-
Unter
Verwendung der Ergebnisse aus der obigen Analyse wurde die Wahrscheinlichkeit,
dass ein Peptid, das durch die 5'-Region
der mRNA kodiert wird, wirklich ein echtes Signalpeptid auf Grundlage
seines Von Heijnes-Scores ist, berechnet, wobei Annahme als Grundlage
diente, dass entweder 10% der menschlichen Proteine sekretiert werden
oder dass 20% der menschlichen Proteine sekretiert werden. Die Ergebnisse dieser
Analyse sind in 2 und in Tabelle IV gezeigt.
-
Unter
Verwendung des obigen Verfahrens zur Identifizierung von sekretorischen
Proteinen wurden 5'-ESTs
der nachfolgenden Polypeptide, für
die bekannt ist, dass sie sekretiert werden, erhalten: humanes Glukagon,
Gamma-Interferon
induzierter Monokin-Precursor, sekretiertes Cyclophilin-ähnliches
Protein, humanes Pleiotropin und humaner Biotinidase-Precursor.
Somit identifizierte das obige Verfahren erfolgreich diejenigen 5'-ESTs, die ein Signalpeptid
kodieren.
-
Um
zu bestätigen,
dass das Signalpeptid, das durch die 5'-ESTs kodiert wird, tatsächlich als
Signalpeptid wirkt, können
die Signalsequenzen aus den 5'-ESTs in einen Vektor
kloniert werden, der zur Identifizierung von Signalpeptiden konzipiert
ist. Solche Vektoren sind so konzipiert, dass sie die Fähigkeit
in Selektionsmedium zu wachsen ausschließlich solchen Wirtszellen verleihen,
die einen Vektor mit einer operativen verknüpften Signalsequenz enthalten.
Um zu bestätigen,
dass ein 5'-EST
ein wirkliches Signalpeptid kodiert, kann die Signalsequenz des
5'-ESTs beispielsweise
stromaufwärts
und im Leserahmen mit einer nicht sekretorischen Form des Hefe-Invertasegens
in Vektoren zur Signalpeptidselektion insertiert werden, wie denjenigen Vektoren,
die in US-Patent Nr. 5,536,637 beschrieben sind. Wachstum von Wirtszellen,
die Vektoren zur Signalsequenzselektion mit der korrekt insertierten
5'-EST-Signalsequenz
enthalten, bestätigt,
dass das 5'-EST ein
echtes Signalpeptid kodiert.
-
Alternativ
kann das Vorliegen eines Signalpeptid durch Klonierung der erweiterten
cDNA, die unter Verwendung der ESTs erhalten wurden, in Expressionsvektoren,
wie beispielsweise pXT1 (wie in Beispiel 30 weiter unten beschrieben)
bestätigt
werden oder durch Konstruktion von Promotorsignal-Sequenzreportergen-Vektoren,
die Fusionsproteine zwischen dem Signalpeptid und einem Assay-fähigen Reportergen
kodieren. Nach Einführung
dieser Vektoren in eine geeignete Wirtszelle, wie beispielsweise
COS-Zellen oder NIH 3T3-Zellen, kann das Wachstumsmedium geerntet
werden und im Hinblick auf das Vorliegen des sekretierten Proteins
analysiert werden. Das Medium aus diesen Zellen wird mit dem Medium
aus Kontrollzellen, die Vektoren ohne die Signalsequenz oder das
erweiterte cDNA-Insert enthalten, verglichen, um Vektoren zu identifizieren,
die ein funktionales Signalpeptid oder ein authentisches sekretiertes
Protein kodieren.
-
Diejenigen
5'-ESTs, die ein
Signalpeptid kodieren, wie es durch das Verfahren gemäß Beispiel
22 oben bestimmt wurde, wurden ferner auf Grundlage ihrer Homologie
zu bekannten Sequenzen in vier Kategorien eingruppiert, wie es in
Beispiel 24 weiter unten beschrieben wird.
-
BEISPIEL 24
-
Kategorisierung von Signalpeptid
kodierenden 5'-ESTs
-
Solche
5'-ESTs mit einer
Sequenz, die weder mit einer beliebigen bekannten Wirbeltiersequenz
noch mit einer beliebigen, öffentlich
zugänglichen
EST-Sequenz übereinstimmten,
wurden als „neu" bezeichnet. Unter
den Sequenzen in der SignalTagTM-Datenbank
fielen 947 der 5'-ESTs
mit einem Von Heijnes Score von wenigstens 3,5 in diese Kategorie.
-
Solche
5'-ESTs, die eine
Sequenz aufwiesen, die mit keiner Wirbeltiersequenz übereinstimmten,
aber mit einem öffentlich
bekannten EST übereinstimmten,
wurden als „EST-ext" bezeichnet, vorausgesetzt,
dass die bekannte EST-Sequenz wenigstens um 40 Nukleotide in 5'-Richtung erweitert
war. Unter den Sequenzen in der SignalTagTM-Datenbank
fielen 150 der 5'-ESTs
mit einem Von Heijnes Score von wenigstens 3,5 in diese Kategorie.
-
Solche
ESTs, die mit keiner Wirbeltiersequenz übereinstimmten, jedoch mit
einem öffentlich
bekannten EST übereinstimmten,
wobei das bekannte EST nicht wenigstens 40 Nukleotide in 5'-Richtung erweitert war,
wurden als „EST" bezeichnet. Unter
den Sequenzen in der SignalTagTM-Datenbank
fielen 599 der 5'-ESTs mit einem Von
Heijnes Score von wenigstens 3,5 in diese Kategorie.
-
Solche
5'-ESTs, die mit
einer humanen mRNA-Sequenz übereinstimmten,
aber die bekannte Sequenz um wenigstens 40 Nukleotide in 5'-Richtung erweiterten,
wurden als „VERT-ext" bezeichnet. Unter
den Sequenzen in der SignalTagTM-Datenbank
fielen 23 der 5'-ESTs
mit einem Von Heijnes Score von wenigstens 3,5 in diese Kategorie.
Von dieser Kategorie war ein 5'-EST
umfasst, das die bekannte Sequenzen der humanen Translokase-mRNA
um mehr als 200 Basen in 5'-Richtung
erweiterte. Es wurde auch ein 5'-EST
identifiziert, das die Sequenz eines humanen Tumorsuppressor-Gens
in 5'-Richtung erweiterte.
-
Tabelle
V zeigt die Verteilung von 5'-ESTs
in jeder Kategorie und die Zahl an 5'-ESTs in jeder Kategorie mit einem gegebenen
von Heijnes Minimumscore.
-
3. Bewertung räumlicher
und zeitlicher Expression von mRNAs, die mit den 5'-ESTs oder den erweiterten cDNAs korrespondieren
-
Jeder
der 5'-ESTs wurde
auf Grundlage des Gewebes, aus welchem die korrespondierende mRNA
erhalten worden war, auch kategorisiert, wie es in Beispiel 25 weiter
unten beschrieben wird.
-
BEISPIEL 25
-
Kategorisierung von Expressionsmustern
-
Tabelle
VI zeigt die Verteilung von 5'-ESTs
in jeder der oben definierten Kategorien im Hinblick auf das Gewebe,
aus dem die 5'-ESTs
der korrespondierenden mRNA erhalten wurden.
-
Tabelle
II stellt die Sequenzidentifizierungsnummer einer aus Gehirn abgeleiteten
5'-EST-Sequenz, die
Kategorie, unter welche diese Sequenz fällt, und den von Heijnes Score
des Signalpeptids, das sie kodiert, bereit. Die 5'-EST-Sequenz und die kodierende
Aminosäuresequenz
sind im anhängigen
Sequenzprotokoll bereitgestellt. Tabelle III stellt die Sequenz
ID Nummern des 5'-ESTs und die Sequenz
des Signalpeptids, das es kodiert, bereit. Die Sequenzen des 5'-ESTs und des Polypeptids,
das es kodiert, werden im hieran angefügten Sequenzprotokoll bereitgestellt.
-
Die
DNA-Sequenz SEQ ID No: 38 kann auf einfache Weise nach beliebigen
darin enthaltenen Fehlern durchmustert werden und jede Zweideutigkeit
bezüglich
der Sequenz kann durch Resequenzierung beider Stränge eines
Fragments, das solche Fehler oder Zweideutigkeiten enthält, aufgelöst werden.
Solche Fragmente können
aus den Plasmiden, die im Labor der Erfinder gelagert sind, erhalten
werden oder können
unter Verwendung der hierin beschriebenen Techniken isoliert werden.
Die Auflösung
jeglicher derartiger Zweideutigkeiten oder Fehler kann durch Verwendung
von Primern erleichtert werden, die an Sequenzen hybridisieren, die
nahe der zweideutigen oder fehlerhaften Sequenzen lokalisiert sind.
Beispielsweise können
die Primer an Sequenzen innerhalb von 50-75 Basen im Bereich der
Zweideutigkeit oder des Fehlers hybridisieren. Nach Auflösung eines
Fehlers oder einer Zweideutigkeit können in der Proteinsequenz,
die durch die DNA kodiert wird, die den Fehler oder die Zweideutigkeit
enthält,
entsprechende Korrekturen vorgenommen werden.
-
Zusätzlich zur
Kategorisierung der 5'-ESTs
können
im Hinblick auf ihr Ursprungsgewebe sowohl die räumlichen und zeitlichen Expressionsmuster
der mRNAs, die mit den 5'-ESTs
korrespondieren, als auch ihre Expressionsmengen, bestimmt werden,
wie es in Beispiel 26 weiter unten beschrieben wird. Die Charakterisierung
der räumlichen
und zeitlichen Expressionsmuster und Expressionsmengen dieser mRNAs
ist bei der Konzeption von Expressionsvektoren nützlich, die in räumlich oder
zeitabhängig
gewünschter
Weise zur Herstellung einer gewünschten
Menge eines Genprodukts in der Lage sind, und wird weiter unten
ausführlicher diskutiert.
-
Darüber hinaus
können
auch 5'-ESTs, deren
korrespondierende mRNAs mit einem Erkrankungszustand verbunden sind,
identifiziert werden. Beispielsweise kann eine bestimmte Krankheit
aus einem Expressionsmangel, Überexpression
oder Unterexpression einer mRNA, die mit einem 5'-EST korrespondiert, herrühren. Durch
Vergleich der mRNA-Expressionsmuster und -mengen in Proben, die
von gesunden Individuen entnommen wurden, mit Proben von Individuen,
die unter einer bestimmten Krankheit leiden, können für diese Krankheit verantwortliche
5'-ESTs identifiziert
werden.
-
Es
wird erkannt, dass die Ergebnisse der obigen Charakterisierungsverfahren
für 5'-ESTs auch auf erweiterte
cDNAs (die wie weiter unten beschrieben erhalten werden können) angewendet
werden können,
die Sequenzen enthalten, die zu den 5'-ESTs benachbart sind. Es wird auch
erkannt, dass anstelle die ESTs selbst zu charakterisieren die Charakterisierung
aufgeschoben werden kann, bis erweiterte cDNAs erhalten worden sind.
-
BEISPIEL 26
-
Bewertung von Exgressionsmengen
und -mustern von mRNAs, die mit 5'-ESTs oder erweiterten cDNAs korrespondieren
-
Expressionsmengen
und -muster von mRNAs, die mit 5'-ESTs
oder erweiterten cDNAs (die wie weiter unten in Beispiel 27 beschrieben
erhältlich
sind) korrespondieren, können
durch Hybridisierung in Lösung
mit langen Sonden analysiert werden, wie es in der internationalen
Patentanmeldung Nr. WO 97/05277 beschrieben wird. In Kürze, ein
5'-EST, eine erweiterte
cDNA oder ein Fragment davon welche mit dem Gen korrespondieren,
das die zu charakterisierende mRNA kodiert, wird in eine Klonierungsstelle
unmittelbar stromabwärts von
einem Bakteriophagen (T3, T7 oder SP6) RNA-Polymerasepromotor insertiert, um Antisense
RNA zu erzeugen. Vorzugsweise weist das 5'-EST oder die erweiterte cDNA 100 oder
mehr Nukleotide auf. Das Plasmid wird linearisiert und in Gegenwart
von Ribonukleotiden transkribiert, die modifizierte Ribonukleotide
(d.h. Biotin-UTP und DIG-UTP) umfassen. Ein Überschuss dieser doppelt markierten
RNA wird in Lösung
mit mRNA hybridisiert, die aus Zellen oder Gewebe von Interesse
isoliert wurde. Die Hybridisierungen wurden unter stringenten Standardbedingungen
durchgeführt
(40-50°C
für 16
Stunden in 80% Formamid, 0,4 M NaCl-Puffer, pH 7-8). Die nicht hybridisierte
Sonde wird durch Verdau mit Ribonukleasen, die für einzelsträngige RNA spezifisch sind (d.h.
RNasen CL3, TI, Phy M, U2 oder A), entfernt. Das Vorliegen der Biotin-UTP-Modifikation
ermöglicht
das Einfangen des Hybrids auf einer mit Streptavidin beschichteten
Mikrotitrationsplatte. Das Vorliegen der DIG-Modifikation ermöglicht es, das Hybrid zu detektieren
und unter Verwendung eines anti-DIG-Antikörpers, der mit alkalischer
Phosphatase gekoppelt ist, mittels ELISA zu quantifizieren.
-
Die
5'-ESTs, erweiterten
cDNAs oder Fragmente davon können
für eine
serielle Analyse der Genexpression (SAGE) auch mit Nukleotidsequenz-Tags
versehen werden, wie es in der UK-Patentanmeldung No. 2 305 241
A beschrieben wird. In diesem Verfahren werden cDNAs aus einer Zelle,
aus Gewebe, aus einem Organismus oder einer anderen Nukleinsäurequelle,
für welche
die Genexpressionsmuster bestimmt werden müssen, hergestellt. Die sich
ergebenden cDNAs werden in zwei Pools aufgeteilt. In jedem Pool
werden die cDNAs mit einer ersten Restriktionsendonuklease gespalten,
die als Anchoring-Enzym
bezeichnet wird und die eine Erkennungsstelle aufweist, für die es
wahrscheinlich ist, dass sie in den meisten cDNAs wenigstens einmal
vorkommt. Die Fragmente, die den 5'- oder 3'-Hauptabschnitt der gespaltenen cDNA
enthalten, werden durch Binden an ein Einfangmedium, wie beispielsweise
Streptavidin beschichtete Beads, isoliert. Ein erster Oligonukleotidlinker
mit einer ersten Sequenz zur Hybridisierung an einen Amplifizierungsprimer
und einer internen Restriktionsstelle für eine so genannte Tagging-Endonuklease
wird an die verdauten cDNAs im ersten Pool ligiert. Ein Verdau mit
der zweiten Endonuklease erzeugt kurze Tagfragmente aus den cDNAs.
-
Ein
zweites Oligonukleotid mit einer zweiten Sequenz zur Hybridisierung
eines Amplifikationsprimers und einer internen Restriktionsstelle
wird mit den verdauten cDNAs im zweiten Pool ligiert. Die cDNA-Fragmente
im zweiten Pool werden auch mit der Tagging-Endonuklease verdaut,
um kurze Tagfragmente zu erzeugen, die von den cDNAs im zweiten
Pool abgeleitet sind. Die Tags, die sich aus dem Verdau des ersten
und zweiten Pools mit dem Anchoring-Enzym und der Tagging-Endonuklease
ergeben, werden miteinander ligiert, um so genannte Ditags zu bilden.
In einigen Ausführungsformen
werden die Ditags hinter einander angeordnet (concatamerized), um
Ligationsprodukte zu erzeugen, die 2 bis 200 Ditags enthalten. Anschließend werden die
Tag-Sequenzen bestimmt und mit den Sequenzen der 5'-ESTs oder erweiterten
cDNAs verglichen, um zu bestimmen, welche 5'-ESTs oder erweiterten cDNAs in der
Zelle, dem Gewebe, dem Organismus oder der anderen Nukleinsäurequelle,
von denen die Tags abgeleitet waren, exprimiert werden. Auf diese
Weise wird das Expressionsmuster der 5'-ESTs
oder erweiterten cDNAs in der Zelle, dem Gewebe, dem Organismus
oder der anderen Nukleinsäurequelle
erhalten.
-
Eine
quantitative Analyse der Genexpression kann auch unter Verwendung
von Arrays durchgeführt werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck Array eine eindimensionale,
zweidimensionale oder multidimensionale Anordnung von Volllängen-cDNAs
(z.B. erweiterte cDNAs, welche die kodierende Sequenz für das Signalpeptid,
die kodierende Sequenz für
das reife Protein und ein Stopkodon umfassen), erweiterten cDNAs,
5'-ESTs oder Fragmenten
davon, die eine ausreichende Länge
aufweisen, um eine spezifische Detektion der Genexpression zu ermöglichen.
Vorzugsweise sind die Fragmente wenigstens 15 Nukleotide lang. Stärker bevorzugt
sind die Fragmente wenigstens 100 Nukleotide lang, stärker bevorzugt
sind die Fragmente mehr als 100 Nukleotide lang. In einigen Ausführungsformen
können
die Fragmente mehr als 500 Nukleotide lang sein.
-
Eine
quantitative Analyse der Genexpression kann beispielsweise wie unten
beschrieben mit Volllängen-cDNAs,
erweiterten cDNAs, 5'-ESTs
oder Fragmenten davon in einem Komplementär-DNA-Mikroarray durchgeführt werden,
wie er von Schena et al. (Science 270:467-470, 1995; Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 93:10614-10619,
1996) beschrieben wird. Volllängen-cDNAs,
erweiterte cDNAs, 5'-ESTs
oder Fragmente davon werden durch PCR amplifiziert und aus 96 Well-Mikrotiterplatten
auf silylierte Mikroskopdeckgläser
unter Verwendung von Hochgeschwindigkeitsrobotertechnik angeordnet.
Gedruckte (printed) Arrays werden in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert,
um eine Rehydrierung des Arrayelements zu ermöglichen und einmal in 0,2% SDS
für 1 min,
zweimal in Wasser für
1 min und einmal für
5 min in Natriumborhydridlösung
gespült.
Die Arrays werden in Wasser für
2 min bei 95°C
eingetaucht, für
1 min in 0,2% SDS überführt, zweimal
mit Wasser gespült,
luftgetrocknet und in der Dunkelheit bei 25°C gelagert.
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Zell-
oder Gewebe-mRNA wird isoliert oder kommerziell bezogen und Sonden
werden durch eine einzelne Runde reverser Transkription hergestellt.
Die Sonden werden auf 1 cm2 Mikroarrays
unter einem 14 × 14
Deckglas aus Glas für
6-12 Stunden bei 60°C
hybridisiert. Die Arrays werden für 5 min bei 25°C in Waschpuffer
mit schwacher Stringenz (1 × SSC/0,2%
SDS) und anschließend
für 10
min bei Raumtemperatur in Waschpuffer mit hoher Stringenz (0,1 × SSC/0,2
SDS) gewaschen. Die Arrays werden in 0,1 × SSC unter Verwendung einer Fluoreszenzlaser-Scanningvorrichtung,
die mit einem maßgeschneiderten
Filterset ausgestattet ist, gescannt. Durch Bilden des Durchschnitts
für die
Verhältnisse
von zwei unabhängigen
Hybridisierungen werden genaue differentielle Expressionsmessungen
erhalten.
-
Eine
quantitative Analyse der Expression von Genen kann auch mit Volllängen-cDNAs,
erweiterten cDNAs, 5'-ESTs
oder Fragmenten davon in Komplementär-DNA-Arrays durchgeführt werden,
wie es von Pietu et al. (Genome Research 6:492-503, 1996) beschrieben
wird. Die Volllängen-cDNAs,
erweiterten cDNAs, 5'-ESTs
oder Fragmente davon werden durch PCR amplifiziert und auf Membranen
punktförmig
aufgetragen. Anschließend
werden mRNAs, die aus verschiedenen Geweben oder Zellen stammen,
mit radioaktiven Nukleotiden markiert. Nach der Hybridisierung und
Waschen unter kontrollierten Bedingungen werden die hybridisierten
mRNAs durch Phospho-Imaging oder Autoradiographie detektiert. Die
Experimente werden zweifach ausgeführt und anschließend wird
eine quantitative Analyse differentiell exprimierter mRNAs durchgeführt.
-
Alternativ
kann die Expressionsanalyse der 5'-ESTs oder erweiterten cDNAs über Nukleotidarrays
mit hoher Dichte durchgeführt
werden, wie es von Lockhart et al. (Nature Biotechnology 14: 1675-1680,
1996) und Sosnowsky et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 94:1119-1123,
1997) beschrieben wird. Oligonukleotide mit 15-50 Nukleotiden, die
mit den Sequenzen der 5'-ESTs
oder erweiterten cDNAs korrespondieren, werden direkt auf dem Chip
synthetisiert (Lockhard et al., supra) oder synthetisiert und anschließend an
den Chip adressiert (Sosnowsky et al., supra). Vorzugsweise sind
die Oligonukleotide etwa 20 Nukleotide lang.
-
Die
cDNA-Sonden, die mit einer geeigneten Verbindung, wie beispielsweise
Biotin, Digoxigenin oder einem fluoreszierenden Farbstoff markiert
sind, werden aus der geeigneten mRNA-Population synthetisiert und
anschließend
auf Zufallsbasis zu einer Durchschnittsgröße von 50-100 Nukleotiden fragmentiert.
Die Sonden werden anschließend
auf dem Chip hybridisiert. Nach Waschen, wie es in Lockhard et al.,
supra, beschrieben wird, und Anlegen verschiedener elektrischer
Felder (Sonowsky et al., supra) werden die Farbstoffe oder markierten
Verbindungen detektiert und quantifiziert. Die Hybridisierungen
werden zweifach durchgeführt.
Eine vergleichende Analyse der Signalintensitäten, die von cDNA-Sonden auf demselben
Zieloligonukleotid in verschiedenen cDNA-Proben stammen, zeigt eine
differentielle Expression der mRNA, die mit dem 5'-EST oder der erweiterten
cDNA korrespondiert, woraus die Oligonukleotidsequenz konzipiert
wurde.
-
III. Verwendung von 5'-ESTs zur Klonierung
erweiterter cDNAs sowie zur Klonierung entsprechender genomischer
DNAs
-
Nachdem
5'-ESTs, die das
5'-Ende der entsprechenden
mRNAs enthalten, unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren
selektiert wurden, können
sie verwendet werden, um erweiterte cDNAs zu isolieren, die Sequenzen
enthalten, die zu den 5'-ESTs
benachbart sind. Die erweiterten cDNAs können die vollständige kodierende
Sequenz des Proteins enthalten, das durch die korrespondierende
mRNA kodiert wird, einschließlich
der authentischen Translationsstartstelle, der Signalsequenz und
der Sequenz, die das reife Protein kodiert, das zurückbleibt,
nachdem das Signalpeptid abgespalten wurde. Solche erweiterten cDNAs werden
hierin als „Volllängen-cDNAs" bezeichnet. Alternativ
können
die erweiterten cDNAs nur die Sequenz enthalten, die das reife Protein
kodiert, das zurückbleibt,
nachdem das Signalpeptid abgespalten wurde, oder nur die Sequenz,
die das Signalpeptid kodiert.
-
Beispiel
27 beschreibt weiter unten ein allgemeines Verfahren zum Erlangen
erweiterter cDNAs unter Verwendung von 5'-ESTs. Beispiel 28 stellt unter Verwendung
des in Beispiel 27 beschriebenen Verfahrens experimentelle Ergebnisse
zur Verfügung,
die einige erweiterte cDNAs beschreiben, einschließlich der
vollständig
kodierenden Sequenz und des authentischen 5'-Endes der korrespondierenden mRNA für einige
sekretierte Proteine.
-
Die
Verfahren gemäß der Beispiele
27, 28 und 29 können
auch verwendet werden, um erweiterte cDNAs zu erhalten, die weniger
als die vollständige
kodierende Sequenz der sekretierten Proteine kodieren, die durch
die Gene, die mit den 5'-ESTs
korrespondieren, kodiert werden. In einigen Ausführungsformen kodieren die gemäß diesem
Verfahren isolierten cDNAs wenigstens 10 Aminosäuren des Proteins, das durch
die Sequenz gemäß SEQ ID
No: 38 kodiert wird. In weiteren Ausführungsformen kodieren die erweiterten
cDNAs wenigstens 20 Aminosäuren
des Proteins, das durch die Sequenz gemäß SEQ ID No: 38 kodiert wird.
In weiteren Ausführungsformen
kodieren die erweiterten cDNAs wenigstens 30 Aminosäuren der
Sequenz gemäß SEQ ID
No: 38. In einer bevorzugten Ausführungsform kodieren die erweiterten
cDNAs eine Volllängen-Proteinsequenz, die
die Protein kodierende Sequenz gemäß SEQ ID No: 38 umfasst.
-
BEISPIEL 27
-
Allgemeines Verfahren
zur Verwendung von 5'-ESTs
zur Klonierung und Seguenzierung von cDNAs. die die vollständige kodierende
Region und das authentische 5'-Ende
der korrespondierenden mRNA umfassen
-
Das
folgende allgemeine Verfahren wurde verwendet, um erweiterte cDNAs
schnell und effizient zu isolieren, die sowohl die authentischen
5'-Enden ihrer korrespondierenden
mRNAs als auch die das vollständige
Protein kodierende Sequenz aufweisen und die Sequenz umfassen, die
neben den Sequenzen der 5'-ESTs liegt, die verwendet
wurde um diese zu erhalten. Dieses Verfahren kann auf erweiterte
cDNAs für
ein beliebiges 5'-EST
in der NetGeneTM-Datenbank angewandt werden,
einschließlich
solcher 5'-ESTs,
die Polypeptide kodieren, die zu sekretierten Proteinen gehören. Dieses
Verfahren ist in 3 zusammengefasst.
-
I. Erlangen
erweiterter cDNAs
-
a) Erststrangsynthese
-
Dieses
Verfahren zieht seinen Vorteil aus der bekannten 5'-mRNA Sequenz. Eine
reverse Transkriptionsreaktion wird an gereinigter mRNA mit einem
Poly 14dT-Primer durchgeführt,
der eine 49 Nukleotidsequenz an seinem 5'-Ende enthält, wobei die Reaktion die
Addition einer bekannten Sequenz an das Ende der cDNA ermöglicht,
die mit dem 3'-Ende
der mRNA korrespondiert. Beispielsweise kann der Primer die folgende Sequenz
aufweisen: 5'-ATC
GTT GAG ACT CGT ACC AGC AGA GTC ACG AGA GAG ACT ACA CGG TAC TGG
TTT TTT TTT TTT TTVN-3' (SEQ
ID NO: 14). Der Fachmann erkennt, dass auch andere Sequenzen an die
Poly dT-Sequenz addiert und verwendet werden können, um die Erststrangsynthese
zu starten (to prime). Unter Verwendung dieses Primers und einer
Reversen Transkriptase, wie beispielsweise dem Superscript II-Enzym
(Gibco BRL) oder dem Rnase H Minus M-MLV-Enzym (Promega), wird ein
reverses Transkript erzeugt, das an der 3'-PolyA-Stelle der RNAs verankert ist.
-
Nach
Entfernung der an den cDNA-Erststrang hybridisierten mRNA durch
alkalische Hydrolyse, werden die Produkte der alkalischen Hydrolyse
und der verbleibende Poly dT-Primer durch eine Ausschluss-Säule, wie
beispielsweise eine AcA34 (Biosepra) Matrix, entfernt, wie es in
Beispiel 11 erläutert
wird.
-
b) Zweitstrangsynthese
-
An
jedem Ende wird auf Grundlage der bekannten 5'-Sequenz des 5'-ESTs und des bekannten 3'-Endes, das durch
den während
der Erststrangsynthese verwendeten Poly dT-Primer hinzugefügt wurde,
ein Paar von Nested-Primern (verschachtelten Primern) konzipiert.
Softwareprogramme, die zur Konzeption von Primern verwendet werden,
basieren entweder auf dem GC-Gehalt und den Schmelztemperaturen
von Oligonukleotiden, wie beispielsweise OSP (Illier und Green,
PCR Meth. Appl. 1:124-128, 1991), oder beruhen auf dem Oktamerhäufigkeits-Disparitätsverfahren
(octamer frequency disparity method) (Griffais et al., Nucleic Acids Res.
19:3887-3891, 1991), wie beispielsweise PC-Rare (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/software/PC-Rare/doc/manuel.html).
-
Vorzugsweise
sind die Nested-Primer am 5'-Ende
durch vier bis neun Basen voneinander getrennt. Die 5'-Primersequenzen
können
im Hinblick darauf ausgewählt
werden, dass sie Schmelztemperaturen und Spezifitäten aufweisen,
die zur Verwendung in PCR-Reaktionen geeignet sind.
-
Vorzugsweise
sind die Nested-Primer am 3'-Ende
durch vier bis neun Basen voneinander getrennt. Beispielsweise können die
Nested-3'-Primer
die folgenden Sequenzen aufweisen: (5'-CCA GCA GAG TCA CGA GAG AGA CTA CAC
GG-3' (SEQ ID NO:
15) und 5'-CAC GAG
AGA GAC TAC ACG GTA CTG G-3' (SEQ ID NO: 16).
Diese Primer wurden ausgewählt,
da sie Schmelztemperaturen und Spezifitäten aufweisen, die mit ihrer
Verwendung in PCR-Reaktionen kompatibel sind. Der Fachmann erkennt
jedoch, dass auch andere Sequenzen als Primer verwendet werden können.
-
Der
erste PCR-Lauf mit 25 Zyklen wird unter Verwendung des Advantage
Tth Polymerase Mix (Clontech) und dem äußeren Primer von jedem der
Nested-Paare durchgeführt. Anschließend wird
eine PCR-Reaktion mit 20 Zyklen unter Verwendung desselben Enzyms
und dem inneren Primer von jedem der Nested-Paare mit 1/2500 des ersten PCR-Produkts
durchgeführt.
Danach werden die Primer und Nukleotide entfernt.
-
2. Seguenzierung von erweiterten
cDNAs mit voller Länge
oder Fragmenten davon
-
Aufgrund
des Fehlens von Positionsbeschränkungen
bei der Konzeption der zur PCR-Verwendung geeigneten 5'-Nested-Primer werden
unter Verwendung der OSP-Software zwei Typen von Amplicons erhalten.
Vorzugsweise ist der zweite 5'-Primer stromaufwärts vom
Translationsinitationskodon lokalisiert und ergibt so ein Nested-PCR-Produkt,
das die vollständige
kodierende Sequenz enthält.
Eine derartige erweiterten cDNA mit voller Länge wird direkt einem Klonierungsverfahren
unterzogen, wie es in Abschnitt a beschreiben ist. In einigen Fällen ist
der zweite 5'-Primer
jedoch stromabwärts
vom Translationsinitationskodon lokalisiert und führt so zu
einem PCR-Produkt, das nur einen Teil des ORF enthält. Derartige
unvollständige
PCR-Produkte werden einem modifiziertem Verfahren, das in Abschnitt
b beschrieben wird, unterzogen.
-
a) Nested PCR-Produkte,
die vollständige
ORFs enthalten
-
Wenn
das sich ergebende Nested PCR-Produkt die vollständige kodierende Sequenz enthält, wie
es aus der 5'-EST-Sequenz
vorhergesagt ist, wird es, wie es in Abschnitt 3 beschrieben wird,
in einen geeigneten Vektor kloniert, wie beispielsweise pED6depc2.
-
b) Nested PCR-Produkte,
die unvollständige
ORFs enthalten
-
Wenn
das Amplicon nicht die vollständige
kodierende Sequenz enthält,
sind Zwischenschritte notwendig, um sowohl die vollständige kodierende
Sequenz als auch ein PCR-Produkt, das die vollständige kodierende Sequenz enthält, zu erhalten.
Die vollständige
kodierende Sequenz kann aus mehreren Teilsequenzen zusammengesetzt
werden, die aus verschiedenen PCR-Produkten direkt bestimmt werden,
wie es im folgenden Abschnitt beschrieben wird.
-
Nachdem
die vollständige
kodierende Sequenz vollständig
bestimmt worden ist, werden neue Primer, die zur PCR-Verwendung
kompatibel sind, konzipiert, um Amplicons zu erhalten, die die vollständige kodierende
Region umfassen. In solchen Fällen
sind jedoch zur PCR-Verwendung kompatible 3'-Primer innerhalb der 3'UTR der korrespondierenden
mRNA lokalisiert und führen
so zu Amplicons, denen ein Teil dieser Region fehlt, z.B. der PolyA-Strang
und manchmal das Polyadenylierungssignal, wie es in 3 dargestellt
ist. Solche erweiterten cDNAs mit voller Länge werden wie in Abschnitt
3 beschrieben anschließend
in einen geeigneten Vektor kloniert.
-
c) Sequenzierung erweiterter
cDNAs
-
Die
Sequenzierung erweiterter cDNAs wird unter Verwendung eines Die
Terminator Ansatzes mit dem AmpliTaq-DNA-Polymerase FS Kit, der
von Perkin Elmer erhältlich
ist, durchgeführt.
-
Um
die PCR-Fragmente zu sequenzieren wird Primerwandern (primer walking)
durchgeführt,
wobei zur Auswahl der Primer Software, wie beispielsweise OSP, verwendet
wird und zur Konstruktion von Contigs der Wandersequenzen (walking
sequences), automatisierte Computersoftware, wie beispielsweise
ASMG (Sutton et al., Genome Science Technol. 1:9-19, 1995) verwendet
wird, wobei einschließlich
des 5'-Tags am Start
minimale Überlappungen
von 32 Nukleotiden verwendet werden Vorzugsweise wird das Primerwandern solange
durchgeführt,
bis die Sequenzen der Volllängen-cDNAs
erhalten werden.
-
Der
Abschluss der Sequenzierung eines gegebenen erweiterten cDNA-Fragments wird wie
im Folgenden beschrieben festgestellt. Da die Sequenzen, die nach
dem PolyA-Strang lokalisiert sind, im Falle nicht klonierter Produkte
nur schwer genau zu bestimmen sind, werden die Verfahren zur Sequenzierung
und des Primerwanderns für
PCR-Produkte unterbrochen, wenn ein PolyA-Strang in erweiterten
cDNAs identifiziert wird, wobei die cDNAs erhalten wurden, wie es
unter Fall b) beschrieben wird. Die Sequenzlänge wird mit der Größe des Nested
PCR-Produkts verglichen, das wie oben beschrieben erhalten wurde.
Aufgrund der beschränkten Genauigkeit
der Bestimmung der PCR-Produktgröße durch
Gelelektrophorese wird eine Sequenz dann als vollständig angesehen,
wenn die Größe der erhaltenen
Sequenz wenigstens 70% der Größe des ersten
Nested PCR-Produkts beträgt.
Wenn die Länge
der durch Computeranalyse bestimmten Sequenz nicht wenigstens 70%
der Länge
des Nested PCR-Produkts beträgt,
werden diese PCR-Produkte kloniert und die Sequenz der Insertion
wird bestimmt. Wenn Northern Blot-Daten zur Verfügung stehen, wird die Größe der mRNA,
die für
ein gegebenes PCR-Produkt detektiert wurde, verwendet, um abschließend zu bewerten,
ob die Sequenz vollständig
ist. Sequenzen, die die obigen Kriterien nicht erfüllen, werden
verworfen und einem neuen Isolierungsverfahren unterzogen.
-
Die
Sequenzdaten aller erweiterten cDNAs werden anschließend auf
eine proprietäre
Datenbank überführt, wo
Schritte zur Qualitätskontrolle
und Validierung durchgeführt
werden wie es in Beispiel 15 beschrieben wird.
-
3. Klonierung
von erweiterten cDNAs mit voller Länge
-
Das
die vollständige
kodierende Sequenz enthaltende PCR-Produkt wird anschließend in
einen geeigneten Vektor kloniert. Beispielsweise können die
erweiterten cDNAs in den Expressionsvektor pED6dpc2 (DiscoverEase,
Genetics Institute, Cambridge, MA) wie folgt kloniert werden. Die
pED6dpc2-Vektor-DNA wird durch Durchführen eines EcoRI-Verdaus woran
sich eine Auffüllreaktion
anschließt
mit glatten Enden bereitgestellt. Der Vektor mit glatten Enden wird
dephosphoryliert. Nach Entfernung der PCR-Primer und Ethanolpräzipitation
wird das PCR-Produkt, das die vollständige kodierende Sequenz oder
die erweiterte cDNA wie oben beschrieben enthält, mit einer Kinase phosphoryliert,
die anschließend
durch Phenol-Sevag-Extraktion und Präzipitierung entfernt wird.
Die doppelsträngige
erweiterte cDNA wird anschließend
in den Vektor ligiert und das sich ergebende Expressionsplasmid
wird in geeignete Wirtszellen eingeführt.
-
Da
die wie oben beschrieben erhaltenen PCR-Produkte Moleküle mit glatten
Enden sind, die in beiden Richtungen kloniert werden können, wird
für jedes
PCR-Produkt die Orientierung mehrerer Klone bestimmt. Anschließend werden
4 bis 10 Klone in Mikrotiterplatten angeordnet und einer PCR-Reaktion
unterzogen, wobei ein erster Primer verwendet wird, der nahe der
Klonierungsstelle im Vektor lokalisiert ist, und ein zweiter Primer
verwendet wird, der in dem Abschnitt der erweiterten cDNA lokalisiert
ist, der mit dem 3'-Ende
der mRNA korrespondiert. Dieser zweite Primer kann im Fall von direkter
Klonierung (Fall a) der Antisense Primer sein, der in der Anchored-PCR-Reaktion
verwendet wurde, oder im Fall indirekter Klonierung (Fall b) der
Antisense Primer, der innerhalb der 3'UTR lokalisiert ist. Klone, in welchen
das Startkodon der erweiterten cDNA operativ mit dem Promotor im
Vektor verknüpft
sind, um so die Expression des durch die erweiterte cDNA kodierten
Proteins zu ermöglichen,
werden aufbewahrt und sequenziert. Zusätzlich zu den Enden der cDNA-Inserts
werden auch etwa 50 bp Vektor-DNA auf jeder Seite des cDNA-Inserts
sequenziert.
-
Die
klonierten PCR-Produkte werden anschließend gemäß dem zuvor beschriebenen Verfahren
vollständig
sequenziert. In diesem Fall wird anschließend eine Anordnung langer
Fragmente zu Contigs (contigation) hinsichtlich von Wandersequenzen
durchgeführt,
die bereits für
nicht klonierte PCR-Produkte während des
Primerwanderns contigiert worden waren. Die Sequenzierung klonierter
Amplicons ist abgeschlossen, wenn die sich ergebenden Contigs sowohl
die vollständige
kodierende Region als auch überlappende
Sequenzen mit Vektor-DNA an beiden Enden umfassen.
-
4. Computeranalyse
von erweiterter cDNA mit voller Länge
-
Sequenzen
von erweiterten cDNAs mit voller Länge werden, wie weiter unten
beschrieben, einer weiteren Analyse unterzogen. Bevor die erweiterten
cDNAs mit voller Länge
nach Sequenzen von Interesse durchsucht werden, werden erweiterte
cDNAs, die nicht von Interesse sind (Vektor-RNAs, Transfer-RNAs, ribosomale
RNAs, mitochondrielle RNAs, prokaryotische RNAs und RNAs aus Pilzen),
unter Verwendung von Verfahren, die im wesentlichen ähnlich zu
denen sind, die für
5'-ESTs in Beispiel
18 beschrieben wurden, verworfen.
-
a) Identifizierung struktureller
Merkmale
-
Strukturelle
Merkmale, z.B. PolyA-Schwanz und Polyadenylierungssignal, der Sequenzen
der erweiterten cDNAs mit voller Länge werden anschließend wie
im Folgenden beschrieben bestimmt.
-
Ein
PolyA-Schwanz ist als homopolymerer Abschnitt von wenigstens 11
As mit höchstens
einer alternativen Base darin definiert. Die Suche nach einem PolyA-Schwanz
ist auf die letzten 100 Nt der Sequenz begrenzt und auf Abschnitte
mit 11 aufeinander folgenden As beschränkt, da Sequenzierungsreaktionen
nach einem solchen PolyA-Abschnitt oft nicht lesbar sind. Abschnitte
mit mehr als 90 Homologie über
8 Nukleotide hinweg werden unter Verwendung von BLAST2N als PolyA-Schwänze identifiziert.
-
Um
nach einem Polyadenylierungssignal zu suchen, wird der PolyA-Schwanz von der Volllängensequenz
abgetrennt. Die 50 bp, die dem PolyA-Schwanz vorausgehen, werden als erstes
nach dem kanonischen Polyadenylierungssignal AAUAAA durchsucht und
wenn das kanonische Signal nicht detektier wird, werden sie nach
dem alternativen AUUAAA-Signal durchsucht (Sheets et al., Nuc. Acids
Res. 18:5799-5805, 1990). Wenn keines dieser beiden Konsensus-Polyadenylierungssignale
nachgewiesen wird, wird das kanonische Motiv erneut durchsucht,
wobei eine Nichtübereinstimmung
zugelassen wird, um möglichen
Sequenzierungsfehlern Rechnung zu tragen. Mehr als 85% der identifizierten
Polyadenylierungssignale beider Typen enden tatsächlich 10 bis 30 bp vom PolyA-Schwanz
entfernt. Die alternativen AUUAAA-Signale stelen etwa 15% der Gesamtzahl
der identifizierten Polyadenylierungssignale dar.
-
b) Identifizierung funktioneller
Merkmale
-
Funktionelle
Merkmale, z.B. ORFs und Signalsequenzen, der Sequenzen der erweiterten
cDNAs mit voller Länge
wurden anschließend
bestimmt wie es im Folgenden beschrieben wird.
-
Die
3 Leserahmen im oberen Strang erweiterter cDNAs werden nach ORFs
durchsucht, die als die Fragmente mit maximaler Länge definiert
sind, die mit einem Translationsinitatinoskodon beginnen und mit
einem Stopkodon enden. ORFs, die wenigstens 20 Aminosäuren kodieren,
sind bevorzugt.
-
Jeder
nachgewiesene ORF wird anschließend
auf das Vorliegen eines Signalpeptids in den ersten 50 Aminosäuren oder
wo angebracht ist in kürzeren
Regionen bis hin zu 20 Aminosäuren
oder weniger im ORF unter Verwendung des Matrixverfahrens nach von
Heijne (Nuc. Acids Res. 14:4683-4690, 1986) durchsucht, wie es in
Beispiel 22 beschrieben wird.
-
c) Homologie zu Nukleotid-
oder Proteinsequenzen
-
Eine
Kategorisierung von Volllängen-Sequenzen
kann unter Verwendung von Verfahren, die im Wesentlichen zu denjenigen ähnlich sind,
die in Beispiel 24 für
5'-ESTs beschrieben
wurden, erreicht werden.
-
Erweiterte
cDNAs, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, können anschließend bearbeitet
werden, um Nukleinsäuren
zu erhalten, die gewünschte
Abschnitte der erweiterten cDNA umfassen, wobei herkömmliche
Techniken, wie beispielsweise Subklonierung, PCR oder in vitro-Oligonukleotidsynthese
verwendet werden. Beispielsweise können Nukleinsäuren, die
nur die vollständig
kodierenden Sequenzen umfassen (d.h. die Sequenzen, die das Signalpeptid
und das reife Protein kodieren, das zurückbleibt, nachdem das Signalpeptid
abgespalten worden ist), unter Verwendung von dem Fachmann bekannten
Techniken erhalten werden. Alternativ können herkömmliche Techniken verwendet
werden, um Nukleinsäuren
zu erhalten, die nur die kodierenden Sequenzen für das reife Protein enthalten,
das zurückbleibt,
wenn das Signalpeptid abgespalten wurde, oder um Nukleinsäuren zu
erhalten, die nur die für
die Signalpeptide kodierenden Sequenzen enthalten.
-
In
gleicher Weise können
Nukleinsäuren,
die einen anderen beliebigen Abschnitt der für das sekretierte Protein kodierenden
Sequenzen enthalten, erhalten werden. Beispielsweise kann die Nukleinsäure wenigstens
10 aufeinander folgende Basen einer erweiterten cDNA enthalten,
wie beispielsweise eine der hierin weiter unten beschriebenen erweiterten
cDNAs. In einer anderen Ausführungsform
kann die Nukleinsäure
wenigstens 15 aufeinander folgende Basen einer erweiterten cDNA,
enthalten, wie beispielsweise einer der weiter unten beschriebenen
erweiterten cDNAs. Alternativ kann die Nukleinsäure wenigstens 20 aufeinander
folgende Basen einer erweiterten cDNA enthalten, wie beispielsweise
einer der weiter unten beschriebenen erweiterten cDNAs. In einer
anderen Ausführungsform
kann die Nukleinsäure
wenigstens 25 aufeinander folgende Basen einer erweiterten cDNA
enthalten, wie beispielsweise einer der weiter unten beschriebenen
erweiterten cDNAs. In noch einer anderen Ausführungsform kann die Nukleinsäure wenigstens
40 aufeinander folgende Basen einer erweiterten cDNA enthalten,
wie beispielsweise einer der weiter unten beschriebenen erweiterten cDNAs.
-
Nachdem
eine erweiterte cDNA erhalten wurde, kann sie sequenziert werden,
um die Aminosäuresequenz
zu bestimmen, die sie kodiert. Nachdem die kodierte Aminosäuresequenz
einmal bestimmt worden ist, kann jede der vielen denkbaren cDNAs,
die das Protein kodieren, durch einfache Anwendung der Degeneration
des genetischen Codes erzeugt und identifiziert werden. Beispielsweise
können
allelische Varianten und andere homologe Nukleinsäuren, wie
weiter unten beschrieben, identifiziert werden. Alternativ können die
Nukleinsäuren,
die die gewünschte
Aminosäuresequenz
kodieren, in vitro synthetisiert werden.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
kann die kodierende Sequenz unter Verwendung der bekannten Kodon-
und Kodonpaar-Preferenzen des Wirtsorganismus, in dem die cDNA exprimiert
werden soll, ausgewählt
werden.
-
Die
aus den hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleiteten erweiterten cDNAs wurden wie in Beispiel 28 weiter
unten beschrieben erhalten.
-
BEISPIEL 28
-
Charakterisierung klonierter
erweiterter cDNAs, die unter Verwendung von 5'-ESTs erhalten wurden
-
Das
oben in Beispiel 27 beschriebene Verfahren wurden verwendet, um
die erweiterten cDNAs, die von den hierin beschriebenen 5'-ESTs für eine Vielfalt
von Geweben abgeleitet wurden, zu erhalten. Die folgende Liste stellt
einige Beispiele der so erhaltenen erweiterten cDNAs zusammen.
-
Unter
Verwendung dieses Ansatzes wurde die Volllängen-cDNA gemäß SEQ ID
NO: 17 erhalten (interne Identifizierungsnummer 48-19-3-G1-FL1).
Diese cDNA fällt
in die oben beschriebene „EST-ext" Kategorie und kodiert
das Signalpeptid MKKVLLLITAILAVAVG (SEQ ID NO: 18) mit einem von
Heijne-Score von 8.2.
-
Die
Volllängen-cDNA
gemäß SEQ ID
NO: 19 wurde ebenfalls unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten
(interne Identifizierungsnummer 58-34-2-E7-FL2). Diese cDNA fällt in die
oben beschriebene „EST-ext" Kategorie und kodiert
das Signalpeptid MWWFQQGLSFLPSALVIWTSA (SEQ ID NO: 20) mit einem von
Heijne-Score von 5.5.
-
Eine
andere unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens erhaltene
Volllängen-cDNA
weist die Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 21 auf (interne Identifizierungsnummer 51-27-1-E8-FL1). Diese
cDNA fällt
in die oben beschriebene „EST-ext" Kategorie und kodiert
das Signalpeptid MVLTTLPSANSANSPVNMPTTGPNSLSYASSALSPCLT (SEQ ID
NO: 22) mit einem von Heijne-Score von 5.9.
-
Das
obige Verfahren wurde ebenfalls verwendet, um eine Volllängen-cDNA
mit der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 23 zu erhalten (interne Identifizierungsnummer 76-4-1-G5-FL1).
Diese cDNA fällt
in die oben beschriebene „EST-ext" Kategorie und kodiert
das Signalpeptid ILSTVTALTFAXA (SEQ ID NO: 24) mit einem von Heijne-Score
von 5.5.
-
Die
Volllängen-cDNA
gemäß SEQ ID
NO: 25 wurde ebenfalls unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten
(interne Identifizierungsnummer 51-3-3-B10-FL3). Diese cDNA fällt in die
oben beschriebene Kategorie „neu" und kodiert ein
Signalpeptid LVLTLCTLPLAVA (SEQ ID NO: 26) mit einem von Heijne-Score
von 10.1.
-
Die
Volllängen-cDNA
gemäß SEQ ID
NO: 27 wurde ebenfalls unter Verwendung dieses Verfahrens erhalten
(interne Identifizierungsnummer 58-35-2-F10-FL2). Diese cDNA fällt in die
oben beschriebene Kategorie „neu" und kodiert ein
Signalpeptid LWLLFFLVTAIHA (SEQ ID NO: 28) mit einem von Heijne-Score
von 10.7.
-
Bakterienklone,
die Plasmide enthalten, die die oben beschriebenen Volllängen-cDNAs
enthalten, werden gegenwärtig
in den Laboren des Erfinders unter den oben bereitgestellten internen
Identifizierungsnummern gelagert. Die Inserts können aus den gelagerten Materialien
durch Aufzucht eines Aliquots des entsprechenden Bakterienklons
im geeigneten Medium gewonnen werden.
-
Anschließend kann
die Plasmid-DNA unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren
zur Plasmidisolierung, wie beispielsweise alkalische Lyse von Minipreps
oder alkalische Lyse im Großmaßstab als Verfahren
zur Plasmidisolierung, isoliert werden. Wenn gewünscht, kann die Plasmid-DNA
ferner mittels Zentrifugation auf einem Cäsiumchloridgradienten, Größenausschlusschromatografie
oder Anionenaustauschchromatografie weiter angereichert werden.
Die unter Verwendung dieser Verfahren erhaltene Plasmid-DNA kann anschließend unter
Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardklonierungstechniken
manipuliert werden. Alternativ kann eine PCR mit Primern, die hinsichtlich
beider Enden der cDNA-Insertion konzipiert sind, durchgeführt werden.
Das mit der cDNA korrespondierende PCR-Produkt kann anschließend unter
Verwendung von dem Fachmann vertrauten Standardklonierungstechniken
manipuliert werden.
-
Die
durch die erweiterten cDNAs kodierten Polypeptide können auf
das Vorliegen bekannter struktureller oder funktioneller Motive
oder auf das Vorliegen von Signaturen, kleiner Aminosäuresequenzen,
die unter den Mitgliedern einer Proteinfamilie konserviert sind,
durchsucht werden. Die konservierten Regionen sind verwendet worden,
um Konsensusmuster oder -matrizen abzuleiten, die in der PROSITE-Datenbank
erfasst sind, insbesondere die Datei Prosite.dat (Version 13.0 vom
November 1995, die sich unter http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html
befindet). Die Programme Prosite_convert und Prosite_scan (http://ulrec3.unil.ch/ftpserveur/prosite_scan)
können
verwendet werden, um Signaturen auf erweiterten cDNAs zu finden.
-
Für jedes
Muster, das mit dem Prosite_convert Programm aus der Prosite.dat
Datei erhalten wurde, kann die Fehlerfreiheit der Detektion einer
neuen Proteinsequenz durch Bewertung der Häufigkeit irrelevanter Treffer
im Hinblick auf die Population humaner sekretierter Proteine, die
von der SWISSPROT-Datenbank
umfasst sind, beurteilt werden. Das Verhältnis zwischen der Trefferzahl
im Hinblick auf verschobene (shuffled) Proteine (mit einer Fenstergröße von 20
Aminosäuren)
und der Trefferzahl Hinblick auf native (nicht verschobene; unshuffled)
Proteine kann als Index verwendet werden. Jedes Muster, für das das
Verhältnis
größer als 20%
ist (ein Treffer in Bezug auf verschobene Proteine gegenüber 5 Treffern
in Bezug auf native Proteine) kann während der Suche mit Prosite_scan übergangen
werden. Das Programm, das verwendet wurde, um Proteinsequenzen zu
verschieben (db_shuffled) und das Programm, das verwendet wurde,
um Statistiken für jedes
Muster in den Proteindatenbanken zu bestimmen (Prosite_statistics),
stehen auf der ftp-Seite http://ulrec3.unil.ch/ftpserveur/prosite_scan
zur Verfügung.
-
Zusätzlich zu
den auf PCR basierenden Verfahren zum Erlangen erweiterter cDNAs
können
auch traditionelle Verfahren auf Grundlage von Hybridisierung verwendet
werden. Diese Verfahren können
auch verwendet werden, um genomische DNAs zu erhalten, die mRNAs
kodieren, von denen die 5'-ESTs
abgeleitet sind, mRNAs, die mit den erweiterten cDNAs korrespondieren
oder Nukleinsäuren,
die zu den erweiterten cDNAs oder 5'-ESTs homolog sind. Beispiel 29 stellt
weiter unten Beispiele für
solche Verfahren bereit.
-
BEISPIEL 29
-
Verfahren zum Erlangen
von cDNAs, die die vollständige
kodierende Region und das authentische 5'-Ende der korrespondierenden mRNA umfassen
-
Eine
Volllängen-cDNA-Bibliothek
kann unter Verwendung der Strategien, die in den Beispielen 13,14,15
und 16 weiter oben beschrieben sind, durch Austausch des in Beispiel
14 verwendeten willkürlichen Nonamers
mit einem Oligo-dT-Primer hergestellt werden. Beispielsweise kann
das Oligonukleotid gemäß SEQ ID
NO: 14 verwendet werden.
-
Alternativ
kann eine cDNA-Bibliothek oder genomische DNA-Bibliothek von einer
kommerziellen Bezugsquelle bezogen oder durch Verwendung von dem
Fachmann bekannten Techniken hergestellt werden. Solche cDNA- oder
genomische DNA-Bibliotheken können
wie folgt verwendet werden, um erweiterte cDNAs zu isolieren, die
aus einem 5'-EST
oder zu den erweiterten cDNAs oder 5'-ESTs
Nukleinsäurenhomologen
erhalten wurden. Die cDNA-Bibliothek oder genomische DNA-Bibliothek
wird mit einer detektierbaren Sonde hybridisiert, die wenigstens
10 aufeinander folgende Nukleotide des 5'-ESTs oder der erweiterten cDNA umfasst, wobei
herkömmliche
Techniken verwendet werden. Vorzugsweise umfasst die Probe wenigstens
12, 15 oder 17 aufeinander folgende Nukleotide des 5'-ESTs oder der erweiterten
cDNA. Stärker
bevorzugt umfasst die Probe wenigstens 20 bis 30 aufeinander folgende
Nukleotide des 5'-ESTs
oder der erweiterten cDNA. In einigen Ausführungsformen umfasst die Sonde
mehr als 30 Nukleotide des 5'-ESTs
oder der erweiterten cDNA.
-
Techniken
zur Identifizierung von cDNA-Klonen in einer cDNA-Bibliothek, die
an eine gegebene Sondensequenz hybridisieren, sind in Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratoy Manual 2. Ausgabe, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 1989, offenbart. Die gleichen Techniken
können
verwendet werden, um genomische DNA zu isolieren.
-
In
Kürze,
cDNA- oder genomische DNA-Klone, die an die detektierbare Sonde
hybridisieren, werden identifiziert und zur weiteren Manipulierung
wie folgt isoliert. Eine Probe, die wenigstens 10 aufeinander folgende
Nukleotide des 5'-ESTs oder der erweiterten
cDNA umfasst, wird mit einer detektierbaren Markierung, wie beispielsweise
einem Radioisotop oder einem Fluoreszenzmolekül, markiert. Die Probe umfasst
vorzugsweise wenigstens 12, 15 oder 17 aufeinander folgende Nukleotide
aus dem 5'-EST oder
der erweiterten cDNA. Stärker
bevorzugt umfasst die Sonde 20 bis 30 aufeinander folgende Nukleotide
aus dem 5'-EST oder
der erweiterten cDNA. In einigen Ausführungsformen umfasst die Probe
mehr als 30 Nukleotide aus dem 5'-EST oder
der erweiterten cDNA.
-
Techniken
zur Markierung der Sonde sind wohl bekannt und umfassen Phosphorylierung
mit Polynukleotidkinase, Nick-Translation, in vitro-Transkription
und nicht radioaktive Techniken. Die cDNAs oder genomischen DNAs
in der Bibliothek werden auf Nitrocellulose- oder Nylonfilter überführt und
denaturiert. Nach Blockierung unspezifischer Stellen wird der Filter
mit der markierten Sonde für
eine ausreichende Zeitspanne inkubiert, um das Binden der Sonde
an cDNAs oder genomische DNAs, die eine Sequenz enthalten, die daran hybridisieren
kann zu ermöglichen.
-
Durch
Verändern
der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen, die verwendet werden,
um erweiterte cDNAs oder genomische DNAs, die an die detektierbare
Sonde hybridisieren, zu identifizieren, können erweiterte cDNAs mit unterschiedlichen
Graden von Homologie gegenüber
der Sonde identifiziert und isoliert werden, wobei dies weiter unten
beschrieben wird.
-
1. Identifizierung
erweiterter cDNA- oder genomischer cDNA-Sequenzen mit einem hohen
Maß an
Homologie zur markierten Sonde
-
Um
die erweiterten cDNAs oder genomischen DNAs mit einem hohen Grad
an Homologie zur Sondensequenz zu identifizieren, kann die Schmelztemperatur
der Sonde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet werden:
Für Sonden
mit einer Länge
zwischen 14 und 70 Nukleotiden wird die Schmelztemperatur (Tm) unter
Verwendung der Gleichung Tm=81,5+16,6(log[Na+])+0,41(Fraktion
G+C)-(600/N) berechnet, wobei N die Länge der Sonde ist.
-
Wenn
die Hybridisierung in einer Formamid haltigen Lösung durchgeführt wird,
kann die Schmelztemperatur unter Verwendung der Gleichung Tm=81,5+16,6(log[Na+])+0,41
(Fraktion G+C)-(0,63% Formamid)-(600/N) berechnet werden, wobei
N die Länge
der Sonde ist.
-
Eine
Vorhybridisierung kann in 6 × SSC,
5 × Denhardt's Reagenz, 0,5 SDS,
100 μg denaturierter
fragmentierter Lachssperma-DNA oder 6 × SSC, 5 × Denhardt's Reagenz, 0,5% SDS, 100 μg denaturierter
fragmentierter Lachssperma-DNA, 50% Formamid durchgeführt werden.
Die Rezepte für
SSC und Denhardt's-Lösungen sind
in Sambrook et al., supra, aufgeführt.
-
Die
Hybridisierung wird durch Zugabe der detektierbaren Sonde zu den
oben aufgeführten
Vorhybridisierungslösungen
durchgeführt.
Wenn die Sonde eine doppelsträngige
DNA umfasst, wird sie vor der Zugabe zur Hybridisierungslösung denaturiert.
Der Filter wird mit der Hybridisierungslösung für eine ausreichend lange Zeitspanne
in Kontakt gebracht, um es der Sonde zu ermöglichen, an erweiterte cDNAs
oder genomische DNAs, die zur Sonde komplementäre Sequenzen oder Homologe
enthalten, zu hybridisieren. Für
Sonden mit einer Länge
von über
200 Nukleotiden kann die Hybridisierung 15-25°C
unterhalb der Tm durchgeführt
werden. Für
kürzere
Sonden, wie beispielsweise Oligonukleotidsonden, kann die Hybridisierung
15-25°C
unterhalb der Tm durchgeführt
werden. Für
Hybridisierungen in 6× SSC
wird die Hybridisierung vorzugsweise bei etwa 68°C ausgeführt. Für Hybridisierungen in 50% Formamid
enthaltenden Lösungen
wird die Hybridisierung vorzugsweise bei etwa 42°C ausgeführt.
-
Alle
vorausgehenden Hybridisierungen werden als „stringente" Bedingungen betrachtet.
-
Im
Anschluss an die Hybridisierung wird der Filter in 2 × SSC, 0,1%
SDS bei Raumtemperatur für
15 Minuten gewaschen. Anschließend
wird der Filter mit 0,1 × SSC,
0,5% SDS bei Raumtemperatur für
30 Minuten bis zu 1 Stunde gewaschen. Danach wird die Lösung bei
der Hybridisierungstemperatur in 0,1 × SSC, 0,5 SDS gewaschen. Ein
abschließender
Waschschritt wird in 0,1 × SSC
bei Raumtemperatur durchgeführt.
-
Erweiterte
cDNAs, Nukleinsäurehomologe
zu erweiterten cDNAs oder 5'-ESTs oder genomische DNAs,
die an die Sonde hybridisierten, werden durch Autoradiographie oder
andere herkömmliche
Techniken identifiziert.
-
2. Erlangen
erweiterter cDNA- oder genomischer cDNA-Sequenzen mit einem niedrigeren
Maß an
Homologie zur markierten Sonde
-
Das
obige Verfahren kann modifiziert werden, um erweiterte cDNAs, Nukleinsäurehomologe
zu erweiterten cDNAs oder genomische DNAs mit einem abnehmenden
Maß an
Homologie zur Sondensequenz zu identifizieren. Beispielsweise können weniger
stringente Bedingungen verwendet werden, um erweiterte cDNAs, Nukleinsäurehomologe
zu erweiterten cDNAs oder genomische DNAs mit abnehmender Homologie
zu der detektierbaren Sonde zu erhalten. Beispielsweise kann die
Hybridisierungstemperatur in Schrittgrößen von 5°C von 68°C bis auf 42°C in einem Hybridisierungspuffer
mit einer Natriumkonzentration von etwa 1 M abgesenkt werden. Im
Anschluss an die Hybridisierung kann der Filter mit 2 × SSC, 0,5%
SDS bei der Hybridisierungstemperatur gewaschen werden. Diese Bedingungen
werden über
50°C als „moderate" Bedingungen und unter
50°C als „schwache" Bedingungen betrachtet.
-
Alternativ
kann die Hybridisierung in Puffern, wie beispielsweise Formamid
enthaltender 6 × SSC-Puffer
bei einer Temperatur von 42°C
durchgeführt
werden. In diesem Fall kann die Konzentration an Formamid im Hybridisierungspuffer
in 5%-Schritten von 50% auf 0% verringert werden, um Klone mit einem
niedrigeren Maß an
Homologie zu der Sonde zu identifizieren. Im Anschluss an die Hybridisierung
kann der Filter mit 6 × SSC,
0,5% SDS bei 50°C
gewaschen werden. Über
25% Formamid werden die Bedingungen als „moderate" Bedingungen und unter 25% Formamid
als „schwache" Bedingungen betrachtet.
-
Erweiterte
cDNAs, Nukleinsäurehomologe
zu erweiterten cDNAs oder genomische DNAs, die an die Sonde hybridisiert
haben, werden durch Autoradiographie identifiziert.
-
3. Bestimmung
des Grades an Homologie zwischen den erhaltenen erweiterten cDNAs
und der markierten Sonde
-
Wenn
es erwünscht
ist, Nukleinsäurehomologe
zu erweiterten cDNAs zu erhalten, wie beispielsweise allelische
Varianten davon, oder Nukleinsäuren,
die Proteine kodieren, die mit den Proteinen, die durch die erweiterten
cDNAs kodiert werden, in Zusammenhang stehen, kann der Grad an Homologie
zwischen der hybridisierten Nukleinsäure und der erweiterten cDNA
oder dem 5'-EST,
die als Sonde verwendet wurden, unter Verwendung von BLAST2N weiter
bestimmt werden; die Parameter können
abhängig
von der Sequenzlänge und
dem untersuchten Grad an Homologie angepasst werden. Um den Grad
an Homologie zwischen der hybridisierten Nukleinsäure und
der erweiterten cDNA oder dem 5'-EST, von denen die
Sonde abgeleitet wurde, zu bestimmen, werden die Nukleotidsequenzen
der hybridisierten Nukleinsäure
und die der erweiterten cDNA oder des 5'-ESTs, von denen die Sonde abgeleitet
wurde, verglichen.
-
Beispielsweise
können
unter Verwendung der obigen Verfahren Nukleinsäuren mit wenigsten 95% Nukleinsäurehomologie
zu der erweiterten cDNA oder dem 5'-EST,
von denen die Sonde abgeleitet wurde, erhalten und identifiziert
werden. In ähnlicher
Weise kann man unter Verwendung fortschreitend weniger stringenter Hybridisierungsbedingungen
Nukleinsäuren
mit wenigstens 90%, wenigstens 85%, wenigstens 80% oder wenigstens
75% Homologie zu der erweiterten cDNA oder dem 5'-EST, von denen die Sonde abgeleitet
wurde, erhalten und identifizieren.
-
Um
zu bestimmen, ob ein Klon ein Protein mit einem gegebenen Maß an Homologie
zu dem Protein, das durch die erweiterte cDNA oder das 5'-EST kodiert wird,
kodiert, wird die Aminosäuresequenz,
die durch die erweiterte cDNA oder das 5'-EST kodiert wird, mit der Aminosäuresequenz,
die durch die hybridisierende Nukleinsäure kodiert wird, verglichen.
Es wird festgestellt, dass Homologie vorliegt, wenn eine Aminosäuresequenz
in der erweiterten cDNA oder dem 5'-EST mit einer Aminosäuresequenz
in der hybridisierenden Nukleinsäure
in enger Beziehung steht. Eine Sequenz steht in enger Beziehung,
wenn sie zu der Sequenz der erweiterten cDNA oder der des 5'-ESTs identisch ist
oder wenn sie eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen enthält, in denen
Aminosäuren
mit ähnlichen
Charaktereigenschaften untereinander substituiert worden sind. Unter
Verwendung der obigen Verfahren und Algorithmen, wie beispielsweise
FASTA, mit Parametern, die von der Sequenzlänge und dem untersuchten Grad
an Homologie abhängig
sind, kann man Nukleinsäuren
erhalten, die Proteine kodieren, die wenigstens 95%, wenigstens
90%, wenigstens 85%, wenigstens 80% oder wenigstens 75% Homologie
zu den Proteinen aufweisen, die von der erweiterten cDNA oder dem
5'-EST kodiert werden,
von der/dem die Sonde abgeleitet wurde.
-
Um
erweiterte cDNAs unter Verwendung von 5'-ESTs zu erhalten stehen über die
oben beschriebenen Verfahren hinausgehend andere Protokolle zur
Verfügung,
wie es in den nachfolgenden Absätzen
ausgeführt wird.
-
Erweiterte
cDNAs können
durch das Erlangen von mRNA aus dem Gewebe, aus der Zelle oder dem Organismus
von Interesse hergestellt werden, wobei auf PolyA-Selektionsverfahren
zurückgreifende mRNA-Herstellungsverfahren
oder andere dem Fachmann bekannten Techniken verwendet werden. Ein
erster Primer, der zur Hybridisierung mit dem PolyA-Schwanz der mRNA
in der Lage ist, wird an die mRNA hybridisiert und eine reverse
Transkriptionsreaktion wird durchgeführt, um einen cDNA-Erststrang
zu erzeugen.
-
Der
cDNA-Erststrang wird mit einem zweiten Primer, der wenigstens 10
aufeinander folgende Nukleotide gemäß der Sequenz SEQ ID NO: 38
enthält,
hybridisiert. Vorzugsweise umfasst der Primer wenigstens 12, 15
oder 17 aufeinander folgende Nukleotide gemäß der Sequenz SEO ID NO: 38.
Stärker
bevorzugt umfasst der Primer 20 bis 30 aufeinander folgende Nukleotide
gemäß der Sequenz
SEQ ID NO: 38. In einigen Ausführungsformen
umfasst der Primer mehr als 30 Nukleotide der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 38. Wenn es gewünscht
ist, erweiterte cDNAs zu erhalten, die die Gesamtprotein kodierende
Sequenz einschließlich
der authentischen Translationsinitiationsstelle enthalten, enthält der verwendete
zweite Primer Sequenzen, die stromaufwärts der Translationsinitiationsstelle
lokalisiert sind. Zur Erzeugung eines zum cDNA-Erststrang komplementären cDNA-Sekundärstrangs,
ist der zweite Primer erweitert. Alternativ kann wie weiter oben
beschrieben wird, eine RT-PCR-Reaktion
durchgeführt
werden, wobei Primer von beiden Enden der cDNA, die erhalten werden
soll, eingesetzt werden.
-
Erweiterte
cDNAs, die 5'-Fragmente
der mRNA enthalten, können
durch Hybridisierung einer mRNA, die die Sequenz für das 5'-EST umfasst, für das eine
erweiterte cDNA erwünscht
ist, mit einem Primer, der wenigstens 10 aufeinander folgende Nukleotide
der Sequenzen umfasst, die komplementär zu dem 5'-EST sind, und reverses Transkribieren
des hybridisierten Primers zur Erstellung eines cDNA-Erststrang
der mRNAs, erzeugt werden. Vorzugsweise umfasst der Primer wenigstens
12, 15 oder 17 aufeinander folgende Nukleotide des 5'-ESTs. Stärker bevorzugt
umfasst der Primer 20 bis 30 aufeinander folgende Nukleotide des 5'-ESTs.
-
Danach
wird ein cDNA-Zweitstrang, der komplementär zum cDNA-Erststrang ist, synthetisiert. Der cDNA-Zweitstrang
kann durch Hybridisierung eines Primers, der komplementär zu Sequenzen
im cDNA-Erststrang ist, an den cDNA-Erststrang und Verlängern des
Primers zur Erzeugung des cDNA-Zweitstrangs
hergestellt werden.
-
Die
doppelsträngigen
erweiterten cDNAs, die unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren hergestellt
wurden, werden isoliert und kloniert. Die erweiterten cDNAs können in
Vektoren, wie beispielsweise Plasmide, oder virale Vektoren kloniert
werden, die zur Replikation in einer entsprechenden Wirtszelle fähig sind.
Die Wirtszelle kann beispielsweise eine Bakterienzelle, eine Säugerzelle,
eine Geflügelzelle
oder eine Insektenzelle sein.
-
Techniken
zur Isolierung von mRNA, zum reversen Transkribieren eines Primers,
der an mRNA hybridisiert ist, um einen cDNA-Erststrang zu erzeugen,
Verlängern
eines Primers, um einen cDNA-Zweitstrang zu erzeugen, der komplementär zum cDNA-Erststrang
ist, Isolieren der doppelsträngigen
cDNA und Klonieren der doppelsträngigen
cDNA sind dem Fachmann wohl bekannt und in Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. 1997 und Sambrook et
al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1989, beschrieben.
-
Alternativ
können
Verfahren, wie beispielsweise das in Beispiel 29 beschriebene, zum
Erlangen von Volllängen-cDNAs
oder erweiterten cDNAs verwendet werden. In diesem Ansatz werden
Volllängen-
oder erweiterte cDNAs aus mRNA hergestellt und wie im Folgenden
beschrieben in doppelsträngige
Phagemids kloniert. Die cDNA-Bibliothek in den doppelsträngigen Phagemids
wird anschließend
durch Behandlung mit einer Endonuklease, wie beispielsweise dem Gene
11-Produkt des Phagen F1, und einer Exonuklease (Chang et al., Gene
127:95-8, 1993) in eine einzelsträngige Form gebracht. Ein biotinyliertes
Oligonukleotid, das die Sequenz eines 5'-ESTs oder die Sequenz eines wenigstens
10 Nukleotide davon enthaltenden Fragments umfasst, wird an die
einzelsträngigen
Phagemids hybridisiert. Vorzugsweise umfasst das Fragment wenigstens 12,
15 oder 17 aufeinander folgende Nukleotide des 5'-ESTs. Stärker bevorzugt umfasst das
Fragment 20 bis 30 aufeinander folgende Nukleotide des 5'-ESTs. In einigen
Verfahren kann das Fragment mehr als 30 aufeinander folgende Nukleotide
des 5'-ESTs umfassen.
-
Hybride
zwischen dem biotinylierten Oligonukleotid und Phagemids mit Inserts,
die die 5'-EST-Sequenz
enthalten, werden durch Inkubation der Hybride mit Streptavidin
beschichteten paramagnetischen Beads und Gewinnung der Beads mit
einem Magneten isoliert (Fry et al., Biotechniques, 13:124-131,
1992). Danach werden die sich ergebenden Phagemids, die die 5'-EST-Sequenz enthalten,
von den Beads abgelöst
und unter Verwendung eines Primers, der für die 5'-EST-Sequenz spezifisch ist, in doppelsträngige DNA
umgewandelt. Alternativ können
Protokolle, wie beispielsweise der Gene Trapper Kit (Gibco BRL)
verwendet werden. Die so erhaltene doppelsträngige DNA wird in Bakterien
transformiert. Erweiterte cDNAs, die die 5'-EST-Sequenz enthalten, werden durch
Kolonie-PCR oder Kolonie-Hybridisierung identifiziert.
-
Unter
Verwendung eines beliebigen der oben in Abschnitt III beschriebenen
Verfahren kann eine Vielzahl erweiterter cDNAs, die Volllängenprotein
kodierende Sequenzen oder Sequenzen enthalten, die nur das reife
Protein kodieren, das zurückbleibt
nachdem das Signalpeptid abgespalten wurde, als cDNA-Bibliotheken für eine nachfolgende
Bewertung der kodierten Proteine oder zur Verwendung in diagnostischen
Assays, wie es weiter unten beschrieben wird, bereitgestellt werden.
-
IV. Expression von Proteinen,
die durch erweiterte cDNAs kodiert werden, welche unter Verwendung
von 5'-ESTs isoliert
wurden
-
Erweiterte
cDNAs, die Gesamtprotein kodierende Sequenzen ihrer entsprechenden
mRNAs oder Abschnitte davon kodieren, wie beispielsweise cDNAs,
die das reife Protein kodieren, können verwendet werden, um die
kodierten sekretierten Proteine oder Abschnitte davon zu exprimieren,
wie es in Beispiel 30 weiter unten beschrieben wird. Wenn gewünscht, können die
erweiterten cDNAs die Sequenzen enthalten, die das Signalpeptid
kodieren, um so die Sekretion des exprimierten Proteins zu vereinfachen.
Es wird erkannt, dass eine Vielzahl von erweiterten cDNAs, die Gesamtprotein
kodierende Sequenzen oder Abschnitte davon enthalten, gleichzeitig
in Expressionsvektoren kloniert werden können, um so eine Expressionsbibliothek
zur Analyse der kodierten Proteine zu erzeugen, wie es weiter unten
beschrieben wird.
-
BEISPIEL 30
-
Expression der Proteine,
die durch die Gene kodiert werden, die mit 5'-ESTs oder Teilen davon korrespondieren
-
Um
die Proteine zu exprimieren, die durch die Gene kodiert werden,
die mit 5'-ESTs
(oder Teilen davon) korrespondieren, werden Volllängen-cDNAs,
die die vollständige
Protein kodierende Region enthalten, oder erweiterte cDNAs, die
Sequenzen in Nachbarschaft zu den 5'-ESTs (oder Abschnitten davon) enthalten, erhalten,
wie es in den Beispielen 27-29 beschrieben wird, und in einen geeigneten
Expressionsvektor kloniert. Wenn gewünscht, können die Nukleinsäuren die
Sequenzen enthalten, die das Signalpeptid kodieren, um so die Sekretion
des exprimierten Proteins zu erleichtern. Die Nukleinsäuren, die
in die Expressionsvektoren insertiert werden, können auch Sequenzen enthalten,
die sich stromaufwärts
zu den Sequenzen befinden, die das Signalpeptid kodieren, wie beispielsweise
Sequenzen, die Expressionsmengen regulieren oder Sequenzen, die
eine gewebespezifische Expression übertragen.
-
Die
Nukleinsäure,
die das zu exprimierende Protein oder das Polypeptid kodiert, ist
operativ mit einem Promotor in einem Expressionsvektor verknüpft, wobei
hierzu herkömmliche
Klonierungstechnologien verwendet werden. Der Expressionsvektor
kann ein beliebiges, im Fachbereich bekanntes Säuger-, Hefe-, Insekten- oder
bakterielles Expressionssystem sein. Kommerziell erhältliche
Vektoren und Expressionssysteme stehen von einer Vielzahl von Lieferanten
zur Verfügung,
einschließlich
Genetics Institut (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, Kalifornien),
Promega (Madison, Wisconsin) und Invitrogen (San Diego, Kalifornien).
Wenn gewünscht,
kann der Kodonkontext und die Kodonpaarung der Sequenz für den bestimmten
Expressionsorganismus, in den der Expressionsvektor eingeführt wird,
optimiert werden, wie es beispielhaft durch Hatfield, et al., US-Patent
Nr. 5,082,767 beschrieben wird, um so die Expression zu steigern
und um eine passende Proteinfaltung zu ermöglichen.
-
Die
in den Expressionsvektor einklonierte cDNA kann das vollständige Protein
(d.h. das Signalpeptid und das reife Protein), das reife Protein
(d.h. das Protein, das durch Abspalten des Signalpeptids erzeugt
wurde), nur das Signalpeptid oder einen anderen beliebigen Abschnitt
davon enthalten.
-
Das
folgende Verfahren wird als ein beispielhaftes Verfahren zur Expression
der Proteine bereitgestellt, die durch die erweiterten cDNAs kodiert
werden, die mit den 5'-ESTs
oder den Nukleinsäuren
korrespondieren wie es oben beschrieben wird. Zuerst werden das
Methionininitiationskodon für
das Gen und das PolyA-Signal des Gens identifiziert. Wenn die Nukleinsäure, die
das zu exprimierende Polypeptid kodiert, kein Methionin aufweist,
das als Initiationsstartstelle dient, kann ein initiierendes Methionin
neben dem ersten Kodon der Nukleinsäure eingefügt werden, wobei herkömmliche
Techniken verwendet werden. In gleicher Weise kann, wenn die erweiterte
cDNA kein PolyA-Signal
aufweist, diese Sequenz an das Konstrukt angefügt werden, beispielsweise durch
Ausspleißen
des PolyA-Signals aus pSG5 (Stratagene), wobei BglII- und SalI-Restriktionsendonukleaseenzyme
verwendet werden, und Einfügen
dieses PolyA-Signals in den Säugerexpressionsvektor
pXT1 (Stratagene). pXT1 enthält die
LTRs und einen Teil des gag-Gens aus Moloney Murine Leukemia Virus.
Die Position der LTRs im Konstrukt ermöglicht eine effiziente stabile
Transfektion. Der Vektor umfasst den Herpes Simplex Tymidinkinasepromotor
und das selektierbare Neomycingen. Die erweiterte cDNA oder ein
Abschnitt davon, die/der das zu exprimierende Polypeptid kodiert,
wird durch eine PCR-Reaktion aus dem bakteriellen Vektor erhalten,
wobei Oligonukleotidprimer verwendet werden, die komplementär zu der
erweiterten cDNA oder einem Abschnitt davon sind und die Restriktionsendonuklease-Sequenzen
für PstI
enthalten, die in den 5'-Primer
eingebracht sind, und für
BglII am 5'-Ende
des entsprechenden cDNA 3'-Primers, wobei
darauf geachtet wird, sicherzustellen, dass die erweiterte cDNA
mit dem PolyA-Signal positioniert ist. Das gereinigte Fragment,
das aus der entsprechenden PCR-Reaktion erhalten wird, wird mit
PstI verdaut, mit einer Exonuklease mit glatten Enden versehen,
mit Bgl II verdaut, gereinigt und in den pXT1-Vektor ligiert, der ein
PolyA-Signal enthält
und für
diese Ligation (glatt/BglII) vorbereitet wurde.
-
Das
ligierte Produkt wird unter Verwendung von Lipofectin (Life Technologies,
Inc., Grand Island, New York) in Maus-NIH 3T3-Zellen transfiziert,
wobei Bedingungen wie sie in der Produktbeschreibung beschrieben sind,
eingehalten werden. Nach Aufzucht der transfizierten Zellen in 600 μg/ml G418
(Sigma, St. Louis, Missouri) werden positive Transfektanten selektiert.
Das exprimierte Protein wird vorzugsweise in das Kulturmedium abgegeben,
wodurch die Aufreinigung vereinfacht wird.
-
Alternativ
können
die erweiterten cDNAs, wie es weiter oben beschrieben wird, in pED6dpc2
kloniert werden. Die sich ergebenden pED6dpc2-Konstrukte können in
eine geeignete Wirtszelle, wie beispielsweise COS 1-Zellen, transfiziert
werden. Methotrexat resistente Zellen werden selektiert und expandiert.
Vorzugsweise wird das Protein, das von der erweiterten cDNA exprimiert
wird, in das Kulturmedium abgegeben, wodurch die Aufreinigung vereinfacht
wird.
-
Proteine
im Kulturmedium werden durch Gelelektrophorese getrennt. Wenn gewünscht, können die Proteine
durch Ammoniumsulfat präzipitiert
werden oder vor der Elektrophorese auf Grundlage ihrer Größe oder
Ladung getrennt werden.
-
Als
Kontrolle wird der Expressionsvektor, der kein cDNA-Insert aufweist,
in Wirtszellen oder Organismen eingebracht und die Proteine im Medium
werden geerntet. Die sekretierten Proteine, die im Medium vorliegen,
werden unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken detektiert,
wie beispielsweise Coomassie Blau- oder Silberfärbung, oder unter Verwendung
von Antikörpern
gegen das durch die erweiterte cDNA kodierte Protein.
-
Antikörper, die
in der Lage sind, das Protein von Interesse spezifisch zu erkennen,
können
unter Verwendung synthetischer 15-mer Peptide erzeugt werden, die
eine Sequenz aufweisen, die durch das geeignete 5'-EST, die geeignete
erweiterte cDNA oder einen Abschnitt davon kodiert wird. Die synthetischen
Peptide werden in Mäuse
injiziert, um einen Antikörper
zu dem Polypeptid, das durch das 5'-EST, die erweiterte cDNA oder den Abschnitt
davon kodiert wird, zu erzeugen.
-
Sekretierte
Proteine aus den Wirtszellen oder Organismen, die einen Expressionsvektor
enthalten, der die erweiterte cDNA enthält, die aus einem 5'-EST oder einem Abschnitt davon abgeleitet
ist, werden mit denen aus den Kontrollzellen oder dem Kontrollorganismus
verglichen. Die Gegenwart einer Bande im Medium von den Zellen,
die den Vektor enthalten, die im Medium aus Kontrollzellen nicht
vorliegt, zeigt, dass die erweiterte cDNA ein sekretiertes Protein
kodiert. Im Allgemeinen hat die Bande, die dem Protein entspricht,
das von der erweiterten cDNA kodiert wird, eine Mobilität nahe bei
der erwarteten Mobilität,
wobei dies auf der Zahl der Aminosäuren im offenen Leserahmen
der erweiterten cDNA beruht. Jedoch kann die Bande in Folge von
Modifikationen, wie beispielsweise Glykosylierung, Ubiquitinierung
oder enzymatischer Spaltung, eine Mobilität aufweisen, die sich von der
erwarteten Mobilität
unterscheidet.
-
Alternativ
können,
wenn das aus den obigen Expressionsvektoren exprimierte Protein
keine seine Sekretion lenkenden Sequenzen enthält, die von den Wirtszellen
exprimierten Proteine, wobei die Wirtszellen einen Expressionsvektor
mit einem Insert enthalten, das ein sekretiertes Protein oder einen
Abschnitt davon kodiert, mit den Proteinen verglichen werden, die
in Kontrollwirtszellen exprimiert werden, die den Expressionsvektor
ohne Insert enthalten. Das Vorliegen einer Bande in Proben von Zellen,
die den Expressionsvektor mit einem Insert enthalten, die in Proben
von Zellen, die den Expressionsvektor ohne Insert enthalten, nicht
vorliegt, zeigt, dass das gewünschte
Protein oder der Abschnitt davon exprimiert wird. Im Allgemeinen
weist die Bande die Mobilität,
die für
das sekretierte Protein oder den Abschnitt davon erwartet wird,
auf. Jedoch kann die Bande in Folge von Modifizierungen, wie beispielsweise
Glykosylierung, Ubiquitinierung oder enzymatischer Spaltung, eine
von der erwarteten Mobilität
abweichende Mobilität
aufweisen.
-
Das
durch die erweiterte cDNA kodierte Protein kann unter Verwendung
von standardmäßigen Immunochromatografie-Techniken
gereinigt werden. In derartigen Verfahren wird eine Lösung, die
das sekretierte Protein enthält,
wie beispielsweise Kulturmedium oder Zellextrakt, auf eine Säule aufgebracht,
die Antikörper gegen
das sekretierte Protein aufweist, wobei die Antikörper an
der Chromatografiematrix angebracht sind. Man lässt das sekretierte Protein
an die Immunochromatografiesäule
binden. Danach wird die Säule
gewaschen, um nicht spezifisch gebundene Proteine zu entfernen.
Das spezifisch gebundene sekretierte Protein wird anschließend von
der Säule
freigesetzt und unter Verwendung von Standardtechniken gewonnen.
-
Falls
eine Antikörperherstellung
nicht möglich
ist, kann die erweiterte cDNA-Sequenz
oder der Abschnitt davon in Expressionsvektoren eingebracht werden,
die zur Verwendung in Reinigungsschemata konzipiert worden sind,
die auf Chimäre
Polypeptide zurückgreifen.
In derartigen Strategien ist die kodierende Sequenz der erweiterten
cDNA oder des Abschnitts davon im Rahmen mit einem Gen insertiert,
das die andere Hälfte
der Chimäre
kodiert. Die andere Hälfte
der Chimäre
kann β-Globin
oder ein nickelbindendes Polypeptid sein. Eine Chromatografiematrix
mit einem daran angebrachten Antikörper gegen β-Globin oder Nickel wird anschließend verwendet,
um das Chimäre
Protein zu reinigen. Proteasespaltstellen können zwischen dem β-Globin-Gen
oder dem nickelbindendem Polypeptid und der erweiterten cDNA oder
dem Abschnitt davon konstruiert sein. Daher können die zwei Polypeptide der
Chimäre
durch Proteaseverdau voneinander getrennt werden.
-
Ein
zur Erzeugung von β-Globin-Chimären nützlicher
Expressionsvektor ist pSG5 (Stratagene), der Kaninchen-β-Globin kodiert.
Intron II des Kaninchen-β-Globin-Gens ermöglicht das
Spleißen
des exprimierten Transkripts und das in dieses Konstrukt eingebrachte
Polyadenylierungssignal erhöht
die Expressionsmenge. Diese Verfahren sind so wie beschrieben dem
Fachmann im Bereich der Molekularbiologie wohl vertraut. Standardverfahren
sind in Texten über
Verfahren, wie beispielsweise Davis et al., (Basic Methods in Molecular
Biology, Davis, Dibner und Battex, Hg., Elsevier Press, NY, 1986)
beschrieben und viele andere Verfahren stehen von Stratagene, Life
Technologies, Inc. oder Promega zur Verfügung. Zusätzlich können vom Konstrukt Polypeptide
unter Verwendung von in vitro-Translationssystemen, wie beispielsweise
dem In vitro ExpressTM Translation Kit (Stratagene),
hergestellt werden.
-
Im
Anschluss an die Expression und Reinigung der sekretierten Proteine,
die durch die 5'-ESTs,
erweiterten cDNAs oder Fragmente davon kodiert werden, können die
gereinigten Proteine auf ihre Fähigkeit, an
die Oberfläche
verschiedener Zelltypen zu binden, getestet werden, wie es in Beispiel
31 weiter unten beschrieben wird. Es wird erkannt, dass eine Vielzahl
von Proteinen, die durch diese cDNAs exprimiert werden, von einem
Panel von Proteinen umfasst sein kann, um so gleichzeitig sowohl
hinsichtlich ihrer weiter unten genau beschrieben Aktivitäten, als
auch im Hinblick auf andere biologische Rollen, für die Assays
zur Aktivitätsbestimmung
zur Verfügung
stehen, beurteilt zu werden.
-
BEISPIEL 31
-
Analyse sekretierter Proteine,
zur Bestimmung, ob die Proteine an die Zelloberfläche binden
-
Die
durch die 5'-ESTs,
erweiterten cDNAs oder Fragmente davon kodierten Proteine werden
in Expressionsvektoren, wie diejenigen, die in Beispiel 30 beschrieben
sind, kloniert. Die Proteine werden über Größe, Ladung, Immunchromatografie
oder andere dem Fachmann vertraute Techniken gereinigt. Im Anschluss an
die Reinigung werden die Proteine unter Verwendung von dem Fachmann
bekannten Techniken markiert. Die markierten Proteine werden mit
Zellen oder Zelllinien inkubiert, die aus einer Vielfalt von Organismen
oder Geweben abgeleitet sind, um es den Proteinen zu ermöglichen,
an einen beliebigen Rezeptor auf der Zelloberfläche zu binden. Im Anschluss
an die Inkubation werden die Zellen gewaschen, um unspezifisch gebundenes
Protein zu entfernen. Die markierten Proteine werden durch Autoradiografie
detektiert. Alternativ können
nicht markierte Proteine mit den Zellen inkubiert werden und unter
Verwendung von daran anhaftenden Antikörpern, die eine detektierbare
Markierung aufweisen, wie beispielsweise ein fluoreszierendes Molekül, detektiert
werden.
-
Die
Spezifität
der Zelloberflächenbindung
kann durch Durchführung
einer Kompetitionsanalyse analysiert werden, wobei verschiedene
Mengen unmarkiertes Protein zusammen mit dem markierten Protein
inkubiert werden. Die Menge an markiertem Protein, das an die Zelloberfläche gebunden
ist, nimmt ab, wenn die Menge an kompetitivem unmarkiertem Protein
ansteigt. Als Kontrolle sind in einigen Bindereaktionen verschiedene
Mengen an unmarkiertem Protein umfasst, das mit dem markierten Protein
nicht in Beziehung steht. Die Mengen an markiertem Protein, das
an die Zelloberfläche
gebunden ist, sinkt nicht in solchen Bindereaktionen ab, die steigende
Mengen an nicht in Beziehung stehendem unmarkierten Proteinen enthalten,
was zeigt, dass das Protein, das durch die cDNA kodiert wird, spezifisch
an die Zelloberfläche
bindet.
-
Wie
oben diskutiert, zeigen sekretierte Proteine eine Vielzahl von wichtigen
physiologischen Effekten und stellen in der Konsequenz eine wertvolle
therapeutische Quelle dar. Die sekretierten Proteine, die durch die
erweiterten cDNAs oder Teile davon kodiert werden, die gemäß den Beispielen
27-29 hergestellt wurden, können
wie es weiter unten beschrieben wird, beurteilt werden, um ihre
physiologischen Wirkungen zu bestimmen.
-
BEISPIEL 32
-
Untersuchen der durch
die erweiterten cDNAs oder durch Abschnitte davon exprimierten Proteine
hinsichtlich Zytokin-, Zellproliferations- oder Zelldifferenzierungs-Aktivität
-
Wie
oben diskutiert, können
sekretierte Proteine als Zytokine wirken oder können die zelluläre Proliferation
oder Differenzierung beeinflussen. Viele bis heute entdeckte Proteinfaktoren,
einschließlich
aller bekannten Zytokine, wiesen in einem oder mehreren faktorabhängigen Zellproliferationsassays
Aktivität
auf und daher dienen diese Assays als zweckmäßige Bestätigung der Zytokinaktivität. Die Aktivität eines
Proteins, das durch die erweiterten cDNAs kodiert wird, wird durch
einen beliebigen aus einer Reihe von routinemäßigen faktorabhängigen Zellproliferationsassays
für Zelllinien,
einschließlich,
ohne Beschränkung,
32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3, MC9/G, M+ (preB
M+), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2, CTLL2,
TF-1, Mo7c und CMK, bewiesen. Die Proteine, die durch die oben beschriebenen
erweiterten cDNAs oder Abschnitte davon kodiert werden, können bezüglich ihrer
Fähigkeit,
die T-Zell- oder Thymozytproliferation in Assays, wie beispielsweise diejenigen,
die oben oder in den folgenden Referenzen beschrieben sind, beurteilt
werden: Current Protocols in Immunology, Hrsg. von Coligan et al.,
Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience; Takai et al.,
J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bertagnolli et al., J. Immunol.
145:1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cell. Immunol. 133:327-341,
1991; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783 1992; Bowman
et al., J. Immunol. 152:1756-1761, 1994.
-
Zusätzlich sind
zahlreiche Assays zur Zytokinproduktion und/oder der Proliferation
von Milzzellen, Lymphknotenzellen und Thymozyten bekannt. Diese
umfassen die Techniken, die in Current Protocols in Immunology,
supra 1:3.12.1-3.12.14
und in Schreiber in Current Protocols in Immunology, supra 1:6.8.1-6.8.8
offenbart sind.
-
Die
durch die cDNAs kodierten Proteine können auch nach ihrer Fähigkeit,
Proliferation und Differenzierung hämatopoetischer oder lymphopoetischer
Zellen zu regulieren, untersucht werden. Viele Assays auf eine derartige
Aktivität
hin sind dem Fachmann bekannt, einschließlich der Assays in den folgenden
Referenzen: Bottomly et al., in Current Protocols in Immunology,
supra 1:6.3.1-6.3.12; de Vries et al., J. Exp. Med. 173:1205-1211,
1991; Moreau et al., Nature 36:690-692, 1988; Greenberger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:2931-2938, 1983; Nordan, R., in
Current Protocols in Immunology, supra 1:6.6.1-6.6.5; Smith et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:1857-1861, 1986; Bennett et al., in
Current Protocols Immunology supra, 1:6.15.1; Ciarletta et al.,
in Current Protocols Immunology supra, 1:6.13.1.
-
Die
durch die cDNAs kodierten Proteine können auch auf ihre Fähigkeit,
die Antworten von T-Zellen auf Antigene zu regulieren, hin untersucht
werden. Viele Assays auf eine derartige Aktivität hin sind dem Fachmann bekannt,
einschließlich
der Assays, die in den folgenden Referenzen beschrieben sind: Kapitel
3 (In vitro Assays zur Maus Lymphozytenfunktion), Kapitel 6 (Zytokine
and ihre zellulären
Rezeptoren) und Kapitel 7 (Immunologische Studien in Menschen) in
Current Protocols in Immunology supra, Weinberger et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77:6091-6095, 1980; Weinberger et al., Eur.
J. Immun. 11:405-411, 1981; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500,
1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988.
-
Derartige,
eine Zytokin-, Zellproliferations- oder Zelldifferenzierungsaktivität aufweisende
Proteine können
anschließend
als Pharmazeutika formuliert werden oder verwendet werden, um klinische
Zustände
zu behandeln, unter welchen die Induktion von Zellproliferation
oder -differenzierung günstig
ist. Alternativ können Gene,
die diese Proteine kodieren oder Nukleinsäuren, die die Expression dieser
Proteine regulieren, in geeignete Wirtszellen eingeführt werden,
um die Expression der Proteine wie gewünscht zu erhöhen oder
zu erniedrigen, wobei dies weiter unten ausführlicher beschrieben wird.
-
BEISPIEL 33
-
Untersuchung
der durch die erweiterten cDNAs oder durch Abschnitte davon exprimierten
Proteine hinsichtlich einer Aktivität als Regulatoren des Immunsystems
-
Die
durch die cDNAs kodierten Proteine können auch hinsichtlich ihrer
Wirkungen als Immunregulatoren beurteilt werden. Beispielsweise
können
diese Proteine bezüglich
ihrer Aktivität,
die Thymozyten- oder Splenozyten-Zytotoxizität zu beeinflussen, beurteilt
werden. Zahlreiche Assays auf eine derartige Aktivität hin sind
dem Fachmann bekannt, einschließlich
der Assays, die in den folgenden Referenzen beschrieben werden:
Kapitel 3 (In vitro Assays zur Maus Lymphozytenfunktion 3.1-3.19)
und Kapitel 7 (Immunologische Studien in Menschen) in Current Protocols
in Immunology, Coligan et al., Hrsg., Greene Publishing Associates
and Wiley-Interscience; Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974,
1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al.,
J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512,
1988; Bowman et al., J. Virology 61:1992-1998; Bertagnolli et al.,
Cell. Immunol. 133:327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092,
1994.
-
Die
durch die cDNAs kodierten Proteine können auch bezüglich ihrer
Wirkungen auf T-Zell abhängige Immunglobulinreaktionen
und Isotyp Switching beurteilt werden. Zahlreiche Assays auf eine
derartige Aktivität hin
sind dem Fachmann bekannt, einschließlich der Assays, die in den
folgenden Referenzen beschrieben werden: Maliszewski, J. Immunol.
144:3028-3033, 1990; Mond et al., in Current Protocols in Immunology, 1:3.8.1-3.8.16,
supra.
-
Die
durch die cDNAs kodierten Proteine können auch hinsichtlich ihrer
Wirkung auf Immuneffektorzellen, einschließlich ihrer Wirkung auf Th1-Zellen
und zytotoxische Lymphozyten hin beurteilt werden. Zahlreiche Assays
auf eine derartige Aktivität
hin sind dem Fachmann bekannt, einschließlich der Assays, die in den
folgenden Referenzen beschrieben werden: Kapitel 3 (In vitro Assays
zur Maus Lymphozytenfunktion 3.1-3.19) und Kapitel 7 (Immunologische
Studien in Menschen) in Current Protocols in Immunology, supra;
Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J.
Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783,
1992.
-
Die
durch die cDNAs kodierten Proteine können auch hinsichtlich ihrer
Wirkung auf die durch dendritische Zellen vermittelte Aktivierung
von naiven T-Zellen
beurteilt werden. Zahlreiche Assays auf eine derartige Aktivität hin sind
dem Fachmann bekannt, einschließlich
der Assays, die in den folgenden Referenzen beschrieben werden:
Guery et al., J. Immunol., 134:536-544, 1995; Inaba et al., J. Exp.
Med. 173:549-559, 1991; Macatonia et al., J. Immunol. 154:5071-5079,
1995; Porgador et al., J. Exp. Med. 182:255-260, 1995; Nair et al.,
J. Virol. 67:4062-4069,
1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al.,
J. Exp. Med. 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical
Investigation 94:797-807, 1994 und Inaba et al., J. Exp. Med. 172:631-640,
1990.
-
Die
durch die cDNAs kodierten Proteine können auch hinsichtlich ihres
Einflusses auf die Lebensdauer von Lymphozyten beurteilt werden.
Zahlreiche Assays auf eine derartige Aktivität hin sind dem Fachmann bekannt,
einschließlich
der Assays, die in den folgenden Referenzen beschrieben werden:
Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al.,
Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Res. 53:1945-1951,
1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, J. Immunol.
145:4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca
et al., Int. J. Oncol. 1:639-648, 1992.
-
Die
durch die cDNAs kodierten Proteine können auch hinsichtlich ihres
Einflusses auf frühe
Stufen des T-Zell-Deteminierung und der T-Zell-Entwicklung hin beurteilt
werden. Zahlreiche Assays auf eine derartige Aktivität hin sind
dem Fachmann bekannt, einschließlich
aber ohne Beschränkung
auf die Assays, die in den folgenden Referenzen beschrieben werden:
Antica et al., Blood 84:111-117, 1994; Fine et al., Cell. Immunol. 155:111-122,
1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778,
1995; Toki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7548-7551, 1991.
-
Die
Proteine, die Aktivität
als Regulatoren der Immunsystemaktivität zeigen, können dann als Pharmazeutika
formuliert werden und verwendet werden, um klinische Zustände zu behandeln,
in welchen die Regulation von Immunaktivität günstig ist. Beispielsweise kann
das Protein bei der Behandlung verschiedener Immunschwächen und
Erkrankungen nützlich
sein (einschließlich
schwerer kombinierter Immunschwächen), z.B.
sowohl beim Regulieren (nach oben oder nach unten) von Wachstum
und Proliferation von T- und/oder B-Lymphozyten als auch beim Einwirken
auf die zytolytische Aktivität
von NK-Zellen und anderen Zellpopulationen. Diese Immunschwächen können genetischen
Ursprungs sein oder können
sowohl durch virale (z.B. HIV) als auch durch bakterielle Infektionen
oder von Pilzinfektionenn verursacht werden oder können sich
aus Autoimmunerkrankungen ergeben. Insbesondere können infektiöse Erkrankungen,
die durch virale oder bakterielle Infektionen oder durch Pilze oder
andere Infektionen verursacht werden, unter Verwendung eines Proteins,
das durch erweiterte cDNAs, kodiert wird, die von den 5'-ESTs der vorliegenden
Erfindung abgeleitet sind, behandelt werden, einschließlich Infektionen
mit HIV, Hepatitis-Viren,
Herpes-Viren, Mycobakterien, Leishmania spp., Plasmodium und verschiedenen
durch Pilzinfektionen, wie zum Beispiel Candidiasis. In diesem Zusammenhang
kann selbstverständlich
ein Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert wird, die von den
5'-ESTs der vorliegenden
Erfindung abgeleitet sind, ebenfalls dabei nützlich ein Immunsystem zu stimulieren,
wo dies im Allgemeinen wünschenswert
ist d.h. bei der Behandlung von Krebs.
-
Alternativ
können
Proteine, die von erweiterten cDNAs kodiert werden, die von den
hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendet
werden, einschließlich
beispielsweise Bindegewebserkrankungen, Multipler Sklerose, systemisches
Lupus erythematosus, Rheumatoide Arthritis, autoimmune Lungenentzündung, Guillian-Barre Syndrom, autoimmune
Thyroiditis, insulinabhängiger
Diabetes mellitus, Myasthenia gravis, Transplantat-Wirt-Reaktion
(graft-versus-host disease, GVHD) und autoimmune entzündliche
Augenerkrankungen. Ein derartiges Protein, das durch erweiterte
cDNAs kodiert wird, die von den hierin beschriebenen 5'-ESTs abgeleitet
sind, kann auch bei der Behandlung allergischer Reaktionen und Zustände, wie
zum Beispiel Asthma (insbesondere allergisches Asthma) oder anderen
Atemwegserkrankungen, nützlich
sein. Andere Zustände,
bei denen eine Immunsuppression wünschenswert ist (einschließlich beispielsweise
Organtransplantation), können
auch unter Verwendung eines Proteins behandelbar sein, das durch
erweiterte cDNAs kodiert wird, die von den hierin beschriebenen
5'-ESTs abgeleitet
sind.
-
Unter
Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine
kann es ebenfalls möglich
sein, Immunantworten nach oben oder nach unten zu regulieren.
-
Eine
Regulation nach unten kann das Hemmen oder Blockieren einer Immunantwort,
die bereits abläuft,
umfassen, oder kann das Verhindern der Induktion einer Immunantwort
umfassen. Die Funktionen aktivierter T-Zellen können durch Supprimieren der
T-Zell-Antworten oder durch Induzieren spezifischer Toleranz in
T-Zellen oder durch beides gehemmt werden. Die Immunsuppression
von T-Zell-Antworten ist im Allgemeinen ein aktiver, nicht antigenspezifischer
Prozess, der einer kontinuierlichen Exposition von T-Zellen gegenüber dem
suppressiven Mittel bedarf. Toleranz, die eine Induktion von Unempfindlichkeit
oder Anergie in T-Zellen umfasst, ist von Immunsuppression dadurch
unterscheidbar, dass sie im Allgemeinen antigenspezifisch ist und
nach dem Ende der Exposition gegenüber dem Toleranz verleihenden
(tolerizing) Mittel andauert. Praktisch kann Toleranz durch das
Fehlen einer T-Zell-Antwort auf Reexposition gegenüber einem
spezifischen Antigen in der Abwesenheit eines Toleranz verleihenden
Mittels gezeigt werden.
-
Regulierung
nach unten oder Verhinderung einer oder mehrerer Antigenfunktionen
(einschließlich aber
ohne Beschränkung
auf B-Lymphozyt-Antigenfunktionen,
wie zum Beispiel B7-Costimulation), z.B. Verhinderung eines hohen
Grads an Lymphokinsynthese durch aktivierte T-Zellen, sind unter
den Umständen
einer Gewebe-, Haut- und Organtransplantation und bei einer Transplantat-Wirt-Reaktion
(GVHD) nützlich.
Beispielsweise sollte die Blockierung der T-Zell-Funktion bei einer
Gewebetransplantation zu einer verringerten Zerstörung von
Gewebe führen.
Typischerweise wird in Gewebetransplantaten die Abstoßung des
Transplantats über
seine Fremderkennung durch T-Zellen initiiert, woran sich eine Immunreaktion
anschließt,
die das Transplantat zerstört.
Die Verabreichung eines Moleküls
vor der Transplantation, das die Wechselwirkung eines B-7-Lymphozyt-Antigens
mit seinem/seinen natürlichem(n)
Ligand(en) auf Immunzellen hemmt oder blockiert (wie beispielsweise
eine lösliche,
monomere Form eines Peptids mit B7-2-Aktivität allein oder in Verbindung
mit einer monomeren Form eines Peptids mit einer Aktivität eines
anderen B-Lymphozyt-Antigens
(z.B. B7-1, B7-3) oder einem blockierenden Antikörper), kann zum Binden des
Moleküls
an den/die natürlichen
Ligand(en) auf den Immunzellen führen,
ohne das entsprechende kostimulatorische Signal zu übertragen.
In diesem Fall verhindert die Blockierung der B-Lymphozyt-Antigenfunktion
eine Zytokinsynthese durch Immunzellen, wie beispielsweise T-Zellen,
und wirkt daher als ein Immunsuppressor. Darüber hinaus kann das Fehlen der
Costimulation auch ausreichen, zu einem Nichtreagieren (anergize)
der T-Zellen bei herabgesetzter Immunlage zu führen, wodurch in einem Probanden
Toleranz induziert wird. Durch Induktion einer lang andauernden
Toleranz durch B-Lymphozyt-Antigen
blockierende Mittel kann durch das Bedürfnis nach einer wiederholten
Verabreichung dieser blockierenden Mittel vermieden werden. Um eine
ausreichende Immunsuppression oder Toleranz in einem Probanden zu
erreichen, kann es auch notwendig sein, die Funktion einer Kombination
von B-Lymphozyt-Antigenen
zu blockieren.
-
Die
Wirksamkeit bestimmter blockierender Mittel beim Verhindern der
Abstoßung
eines Organtransplantats oder von GVHD kann unter Verwendung von
Tiermodellen beurteilt werden, die zur Vorhersage über die
Wirksamkeit in Menschen geeignet sind. Beispiele geeigneter Systeme,
die verwendet werden können, umfassen
allogene Herztransplantate in Ratten und xenogene Bauchspeicheldrüsen-Inselzelltransplantate
in Mäusen,
wobei beide Transplantate eingesetzt wurden, um die immunsuppressiven
Wirkungen des CTLA4Ig-Fusionsproteins
in vivo zu untersuchen, wie es in Lenschow et al., Science 257:789-792,
1992 und Turka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11102-11105,
1992, beschrieben wird. Zusätzlich
können
GVHD-Mausmodelle (siehe Paul, Hrsg., Fundamental Immunology. Raven
Press, New York, 1989, Seiten 846-847) verwendet werden, um in vivo
die Wirkung der Blockierung der B-Lymphozyt-Antigenfunktion auf die Entwicklung
dieser Erkrankung zu untersuchen.
-
Eine
Blockierung der Antigenfunktion kann auch bei der Behandlung von
Autoimmunerkrankungen therapeutisch nützlich sein. Viele Autoimmunerkrankungen
sind das Ergebnis einer unpassenden Aktivierung von T-Zellen, die
gegen Eigengewebe reaktiv sind, und die die Herstellung von Zytokinen
und Autoantikörpern fördern, die
an der Pathologie dieser Erkrankungen beteiligt sind. Die Verhinderung
der Aktivierung autoreaktiver T-Zellen kann Krankheitssymptome verringern
oder beseitigen. Eine Verabreichung von Mitteln, die auf die Kostimulierung
von T-Zellen durch Stören
der Rezeptor/Ligandwechselwirkungen der B-Lymphozyt-Antigene blockierend
wirken, können
verwendet werden, um die T-Zell-Aktivierung zu hemmen und um die
Erzeugung von Autoantikörpern
oder T-Zell abgeleiteten Zytokinen zu verhindern, die am Krankheitsprozess
möglicherweise
beteiligt sind. Zusätzlich
können
blockierende Mittel eine antigenspezifische Toleranz autoreaktiver T-Zellen
induzieren, die zu einer langfristigen Entlastung von der Krankheit
führen
könnte.
Die Wirksamkeit blockierender Mittel bei der Verhinderung oder Linderung
von Autoimmunerkrankungen kann unter Verwendung einer Vielzahl gut
charakterisierter Tiermodelle für
humane Autoimmunerkrankungen bestimmt werden. Beispiele umfassen
experimentelle murine Autoimmunencephalitis, systemische Lupus erythematosis
in MRUpr/pr Mäusen
oder NZB Hybridmäusen,
murine Autoimmuncollagenarthritis, Diabetes mellitus in OD Mäusen und
BB Ratten und experimentelles murines Erbgoldflammsyndrom (siehe
Paul Hrsg., supra, Seiten 840-856).
-
Eine
Hochregulierung einer Antigenfunktion (vorzugsweise einer B-Lymphozyt-Antigenfunktion)
als Mittel zur Hochregulierung von Immunantworten kann in der Therapie
auch nützlich
sein. Die Hochregulierung von Immunantworten kann entweder eine
Steigerung einer bestehenden Immunantwort oder das Auslösen einer
Inititalimmunantwort umfassen, wie es durch die folgenden Beispiele
gezeigt wird. Beispielsweise kann das Steigern einer Immunantwort
durch Stimulierung der B-Lymphozyt-Antigenfunktion in Fällen viraler
Infektionen nützlich
sein. Zusätzlich
können
systemische virale Erkrankungen, wie beispielsweise Grippe, Schnupfen
und Encephalitis durch Verabreichung einer stimulatorischen Form
von B-Lymphozyt-Antigenen systemisch gelindert werden.
-
Alternativ
können
antivirale Immunantworten in einem infizierten Patienten durch Entfernen
der T-Zellen aus dem Patienten, Kostimulieren der T-Zellen in vitro
mit viral antigen-gepulsten APCs, wobei entweder ein Peptid, das
durch die erweiterten cDNAs kodiert wird, die von den hierin beschriebenen
5'-ESTs abgeleitet sind,
oder zusammen mit einer stimulatorischen Form eines löslichen
Peptids, das durch die erweiterten cDNAs kodiert wird, die von den
hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet ist, exprimiert wird, und Wiedereinführen der in vitro vorbehandelten
(primed) T-Zellen in den Patienten. Die infizierten Zellen sind
nun in der Lage, ein kostimulatorisches Signal an T-Zellen in vivo
abzugeben, wodurch die T-Zellen aktiviert werden.
-
In
einer anderen Anwendung kann die Hochregulierung oder Steigerung
der Antigenfunktion (vorzugsweise B-Lymphozyt-Antigenfunktion) bei
der Induktion von Tumorimmunität
nützlich
sein. Tumorzellen (z.B. Sarcoma, Melanoma, Lymphoma, Leukämie, Neuroblastoma,
Carcinoma), die mit einer Nukleinsäure transfiziert sind, die
wenigstens ein Peptid kodiert, das durch cDNAs kodiert wird, die
von den hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, können
einem Probanden verabreicht werden, um eine tumorspezifische Toleranz
in dem Proband zu überwinden.
Wenn gewünscht,
kann die Tumorzelle transfiziert werden, um eine Kombination von
Peptiden zu exprimieren. Beispielsweise können von einem Patienten erhaltene
Tumorzellen ex vivo mit einem Expressionsvektor transfiziert werden,
der die Expression eines Peptids mit ausschließlich B7-2-artiger Aktivität oder in
Verbindung mit einem Peptid mit B7-1-artiger Aktivität und/oder B7-3-artiger Aktivität lenkt.
Die transfizierten Tumorzellen werden an den Patienten zurückgegeben,
um eine Expression der Peptide auf der Oberfläche der transfizierten Zelle
zu bewirken. Alternativ können
Gentherapietechniken verwendet werden, um eine Tumorzelle als Zielstruktur
für eine
Transfektion in vivo anzusprechen.
-
Das
Vorliegen der durch die erweiterten cDNAs kodierten Peptide, die
von den hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, mit der Aktivität
eines/von B-Lymphozyt-Antigens/Antigenen
auf der Tumorzellenoberfläche
stellt das notwendige Kostimulierungssignal für T-Zellen bereit, um eine
T-Zell vermittelte Immunantwort gegen die transfizierten Tumorzellen
zu induzieren. Darüber
hinaus können
Tumorzellen, die keine MHC Klasse I- oder MHC Klasse II-Moleküle reexprimieren
können
oder unzureichende Mengen davon reexprimieren, mit Nukleinsäuren transfiziert
werden, die eine vollständige
oder einen Teil (z.B. ein verkürzter
Abschnitt einer zytoplasmatischen Domäne) einer MHC Klasse I α-Kette und β2-Microglobulin
oder einer MHC Klasse II α-Kette
und einer MHC Klasse II β-Kette kodieren, um
so MHC Klasse I- bzw. MHC Klasse II-Proteine auf der Zelloberfläche zu exprimieren.
Die Expression geeigneter MHC Klasse I- oder MHC Klasse II-Moleküle in Verbindung
mit einem Peptid, das die Aktivität eines B-Lymphozyten-Antigens aufweist (z.B.
B7-1, B7-2, B7-3), induziert eine T-Zell vermittelte Immunantwort
gegen die transfizierte Tumorzelle. Gegebenenfalls kann auch ein Antisense-Konstrukt
kodierendes Gen, das die Expression eines MHC Klasse II assoziierten
Proteins blockiert, wie beispielsweise die Invariante Kette, ebenfalls
mit einer ein Peptid kodierenden DNA kotransfiziert werden, wobei
dieses Peptid die Aktivität
eines B-Lymphozyten-Antigens aufweist, um so die Präsentation
tumorassoziierter Antigene zu fördern
und um tumorspezifische Immunität
zu induzieren. Daher kann die Induktion einer T-Zell vermittelten
Immunantwort in einem menschlichen Probanden ausreichen, um die
tumorspezifische Toleranz in dem Probanden zu überwinden. Alternativ können, wie
es weiter unten ausführlicher
beschrieben wird, Gene, die diese für das Immunsystem regulatorischen
Proteine kodieren, oder Nukleinsäuren,
die die Expression derartiger Proteine regulieren, in eine geeignete
Wirtszelle eingeführt
werden, um die Expression der Proteine wie gewünscht zu erhöhen oder
zu erniedrigen.
-
BEISPIEL 34
-
Untersuchung
der durch die erweiterten cDNAs oder durch Abschnitte davon exprimierten
Proteine hinsichtlich einer Blutdruck regulierenden Aktivität
-
Die
durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte davon kodierten Proteine
können
auch hinsichtlich ihrer Blutdruck regulierenden Aktivität beurteilt
werden. Beispielsweise kann die Wirkung der Proteine auf die nichthumane
embryonale Stammzelldifferenzierung beurteilt werden. Zahlreiche
Assays auf eine derartige Aktivität hin sind dem Fachmann bekannt,
einschließlich
der Assays, die in den folgenden Referenzen beschrieben sind: Johansson
et al., Cell. Biol. 15:141-151, 1995; Keller et al., Mol. Cell.
Biol. 13:473-486, 1993; McClanahan et al., Blood 81:2903-2915, 1993.
-
Die
durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte davon kodierten Proteine,
können
auch hinsichtlich ihres Einflusses auf die Lebensdauer von Stammzellen
und die Stammzelldifferenzierung beurteilt werden. Zahlreiche Assays
auf eine derartige Aktivität
hin sind dem Fachmann bekannt, einschließlich der Assays, die in den
folgenden Referenzen beschrieben sind: Freshney, Methylzellulosekoloniebildende
Assays, in Culture of Hematopoietic Cells., Freshney et al., Hrsg.,
Seiten 265-268, Wiley-Liss, Inc., New York, NY. 1994; Hirayama et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5907-5911, 1992; McNiece und
Briddell, in Culture of Hematopoietic Cells, supra; Neben et al.,
Exp. Hematol. 22:353-359, 1994; Ploemacher und Cobblestone in Culture
of Hematopoietic Cells, supra, 1-21; Spooncer et al., in Culture
of Hematopoietic Cells, supra 163-179 und Sutherland in Culture
of Hematopoietic Cells, supra, 139-162.
-
Die
eine Blutdruck regulierende Aktivität aufweisenden Proteine können dann
als Pharmazeutika formuliert werden und verwendet werden, um klinische
Zustände
zu behandeln, unter denen die Regulierung von Blutdruck günstig ist,
wie beispielsweise bei der Behandlung von Knochenmark- oder Lymphoidzellmängeln. Eine
Beteiligung bei der Regulierung von Blutdruck wird sogar auch durch
eine geringfügige
biologische Aktivität
zugunsten von koloniebildenden Zellen oder von faktorabhängigen Zelllinien
deutlich. Zum Beispiel zeigen Proteine, die das Wachstum und die
Proliferation von Erythroidvorläuferzellen
allein oder in Kombination mit anderen Zytokinen stimulieren, einen
Nutzen, beispielsweise bei der Behandlung verschiedener Anämien oder
zur Verwendung in Verbindung mit Bestrahlung/Chemotherapie, um die
Produktion von Erythroidvorläufer und/oder
Erythroidzellen zu stimulieren. Proteine, die das Wachstum und die
Proliferation von Knochenmarkszellen stimulieren, wie beispielsweise
Granulozyten und Monozyten/Macrophagen (d.h. herkömmliche CSF-Aktivität), können beispielsweise
in Verbindung mit Chemotherapie nützlich sein, um einer nachfolgenden Knochenmarksdepression
vorzubeugen oder diese zu behandeln. Proteine, die das Wachstum
und die Proliferation von Megakaryozyten und infolge dessen von
Plättchen
unterstützen,
ermöglichen
die Vorbeugung oder die Behandlung verschiedener Plättchenerkrankungen,
wie beispielsweise von Thrombozytopenie, und können im Allgemeinen anstelle
von oder ergänzend
zu Plättchentransfusionen
verwendet werden. Proteine, die das Wachstum und die Proliferation
von hämatopoetischen
Stammzellen unterstützen,
die in der Lage sind, zu beliebigen und allen oben erwähnten hämatopoetischen
Zellen zu reifen, können
deshalb sowohl bei verschiedenen Stammzellerkrankungen ihren therapeutischen
Nutzen finden (wie beispielsweise denjenigen, die gewöhnlich mit
Transplantation behandelt werden, einschließlich aber ohne Beschränkung auf
aplastische Anämie
und paroxysmale nächtliche
Hämoglobinurie),
als auch bei der Neubesiedlung des Stammzellkompartments nach Bestrahlung/Chemotherapie
entweder in vivo oder ex vivo (d.h. in Verbindung mit Knochenmarktransplantation
oder mit peripherer Stammzelltransplantation (homolog oder heterolog)),
als auch als normale oder genetisch veränderte Zellen zur Gentherapie.
Alternativ können,
wie es weiter unten ausführlicher
beschrieben wird, Gene, die Proteine mit Blutdruck regulierender
Aktivität
kodieren, oder Nukleinsäuren,
die die Expression derartiger Proteine regulieren, in geeignete
Wirtszellen eingebracht werden, um wie gewünscht die Expression der Proteine
zu steigern oder zu verringern.
-
BEISPIEL 35
-
Untersuchung
der durch die erweiterten cDNAs oder durch Abschnitte davon exprimierten
Proteine hinsichtlich der Regulation von Gewebewachstum
-
Die
durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte davon kodierten Proteine
können
auch hinsichtlich ihrer Wirksamkeit auf Gewebewachstum beurteilt
werden. Zahlreiche Assays auf eine derartige Aktivität hin sind
dem Fachmann bekannt, einschließlich
der Assays, die in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 95/16035,
der internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO 95/05846 und der internationalen Patentveröffentlichung
Nr. WO 91/07491 offenbart sind.
-
Assays
zur Wundheilungsaktivität
umfassen ohne Beschränkung
die Assays, die beschrieben sind in: Winter, Epidermal Wound Healing,
Seiten 71-112, Maibach
und Rovee, Hrsg., Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago, sowie
die durch Eaglstein und Mertz, J. Invest. Dermatol. 71:382-84, 1978
veränderten
Assays, und die hierin durch Referenz eingeschlossen sind.
-
Diejenigen
Proteine, die an der Regulation von Gewebewachstum beteiligt sind,
können
dann als Pharmazeutika formuliert werden und verwendet werden, um
klinische Zustände
zu behandeln, bei denen die Regulation von Gewebewachstum günstig ist.
Beispielsweise kann ein Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert
wird, die von den hierin beschriebenen 5'-ESTs abgeleitet sind, sowohl auch in
Zusammensetzungen nützlich
sein, die zum Knochen-, Knorpel-, Sehnen-, Bänder- und/oder Nervengewebewachstum
oder – regeneration
verwendet werden, als auch bei der Wundheilung und zur Erneuerung
und zum Ersatz von Gewebe, sowie bei der Behandlung von Verbrennungen,
Schnittwunden und Entzündungen
Verwendung finden.
-
Ein
Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert wird, die aus den hierin
beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, das Knorpel- und/oder Knochenwachstum unter Umständen induziert,
unter denen Knochen normalerweise nicht gebildet wird, findet bei
der Heilung von Knochenbrüchen
und Knorpelschaden oder- defekten
in Menschen oder anderen Tieren Anwendung. Eine derartige Präparation,
die auf ein erfindungsgemäßes Protein
zurückgreift,
kann prophylaktisch zur Linderung sowohl von geschlossenen als auch
offenen Brüchen und
auch für
eine verbesserte Fixierung künstlicher
Verbindungsstücke
verwendet werden. Eine de novo Knochensynthese, die durch ein osteogenes
Mittel induziert wird, trägt
zur Reparatur congenitaler, traumainduzierter oder onkologischer
resektionsinduzierter, den Schädel
betreffender Defekte bei und ist in der kosmetisch-plastischen Chirurgie
ebenfalls nützlich.
-
Ein
erfindungsgemäßes Protein
kann auch bei der Behandlung peridontaler Erkrankungen und anderen
Verfahren zur Zahnreparatur verwendet werden. Solche Mittel können eine
Umgebung bereitstellen, um knochenbildende Zellen anzuziehen, das
Wachstum knochenbildender Zellen zu stimulieren oder die Differenzierung
von Vorläufern
knochenbildender Zellen zu induzieren. Ein erfindungsgemäßes Protein
kann auch bei der Behandlung von Osteoporose und Osteoarthritis
nützlich
sein, wie beispielsweise durch Stimulation der Knochen- und/oder Knorpelreparatur
oder durch Blockieren von Entzündungen
oder Prozessen des Gewebeabbaus (Collagenaseaktivität, Osteoklastenaktivität etc.),
die durch Entzündungsprozesse
vermittelt werden.
-
Eine
andere Kategorie geweberegenerierender Aktivität, die dem Protein zugeschrieben
werden kann, das durch erweiterte cDNAs kodiert wird, die von den
hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, ist die Sehnen/Bänderbildung. Ein Protein, das
von erweiterten cDNAs kodiert wird, die von den hierin beschriebenen 5'-ESTs abgeleitet
sind, das sehnen/bänderartiges
Gewebe oder andere Gewebebildung unter Umständen induziert, unter welchen
sich Gewebe normalerweise nicht bildet, findet beim Heilen von Sehnen-
oder Bänderrissen,
Fehlbildungen oder anderen Sehnen- oder Bänderdefekten in Menschen oder
anderen Tieren Anwendung. Eine derartige Präparation, die ein sehnen/bänderartiges
Gewebe induzierendes Protein verwendet, kann sowohl bei der Schadensvorbeugung
für Sehnen-
oder Bändergewebe
prophylaktische Anwendung finden als auch für eine verbesserten Fixierung
von Sehnen oder Bändern
gegenüber
Knochen oder anderen Geweben, sowie beim Reparieren von Defekten
von Sehnen- oder Bändergewebe
verwendet werden. Eine de novo Bildung von sehnen/bänderartigen
Geweben, das durch eine Zusammensetzung induziert wird, die durch erweiterte
cDNAs kodiert wird, die von den hierin beschriebenen 5'-ESTs abgeleitet
sind, trägt
zur Reparatur von Sehnen- oder Bänderdefekten
mit congen talem, traumatischem oder anderem Ursprung bei und ist
in der kosmetisch-plastischen Chirurgie zum Anbringen oder Reparieren
von Sehnen oder Bändern
ebenfalls anwendbar. Die Zusammensetzungen, die durch erweiterte
cDNAs kodiert werden, die von den hierin beschriebenen 5'-ESTs abgeleitet
sind, können
eine Umgebung bereitstellen, um bänder- oder sehnenbildende Zellen anzuziehen,
das Wachstum von bänder-
oder sehnenbildenden Zellen zu stimulieren, die Differenzierung
von Vorläufern
von bänder-
oder sehnenbildenden Zellen zu induzieren oder das Wachstum von
Bänder-/Sehnenzellen
oder Vorläuferzellen
ex vivo für
eine Rückgabe
in vivo zu induzieren, um dort eine Gewebereparatur zu bewirken.
Die hierin beschriebenen Zusammensetzungen können auch bei der Behandlung
von Tendinitis, Carpaltunnelsyndrom und anderen Sehnen- oder Bänderdefekten
nützlich
sein. Die Zusammensetzungen können
wie im Fachbereich bekannt auch eine geeignete Matrix und/oder ein
absonderndes Mittel als Träger enthalten.
-
Das
Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert wird, die von den hierin
beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, kann auch zur Proliferation neuraler Zellen und
zur Regenerierung von Nerven- und Gehirngewebe anwendbar sein, d.h.
sowohl zur Behandlung von Erkrankungen des zentralen und peripheren
Nervensystems und Neuropathien als auch von mechanischen und traumatischen
Erkrankungen, die eine Degenerierung, ein Absterben oder Trauma
von Neuralzellen oder Nervengewebe umfassen, verwendet werden. Insbesondere
kann ein Protein zur Behandlung von Erkrankungen des peripheren
Nervensystems verwendet werden, wie beispielsweise Verletzungen
peripherer Nerven, peripherer Neuropathie und lokalisierten Neuropathien
und Erkrankungen des zentralen Nervensystems, wie beispielsweise
der Alzheimer-Erkrankung, Parkinson-Erkrankung, Huntington-Erkrankung,
amyotropher Lateralsklerose und Shy-Drager-Syndrom. Weitere Zustände, die
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, umfassen
mechanische und traumatische Erkrankungen, wie beispielsweise Rückenmarkserkrankungen,
Schädeltrauma und
cerebrovaskuläre
Erkrankungen, wie beispielsweise Apoplexie. Periphere Neuropathien,
die aus Chemotherapie oder anderen medizinischen Therapien herrühren, können ebenfalls
unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins behandelbar sein.
-
Erfindungsgemäße Proteine
können
auch nützlich
sein, um ein besseres Verschließen
von nicht heilenden Wunden zu fördern,
einschließlich
aber ohne Beschränkung
auf Druckulzeration, mit vaskulärer
Insuffizienz im Zusammenhang stehende Ulzerationen, chirurgische
und traumatische Wunden und dergleichen.
-
Es
wird erwartet, dass ein Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert
wird, die von den hierin beschriebenen 5'-ESTs abgeleitet sind, auch eine Aktivität hinsichtlich
der Erzeugung oder Regenerierung anderer Gewebe aufweist, wie beispielsweise
Organen (einschließlich
zum Beispiel Bauchspeicheldrüse,
Leber, Darm, Niere, Haut, Endothel), Muskeln (glatt, quergestreift
oder Herz) und vaskulärem
Gewebe (einschließlich vaskuläres Endothel)
oder zur Wachstumsförderung
von Zellen, die solches Gewebe umfassen, dient. Ein Teil der gewünschten
Wirkungen kann durch Hemmung oder Veränderung fibrotischer Narbenbildung
erreicht werden, um es so normalem Gewebe zu ermöglichen sich zu bilden. Ein
erfindungsgemäßes Protein
kann auch angiogenetische Aktivität aufweisen.
-
Ein
Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert wird, die von den hierin
beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, kann ebenfalls zum Schutz oder zur Regeneration
des Darms, sowie zur Behandlung von Lungen- oder Leberfibrose, für Reperfusionsverletzungen
in verschiedenen Geweben und Zuständen, die aus einem systemischen
Zytokinschaden herrühren,
anwendbar sein.
-
Ein
Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert wird, die von den hierin
beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, kann auch beim Fördern oder Hemmen der Differenzierung
von oben beschriebenen Geweben aus Vorläufergeweben oder -zellen oder
zur Hemmung des Wachstums von oben beschriebenen Geweben nützlich sein.
-
Alternativ
können,
wie es weiter unten ausführlicher
beschrieben wird, Gene, die Proteine mit wachstumsregulierender
Aktivität
kodieren, oder Nukleinsäuren,
die die Expression derartiger Proteine regulieren, in geeignete
Wirtszellen eingebracht werden, um die Expression der Proteine wie
gewünscht
zu erhöhen
oder zu erniedrigen.
-
BEISPIEL 36
-
Untersuchung
der durch die erweiterten cDNAs oder durch Abschnittn davon exprimierten
Proteine hinsichtlich der Regulation von Fortpflanzungshormonen
-
Die
durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte davon kodierten Proteine
können
auch hinsichtlich ihrer Fähigkeit
Fortpflanzungshormone zu regulieren, beurteilt werden, wie beispielsweise
Follikel stimulierende Hormone. Zahlreiche Assays auf eine derartige
Aktivität
hin sind dem Fachmann bekannt, einschließlich der Assays, die in den
folgenden Referenzen beschrieben werden: Vale et al., Endocrinol.
91:562-572, 1972; Ling et al., Nature 321:779-782, 1986; Vale et
al., Nature 321:776-779, 1986; Mason et al., Nature 318:659-663,
1985; Forage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3091-3095, 1986,
Kapitel 6.12 in Current Protocols in Immunology, Coligan et al.
Hrsg. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience; Taub et al., J. Clin.
Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind et al., APMIS 103:140-146, 1995;
Muller et al., Eur. J. Immunol. 25:1744-1748; Gruber et al., J.
Immunol. 152:5860-5867, 1994; Johnston et al., J. Immunol. 153:1762-1768, 1994.
-
Die
Proteine, die Aktivität
wie Fortpflanzungshormone oder wie Regulatoren der Zellbewegung
aufweisen, können
dann als Pharmazeutika formuliert werden und verwendet werden, um
klinische Zustände
zu behandeln, in welchen die Regulation von Fortpflanzungshormonen
günstig
ist. Beispielsweise kann ein Protein, das durch erweiterte cDNAs
kodiert wird, die von den hierin beschriebenen 5'-ESTs abgeleitet sind, auch mit Activin
oder Inhibin in Zusammenhang stehende Aktivitäten aufweisen. Inhibine sind
durch ihre Fähigkeit
gekennzeichnet, die Freisetzung des follikelstimulierenden Hormons
(FSH) zu hemmen, während
Activine durch ihre Fähigkeit
gekennzeichnet sind, die Freisetzung von FSH zu stimulieren. Daher
kann ein Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert wird, die von
den hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, allein oder in Form von Heterodimeren mit einem
Mitglied der Inhibin α-Familie
als Verhütungsmittel
anwendbar sein, wobei dies auf der Fähigkeit der Inhibine basiert,
die Fruchtbarkeit in weiblichen Säugern abzusenken sowie die
Spermatogenese in männlichen
Säugern
abzusenken. Die Verabreichung ausreichender Mengen anderer Inhibine kann
in diesen Säugern
Unfruchtbarkeit induzieren. Alternativ kann das erfindungsgemäße Protein
als Homodimer oder Heterodimer mit anderen Proteinuntereinheiten
der Inhibin-B-Gruppe als Fruchtbarkeit induzierendes Therapeutikum
verwendet werden, wobei dies auf der Fähigkeit von Activinmolekülen basiert,
die FSH-Freisetzung aus Zellen des Hypophysenvorderlappens zu stimulieren.
Siehe zum Beispiel US-Patent 4,798,885. Ein erfindungsgemäßes Protein
kann auch zur Förderung
des Beginns der Fruchtbarkeit in nicht geschlechtsreifen Säugetieren
anwendbar sein, um so die reproduktive Lebensleistung von Haustieren,
wie beispielsweise Kühen,
Schafen und Schweinen, zu erhöhen.
-
Alternativ
können,
wie es weiter unten ausführlicher
beschrieben wird, Gene, die Proteine mit regulierender Aktivität hinsichtlich
von Fortpflanzungshormonen kodieren, oder Nukleinsäuren, die
die Expression derartiger Proteine regulieren, in geeignete Wirtszellen
eingeführt
werden, um die Expression der Proteine wie gewünscht zu erhöhen oder
zu erniedrigen.
-
BEISPIEL 37
-
Untersuchung der durch
die erweiterten cDNAs oder durch Abschnitte davon exprimierten Proteine
hinsichtlich ihrer chemotaktischen/chemokinetischen Aktivität
-
Die
durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte davon kodierten Proteine
können
auch bezüglich
ihrer chemotaktischen/chemokinetischen Aktivität beurteilt werden. Beispielsweise
kann ein Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert wird, die von
den hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, chemotaktische oder chemokinetische Aktivität für Säugetierzellen
aufweisen (z.B. als ein Chemokin wirken), einschließlich zum Beispiel
Monozyten, Fibroblasten, Neutrophile, T-Zellen, Mastzellen, Eosinophile, Epithel-
und/oder Endothelzellen. Chemotaktische und chemokinetische Proteine
können
verwendet werden, um eine gewünschte
Zellpopulation für
einen gewünschten
Wirkungsort zu mobilisieren oder anzuziehen. Chemotaktische oder
chemokinetische Proteine stellen sowohl bestimmte Vorteile bei der
Behandlung von Wunden und anderen Gewebetrauma als auch bei der
Behandlung lokalisierter Infektionen bereit. Beispielsweise kann
das Anziehen von Lymphozyten, Monozyten oder Neutrophilen zu Tumoren
oder Infektionsstellen zu verbesserten Immunantworten gegen den
Tumor oder das infektiöse
Mittel führen.
-
Ein
Protein oder Peptid weist für
eine bestimmte Zellpopulation chemotaktische Aktivität auf, wenn
es die gerichtete Orientierung oder Bewegung einer solchen Zellpopulation
direkt oder indirekt stimulieren kann. Vorzugsweise weist das Protein
oder Peptid die Fähigkeit
auf, die gerichtete Bewegung der Zellen direkt zu stimulieren. Ob
ein bestimmtes Protein chemotaktische Aktivität für eine Zellpopulation aufweist,
kann unter Verwendung eines derartigen Proteins oder Peptids auf
einfache Weise in jedem bekannten Assay zur Chemotaxis von Zellen
bestimmt werden.
-
Die
Aktivität
eines erfindungsgemäßen Proteins
kann neben anderen Möglichkeiten
durch die folgenden Verfahren gemessen werden: Assays zur chemotaktischen
Aktivität
(die Proteine identifizieren, die Chemotaxis induzieren oder verhindern)
bestehen aus Assays, die sowohl die Fähigkeit eines Proteins messen, die
Wanderung von Zellen über
eine Membran hinweg zu induzieren als auch die Fähigkeit eines Proteins, die Adhäsion einer
Zellpopulation an eine andere Zellpopulation zu induzieren. Geeignete
Assays zur Bewegung und Adhäsion
umfassen ohne Beschränkung
diejenigen die beschrieben sind in: Current Protocols in Immunology,
Hrsg. von Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach und Strober, Pub.
Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, Kapitel 6.12:6.12.1-6.12.28;
Taub et al., J. Clin. Invest. 95:1370-1376, 1995; Lind et al., APMIS
103:140-146, 1995; Mueller et al., Eur. J. Immunol. 25:1744-1748;
Gruber et al., J. Immunol. 152:5860-5867, 1994; Johnston et al.,
J. Immunol., 153:1762-1768, 1994.
-
BEISPIEL 38
-
Untersuchung
der durch die erweiterten cDNAs oder durch Abschnitte davon exprimierten
Proteine hinsichtlich der Regulation der Blutgerinnung
-
Die
durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte davon kodierten Proteine
können
auch hinsichtlich ihrer Wirkungen auf die Blutgerinnung beurteilt
werden. Zahlreiche Assays auf eine derartige Aktivität hin sind dem
Fachmann bekannt, einschließlich
der Assays, die in den folgenden Referenzen offenbart sind: Linet
et al., J. Clin. Pharmacol. 26:131-140, 1986; Burdick et al., Thrombosis
Res. 45:413-419,
1987; Humphrey et al., Fibrinolysis 5:71-79, 1991; Schaub, Prostaglandins
35:467-474, 1988.
-
Die
Proteine, die an der Regulierung der Blutgerinnung beteiligt sind,
können
dann als Pharmazeutika formuliert werden und verwendet werden, um
klinische Zustände
zu behandeln, bei welchen die Regulierung der Blutgerinnung günstig ist.
Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Protein hämostatische
oder thrombolytische Aktivität
aufweisen. Im Ergebnis wird von einem derartigen Protein erwartet,
dass es bei der Behandlung verschiedener Gerinnungskrankheiten (einschließlich Erbrankheiten,
wie zum Beispiel Bluterkrankheiten) oder zur Steigerung der Gerinnung
und anderen hämostatischen
Ereignissen beim Behandeln von Wunden, die aus Trauma, chirurgischen
Eingriffen oder anderen Gründen
herrühren,
nützlich
ist. Ein erfindungsgemäßes Protein
kann auch zur Auflösung
oder zur Bildungshemmung von Thrombosen und zur Behandlung und Vorbeugung
von Zuständen,
die sich daraus ergeben (wie beispielsweise Herzinfarkt und Infarkt von
Gefäßen des
zentralen Nervensystems (z.B. Apoplexie)), nützlich sein. Alternativ können, wie
es weiter unten ausführlicher
beschrieben wird, Gene, die Proteine mit Blutgerinnungsaktivität kodieren,
oder Nukleinsäuren,
die die Expression derartiger Proteine regulieren, in geeignete
Wirtszellen eingefügt
werden, um die Expression der Proteine wie gewünscht zu erhöhen oder
zu erniedrigen.
-
BEISPIEL 39
-
Untersuchung der durch
die erweiterten cDNAs oder durch Abschnitte davon exprimierten Proteine
hinsichtlich ihrer Beteiligung bei Rezeptor/Ligandwechselwirkungen
-
Die
durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte davon kodierten Proteine
können
auch hinsichtlich ihrer Beteiligung bei Rezeptor/Ligandwechselwirkungen
beurteilt werden. Zahlreiche Assays im Hinblick auf eine derartige
Beteiligung sind dem Fachmann bekannt, einschließlich der Assays, die in den
folgenden Referenzen offenbart werden: Kapitel 7. 7.28.1-7.28.22
in Current Protocols in Immunology, Coligan et al. Hrsg. Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience;
Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6864-6868, 1987; Bierer
et al., J. Exp. Med. 168:1145-1156, 1988; Rosenstein et al., J.
Exp. Med. 169:149-160,
1989; Stoltenborg et al., J. Immunol. Methods 175:59-68, 1994; Stitt
et al., Cell 80:661-670, 1995; Gyuris et al., Cell 75:791-803, 1993.
-
Beispielsweise
können
die Proteine, die durch erweiterte cDNAs kodiert werden, die von
den hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind, auch Aktivität
als Rezeptoren, Rezeptorliganden oder Inhibitoren oder als Agonisten
von Rezeptor/Ligandwechselwirkungen aufweisen. Beispiele für solche
Rezeptoren und Liganden umfassen ohne Beschränkung Zytokinrezeptoren und
ihre Liganden, Rezeptorkinasen und ihre Liganden, Rezeptorphosphatasen
und ihre Liganden, Rezeptoren, die an Zell-Zell-Wechselwirkungen
beteiligt sind und ihre Liganden (einschließlich aber ohne Beschränkung auf
zelluläre
Adhäsionsmoleküle (wie
beispielsweise Selektine, Integrine und ihre Liganden) und Rezeptor/Ligandpaare,
die bei der Antigenpräsentation,
Antigenerkennung und an der Entwicklung zellulärer und humoraler Immunantworten
beteiligt sind). Rezeptoren und Liganden sind auch zum Screening
nach möglichen
Peptiden oder kleinen Molekülen,
die als Inhibitoren der relevanten Rezeptor/Ligandwechselwirkung
wirken, nützlich.
Ein Protein, das durch erweiterte cDNAs kodiert wird, die von den
hierin beschriebenen 5'-ESTs
abgeleitet sind (einschließlich
aber ohne Beschränkung
auf Fragmente von Rezeptoren und Liganden), kann selbst als Inhibitor
von Rezeptor/Ligandwechselwirkungen verwendet werden. Alternativ,
wie es weiter unten ausführlicher
beschrieben wird, können
Gene, die Proteine kodieren, die bei Rezeptor/Ligandwechselwirkungen
beteiligt sind, oder Nukleinsäuren,
die die Expression derartiger Proteine regulieren, in geeignete
Wirtszellen eingeführt
werden, um die Expression der Proteine wie gewünscht zu erhöhen oder
zu erniedrigen.
-
BEISPIEL 40
-
Untersuchung
der durch die erweiterten cDNAs oder durch Abschnitte davon exprimierten
Proteine hinsichtlich entzündungshemmender
Aktivität
-
Die
durch die erweiterten cDNAs oder einen Abschnitt davon kodierten
Proteine können
auch hinsichtlich ihrer entzündungshemmenden
Aktivität
beurteilt werden. Die entzündungshemmenden
Aktivität
kann durch Bereitstellen eines Stimulus für an der Entzündungsreaktion
beteiligte Zellen, durch Hemmung oder Förderung von Zell-Zell-Wechselwirkungen
(wie zum Beispiel Zelladhäsion),
durch Hemmung oder Förderung
von am Entzündungsprozess
beteiligter Zellchemotaxis, durch Hemmung oder Förderung von Flüssigkeitsaustritt aus
der Zelle oder durch Stimulierung oder Unterdrückung der Produktion anderer
Faktoren, die eine Entzündungsreaktion
auf direktere Weise hemmen oder fördern, erreicht werden. Proteine,
die solche Aktivitäten
aufweisen, können
verwendet werden, um entzündliche
Zustände
zu behandeln, einschließlich
chronischer oder akuter Zustände,
einschließlich
aber ohne Beschränkung
auf Entzündungen,
die im Zusammenhang stehen mit einer Infektion (wie zum Beispiel
septischer Schock, Sepsis oder systemisches Entzündungsreaktionssyndrom), Ischämie-Reperfusionsverletzung,
Endotoxin-Sterblichkeit, Arthritis, komplementvermittelte hyperakute
Abstoßungsreaktion,
Nephritis, Zytokin- oder chemokininduzierte Lungenverletzung, entzündliche
Darmerkrankung, Crohn-Erkrankung oder die sich aus einer Überproduktion
von Zytokinen ergeben, wie beispielsweise TNF oder IL-1. Erfindungsgemäße Proteine
können
auch nützlich
sein, um Anaphylaxie und Hyperempfindlichkeit gegenüber einer
antigenischen Substanz oder einem antigenischen Material zu behandeln.
Alternativ können,
wie es weiter unten ausführlicher
beschrieben wird, Gene, die Proteine mit entzündungshemmender Aktivität kodieren,
oder Nukleinsäuren,
die die Expression derartiger Proteine regulieren, in geeignete
Wirtszellen eingeführt
werden, um die Expression der Proteine wie gewünscht zu erhöhen oder
zu erniedrigen.
-
BEISPIEL 41
-
Untersuchung
der durch die erweiterten cDNAs oder durch Abschnitte davon exprimierten
Proteine hinsichtlich Aktivität
bei der Hemmung von Tumoren
-
Die
durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte davon kodierten Proteine
können
auch hinsichtlich ihrer Aktivität
bei der Hemmung von Tumoren beurteilt werden. Zusätzlich zu
den oben beschriebenen Aktivitäten
zur immunologischen Behandlung oder Vorbeugung von Tumoren kann
ein erfindungsgemäßes Protein andere
Antitumoraktivität
aufweisen. Ein Protein kann Tumorwachstum direkt oder indirekt (wie
zum Beispiel durch ADCC) hemmen. Ein Protein kann seine Wirkung
bei der Tumorhemmung durch Einwirken auf Tumorgewebe oder Tumorvorläufergewebe,
durch Hemmung der Bildung von Geweben, die notwendig sind, um das Tumorwachstum
zu unterstützen
(wie beispielsweise durch Hemmung von Angiogenese), durch ein Bewirken einer
Produktion anderer Tumorwachstum hemmender Faktoren, Mittel oder
Zelltypen oder durch Unterdrücken,
Entfernen oder Hemmen von Tumorwachstum fördernden Faktoren, Mitteln
oder Zelltypen zeigen. Alternativ können, wie es weiter unten ausführlicher
beschrieben wird, Gene, die Proteine mit einer Tumor hemmenden Aktivität kodieren,
oder Nukleinsäuren,
die die Expression derartiger Proteine regulieren, in geeignete Wirtszellen
eingeführt
werden, um die Expression der Proteine wie gewünscht zu erhöhen oder
zu erniedrigen.
-
Ein
erfindungsgemäßes Protein
kann auch eine oder mehrere der folgenden zusätzlichen Aktivitäten oder
Wirkungen aufweisen: Hemmung des Wachstums, Infektion oder Funktion
von, oder das Abtöten
von, infektiösen
Mitteln, einschließlich,
aber ohne Beschränkung
auf Bakterien, Viren, Pilze und andere Parasiten; Einwirkung auf
körperliche
Merkmale (unterdrückend
oder verstärkend),
einschließlich,
aber ohne Beschränkung
auf Größe, Gewicht,
Haarfarbe, Augenfarbe, Haut, Fett-zu-Fettfreiverhältnis oder
eine andere Gewebepigmentierung oder Größe oder Form von Organen oder
des Körpers
(beispielsweise Brustvergrößerung oder -verkleinerung, Änderung
der Knochenform oder -gestalt); Einwirken auf den Biorhythmus oder
24-Stunden-Zyklen oder Rhythmen: Einwirken auf die Fruchtbarkeit
von männlichen
oder weiblichen Probanden; Einwirken auf den Metabolismus, Katabolismus,
Anabolismus, die Verarbeitung, die Verwertung, Speicherung oder
Entfernung von diätischem
Fett, Lipid, Protein, Kohlenhydrat, Vitaminen, Mineralien, Cofaktoren
oder anderen Ernährungsfaktoren
oder -komponente(n); Einwirken auf Verhaltensmerkmale, einschließlich, aber
ohne Beschränkung
auf Appetit, Libido, Stress, Denkfähigkeit (einschließlich kognitiver
Erkrankungen), Depression (einschließlich depressiver Erkrankungen)
und gewalttätigen
Verhaltensmustern; Bereitstellung analgetischer Wirkungen oder anderer
schmerzverringernder Wirkungen; Förderung von Differenzierung
und Wachstum von embryonalen Stammzellen in Linien, die sich von
hämotopoetischen
Linien unterscheiden; hormonelle oder endokrine Aktivität; im Fall
von Enzymen Korrektur von Mangelfunktionen des Enzyms und Behandlung
von Erkrankungen, die mit einer Mangelfunktion im Zusammenhang stehen;
Behandlung hyperproliferativer Erkrankungen (wie beispielsweise
Psoriasis); immunglobulinartiger Aktivität (wie beispielsweise die Fähigkeit, Antigene
oder ein Komplement zu binden); und die Fähigkeit, als Antigen in einer
Impfstoffzusammensetzung zu wirken, um eine Immunantwort gegen ein
derartiges Protein oder ein anderes Material oder eine Einheit, die
mit einem derartigen Protein kreuzreaktiv ist, hervorzurufen. Alternativ
können,
wie es weiter unten ausführlicher
beschrieben wird, Gene, die Proteine kodieren, die mit einer der
oben dargelegten Aktivitäten
in Zusammenhang stehen, oder Nukleinsäuren, die die Expression derartiger
Proteine regulieren, in geeignete Wirtszellen eingeführt werden,
um die Expression der Proteine wie gewünscht zu erhöhen oder
zu erniedrigen.
-
BEISPIEL 42
-
Identifizierung von Proteinen,
die mit durch erweiterte cDNAs kodierten Polypeptiden Wechselwirken
-
Proteine,
die mit den Polypeptiden wechselwirken, die durch erweiterte cDNAs
kodiert werden, die von den 5'-ESTs
oder Fragmenten davon abgeleitet sind, wie beispielsweise Rezeptorproteine,
können
unter Verwendung von zwei Hybridsystemen, wie beispielsweise dem
Matchmaker Two Hybrid System 2 (Katalog Nr. K1604-1, Clontech),
identifiziert werden. Wie es im dem Kit beigelegten Handbuch beschrieben
wird, werden die cDNAs, die von den 5'-ESTs abgeleitet sind, oder Fragmente
davon in einen Expressionsvektor insertiert, so dass sie sich im
Leserahmen mit DNA befinden, die die DNA-Bindungsdomäne des Hefetranskriptionsaktivators
GAL4 kodiert. cDNAs in einer cDNA-Bibliothek, die Proteine kodiert,
die mit den Polypeptiden, die durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte
davon kodiert werden, wechselwirken könnten, werden in einen zweiten
Expressionsvektor insertiert, so dass sie sich im Leserahmen mit
der DNA befinden, die die Aktivierungsdomäne von GAL4 kodiert. Die zwei
Expressionsplasmide werden in Hefe transformiert und die Hefe wird
auf Selektionsmedium ausplattiert, das sowohl hinsichtlich einer
Expression selektierbarer Marker auf jedem der beiden Expressionsvektoren
als auch hinsichtlich der GAL4-abhängigen Expression des HIS3-Gens
selektiert. Transformanten, die in der Lage sind, auf Medium, das
kein Histidin enthält,
zu wachsen, werden hinsichtlich GAL4-abhängiger lacZ-Expression durchmustert.
Solche Zellen, die sowohl bezüglich
der Histidinselektion und des lacZ-Assays positiv sind, enthalten
Plasmide, die Proteine kodieren, die mit den Polypeptiden Wechselwirken,
die durch die erweiterten cDNAs oder Abschnitte kodiert werden.
-
Alternativ
kann das System, das in Lustig et al., Methods in Enzymology 283:83-99,
1997 und im US-Patent Nr. 5,654,150 beschrieben wird, verwendet
werden, um Moleküle
zu identifizieren, die mit den Polypeptiden wechselwirken, die durch
erweiterte cDNAs kodiert werden. In solchen Systemen werden in vitro-Transkriptionsreaktionen
bezüglich
eines Pools von Vektoren durchgeführt, die erweiterte cDNA-Inserts
enthalten, die stromabwärts
eines Promotors kloniert sind, der die in vitro-Transkription lenkt.
Die sich ergebenden mRNA-Pools werden in Xenopus laevis Oozyten
eingeführt.
Die Oozyten werden anschließend
hinsichtlich einer gewünschten
Aktivität
untersucht.
-
Alternativ
können
die zusammengefassten, wie oben beschrieben hergestellten in vitro-Transkriptionsprodukte
in vitro translatiert werden. Die zusammengefassten in vitro-Translationsprodukte
können
hinsichtlich einer gewünschten
Aktivität
oder hinsichtlich einer Wechselwirkung mit einem bekannten Polypeptid untersucht
werden.
-
Proteine
oder andere Moleküle,
die mit Polypeptiden wechselwirken, die durch erweiterte cDNAs kodiert
werden, können
durch eine Vielfalt zusätzlicher
Techniken nachgewiesen werden. In einem Verfahren können Affinitätssäulen erstellt
werden, die das Polypeptid enthalten, das durch die erweiterte cDNA
oder einen Abschnitt davon kodiert wird. In einigen Versionen dieses
Verfahrens enthält
die Affinitätssäule chimäre Proteine,
in denen das Protein, das durch die erweiterten cDNAs oder einen
Abschnitt davon kodiert wird, mit einer Glutathion-S-Transferase fusioniert
ist. Ein Gemisch zellulärer
Proteine oder ein Pool wie oben beschrieben exprimierter Proteine
wird auf die Affinitätssäule aufgetragen.
Proteine, die mit dem Polypeptid wechselwirken, das an die Säule angefügt ist,
können
anschließend
isoliert und auf einem 2-D-Elektrophoresegel analysiert werden,
wie es in Rasmunsen et al., Electrophoresis 18:588-598, 1997, beschrieben
wird. Alternativ können
die Proteine, die auf der Affinitätssäule zurückgehalten werden, durch Verfahren,
die auf Elektrophorese basieren, gereinigt und sequenziert werden.
Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um Antikörper zu
isolieren, um nach Produkten aus Phage Display zu durchmustern oder
Phage Display humane Antikörper
durchzumustern.
-
Proteine,
die mit Polypeptiden wechselwirken, die durch erweiterte cDNAs oder
Abschnitte davon kodiert werden, können auch unter Verwendung
eines optischen Biosensors durchmustert werden, wie er in Edwards
und Leatherbarrow, Analytical Biochemistry 246:1-6,1997, beschrieben
wird. Der Hauptvorteil des Verfahrens ist, dass es die Bestimmung
der Assoziierungsrate zwischen dem Protein und anderen wechselwirkenden
Molekülen
ermöglicht.
Daher ist es möglich,
spezifisch wechselwirkende Moleküle
mit einer hohen oder niedrigen Assoziierungsrate zu selektieren.
Typischerweise wird ein Zielmolekül mit einer Sensoroberfläche verknüpft (über eine
Carboxymethyldextranmatrix) und eine Probe mit Testmolekülen wird
mit den Zielmolekülen
in Kontakt gebracht. Das Binden eines Testmoleküls an das Zielmolekül führt zu einer
Veränderung hinsichtlich
des Brechungsindex und/oder der Dicke. Diese Veränderung wird durch den Biosensor
detektiert, vorausgesetzt sie vollzieht sich im evaneszenten Feld
(das sich einige hundert Nanometer von der Sensoroberfläche ausdehnt).
In diesen Screening-Assays kann das Zielmolekül eines der Polypeptide sein,
die durch erweiterte cDNAs oder einen Abschnitt davon kodiert werden,
und die Testprobe kann eine Proteinkollektion sein, die aus Geweben
oder Zellen extrahiert wurde, ein Pool exprimierter Proteine, kombinatorische
Peptide und/oder chemische Bibliotheken oder Peptide aus Phage Display.
Die Gewebe oder Zellen, von welchen die Testproteine extrahiert
werden, können
von jeder beliebigen Spezies stammen.
-
In
anderen Verfahren wird ein Zielmolekül immobilisiert und die Testpopulation
ist eine Kollektion einzelner Polypeptide, die durch die erweiterten
cDNAs oder Abschnitte davon kodiert wird.
-
Um
die Wechselwirkung der Proteine, die durch die erweiterten cDNAs
oder Abschnitte davon kodiert werden, mit Wirkstoffen zu untersuchen,
kann das mit Mikrodialyse gekoppelte HPLC-Verfahren, das von Wang
et al., Chromatographia 44:205-208, 1997, beschrieben wurde, oder
das Affinitätskapillarelektrophoreseverfahren,
das von Busch et al., J. Chromatogr. 777:311-328, 1997, beschrieben
wurde, verwendet werden:
Es wird vom Fachmann erkannt, dass
die von den erweiterten cDNAs oder Abschnitten davon exprimierten Proteine
zusätzlich
zu den weiter oben spezifisch aufgezählten Aktivitäten hinsichtlich
zahlreicher anderer Aktivitäten
untersucht werden können.
Beispielsweise können
die exprimierten Proteine hinsichtlich Anwendungen beurteilt werden,
die Kontrolle und Regulierung von Entzündungen, Tumorproliferation
oder Metastasis, Infektionen oder andere klinische Zustände umfassen.
Zusätzlich
können
die von den erweiterten cDNAs oder Abschnitten davon exprimierten
Proteine als Nahrungsmittel oder kosmetische Mittel nützlich sein.
-
Die
von den cDNAs oder Abschnitten davon exprimierten Proteine können verwendet
werden, um Antikörper
zu erzeugen, die in der Lage sind, spezifisch an das exprimierte
Protein oder Fragmente davon zu binden, wie es in Beispiel 40 weiter
unten beschrieben wird. Die Antikörper können in der Lage sein, an ein
Volllängenprotein,
das durch eine cDNA kodiert wird, die von einem 5'-EST abgeleitet ist,
an ein reifes Protein (d.h. das Protein, das durch Abspaltung des
Signalpeptids erzeugt wird), das durch eine cDNA kodiert ist, die
von einem 5'-EST
abgeleitet ist, oder an ein Signalpeptid zu binden, das durch eine
cDNA kodiert wird, die von einem 5'-EST abgeleitet ist. Alternativ können die
Antikörper
in der Lage sein, Fragmente mit wenigstens 10 Aminosäuren der
Proteine, die durch die obigen cDNAs kodiert werden, zu binden.
In einigen Ausführungsformen
können
die Antikörper
in der Lage sein, Fragmente mit wenigstens 15 Aminosäuren der
durch die obigen cDNAs kodierten Proteine zu binden. In anderen
Ausführungsformen
können
die Antikörper
in der Lage sein, Fragmente mit wenigstens 25 Aminosäuren der
Proteine, die durch die erweiterten cDNAs exprimiert werden, die
wenigstens 25 Aminosäuren
der Proteine umfassen, die durch die obigen cDNAs kodiert werden,
zu binden. In anderen Ausführungsformen
können
die Antikörper
in der Lage sein, Fragmente von wenigstens 40 Aminosäuren der
durch die obigen cDNAs kodierten Proteine zu binden.
-
BEISPIEL 43
-
Herstellung
eines Antikörpers
für ein
humanes Protein
-
Ein
im Wesentlichen reines Protein oder Polypeptid wird, wie in Beispiel
30 beschrieben, aus den transfizierten und transformierten Zellen
isoliert. Die Konzentration des Proteins in der Endpräparation
wird auf einen Wert im Bereich von einigen μg/ml angepasst, beispielsweise
durch Konzentrierung auf einer Amicon-Filtervorrichtung. Ein monoklonaler
oder polyklonaler Antikörper
gegen das Protein kann anschließend
wie folgt hergestellt werden:
-
1. Herstellung
monoklonaler Antikörper
durch Hybridom-Fusion
-
Monoklonale
Antikörper
gegen Epitope beliebiger Peptide, die wie oben beschrieben identifiziert
und isoliert worden sind, können
gemäß dem klassischen
Verfahren von Kohler und Milstein, Nature 256:495, 1975, oder davon
abgeleiteten Verfahren aus murinen Hybridomen hergestellt werden.
In Kürze,
eine Maus wird wiederholt mit wenigen Mikrogramm des ausgewählten Proteins
oder davon abgeleiteter Peptide über
einen Zeitraum von wenigen Wochen beimpft. Die Maus wird anschließend geopfert
und die Antikörper
erzeugenden Milzzellen werden isoliert. Die Milzzellen werden mittels
Polyethylenglycol mit Mausmyelomzellen fusioniert und der Überschuss
an unfusionierten Zellen wird durch Anzucht des Systems auf selektiven
Medien, die Aminopterin (HAT-Medien) umfassen, zerstört. Die
erfolgreich fusionierten Zellen werden verdünnt und Aliquote der Verdünnung werden
in Wells einer Mikrotiterplatte platziert, wobei das Kulturwachstum
dort fortgeführt
wird. Antikörper
erzeugende Klone werden durch Immunoassayverfahren über die
Detektion eines Antikörpers
im Überstandfluid
der Wells identifiziert, wie beispielsweise durch ELISA, wie es
ursprünglich
von Engvall, Meth. Enzymol. 70:419, 1980, und davon abgeleiteten
Verfahren beschrieben wird. Ausgewählte positive Klone können expandiert
werden und ihr monoklonales Antikörperprodukt kann zur Verwendung
geerntet werden. Ausführliche
Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper werden in Davis et al.,
in Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York, Abschnitt
21-2 beschrieben.
-
2. Erzeugung
polyklonaler Antikörper
durch Immunisierung
-
Polyklonales
Antiserum, das Antikörper
für heterogene
Epitope eines einzelnen Proteins enthält, kann durch Immunisierung
geeigneter Tiere mit dem exprimierten Protein oder davon abgeleiteten
Peptiden hergestellt werden, wobei diese unverändert oder verändert sein
können,
um die Immunogenität
zu steigern. Eine effektive Herstellung polyklonaler Antikörper wird
durch viele Faktoren beeinflusst, die sowohl mit dem Antigen als
auch der Wirtsspezies im Zusammenhang stehen. Beispielsweise neigen
kleine Moleküle
dazu, weniger immunogen als andere zu sein und können die Verwendung von Trägern und
Adjuvantien erfordern. Die Reaktion der Wirtstiere kann in Abhängigkeit
von der Impfstelle und den Dosierungen ebenfalls variieren, wobei sowohl
unzureichende als auch überschüssige Dosen
an Antigen zu Antiseren mit niedrigem Titer führen. Geringe Dosen (ng-Mengen)
an Antigen, die an mehreren intradermalen Stellen verabreicht werden,
scheinen am verlässlichsten
zu sein. Ein effektives Immunisierungsprotokoll für Kaninchen
kann Vaitukaitis et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 33:988-991
(1971) entnommen werden.
-
Auffrischungsinjektionen
können
in regelmäßigen Abständen verabreicht
werden und Antiserum kann geerntet werden, wenn der Antikörpertiter
des Antiserums zu fallen beginnt, wobei dies halb quantitativ bestimmt
wird, wie beispielsweise durch doppelte Immunodiffusion in Agar
gegen bekannte Konzentrationen des Antigens. Siehe zum Beispiel
Ouchterlony et al., Kapitel 19 in: Handbook of Experimental Immunology
D. Wier (Hrsg.) Blackwell (1973). Die Plateaukonzentration des Antikörpers liegt
gewöhnlich
im Bereich von 0,1 bis 0,2 mg/ml Serum (etwa 12 μM). Die Affinität der Antiseren
für das
Antigen wird durch Erstellung kompetetiver Bindungskurven bestimmt,
wie es beispielsweise durch Fisher, D., Kapitel 42 in: Manual of
Clinical Immunology, 2. Ausgabe (Rose und Friedman, Hrsg.) Amer.
Soc. For Microbiol., Washington, D.C. (1980) beschrieben wird.
-
Nach
einem der beiden Protokolle hergestellte Antikörperpräparationen sind in quantitativen
Immunoassays zur Konzentrationsbestimmung von antigentragenden Substanzen
in biologischen Proben nützlich;
sie werden halb-quantitativ oder qualitativ verwendet, um das Vorliegen
eines Antigens in einer biologischen Probe zu identifizieren. Die
Antikörper
können
auch in therapeutischen Zusammensetzungen zum Abtöten von Zellen
verwendet werden, die das Protein exprimieren, oder sie können zur
Verringerung der Menge an Protein im Körper verwendet werden.
-
V. Verwendung von 5'-ESTs oder Sequenzen,
die davon erhältlich
sind oder Abschnitten davon, als Reagenzien
-
Die
hierin beschriebenen 5'-ESTs
(oder cDNAs oder genomische DNAs, die davon erhältlich sind) können als
Reagenzien in Isolierungsverfahren, diagnostischen Assays und forensischen
Verfahren verwendet werden. Beispielsweise können Sequenzen aus den 5'-ESTs (oder den cDNAs
oder den genomischen DNAs, die davon erhältlich sind) detektierbar markiert
werden und als Sonden verwendet werden, um andere Sequenzen zu isolieren,
die fähig
sind mit ihnen zu hybridisieren. Zusätzlich können Sequenzen aus 5'-ESTs (oder cDNAs
oder genomischen DNAs, die davon erhältlich sind) verwendet werden,
um PCR-Primer zu konzipieren, die in Isolierungsverfahren, diagnostischen
und forensischen Verfahren verwendet werden.
-
1. Verwendung von 5'-ESTs oder Sequenzen
die davon erhältlich
sind oder Abschnitten davon in Isolierungsverfahren diagnostischen
und forensischen Verfahren
-
BEISPIEL 44
-
Herstellung
von PCR-Primern und Amplifizierung von DNA
-
Die
5'-EST-Sequenzen
(oder cDNAs oder genomische DNAs, die davon erhältlich sind) können verwendet
werden, um PCR-Primer für
eine Vielfalt von Anwendungen herzustellen, einschließlich Isolierungsverfahren
zur Klonierung von Nukleinsäuren,
die in der Lage sind, an derartigen Sequenzen zu hybridisieren,
diagnostischen Techniken und forensischen Techniken. Die PCR-Primer
sind wenigstens 10 Basen und vorzugsweise wenigstens 12, 15 oder
17 Basen lang. Stärker
bevorzugt sind die PCR-Primer wenigstens 20-30 Basen lang. In einigen
Ausführungsformen
können
die PCR-Primer mehr als 30 Basen lang sein. Es ist bevorzugt, dass
die Primerpaare in etwa das gleiche G/C-Verhältnis aufweisen, so dass die
Schmelztemperaturen in etwa die gleichen sind. Eine Vielfalt an
PCR-Techniken ist
dem Fachmann bekannt. Für
eine Übersicht
zur PCR-Technologie siehe Molecular Cloning to Genetic Engineering,
White Hrsg. In Methods in Molecular Biology 67:Humana Press, Totowa
1997. In jedem dieser PCR-Verfahren
werden PCR-Primer auf beiden Seiten der Nukleinsäuresequenzen, die amplifiziert
werden sollen, zusammen mit dNTPs und einer thermostabilen Polymerase,
wie beispielsweise Taq-Polymerase, Pfu-Polymerase oder Vent-Polymerase, zu einer
geeignet hergestellten Nukleinsäureprobe
zugegeben. Die Nukleinsäure
in der Probe wird denaturiert und die PCR-Primer werden spezifisch
an komplementäre
Nukleinsäuresequenzen
in der Probe hybridisiert. Die hybridisierten Primer werden verlängert. Danach
wird ein weiterer Zyklus aus Denaturierung, Hybridisierung und Verlängerung
begonnen. Zur Erzeugung eines amplifizierten Fragments, das die
Nukleinsäuresequenz
zwischen den Primerstellen enthält,
werden die Zyklen mehrmals wiederholt.
-
BEISPIEL 45
-
Verwendung von 5'-ESTs als Sonden
-
Sonden,
die von 5'-ESTs
abgeleitet sind (oder von cDNAs oder genomischen DNAs, die davon
erhältlich
sind), einschließlich
Volllängen-cDNAs
oder genomischen Sequenzen, können
mit dem Fachmann bekannten detektierbaren Markierungen, einschließlich Radioisotopen
und nicht radioaktiven Markierungen, markiert werden, um eine detektierbare
Sonde bereitzustellen. Die detektierbare Sonde kann einzelsträngig oder
doppelsträngig
sein und kann unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken
hergestellt werden, einschließlich
in vitro-Transkription, Nick-Translation oder Kinasereaktionen.
Eine Nukleinsäureprobe, die
eine Sequenz enthält,
die in der Lage ist, mit der markierten Sonde zu hybridisieren,
wird mit der markierten Sonde in Kontakt gebracht. Wenn die Nukleinsäure in der
Probe doppelsträngig
ist, kann sie vor dem Inkontaktbringen mit der Sonde denaturiert
werden. In einigen Anwendungen kann die Nukleinsäureprobe auf einer Oberfläche, wie
beispielsweise einer Nitrozellulose- oder einer Nylonmembran, immobilisiert
werden. Die Nukleinsäureprobe
kann Nukleinsäuren
umfassen, die aus einer Vielfalt an Quellen erhalten wurden, einschließlich genomischer
DNA, cDNA-Bibliotheken, RNA oder Gewebeproben.
-
Verfahren,
die verwendet werden, um das Vorliegen von Nukleinsäuren zu
detektieren, die in der Lage sind, an die detektierbare Sonde zu
hybridisieren, umfassen wohl bekannte Techniken, wie beispielsweise Southern
Blotting, Northern Blotting, Dot Blotting, Koloniehybridisierung
und Plaquehybridisierung. In einigen Anwendungen kann die Nukleinsäure, die
zur Hybridisierung an die markierte Sonde fähig ist, in Vektoren kloniert
werden, wie beispielsweise Expressionsvektoren, Sequenzierungsvektoren
oder in vivo-Transkriptionsvektoren, um die Charakterisierung und
Expression der hybridisierenden Nukleinsäuren in der Probe zu ermöglichen.
Beispielsweise können
derartige Techniken verwendet werden, um Sequenzen in einer genomischen
Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek zu isolieren und zu klonieren,
die in der Lage sind, an die detektierbare Probe zu hybridisieren,
wie es in Beispiel 30 weiter oben beschrieben wird.
-
PCR-Primer,
die, wie in Beispiel 44 weiter oben beschrieben, hergestellt wurden,
können
in forensischen Analysen verwendet werden, wie beispielsweise den
DNA-Fingerprint-Techniken, wobei dies in den Beispielen 46-50 weiter
unten beschrieben wird. Solche Analysen können detektierbare Sonden oder
Primer verwenden, die auf den Sequenzen der 5'-ESTs oder der cDNAs oder der genomischen
DNAs, die unter Verwendung der 5'-ESTs
isoliert wurden, basieren.
-
Forensischer
Abgleich durch DNA-Sequenzierunq
-
In
einem beispielhaften Verfahren werden DNA-Proben, die aus forensischen
Einzelproben isoliert wurden, zum Beispiel Haar-, Samen-, Blut-
oder Hautzellen, durch herkömmliche
Verfahren isoliert. Ein Panel an PCR-Primern, die auf einer Anzahl
der 5'-ESTs aus
Beispiel 25 oder cDNAs oder genomischen DNAs, die daraus wie weiter
oben beschrieben isoliert wurden, basiert, wird anschließend in Übereinstimmung
mit Beispiel 44 verwendet, um DNA mit einer Länge von etwa 100-200 Basen
aus den forensischen Einzelproben zu amplifizieren. Entsprechende
Sequenzen werden aus einem Testprobanden erhalten. Jede dieser Identifizierungs-DNAs
wird anschließend
unter Verwendung von Standardtechniken sequenziert und ein einfacher
Datenbankvergleich bestimmt die Unterschiede, falls welche vorliegen,
zwischen den Sequenzen aus dem Probanden und denen aus der Probe.
Statistisch signifikante Unterschiede zwischen DNA-Sequenzen des
Verdächtigen
und denen aus der Probe belegen beweiskräftig ein Fehlen von Identität. Dieses
Fehlen an Identität kann
beispielsweise mit nur einer Sequenz bestätigt werden. Andererseits sollte
Identität
mit einer großen
Zahl von Sequenzen, die alle übereinstimmen,
gezeigt werden. Vorzugsweise wird ein Minimum von 50 statistisch identischen
Sequenzen mit 100 Basen Länge
verwendet, um die Identität
zwischen dem Verdächtigen
und der Probe zu beweisen.
-
BEISPIEL 47
-
Positive Identifizierung
durch DNA-Sequenzierung
-
Die
im vorausgehenden Beispiel aufgezeigte Technik kann in einem größeren Maßstab auch
verwendet werden, um eine eindeutige Identifizierung in der Art
eines Fingerabdrucks von einem beliebigen Individuum bereitzustellen.
In dieser Technik werden Primer aus einer großen Anzahl von 5'-EST-Sequenzen aus
Beispiel 25 oder cDNA oder genomische DNA-Sequenzen, die davon erhältlich sind,
hergestellt. Vorzugsweise werden 20 bis 50 verschiedene Primer verwendet.
Diese Primer werden verwendet, um eine entsprechende Anzahl PCR-generierter DNA-Segmente
des fraglichen Individuums in Übereinstimmung
mit Beispiel 44 zu erzeugen. Jedes dieser DNA-Segmente wird unter
Verwendung der in Beispiel 46 dargelegten Verfahren sequenziert.
Die Sequenzdatenbanken, die durch dieses Verfahren erzeugt wurden,
identifizieren eindeutig das Individuum, von dem die Sequenzen erhalten
wurden. Das gleiche Panel an Primern kann dann zu einem beliebigen
späteren
Zeitpunkt verwendet werden, um Gewebe oder andere biologische Einzelproben
mit diesem Individuum in absoluten Bezug zu setzen.
-
BEISPIEL 48
-
Forensische
Southern Blot Identifizierung
-
Das
Verfahren gemäß Beispiel
47 wird wiederholt, um ein Panel von wenigstens 10 amplifizierten
Sequenzen aus einem Individuum und einer Einzelprobe zu erhalten.
Vorzugsweise enthält
das Panel wenigstens 50 amplifizierte Sequenzen. Stärker bevorzugt
enthält
das Panel 100 amplifizierte Sequenzen. In einigen Ausführungsformen
enthält
das Panel 200 amplifizierte Sequenzen. Diese PCR-erzeugte DNA wird
anschließend mit
einem oder einer Kombination, vorzugsweise 4 basenspezifischen Restriktionsenzymen
verdaut. Solche Enzyme sind kommerziell erhältlich und dem Fachmann bekannt.
Nach dem Verdau werden die sich ergebenden Genfragmente bezüglich ihrer
Größe in mehreren
doppelten Wells auf einem Agarosegel aufgetrennt und auf Nitrozellulose
unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Southern Blot-Techniken übertragen.
Für eine Übersicht
bezüglich
Southern Blot-Übertragung
siehe Davis et al. (Basic Methods in Molecular Biology, 1986, Elsevier
Press, Seiten 62-65).
-
Ein
Panel an Proben, die auf den 5'-EST-Sequenzen
(oder den cDNAs oder den genomischen DNAs, die davon erhältlich sind)
oder Fragmenten davon mit wenigstens 10 Basen basieren, werden radioaktiv
oder colorimetrisch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten
Verfahren, wie beispielsweise Nick-Translation oder Endmarkierung, markiert
und auf dem Southern Blot unter Verwendung von im Fachbereich bekannten
Techniken hybridisiert (Davis et al., supra). Vorzugsweise umfasst
die Sonde wenigstens 12, 15 oder 17 aufeinander folgende Nukleotide
des 5'-ESTs (oder
der cDNAs oder der genomischen DNAs, die davon erhältlich sind).
Stärker
bevorzugt umfasst die Sonde wenigstens 20-30 aufeinander folgende
Nukleotide des 5'-ESTs
(oder der cDNAs oder der genomischen DNAs, die davon erhältlich sind).
In einigen Ausführungsformen
umfasst die Sonde mehr als 30 Nukleotide des 5'-ESTs (oder der cDNAs oder der genomischen
DNAs, die davon erhältlich
sind).
-
Vorzugsweise
werden wenigstens 5 bis 10 dieser markierten Sonden verwendet und
stärker
bevorzugt werden wenigstens etwa 20 oder 30 verwendet, um ein eindeutiges
Muster bereitzustellen. Die sich ergebenden Banden, die in Folge
der Hybridisierung einer großen
5'-EST-Probe (oder
einer cDNA-Probe oder einer genomischen DNA-Probe, die davon erhältlich sind)
erscheinen, sind ein eindeutiger Identifikator. Da die Restriktionsenzymspaltung
für jedes
Individuum unterschiedlich ist, ist auch das Bandenmuster auf dem
Southern Blot eindeutig. Eine Erhöhung der Zahl an 5'-EST-Sonden (oder
an cDNA- oder genomischen DNA-Sonden, die davon erhältlich sind)
stellt ein statistisch höheres
Maß an
Zuverlässigkeit
bezüglich
der Identifizierung bereit, da eine erhöhte Zahl an Bandensätzen zur
Identifizierung verwendet wird.
-
BEISPIEL 49
-
Dot Blot-Identifizierungsverfahren
-
Eine
andere Technik zur Identifizierung von Individuen greift auf eine
Dot Blot-Hybridisierungstechnik unter Verwendung der hierin offenbarten
5'-EST-Sequenzen zurück.
-
Genomische
DNA wird aus dem Kern eines Probanden, der identifiziert werden
soll, isoliert. Oligonukleotidsonden mit einer Länge von etwa 30 bp werden synthetisiert,
die wenigstens 10, vorzugsweise 50 Sequenzen der 5'-ESTs oder cDNAs
oder genomischen DNAs, die davon erhältlich sind, entsprechen. Die
Sonden werden verwendet, um die genomische DNA unter dem Fachmann bekannten
Bedingungen zu hybridisieren. Die Oligonukleotide werden unter Verwendung
von Polynukleotidkinase (Pharmacia) mit P32 endmarkiert. Die
Dot Blots werden durch Platzieren der genomischen DNA auf Nitrozellulose
oder ähnlichem
unter Verwendung eines Vakuum Dot Blot Manifolds (BioRad, Richmond,
Kalifornien) aufgetragen. Der Nitrozellulosefilter, der die genomischen
Sequenzen enthält,
wird gebacken oder die Sequenzen werden mittels UV mit dem Filter verknüpft, prehybridisiert
und unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Techniken (Davis
et al., supra) hybridisiert. Die 32P markierten
DNA-Fragmente werden
anschließend
nacheinander unter stufenweise veränderten stringenten Bedingungen
hybridisiert, um minimale Unterschiede zwischen der 30 bp Sequenz
und der DNA zu detektieren. Tetramethylammoniumchlorid ist bei der
Identifizierung von Klonen, die eine geringe Zahl an Nukleotid-Fehlabgleichen
enthalten, nützlich
(Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82(6):1585-1588, 1985).
Ein eindeutiges Dotmuster unterscheidet ein Individuum von einem
anderen Individuum.
-
5'-EST-Sequenzen (oder
cDNAs oder genomische DNAs, die davon erhältlich sind) oder Oligonukleotide,
die wenigstens 10 aufeinander folgende Basen aus diesen Sequenzen
enthalten, können
als Sonden in der nachfolgend beschriebenen alternativen Fingerprint-Technik
verwendet werden. Vorzugsweise umfasst die Sonde wenigstens 12,
15 oder 17 aufeinander folgende Nukleotide der 5'-EST-Sequenzen (oder cDNAs oder genomische
DNAs, die davon erhältlich
sind). Stärker
bevorzugt umfasst die Sonde wenigstens 20-30 aufeinander folgende
Nukleotide der 5'-EST-Sequenzen
(oder cDNAs oder genomischen DNAs, die davon erhältlich sind). In einigen Ausführungsformen
umfasst die Sonde mehr als 30 Nukleotide der 5'-EST-Sequenzen (oder cDNAs oder genomischen
DNAs, die davon erhältlich
sind).
-
Vorzugsweise
wird in dieser alternativen Fingerprinting-Technik eine Vielzahl
an Sonden mit Sequenzen aus verschiedenen Genen verwendet. Beispiel
50 weiter unten stellt ein repräsentatives
alternatives Fingerprint-Verfahren bereit, in dem die Sonden von
5'-EST abgeleitet
sind.
-
BEISPIEL 50
-
Alternative "Fingerprint"-Identifizierungstechnik
-
20-mer
Oligonukleotide werden aus einer großen Anzahl von 5'-ESTs z.B. 50, 100
oder 200 unter Verwendung kommerziell zur Verfügung stehender Oligonukleotid-Dienstleistungsunternehmen,
wie beispielsweise Genset, Paris, Frankreich, hergestellt. Zellproben
aus dem Testprobanden werden unter Verwendung von im Fachbereich
bekannten Techniken auf DNA hin aufgereinigt. Die Nukleinsäure wird
mit Restriktionsenzymen, wie beispielsweise EcoRI und XbaI, verdaut.
Nach dem Verdau werden die Proben auf Wells zur Elektrophorese aufgetragen.
Dieses im Fachbereich bekannte Verfahren kann abgeändert werden,
um Polyacrylamidelektrophorese einsetzen zu können, jedoch werden in diesem
Beispiel Proben, die 5 μg
DNA enthalten, in Wells aufgetragen und auf 0,8% Agarosegel aufgetrennt.
Die Gele werden unter Verwendung von standardmäßigen Southern Blot auf Nitrozellulose überführt.
-
10
ng von jedem der Oligonukleotide werden zusammengefasst und mit 32P endmarkiert. Die Nitrozellulose wird
mit Blockierlösung
prehybridisiert und mit den markierten Sonden hybridisiert. Im Anschluss
an die Hybridisierung und Waschen wird der Nitrozellulosefilter
gegenüber
einem X-Omat AR-Röntgenfilm
exponiert. Das sich ergebende Hybridisierungsmuster ist für jedes
Individuum eindeutig.
-
Es
wird im Rahmen dieses Beispiels zusätzlich in Erwägung gezogen,
dass die Anzahl der verwendeten Probensequenzen zum Zwecke zusätzlicher
Genauigkeit und Klarheit verändert
werden kann.
-
Die
Proteine, die durch die erweiterten cDNAs kodiert werden, können auch
verwendet werden, um, wie es in den Beispielen 30 und 43 erklärt wird,
Antikörper
zu erzeugen, um so den Gewebetyp oder die Zellspezies, von dem/der
die Probe abgeleitet wurde, zu identifizieren, wobei dies in Beispiel
51 beschrieben wird.
-
BEISPIEL 51
-
Identifizierung
von Gewebetypen oder Zellspezies mittels markierter gewebespezifischer
Antikörper
-
Die
Identifizierung spezifischer Gewebe wird durch die Visualisierung
gewebespezifischer Antigene mittels Antikörperpräparationen gemäß den Beispielen
30 und 43 ermöglicht,
die mit einem detektierbaren Marker direkt oder indirekt konjugiert
sind. Ausgewählte
markierte Antikörperspezies
binden an ihren spezifischen Antigenbindepartner in Gewebeabschnitten,
Zellsuspensionen oder in Extrakten löslicher Proteine aus einer
Gewebeprobe, um so ein Muster für
eine qualitative oder halb-qualitative Interpretation bereitzustellen.
-
Für diese
Verfahren müssen
Antiseren einen Wirkstoffgehalt aufweisen, der über dem der nativen Präparation
liegt, und deshalb werden Antikörper
durch Isolierung der Gammaglobulinfraktion bis zu einem mg/ml Niveau
konzentriert, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatografie
oder durch Ammoniumsulfatfraktionierung. Um höchstmöglich spezifische Antiseren
bereitzustellen, müssen
bevor die Antikörper
mit dem Marker markiert werden auch unerwünschte Antikörper, zum
Beispiel für
gewöhnliche
Proteine, aus der Gammaglobulinfraktion entfernt werden, beispielsweise
mittels unlöslicher
Immunoabsorbentien. Sowohl monoklonale als auch heterologe Antikörper sind
für beide
Verfahren geeignet.
-
A. Immunohistochemische
Techniken
-
Gereinigte
Antikörper
mit hohem Titer, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, werden
mit einem detektierbaren Marker konjugiert, wie es beispielsweise
von Fudenberg, Kapitel 26 in: Basic and Clinical Immunology, 3.
Ausgabe, Lange, Los Altos, Kalifornien, 1980 oder Rose et al., Kapitel
12 in: Methods in Immunodiagnosis, 2. Ausgabe John Wiley and Sons,
New York (1980) beschrieben wird.
-
Ein
Fluoreszenzmarker, entweder Fluorescein oder Rhodamin, ist bevorzugt,
aber die Antikörper
können
auch mit einem Enzym markiert sein, das eine farberzeugende Reaktion
mit einem Substrat unterstützt, wie
beispielsweise Meerrettich-Peroxidase. Wie es weiter unten beschrieben
wird, können
in einem zweiten Schritt Marker zu einem gewebegebundenen Antikörper hinzugegeben
werden. Alternativ können
spezifische Antigewebe-Antikörper
mit Ferritin oder anderen Partikeln mit hoher Elektronendichte markiert
werden und die Lokalisierung der Ferritin-gekoppelten Antigen-Antikörper-Komplexe
kann mittels eines Elektronenmikroskops erfolgen. In noch einem
weiteren Ansatz können
die Antikörper
radiomarkiert werden, beispielsweise mit 125I, und
durch Überschichten
der mit Antikörper
behandelten Präparation
mittels einer fotografischen Emulsion detektiert werden.
-
Präparationen
zur Ausführung
der Verfahren können
monoklonale oder polyklonale Antikörper für ein einzelnes Protein oder
Peptid umfassen, deren Spezifität
für einen
Gewebetyp, wie beispielsweise Hirngewebe, identifiziert worden ist,
oder es können
Antikörperpräparationen
für mehrere
antigenisch unterschiedliche gewebespezifische Antigene in Panelen
verwendet werden, je nach dem wie erforderlich, unabhängig voneinander
oder in Gemischen.
-
Gewebeabschnitte
und Zellsuspensionen zur immunohistochemischen Untersuchung werden
gemäß herkömmlichen
histologischen Techniken hergestellt. Mehrere Cryostatabschnitte
(etwa 4 um, unfixiert) des unbekannten Gewebes und der bekannten
Kontrolle werden montiert und jeder Objektträger wird mit unterschiedlichen
Verdünnungen
der Antikörperpräparation
bedeckt. Abschnitte bekannter und unbekannter Gewebe sollten auch
mit Präparationen
behandelt werden, um eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle,
beispielsweise Pre-Immunseren, und eine Kontrolle für unspezifische
Färbung,
beispielsweise Puffer, bereitzustellen.
-
Die
behandelten Abschnitte werden in einer feuchten Kammer für etwa 30
min bei Raumtemperatur inkubiert, gespült und anschließend in
Puffer für
30-45 min gewaschen. Überschüssige Flüssigkeit
wird abgetupft und der Marker wird entwickelt.
-
Falls
der gewebespezifische Antikörper
während
der ersten Inkubation nicht markiert wurde, kann er zu diesem Zeitpunkt
in einer zweiten Antikörper-Antikörper-Reaktion
markiert werden, beispielsweise durch Zugabe von Fluorescein- oder
Enzym-konjugiertem Antikörper
gegen die Immunoglobulinklasse der das Antiserum erzeugenden Spezies,
zum Beispiel Fluorescein-markierter Antikörper gegen Maus-IgG. Derartige
markierte Seren sind kommerziell erhältlich.
-
Das
Antigen, das durch das obige Verfahren in den Geweben nachgewiesen
worden ist, kann durch Messung der Farb- oder Fluoreszenz-Intensität im Gewebeabschnitt
und Kalibrierung des Signals unter Verwendung von geeigneten Standards
quantifiziert werden.
-
B. Identifizierung gewebespezifischer
löslicher
Proteine
-
Die
Visualisierung gewebespezifischer Proteine und die Identifizierung
unbekannter Gewebe gemäß diesem
Verfahren wird unter Verwendung markierter Antikörperreagenzien und einer Detektionsstrategie,
wie sie für
die Immunohistochemie beschrieben wurde, durchgeführt; jedoch
wird die Probe nach einer elektrophoretischen Technik hergestellt,
um die Proteine, die aus dem Gewebe extrahiert wurden, zur Detektion
in einem systematischen Array auf Grundlage des Molekulargewichts
zu verteilen.
-
Eine
Gewebeprobe wird unter Verwendung einer Virtis-Vorrichtung homogenisiert;
Zellsuspensionen werden durch Dounce-Homogenisierung oder osmotische
Lyse, wie im Fachbereich üblich
aufgebrochen, wobei in beiden Fällen, falls
nötig,
Detergenzien verwendet werden, um Zellmembranen aufzubrechen. Unlösliche Zellkomponenten,
wie beispielsweise Zellkerne, Microsomen und Membranfragmente, werden
durch Ultrazentrifugation entfernt und die lösliche proteinenthaltende Fraktion,
falls nötig,
konzentriert und zur Analyse zurückgehalten.
-
Eine
Probe der Lösung
mit löslichen
Proteinen wird durch herkömmliche
SDS-Polyacrylamidelektrophorese in einzelne Proteinspezies aufgelöst, wie
es beispielsweise durch Davis et al., Abschnitt 19-2 in: Basic Methods
in Molecular Biology, Leder Hrsg., Elsevier, New York, 1986 beschrieben
wird, wobei in einem Satz von Gelen ein Bereich von Polyacrylamidmengen
verwendet wird, um den voltständigen
Molekulargewichtsbereich der Proteine, die in der Probe detektiert
werden sollen, aufzulösen.
Ein Größenmarker
wird parallel aufgetrennt, um so die Molekulargewichte der einzelnen
Proteine abschätzen
zu können.
Die zu analysierende Probengröße entspricht
einem zweckmäßigen Volumen
von 5 bis 55 μl
und enthält
etwa 1 bis 100 μg
Protein. Ein Aliquot von jedem der aufgelösten Proteine wird durch blotten
auf ein Nitrozellulosefilterpapier übertragen, wobei dieses Verfahren
das Auflösungsmuster
erhält.
Es werden mehrere Kopien hergestellt. Das Verfahren, das als Western
Blot Analyse bekannt ist, ist in Davis, L. Et al., supra Abschnitt
19-3, gut beschrieben. Ein Satz der Nitrozelluloseblots wird mit
Coomassie Blau Farbstoff angefärbt,
um den vollständigen
Satz an Proteinen zum Vergleich mit den antikörpergebundenen Proteinen sichtbar
zu machen. Die verbleibenden Nitrozellulosefilter werden anschließend mit
einer Lösung
aus einem oder mehreren spezifischen Antiseren von gewebespezifischen
Proteinen, die wie in den Beispielen 30 und 43 beschrieben hergestellt
wurden, inkubiert. In diesen Verfahren werden, wie in Verfahren
A oben beschrieben, geeignete Positiv- und Negativproben und Reagenzkontrollen
mitgeführt.
-
In
beiden Verfahren A oder B kann eine detektierbare Markierung an
den Primärgewebeantigen-Primärantikörper-Komplex
nach verschiedenen Strategien und Abänderungen davon angebracht
werden. In einem direkten Ansatz kann der primärspezifische Antikörper markiert
werden; alternativ kann der unmarkierte Komplex durch einen markierten
Zweit-anti-IgG-Antikörper
gebunden werden. In anderen Ansätzen
ist entweder der Primär-
oder der Sekundärantikörper mit
einem Biotinmolekül
konjugiert, das in einem nachfolgenden Schritt an einen avidinkonjugierten
Marker binden kann. Gemäß noch einer
weiteren Strategie wird enzymmarkiertes oder radioaktives Protein
A, das die Fähigkeit
besitzt, an jedes beliebige IgG zu binden, in einem abschließenden Schritt
entweder an den Primär- oder Sekundärantikörper gebunden.
-
Das
Sichtbarmachen gewebespezifischer Antigenbindung in einem Ausmaß, das über dem
liegt, das in Kontrollgeweben für
einen oder mehrere gewebespezifische Antikörper beobachtet wird, wobei
die Antikörper
aus den Gensequenzen hergestellt wurden, die aus erweiterten cDNA-Sequenzen
identifiziert wurden, kann Gewebe von unbekanntem Ursprung identifizieren,
wie beispielsweise forensische Proben oder differenziertes Tumorgewebe,
das an fremden Körperstellen
metastasiert hat.
-
Zusätzlich zu
ihren Anwendungen in der Forensik und bei der Identifizierung können 5'-ESTs (oder cDNAs
oder genomische DNAs, die davon erhältlich sind) bezüglich ihrer
chromosomalen Lage kartiert werden. Beispiel 52 weiter unten beschreibt
Strahlungshybrid(SH)kartierung von humanen chromosomalen Abschnitten
unter Verwendung von 5'-ESTs.
Beispiel 53 weiter unten beschreibt ein repräsentatives Verfahren zur Kartierung
eines 5'-ESTs bezüglich seiner
Lage auf einem humanen Chromosom. Beispiel 54 beschreibt die Kartierung
von 5'-ESTs bezüglich Chromosomen
in der Metaphase durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Der Fachmann
erkennt, dass die Verfahren gemäß den Beispielen
52-54 auch verwendet werden können,
um cDNAs oder genomische DNAs, die aus den 5'-ESTs erhalten werden können, bezüglich ihrer
chromosomalen Lage zu kartieren.
-
2. Verwendung von 5'-ESTs oder Sequenzen,
die daraus erhältlich
sind oder Abschnitten davon, bei der Chromosomenkartierung
-
BEISPIEL 52
-
Strahlungshybridkartierung
von 5'-ESTs hinsichtlich
des menschlichen Genoms
-
Strahlungshybrid
(SH)kartierung ist ein genetischer Ansatz für somatische Zellen, der zur
hochaufgelösten
Kartierung des menschlichen Genoms verwendet werden kann. In diesem
Verfahren werden Zelllinien, die eines oder mehrere menschliche
Chromosomen enthalten, in einem tödlichen Ausmaß bestrahlt,
wobei jedes Chromosom in Fragmente zerbricht, deren Größe von der
Strahlendosis abhängig
ist. Diese Fragmente werden durch Fusion mit kultivierten Fresszellen
gewonnen, was zu Subklonen führt,
die verschiedene Abschnitte des menschlichen Genoms enthalten. Dieses
Verfahren wird von Benham et al., Genomics 4:509-517, 1989, und
Cox et al., Science 250:245-250, 1990, beschrieben. Die zufällige und
unabhängige
Art der Subklone ermöglicht
eine effiziente Kartierung eines beliebigen menschlichen Genommarkers.
Menschliche DNA, die aus einem Panel von 80-100 Zelllinien isoliert
wurde, stellt ein Kartierungsreagenz zur 5'-EST-Anordnung bereit. In diesem Verfahren
wird die Bruchhäufigkeit
zwischen Markern herangezogen, um den Abstand zu bestimmen, wobei
dies die Konstruktion hochaufgelöster
Karten ermöglicht,
wie es für
die Verwendung herkömmlicher
ESTs bereits ausgeführt
wurde (Schuler et al., Science 274:540-546, 1996).
-
Es
wurde SH-Kartierung verwendet, um eine hochaufgelöste Strahlungshybridkarte
des vollständigen Genoms
des menschlichen Chromosoms 17q22-q25.3 über die Gene für das Wachstumshormon
(Growth Hormome, GH) und Tymidinkinase (TK) (Foster et al., Genomics
33:185-192, 1996), den Abschnitt, der das Gorlin-Syndromgen umgibt
(Obermayr et al., Eur. J. Hum. Genet. 4:242-245, 1996), die Loci,
die den vollständigen kurzen
Arm von Chromosom 12 abdecken (Raeymaekers et al., Genomics 29:170-178,
1995), den Abschnitt des humanen Chromosoms 22, der den Neurofibromatosistyp
2 Locus enthält
(Frazer et al., Genomics 14:574-584, 1992), und die 13 Loci auf
dem langen Arm von Chromosom 5 (Warrington et al., Genomics 11:701-708,
1991) herzustellen.
-
BEISPIEL 53
-
Kartierung von 5'-ESTs auf humanen
Chromosomen unter Verwendung von PCR-Techniken
-
5'-ESTs (oder cDNAs
oder genomische DNAs, die davon erhältlich sind) können unter
Verwendung von Methoden auf PCR-Basis menschlichen Chromosomen zugeordnet
werden. In solchen Ansätzen
werden Oligonukleotid-Primerpaare
aus den 5'-ESTs
(oder den cDNAs oder den genomischen DNAs, die davon erhältlich sind)
konzipiert, um die Wahrscheinlichkeit einer Amplifizierung über ein
Intron zu minimieren. Vorzugsweise weisen die Oligonukleotid-Primer
eine Länge
von 18-23 bp auf und sind zur PCR-Amplifizierung konzipiert. Die
Erstellung von PCR-Primern aus bekannten Sequenzen ist dem Fachmann
wohl bekannt. Für
eine Übersicht
zur PCR-Technologie siehe Erlich in PCR Technology, Principles and
Applications for DNA Amplification, Freeman und Co., New York, 1992.
-
Zur
Amplifizierung von Matrizen aus humaner genomischer Gesamt-DNA werden
Primer werden in Polymerasekettenreaktionen (PCR) eingesetzt. Die
PCR-Bedingungen
sind wie folgt: 60 ng genomische DNA wird als Matrize für eine PCR
mit 80 ng eines jeden Oligonukleotid-Primers, 0,6 Einheiten Taq-Polymerase
und 1 μCu
eines 32P-markierten Deoxycytidintriphosphats
verwendet. Die PCR wird in einem Microplate Thermocycler (Techne)
unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 30 Zyklen bei 94°C, 1,4 min;
55°C, 2
min; und 72°C,
2 min; mit einer abschließenden
Verlängerung
bei 72°C
für 10
min. Die amplifizierten Produkte werden auf einem 6%igen Polyacrylamidsequenzierungsgel
analysiert und durch Autoradiografie visualisiert. Wenn die Länge des
sich ergebenden PCR-Produkts
identisch ist zum Abstand zwischen den Enden der Primersequenzen
in der erweiterten cDNA, aus der die Primer abgeleitet wurden, wird
die PCR- Reaktion
anschließend mit
DNA-Matrizen aus zwei Panelen somatischer Mensch-Nager Zellhybride, BIOS PCRable DNA
(BIOS Corporation) und NIGMS Human-Rodent Somatic Cell Hybrid Mapping Panel
Number 1 (NIGMS, Camden, NJ) wiederholt.
-
Die
PCR wird eingesetzt, um eine Serie somatischer Zellhybrid-Zelllinien,
die definierte Sätze
an humanen Chromosomen enthalten, bezüglich des Vorliegens eines
gegebenen 5'-ESTs
(oder einer cDNA oder einer genomischen DNA, die davon erhältlich ist)
durchzumustern. Die DNA wird aus den somatischen Hybriden isoliert
und als Ausgangsmatrizen für
PCR-Reaktionen unter Verwendung der Primerpaare des 5'-ESTs (oder einer
cDNA oder einer genomischen DNA, die davon erhältlich ist) verwendet. Nur
solche somatischen Zellhybride mit Chromosomen, die das humane Gen
enthalten, das mit dem 5'-EST (oder der cDNA
oder der genomischen DNA, die daraus erhältlich ist) korrespondiert,
führen
zu einem amplifizierten Fragment. Das 5'-EST (oder die cDNA oder die genomische
DNA, die daraus erhältlich
ist) wird dem Chromosom durch Analyse des Segregationsmusters der
PCR-Produkte aus den somatischen Hybrid-DNA-Matrizen zugeordnet. Das
einzige humane Chromosom, das in allen Zellhybriden vorliegt, die
zu einem amplifizierten Fragment führen, ist das Chromosom, das
das 5'-EST (oder
die cDNA oder die genomische DNA, die daraus erhältlich ist) enthält. Für eine Übersicht
zu Techniken und Analysen von Ergebnissen aus Experimenten zur somatischen Zell-Gen-Charakterisierung
siehe Ledbetter et al., Genomics 6:475-481, 1990.
-
BEISPIEL 54
-
Kartierung erweiterter
5'-ESTs auf Chromosomen
unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung
-
Fluoreszenz
in situ-Hybridisierung ermöglicht,
dass das 5'-EST
(oder die cDNA oder die genomische DNA, die davon erhältlich ist)
an einer bestimmter Stelle auf einem gegebenen Chromosom kartiert
wird. Die Chromosomen, die für
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungstechniken verwendet werden, können aus
einer Vielfalt von Quellen, einschließlich Zellkulturen, Geweben
oder Vollblut, erhalten werden.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine chromosomale Lage eines 5'-ESTs (oder einer cDNA oder genomischen
DNA, die davon erhältlich
ist) durch FISH erhalten, wie es von Cherif et al. (Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 87:6639-6643, 1990) beschrieben wird. Chromosomen
in der Metaphase werden aus Phytohemagglutinin (PHA)-stimulierten
Blutzelldonoren hergestellt. PHS-stimulierte
Lymphozyten aus gesunden Männern werden
für 72
hin RPMI-1640-Medium
kultiviert. Zur Synchronisierung wird Methotrexat (10 μM) für 17 h zugegeben,
wobei im Anschluss 5-Bromdeoxyuridin (5-BrdU, 0,1 mM) für 6 h zugegeben
wird. Colcemid (1 μg/ml)
wird für
die letzten 15 min vor der Ernte der Zellen zugegeben. Die Zellen
werden gesammelt, in RPMI gewaschen, mit einer hypotonischen Lösung aus
KCl (75 mM) bei 37°C
für 15
min inkubiert und unter dreimaligem Wechseln in Methanol:Essigsäure (3:1)
fixiert. Die Zellsuspension wird auf einen Glasobjektträger aufgetropft
und luftgetrocknet. Das 5'-EST
(oder die cDNA oder die genomische DNA, die davon erhältlich ist)
wird mit Biotin-16 dUTP durch Nick-Translation gemäß den Anweisungen
des Herstellers (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) markiert,
unter Verwendung einer Sephadex G-50-Säule (Pharmacia, Upsala, Schweden)
gereinigt und präzipitiert.
Kurz vor der Hybridisierung wird das DNA-Pellet in Hybridisierungspuffer gelöst (50%
Formamid, 2 × SSC,
10% Dextransulfat, 1 mg/ml mit Ultraschall behandelte Lachssperma-DNA, pH
7) und die Probe wird bei 70°C
für 5-10
min denaturiert.
-
Die
bei –20°C gehaltenen
Objektträger
werden für
1 h bei 37°C
mit RNase A (100 μg/ml)
behandelt, dreimal in 2 × SSC
gespült
und in einer Ethanolreihe dehydriert. Die Chromosompräparationen
werden in 70% Formamid, 2 × SSC
für 2 min
bei 70°C
denaturiert, anschließend
bei 4°C
dehydriert. Die Objektträger
werden mit Proteinase K (10 μg/100
ml in 20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2) bei 37°C für 8 min
behandelt und dehydriert. Das Hybridisierungsgemisch, das die Sonde
enthält,
wird auf dem Objektträger
platziert, mit einem Deckglas abgedeckt, mit Gummikitt versiegelt
und über
Nacht in einer feuchten Kammer bei 37°C hybridisiert. Nach der Hybridisierung
und Waschschritten im Anschluss an die Hybridisierung wird die biotinylierte
Sonde durch Avidin-FITC detektiert und mit zusätzlichen Schichten von biotinylierten
Ziege-anti-Avidin und Avidin-FITC amplifiziert. Zur chromosomalen
Lagebestimmung werden fluoreszierende R-Banden, wie kürzlich beschrieben (Cherif
et al., supra), erhalten. Die Objektträger werden unter einem LEICA-Fluoreszenzmikroskop
(DMRXA) beobachtet. Die Chromosomen werden mit Propidiumjodid gegengefärbt und
das Fluoreszenzsignal der Sonde erscheint als zwei symmetrisch gelbgrüne Punkte
auf beiden Chromatiden des fluoreszierenden R-Band-Chromosoms (rot).
Daher kann ein bestimmtes 5'-EST
(oder eine cDNA oder genomische DNA, die daraus erhältlich ist)
einer bestimmten zytogenetischen R-Bande auf einem gegebenen Chromosom
zugeordnet werden.
-
Nachdem
das 5'-EST (oder
die cDNA oder die genomische DNA, die daraus erhältlich ist) unter Verwendung
der in den Beispielen 52-54 weiter oben beschriebenen Techniken
einmal bestimmten Chromosomen zugeordnet worden ist, können sie
verwendet werden, um eine hochaufgelöste Chromosomenkarte zu erstellen,
auf der sie lokalisiert sind oder um die Chromosomen in der Probe
zu identifizieren.
-
BEISPIEL 55
-
Verwendung von 5'-ESTs, um Chromosomkarten
zu konstruieren oder zu erweitern
-
Chromosomkartierung
umfasst das Zuordnen einer gegebenen eindeutigen Sequenz zu einem
bestimmten Chromosom, wie es oben beschrieben wurde. Nachdem die
eindeutige Sequenz einmal auf einem gegebenen Chromosom kartiert
worden ist, wird sie relativ zu anderen eindeutigen Sequenzen zugeordnet, die
auf demselben Chromosom lokalisiert sind. Ein Ansatz zur Chromosomenkartierung
verwendet eine Serie künstlicher
Hefechromosomen (YACs), die mehrere tausend lange Inserts tragen,
die aus den Chromosomen des Organismus abgeleitet wurden, von denen
die erweiterten cDNAs (oder die genomische DNAs, die daraus erhältlich sind)
erhalten wurden. Dieser Ansatz wird in Nagaraja et al., Genome Research
7:210-222, 1997, beschrieben. In Kürze, in diesem Ansatz wird
jedes Chromosom in überlappende
Stücke
zerbrochen, die in den YAC-Vektor insertiert werden. Die YAC-Inserts
werden unter Verwendung von PCR oder anderen Verfahren durchmustert,
um zu bestimmen, ob sie das 5'-EST
(oder die cDNA oder die genomische DNA, die daraus erhältlich ist)
umfassen, dessen Position bestimmt werden soll. Sobald das Insert,
das das 5'-EST (oder
die cDNA oder die genomische DNA, die daraus erhältlich ist) umfasst, einmal
nachgewiesen worden ist, kann das Insert durch PCR oder andere Verfahren
analysiert werden, um zu bestimmen, ob das Insert auch andere Sequenzen
enthält,
für die
bekannt ist, dass sie sich auf dem Chromosom in dem Abschnitt befinden,
von dem das 5'-EST
(oder die cDNA oder die genomische DNA, die daraus erhältlich ist)
abgeleitet wurde. Dieses Verfahren kann für jedes Insert in der YAC-Bibliothek
wiederholt werden, um die Lokalisierung einer jeden der erweiterten
cDNAs (oder der genomischen DNAs, die daraus erhältlich sind) relativ zueinander
und zu anderen bekannten chromosomalen Markern zu bestimmen. Auf
diese Weise kann eine hochaufgelöste
Karte der Verteilung einer Vielzahl eindeutiger Marker über jedes
einzelne der Chromosomen des Organismus erhalten werden.
-
Wie
in Beispiel 56 weiter unten beschrieben, können erweiterte cDNAs (oder
genomische DNAs, die daraus erhältlich
sind) auch zur Identifizierung von Genen verwendet werden, die mit
einem bestimmten Phänotyp
verbunden sind, wie beispielsweise einer Erbkrankheit oder einer
Wirkstoffantwort.
-
3. Verwendung von 5'-ESTs oder Sequenzen,
die daraus erhältlich
sind, oder Fragmenten davon zur Identifizierung von Genen
-
BEISPIEL 56
-
Identifizierung von Genen,
die mit Erbkrankheiten oder Ansprechen auf einen Wirkstoff im Zusammenhang
stehen
-
Dieses
Beispiel zeigt einen Ansatz, der zum Erstellen eins Zusammenhangs
von 5'-ESTs (oder
cDNA oder genomischer DNA, die daraus erhältlich ist) mit bestimmten
phänotypischen
Merkmalen nützlich
ist. In diesem Beispiel wird ein bestimmtes 5'-EST (oder eine cDNA oder genomische
DNA, die daraus erhältlich
ist) als Testsonde verwendet, um dieses 5'-EST (oder die cDNA oder die genomische
DNA, die daraus erhältlich ist)
mit einem bestimmten phänotypischen
Merkmal in Zusammenhang zu setzen.
-
5'-ESTs (oder cDNA
oder genomische DNA, die daraus erhältlich ist) werden an bestimmten
Stelle auf einem menschlichen Chromosom unter Verwendung von Techniken,
wie denjenigen, die in den Beispielen 52 und 53 beschrieben sind,
oder anderen, im Fachbereich bekannten Techniken, kartiert. Eine
Suche zur Mendelschen Vererbung im Menschen (McKusick in Mendelian
Inheritance in Man (Online verfügbar über Johns Hopkins
University Welch Medical Library) offenbart, dass der Abschnitt
des humanen Chromosoms, der das 5'-EST (oder die cDNA oder die genomische
DNA, die daraus erhältlich
ist) enthält,
eine sehr genreiche Region darstellt, die mehrere bekannte Gene
und einige Krankheiten oder Phänotypen
umfasst, für
die keine Gene identifiziert wurden. Das Gen, das mit diesem 5'-EST (oder der cDNA
oder der genomischen DNA, die daraus erhältlich ist) korrespondiert,
ist deshalb ein unmittelbar ein Kandidat für jede dieser genetischen Erkrankungen.
-
Zellen
aus Patienten mit diesen Erkrankungen oder Phänotypen werden isoliert und
in Kultur expandiert. PCR-Primer des 5'-ESTs (oder der cDNA oder der genomischen
DNA, die daraus erhältlich
ist) werden verwendet, um genomische DNA, mRNA oder cDNA, die von
den Patienten erhalten wurde, durchzumustern. 5'-ESTs (oder cDNA oder genomische DNA,
die daraus erhältlich
ist), die in den Patienten nicht amplifiziert werden, können durch
weitere Untersuchungen mit einer bestimmten Krankheit positiv in
Zusammenhang gebracht werden. Alternativ kann die PCR-Untersuchung
zu Fragmenten mit abweichenden Längen
führen, wenn
die Proben von einem Individuum abgeleitet sind, das den Phänotyp aufweist,
der mit der Erkrankung in Zusammenhang steht, als wenn die Probe
von einem gesunden Individuum abgeleitet ist, wobei dies zeigt, dass
das Gen, das das 5'-EST
enthält,
für die
genetische Erkrankung verantwortlich sein kann.
-
VI. Verwendung eines 5'-ESTs (oder cDNA
oder genomischer DNA, die daraus erhältlich ist) zur Konstruktion von
Vektoren
-
Die
vorliegenden 5'-ESTs
(oder cDNA oder genomische DNA, die daraus erhältlich ist) können auch verwendet
werden, um Sekretionsvektoren zu konstruieren, die in der Lage sind,
die Sekretion der Proteine zu lenken, die durch Gene in den Vektoren
kodiert werden. Solche Sekretionsvektoren können die Reinigung oder Anreicherung
der Proteine erleichtern, die durch Gene kodiert werden, die im
Sekretionsvektor insertiert sind, wobei die Zahl an Hintergrundproteinen,
von welchen das gewünschte
Protein gereinigt oder angereichert werden muss, verringert wird.
Beispielhafte Sekretionsvektoren werden in Beispiel 57 weiter unten
beschrieben.
-
1. Konstruktion
von Sekretionsvektoren
-
BEISPIEL 57
-
Konstruktion von Sekretionsvektoren
-
Die
Sekretionsvektoren umfassen einen Promotor, der in der Lage ist,
Genexpression in der Wirtszelle, im Gewebe oder einem Organismus
von Interesse zu lenken. Solche Promotoren umfassen den Rous Sarcoma
Virus- Promotor,
den SV40-Promotor, den humanen Zytomegalovirus-Promotor und andere
dem Fachmann vertraute Promotoren.
-
Eine
Signalsequenz eines 5'-ESTs
(oder einer cDNA oder einer genomischen DNA, die daraus erhältlich ist)
ist mit dem Promotor operativ so verknüpft, dass die mRNA, die vom
Promotor transkribiert wird, die Translation des Signalpeptids lenkt.
Die Wirtszelle, das Gewebe oder der Organismus kann eine beliebige
Zelle, ein beliebiges Gewebe oder ein beliebiger Organismus sein,
der das Signalpeptid erkennt, das durch die Signalsequenz im 5'-EST (oder der cDNA
oder der genomischen DNA, die daraus erhältlich ist) kodiert wird. Geeignete
Wirtszellen umfassen Säugerzellen,
Gewebe aus Säugern
oder Säugerorganismen,
Vogelzellen, Vogelgewebe oder Vogelorganismen, Insektenzellen, Insektengewebe
oder Insektenorganismen oder Hefe.
-
Zusätzlich enthält der Sekretionsvektor
Klonierungsstellen zum Insertieren der Gene, die die Proteine kodieren,
die sekretiert werden sollen. Die Klonierungsstellen ermöglichen
die Klonierung des insertierten Gens im Leserahmen mit der Signalsequenz,
so dass ein Fusionsprotein, in dem das Signalpeptid mit dem Protein
fusioniert ist, das durch das insertierte Gen kodiert wird, von
der mRNA exprimiert wird, die vom Promotor transkribiert wird. Das
Signalpeptid lenkt die extrazelluläre Sekretion des Fusionsproteins.
-
Der
Sekretionsvektor kann DNA oder RNA sein und kann sich in das Chromosom
des Wirts integrieren, wobei er als ein extrachromosomales Replikon
stabil im Wirt verbleiben kann, der Sekretionsvektor kann ein künstliches
Chromosom sein oder er kann transient im Wirt vorliegen. Viele Nukleinsäurerückgrate,
die zur Verwendung als Sekretionsvektoren geeignet sind, sind dem
Fachmann bekannt, einschließlich
retroviraler Vektoren, SV40-Vektoren, Bovine Papilloma Virus-Vektoren,
hefeintegrierender Plasmiden, hefeepisomaler Plasmiden, künstlicher
Chromosomen aus Hefe, künstlicher
menschlicher Chromosomen, P-Element-Vektoren, Baculovirus-Vektoren
oder bakterieller Plasmide, die in der Lage sind, transient in den
Wirt eingeführt
werden zu können.
-
Der
Sekretionsvektor kann auch ein PolyA-Signal enthalten, dergestalt,
dass das PolyA-Signal stromabwärts
des Gens, das in den Sekretionsvektor insertiert ist, lokalisiert
ist.
-
Nachdem
das Gen, das das Protein kodiert, für das eine Sekretion erwünscht ist,
in den Sekretionsvektor insertiert worden ist, wird der Sekretionsvektor
in die Wirtszelle, das Gewebe oder den Organismus unter Verwendung
von Calciumphosphatpräzipitierung,
DEAE-Dextran, Elektroporation, liposomenvermittelter Transfektion,
viraler Partikel oder als bloße
DNA eingeführt.
Das durch das insertierte Gen kodierte Protein wird anschließend unter
Verwendung konventioneller Techniken, wie beispielsweise Ammoniumsulfatpräzipitierung,
Immunopräzipitierung,
Immunochromatografie, Größenausschlusschromatografie,
Ionenaustauschchromatografie und HPLC, aus dem Überstand aufgereinigt oder
angereichert. Alternativ kann das sekretierte Protein in ausreichendem
Maß angereichert
oder in reinen Zustand im Überstand
oder im Wachstumsmedium des Wirts vorliegen, so dass es möglich ist,
es für
den beabsichtigten Zweck ohne weitere Anreicherung zu verwenden.
-
Die
Signalsequenzen können
auch in Vektoren insertiert werden, die zur Gentherapie konzipiert
sind. In derartigen Vektoren ist die Signalsequenz operativ mit
einem Promotor verknüpft,
so dass die mRNA, die vom Promotor transkribiert wird, das Signalpeptid
kodiert. Eine Klonierungsstelle ist stromabwärts der Signalsequenz lokalisiert,
so dass ein Gen, das ein Protein kodiert, dessen Sekretion erwünscht ist,
leicht in den Vektor insertiert werden kann und mit der Signalsequenz
fusioniert werden kann. Der Vektor wird in eine geeignete Wirtszelle
eingeführt.
Das Protein, das vom Promotor exprimiert wird, wird extrazellulär sekretiert,
wodurch ein therapeutischer Effekt erzeugt wird.
-
Die
5'-ESTs können auch
verwendet werden, um Sequenzen zu klonieren, die stromaufwärts der 5'-ESTs lokalisiert
sind und in der Lage sind, die Genexpression zu regulieren, einschließlich Promotorsequenzen,
Enhancer- Sequenzen
und anderen stromaufwärts
liegenden Sequenzen, die den Grad an Transkription oder Translation
beeinflussen. Nachdem sie identifiziert und kloniert worden sind,
können
diese stromaufwärts liegenden
regulatorischen Sequenzen in Expressionsvektoren verwendet werden,
die konzipiert wurden, die Expression eines insertierten Gens in
einer räumlichen,
zeitlichen, entwicklungsspezifischen oder quantitativen Weise zu
lenken. Beispiel 58 beschreibt ein Verfahren zur Klonierung von
Sequenzen, die stromaufwärts der
erweiterten cDNAs oder 5'-ESTs liegen.
-
2. Identifizierung
von stromaufwärts
liegenden Sequenzen mit Promotoraktivität oder regulatorischer Aktivitäten
-
BEISPIEL 58
-
Verwendung erweiterter
cDNAs oder 5'-ESTs
um stromaufwärts
liegende Sequenzen aus genomischer DNA zu klonieren
-
Aus
erweiterten cDNAs oder 5'-ESTs
abgeleitete Sequenzen können
verwendet werden, um die entsprechenden Gene unter Verwendung von
Chromosomen-Wander-Techniken (chromosome walking) zu isolieren.
In einer Chromosomen-Wander-Technik, die den von Clontech verfügbaren GenomeWalkerTM-Kit verwendet, werden fünf Gesamtgenom-DNA-Proben
mit einem jeweils einem unterschiedlichen Restriktionsenzym verdaut,
das eine 6 Basen-Erkennungsstelle aufweist und ein glattes Ende
zurücklässt. Im
Anschluss an den Verdau werden Oligonukleotidadapter an jedes Ende
der sich ergebenden genomischen DNA-Fragmente ligiert.
-
Für jede der
fünf genomischen
DNA-Bibliotheken wird eine erste PCR-Reaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers
durchgeführt,
wobei ein äußerer Adapterprimer,
der im Kit bereitgestellt wird, und ein äußerer genspezifischer Primer
verwendet wird. Der genspezifische Primer sollte so gewählt werden,
um spezifisch für
die erweiterte cDNA oder das 5'-EST
von Interesse zu sein und sollte eine Schmelztemperatur, eine Länge und
eine Lage in der erweiterten cDNA oder dem 5'-EST aufweisen, die mit seiner Verwendung
in PCR-Reaktionen vereinbar sind. Jede erste PCR-Reaktion enthält 5 ng
genomische DNA, 5 μl
10 × Tth-Reaktionspuffer,
0,2 mM eines jeden dNTP, jeweils 0,2μM äußeren Adapterprimer und äußeren genspezifischen
Primer, 1,1 mM Mg(OAc)2 und 1 μl des Tth-Polymerase
50 × Mix
in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
Der Reaktionszyklus für
die erste PCR-Reaktion ist der folgende: 1 min – 94°C/2 sec –94°C, 3 min – 72°C (7 Zyklen)/2 sec – 94°C, 3 min – 67°C (32 Zyklen)/5
min – 67°C.
-
Das
Produkt der ersten PCR-Reaktion wird verdünnt und als Matrize für eine zweite
PCR-Reaktion gemäß den Anweisungen
des Herstellers verwendet, wobei ein Paar von Nested-Primern verwendet
wird, die innerhalb des Amplicons lokalisiert sind, das sich aus
der ersten PCR-Reaktion ergibt. Beispielsweise können 5 μl des Reaktionsprodukts aus
dem ersten PCR-Reaktionsgemisch 180 fach verdünnt werden. Die Reaktion werden
in einem 50 μl
Volumen mit einer Zusammensetzung durchgeführt, die der der ersten PCR-Reaktion entspricht,
außer
das Nested-Primer verwendet werden. Der erste Nested-Primer ist
spezifisch für
den Adapter und wird mit dem GenomeWalkerTM-Kit
bereitgestellt. Der zweite Nested-Primer ist spezifisch für die bestimmte erweiterte
cDNA oder das 5'-EST,
für das
der Promotor kloniert werden soll und sollte eine Schmelztemperatur, Länge und
Lage in der erweiterten cDNA oder dem 5'-EST aufweisen, die mit seiner Verwendung
in PCR-Reaktionen vereinbar ist. Die Reaktionsparameter der zweiten
PCR-Reaktion sind die folgenden: 1 min – 94°C/2 sec –94°C, 3 min – 72°C (6 Zyklen)/2 sec – 94°C, 3 min – 67°C (25 Zyklen)/5
min – 67°C. Das Produkt
der zweiten PCR-Reaktion wird unter Verwendung von Standardtechniken
gereinigt, kloniert und sequenziert.
-
Alternativ
können
zwei oder mehrere humane genomische DNA-Bibliotheken unter Verwendung von zwei
oder mehr Restriktionsenzymen konstruiert werden. Die verdaute genomische
DNA wird in Vektoren kloniert, die in einzelsträngige, zirkuläre oder
lineare DNA umgewandelt werden können.
Ein biotinyliertes Oligonukleotid, das wenigstens 15 Nukleotide
der erweiterten cDNA oder der 5'-EST-Sequenz
umfasst, wird an die einzelsträngige
DNA hybridisiert. Die Hybride zwischen dem biotinylierten Oligonukleotid
und der einzelsträngigen
DNA, die die erweiterte cDNA oder 5'-EST-Sequenz enthält, werden, wie in Beispiel
29 weiter oben beschrieben, isoliert. Danach wird die einzelsträngige DNA,
die die erweiterte cDNA oder 5'-EST-Sequenz
enthält,
von den Beads abgelöst
und unter Verwendung eines Primers, der für die erweiterte cDNA oder 5'-EST-Sequenz spezifisch
ist, oder eines Primers, der einer Sequenz entspricht, die vom Klonierungsvektor umfasst
ist, in doppelsträngige
DNA umgewandelt. Die sich ergebende doppelsträngige DNA wird in Bakterien transformiert.
DNAs, die die 5'-EST-
oder erweiterte cDNA-Sequenzen enthalten, werden durch Kolonie-PCR oder Kolonie-Hybridisierung
identifiziert.
-
Nachdem
die stromaufwärts
liegenden genomischen Sequenzen einmal wie weiter oben beschrieben kloniert
und sequenziert worden sind, können
voraussichtliche Promotoren und Transkriptionsstartstellen innerhalb
der stromaufwärts
liegenden Sequenzen durch Vergleich der Sequenzen, die stromaufwärts der
erweiterten cDNAs oder 5'-ESTs
liegen, mit Datenbanken, die bekannte Transkriptionsstartstellen,
Transkriptionsfaktorbindungsstellen oder Promotorsequenzen enthalten,
identifiziert werden.
-
Zusätzlich können Promotoren
in stromaufwärts
liegende Sequenzen unter Verwendung von Promotorreportervektoren
identifiziert werden, wie es in Beispiel 59 beschrieben wird.
-
BEISPIEL 59
-
Identifizierung
von Promotoren in klonierten stromaufwärts liegenden Sequenzen
-
Die
stromaufwärts
liegenden genomischen Sequenzen der erweiterten cDNAs oder 5'-ESTs werden in einen
geeigneten Promotorreportervektor kloniert, wie beispielsweise die
pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, pβgal-Basic,
pβgal-Enhancer oder pEGFP-1-Promotorreportervektoren,
die von Clontech erhältlich
sind. In Kürze,
jeder dieser Promotorreportervektoren umfasst multiple Klonierungsstellen,
die stromaufwärts
eines Reportergens liegen, das ein Protein kodiert, für das in
einfacher Weise eine Probenbestimmung durchgeführt werden kann, wie beispielsweise
sekretierte alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder grün fluoreszierendes
Protein. Die Sequenzen, die stromaufwärts der erweiterten cDNAs oder
5'-ESTs liegen,
werden in die Klonierungsstellen stromaufwärts des Reportergens in beiden
Orientierungen kloniert und in eine geeignete Wirtszelle eingeführt. Hinsichtlich
der Menge an Reporterprotein wird eine Untersuchung durchgeführt und
mit der Menge verglichen, die von einem Vektor erhalten wird, der
kein Insert in der Klonierungsstelle trägt. Das Vorliegen einer erhöhten Expressionsmenge
in einem Vektor, der das Insert enthält im Hinblick auf den Kontrollvektor,
zeigt das Vorliegen eines Promotors im Insert. Wenn nötig, können die
stromaufwärts
liegenden Sequenzen in Vektoren kloniert werden, die einen Enhancer
für eine
Erhöhung
der Transkriptionsmengen von schwachen Promotorsequenzen enthält. Eine
signifikant höhere
Menge an Expression als die, die für den Vektor beobachtet wird,
der kein Insert trägt,
zeigt, dass eine Promotorsequenz in der insertierten stromaufwärts liegenden
Sequenz vorliegt.
-
Geeignete
Wirtszellen für
die Promotorreportervektoren können
auf Grundlage der Ergebnisse zur oben beschriebenen Bestimmung der
Expressionsmuster der erweiterten cDNAs und 5'-ESTs ausgewählt werden. Wenn die Expressionsmusteranalyse
beispielsweise zeigt, dass die mRNA, die einer bestimmten erweiterten
cDNA oder einem 5'-EST
entspricht, in Fibroblasten exprimiert wird, kann der Promotorreportervektor
in eine humane Fibroblastenzelllinie eingeführt werden.
-
Promotorsequenzen
innerhalb der stromaufwärts
liegenden genomischen DNA können
ferner durch Konstruktion von verschachtelten Deletionen (nested
deletions) in der stromaufwärts
liegenden DNA bestimmt werden, wobei herkömmliche Techniken, wie beispielsweise
Exonuklease III-Verdau, verwendet werden. Die sich ergebenden deletierten
Fragmente können
in den Promotorreportervektor insertiert werden, um zu bestimmen,
ob die Deletion eine verringerte oder ausgeschaltete Promotoraktivität aufweist.
Auf diese Weise können
die Grenzen der Promotoren bestimmt werden. Wenn gewünscht, können die
möglichen
einzelnen regulatorischen Stellen innerhalb des Promotors unter
Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese (side directed mutagenesis)
oder Linkerscanning identifiziert werden, um die möglichen
Transkriptionsfaktorbindungsstellen innerhalb des Promotors einzeln
oder in Kombination zu auszuschalten. Die Wirkungen dieser Mutationen
auf das Transkriptionsniveau können
unter Einführung
der Mutationen in die Klonierungsstellen in die Promotorreportervektoren
bestimmt werden.
-
BEISPIEL 60
-
Klonierung
und Identifizierung von Promotoren
-
Unter
Verwendung des Verfahrens, das in Beispiel 58 weiter oben mit 5'-ESTs beschrieben wird, wurden stromaufwärts liegende
Sequenzen von mehreren Genen erhalten. Unter Verwendung des Primerpaares GGG
AAG ATG GAG ATA GTA TTG CCT G (SEQ ID NO: 29) und CTG CCA TGT ACA
TGA TAG AGA GAT TC (SEQ ID NO: 30) wurde der Promotor mit der internen
Bezeichnung P13H2 (SEQ ID NO: 31) erhalten.
-
Unter
Verwendung des Primerpaares GTA CCA GGGG ACT GTG ACC ATT GC (SEQ
ID NO: 32) und CTG TGA CCA TTG CTC CCA AGA GAG (SEQ ID NO: 33) wurde
der Promotor mit der internen Bezeichnung t15B4 (SEQ ID NO: 34)
erhalten.
-
Unter
Verwendung des Primerpaares CTG GGA TGG AAG GCA CGG TA (SEQ ID NO:
35) und GAG ACC ACA CAG CTA GAC AA (SEQ ID NO: 36) wurde der Promotor
mit der internen Bezeichnung P29B6 (SEQ ID NO: 37) erhalten.
-
4 stellt
eine schematische Beschreibung der isolierten Promotoren bereit
und die Art und Weise, wie sie mit den entsprechenden 5'-Tags zusammengesetzt
sind. Die stromaufwärts
liegenden Sequenzen wurden hinsichtlich des Vorliegens von Motiven,
die Transkriptionsfaktorbindungsstellen oder bekannten Transkriptionsstartstellen ähneln, durchmustert,
wobei das Computerprogramm Matlnspector Version 2.0, August 1996
verwendet wurde.
-
Tabelle
VII beschreibt die Transkriptionsfaktorbindungsstellen, die in jedem
dieser Promotoren vorliegen. Die mit Matrix bezeichneten Spalten
zeigen den Namen der verwendeten Matlnspector-Matrix an. Die mit Position
bezeichneten Spalten zeigen die 5'-Position der Promotorstelle. Die Nummerierung
der Sequenzen beginnt mit der Transkriptionsstelle, wie sie durch
Abgleich der Genomsequenz mit der 5'-EST-Sequenz bestimmt wird. Die Spalte,
die mit „Orientierung" bezeichnet ist,
zeigt den DNA-Strang, auf dem die Stelle nachgewiesen wird, wobei
der +-Strang der kodierende Strang ist, wobei er durch Abgleich
der Genomsequenz mit der Sequenz des 5'-ESTs bestimmt wird. Die Spalte, die
mit „Score" bezeichnet ist,
zeigt den Matlnspector Score, der für diese Stelle nachgewiesen
wurde. Die Spalte, die mit „Länge" bezeichnet ist,
zeigt die Länge
der Stelle in Nukleotiden. Die Spalte, die mit „Sequenz" bezeichnet ist, zeigt die Sequenz der
gefundenen Stelle.
-
Bakterienklone,
die Plasmide enthalten, die die oben beschriebenen Promotorsequenzen
enthalten, werden gegenwärtig
in den Laboratorien des Erfinders unter den oben bereitgestellten
internen Identifizierungsnummern gelagert. Die Inserts können aus
den hinterlegten Materialien durch Anzucht eines Aliquotes eines
geeigneten Bakterienklons in geeignetem Medium gewonnen werden.
Die Plasmid-DNA kann anschließend
unter dem Fachmann bekannten Plasmidisolierungsverfahren, wie beispielsweise
Verfahren zur alkalischen Lyse im Miniprep-Maßstab oder Plasmidisolierung
auf Basis alkalischer Lyse im Großmaßstab, isoliert werden. Wenn
gewünscht,
kann die Plasmid-DNA durch Zentrifugation auf einem Cäsiumchloridgradienten, Größenausschlusschromatografie
oder Anionenaustauschchromatografie weiter angereichert werden.
-
Die
unter Verwendung dieser Verfahren erhaltene Plasmid-DNA kann anschließend unter
Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardklonierungstechniken
manipuliert werden. Alternativ kann eine PCR mit Primern, die an
beiden Enden der EST-Insertion konzipiert worden sind, durchgeführt werden.
Das dem 5'-EST entsprechende
PCR-Produkt kann anschließend
unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Standardklonierungstechniken
manipuliert werden.
-
Die
Promotoren und andere regulatorische Sequenzen, die stromaufwärts der
erweiterten cDNAs oder 5'-ESTs
lokalisiert sind, können
verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konzipieren, die in
der Lage sind, die Expression eines insertierten Gens in einer gewünschten
räumlichen,
zeitlichen, entwicklungsspezifischen oder quantitativen Weise zu
lenken. Ein Promotor, der in der Lage ist, die gewünschten
räumlichen, zeitlichen,
entwicklungsspezifischen und quantitativen Muster zu lenken, kann
unter Verwendung der Ergebnisse zur Expressionsanalyse, die in Beispiel
26 weiter oben beschrieben wird, selektiert werden. Beispielsweise
kann, wenn ein Promotor erwünscht
ist, der ein hohes Maß an
Expression im Muskel verleiht, die Promotorsequenz, die stromaufwärts einer
erweiterten cDNA oder eines 5'-EST
liegt, die von einer mRNA abgeleitet sind, die im Muskel in hohem
Maße exprimiert
wird, im Expressionsvektor verwendet werden, wie es durch das Verfahren
gemäß Beispiel
26 bestimmt ist.
-
Vorzugsweise
wird der gewünschte
Promotor nahe einer multiplen Restriktionsschnittstelle platziert, um
die Klonierung des gewünschten
Inserts stromabwärts
des Promotors zu ermöglichen,
so dass der Promotor in der Lage ist, die Expression des insertierten
Gens zu lenken. Der Promotor kann in herkömmliche Nukleinsäurerückgrate
insertiert werden, die für
eine extrachromosomale Replikation, Integration in die Wirtschromosomen
oder transiente Expression konzipiert sind. Geeignete Rückgrate
für die
vorliegenden Expressionsvektoren umfassen retrovirale Rückgrate,
Rückgrate
von eukaryotischen Episomen, wie beispielsweise SV40 oder Bovine
Papilloma Virus, Rückgrate
von bakteriellen Episomen oder künstliche
Chromosomen.
-
Vorzugsweise
umfassen die Expressionsvektoren ein PolyA-Signal stromabwärts der
multiplen Restriktionsstelle, dass zur Polyadenylierung von mRNA
dient, die von dem Gen transkribiert wird, das in den Expressionsvektor
insertiert ist.
-
Im
Anschluss an die Identifizierung von Promotorsequenzen, wobei Verfahren
gemäß den Beispielen 58-60
verwendet werden, können
Proteine, die mit dem Promotor wechselwirken, identifiziert werden
wie es in Beispiel 61 weiter unten beschrieben wird.
-
BEISPIEL 61
-
Identifizierung von Proteinen,
die mit Promotorsequenzen stromaufwärts liegender regulatorischer
Sequenzen oder mit mRNA wechselwirken
-
Sequenzen
innerhalb der Promotorregion, die wahrscheinlich Transkriptionsfaktoren
binden, können durch
Homologie mit bekannten Transkriptionsfaktorbindungsstellen oder
durch herkömmliche
Mutagenese- oder Deletionsanalysen von Reporterplasmiden identifiziert
werden, die die Promotorsequenz enthalten. Beispielsweise können Deletionen
in einem Reporterplasmid erzeugt werden, das die Promotorsequenz
von Interesse enthält,
die operativ mit einem Reportergen verknüpft ist, hinsichtlich dessen
ein Assay durchgeführt werden
kann. Die Reporterplasmide, die verschiedene Deletionen innerhalb
der Promotorregion tragen, werden in eine geeignete Wirtszelle transfiziert
und die Wirkung der Deletionen auf die Expressionsniveaus wird beurteilt.
Transkriptionsfaktorbindungsstellen mit den Regionen, in welchen
Deletionen, die die Expressionsniveaus absenken, können ferner
unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese, Linkerscanning-Analyse oder
anderen, dem Fachmann bekannten Techniken, lokalisiert werden.
-
Nukleinsäuren, die
Proteine kodieren, die mit Sequenzen im Promotor wechselwirken,
können
unter Verwendung von Ein-Hybridsystemen identifiziert werden, wie
beispielsweise den Ein-Hybridsystemen, die im Handbuch beschrieben
sind, das dem Matchmaker One-Hybrid System Kit beiliegt, wobei der
Kit von Clontech erhältlich
ist (Katalog Nr. K1603-1 ). In Kürze,
das Matchmaker One-Hybrid System wird wie folgt verwendet. Die Zielsequenz,
für die
es erwünscht
ist, daran bindende Proteine zu identifizieren, wird stromaufwärts von einem
selektierbaren Reportergen kloniert und in das Hefegenom integriert.
Vorzugsweise werden mehrere Kopien der Zielsequenzen als Tandem
in das Reporterplasmid insertiert. Eine Bibliothek, die aus Fusionsprodukten
von cDNAs, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit an den Promotor zu
binden, beurteilt werden sollen, und der Aktivierungsdomäne eines
Hefetranskriptionsfaktors, wie beispielsweise GAL4, besteht, wird
in den Hefestamm transformiert, der die integrierte Reportersequenz
enthält.
Die Hefe wird auf selektiven Medien ausplattiert, um Zellen zu selektieren,
die selektierbaren Marker, der mit der Promotorsequenz verknüpft ist,
zu exprimieren. Die Kolonien, die auf den selektiven Medien wachsen,
enthalten Gene, die Proteine kodieren, die an die Zielsequenz binden.
Die Inserts in den Genen, die die Fusionsproteine kodieren, werden
ferner durch Sequenzierung charakterisiert. Zusätzlich können die Inserts in Expressionsvektoren
oder in in vitro-Transkriptionsvektoren insertiert werden. Das Binden
der durch Inserts kodierten Polypeptide an die Promotor-DNA kann
durch Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, bestätigt werden,
wie beispielsweise Gelshift-Analysen oder DNAse-Protection-Analyse.
-
VII. Verwendung von 5'-ESTs (oder cDNAs
oder genomischer DNAs, die davon erhältlich sind) in der Gentherapie
-
Die
vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von 5'-ESTs (oder cDNA
oder genomischer DNA, die daraus erhältlich ist) in Strategien zur
Gentherapie, einschließlich
Antisense- und Triple Helix-Strategien, wie sie in den Beispielen
62 und 63 weiter unten beschrieben wird. In Antisense-Ansätzen werden
zu einer mRNA komplementäre
Nukleinsäuresequenzen
intrazellulär
an die mRNA hybridisiert, wodurch sie die Expression des durch die
mRNA kodierten Proteins blockieren. Die Antisense Sequenzen können Genexpression über eine
Vielfalt an Mechanismen verhindern. Beispielsweise können die
Antisense Sequenzen die Fähigkeit
der Ribosomen hemmen, die mRNA zu translatieren.
-
Alternativ
können
die Antisense Sequenzen den Transport der mRNA aus dem Kern ins
Zytoplasma blockieren, wodurch die zur Translation zur Verfügung stehende
mRNA-Menge beschränkt
wird. Ein anderer Mechanismus, über
den Antisense Sequenzen Genexpression hemmen können, ist eine Wechselwirkung
mit mRNA-Spleißen.
In noch einer anderen Strategie kann die Antisense Nukleinsäure Teil
eines Ribozyms sein, das in der Lage ist, die Ziel-mRNA spezifisch
zu spalten.
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BEISPIEL 62
-
Herstellung
und Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden
-
Die
Antisense Nukleinsäuremoleküle, die
in der Gentherapie verwendet werden sollen, können entweder DNA- oder RNA-Sequenzen
sein. Sie können
eine Sequenz umfassen, die komplementär zu der Sequenz des 5'-ESTs (oder der cDNA
oder der genomischen DNA, die davon erhältlich ist) ist. Die Antisense
Nukleinsäuren
können
eine Länge
und eine Schmelztemperatur aufweisen die ausreicht, die Bildung
einer intrazellulären
Duplex mit ausreichender Stabilität zu ermöglichen, um so die Expression
der mRNA in der Duplex zu hemmen. Strategien zur Konzipierung von
Antisense Nukleinsäuren,
die zur Verwendung in der Gentherapie geeignet sind, sind in Green
et al., Anm. Rev. Biochem. 55:569-597, 1986, und Izant und Weintraub,
Cell 36:1007-1015, 1984, offenbart.
-
In
einigen Strategien werden Antisense Moleküle von einer Protein kodierenden
Nukleotidsequenz durch Umkehrung der Orientierung der kodierenden
Region im Hinblick auf einen Promotor erhalten, um so den Gegenstrang
von dem Strang zu transkribieren, der normalerweise in der Zelle
transkribiert wird. Die Antisense Moleküle können unter Verwendung von in
vitro-Transkriptionssystemen
transkribiert werden, wie beispielsweise denjenigen Systemen, die
T7- oder SP6-Polymerase verwenden, um das Transkript zu erzeugen. Ein
anderer Ansatz greift auf die Transkription der Antisense Nukleinsäuren in
vivo zurück,
wobei eine Antisense Sequenz enthaltende DNA in einem Expressionsvektor
operativ mit einem Promotor verknüpft wird.
-
Alternativ
können
Oligonukleotide, die zu dem Strang komplementär sind, der in der Zelle normalerweise
transkribiert wird, in vitro synthetisiert werden. Daher sind die
Antisense Nukleinsäuren
komplementär zu
der entsprechenden mRNA und in der Lage, an die mRNA zu hybridisieren,
um so eine Duplex zu erzeugen. In einigen Ausführungsformen können die
Antisense Sequenzen modifizierte Zuckerphosphatrückgrate enthalten, um die Stabilität zu erhöhen und
um sie weniger sensitiv für
einen RNAse-Angriff zu machen. Beispiele für Modifikationen, die zur Verwendung
in Antisense Strategien geeignet sind, werden von Rossi et al.,
Pharmacol. Ther. 50(2):245-254, 1991, beschrieben.
-
Verschiedene
Typen von Antisense Oligonukleotiden, die zu der Sequenz des 5'-ESTs (oder der cDNA oder
der genomischen DNA, die davon erhältlich ist) komplementär sind,
können
verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden stabile und
semi-stabile Antisense Oligonukleotide verwendet, wie sie in der
internationalen Patentanmeldung Nr. PCT WO 94/23026 beschrieben
sind. In diesen Molekülen
sind das 3'-Ende
oder beide 3'- und
5'-Enden mit intramolekularen
Wasserstoffbrücken
zwischen komplementären
Basenpaaren belegt. Im Vergleich zu herkömmlichen Antisense Oligonukleotiden
sind diese Moleküle
besser in der Lage, Exonuklease-Angriffen zu widerstehen und weisen
eine erhöhte
Stabilität
auf.
-
In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
werden die Antisense Oligodeoxynukleotide gegen Herpes simplex Virus-Typen
1 und 2 verwendet, wie sie in der internationalen Patentanmeldung
Nr. WO 95/0414 1 beschrieben sind.
-
In
noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die kovalent
querverknüpften
Antisense Oligonukleotide verwendet, die in der internationalen
Patentanmeldung Nr. WO 96/31523 beschrieben sind. Diese doppel-
oder einzelsträngigen
Oligonukleotide umfassen eine bzw. mehrere kovalente inter- oder intraoligonukleotid
Querverknüpfungen,
wobei die Querverknüpfung
aus einer Amidbindung zwischen einer primären Amingruppe des einen Strangs
und einer Carboxylgruppe des anderen Strangs oder des gleichen Strangs besteht,
wobei die primäre
Amingruppe in der 2'-Position
des Strangnukleotid-Monosaccharidrings
direkt substituiert ist und die Carboxylgruppe durch eine aliphatische
Spacergruppe getragen wird, substituiert an einem Nukleotid oder
Nukleotidanalogon des anderen oder des gleichen Strangs.
-
Die
Antisense Oligodeoxynukleotide und Oligonukleotide, die in der internationalen
Anmeldung Nr. WO 92/18522 offenbart sind, können auch verwendet werden.
Diese Moleküle
sind gegenüber
einem Abbau stabil und enthalten wenigstens eine Transkriptionskontrollerkennungssequenz,
die an Kontrollproteine bindet und dafür als Köder wirksam ist. Diese Moleküle können "Haarnadel-Strukturen", "Hantel-Strukturen" ("dumbbell" structures), "modifizierte Hantel-Strukturen", "quervernetzte Köderstrukturen" ("cross-linked" decoy structures)
und "Schleifen"-Strukturen enthalten.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
werden die zyklischen doppelsträngigen
Oligonukleotide, die in der europäischen Patentanmeldung Nr.
0 572 287 A2 beschrieben sind, verwendet. Diese ligierten Oligonukleotid-"Hanteln" enthalten die Bindungsstelle für einen
Transkriptionsfaktor und hemmen die Expression des unter Kontrolle
des Transkriptionsfaktors stehenden Gens durch Beschlagnahme des
Faktors.
-
Die
Verwendung der geschlossenen Antisense-Oligonukleotide, die in der
internationalen Anmeldung Nr. WO 92/19732 offenbart sind, ist ebenfalls
umfasst. Da diese Moleküle
keine freien Enden aufweisen, sind sie gegenüber Abbau durch Exonukleasen
resistenter als herkömmliche
Oligonukleotide. Diese Oligonukleotide können multifunktional sein und
können
mit mehreren Regionen, die zur Ziel-mRNA nicht benachbart sind, wechselwirken.
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Die
geeignete Menge an Antisense Nukleinsäuren, die benötigt wird,
um Genexpression zu hemmen, kann unter Verwendung von in vitro-Expressionsanalyse
bestimmt werden. Das Antisense Molekül kann durch Diffusion, Injektion,
Infusion, Transfektion oder h-Region vermitteltem Import unter Verwendung
von im Fachbereich bekannten Verfahren in die Zellen eingeführt werden.
Beispielsweise kann die Antisense Nukleinsäure als bloßes oder nacktes Oligonukleotid,
als in Lipid verkapseltes Oligonukleotid, als Oligonukleotidsequenz, die
durch ein virales Protein verkappselt ist, oder als eine Oligonukleotidsequenz,
die mit einem in einem Expressionsvektor enthaltenem Promotor operativ
verknüpft
ist, in den Körper
eingeführt
werden. Der Expressionsvektor kann ein beliebiger aus der Vielfalt
von im Fachbereich bekannten Expressionsvektoren sein, einschließlich retroviraler
oder viraler Vektoren, Vektoren die zur extrachromosomalen Replikation
fähig sind
oder integrierenden Vektoren. Die Vektoren können DNA oder RNA sein.
-
Die
Antisense Moleküle
werden in Zellproben mit einer Reihe von verschiedenen Konzentrationen, vorzugsweise
zwischen 1 × 10–10 M
bis 1 × 10–4 M
eingeführt.
Nachdem die Minimumkonzentration, die die Genexpression adäquat kontrollieren
kann, identifiziert worden ist, wird die optimierte Dosis in eine
Dosierung umgerechnet, die zur Verwendung in vivo geeignet ist.
Beispielsweise wird eine Hemmkonzentration in Kultur von 1 × 10–7' zu einer Dosis von
etwa 0,6 mg/kg Körpergewicht
umgerechnet. Oligonukleotidmengen, die 100 mg/kg Körpergewicht
oder höher
erreichen, können
möglich
sein, nachdem die Toxizität
der Oligonukleotide an Labortieren getestet wurde. Es ist zusätzlich umfasst,
dass Zellen aus Wirbeltieren entnommen werden, mit Antisense Oligonukleotiden
behandelt werden und wieder in das Wirbeltier eingeführt werden.
-
Es
ist ferner umfasst, dass die Antisense Oligonukleotidsequenz in
eine Ribozymsequenz eingebracht wird, um es dem Antisense Element
zu ermöglichen,
spezifisch zu binden und seine Ziel-mRNA zu spalten. Für technische
Anwendungen im Hinblick auf Ribozyme und Antisense Oligonukleotide
siehe Rossi et al., supra.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Erfindung wird das durch das Gen kodierte Polypeptid zuerst
identifiziert, so dass die Wirkung der Antisense Hemmung auf die
Translation unter Verwendung von Techniken überwacht werden kann, die umfassen
aber nicht beschränkt
sind auf Antikörper
vermittelte Tests, wie beispielsweise RIAs und ELISA, funktionale
Assays oder Radiomarkierung.
-
Die
hierin beschriebenen 5'-ESTs
(oder cDNAs oder genomische DNAs, die davon erhältlich sind) können auch
in Gentherapieansätzen
verwendet werden, die auf Bildung einer intrazellulären Triplehelix
beruhen. Triplehelix-Oligonukleotide werden verwendet, um die Transkription
von einem Genom zu hemmen. Sie sind insbesondere für Untersuchungen
hinsichtlich Veränderungen
der Zellaktivität
nützlich,
da sie mit einem bestimmten Gen in Zusammenhang stehen. Die 5'-EST-Sequenzen (oder cDNAs
oder genomische DNAs, die davon erhältlich sind) oder stärker bevorzugt
ein Abschnitt dieser Sequenzen kann verwendet werden, um die Genexpression
in Individuen mit Krankheiten, die mit der Expression eines bestimmten
Gens in Zusammenhang stehen, zu hemmen. In ähnlicher Weise kann ein Abschnitt
der 5'-EST-Sequenzen
(oder der cDNAs oder der genomischen DNAs, die davon erhältlich sind)
verwendet werden, um die Wirkung der Hemmung der Transkription eines
bestimmten Gens innerhalb der Zelle zu untersuchen. Herkömmlich wurden
Homopurinsequenzen im Rahmen von Triplehelix-Strategien für am nützlichsten
gehalten. Jedoch können
Homopyrimidinsequenzen ebenfalls die Genexpression hemmen. Derartige
Homopyrimidinoligonukleotide binden an die große Furche bei Homopurin/Homopyrimidinsequenzen.
Deshalb sind beide Arten von Sequenzen des 5'-ESTs oder des Gens, das mit dem 5'-EST korrespondiert,
umfasst.
-
BEISPIEL 63
-
Herstellung
und Verwendung von Triplehelix-Sonden
-
Die
Sequenzen der 5'-ESTs
(oder der cDNAs oder der genomischen DNAs, die davon erhältlich sind) werden
durchsucht, um 10-mer oder 20-mer Homopyrimidin- oder Homopurinabschnitte
zu identifizieren, die in Strategien auf Grundlage von Triplehelices
zur Hemmung von Genexpression verwendet werden könnten. Im Anschluss an die
Identifizierung von Homopyrimidin- oder Homopurinabschnitten mit
Kandidatenstatus wird ihre Wirksamkeit bei der Hemmung von Genexpression
durch Einführen
verschiedener Mengen an Oligonukleotiden, die die Kandidatensequenzen
enthalten, in Gewebekulturzellen, die normalerweise das Zielgen
exprimieren, beurteilt. Die Oligonukleotide können mit einem Oligonukleotid-Synthesizer
hergestellt werden oder können
kommerziell von einer Firma bezogen werden, die sich auf die Oligonukleotidsynthese
für Kunden
spezialisiert hat, wie beispielsweise GENSET, Paris, Frankreich.
-
Die
Oligonukleotide können
in die Zellen unter Verwendung einer Vielfalt von dem Fachmann bekannten
Verfahren eingeführt
werden, einschließlich
aber nicht beschränkt
auf Calciumphosphatpräzipitierung, DEAE-Dextran,
Elektroporation, liposomvermittelte Transfektion oder native Aufnahme.
-
Behandelte
Zellen werden auf eine veränderte
Zellfunktionen oder verringerte Genexpression hin überwacht,
wobei Techniken, wie beispielsweise Northern Blotting, RNAse Protection
Assays oder Strategien auf Grundlage von PCR verwendet werden, um
so die Transkriptionsmengen des Zielgens in den Zellen zu überwachen,
die mit dem Oligonukleotid behandelt wurden. Die zu überwachenden
Zellfunktionen werden auf Grundlage der Homologien des Zielgens,
das mit der erweiterten cDNA korrespondiert, von der das Oligonukleotid
abgeleitet wurde, mit bekannten Gensequenzen, die mit einer bestimmten
Funktion im Zusammenhang stehen, vorhergesagt. Die Zellfunktionen
können
auch auf Grundlage des Vorliegens abnormaler Physiologien innerhalb
der Zellen, die aus Individuen mit einer Erbkrankheit abgeleitet
wurden, vorhergesagt werden, insbesondere wenn die erweiterte cDNA
mit der Krankheit verbunden ist, wobei die in Beispiel 56 beschriebenen Techniken
verwendet werden.
-
Die
Oligonukleotide, die bei der Hemmung der Genexpression in den Gewebekulturzellen
wirksam sind, können
anschließend
unter Verwendung von Techniken, die weiter oben und in Beispiel
62 beschrieben sind, mit einer Dosierung, die auf Grundlage der
in vitro-Ergebnisse berechnet wurde, wie es in Beispiel 62 beschrieben
wird, eingeführt
werden.
-
In
einigen Ausführungsformen
können
die natürlichen
(beta) Anomere der Oligonukleotideinheiten durch alpha Anomere ersetzt
werden, um so die Oligonukleotide gegenüber Nukleasen resistenter zu
machen. Ferner kann ein interkalierendes Mittel, wie beispielsweise
Ethidiumbromid oder dergleichen, an das 3'-Ende des alpha Oligonukleotids angebracht
werden, um die Triplehelix zu stabilisieren. Für Informationen zur Herstellung
von Oligonukleotiden, die zur Triplehelixbildung geeignet sind,
siehe Griffin et al., Science 245:967-971, 1989.
-
BEISPIEL 64
-
Verwendung unter Verwendung
der 5'-ESTs erhaltenen
cDNAs zur Expression eines kodierten Protein in einem Wirtsorganismus
-
Die
cDNAs, die wie oben beschrieben unter Verwendung der hierin beschriebenen
5'-ESTs erhalten wurden,
können
auch verwendet werden, um ein kodiertes Protein in einem Wirtsorganismus
zu exprimieren, um eine vorteilhafte Wirkung zu erzielen. In solchen
Verfahren kann das kodierte Protein transient im Wirtsorganismus
exprimiert werden oder das kodierte Protein kann stabil im Wirtsorganismus
exprimiert werden. Das kodierte Protein kann eine beliebige der
oben beschriebenen Aktivitäten
aufweisen. Das kodierte Protein kann ein Protein sein, das im Wirtsorganismus
nicht vorhanden ist oder das kodierte Protein kann alternativ die
im Wirtsorganismus vorkommenden Proteinmengen erhöhen.
-
Eine
erweiterte cDNA mit voller Länge,
die das Signalpeptid und das reife Protein kodiert, oder eine erweiterte
cDNA, die nur das reife Protein kodiert, wird in den Wirtsorganismus
eingeführt.
Die erweiterte cDNA kann in den Wirtsorganismus unter Verwendung
einer Vielfalt von dem Fachmann bekannten Techniken eingeführt werden.
Beispielsweise kann die erweiterte cDNA als nackte DNA in den Wirtsorganismus
injiziert werden, so dass das kodierte Protein im Wirtsorganismus
exprimiert wird, wodurch eine vorteilhafte Wirkung erzielt wird.
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Alternativ
kann die erweiterte cDNA in einen Expressionsvektor stromabwärts eines
Promotors kloniert werden, der im Wirtsorganismus aktiv ist. Der
Expressionsvektor kann ein beliebiger der Expressionsvektoren sein,
die zur Verwendung in der Gentherapie konzipiert sind, einschließlich viraler
oder retroviraler Vektoren. Der Expressionsvektor kann direkt in
den Wirtsorganismus eingeführt
werden, so dass das kodierte Protein im Wirtsorganismus exprimiert
wird, um eine vorteilhafte Wirkung zu erzeugen. In einem anderen
Ansatz kann der Expressionsvektor in vitro in Zellen eingefügt werden.
Die Zellen, die den Expressionsvektor enthalten, werden danach selektiert
und in den Wirtsorganismus eingeführt, wo sie das kodierte Protein
exprimieren, um eine vorteilhafte Wirkung zu erzeugen.
-
BEISPIEL 65
-
Verwendung von Signalpeptiden,
die durch 5'-ESTs
oder daraus erhaltenen Sequenzen kodiert werden, um Proteine in
Zellen zu importieren
-
Die
kurze hydrophobe Kernregion (h) von Signalpeptiden, die durch die
5'-ESTs oder erweiterte
cDNAs kodiert werden, die von den SEQ ID Nos: 38-270 abgeleitet
sind, können
auch als Träger
verwendet werden, um ein Peptid oder Protein von Interesse, eine
so genannte Fracht, in Gewebekulturzellen zu importieren (Lin et
al., J. Biol. Chem.,270:14225-14258, 1995; Du et al., J. Peptide
Res., 51:235-243, 1998; Rojas et al., Nature Biotech., 16:370-375,
1998).
-
Wenn
zellpermeable Peptide von beschränkter
Größe (etwa
bis zu 25 Aminosäuren) über eine
Zellmembran transloziert werden sollen, kann auf chemische Synthese
zurückgegriffen
werden, um die h-Region entweder an den C-Terminus oder an den N-Terminus
des Frachtpeptids von Interesse anzufügen. Alternativ können, wenn
längere
Peptide oder Proteine in Zellen importiert werden sollen, Nukleinsäuren genetisch
verändert
werden, wobei dem Fachmann bekannte Techniken verwendet werden,
um die erweiterte cDNA-Sequenz, die die h-Region kodiert, mit dem
5'- oder 3'-Ende der DNA-Sequenz,
die das Frachtpolypeptid kodiert, zu verknüpfen. Derartig genetisch veränderte Nukleinsäuren werden
anschließend
entweder in vitro oder in vivo nach der Transfektion in geeignete
Zellen translatiert, wobei herkömmliche
Techniken verwendet werden, um das sich ergebende zellpermeable
Polypeptid herzustellen. Geeignete Wirtszellen werden anschließend mit
dem zellpermeablen Polypeptid einfach inkubiert, das anschließend über die
Membran hinweg transloziert wird.
-
Dieses
Verfahren kann angewandt werden, um verschiedene intrazelluläre Funktionen
oder zelluläre Prozesse
zu untersuchen. Beispielsweise wurde es verwendet, um funktionell
relevante Domänen
intrazellulärer
Proteine zu sondieren und um Protein-Protein-Wechselwirkungen, die
an Signaltransduktionswegen beteiligt sind, zu untersuchen (Lin
et al., supra; Lin et al., J. Biol. Chem., 271:5305-5308, 1996; Rojas
et al., J. Biol. Chem., 271:27456-27461, 1996; Liu et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93:11819-11824, 1996; Rojas et al., Bioch.
Biophys. Res. Commun., 234:675-680, 1997).
-
Solche
Techniken können
in der Zelltherapie eingesetzt werden, um Proteine zu importieren,
wobei therapeutische Wirkungen erzielt werden. Beispielsweise können Zellen,
die aus einem Patienten isoliert wurden, mit importierten therapeutischen
Proteinen behandelt werden und anschließend wieder in den Wirtsorganismus
eingeführt
werden.
-
Alternativ
kann die h-Region von Signalpeptiden der vorliegenden Erfindung
in Kombination mit einem Kernlokalisierungssignal verwendet werden,
um Nukleinsäuren
in den Zellkern abzugeben. Derartige Oligonukleotide können Antisense
Oligonukleotide oder Oligonukleotide sein, die konzipiert wurden,
um Triplehelices zu bilden, wie es in den Beispielen 62 bzw. 63
beschrieben wird, um die Prozessierung und/oder Reifung einer zellulären Ziel-RNA
zu hemmen.
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Wie
oben beschrieben, können
die cDNAs oder Abschnitte davon, die unter Verwendung der hierin beschriebenen
5'-ESTs erhalten
wurden, für
verschiedene Zwecke verwendet werden. Die Polynukleotide können verwendet
werden, um rekombinantes Protein zur Analyse, Charakterisierung
oder therapeutischen Verwendung zu exprimieren; als Marker für Gewebe,
in denen das entsprechende Protein vorzugsweise exprimiert wird
(entweder konstitutiv oder in einer bestimmten Phase der Gewebedifferenzierung
oder -entwicklung oder bei Krankheitszuständen); als Molekulargewichtsmarker
auf Southern Gelen; als Chromosomenmarker oder Tags (wenn markiert),
um Chromosomen zu identifizieren oder um miteinander in Beziehung
stehende Genpositionen zu kartieren; um sie mit endogenen DNA-Sequenzen
in Patienten zu vergleichen, um so mögliche genetische Erkrankungen
zu identifizieren; als Sonden zur Hybridisierung und zur Entdeckung
neuer miteinander in Beziehung stehender DNA-Sequenzen; als Informationsquelle,
um PCR-Primer für
genetisches Fingerprinting abzuleiten; für eine Auswahl und Herstellung
von Oligomeren zur Befestigung auf einem „Genchip" oder einem anderem Träger, einschließlich der
Untersuchung von Expressionsmustern; zur Herstellung von Anti-Proteinantikörpern unter
Verwendung von DNA-Immunisierungstechniken und als Antigen zur Herstellung
von Anti-DNA-Antikörpern
oder um andere Immunantworten auszulösen. In Fällen in denen das Polynukleotid
ein Protein kodiert, das an ein anderes Protein bindet oder möglicherweise
bindet (beispielsweise in einer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung)
kann das Polynukleotid auch in Interaction Trap Assays verwendet werden
(wie beispielsweise dem der in Gyuris et al., Cell 75:791-803, 1993
beschrieben wird), um Polynukleotide zu identifizieren, mit denen
die Bindung stattfindet oder um Hemmstoffe der Bindewechselwirkung
zu identifizieren.
-
Die
Proteine oder Polypeptide, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt
werden, können
in ähnlicher
Weise in Assays verwendet werden, um die biologische Aktivität zu bestimmen,
einschließlich
einem Panel multipler Proteine für
Hochdurchsatz-Screening; um Antikörper zu erzeugen oder um eine
andere Immunantwort auszulösen;
als ein Reagenz (einschließlich
des markierten Reagenz) in Assays, die konzipiert sind, die Mengen
des Proteins (oder seines Rezeptors) in biologischen Fluiden quantitativ
zu bestimmen; als Marker für
Gewebe, in denen das entsprechende Protein vorzugsweise exprimiert
wird (entweder konstitutiv oder in einer bestimmten Phase der Gewebedifferenzierung
oder -entwicklung oder in einem Krankheitszustand); und selbstverständlich um
korrelierende Rezeptoren oder Liganden zu isolieren. In Fällen in
denen das Protein bindet oder möglicherweise
bindet (wie beispielsweise in einer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung), kann das Protein
verwendet werden, um andere Proteine zu identifizieren, mit denen
eine Bindung stattfindet, oder um Hemmstoffe der Bindungswechselwirkung
zu identifizieren. Proteine, die bei diesen Bindungswechselwirkungen
beteiligt sind, können
auch verwendet werden, um nach Peptidhemmstoffen oder kleinen Molekülhemmstoffen
oder Agonisten dieser Bindewechselwirkung durchzumustern.
-
Beliebige
oder alle dieser Forschungsmöglichkeiten
können
dahingehend entwickelt werden, dass sie als Reagenz geeignet sind,
oder zu einem Kitformat zur Kommerzialisierung als Forschungsprodukte
weiterentwickelt werden.
-
Die
weiter oben aufgeführten
Verfahren zur Durchführung
der Verwendungen sind dem Fachmann wohl bekannt. Referenzen, die
derartige Verfahren offenbaren, umfassen ohne Beschränkung Molecular
Cloning; A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold spring Harbor Laboratory
Press, Sambrook, Fritsch und Maniatis Hrsg., 1989, und Methods in
Enzymology; Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press,
Berger und Kimmel Hrsg., 1987.
-
Erfindungsgemäße Polynukleotide
und Proteine können
auch als Nahrungsmittelquellen oder Nahrungsmittelergänzungsstoffe
verwendet werden. Derartige Verwendungen umfassen ohne Beschränkung die Verwendung
als Protein- oder Aminosäurezusatz,
die Verwendung als Kohlenstoffquelle, die Verwendung als Stickstoffquelle
und die Verwendung als Kohlenwasserstoffquelle. In derartigen Fällen kann
das erfindungsgemäße Protein
oder Polynukleotid der Nahrung für
einen beliebigen Organismus zugefügt werden oder es kann als
getrennte feste oder flüssige
Präparation
verabreicht werden, wie beispielsweise in Form eines Puders, als Pillen,
Lösungen,
Suspensionen oder als Kapseln. Im Fall von Mikroorganismen kann
das erfindungsgemäße Protein
oder Polynukleotid dem Medium zugegeben werden, in oder auf welchem
der Mikroorganismus kultiviert wird.
-
Auch
wenn diese Erfindung hinsichtlich bestimmter bevorzugter Ausführungsformen
beschrieben wurde, sind andere Ausführungsformen dem Durchschnittsfachmann
im Hinblick auf die hierin dargelegte Offenbarung offensichtlich
und fallen auch in den Bereich dieser Erfindung. Entsprechend ist
es beabsichtigt, dass der Bereich der Erfindung nur durch Referenz
auf die angefügten
Ansprüche
bestimmt ist.
Tabelle
II
Tabelle
III
SEQ.ID
NO. | SIGNALPEPTID |
ID38 | MLLEVPWLSSTVSCAQG |
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Beschreibung von Transkriptionsfaktorbindungsstellen,
die auf Promotoren vorliegen, die aus SignalTag-Sequenzen isoliert
worden sind
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Promotorsequenz P13H2
(546bp):
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Promotorsequenz P16B4
(861 bp):
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Promotorsequenz P29B6
(556bp):
Tabelle
VII
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