MX2007009878A - Anticuerpos monoclonales para antigeno de membrana especifica para prostata (amep). - Google Patents

Abstract

La presente invencion provee anticuerpos monoclonales asilados, particularmente anticuerpos monoclonales humanos, que se unen especificamente a AMEP con alta afinidad. Tambien se proveen moleculas de acido nucleico que codifican los anticuerpos de la invencion, vectores de expresion, celulas huesped y metodo para expresar los anticuerpos de la invencion. Tambien se proveen inmunoconjugados, moleculas biespecificas y composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos de la invencion. La invencion tambien provee metodos para tratar cancer.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA ANTIGENO DE MEMBRANA ESPECIFICA PARA PRÓSTATA (AMEP) Antecedentes de la Invención El cáncer de próstata es una causa principal de morbidez y mortalidad entre los hombres. Los tratamientos para cáncer de próstata incluyen cirugía hormonas, radiación, y quimioterapia. Hay tratamientos porco efectivos para la enfermedad de próstata metastática. Por lo tanto, es critica la identificación de genes y/o productos de genes que representan marcadores de diagnostico y pronóstico, asi como blancos para terapia. El antigeno especifico para próstata (AEP) es un marcador de cáncer que es útil en el diagnóstico clinico y en estadísticas de cáncer de próstata. Sin embargo, AEP no puede diferenciar el inicio de hiperplasia prostática (IHP) de prostatitis o cáncer de próstata en la escala de 4-10 ng/ml, por lo tanto, necesitando una evaluación citológica y/o histológica para confirmar el diagnóstico apropiado (Barren, R.J, y otros (1998) Prostate 36: 181-188). El antigeno de membrana especifica para próstata (AMEP) es una glicoproteina de transmembrana de tipo II con 750 aminoácidos de aproximadamente 110 kD que tiene homología del 54% al receptor de transferina. AMEP tiene 3 dominios estructurales, incluyendo un dominio intracelular de 19 aminoácidos, un dominio de transmembrana de 24 aminoácidos y un dominio extracelular de 707 aminoácidos. La proteina de AMEP tiene 3 dominios estructurales, incluyendo un dominio intracelular de 19 aminoácidos, un dominio de transmembrana de 24 aminoácidos, y un domino extracelular de 70 '7 aminoácidos. La proteina de AMEP exhibe neurocarboxipeptidasa y actividad de folato hidrolasa y se reporta que está implicada en la regulación neuroendocrina del crecimiento y diferenciación de próstata (Heston, .D. (1996) Urologe-Ausgabe A. 35:400-407). AEP es una forma alternativamente empalmada de AMEP que está localizada en el citoplasma. AMEP se expresó predominantemente por células epiteliales prostáticas. La expresión de AMEP se incrementó en cáncer de próstata, especialmente en carcinomas pobremente diferenciados, metastáticos y refractarias a la hormona (Gregorakis, A.K. y otros (10998) Seminars in Urologic Oncology 16: 2-12; Silver, D.A. (1997) Clinical C ncer Research 3: 81-85). La expresión de bajo nivel de AMEP se observó en tejidos extraprostáticos tal como el intestino delgado, glándula salivarla, mucosa duodenal, túbulos renales proximales y cerebro (Silver, D.A. (1997) Clinical Cáncer Research 3: 81-85) . AMEP también se expresa en células endoteliales de vasos capilares en áreas peritumorales y endotumorales de ciertas malignidades, incluyendo carcinomas de células renales, y carcinomas de colon, pero no en vasos sanguíneos de tejidos normales. Además, se reportó que AMEP se relaciona con angiongénesis tumoral (Silver, D.A. (1997) Clinical Cáncer Research 3: 81-85). Recientemente, AMEP se ha demostrado que se expresa en células endoteliales de neovasculatura asociada con tumores en carcinomas del colon, pecho, vejiga, páncreas, riñon y melanoma (Chang, S.S. (2004) Curr Opin Investig Drugs 5:611-5). Los anticuerpos contra dominio extracelular de AMEP se han descrito en (véase, Liu, H. y otros (1997) Cáncer Res. 57:3629-3634; Murpy, G.P. y otros (998) J. Urol. 160:2396-2401; Wang, S. y otros (2001) Int. J. Cáncer 92: 871-876; Kato, K y otros (2003) Int. J. Urol. 10:439-444; Patente de E.U.A. NO. 6,150,508 y Patente de E.U.A. No. 6,107,090). Más recientemente, se han descrito anticuerpos humanos y humanizados que se unen a AMEP (véase v.gr., Bander, N.H. y otros (2003) Semin. Oncol. 30:667-676; Publicación de PCT WO 02/098897; Publicación de PCT WO 01/09192; Publicación de PCT WO 03/06406; Publicación de PCT WO 03/034903; y Solicitud de AUA No. 2004/003606). Dichos anticuerpos se han usado para formar la imagen de células de cáncer de próstata (véase v.gr. Yao, D. y otros (2002) Semin. Urol. Oncol. 20:211-218; Bander, N.H. y otros (2003) J. Urol. 170:1717-1721). Anticuerpos anti-AMEP también se han usado para la intervención terapéutico en tratamiento de cáncer de próstata, normalmente como un conjugado con un agente quimioterapéutico o isótopo radioactivo (véase, v.gr. Nanus, D.M., y otros (2003) J. Urol. 170:S84-89; Milowsky, M.I. y otros (2004) J. Clin. Oncol. 22:2522-2531; Henry, M.D. y otros (2004) Cáncer Res. 64:7995-8001). Consecuentemente AMEP representa un blanco valuable para el tratamiento de cáncer de próstata y una variedad de otras enfermedades caracterizadas por expresión de AMEP y se desean agentes terapéuticos adicionales que reconoce AMEP.

Sumario de la Invención La presente invención provee anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen a AMEP. Los anticuerpos de la invención tienen propiedades deseadas, tales como alta afinidad para AMEP, la capacidad para ser internalizada por células que expresan AMEP y una temperatura de fusión alta. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención tienen temperaturas de fusión de por lo menos 67 °C, o por lo menos 69°C o por lo menos 71°C. En un aspecto, la invención pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antigeno del mismo, comprendiendo una región variable de cadena pesada que es el producto o derivado de un gen humano de VH3-30.3, en donde la especificidad de anticuerpo se une a AMEP. La invención además provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antigeno del mismo, comprendiendo una región variable de cadena ligera que es producto de un derivado de un gen humano VKL18, en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP. En una modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antigeno del mismo, comprendiendo: (a) una región variable de cadena pesada de un gen humano VH3-30.3; y (b) una región variable de cadena ligera de un gen humano BKL18; en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP. En otra modalidad especifica, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antigeno del mismo, comprendiendo: (a) una región variable de cadena pesada de un gen humano VH3-30.3; y (b) una región variable de cadena ligera de un gen humano BKL18; en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP. En modalidades preferidas, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antigeno del mismo, comprendiendo: (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 9, 10, 11, y 12; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 13, 14, 15, y 16; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1|7, 18, 19, y 20; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 21, 22, 23, y 24; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25, 26, 27, y 28; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32; en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP. Una combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 9; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 13; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 17; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 21; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 25; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 29. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 10; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 14; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 18; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 22; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 26; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 30. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 11; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 15; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 19; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 23; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 27; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 31. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 12; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 16; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 20; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 24; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 28; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 32. Otros anticuerpos preferidos de la invención, o porciones de unión de antigeno de los mismos, comprenden: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1, 2, 3, y 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 5, 6, 7, y 8; En donde el anticuerpos se une específicamente a AMEP. Una combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8.

Los anticuerpos de la invención, por ejemplo, pueden ser anticuerpos de longitud completa, por ejemplo un isotipo de IgGl o IgG4. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos de Fab o Fab' 2, o anticuerpos de una sola cadena. La invención también provee un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención, o porción de unión de antigeno del mismo, ligada a un agente terapéutico, tal como citotoxina o un isótopo radioactivo. La invención también provee una molécula biespecifica que comprende un anticuerpo, o porción de unión de antigeno del mismo, de la invención, ligado a una segunda porción funcional que tiene una especificidad de unión diferente que dicho anticuerpo, o porción de unión de antigeno del mismo. Las composiciones que comprenden un anticuerpo o porción de unión de antigeno del mismo, o un inmunoconjugado o molécula biespecifica de la invención y también se provee un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos, o porciones de unión a antigeno de los mismos, de la invención, también son abarcados por la invención, asi como los vectores de expresión que comprenden dichos ácidos nucleicos y células huésped que comprenden dichos vectores de expresión. Además, la invención provee un ratón transgénico que comprende transgenes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el ratón expresa un anticuerpo de la invención, asi como hibridomas preparados de dicho ratón, en donde el hibridoma produce el anticuerpo de la invención. En aún otro aspecto, la invención provee un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, en donde las células tumorales o células endoteliales vasculares próximas a las células tumorales expresan AMEP, comprendiendo administrar a un sujeto un anticuerpo humano anti-AMEP de la presente invención en una cantidad efectiva para desarrollar las células tumorales. En una modalidad preferida, se inhibe el crecimiento de las células tumorales de próstata. La invención también provee métodos para formar anticuerpos anti-AMEP de la "segunda generación" basado en las secuencias de anticuerpos anti-AMEP provistos en la presente. Por ejemplo, la invención provee un método para prepara un anticuerpo anti-AMEP comprendiendo: (a) proveer: (i) una secuencia de anticuerpos de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDRl que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 99, 10, 11, y 12, una secuencia de CDR2 que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 13, 14, 15, y 16; y una secuencia de CDR3 que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 17, 18, 19, y 20; o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDRl que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 21, 22, 23 y 24, una secuencia de CDR2 que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 25, 26, 27, y 28, y una secuencia de CDR3 que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32; (b) alterar por lo menos un residuo de aminoácidos dentro de por lo menos una secuencia de anticuerpo de región variable, dicha secuencia siendo seleccionada de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera, para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo alterada; y (c) expresar la secuencia del anticuerpo alterada como una proteina. En otro aspecto, la invención provee un método para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor (v.gr., próstata, colon, renal, rectal, urotelial, mamario, vejiga, higado, páncreas o melanoma) en un sujeto, en donde las células del tumor o células vasculares endoteliales próximas a AMEP expresan tumor. El método incluye administrar a un sujeto un anticuerpo anti-AMEP, o porción de unión de antigeno del mismo, en combinación con un agente anti-tumoral tanto en una cantidad efectiva para inhibir o prevenir crecimiento del tumor.

En otro aspecto, la invención provee un método para estimular el anticuerpo que depende de la citotoxicidad mediada por células (CCDA) de un tumor en un sujeto, en donde las células de tumor o células endoteliales vasculares próximas a AMEP que expresan tumores. El método incluye administrar a un sujeto un anticuerpo anti-AMEP, o porción de unión del mismo, en combinación con un agente anti-tumoral tanto en una cantidad efectiva para estimular citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (CCDA) del tumor. En un aspecto adicional, la invención provee un método para inhibir caquexia relacionada con tumores en un sujeto, en donde las células del tumo o células endoteliales vasculares próximas a AMEP que expresan el tumor. El método incluye administrar a un sujeto un anticuerpo anti-AMEP, o porción de unión de antigeno del mismo, en combinación con un agente anti-tumoral en una cantidad efectiva para inhibir caquexia relacionada con tumores en el sujeto. En una modalidad de la invención, la administración del anticuerpo anti-AMEP, o porción de unión de antigeno del mismo, a un sujeto, en combinación con el agente antitumoral, conduce a un efecto sinergistico de la inhibición del crecimiento del tumor. En otra modalidad, el agente antitumoral ocasiona daño en la masa tumoral, conduciendo asi a un a citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos efectivos (CCDA) del tumor. En una modalidad, el anticuerpo anti-AMEP puede ser di anticuerpo 7F12 1C3, 2A10 2F5 o 2c6. En una modalidad de la presente invención, el agente antitumoral es un agente quimioterapéutico, tal como Taxotere® (docetaxel) . En otra modalidad, el agente antitumoral es un agente anti-angiogénico, tal como angiostatina Kl-3, Arresten, aaAT, Canstatin, DL-a-difluorometil-ornitina, Endostatina, Fumagilina, geniseina, Minociclina, Staurosporina, Talidomida, y Tumstatina. En otra modalidad, el agente anti- .tumoral es un agente inmunomodulador, tal como anticuerpos anti-PODl, anticuerpos anti-CTLA-4, oligodesoxiribonucleótido fosforotiolado (1018 ISS) , vacunas de gen GM-CSF, interleucina 2, interleucina 7 (CYT 99 07), interleucina 12 e interleucina 21. En otro aspecto, la invención provee método para identificar un agente anti-tumoral capaz de actuar sinergisticamente con un anticuerpo anti-AMEP para inhibir o prevenir el crecimiento tumoral, en donde las células del tumor o células endoteliales vasculares próximas a AMEP que expresan tumor. El método incluye poner en contacto una composición de indicador con (a) un agente antitumoral solo, (b) un anticuerpo anti-AMEP solo, y (c) ambos agentes antitumorales de prueba y un anticuerpo anti AMEP; y comparando la capacidad de (a) el agente antitumoral de prueba solo y (b) el anticuerpo anti-AMEP solo para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor a la capacidad de (c) tanto el agente anti-tumoral y el anticuerpo anti-AMEP para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor, en donde la inhibición o prevención de crecimiento tumoral por (c) en una cantidad que es mayor al efecto aditivo de (a) y (b) podria conducir a la identificación de un agente antitumoral capaz de actuar sinergisticamente con un anticuerpo anti-AMEP para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor. En otro aspecto, la invención pertenece a una composición que comprende un anticuerpo anti AMEP (v.gr., 7F12 1C3, 2A10, 2F5 o 2C6) y un agente anti-tumoral (v.gr., Taxotere® (docetaxel) , angiostatina Kl-3, Arresten, aaAT, Canstatina, DL-a-Difluorometil-ornitina, Endostatina, Fumagilina, Genisteina, Minociclina, Staurosporina, Thalidomida, Tumstatina, un anticuerpo anti-PDI, un anticuerpo anti-CTLA-4, oligodesoxiribonucleótido fosforotiolato (1018 ISS) , una vacuna de gen GM-CSF, interleucina 2, interleucina 7 (CYT 99 07), interleucina 12 o interleucina 21) en una cantidad efectiva para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor y un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad efectiva para estimular anticuerpo dependiente de citotoxicidad mediada por célula (CCDA) de un tumor y un vehículo farmacéuticamente aceptable . Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos que no se podrían considerar limitantes. Los contenidos y referencias, entradas de banco de Genes, patente y solicitudes de patentes publicadas citadas a través de esta solicitud de incorporan expresamente en la presente por referencia.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura ÍA muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 33) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 1) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano IC3. Las regiones CDRl (SEC ID NO: 9), CDR2 (SEC ID NO: 13) y CDR3 (SEC ID NO: 17) se delinean y se indican las derivaciones de la linea germinal V, D y J. La Figura IB muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 37) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 5) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano IC3. Las regiones CDRl (SEC ID NO: 21), CDR2 (SEC ID NO: 25) y CDR3 (SEC ID NO: 29) se delinean y se indican las derivaciones de la linea germinal V y J. La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 34) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 2) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2A10. Las regiones CDRl (SEC ID NO: 10), CDR2 (SEC ID NO: 14) y CDR3 (SEC ID NO: 18) se delinean y se indican las derivaciones de la linea germinal V y J. La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 38) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 6) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 2A10. Las regiones CDRl (SEC ID NO: 22), CDR2 (SEC ID NO: 26) y CDR3 (SEC ID NO: 30) se delinean y se indican las derivaciones de la linea germinal V y J. La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 35) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 3) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2F5. Las regiones CDRl (SEC ID NO: 11), CDR2 (SEC ID NO: 15) y CDR3 (SEC ID NO: 19) se delinean y se indican las derivaciones de la linea germinal V y J. La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 39) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 7) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 2F5. Las regiones CDRl (SEC ID NO: 23), CDR2 (SEC ID NO: 27) y CDR3 (SEC ID NO: 31) se delinean y se indican las derivaciones de la linea germinal V y J. La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 36) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 4) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2C6. Las regiones CDRl (SEC ID NO: 12), CDR2 (SEC ID NO: 16) y CDR3 (SEC ID NO: 20) se delinean y se indican las derivaciones de la linea germinal V y J. La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID NO: 40) y secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 8) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 2C6. Las regiones CDRl (SEC ID NO: 24), CDR2 (SEC ID NO: 28) y CDR3 (SEC ID NO: 33) se delinean y se indican las derivaciones de la linea germinal V y J. La Figura 5 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 1C3 (SEC ID NO: 1) con la secuencia de aminoácido VH3-30.3 (SEC ID NO: 41) y la linea germinal JH6n (SEC ID NO: 454) . La Figura 6 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 2A10 (SEC ID NO: 2), 2F5 (SEC ID NO: 3) y 12C6 (sec ID NO: 4) con la secuencia de aminoácidos VH5-51 de la linea germinal humana (SEC ID NO: 42) . La Figura 7 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de IC3 (SEC ID NO: 5), 2A10 (SEC ID NO: 6), y 2F5 (residuos 1-107 de SEC ID NO: 7) con la secuencia de aminoácidos VKL18 de la linea germinal humana (SEC ID NO: 43) y la linea germinal JK4 (SEC ID NO: 46) .

La Figura 8 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 2C6 (SEC ID NO: 8) con la secuencia de aminoácidos VKL6 de la línea germinal humana (SEC ID NO: 44) y la línea germinal JK3 (SEC ID NO: 47) . La Figura 9 muestra los resultados de experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos 2F5, 2A10 y 2C6, dirigidos contra AMEP humano se une la superficie celular de AMEP- expresando células LNCaP. Las Figuras 10 muestran los resultados de experimentos de ELISA que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra AMEP humano se une específicamente a AMEP purificado de células LNCaP. Las Figuras 11A-11B son resultados de estudios de competencia de unión de anticuerpos que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos 2A10 y 7F12, dirigidos contra AMEP humano, compiten para unirse a células de cáncer de próstata LNCaP que expresan AMEP. La Figura 11 muestra la competencia de 125I-7F12 con un anticuerpo 2A10 frío. Las Figuras 12A-12B muestran los resultados de experimentos de internalización que demuestran que el anticuerpo monoclonal humano 2A10, dirigidos contra AMEP humano, introduce células de cáncer de próstata LNCa que expresan AMEP por un análisis de liberación de 3H-timidina.

La Figura 12A muestra resultados para células de LNCaP sembrados durante 2 horas antes de la introducción del anticuerpo. La Figura 12B muestra resultados para células de LNCa sembradas durante la noche antes de la introducción del anticuerpo. Las Figuras 13A-13B son gráficas que describen las curvas de crecimiento de xenoinjertos de tumor de LNCaP de la media y mediana para ratones tratados con: el anticuerpo 7F12 anti-AMEP, el anticuerpo de control de isotipo Rituxan, Taxotere (2 mg/kg), Taxotere (4 mg/kg), el anticuerpo 7F12 anti-AMEP en combinación con Taxotere (2 mg/kg) , en anticuerpo anti-AMEP 7F12 en combinación con Taxotere (4 mg/kg) , el anticuerpo de control de isotipo Rituxan en combinación con Taxotere (4 mg/kg), o PBS. Las Figuras 13C-13D son gráficas que describen el cambio de peso corporal medio y mediana de ratones portadores de tumor LNCaP tratados con: el anticuerpo 7F12 anti-AMEP, el anticuerpo de control de isotipo Rituxan, Taxotere (2 mg/kg), Taxotere (4 mg/kg), el anticuerpo de 7F12 anti-AMEP en combinación con Taxotere (2 mg/kg) , el anticuerpo 7F12 anti-AMEP en combinación con Taxotere (4 mg/kg) , el anticuerpo de control de isotipo Rituxan en combinación con Taxotere (2 mg/kg) , el anticuerpo de control de isotipo Rituxan en combinación con Taxotere (4 mg/kg) , o PBS.

Las Figuras 14A-14B son gráficas que describen las curvas de crecimiento de xenoinjertos de tumor de LNCaP media y mediana para ratones tratados con el anticuerpo 7F12 anti-AMEP, el anticuerpo de control de isotipo Rituxan, o PBS, Figuras 14C-14D son gráficas que describen el cambio de peso corporal medio y mediano de ratones portadores de tumo de LNCaP tratados con: el anticuerpo 7F12 anti-AMEP, el anticuerpo de control de isotipo Rituxan, o PBS. Las Figuras 15A-15B son gráficas que describen las curvas de crecimiento de xenoinjertos de tumor de LNCaP media y mediana para ratones tratados con: Taxotere (4 mg/kg) , el anticuerpo de control de isotipo Rituxan en combinación con Taxotere (4 mg/kg) , el anticuerpo anti-AMEP 7F12 en combinación con Taxotere (4 mg/kg), o PBS. Las Figuras 15C-15D son gráficas que describen el cambio de peso corporal medio y mediano de ratones portadores de tumor LNCaP tratados con: Taxotere (4 mg/kg) , el anticuerpo de control de isotipo Rituxan en combinación con Taxotere (4 mg/kg) , el anticuerpo 7F12 anti-AMEP en combinación con Taxotere (4 mg/kg), o PBS. Las Figuras 16A-16B son gráficas que describen los xenoinjertos de tumor LNCaP media y mediana para ratones tratados con: Taxotere (2 mg/kg) , el anticuerpo 7F12 anti-AMEP en combinación con Taxotere (2 mg/kg), el anticuerpo de control de isotipo Rituxan en combinación con Taxotere (2 mg/kg), o PBS. Las Figuras 16C-16D son gráficas que describen el cambio de peso corporal media y mediano de ratones portadores de tumor LNCaP tratados con: Taxotere (2 mg/kg), el anticuerpo 7F12 anti-AMEP en combinación con Taxotere (2 mg/kg) , el anticuerpo de control de isotipo Rituxan en combinación con Taxotere (2 mg/kg) o PBS. La Figura 17A-17B muestra los resultados de análisis de proliferación celular que demuestra que los anticuerpos anti-AMEP monoclonales humanos conjugados con toxina muestran citotoxicidad a células de cáncer de próstata (A) con un lavado de tres horas y (B) con un lavado continuo. La Fig. 18 es una gráfica de cambios en volumen del tumor sobre el tiempo para ratones dosificados con un conjugado de anticuerpo- fármaco de control de isotipo, un conjugado de anticuerpo- fármaco aAMEP, o un regulador de conjugación solo (vehículo) . La Fig. 19 es una gráfica de cambios en volumen del tumor sobre el tiempo para ratones dosificados con varias cantidades de un conjugado de anticuerpo- fármaco aAMEP, o un regulador de conjugación solo (vehículo) . La Fig. 20 es una gráfica de cambios en volumen del tumor sobre el tiempo para ratones dosificados con varias cantidades de un conjugado de anticuerpo- fármaco de control de isotipo, o un regulador de conjugación solo (vehículo) . La Fig. 21 es una gráfica de cambios en volumen del tumor sobre el tiempo para ratones dosificados con varias cantidades de un conjugado de anticuerpo-fármaco de control de isotipo, o un regulador de conjugación solo (vehículo) . La Fig. 22 es una gráfica de cambios en volumen del tumor sobre el tiempo para ratones dosificados con varias cantidades de un conjugado de anticuerpo-fármaco oAMEP, o un regulador de conjugación solo (vehículo) . La Fig. 23 es una gráfica de cambios en volumen tumoral sobre tiempo, para tumores que tienen un volumen de tumor promedio inicial de 240 mm3, para ratones dosificados con un conjugado de anticuerpo-fármaco de control de isotipo, un conjugado de anticuerpo-fármaco aAMEP, o un regulador de conjugación solo (vehículo) . La Fig. 24 es una gráfica de cambios en volumen tumoral sobre tiempo, para tumores que tienen un volumen de tumor promedio inicial de 430 mm3, para ratones dosificados con un conjugado de anticuerpo-fármaco de oAMEP, o un regulador de conjugación solo (vehículo) .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales aislados, anticuerpos monoclonales particularmente humanos, que se unen específicamente a AMEP con alta afinidad. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se derivan de secuencias de la línea germinal de cadena pesada y ligera particulares y/o características estructurales particulares tales como regiones de CDR que comprenden secuencias de aminoácidos particulares. La invención provee anticuerpos aislados, métodos para formar dichos anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecificas que comprenden dichos anticuerpos y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. La invención también se refiere a métodos para usar los anticuerpos tal como el tratamiento de enfermedades tales como cáncer. Con el fin de que la presente invención se entienda más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Las definiciones adicionales se exhiben a través de la descripción detallada. Los términos "antígeno de membrana específica para próstata" y "AMEP" se usan intercambiablemente en la presente, e incluyen cualquier variante, isoforma y homólogos de especies de AMEP humano que se expresan naturalmente por las células y que retienen la unión a los anticuerpos IC3, 2A10, 2F5 o 2C6 descritos en la presente. La secuencia de aminoácidos completa de proteína de AMEP humana tiene el número de acceso al Banco de Genes número NP_004467. La secuencia de ADNc completa que codifica la proteína de AMEP humana tiene el número de acceso al Banco de Genes NM 004476.

Una "ruta de transducción de señales" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que juegan un papel en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. Como se usa en la presente, la frase "receptor de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de dicha señal a través de la membrana de plasma de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el receptor de AMEP. El término "anticuerpo" como se denomina en la presente incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión de antígeno (es decir, "porción de unión de antígeno") o cadenas sencillas del mismo. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por uniones de disulfuro, o una porción de unión de antígeno del mismo. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH?, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones de VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (RDC) , interpuestas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones de estructura (RE) . Cada VH y VL está compuesto de tres RDC y cuatro RE, dispuestos desde la terminación amino a la terminación carboxi en el siguiente orden: REÍ, RDC1, RE2, RDC2, RE3, RDC3, ER4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores huésped, incluyendo varias células del sistema inmune (v.gr. células efectoras) y el primer componente (Ciq) del sistema de complemento clásico. El término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo", como se usa en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (v.gr., AMEP). Se ha mostrado que la función de unión de antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento de Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios V, VH, C y CH?; (ii) un fragmento de F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos de Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento de Fd que consiste de los dominios de VH y CH?; (iv) un fragmento de Fv que consiste de los dominios de VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de Fab (Ward y otros, (1989) Nature 341: 544-546), que consiste de un dominio de VH; y (vi) una región de determinación de complementariedad (RDC) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V y VH, se codifican por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por una ligadura sintética que les permite hacerse como una cadena de una sola proteína en la cual las regiones de V y VH están en pares para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fb de una sola cadena (scFv) ; véase, v.gr., Bird y otros (1988) Science 242: 423-426; y Huston y otros (1988) Proc. Ntl. Acad. Sci EUA 85: 5879-5883) . Dichos anticuerpos de una sola cadena también se pretende que estén abarcados dentro del término "porción de unión de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en la técnica, y los fragmentos se tamizaron para utilidad de la misma manera como son los anticuerpos intactos. Un "anticuerpo aislado", como se usa en la presente, se pretende que se refiere a aun anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (v.gr., un anticuerpo aislado que se une específicamente a AMEP está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos diferentes a AMEP) . Un anticuerpo aislado que se une específicamente a AMEP, sin embargo, puede tener reactividad cruzada a otro antígenos, tales como moléculas de AMEP de otras especies. Sin embargo, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular sencilla. Una composición de anticuerpo monoclonal exhibe una sola especificidad de unión y afinidad de un epítope particular. El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales tanto la estructura como regiones de RDC se derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (v.gr., mutaciones introducidas por mutagénesis específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no se pretende que incluya anticuerpos en los cuales las secuencias de RDC derivadas de la línea germinal de otras especies de mamíferos, tales como un ratón, se han injertado en secuencias de estructuras humana. El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que exhiben una especificidad de una sola unión que tienen regiones variables en las cuales tanto la estructura como las regiones de RDC se derivan de las secuencias de inmunoglobulina de la linea germinal humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, v.gr., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgene de cadena pesada humana y un transgene de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada. El término "anticuerpo humano recombinante", como se usa en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se prepararan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (v.gr., un ratón) que es transgénico o transcromosomal para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado del mismo (descrito más adelante) , (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, v.gr., de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios, recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique dividir secuencias de genes de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las cuales la estructura y regiones de RDC se derivan de las secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vitro (o cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humano, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio in vivo de la linea germinal de anticuerpos humana. Como se usa en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos (v.gr., IgM o IgGI) que se codifica por los genes de región constante de cadena pesada. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan intercambiablemente en la presente con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno" .

El término "derivados de anticuerpos humanos" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, v.gr., un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo . El término "anticuerpo humanizado" se pretende que se refiera a anticuerpos en los cuales las secuencias de RDC derivadas de la linea germinal de otras especies de mamíferos, tales como un ratón, se han injertado en las secuencias de estructura humana. Las modificaciones de la región de estructura adicional pueden estar dentro de las secuencias de la estructura humana. El término "anticuerpo quimérico" se pretende que se refiere a anticuerpos en los cuales las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de región constante se derivan de otras especies, tales como un anticuerpo en el cual las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de región constante se derivan de un anticuerpo humano. Como se usa en la presente, un anticuerpo que "se une específicamente a AMEP humano" se pretende que se refiera a un anticuerpo que se unen a AMEP humano con una KD de 5x1O"8 M o menos, más preferiblemente de 1 x 10~8M o menos, más preferiblemente de 5 x 10~9M o menos, más preferiblemente 1.2 x 10"9 M o menos, aún más preferiblemente entre 1.2 y 10~9 M y 1.2 x 10"10 M o menos.

El término "KaS0c" o "Ka" como se usa en la presente, se pretende que se refiera al régimen de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kd?s" o "Kd", como se usa en la presente, se pretende que se refiera al régimen de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular. El término "KD", como se usa en la presente, se pretende que se refiere a la constante de disociación, que se obtiene de la relación de Kd a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M) . Los valores de KD para anticuerpos pueden determinarse usando métodos bien establecidos en la materia. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es usando resonancia de plasmon superficial, preferiblemente usando un sistema biosensor tal como sistema Biacore®. Como se usa en la presente, el término "alta afinidad" para un anticuerpo de IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10"7 M o menos, más preferiblemente 10~8 M o menos, más preferiblemente 10~9 o menos, y aún más preferiblemente 10"10 M o menos, para un antígeno blanco. Sin embargo, unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, unión de "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10~7 M o menos, más preferiblemente 10~8 M o menos, aún más preferiblemente 10~9 M o menos. El término "vector", como se usa en la presente, se pretende que se refiere a una molécula de ácidos nucleicos capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha ligado. Un tipo de vector es un "plasmido", que se refiere a un ciclo de ADN de doble hebra circular en la cual pueden estar ligados los segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde pueden estar ligados los segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores pueden ser de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (v.gr., vectores bacterianos que tiene un origen bacterial de replicación y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (v.gr., vectores de mamíferos no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped al introducirse en la célula huésped, y así se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los cuales se ligan operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente como "vectores de expresión recombinante" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante con frecuencia tienen la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se puede usar intercambiablemente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención se pretende que incluye dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (v.gr., retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que sirven para funciones equivalentes. El término "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se usa en la presente, se pretende que se refiera a una célula en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se deberá entender que dichos términos se pretende que se refieran no solo a la célula particular sino a la progenie de dicha célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en generaciones sucesoras debido a cualquier mutación o influencias ambientales, de hecho, dicha progenie puede no ser idéntica a la célula madre, pero aún se incluyen dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente. Las células huésped recombinantes incluyen, por ejemplo, células de CHO, transfectomas, y células linfociticas . Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, v.gr., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Los términos "animal no humano transgénico" se refiere a un animal no humano que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes de cadena pesada y/o ligera humana o transcromosomal (ya sea integrado o no integrado en el ADN genómico natural del animal) y que es capaz de expresar completamente anticuerpos humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgene de cadena ligera humana y un transgene de cadena pesada humana o transcromosomal de cadena pesada humana, de manera que el ratón produce anticuerpos anti-AMEP humanos cuando se inmunizan con antígeno de AMEP y/o células que expresan AMEP. El transgene de cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosomal del ratón, como es el caso para ratones transgénicos HuMA, o el transgene de cadena pesada humana puede mantenerse extracromosomalmente, como es el caso para ratones transcromosomales (v.gr,, KM)) como se describió en WO 02/43478. Dichos ratones transgénicos y transcromosomales pueden producir isotipos múltiples de anticuerpos monoclonales humanos a AMEP (v.gr., IgG, IgA y/o IgE) por sufrir recombinación de V-D-J e intercambio de isotipos. Como se usa en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, v.gr., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Varios aspectos de la invención se describen en mayor detalle en las siguientes subsecciones. Anticuerpos Anti-AMEP Los anticuerpos de la invención se caracterizan por aspectos o propiedades funcionales de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a AMEP humano. Preferiblemente, un anticuerpo de la invención se une a AMEP con alta afinidad, por ejemplo, con una KD de 5 x 10"7 M o menos. Como otro ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a una línea celular LNCaP que expresa AMEP (ATCC CRL-1740) . Los análisis normales para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia AMEP se conocen en la materia, incluyendo, por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia Western y RÍA. Los análisis adecuados se describen en detalle en los Ejemplo, La cinética de unión (v.gr., afinidad de unión) de los anticuerpos también se pueden evaluar por análisis normales conocidos en la técnica, tal como por ELISA, Scatchard, y análisis Biacore. Otras propiedades preferidas de los anticuerpos de la invención incluyen la capacidad de ser internalizados por células que expresan AMEP y alta termoestabilidad. La internalización de anticuerpos pueden evaluarse como se describió en el Ejemplo 6. La termoestabilidad puede evaluarse como se describió en el Ejemplo 7. Los anticuerpos preferidos de la invención tienen un punto de fusión de por lo menos 65°C, más preferiblemente por lo menos 66°C, aún más preferiblemente por lo menos 67°C, aún más preferiblemente por lo menos 68°C, aún todavía preferiblemente por lo menos 69°C, todavía más preferiblemente por lo menos 70°C y aún más preferiblemente por lo menos 71°C. Preferiblemente un anticuerpo de la invención tiene un punto de fusión en una escala de 67°C a 72°C, más preferiblemente 68°C a 72°C, o 69°C a 72°C, o 70°C a 72°C o 69°C a 71.43°C o el anticuerpo tiene un punto de fusión de aproximadamente 71.43°C.

Anticuerpos Monoclonales IC3, 2A10C, 2F5 y 2C6 Los anticuerpos preferidos de la invención son los anticuerpos monoclonales humanos IC3, 2A10, 2F5, y 2C6, aislados y caracterizados estructuralmente como se describió en los Ejemplos 1 y 2. Las secuencias de aminoácidos VH de IC3, 2A10, 2F5, y 2C6 se muestran en la SEC ID NO: 1, 2, 3, y 4, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos VL de IC3, 2A10, 2F5, y 2C6 se muestran en SEC ID NO: 5, 6, 7 y 8, respectivamente . Dado que cada uno de estos anticuerpos pueden unirse a AMEP, las secuencias de VH y V pueden "mezclarse e igualarse" para crear otras moléculas de unión anti-AMEP de la invención. La unión de AMEP de dichos anticuerpos "mezclados o igualados" puede probarse usando los análisis de unión descritos antes y en los Ejemplos (v.gr., FACS, o ELISA) . Preferiblemente, cuando se mezclan e igualan las cadenas VH y VL, una secuencia de VH de un par VH/VL particular se reemplaza con una secuencia de VH estructuralmente similar. Así mismo, preferiblemente una secuencia de VL de un par VH/V particular se reemplaza con una secuencia de VL estructuralmente similar. Consecuentemente, en un aspecto, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1, 2, 3 y 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEC ID NO: 5, 6, 7, y 8; en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP, preferiblemente AMEP humano. Las combinaciones de cadena pesada y ligera preferidas incluyen: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1, y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5, o (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8. En otro aspecto, la invención provee anticuerpos que comprenden la cadena pesada y cadena ligera CDRls, CR2s y CDR3s DE 1C3, 2A10, 2F5, y 2C6, o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de CDRls de VM de 1C3, 2A10, 2F5, y 2C6 se muestran en SEC ID NO: 9, 10, 11, y 12, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de CDR2 de VH de 1C3, 2A10, 2F5, y 2C6 se muestran en SEC ID NO: 13, 14, 15, y 16, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de CDR3s de VH de 1C3, 2A10, 2F5 y 2C6 se muestran en SEC ID NO: 17, 18, 19, y 20, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de la CDRl de V? de 1C3, 2A10, 2F5 u 2C6 se muestran en la SEC ID NO: 21, 22, 23, y 24, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de CDR2 de V? de IC3, 2A10, 2F5, y 2C6 se muestran en SEC ID NO: 25, 26, 27, y 28, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de CDR3 V? de 1C3, 2A10, 2F5, y 2C6, se muestran en la SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32, respectivamente. Las regiones de CDR se delinean usando el sistema Kabat (Kabat, E.A., y otros 81991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.A., Publicación de NIH No. 91-3242) . Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a AMEP y que la especificidad de unión de antígeno se provee principalmente por las regiones CDRl, CDR2, y CDR3, las secuencias de CDRl, CDR2, y CDR3 de VH y las secuencias de CDRl, CDR2, y CDR3 de V? pueden ser "mezcladas e igualadas" (es decir, CDR de diferentes anticuerpos pueden mezclarse e igualarse, aunque cada anticuerpo debe contener CDRl, CDR2, y CDR3 de VH y CDRl, CDR2, y CDR3 de V?) para crear otras moléculas de unión anti-AMEP de la invención. La unión de AMEP de dichos anticuerpos "mezclados e igualados" pueden probarse usando los análisis de unión descritos antes y en los Ejemplos (v.gr., FACS, ELISA, análisis Biacore). Preferiblemente, cuando las secuencias de CDR de VH se mezclan e igualan la secuencia de CDRl, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia particular de VH se reemplaza con una secuencia de CDR estructuralmente similar. Así mismo, cuando las secuencias de CDR V se mezclan e iguala, la secuencia de CDRl, CDR2, y/o CDR3 de una secuencia de Vk particular se reemplaza preferiblemente con una secuencia de CDR estructuralmente similar. Será fácilmente evidente para el experto que las secuencias de VH y V novedosas puede crearse sustituyendo una o más secuencias de las regiones de CDR VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares a las secuencias de CDR descritas en la presente para anticuerpos monoclonales IC3, 2A10, 2F5 y 2C6. Consecuentemente, en otro aspecto, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo comprendiendo: (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 9, 10, 11 y 12; (b) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO. 13, 14, 15, y 16; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 17, 18, 19, y 20; (d) una región variable de cadena libera CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 21, 22, 23, y 24; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25, 26, 27, y 28; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32; En donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP, preferiblemente AMEP humano. En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 9; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 13; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 17; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 21; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 25; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 29. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 10; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 14; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 18; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 22; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 26; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 30. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 11; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 15; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 19; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 23; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 27; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 31. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 12; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 16; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 20; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 24; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 28; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 32.

Anticuerpos que tienen Secuencias de la linea Germinal Particular En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de la línea germinal particular y/o una región variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de línea germinal particular. Por ejemplo, en una modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de unión de antígeno de la misma, comprendiendo una región variable de cadena pesada que es el producto de, o derivado de un gen VH 3-30.3 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP. En otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión de antígeno del mismo, comprendiendo una región variable de cadena ligera que es el producto de, o derivado de un gen V? L18 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP. En aún otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen VH 3-30.3 humano (SEC ID NO: 41) ; (b) comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de, o derivado de un gen V? L18 humano (SEC ID NO: 43) ; y En donde el anticuerpo se une a AMEP, preferiblemente AMEP humano. En aún otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de, o derivado de un gen VH 5-51 humano (SEC ID NO: 42) ; (b) comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de, o derivado de un gen V? L18 humano (SEC ID NO: 44) ; y en donde el anticuerpo se une a AMEP, preferiblemente AMEP humano. En aún otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de, o derivado de un gen VH 5-51 humano (SEC ID NO: 42) ; (b) comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de, o derivado de un gen V? L18 humano (SEC ID NO: 44) ; y En donde el anticuerpo se une a AMEP, preferiblemente AMEP. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene VH y V de VH 3-30.3 y V? L18, respectivamente, es 1C3. Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y V? de VH 3-30.3 y V L18, respectivamente, son 2A10 y 2F5. Como se usa en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Dichos sistemas incluye inmunizar ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o tamizar una biblioteca de gen de inmunoglobulina humana exhibida en el fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede identificarse como tal comparado la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano a las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas de la línea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana que está más cercana en secuencia (es decir, % de identidad mayor) a la secuencia del anticuerpo humano. El anticuerpo humano que es "el producto de" o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede contener diferencias de aminoácidos comparado con la secuencia de la línea germinal, debido, por ejemplo, mutaciones somáticas que ocurren naturalmente o introducción intencional de mutación dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado normalmente por lo menos es 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano por ser humano cuando se comparó con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de otra especie (v.gr., secuencias de la linea germinal de murinos). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser por lo menos 95%, o aún por lo menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en secuencida de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de la línea germinal humana particular exhibirá no más de 10 diferencias de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede exhibir no más de 5, o uno no más de 4, 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.

Anticuerpos Homólogos En aún otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprende secuencias de aminoácidos que son homólogos a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpo anti-AMEP de la invención. Poro ejemplo, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, comprendiendo una regían variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde: (a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que por lo menos es 80% homólogo a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1, 2, 3, y 4; (b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que por lo menos es 80% homólogo a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 5, 6, 7, y 8; y (c) el anticuerpo se une específicamente a una línea celular LNCaP que expresa AMEP. En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos VH y/o VL puede ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ó 99% homólogos a las secuencias exhibidas antes. Un anticuerpo que tiene regiones VH y V de las secuencias exhibidas antes, pueden obtenerse por mutagénesis (v.gr., mutagénesis dirigida al sitio o mediada por RCP) de las moléculas de ácidos nucleicos que corresponden a SEC ID NO: 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, y 40, seguido por la prueba del anticuerpo alterado codificado para función retenida (es decir, unión a AMEP humano con una KD de 5 x 10~8 M o menos) usando los análisis funcionales descritos en la presente. Como se usa en la presente, el porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente al porcentaje de identidad entre dos secuencias. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidos por las secuencias (es decir, % homología = # de posiciones idénticas/total # de posiciones por 100) , tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesita ser introducido para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación de porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático, como se describió en los siguientes ejemplos no limitantes. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos pueden determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso de PAM120, una penalidad de longitud de espacios de 12 y una penalidad de espacios de 4. Además, la presente identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa de GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacios de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y un peso longitudinal de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6.

Adicional o alternativamente, las secuencias de proteínas de la presente invención además pueden usarse como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse usando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, y otros (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-10. Las búsquedas de proteina BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, clasificación = 50, longitud de palabras = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de anticuerpos de la invención. Para obtener alienaciones separadas para fines de comparación, se puede utilizar BLAST Gapped como se describió en Altschul y otros, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y BLAST Gapped, se pueden usar los parámetros por omisión de los programas respectivos (v.gr., XBLAST y NBLAST). Véase http: //www.ncbi .nih . gov.

Los anticuerpos con Modificaciones Conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, en donde una o más secuencias de CDR comprenden secuencias de aminoácidos específicas basadas en los anticuerpos preferidos descritos en la presente, (v.gr., IC3, 12A10, 2F5 o 2C6) , o modificaciones conservadoras de los mismos y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-AMEP de la invención. Consecuentemente, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, comprendiendo una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias de CDRl, CDR2, y CDR3, en donde: (a) la secuencia CDR3 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 17, 18, 19, y 20 y modificaciones conservadoras de los mismos; (b) la secuencia CDR3 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32 y modificaciones conservadoras de los mismos; y (c) el anticuerpo se une específicamente a una línea celular de LNCaP que expresa AMEP. En una modalidad preferida, la secuencia CDR2 de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 13, 14, 15, y 16, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia de CDR2 de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 25, 26, 27, y 28 y modificaciones conservadoras de los mismos. En otra modalidad preferida, la secuencia de CDRl de región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 9, 10, 11, y 12, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia CDRl de región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEC ID NO: 21, 22, 23, y 24 y modificaciones conservadoras de las mismas . Como se usa en la presente, el término "modificaciones de secuencia conservadora" se pretende que se refiere a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Dichas modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones y supresiones de aminoácidos. Las modificaciones pueden introducirse en un anticuerpo de la invención por técnicas normales conocidas en la materia, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por RCP. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas en las cuales el residuo de aminoácidos se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tiene cadenas laterales similares se han definido en la materia. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.gr. lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acídicas (v.gr., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (v.gr., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano) , cadenas laterales no polares (v.gr., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales ramificadas con beta (v.gr., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.gr., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de la regiones de CDR de un anticuerpo de la invención puede reemplazarse con otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede probarse para función retenida (es decir, la función exhibida en (c) ) usando los análisis funcionales descritos en la presente.

Anticuerpos que se Unen al Mismo Epítope como Anticuerpos Anti-AMEP de la Invención. En otra modalidad, la invención provee anticuerpos que se unen al mismo epítope en AMEP humano como cualquiera de los anticuerpos monoclonales AMEP de la invención (es decir, anticuerpos que tiene la capacidad de competencia cruzada para unirse a AMEP con cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la invención) . En modalidades preferidas, el anticuerpo de referencia para estudios de competencia cruzada puede ser el anticuerpo monoclonal IC3 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en SEC ID NO: 1 y 5, respectivamente) , o el anticuerpo monoclonal 2A10 (que tiene secuencias de VH y VL como se muestra en SEC ID NO: 4 y 8, respectivamente) . Dichos anticuerpos de competencia cruzada pueden identificarse con base en su capacidad de competencia cruzada con los anticuerpos de la invención actual. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de , por ejemplo 1C3, 2A10, 2F5, o 2C6, la AMEP humana demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con 1C3, 2A10, 2F5, o 2C6 para unirse a AMEP humano y por lo tanto se une al mismo epítope en AMEP humano como 1C3, 2A10, 2F5, o 2C6. En una modalidad preferida, el anticuerpo que se une al mismo epítope en AMEP humano como 1C3, 2A10, 2F5 o 2C6 es un anticuerpo monoclonal humano. Dichos anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describió en los Ejemplos .

Anticuerpos Tratados y Modificados Un anticuerpo de la invención se puede preparar además usando un anticuerpo que tiene una o más secuencias de VH y/o V descritas en la presente como material de partida para tratar un anticuerpo modificado, dicho anticuerpo modificado puede tener propiedades alterada del anticuerpo de partida. Un anticuerpo puede tratarse modificando uno o más residuos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y VL) , por ejemplo, dentro de una o más regiones de CDR y/o dentro de una o más regiones de estructura. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede tratarse modificando uno o más residuos dentro de una o amas regiones variables (es decir, VH y/o V ) , por ejemplo, dentro de una o más regiones de CDR y/o dentro de una o más regiones de estructura. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede tratarse modificando residuos dentro de la región constante, por ejemplo, para alterar la función efectora del anticuerpo. Un tipo de tratamiento de región variable que puede llevarse a cabo es injerto de CDR. Los anticuerpos interactúan con antígenos blanco predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y ligera (CDR) . Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de CDR son más diversas entre anticuerpo individuales que las secuencias fuera de CDR. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos presentes en la naturaleza para construir vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo presente en la naturaleza especifico injertado en secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (Véase, v.gr., Riechmann, L. y otros (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. y otros (1986) Nature 321: 522-525; Queen, C. y otros (1989) Proc. Nati. Acad. Véase EUA 86:10029-1033; Patente de E.U.A. NO. 5,225,59 de Winter, y Patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 a Queen, y otros). Consecuentemente, otra modalidad de la invención pertenece a un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2, y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 9, 10, 11, y 12, SEC ID NO: 13, 14, 15, y 16, y SEC ID NO: 17, 18, 19, y 20, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2, y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada de grupo que consiste de SEC ID NO: 21, 22, 23 y 24, SEC ID NO: 25, 26, 27, y 28, y SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32, respectivamente. Por lo tanto, dichos anticuerpos contienen las secuencias de CDR VH y V de anticuerpos monoclonales 1C3, 2A10, 2F5 o 2C6 aún pueden contener diferentes secuencias de estructura de estos anticuerpos . Dichas secuencias de estructuras pueden obtenerse de bases de datos de ADN públicas o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de la línea germinal POr ejemplo, secuencias de ADN de al línea germinal para genes de región variable de cadena pesada y ligera pueden encontrarse en la base de datos de secuencia de línea germinal humana "VBase" (disponible en el Internet en www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat, E. A., y otros (991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.A. Publicación de NIH No. 91-3242; Tomlinson, I. M:, y otros (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveáis about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol, 227: 776-798; y Cox, J., P. L. y otros (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveáis a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; el contenido de cada una de las cuales se incorpora expresamente en la presente por referencia. Las secuencias de estructura preferidas para usarse en los anticuerpos de la invención son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura usada por anticuerpos seccionados de la invención, v.gr., similar a las secuencias de estructura VH 3-30.3 (SEC ID NO: 41) y/o las secuencias de estructuras VH 5-51 (SEC ID NO: 42) y/o las secuencias de estructura V? L18 (SEC ID NO: 43) y/o las secuencias de estructura V? L6 (SEC ID NO: 44) usado por anticuerpos monoclonales preferidos de la invención. Las secuencias CDRl, CDR2, CDR3 de VH y las secuencias de CDRl, CDR2, y CDR3 de V? pueden injertarse en regiones de estructura que tiene la secuencia idéntica como la encontrada en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal que deriva la secuencia de estructura, o las secuencias de CDR pueden injertarse en regiones de estructura que contiene una o más mutaciones comparado con las secuencias de la linea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de estructura para mantener o mejora la capacidad de unión de antígeno al anticuerpo (v.gr., Patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen y otros). Otro tipo de modificación de región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de las regiones de CDRl, CDR2 y/o CDR3 de vH y/o V? para mejorar así una o más propiedades de unión (v.gr., afinidad) o el anticuerpo de interés. La mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por RCP puede llevarse a cabo para introducir la mutación y el efecto en unión de anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, puede evaluarse análisis in vitro o in vivo como se describió en la presente y se proporcionó en los Ejemplos. Se introducen las modificaciones preferiblemente conservadoras (como se trató antes) . Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos pero preferiblemente son sustituciones. Además, se alteran normalmente no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región de CDR. Consecuentemente, en otra modalidad, la invención provee anticuerpos monoclonales anti-AMEP aislados, o porciones de unión de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región de CDRl de VH que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 9, 10, 11, y 12; (b) una región de CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 13, 14, 15, y 16, (c) una región de CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 17, 18, 19, y 20, o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos, comparado con SEC ID NO: 9, 10, 11, y 12; (b) una región de CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 13, 14, 15, y 16, o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones, o adiciones de aminoácidos, comparado con SEC ID NO: 17, 18, 19, y 20, o una secuencia de aminoácidos que tienen uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos comparado con SEC ID NO: 17, 18, 19 y 20; (d) una región de CDRl de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 21, 22, 23, y 24; (e) una región de CDR2 de V? que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25, 26, 27 y 28, o una secuencia de aminoácidos que tienen uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos comparado con SEC ID NO: 25, 26, 27 y 28; y (f) una región CDR3 de Vk que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 29, 30, 31 y 32, o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos comparado con SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32. Los anticuerpos tratados de la invención incluyen aquellos en los cuales se han hecho modificaciones a los residuos de estructura dentro de Vh y/o V?, v.gr., para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente dichas modificaciones de estructura se hacen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por el ejemplo, un enfoque es "mutar inversamente" uno o más residuos de estructura a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que se ha sometido a mutación somática puede contener residuos de estructura que difieren de la secuencia de al línea germinal de al cual se deriva el anticuerpo. Dichos residuos pueden identificarse comparando las secuencias de estructura de anticuerpos a las secuencias de la línea germinal de la cual se deriva el anticuerpo. Dichos anticuerpos "mutados inversamente" se pretende también que sean abarcados por la invención. Por ejemplo, para residuo #9 de aminoácidos, 2C6 (dentro de FRl) de VH es una serina mientras que este residuo en la secuencia de la línea germinal de VH 5-51 correspondiente es una alanina. Para regresar a las secuencias de región de estructura a su configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "mutarse inversamente" a la secuencia de la línea germina, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por RCP (v.gr., residuo 9 de FRl de VH de 2C6 puede "mutarse inversamente" de serina a alanina) . Como otro ejemplo, para 2F5, el residuo de aminoácidos #84 (dentro de FR3) de VH es una asparagina mientras que este residuo en la secuencias de la línea germinal VH 5-51 es una serina. Para regresar a las secuencias de la región de estructura a su configuración de la línea germinal, por ejemplo, residuo 18 de FR3 de VH de 2F5 puede "mutarse inversamente" de asparagina a serina.

Otro tipo de modificación de estructura implica mutar uno o más residuos dentro de la región de estructura, o aún dentro de una o más regiones de CDR, para remover epítopes de células T para reducir así la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se denomina como "desinmunización" como se describió en mayor detalle en la Publicación de Patente de E.U.A. NO. 2003015343 por Carr y otros . Además o alternativo a las modificaciones hechas dentro de las regiones de estructura o CDR, los anticuerpos de la invención pueden tratarse para incluir modificaciones dentro de la región de Fc, normalmente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como vida media de suero, fijación de complemento, unión de receptor de Fc y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (v.gr., una o más porciones químicas pueden conectarse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe en mayor detalle más adelante. La numeración de residuos en la región de Fc es el índice de Kabt de EU. En una modalidad, la región de articulación de CH1 se modifica de manera que el número de residuos de cisteina en la región de articulación se altera, v.gr., incrementa o disminuye. Este enfoque se describe además en la Patente de E.U.A. No. 5,677,425 por Bodmer y otros. El número de residuos de cisteina en al región de articulación de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar el ensamble de las cadenas ligera y pesada o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo. En otra modalidad, la región de articulación Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, una o más mutaciones de aminoácidos se introducen en la región de interfase de domino CH2-CH3 del fragmento de articulación de Fc de manera que el anticuerpo tiene unión de proteína A (SpA) de Staphylococcyl en relación a la unión de SpA de dominio de articulación de Fc nativo. Este enfoque se describe en mayor detalle en la Patente de E.U.A. No. 6,165,745 por Ward y otros. En otra modalidad, el anticuerpo se modifica para incrementar su vida media biológica. Varios enfoques son posibles. Por ejemplo, una o más de las siguientes mutaciones pueden introducirse: T252L, T254S, T256F, como se describió en la Patente de E.U.A. NO. 6,277,375 de Ward. Alternativamente, para incrementar la vida media biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CHI o CL para contener un epítope de unión de receptor salvaje tomado de dos ciclos de un domino de CH2 de una región de Fc de un IgG, como se describió en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,869,046 y 6,121,022 por Presta y otros. En aún otras modalidades, la región de Fc se altera reemplazando por lo menos un residuo de aminoácidos con un residuo de aminoácidos diferente para alterar la función del efector del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden reemplazarse con un residuo de aminoácidos diferente de manera que el anticuerpo tiene una afinidad alterada para un ligando efector pero retiene la capacidad de unión del antígeno del anticuerpo madre. El ligando efector para el cual se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de FC o el componente Cl del complemento. Este enfoque se describe en mayor detalle en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,6243,821, y 5,648,260 amos de Winter y otros . En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de residuos de aminoácidos 329, 331, y 332 pueden reemplazarse con un residuo de aminoácidos diferente de manera que el anticuerpo tiene unión de Ciq alterada y/o citotoxicidad dependiente de complemento reducido o eliminado (cDC) . Este enfoque se describió en mayor detalle en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,194,551 por Idusogie y otros. En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las posiciones 231 y 239 de aminoácidos se alteran para alterar así la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se escribió además en la Publicación de PCT WO 94/29351 por Bodmer y otros. En aún otro ejemplo, la región de Fc se modifica para incrementar la capacidad del anticuerpo de mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA) . y/o incrementar la afinidad del anticuerpo de un receptor de Fc? modificando uno o más aminoácidos en las siguiente posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434,435,437,438 ó 439. Este enfoque se describió además en la publicación de PCT WO 00/42072 por Presta. Además, los sitios de unión en IgGl humano para Fc?RI, Fc?RII, Fc?RIII y FcRn se han mapeado y variantes con unión mejorada se han descrito (ver Shieds, R.L., y otros (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604). Las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334, y 339 se mostraron que mejoran la unión a Fc?lII. Adicionalmente, se mostró que las siguientes mutantes de combinación mejoran la unión de Fc?RIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.

En aún otra modalidad, se modificó la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede formar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación) . La glicosilación puede alterarse, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo para antígeno. Dichas modificaciones de carbohidratos puede lograrse, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia de anticuerpos. Por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos puede hacer que de cómo resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de estructura de región variable para eliminar así la glicosilación en dicho sitio. Dicha aglicosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo para antígeno. Dicho enfoque se describió en mayor detalle en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,714,350 y 6,350,861 por Co y otros. Adicional o alternativamente, un anticuerpo puede hacerse de menara que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras de Glc Nac de bisección incrementadas. Dichos patrones de glicosilación alterados han demostrado que incrementa la capacidad de CCDA de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidratos pueden lograrse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de glicosilación alterada. Las células con maquinaria de glicosilación alterada que han descrito en la materia y pueden usarse como células huésped en las cuales expresa anticuerpos recombinantes de la invención para producir así un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FuT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), dichos anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Se crearon líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8"/_ por la alteración dirigida al blanco del gen de FUT8 en células CHO/DG44 usando dos vectores de reemplazo (véase Publicación de Patente de E.U.A. No. 2004110704 por Yamane y otros y Yamane-Ohnuki y otros (2004) Biotechnol Biong. 87:614-22). Como otro ejemplo, la EP 1,176,195 por Hanai y otros describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transfrasa, de manera que los anticuerpos expresados en dicha línea celular exhiben hipofucosilación reduciendo o eliminando la enzima relacionada con la unión de alfa 1,6. Hanai y otros también describen líneas celulares que tiene una actividad enzimática baja para agregar fucosa a la N-acetilglucosamina que se una a al región de Fc del anticuerpo o no tiene la actividad enzimática, por ejemplo, la línea de células de mieloma YB2/0 (Atcc CRL 11662) . La Publicación de PCT WO 03/035835 por Presta describe una línea celular de CHO variante, células de Lecl3, con capacidad reducida de unir fucosa a carbohidratos ligados a Asn(297), dando como resultado así la hipofucosilación de anticuerpos expresados en dichas células huésped (ver también Shields, R.L. y otros (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740). La Publicación de PCT Wo 99/54342 por Umana y otros, describe líneas celulares tratadas para expresar glicosiltransferasas de modificación por glicoproteína (v.gr., beta (1,4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (Gn TIII)) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares tratadas exhiben bisección incrementada de estructuras de GlcNac que de como resultado la actividad de CCDA incrementada de los anticuerpo (ver también Umana y otros (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo pueden separarse usando una enzima de fucosidasa. Por ejemplo, la alfa-L-fucosidasa de fucosidasa remueve residuos de fucosilo de anticuerpos (Tarentino, A.L. y otros (1975) Biochem. 14:5516-23). Otra modificación de los anticuerpos presentes que se contempla por la invención es pegilación. Un anticuerpo puede pegilarse para, por ejemplo, incrementar la vida media biológica (v.gr., suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, normalmente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG) , tal como un éster reactivo o derivado de aldehido o derivado de aldehido de PEG, bajo condiciones en las cuales se unen uno o más grupos PEG al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo vía una reacción de acilación o una reacción del alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) . Como se usa en la presente el término "polietilenglicol" se pretende que abarque cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivar otras proteínas, tales como mono alcoxi (C1-C10)- o ariloxi-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que será pegilado es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase, por ejemplo, EP 0 154 316 por Nishimura y otros y EP 0 401 384 por Ishikaa y otros.

Métodos para Tratar Anticuerpos Como se trató antes, los anticuerpos anti-AMEP que tiene secuencias de VH y V? descritas en al presente, pueden usarse para crear nuevos anticuerpos anti-AMEP modificando las secuencias de BH y/o V?, o las regiones constantes unidas a la misma. Por lo tanto, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo anti-AMEP de los anticuerpos anti-AMEP que retienen por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tales como unión a AMEP humano. Por ejemplo, una o más regiones de CDR de 1C3, 2A10, 2F5, o 2C6, o mutaciones de los mismos se pueden combinar recombinantemente con regiones de estructura conocidas y/o otras CDR para crear anticuerpos anti-AMEP, tratados recombinantemente, adicionales, de la invención, como se trató antes. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en al sección previa. El material de partida para el método de tratamiento es una o más secuencias de VH yo V? provistas en la presente, o una o más regiones de CDR de los mismos. Para crear el anticuerpo tratado, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteina) un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de VH y/o V provistas en la presente, o una o más regiones de CDR de los mismos. En su lugar, la información contenida en las secuencias se usa como el material de partida para crear una secuencia de "segunda generación" derivada de la secuencia original y luego la secuencia de la "segunda generación" se prepara y expresa como una proteína. Consecuentemente, en otra modalidad, la invención provee un método para preparar un anticuerpo anti-AMEP que comprende : (a) proveer: (i) una secuencia de anticuerpos de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDRl seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 9, 10, 11, y 12, y una secuencia de CDR2 seleccionada del grupos que consiste de SEC ID NO: 13, 14, 15, y 16, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 17, 18., 19, y 20; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDRl seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO.: 21, 22, 23, y 24, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25, 26, 27, 28, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32; (b) alterar por lo menos un residuo de aminoácidos dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo alterada; y (c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteina. Las técnicas de biología molecular normal pueden usarse para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada . Preferiblemente, el anticuerpo codificado por las secuencias de anticuerpos alterados es una que retiene, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-AMEP descritos en la presente, dichas propiedades funcionales incluyen, pero no se limita a unirse específicamente a una línea celular LNCaP que expresa AMEP.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden evaluarse usando análisis normales disponibles en la materia y/o descritos en la presente, tales como aquellos exhibidos en los Ejemplos (v.gr., citometría de flujo, análisis de unión) . En ciertas modalidades de los métodos para tratar anticuerpos de la invención. Se pueden introducir aleatoriamente las mutaciones o selectivamente a lo largo de todo o parte de un anticuerpo anti-AMEP pueden tamizarse para unir actividad y/o otras propiedades funcionales como se describió en la presente. En la materia se han descrito métodos de mutaciones. Por ejemplo, la Publicación de PCT WO 02/092780 por Short describe métodos para crear y tamizar mutaciones de anticuerpos usando mutagénesis de saturación, ensamble de ligadura sintética, o una combinación de los mismos. Alternativamente, la Publicación de PCT WO 03/074679 por Lazar y otros, describe métodos para usar métodos de tamizado computacionales para optimizar las propiedades fisicoquímicas de anticuerpos.

Moléculas de Ácidos Nucleicos que Codifican Anticuerpos de la Invención Otro aspecto de la invención pertenece a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisato celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico es "aislado" o "vuelto sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, v.gr., otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, por técnicas normales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandeo de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis de gel de agarosa y otros bien conocidos en la materia. Véase Ausubel, y otros, ed. (1978) Current Protocols in Molecular Bioloty, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York Un ácido nucleico de la invención, por ejemplo, puede ser AND o ARN y puede o no contener secuencias intronicas. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden obtener usando técnicas de biología molecular normales. Para anticuerpos expresados por hibridomas (v.gr., hibridomas preparados de ratones transgénicos que portan genes de inmunoglobulina human como se describió más adelante) , ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo hecho por el hibridoma puede obtenerse por amplificación de RCP o técnicas de clonación de ADNc. Para anticuerpos obtenidos de un banco de gen de inmunoglobulina (v.gr., usando técnicas de exhibición de fagos), el ácido nucleico que codifica el anticuerpo puede recuperarse de la biblioteca. Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas de la invención son aquellas que codifican las secuencias de VH y VL de los anticuerpos monoclonales de 1C3, 2A10, 2F5, y 2C6 se muestran en SEC ID NO: 33, 34, 35 y 36 respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de VL de 1C3, 2A10, 2F5, y 2C6, se muestran en SEC ID NO: 37, 38, 39 y 40, respectivamente. Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican segmentos de VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse más por técnicas de ADN recombinante normales, por ejemplo, para convertir los genes de región variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento de Fab o a un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se obliga operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un ligador flexible. El término "ligado operativamente", como se usa en este contexto, se pretende que signifique que los dos fragmentos de ADN se unan de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en el marco. El ADN aislado que codifica la región de VH puede convertirse a un gen de cadena pesada de longitud completa ligando operativamente el ADN que codifica VH a una molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2, y CDH3) . Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humana se conocen en la materia (véase v.gr., Kabat, E.A. y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.A., Publicación de NIH No. 91-3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación de RCP. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferiblemente es una región constante de IgGl o IgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento de Fab, el ADN que codifica VH puede ligarse operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante de CHI de cadena pesada. El ADN aislado que codifica la región de VL puede convertirse a un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena ligera de Fab) ligando operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humana se conocen en la materia (véase v.gr., Kabat, E. A., y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de E.U.A., Publicación de NIH No. 91-3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación de RCP. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero más preferiblemente es una región constante de kappa. Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se ligaron operativamente a otro fragmento que codifica un ligador flexible, v.gr, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser) 3 (SEC ID NO: 48), de manera que las secuencias de H y VL pueden expresarse como proteína de una sola cadena o contigua, con las regiones de VL y VH unidas por el ligador flexible (véase, por ejemplo, Bird y otros (1988) Science 242: 423-426; Huston y otros (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85: 5879-5883; McCafferty y otros, (1990) Nature 348: 552-554).

Producción de Anticuerpos Monoclonales de la Invención Los anticuerpos monoclonales (mABs) de la presente invención se pueden producir por una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpos monoclonales convencionales v.gr., la técnica de hibridización de células somáticas normales de Kolhler y Milsteina (1975) Nature 256: 495. Aunque se prefieren los procedimientos de hibridización de células somáticas, en principio, otras técnicas para producir anticuerpo monocolonal puede emplearse, v.gr., transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema de murinos. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento bien establecido. Los protocolos de inmunización y técnica para aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en la materia. Los parámetros de fusión (v.gr., células de mieloma de murinos) y procedimientos de fusión son también conocidos. Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente reinvención pueden prepararse con base en la secuencia de un anticuerpo monocolonal de murinos preparados como se describió antes. En ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede obtenerse del hibridoma de murino de interés y tratarse para contener secuencias de inumoglobulina que no es de murinos (v.gr., humana) usando técnicas de biología molecular normales Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, la regiones variables de murinos pueden ligarse a regiones constantes humanas usando métodos conocidos en la materia (ver por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,816,567 de Cabilly y otros). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones de CDR de murinos pueden insertarse en una estructura humana usando métodos conocidos en la materia (véase v.gr., Patente de E.U.A. No. 5,225,539 de Winter, y Patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen y otros) . En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Dichos anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra AMEP pueden generarse usando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema de ratones. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones denominados en al presente como ratones HuMAb y ratones KM™ respectivamente, y se denominan colectivamente en la presente como "ratones de Ig humanos". El ratón HúMAb® (Medarex, Inc.) contiene mini-sitios de genes de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y secuencias de inmunoglobulina de cadena ligera K, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los sitios de cadena de µ y K (véase, v.gr., Lonberg, y otros (1994) Nature 368 (6474): 856-859) . Consecuentemente, los ratones exhiben expresión reducida de IgM de ratón o K, y en respuesta a inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos se someten a intercambio de clases y mutación somática para generar IgG? monoclonal humano de alta afinidad (Lonberg, N. y otros (1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-932, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y uso de ratones HuMab, y las modificaciones genómicas probadas por dichos ratones, se describió además en Taylor, L. y o tros (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chem, J. y otros (1993) International Immunology 5:647-656; Tualillon y otros (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 3720-3724; Choi y otros (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. y otros 81993) EMBO J 12: 821-830; Tuaillon y otros (1994) J. Immunol. 152: 2912-2690; Taylor, L. y otros 81994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. y otros (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, el contenido de todas las cuales se incorpora aquí específicamente por referencia en su totalidad. Véase además, Patentes de E.U.A. Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,807 a Surani y otros; Publicaciones de PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todos de Lonber y Kay; y Publicación de PCT nO. WO 01/14424 de Kor an y otros. En otra modalidad, los anticuerpo s humanos de la invención pueden surgir usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en trasngenes y transcromosomas, tales como un ratón que porta un transgene de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana. Dichos ratones, denominados en la presente como "ratones KM™", se describen en detalle en la Publicación de PCT WO 02/43478 a Ishida otros. Aún otros sistemas de animales transgénicos alternativos expresando genes de inmunoglobulina están disponibles en la materia y se pueden usar para originar anticuerpos anti-AMEP de la invención. Por ejemplo, se puede usar un sistema transgénico alternativo denominado como Xenoratón (Abgenix, Inc.); dichos ratones se describieron en, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 a Kucherlapati y otros. Además, los sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la materia y se pueden usar para originar anticuerpos anti-AMEP de la invención, por ejemplo, se pueden usar los ratones que portan un transcromosoma de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana, denominada como "ratones TC"; dichos ratones se describen en Tomizuka y otros 82000) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 97: 722-727. Además, las vacas que portan transcromosomas de cadena pesada y ligra humana se han descrito en la materia (Kuroiwa y otros (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y se pueden usar para originar anticuerpos anti-AMEP de la invención. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar usando métodos de exhibición de fagos para tamizar bibliotecas de gene de inmunoglobulina humana. Dichos métodos de exhibición de datos para aislar anticuerpos humanos se establecen en la materia. Véase por ejemplo: Patentes de E.U.A. NOs. 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 de Ladner y otros; Patentes de E.U-A. Nos. 5,427,908 y 5,580,717 de Dower y otros; Patentes de A..A. Nos. 5,969,108 y 6,172,197 de MacCafferty y otros; y Patentes de E.U.A. Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 y 6,593,081 de Griffiths y otros. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar usando ratones de SCID en los cuales se han reconstitudido las células inmunes de manera u3 se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos al inmunizarse. Dichos ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,476,996 y 5,698,767 de Wilson y otros.

Inmunización de Ratones con Ig Humano Cuando se usan ratones de Ig humano para originar anticuerpos humanos de la invención, dichos ratones pueden inmunizarse con una linea celular que expresan AMEP, tal como la línea celular LNCaP (ATCC CRL-1740) , una preparación purificada o enriquecida de antígeno de AMEP y/o AMEP recombinante, o una proteína de fusión de AMEP, como se describió por Lonberg, N, y otros (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. y otros 81996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y Publicación de PCT WO 98/24884 y WO 01/14424. Preferiblemente, los ratones serán de 6-16 semanas de edad mediante la primera infusión. Por ejemplo, una preparación purificada o recombinante (5-50 µg) de antígeno de AMEP se puede usar para inmunizar intraperitonealmente los ratones de Ig humano. Los procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos de AMEP se describieron en el siguiente Ejemplo 1. La experiencia acumulativa con varios antígenos ha mostrado que los ratones transgénicos responden cuando se inmunizaron intraperitonealmente IP) inmunizados inicialmente con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido por cualquier otra inmunización de IP débil hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante incompleto de Freud. Sin embargo, también se encontró que los adyuvantes diferentes a Freund también son efectivos. Además, se encontró que las células completas en ausencia de adyuvante son altamente inmunogénicos. La respuesta inmune puede monitorearse sobre el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas por sangrados retro-orbitales. El plasma puede tamizarse por ELISA (como se describió más adelante) , y los ratones con suficientes titulaciones de inmunoglobulina humana anti-AMEP se pueden usar para fusiones. Los ratones pueden reforzarse intravenosamente con antígeno 3 días antes de sacrificar y remover el bazo. Se espera que puedan ser necesarias 2-3 fusiones para cada inmunización. Entre 6 y 24 ratones se inmunizan típicamente para cada antígeno. Usualmente se usan las cepas de HCo7 y HCol2. Además, los transgenes HCo7 y HCol2 pueden desarrollarse juntos en un solo ratón teniendo dos transgenes de cadena pesada humana diferente (HCo7/Hcol2) . Alternativa o adicionalmente, se puede usar la cepa de ratón KM™.

Generación de Hibridomas que producen Anticuerpos Monoclonales Humanos de la Invención Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención, esplenocitos y/o células de nodo linfático de ratones inmunizados pueden aislarse y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como línea celular de mieloma. Los hibridomas resultantes pueden tamizarse para la producción de anticuerpos específicos para antígenos. Por ejemplo, suspensiones de células solas de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados pueden fusionarse a un sexto del número de células de mieloma de ratón no secretor de P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% PEG. Las células se sembraron en placas de aproximadamente 2 x 105 en placa de microtitulación de fondo, seguido por una incubación de dos semanas en medio selectivo conteniendo Suero Clone fetales 20%, 18% medio condicionado "653", 5% origen (IGEN), 4 mM de L-glutamina, lmM de piruvato de sodio, 5mM HEPES, 0.055 mM 32-mercaptoetanol, 50 unidades/ (ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml gentamicina y IX HAT (Sigma; el HAT se agrega 24 horas después de la fusión) . Después de aproximadamente dos semanas, las células pueden cultivarse en medio en el cual se reemplaza HAT con HT . Los pozos individuales pueden tamizarse por ELISA para anticuerpos IgM ye IgG monoclonales humanos. Una vez que ocurre el desarrollo de hibridoma extensivo, el medio puede observarse usualmente después de 10-14 días. Se pueden volver a sembrar en placas los hibridomas de secreción de anticuerpo, volverse a tamizar, y si aún es positivo para IgG humano, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse por lo menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables entonces pueden cultivarse in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejidos para caracterización. Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, los hibridomas seleccionados pueden desarrollarse en un matras de agitación de dos litros para purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). El IgG eluído puede revisarse por electroforesis de gel y cromatografía de líquidos de alto rendimiento para asegurar pureza. La solución reguladora puede intercambiarse en PBS y la concentración se puede determinar por OD 280 usando coeficiente de extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden tomarse por alícuota y almacenarse a -80°C.

Generación de Transfectomas que Producen Anticuerpos monoclonales de la Invención Los anticuerpos de la invención también se pueden producir en un transfector de células huésped cuando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como es bien conocido en la materia (v.gr. Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, El ADN que codifica cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa, pueden obtenerse por técnicas de biología molecular normal (v.gr., amplificación de RCP o clonación de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y el ADN puede insertarse en vectores de expresión de manera que los genes se ligaron operativamente a secuencias de control transcripcional y traslacional. En este contexto, el término "ligado operativamente" se pretende que signifique que un gen de anticuerpo se liga en un vector de manera que las secuencias de control transcripcional y traslacional dentro del vector sirve para la función pretendida de regular la transcripción y traslación del gen de anticuerpos. El vector de expresión y secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de cadena aligera de anticuerpos y el gen de cadenas pesada de anticuerpos puede insertarse en el vector separado, o más normalmente, ambos genes se insertaron en el vector de expresión. Los genes de anticuerpos se insertaron en el vector de expresión por métodos normales (v.gr., ligadura de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen de anticuerpos y vector, o ligadura extrema roma si no están presentes los sitios de restricción) . Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente se puede usar para crear genes de anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpos insertándolos en vectores de expresión que ya codifica regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera del isotipo deseado de manera que el segmento de VH se liga operativamente a los segmentos de CH dentro del vector y el segmento de V? se liga operativamente al segmento de CL dentro del vector. Adicionalmente, o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de manera que el péptido de señal se liga en el marco a la terminación amino del gen de cadena de anticuerpos. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína sin inmunoglobulina) . Además de los genes de cadena de anticuerpos, los vectores de expresión recombinantes de la invención porta secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpos en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" se pretende que incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (v.gr., señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traslación de los genes de cadena de anticuerpos. Dichas secuencias reguladoras se descrien, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Se apreciará por los expertos en la materia que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de dichos factores como la elección de la célula huésped que será transformada, el nivel de expresión de proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión de células huésped de mamíferos incluyen elementos virales que dirigen los niveles superiores de expresión de proteínas en células de mamíferos, dichos promotores y/o mejoradores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus 40 de Simio (SV40), adenovirus, (v.gr, el promotor tardía principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Alternativamente, se pueden usar secuencias reguladoras no virales, de manera que el promotor de ubiquitina o promotor de ß-globulina. Aún, además, los elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor de SR , que contiene secuencias de promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga de virus de leucemia de células T humanas tipo 1 (Takebe, Y. y otros (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472). Además de los genes de cadena de anticuerpos y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, de manera que las secuencias pueden regular la replicación del vector en células huésped (v.gr., orígenes de replicación) y genes de marcador seleccionable. El gen marcado seleccionable facilita la selección de células huésped en los cuales el vector se ha introducido (véase, v.gr., Patentes de E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,1789,017 todos por Axel y otros). Por ejemplo, normalmente el gen de marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (ara usarse en las células huésped de DHFR con selección/amplificación de metotrexato) y el gen nuevo (para selección G418) . Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula huésped por técnicas normales. Las diferentes formas del término "transfección" se pretende que abarquen una amplia variedad de técnicas usadas comúnmente para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, v.gr., electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células huésped procarióticas o eucarióticas la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, y más preferiblemente células de mamíferos particulares, tienen más probabilidad que las células procarioticas para ensamblar y secretar un anticuerpo doblado apropiadamente e inmunológicamente activo. La expresión procariótica de genes de anticuerpos que se han reportado que son inefectivos para la producción de rendimientos superiores de anticuerpo activo (Boss, M.A. y Wood, C.R. (1985) Immunology Today 6: 12-13) .

Las células huésped de mamíferos preferidos para expresar los anticuerpo recombinantes de la invención incluyen Ovario de Hámster Chino (células de CHO) (incluyendo células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220, usado con un marcador seleccionable de DHFR, v.gr., como se describió en R.J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma de NSO, células de COS y células SP2. En particular, para usarse con células de mieloma de NSO, las células COS y células SP2. En particular, para usarse con células de mieloma de NSO, otro sistema de expresión preferida es el sistema de expresión de genes de GS descrito en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338,841. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican genes de anticuerpos se introducen en células huésped de mamíferos, se producen los anticuerpos cultivando las células huésped durante un tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped, o más preferiblemente, secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se desarrollan las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteína normal.

Caracterización de Unión de Anticuerpos a Antígeno Los anticuerpos de la invención pueden probarse para unirse a AMEP por ejemplo, por citometría de flujo. En resumen, las células de LNCaP preferiblemente se recuperan recientemente de matraces de cultivo de tejido y se preparara una sola suspensión celular. Las suspensiones celulares de LNCaP son teñidas con anticuerpo primario directamente o después de la fijación con 1% de paraformaldehído en PBS. Aproximadamente un millón de células se resuspendieron en PBS conteniendo 0.5% BSA y 50-200 µg/ml de anticuerpo primario y se incubó en hielo durante 30minutos. Las células se lavaron dos veces con PBS conteniendo 0.1% BSA, 0.01% de NaN3, se resuspendió en 100 µl de IgG anti-humano de cabra conjugado de FITC diluido al 1:100 (Jacson ImmunoResearch, West Grove, PA) , y se incubó enhielo durante 30 minutos adicionales, Las células de nuevo se lavaron dos veces y se resuspendieron en 0.5 ml de solución reguladora de lavado y se analizó para tinción fluorescente de un citómetro de FACSCalibur (Becton-Dichinson, San José, CA) . Alternativamente, los anticuerpos de la invención pueden probarse para unirse a AMEP por ELISa. En resumen, las placas de microtitulación se revistieron con AMEP purificado a 0.25 µg/ml en PBS, y luego se bloqueó con 5% de albúmina de suero de bovino en PBS. Las diluciones de anticuerpo (v.gr., diluciones de plasma de ratones inmunizados con AMEP) se agregaron cada pozo y se incubaron durante 1-2 horas a 37°C.

Después de lavar, las placas se desarrollaron con sustrato de pNPP (1 mg/ml), y se analizaron a OD de 405-650. Preferiblemente, los ratones que desarrollan las titulaciones superiores puede usarse para fusiones. Un análisis de ELISA como se describió antes puede usarse para tamizar hibridomas que muestran reactividad positiva con inmunógeno de AMEP. Los hibridomas que se unen con alta avidez a AMEP se subclonaron y caracterizaron adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células madre (por ELISA) , pueden elegirse para formar un banco de células 5-10 vial almacenado a -140°C, y para purificación de anticuerpos. Para purificar anticuerpos anti-AMEP, hibridomas seleccionados pueden desarrollarse en matraces con agitador de dos litros para purificación de anticuerpos monoclonal. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ) . IgG eluido puede revisarse por electroforesis de gel y cromatografia de líquidos de alto rendimiento para asegurar la pureza. La solución reguladora puede intercambiarse en PBS y la concentración puede determinarse por OD2so usando coeficiente de extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden tomarse por alícuota y almacenarse a -80°C.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-AMEP se unen a epitopes únicos, cada anticuerpo pueden biotinilarse usando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL) . Los estudios de competencia usando anticuerpos monoclonales no marcados por anticuerpos monoclonales biotinilados pueden realizarse usando placas de Elisa revestidas con AMEP como se describió antes. La unión de mAb biotinilada puede detectarse con una sonda de fosfatasa alcalina de estreptavidina. Alternativamente, los estudios de competencia pueden realizarse usando anticuerpo radiomarcado y los anticuerpos de competencia no marcados pueden detectarse en un análisis Scatchard, como se describió además en los siguientes Ejemplos. Para determinar el isotipo de anticuerpo purificados, el isotipo ELISA puede realizarse usando reactivos especificados para anticuerpos de un isotipo particular Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, los pozos sde placas de microtitulación pueden revestirse con 1 µg/ml de inmunoglobulina anti-humana durante la noche a 4°C. Después de bloqu4ear con BSA 1%, las palcas se hacen reaccionar con 1 µg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de prueba o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante una a dos horas. Los pozos pueden hacerse reaccionar con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específica para IgGl humano o IgM humano. Las placas se desarrollaron y analizaron como se describió antes. Los IgG humanos anti-AMEP además pueden probarse para reactividad con antígeno AMEP por Inmunofluorescencia Western. En resumen, AMEP puede prepararse y someterse a eletroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato dodecilo de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, se bloquearon con suero de becerro fetal al 10% y se probaron con los anticuerpo monoclonales que serán probados. La unión de IgG humano puede detectarse usando fosfatas alcalina de IgG antihumana y desarrollado con tabletas de sustrato de BCIP/NBT (Sigma Chem., Co . , St. Louis, Mo . ) Inmunoconjugados En otro aspecto, la presente invención caracteriza un anticuerpo anti-AMEP, o un fragmento del mismo, conjugado a una poción terapéutica, tal como citotoxina, un fármaco (v.gr., un inmunosupresor) o una radiotoxina. Dichos conjugados se denominan en la presente como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan como "inmunotoxinas" . Una citotoxina o agente citotoxico incluye cualquier agente que es perjudicial para células (v.gr., asesinas). Ejemplos incluyen taxol, citocalasin B, gramicidina D, brumuro de etidinio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubidina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoide procaína, tetracaina, lidocaina, propanollo, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (v.gr., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina) , agentes de alquilación (v.gr., mecloretamina, tioepa-clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) ciclotosfamida, busulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cistplatina) , antraciclinas (v.gr., daunorubicina (anteriormente daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (v.gr., dactinomicina (anteriormente actinomicina9, bleomicina, mitramicina, yantramicina (AmC) ) , y agentes antimitóticos (v.gr., vincritina y vinblastina). Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que pueden conjugase a un anticuerpo de la invención incluyen duocramicinas, caliqueamicinas, maitansinas y auristatinas, y derivados de los mismos. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo calquemicina es comercialmente disponible (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst) .

Las citotoxinas pueden conjugarse a anticuerpos de la invención usando tecnología de ligadura disponible en la materia. Ejemplos de tipos de ligadura que se han usado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, peor no están limitados a, hidrazonas, tioéteres, estrés, disulfuros y ligaduras que contiene péptidos. Se puede elegir una ligadura que es, por ejemplo, susceptible a la separación por pH bajo dentro del compartimiento lisosomal, por ejemplo, es susceptible a la separación por pH bajo dentro del compartimiento lisosomal o susceptible a separación por proteasas, tales como proteasas experesadas preferencialmente un tejido tumoral tal como catepsinas (v.gr., catepsinas B, C, D) . Para discusión adicional de los tipos de citotoxinas, las ligaduras y métodos para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos, véase también Saito, G. y otros (2003) Adv. Drug. Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail, P.A. y otros (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Alien, T.M. (2002) Nat. Rev. Cáncer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R.J. (2002) Curr. Opin. Inestig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. y Springer C.J. (2001) Adv. Drug. Delib. Rev. 53:247-264. Los anticuerpos de la presente invención pueden conjugarse a un isótopo radioactivo para generar radiofarmacéuticos citotoxicos, también denominados como radioinmuno conjugados. Ejemplos de isótopos radioactivos que pueden conjugase a anticuerpos para usarse diagnóstica o terapéuticamente incluye, pero no están limitadas a, yodo131, yodo125, indio111, itrio90 y lutecio177. El método para preparar radioinmuno conjugados se estabilizan en la materia. Ejemplos de radioinmuno conjugados están comercialmente disponibles, incluyendo Zevalin™ (IDEC Pharamaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pahramceuticals) , y métodos similares pueden usarse para preparara radioinmuno-conjugados usando los anticuerpos de la invención. Los conjugados de anticuerpos de la invención se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada, y la porción de fármaco no se deberá interpretar como limitada a agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o fragmento activo del mismo, tal como abrina, ricina A, exotoxinas de pseudomonas, o toxina de difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral o interferon-?; o, los modificadores de respuesta biológica tal como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interluecina ("IL-6"), el factor de estimulación de colonia de macrófagos de granulocitos ("GM-CSF"), factor de estimulación de colonia de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento. Las técnicas para conjugar dicha porción terapéutica a anticuerpos son bien conocidos, véase, v.gr., Arnon y otros, "Monolconal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld y otros (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y otros, "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a. Ed.), Robinson y otros (eds.) págs. 623-53 (MarcelDekker, Incl. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Aplications, Pinchera y otros (esd.) págs 475-506 (1985) ; "Analysis, Results, An Future Prospective of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies por Cáncer dEtection And Therapy, Balwin y otros (eds.), págs 303-16 (Academic Press 1985), yu Thorpe, y otros, "The Preparation and Cytotoxic Properties of Antiboy-Toxin Conujugates", Im unol. Ref. 62:119-58 (1982).

Moléculas Biespecíficas En otro aspecto, la presente invención caracteriza moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-AMEP, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o porciones de unión de antígeno del mismo, se puede derivar o ligarse a otra molécula funcional, v.gr., otro péptido o proteína (v.gr., otro anticuerpo o ligando para un receptor) con el fin de generar una molécula biespecífica que se una por lo menos a dos sitios de unión diferentes o moléculas dirigidas al sitio. El anticuerpo de la invención de hecho, se puede derivar o ligar a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos diferentes sitios de unión y/o moléculas blanco, dichas moléculas multiespecíficas también se pretende que sean abarcadas por el término "molécula biespecífica" como se usa en la presente. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede estar ligado funcionalmente a (v.gr., por acoplamiento químico, fusión genético, asociación no covalente o de otra manera) a una o más moléculas de unión, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o imitador de unión, de manera que resulta una molécula biespecífica. Consecuentemente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden por lo menos una primera especificidad de unión para AMEP y una segunda especificidad de unión para un segundo epítope blanco. En una modalidad particular de la invención, el segundo epítope blando es un receptor de Fc, v.gr., Fc?R humano (CD64) o un receptor de Fca (CD89) . Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas capaces de unirse a las FC?R y VcaR que expresan células efectoras (v.gr., monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN) ) y a células blanco que expresan AMEP. Estas moléculas AMEP blanco biespecíficas que expresan células efectoras y actividades celulares efectoras mediadas por receptor FC de accionamiento, tales como fagocitosis de un AMEP que expresa células, citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA) , libración de citoquina, o generación de anión de superóxido. En una modalidad de la invención en la cual la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula además puede incluir una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-AMEP. En una modalidad, la tercera especificidad de unión es una porción de factor anti-aumento (FA) , v.gr., una molécula que se une a una proteína superficial implicada en actividad citotóxica y asi incrementa la respuesta inmune contra la célula blanco. La "porción de factor anti-aumento" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molécula dada, v.gr., un antígeno o un receptor, y por lo tanto da como resultado un aumento al efecto de las determinantes de unión para el receptor de Fc o antígeno de célula blanco. La "porción de factor antiaumento" puede unirse a un receptor de Fc o a un antígeno de célula blanco. Alternativamente, la porción de factor anti- aumento puede unirse a una entidad que es diferente de la entidad a la cual se unen la primera y segunda especificidades de unión. Por ejemplo, la porción de factor anti-aumento puede unirse a una célula T citotóxica (v.gr., vía CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que da como resultado una respuesta inmune contra la célula blanco) . En una modalidad, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como una especificidad de unión por lo menos un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, v.gr., un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de una sola cadena. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o una construcción de una sola cadena como se describió en Ladner y otros. Patente de E.U.A. No. 4,946,778, el contenido de la cual se incorpora expresamente por referencia. En una modalidad, la especificidad de unión para un receptor de Fc? se provee por un anticuerpo monoclonal, la unión del cual no se bloquea por inmunoglobulina G humana (IgG). Como se usa en la presente, el término "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena ? localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor transmembrana o soluble que se agrupan en tres clases de receptores de Fc?: Fc?RI (CD64), FC?RII (CD32), y Fc?RIII (CD16). En una modalidad preferida, el receptor de Fc? un Fc?RI de alta afinidad humana. L Fc?Rl humano es una molécula de 72 kDa, que muestra alta afinidad para IgG monomérico (108-109 M"1) . La producción y caracterización de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fc? preferidos se describen por Fanger y otros, en la Publicación de PCT WO 88/00052 y en la Patente de E.U.A. No. 4,954,617, las enseñanzas de la cual se incorporan completamente por referencia en la presente. Estos anticuerpos se unen a un epítope de Fc?Rl, Fc?RlI o Fc?Rl11 en un sitio que es diferente del sitio de unión de Fc? del receptor y, por lo tanto, su unión no se bloquea sustancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos anti-Fc?RI específicos útiles en esta invención son mAb 22, mAb 32, mAb44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce una mAb 32 está disponible de la Colección de Tipo de Cultivos Americana, Acceso de ATCC NO. HB9469. En otras modalidades, el anticuerpo receptor anti-Fc? es una forma humanizada de anticuerpo monoclonal 22 (H22) . La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano, F.F. y otros (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y Publicación de PCT WO 94/10332. La línea celular que produce el anticuerpo H22 se depositó en la Colección de Tipo de Cultivo Americana bajo la designación HA022CL1 y tiene el no. de acceso CRL 11177.

En aún otras modalidades preferidas, la especificidad de unión para un receptor de Fc se provee por un anticuerpo que se une a un receptor de IgA humano, v.gr., un receptor Fc-alfa (FcaRl (CD89) ) , la unión del cual preferiblemente no se bloquea por inmunoglobulina A humana (IgA) . El término "receptor IgA" se pretende que incluye el producto del gen de un gen a (FcaRl) localizado en el cromosoma 19. Este gen se conoce que codifica varias isoformas de transmembrana divididas alternativamente de 55 a 110 kDa. FcaRl (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinófilicos y neutrofílicos, pero no en poblaciones de células no efectoras. FcaRl tiene afinidad media (*5xl07 M"1) para IgAl y IgA2, que se incrementa por la exposición a citocinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, J.-C. y otros (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-444). Cuatro anticuerpos monoclonales específicos para FcaRl, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen afuera del domino de unión del ligando IgA, han sido descritos (Monteiro, R.C. y otros (1992) J. Immunol. 148: 1764). FcaRl y Fc?Rl son receptores accionadores preferidos para usarse ne las moléculas biespecíficas de la invención debido a que (1) se expresan principalmente en célula efectoras inmunes, v.gr., monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas; (2) expresados a altos niveles (v.gr., 5,000-100,000 por célula), (3) mediadores de actividades citotoxicas (v.gr., CCDA, fagocitosis); (4) presentación de antígeno mejorada media de antígenos, incluyendo autoantígenos, dirigidos a ellos. Mientras que se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden empelarse en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos de murinos, quiméricos y monoclonales humanizados . Las moléculas biespecíficas de la presente invención se pueden preparar conjugando las especificidades de unión constituyentes, v.gr., las especificidades de unión anti-FCR y antí-AMEP, usando métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecifica puede generarse por separado y luego conjugarse a otra. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una variedad de acoplamiento de agentes de entrelazamiento para conjugación covalente. Ejemplos de agentes de entrelazamiento incluyen proteína A, cardbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA) , 5, 5' -ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) , ofenilendimaleimida (OPDM) , N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) y 4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase v.gr., Karpovsky y otros 81984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA y otros 81985) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 8648). Otros métodos incluyen aquellso descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan y otros (1985) Science 229: 81-83) y Glennie y otros (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co . (Rockford, IL) : Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, pueden conjugarse vía unión de sulfhidrilo de las regiones de gozne de terminación C de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región de articulación se modifica para contener un número impar de residuos de sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugación. Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es un mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x proteína de fusión Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de una sola cadena que comprende un anticuerpo de una sola cadena y una determinante de unión, o una molécula biespecifica de una sola cadena que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender por lo menos dos moléculas de una sola cadena. Los métodos para preparar molécula biespecíficas se describen por ejemplo en la Patente de E.U.A. Número 5,260,203; Patente de E.U.A. Número 5,455,030; Patente de E.U.A. Número 4,881,175; Patente de E.U.A. Número 5,132,405; Patente de E.U.A. Número 5,091,5113; Patente de E.U.A. Número 5,476,786; Patente de E.U.A. Número 5,013,653; Patente de E.U.A. Número 5,258,498; y Patente de E.U.A. Número 5, 482, 858. La unión de las moléculas biespecíficas de sus blancos específicos pueden confirmarse por ejemplo, por análisis inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) , radioinmunoanálisis (RÍA) . Análisis de FACS, bioanálisis (v.gr., inhibición de crecimiento), o análisis de inmunotransferencia Western. Cada uno de estoa análisis detecta generalmente la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo marcado (v.gr. un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de anticuerpos de FCR pueden detectarse usando v.gr., un anticuerpo ligado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente a los complejos de anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden detectarse usando cualquiera de una variedad de otros inmunoanálisis. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radioactivamente y usarse en un radioinmunoanálisis (RÍA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo, 1986, que se incorpora aquí por referencia) . El isótopo radioactivo puede detectarse por dichos medios como el uso de un contador ? o un contador de centelleo o por autoradiografía.

Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención provee una composición, v.gr., una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o porciones de unión de antígeno del mismo, de la presente invención, formulado junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de (v.gr., dos o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecíficos) que se une a diferentes epitopes en el antígeno blanco o que tienen actividades complementarias . Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinarse con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-AMEP de al presente invención combinada con por lo menos otro agente anti-inflamatorio o inmunosupresor. Ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden usar en terapia de combinación se describen en mayor detalle más delante en la sección en usos de los anticuerpos de la invención. Como se usa en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y otros los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (v.gr., por inyección o infusión) . Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado, o molécula biespecífica, puede revestirse en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto. Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto madre y no imparte ningún efecto toxicológico indeseado (véase v.gr., Berge, S.M., y otros (1977) J. Pharm Scie. 66: 1-19).

Ejemplos de dicha sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono y dicarboxílico alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de base incluyen aquellos derivados de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares., así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N, N' -dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares. Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir u antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteina, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelatadores de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamina tetracético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares. Ejemplos de vehículos acuoso y no acuoso adecuados que pueden empelarse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) , y mezclas adecuados de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como elcitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y por el uso de gantes tensioactivos. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de presencia de microorganismos puede asegurarse por procedimientos de esterilización, supra, y por la inclusión de varios angentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sorbico, y similares. También puede ser conveniente incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede realizarse por la inclusión de agentes que retardan la absorción tal como monoestearato de aluminio y gelatina. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la materia. Excepto a cuanto a cualquier medio convencional o agente sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. Suplementariamente, los compuestos activos también pueden incorporarse en las composiciones . Normalmente las composiciones terapéuticas deben ser estériles y estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento. La composición se puede formar como una solución, microemulsión, liposoma, o otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) , y mezclas adecuadas del mismo. La fluidse apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un revestimiento que es una lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensioactivos. En muchos casos, serpa preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en al composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados antes, según se requiera, seguido por microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de estos enumerados antes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y secado a congelación (liofilización) que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución filtrada previamente estéril del mismo . La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una sola forma de dosis variará dependiendo del sujeto que está siendo tratado y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una sola forma de dosis generalmente será la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, fuera del cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0.01 por ciento a alrededor de noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 0.1 por ciento a alrededor de 70 por ciento, más preferiblemente de aproximadamente 1 por ciento a alrededor de 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los regímenes de dosis se ajustan para proveer la respuesta óptima deseada (v.gr., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas con el tiempo o la dosis puede reducirse proporcionalmente o incrementarse como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosis para facilidad de administración y uniformidad de dosis. La forma unitaria de dosis como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitaria para los sujetos que serán tratados, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosis de la invención se dictan por y dependen directamente de (a) las caracteristicas únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que será logrado y(b) las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Para la administración del anticuerpo, la dosis varía de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más usualmente 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal huésped. Por ejemplo, las-dosis pueden ser de 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro de la escala de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ilustrativo abarca la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses, o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosis preferidos para un anticuerpo de anti-AMEP de la invención incluye 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal vía administración intravenosa, siendo dado el anticuerpo usando uno de los siguientes programas: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, luego cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas. En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión se pueden administrar simultáneamente, el cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado cae dentro de los rangos indicados. El anticuerpo usualmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosis únicas puede ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anual. Los intervalos también puede ser irregulares como se indica midiendo los niveles sanguíneos de anticuerpo al antígeno blanco en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo de plasma de aproximadamente 1-1000 µg/ml en algunos métodos aproximadamente 25-300 µg/ml. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere administración menos frecuente. La dosis y frecuencia varía dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la mida media más larga, seguido por anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos no humanos. La dosis y frecuencia de administración puede variar dependiendo si el tratamiento es profiláctico o terapéuticos. En aplicaciones profilácticas, una dosis relativamente baja se administra a intervalos relativamente son frecuentes durante largo tiempo. Dichos pacientes continúan recibiendo tratamiento para el reto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos se requiera algunas veces hasta que se reduce la progresión de la enfermedad o se termina, y preferiblemente hasta que el paciente muestra disminución parcial o completa de síntomas de enfermedad. Después, se le puede administrar al paciente un régimen profiláctico. Los niveles de dosis actuales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar de manera que se obtiene una cantidad del ingrediente activo que es efectivo para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxico para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o del éster, sal o amida de las mismas, la ruta de administración, el tiempo de administración, el régimen de expresión del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que se está tratando, y los factores similares bien conocidos en la técnica médica. Una "dosis terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-AMEP de la invención da como resultado preferiblemente una disminución en severidad de síntomas de enfermedad, un incremento en frecuencia y duración de los periodos libres de síntoma s de la enfermedad, o una prevención de daño y incapacidad debido a la aflicción de enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de AMEP + tumores, una "dosis terapéuticamente efectiva" inhibe preferiblemente el crecimiento celular o crecimiento tumoral por lo menos por aproximadamente 20%, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 40%, aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 60%, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 80% en relación a los sujetos no tratados. Las capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un sistema de modelo animal que predice la eficacia en los tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto de inhibir, dicha inhibición es in vitro por análisis conocidos para quien es experto. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o de alguna manera disminuir los síntomas en un sujeto. Aleguen expelo en la materia podría poder determinar dicha cantidades con base en dichos factores como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o ruta de administración seleccionada. Una composición de la presente invención puede administrarse vía uno o más rutas de administración usando uno o más de una variedad de métodos conocidos en al materia. Como se apreciará por el experto, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administración preferidas para anticuerpos de la invención incluyen rutas de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal y otras, por ejemplo, por inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se usa en la presente significa modos de administración diferentes a la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqujeal, subcutánea, subcuticular, intraarticualr, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural ye intraesternal e infusión. Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede administrarse vía una ruta no parenteral, tal como una ruta tópica epidérmica mucosal de administración, por ejemplo, inrtranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente o tópicamente. Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parche transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocomaptibles biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, polioroesteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones se patentaron o generalmente son conocidas para los expertos en la materia. Véase, v.gr., Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la materia. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmico sin agujas, tales como los dispositivos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; o 4,596,556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente invención incluyen: Patente de E.U.A. No. 4,487,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; o 4,596,556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente invención incluyen: Patente de E.U.A. NO. 4,487,603, que describe una bomba de micro-infusión implantable para dispensar medicamento a un régimen controlado; Patente de E.U.A. No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Patente de E.U.A. No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamento a un régimen de infusión preciso; Patentes de E.U.A. No. 4,447,224, que describe una aparato de infucsidón implantable de fujo variable para suministro continuo de fármaco; Patente de E.U.A. No. 4,439,196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y Patente de E.U.A. No. 4,475,196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan aquí por referencia. Muchos otros implantes, sistemas de suministro y módulos se conocen por loes expertos en la materia. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención se pueden formular para asegurar distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera de sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención cruzan la BBB (si se desea) , pueden formularse, por ejemplo, en lisosomas. Para métodos de manufactura de liposomas, véase, v.gr., Patentes de E.U.A. 4,522,811; 5,374,548 y 5,399,331. Los lisosomas pueden comprender una o más porciones que se transportan selectivamente en célula específicas u órganos, mejorando así el suministro de fármaco dirigido (véase, v.gr., V.V. Ranade (2989) J. Clin. Farmacol. 29:685). Las porciones dirigidas ilustrativas incluyen folato o biotina (véase, vgr., Patnte de E.U.A. 5,416,016 de Low y otros9; amnosidos (Umezawa uyh otros (1988) Biochem. Biophys. Re. Commun. 153:1038); anticuerpos (P.G. Bloeman y otros (1995) FEBS Lett. 357: 140: M. Owais y otros (995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180) ; receptor de proteína A de agente tensioactivo (Briscoe y otros 81995) Am. J. Physiol. 1233:124); pl20 (Schereier y otros 81994) J. Bol. Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen 81994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos y Métodos de la invención Los anticuerpos, composiciones de anticuerpos y métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades diagnósticas y terapéuticas in vitro e in vivo que implican el diagnóstico y tratamiento de trastornos que implican la expresión de AMEP. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, v.gr., in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, v.gr., in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar una variedad de trastornos. Como se usa en la presente, el término "sujeto" se pretende que incluye animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, v.gr., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, cerdos, pollos, aves, anfibios, y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos asociados con expresión de AMEP. Cuando los anticuerpos para AMEP se administran junto con otros agente, los dos se pueden administrar en cualquier orden o simultáneamente . Las rutas adecuadas para administrar las composiciones de anticuerpo (v.gr., anticuerpo o inmunoconjugado) de la invención in vivo e in vitro, son bien conocidas en la materia y se pueden seleccionar por quienes tienen experiencia ordinaria. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos pueden administrarse por inyección (v.gr., intravenosa o subcutánea) . Las dosis adecuadas de la moléculas usadas dependerá de la edad y peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpo. En una modalidad, los anticuerpos de la invención se pueden probar inicialmente para unir la actividad asociada con el uso terapéutico o diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden probarse usando ELICA y análisis de citometría de flujo. Además, la actividad asociada con uso terapéutico o diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden probarse usando ELISA y análisis de citometría de flujo. Además, la actividad de estas moléculas para accionar por lo menos una actividad de células efectoras mediadas por el efector, incluyendo inhibir el crecimiento y/o matar células que expresan AMEP se pueden analizar. Los protocolos para analizar CCDA mediado por células efectoras son como se describe en los siguientes Ejemplos.

A. Métodos de Detección En una modalidad, los anticuerpos de la invención pueden usarse para detectar niveles de AMEP, o niveles de células que contienen AMEP en su superficie de membrana, dichos niveles pueden ligarse a ciertos síntomas de enfermedades . En una modalidad particular, la invención provee métodos para detectar la presencia de AMEP en una muestra, o midiendo la cantidad de AMEP en la superficie de porción de unión de antígeno del mismo, que específicamente se une a AMEP, bajo condiciones para permitir la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y AMEP. La formación de un complejo se detecta luego, en donde una formación de complejo de diferencia entre la muestra comparada con la muestra de control indica la presencia de AMEP en la muestra. Por ejemplo, los métodos de detección normales, bien conocidos en la materia, tal como ELISA y análisis de citometría de flujo, pueden realizarse usando las composiciones de la invención. Consecuentemente, en un aspecto, la invención provee además métodos para detectar la presencia de AMEP (v.gr., AMEP humano) en una muestra, o midiendo la cantidad de AMEP, comprendiendo poner en contacto la muestra y una muestra de control con un anticuerpo de la invención o una porción de unión de antígeno del mismo, que se une específicamente a AMEP, bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y AMEP. La formación de un complejo se detecta luego, en donde una diferencia en formación de complejo entre la muestra comparada con la muestra de control indica la presencia de AMEP en la muestra. Las composiciones de la invención también se pueden usar para dirigir las células que expresan AMEP, por ejemplo, para marcar dichas células. Para dicho uso, el agente de unión puede ligarse a una molécula que puede detectarse. Por lo tanto, la invención provee métodos para localizar células ex vivo o in vitro que expresan AMEP. La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, un raidioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima.

B. Inhibición de Crecimiento de AMEP + Células Los anticuerpos pueden usarse para inhibir el crecimiento de células que expresan AMEP que, a su vez, pueden ligarse a la prevención o disminución de dichos síntomas de enfermedad asociados con la expresión de AMEP. Las diferencias en la expresión de AMEP durante un estado de enfermedad comparado con un estado sin enfermedad puede determinarse por el contacto de una muestra de prueba de un sujeto que sufre de la enfermedad y una muestra de control con el anticuerpo anti-AMEP bajo condiciones qu4e permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y AMEP. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y AMEP se detectan y comparan en la muestra y el control. Por ejemplo, los anticuerpos pueden usarse para producir in vivo o in vitro una o más de las siguientes actividades biológicas: para inhibir el crecimiento de y/o matar una célula que expresa AMEP, para mediar fagocitosis o CCDA de una célula que expresa AMEP en presencia de células efectoras humanas, para inhibir el derrame de AMEP soluble. Como se trató en la presente, los anticuerpos de la invención exhiben actividad de CCDA mejorada comparado con la forma fucosilada del anticuerpo. Consecuentemente, en otro aspecto, la invención provee un método para inhibir el crecimiento de células de AMEP+ que comprende el contacto de dicha células con un anticuerpo anti-AMEP bajo condiciones suficientes para inducir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (CCDA) de dicha células. Las células, por ejemplo, pueden ser células tumorales en una modalidad preferida, el anticuerpo anti-AMEP es un anticuerpo humano. En una modalidad, los anticuerpo o porciones de unión de los mismos, de la presente invención pueden usarse para modular niveles de AMEP en células blanco, de manera que se coronan o eliminan receptores en la superficie celular. Las mezclas de anticuerpos receptores anti-Fc también se pueden usar para este fin. Las células efectoras específicas para el blanco, v.gr., células efectoras ligadas a composiciones de la invención se pueden usar como agentes terapéuticos. Las células efectoras para dirigir al blanco pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células que portan receptor de IgG o IgA. Si se desea, las células efectoras pueden obtenerse del sujeto que será tratado. Las células efectoras específicas para blanco, pueden administrarse como una suspensión de células en una solución fisiológicamente ace4ptable. El número de células administradas puede ser en el orden de 108-109 pero variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener localización en la célula blanco, v.gr., una célula tumoral que expresa AMEP, y efectúa la muerte de células por ejemplo, por fagocitosis. Las rutas de administración también puede variar. La terapia con células efectoras específicas para blanco pueden realizarse junto con otras técnicas para remoción de células dirigidas al blanco. Por ejemplo, la terapia antitumoral usando las composiciones de la invención y/o células efectoras armadas con estas composiciones pueden usarse junto con quimioterapia. Adicionalmente, la inmunoterapia de combinación pueden usarse para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia rechazo de células tumorales.

C. Uso de Inmunoconjugados y Terapia de Combinación En una modalidad, los inmunoconjugados de la invención se pueden usar para dirigir compuestos (v.gr., agentes terapéuticos, etiquetas, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) a células que tiene moléculas de superficie celular de AMEP ligando dichos compuestos al anticuerpo. Por lo tanto, la invención también provee métodos para localizar células ex vivo o in vitro expresando AMEP (v.gr., con una etiqueta detectable, tal como un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima) . Alternativamente, los inmunoconjugados se pueden usar para matar células que tiene receptores de superficie celular de AMEP dirigiendo al blanco las citotoxinas o radiotoxinas a AMEP, tal como células tumorales expresan AMEP para eliminar así la célula tumoral. En otras modalidades, el sujeto puede tratarse adicionalmente con un agente que modula, v.gr., mejora o inhibe, la expresión o actividad de Fc? o receptores Fc? por ejemplo, tratando el sujeto con una citoquina. Las citoquinas preferidas para administración durante el tratamiento incluyen factor de estimulación de colonias de granulositos (G-CSF) , factor de estimulación de colonias de macrófagos-granulositos (G-CSF), interferon-? (IFN-?), y factor de necrosis tumoral (TNF) . En otra modalidad, los pacientes tratados con composiciones de anticuerpos de la invención pueden administrarse adicionalmente (antes de, simultáneamente con, o después de administración de un anticuerpo de la invención) con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que mejora o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos humanos. El anticuerpo puede ligarse al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse separado del agente. En el último caso (administración separada) el anticuerpo puede administrarse con otras terapias conocidas, v.gr., una terapia contra cáncer, v.gr., radiación. Dichos agentes terapéuticos incluye, entre otros, agentes antineoplásticos tales como doxorubicina (adriamicina) , sulfato de cisplatina bleomicina, carmustina, clorambucilo, y ciclofosfamida hidroxiurea que, por ellos mismos, solo son efectivos a niveles que son tóxicos o subtóxicos a un paciente. La cisplatina se administra intravenosamente como una dosis de 100 mg/ml una vez cada cuatro semanas y adriamicina se administra intravenosamente como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de los anticuerpos anti-AMEP o fragmentos de unión de antígeno del mismo, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos provee dos agentes contra cáncer que opera vía diferentes mecanismos que dan un efecto citotóxico a las células tumorales humanas. Dicha coadministración puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que podrían volverlos no reactivos con el anticuerpo.

D. Tratamiento de Cáncer Se ha mostrado que AMEP se expresa en células tumorales, tal como células de tumores de carcinoma de próstata, , y también se ha mostrado que se expresan en células endoteliales vasculares próximas a células cancerosas, tales como células cancerosas uroteliales, células cancerosas de colon, células cancerosas rectales, célula cancerosas de pulmón, células cancerosas de mama, y células cancerosas de adenocarcinoma metastático del hígado (ver Patente de E.U.A. No. 6,136,311). Consecuentemente, los anticuerpos de la invención se pueden usar para tratar cáncer inhibiendo el crecimiento de células tumorales que expresan AMEP o inhibiendo el crecimiento de células endoteliales vasculares próximas a células tumorales. Por lo tanto, en otra modalidad, la presente invención provee un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, en donde las células del tumor o células endoteliales vasculares próximas al tumor son AMEP+, en el cual un anticuerpo anti-AMEP de la invención se administró al sujeto de manera que el crecimiento del tumor se inhibe. Para sujetos humanos, el anticuerpo preferiblemente es un anticuerpo humanizado o humano. En una modalidad preferida, las células tumorales y células de tumor de próstata. En otras modalidades, las células tumorales son de cánceres tales como colon, renal, rectal, urotelial, mama, vejiga, hígado, páncreas o melanoma.

Los métodos de tratamiento de la invención implican administrar a un sujeto una composición de anticuerpo de la presente invención en una cantidad efectiva para tratar o prevenir el trastorno. La composición de anticuerpo puede administrarse solo o con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico (conmutado a, o administrado con el anticuerpo) , que actúa junto con o sinergísticamente con la composición de anticuerpo para tratar o prevenir la enfermedad asociada con expresión de AMEP. Los métodos de tratamiento de la invención también implican administrar a un sujeto un anticuerpo anti-AMEP en combinación con toro agente, tal como un agente antitumoral, que actúa junto con o sinergísticamente con la composición de anticuerpo para tratar o prevenir la enfermedad asociada con expresión de AMEP. Como se muestra en la presente, el uso de anticuerpo anti-AMEP 7F12 en combinación con Taxotere® (Docetaxel) dio como resultado la inhibición de crecimiento tumoral en un modelo animal y curó los animales de caquexia relacionada con tumor (ver Ejemplo 8) . Si pretender esta limitado por un mecanismo, se piensa que el uso de un agente anti-tumoral ocasiona daño en la masa tumoral, permitiendo así la penetración mejorada de anticuerpo, las células efectoras o un componente efector alternativo, conduciendo a citotoxicidad efectiva. En una modalidad, el uso de un agente antitumoral ocasiona daño en la masa tumoral, permitiendo así que las células efectoras tengan acceso al tumor, conduciendo a una citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA) más efectiva de las células tumorales. En otra modalidad, el uso de un agente anti-tumoral, v.gr., un inhibidor de microtúbulos, ocasiona que las células tumorales serán intrínsecamente más susceptibles a la muerte mediada por anti-AMEP. En una modalidad de la invención, el efecto sinergístico o aditivo obtenido por la administración de un anticuerpo anti-AMEP y un agente anti-tumoral es independiente de, es decir, no se ocasiona por, la inversa de la polaridad apical del antígeno AMEP a la membrana de plasma basolateral . Como se usa en la presente, el término "anticuerpo anti-AMEP" incluye cualquier anticuerpo que se une específicamente al antígeno de membrana específica de próstata humana. Ejemplos de dichos anticuerpos incluyen los anticuerpos descritos en la presente, los anticuerpos de4scritos en la Solicitud de Patente de E.U.A. No. 10/059989 y Publicación de PCT No. WO 03064606A3, o los anticuerpos descritos en la Solicitud Provisional No. 60/660431. Todo el contenido de cada una de las solicitudes anteriores se incorpora aquí por referencia. Como se usa en la presente, el término "agente anti-tumoral" incluye cualquier agente que puede usarse para destruido a ayudar a destruir (v.gr., parcial o totalmente, un tumor. En una modalidad, el agente antitumoral es capaz de ocasionar daño en la masa tumoral, permitiendo así que las células efectoras tengan acceso al tumor más fácilmente, conduciendo a un anticuerpo más efectivo que depende de la citotoxicidad mediada por células (CCDA) de las células tumorales. El término "agente anti-tumoral" incluye agentes quimioterapéuticos, inhibidores de angiogénesis, agentes de bloqueo de microtúbulos, agentes inmunomoduladores, inhibidores de angiogénesis, agentes bloqueadores de microtúbulos, agentes inmunomoduladores, intercaladores de ADN, entrelazadores, inhibidores de síntesis de ADN, reguladores de transcripción de ADN-ARN, inhibidores de enzimas y reguladores de genes. El término "agente quimioterapéutico" incluye cualquier agente que puede usarse para tratar cáncer, v.gr., cáncer de próstata. Los agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de alquilación, antimetabolitos, alcaloides de plantas, antibióticos antitumorales y hormonas de esteroides. Ejemplos específicos de gentes quimioterapéuticos incluye, pero no están limitados a, ácido retinoico todo trans, aminoglutatimida, azacitidina, Azatiopirina, Bleomicina (Blenoxano) , Bisulfano (Mieleran) , Carboplatina, Carboplatino (Paraplatina) , carmustina, Carmustina (BCNU) , Capecitabina, CCNU (Lomustina) , Clorambucilo (Leukeran) , 2-Clorodeoxiadenosina (2-CDA; Cladribina, Leustatina) , Cis- platino (Platinol), Cisplatina (cis-DDP) , sulfato de cisplatin bleomicina, Clorambucilo, Ciclofosfamida (Citoxanl CTX) , Ciclofosfamida hidroxiurea, Citarabina (Ara-C; citosina arabinosida) , Daunorubicina (Cerubidina) , Dacarbazina (DTIC; dimetiltriazenoimidazolecarboxamida) , Dactinomicina (actinomicina D) , Daunorubicina (daunomicina; rubidomicina) , Dietilstilbestrol, Docetaxel (Taxotere) , Doxifluridina, Doxorubicina (Adriamicina) , Epirubicina, Etinil estradoilo, Etopasida (VP-16, VePesid), Fluorouracilo (5-Fu; Floxuridina, fluorodeoxiuridina; FUdR) , Fludarabina (Fludara), Flutamida, Fluoximesterona, Gemcitabina (Gemzar) , Herceptina (Trastuzumab; anticuerpo anti-HER 2 monoclonal) , Hidroxiurea (Hydrea) , caproato de hidroxiprogesterona, Idarubicina, Ifosfamida (Ifex), Interferon alfa, Irinotecan (CPT-II), L-Asparaginasa, Leuprolida, Mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, Melfelan (Alkeran) , Mercaptopurina ( 6-mercaptopurina; 6-MP) , Methotrexato (MTX; ametopterina) , Mitomicina (mitomicina C) , Mitotano (o,p'-DDD), Mitoxantrone (Novantrone), Oxaliplatina, Paclitaxel (Taxol) , Pemetrexed, Pentostatin (2-deoxicoformicina) , Plicamicina (mitramicina) , Prednisona, Procarbazina (Matulane; N-metilhidrazina, MIH) , Rituxin (Rituximap) , Semustina (Methil-CCNU) , Streptozocina, Taxol, Tamoxifen, Teniposida, Tertiposida, Testosterone propionato, Tioguanina ( 6-tioguanina; TG) , Tiotepa, Tomudex (Raltitrexed) , Topotecan (Hicamtin; (S) -10- [ (dimetilamino) metil] -4-etil-4, 9-dihidroxi-lH-pirano [3 ' , 4'), Treosulfan (Ovastat) , Valrubicina, Vinblastina (VLB; Velban) , Vincristina (Oncovin) , Vindesina, y Vinorelbina (Navelbina) . El término "agente de bloqueo de microtúbulos" incluye cualquier agente que es capas de alterar la organización normal y dinámicas de microtúbulos. Ejemplos de agentes de bloqueo de microtúbulos incluyen, pero no se limitan a, taxanos (Taxol® (Paclitaxel), Taxotere® (docetaxel) ) , vinca alcaloides (vinblastina, vincristina (Oncovin) , Vindesina (Eldesina, Fildesina) , Vinorelbina (Navelbina)), 2-metoxiestradiol (2ME2), estramustina, epotilones, Colchicina, Dolastatina 15, Nocodazol, Podofilotoxina, Rizoxina. Los términos "inhibidor angiogénesis" y "agente anti-angiogénico" se usan intercambiablemente en la presente e incluye cualquier agente que es capaz de evitar o inhibir la formación de vasos sanguíneos. Ejemplos específicos de inhibidores de angiogénesis incluyen, pero no están limitados a, Angiostatina Kl-3, Arresten, aaAT, Canstatina, DL-a-difluorometil-ornitina, Endostatina, Fumagilina, Genisteina, Minociclina, Staurosporina, (±) -Talidomida y Tumstatina. El término "agente inmunomodulador" incluye cualquier agente que modula, v.gr., estimula una respuesta inmune. Ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen anticuerpos, tales como anticuerpos anti_PDl y anticuerpos anti-CTLA-4, solos o en combinación, descritos, entre otros, en la Solicitud Provisional de E.U.A. No. 60/679,466, presentado el 05/09/2005; en la Publicación de PCVT WO 01/14424; en la Solictud provisional 60/738,434, presentada el 11/21/2005/; y en la Solicitud Provisional de E.U.A. , presentada el 12/08/2005 (Caso No. MEDX-012US2 o 04280/1203401-US1) , todo el contenido de cada una de las cuales se incorpora expresamente aquí por referencia. Los agentes inmunomoduladores adicionales que se pueden usar en los métodos de la presente invención incluyen anticuerpos que bloquean una señal co-estimuladora (v.gr., CD28 o ICOS), anticuerpos que activan una señal inhibidora via CTLA4, y/o anticuerpos contra otros marcadores celulares inmunes (v.gr., CD40, ligando CD40, o citoquinas), proteínas de fusión (v.gr., CTLA4-Fc, PD-l-Fc) , y fármacos inmunosupresores, (v.gr., rapamicina, ciclosporina A o FK506) . Otros ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen oligodesoxiribonucleotido fosfotiolato (1018 ISS), GVAX (una vacuna de gen GM-CSF), interleucinas (v.gr., interleucina-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 (CYT 99 07), -8, -9, -10, -11, -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -20, -21, -22, -23, -24, -25, -26, -27, -28, -29 y -30), v.gr., anticuerpos de interleucina recombinantes, v.gr., IL-2, v.gr., Aldeslecina, v.gr., oprelvekina, v.gr., antagonistas de receptor de interleucina, v.gr., antagonistas de receptor de IL-1, v.gr., anaquinra, glucocerebrosidasa, v.gr., Imiclucerasa, factor de activación de macrófagos, péptido de macrófagos, factor de células B, y factor de células T. Ejemplos de intercaladores/entrelazadores de ADN incluyen, pero no están limitados a, bleomicina, carboplatina, carmustina, Clorambucilo, ciclofosfamida, bicloruro de diaminoplatino (II) (Cisplatina), Mefalan, Mitoxantrona, y Oxaliplatina. Ejemplos de inhibidores de síntesis de ADN incluyen, pero no están limitados a, (±) -Ametopterina (Metotrexato), 1,4-dióxido de 3-amino-l, 2, 4-benzotriazina, Aminopterina, ß-D-arabinofuranosido, 5-fluoro-5'-desoxiruidina, 5-fluorouracilo, Ganciclovir, Hidroxiurea, y Mitomicina C. Ejemplos de reguladores de transcripción de ADN-ARN incluyen, pero no están limitados a, Actinomicina D, Daunorubicina, Doxorubicina, Homoharringtonina, y Idarubicina. Ejemplos de inhibidores de enzima incluyen, peor no están limitados a, S (+) -Campotecina, Curcumina, (-)-Deguelina, 5, 6-diclorobencimidazol 1-ß-D-ribofuranosido, Etoposido, Formestano, Fostriecina, Hispidina, ácido 2-imino- 1-imidazoli-dinacético (Ciclocreatina) , Mevinolina, Tricostatina A, Tirfostina AG 34, y Tirfostina AG 879. Ejemplos de reguladores de genes incluyen, pero no están limitados a, 5-Aza-2 ' -desoxicitidina, 5-Azacitidina, Colecaciferol (Vitamina D3), 4-hidroxitamoxifen, Melatonina, Mifeproistona, Raloxifeno, Retinal todo trans (aldehido de Vitamina A) , ácido retinoico, ácido de vitamina A todo trans, ácido 9-cis-retinoico, ácido 13-cis-retinoico, Retinol (Vitamina A), Tamoxifen, y Troglitazona. Los métodos de al invención también implica administrar a un sujeto un inmunoconjugado (comprendiendo un anticuerpo anti-AMEP, o porción de unión de antígeno del mismo, ligado a una segunda porción ligada que tiene una especificidad de unión diferente que el anticuerpo) en combinación con un agente antitumoral, que actúa junto con o sinergísticamente con la composición de anticuerpo para tratar o prevenir la enfermedad asociada con la expresión de AMEP. El agente antitumoral puede administrarse en cualquier dosis terapéuticamente efectiva conocida en la materia o como se describió en la presente (véase composiciones farmacéuticas) . El anticuerpo anti-AMEP puede administrarse en combinación con un solo agente antitumoral. El anticuerpo anti-AMEP también se puede administrar en combinación con dos o más agentes anti-tumorales .

El anticuerpo anti-AMEP puede administrarse simultáneamente. Por ejemplo, el anticuerpo anti-AMEP y el agente anti-tumoral puede administrarse junto en una sola formulación farmacéutica. En otra modalidad, el anticuerpo anti-AMEP y el agente antitumoral puede administrarse al mismo tiempo como dos formulaciones farmacéuticas separadas. El anticuerpo anti-AMEP y el agente antitumoral también se puede administrar a diferentes tiempos. Por ejemplo, los agentes antitumorales pueden administrarse antes de la administración del anticuerpo anti-AMEP (v.gr., aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 24 o 48 horas antes de la administración del anticuerpo anti-AMEP) . Alternativamente, el anticuerpo anti-AMEP puede administrarse antes de la administración de los agentes antitumorales (v.gr., alrededor de 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10, 15, 20, o 48 horas antes de la administración de los agentes antitumorales) . En una modalidad, el anticuerpo anti-AMEP puede administrarse en combinación con un agente antitumoral de acuerdo con el programa de dosificación delineado en la presente en la Tabla 1.

Equipos También dentro del alcance de la invención hay equipos que comprenden un anticuerpo de la invención e instrucciones de uso. El equipo puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como reactivo inmunoestimulador, un agente citotóxico o un agente radiotóxico, o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (v.gr., un anticuerpo que tiene una actividad complementaria que se une a un epitope en el antígeno de AMEP distinto del primer anticuerpo) . Los equipos incluyen normalmente una etiqueta que indica el uso que se pretende de los contenidos del equipo. El término etiqueta incluye cualquier escrito, o material grabado suministrado en o con el equipo, o que de alguna manera acompaña al equipo. La presente invención además se ilustra por los siguientes ejemplos que no deberán interpretarse como limitantes. El contenido de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas a través de esta solicitud se incorporan expresamente en la presente por referencia.

Ejemplo 1: Generación de Anticuerpos Monoclonales Humanos Contra AMEP Antígeno Protocolos de inmunización usados como células de antígeno de la línea celular de cáncer de próstata que expresa AMEP (ATCC CRL-1740) . Ratones HuMab Transgénicos Los anticuerpos monoclonales completamente humanos de AMEP se prepararon usando la cepa de HCol2 de ratones transgénicos de HuMab, que expresa genes de anticuerpos humanos. En estas cepas de ratones, el gen de cadena ligera kappa de ratón endógeno se ha alterado homocigofamente como se describió en Chen y otros (1993) EMBO J. 12: 811-820 y el gen de cadena pesada de ratón endógena se ha alterado homocitodamente como se describió en el Ejemplo 1 de Publicación de PcT WO 01/09187. Además, esta cepa de ratón porta un transgene de cadena ligera de kappa humano, KCo5, como se describió en Fishwild y otros (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, y un transgene de cadena pesada humano, HCol2, como se describió en el ejemplo 2 de la Publicación de PCT WO 01/09187.

Inmunizaciones de HuMab: Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para AMEP, los ratones HuMab se inmunizaron con células de INCaP que expresan AMEP como antígeno. Los esquemas de inmunización general para ratones HuMab se describieron en Lonberg, N. y otros (1994) Nature 368 (6474) : 856-859; Fischwsild, D. y otros (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y Publicación de PCT WO 98/248843. Los ratones tuvieron 6-16 semanas de edad por la primera infusión de antígeno. 5-10xl06 se usaron para inmunizar los ratones de HuMab intraperitonealmente (IP), subcutáneamente (Se) o vía inyección de almohadilla de pata. Los ratones transgénicos se inmunizaron dos veces con antígeno en adyuvante completo de Freund o adyuvante IP de Ribi, seguido por 3-21 días de IP (hasta un total de 11 inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund o Ribi. La respuesta inmune se monitoreó por sangrados retro-orbitales. El plasma se tamizó por ELISA (como se describe más adelante) , y los ratones con suficientes titulaciones de inmunoglobulina humana anti-AMEP se usaron para fusiones. Los ratos se reforzaron intravenosamente con antígeno 3 días antes de sacrificar y remover el bazo. Normalmente, se realizaron 10-35 fusiones para cada antígeno. Se inmunizaron varias docenas de ratones para cada antígeno.

Selección de Anticuerpos Anti-AMEP de Producción de Ratones HuMab Para seleccionar ratones HuMab que producen anticuerpos que se unan a AMEP, s4e tamizaron sueros de ratones inmunizados para unirse a la línea celular de cáncer de próstata que expresa AMEP, pero no una línea celular de cáncer de próstata negativa por citometría de flujo. En resumen, la unión de anticuerpos anti-AMEP se evaluaron incubando células de LNCaP con el anticuerpo anti-AMEP a una concentración de 20 µg/ml. Las células se lavaron y se detectó la unión con un EgGab anti-humano marcado con FITC. Los análisis de citometría de flujo se realizaron usando una citometría de flujo de FACScan (Becton Dickinson, San José, CA ) . Los anticuerpos que se unen a las células de LNCaP que expresan AMEP pero no las células de cáncer de próstata que no expresan AMEP se probaron además para unirse a AMEP por ELISA, como se describió en Fishwild, D. y otros (1996) . En resumen, las placas de microtitulación se revistieron con AMEP purificado a 1-2 µg/ml en PBS, 100 µl/pozos incubados a 4°C durante la noche luego se bloquearon con 200 µl/pozo de 5% de suero de bovino fetal en PBS/Tween (0.05%). Las diluciones de suero de ratones inmunizados con AMEP se agregaron a cada pozo y se incubaron durante4 1-lhoras a temperatura ambiente. Las palcas se lavaron con PBS/Tween y luego se incubaron con un anticuerpo policlonal de IgG antihumano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HR= durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se desarrollaron con sustrato de ABTX (Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml) y se analizaron por el espectrofotómetro a OD 415-49. Los ratones que desarrollaron las titulaciones superiores de anticuerpos anti-AMEP se usaron para fusiones. Las fusiones se realizaron como se describe más adelante y se probaron los sobrenadantes de hibridoma para actividad anti-AMEP por ELISA.

Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Humanos a AMEP: Los esplenocitos de ratones, aislados del ratón de HuMab, se fusionaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón basada en protocolos normales. Los hibridomas resultantes se tamizaron para la producción de anticuerpos específicos para antígenos. Las suspensiones de una sola célula de esplenocitos de ratones inmunizados se fusionaron a un cuarto del numero de células de mieloma de ratón sin secreción SP2/0 (ATCC, CRL 1581) con 50% PEG (Sigma) . Se sembraron en placas las células a aproximadamente 1 x 105/pozo en placa de microtitulación de fondo plano seguido por aproximadamente dos semanas de incubación en medio selectivo conteniendo 10 % de suero de bovino fetal, 10% de medio condicionado P388DI (ATVCC, CRL TIB-63), 3-5% de origen (IGEN) en DMEM (Mediatech, CRL 10013, con alto contenido de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio) más 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina y lxHAT (Sigma, CRL P-7185) . Después de 1-2 semanas, las células se cultivaron en el medio en el cual se reemplazó HAT con HT. Los pozos individuales se tamizaron por ELISA (descrito antes) para anticuerpos de IgG monoclonales anti-AMEP humano. Una vez que ocurrió el crecimiento de hibridoma extensivo, se monitoreó el medio usualmente después de 10-14 días. Los hibridomas de secreción de anticuerpos se volvieron a sembrar en placas, se tamizaron de nuevo y, si aún es positivo para IgG humano, se subclonaron los anticuerpos monoclonales anti-AMEP por lo menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables se cultivaron luego in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para caracterización adicional. Los clones de hibridomas IC3, 2A10, 3F5, 2C6 se seleccionaron para análisis adicional.

Ejemplo 2: Caracterización Estructural de Anticuerpos Monoclonales Humanos 1C3, 2A10, 2F5, y 2C6 Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de 1C3, 2A10, 2F5 y 2C6 se obtuvieron de los hibridomas de 1C3, 2A10, 2F5, y 2C6, respectivamente, usando técnicas de RCP normales y se secuenciaron usando técnicas de secuenciación de ADN normales . El nucleótido y secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 1C3 se muestran en la Figura 1A y en SEC ID NO: 33 y 1, repsectivamente . Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 1C3 se muestran en la Figura IB y en SEC ID NO: 37 y 5, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 1C3 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la linea germinal humana conocida demostró que la cadena pesada de 1C3 usa un segmento de VH de la línea germinal humana VH 3-30.3, un segmento D no determinado y un segmento JH de la linea germinal humana JH 6b. la alienación de la secuencia de IC3 VH a la secuencia de VH 3-30.3 de la línea germinal se muestra en la Figura 5. El análisis adicional de la secuencia de IC3 VH usando el sistema de Kabat de la determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras ÍA y 5, y en las SEC ID NO: 9, 13, y 17, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 1C3 a las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostró que la cadena ligera de 1C3 usa un segmento de VL de la línea germinal humana VK L18 y un segmento de JK de la línea germinal humana JK 4. La alienación de la secuencia de IC3 VL a la secuencia VK L18 de la linea germinal se muestra en la Figura 7. El análisis adicional de la secuencia de 1C3 VL usando el sistema Kabat de la determinación de la región de CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras IB y 7, y en SEC ID NO: 21, 25 y 29, respectivamente.

Las secuencias de nubl4epotidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 2A10 se muestran en la Figura 2A y en SEC ID NO: 34 y 2, respectivamente. El nucleótido y secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 2A10 se muestran en la Figura 2B y en SEC ID NO: 38 y 6, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 2A10 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostraron que la cadena pesada de 2A10 usa un segmento de BH de la línea germinal humana VH 5-51, un segmento D de la línea germinal humana 7-27, y un segmento de JH de la línea germinal humana JH 2. La alineación de la secuencia de BH 2A10 como se muestra en la Figura 6. El análisis adicional de la secuencia 2A10 VH usando el sistema Kabat de la determinación de la región de CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 2A y 6, y en SEC ID NO: 10, 14, y 18, repectivamente . La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera 2A10 a las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostrado que la cadena ligera 2A10 usa un segmento de VL del segmento VK L18 y JK de la línea germinal humana de la línea germinal humana JK 4. La alineación de la secuencia de 2A10 BL a la secuencia de la linea germinal VK L18 se muestra en la Figura 7. El análisis adicional de la secuencia de 2A10 VL usando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las figuras 2B y 7, y en la SEC ID NO: 22, 26, y 30, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 2F5 se muestran en la Figura 3A y en SEC ID NO: 35, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 2F5 a las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana demostraron que la cadena pesada de 2F5 usa un segmento de la línea germinal humana VH 5-51, un segmento D de la línea germinal humana 7-27, y un segmento JH de la línea germinal humana JH-2. La alienación de la secuencia de VH 2F5 a la secuencia de la línea germinal VH 5-51 se muestra en la Figura 6. El análisis adicional de la secuencia de VH 2F5 usando el sistema Kabat de la determinación de la región de CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 3A y 6, y en SEC ID NO: 11, 15 y 19, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena aligera 2F5 a las secuencia de cadena ligera de inmunoglobulina de la linea germinal humana demostraron que la cadena aligera 2F5 usa un segmento de VL de la línea germinal humana VK L18 y un segmento de JK de la línea germinal humana JK . La alineación de al secuencia de 2F45 VL a la secuencia de linea germinal VK L18 se muestra en la Figura 7. Los análisis adicionales de la secuencia de 2F5 VL usando un sistema de Kabat de la determinación de la región de CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 3B y 7, y en SEC ID NO: 23, 27 y 31, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 2C6 como se muestra en la Figura 4A> y en la SEC Id NO: 36 y 4, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 2C6 se muestran en la Figura 4B y en SEC IDNO: 40 y 8, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada 2C6 a las secuencia de cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocida demostraron que la cadena pesada 2C6 usa un segmento BH de la línea germinal humana VH 5-51, un segmento D de la línea germinal humana 6-13, y un segmento de JH de la línea germinal humana JH 4b. La alienación de al secuencia 2C6 VH a la secuencia 5-51 de la línea germinal VH se muestra en la Figura 6. El análisis adicional de la secuencia de 2C6 VH usando el sistema de Kabat de la determinación de la región de CDR condujo a la delineación de las regiones de CDRl, CDR2 y CD3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 4A y 6, y en SEC ID NO: 12, 16, y 20, respectivamente. La comparición de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera a las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostraron que la cadena aligera 2C6 usa un segmento de VL de la línea germinal humana VK L6 y un segmento de JK de la línea germinal humana JK 3. La alineación de la secuencia de 2C6 VL a la secuencia de la línea germinal VK L6 se muestra en la Figura 8. El análisis adicional de la secuencia 2C6 VL usando el sistema de Kabat de la determinación de la región de CDR condujo a al delineación de las regiones de CDRl, CEDR2 y CD3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 4B y 8, y en SEC ID NO: 24, 28 y 32 respectivamente.

Ejemplo 3: Caracterización de Especificidad de unión de Anticuerpos Monoclonales Humanos Anti-AMEP En este ejemplo, la especificidad de unión se examinó por citometría de flujo en una línea celular de células de cáncer de próstata expresando AMEP y por ELISA usando AMEP purificado.

Especificidad de unión por citometría de flujo La línea celular de cáncer de próstata LNCaP que expresa AMEP humana se usó para determinar la especificidad de anticuerpos monoclonales humanos anti-AMEP por citometría de flujo. La unión de anticuerpos monoclonales humanos anti-AMEP de 2F5, 2A10, y 2C6 se evaluaron incubando las células de LNCaP con los anticuerpos monoclonales humanos anti-AMEP a diferentes concentraciones. Las células se lavaron y la unión se detectó con un IgG Ab anti-humano marcado con FITC. Los análisis de citometría de flujo se realizaron usando una citometría de flujo de FACScan (Becton Dichinson, San José, CA) . El anticuerpo monoclonal 7F12 anti-AMEP humano (como se describió en la Publicación de PCT WO 03/164606) se usó como un control positivo y un anticuerpo de control de isotipo específico sin AMEP se usó como un control negativo. Los resultados se describieron en la Figura 9. los anticuerpos monoclonales humanos anti-AMEP 2F5, 2A10, y 2C6 se unieron específicamente a las células de LNCaP que expresan AMEP.

Especificidad de unión por ELISA Una comparación de anticuerpos anti-AMEP en la unión a AMEP inmunopurificada se realizó por ELISA normal para examinar la especificidad de unión para AMEP. AMEP se inmunopurifico de células LNCaP y se probaron para unión contra anticuerpos monoclonales humanos anti-AMEP 1C3, 2A10, 2F5 y 2C6. Se realizaron procedimientos de ELISA normales. Los anticuerpos monoclonales humanos anti-AMEP se agregaron a una concentración de 5 µg/ml y se tituló a diluciones en serie de 1:2. El anticuerpo policlonal de IgGA anti-humano de cabra (específico para cadena Kappa) conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) se usó como anticuerpo secundario. El anticuerpo monoclonal anti-AMEP 7F12 se usó como un control positivo y se usó un espacio en blanco como un control negativo. Los resultados se muestran en la Figura 10. Los anticuerpos monoclonales humanos anti-AMEP 2A10 y 2F5 unidos con alta especificidad a AMEP. Los anticuerpo monoclonales humanos anti-AMEP IC3 y 2C6 exhibieron unión detectable pero de nivel bajo a AMEP en un análisis de ELISA, sugiriendo que estos anticuerpo se una a un epítope oculto en un análisis de ELISA.

Ejemplo 4: Análisis de Scatchard de afinidad de unión de anticuerpos monoclonales anti-AMEP La afinidad de unión del anticuerpo de 2A10 para la línea celular de cáncer de próstata que expresa AMEP LNCaP se probó usando un análisis Scatchard. Las células de LNCaP se obtuvieron de ATCC (CRL- 17400) y se desarrollaron en medio que contiene suero de bovino fetal (PBS) al 10%. Las células se tripsinizaron y lavaron una vez den solución reguladora de unión basada en Tris (24 mM Tris pH 7.2, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2mM Glucosa, lmM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1% BSA) y las células se ajustaron a 2xl06 células/ml de solución reguladora de unión. Las placas de miliporo (MAFB NOB) se revistieron con 1% de lecho sec sin grasa en agua y se almacenaron a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con 0.2 ml de solución reguladora de unión. Cincuenta microlitros de solución reguladora sola se agregaron a los pozos de unión máximos (unión total) . Veinticinco microlitros de solución reguladora sola se agregaron a los pozos de control (unión no específica) . La concentración variable de anticuerpo anti-AMEP de I125 se agregó a todos los pozos en un volumen de 25 µl . Las concentraciones variables de anticuerpos no marcados con un exceso de 100 veces se agregó en un volumen de 25µl de células LNCaP (2 x 106 células/ml) en solución reguladora de unión se agregaron a todos los pozos. Las placas se incubaron durante 2 horas a 200 RPM en un agitador a 4°C. Al terminar la incubación de las placas de Millipore se lavaron tres veces con 0.2 ml de solución reguladora de lavado frío (24 mM de Tris pH 7.2, 500 mM NaCl, 2.7 M KCl, 2 mM Glucosa, 1 mM CaCl2, 1 mM de MgCl2, 0.1% BSA) . Los filtros se removieron y se contaron en un contador gama. La evaluación de unión de equilibrio se llevó a cabo usando parámetros de unión a un solo sitio con el software Prism (San Diego, CA) .

Usando El análisis de unión de Scatchard anterior la KD del anticuerpo 2A10 para células LNCaP fue de aproximadamente 0.8 nM.

Ejemplo 5: Análisis de unión de competencia de epítope El anticuerpo monoclonal anti-AMEP 2A10 se comparó con un anticuerpo anti AMEP conocido, 7F12 (descrito en la Publicación de PCT WO 03/064606) para examinar si los dos anticuerpos se unieron a la misma región de epítope usando un análisis de competencia. Las células LNCaP se obtuvieron de ATCC (CR1-1740) y se desarrollaron en medio de RPM1 conteniendo 10% de suero de bovino fetal (PBS) . Las células se tripsinizaron y lavaron una vez en solución de unión con base de Tris (24 mM Tris pH 7.2, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2 M Glucosa, 1 mM CaCl2, ImM MgCl2 0.1% BSA) y las células se ajustaron a 2 x 106 células/ml en solución reguladora de unión. Las placas de Millipore (MAFB NOB) se cubrí rieron con 1% de leche seca sin grasa en agua y se almacenaron a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con 0.2 ml de solución reguladora de unión. Veinticinco microlitros de solución reguladora sola se agregaron a los pozos (Unión no específica) . Una concentración fija de anticuerpo 125I-anti- AMEP se agregó a todos los posos en un volumen de 25 µl . Las concentraciones variables de anticuerpo no marcado se agregaron a pozos en un volumen de 25 µl y 25µl de células LNCaP (2xl06 células/ml) en solución reguladora de unión se agregaron a todos los pozos. Las placas se incubaron durante 2 horas a 200 RPM en un agitador a 4°C. Al completar la incubación de las placas de Millipore se lavaron tres veces con 0.2 ml de solución reguladora de lavado frío (24 mM Tris pH 7.2, 500 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2mM glucosa, 1MM CaCl2, ImM MgC12, 0.1% BSA). Los filtros se removieron y contaron en un contador gamma. La evaluación de unión de equilibrio se llevó a cabo usando parámetros de unión de un solo sitio con el software Prism (San Diego, CA) . Un anticuerpo de control de isotipo se usó como un control negativo. Los resultados de unión de competencia contra 125I-2A10 se muestran en la Figura HA y la unión de competencia contra 125I-78F12 se muestran en la Figura 11B. Los resultados mostraron que la adición de anticuerpo 7F12 no marcados inhibe la unión de 2A10 marcado a células LNCaP y la adición de anticuerpo 2A10 inhibe la unión de 7F12 a células LNCaP y la adición de anticuerpo 2A10 no marcado inhibe la unión de 7F12 marcado a células LNCaP. Esto demuestra que los anticuerpos anti-AMEP 2A10 y 7F12 se gene al mismo o un epítope muy similar en AMEP.

Ejemplo 6: Internalización de anticuerpo monoclonal anti-AMEP Se probaron HuMAb anti-AMEP para la capacidad de internalizarse en células de cáncer de próstata que expresan AMEP usando un análisis de internalización Hum-Zap. Las pruebas de Hum-Zap para internalización de un anticuerpo humano primario a través de la unión de un anticuerpo secundario con afinidad para IgG conjugado a la toxina saporina. La linea celular de cáncer de próstata LNCaP que expresa AMEP se sembró a 2.5xl04 células/pozo en pozos de 100 µl ya sea durante la noche o al siguiente día durante un período de dos horas. Cualquiera del anticuerpo 2A10 o 7F12 anti-AMEP se agregaron a los pozos a una concentración inicial de 30 mM y se titularon a 1:3 diluciones en serie. Un anticuerpo de control de isotipo que no es específico para AMEP se usó como un control negativo. El Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, IT-22-25) se agregó a una concentración de 11 M y las placas se dejaron incubar durante 48 horas. Las placas se impulsaron entonces con 1.0 µCi de 1H-timidina durante 24 horas, se recuperaron y leyeron en un Contador de Centellero de Cuenta Superior (Packard Instruments) . Los resultados se muestran en la Figura 12. El anticuerpo 2A10 anti-AMEP mostró una disminución que depende de la concentración de anticuerpos en la incorporación de 1H-timidina en células de cáncer de próstata LNCap que expresa AMEP. Estos datos demuestran que el anticuerpo 2A10 anti-AMEP internaliza en una línea celular de cáncer de próstata.

Ejemplo 7: Termoestabilidad de anticuerpos monoclonales anti-AMEP por calorimetría de barrido diferencial La estabilidad térmica del anticuerpo monoclonal anti-AMEP 2A10 se comparó con el anticuerpo 7F12 usando análisis calorimétrico de la temperatura de fusión del anticuerpo . Las mediciones calorimétricas de temperaturas de fusión ™ se llevaron a cabo en una plataforma de microcalorímetro de barrido diferencial DSC VP-Capillary que se combinó con jun automuestreador (MicroCal LLC, Norhampton, MA, EUA) . El volumen de células de la muestra es de 0.144 ml . Los datos de desnaturalización en las formas glicosilada y desglicosilada de los anticuerpos se obtuvo calentando las muestras, a una concentración de 2.3 µM, de 30 a 95°C a un régimen de l°C/min. Las muestras de proteína estuvieron presentes en solución salina regulada con fosfato (PBS) a pH 7.4. La misma solución reguladora se usó en la célula de referencia para obtener la capacidad de calor molar por comparación. Los termogramas observados se corrigieron en la línea de base y los datos normalizados se analizaron con base en un modelo de 2 pasos, usando el software Origin v7.0. El clon 2A10 tiene termoestabilidad superior, con una Tm de 71.43°C, comparado con 63.05°C obtenido del clon 7F12.

Ejemplo 8: Tratamiento de xenoinjertos tumorales in vivo con una combinación de Taxotere® y el anticuerpo 7F12 La eficacia antitumoral del anticuerpo 7F12 anti-AMEP en combinación con Taxotere® (docetaxel) se probó en xenoinjertos de carcinoma de próstata humana de LNCaP desarrollado en ratones macho CB17.SCID. Las células de cáncer de próstata LNCaP que expresan altos niveles de AMEP se obtuvieron de ATCC (Cat# CRL-1740) y se expandieron in vitro siguiendo la instrucción de ATCC. Los ratones machos de 8 semanas de edad CB17-SCID de Taconic se implantaron subcutáneamente en el flanco derecho con 2.5 x 106 células LNCaP en 0.2 ml de PBS/Matrigen (1:1) por ratón. Los ratones se pesaron y midieron para volumen tumoral usando un calibrador electrónico dos veces a la semana partiendo tres semanas después del implante. Los volúmenes tumorales se calcularon como peso x anchura x longitud. Los ratones con tumores vascularizados (determinados por la apariencia de los tumores) de 180 mm3 se aleatorizaron en el grupo de tratamiento y se dosificaron por peso corporal individual en el Día 0. Los ratones se monitorizaron para crecimiento alrededor de 60 días después de la dosificación y terminaron al final del estudio. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron punto final de tumor (1500 mm3) . La información de dosificación se resumió en la Tabla 1. Taxotere® se dosificó a Q3Dx3 intravenosamente (iv) a través de la vena de la cola. El anticuerpo de control de isotipo Rituxan® y el anticuerpo anti-AMEP 7F12 se dosificaron intraperitonealmente (ip) Q3Dx5, seguido con Q7Dx6.

Tabla 1 : Información de Dosificación Los resultados de los experimentos anteriores se describen en las Figuras 13-16. Como se muestra en las Figuras 13A-13B y Figuras 14A-14B, 30 mg/kg del anticuerpo 7F12 anti-AMEP solo diminuyó modestamente el desarrollo de los tumores de INCaP. Taxotere® mostró una eficacia de crecimiento anti-tumoral dependiente de la dosis en las dos dosis probadas (es decir, 2 y 4 mg/kg) . La terapia de combinación de 30 mg/kg del anticuerpo 7F12 anti-AMEP y 4 mg/kg de Taxotere® mostró eficacia superior que cada tratamiento solo y dio como resultado inhibición casi completa de crecimiento tumoral LNCaP (véase Figuras 13A-13B y Figuras 15A-15B) . Como se muestra en las Figuras 13C-13D y Figuras 15C-15D, este régimen de combinación también curó a los ratones de caquexia relacionada con tumor LNCaP. La terapia de combinación de 30 mg/kg del anticuerpo 7F12 anti-AMEP y 2 mg/kg de Taxotere® también mostró eficacia superior que cada tratamiento solo (ver Figuras 13A-13D y Figuras 16A-16D) . Los siguientes datos demuestran un aditivo y posiblemente efecto sinergístico al anticuerpo 7F12 anti-AMEP en combinación con quimioterapia de Taxotere® para tratar tumores, tales como tumores de próstata.

Ejemplo 8: Evaluación de muerte de células de un anticuerpo anti-AMEP conjugado con toxina en líneas celulares de cáncer de próstata En este ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-AMEP conjugados a una toxina se probaron para la capacidad de matar AMEP + líneas de células de cáncer de próstata en un análisis de proliferación celular. El anticuerpo 2A10 HuMAb anti-AMEP se conjugó a una toxina vía un ligador, tal como un peptidilo, hidrazona o ligador de disulfuro. Ejemplos de compuestos de toxina que pueden conjugarse a los anticuerpos de la presente invención se describieron en la solicitud presentada con el Caso No. 04280/100M629US3, presentad el 26 de septiembre de 2005. La línea celular LNCaP de cáncer de próstata que expresa AMEP se sembró a 2.5x10'' células/pozo en pozos de 100 µl durante 3 horas.. Un conjugado de anticuerpo-toxina anti-AMEP se agregó a los pozos a una concentración de partida de 30 nM y se titulo a diluciones en serie de 1:3. Un anticuerpo de control de isotipo que no es específico para AMEP se usó como un control negativo. Se permitió que las placas se incubaran durante 72 horas con un lavado de 3 horas o un lavado continuo. Las placas se impulsaron con 1.0 µCi de 3H-timidina durante 24 hora, se recuperaron y leyeron en un Contador de Centelleo de Cuenta Superior (Packard Instruments, Meriden, CT) . Los resultados se muestran en la Figura 17A (lavado de tres horas) y 17B (lavado continuo) . El anticuerpo 2A10 anti-AMEP mostró una concentración de anticuerpo-toxina que depende de la disminución en la incorporación de 3H-timidina en células de cáncer de próstata LNCaP que expresa AMEP. Los valores de EC50 para el anticuerpo 2A10 anti-AMEP fue de 0.157 nM para el análisis de lavado y 0.0643 nM para el análisis de lavado continuo. Estos datos demuestran que anti-AMEP son citotóxicos para células de cáncer de próstata cuando se conjugan a una toxina.

Ejemplo 9: Estudios In Vivo En este ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-AMEP conjugados a una toxina se probaron para la capacidad de matar líneas celulares de cáncer de próstata AMEP+ in vivo.

A. Tratamiento de xenoinjertos tumorales in vivo El 2A10 de HuMAb anti-AMEP y un anticuerpo de control de isotipo se intercambiaron ambos con solución reguladora en una solución reguladora de fosfato 0. ÍM a pH 8.0 conteniendo 50 mM de NaCl y 2 mM de DTPA, y se concentró a 6 mg/ml. Ambos anticuerpos se tiolizaron por incubación con un exceso molar de 25 veces de 2-iminotiolano durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por la desalación en 0.1 M de solución reguladora de fosfato pH 6.0 conteniendo 50 mM de NaCl y 2 mM de solución reguladora de DTPA usando una columna de Sephadex G-25. Los anticuerpos tiolizados se mantuvieron entones en hielo, mientras que se determinó el número de grupos tiol introducidos. Esto se logró por reacción de una muestra de anticuerpo tiolizado con ditiodipiridina (DTDP) . La absorbancia a 280 nm se midió para determinar la concentración de proteína en las muestras y luego se incubó una alícuota de cada muestra (0.9 ml) conO.l ml de DTDP (5 mM de solución madre en etanol) durante 19 minutos a temperatura ambiente. Las muestran en blanco de solución reguladora sola más DTDP se incubaron a lo largo del tiempo. La absorbancia a 324 nm se midió y el número de tioles presentes por anticuerpo se cuantificó usando un coeficiente de extinción para tiopiridina de 19800 m"1. En el caso de anti-AMEP se introdujeron 5.3 tioles por anticuerpo, y en el caso de control de isotipo 6.0. Los anticuerpos tiolizados se incubaron luego con 3 veces el exceso molar del Compuesto A sobre la concentración molar de los grupos tiol.

Compuesto A 5 mM de solución madre en DMSO del Compuesto A se agregaron a los anticuerpos tiolizados junto con suficiente DMSO para llevar la concentración final de DMSO a 10% (v/v) . Después de la incubación a temperatura ambiente durante 3 horas el pH de la mezcla de incubación se elevó a 7.0 usando trietanolamina. Los conjugados de anticuerpo-Compuesto A se purificaron por cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Sephacryl S200 equilibrada previamente con solución reguladora de fosfato 0.1 M (pH 7.2) conteniendo 50 mM de NaCl y 5% (v/v) de DMSO. Las fracciones que contienen conjugado monomérico se recuperaron y combinaron. Los conjugados purificados resultantes se concentraron luego en una célula agitada bajo nitrógeno, usando una membrana de corte de 10 kDa. Las concentraciones y relaciones de sustitución (número de moléculas de fármaco únicas por molécula de anticuerpo) de los conjugados se determinó usando absorbancia a 280 nm y 340 nm, por referencia a los coeficientes de extinción de anticuerpo y Compuesto A en cada longitud de onda como se midió previamente. Los ejemplos de otros compuestos de toxina que pueden conjugarse a los anticuerpos de la presente invención se describieron en la solicitud de Patente de E.U.A. co-perteneciente con el Caso No. 04280/100M6299US3, presentada el 26 de septiembre de 2005.

La eficacia anti-tumoral de anti-AMEP (clon 2A10) conjugado con el Compuesto A se probó en LNCaP, que es xenoinjerto de carcinoma de próstata humano desarrollado en ratones macho CB17.SCID (disponible de Taconic, Germantown, NY) . Las células de cáncer de próstata LNCaP que expresan niveles superiores de AMEP se obtuvieron de ATCC (Cat# CRL-1740) y se expandieron in vitro siguiendo la instrucción de ATCC. Se implantaron subcutáneamente ratones CB17-SCID macho de 8 semanas de edad de Taconic en el flanco derecho con 2.5 x 106 células de LNCaP en 0.2 ml de PBS/Matrigen (1:1) por ratón. Los ratones se pesaron y midieron para tumores tridimensionalmente usando un calibrador electrónico dos veces a la semana iniciando tres semanas después del implante. El volumen de tumor individual se calculó como peso x anchura x longitud. Los ratones con tumores vascularizados (determinados por apariencia de los tumores) de tamaños apropiados se aleatorizaron en grupos de tratamiento y se dosificaron por peso corporal individual en el Día 0. Se moni torearon los ratones para crecimiento tumoral alrededor de 60 días después de la dosificación y terminaron al final el estudio. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron el punto final del tumor (1500 mm3) . El diseño de este estudio de xenoinjerto se resumió en la tabla 2.

Tabla 2. Resumen del Estudio de Xenoinjerto LNCaP Como se muestra en la Fig. 18, 0.3 µmoles/kg (haciendo referencia a las moles del Compuesto A de citotoxina) del conjugado de 2A10-Compuesto A indujo la regresión completa de los tres tumores de LNCaP pequeño estabilizado.

B. Estudio de Respuesta a la Dosis Anti-AMEP (2A10) se intercambió por la solución reguladora en solución reguladora de fosfato 0. ÍM pH 8.0 conteniendo 50 mM NaCl y 2 mM DTPA, y se concentró a 5.6 mg/ml. El anticuerpo se tiolizó por incubación con un exceso molar de 7.5 veces de 2-iminotiolano durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por la desalación a pH 6.0 de solución reguladora de 50 mM HEPES conteniendo 5mM de glicina, 2 mM de DTPA y 3% (v/v) glicerol usando una columna Sephadex G-25. El anticuerpo tiolizado se mantuvo en hielo mientras que se determinó el número de grupos tiol introducido. Esto se logró por la reacción de una muestra de anticuerpo tiolizado con ditiodipiridina (DTDP) . La absorbancia a 280nm se midió para determinar la concentración de proteína en las muestras y luego se incubó una alícuota de cada muestra (0.9 ml) conO.l ml de dTDP (5 mM de solución madre en etanol) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras en blanco de la solución reguladora sola más DTDP se incubaron a lo largo del tiempo. La absorbancia a 324 nm se midió y el número de tioles presentes por anticuerpo se cuantificó usando un coeficiente de extinción para tiopiridina de 19800 M"1. El anticuerpo tiolizado se incubó con el doble del exceso molar del Compuesto A, 5 mM de solución madre en 10% (v/v) DMSO/90% (v/v) de éter dimetílico de etilenglicol, se agregó al anticuerpo tiolizado junto con suficiente éter dimetílico de etilenglicol para llevar la concentración final a 5% (v/v) . Después de la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas, se purificó el conjugado de anticuerpo-Compuesto A por cromatografía de intercambio iónico. La mezcla de reacción se aplicó a una columna de SP-Sepharose previamente equilibrada en solución reguladora A (50 mM HEPES, 5 mM glicina, 3% (v/v) glicerol, pH 6.). La columna se lavó con solución reguladora A, luego con 95% de solución reguladora A, 5% de solución reguladora B (50 mM HEPES, ÍM NaCl, 5mM glicina, 3% (v/v) glicerol, pH 7.2) y luego el conjugado de anticuerpo-Compuesto A se eluyó con 10% de solución reguladora B, 90% de solución reguladora A. Las fracciones que contienen conjugado monomérico se recuperaron y combinaron y el pH se ajustó a 7.2 por adición de monoetanolamina. El conjugado purificado resultante se dializó luego en 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM glicina, 3% (v/v) glicerol, pH 7.2 y luego se concentró en una célula agitada bajo nitrógeno, usando una membrana de corte de 10 kDa. Las concentraciones y relaciones de sustitución (numero de moléculas de fármaco conectadas por molécula de anticuerpo) del conjugado se determinó usando absorbancia a 280 nm y 340 nm, por referencia a los coeficientes de extinción del anticuerpo y el Compuesto A en cada longitud de onda como se midió previamente. El conjugado de control de isotipo (anti-CD70 2H5) se preparó usando el mismo método excepto que la elusión de conjugado de la columna de intercambio iónico se logró con 5% de solución reguladora B, 85% solución reguladora A. La eficacia y selectividad de los conjugados se determinó usando xenoinjertos de carcinoma de próstata humana LNCaP desarrollados en ratones macho CB17.SCID como se describió antes. El diseño de este estudio de xenoinjerto se resumió en la Tabla 3.

Tabla 3: Resumen de Estudio de Xenoinjerto LNCaP Como se muestra en la Tabla 3 y Figs. 19-20, 0.15 µmol/kg de anti-AMEP-Compuesto A (Fig. 19) tuvo mejor eficacia anti-tumoral que 0.90 µmol/kg de isotipo de control-Compuesto A, indicando por lo menos selectividad de >6x (Fig. 20). 0.90 µmol/kg de anti-AMEP-Compuesto A solo mostró toxicidad temporal (Figs. 21-22) y estuvo por debajo de la dosis tolerada máxima. Por lo tanto, un índice terapéutico sobre 6 veces se identificó para anti-AMEP-Compuesto A en ratones portadores de tumor LNCaP.

C. Eficacia en Tumores Grandes Anti-AMEP (2A10) se intercambió por la solución reguladora en solución reguladora de fosfato 0. ÍM pH 8.0 conteniendo 50 mM NaCl y 2 mM DTPA, y se concentró a 5.6 mg/ml. El anticuerpo se tiolizó por incubación con un exceso molar de 7.5 veces de 2-iminotiolano durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por la desalación a pHd.O de solución reguladora de 50 mM HEPES conteniendo 5mM de glicina, 2 mM de DTPA y 3% (v/v) glicerol usando una columna Sephadex G-25. El anticuerpo tiolizado se mantuvo en hielo mientras que se determinó el número de grupos tiol introducido. Esto se logró por la reacción de una muestra de anticuerpo tiolizado con ditiodipiridina (DTDP) . La absorbancia a 280nm se midió para determinar la concentración de proteína en las muestras y luego se incubó una alícuota de cada muestra (0.9 ml) con 0.1 ml de DTDP (5 mM de solución madre en etanol) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras en blanco de la solución reguladora sola más DTDP se incubaron a lo largo del tiempo. La absorbancia a 324 nm se midió y el número de tioles presentes por anticuerpo se cuantificó usando un coeficiente de extinción para tiopiridina de 19800 M"1. El anticuerpo tiolizado se incubó con el doble del exceso molar del Compuesto A, 5 mM de solución madre en 10% (v/v) DMSO/90% (v/v) de éter dimetilico de etilenglicol, se agregó al anticuerpo tiolizado junto con suficiente éter dimetílico de etilenglicol para llevar la concentración final a 5% (v/v) . Después de la incubación a temperatura ambiente durante 2 horas, se purificó el conjugado de anticuerpo-Compuesto A por cromatografía de intercambio iónico. La mezcla de reacción se aplicó a una columna de SP-Sepharose previamente equilibrada en solución reguladora A (50 mM HEPES, 5 mM glicina, 3% (v/v) glicerol, pH 6.). La columna se lavó con solución reguladora A, luego con 95% de solución reguladora A, 5% de solución reguladora B (50 mM HEPES, ÍM NaCl, 5mM glicina, 3% (v/v) glicerol, pH 7.2) y luego el conjugado de anticuerpo-Compuesto A se eluyó con 10% de solución reguladora B, 90% de solución reguladora A. Las fracciones que contienen conjugado monomérico se recuperaron y combinaron y el pH se ajustó a 7.2 por adición de monoetanolamina. El conjugado purificado resultante se dializó luego en 50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM glicina, 3% (v/v) glicerol, pH 7.2 y luego se concentró en una célula agitada bajo nitrógeno, usando una membrana de corte de 10 kDa. Las concentraciones y relaciones de sustitución (numero de moléculas de fármaco conectadas por molécula de anticuerpo) del conjugado se determinó usando absorbancia a 280 nm y 340 nm, por referencia a los coeficientes de extinción del anticuerpo y el Compuesto A en cada longitud de onda como se midió previamente. El conjugado de control de isotipo (anti-CD70 2H5) se preparó usando el mismo método excepto que la elusión de conjugado de la columna de intercambio iónico se logró con 5% de solución reguladora B, 85% solución reguladora A. La eficacia y selectividad de los conjugados se determinó usando xenoinjertos de carcinoma de próstata humana LNCaP desarrollados en ratones macho CB17.SCID como se describió antes. El diseño de este estudio de xenoinjerto se resumió en las Tablas 4 y 5.

Tabla 4. Resumen de Estudio de Xenoinjerto LNCaP Como ose muestra en la Tabla 4 y Fig. 23, una sola dosis baja de 0.15 µmol/kg de Anti-AMEP-Compuesto A inhibió en gran parte el desarrollo de tumores de INCaP grandes establecidos de tamaños promedio de 240 mm3. En Contraste, 0.15 µmoles/kg de control de isotipo-Compuesto A tuvo eficacia anti-tumoral minima. Como se muestra en la Tabla 5 y Fig. 24, una sola dosis de 0.30 µmol/kg de anti-AMEP-Compuesto A indujo la regresión y se inhibió el crecimiento de tumores de INCaP muy grandes de tamaños promedio de 430 mm .

Tabla 5. Resumen de Estudio de Xenoinjerto LNCaP Cada una de las solicitudes de patentes, patente, publicaciones y otros documentos publicados mencionados o denominados en esta especificación se incorpora aquí por referencia en su totalidad, al mismo grado que cada solicitud de patentes individual, patente, publicación y otros documentos publicados se indicó específica e individualmente para incorporarse por referencia. Mientras la presente invención se ha descrito con referencia a las modalidades específicas de la misma, se deberá entender por los expertos en la materia que se pueden hacer varios cambios y se pueden sustituir equivalentes sin alejarse del espíritu y alcance de la invención y las reivindicaciones anexas. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación particular, material, composición de materia, proceso, paso o pasos de proceso, al objetivo, espíritu y alcance de la presente invención. Se pretende que dichas modificaciones estén dentro del alcance de las reivindicaciones anexas a la misma.

RESUMEN DE LISTAS DE SECUENCIA

Claims (55)

REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente al antígeno de membrana específica de próstata (AMEP) , en donde el anticuerpo tiene una temperatura de fusión de por lo menos 67 °C.

2.- El anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una temperatura de fusión de por lo menos 69°C.

3.- El anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene una temperatura de fusión de por lo menos 71°C.

4.- Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión de antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de, o derivado de un gen VH 3-30.3 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP.

5.- Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión de antígeno del mismos, comprendiendo: a) una región variable de cadena pesada de un gen VH 3-30.3 humano; y b) una región variable de cadena aligera de un gen V? L18 humano; en donde el anticuerpo se une específicamente a PSMA.

6.- Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión de antígeno del mismo comprendiendo una región variable de cadena ligera que es el producto de, o derivado de un gen V? L18 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP.

7.- Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión de antígeno del mismo, comprendiendo: a) una región variable de cadena pesada de un gen VH humano; y b) una región variable de cadena ligera de un gen V? humano; en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP.

8.- Un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo, comprendiendo: (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 9, 10, 11, y 12; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 13, 14, 15, y 16; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1|7, 18, 19, y 20; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 21, 22, 23, y 24; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 25, 26, 27, y 28; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32; en donde el anticuerpo se une específicamente a AMEP.

9.- El anticuerpo de la reivindicación 8, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 9; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 13; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 17; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 21; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 25; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 29.

10.- El anticuerpo de la reivindicación 8, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 10; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 14; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 18; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 22; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 26; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 30.

11.- El anticuerpo de la reivindicación 8, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 11; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 15; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 19; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 23; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 27; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 31.

12.- El anticuerpo de la reivindicación 8, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada CDRl que comprende SEC ID NO: 12; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende SEC ID NO: 16; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende SEC ID NO: 20; (d) una región variable de cadena ligera CDRl que comprende SEC ID NO: 24; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende SEC ID NO: 28; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende SEC ID NO: 32. 13.- Un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión de antígeno del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 1, 2, 3, y 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEC ID NO: 5, 6, 7, y 8; en donde el anticuerpo se une específicamente a

AMEP.

14.- El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 5.

15.- El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 6.

16.- El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 7.

17.- El anticuerpo de la reivindicación 13, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 8.

18.- Una composición que comprende el anticuerpo, o porción de unión de antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19.- Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, o porción de unión de antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, ligado a un agente terapéutico.

20.- Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 19, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21.- El inmunoconjugado de la reivindicación 19, en donde el agente terapéutico es una citotoxina.

22.- Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 21 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23.- El inmunoconjugado de la reivindicación 19, en donde el agente terapéutico es un isotipo radioactivo.

24.- Una composición que comprende un inmunoconjugado de la reivindicación 23, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

25.- Una molécula biespecífica que comprende el anticuerpo, o porción de unión de antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, ligado a una segunda porción funcional que tiene una especificidad de unión diferente a dicho anticuerpo, o porción de unión de antígeno del mismo.

26.- Una composición que comprende la molécula biespecífica de la reivindicación 25, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

27.- Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo, o porción de unión de antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-17. 28.- Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación

28.

29.- Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 28.

30.- Un ratón transgénico que comprende un transgen de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el ratón expresa el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

31.- Un hibridoma preparado del ratón de la reivindicación 30, en donde el hibridoma produce dicho anticuerpo .

32.- Un método para inhibir el crecimiento de un tumor en un sujeto, en donde las células del tumor o células endoteliales vasculares próximas al AMEP, que comprende administrar a un sujeto el anticuerpo, o porción de unión de antígeno del mismo, o cualquiera de las reivindicaciones 1-17 en una cantidad efectiva para inhibir crecimiento del tumor.

33.- El método de la reivindicación 32, en donde el tumor es un tumor de cáncer de próstata.

34.- El método de la reivindicación 32, en donde el tumor es de cáncer seleccionado del grupo que consiste de colon, renal, rectal, urotelial, mama, vejiga, hígado, páncreas o melanoma.

35.- Un método para preparar un anticuerpo anti-EMPA que comprende : (a) proveer: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDRl que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 9, 10, 11, y 12, una secuencia de CDR2 que se selecciona del grupo que consiste de Sec ID NO: 13, 14, 15 y 16; y una secuencia de CDR3 que se seleccionadle grupo que consiste de SEC ID NO: 17. 18, 19 y 20; o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDRl que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 21, 22, 23, y 24, una secuencia de CDR2 que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 25, 26, 27, y 28, y una secuencia de CDR3 que se selecciona del grupo que consiste de SEC ID NO: 29, 30, 31, y 32; (b) alterar por lo menos un residuo de aminoácidos dentro de por lo menos una secuencia de anticuerpo de región variable, dicha secuencia siendo seleccionada de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera, para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo alterada; y (c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.

36.- Un método para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor en un sujeto, en donde las células del tumor o células endoteliales vasculares próximas al tumor expresan AMEP, o porción de unión de antígeno del mismo, en combinación con un agente anti-tumoral en una cantidad efectiva para inhibir o prevenir el crecimiento del tumor.

37.- El método de la reivindicación 36, en donde la administración a dicho sujeto del anticuerpo anti-AMEP, o porción de unión de antígeno del mismo, en combinación con dicho agente anti-tumoral, conduce a un efecto sinergístico en la inhibición del crecimiento de dicho tumor.

38.- El método de la reivindicación 36, en donde dicho agente anti-tumoral ocasiona daño en la masa tumoral, conduciendo así a una citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA) del tumor.

39.- El método de la reivindicación 36, en donde el anticuerpo anti-PSMA es el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-17.

40.- El método de la reivindicación 36, en donde dicho anticuerpo anti-AMEP es el anticuerpo 7F12.

41.- El método de la reivindicación 36, en donde el anticuerpo anti-AMEP es el anticuerpo 2A10.

42.- El método de la reivindicación 36, en donde dicho agente anti-tumoral es un agente quimioterapéutico.

43.- El método de la reivindicación 36, en donde el tumor es de un cáncer seleccionado del grupo que consiste de colon, renal, rectal, urotelial, mama, vejiga, hígado, páncreas y melanoma.

44.- El método de la reivindicación 36, en donde el agente anti-tumoral es un agente quimioterapéutico.

45.- El método de la reivindicación 44, en donde dicho agente quimioterapéutico es Taxotere® (docetaxel).

46.- El método de la reivindicación 36, en donde el agente anti-tumoral es un agente anti-angiogénico.

47.- El método de la reivindicación 46, en donde el agente anti-angiogénico se selecciona del grupo que consiste de angiostatina Kl-3, Arreten, aaAT, Canstatina, DL-a-difluorometil-ornitina, Endostatina, Fumagilina, Genisteina, Minociclina, Staruosporina, Thalidomida, y Tumstatina.

48.- El método de la reivindicación 36, en donde el agente anti-tumoral es un agente inmno odulador .

49.- El método de la reivindicación 48, en donde dicho agente inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos anti-PDI, anticuerpos anti-CTLA-4, fosforotiolato oligodesoxiribonucleótido (1018 ISS), vacunas de gen GM-CSF, interleucina 2, interleucina 7 (CYT 99 07), interleucina 12 e interleucina 21.

50.- Un método para estimular citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (CCDA) de un tumor en un sujeto, en donde las células de tumor o células endoteliales vasculares próximas al tumor expresan AMEP, comprendiendo administrar a un sujeto un anticuerpo anti-AMEP, o porción de unión de antígeno del mismo, en combinación con un agente anti-tumoral en una cantidad efectiva para estimular citotoxicidad mediada por células que dependen de anticuerpos (CCDA) del tumor.

51.- Un método para inhibir la caquexia relacionada con tumor en un sujeto, en donde las células del tumor o próximas a células endoteliales vasculares al tumor expresan AMEP, comprendiendo administrar a un sujeto un anticuerpo anti-AMEP, o porción de unión de antígeno del mismo, en combinación con un agente anti-tumoral en una cantidad efectiva para inhibir caquexia relacionada con tumor en el sujeto.

52.- Una composición que comprende un anticuerpo anti-AMEP y un agente anti-tumoral en una cantidad efectiva para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

53.- Una composición que comprende un anticuerpo anti-AMEP y un agente anti-tumoral en una cantidad efectiva para estimular citotoxicidad mediada por células que dependen de anticuerpo (CCAD) de un tumor y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

54.- Un método para un agente anti-tumoral capaz de actuar sinergisticamente con un anticuerpo anti-AMEP PARA inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor, en donde las células del tumor o células endoteliales vasculares próximas al tumor expresan AMEP, comprendiendo. poner en contacto una composición indicadora con: (a) un agente anti-tumoral de prueba solo, (b) un anticuerpo anti-AMEP solo, y (c) un agente anti-tumoral de prueba y un anticuerpo anti-AMEP; y comparar la capacidad de (a) el agente anti-tumoral solo y (b) el anticuerpo anti-AMEP solo para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor a la capacidad de (c) el agente anti-tumoral y el anticuerpo anti-AMEP para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor, en donde la inhibición o prevención de crecimiento tumoral por (c) en una cantidad que es mayor al efecto de aditivo de (a) y (b) podría conducir a la identificación de un agente anti-tumoral capaz de activarse sinergísticamente con un anticuerpo anti-AMEP para inhibir o prevenir el crecimiento de un tumor.

55.- El método de la reivindicación 54, en donde la composición del indicador es un modelo animal para un tumor.