KR101527342B1

KR101527342B1 - 글리피칸-3에 대한 단클론 항체

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Publication number: KR101527342B1
Application number: KR1020157007446A
Authority: KR
Inventors: 조나선 알렉산더 테렛; 리-솅 루; 하이춘 후앙; 다펭 야오; 친 판; 하이디 르블랑; 티모시 스프롤; 마크 야마나카
Original assignee: 메다렉스, 엘.엘.시.
Priority date: 2007-07-17
Filing date: 2008-07-17
Publication date: 2015-06-09
Also published as: ES2562790T3; US20140186892A1; JP2010533498A; MX2010000537A; US9217033B2; US8680247B2; AU2008275985B2; AU2008275985A1; SI2178921T1; RS54624B1; KR20150038732A; WO2009012394A1; CY1117236T1; EP2178921B1; EP2178921A1; DK2178921T3; US20100209432A1; PL2178921T3; KR101570252B1; JP5868593B2

Abstract

본 발명에서는 높은 친화력으로 글리피칸(Glypican)-3에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체, 특히 인간 단클론 항체를 개시한다. 글리피칸-3 항체를 인코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포와 글리피칸-3 항체를 발현하는 방법 역시 개시된다. 글리피칸-3 항체를 포함하는 면역접합체(immunoconjugate), 이중특이적(bispecific) 분자와 제약학적 조성물 역시 개시된다. 글리피칸-3을 검출하는 방법, 그리고 간세포 암(hepatocellular cancer)을 비롯한 다양한 글리피칸-3-관련된 장애를 치료하는 방법이 개시된다.

Description

글리피칸-3에 대한 단클론 항체{Monoclonal Antibodies Against Glypican-3}

본 발명은 높은 친화력으로 글리피칸(Glypican)-3에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체, 특히 인간 단클론 항체에 관계한다.

본 발명의 배경기술

글리피칸-3은 글리코실-포스파티딜이노시톨(glycosyl-phosphatidylinositol) -고정된 헤파린 술페이트 프로테오글리칸(heparin sulfate proteoglycan)의 글리피칸 집단에 속하는 종양 태아성 항원(oncofetal antigen)이다. 글리피칸은 헤파린술페이트 글리코사미노글리칸(heparinsulphate glycosaminoglycan)으로 불리는 복잡한 다당류 사슬(polysaccharide chain)에 공유 연결(covalent linkage)로 특징된다. 글리피칸은 세포-세포외 간질 접촉면(cellular-extracellular matrix interface)에서 세포 신호전달(cell signaling)에 관여한다(Sasisekharan et al., Nature Reviews | Cancer, Volume 2 (2002)). 현재까지, 인간 글리피칸 집단의 6가지 독특한 구성원이 확인되었다. 세포 막-결합된 글리피칸-3은 하나 이상의 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 연결된 2개의 아단위(subunit)로 구성된다.

글리피칸-3은 발달(development) 동안 태아 간과 태반(placenta)에서 발현되고 정상적인 성체 조직(adult tissue)에서 하향-조절되거나 침묵된다. 글리피칸-3 유전자에서 돌연변이와 결실은 인간에서 Simpson-Golabi-Behmel 증후군 또는 Simpson dysmorphia 증후군의 원인이 된다. 글리피칸-3은 다양한 암, 특히 간세포 암종(hepatocellular carcinoma, “HCC”), 흑색종(melanoma), 윌름 종양(Wilm’s tumor), 그리고 간모세포종(hepatoblastoma)에서 발현된다(Jakubovic and Jothy; Ex. Mol. Path. 82:184-189 (2007); Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)).

HCC는 전세계적으로 암-관련된 사망의 세 번째 원인이다. 매년, 대략 1백만 명이 HCC로 사망한다(Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005)). B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), 그리고 간 경변(cirrhosis)에 이르는 만성적인 알코올 중독(chronic heavy alcohol use)은 HCC의 가장 일반적인 원인이다. 이의 발생률(incidence)은 C형 간염 바이러스 감염의 확산으로 인하여 미국에서 급증하고 있고, 차기 20년 동안 증가할 것으로 예상된다. HCC는 주로, 간 이식(liver transplantation) 또는 종양 절제(tumor resection)로 치료된다. 환자 예후(patient prognosis)는 기초 간 기능(underlying liver function)과 종양이 진단되는 단계 둘 모두에 좌우된다(Parikh and Hyman, Am J Med. 120(3):194-202 (2007)). 효과적인 HCC 치료 전략이 요구된다.

본 발명의 요약

본 발명에서는 글리피칸-3에 결합하고 다수의 바람직한 특성을 나타내는 분리된 단클론 항체, 특히 인간 단클론 항체를 제시한다. 이들 특성에는 인간 글리피칸-3에 높은 친화력 결합(affinity binding)이 포함된다.

한 측면에서, 본 발명은 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관계하는데, 여기서 상기 항체는

(a) 1x10^-7 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하고;

(b) 글리피칸-3으로 형질감염(transfection)된 인간 CHO 세포에 결합한다.

적절하게는, 상기 항체는 인간 항체이지만, 대안적 구체예에서, 상기 항체는 뮤린(murine) 항체, 키메라(chimeric) 항체 또는 인간화(humanized) 항체일 수 있다.

한 구체예에서, 상기 항체는 5 x 10^-8 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 2 x 10^-8 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 1 x 10^-8 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 5x10^-9 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 4x10^-9 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 3x10^-9 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 또는 2 x 10^-9 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제시하는데, 여기서 상기 항체는 글리피칸-3에 결합에 대하여 참고 항체와 교차-경쟁(cross-compete)하고, 상기 참고 항체는

(a) SEQ ID NO:19, 20과 21로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region); 그리고

(b) SEQ ID NO:22, 23과 24로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(light chain variable region)을 포함한다.

다양한 구체예에서, 참고 항체는

(a) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고

(b) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고; 또는, 참고 항체는

(a) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고

(b) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

또는, 참고 항체는

(a) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고

(b) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명에서는 인간 V_H 5-51 유전자의 산물이거나 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 상기 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합한다. 본 발명에서는 또한, 인간 V_K A27 유전자의 산물이거나 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 상기 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합한다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에서는

(a) 인간 V_H5-51 유전자의 중쇄 가변 영역; 그리고

(b) 인간 V_K A27 유전자의 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분에 관계하는데, 여기서 상기 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합한다.

다른 측면에서, 본 발명에서는 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제시하는데, 여기서

(a) 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 SEQ ID NO:7, 8과 9의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형(conservative modification)으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;

(b) 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 SEQ ID NO:16, 17과 18의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;

(c) 상기 항체는 1x10^-7 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하고; 또는

(d) 글리피칸-3으로 형질감염된 인간 CHO 세포에 결합한다.

적절하게는, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 SEQ ID NO:4, 5와 6의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 SEQ ID NO:13, 14와 15의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 적절하게는, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 SEQ ID NO:1, 2와 3의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 SEQ ID NO:10, 11과 12의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

바람직한 조합은

(a) SEQ ID NO:1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) SEQ ID NO:4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) SEQ ID NO:7을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) SEQ ID NO:10을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) SEQ ID NO:13을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 그리고

(f) SEQ ID NO:16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

다른 바람직한 조합은

(a) SEQ ID NO:2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) SEQ ID NO:5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) SEQ ID NO:8을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) SEQ ID NO:11을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) SEQ ID NO:14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 그리고

(f) SEQ ID NO:17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

다른 바람직한 조합은

(a) SEQ ID NO:3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) SEQ ID NO:6을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) SEQ ID NO:9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) SEQ ID NO:12를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) SEQ ID NO:15를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 그리고

(f) SEQ ID NO:18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 항체, 또는 이들의 항원 결합 부분은

(a) SEQ ID NO:19, 20과 21로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고

(b) SEQ ID NO:22, 23과 24로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고;

여기서 상기 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합한다.

바람직한 조합은

(b) SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 바람직한 조합은

본 발명의 다른 측면에서, 글리피칸-3에 결합에 대하여 상기한 임의의 항체와 경쟁하는 항체 또는 이들의 항원-결합 부분이 제시된다.

본 발명의 항체는 예로써, 전장(full-length) 항체, 예를 들면, IgG1 또는 IgG4 아이소타입(isotype)의 전장 항체일 수 있다. 대안으로, 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fab, Fab’ 또는 Fab’2 단편, 또는 단일 사슬(single chain) 항체일 수 있다.

본 발명에서는 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하고 치료 약제(therapeutic agent), 예를 들면, 세포독소(cytotoxin) 또는 방사성 동위원소(radioactive isotope)에 연결된 면역접합체(immunoconjugate)를 제시한다. 본 발명에서는 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 상이한 결합 특이도(binding specificity)를 갖는 두 번째 기능성 모이어티(functional moiety)에 연결된 이중특이적(bispecific) 분자를 제시한다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자와 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 또한 제시된다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩하는 핵산 분자, 그리고 이들 핵산을 포함하는 발현 벡터와 이들 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포 역시 본 발명에 포함된다.

본 발명에서는 글리피칸-3을 발현하는 종양 세포의 성장을 저해하는 방법을 제시한다. 이들 방법은 종양 세포의 성장을 저해하는 효과량으로 이들 세포를 항-글리피칸-3 항체 또는 이의 항원-결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 종양 세포는 간 조직으로부터 유래된다. 부가적으로, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 면역접합체일 수 있다. 본 발명의 면역접합체는 치료 약제, 예를 들면, 세포독소 또는 방사성 동위원소일 수 있다.

본 발명의 다른 특징과 장점은 제한으로 간주되지 않는 아래의 상세한 설명과 실시예로부터 명백할 것이다. 본 명세서 전반에서 언급된 모든 참고문헌, Genbank 기재, 특허와 공개된 특허 출원의 내용은 본 발명에서 명백히 참조로서 편입된다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명은 높은 친화력으로 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는 분리된 단클론 항체, 특히 인간 단클론 항체에 관계한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 특정의 중쇄와 경쇄 배선 서열로부터 유래되고 및/또는 특정의 구조적 특징(structural feature), 예를 들면, 특정의 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역을 포함한다. 본 발명에서는 분리된 항체, 이들 항체를 제조하는 방법, 이들 항체를 포함하는 면역접합체와 이중특이적 분자, 그리고 본 발명의 항체, 면역접합체 또는 이중특이적 분자를 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다. 본 발명은 또한, 예로써 글리피칸-3을 검출하고, 그리고 글리피칸-3의 발현과 연관된 질환, 예를 들면, 글리피칸-3을 발현하는 간 세포 악성종양을 치료하기 위하여 이들 항체를 이용하는 방법에 관계한다. 따라서 본 발명에서는 간 세포 악성종양, 예를 들면, HCC를 치료하기 위하여 본 발명의 항-글리피칸-3 항체를 이용하는 방법을 제시한다.

본 발명이 더욱 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위하여, 일정한 용어가 먼저 정의된다. 부가적인 정의는 상세한 설명 전반에서 열거된다.

용어 “글리피칸-3”, “글리피칸 프로테오글리칸 3”, “GPC3”, “OTTHUMP00000062492”, “GTR2-2”, “SGB”, “DGSX”, “SDYS”, “SGBS”, “OCI-5”와 “SGBS1”은 동의어로서 이용되고, 여기에는 인간 글리피칸-3의 변이체(variant), 동종형(isoform)과 종 동족체(species homolog)가 포함된다. 따라서 본 발명의 인간 항체는 일정한 사례에서, 인간 이외의 종으로부터 글리피칸-3과 교차-반응(cross-reaction)한다. 특정 구체예에서, 항체는 하나 이상의 인간 글리피칸-3 단백질에 완전히 특이적이고, 종 교차-반응성(species cross-reactivity) 또는 다른 유형의 비-인간 교차-반응성(non-human cross-reactivity)을 나타내지 않는다. 전형적인 인간 글리피칸-3의 완전한 아미노산 서열은 Genbank/NCBI 수탁 번호 NM_004484(SEQ ID NO:36)를 갖는다.

용어 “면역 반응(immune response)”은 침입 병원균(invading pathogen), 병원균으로 감염된 세포 또는 조직, 암 세포, 또는, 자가면역(autoimmunity) 또는 병리학적 염증(pathological inflammation)의 경우에, 정상적인 인간 세포 또는 조직에 선택적인 손상, 이들의 파괴, 또는 인체로부터 이들의 소멸을 결과하는, 예로써 림프구(lymphocyte), 항원 제시 세포(antigen presenting cell), 식세포(phagocytic cell), 과립구(granulocyte), 그리고 상기 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자(soluble macromolecule)(항체, 사이토킨(cytokine)과 보체(complement))의 작용을 지칭한다.

“신호 전달 경로(signal transduction pathway)”는 세포의 한 부분에서 세포의 다른 부분으로 신호의 전달에서 일정한 역할을 수행하는 여러 신호 전달 분자 사이에 생화학적 상관관계(biochemical relationship)를 지칭한다. 본 명세서에서, 관용구 “세포 표면 수용체(cell surface receptor)”에는 예로써, 신호 접수와 세포의 원형질 막(plasma membrane)을 가로질러 이런 신호의 전달이 가능한 분자와 분자 복합체가 포함된다. 본 발명의 “세포 표면 수용체”의 실례는 글리피칸-3 수용체이다.

본 명세서에서, 용어 “항체”에는 완전 항체와 임의의 항원 결합 단편(즉, “항원-결합 부분”) 또는 이들의 단일 사슬이 포함된다. “항체”는 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 서로 연결된 적어도 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질(glycoprotein), 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(heavy chain variable region)(V_H로서 약칭됨)과 중쇄 불변 영역(heavy chain constant region)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, C_H1, C_H2와 C_H3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(light chain variable region)(V_L로서 약칭됨)과 경쇄 불변 영역(light chain constant region)으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, C_L로 구성된다. V_H와 V_L 영역은 골격 영역(framework region, FR)으로 명명된 더욱 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로 명명된 과변이(hypervariability) 영역으로 더욱 세분될 수 있다. 각 V_H와 V_L은 아미노-말단(amino-terminus)으로부터 카르복시-말단(carboxy-terminus)으로 아래의 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3과 FR4로 정렬된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다. 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인(binding domain)을 내포한다. 항체의 불변 영역은 면역계(immune system)의 다양한 세포(가령, 작동체 세포(effector cell)와 고전적 보체계(classical complement system)의 첫 번째 성분(Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자(factor)에 면역글로불린(immunoglobulin)의 결합을 매개할 수 있다.

본 명세서에서, 항체의 “항원-결합 부분”(또는, 간단하게 “항체 부분”)은 항원(가령, 글리피칸-3)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는, 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어 항체의 “항원-결합 부분”에 포함되는 결합 단편의 실례에는 (i) V_L, V_H, C_L과 C_H1 도메인으로 구성되는 일가 단편(monovalent fragment)인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역(hinge region)에서 이황화 가교(disulfide bridge)에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 이가 단편(bivalent fragment)인 F(ab’)₂ 단편; (iii) 힌지 영역의 일부를 포함하고 본질적으로 Fab인 Fab’ 단편(참조: FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) V_H와 C_H1 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (v) 항체의 단일 팔(single arm)의 V_L과 V_H 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (vi) V_H 도메인으로 구성되는 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vii) 분리된 상보성 결정 영역(CDR); 그리고 (viii) 단일 가변 도메인과 2개의 불변 도메인을 내포하는 중쇄 가변 영역인 나노바디(nanobody)가 포함된다. 더 나아가, Fv 단편의 2개 도메인, V_L과 V_H가 별개의 유전자에 의해 코딩되긴 하지만, 이들은 V_L과 V_H 영역이 쌍을 이뤄 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려져 있음)로서 제조를 가능하게 하는 합성 링커(synthetic linker)에 의해, 재조합 방법(recombinant method)을 이용하여 연결될 수 있다(예로써, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 그리고 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 참조). 이런 단일 사슬 항체 역시 용어 항체의 “항원-결합 부분”에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 전통적인 기술을 이용하여 획득되고, 이들 단편은 본래 항체에서와 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝(screening)된다.

본 명세서에서, “분리된 항체”는 상이한 항원 특이도를 갖는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 지칭하도록 의도된다. (가령, 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 글리피칸-3 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 존재하지 않는다). 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 하지만, 다른 항원, 예를 들면, 다른 종으로부터 글리피칸-3 분자에 교차-반응성(cross-reactivity)을 나타낼 수 있다. 게다가, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “단클론 항체” 또는 “단클론 항체 조성물”은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제조물을 지칭한다. 단클론 항체 조성물은 특정의 에피토프(epitope)에 대한 단일 결합 특이도와 친화력을 나타낸다.

본 명세서에서, 용어 “인간 항체”는 골격 영역과 CDR 영역 둘 모두 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 내포하는 항체를 포함하도록 의도된다. 더 나아가, 항체가 불변 영역을 내포하면, 상기 불변 영역 역시 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(가령, 시험관내에서 무작위 또는 특정 부위 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이(somatic mutation)에 의해 도입된 돌연변이). 하지만, 본 명세서에서, 용어 “인간 항체”는 다른 포유동물 종, 예를 들면, 생쥐의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열 상에 접합된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.

용어 “인간 단클론 항체”는 골격 영역과 CDR 영역 둘 모두 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 포함하고 단일 결합 특이도를 나타내는 항체를 지칭한다. 한 구체예에서, 인간 단클론 항체는 인간 중쇄 도입유전자(transgene)와 경쇄 도입유전자를 포함하는 유전체(genome)이 영속화 세포에 융합된 유전자도입(transgenic) 비-인간 동물, 예를 들면, 유전자도입 생쥐로부터 획득된 B 세포를 포함하는 하이브리도마(hybridoma)에 의해 생산된다.

본 명세서에서, 용어 “재조합 인간 항체”에는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 산출되거나, 또는 분리된 모든 인간 항체, 예를 들면, (a) 인간 면역글로불린 유전자에 대하여 유전자도입 또는 염색체도입(transchromosomal)인 동물(가령, 생쥐) 또는 이들로부터 제조된 하이브리도마(하기에 더욱 상세하게 기술됨)로부터 분리된 항체, (b) 인간 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들면, 이입세포(transfectoma)로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 그리고 (d) 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 절단접합(splicing)을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 산출되거나, 또는 분리된 항체가 포함된다. 이런 재조합 인간 항체는 골격 영역과 CDR 영역이 인간 배선 면역글로불린 서열로부터 유래되는 가변 영역을 포함한다. 하지만, 특정 구체예에서, 이런 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 동물 유전자도입이 이용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)이 수행될 수 있고, 따라서 재조합 항체의 V_H와 V_L영역의 아미노산 서열은 인간 배선 V_H와 V_L 서열로부터 유래되고 이들 서열에 관련되지만, 생체내에서 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않는 서열이다.

본 명세서에서, “아이소타입(isotype)”은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 항체 분류(가령, IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.

관용구 “항원을 인식하는 항체”와 “항원에 특이적인 항체"는 본 명세서에서, 용어 “항원에 특이적으로 결합하는 항체”와 동의어로서 이용된다.

용어 “인간 항체 유도체”는 인간 항체의 변형된 형태, 예를 들면, 항체와 다른 작용제 또는 항체의 접합체(conjugate)를 지칭한다.

용어 “인간화 항체”는 다른 포유동물 종, 예를 들면, 생쥐의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열 상에 접합된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.

추가적인 골격 영역 변형은 인간 골격 서열 내에서 만들어진다.

용어 “키메라 항체”는 가변 영역 서열이 한 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열이 다른 종으로부터 유래되는 항체, 예를 들면, 가변 영역 서열이 생쥐 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열이 인간 항체로부터 유래되는 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.

본 명세서에서, “인간 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는” 항체는 1 x 10^-7 M 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 5 x 10^-8 M 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 3 x 10^-8 M 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-8 M 또는 그 이하, 이보다 더욱 바람직하게는 5 x 10^-9 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하는 항체를 지칭하도록 의도된다.

본 명세서에서, 단백질 또는 세포에 “실질적으로 결합하지 않는”은 상기 단백질 또는 세포에 결합하지 않거나, 또는 높은 친화력으로, 다시 말하면, 1 x 10^-6 M 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-5 M 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-4 M 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-3 M 또는 그 이상, 이보다 더욱 바람직하게는 1 x 10^-2 M 또는 그 이상의 K_D로 결합하지 않는다는 것을 의미한다.

본 명세서에서, 용어 “K_assoc” 또는 “K_a”는 특정의 항체-항원 상호작용의 결합 속도(association rate)를 지칭하도록 의도되는 반면, 본 명세서에서 용어 “K_dis” 또는 “K_d”는 특정의 항체-항원 상호작용의 해리 속도(dissociation rate)를 지칭하도록 의도된다. 본 명세서에서, 용어 “K_D”는 K_d 대(對) K_a의 비율(즉, K_d/K_a)로부터 획득되고 몰 농도(molar concentration)(M)로 표시되는 해리 상수를 지칭하도록 의도된다. 항체에 대한 K_D 수치는 당분야에 널리 확립된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 항체의 K_D를 측정하기 위한 바람직한 방법은 가급적, 바이오센서(biosensor) 시스템, 예를 들면, Biacore® 시스템을 이용한 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)이다.

본 명세서에서, IgG 항체에 대한 “높은 친화력”은 표적 항원에 대하여 1 x 10^-7 M 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 5 x 10^-8 M 또는 그 이하, 이보다 더욱 바람직하게는 1x10^-8 M 또는 그 이하, 이보다 더욱 바람직하게는 5 x 10^-9 M 또는 그 이하, 그리고 이보다 더욱 바람직하게는 1 x 10^-9 M 또는 그 이하의 K_D를 갖는 항체를 지칭한다. 하지만, “높은 친화력” 결합은 다른 항체 아이소타입의 경우에 변할 수 있다. 가령, IgM 아이소타입에 대한 “높은 친화력” 결합은 10^-6 M 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 10^-7 M 또는 그 이하, 이보다 더욱 바람직하게는 10^-8 M 또는 그 이하의 K_D를 갖는 항체를 지칭한다.

본 명세서에서, 용어 “개체”에는 임의의 인간 또는 비-인간 동물이 포함된다. 용어 “비-인간 동물”에는 모든 척추동물, 예를 들면, 포유동물과 비-포유동물, 예를 들면, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 양서류, 파충류 등이 포함된다.

본 발명의 다양한 측면은 아래의 하위섹션에서 더욱 상세하게 기술된다.

항-글리피칸-3 항체

본 발명의 항체는 이들 항체의 특정의 기능적 특징 또는 특성으로 특징된다. 가령, 상기 항체는 인간 글리피칸-3에 특이적으로 결합한다. 적절하게는, 본 발명의 항체는 높은 친화력으로, 예를 들면, 1 x 10^-7 M 또는 그 이하의 K_D로 글리피칸-3에 결합한다. 적절하게는, 본 발명의 항-글리피칸-3 항체는 아래의 특징 중에서 하나 이상을 나타낸다:

(b) 글리피칸-3으로 형질감염된 인간 CHO 세포에 결합한다.

적절하게는, 상기 항체는 5 x 10^-8 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 2 x 10^-8 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 5x10^-9 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 4x10^-9 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 3x10^-9 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합하거나, 또는 2.1 x 10 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합한다.

적절하게는, 상기 항체는 글리피칸-3에 존재하는 항원성 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프는 다른 단백질에 존재하지 않는다. 상기 항체는 전형적으로, 글리피칸-3에 결합하고 다른 단백질에 결합하지 않거나, 또는 낮은 친화력, 예를 들면, 1 x 10^-6 M 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-5 M 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-4 M 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 1 x 10^-3 M 또는 그 이상, 이보다 더욱 바람직하게는 1 x 10^-2 M 또는 그 이상의 K_D로 다른 단백질에 결합한다. 적절하게는, 상기 항체는 관련된 단백질에 실질적으로 결합하지 않는다, 가령, 상기 항체는 글리피칸-1, 글리피칸-2, 글리피칸-4 또는 글리피칸-6에 실질적으로 결합하지 않는다.

한 구체예에서, 상기 항체는 글리피칸-3을 발현하는 세포 내로 내재화된다. 예로써, HumZap 내재화 분석법을 비롯한, 항체 내재화를 평가하는 표준 분석법은 당분야에 공지되어 있다.

예로써, ELISA, 웨스턴 블랏(Western blot), RIA, 그리고 유세포 분석법(flow cytometry analysis)을 비롯한, 글리피칸-3에 대한 항체의 결합 능력을 평가하는 표준 분석법은 당분야에 공지되어 있다. 적절한 분석법은 실시예에서 상세하게 기술된다. 항체의 결합 동역학(binding kinetics)(가령, 결합 친화력) 역시 당분야에 공지된 표준 분석법, 예를 들면, Biacore® 시스템 분석법에 의해 평가될 수 있다. 종양 세포, 예를 들면, Hep-3b 또는 Hep-G2(각각, ATCC Deposit No. HB-8064와 HB-8065)에 대한 결합을 평가하기 위하여, 세포는 공개적으로 가용한 공급원, 예를 들면, American Type Culture Collection으로부터 획득될 수 있고, 표준 분석법, 예를 들면, 유세포 분석법에 이용될 수 있다.

단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10

본 발명의 바람직한 항체는 실시예 1과 2에 기술된 바와 같이 분리되고 구조적으로 특징되는 인간 단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10이다. 4A6, 11E7과 16D10의 V_H 아미노산 서열은 각각, SEQ ID NO:19, 20과 21에 도시된다. 4A6, 11E7과 16D10의 V_L 아미노산 서열은 각각, SEQ ID NO:22, 23과 24에 도시된다.

이들 각 항체가 글리피칸-3에 결합할 수 있음을 고려할 때, 이들 V_H와 V_L 서열은 본 발명의 다른 항-글리피칸-3 결합 분자를 산출하기 위하여 “혼화(mix)되고 매치(match)”될 수 있다. 이런 “혼화되고 매치”된 항체의 글리피칸-3 결합은 상기에서, 그리고 실시예에서 기술된 결합 분석법(가령, ELISA)을 이용하여 검사될 수 있다. 적절하게는, V_H와 V_L 사슬이 혼화되고 매치될 때, 특정의 V_H/V_L 쌍(pairing)으로부터 V_H 서열은 구조적으로 유사한 V_H 서열로 대체된다. 유사하게, 적절하게는, 특정의 V_H/V_L쌍으로부터 V_L 서열은 구조적으로 유사한 V_L 서열로 대체된다.

따라서 한 측면에서, 본 발명에서는

(a) SEQ ID NO: 19, 20과 21로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고

(b) SEQ ID NO: 22, 23과 24로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제시하는데,

여기서 상기 항체는 글리피칸-3, 바람직하게는 인간 글리피칸-3에 특이적으로 결합한다.

바람직한 중쇄와 경쇄 조합은

(a) SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(b) SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는

(c) SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 그리고 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명에서는 4A6, 11E7과 16D10의 중쇄와 경쇄 CDR1, CDR2와 CDR3, 또는 이들의 조합을 포함하는 항체를 제시한다. 4A6, 11E7과 16D10의 V_H CDR1의 아미노산 서열은 각각, SEQ ID NO:1, 2와 3에 도시된다. 4A6, 11E7과 16D10의 V_H CDR2의 아미노산 서열은 각각, SEQ ID NO:4, 5와 6에 도시된다. 4A6, 11E7과 16D10의 V_H CDR3의 아미노산 서열은 각각, SEQ ID NO:7, 8과 9에 도시된다. 4A6, 11E7과 16D10의 V_k CDR1의 아미노산 서열은 각각, SEQ ID NO:10, 11과 12에 도시된다. 4A6, 11E7과 16D10의 V_k CDR2의 아미노산 서열은 각각, SEQ ID NO:13, 14와 15에 도시된다. 4A6, 11E7과 16D10의 V_kCDR3의 아미노산 서열은 각각, SEQ ID NO:16, 17과 18에 도시된다. CDR 영역은 Kabat 체계(Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)를 이용하여 표시된다.

이들 각 항체가 글리피칸-3에 결합할 수 있고, 항원-결합 특이도가 일차적으로 CDR1, CDR2와 CDR3 영역에 의해 제공된다는 점을 고려할 때, V_H CDR1, CDR2와 CDR3 서열 및 V_k CDR1, CDR2와 CDR3 서열은 본 발명의 다른 항-글리피칸-3 결합 분자를 산출하기 위하여 “혼화되고 매치”될 수 있다(즉, 각 항체가 V_H CDR1, CDR2와 CDR3 및 V_k CDR1, CDR2와 CDR3을 포함해야 하지만, 상이한 항체로부터 CDR이 혼화되고 매치될 수 있다). 이런 “혼화되고 매치”된 항체의 글리피칸-3 결합은 상기에서, 그리고 실시예에서 기술된 결합 분석법(가령, ELISA, Biacore® 분석법)을 이용하여 조사될 수 있다. 적절하게는, V_H CDR 서열이 혼화되고 매치되는 경우에, 특정의 V_H 서열로부터 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 구조적으로 유사한 CDR 서열로 대체된다. 유사하게, V_k CDR 서열이 혼화되고 매치되는 경우에, 특정의 V_k 서열로부터 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열은 가급적, 구조적으로 유사한 CDR 서열로 대체된다. 신규한 V_H와 V_L 서열이 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L CDR 영역 서열을 본 발명에서 단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10에 대하여 개시된 CDR 서열로부터 구조적으로 유사한 서열로 치환함으로써 산출될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.

따라서 다른 측면에서, 본 발명에서는

(a) SEQ ID NO:1, 2와 3으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) SEQ ID NO:4, 5와 6으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) SEQ ID NO:7, 8과 9로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) SEQ ID NO:10, 11과 12로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) SEQ ID NO:13, 14와 15로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 그리고

(f) SEQ ID NO:16, 17과 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제시하는데,

바람직한 구체예에서, 상기 항체는

(a) SEQ ID NO:1을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) SEQ ID NO:4를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) SEQ ID NO:7을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) SEQ ID NO:10을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) SEQ ID NO:13을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 그리고

(f) SEQ ID NO:16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는

(a) SEQ ID NO:2를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) SEQ ID NO:5를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) SEQ ID NO:8을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) SEQ ID NO:11을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) SEQ ID NO:14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 그리고

(f) SEQ ID NO:17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

다른 바람직한 구체예에서, 상기 항체는

(a) SEQ ID NO:3을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;

(b) SEQ ID NO:6을 중쇄 가변 영역 CDR2;

(c) SEQ ID NO:9를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;

(d) SEQ ID NO:12를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;

(e) SEQ ID NO:15를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 그리고

(f) SEQ ID NO:18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3을 포함한다.

CDR1 및/또는 CDR2 도메인으로부터 독립적으로, CDR3 도메인이 단독으로 동계 항원(cognate antigen)에 대한 항체의 결합 특이도를 결정할 수 있고 공통의 CDR3 서열에 기초하여 동일한 결합 특이도를 갖는 복수의 항체가 예상대로 산출될 수 있음은 당분야에 널리 알려져 있다. 예로써, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000)(뮤린 항-CD30 항체 Ki-4의 중쇄 가변 도메인 CDR3만을 이용한 인간화 항-CD30 항체의 생산을 기술함); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000)(부모 뮤린 MOC-31 항-EGP-2 항체의 중쇄 CDR3 서열만을 이용한 재조합 상피 당단백질-2(EGP-2) 항체를 기술함); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998)(뮤린 항-인테그린 α_vβ₃ 항체 LM609의 중쇄와 경쇄 가변 CDR3 도메인을 이용한 인간화 항-인테그린 α_vβ₃ 항체의 패널을 기술함, 여기서 각 구성원 항체는 CDR3 도메인 외부에 별개의 서열을 포함하고 부모 뮤린 항체와 동등하거나 이보다 높은 친화력으로 부모 뮤린 항체에서와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994)(CDR3 도메인이 항원 결합에 가장 중요한 기여를 제공한다는 것을 개시함); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995)(인간 태반 DNA에 대한 3가지 Fab(SI-1, SI-40과 SI-32)의 중쇄 CDR3 서열의 항-파상풍 톡소이드(tetanus toxoid) Fab의 중쇄로의 접합(grafting)과 이에 따른, 기존 중쇄 CDR3의 대체를 기술하고, CDR3 도메인이 단독으로 결합 특이도를 공여한다는 것을 증명함); 그리고 Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996)(부모 다중특이적 Fab LNA3의 중쇄 CDR3 단독의 단일특이적 IgG 파상풍 톡소이드-결합 Fab p313 항체의 중쇄로의 이전이 상기 부모 Fab의 결합 특이도를 유지하는데 충분한다는 것을 증명하는 접합 연구를 기술함)를 참조한다. 이들 각 참고문헌은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다.

따라서 본 발명에서는 인간 또는 비-인간 동물로부터 유래된 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단클론 항체를 제시하는데, 여기서 상기 단클론 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 일정한 측면에서, 본 발명에서는 비-인간 항체, 예를 들면, 생쥐 또는 쥐 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단클론 항체를 제시하는데, 여기서 상기 단클론 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 구체예에서, 비-인간 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 이런 발명 항체는 (a) 결합에 대하여 상응하는 부모 비-인간 항체와 경쟁할 수 있고; (b) 기능적 특징을 유지하고; (c) 상응하는 부모 비-인간 항체에서와 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 상응하는 부모 비-인간 항체에서와 유사한 결합 친화력을 갖는다.

다른 측면에서, 본 발명에서는 인간 항체, 예를 들면, 비-인간 동물로부터 획득된 인간 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단클론 항체를 제시하는데, 여기서 상기 인간 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합할 수 있다. 다른 측면에서, 본 발명에서는 첫 번째 인간 항체, 예를 들면, 비-인간 동물로부터 획득된 인간 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 단클론 항체를 제시하는데, 여기서 상기 첫 번째 인간 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 첫 번째 인간 항체로부터 CDR3 도메인은 글리피칸-3에 대한 결합 특이도가 부재하는 인간 항체에서 CDR3 도메인을 대체하여 글리피칸-3에 특이적으로 결합할 수 있는 두 번째 인간 항체를 산출한다. 일부 구체예에서, 첫 번째 인간 항체로부터 하나 이상의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3 도메인을 포함하는 이런 발명 항체는 (a) 결합에 대하여 상응하는 부모 첫 번째 인간 항체와 경쟁할 수 있고; (b) 기능적 특징을 유지하고; (c) 상응하는 부모 첫 번째 인간 항체에서와 동일한 에피토프에 결합하고; 및/또는 (d) 상응하는 부모 첫 번째 인간 항체에서와 유사한 결합 친화력을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 첫 번째 인간 항체는 4A6, 11E7과 16D10이다.

특정의 배선 서열을 보유하는 항체

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 특정의 배선 중쇄 면역글로불린 유전자로부터 중쇄 가변 영역 및/또는 특정의 배선 경쇄 면역글로불린 유전자로부터 경쇄 가변 영역을 포함한다.

가령, 바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 인간 V_H 5-51 유전자의 산물이거나 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 상기 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합한다. 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 인간 V_K A27 유전자의 산물이거나 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 상기 항체는 글리피칸-3에 특이적으로 결합한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에서는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 제시하는데, 여기서 상기 항체는

(a) 인간 V_H 5-51 유전자(상기 유전자는 SEQ ID NO:31에 열거된 아미노산 서열을 인코딩한다)의 산물이거나 이로부터 유래된 중쇄 가변 영역을 포함하고;

(b) 인간 V_K A27 유전자(상기 유전자는 SEQ ID NO:33에 열거된 아미노산 서열을 인코딩한다)의 산물이거나 이로부터 유래된 경쇄 가변 영역을 포함하고; 그리고;

(c) 글리피칸-3, 바람직하게는 인간 글리피칸-3에 특이적으로 결합한다.

V _H 5-51과 V _K A27을 포함하는 항체의 실례는 4A6, 11E7과 16D10이다.

본 명세서에서, 인간 항체는 항체의 가변 영역이 인간 배선 면역글로불린 유전자를 이용하는 시스템으로부터 획득되는 경우에, 특정의 배선 서열의 “산물”이거나 “이로부터 유래된” 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이런 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 유전자도입 생쥐를 목적하는 항원으로 면역시키거나, 또는 파지(phage) 상에 전시된 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 목적하는 항원으로 스크리닝하는 것을 포함한다. 인간 배선 면역글로불린 서열의 “산물”이거나 “이로부터 유래된” 인간 항체는 예로써, 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 배선 면역글로불린의 아미노산 서열에 비교하고 상기 인간 항체의 서열에 서열에서 가장 가까운(즉, 최대 동일성%) 인간 배선 면역글로불린 서열을 선택함으로써 확인될 수 있다. 특정의 인간 배선 면역글로불린 서열의 “산물”이거나 “이로부터 유래된” 인간 항체는 예로써, 자연-발생 체세포 돌연변이 또는 특정 부위 돌연변이의 의도적 도입으로 인하여, 상기 배선 서열과 비교하여 아미노산 차이를 내포할 수 있다. 하지만, 선택된 인간 항체는 전형적으로, 인간 배선 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열에 아미노산 서열에서 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 배선 면역글로불린 아미노산 서열(가령, 뮤린 배선 서열)과 비교하여 상기 인간 항체를 인간적인 존재로서 확인시키는 아미노산 잔기를 내포한다. 일정한 사례에서, 인간 항체는 배선 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열에 아미노산 서열에서 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정의 인간 배선 서열로부터 유래된 인간 항체는 인간 배선 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로부터 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 일정한 사례에서, 인간 항체는 배선 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로부터 5개 이하, 또는 심지어 4개, 3개, 2개, 또는 1개의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.

상동성 항체

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 본 발명에 개시된 바람직한 항체의 아미노산 서열에 상동성인 아미노산 서열을 포함하는 중쇄와 경쇄 가변 영역을 포함하는데, 여기서 상기 항체는 본 발명의 항-글리피칸-3 항체의 희망하는 기능적 특성을 유지한다.

가령, 본 발명에서는 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제시하는데, 여기서

(a) 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:19, 20과 21로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고;

(b) 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:22, 23과 24로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 80% 상동성인 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

(c) 상기 항체는 1x10^-7 M 또는 그 이하의 K_D로 인간 글리피칸-3에 결합한다.

상기 항체는 인간 글리피칸-3으로 형질감염된 CHO 세포에도 결합할 수 있다.

다양한 구체예에서, 상기 항체는 예로써, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.

다른 구체예에서, V_H 및/또는 V_L 아미노산 서열은 앞서 열거된 서열에 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성일 수 있다. 앞서 열거된 서열의 V_H와 V_L 영역에 높은(즉, 80% 또는 그 이상) 상동성을 갖는 V_H와 V_L 영역을 포함하는 항체는 SEQ ID NO:25, 26, 27, 28, 29와 30을 인코딩하는 핵산 분자의 돌연변이유발(가령, 특정 부위 또는 PCR-매개된 돌연변이유발)과 그 이후에, 본 명세서에 기술된 기능 분석법을 이용한, 글리피칸-3에 결합하는 능력에 대한 인코딩되고 변형된 항체의 검사에 의해 획득될 수 있다.

본 명세서에서, 두 아미노산 서열 사이에 상동성 비율(percent homology)은 이들 두 서열 사이에 동일성 비율(percent identity)에 동등하다. 두 서열 사이에 동일성 비율은 이들 두 서열의 최적 정렬을 위하여 도입되는 갭(gap)의 총수와 각 갭의 길이를 고려하여, 이들 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 총수(즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/위치의 전체 # x 100)이다. 서열의 비교와 두 서열 사이에 동일성 비율의 결정은 하기 무제한적 실시예에 기술된 바와 같이 수학적 알고리즘(mathematical algorithm)을 이용하여 달성될 수 있다.

두 아미노산 서열 사이에 동일성 비율은 PAM120 가중치 유수 테이블(weight residue table), 12의 갭 길이 페널티(gap length penalty)와 4의 갭 페널티(gap penalty)를 이용하고, ALIGN 프로그램(version 2.0)에 통합된 E. Meyers와 W. Miller(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 이에 더하여, 두 아미노산 서열 사이에 동일성 비율은 Blossum 62 매트릭스(matrix) 또는 PAM250 매트릭스, 그리고 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 가중치(gap weight)와 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 이용하고, GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com)에서 GAP 프로그램에 통합된 Needleman과 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) 알고리즘에 의해 결정될 수 있다.

부가적으로 또는 대안으로, 본 발명의 단백질 서열은 예로써, 관련된 서열을 확인하기 위하여 공개 데이터베이스에서 검색을 수행하는 “쿼리 서열(query sequence)”로서 이용될 수도 있다. 이런 검색은 Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 XBLAST 프로그램(version 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 항체 분자에 아미노산 서열 상동성을 획득하기 위하여 XBLAST 프로그램, 스코어(score) = 50, 단어길이(wordlength) = 3으로 수행될 수 있다. 비교 목적으로 갭이 도입된 정렬을 획득하기 위하여, 갭이 도입된 BLAST가 Altschul et al., (1997) Nucelic Acids Res. 25(17):3389-3402에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST와 갭이 도입된 BLAST 프로그램을 이용할 때, 개별 프로그램(가령, XBLAST와 NBLAST)의 디폴트 파라미터(default parameter)가 이용될 수 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

보존성 변형을 갖는 항체

특정 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄 가변 영역 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하고 경쇄 가변 영역 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는데, 여기서 이들 CDR 서열 중에서 하나 이상이 본 발명에 개시된 본 발명에 개시된 바람직한 항체(가령, 4A6, 11E7과 16D10), 또는 이들의 보존성 변형에 기초한 특정된 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 상기 항체는 본 발명의 항-글리피칸-3 항체의 희망하는 기능적 특성을 유지한다. 따라서 본 발명에서는 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역과 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 제시하는데, 여기서

(a) 상기 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 SEQ ID NO:7, 8과 9의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;

(b) 상기 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 SEQ ID NO:16, 17과 18의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고

상기 항체는 인간 글리피칸-3로 형질감염된 CHO 세포에 결합할 수도 있다.

바람직한 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 SEQ ID NO:4, 5와 6의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 SEQ ID NO:13, 14와 15의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 SEQ ID NO:1, 2와 3의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 SEQ ID NO:10, 11과 12의 아미노산 서열, 그리고 이들의 보존성 변형으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

다양한 구체예에서, 항체는 예로써, 인간 항체, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “보존성 서열 변형”은 아미노산 서열을 내포하는 항체의 결합 특징에 현저한 영향을 주거나 이러한 결합 특징을 변화시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하도록 의도된다. 이런 보존성 변형에는 아미노산 치환, 부가와 결실이 포함된다. 변형은 당분야에 공지된 표준 기술, 예를 들면, 특정 부위 돌연변이유발과 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 본 발명의 항체로 도입될 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄(side chain)를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 집단은 당분야에 정의되어 있다. 이들 집단에는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산(가령, 리신(lysine), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine)), 산성 측쇄를 갖는 아미노산(가령, 아스파라긴산(aspartic acid), 글루타민산(glutamic acid)), 하전되지 않은 극성 측쇄(가령, 글리신(glycine), 아스파라긴(asparagine), 글루타민(glutamine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 티로신(tyrosine), 시스테인(cysteine), 트립토판(tryptophan)), 비극성 측쇄(가령, 알라닌(alanine), 발린(valine), 루이신(leucine), 이소루이신(isoleucine), 프롤린(proline), 페닐알라닌(phenylalanine), 메티오닌(methionine)), 베타-가지 측쇄(가령, 트레오닌(threonine), 발린(valine), 이소루이신(isoleucine))와 방향족 측쇄(가령, 티로신(tyrosine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 히스티딘(histidine))가 포함된다. 따라서 본 발명의 항체의 CDR 영역 내에 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 집단으로부터 다른 아미노산 잔기로 대체될 수 있고, 변형된 항체는 본 명세서에 기술된 기능 분석법을 이용하여 글리피칸-3에 결합하는 능력에 대하여 조사될 수 있다.

SEQ ID NO:1, 2, 또는 3의 중쇄 CDR1 서열은 하나 이상의 보존성 서열 변형, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다; SEQ ID NO:10, 11, 또는 12의 경쇄 CDR1 서열은 하나 이상의 보존성 서열 변형, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다; SEQ ID NO:4, 5, 또는 6에 도시된 중쇄 CDR2 서열은 하나 이상의 보존성 서열 변형, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다; SEQ ID NO:13, 14, 또는 15에 도시된 경쇄 CDR2 서열은 하나 이상의 보존성 서열 변형, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다; SEQ ID NO:7, 8, 또는 9에 도시된 중쇄 CDR3 서열은 하나 이상의 보존성 서열 변형, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다; 및/또는 SEQ ID NO:16, 17, 또는 18에 도시된 경쇄 CDR3 서열은 하나 이상의 보존성 서열 변형, 예를 들면, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함할 수 있다.

본 발명의 항-글리피칸-3 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 항체

다른 구체예에서, 본 발명에서는 인간 글리피칸-3 상에서 본 발명의 글리피칸-3 단클론 항체에서와 동일한 에피토프에 결합하는 항체(즉, 글리피칸-3에 결합에 대하여 본 발명의 단클론 항체와 교차-경쟁(cross-competition)하는 능력을 갖는 항체)를 제시한다. 바람직한 구체예에서, 교차-경쟁 연구를 위한 참고 항체는 단클론 항체 4A6(각각, SEQ ID NO:19와 22에 도시된 바와 같은 V_H와 V_L 서열 포함), 단클론 항체 11E7(각각, SEQ ID NO:20과 23에 도시된 바와 같은 V_H와 V_L 서열 포함), 또는 단클론 항체 16D10(각각, SEQ ID NO:21과 24에 도시된 바와 같은 V_H와 V_L 서열 포함). 이런 교차-경쟁 항체는 표준 글리피칸-3 결합 분석법에서 4A6, 11E7, 또는 16D10과 교차-경쟁하는 능력에 기초하여 확인될 수 있다. 가령, 본 발명의 항체와의 교차-경쟁을 증명하기 위하여 Biacore 분석법, ELISA 분석법 또는 유세포 분석법이 이용될 수 있다. 인간 글리피칸-3에 예로써, 4A6, 11E7, 또는 16D10의 결합을 저해하는 검사 항체의 능력은 이러한 검사 항체가 인간 글리피칸-3에 결합에 대하여 4A6, 11E7, 또는 16D10과 경쟁할 수 있고, 따라서 인간 글리피칸-3 상에서 4A6, 11E7, 또는 16D10에서와 동일한 에피토프에 결합한다는 것을 증명한다. 바람직한 구체예에서, 인간 글리피칸-3 상에서 4A6, 11E7, 또는 16D10에서와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 인간 단클론 항체이다. 이런 인간 단클론 항체는 실시예에 기술된 바와 같이 제조되고 분리될 수 있다.

가공되고 변형된 항체

본 발명의 항체는 본 발명에 개시된 하나 이상의 V_H 및/또는 V_L서열을 포함하는 항체를 이용하여 제조되고, 변형된 항체를 가공하기 위한 출발 물질(starting material)로서 이용될 수 있는데, 상기 변형된 항체는 출발 항체와 비교하여 변화된 특성을 갖는다. 항체는 한쪽 또는 양쪽 가변 영역(즉, V_H 및/또는 V_L) 내에서, 예를 들면, 하나 이상의 CDR 영역 내에서 및/또는 하나 이상의 골격 영역 내에서 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 가공될 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로, 항체는 예로써, 이러한 항체의 작동체 기능을 변화시키기 위하여 불변 영액 내에서 잔기를 변형함으로써 가공될 수 있다.

특정 구체예에서, CDR 접합(grafting)은 항체의 가변 영역을 조작하는데 이용될 수 있다. 항체는 주로, 6개의 중쇄와 경쇄 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR) 내에 위치하는 아미노산 잔기를 통하여 표적 항원과 상호작용한다. 이런 이유로, CDR 내에서 아미노산 서열은 CDR 외부의 서열보다 개별 항체 사이에 더욱 다양하다. CDR 서열이 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 특성을 갖는 상이한 항체로부터 골격 서열에 접합된 특정한 자연 발생 항체로부터 CDR 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제함으로써 특정한 자연 발생 항체의 특성을 모방하는 재조합 항체를 발현하는 것이 가능하다(예로써, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; U.S. Patent No. 5,225,539(Winter), 그리고 U.S. Patent No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; 6,180,370(Queen et al.) 참조).

따라서 본 발명의 다른 구체예는 각각, SEQ ID NO:1, 2와 3, SEQ ID NO:4, 5와 6, 그리고 SEQ ID NO:7, 8과 9로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 그리고 각각, SEQ ID NO:10, 11과 12, SEQ ID NO:13, 14와 15, 그리고 SEQ ID NO:16, 17과 18로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, CDR2와 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 단클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 관계한다. 따라서 이들 항체는 단클론 항체 4A6, 11E7, 또는 16D10의 V_H와 V_L CDR 서열을 내포하면서 이들 항체로부터 상이한 골격 서열을 내포할 수 있다.

이런 골격 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공개 DNA데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 획득될 수 있다. 가령, 인간 중쇄와 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 “VBase” 인간 배선 서열 데이터베이스(인터넷 상에서 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase에서 이용가능), 그리고 Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) “The Repertoire of Human Germline V_H 서열 Reveals about Fifty Groups of V_H Segments with Different Hypervariable Loops” J. Mol. Biol. 227:776-798; 그리고 Cox, J. P. L. et al. (1994) “A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals a Strong Bias in their Usage” Eur. J. Immunol. 24:827-836; 이들 각각의 내용은 본 발명에서 명백히 참조로서 편입된다)에서 발견할 수 있다. 다른 실례로서, 인간 중쇄와 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 Genbank 데이터베이스에서 발견할 수 있다. 가령, HCo7 HuMAb 생쥐에서 관찰되는 아래의 중쇄 배선 서열은 첨부된 Genbank 수탁 번호로 가용하다: 1-69(NG_0010109, NT_024637과 BC070333), 3-33(NG_0010109와 NT_024637), 그리고 3-7(NG_0010109와 NT_024637). 다른 실례로서, HCo12 HuMAb 생쥐에서 관찰되는 아래의 중쇄 배선 서열은 첨부된 Genbank 수탁 번호로 가용하다: 1-69(NG_0010109, NT_024637과 BC070333), 5-51(NG_0010109와 NT_024637), 4-34(NG_0010109와 NT_024637), 3-30.3(CAJ556644), 그리고 3-23(AJ406678).

항체 단백질 서열은 당업자에게 널리 공지된, 갭이 도입된 BLAST(Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402)로 불리는 서열 유사성 검색 방법 중에서 한 가지를 이용하여 수집된 단백질 서열 데이터베이스에 비교된다. BLAST는 항체 서열과 데이터베이스 서열 사이에 통계학적으로 유의한 정렬은 정렬된 단어의 고득점 단편 쌍(high-scoring segment pair, HSP)을 내포할 가능성이 높다는 점에서 발견적(heuristic) 알고리즘이다. 스코어가 확장(extension) 또는 정돈(trimming)에 의해 개선될 수 없는 단편 쌍은 히트(hit)로 불린다. 간단히 말하면, VBASE 기원의 뉴클레오티드 서열( http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/ list2.php )은 번역되고, FR1 내지 FR3 골격 영역과 이들 사이의 영역이 유지된다. 상기 데이터베이스 서열은 98개 잔기의 평균 길이(average length)를 갖는다. 단백질의 전장에서 정확한 매치(match)인 중복 서열은 제거된다. BLAST는 작동 중지된 낮은 복잡성 필터(low complexity filter), 그리고 서열 매치를 산출하는 최고 5개 히트를 위한 필터인 BLOSUM62의 치환 매트릭스를 제외하고, 디폴트 표준 파라미터로 설정된 blastp 프로그램을 이용하여 단백질을 검색한다. 뉴클레오티드 서열은 6개 프레임(frame) 모두에서 번역되고, 상기 데이터베이스 서열의 매칭 단편(matching segment)에서 종결 코돈(stop codon)이 없는 프레임은 잠재적 히트(potential hit)로 간주된다. 이는 차례로, BLAST 프로그램 tblastx를 이용하여 확증되는데, 상기 프로그램은 6개 프레임 모두에서 항체 서열을 번역하고, 6개 프레임 모두에서 동적으로 번역된 VBASE 뉴클레오티드 서열에 이들 번역을 비교한다.

동일률(identity)은 전장 서열에서 항체 서열과 단백질 데이터베이스 사이에 정확한 아미노산 매치이다. 이들 파지티브(positive)(동일률 + 치환 매치)는 동일하지 않지만 BLOSUM62 치환 매트릭스에 의해 인도되는 아미노산 치환이다. 항체 서열이 같은 동일률로 2개의 데이터베이스 서열에 매치되면, 최대 파지티브를 갖는 히트는 매칭 서열 히트(matching sequence hit)인 것으로 결정될 것이다.

본 발명의 항체에 이용하기 바람직한 골격 서열은 본 발명의 선택된 항체에 의해 이용되는 골격 서열, 예를 들면, 본 발명의 바람직한 단클론 항체에 의해 이용되는 V_H 5-51 골격 서열(SEQ ID NO:31) 및/또는 V_K A27 골격 서열(SEQ ID NO:33)에 구조적으로 유사한 것들이다. V_H CDR1, CDR2와 CDR3 서열, 그리고 V_K CDR1, CDR2와 CDR3 서열은 배선 면역글로불린 유전자에서 관찰되는 것과 동일한 서열을 보유하는 골격 영역에 접합될 수 있고, 상기 골격 서열은 상기 배선 면역글로불린 유전자로부터 유래되고, 또는 이들 CDR 서열은 배선 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 내포하는 골격 영역에 접합될 수 있다. 가령, 일정한 사례에서, 항체의 항원 결합 능력을 유지하거나 강화시키기 위한 골격 영역 내에서 잔기의 돌연변이는 유익한 것으로 밝혀졌다(예로써, U.S. Patent No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; 6,180,370(Queen et al.) 참조).

다른 유형의 가변 영역 변형은 목적하는 항체의 하나 이상의 결합 특성(가령, 친화력)을 개선하기 위하여 V_H 및/또는 V_K CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역 내에서 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 것이다. 돌연변이를 도입하기 위하여 특정 부위 돌연변이유발 또는 PCR-매개된 돌연변이유발이 수행될 수 있고, 본 명세서에서 기술되고 실시예에서 제공된 바와 같은 in vitro 또는 in vivo 분석법에서 항체 결합, 또는 다른 목적하는 기능적 특성에 대한 효과가 평가될 수 있다. 적절하게는, 보존성 변형(앞서 논의된 바와 같음)이 도입된다. 이들 돌연변이는 아미노산 치환, 부가 또는 결실일 수 있지만, 바람직하게는 치환이다. 게다가, CDR 영역 내에서 전형적으로 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 잔기가 변형된다.

따라서 다른 구체예에서, 본 발명에서는 (a) SEQ ID NO:1, 2와 3, 또는 SEQ ID NO:1, 2와 3과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 V_HCDR1 영역; (b) SEQ ID NO:4, 5와 6, 또는 SEQ ID NO:4, 5와 6과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 V_HCDR2 영역; (c) SEQ ID NO:7, 8과 9, 또는 SEQ ID NO:7, 8과 9와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 V_H CDR3 영역; (d) SEQ ID NO:10, 11과 12, 또는 SEQ ID NO: 10, 11과 12와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 V_KCDR1 영역; (e) SEQ ID NO: 13, 14와 15, 또는 SEQ ID NO: 13, 14와 15와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 V_K CDR2 영역; 그리고 (f) SEQ ID NO: 16, 17과 18, 또는 SEQ ID NO: 16, 17과 18과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 V_K CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 분리된 항-글리피칸-3 단클론 항체, 또는 이들의 항원 결합 부분을 제시한다.

본 발명의 가공된 항체에는 예로써, 이러한 항체의 특성을 개선하기 위하여 V_H 및/또는 V_K 내에서 골격 잔기가 변형된 것들이 포함된다. 전형적으로, 이런 골격 변형은 항체의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키기 위하여 수행된다. 가령, 한 가지 접근법은 하나 이상의 골격 잔기를 상응하는 배선 서열로 “복위돌연변이(backmutation)”시키는 것이다. 더욱 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪는 항체는 이러한 항체가 유래되는 배선 서열과 상이한 골격 잔기를 내포한다. 이런 잔기는 항체 골격 서열을 이러한 항체가 유래되는 배선 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 가령, 4A6의 경우에, Kabat 넘버링 체계(numbering system)를 이용하면, V_H의 아미노산 잔기 #73(FR3 내에서)은 아르기닌(SEQ ID NO:19)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 리신(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열(configuration)로 복귀시키기 위하여, 체세포 돌연변이는 예로써, 특정 부위 돌연변이유발 또는 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 배선 서열로 “복귀돌연변이”될 수 있다(가령, 4A6의 V_H의 잔기 #73(FR3의 잔기 #8)은 아르기닌에서 리신으로 “복귀돌연변이”될 수 있다).

다른 실례로서, 4A6의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #76(FR3 내에서)은 아르기닌(SEQ ID NO:19)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 세린(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 4A6의 V_H의 잔기 #76(FR3의 잔기 #11)은 아르기닌에서 세린으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 4A6의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #89(FR3 내에서)는 루이신(SEQ ID NO:19)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 메티오닌(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 4A6의 V_H의 잔기 #89(FR3의 잔기 #27)는 루이신에서 메티오닌으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 11E7의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #76(FR3 내에서)은 아르기닌(SEQ ID NO:20)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 세린(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 11E7의 V_H의 잔기 #76(FR3의 잔기 #11)은 아르기닌에서 세린으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #10(FR1 내에서)은 아스파라진산염(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 글루타민산염(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #10(FR1의 잔기 #10)은 아스파라진산염에서 글루타민산염으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #12(FR1 내에서)는 트]레오닌(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 리신(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #12(FR1의 잔기 #12)는 트레오닌에서 리신으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #24(FR1 내에서)는 발린(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 글리신(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #24(FR1의 잔기 #24)는 발린에서 글리신으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #28(FR1 내에서)은 아르기닌(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 세린(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #28(FR1의 잔기 #28)은 아르기닌에서 세린으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #37(FR2 내에서)은 메티오닌(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 발린(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #37(FR2의 잔기 #2)은 메티오닌에서 발린으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #41(FR2 내에서)은 세린(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 프롤린(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #41(FR2의 잔기 #6)은 세린에서 프롤린으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #66(FR3 내에서)은 히스티딘(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 글루타민(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #66(FR3의 잔기 #1)은 히스티딘에서 글루타민으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #76(FR3 내에서)은 아스파라긴(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 세린(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #76(FR3의 잔기 #11)은 아스파라긴에서 세린으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #81(FR3 내에서)은 아르기닌(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 글루타민(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #81(FR3의 잔기 #16)은 아르기닌에서 글루타민으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

다른 실례로서, 16D10의 경우에, V_H의 아미노산 잔기 #89(FR3 내에서)는 이소루이신(SEQ ID NO:21)인 반면, 상응하는 V_H 5-51 배선 서열에서 상기 잔기는 메티오닌(SEQ ID NO:31)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_H의 잔기 #89(FR3의 잔기 #27)는 이소루이신에서 메티오닌으로 “복귀돌연변이”될 수 있다. 이런 “복귀돌연변이”된 항체 역시 본 발명에 포함된다.

유사하게, 본 발명에서는 경쇄 내에서 골격 잔기의 복귀돌연변이를 제시한다. 가령, 16D10의 경우에, V_K의 아미노산 잔기 #3(FR1 내에서)은 루이신(SEQ ID NO:24)인 반면, 상응하는 V_K A27 배선 서열에서 상기 잔기는 발린(SEQ ID NO:33)이다. 골격 영역 서열을 그들의 배선 배열로 복귀시키기 위하여, 예로써 16D10의 V_K의 잔기 #3(FR1의 잔기 #3)은 루이신에서 발린으로 “복귀돌연변이”될 수 있다.

다른 유형의 골격 변형은 T 세포 에피토프를 제거하여 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키기 위하여 골격 영역 내에서, 또는 심지어 하나 이상의 CDR 영역 내에서 하나 이상의 잔기의 돌연변이를 수반한다. 이러한 접근법은 “탈면역화(deimmunization)”로서 지칭되고, U.S. Patent Publication No. 20030153043(Carr et al.)에서 더욱 상세하게 기술된다.

골격 또는 CDR 영역 내에서 수행된 변형에 추가하여 또는 대안으로, 본 발명의 항체는 전형적으로, 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예를 들면, 혈청 반감기(serum half-life), 보체 고정(complement fixation), Fc 수용체 결합 및/또는 항원-의존성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity)을 변화시키기 위하여 Fc 영역 내에서 변형을 포함하도록 가공될 수 있다. 더 나아가, 본 발명의 항체는 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변화시키기 위하여, 화학적으로 변형되거나(가령, 하나 이상의 화학적 모이어티(chemical moiety)가 상기 항체에 부착될 수 있다), 또는 당화(glycosylation)가 변하도록 변형될 수 있다. 이들 각 구체예는 하기에 더욱 상세하게 기술된다. Fc 영역 내에서 잔기의 넘버링은 Kabat의 EU 지수의 넘버링이다.

한 구체예에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역 내에서 시스테인 잔기의 총수가 변하도록, 예를 들면, 증가 또는 감소하도록 변형된다. 이러한 접근법은 U.S. Patent No. 5,677,425(Bodmer et al.)에서 더욱 상세하게 기술된다. CH1의 힌지 영역 내에서 시스테인 잔기의 총수는 예로써, 경쇄와 중쇄의 조립(assembly)을 촉진하기 위하여, 또는 항체의 안정성(stability)을 증가 또는 감소시키기 위하여 변화된다.

다른 구체예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기(biological half life)가 감소하도록 돌연변이될 수 있다. 더욱 구체적으로, 항체가 고유 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비하여 손상된 스타필로코커스 단백질 A(Staphylococcyl protein A, SpA) 결합을 갖도록 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 접촉면 영역 내로 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 도입된다. 이러한 접근법은 U.S. Patent No. 6,165,745(Ward et al.)에서 더욱 상세하게 기술된다.

다른 구체예에서, 항체는 생물학적 반감기가 증가하도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 가령, U.S. Patent No. 6,277,375(Ward)에 기술된 바와 같이, 아래의 돌연변이 중에서 하나 이상이 도입될 수 있다: T252L, T254S와 T256F. 대안으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위하여, 항체는 U.S. Patent No. 5,869,046과 6,121,022(Presta et al.)에 기술된 바와 같이, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프(loop)로부터 포획된 구조(salvage) 수용체 결합 에피토프를 내포하도록 CH1 또는 C_L 영역 내에서 변형될 수 있다.

또 다른 구체예에서, Fc 영역은 항체의 작동체 기능을 변화시키기 위하여 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변형된다. 가령, 항체가 작동체 리간드(effector ligand)에 대한 변화된 친화력을 갖지만 부모 항체의 항원-결합 능력을 유지하도록 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320과 322에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 자신에 대한 친화력이 변화되는 작동체 리간드는 예로써, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이러한 접근법은 U.S. Patent No. 5,624,821과 5,648,260(Winter et al.)에서 더욱 상세하게 기술된다.

다른 실례에서, 항체가 변화된 C1q 결합 및/또는 감소된 또는 소멸된 보체 의존성 세포독성(CDC)을 갖도록 아미노산 잔기 329, 331과 322에서 선택되는 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이러한 접근법은 U.S. Patent No. 6,194,551(Idusogie et al.)에서 더욱 상세하게 기술된다.

다른 실례에서, 보체를 고정시키는 항체의 능력을 변화시키기 위하여 아미노산 위치 231과 239 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된다. 이러한 접근법은 PCT Publication WO 94/29351(Bodmer et al.)에서 더욱 상세하게 기술된다.

또 다른 실례에서, 아래의 위치: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 또는 439에서 하나 이상의 아미노산을 변형함으로써 항체 의존성 세포독성(ADCC)을 매개하는 항체의 능력을 증가시키고 및/또는 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화력을 증가시키기 위하여 Fc 영역이 변형된다. 이러한 접근법은 PCT Publication WO 00/42072(Presta)에서 더욱 상세하게 기술된다. 게다가, 인간 IgG1 상에서 FcγR1, FcγRII, FcγRIII과 FcRn에 대한 결합 부위가 매핑(mapping)되었고, 향상된 결합을 갖는 변이체가 기술되었다(참조: Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). FcγRIII에 대한 결합을 향상시키는 위치 256, 290, 298, 333, 334와 339에서 특정한 돌연변이가 밝혀졌다. 부가적으로, 아래의 조합 돌연변이체(combination mutant)는 FcγRIII 결합이 향상되는 것으로 밝혀졌다: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A와 S298A/E333A/K334A.

또 다른 구체예에서, 항체의 당화가 변형된다. 가령, 무당화(aglycosylation) 항체가 만들어질 수 있다(즉, 항체에서 당화가 부재한다). 당화는 예로써, 항원에 대한 항체의 친화력을 증가시키기 위하여 변형될 수 있다. 이런 탄수화물 변형은 예로써, 항체 서열 내에서 당화의 하나 이상의 부위를 변형함으로써 달성될 수 있다. 가령, 하나 이상의 가변 영역 골격 당화 부위를 제거하여 상기 부위에서 당화를 제거하는 하나 이상의 아미노산 치환이 수행될 수 있다. 이런 무당화는 항원에 대한 항체의 친화력을 증가시킬 수도 있다. 이런 접근법은 U.S. Patent No. 5,714,350과 6,350,861(Co et al.)에서 더욱 상세하게 기술된다.

부가적으로 또는 대안으로, 변화된 유형의 당화를 갖는 항체, 예를 들면, 감소된 양의 푸코실(fucosyl) 잔기를 보유하는 하이포푸코실화(hypofucosylation) 항체 또는 증가된 이등분(bisecting) GlcNac 구조를 보유하는 항체가 만들어질 수 있다. 이런 변화된 당화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되었다. 이런 탄수화물 변형은 예로써, 변화된 당화 절차(machinery)를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현함으로써 달성될 수 있다. 변화된 당화 절차를 갖는 세포는 당분야에서 공지되어 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현하여 변화된 당화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 가령, 세포주(cell line) Ms704, Ms705와 Ms709는 푸코실전이효소(fucosyltransferase) 유전자, FUT8(alpha (1,6) fucosyltransferase)이 부재하고, 따라서 Ms704, Ms705와 Ms709 세포주에서 발현된 항체는 그들의 탄수화물 상에서 푸코오스(fucose)가 부재한다. Ms704, Ms705와 Ms709 FUT8^-/- 세포주는 2가지 대체 벡터(replacement vector)를 이용한, CHO/DG44 세포에서 FUT8 유전자의 표적화된 붕괴에 의해 산출되었다(참조: U.S. Patent Publication No. 20040110704(Yamane et al.)와 Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). 다른 실례로서, EP 1,176,195(Hanai et al.)에서는 푸코실 전이효소를 인코딩하는 기능적으로 붕괴된 FUT8 유전자를 보유하는 세포주를 기술하는데, 이런 세포주에서 발현된 항체는 알파 1,6 결합-관련된 효소를 감소시키거나 소멸시킴으로써 하이포푸코실화를 나타낸다. Hanai et al. 역시 항체의 Fc 영역에 결합하는 N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine)에 푸코오스를 부가하는 효소 활성이 낮거나 이러한 효소 활성을 갖지 않는 세포주, 예를 들면, 쥐 골수종 세포주 YB2/0(ATCC CRL 1662)를 기술한다. PCT Publication WO 03/035835(Presta))에서는 푸코오스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착하는 능력이 감소된 변이 CHO 세포주, Lec13 세포를 기술하는데, 상기 숙주 세포에서 발현된 항체는 하이포푸코실화된다(참조: Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). PCT Publication WO 99/54342(Umana et al.)에서는 당단백질-변형 글리코실 전이효소(glycosyl transferases)(가령, 베타(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소(acetylglucosaminyltransferase) III(GnTIII))를 발현하도록 가공된 세포주를 기술하는데, 이러한 가공된 세포주에서 발현된 항체는 상기 항체의 증가된 ADCC 활성을 결과하는 증가된 이등분 GlcNac 구조를 나타낸다(참조; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). 대안으로, 푸코시다아제(fucosidase) 효소를 이용하여 항체의 푸코오스 잔기가 절단될 수도 있다. 가령, 푸코시다아제 알파-L-푸코시다아제는 항체로부터 푸코실 잔기를 제거한다(Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

본 발명에서 고려되는 항체의 다른 변형은 페길화(pegylation)이다. 항체는 예로써, 항체의 생물학적(가령, 혈청) 반감기를 증가시키기 위하여 페길화될 수 있다. 항체를 페길화시키기 위하여, 항체, 또는 이의 단편은 전형적으로, 하나 이상의 PEG 기가 이러한 항체 또는 항체 단편에 부착되어 지는 조건 하에 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 예를 들면, 반응성 에스테르(reactive ester) 또는 PEG의 알데히드 유도체(aldehyde derivative)와 반응된다. 적절하게는, 페길화는 반응성(reactive) PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)로 아실화(acylation) 반응 또는 알킬화(alkylation) 반응을 통하여 수행된다. 본 명세서에서, 용어 “폴리에틸렌 글리콜”은 다른 단백질을 유도하는데 이용되는 임의 형태의 PEG, 예를 들면, 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드(maleimide)를 포괄하도록 의도된다. 특정 구체예에서, 페길화되는 항체는 무당화된 항체이다. 단백질을 페길화시키는 방법은 당분야에 공지되어 있고 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예로써, EP 0 154 316(Nishimura et al.)과 EP 0 401 384(Ishikawa et al.)를 참조한다.

항체 물리적 특성

본 발명의 항체는 항-글리피칸-3 항체의 다양한 물리적 특성에 의해 더욱 특징될 수 있다. 이들 물리적 특성에 기초된 상이한 부류의 항체를 검출하고 및/또는 구별하는데 다양한 분석법이 이용될 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄 또는 중쇄 가변 영역에서 하나 이상의 당화 부위를 내포한다. 가변 영역 내에서 하나 이상의 당화 부위의 존재는 변화된 항원 결합으로 인하여, 항체의 증가된 면역원성 또는 항체의 pK의 변화를 결과할 수 있다(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). 당화는 N-X-S/T 서열을 내포하는 모티프(motif)에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 가변 영역 당화는 Glycoblot 분석법을 이용하여 조사될 수 있는데, 이는 항체를 절단하여 Fab를 생산하고, 이후 과요오드 산화(periodate oxidation)와 시프 염기 형성(Schiff base formation)을 측정하는 분석법을 이용하여 당화를 조사한다. 대안으로, 가변 영역 당화는 Dionex 광 크로마토그래피(light chromatography)(Dionex-LC)를 이용하여 조사될 수 있는데, 이는 Fab로부터 당류(saccharide)를 단당류(monosaccharide)로 절단하고 개별 당류 함량(saccharide content)을 분석한다. 일부 사례에서, 가변 영역 당화를 갖지 않는 항-글리피칸-3 항체를 획득하는 것이 바람직하다. 이는 가변 영역 내에서 당화 모티프를 내포하지 않는 항체를 선별함으로써, 또는 당분야에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 당화 모티프 내에서 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 아스파라긴 이성(isomerism) 부위를 내포하지 않는다. 탈아미드화(deamidation) 또는 이소아스파르트산(isoaspartic acid) 효과는 각각, N-G 또는 D-G 서열 상에서 나타날 수 있다. 탈아미드화 또는 이소아스파르트산 효과는 사슬 주요부 보다는 측쇄 카르복시 말단 외부에 꼬임 구조(kinked structure)를 산출함으로써 항체의 안정성을 감소시키는 이소아스파르트산의 발생을 결과한다. 이소아스파르트산의 발생은 등량(iso-quant) 분석법을 이용하여 측정될 수 있는데, 이는 역상(reverse-phase) HPLC를 이용하여 이소아스파르트산을 조사한다.

각 항체는 독특한 등전점(isoelectric point, pI)을 가지긴 하지만, 일반적으로 항체는 6 내지 9.5의 pH 범위에 들어간다. IgG1 항체에 대한 pI는 전형적으로, 7-9.5의 pH 범위에 들어가고, IgG4 항체에 대한 pI는 전형적으로, 6-8의 pH 범위에 들어간다. 항체는 이러한 범위를 벗어나는 pI를 가질 수도 있다. 이들 효과가 전반적으로 알려져 있진 않지만, 정상 범위를 벗어나는 pI를 갖는 항체는 생체내 조건 하에서 상당한 풀림(unfolding)과 불안정성(instability)을 가질 것으로 추측된다. 등전점은 모세관 등전 집중 분석법(capillary isoelectric focusing assay)을 이용하여 조사될 수 있는데, 이는 pH 구배(gradient)를 발생시키고, 증가된 정확도를 위하여 레이저 집중(laser focusing)을 이용할 수도 있다(Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). 일부 사례에서, 정상 범위에 들어가는 pI 수치를 갖는 항-글리피칸-3 항체를 획득하는 것이 바람직하다. 이는 정상 범위에서 pI를 갖는 항체를 선별함으로써, 또는 당분야에 널리 공지된 표준 기술을 이용하여 하전 표면 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다.

각 항체는 열 안정성(thermal stability)을 지시하는 용융 온도(melting temperature)를 가진다(Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). 더욱 높은 열 안정성은 생체내에서 더욱 큰 전체 항체 안정성을 지시한다. 항체의 융점(melting point)은 통상적인 기술, 예를 들면, 시차 주사 열량법(differential scanning calorimetry)을 이용하여 측정될 수 있다(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). T_M1은 항체의 최초 풀림의 온도를 지시한다. T_M2는 항체의 완전한 풀림의 온도를 지시한다. 일반적으로, 본 발명의 항체의 T_M1은 60℃ 이상, 바람직하게는 65℃ 이상, 이보다 더욱 바람직하게는 70℃ 이상이 바람직하다. 대안으로, 항체의 열 안정성은 원편광 이색성(circular dichroism)을 이용하여 측정될 수도 있다(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

바람직한 구체예에서, 급속하게 분해되지 않는 항체가 선택된다. 항-글리피칸-3 항체의 단편화(fragmentation)는 당분야에서 널리 인지되는 바와 같이, 모세관 전기영동(capillary electrophoresis, CE)과 MALDI-MS를 이용하여 측정될 수 있다(Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

다른 바람직한 구체예에서, 최소 집합 효과(aggregation effect)를 갖는 항체가 선택된다. 집합은 원치 않는 면역 반응 및/또는 변화된 또는 불리한 약물동력학적(pharmacokinetic) 특성의 유인으로 이어질 수 있다. 일반적으로, 항체는 25% 또는 그 이하, 바람직하게는 20% 또는 그 이하, 이보다 더욱 바람직하게는 15% 또는 그 이하, 이보다 더욱 바람직하게는 10% 또는 그 이하, 그리고 이보다 더욱 바람직하게는 5% 또는 그 이하의 집합이 허용된다. 집합은 크기-배제 칼럼(size-exclusion column, SEC), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC), 그리고 단량체(monomer), 이합체(dimer), 삼합체(trimer) 또는 다합체(multimer)를 확인하기 위한 광 산란(light scattering)을 비롯한, 당분야에 널리 공지된 여러 기술에 의해 측정될 수 있다.

항체를 가공하는 방법

앞서 언급된 바와 같이, 본 발명에 개시된 V_H와 V_K 서열을 포함하는 항-글리피칸-3 항체는 V_H 및/또는 V_K 서열, 또는 이들에 부착된 불변 영역을 변형함으로써 새로운 항-글리피칸-3 항체를 산출하는데 이용될 수 있다. 따라서 본 발명의 다른 측면에서, 본 발명의 항-글리피칸-3 항체, 예를 들면, 4A6, 11E7과 16D10의 구조적 특징은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능 특성, 예를 들면, 인간 글리피칸-3에 결합을 유지하는 구조적으로 관련된 항-글리피칸-3 항체를 산출하는데 이용된다. 가령, 4A6의, 11E7과 16D10, 또는 이들의 돌연변이의 하나 이상의 CDR 영역은 앞서 논의된 바와 같이, 공지된 골격 영역 및/또는 다른 CDR과 재조합 방식으로 결합되어 본 발명의 추가의 재조합-가공된 항-글리피칸-3 항체를 산출할 수 있다. 다른 유형의 변형에는 이전 섹션에서 기술된 것들이 포함된다. 이러한 가공 방법을 위한 출발 물질은 본 명세서에 제시된 하나 이상의 V_H 및/또는 V_K 서열, 또는 이들의 하나 이상의 CDR 영역이다. 가공된 항체를 산출하기 위하여, 본 명세서에 제시된 하나 이상의 V_H 및/또는 V_K 서열, 또는 이들의 하나 이상의 CDR 영역을 포함하는 항체를 실제로 제조(즉, 단백질로서 발현)할 필요는 없다. 오히려, 상기 서열에 내포된 정보는 최초 서열로부터 유래된 “2세대” 서열을 산출하기 위한 출발 물질로서 이용되고, 이러한 “2세대” 서열은 단백질로서 제조되고 발현된다.

따라서 다른 구체예에서, 본 발명에서는 항-글리피칸-3 항체를 제조하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 아래의 단계를 포함한다:

(a) (i) SEQ ID NO:1, 2와 3으로 구성된 군에서 선택되는 CDR1 서열, SEQ ID NO:4, 5와 6으로 구성된 군에서 선택되는 CDR2 서열 및/또는 SEQ ID NO:7, 8과 9로 구성된 군에서 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) SEQ ID NO:10, 11과 12로 구성된 군에서 선택되는 CDR1 서열, SEQ ID NO: 13, 14와 15로 구성된 군에서 선택되는 CDR2 서열 및/또는 SEQ ID NO: 16, 17과 18로 구성된 군에서 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 단계;

(b) 중쇄 가변 영역 항체 서열 및/또는 경쇄 가변 영역 항체 서열 내에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 변형하여 적어도 하나의 변형된 항체 서열을 산출하는 단계; 그리고

(c) 변형된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 단계.

이러한 변형된 항체 서열을 제조하고 발현시키기 위하여 표준 분자 생물학 기술이 이용될 수 있다.

적절하게는, 이러한 변형된 항체 서열에 의해 인코딩된 항체는 본 발명에 개시된 항-글리피칸-3 항체의 기능적 특성 중에서 한 가지, 일부 또는 전부를 유지하는 항체인데, 이들 기능적 특성에는 아래와 같은 특성이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다:

(i) 인간 글리피칸-3에 1x10^-7 M 또는 그 이하의 K_D로 결합한다;

(ii) 글리피칸-3으로 형질감염된 인간 CHO 세포에 결합한다.

이들 변형된 항체의 기능적 특성은 당분야에 가용한 및/또는 본 명세서에 기술된 표준 분석법, 예를 들면, 실시예에 열거된 것들(가령, 유세포 분석법, 결합 분석법)을 이용하여 평가될 수 있다.

본 발명의 항체를 가공하는 방법의 특정 구체예에서, 돌연변이는 항-글리피칸-3 항체 코딩 서열의 전부 또는 일부를 따라서 무작위로 또는 선택적으로 도입될 수 있고, 결과의 변형된 항-글리피칸-3 항체는 본 명세서에 기술된 바와 같이 결합 활성 및/또는 다른 기능적 특성에 대하여 스크리닝될 수 있다. 돌연변이 방법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, PCT Publication WO 02/092780(Short)에서는 포화 돌연변이유발(saturation mutagenesis), 합성 결찰 조립(synthetic ligation assembly), 또는 이들의 조합을 이용하여 항체 돌연변이를 산출하고 스크리닝하는 방법을 기술한다. 대안으로, PCT Publication WO 03/074679(Lazar et al.)에서는 항체의 물리화학적 특성을 최적화하기 위하여 계산 스크리닝(computational screening) 방법을 이용하는 방법을 기술한다.

본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 분자

본 발명의 다른 측면은 본 발명의 항체를 인코딩하는 핵산 분자에 관계한다. 이들 핵산은 완전 세포, 세포 용해질(lysate), 또는 부분적으로 정제된 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩(banding), 칼럼 크로마토그래피(column chromatography), 아가로즈 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)과 당분야에 널리 공지된 다른 기술을 비롯한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들면, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 정제될 때, “분리”, 또는 “실질적으로 순수”하게 된다(참조: F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York). 본 발명의 핵산은 예로써, DNA 또는 RNA이고, 인트론(intronic) 서열을 내포하거나 내포하지 않을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 핵산은 cDNA 분자이다.

본 발명의 핵산은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 획득될 수 있다. 하이브리도마(가령, 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 유전자도입 생쥐로부터 제조된 하이브리도마)에 의해 발현된 항체의 경우에, 하이브리도마에 의해 만들어진 항체의 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 cDNA는 표준 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝 기술에 의해 획득될 수 있다. 면역글로불린 유전자 라이브러리(가령, 파지 전시(phage display) 기술을 이용한)로부터 획득된 항체의 경우에, 상기 항체를 인코딩하는 핵산은 상기 라이브러리로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 바람직한 핵산 분자는 4A6, 11E7, 또는 16D10 단클론 항체의 V_H와 V_L서열을 인코딩하는 것들이다. 4A6, 11E7, 또는 16D10의 V_H서열을 인코딩하는 DNA 서열은 각각, SEQ ID NO:25, 26과 27에 열거된다. 4A6, 11E7, 또는 16D10의 V_L 서열을 인코딩하는 DNA 서열은 각각, SEQ ID NO:28, 29와 30에 열거된다.

본 발명의 다른 바람직한 핵산은 SEQ ID NO:25, 26, 27, 28, 29와 30에 열거된 서열 중에서 하나와 적어도 80% 서열 동일성, 예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산인데, 이들 핵산은 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분을 인코딩한다.

두 핵산 서열 사이에 동일성 비율은 이들 두 서열의 최적 정렬을 위하여 도입되는 갭(gap)의 총수와 각 갭의 길이를 고려하여, 서열 내에서 뉴클레오티드가 동일한 위치의 총수이다. 서열의 비교와 두 서열 사이에 동일성 비율의 결정은 수학적 알고리즘(mathematical algorithm), 예를 들면, Meyers와 Miller의 알고리즘 또는 앞서 기술된 Altschul의 XBLAST 프로그램을 이용하여 달성될 수 있다.

더 나아가, 본 발명의 바람직한 핵산은 SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29와 30에 열거된 핵산 서열의 하나 이상의 CDR-인코딩 부분을 포함한다. 이러한 구체예에서, 핵산은 4A6, 11E7, 또는 16D10의 중쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열, 또는 4A6, 11E7, 또는 16D10의 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 서열을 포함할 수 있다.

SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30의 이와 같은 CDR-인코딩 부분과 적어도 80%, 예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 핵산 역시 본 발명의 바람직한 핵산이다. 이런 핵산은 비-CDR 코딩 영역 및/또는 CDR-코딩 영역 내에서 SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30의 상응하는 부분과 상이할 수 있다. 이러한 차이가 CDR-코딩 영역 내에 존재하는 경우에, 핵산에 인코딩된 핵산 CDR 영역은 전형적으로, 4A6, 11E7과 16D10의 상응하는 CDR 서열과 비교하여 본 명세서에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 보존성 서열 변형을 포함한다.

V_H와 V_L 단편을 인코딩하는 DNA 단편이 획득되면, 이들 DNA 단편은 예로써, 가변 영역 유전자를 전장 항체 사슬 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시키기 위하여 표준 재조합 DNA 기술에 의해 더욱 조작될 수 있다. 이들 조작에서, V_L- 또는 V_H-인코딩 DNA 단편은 다른 단백질, 예를 들면, 항체 불변 영역 또는 유연성 링커(flexible linker)를 인코딩하는 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이러한 문맥에서, 용어 “작동가능하게 연결된”은 2개의 DNA 단편이 이들 2개의 DNA 단편에 의해 인코딩된 아미노산 서열이 인-프레임(in-frame)으로 존속하도록 연결되는 것을 의미하는 것으로 의도된다.

V_H 영역을 인코딩하는 분리된 DNA는 VH-인코딩 DNA를 중쇄 불변 영역(CH1, CH2와 CH3)을 인코딩하는 다른 DNA 분자를 작동가능하게 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당분야에 공지되어 있고(예로써, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는, IgG1 또는 IgG4 불변 영역이다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우에, V_H-인코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 인코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다.

V_L 영역을 인코딩하는 분리된 DNA는 V_L-인코딩 DNA를 경쇄 불변 영역, CL을 인코딩하는 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결함으로써 전장 경쇄 유전자(그리고, Fab 경쇄 유전자)로 전환될 수 있다. 인간 경쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당분야에 공지되어 있고(예로써, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 획득될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 카파(kappa) 또는 람다(lambda) 불변 영역일 수 있다.

scFv 유전자를 산출하기 위하여, VH-와 VL-인코딩 DNA 단편은 유연성 링커를 인코딩하는, 예를 들면, 아미노산 서열 (Gly4-Ser)3을 인코딩하는 다른 단편에 작동가능하게 연결되고, 따라서 VH와 VL 서열은 VL과 VH 영역이 유연성 링커에 의해 연결된 연속 단일-사슬(contiguous single-chain) 단백질로서 발현될 수 있다(예로써, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554 참조).

단클론 항체의 생산

본 발명의 단클론 항체(mAb)는 전통적인 단클론 항체 방법, 예를 들면, Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495의 표준 체세포 혼성화(hybridization) 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 기술이 선호되긴 하지만, 원칙적으로, 단클론 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들면, B 림프구의 바이러스성 또는 종양원성 형질전환(transformation)이 이용될 수 있다.

하이브리도마를 제조하기 위한 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 생쥐에서 하이브리도마 생산은 널리-확립된 절차이다. 면역화 프로토콜(immunization protocol)과 융합을 위한 면역화된 비장세포(splenocyte)의 분리 기술은 당분야에 공지되어 있다. 융합 상대(가령, 뮤린 골수종 세포)와 융합 절차 역시 공지되어 있다.

본 발명의 키메라 또는 인간화 항체는 앞서 기술된 바와 같이 제조된 비-인간 단클론 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 중쇄와 경쇄 면역글로불린을 인코딩하는 DNA는 목적하는 비-인간 하이브리도마로부터 획득되고, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 비-뮤린(가령, 인간) 면역글로불린 서열을 내포하도록 가공될 수 있다. 가령, 키메라 항체를 산출하기 위하여, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 뮤린 가변 영역이 인간 불변 영역에 연결될 수 있다(예로써, U.S. Patent No. 4,816,567(Cabilly et al.) 참조). 인간화 항체를 산출하기 위하여, 당분야에 공지된 방법을 이용하여 뮤린 CDR 영역이 인간 골격 내로 삽입될 수 있다(예로써, U.S. Patent No. 5,225,539(Winter)와 U.S. Patent No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762; 6,180,370(Queen et al.) 참조).

바람직한 구체예에서, 본 발명의 항체는 인간 단클론 항체이다. 글리피칸-3을 지향하는 이런 인간 단클론 항체는 생쥐 시스템보다는 인간 면역계(immune system) 일부를 보유하는 유전자도입 또는 염색체도입 생쥐를 이용하여 산출될 수 있다. 이런 유전자도입과 염색체도입 생쥐는 본 명세서에서 각각, HuMAb 생쥐®와 KM 생쥐®로서 지칭되는 생쥐를 포함하고, 본 명세서에서 “인간 Ig 생쥐”로 총칭된다.

HuMAb 생쥐®(Medarex®, Inc.)는 내인성 μ와 κ 사슬 좌위(locus)를 비활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께, 재정렬되지 않은 인간 중쇄(μ와 γ)와 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 인코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌위(miniloci)를 내포한다(예로써, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859 참조). 따라서 이들 생쥐는 생쥐 IgM 또는 κ의 감소된 발현을 나타내고, 면역화에 대한 반응으로, 도입된 인간 중쇄와 경쇄 도입유전자는 높은 친화력 인간 IgGκ 단클론 항체를 산출하기 위하여 클래스 전환(class switching)과 체세포 돌연변이를 겪는다(Lonberg, N. et al. (1994), supra; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101에서 재검토됨; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). HuMAb 생쥐®의 제조와 이용, 그리고 이런 생쥐에 의해 보유되는 유전체 변형은 Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; 그리고 Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851에서 더욱 상세하게 기술되는데, 이들 문헌의 내용은 본 발명에서 명백히 참조로서 편입된다. 게다가, U.S. Patent No. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299와 5,770,429(Lonberg and Kay); U.S. Patent No. 5,545,807(Surani et al.); PCT Publication No. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884와 WO 99/45962(Lonberg와 Kay); 그리고 PCT Publication No. WO 01/14424(Korman et al.)를 참조한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 인간 항체는 도입유전자와 도입염색체(transchromosome) 상에 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 생쥐, 예를 들면, 인간 중쇄 도입유전자와 인간 경쇄 도입염색체를 보유하는 생쥐를 이용하여 생산될 수 있다. 이러한 생쥐는 본 명세서에서, “KM 생쥐®”로 지칭되고 PCT Publication WO 02/43478(Ishida et al.)에서 상세하게 기술된다.

더 나아가, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 유전자도입 동물 시스템이 당분야에서 가용하고 본 발명의 항-글리피칸-3 항체를 생산하는데 이용될 수 있다. 가령, Xenomouse(Abgenix, Inc.)로 지칭되는 대안적 유전자도입 시스템이 이용될 수 있다; 이런 생쥐는 예로써, U.S. Patent No. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584와 6,162,963(Kucherlapati et al.)에서 기술된다.

더 나아가, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적 염색체도입 동물 시스템이 당분야에서 가용하고 본 발명의 항-글리피칸-3 항체를 생산하는데 이용될 수 있다. 가령, “TC 생쥐”로 지칭되는, 인간 중쇄 도입염색체와 인간 경쇄 도입염색체를 모두 보유하는 생쥐가 이용될 수 있다; 이런 생쥐는 Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727에서 기술된다. 더 나아가, 인간 중쇄와 경쇄 도입염색체를 보유하는 소가 당분야에서 보고되었고(Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894와 PCT application No. WO/2002/092812) 본 발명의 항-글리피칸-3 항체를 생산하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 인간 단클론 항체는 또한, 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 전시(phage display) 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 인간 항체를 분리하기 위한 이런 파지 전시 방법은 당분야에 확립되어 있다. 예로써, U.S. Patent No. 5,223,409; 5,403,484와 5,571,698(Ladner et al.); U.S. Patent No. 5,427,908과 5,580,717(Dower et al.); U.S. Patent No. 5,969,108과 6,172,197(McCafferty et al.); 그리고 U.S. Patent No. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915와 6,593,081(Griffiths et al.)을 참조한다.

본 발명의 인간 단클론 항체는 또한, 면역화 이후에 인간 항체 반응이 산출될 수 있도록 인간 면역 세포가 재구성된 SCID 생쥐를 이용하여 제조될 수 있다. 이런 생쥐는 예로써, U.S. Patent No. 5,476,996과 5,698,767(Wilson et al.)에 기술된다.

인간 Ig 생쥐의 면역화

본 발명의 인간 항체를 생산하기 위하여 인간 Ig 생쥐가 이용될 때, 이런 생쥐는 Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 그리고 PCT Publication WO 98/24884와 WO 01/14424에서 기술된 바와 같이, 글리피칸-3 항원 및/또는 재조합 글리피칸-3, 또는 글리피칸-3 또는 글리피칸-3 융합 단백질을 발현하는 세포의 정제된 또는 농축된 제조물로 면역화될 수 있다. 적절하게는, 이들 생쥐는 첫 번째 주입 시점에 6-16주령이다. 가령, 글리피칸-3 항원의 정제된 또는 재조합 제조물(5-50 )이 인간 Ig 생쥐를 복강내에서 면역화시키는데 이용될 수 있다.

글리피칸-3에 대한 완전 인간 단클론 항체를 산출하는 상세한 절차는 하기 실시예 1에서 기술된다. 다양한 항원으로 누적된 경험은 이러한 유전자도입 생쥐가 완전 Freund 어쥬번트에서 항원으로 초기 복강내 면역화(IP)와 그 이후에, 불완전 Freund 어쥬번트에서 항원으로 격주 IP 면역화(최대 총 6회)에 반응한다는 것을 확인한다. 하지만, Freund 이외의 다른 어쥬번트 역시 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 어쥬번트의 부재에서 완전 세포는 고도로 면역원성인 것으로 밝혀졌다. 이러한 면역 반응은 안와후 채혈(retroorbital bleed)에 의해 획득되는 혈장 샘플(plasma sample)로 면역화 프로토콜의 과정에서 모니터링(monitoring)될 수 있다. 혈장은 ELISA(하기에 기술된 바와 같음)에 의해 스크리닝될 수 있고, 충분한 역가(titer)의 항-글리피칸-3 인간 면역글로불린을 보유하는 생쥐는 융합에 이용될 수 있다. 생쥐는 희생과 비장의 제거에 앞서 3일 시점에, 항원으로 정맥내 추가접종(boosting)될 수 있다. 각 면역화를 위하여 2-3회 융합이 수행될 것으로 예상된다. 전형적으로, 각 항원에 대하여 6마리 내지 24마리 생쥐가 면역화된다. 한 구체예에서, HCo7, HCo12 또는 HCo17 인간 중쇄 도입유전자 균주를 보유하는 생쥐 균주가 이용된다. 대안으로 또는 부가적으로, KM 생쥐® 균주가 이용될 수 있다. 이에 더하여, 이들 균주 중에서 2가지 이상이 복수의 상이한 인간 중쇄 도입유전자를 보유하는 단일 생쥐 내로 함께 증식될 수 있다.

인간 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 산출

본 발명의 인간 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 산출하기 위하여, 면역화된 생쥐로부터 비장세포 및/또는 림프절(lymph node) 세포는 분리되고 적절한 영속화 세포주, 예를 들면, 생쥐 골수종 세포주에 융합될 수 있다. 결과의 하이브리도마는 항원-특이적 항체의 생산을 위하여 스크리닝될 수 있다. 가령, 면역화된 생쥐로부터 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG를 갖는 P3X63-Ag8.653 무분비(non-secreting) 생쥐 골수종 세포(ATCC, CRL 1580)의 1/6 숫자에 융합될 수 있다. 대안으로, 면역화된 생쥐로부터 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 CytoPulse 대형 챔버 세포 융합 전기천공장치(electroporator)(CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland)를 이용한 전기장 기초된 전기융합(electric field based electrofusion) 방법에 의해 융합될 수 있다. 세포는 넓적 바닥 마이크로역가 평판(flat bottom microtiter plate)에서 대략 2 x 10⁵로 도말되고, 그 이후에 20% 태아 클론 혈청(fetal Clone Serum), 18% “653” 조건 배지(conditioned media), 5% origen(IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨,(sodium pyruvate) 5mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올(mercaptoethanol), 50 unit/㎖ 페니실린(penicillin), 50 ㎎/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin), 50 ㎎/㎖ 젠타마이신(gentamycin)과 1X HAT(Sigma; HAT는 융합후 24시간 시점에 첨가된다)를 내포하는 선택 배지(selective medium)에서 2주간 배양된다. 대략 2주후, 세포는 HAT가 HT로 대체되는 배지에서 배양될 수 있다. 이후, 개별 웰은 ELISA에 의해 인간 단클론 IgM과 IgG 항체에 대하여 스크리닝될 수 있다. 광범위한 하이브리도마 성장이 진행되면, 배지는 일반적으로, 10-14일후에 관찰될 수 있다. 항체 분비 하이브리도마는 재도말되고, 다시 스크리닝될 수 있는데, 인간 IgG에 대하여 여전히 양성이면 상기 단클론 항체는 제한 희석(limiting dilution)에 의해 적어도 2회 서브클로닝(subcloning)될 수 있다. 안정적인 서브클론(subclone)은 이후, 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 산출하기 위하여 시험관내에서 배양될 수 있다.

인간 단클론 항체를 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마는 단클론 항체 정제를 위한 2-ℓ스피너-플라스크(spinner-flask)에서 성장될 수 있다. 상층액은 단백질 A-세파로즈(sepharose)(Pharmacia, Piscataway, N.J.)로 친화력 크로마토그래피에 앞서 여과되고 농축될 수 있다. 용리된 IgG는 순도를 담보하기 위하여 겔 전기영동과 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 점검될 수 있다. 완충액(buffer solution)은 PBS 내로 교체될 수 있고, 농도는 1.43 흡광 계수(extinction coefficient)를 이용한 OD280에 의해 측정될 수 있다. 단클론 항체는 등분되고 -80℃에서 보관될 수 있다.

단클론 항체를 생산하는 이입세포의 산출

또한, 본 발명의 항체는 예로써, 당분야에 널리 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술과 유전자 형질감염(transfection) 방법의 조합을 이용하여 숙주 세포 이입세포에서 생산될 수 있다(가령, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

가령, 항체, 또는 이들의 항체 단편을 발현하기 위하여, 부분 또는 전장 경쇄와 중쇄를 인코딩하는 DNA는 표준 분자 생물학 기술(가령, 목적하는 항체를 발현하는 하이브리도마를 이용한 PCR 증폭 또는 cDNA 클로닝)에 의해 획득될 수 있고, DNA는 이들 유전자가 전사와 번역 제어 서열(control sequence)에 작동가능하게 연결되도록 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 문맥에서, 용어 “작동가능하게 연결된”은 벡터 내에 전사와 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사와 번역을 조절하는 의도된 기능을 수행하도록 항체 유전자가 벡터 내로 결찰된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터와 발현 제어 서열은 이용된 발현 숙주 세포와 양립하도록 선택된다. 항체 경쇄 유전자와 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터 내로 삽입되고, 또는, 더욱 전형적으로, 양쪽 유전자는 동일한 발현 벡터 내로 삽입된다. 이들 항체 유전자는 표준 방법(가령, 항체 유전자 단편과 벡터 상에서 상보성 제한 부위(complementary restriction site)의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않으면 평활 말단 결찰(blunt end ligation))에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 본 발명에 개시된 항체의 경쇄와 중쇄 가변 영역은 V_H 단편이 벡터 내에서 C_H 단편에 작동가능하게 연결되고 V_K 단편이 벡터 내에서 C_L 단편에 작동가능하게 연결되도록 원하는 아이소타입의 중쇄 불변과 경쇄 불변 영역을 이미 인코딩하는 발현 벡터 내로 그들을 삽입함으로써 임의의 항체 아이소타입의 전장 항체 유전자를 산출하는데 이용될 수 있다. 부가적으로 또는 대안으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 항체 사슬의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 인코딩할 수 있다. 항체 사슬 유전자는 신호 펩티드가 이러한 항체 사슬 유전자의 아미노 말단에 인-프레임 연결되도록 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이질성 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질로부터 신호 펩티드)일 수 있다.

항체 사슬 유전자 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 항체 사슬 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 보유한다. 용어 “조절 서열”은 항체 사슬 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer)와 다른 발현 제어 요소(가령, 폴리아데닐화(polyadenylation) 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이런 조절 서열은 예로써, Goeddel(Gene expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))에서 기술된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 조절 서열의 선택을 비롯한 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 희망하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 좌우된다. 포유동물 숙주 세포 발현을 위한 바람직한 조절 서열에는 포유동물 세포 내에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV), 유인원 바이러스(Simian Virus) 40(SV40), 아데노바이러스(adenovirus)(가령, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenovirus major late promoter, AdMLP)와 폴리오마(polyoma)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서가 포함된다. 대안으로, 비-바이러스 조절 서열, 예를 들면, 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터 또는 β-글로빈(globin) 프로모터가 이용될 수도 있다. 더 나아가, 상이한 출처로부터 서열로 구성된 조절 요소, 예를 들면, SV40 조기 프로모터로부터 서열과 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입 1의 긴 말단 반복(long terminal repeat)을 내포하는 SRα 프로모터 시스템이 이용될 수 있다(Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

항체 사슬 유전자와 조절 서열 이외에, 본 발명의 재조합 발현 벡터는 부가적인 서열, 예를 들면, 숙주 세포 내에서 상기 벡터의 복제를 조절하는 서열(가령, 복제 기점)과 선별가능 마커(selectable marker) 유전자를 보유할 수도 있다. 선별가능 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선별을 용이하게 한다(예로써, U.S. Pat. No. 4,399,216; 4,634,665와 5,179,017(Axel et al.) 참조). 가령, 전형적으로, 선별가능 마커 유전자는 약물, 예를 들면, G418, 히그로마이신(hygromycin) 또는 메토트렉세이트(methotrexate)에 대한 내성(resistance)을, 벡터가 도입된 숙주 세포에 공여한다. 바람직한 선별가능 마커 유전자에는 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase, DHFR) 유전자(dhfr- 숙주 세포에서 메토트렉세이트 선별/증폭에 이용)와 neo 유전자(G418 선별에 이용)가 포함된다.

경쇄와 중쇄의 발현을 위하여, 이러한 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 발현 벡터는 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 다양한 형태의 용어 “형질감염”은 외인성 DNA의 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로의 도입에 통상적으로 이용되는 폭넓은 기술, 예를 들면, 전기천공(electroporation), 칼슘-인산염 침전(calcium-phosphate precipitation), DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포괄하는 것으로 의도된다. 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 항체를 발현하는 것이 이론적으로 가능하긴 하지만, 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 항체의 발현이 가장 바람직한데, 그 이유는 이런 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절하게 접힘된 면역학적 활성 항체를 조립하고 분비할 가능성이 더욱 높기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 활성 항체의 높은 수율 생산에 무효한 것으로 보고되었다(Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

본 발명의 재조합 항체를 발현하는데 적합한 포유동물 숙주 세포에는 예로써, R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621에 기술된 바와 같이 DHFR 선별가능 마커와 함께 이용되는 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포(Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220에 기술된 dhfr^- CHO 세포 포함), NSO 골수종 세포, COS 세포와 SP2 세포가 포함된다. 특히, NSO 골수종 세포와 함께 이용을 위하여, 다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462(Wilson), WO 89/01036(Bebbington)과 EP 338,841(Bebbington)에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포 내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포 내에서 상기 항체의 발현 또는, 더욱 적절하게는, 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로 상기 항체의 분비를 가능하게 하는 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양함으로써 생산된다. 항체는 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 회수될 수 있다.

항원에 항체 결합의 특성화

본 발명의 항체는 예로써, 표준 ELISA에 의해 글리피칸-3에 결합에 대하여 조사될 수 있다. 간단히 말하면, 마이크로역가 평판(microtiter plate)은 PBS에서 0.25㎍/㎖로 정제된 글리피칸-3으로 코팅되고, 이후 PBS에서 5% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 차단된다. 항체 희석액(가령, 글리피칸-3-면역화된 생쥐로부터 혈장 희석액)은 각 웰에 첨가되고 37°C에서 1-2시간 동안 항온 처리된다. 평판은 PBS/Tween으로 세척되고, 이후 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase)에 접합된 이차 반응물(가령, 인간 항체의 경우에, 항-항-인간 IgG Fc-특이적 다클론 반응물)과 함께 37℃에서 1시간 동안 항온 처리된다. 세척후, 평판은 pNPP 기질(1 ㎎/㎖)로 진전되고, 405-650의 OD에서 분석된다. 적절하게는, 최대 역가를 발생시키는 생쥐가 융합에 이용될 것이다.

앞서 기술된 바와 같은 ELISA 분석은 글리피칸-3 면역원(immunogen)과 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝하는 데에도 이용될 수 있다. 글리피칸-3에 높은 결합활성(avidity)으로 결합하는 하이브리도마는 서브클로닝되고 더욱 특성화된다. -140℃에서 보관되는 5-10개 바이알 세포 뱅크(cell bank)를 만들고, 항체 정제를 위하여, 부모 세포의 반응성(ELISA에 의해)을 유지하는 각 하이브리도마로부터 하나의 클론이 선택될 수 있다.

항-글리피칸-3 항체를 정제하기 위하여, 선택된 하이브리도마는 단클론 항체 정제를 위한 2-ℓ 스피너-플라스크(spinner-flask)에서 성장될 수 있다. 상층액은 단백질 A-세파로즈(sepharose)(Pharmacia, Piscataway, N.J.)로 친화력 크로마토그래피에 앞서 여과되고 농축될 수 있다. 용리된 IgG는 순도를 담보하기 위하여 겔 전기영동과 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 점검될 수 있다. 완충액(buffer solution)은 PBS 내로 교체될 수 있고, 농도는 1.43 흡광 계수(extinction coefficient)를 이용한 OD280에 의해 측정될 수 있다. 단클론 항체는 등분되고 -80℃에서 보관될 수 있다.

선택된 항-글리피칸-3 단클론 항체가 독특한 에피토프에 결합하는 지를 결정하기 위하여, 각 항체는 상업적으로 가용한 시약(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 비오틴화될 수 있다. 표지되지 않은 단클론 항체와 비오틴화된 단클론 항체를 이용한 경쟁 연구는 앞서 기술된 바와 같이 글리피칸-3 코팅된-ELISA 평판을 이용하여 수행될 수 있다. 비오틴화된 mAb 결합은 스트렙-아비딘-알칼리성 포스파타아제 프로브(strep-avidin-alkaline phosphatase probe)로 검출될 수 있다.

정제된 항체의 아이소타입을 결정하기 위하여, 특정의 아이소타입의 항체에 특이적인 반응물을 이용한 아이소타입 ELISA가 수행될 수 있다. 가령, 인간 단클론 항체의 아이소타입을 결정하기 위하여, 마이크로역가 평판의 웰이 4℃에서 하룻밤동안 1 ㎍/㎖의 항-인간 면역글로불린으로 코팅될 수 있다. 1% BSA로 차단한 이후, 평판은 주변 온도(ambient temperature)에서 1시간 내지 2시간 동안 1 ㎍/㎖ 또는 그 이하의 검사 단클론 항체 또는 정제된 아이소타입 대조와 반응된다. 이들 웰은 이후, 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타아제-접합된 프로브와 반응된다. 평판은 진전되고 앞서 기술된 바와 같이 분석된다.

항-글리피칸-3 인간 IgG는 웨스턴 블랏팅(Western blotting)으로 글리피칸-3 항원과의 반응성에 대하여 더욱 조사될 수 있다. 간단히 말하면, 글리피칸-3은 제조되고 황산도데실나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)이 수행될 수 있다. 전기영동후, 분리된 항원은 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 막으로 이전되고, 10% 소 태아 혈청(fetal calf serum)으로 차단되고, 조사되는 단클론 항체로 탐침된다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타아제를 이용하여 검출되고 BCIP/NBT 기질 정제(Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.)로 진전될 수 있다.

또한, 본 발명의 항체의 결합 특이도는 예로써, 유세포 분석법으로, 글리피칸-3을 발현하는 세포에 항체의 결합을 모니터링함으로써 결정될 수도 있다. 전형적으로, 세포주, 예를 들면, CHO 세포주는 글리피칸-3의 막통과 형태(transmembrane form)를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된다. 이러한 형질감염된 단백질은 태그(tag), 예를 들면, myc-태그를 가급적, 이러한 태그에 대한 항체를 이용한 검출을 위하여 N-말단에서 포함할 수 있다. 글리피칸-3에 본 발명의 항체의 결합은 형질감염된 세포를 상기 항체와 함께 배양하고, 결합된 항체를 검출함으로써 결정될 수 있다. 형질감염된 단백질 상에서 태그에 항체의 결합은 양성 대조(positive control)로서 이용된다.

글리피칸-3에 대한 본 발명의 항체의 특이도는 글리피칸-3에 결합을 측정하는 방법과 동일한 방법을 이용하여 상기 항체가 다른 단백질(가령, 글리피칸-1, 글리피칸-2, 글리피칸-4 또는 글리피칸-6) 또는 글리피칸-3 자체에 결합하는 지를 결정함으로써 더욱 조사될 수 있다.

면역접합체

다른 측면에서, 본 발명은 치료 모이어티(therapeutic moiety), 예를 들면, 세포독소, 약물(가령, 면역억제제(immunosuppressant)) 또는 방사성독소(radiotoxin)에 접합된 항-글리피칸-3 항체, 또는 이의 단편을 특징으로 한다. 이런 접합체는 “면역접합체”로 지칭된다. 하나 이상의 세포독소를 포함하는 면역접합체는 “면역독소(immunotoxin)”로 지칭된다. 세포독소 또는 세포독성제(cytotoxic agent)에는 세포에 유해한(가령, 세포를 사멸시키는) 작용제가 포함된다. 실례에는 탁솔(taxol), 시토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 브롬화 에티듐(ethidium bromide), 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 테노포시드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜히친(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디히드록시 안트라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미트라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin) D, 1-데히드로테스토스테론(dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoid), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로파라놀롤(propranolol), 그리고 푸로마이신(puromycin)과 이의 유사체와 동족체가 포함된다. 치료 약제에는 또한, 예로써 항대사물질(antimetabolite)(가령, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-메르캅토퓨린(mercaptopurine), 6-티오구아닌(thioguanine), 시타라빈(cytarabine), 5-플루오르우라실 데카르바진(fluorouracil decarbazine)), 알킬화제(alkylating agent)(가령, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카르무스틴(carmustine, BSNU)와 로무스틴(lomustine, CCNU), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신(mitomycin) C, 그리고 시스-디클로로디아민 백금(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP) 시스플라틴(cisplatin)), 안트라사이클린(anthracycline)(가령, 다우노루비신(daunorubicin)(이전에 다우노마이신(daunomycin))과 독소루비신(doxorubicin)), 항생제(가령, 닥티노마이신(dactinomycin)(이전에 악티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 미트라마이신(mithramycin), 그리고 안트라마이신(anthramycin)(AMC)), 그리고 항-유사분열제(anti-mitotic agent)(가령, 빈크리스틴(vincristine)과 빈블라스틴(vinblastine))가 포함된다.

본 발명의 항체에 접합될 수 있는 치료 세포독소의 다른 바람직한 실례에는 듀오카르마이신(duocarmycin), 칼리케아미신(calicheamicin), 메이탄신(maytansine)과 아우리스타틴(auristatin), 그리고 이들의 유도체가 포함된다. 칼리케아미신 항체 접합체의 한 가지 실례는 상업적으로 가용하다(Mylotarg®; American Home Products).

세포독소는 당분야에 가용한 링커 기술을 이용하여 본 발명의 항체에 접합될 수 있다. 세포독소를 항체에 접합시키는데 이용되는 링커 유형의 실례에는 히드라존(hydrazone), 티오에테르(thioether), 에스테르(ester), 디설피드(disulfide)와 펩티드-포함 링커가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 예로써, 리소좀 구획(lysosomal compartment) 내에서 낮은 pH에 의한 절단, 또는 프로테아제(protease), 예를 들면, 종양 조직에서 우선적으로 발현되는 프로테아제, 예를 들면, 카텝신(cathepsin)(가령, 카텝신 B, C, D)에 의한 절단에 취약한 링커가 선택될 수 있다.

세포독소의 실례는 예로써, U.S. Patent No. 6,989,452, 7,087,600과 7,129,261, 그리고 PCT Application No. PCT/US02/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US06/37793, PCT/US06/060050, PCT/US2006/060711, WO/2006/110476, 그리고 U.S. Patent Application No. 60/891,028에서 기술되는데, 이들 모두 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다. 치료 약제를 항체에 접합시키기 위한 세포독소, 링커와 방법의 유형에 관한 더욱 상세한 정보는 Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264를 참조한다.

본 발명의 항체는 방사성면역접합체(radioimmunoconjugate)로 지칭되는 세포독성 방사성약제를 산출하기 위하여 방사성 동위원소에 접합될 수도 있다. 진단 또는 치료 목적에 이용을 위하여 항체에 접합될 수 있는 방사성 동위원소의 실례에는 요오드(iodine)¹³¹, 인듐(indium)¹¹¹, 이트륨(yttrium)⁹⁰과 루테튬(lutetium)¹⁷⁷이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 방사성면역접합체를 제조하는 방법은 당분야에 확립되어 있다. Zevalin®(IDEC Pharmaceuticals)과 Bexxar®(Corixa Pharmaceuticals)을 비롯한 방사성면역접합체의 실례는 상업적으로 가용하고, 본 발명의 항체를 이용하여 방사성면역접합체를 제조하는데 유사한 방법이 이용될 수 있다.

본 발명의 항체 접합체는 소정의 생물학적 반응을 변화시키는데 이용될 수 있고, 약물 모이어티는 고전적인 화학 치료 약제에 한정되지 않는다. 가령, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 이런 단백질에는 예로써, 효소 활성 독소, 또는 이의 활성 단편, 예를 들면, 아브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스 엑소톡신(pseudomonas exotoxin), 또는 디프테리아 독소(diphtheria toxin); 단백질, 예를 들면, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor) 또는 인터페론(interferon)-γ; 또는, 생물학적 반응 조절제, 예를 들면, 림포카인(lymphokine), 인터루킨(interleukin)-1(“IL-1”), 인터루킨-2(“IL-2”), 인터루킨-6(“IL-6”), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, “GM-CSF”), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, “G-CSF”), 또는 다른 성장 인자가 포함된다.

이런 치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술은 널리 공지되어 있다. 예로써, Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery (2^nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982)을 참조한다.

이중특이적 분자

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항-글리피칸-3 항체, 또는 이의 단편을 포함하는 이중특이적 분자를 특징으로 한다. 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 적어도 2개의 상이한 결합 부위 또는 표적 분자에 결합하는 이중특이적 분자를 산출하기 위하여 다른 기능 분자, 예를 들면, 다른 펩티드 또는 단백질(가령, 다른 항체 또는 수용체에 대한 리간드)로 유도되거나, 또는 이러한 분자에 연결될 수 있다. 본 발명의 항체는 실제로, 2개 이상의 상이한 결합 부위 및/또는 표적 분자에 결합하는 다중특이적 분자를 산출하기 위하여 유도되거나, 또는 1개 이상의 다른 기능 분자에 연결될 수도 있다; 이런 다중특이적 분자 역시 본 명세서에서, 용어 “이중특이적 분자”에 포함되는 것으로 의도된다. 본 발명의 이중특이적 분자를 산출하기 위하여, 본 발명의 항체는 이중특이적 분자가 발생하도록 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들면, 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 연결될 수 있다(가령, 화학적 결합, 유전자 융합, 비공유 결합 등에 의해).

따라서 본 발명은 글리피칸-3에 대한 적어도 하나의 첫 번째 결합 특이도와 두 번째 표적 에피토프에 대한 두 번째 결합 특이도를 포함하는 이중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 두 번째 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들면, 인간 FcγRI(CD64) 또는 인간 Fcα 수용체(CD89)이다. 이런 이유로, 본 발명은 FcγR 또는 FcαR 발현 작동체 세포(가령, 단핵구(monocyte), 대식세포 또는 다형핵(polymorphonuclear) 세포(PMN))에, 그리고 글리피칸-3을 발현하는 표적 세포 둘 모두에 결합할 수 있는 이중특이적 분자를 포함한다. 이들 이중특이적 분자는 글리피칸-3 발현 세포를 작동체 세포로 표적화시키고 Fc 수용체-매개된 작동체 세포 활성, 예를 들면, 글리피칸-3 발현 세포의 식세포작용(phagocytosis), 항체 의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC), 사이토킨 방출, 또는 과산화 음이온(superoxide anion)의 산출을 유발한다.

이중특이적 분자가 다중특이적인 본 발명의 한 구체예에서, 상기 분자는 항-Fc 결합 특이도와 항-글리피칸-3 결합 특이도 이외에, 세 번째 결합 특이도를 더욱 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 세 번째 결합 특이도는 항-강화 인자(EF) 부분, 예를 들면, 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질에 결합하여 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. “항-강화 인자 부분”은 소정의 분자, 예를 들면, 항원 또는 수용체에 결합하여 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정부위(binding determinant)의 효과의 강화를 결과하는 항체, 기능 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. “항-강화 인자 부분”은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 결합할 수 있다. 대안으로, 항-강화 인자 부분은 첫 번째와 두 번째 결합 특이도가 결합하는 존재(entity)로부터 상이한 존재에 결합할 수 있다. 가령, 항-강화 인자 부분은 세포독성 T-세포(가령, 표적 세포에 대하여 증가된 면역 반응을 결과하는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역 세포)일 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 결합 특이도로, 적어도 하나의 항체, 또는 예로써, Fab, Fab’, F(ab’)₂, Fv, Fd, dAb 또는 단일 사슬 Fv를 비롯한 이들의 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한, 본 발명에서 명백히 참조로서 편입되는 U.S. Patent No. 4,946,778(Ladner et al.)에서 기술된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이합체(dimer), 또는 이의 최소 단편, 예를 들면, Fv 또는 단일 사슬 구조체일 수도 있다.

한 구체예에서, Fcγ 수용체에 대한 결합 특이도는 단클론 항체에 의해 제공되고, 이의 결합이 인간 면역글로불린 G(IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본 명세서에서, 용어 “IgG 수용체”는 염색체 1에 위치하는 8개의 γ-사슬 유전자 중에서 임의의 하나의 유전자 산물을 지칭한다. 이들 유전자는 3가지 Fcγ 수용체 부류: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32)와 FcγRIII(CD16)으로 분류되는 총 12가지 막통과 또는 가용성 수용체 동종형을 인코딩한다. 바람직한 구체예에서, Fcγ 수용체는 인간 높은 친화력 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 72 kDa 분자인데, 이는 단량체 IgG에 대한 높은 친화력(10⁸ - 10⁹ M^-1)을 나타낸다.

일정한 바람직한 항-Fcγ 단클론 항체의 생산과 특성화는 PCT Publication WO 88/00052와 U.S. Patent No. 4,954,617(Fanger et al.)에서 기술되는데, 이들의 교시는 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다. 이들 항체는 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII의 Fcγ 결합 부위와 상이한 부위에서 상기 수용체의 에피토프에 결합하고, 따라서 그들의 결합이 생리 수준의 IgG에 의해 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이적인 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62와 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마는 American Type Culture Collection, ATCC Accession No. HB9469로부터 가용하다. 다른 구체예에서, 항-Fcγ 수용체 항체는 단클론 항체 22의 인간화 형태(H22)이다. H22 항체의 생산과 특성화는 Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002와 PCT Publication WO 94/10332(Tempest et al.)에서 기술된다. H22 항체 생산 세포주는 HA022CL1 명칭 하에 American Type Culture Collection에 기탁되었고 수탁 번호 CRL 11177을 갖는다.

또 다른 바람직한 구체예에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이도는 인간 IgA 수용체, 예를 들면, Fc-알파 수용체 (FcαRI(CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되고, 이의 결합은 가급적, 인간 면역글로불린 A(IgA)에 의해 차단되지 않는다. 용어 “IgA 수용체”는 염색체 19에 위치하는 하나의 α-유전자의 유전자 산물(FcαRI)을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 유전자는 55 내지 110 kDa의 여러 택일적으로 절단접합된 막통과 동종형을 인코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRI(CD89)는 단핵세포/대식세포, 호산성과 호중성 과립구에서 구조적으로 발현되지만, 비-작동체 세포 개체군에서는 발현되지 않는다. FcαRI는 IgA1과 IgA2 둘 모두에 대하여 중간 친화력( 5 x 10⁷ M^-1)을 갖는데, 이는 사이토킨, 예를 들면, G-CSF 또는 GM-CSF에 노출 이후에 증가된다(Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). IgA 리간드 결합 도메인 외부에서 FcαRI에 결합하는, A3, A59, A62와 A77로 확인된 4가지 FcαRI-특이적 단클론 항체가 보고되었다(Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).

FcαRI와 FcγRI는 본 발명의 이중특이적 분자에서 이용에 바람직한 유발 수용체(trigger receptor)인데, 그 이유는 이들 수용체가 (1) 면역 작동체 세포, 예를 들면, 단핵세포, PMN, 대식세포와 수상돌기 세포(dendritic cell)에서 일차적으로 발현되고; (2) 높은 수준(가령, 세포당 5,000-100,000개)에서 발현되고; (3) 세포독성 활성(가령, ADCC, 식세포작용)의 매개인자이고; 그리고 (4) 그들에게 표적화되는, 자기항원(self-antigen)을 비롯한 항원의 강화된 항원 제시를 매개하기 때문이다.

인간 단클론 항체가 선호되긴 하지만, 본 발명의 이중특이적 분자에 이용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라와 인간화 단클론 항체이다.

본 발명의 이중특이적 분자는 당분야에 공지된 방법을 이용하여, 구조성 결합 특이도, 예를 들면, 항-FcR과 항-글리피칸-3 결합 특이도를 접합함으로써 제조될 수 있다. 가령, 이중특이적 분자의 각 결합 특이도는 별개로 산출되고, 이후 서로 접합될 수 있다. 결합 특이도가 단백질 또는 펩티드이면, 다양한 결합제(coupling agent) 또는 가교-연결제(cross-linking agent)가 공유 접합(covalent conjugation)에 이용될 수 있다. 가교-연결제의 실례에는 단백질 A, 카보디이미드(carbodiimide), N-숙시니미딜-S-아세틸-티오아세테이트(SATA), 5,5’-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB), o-페닐렌디말레이미드(phenylenedimaleimide)(oPDM), N-숙시니미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 그리고 설포숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(설포-SMCC)가 포함된다(예로써, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648 참조). 다른 방법에는 Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83; 그리고 Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375에 기술된 것들이 포함된다. 바람직한 접합제(conjugating agent)는 SATA와 설포-SMCC인데, 둘 모두 Pierce Chemical Co.(Rockford, IL)로부터 가용하다.

결합 특이도가 항체일 때, 이들은 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 설피드릴 결합(sulfhydryl bonding)을 통하여 접합될 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 힌지 영역은 접합에 앞서, 홀수 개, 바람직하게는 1개의 설피드릴 잔기를 내포하도록 변형된다.

대안으로, 양쪽 결합 특이도는 동일한 벡터 내에 인코딩되고, 동일한 숙주 세포 내에서 발현되고 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)₂ 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 분자는 하나의 단일 사슬 항체와 결합 결정부위를 포함하는 단일 사슬 분자, 또는 2개의 결합 결정부위를 포함하는 단일 사슬 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 분자는 적어도 2개의 단일 사슬 분자를 포함할 수도 있다. 이중특이적 분자를 제조하는 방법은 예로써, U.S. Patent No. 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498과 5,482,858에 기술되는데, 이들 모두 본 발명에서 명백히 참조로서 편입된다.

이중특이적 분자의 그들의 특이적 표적에 결합은 예로써, 효소-연결된 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA), 방사성면역분석법(radioimmunoassay, RIA), FACS 분석, 생물학적 정량(bioassay)(가령, 성장 저해), 또는 웨스턴 블랏(Western Blot) 분석에 의해 확증될 수 있다. 이들 각 분석법은 일반적으로, 목적하는 복합체에 특이적인 표지된 반응물(가령, 항체)을 이용함으로써 목적하는 특정의 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 가령, FcR-항체 복합체는 예로써, 항체-FcR 복합체를 인식하고 여기에 특이적으로 결합하는 효소-연결된 항체 또는 항체 단편을 이용하여 검출될 수 있다. 대안으로, 복합체는 다양한 다른 면역분석법(immunoassay)을 이용하여 검출될 수 있다. 가령, 항체는 방사성 표지되고, 방사성면역분석법(RIA)에 이용될 수 있다(예로써, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986 참조). 방사성 동위원소는 γ 계수기 또는 신틸레이션 계수기의 이용과 같은 수단에 의해, 또는 방사능사진촬영(autoradiography)에 의해 검출될 수 있다.

제약학적 조성물

다른 측면에서, 본 발명에서는 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 조제된, 본 발명의 단클론 항체, 또는 이들의 항원-결합 부분 중에서 한 가지 또는 이들의 조합을 포함하는 조성물, 예를 들면, 제약학적 조성물을 제시한다. 이런 조성물은 본 발명의 항체, 또는 면역접합체 또는 이중특이적 분자(가령, 2개 또는 그 이상의 상이한) 중에서 한 가지 또는 이들의 조합을 포함할 수도 있다. 가령, 본 발명의 제약학적 조성물은 표적 항원 상에서 상이한 에피토프에 결합하거나, 또는 상보성 활성(complementary activity)을 갖는 항체(또는 면역접합체 또는 이중특이체)의 조합을 포함할 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물은 또한, 복합 요법(combination therapy)으로, 다시 말하면, 다른 약제(agent)와 조합으로 투여될 수 있다. 가령, 이러한 복합 요법은 적어도 하나의 다른 소염제(anti-inflammatory agent) 또는 면역억제제(immunosuppressant agent)와 조합된 본 발명의 항-글리피칸-3 항체를 포함할 수 있다. 복합 요법에 이용될 수 있는 치료 약제의 실례는 본 발명의 항체의 이용에 관한 하기 섹션에서 더욱 상세하게 기술된다.

본 명세서에서, “제약학적으로 허용되는 담체”는 생리학적으로 양립성인 모든 용매, 분산 매체(dispersion media), 코팅(coating), 항생제와 항진균제, 등장성제(isotonic agent)와 흡수 지연제(absorption delaying agent) 등을 포함한다. 적절하게는, 이러한 담체는 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 비경구(parenteral), 척수(spinal) 또는 표피(epidermal) 투여(가령, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 다시 말하면, 항체, 면역접합체, 또는 이중특이적 분자는 상기 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산과 다른 자연 조건의 작용으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.

본 발명의 제약학적 화합물은 하나 이상의 제약학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. “제약학적으로 허용되는 염”은 부모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하면서 임의의 원치 않는 독성 효과를 유발하지 않는 염을 지칭한다(예로써, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19 참조). 이런 염의 실례에는 산 부가염(acid addition salt)과 염기 부가염(base addition salt)이 포함된다. 산 부가염에는 무독성 무기염(nontoxic inorganic acid), 예를 들면, 염화수소산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등, 그리고 무독성 유기산(nontoxic organic acid), 예를 들면, 지방족 모노-와 디카르복실산, 페닐-치환된 알카노산(alkanoic acid), 히드록시 알카노산(hydroxy alkanoic acid), 방향족 산(aromatic acid), 지방족과 방향족 술폰산(sulfonic acid) 등으로부터 유래된 것들이 포함된다.

염기 부가염에는 알칼리성 토류 금속(alkaline earth metal), 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등, 그리고 무독성 유기 아민(nontoxic organic amine), 예를 들면, N,N’-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민(methylglucamine), 클로로프로카인(chloroprocaine), 콜린(choline), 디에탄올아민(diethanolamine), 에틸렌디아민(ethylenediamine), 프로카인(procaine) 등으로부터 유래된 것들이 포함된다.

본 발명의 제약학적 조성물은 또한, 제약학적으로 허용되는 항-산화제를 포함할 수 있다. 제약학적으로 허용되는 항산화제의 실례에는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산(ascorbic acid), 시스테인 염산염(cysteine hydrochloride), 황산수소나트륨(sodium bisulfate), 메타이아황산 나트륨(sodium metabisulfite), 아황산나트륨(sodium sulfite) 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들면, 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 부틸화된 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸화된 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT), 레시틴(lecithin), 프로필 갈레이트(propyl gallate), 알파-토코페롤(alpha-tocopherol) 등; 그리고 (3) 금속 킬레이트화제(metal chelating agent), 예를 들면, 구연산(citric acid), 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA), 소르비톨(sorbitol), 타르타르산(tartaric acid), 인산(phosphoric acid) 등이 포함된다.

본 발명의 제약학적 조성물에 이용될 수 있는 적합한 수성과 비수성 담체의 실례에는 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등)과 이들의 적절한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들면, 올리브 오일, 그리고 주사가능 유기 에스테르(injectable organic ester), 예를 들면, 에틸 올레산염(ethyl oleate)이 포함된다. 적절한 유동성(fluidity)은 예로써, 코팅 물질(coating material), 예를 들면, 레시틴의 이용에 의해, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다.

이들 조성물은 또한, 어쥬번트, 예를 들면, 보존제(preservative), 습윤제(wetting agent), 유화제(emulsifying agent)와 분산제(dispersing agent)를 포함할 수 있다. 미생물 존재의 예방은 멸균 절차(sterilization procedure)에 의해, 그리고 다양한 항생제와 항진균제, 예를 들면, 파라벤(paraben), 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀 소르브산(phenol sorbic acid) 등의 포함에 의해 담보될 수 있다. 또한, 등장성제(isotonic agent), 예를 들면, 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 이에 더하여, 주사가능 제약학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate)와 젤라틴(gelatin)의 포함에 의해 달성될 수 있다.

제약학적으로 허용되는 담체에는 무균 주사가능 용액 또는 분산액의 즉석 제조(extemporaneous preparation)를 위한 무균 수성 용액 또는 분산액과 무균 분말이 포함된다. 제약학적 활성 물질에 대한 이런 매체와 작용제의 이용은 당분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매체 또는 작용제가 활성 화합물과 비양립성인 경우를 제외하고, 본 발명의 제약학적 조성물에서 이들의 이용이 고려된다. 보충 활성 화합물 역시 조성물 내로 통합될 수 있다.

치료 조성물은 전형적으로, 무균이고 제조와 보관 조건 하에 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼(microemulsion), 리포좀(liposome), 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정연한 구조(ordered structure)로서 조제될 수 있다. 담체는 예로써, 물, 에탄올, 폴리올(가령, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 그리고 이들의 적절한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산액 매체일 수 있다. 적절한 유동성은 예로써, 코팅, 예를 들면, 레시틴의 이용에 의해, 분산제의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장성제(isotonic agent), 예를 들면, 당, 다가알코올(polyalcohol), 예를 들면, 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염과 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.

무균 주사가능 용액은 앞서 기술된 성분 중에서 한 가지 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매에 활성 화합물을 필요한 양으로 통합하고, 필요에 따라서 그 이후에, 멸균 마이크로여과(sterilization microfiltration)에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산액 매체와 앞서 기술된 것들로부터 필요한 다른 성분을 내포하는 무균 운반제 내로 활성 화합물을 통합함으로써 제조될 수 있다. 무균 주사가능 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 사전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 부가적인 원하는 성분의 분말을 산출하는 진공 건조(vacuum drying)와 냉동(freeze-drying)(동결 건조(lyophilization))이다.

단일 약형(dosage form)을 생산하기 위하여 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 개체와 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 약형을 생산하기 위하여 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로, 치료 효과를 산출하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 상기 양은 제약학적으로 허용되는 담체와의 조합에서 100% 중에서 대략 0.01% 내지 대략 99% 범위의 활성 성분, 바람직하게는 대략 0.1% 내지 대략 70%, 가장 바람직하게는 대략 1% 내지 대략 30%의 활성 성분일 것이다.

투약 섭생(dosage regimen)은 최적의 원하는 반응(가령, 치료 반응)을 제공하기 위하여 조정된다. 가령, 단일 주사(bolus)가 투여되거나, 시간의 추이에서 여러 분할된 분량(divided dose)이 투여되거나, 또는 복용량이 치료 상황의 위급성에 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 편의한 투여와 균일한 투약을 위하여 단위 약형(dosage unit form)으로 비경구 조성물을 조제하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서, 단위 약형은 치료되는 개체에 대한 단일 적량(unitary dosage)으로서 적합한 물리적으로 별개의 단위체를 지칭한다; 각 단위체는 요구되는 제약학적 담체와 공동으로 원하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 활성 화합물의 미리 결정된 양을 포함한다. 본 발명의 단위 약형에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 독특한 특징과 달성되는 특정의 치료 효과, 그리고 (b) 개체에서 감수성의 치료를 위한 활성 화합물과 같은 조제(compounding) 분야에 내재된 한계에 직접적으로 좌우된다.

항체의 투여를 위하여, 용량 범위는 호스트 체중 ㎏당 대략 0.0001 내지 100 ㎎, 더욱 일반적으로, 0.01 내지 5 ㎎이다. 가령, 용량은 0.3 ㎎/체중 ㎏, 1 ㎎/체중 ㎏, 3 ㎎/체중 ㎏, 5 ㎎/체중 ㎏ 또는 10 ㎎/체중 ㎏이거나, 또는 1-10 ㎎/㎏의 범위 내에 들어갈 수 있다. 전형적인 치료 섭생(treatment regime)은 주 1회, 2주 1회, 3주 1회, 4주 1회, 월 1회, 3개월 1회, 또는 3개월 내지 6개월 1회 투여를 수반한다. 본 발명의 항-글리피칸-3 항체에 바람직한 투약 섭생은 정맥내 투여를 통하여 1 ㎎/체중 ㎏ 또는 3 ㎎/체중 ㎏을 포함하는데, 상기 항체는 아래의 투약 일정(dosing schedule) 중에서 한 가지를 이용하여 제공된다: (i) 4주 1회 간격으로 6회 투약, 이후 3개월 1회; (ii) 3주 1회; (iii) 3 ㎎/체중 ㎏으로 1회, 그 이후에 1 ㎎/체중 ㎏으로 3주 1회.

일부 방법에서, 상이한 결합 특이도를 갖는 2개 또는 그 이상의 단클론 항체가 동시에 투여되는데, 이런 경우에 투여되는 각 항체의 용량은 지정된 범위 내에 들어간다. 항체는 일반적으로, 다중 시점에 투여된다. 단일 투약 간에 간격은 예로써, 1주, 1개월, 3개월 또는 1년일 수 있다. 간격은 또한, 환자에서 표적 항원에 대한 항체의 혈중 수준(blood level)을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙할 수도 있다. 일부 방법에서, 용량은 대략 1-1000 ㎍/㎖의 혈장 항체 농도를 달성하기 위하여, 그리고 일부 방법에서 대략 25-300 ㎍/㎖의 혈장 항체 농도를 달성하기 위하여 조정된다.

대안으로, 항체는 서방 제제(sustained release formulation)로서 투여될 수 있는데, 이런 경우에 더욱 낮은 빈도의 투여가 요구된다. 용량과 빈도는 환자에서 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간 항체는 가장 긴 반감기를 나타내고, 인간화 항체, 키메라 항체와 비-인간 항체가 그 뒤를 잇는다. 투여 용량과 빈도는 이러한 치료가 예방 또는 치료를 목적으로 하는 지에 따라 달라질 수 있다. 예방적 적용에서, 상대적으로 낮은 용량이 긴 기간 동안 상대적으로 드문 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 생애 동안 처리를 계속 받는다. 치료적 적용에서, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 바람직하게는 환자가 질병의 증상의 부분적인 또는 완전한 완화를 보일 때까지 상대적으로 짧은 간격에서 상대적으로 높은 용량이 때때로 요구된다. 이후, 환자는 예방적 섭생(prophylactic regime)이 투여될 수 있다.

본 발명의 제약학적 조성물에서 활성 성분의 실제 용량 수준은 환자에 대한 독성 없이, 특정의 환자, 조성물과 투여 방식에 대한 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 획득하기 위하여 변할 수 있다. 선택되는 용량 수준은 이용되는 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료의 지속 기간, 이용되는 특정 조성물과 병용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강과 이전 병력(medical history), 그리고 의학 분야에 널리 공지된 유사 인자를 비롯한 다양한 약동학적 인자(pharmacokinetic factor)에 좌우될 것이다.

본 발명의 항-글리피칸-3 항체의 “치료 효과량”은 가급적, 질병 증상의 심각도에서 감소, 질병 증상-없는 기간의 빈도와 지속 기간에서 증가, 또는 질병 고통(disease affliction)에 기인한 손상 또는 장애의 예방을 결과한다. 가령, 글리피칸-3⁺ 종양의 치료의 경우에, “치료 효과량”은 치료되지 않은 개체에 비하여 세포 성장 또는 종양 성장을 바람직하게는 적어도 대략 20%, 더욱 바람직하게는 적어도 대략 40%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 대략 60%, 이보다 더욱 더욱 바람직하게는 적어도 대략 80% 저해한다. 종양 성장을 저해하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 전조하는 동물 모형 시스템에서 평가될 수 있다. 대안으로, 조성물의 이러한 특성은 세포 성장을 저해하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있고, 이런 저해는 당업자에게 공지된 분석법에 의해 시험관내에서 측정될 수 있다. 치료 화합물의 치료 효과량은 종양 크기를 감소시키거나, 또는 개체에서 증상을 개선할 수 있다. 당업자는 개체의 크기, 개체의 증상의 심각도, 그리고 선택되는 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자에 기초하여 이런 양을 결정할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물은 당분야에 공지된 다양한 방법 중에서 한 가지 이상을 이용하여 한 가지 이상의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 투여 방식은 희망하는 결과에 따라 달라질 것이다. 본 발명의 항체에 바람직한 투여 경로에는 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 피하, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들면, 주사(injection) 또는 주입(infusion)에 의한 투여가 포함된다. 본 명세서에서, 관용구 “비경구 투여”는 장관내(enteral)와 국소 투여 이외에 다른 투여 방식, 일반적으로 주사에 의해 투여를 의미하는데, 여기에는 제한 없이, 근육내(intramuscular), 동맥내(intraarterial), 척수강내(intrathecal), 피막내(intracapsular), 안와내(intraorbital), 심장내(intracardiac), 피내(intradermal), 복강내(intraperitoneal), 경기관(transtracheal), 피하(subcutaneous), 표피하(subcuticular), 관절내(intraarticular), 피막하(subcapsular), 지주막하(subarachnoid), 척수내(intraspinal), 경막외(epidural)와 흉골내(intrasternal) 주사와 주입이 포함된다.

대안으로, 본 발명의 항체는 비-비경구 경로, 예를 들면, 비강내(intranasal), 구강(oral), 질(vaginal), 직장(rectal), 설하(sublingual) 또는 국소(topical)와 같은 국소(topical), 표피(epidermal) 또는 점막(mucosal) 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다.

활성 화합물은 이러한 화합물을 급속한 방출로부터 보호하는 담체, 예를 들면, 이식물(implant), 경피 패치(transdermal patch)와 마이크로캡슐화된 전달 시스템(microencapsulated delivery system)을 비롯한 서방 제제(controlled release formulation)와 함께 제조될 수 있다. 생물분해성 생체적합성 중합체, 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트(ethylene vinyl acetate), 폴리무수물(polyanhydride), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 콜라겐(collagen), 폴리오르쏘에스테르(polyorthoester), 그리고 폴리락트산(polylactic acid)이 이용될 수 있다. 이런 제제의 제조를 위한 다양한 방법은 특허되었거나, 또는 당업자에게 전반적으로 공지되어 있다. 예로써, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조한다.

치료 조성물은 당분야에 공지된 의료 장치로 투여될 수 있다. 가령, 바람직한 구체예에서, 본 발명의 치료 조성물은 바늘 없는 피하 주사 장치(hypodermic injection device), 예를 들면, U.S. Patent No. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물과 모듈의 실례에는 U.S.No.,487,603에 개시된, 통제된 속도로 약물을 분배하기 위한 이식가능 마이크로-주입 펌프(implantable micro-infusion pump); U.S.No.,486,194에 개시된, 피부를 통하여 약제를 투여하기 위한 치료 장치; U.S.No.,447,233에 개시된, 정확한 주입 속도로 약제를 전달하기 위한 약제 주입 펌프(medication infusion pump); U.S.No.,447,224에 개시된, 연속 약물 전달(continuous drug delivery)을 위한 가변 유동 이식가능 주입 기구(variable flow implantable infusion apparatus); U.S.No.,439,196에 개시된, 멀티-챔버 구획(multi-chamber compartment)을 보유하는 삼투성 약물 전달 시스템(osmotic drug delivery system); 그리고 U.S.No.,475,196에 개시된, 삼투성 약물 전달 시스템이 포함된다. 이들 특허는 본 발명에서 참조로서 편입된다. 많은 다른 이와 같은 이식물, 전달 시스템, 그리고 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 인간 단클론 항체는 생체내에서 적절한 분포가 담보되도록 조제될 수 있다. 가령, 뇌-혈관 장벽(blood-brain barrier, BBB)은 많은 고도 친수성 화합물을 배제시킨다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB(원하는 경우에)를 교차하도록 담보하기 위하여, 이들은 예로써, 리포좀에서 조제될 수 있다. 리포좀 제조 방법에 관련하여, 예로써 U.S. Patent 4,522,811; 5,374,548과 5,399,331을 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 장기 내로 선택적으로 수송되는 하나 이상의 모이어티를 포함하고, 따라서 표적화된 약물 전달을 강화시킬 수 있다(예로써, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685 참조). 전형적인 표적화 모이어티(targeting moiety)에는 엽산염(folate) 또는 비오틴(biotin)(예로써, U.S. Patent 5,416,016(Low et al.) 참조); 만노시드(mannoside)(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273)이 포함된다.

용도와 방법

본 발명의 항체, 특히, 인간 항체, 항체 조성물과 방법은 글리피칸-3 매개된 질환의 진단과 치료를 수반하는 다수의 in vitro와 in vivo 진단과 치료 효용을 갖는다. 가령, 이들 분자는 다양한 질환을 치료하고, 예방하고, 진단하기 위하여 배양 세포, 시험관내 세포 또는 탈체 세포에 투여되거나, 또는 인간 개체, 예를 들면, 생체내 투여될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 “개체”는 인간과 비-인간 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 비-인간 동물에는 모든 척추동물, 예를 들면, 포유동물과 비-포유동물, 예를 들면, 비-인간 영장류, 양, 개, 고양이, 소, 말, 닭, 양서류와 파충류가 포함된다. 바람직한 개체에는 글리피칸-3 활성에 의해 매개되는 질환을 앓는 인간 환자가 포함된다. 이들 방법은 비정상적 글리피칸-3 발현과 연관된 질환을 앓는 인간 환자를 치료하는데 특히 적합하다. 글리피칸-3에 대한 항체가 다른 작용제와 함께 투여될 때, 이들 둘은 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.

글리피칸-3에 대한 본 발명의 항체의 특이적인 결합을 고려할 때, 본 발명의 항체는 세포의 표면 상에서 글리피칸-3 발현을 특이적으로 검출하는데 이용될 수 있고, 또한 면역친화력 정제(immunoaffinity purification)를 통하여 글리피칸-3을 정제하는데 이용될 수 있다.

더 나아가, 다양한 간 종양 세포 상에서 글리피칸-3의 발현을 고려하여, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물과 방법은 간 종양원성 질환(liver tumorigenic disorder), 예를 들면, HCC 세포를 비롯한 글리피칸-3을 발현하는 종양 세포의 존재로 특징되는 질환을 앓는 개체를 치료하는데 이용될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 항체(가령, 인간 단클론 항체, 다중특이적- 또는 이중특이적 분자와 조성물)는 글리피칸-3의 수준, 또는 막 표면 상에 글리피칸-3을 내포하는 세포의 수준을 검출하는데 이용될 수 있는데, 이들 수준은 이후, 특정 질병 증상에 연결될 수 있다. 대안으로, 항체는 글리피칸-3 기능을 저해 또는 차단하는데 이용될 수 있고, 이는 차례로, 특정 질병 증상의 예방 또는 개선에 연계될 수 있고, 따라서 글리피칸-3을 상기 질환의 매개인자로서 관련시킨다. 이는 항체와 글리피칸-3 사이에 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 시료와 대조 시료를 항- 글리피칸-3 항체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체와 글리피칸-3 사이에 형성된 복합체는 시료와 대조에서 검출되고 비교된다.

다른 구체예에서, 본 발명의 항체(가령, 인간 항체, 다중특이적- 또는 이중특이적 분자와 조성물)는 시험관내에서 치료 또는 진단 용도와 연관된 결합 활성에 대하여 초기에 조사될 수 있다. 가령, 본 발명의 조성물은 하기 실시예에 기술된 유세포 분석법을 이용하여 조사될 수 있다.

본 발명의 항체(가령, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자, 면역접합체와 조성물)는 글리피칸-3-관련된 질환의 치료와 진단에서 부가적인 유용성을 갖는다. 가령, 이들 인간 단클론 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자, 그리고 면역접합체는 생체내에서 또는 시험관내에서, 아래의 생물 활성 중에서 한 가지 이상을 유도하는데 이용될 수 있다: 글리피칸-3을 발현하는 세포의 성장 저해 및/또는 이러한 세포의 사멸; 인간 작동체 세포의 존재에서 글리피칸-3을 발현하는 세포의 식세포작용 또는 ADCC의 매개, 또는 글리피칸-3에 결합으로부터 글리피칸-3 리간드 차단.

특정 구체예에서, 이들 항체(가령, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자와 조성물)는 다양한 글리피칸-3-관련된 질환을 치료, 예방 또는 진단하기 위하여 생체내에서 이용된다. 글리피칸-3-관련된 질환의 실례에는 특히, HCC와 다른 간암이 포함된다.

생체내에서와 시험관내에서 본 발명의 항체 조성물(가령, 인간 단클론 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자와 면역접합체)을 투여하는데 적합한 경로는 당분야에 널리 공지되어 있고, 당업자에 의해 선택될 수 있다. 가령, 이들 항체 조성물은 주사(가령, 정맥내 또는 피하)에 의해 투여될 수 있다. 이용되는 분자의 적절한 용량은 개체의 연령과 체중, 그리고 항체 조성물의 농도 및/또는 제제에 좌우될 것이다.

앞서 기술된 바와 같이, 본 발명의 인간 항-글리피칸-3 항체는 한 가지 이상의 다른 치료 약제, 예를 들면, 세포독성제, 방사성독성제 또는 면역억제제와 공동-투여될 수 있다. 항체는 작용제(면역복합체(immunocomplex)로서)에 연결되거나, 또는 상기 작용제와 별도로 투여될 수 있다, 후자 경우(별도 투여)에, 항체는 작용제 이전에, 작용제 이후에 또는 작용제와 동시에 투여되거나, 또는 다른 공지된 요법, 예를 들면, 항-암 요법(가령, 방사선)과 공동-투여될 수 있다. 이런 치료 약제에는 특히, 항-신생물제(anti-neoplastic agent), 예를 들면, 독소루비신(doxorubicin)(아드리아마이신(adriamycin)), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트)(cisplatin bleomycin sulfate), 카르무스틴(carmustine), 클로람부실(chlorambucil)과 시클로포스파미드 히드록시요소(cyclophosphamide hydroxyurea)가 포함되는데, 이들은 단독으로, 환자에 독성 또는 독성이하인 수준에서만 효과적이다. 시스플라틴은 100 ㎎/㎏ 복용량으로 4주 1회 정맥내 투여되고, 아드리아마이신은 60-75 ㎎/㎖ 복용량으로 21일마다 1회 정맥내 투여된다. 본 발명의 인간 항-글리피칸-3 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편과 화학치료 약제의 공동-투여는 인간 종양 세포에 세포독성 효과를 산출하는 상이한 기전을 통하여 작동하는 2가지 항-암 작용제를 제공한다. 이런 공동-투여는 약물에 대한 내성 발생 또는 종양 세포를 항체와 반응하지 않도록 만드는 이들 종양 세포의 항원성에서 변화에 기인한 문제를 해결할 수 있다.

표적-특이적 작동체 세포, 예를 들면, 본 발명의 조성물(가령, 인간 항체, 다중특이적 분자와 이중특이적 분자)에 연결된 작동체 세포 역시 치료 약제로서 이용될 수 있다. 표적화를 위한 작동체 세포는 인간 백혈구, 예를 들면, 대식세포, 호중구 또는 단핵세포일 수 있다. 다른 세포에는 호산구, 자연 킬러 세포, 그리고 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포가 포함된다. 원하는 경우에, 작동체 세포는 치료되는 개체로부터 획득될 수 있다. 표적-특이적 작동체 세포는 생리학적으로 허용되는 용액에서 세포의 현탁액으로서 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 총수는 10⁸-10⁹의 자리수(order)에 존재할 수 있긴 하지만 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 양은 표적 세포, 예를 들면, 종양 글리피칸-3을 발현하는 세포에서 국지화(localization)를 획득하고 예로써, 식세포작용으로 세포 사멸을 달성하는데 충분할 것이다. 투여 경로 역시 변할 수 있다.

표적-특이적 작동체 세포로 치료는 표적화된 세포의 제거를 위한 다른 기술과 함께 수행될 수 있다. 가령, 본 발명의 조성물(가령, 인간 항체, 다중특이적 분자와 이중특이적 분자) 및/또는 이들 조성물로 무장한 작동체 세포를 이용한 항-종양 치료는 화학요법과 함께 이용될 수 있다. 부가적으로, 2가지 상이한 세포독성 작동체 개체군을 종양 세포 거부반응으로 향하도록 하기 위하여 복합 면역요법(combination immunotherapy)이 이용될 수도 있다. 가령, 항-Fc-감마 RI 또는 항-CD3에 연결된 항-글리피칸-3 항체는 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 이용될 수 있다.

본 발명의 이중특이적 분자와 다중특이적 분자 역시 예로써, 세포 표면 상에서 수용체의 캡핑(capping)과 제거에 의해, 작동체 세포 상에서 FcγR 또는 FcγR 수준을 조절하는데 이용될 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물 역시 이러한 목적에 이용될 수 있다.

보체 결합 부위, 예를 들면, 보체에 결합하는 IgG1, -2, 또는 -3 또는 IgM으로부터 부분을 포함하는 본 발명의 조성물(가령, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자와 면역접합체)은 보체의 존재에서도 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 결합제와 적절한 작동체 세포로 표적 세포를 포함하는 세포 개체군의 탈체 처리는 보체 또는 보체 포함 혈청의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 식세포작용은 보체 단백질의 결합에 의해 향상될 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물(가령, 인간 항체, 다중특이적 분자와 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포는 보체에 의해 용해될 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.

본 발명의 조성물(가령, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자와 면역접합체)은 또한, 보체와 함께 투여될 수도 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에서는 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자와 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물을 제시한다. 이들 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 분자 또는 이중특이적 분자에 근접하여 위치할 때 유리할 수 있다. 대안으로, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 분자 또는 이중특이적 분자와 보체 또는 혈청은 개별적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 범위에는 본 발명의 항체 조성물(가령, 인간 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자, 또는 면역접합체)과 사용설명서를 포함하는 키트 역시 포함된다. 이러한 키트는 한 가지 이상의 부가적인 반응물, 예를 들면, 면역억제 반응물, 세포독성제 또는 방사성독성제, 또는 본 발명의 하나 이상의 추가적인 인간 항체(가령, 첫 번째 인간 항체에서와 상이한 글리피칸-3 항원에서 에피토프에 결합하는 상보성 활성을 갖는 인간 항체)를 더욱 포함할 수 있다.

따라서 본 발명의 항체 조성물로 치료되는 환자는 본 발명의 인간 항체의 치료 효과를 향상 또는 증강시키는 다른 치료 약제, 예를 들면, 세포독성제 또는 방사성독성제(본 발명의 인간 항체의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에)가 부가적으로 투여될 수 있다.

다른 구체예에서, 개체는 예로써, 사이토킨으로 치료함으로써 Fcγ 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절하는, 예를 들면, 향상 또는 저해하는 작용제로 부가적으로 치료될 수 있다. 다중특이적 분자로 치료 동안 투여에 바람직한 사이토킨에는 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ), 그리고 종양 괴사 인자(TNF)가 포함된다.

또한, 본 발명의 조성물(가령, 인간 항체, 다중특이적 분자와 이중특이적 분자)은 FcγR 또는 글리피칸-3을 발현하는 표적 세포를 표지하기 위하여, 이들 세포를 표적화하는데 이용될 수 있다. 이런 용도에서, 결합제는 검출될 수 있는 분자에 연결될 수 있다. 따라서 본 발명에서는 Fc 수용체, 예를 들면, FcγR, 또는 글리피칸-3을 발현하는 ex vivo 또는 in vitro 세포를 국지화하는 방법을 제시한다. 검출가능 표지는 예로써, 방사성동위원소(radioisotope), 형광 화합물(fluorescent compound), 효소(enzyme), 또는 효소 보조인자(enzyme co-factor)일 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명에서는 시료 내에서 글리피칸-3 항원의 존재를 검출하거나, 또는 글리피칸-3 항원의 양을 측정하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 항체 또는 이의 일부분과 글리피칸-3 사이에 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에, 시료와 대조 시료를 글리피칸-3에 특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체, 또는 이의 항원 결합 부분과 접촉시키는 단계를 포함한다. 이후, 복합체의 형성이 검출되는데, 여기서 대조 시료와 비교하여 시료 간에 상이한 복합체 형성은 상기 시료 내에 글리피칸-3 항원의 존재를 지시한다.

다른 구체예에서, 본 발명에서는 개체에서 글리피칸-3 매개된 질환, 예를 들면, HCC와 다른 간암을 치료하는 방법을 제시한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 면역접합체는 화합물(가령, 치료 약제, 라벨, 세포독소, 방사성독소, 면역억제제 등)을 항체에 연결함으로써, 글리피칸-3 세포 표면 수용체를 보유하는 세포로 이들 화합물을 표적화시키는데 이용될 수 있다. 가령, 항-글리피칸-3 항체는 US Patent No. 6,281,354와 6,548,530, US patent publication No. 20030050331, 20030064984, 20030073852와 20040087497, 또는 WO 03/022806에서 기술된 임의의 독소 화합물에 접합될 수 있다. 따라서 본 발명에서는 글리피칸-3을 발현하는 세포를 ex vivo 또는 in vivo 국지화하는 방법(가령, 검출가능 라벨, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자를 이용하여)을 제시한다. 대안으로, 이들 면역접합체는 글리피칸-3에 세포독소 또는 방사성독소를 표적화함으로써 글리피칸-3 세포 표면 수용체를 보유하는 세포를 사멸시키는데 이용될 수 있다.

본 발명은 아래의 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명되는데, 이들 실시예는 본 발명을 결코 한정하지 않는다. 본 명세서 전반에 언급된 모든 도면과 참고문헌, 특허와 공개된 특허 출원의 내용은 본 발명에서 명백히 참조로서 편입된다.

본 발명에 따른 글리피칸-3 항체는 간세포 암(hepatocellular cancer)을 비롯한 다양한 글리피칸-3-관련된 장애를 치료하는데 효과적이다.

도면의 간단한 설명
도 1A에서는 4A6 인간 단클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:25)과 아미노산 서열(SEQ ID NO:19)을 도시한다. CDR1(SEQ ID NO:1), CDR2(SEQ ID NO:4)와 CDR3(SEQ ID NO:7) 영역이 묘사되고, V, D와 J 배선(germline) 유래가 지시된다.
도 1B에서는 4A6 인간 단클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:28)과 아미노산 서열(SEQ ID NO:22)을 도시한다. CDR1(SEQ ID NO:10), CDR2(SEQ ID NO:13)와 CDR3(SEQ ID NO:16) 영역이 묘사되고, V와 J 배선 유래가 지시된다.
도 2A에서는 11E7 인간 단클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:26)과 아미노산 서열(SEQ ID NO:20)을 도시한다. CDR1(SEQ ID NO:2), CDR2(SEQ ID NO:5)와 CDR3(SEQ ID NO:8) 영역이 묘사되고, V와 J 배선 유래가 지시된다.
도 2B에서는 11E7 인간 단클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:29)과 아미노산 서열(SEQ ID NO:23)을 도시한다. CDR1(SEQ ID NO:11), CDR2(SEQ ID NO:14)와 CDR3(SEQ ID NO:17) 영역이 묘사되고, V와 J 배선 유래가 지시된다.
도 3A에서는 16D10 인간 단클론 항체의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:27)과 아미노산 서열(SEQ ID NO:21)을 도시한다. CDR1(SEQ ID NO:3), CDR2(SEQ ID NO:6)와 CDR3(SEQ ID NO:9) 영역이 묘사되고, V와 J 배선 유래가 지시된다.
도 3B에서는 16D10 인간 단클론 항체의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:30)과 아미노산 서열(SEQ ID NO:24)을 도시한다. CDR1(SEQ ID NO:12), CDR2(SEQ ID NO:15)와 CDR3(SEQ ID NO:18) 영역이 묘사되고, V와 J 배선 유래가 지시된다.
도 4에서는 인간 배선 V_H 5-51 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)과 인간 배선 J_H JH4b 아미노산 서열(SEQ ID NO:32)과 함께, 4A6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:19)의 정렬을 도시한다.
도 5에서는 인간 배선 V_H 5-51 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)과 인간 배선 J_H JH4b 아미노산 서열(SEQ ID NO:32)과 함께, 11E7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:20)의 정렬을 도시한다.
도 6에서는 인간 배선 V_H 5-51 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)과 인간 배선 J_H JH4b 아미노산 서열(SEQ ID NO:32)과 함께, 16D10의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:21)의 정렬을 도시한다.
도 7에서는 인간 배선 V_k A27 아미노산 서열(SEQ ID NO:33)과 인간 배선 J_K JK4 아미노산 서열(SEQ ID NO:34)과 함께, 4A6의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:22)의 정렬을 도시한다.
도 8에서는 인간 배선 V_k A27 아미노산 서열(SEQ ID NO:33)과 인간 배선 J_K JK4 아미노산 서열(SEQ ID NO:34)과 함께, 11E7의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:23)의 정렬을 도시한다.
도 9에서는 인간 배선 V_k A27 아미노산 서열(SEQ ID NO:33)과 인간 배선 J_K JK1 아미노산 서열(SEQ ID NO:35)과 함께, 16D10의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO:24)의 정렬을 도시한다.
도 10에서는 HCC 세포주 Hep-3B에 대한 4A6, 11E7과 16D10 단클론 항체의 결합 친화력을 도시한다. 결합은 형광 활성화된 세포 분별기(Fluorescence Activated Cell Sorter, “FACS”) 분석을 이용하여 측정되었다.
도 11에서는 단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10이 HCC 세포주 Hep-3B와 Hep-G2에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다. 결합은 FACS 분석을 이용하여 측정되었다.
도 12에서는 단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10이 글리피칸-3 발현 벡터로 안정적으로 형질감염된 CHO 세포에 특이적으로 결합하지만 부모 CHO 세포주에 결합하지 않는다는 것을 보여준다. 결합은 FACS 분석을 이용하여 측정되었다.
도 13에서는 단클론 항체 4A6이 환자로부터 채취된 간암 세포에 결합한다는 것을 보여준다. 항체 결합은 면역조직화학 분석(immunohistochemistry assay)에서 확인되었다.
도 14에서는 단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10이 Hep-3B 세포의 자연 킬러(natural killer, “NK”) T-세포-매개된 사멸을 매개할 수 있다는 것을 보여준다. 사멸은 항체-의존성 세포독성(“ADCC”) 분석으로 측정되었다.
도 15에서는 단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10이 세포-표면 글리피칸 3에 결합 이후에 Hep-3B 세포에 의해 내재화(internalization)된다는 것을 보여준다. 내재화는 Hum-ZAP 분석(Advanced Targeting Systems, San Diego, CA)으로 측정되었다.
도 16에서는 단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10이 세포-표면 글리피칸 3에 결합 이후에 Hep-3B 세포에 의해 내재화된다는 것을 보여준다. 내재화는 면역형광 분석(immunofluorescence assay)에서 확인되었다.

실시예

실시예 1: 글리피칸-3에 대한 인간 단클론 항체의 산출

항원

비-글리피칸-3 폴리펩티드, 히스티딘 태그에 연결된 글리피칸-3 단백질의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질, 글리피칸-3-his를 산출하였다. 글리피칸-3-his는 표준 재조합 방법에 의해 산출되고 면역화를 위한 항원으로서 이용되었다. 이에 더하여, CHO 세포는 글리피칸-3-Myc 발현 구조체(expression construct)로 형질감염되고 세포주, Hep-G2는 면역화를 위한 항원으로서 이용되었다.

유전자도입 HuMAb 생쥐®와 KM 생쥐®

글리피칸-3에 대한 완전 인간 단클론 항체는 유전자도입 HuMAb 생쥐®의 HCo17 균주와 유전자도입 염색체도입 생쥐의 KM 균주를 이용하여 제조하였는데, 이들은 각각, 인간 항체 유전자를 발현한다. HCo17 균주는 본 발명에서 순전히 참조로서 편입되는 WO/2005/058815에서 기술된 바와 같이 작제되었다. KM 균주는 본 발명에서 순전히 참조로서 편입되는 WO 02/43478에서 기술된 바와 같이 작제되었다.

HuMab 생쥐와 KM 생쥐 면역화

글리피칸-3에 대한 완전 인간 단클론 항체를 산출하기 위하여, HuMAb 생쥐®와 KM 생쥐®의 생쥐는 Glypicn-3-Myc 단백질을 발현하는 CHO 세포인 CHO-S 세포와 Hep-G2 세포에서 발현된 글리피칸-3-his 단백질로 면역화시켰다. HuMAb 생쥐®에 대한 전반적인 면역화 계획은 Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 그리고 PCT Publication WO 98/24884에서 기술된다.생쥐는 항원의 첫 번째 주입 시점에 6-16주령이었다. 글리피칸-3 융합 단백질 또는 글리피칸-3 발현 세포(1x10⁷개 세포)의 정제된 재조합 제조물(5-25 ㎍)은 각 HuMab 생쥐®와 KM 생쥐®를 면역화시키는데 이용하였다.

유전자도입 생쥐는 완전 Freund 어쥬번트 또는 Ribi 어쥬번트에서 항원으로 복강내(IP), 피하(Sc) 또는 풋패드(footpad)(FP) 면역화와 그 이후에, 불완전 Freund 또는 Ribi 어쥬번트에서 항원으로 3-21일 IP, Sc 또는 FP 면역화(최대 총 12회 면역화)를 수행하였다.면역 반응은 안와후 채혈(retroorbital bleed)로 모니터링하였다. 혈장은 ELISA(하기에 기술된 바와 같음)와 FACS로 스크리닝하고, 충분한 역가의 항-글리피칸-3 인간 면역글로불린을 갖는 생쥐는 융합에 이용하였다. 생쥐는 희생과 비장 제거에 앞서 3일과 2일 시점에, 항원으로 정맥내 추가접종하였다. 전형적으로, 각 항원에 대하여 10회 내지 35회 융합이 수행되었다. 각 항원에 대하여 수십 마리의 생쥐를 면역화시켰다.

항-글리피칸-3 항체를 생산하는 HuMab 생쥐® 또는 KM 생쥐®의 선별

글리피칸-3에 결합하는 항체를 생산하는 HuMab 생쥐® 또는 KM 생쥐®를 선별하기 위하여, 면역화된 생쥐로부터 혈청을 Fishwild, D. et al. (1996)(supra)에 기술된 바와 같이 ELISA로 검사하였다. 간단히 말하면, 마이크로역가 평판은 PBS에서 1-2 ㎍/㎖로 정제된 재조합 글리피칸-3으로 코팅하고, 50 ㎕/웰(well)을 4℃에서 하룻밤동안 항온처리하고, 이후 PBS/Tween(0.05%)에서 200 ㎕/웰의 5% 닭 혈청으로 차단하였다. 글리피칸-3-면역화된 생쥐로부터 혈청의 희석액을 각 웰에 첨가하고 실온에서 1-2시간 동안 항온 처리하였다. 평판은 PBS/Tween으로 세척하고, 이후 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP)와 접합된 염소-항-인간 IgG Fc 다클론 항체와 함께 1시간 동안 실온에서 항온 처리하였다. 세척후, 평판은 ABTS 기질(Sigma, A-1888, 0.22 ㎎/㎖)로 진전시키고 OD 415-495에서 분광광도계(spectrophotometer)로 분석하였다.

면역화된 생쥐로부터 혈청은 이후, 글리피칸-3을 발현하지 않는 대조 세포주에는 결합하지 않으면서 재조합 인간 글리피칸-3을 발현하는 세포주에 결합하는 지에 대하여 유세포 분석법으로 더욱 스크리닝하였다. 간단히 말하면, 항-글리피칸-3 항체의 결합은 글리피칸-3-발현 CHO 세포를 1:20 희석도에서 항-글리피칸-3 항체와 함께 배양함으로써 평가하였다. 이들 세포는 세척하고 FITC-표지된 항-인간 IgG Ab로 결합을 검출하였다. FACScan 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 최대 역가의 항-글리피칸-3 항체를 생산한 생쥐는 융합에 이용하였다. 융합은 하기에 기술된 바와 같이 수행하고, 하이브리도마 상층액은 ELISA와 FACS로 항-글리피칸-3 활성을 조사하였다.

글리피칸-3에 대한 인간 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 산출:

HuMab 생쥐® 또는 KM 생쥐®로부터 분리된 생쥐 비장세포는 CytoPulse 대형 챔버 세포 융합 전기천공장치(electroporator)(CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland)를 이용한 전기장 기초된 전기융합(electric field based electrofusion)을 이용하여 융합시켰다. 결과의 하이브리도마는 이후, 항원-특이적 항체의 생산을 위하여 스크리닝하였다. 면역화된 생쥐로부터 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 CytoPulse 대형 챔버 세포 융합 전기천공장치(CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland)를 이용한 전기장 기초된 전기융합을 이용하여 SP2/0 무분비 생쥐 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)와 융합시켰다. 세포는 넓적 바닥 마이크로역가 평판(flat bottom microtiter plate)에서 대략 1 x 10⁴개 세포/웰로 도말하고, 그 이후에 10% 소 태아 혈청, 10% P388D1(ATCC, CRL TIB-63) 조건 배지, DMEM(Mediatech, CRL 10013, 높은 글루코오스, L-글루타민과 피루브산나트륨 포함) + 5 mM HEPES에서 3-5% origen(IGEN), 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 ㎎/㎖ 젠타마이신과 1x HAT(Sigma, CRLP-7185)를 포함하는 선택 배지에서 대략 2주 배양을 수행하였다. 1-2주후, 세포는 HAT가 HT로 대체된 배지에서 배양하였다. 이후, 개별 웰은 ELISA와 FACS(앞서 기술됨)에 의해 인간 항-글리피칸-3 단클론 IgG 항체에 대하여 스크리닝하였다. 광범위한 하이브리도마 성장이 진행되면, 배지는 일반적으로, 10-14일후에 모니터링하였다. 항체 분비 하이브리도마는 재도말하고, 다시 스크리닝하였는데, 인간 IgG에 대하여 여전히 양성이면 항-글리피칸-3 단클론 항체는 제한 희석(limiting dilution)에 의해 적어도 2회 서브클로닝(subcloning)하였다. 안정적인 서브클론(subclone)은 이후, 추가적인 특성화를 위한 조직 배양 배지에서 소량의 항체를 산출하기 위하여 시험관내에서 배양하였다.

HuMAb 생쥐®로부터 산출된 하이브리도마 클론 4A6, 11E7과 16D10은 추가적인 분석을 위하여 선택되었다.

실시예 2: 인간 단클론 항체 4A6, 11E7와 16D10의 구조적 특성화

4A6, 11E7과 16D10 단클론 항체의 중쇄와 경쇄 가변 영역을 인코딩하는 cDNA 서열은 표준 PCR 기술을 이용하여 각각, 4A6, 11E7과 16D10 하이브리도마로부터 획득하고 표준 DNA 염기서열분석 기술을 이용하여 염기서열분석하였다.

4A6의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 도 1A에서, 그리고 SEQ ID NO:25와 19에서 각각 도시된다.

4A6의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 도 1B에서, 그리고 SEQ ID NO:28과 22에서 각각 도시된다.

공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열에 4A6 중쇄 면역글로불린 서열의 비교 결과는 상기 4A6 중쇄가 인간 배선 V_H 5-51로부터 V_H 단편과 인간 배선 JH4b로부터 J_H 단편을 이용한다는 것을 증명하였다. 4A6 V_H 서열 대(對) 배선 V_H 5-51 서열의 정렬은 도 4에 도시된다. CDR 영역 결정의 Kabat 시스템을 이용한, 4A6 V_H 서열의 추가적인 분석은 도 1A와 4에서, 그리고 SEQ ID NO:1, 4와 7에서 각각 도시된 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2와 CD3 영역의 묘사로 이어졌다.

공지된 인간 배선 면역글로불린 경쇄 서열에 4A6 경쇄 면역글로불린 서열의 비교 결과는 4A6 경쇄가 인간 배선 V_K A27로부터 V_L 단편과 인간 배선 JK4로부터 J_K 단편을 이용한다는 것을 증명하였다. 4A6 V_L 서열 대(對) 배선 V_K A27 서열의 정렬은 도 7에 도시된다. CDR 영역 결정의 Kabat 시스템을 이용한, 4A6 V_L 서열의 추가적인 분석은 도 1B와 7에서, 그리고 SEQ ID NO:10, 13과 16에서 각각 도시된 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2와 CD3 영역의 묘사로 이어졌다.

11E7의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 도 2A에서, 그리고 SEQ ID NO:26과 20에 각각 도시된다.

11E7의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 도 2B에서, 그리고 SEQ ID NO:29와 23에 각각 도시된다.

공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열에 11E7 중쇄 면역글로불린 서열의 비교 결과는 11E7 중쇄가 인간 배선 V_H 5-51로부터 V_H 단편과 인간 배선 JH4b로부터 J_H 단편을 이용한다는 것을 증명하였다. 11E7 V_H 서열 대(對) 배선 V_H 5-51 서열의 정렬은 도 5에 도시된다. CDR 영역 결정의 Kabat 시스템을 이용한, 11E7 V_H 서열의 추가적인 분석은 도 2A와 5에서, 그리고 SEQ ID NO:2, 5와 8에서 각각 도시된 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2와 CD3 영역의 묘사로 이어졌다.

공지된 인간 배선 면역글로불린 경쇄 서열에 11E7 경쇄 면역글로불린 서열의 비교 결과는 11E7 경쇄가 인간 배선 V_K A27로부터 V_L 단편과 인간 배선 JK4로부터 J_K 단편을 증명하였다. 11E7 V_L 서열 대(對) 배선 V_K A27 서열의 정렬은 도 8에 도시된다. CDR 영역 결정의 Kabat 시스템을 이용한, 11E7 V_L 서열의 추가적인 분석은 도 2B와 8에서, 그리고 SEQ ID NO:11, 14와 17에서 각각 도시된 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2와 CD3 영역의 묘사로 이어졌다.

16D10의 중쇄 가변 영역의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 도 3A에서, 그리고 SEQ ID NO:27과 21에서 각각 도시된다.

16D10의 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 도 3B에서, 그리고 SEQ ID NO:30과 24에서 각각 도시된다.

공지된 인간 배선 면역글로불린 중쇄 서열에 16D10 중쇄 면역글로불린 서열의 비교 결과는 16D10 중쇄가 인간 배선 V_H 5-51로부터 V_H 단편과 인간 배선 JH4b로부터 J_H 단편을 이용한다는 것을 증명하였다. 16D10 V_H 서열 대(對) 배선 V_H 5-51 서열의 정렬은 도 6에 도시된다. CDR 영역 결정의 Kabat 시스템을 이용한, 16D10 V_H 서열의 추가적인 분석은 도 3A와 6에서, 그리고 SEQ ID NO:3, 6과 9에서 각각 도시된 바와 같은 중쇄 CDR1, CDR2와 CD3 영역의 묘사로 이어졌다.

공지된 인간 배선 면역글로불린 경쇄 서열에 16D10 경쇄 면역글로불린 서열의 비교 결과는 16D10 경쇄가 인간 배선 V_K A27로부터 V_L 단편과 인간 배선 JK1로부터 J_K 단편을 이용한다는 것을 증명하였다. 16D10 V_L 서열 대(對) 배선 V_K A27 서열의 정렬은 도 9에 도시된다. CDR 영역 결정의 Kabat 시스템을 이용한, 16D10 V_L 서열의 추가적인 분석은 도 3B와 9에서, 그리고 SEQ ID NO:12, 15와 18에서 각각 도시된 바와 같은 경쇄 CDR1, CDR2와 CD3 영역의 묘사로 이어졌다.

실시예 3:항-글리피칸-3 인간 단클론 항체의 결합 특이도와 결합 동역학의 특성화

본 실시예에서, 항-글리피칸-3 항체의 결합 친화력, 동역학과 특이도를 Biacore 분석과 유세포 분석법으로 조사하였다.

결합 친화력과 동역학

항-글리피칸-3 항체는 Biacore 분석(Biacore AB, Uppsala, Sweden)으로 친화력과 결합 동역학에 대하여 특성화하였다. 글리피칸-3은 표준 아민 커플링 화학과 Biacore에 의해 제공된 키트를 이용하여, 일차 아민을 통하여 CM5 칩(카르복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran) 코팅된 칩)에 공유 연결시켰다. 결합은 40 ㎕/min의 유속(flow rate)에서 20, 10, 5, 2.5와 1.25 ㎍/㎖로 HBS-EP 완충액(Biacore AB)에서 항-글리피칸-3 단클론 항체의 농도 시리즈를 흘러 보냄으로써 측정하였다.배경 결합은 동일한 칩을 가로질러 IgG1의 농도 시리즈를 흘러 보냄으로써 확인하였다. 항원-항체 회합 동역학(association kinetics)은 3분 동안 추적하고, 분리 동역학(dissociation kinetics)은 10분 동안 추적하였다. 회합과 분리 곡선은 BIAevaluation 소프트웨어(Biacore AB)를 이용하여 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모형에 맞추었다. 측정된 K_D, k_on과 k_off 수치는 표 1에 도시된다.

항-글리피칸-3 단클론 항체에 대한 Biacore 결합 데이터

항-글리피칸-3 항체	친화력 K_D x 10^-9 (M)	On rate k_on x 10⁶ (1/Ms)	Off rate k_off x 10^-4 1/s
4A6	0.20	1.6	3.2
16D10	0.31	1.8	5.4
11E7	0.40	1.8	7.3

FACS에 의해 측정된 결합 친화력

항-글리피칸-3 항체는 형광 활성화된 세포 분별기(“FACS”) 분석에서 높은 친화력으로 세포-표면 글리피칸-3 단백질에 결합하는 것으로 밝혀졌다. HCC 세포주 Hep-3B는 96-웰 평판의 각 웰 내로 2 x 10⁵개 세포의 밀도로 첨가하였다. 4A6, 11E7과 16D10 단클론 항체는 20 ㎍/㎖의 출발 농도로 첨가하고 1:3 희석도에서 연속적으로 희석하였다. 이들 세포는 세척하고, 결합은 FITC-표지된 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. FACSCalibur 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 평균 형광 강도(mean fluorescence intensity, “MFI”)로서 구획된 결과의 결합 친화력은 도 10에 도시된다. 항체의 결합 친화력은 농도-의존성 방식으로 HCC 세포에 결합하였다. 각 항체에 대한 효과적인 농도(“EC50”)는 50% 평균 형광 강도(“MFI”)를 결과하는 농도로서 결정되었다. 본 실시예에서, 가장 강한 결합 친화력은 4A6 항체에서 관찰되었는데, 이는 0.83의 MFI를 보였다. 그 다음으로 우수한 친화력은 16D10에서 관찰되었는데, 이는 1.39의 EC50을 보였다. 이들 3개의 항체 중에서 가장 낮은 친화력은 11E7에서 관찰되었는데, 이는 1.98의 EC50을 보였다.

FACS에 의해 측정된 결합 특이도

항-글리피칸-3 항체는 FACS 분석에서 높은 특이도로 세포-표면 글리피칸-3 단백질에 결합하는 것으로 밝혀졌다. HCC 세포주 Hep-3B와 Hep-G2는 DMEM + 10% FBS에서 1 x 10⁵개 세포의 밀도로 성장시켰다. 4A6, 11E7과 16D10 단클론 항체는 10 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 부가적으로, 비교를 위하여 3가지 음성 대조(negative control)를 분석하였다. 이들 3가지 음성 대조는 (1) 착색(stain) 없음, (2) 이차 항체 단독 첨가, 그리고 (3) hIgG₁ 아이소타입 대조 항체이었다. 이들 세포는 세척하고, 결합은 FITC-표지된 항-인간 IgG Ab로 검출하였다. FACSCalibur 유세포 분석기를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 도 11에서는 항-글리피칸-3 항체가 높은 친화력으로 HCC 세포에 결합한다는 것을 보여준다. 대조적으로, 음성 대조 시료는 HCC 세포에 결합을 전혀 보이지 않았다.

세포 표면 상에서 글리피칸-3을 안정적으로 발현하는 중국 햄스터 난소(chinese hamster ovary, CHO) 세포주는 발달시키고 유세포 분석법으로 글리피칸-3 단클론 항체의 특이도를 결정하는데 이용하였다. CHO 세포는 글리피칸-3을 인코딩하는 전장 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드로 형질감염시켰다. 3가지 항-글리피칸-3 단클론 항체의 결합은 형질감염된 세포를 10 ㎍/㎖의 농도에서 각각의 글리피칸-3 항체와 함께 배양함으로써 평가하였다. 이들 세포는 세척하고, 결합은 피코에리트린(phycoerythrin)-표지된 항-인간 IgG Ab(BD Biosciences)로 검출하였다. 이차 항체 단독은 음성 대조로서 이용하였다. 결과는 도 12에 도시된다. 글리피칸-3 단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10은 글리피칸-3으로 형질감염된 CHO 세포주에 결합하지만 부모 CHO 세포주에 결합하지 않았다. 이들 데이터는 글리피칸-3에 대한 이들 단클론 항체의 특이도를 증명한다.

Biacore에 의한 항-글리피칸-3 단클론 항체의 에피토프 분할(binning)

에피토프 분할(binning)은 항-글리피칸-3 항체가 중복 에피토프에 결합하는 지를 결정하기 위하여 Biacore 분석으로 수행하였다. 중복 에피토프를 갖는 항체들은 글리피칸-3에 결합에 대하여 경쟁하는 반면, 상이한 에피토프를 갖는 항체들은 경쟁하지 않고 항원에 동시에 결합할 것이다. 정제된 4A6과 16D10은 표준 아민 커플링 프로토콜을 이용하여 CM5 칩 상에서 4000 RU로 고정시켰다. 글리피칸-3-his(50 nM)는 주사에 앞서, 4A6, 11E7, 또는 16D10 단클론 항체와 함께 적어도 1시간 동안 사전-항온 처리하였다. 항체 농도는 400 nM에서 출발하는 2-배 희석 시리즈이었다. 항체-항원 혼합물은 5 ㎕/min 유속에서 5분 동안 주사하였다. 4A6, 11E7과 16D10 단클론 항체 각각은 농도-의존성 방식으로, 고정된 4A6과 16D10 항체에 결합에 대하여 경쟁할 수 있었다. 이는 4A6, 16D10과 11E7이 중복 에피토프를 갖는다는 것을 증명한다.

실시예 4: 글리피칸-3 항체는 간암 조직에 결합한다

항-글리피칸-3 단클론 항체 4A6은 인간 간암 조직에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 간암 환자로부터 생검을 획득하고, 상기 항체를 면역조직화학 착색(Cytomyx, MA)에 이용하였다. 5 ㎛ 조직 코어를 이용하였다. 슬라이드 상에서 30분 동안 건조후, 이들 조직 절편은 실온에서 5분 동안 아세톤으로 고정시켰다. 슬라이드는 PBS에서 씻어내고, 혈청-없는 단백질과 과산화효소 차단제(peroxidase blocker)(Dako S2001, CO)로 차단하고, 이후 5 ㎍/㎖에서 일차 항체 복합체와 함께 실온에서 45분 동안 항온 처리하였다. 그 다음, 이들 슬라이드는 세척하고, FITC-접합된 이차 항체(Jackson Immunoresearch Lab, 109-097-003)와 함께 30분 동안 항온 처리하고, PBS로 다시 세척하고, 중합체 HRP 접합체(Dako, CO, K4063)와 함께 20분 동안 항온 처리하였다. 색원체(chromogen)(Dako K3464)를 기질로서 이용하여 갈색 착색(brown staining)을 발생시켰다. 슬라이드는 Faramount Aqueous Mounting Media(Dako, S3025)에 고정시켰다. 4A6은 간 종양 세포에 특이적으로 결합하는 것으로 밝혀졌다. 도 13에 예시된 바와 같이, 4A6 단클론 항체는 암성 간 조직을 특이적으로 착색하지만 주변 정상 조직을 착색하지 않는다. 단클론 항체로 착색될 때, 자궁(uterus), 폐(lung), 간(liver), 신장 결장(kidney colon), 자궁 경부(cervix), 유방(breast), 골수(bone marrow), 부신(adrenal gland), 소뇌(cerebellum), 대뇌(cerebrum), 식도(esophagus), 심장(heart), 전립선(prostate), 태반(placenta), 뇌하수체(pituitary), 난소(ovary), 췌장(pancreas), 중피(mesothelia), 타액선(salivary gland), 편도선(tonsil), 피부(skin), 소장(small intestine), 골격근(skeletal muscle), 위(stomach), 비장(spleen), 고환(testis), 흉선(thymus), 그리고 갑상선(thyroid)을 비롯한 다른 장기는 음성 또는 비-특이적 착색을 나타낸다. 상기 데이터는 항-Gpc3 HuMab 4A6이 간 종양에서 발현된 Gcp3을 인식한다는 것을 증명한다.

실시예 5: 항-글리피칸-3 항체 활성

단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10은 항체-의존성 세포독성(“ADCC”) 분석에서, 자연 킬러 T-세포의 존재에서 Gcp3 양성 Hep-G2 세포를 사멸시키는 것으로 밝혀졌다. 인간 작동체 세포는 아래와 같이 전혈(whole blood)로부터 준비하였다. 인간 말초혈 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell)세포는 표준 Ficoll-paque 분리에 의해, 헤파린처리된 전혈로부터 정제한다. 이들 세포는 10% FBS 200U/㎖의 인간 IL-2(PeproTech, NJ)를 내포하는 RPMI 1640 배지에 재현탁시키고 37℃에서 하룻밤동안 배양한다. 익일에, 이들 세포는 수집하고 RPMI + 1%의 BSA(분석 배지)에서 2회 세척하고 1x10^e6/㎖로 재현탁시킨다.

넓적 바닥 96-웰 평판에서 1x10^e4/웰로 100 ㎕의 표적 세포는 37℃에서 하룻밤동안 분석 배지에서 배양하였다. 이후, 표적 세포는 분석 배지에서 2회 세척하고, 100 ㎕의 분석 배지를 각 웰에 첨가하고, 10 ㎍/㎖의 최종 농도에서 50 ㎕의 작동체 세포와 50 ㎕의 항-Gpc3 항체 또는 아이소타입 대조로서 인간 IgG1과 함께 배양하였다. Gpc3+ Hep-G2 세포주는 형광 방출 분석(fluorescence emission analysis)에 의해 Takara LDH 세포독성 검출 키트(Roche, 04744 926001, Switzerland)를 이용하여 항-Gpc3 항체에 대한 항체 특이적 ADCC에 대하여 아래와 같이 조사하였다. 표적 세포주, Hep-G2는 1:50의 표적 대 작동체 비율에서 작동체 세포와 함께 배양하였다. 37℃에서 18시간 배양후, 100 ㎕의 상층액을 수집하고 새로운 넓적 바닥 96-웰 평판으로 이전하였다. 100 ㎕의 용액 C를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하였다. 490 nM에서 시료의 흡광도는 SPECTRAMAX 340 PC(MTX Lab System, VA)로 측정하였다. 용해 %는 삼중(triplicate)의 평균 흡광도(average absorbance)를 계산하고 배경(background)을 감수(subtraction)함으로써 측정하였다.

도 14에서 확인할 수 있는 바와 같이, 4A6, 11E7과 16D10 단클론 항체는 각각, hIgG1 아이소타입 대조 항체와 비교하여 자연 킬러 T-세포에 의한 Hep-3b 세포의 특이적 용해를 유발한다.

실시예 6: 항-글리피칸-3 항체 내재화

단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10은 Hum-Zap 분석에서, Hep-3b 세포에 결합 이후에 상기 세포에 의해 내재화(internalization)되는 것으로 밝혀졌다. Hum-ZAP 분석에서는 사포린(saporin)(Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100)에 접합된 항-인간 IgG 이차 항체의 결합을 통한 항-글리피칸-3 단클론 항체의 내재화를 확인하였다. 먼저, 4A6, 11E7과 16D10이 Hep-3B 세포의 표면에 결합하였다. 이후, Hum-ZAP 항체가 이들 일차 항체에 결합하였다. 그 다음, 일차 항체/Hum-ZAP 복합체가 이들 세포에 의해 내재화되었다. 사포린이 세포 내로 들어가면, 단백질 합성 저해와 궁극적인 세포 사멸(cell death)이 진행되었다.

Hum-ZAP 분석은 아래와 같이 수행하였다. 각 세포는 웰당 3x10³개 세포의 밀도로 접종하였다. 항-글리피칸-3 단클론 항체 또는 아이소타입 대조 인간 IgG는 연속적으로 희석하고, 이후 세포에 첨가하였다. 이후, Hum-ZAP를 2 ㎍/㎖의 농도로 첨가하고, 평판을 96시간 동안 배양하였다. 평판에서 세포 생존능(cell viability)은 CellTiter-Glo® Luminescent 세포 생존능 분석 키트(Promega, G7571)로 검출하고, 평판은 490nM에서 Luminomitor(Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA)로 판독하였다. 데이터는 Prism(Graphpad)으로 분석하였다. 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, 세포 사멸은 4A6, 11E7과 16D10 단클론 항체의 농도에 비례하였다. 따라서, 항-글리피칸-3 단클론 항체는 hIgG1 아이소타입 대조 항체와 비교하여 Hep-3b 세포에 의해 유효하게 내재화되었다.

단클론 항체 4A6, 11E7과 16D10은 또한, 면역조직화학 착색 분석(immunohistochemical staining assay)에서 Hep-3b 세포에 의해 내재화되는 것으로 밝혀졌다. 세포 분리 용액으로 수확된 이들 세포는 96-웰 평판의 각 웰에서 100 ㎕의 배지에 대해 10⁴개 세포로 접종하고, FACS 완충액(PBS + 5% FBS)에서 5 ㎍/㎖의 농도에서 각 단클론 항체와 함께 얼음 위에서 30분 동안 배양하였다. 인간 IgG1 아이소타입 대조는 음성 대조로서 이용하였다. 이들 세포는 2회 세척하고, 배지(웰당 100 ㎕)에 재현탁시키고, 이후 1:100 희석도에서 피코에리트린(phycoerythrin)(Jackson ImmunoResearch Lab, PA)으로 접합된 염소 항-인간 이차 항체와 함께 30분 동안 배양하였다. 이들 세포는 이후, 배지로 세척하고, 그 직후에 형광 현미경(fluorescent microscope) 하에 영상화(imaging)하거나, 또는 후기 시점에 영상화를 위하여 37℃에서 배양하였다. 착색된 세포의 세포 형태와 면역형광 강도의 영상은 도 16에 표시된 바와 같이 0분, 30분 또는 60분 시점에 Nikon TE200 카메라로 촬영하였다. 형광은 4A6, 11E7과 16D10 항체로 착색된 세포에서만 관찰되었다. IgG1 대조 항체의 경우에 형광은 전혀 검출되지 않았다.

도 16에서 확인할 수 있는 바와 같이, 항체의 첨가후 0분 시점에, 세포는 세포 표면에서 착색되었다. 30분후, 세포는 항체를 내재화하기 시작하였다. 60분후, 항체는 세포에 의해 거의 완전하게 내재화되었다. 이는 인간 항-글리피칸-3 단클론 항체가 글리피칸-3-발현 HCC 세포에 결합 이후에 특이적으로 내재화된다는 것을 증명한다.

실시예 7: 항-글리피칸-3 항체 안정성

열 안정성

항-글리피칸-3 단클론 항체의 열 안정성(thermal stability)은 4A6, 11E7과 16D10 항체에 대한 용융 온도(melting temperature)의 열량 분석(calorimetric analysis)으로 결정하였다. 용융 온도(T_m)의 열량 측정은 자동시료주입기(autosampler)(MicroCal LLC, Northampton, MA, USA)가 구비된 VP-모세관 DSC 시차 주사 마이크로열량계 플랫폼(differential scanning microcalorimeter platform)에서 수행하였다. 시료 세포 부피는 0.144 ㎖이었다. 항체에 관한 변성(denaturation) 데이터는 pH 7.4에서 인산염 완충된 염수(phosphate-buffered saline, PBS)에서, 2.3 μM의 농도에서 시료를 1℃/min의 비율로 30℃에서 95℃로 가열함으로써 획득하였다. 비교에 의해 몰열용량(molar heat capacity)을 획득하기 위하여 동일한 완충액을 참고 세포(reference cell)에 이용하였다. 관찰된 사진 계측 기록(thermogram)은 기준선 조정(baseline correction)하고, 표준화된 데이터는 소프트웨어 Origin v7.0을 이용하여 비-2변량-정류 모형(non-2-state model)에 기초하여 분석하였다. 표 2에서 확인되는 바와 같이, 16D10은 3개의 항-글리피칸-3 단클론 항체 중에서 가장 높은 수준의 열 안정성을 갖는 것으로 관찰되었다.

시차 주사 열량법:

항-글리피칸-3	T_m1(℃)	T_m2(℃)	T_m3(℃)
16D10	72.1	74.3	83.5
4A6	70.7	80.9	83.1
11E7	70.6	82.6	84.9

형광 분광법에 의해 측정된 화학적 안정성

4A6, 11E7과 16D10의 안정성은 형광 분광법(fluorescence spectroscopy)으로 화학적 변성(chemical denaturation)의 중간점(midpoint)을 측정함으로써 비교하였다. 화학적 변성의 형광 측정은 Micromax 플레이트 판독기(SPEX, Edison, NJ)가 구비된 SPEX Fluorolog 3.22에서 수행하였다. 이들 측정은 PBS 완충액에서 16가지 상이한 농도의 구아니디늄 염산염(guanidinium hydrochloride)에서 20시간 동안 평형화된 항체 시료에서 수행하였다. 이들 측정은 검은, 적은 부피, 비-결합 표면 384-웰 평판(Corning, Acton, MA)에서 수행되고 12 ㎕의 웰 부피(well volume)에서 1 μM의 항체를 필요로 하였다. 형광은 280 nm에서 여기하였고, 방출 스펙트럼(emission spectra)은 320 nm 내지 400 nm에서 측정하였다. 스캔 속도(scan speed)는 1 second/nm이었고, 슬릿(slit)은 5 nm 주파수폭(bandpass)으로 설정되었다. 완충액 블랭크(buffer blank)는 PBS를 이용하여 수행하고 데이터로부터 자동적으로 감수하였다. 데이터는 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하여 2-상태 변성 모형(two-state denaturation model)에 맞추었다. 표 3에서 확인되는 바와 같이, 16D10과 4A6은 유사한 안정성을 갖지만 11E7은 이중상 풀림(biphasic unfolding)을 보이는 것으로 관찰되었다.

형광 분광법에 의해 측정된 화학적 안정성

클론	풀림 중간점(M)
4A6	2.84
16D10	2.74
11E7	이중상

제한 없이, 모든 논문, 간행물, 특허, 특허 출원, 발표문, 문서, 리포터, 원고, 소책자, 책, 인터넷 게시물, 신문 기사, 정기 간행물, 제품 연구 백서(product fact sheet) 등을 비롯한 본 명세서에 언급된 모든 참고문헌은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다. 이들 참고문헌의 언급은 그들 저자에 의한 주장을 요약하기 위한 것으로, 이들 언급된 참고문헌은 선행 기술로서 결코 인정되지 않으며, 출원인은 이들 참고문헌의 정확성과 타당성에 이의를 제기할 권리를 갖는다.

본 발명이 명확한 이해를 위하여 예시와 실례에 의해 상세하게 기술되긴 했지만, 본 발명의 교시에 비추어서 하기 특허청구범위의 사상 또는 범위를 벗어나지 않는 일정한 개변이 만들어질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.

서열 목록의 요약

SEQ ID NO:	서열	SEQ ID NO:	서열
1	V_H CDR1 a.a. 4A6	25	V_H n.t. 4A6
2	V_H CDR1 a.a. 11E7	26	V_H n.t. 11E7
3	V_H CDR1 a.a. 16D10	27	V_H n.t. 16D10
4	V_H CDR2 a.a. 4A6	28	V_K n.t. 4A6
5	V_H CDR2 a.a. 11E7	29	V_K n.t. 11E7
6	V_H CDR2 a.a. 16D10	30	V_K n.t. 16D10
7	V_H CDR3 a.a. 4A6	31	V_H 5-51 배선 a.a.
8	V_H CDR3 a.a. 11E7	32	J_H JH4b 배선 a.a.
9	V_H CDR3 a.a. 16D10	33	V_K A27 배선 a.a.
10	V_K CDR1 a.a. 4A6	34	J_K JK4 배선 a.a.
11	V_K CDR1 a.a. 11E7	35	J_K JK1 배선 a.a
12	V_K CDR1 a.a. 16D10	36	글리피칸-3 a.a.
13	V_K CDR2 a.a. 4A6
14	V_K CDR2 a.a. 11E7
15	V_K CDR2 a.a. 16D10
16	V_K CDR3 a.a. 4A6
17	V_K CDR3 a.a. 11E7
18	V_K CDR3 a.a. 16D10
19	V_H a.a. 4A6
20	V_H a.a. 11E7
21	V_H a.a. 16D10
22	V_K a.a. 4A6
23	V_K a.a. 11E7
24	V_K a.a. 16D10

[수탁번호]

Genbank Acc. No. NM_004484

SEQUENCE LISTING <110> Medarex Inc. Terrett, Jonathan A. Lu, Li-Sheng Huang, Haichun Yao, Dapeng Pan, Chin Leblanc, Heidi Sproul, Timothy Yamanaka, Mark <120> MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST GLYPICAN-3 <130> MXI-374PC <140> WO PCT/US2008/070344 <141> 2008-07-17 <150> US 60/959845 <151> 2007-07-17 <160> 48 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Trp Ile Ala 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Tyr Trp Ile Ala 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asn Tyr Trp Ile Gly 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 8 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Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Thr 1 5 <210> 19 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Arg Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 20 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Thr Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Met Arg Gln Met Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Arg Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Arg Glu Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Val Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 24 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctttcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca ggtccatcag aaccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccttgt attactgtgc gagaacccgg 300 gaggggtact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 26 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc aactactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag aaccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaacccgg 300 gaggggtact ttgactactg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 27 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 gaggtgcaac tggtgcagtc tggagcagat gtgacaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg tttctggata caggtttacc aactactgga tcggctggat gcgccagatg 120 tccgggaaag gcctggaatg gatgggcatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agtccgtcct tccaaggcca cgtcaccatc tcagccgaca aatccatcaa caccgcctac 240 ctacggtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccattt attactgtgc gcgaacccgg 300 gaggggttct ttgactactg gggccaggga accccggtca ccgtctcctc a 351 <210> 28 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccgttca gagtgttagc agcagctatt tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 29 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 30 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gaaattctgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa a 321 <210> 31 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 33 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 <210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 36 <211> 580 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30 Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val 50 55 60 Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala 85 90 95 Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln 100 105 110 Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125 Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe 130 135 140 Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 165 170 175 Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe 195 200 205 Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln 210 215 220 Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile 225 230 235 240 Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 245 250 255 Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys 260 265 270 Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly 275 280 285 Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu 290 295 300 Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu 305 310 315 320 Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys 325 330 335 Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser 340 345 350 Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile 355 360 365 Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His Val Glu His Glu Glu Thr Leu 370 375 380 Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser 385 390 395 400 Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala 405 410 415 Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr 420 425 430 Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His 435 440 445 Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp 450 455 460 Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys 465 470 475 480 Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly 485 490 495 Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly 500 505 510 Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr 515 520 525 Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro 530 535 540 Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe His Asn Leu Gly Asn Val His Ser 545 550 555 560 Pro Leu Lys Leu Leu Thr Ser Met Ala Ile Ser Val Val Cys Phe Phe 565 570 575 Phe Leu Val His 580 <210> 37 <211> 408 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccagc tactggatcg cctgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tttcctggtg actctgatac cagatacagc 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaggt ccatcagaac cgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccttgtatt actgtgcgag aacccgggag 360 gggtactttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 408 <210> 38 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Phe Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Arg Ser Ile Arg 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Leu 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 39 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccgttca gagtgttagc agcagctatt tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa a 381 <210> 40 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Val Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 41 <211> 408 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctgttc tccaaggagt ctgtgccgag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccaac tactggatcg cctgggtgcg ccagatgccc 180 gggaaaggcc tggagtggat ggggatcatc tatcctggtg actctgatac cagatacagc 240 ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagaac cgcctacctg 300 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag aacccgggag 360 gggtactttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 408 <210> 42 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Val Leu Gln Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Arg Glu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 43 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacccac tttcggcgga 360 gggaccaagg tggagatcaa a 381 <210> 44 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 <210> 45 <211> 408 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 atggggtcaa ccgccatcct cgccctcctc ctggctattc tccgaggagt ctgtgccgag 60 gtgcaactgg tgcagtctgg agcagatgtg acaaagcccg gggagtctct gaagatctcc 120 tgtaaggttt ctggatacag gtttaccaac tactggatcg gctggatgcg ccagatgtcc 180 gggaaaggcc tggaatggat gggcatcatc tatcctggtg actctgatac cagatacagt 240 ccgtccttcc aaggccacgt caccatctca gccgacaaat ccatcaacac cgcctaccta 300 cggtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatttatt actgtgcgcg aacccgggag 360 gggttctttg actactgggg ccagggaacc ccggtcaccg tctcctca 408 <210> 46 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ile Leu Arg Gly 1 5 10 15 Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Asp Val Thr Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Arg Phe 35 40 45 Thr Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Met Arg Gln Met Ser Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80 Pro Ser Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Arg Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Arg Glu Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 47 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 atggaaaccc cagcgcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60 gaaattctgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 120 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 180 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 240 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 300 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgac gttcggccaa 360 gggaccaagg tggaaatcaa a 381 <210> 48 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro 65 70 75 80 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 1

Claims

SEQ ID NO:25 및 28로 이루어진 군으로부터 선택되는, 분리된 핵산 분자.
제1항의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
제2항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.