ME02345B - MONOKLONSKA ANTlTELA PROTIV GLIPIKANA-3 - Google Patents

MONOKLONSKA ANTlTELA PROTIV GLIPIKANA-3

Info

Publication number
ME02345B
ME02345B MEP-2016-86A MEP8616A ME02345B ME 02345 B ME02345 B ME 02345B ME P8616 A MEP8616 A ME P8616A ME 02345 B ME02345 B ME 02345B
Authority
ME
Montenegro
Prior art keywords
antibody
seq
variable region
chain variable
antigen
Prior art date
Application number
MEP-2016-86A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Haichun Huang
Chin Pan
Jonathan Alexander Terrett
Li-Sheng Lu
Dapeng Yao
Heidi Leblanc
Timothy Sproul
Mark Yamanaka
Original Assignee
Squibb & Sons Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Squibb & Sons Llc filed Critical Squibb & Sons Llc
Publication of ME02345B publication Critical patent/ME02345B/me

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)

Description

MONOKLONSKA ANTITELA PROTIV GLIPIKANA-3
Opis
Osnova pronalaska
[0001] Glipikan-3 je onkofetalni antigen koji pripada porodici glipikana, heparin-sulfatnih proteoglikana ukotvljenih za glikozil-fosfatidilinozitol. Glipikani se karakterišu time što su kovalentno povezani sa kompleksnim polisaharidnim lancima nazvanim heparinsulfatni glikozaminoglikani. Glipikani su uključeni u ćelijsku signalizaciju, na granici ćelije i vanćelijskog matriksa. (Sasisekharan et al., Nature Reviews I Cancer, Volume 2 (2002).) Do danas, identifikovano je šest različitih članova porodice humanih glipikana. Glipikan-3 vezan za ćelijsku membranu sastavljen je od dve podjedinice povezane jednom ili većim brojem disulfidnih veza.
[0002] Glipikan-3 se eksprimira u fetalnoj jetri i placenti tokom razvića, a u normalnim adultnim tkivima je negativno regulisan ili utišan. Mutacije i delecije u genu za glipikan-3 odgovorne su za Simpson-Golabi-Behmel-sindrom ili sindrom Simpson-ove dismorfije kod ljudi. Glipikan-3 se eksprimira u različitim kancerima i, posebno, u hepatocelularnom karcinomu (hepatocellular carcinoma, "HCC"), melanomu, Wilm-ovom tumoru i hepatoblastomu. (Jakubovic and Jothy; Ex. Mol. Path. 82:184-189 (2007); Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005).)
[0003] U svetu, HCC je treći vodeći uzročnik smrtnih slučajeva koji su posledica kancera. Svake godine, HCC se pripisuje oko 1 milion smrtnih slučajeva. (Nakatsura and Nishimura, Biodrugs 19(2):71-77 (2005).) Virus hepatitisa B, virus hepatitisa C i hroničan teški unos alkohola, koji dovode do ciroze jetre, i dalje su najčešći uzroci HCC. Njegova incidenca dramatično je porasla u Sjedinjenim Američkim Državama zbog širenja infekcije virusom hepatitisa C, a očekuje se da će rasti i u naredne 2 decenije. HCC se leči prvenstveno transplantacijom jetre ili resekcijom tumora. Prognoza za pacijenta zavisi od osnovne funkcije jetre i od stadijuma u kojem je tumor dijagnostikovan. (Parikh and Hyman, Am J Med. 120(3):194-202 (2007).) Postoji potreba za efikasnim strategijama u lečenju HCC.
[0004] Dokument stanja tehnike EP1674111 objavljuje pripremanje monoklonskih antitela koja se vezuju za glipikan-3, koja pokazuju snažnu CDC aktivnost (Pr.16), kao i humanizaciju jednog od njih. Afinitet ovih antitela nije meren.
Kratak opis pronalaska
[0005] Predmetna objava obezbeđuje izolovana monoklonska antitela, posebno humana monoklonska antitela koja se vezuju za glipikan-3 i koja pokazuju brojne željene osobine. Ove osobine uključuju visok afinitet vezivanja za humani glipikan-3.
[0006] U jednom aspektu, objava se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu se antitelo:
(a) vezuje za humani glipikan-3 sa KD od 1 x 10-7 M ili manje;
(b) vezuje za humane CHO ćelije transfektovane glipikanom-3.
[0007] Antitelo je humano antitelo, iako u alternativnim aspektima objave antitelo može da bude mišje antitelo, himerno antitelo ili humanizovano antitelo.
[0008] U jednom aspektu, antitelo se vezuje za humani glipikan-3 sa KD od 5 x 10-8 M ili manje, vezuje se za humani glipikan-3 sa KD od 2 x 10-8 M ili manje, vezuje se za humani glipikan-3 sa KD od 1 x 10-8 M ili manje, vezuje se za humani glipikan-3 sa KD od 5x10-9 M ili manje, vezuje se za humani glipikan-3 sa KD od 4 x 10-9 M ili manje, vezuje se za humani glipikan-3 sa KD od 3 x 10-9 M ili manje, ili se vezuje za humani glipikan-3 sa KD od 2 x 10-9 M ili manje.
[0009] U sledećem aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu antitelo unakrsno kompetira za vezivanje za glipikan-3 sa referentnim antitelom koje uključuje:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:19, 20 i 21; i
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:22, 23 i 24.
[0010] U različitim formama, referentno antitelo uključuje:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22;
ili referentno antitelo uključuje:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23.
ili referentno antitelo uključuje:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24.
[0011] U sledećem aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji uključuju varijabilni region teškog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog VH 5-51 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za glipikan-3. Objava takođe obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji uključuju varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog VK A27 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za glipikan-3.
[0012] U poželjnom aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji uključuju:
(a) varijabilni region teškog lanca humanog VH 5-51 gena; i
(b) varijabilni region lakog lanca humanog VK A27 gena; pri čemu se antitelo
specifično vezuje za glipikan-3.
[0013] U sledećem aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji uključuju:
varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, pri čemu:
(a) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:7, 8 i 9, i njihovih konzervativnih modifikacija;
(b) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:16, 17 i 18, i njihovih konzervativnih modifikacija;
(c) antitelo se vezuje za humani glipikan-3 sa KD od 1 x 10-7 M ili manje; ili
(d) vezuje se za CHO ćelije transfektovane glipikanom-3.
[0014] Poželjno, CDR2 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:4, 5 i 6 i njihovih konzervativnih modifikacija; i CDR2 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:13, 14 i 15 i njihovih konzervativnih modifikacija. Poželjno, CDR1 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:1, 2 i 3 i njihovih konzervativnih modifikacija; i CDR1sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:10, 11 i 12, i njihovih konzervativnih modifikacija.
[0015] Poželjna kombinacija uključuje:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:1;
(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:7;
(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:10;
(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:13; i
(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:16.
[0016] Sledeća poželjna kombinacija uključuje:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:2;
(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:5;
(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:8;
(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:11;
(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:14; i
(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:17.
[0017] Sledeća poželjna kombinacija uključuje:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:6;
(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:9;
(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:12;
(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:15; i
(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:18.
[0018] Druga poželjna antitela objave, ili njihovi antigen-vezujući delovi, uključuju:
(a varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:19, 20 i 21; i
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:22, 23 i 24;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za glipikan-3.
[0019] Poželjna kombinacija uključuje:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22.
[0020] Sledeća poželjna kombinacija uključuje:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID
NO:23.
[0021] Sledeća poželjna kombinacija uključuje:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24.
[0022] U sledećem aspektu objave, obezbeđuju se antitela, ili njihovi antigen-vezujući delovi, koji kompetiraju u vezivanju za glipikan-3 sa bilo kojim od gore pomenutih antitela.
[0023] Antitela pronalaska mogu biti, na primer, antitela pune dužine, na primer IgG1 ili IgG4 izotipa. Alternativno, antitela mogu biti fragmenti antitela kao što su Fab, Fab’ ili Fab’2 fragmenti, ili jednolančana antitela.
[0024] Pronalazak takođe obezbeđuje imunokonjugate koji uključuju antitelo pronalaska, ili njegov antigen-vezujući deo, povezane sa terapijskim sredstvom, na primer citotoksinom ili radioaktivnim izotopom. Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifični molekul koji uključuje antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo pronalaska, povezane sa drugom funkcionalnom komponentom koja ima različitu vezujuću specifičnost od pomenutog antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela.
[0025] Obezbeđene su i smeše koje sadrže antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, ili imunokonjugat ili bispecifični molekul pronalaska i farmaceutski prihvatljivi nosač.
[0026] Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela, ili njihove antigen-vezujuće delove pronalaska, takođe su obuhvaćeni pronalaskom, kao i ekspresioni vektori koji sadrže takve nukleinske kiseline i ćelije-domaćini koje sadrže takve ekspresione vektore.
[0027] Objava obezbeđuje metode inhibiranja rasta tumorskih ćelija koje eksprimiraju glipikan-3. Metodi uključuju dovođenje u kontakt ćelija sa antiglipikan-3 antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim delom, u količini efikasnoj za inhibiranje rasta tumorskih ćelija. U poželjnoj formi, tumorske ćelije su poreklom iz tkiva jetre. Dodatno, antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, mogu biti imunokonjugati. Imunokonjugati pronalaska mogu biti terapijska sredstva, na primer, citotoksini ili radioaktivni izotopi.
[0028] Druge osobine i prednosti sadašnjeg pronalaska biće očigledne na osnovu detaljnog opisa i primera koji slede, a koje ne treba shvatiti kao ograničavajuće.
[0029] Pronalazak je definisan zahtevima.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0030]
Slika 1A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:25) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:19) varijabilnog regiona teškog lanca 4A6 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:1), CDR2 (SEQ ID NO:4) i CDR3 (SEQ ID NO:7) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V, D i J iz germinativne linije.
Slika 1B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:28) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:22) varijabilnog regiona lakog lanca 4A6 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:10), CDR2 (SEQ ID NO:13) i CDR3 (SEQ ID NO:16) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V i J iz germinativne linije.
Slika 2A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:26) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:20) varijabilnog regiona teškog lanca 11E7 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:2), CDR2 (SEQ ID NO:5) i CDR3 (SEQ ID NO:8) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V i J iz germinativne linije.
Slika 2B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:29) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:23) varijabilnog regiona lakog lanca 11E7 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:11), CDR2 (SEQ ID NO:14) i CDR3 (SEQ ID NO:17) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V i J iz germinativne linije.
Slika 3A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:27) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:21) varijabilnog regiona teškog lanca 16D10 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:3), CDR2 (SEQ ID NO:6) i CDR3 (SEQ ID NO:9) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V i J iz germinativne linije.
Slika 3B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO:30) i aminokiselinsku sekvencu (SEQ ID NO:24) varijabilnog regiona lakog lanca 16D10 humanog monoklonskog antitela. CDR1 (SEQ ID NO:12), CDR2 (SEQ ID NO:15) i CDR3 (SEQ ID NO:18) regioni su naznačeni i navedeno je poreklo V i J iz germinativne linije.
Slika 4 prikazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca 4A6 (SEQ ID NO:19) sa aminokiselinskom sekvencom VH 5-51 humane germinativne linije (SEQ ID NO:31) i aminokiselinskom sekvencom JH JH4b humane germinativne linije (SEQ ID NO:32).
Slika 5 prikazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca 11E7 (SEQ ID NO:20) sa aminokiselinskom sekvencom VH 5-51 humane germinativne linije (SEQ ID NO:31) i aminokiselinskom sekvencom JH JH4b humane germinativne linije (SEQ ID NO:32).
Slika 6 prikazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca 16D10 (SEQ ID NO:21) sa aminokiselinskom sekvencom VH 5-51 humane germinativne linije (SEQ ID NO:31) i aminokiselinskom sekvencom JH JH4b humane germinativne linije (SEQ ID NO:32).
Slika 7 prikazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca 4A6 (SEQ ID NO:22) sa aminokiselinskom sekvencom Vk A27 humane germinativne linije(SEQ ID NO:33) i aminokiselinskom sekvencom JK JK4 humane germinativne linije (SEQ ID NO:34).
Slika 8 prikazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca 11E7 (SEQ ID NO:23) sa aminokiselinskom sekvencom Vk A27 humane germinativne linije(SEQ ID NO:33) i aminokiselinskom sekvencom JK JK4 humane germinativne linije (SEQ ID NO:34).
Slika 9 prikazuje poravnavanje aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca 16D10 (SEQ ID NO:24) sa aminokiselinskom sekvencom Vk A27 humane germinativne linije(SEQ ID NO:33) i aminokiselinskom sekvencom JK JK1 humane germinativne linije (SEQ ID NO:35).
Slika 10 prikazuje afinitet vezivanja 4A6, 11E7 i 16D10 monoklonskih antitela za HCC ćelijsku liniju Hep-3B. Vezivanje je mereno korišćenjem testa sortiranja fluorescencijom aktiviranih ćelija (Fluorescence Activated Cell Sorter, "FACS").
Slika 11 prikazuje da se monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10 specifično vezuju za HCC ćelijske linije Hep-3B i Hep-G2. Vezivanje je mereno korišćenjem FACS testa.
Slika 12 prikazuje da se monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10 specifično vezuju za CHO ćelije stabilno transfektovane glipikan-3 ekspresionim vektorom, ali ne i za roditeljsku CHO ćelijsku liniju. Vezivanje je mereno korišćenjem FACS testa.
Slika 13 prikazuje da se monoklonsko antitelo 4A6 vezuje za kancerske ćelije jetre izolovane iz pacijenata. Vezivanje antitela pokazano je imunohistohemijskim testom.
Slika 14 prikazuje da monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10 mogu posredovati u ubijanju Hep-3B ćelija putem T-ćelija prirodnih ubica (natural killer, "NK"). Ubijanje ćelija mereno je testom ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (antibody-dependent cellular cytotoxicity, "ADCC").
Slika 15 prikazuje da se monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10 internalizuju u Hep-3B ćelije posle vezivanja za glipikan-3 na površini ćelije. Internalizacija je merena Hum-ZAP testom (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA).
Slika 16 prikazuje da se monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10 internalizuju u Hep-3B ćelije posle vezivanja za glipikan-3 na površini ćelije. Internalizacija je pokazana testom imunofluorescencije.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0031] Predmetna objava odnosi se na izolovana monoklonska antitela, posebno humana monoklonska antitela koja se specifično vezuju za glipikan-3 sa visokim afinitetom. U određenim aspektima, antitela pronalaska izvedena su iz određenih sekvenci teških i lakih lanaca germinativne linije i/ili sadrže određene strukturne osobine kao što su CDR regioni koji uključuju određene aminokiselinske sekvence. Objava obezbeđuje izolovana antitela, metode spravljanja tih antitela, imunokonjugate i bispecifične molekule koji sadrže ta antitela i farmaceutske smeše koje sadrže antitela, imunokonjugate ili bispecifične molekule pronalaska. Objava se takođe odnosi na metode korišćenja antitela, na primer za detektovanje glipikana-3, kao i za lečenje bolesti udruženih sa ekspresijom glipikana-3, kao što su maligniteti jetre u kojima se eksprimira glipikan-3. U skladu sa tim, objava obezbeđuje i metode upotrebe antiglipikan-3 antitela pronalaska za lečenje maligniteta jetrinih ćelija, na primer, HCC.
[0032] Da bi se predmetni pronalazak lakše razumeo, najpre će biti definisani neki pojmovi. Dodatne definicije biće navedene u detaljnom opisu.
[0033] Pojmovi "glipikan-3", "glipikanski proteoglikan 3", "GPC3", "OTTHUMP00000062492", "GTR2-2", "SGB", "DGSX", "SDYS", "SGBS", "OCI-5", i "SGBS1" koriste se naizmenično i uključuju varijante, izoforme i vrsne homologe humanog glipikana-3. U skladu sa tim, humana antitela ove objave mogu, u određenim slučajevima, unakrsno reagovati sa glipikanom-3 iz vrsta različitih od čoveka. U određenim formama, antitela mogu biti kompletno specifična za jedan ili više humanih glipikan-3 proteina i mogu da ne pokazuju vrsnu ili druge tipove nehumane unakrsne reaktivnosti. Kompletna aminokiselinska sekvenca primera humanog glipikana-3 ima Genbank/NCBI pristupni broj NM_004484 (SEQ ID NO:36).
[0034] Pojam "imunski odgovor" odnosi se na delovanje, na primer, limfocita, antigen-prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita i solubilnih makromolekula koje proizvode navedene ćelije ili jetra (uključujući antitela, citokine i komplement), koje uključuje selektivno oštećenje, destrukciju ili eliminaciju iz čovečjeg tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, kancerskih ćelija, ili, u slučajevima autoimunosti ili patološkog zapaljenja, normalnih humanih ćelija ili tkiva.
[0035] "Putevi prenosa signala" odnosi se na biohemijski odnos koji postoji između nekoliko molekula za prenos signala, koji imaju ulogu u transmisiji signala iz jednog dela ćelije do drugog dela ćelije. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ćelijski površinski receptor" uključuje, na primer, molekule i komplekse molekula sposobne da prime signal i prenesu taj signal kroz ćelijsku membranu. Primer "ćelijskog površinskog receptora" predmetne objave je receptor glipikan-3.
[0036] Pojam "antitelo", kada se pominje u ovom tekstu, uključuje cela antitela i svaki antigen-vezujući fragment (tj., "antigen-vezujući deo") ili njegove pojedinačne lance. "Antitelo" odnosi se na glikoprotein koji uključuje najmanje dva teška (heavy, H) lanca i dva laka (light, L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, ili njihove antigen-vezujuće delove. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sadrži jedan domen, CL. VH i VL regioni mogu da se podele dodatno na regione hipervarijabilnosti, nazvane "regioni koji određuju komplementarnost" (complementarity determining regions, CDR), između kojih se nalaze konzervativniji regioni, nazvani "regioni okvira" (framework regions, FR). Svaki VH i VL sastavljen je od tri CDR i četiri FR, poređana od amino-terminusa do karboksi-terminusa sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkivo ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0037] Pojam "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "deo antitela"), kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen (npr., glipikan-3). Pokazano je da antigen-vezujuća funkcija antitela može da se obavi fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih predmetnom objavom uključuju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab’)2 fragment, bivalentni fragment koji uključuje dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fab’ fragment, koji je suštinski Fab sa delom zglobnog regiona (vidi, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (v) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jedne ručice antitela, (vi) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; (vii) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR); i (viii) nanotelo, teškolančani varijabilni region koji sadrži jedan varijabilni domen i dva konstantna domena. Pored toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani zasebnim genima, oni mogu da se spoje, korišćenjem metoda rekombinacije, sintetskim linkerom koji omogućava da se naprave kao jedan proteinski lanac u kojem se VL i VH regioni sparuju da bi formirali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); vidi, npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela takođe treba da budu obuhvaćena pojmom "antigen-vezujući deo" antitela. Ovi fragmenti antitela dobijaju se konvencionalnim tehnikama poznatim stručnjacima u oblasti, a fragmenti se pretražuju u pogledu upotrebljivosti na isti način kao intaktna antitela.
[0038] "Izolovano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, treba da označi antitelo koje suštinski ne sadrži druga antitela sa različitim antigenskim specifičnostima (npr., izolovano antitelo koje se specifično vezuje za glipikan-3 suštinski ne sadrži antitela koja se specifično vezuju za antigene različite od glipikana-3). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za glipikan-3 može, međutim, da bude unakrsno reaktivno sa drugim antigenima kao što su molekuli glipikana-3 iz drugih vrsta. Štaviše, izolovano antitelo može suštinski da ne sadrži drugi ćelijski materijal i/ili hemikalije.
[0039] Pojmovi "monoklonsko antitelo" ili "smeša monoklonskog antitela" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na preparat molekula antitela jednomolekulskog sastava. Smeša monoklonskog antitela pokazuje jednu molekulsku vezujuću specifičnost i afinitet za određeni epitop.
[0040] Pojam "humano antitelo" kako se koristi u ovom tekstu, treba da uključi antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su i okvirni region i CDR regioni izvedeni iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Pored toga, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Humana antitela pronalaska mogu da uključuju aminokiselinske rezidue koje nisu kodirane imunoglobulinskim sekvencama humane germinativne linije (npr., mutacije uvedene nasumičnom ili usmerenom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, pojam "humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, ne teba da uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije drugih sisarskih vrsta, na primer miša, graftovane u humane okvirne sekvence.
[0041] Pojam "humano monoklonsko antitelo" odnosi se na antitela koja pokazuju jednu vezujuću specifičnost koja ima varijabilne regione u kojima su i okvirni regioni i CDR regioni izvedeni iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. U jednoj formi, humana monoklonska antitela proizvode se hibridomom koji uključuje B-ćeliju dobijenu iz transgene nehumane životinje, npr., transgenog miša, sa genomom koji sadrži humani transgen teškog lanca i humani transgen lakog lanca, fuzionisanu sa imortalisanom ćelijom.
[0042] Pojam "rekombinantno humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje sva humana antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, kreiraju ili izoluju rekombinantno, npr., (a) antitela izolovana iz životinje (npr., miša) koja je transgena ili transhromozomska za humane imunoglobulinske gene ili hibridoma pripremljenog od nje (opisano kasnije), (b) antitela izolovana iz ćelije-domaćina transformisane da eksprimira humano antitelo, npr., iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz biblioteke rekombinantnih, kombinatornih humanih antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, kreirana ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje splajsovanje humanih imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim sekvencama DNK. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne regione u kojima su regioni okvira i CDR regioni izvedeni iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. U nekim formama, međutim, takva rekombinantna humana antitela mogu da se izlože mutagenezi in vitro (ili, kada se koristi životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi) tako da su aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela sekvence koje, iako izvedene i srodne sa VH i VL sekvencama humane germinativne linije, ne moraju prirodno postojati u repertoaru antitela humane germinativne linije in vivo.
[0043] Kako se koristi u ovom tekstu, "izotip" označava klasu antitela (npr., IgM ili IgG1) koja je kodirana genima konstantnog regiona teškog lanca.
[0044] Izrazi "antitelo prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" koriste se u ovom tekstu naizmenično sa pojmom "antitelo koje se specifično vezuje za antigen".
[0045] Pojam "derivati humanog antitela" odnosi se na bilo koji modifikovani oblik humanog antitela, npr., konjugat antitela i drugog sredstva ili antitela.
[0046] Pojam "humanizovano antitelo" treba da označi antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije drugih sisarskih vrsta, npr., miša, graftovane u humane okvirne sekvence. Dodatne modifikacije okvirnog regiona mogu da se naprave unutar humanih okvirnih sekvenci.
[0047] Pojam "himerno antitelo" treba da znači antitela u kojima su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz jedne vrste, a sekvence konstantnog regiona izvedene iz druge vrste, npr., antitelo u kojem su sekvence varijabilnog regiona izvedene iz antitela miša, a sekvence konstantnog regiona izvedene iz antitela čoveka.
[0048] Kako se koristi u ovom tekstu, antitelo koje se "specifično vezuje za humani glipikan-3" treba da označi antitelo koje se vezuje za humani glipikan-3 sa KD od 1 x 10-7 M ili manje, poželjnije 5 x 10-8 M ili manje, poželjnije 3 x 10-8 M ili manje, poželjnije 1 x 10-8 M ili manje, još poželjnije 5 x 10-9 M ili manje.
[0049] Pojam "suštinski se ne vezuje" za protein ili ćelije, kako se koristi u ovom tekstu, znači da se ne vezuje ili da se ne vezuje sa visokim afinitetom za protein ili ćelije, tj. vezuje se za protein ili ćelije sa KD od 1 x 10-6 M ili više, poželjnije 1 x 10-5 M ili više, poželjnije 1 x 10-4 M ili više, poželjnije 1 x 10-3 M ili više, još poželjnije 1 x 10-2 M ili više.
[0050] Pojam "Kassoc" ili "Ka" kako se koristi u ovom tekstu, treba da označi stopu asocijacije određene interakcije antitelo-antigen, dok pojam "Kdis" ili "Kd", kako se koristi u ovom tekstu, treba da označi stopu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Pojam "KD" kako se koristi u ovom tekstu, treba da označi konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa Kd i Ka (tj,. Kd/Ka) i izražava se kao molarna koncentracija (M). KD vrednosti za antitela mogu da se odrede korišćenjem metoda dobro utvrđenih u struci. Poželjni metod određivanja KD antitela je korišćenjem rezonance površinskog plazmona, poželjno uz upotrebu biosenzornog sistema kao što je Biacore® sistem.
[0051] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "visoki afinitet", za IgG antitelo, označava antitelo koje ima KD od 1 x 10-7 M ili manje, poželjnije 5 x 10-8 M ili manje, još poželjnije 1x10-8 M ili manje, još poželjnije 5 x 10-9 M ili manje i još poželjnije 1 x 10-9 M ili manje, za ciljni antigen. Međutim, "visoki afinitet" vezivanja može da varira za druge izotipove antitela. Na primer, "visoki afinitet" vezivanja za IgM izotip označava antitelo koje ima KD od 10-6 M ili manje, poželjnije 10-7 M ili manje, još poželjnije 10-8 M ili manje.
[0052] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "subjekt" uključuje bilo koju humanu ili nehumanu životinju. Pojam "nehumana životinja" uključuje sve vertebrate, npr., sisare i nesisare, kao što su nehumani primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, pilići, vodozemci, gmizavci itd.
[0053] Različiti aspekti pronalaska opisani su detaljnije u odeljcima koji slede.
Antiglipikan-3 antitela
[0054] Antitela pronalaska karakterišu se posebnim funkcionalnim osobinama ili svojstvima antitela. Na primer, antitela se specifično vezuju za humani glipikan-3. Poželjno, antitelo pronalaska vezuje se za glipikan-3 sa visokim afinitetom, na primer sa KD od 1 x 10-7 M ili manje. Antiglipikan-3 antitela pronalaska poželjno pokazuju jednu ili više od sledećih karakteristika:
(a) vezuju se za humani glipikan-3 sa KD od 1x10-7 M ili manje;
(b) vezuju se za humane CHO ćelije transfektovane glipikanom-3.
[0055] Poželjno, antitelo se vezuje za humani glipikan-3 sa KD od 5 x 10-8 M ili manje, vezuje se za humani glipikan-3 sa KD od 2 x 10-8 M ili manje, vezuje se za humani glipikan-3 sa KD od 5 x 10-9 M ili manje, vezuje se za humani glipikan-3 sa KD od 4 x 10-9 M ili manje, vezuje se za humani glipikan-3 sa KD od 3 x 10-9 M ili manje, ili se vezuje za humani glipikan-3 sa KD od 2.1 x 10-9 M ili manje.
[0056] Antitelo se poželjno vezuje za antigenski epitop prisutan na glipikanu-3, koji nije prisutan na drugim proteinima. Antitelo se tipično vezuje za glipikan-3, ali se ne vezuje za druge proteine ili se za druge proteine vezuje sa niskim afinitetom, na primer sa KD od 1 x 10-6 M ili više, poželjnije 1 x 10-5 M ili više, poželjnije 1 x 10-4 M ili više, poželjnije 1 x 10-3 M ili više, još poželjnije 1 x 10-2 M ili više. Poželjno, antitelo se suštinski ne vezuje za srodne proteine, na primer, antitelo se suštinski ne vezuje za glipikan-1, glipikan-2, glipikan-4 ili glipikan-6.
[0057] U jednoj formi, antitelo može da se internalizuje u ćeliju koja eksprimira glipikan-3. Standardni testovi za evaluaciju internalizacije antitela poznati su u struci i uključuju, na primer, HumZap test internalizacije.
[0058] Standardni testovi za evaluaciju vezujuće sposobnosti antitela prema glipikanu-3 poznati su u struci i uključuju, na primer, ELISA testove, Western blotove, RIA testove, i analizu protočnom citometrijom. Pogodni testovi opisani su detaljno u Primerima. Kinetika vezivanja (npr., afinitet vezivanja) antitela takođe može da se proceni standardnim testovima poznatim u struci, na primer analizom Biacore® sistemom. Da bi se procenilo vezivanje za tumorske ćelije, npr. Hep-3b ili Hep-G2 (ATCC br. depozita HB-8064 odnosno HB-8065), ćelije mogu da se dobiju iz javno dostupnih izvora, na primer American Type Culture Collection, i da se koriste u standardnim testovima, na primer u analizi protočnom citometrijom.
Monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10
[0059] Poželjna antitela pronalaska su humana monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10, izolovana i strukturno okarakterisana kako je opisano u Primerima 1 i 2. Aminokiselinske sekvence VH 4A6, 11E7 i 16D10 pokazane su u SEQ ID NO:19, 20 i 21, respektivno. Aminokiselinske sekvence VL 4A6, 11E7 i 16D10 pokazane su u SEQ ID NO:22, 23 i 24, respektivno.
[0060] S obzirom na to da svako od ovih antitela može da se vezuje za glipikan-3, sekvence VH i VL mogu da se "pomešaju i spare" da bi se kreirali drugi antiglipikan-3 vezujući molekuli objave. Vezivanje za glipikan-3 tako "pomešanih i sparenih" antitela može da se testira korišćenjem testova vezivanja opisanih gore i u Primerima (npr., ELISA). Poželjno, kada se VH i VL lanci pomešaju i spare, VH sekvenca iz određenog VH/VL para zamenjuje se strukturno sličnom VH sekvencom. Slično tome, poželjno VL sekvenca iz određenog VH/VL para zamenjuje se strukturno sličnom VL sekvencom.
[0061] Prema tome, u jednom aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo koji uključuju:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 19, 20 i 21; i
(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 22, 23 i 24;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za glipikan-3, poželjno humani glipikan-3.
[0062] Poželjne kombinacije lakog i teškog lanca uključuju:
(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22; ili
(b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23.
(c) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24.
[0063] U drugom aspektu, objava obezbeđuje antitela koja sadrže CDR1, CDR2 i CDR3 teškog i lakog lanca 4A6, 11E7 i 16D10, ili njihove kombinacije. Aminokiselinske sekvence CDR1 VH 4A6, 11E7 i 16D10 pokazane su u SEQ ID NO:1, 2, odnosno 3. Aminokiselinske sekvence CDR2 VH 4A6, 11E7 i 16D10 pokazane su u SEQ ID NO:4, 5, odnosno 6. Aminokiselinske sekvence CDR3 VH 4A6, 11E7 i 16D10 pokazane su u SEQ ID NO:7, 8, odnosno 9. Aminokiselinske sekvence CDR1 Vk 4A6, 11E7 i 16D10 pokazane su u SEQ ID NO:10, 11, odnosno 12. Aminokiselinske sekvence CDR2 Vk 4A6, 11E7 16D10 pokazane su u SEQ ID NO:13, 14, odnosno 15. Aminokiselinske sekvence CDR3 Vk 4A6, 11E7 i 16D10 pokazane su u SEQ ID NO:16,17, odnosno18. CDR regioni su označeni korišćenjem Kabat-ovog sistema (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).
[0064] S obzirom na to da svako od ovih antitela može da se vezuje za glipikan-3 i da se antigen-vezujuća specifičnost obezbeđuje prvenstveno preko CDR1, CDR2 i CDR3 regiona, VH CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence i Vk CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence mogu da se "pomešaju i spare" (tj., CDR iz različitih antitela mogu da se pomešaju i spare, iako svako antitelo mora da sadrži VH CDR1, CDR2 i CDR3 i Vk CDR1, CDR2 i CDR3) da bi se kreirali drugi antiglipikan-3 vezujući molekuli objave.
[0065] Vezivanje takvih "pomešanih i sparenih" antitela za glipikan-3 može da se testira korišćenjem testova vezivanja opisanih gore i u Primerima (npr., ELISA, Biacore® analiza). Poželjno, kada se VH CDR sekvence pomešaju i spare, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene VHsekvence zameni se strukturno sličnom CDR sekvencom (sekvencama). Slično tome, kada se Vk CDR sekvence pomešaju i spare, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene Vk sekvence poželjno se zameni strukturno sličnom CDR sekvencom (sekvencama). Prosečno obučenom stručnjaku biće lako uočljivo da nove VH i VL sekvence mogu da se kreiraju supstituisanjem jedne ili više sekvenci CDR regiona VH i/ili VL strukturno sličnim sekvencama iz CDR sekvenci objavljenih u ovom tekstu, za monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10.
[0066] Prema tome, u još jednom aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji uključuju:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, 2 i 3;
(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:4, 5 i 6;
(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:7, 8 i 9;
(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:10, 11 i 12;
(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:13, 14 i 15; i
(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:16, 17 i 18;
pri čemu se antitelo specifično vezuje za glipikan-3, poželjno humani glipikan-3.
[0067] U poželjnoj formi, antitelo uključuje:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:1;
(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:4;
(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:7;
(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:10;
(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:13; i
(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:16.
[0068] U sledećoj poželjnoj formi, antitelo uključuje:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:2;
(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:5;
(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:8;
(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:11;
(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:14; i
(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:17.
[0069] U sledećoj poželjnoj formi, antitelo uključuje:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:3;
(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:6;
(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:9;
(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:12;
(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:15; i
(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:18.
[0070] U struci je dobro poznato da CDR3 domen, nezavisno od CDR1 i/ili CDR2 domena, može sam da odredi vezujuću specifičnost antitela za poznati antigen i da je moguće predvidljivo stvoriti veći broj antitela koja imaju istu vezujuću specifičnost zasnovanu na zajedničkoj CDR3 sekvenci. Vidi, na primer, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (opisuje proizvodnju humanizovanog anti-CD30 antitela uz korišćenje samo CDR3 varijabilnog domena teškog lanca mišjeg anti-CD30 antitela Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849(2000) (opisuje antitela na rekombinantni epitelni glikoprotein-2 (EGP-2) uz korišćenje samo CDR3 sekvence teškog lanca roditeljskog mišjeg MOC-31 anti-EGP-2 antitela); Rader et al., Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (opisuje panel humanizovanih anti-integrin- αvβ3 antitela uz korišćenje CDR3 domena varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mišjeg anti-integrin-αvβ3 antitela LM609 gde svako antitelo-član sadrži, izvan CDR3 domena, različitu sekvencu i sposobno je da se veže za isti epitop kao roditeljsko mišje antitelo, sa afinitetom visokim kao afinitet roditeljskog mišjeg antitela ili višim); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (objavljuje da CDR3 domen daje najznačajniji doprinos pri vezivanju sa antigenom); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (opisuje graftovanje teškolančanih CDR3 sekvenci tri Fab (SI-1, SI-40 i SI-32) protiv humane placentalne DNK u teški lanac antitetanus-toksoid- Fab, čime se zamenjuje postojeći teškolančani CDR3 i pokazuje da CDR3 domen sam daje vezujuću specifičnost); i Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (opisuje studije graftovanja u kojima prenošenje samo teškolančanog CDR3 roditeljskog polispecifičnog Fab LNA3 na teški lanac monospecifičnog IgG-tetanus-toksoid-vezujućeg Fab p313 antitela dovoljno za zadržavanje vezujuće specifičnosti roditeljskog Fab).
[0071] Prema tome, predmetna objava obezbeđuje monoklonska antitela koja uključuju jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz antitela izvedenog iz humane ili nehumane životinje, pri čemu je monoklonsko antitelo sposobno da se specifično vezuje za glipikan-3. U određenim aspektima, predmetna objava obezbeđuje monoklonska antitela koja uključuju jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz nehumanog antitela, na primer antitela miša ili pacova, pri čemu je monoklonsko antitelo sposobno da se specifično vezuje za glipikan-3. U određenim aspektima, takva inventivna antitela koja uključuju jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz nehumanog antitela (a) sposobna su da kompetiraju u vezivanju; (b) zadržavaju funkcionalne karakteristike; (c) vezuju se za isti epitop; i/ili (d) imaju sličan vezujući afinitet kao odgovarajuće roditeljsko nehumano antitelo.
[0072] U drugim aspektima, predmetna objava obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz humanog antitela, kao što je, na primer, humano antitelo dobijeno iz nehumane životinje, pri čemu je humano antitelo sposobno da se specifično vezuje za glipikan-3. U drugim aspektima, predmetna objava obezbeđuje monoklonska antitela koja sadrže jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz prvog humanog antitela, kao što je, na primer, humano antitelo dobijeno iz nehumane životinje, pri čemu je prvo humano antitelo sposobno da se specifično vezuje za glipikan-3 i pri čemu CDR3 domen iz prvog humanog antitela zamenjuje CDR3 domen u humanom antitelu kojem nedostaje vezujuća specifičnost za glipikan-3, da bi se stvorilo drugo humano antitelo koje je sposobno da se specifično veže za glipikan-3. U nekim aspektima, takva inventivna antitela koja sadrže jedan ili više teško- i/ili lakolančanih CDR3 domena iz prvog humanog antitela (a) sposobna su da kompetiraju u vezivanju; (b) zadržavaju funkcionalne karakteristike; (c) vezuju se za isti epitop; i/ili (d) imaju sličan vezujući afinitet kao odgovarajuće roditeljsko prvo humano antitelo. U poželjnom aspektu, roditeljsko prvo humano antitelo je 4A6, 11E7 i 16D10.
Antitela koja imaju određene sekvence germinativne linije
[0073] U određenim aspektima, antitelo objave sadrži varijabilni region teškog lanca iz određenog gena teškog lanca imunoglobulina germinativne linije i/ili varijabilni region lakog lanca iz određenog gena lakog lanca imunoglobulina germinativne linije.
[0074] Na primer, u poželjnom aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region teškog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog VH 5-51 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za glipikan-3. U drugom poželjnom aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog VK A27 gena, pri čemu se antitelo specifično vezuje za glipikan-3. U još jednom poželjnom aspektu, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu antitelo:
(a) sadrži varijabilni region teškog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog VH 5-51 gena (koji je gen koji kodira aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:31);
(b) sadrži varijabilni region lakog lanca koji je proizvod ili je izveden iz humanog VK A27 gena (koji je gen koji kodira aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:33); i
(c) specifično se vezuje za glipikan-3, poželjno humani glipikan-3.
Primeri antitela koja imaju VH 5-51 i VK A27 su 4A6, 11E7 i 16D10
[0075] Kako se koristi u ovom tekstu, humano antitelo uključuje varijabilni region teškog ili lakog lanca koji je "proizvod" ili je "izveden iz" određene sekvence germinativne linije ako se varijabilni regioni antitela dobijaju iz sistema koji koristi imunoglobulinske gene humane germinativne linije. Takvi sistemi podrazumevaju imunizovanje transgenog miša koji nosi humane imunoglobulinske gene, antigenom od interesa, ili pretraživanje biblioteke humanih imunoglobulinskih gena prikazanih na fagu, antigenom od interesa. Humano antitelo koje je "proizvod" ili je "izvedeno iz" imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije može da se identifikuje kao takvo upoređivanjem aminokiselinske sekvence humanog antitela sa aminokiselinskim sekvencama imunoglobulina humane germinativne linije i odabiranjem imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije koja je po sekvenci najbliža (tj., ima najveći % sličnosti) sekvenci humanog antitela. Humano antitelo koje je "proizvod" ili je "izvedeno iz" određene imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije može da sadrži razlike u amino-kiselinama, kada se uporedi sa sekvencom gerinativne linije, zbog, na primer, prirodnih somatskih mutacija ili namernog uvođenja usmerene mutacije. Međutim, odabrano humano antitelo je tipično najmanje 90% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom imunoglobulinskim genom humane germinativne linije i sadrži aminokiselinske rezidue koje humano antitelo određuju kao humano kada se upoređuje sa imunoglobulinskim aminokiselinskim sekvencama germinativne linije drugih vrsta (npr., sekvence mišje germinativne linije). U nekim slučajevima, humano antitelo može biti najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično po aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom imunoglobulinskim genom germinativne linije. Tipično, humano antitelo izvedeno iz određene sekvence humane germinativne linije pokazivaće ne više od 10 aminokiselinskih razlika u odnosu na aminokiselinsku sekvencu kodiranu imunoglobulinskim genom humane germinativne linije. U nekim slučajevima, humano antitelo može pokazivati ne više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinske razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu kodiranu imunoglobulinskim genom germinativne linije.
Homologa antitela
[0076] U još jednoj formi, antitelo objave uključuje varijabilne regione teškog i lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence homologe sa aminokiselinskim sekvencama poželjnih antitela opisanih u ovom tekstu, i pri čemu antitela zadržavaju željene funkcionalne osobine antiglipikan-3 antitela pronalaska.
[0077] Na primer, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji sadrže varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, gde:
(a) varijabilni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% homologa sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:19, 20 i 21;
(b) varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% homologa sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:22, 23 i 24; i
(c) antitelo se vezuje za humani glipikan-3 sa KD od 1 x 10-7 M ili manje.
[0078] Antitelo može i da se vezuje za CHO ćelije transfektovane humanim glipikanom-3.
[0079] U različitim aspektima, antitelo može da bude, na primer, humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo.
[0080] U drugim aspektima, VH i/ili VL aminokiselinske sekvence mogu da budu 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% homologe sa gore navedenim sekvencama. Antitelo sa VH i VL regionima koji imaju visoku (tj., 80% ili više) homologiju sa VH i VL regionima sekvenci navedenih gore, mogu da se dobiju mutagenezom (npr., usmerenom ili PCR-posredovanom mutagenezom) molekula nukleinskih kiselina kodirajućih za SEQ ID NO:25, 26, 27, 28, 29 i 30, praćeno testiranjem kodiranog izmenjenog antitela u pogledu sposobnosti da se veže za glipikan-3, koriščenjem funkcionalnih testova opisanih u ovom tekstu.
[0081] Kako se koristi u ovom tekstu, procenat homologije između dve aminokiselinske sekvence ekvivalentan je procentu identičnosti između dve sekvence. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija zajedničkih za obe sekvence (tj., % homologije = # identičnih pozicija / ukupan # pozicija x 100), uzimajući u obzir broj procepa, i dužinu svakog procepa, koje je potrebno uvesti da bi se dve sekvence optimalno poravnale. Upoređivanje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može da se obavi korišćenjem matematičkog algoritma, kako je opisano u neograničavajućim primerima dole.
[0082] Procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može da se odredi korišćenjem algoritma E. Meyers i W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)), inkorporisanog u ALIGN program (verzija 2.0), korišćenjem PAM120 matrice verovatnoće mutacija, kazne za dužinu procepa od 12 i kazne za procep od 4. Pored toga, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može da se odredi korišćenjem Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) algoritma koji je inkorporisan u GAP program u GCG softverskom paketu (dostupno na http://www.gcg.com), korišćenjem Blossum 62 matrice ili PAM250 matrice, i težine procepa od 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i težine dužine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.
[0083] Dodatno ili alternativno, proteinske sekvence predmetnog pronalaska mogu da se koriste i kao "sekvenca upita" za obavljanje pretraživanja javnih baza podataka, da bi se, na primer, identifikovale srodne sekvence. Takva pretraživanja mogu da se obave korišćenjem XBLAST programa (verzija 2.0), Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST pretraga proteina može da se uradi pomoću XBLAST programa, skor = 50, dužina reči (wordlength) = 3, da se dobiju aminokiselinske sekvence homologe sa molekulima antitela pronalaska. Za dobijanje poravnavanja sa prekidima, namenjenih upoređivanju, može da se koristi Gapped BLAST, kako je opisano u Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Kada se koriste BLAST i Gapped BLAST programi, mogu se koristiti zadati parametri respektivnih programa (npr., XBLAST i NBLAST). Vidi http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Antitela sa konzervativnim modifikacijama
[0084] U nekim formama, antitelo objave uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, pri čemu jedna ili više ovih CDR sekvenci sadrže specifikovane aminokiselinske sekvence bazirane na poželjnim antitelima opisanim u ovom tekstu (npr., 4A6, 11E7 i 16D10), ili njihove konzervativne modifikacije, i pri čemu antitela zadržavaju željene funkcionalne osobine antiglipikan-3 antitela pronalaska. Prema tome, objava obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji uključuju varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvence CDR1, CDR2 i CDR3, pri čemu:
(a) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:7, 8 i 9, i njihovih konzervativnih modifikacija;
(b) CDR3 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:16, 17 i 18, i njihovih konzervativnih modifikacija; i
(c) antitelo se vezuje za humani glipikan-3 sa KD od 1 x 10-7 M ili manje. Antitelo može da se vezuje i za CHO ćelije transfektovane humanim glipikanom-3.
[0085] U poželjnom aspektu, CDR2 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:4, 5 i 6, i njihovih konzervativnih modifikacija; i CDR2 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:13, 14 i 15, i njihovih konzervativnih modifikacija. U sledećem poželjnom aspektu, CDR1 sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:1, 2 i 3 i njihovih konzervativnih modifikacija; i CDR1 sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO:10, 11 i 12, i njihovih konzervativnih modifikacija.
[0086] U različitim aspektima, antitelo može da bude na primer, humano antitelo, humanizovano antitelo ili himerno antitelo.
[0087] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "konzervativne modifikacije sekvence" treba da označi aminokiselinske modifikacije koje značajno ne utiču ili ne menjaju vezujuće karakteristike antitela koja sadrže tu aminokiselinsku sekvencu. Takve konzervativne modifikacije uključuju aminokiselinske supstitucije, adicije i delecije. Modifikacije mogu da se uvedu u antitelo pronalaska standardnim tehnikama poznatim u struci, kao što su usmerena mutageneza i PCR-posredovana mutageneza. Konzervativne aminokiselinske supstitucije su one u kojima se aminokiselinska rezidua zamenjuje aminokiselinskom reziduom koja ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih rezidua koje imaju slične bočne lance definisane su u struci. Ove porodice uključuju amino-kiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr.,asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr,, glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-granatim bočnim lancima (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Prema tome, jedna ili više aminokiselinskih rezidua u CDR regionima antitela pronalaska mogu da se zamene drugim aminokiselinskim reziduama iz iste porodice bočnih lanaca i izmenjeno antitelo može da se testira u pogledu sposobnosti da se vezuje za glipikan-3, korišćenjem funkcionalnih testova opisanih u ovom tekstu.
[0088] Teškolančana CDR1 sekvenca SEQ ID NO:1, 2, ili 3 može sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, npr., jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; lakolančana CDR1 sekvenca SEQ ID NO:10, 11, ili 12 može sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, npr., jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; teškolančana CDR2 sekvenca pokazana u SEQ ID NO:4, 5, ili 6 može sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, npr., jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; lakolančana CDR2 sekvenca pokazana u SEQ ID NO:13, 14, ili 15 može sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, npr., jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; teškolančana CDR3 sekvenca pokazana u SEQ ID NO:7, 8, ili 9 može sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, npr., jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija; i/ili lakolančana CDR3 sekvenca pokazana u SEQ ID NO:16, 17, ili 18 može sadržati jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, npr., jednu, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih supstitucija, adicija ili delecija.
Antitela koja se vezuju za isti epitop kao antiglipikan-3 antitela pronalaska
[0089] U drugom aspektu, objava obezbeđuje antitela koja se vezuju za isti epitop na humanom glipikanu-3 kao i bilo koje od glipikan-3 monoklonskih antitela pronalaska (tj., antitela koja imaju sposobnost da unakrsno kompetiraju u vezivanju za glipikan-3 sa bilo kojim od monoklonskih antitela pronalaska). U poželjnim aspektima, referentno antitelo za studije unakrsne kompeticije može da bude monoklonsko antitelo 4A6 (koje ima VH i VL sekvence pokazane u SEQ ID NO:19 odnosno 22), monoklonsko antitelo 11E7 (koje ima VH i VL sekvence pokazane u SEQ ID NO:20 odnosno 23), ili monoklonsko antitelo 16D10 (koje ima VH i VL sekvence pokazane u SEQ ID NO:21 odnosno 24). Takva unakrsno-kompetirajuća antitela mogu da se identifikuju na osnovu svoje sposobnosti da u standardnim testovima vezivanja za glipikan-3 unakrsno kompetiraju sa 4A6, 11E7, ili 16D10. Na primer, Biacore analiza, ELISA testovi ili protočna citometrija mogu da se koriste za prikazivanje unakrsne kompeticije sa antitelima sadašnjeg pronalaska. Sposobnost testnog antitela da inhibira vezivanje, na primer, 4A6, 11E7, ili 16D10, za humani glipikan-3 pokazuje da testno antitelo može da kompetira sa 4A6, 11E7, ili 16D10 u vezivanju za humani glipikan-3 i da se prema tome vezuje za isti epitop na humanom glipikanu-3 kao 4A6, 11E7, ili 16D10. U poželjnom aspektu, antitelo koje se vezuje za isti epitop na humanom glipikanu-3 kao 4A6, 11E7, ili 16D10 je humano monoklonsko antitelo. Takva humana monoklonska antitela mogu da se pripreme i izoluju kako je opisano u Primerima.
Inženjerisana i modifikovana antitela
[0090] Antitelo objave može da se pripremi i korišćenjem antitela koje ima jednu ili više VH i/ili VL sekvenci objavljenih u ovom tekstu, kao polaznog materijala za inženjerisanje modifikovanog antitela, koje može da ima izmenjene osobine u poređenju sa polaznim antitelom. Antitelo može da se inženjeriše modifikovanjem jedne ili više amino-kiselina u jednom ili oba varijabilna regiona (tj., VH i/ili VL), na primer u jednom ili više CDR regiona i/ili u jednom ili više regiona okvira. Dodatno ili alternativno, anttelo može da se inženjeriše modifikovanjem rezidua u konstantnom regionu (regionima), na primer da bi se izmenila efektorska funkcija (funkcije) antitela.
[0091] U određenim formama, za inženjerisanje varijabilnih regiona antitela može da se koristi CDR graftovanje. Antitela interaguju sa ciljnim antigenima prvenstveno preko aminokiselinskih rezidua lociranih u šest teško- i lakolančanih regiona koji određuju komplementarnost (CDR). Iz tog razloga, aminokiselinske sekvence u CDR više se razlikuju među pojedinačnim antitelima nego sekvence izvan CDR. Zbog toga što su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija između antitela i antigena, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja imitiraju osobine specifičnih antitela koja se sreću prirodno, konstruisanjem ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnih prirodnih antitela graftovane u sekvence okvira različitih antitela, sa različitim osobinama (vidi, npr., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033; U.S. Patent No. 5,225,539, Winte, i U.S. Patent No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen et al.)
[0092] Prema tome, drugi aspekt objave odnosi se na izolovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji uključuju varijabilni region teškog lanca koji sadrži sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 koje uključuju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, 2 i 3, SEQ ID NO:4, 5 i 6 i SEQ ID NO:7, 8 i 9, respektivno, i varijabilni region lakog lanca koji sadrži sekvence CDR1, CDR2, i CDR3 koje uključuju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:10, 11 i 12, SEQ ID NO:13,14 i 15 i SEQ ID NO:16,17 i 18, respektivno. Prema tome, takva antitela sadrže VH i VL CDR sekvence monoklonskih antitela 4A6, 11E7, ili 16D10, ali mogu da sadrže sekvence okvira različite od sekvenci okvira ovih antitela.
[0093] Takve sekvence okvira mogu da se dobiju iz javne DNK baze podataka ili iz objavljenih referenci koje uključuju genske sekvence antitela germinativne linije. Na primer, DNK sekvence germinativne linije za gene varijabilnih domena humanih teških i lakih lanaca mogu da se nađu u "VBase" bazi podataka sekvenci humane germinativne linije (dostupno na internetu na www.mrccpe. cam.ac.uk/vbase), kao i u Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with-Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; i Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836. Kao drugi primer, DNK sekvence germinativne linije za gene varijabilnih regiona humanih lakih i teških lanaca mogu da se nađu u Genbank database. Na primer, sledeće teškolančane sekvence germinativne linije nađene u HCo7 HuMAb mišu raspoložive su u pridruženim Genbank pristupnim brojevima: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 i BC070333), 3-33 (NG_0010109 i NT_024637) i 3-7 (NG_0010109 i NT_024637). Kao još jedan primer, sledeće teškolančane sekvence germinativne linije nađene u HCo12 HuMAb mišu raspoložive su u pridruženim Genbank pristupnim brojevima:: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 i BC070333), 5-51 (NG_0010109 i NT_024637), 4-34 (NG_0010109 i NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) i 3-23 (AJ406678).
[0094] Proteinske sekvence antitela upoređuju se sa kompilacijskom bazom podataka proteinskih sekvenci korišćenjem jednog od metoda pretraživanja sličnosti između sekvenci nazvanog Gapped BLAST (Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), koji je dobro poznat stručnjacima u oblasti. BLAST je heuristički algoritam po tome što statistički značajno poravnavanje između sekvence antitela i sekvence iz baze podataka verovatno sadrži segmentne parove visokog skora (high-scoring segment pairs, HSP) poravnatih reči. Segmentni parovi čiji skorovi ne mogu da se poboljšaju ekstenzijom ili skraćivanjem nazivaju se pogodak (hit). Ukratko, nukleotidne sekvence VBASE porekla (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php) se translatuju i zadržava se region između i uključujući FR1 i FR3 okvirne regione. Sekvence baze podataka imaju prosečnu dužinu od 98 rezidua. Duplikati sekvenci koje se tačno poklapaju čitavom dužinom proteina se uklanjaju. BLAST traži proteine korišćenjem programa blastp sa zadatim, standardnim parametrima izuzev filtera niske kompleksnosti, koji se isključi, i supstitucione matrice BLOSUM62, filtrira top 5 pogodaka dajući sekvenciona poklapanja. Nukleotidne sekvence se translatuju u svih šest okvira i okvir bez stop kodona u poklapajućem segmentu sekvence iz baze podataka smatra se potencijalnim pogotkom. Ovo se zatim potvrđuje korišćenjem BLAST programa tblastx, koji translatuje sekvencu antitela u svih šest okvira i upoređuje ove translacije sa VBASE nukleotidnim sekvencama dinamički translatovanim u svih šest okvira.
[0095] Identičnosti su tačna aminokiselinska poklapanja između sekvence antitela i proteina baze podataka, čitavom dužinom sekvence. Pozitivi (identičnosti + supstituciono poklapanje) nisu identični nego aminokiselinske supstitucije vođene BLOSUM62 supstitucionom matricom. Ako se sekvenca antitela poklapa sa dve sekvence iz baze podataka sa istom identičnošću, odlučuje se da je "hit" sa najviše pozitiva "hit" poklapajuće sekvence.
[0096] Poželjne sekvence okvira za korišćenje u antitelima pronalaska su one koje su strukturno slične okvirnim sekvencma koje se koriste u odabranim antitelima pronalaska npr., slične sekvencama okvira VH 5-51 (SEQ ID NO:31) i/ili sekvencama okvira VK A27 (SEQ ID NO:33), koje se koriste u poželjnim monoklonskim antitelima pronalaska. VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence, i VK CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence mogu da se graftuju u regione okvira koji imaju identičnu sekvencu kao što je ona nađena u imunoglobulinskom genu germinativne linije iz koje je sekvenca okvira izvedena, ili CDR sekvence mogu da se graftuju u okvirne regione koji sadrže jednu ili više mutacija u poređenju sa sekvencama germinativne linije. Na primer, nađeno je da je u nekim slučajevima korisno mutirati rezidue unutar okvirnih regiona, da bi se zadržala ili pojačala antigen-vezujuća sposobnost antitela (vidi, npr., U.S. Patent No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen et al.).
[0097] Drugi tip modifikacije varijabilnog regiona je mutiranje aminokiselinskih rezidua u VH i/ili VK CDR1, CDR2 i/ili CDR3 regionima, čime se poboljšava jedna ili više vezujućih osobina (npr., afinitet) antitela od interesa. Usmerena mutageneza ili PCR-posredovana mutageneza mogu da se obave da bi se uvela mutacija (mutacije), a efekat na vezivanje antitela ili drugu funkcionalnu osobinu od interesa može da se evaluira testovima in vitro ili in vivo, kako je opisano u ovom tekstu i dato u Primerima. Poželjno, uvode se konzervativne modifikacije (o čemu je bilo reči gore). Mutacije mogu da budu aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije, ali poželjne su supstitucije. Štaviše, tipično se ne izmeni više od jedne, dve, tri, četiri ili pet rezidua u CDR regionu.
[0098] U skladu sa tim, u još jednom aspektu, sadašnja objava obezbeđuje izolovana antiglipikan-3 monoklonska antitela, ili njihove antigen-vezujuće delove, koji uključuju varijabilni region teškog lanca koji sadrži: (a) VH CDR1 region koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, 2 i 3, ili aminokiselinsku sekvencu sa jednom, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NO:1, 2 i 3; (b) VH CDR2 region koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:4, 5 i 6, ili aminokiselinsku sekvencu sa jednom, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NO:4, 5 i 6; (c) VH CDR3 region koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:7, 8 i 9, ili aminokiselinsku sekvencu sa jednom, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NO:7, 8, i 9; (d) VK CDR1 region koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:10, 11 i 12, ili aminokiselinsku sekvencu sa jednom, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NO: 10, 11 i 12; (e) VK CDR2 region koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 14 i 15, ili aminokiselinsku sekvencu sa jednom, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NO: 13, 14 i 15; i (f) VK CDR3 region koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 17 i 18, ili aminokiselinsku sekvencu sa jednom, dve, tri, četiri ili pet aminokiselinskih supstitucija, delecija ili adicija u poređenju sa SEQ ID NO: 16, 17 i 18.
[0099] Inženjerisana antitela pronalaska uključuju ona u kojima su modifikacije napravljene u reziduama okvira u VH i/ili VK, npr. da bi se poboljšale osobine antitela. Tipično, takve modifikacije okvira napravljene su da bi se smanjila imunogenost antitela. Na primer, jedan pristup je "povratno mutiranje" jedne ili više rezidua okvira u odgovarajuću sekvencu germinativne linije. Preciznije, antitelo koje je podleglo somatskoj mutaciji može sadržati rezidue okvira koje se razlikuju od sekvence germinativne linije od koje je antitelo izvedeno. Takve rezidue mogu da se identifikuju upoređivanjem sekvenci okvira antitela sa sekvencama germinativne linije iz kojih je antitelo izvedeno. Na primer, za 4A6, uz korišćenje Kabat-ovog sistema numerisanja, aminokiselinska rezidua #73 (u FR3) VH je arginin (SEQ ID NO:19), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH5-51 sekvenci germinativne linije lizin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, somatske mutacije mogu da se "povratno mutiraju" u sekvencu germinativne linije, na primer, usmerenom mutagenezom ili PCR-posredovanom mutagenezom (npr., rezidua #73 (rezidua #8 FR3) VH 4A6 može da se "povratno mutira" iz arginina u lizin).
[0100] Kao sledeći primer, za 4A6, aminokiselinska rezidua #76 (u FR3) VH je arginin (SEQ ID NO:19), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije serin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #76 (rezidua #11 FR3) VH 4A6 može da se "povratno mutira" iz arginina u serin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0101] Kao sledeći primer, za 4A6, aminokiselinska rezidua #89 (u FR3) VH je leucin (SEQ ID NO:19), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije metionin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #89 (rezidua #27 FR3) VH 4A6 može da se "povratno mutira" iz leucina u metionin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0102] Kao sledeći primer, za 11E7, aminokiselinska rezidua #76 (u FR3) VH je arginin (SEQ ID NO:20), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije serin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #76 (rezidua #11 of FR3) VH 11E7 može da se "povratno mutira" iz arginina u serin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0103] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #10 (u FR1) VH je aspartat (SEQ ID NO:21), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije glutamat (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #10 (rezidua #10 FR1) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz aspartata u glutamat. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0104] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #12 (u FR1) VH je treonin (SEQ ID NO:21), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije lizin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #12 (rezidua #12 FR1) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz treonina u lizin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0105] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #24 (u FR1) VH je valin (SEQ ID NO:21), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije glicin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #24 (rezidua #24 FR1) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz valina u glicin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0106] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #28 (u FR1) VH je arginin (SEQ ID NO:21), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije serin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #28 (rezidua #28 FR1) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz arginina u serin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0107] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #37 (u FR2) VH je metionin (SEQ ID NO:21), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije valin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #37 (rezidua #2 FR2) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz metionina u valin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0108] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #41 (u FR2) VH je serin (SEQ ID NO:21), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije prolin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #41 (rezidua #6 FR2) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz serina u prolin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0109] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #66 (u FR3) VH je histidin (SEQ ID NO:21) dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije glutamin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #66 (rezidua #1 FR3) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz histidina u glutamin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0110] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #76 (u FR3) VH je asparagin (SEQ ID NO:21), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije serin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #76 (rezidua #11 FR3) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz asparagina u serin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0111] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #81 (u FR3) VH je arginin (SEQ ID NO:21), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije glutamin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #81 (rezidua #16 FR3) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz arginina u glutamin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0112] Kao sledeći primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #89 (u FR3) VH je izoleucin (SEQ ID NO:21), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VH 5-51 sekvenci germinativne linije metionin (SEQ ID NO:31). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer #89 (rezidua #27 FR3) VH 16D10 može da se "povratno mutira" iz izoleucina u metionin. Takva "povratno mutirana" antitela takođe treba da budu obuhvaćena pronalaskom.
[0113] Slično, pronalazak daje povratne mutacije rezidua okvirnog regiona u lakom lancu. Na primer, za 16D10, aminokiselinska rezidua #3 (u FR1) VK je leucin (SEQ ID NO:24), dok je ova rezidua u odgovarajućoj VK A27 sekvenci germinativne linije valin (SEQ ID NO:33). Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u svoju konfiguraciju germinativne linije, na primer, rezidua #3 (rezidua #3 FR1) VK 16D10 može da se "povratno mutira" iz leucina u valin.
[0114] Drugi tip modifikacije okvira uključuju mutiranje jedne ili više rezidua u okvirnom regionu, ili čak unutar jednog ili više CDR regiona, da bi se uklonili epitopi za T-ćelije i time redukovala potencijalna imunogenost antitela. Ovaj pristup se označava i kao "deimunizacija" i opisan je detaljnije u U.S. Patent Publication No. 20030153043, Carr et al.
[0115] Dodatno ili alternativno, modifikacijama napravljenim u okvirnom regionu ili CDR regionima, antitela pronalaska mogu da se inženjerišu tako da uključuju modifikacije unutar Fc regiona, tipično da bi se izmenila jedna ili više funkcionalnih osobina antitela, kao što su poluživot u serumu, fiksacija komplementa, vezivanje za Fc receptor, i/ili antigen-zavisna ćelijska citotoksičnost. Pored toga, antitelo pronalaska može da se hemijski modifikuje (npr., za antitelo mogu da se prikače jedna ili više hemijskih komponenti) ili da se modifikuje da bi se izmenila njegova glikozilacija, opet da bi se izmenila jedna ili više funkcionalnih osobina antitela. Svaka od ovih formi opisana je detaljnije dole. Numerisanje rezidua u Fc regionu je prema Kabat-ovom EU indeksu.
[0116] U jednoj formi, zglobni region CH1 je modifikovan tako da je broj cisteinskih rezidua u zglobnom regionu izmenjen, npr., povećan ili smanjen. Ovaj pristup opisan je detaljnije u U.S. Patent No. 5,677,425, Bodmer et al. Broj cisteinskih rezidua u zglobnom regionu CH1 je izmenjen, na primer, da bi se olakšalo udruživanje lakih i teških lanaca ili da bi se povećala ili smanjila stabilnost antitela.
[0117] U drugoj formi, Fc zglobni region antitela je mutiran da bi se skratio biološki poluživot antitela. Preciznije, jedna ili više aminokiselinskih mutacija uvedeno je u interfejs-region CH2-CH3 domena Fc-zglob fragmenta, tako da antitelo ima ometeno vezivanje za Staphylococcyl protein A (SpA) u odnosu na vezivanje nativnog Fc-zglob domena za SpA. Ovaj pristup opisan je detaljnije u U.S. Patent No. 6,165,745, Ward et al.
[0118] U drugoj formi, antitelo je modifikovano da bi se produžio njegov biološki poluživot. Mogući su različiti pristupi. Na primer, može se uvesti jedna ili više sledećih mutacija: T252L, T254S i T256F, kako je opisano u U.S. Patent No. 6,277,375, Ward. Alternativno, da bi se produžio biološki poluživot, antitelo može da se izmeni unutar CH1 ili CL regiona, tako da sadrži epitop sa vezivanje sa receptorom spasa uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kako je opisano u U.S. Patent No. 5,869,046 i 6,121,022, Presta et al.
[0119] U drugim formama, Fc region je promenjen tako što je najmanje jedna aminokiselinska rezidua zamenjena različitom aminokiselinskom reziduom da bi se promenila efektorska funkcija (funkcije) antitela. Na primer, jedna ili više amino-kiselina odabranih između aminokiselinskih rezidua 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 i 322 mogu da se zamene različitim aminokiselinskim reziduama tako da to antitelo ima izmenjen afinitet za efektorski ligand, ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost roditeljskog antitela. Efektorski ligand za koji je afinitet izmenjen može biti, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup opisan je detaljnije u U.S. Patent No. 5,624,821 i 5,648,260, Winter et al., oba
[0120] U drugom primeru, jedna ili više amino-kiselina odabranih između aminokiselinskih rezidua 329, 331 i 322 može biti zamenjeno različitom aminokiselinskom reziduom tako da antitelo ima izmenjeno vezivanje za C1q i/ili smanjenu ili obustavljenu komplement-zavisnu citotoksičnost (complement dependent cytotoxicity, CDC). Ovaj pristup opisan je detaljnije u U.S. Patent No. 6,194,551, Idusogie et al.
[0121] U sledećem primeru, jedna ili više aminokiselinskih rezidua na aminokiselinskim pozicijama 231 i 239 izmenjeno je da bi se time izmenila sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup opisan je detaljnije u PCT Publication WO 94/29351, Bodmer et al.
[0122] U još jednom primeru, Fc region je modifikovan da bi se povećala sposobnost antitela da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC) i/ili da bi se povećao afinitet antitela za Fcγ receptor, modifikovanjem jedne ili više amino-kiselina na sledećim pozicijama: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ili 439. Ovaj pristup opisan je detaljnije u PCT Publication WO 00/42072, Presta. Pored toga, na humanom IgG1 mapirana su vezujuća mesta za FcγR1, FcγRII, FcγRIII i FcRn i opisane su varijante sa poboljšanim vezivanjem (vidi Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Pokazano je da specifične mutacije na pozicijama 256, 290, 298, 333, 334 i 339 poboljšavaju vezivanje za FcγRIII. Pored toga, pokazano je da sledeći kombinacioni mutanti poboljšavaju vezivanje za FcγRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A i S298A/E333A/K334A.
[0123] U još jednoj formi, modifikovana je glikozilacija antitela. Na primer, moguće je napraviti aglikozilovano antitelo (tj., antitelo koje nije glikozilovano). Glikozilacija može da se promeni da bi se, na primer, povećao afinitet antitela prema antigenu. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu da se obave, na primer, izmenom jednog ili više mesta glikozilacije u sekvenci antitela. Na primer, može se napraviti jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje za rezultat imaju eliminaciju jednog ili više glikozilacionih mesta okvira varijabilnog regiona, da bi se time eliminisala glikozilacija na tom mestu. Takva aglikozilacija može da poveća afinitet antitela prema antigenu. Ovaj pristup opisan je detaljnije u U.S. Patent No. 5,714,350 i 6,350,861, Co et al.
[0124] Dodatno ili alternativno, moguće je napraviti antitelo koje ima izmenjeni tip glikozilacije, na primer, hipofukozilovano antitelo sa smanjenom količinom fukozil-rezidua ili antitelo sa povećanim simetrično-delećim GlcNac strukturama. Pokazano je da takav izmenjeni obrazac glikozilacije povećava ADCC sposobnost antitela. Takve modifikacije ugljenih hidrata mogu da se obave, na primer, eksprimiranjem antitela u ćeliji-domaćinu koja ima izmenjenu glikozilacionu mašineriju. Ćelije sa izmenjenom glikozilacionom mašinerijom opisane su u struci i mogu da se koriste kao ćelije-domaćini u kojima će se eksprimirati rekombinantna antitela pronalaska da bi se na taj način proizvelo antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, ćelijske linije Ms704, Ms705 i Ms709 nemaju gen za fukoziltransferazu, FUT8 (alfa (1,6) fukoziltransferaza), tako da antitela koja se eksprimiraju u Ms704, Ms705 i Ms709 ćelijskim linijama nemaju fukozu na svojim ugljenim hidratima. Ms704, Ms705 i Ms709 FUT8-/- ćelijske linije napravljene su ciljanim narušavanjem FUT8 gena u CHO/DG44 ćelijama, korišćenjem dva zamenska vektora (vidi U.S. Patent Publication No. 20040110704, Yamane et al. i Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Kao sledeći primer, EP 1,176,195, Hanai et al. opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalno narušenim FUT8 genom koji kodira fukozil-transferazu, tako da antitela koja se eksprimiraju u toj ćelijskoj liniji pokazuju hipofukozilaciju zbog redukovanja ili eliminacije enzima koji deluju na alfa-1,6 vezu. Hanai et al. opisuju i ćelijske linije sa niskom enzimskom aktivnošću za dodavanje fukoze na N-acetilglukozamin koji se vezuje za Fc region antitela, ili su bez enzimske aktivnosti, na primer ćelijska linija mijeloma pacova YB2/0 (ATCC CRL 1662). PCT Publication WO 03/035835, Presta, opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Lec13 ćelije, sa smanjenom sposobnošću prikačinjanja fukoze za Asn(297)-vezane ugljene hidrate, što takođe za rezultat ima hipofukozilaciju antitela eksprimiranih u toj ćeliji-domaćinu (vidi i Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). PCT Publication WO 99/54342, Umana et al. opisuje ćelijske linije inženjerisane tako da eksprimiraju glikoprotein-modifikujuće glikozil-transferaze (npr., beta(1,4)-N-acetilglukozaminil-transferaza III (GnTIII)), tako da antitela koja se eksprimiraju u inženjerisanim ćelijskim linijama pokazuju povećanje simetrično-delećih GlcNac struktura, što rezultuje povećanom ADCC aktivnošću antitela (vidi i Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativno, fukozne rezidue antitela mogu da se odseku korišćenjem enzima fukozidaze. Na primer, fukozidaza alfa-L-fukozdaza uklanja fukozil-rezidue sa antitela (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).
[0125] Još jedna modifikacija antitela u ovom tekstu, koja se razmatra pronalaskom je pegilacija. Antitelo može da se pegiliše da bi se, na primer, produžio biološki (npr, u serumu) poluživot antitela. Da bi se antitelo pegilisalo, antitelo ili njegov fragment, tipično reaguju sa polietilen-glikolom (PEG), kao što je reaktivni estarski ili aldehidni derivat PEG, pod uslovima u kojima se jedna ili više PEG grupa prikače za antitelo ili fragment antitela. Poželjno, pegilacija se obavlja reakcijom acetilacije ili reakcijom alkilacije sa reaktivnim PEG molekulom (ili analognim reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi). Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "polietilen-glikol" treba da obuhvati svaki od oblika PEG koji su korišćeni za derivatizovanje drugih proteina kao što su mono (C1-C10) alkoksi ili ariloksi-polietilen-glikol ili polietilen-glikol-maleimid. U nekim formama, antitelo koje će se pegilisati je aglikozilovano antitelo. Metodi pegilacije proteina poznati su u struci i mogu da se primene na antitelima pronalaska. Vidi na primer, EP 0 154 316, Nishimura et al. i EP 0 401 384, Ishikawa et al.
Fizičke osobine antitela
[0126] Karakterizacija antitela predmetnog pronalaska može da se vrši i na osnovu različitih fizičkih osobina anti-glipikan-3 antitela. Za detektovanje i/ili diferenciranje različitih klasa antitela na osnovu ovih fizičkih osobina mogu se koristiti različiti testovi.
[0127] U nekim formama, antitela predmetnog pronalaska mogu sadržati jedno ili više mesta glikozilacije u varijabilnom regionu lakog ili teškog lanca. Prisustvo jednog ili više mesta glikozilacije u varijabilnom regionu može rezultovati povećanom imunogenošću antitela ili izmenom pK antitela zbog izmenjenog vezivanja sa antigenom (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Poznato je da do glikozilacije dolazi na motivima koji sadrže N-X-S/T sekvencu. Glikozilacija varijabilnog regiona može da se testira korišćenjem Glycoblot testa, koji seče antitelo da bi se proizveo Fab, a zatim se ispituje glikozilacija korišćenjem testa koji meri oksidaciju perjodata i formiranje Schiff-ove baze. Alternativno, glikozilacija varijabilnog regiona može da se testira korišćenjem Dionex svetlosne hromatografije (Dionex-LC), kojom se saharidi iz Fab seku na monosaharide i zatim se analizira sadržaj pojedinačnih saharida. U nekim slučajevima poželjno je imati anti-glipikan-3 antitelo koje ne sadrži glikozilaciju varijabilnog regiona. Ovo može da se postigne biranjem antitela koja u varijabilnom regionu ne sadrže glikozilacioni motiv ili mutiranjem rezidua u glikozilacionom motivu, koiršćenjem standardnih tehnika dobro poznatih u struci.
[0128] U poželjnoj formi, antitela predmetnog pronalaska ne sadrže mesta izomerije asparagina. Do deamidacije ili efekta izoasparaginske kiseline može doći na N-G ili D-G sekvenci, respektivno. Rezultat deamidacije ili efekta izoasparaginske kiseline je nastanak izoasparaginske kiseline koja smanjuje stabilnost antitela stvaranjem strukture povijene od karboksi-terminusa bočnog lanca, a ne glavnog lanca. Nastajanje izoasparaginske kiseline može da se meri korišćenjem izokvant-testa koji koristi reverzno-faznu HPLC za testiranje na izoasparaginsku kiselinu.
[0129] Svako antitelo će imati jedinstvenu izoelektričnu tačku (pI), ali uglavnom, antitela će biti u opsegu pH između 6 i 9.5. pI za IgG1 antitelo tipično je u opsegu pH 7-9.5 i pI za IgG4 antitelo tipično je u opsegu pH 6-8. Antitela mogu imati pI izvan ovog opsega. Iako su efekti uglavnom nepoznati, postoje mišljenja da antitela sa pI izvan normalnog opsega mogu imati izvesna ispravljanja i biti nestabilna pod uslovima in vivo. Izoelektrična tačka može da se ispituje testom kapilarnog izoelektričnog fokusiranja, koji stvara gradijent pH i može da koristi lasersko fokusiranje za povećanje pouzdanosti (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographic 53:S75-89; Hunt et al (1998) J ChromatogrA 800:355-67). U nekim slučajevima, poželjno je imati antiglipikan-3 antitelo sa pI vrednošću unutar normalnog opsega. Ovo se može postići odabirom antitela sa pI u normalnom opsegu, ili mutiranjem naelektrisanih površinskih rezidua, standardnim tehnikama koje su dobro poznate u struci.
[0130] Svako antitelo imaće temperaturu topljenja koja je indikator termičke stabilnosti (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Viša termička stabilnost ukazuje na veću ukupnu stabilnost antitela in vivo. Tačka topljenja antitela može da se meri korišćenjem tehnike kao što je diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM1 označava temperaturu na kojoj počinje ispravljanje antitela. TM2 označava temperaturu kompletnog ispravljanja antitela. Uopšteno, poželjno je da TM1 antitela predmetnog pronalaska bude veća od 60°C, poželjno veća od 65°C, još poželjnije veća od 70°C. Alternativno, termička stabilnost antitela može da se meri korišćenjem cirkularnog dihroizma (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
[0131] U poželjnoj formi, antitela se biraju tako da ne podležu brzoj razgradnji. Fragmentacija antiglipikan-3 antitela može da se meri korišćenjem kapilarne elektroforeze (capillary electrophoresis, CE) i MALDI-MS, što je dobro poznato u struci (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).
[0132] U sledećoj poželjnoj formi, biraju se antitela koja imaju minimalne efekte agregacije. Agregacija može da dovede do pokretanja neželjenog imunog odgovora i/ili do izmenjenih ili nepoželjnih farmakoloških osobina. Uopšteno, prihvatljiva su antitela sa agregacijom od 25% ili manjom, poželjno 20% ili manjom, još poželjnije 15% ili manjom, još poželjnije 10% ili manjom i još poželjnije 5% ili manjom. Agregacija može da se meri pomoću nekolikoo tehnika dobro poznatih u struci, uključujući ekskluzionu hromatografiju na koloni (size-exclusion column, SEC), tečnu hromatografiju visokih performansi (high performance liquid chromatography, HPLC), i rasipanje svetlosti za identifikovanje monomera, dimera, trimera ili multimera.
Metodi inženjerisanja antitela
[0133] Kao što je gore rečeno, antiglipikan-3 antitela koja imaju VH i VK sekvence objavljene u ovom tekstu, mogu da se koriste za stvaranje novih antiglipikan-3 antitela modifikovanjem VH i/ili VK sekvenci ili konstantnog (konstantnih) regiona prikačenog za njih. Prema tome, u sledećem aspektu objave, strukturne osobine antiglipikan-3 antitela pronalaska, npr. 4A6, 11E7 i 16D10, koriste se za stvaranje strukturno srodnih antiglipikan-3 antitela koja zadržavaju najmanje jednu funkcionalnu osobinu antitela pronalaska, kao što je vezivanje za humani glipikan-3. Na primer, jedan ili više CDR regiona 4A6, 11E7 i 16D10, ili njihovih mutacija, mogu da se rekombinantno kombinuju sa poznatim regionima okvira i/ili drugim CDR da bi se stvorila dodatna, rekombinantno inženjerisana, antiglipikan-3 antitela objave, o kojima je gore bilo reči. Drugi tipovi modifikacija uključuju one koje su opisane u prethodnom odeljku. Polazni materijal za metod inženjerisanja predstavlja jedna ili više VH i/ili VK sekvenci obezbeđenih u ovom tekstu ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Da bi se stvorilo inženjerisano antitelo, nije potrebno pripremiti (tj., eksprimirati u vidu proteina) antitelo koje ima jednu ili više VH i/ili VK sekvenci obezbeđenih u ovom tekstu, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Umesto toga, informacija sadržana u sekvenci (sekvencama) koristi se kao polazni materijal za stvaranje "druge generacije" sekvence (sekvenci) izvedene iz originalne sekvence (sekvenci) i zatim se "druga generacija" sekvence (sekvenci) priprema i eksprimira u vidu proteina.
[0134] Prema tome, u drugom aspektu objava daje metod pripremanja antiglipikan-3 antitela koji uključuje:
(a) obezbeđivanje: (i) sekvence varijabilnog regiona teškog lanca koja sadrži CDR1 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:1, 2 i 3, CDR2 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:4, 5 i 6, i/ili CDR3 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:7, 8, i 9; i/ili (ii) sekvence varijabilnog regiona lakog lanca koja sadrži CDR1 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 11 i 12, CDR2 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 13,14 i 15, i/ili CDR3 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 17, i 18;
(b) menjanje bar jedne aminokiselinske rezidue unutar sekvence varijabilnog regiona teškog lanca antitela i/ili sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antitela, da bi se stvorila najmanje jedna izmenjena sekvenca antitela; i
(c) eksprimiranja izmenjene sekvence antitela u vidu proteina.
Standardne molekularnno-biološke tehnike mogu da se koriste za pripremanje i ekspresiju izmenjene sekvence antitela.
[0135] Poželjno, antitelo kodirano izmenjenom sekvencom (sekvencama) antitela je ono koje zadržava jednu, neke ili sve funkcionalne osobine uključujući, ali ne ograničavajući se na:
(i) vezivanje za humani glipikan-3 sa KD od 1 x 10-7 M ili manje;
(ii) vezivanje za humane CHO ćelije transfektovane glipikanom-3.
[0136] Funkcionalne osobine izmenjenih antitela mogu da se procene korišćenjem standardnih testova raspoloživih u struci i/ili opisanih u ovom tekstu, kao što su oni navedeni u Primerima (npr., protočna citometrija, testovi vezivanja).
[0137] U određenim aspektima metoda inženjerisanja antitela pronalaska, mutacije mogu da se uvedu nasumično ili selektivno duž cele ili delova sekvence koja kodira antiglipikan-3 antitelo i dobijena modifikovana antiglipikan-3 antitela mogu da se pretražuju u pogledu vezujuće aktivnosti i/ili drugih funkcionalnih osobina, kako je opisano u ovom tekstu. Metodi za uvođenje mutacija opisani su u struci. Na primer, PCT Publication WO 02/092780, Short, opisuje metode stvaranja i pretraživanja mutacija antitela korišćenjem saturacione mutageneze, sintetskog ligacijskog sklapanja, ili njihove kombinacije. Alternativno, PCT Publication WO 03/074679, Lazar et al. opisuje metode korišćenja kompjuterskih metoda pretraživanja da bi se optimizovale osobine antitela.
Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela pronalaska
[0138] Drugi aspekt pronalaska odnosi se na molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju antitela pronalaska. Nukleinske kiseline mogu biti prisutne u celim ćelijama, u ćelijskim lizatima, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjena suštinski čistom" kada se očisti od drugih ćelijskih komponenti ili kontaminanata, npr., drugih ćelijskih nukelinskih kiselina ili proteina, korišćenjem standardnih tehnika uključujući tretiranje alkalijama/SDS-om, stvaranje traka pomoću CsCl (CsCl banding, centrifugiranje na gradijentu CsCl), hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge tehnike dobro poznate u struci. Vidi, F. Ausubel,et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Nukleinska kiselina pronalaska može biti, na primer, DNK ili RNK i može, ali ne mora sadržati intronske sekvence. U poželjnoj formi, nukleinska kiselina je cDNK molekul.
[0139] Nukleinske kiseline pronalaska mogu da se dobiju korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Za antitela eksprimirana u hibridomima (npr., hibridomi pripremljeni od transgenih miševa koji nose humane imunoglobulinske gene, kako je opisano detaljnije dole), cDNK kodirajuća za lake i teške lance antitela napravljene hibridomom može da se dobije standardnom PCR amplifikacijom ili tehnikama kloniranja cDNK. Za antitela dobijena iz biblioteke imunoglobulinskih gena (npr., korišćenjem tehnika prikazivanja na fagima), nukleinska kiselina koja kodira antitelo može da se preuzme iz biblioteke.
[0140] Poželjni molekuli nukleinskih kiselina pronalaska su oni koji kodiraju VH i VL sekvence 4A6, 11E7, ili 16D10 monoklonskih antitela. DNK sekvence koje kodiraju VH sekvence 4A6, 11E7, ili 16D10 prikazane su u SEQ ID NO:25, 26 i 27, respektivno. DNK sekvence koje kodiraju VLsekvence 4A6, 11E7, ili 16D10 prikazane su u SEQ ID NO:28, 29 i 30, respektivno.
[0141] Druge poželjne nukleinske kiseline pronalaska su nukleinske kiseline sa najmanje 80% sekvencione identičnosti, na primer najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% sekvencione identičnosti, sa jednom od sekvenci prikazanih u SEQ ID NO:25, 26, 27, 28, 29 i 30, koje su nukelinske kiseline koje kodiraju antitelo pronalaska ili njegov antigen-vezujući deo.
[0142] Procenat identičnosti između dve sekvence nukleinskih kiselina je broj pozicija u sekvenci na kojima su nukelotidi identični, uzimajući u obzir broj procepa i dužinu svakog procepa koje je potrebno uvesti da bi se dve sekvence optimalno poravnale. Upoređivanje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može da se obavi korišćenjem matematičkog algoritma kao što je algoritam Meyers-a i Miller-a ili Altschul-ovog XBLAST programa, opisanog gore.
[0143] Pored toga, poželjne nukleinske kiseline objave uključuju jedan ili više CDR-kodirajućih delova sekvenci nukleinskih kiselina pokazanih u SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 i 30. U ovoj formi, nukleinska kiselina može kodirati CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvencu teškog lanca 4A6, 11E7, ili 16D10 ili COR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvencu lakog lanca 4A6, 11E7, ili 16D10.
[0144] Nukleinske kiseline sa najmanje 80%, na primer najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% sekvencione identičnosti sa takvim CDR-kodirajućim delom SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 takođe su poželjne nukleinske kiseline objave. Takve nukleinske kiseline mogu da se razlikuju od odgovarajućeg dela SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, ili 30 u CDR-nekodirajućem regionu i/ili u CDR-kodirajućem regionu. Kada je razlka u CDR-kodirajućem regionu, region nukleinske kiseline koji kodira CDR tipično sadrži jednu ili više konzervativnih modifikacija sekvence, kako je definisano u ovom tekstu u odnosu na odgovarajuću CDR sekvencu 4A6, 11E7 i 16D10.
[0145] Kada se dobiju DNK fragmenti kodirajući za VH i VL segmente, ovim DNK fragmentima može dalje da se manipuliše korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK, na primer da bi se geni varijabilnog regiona konvertovali u gene lanca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u scFv gen. U ovim manipulacijama, VL- ili VH-kodirajući DNK fragment operativno je povezan sa drugim DNK fragmentom koji kodira drugi protein, na primer konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Pojam "operativno povezan", kako se koristi u ovom kontekstu, treba da označi da su dva fragmenta DNK povezana tako da aminokiselinske sekvence koje kodiraju ta dva fragmenta DNK ostaju u okviru.
[0146] Izolovana DNK koja kodira VH region može da se konvertuje u gen teškog lanca pune dužine, operativnim povezivanjem VH-kodirajuće DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena konstantnog regiona humanog teškog lanca poznate su u struci (vidi, npr., Kabat. E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu da se dobiju standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može da bude konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD, ali najpoželjniji su konstantni region IgG1 ili IgG4. Za gen Fab fragmenta teškog lanca, VH-kodirajuća DNK može da bude operativno povezana sa drugim DNK molekulom koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.
[0147] Izolovana DNK koja kodira VL region može da se konvertuje u gen lakog lanca pune dužine (kao i u gen Fab lakog lanca), operativnim povezivanjem VL-kodirajuće DNK sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence gena konstantnog regiona humanog lakog lanca poznate su u struci (vidi, npr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu da se dobiju standardnom PCR amplifikacijom. U poželjnim formama, konstantni region lakog lanca može da bude kapa ili lambda konstantni region.
[0148] Za stvaranje scFv gena, VH- i VL-kodirajući fragmenti DNK operativno su povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni linker, npr., koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4-Ser)3, tako da VH i VL sekvenca mogu da se eksprimiraju kao kontinuirani jednolančani protein, sa VL i VH regionom povezanim fleksibilnim linkerom (vidi npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).
Proizvodnja monoklonskih antitela
[0149] Monoklonska antitela (monoclonal antibodies, mAb) predmetnog pronalaska mogu da se proizvedu različitim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonskih antiela, npr., standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija, Kohler and Milstein (1975) Nature 256: 495. Iako su postupci hibridizacije somatskih ćelija poželjni, u principu, mogu da se upotrebe i druge tehnike za proizvodnju monoklonskog antitela npr., virusna ili onkogena transformacija B-limfocita.
[0150] Poželjni životinjski sistem za pripremanje hibridoma je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu predstavlja veoma dobro utvrđen postupak. Protokoli imunizacije i tehnike izolacije imunizovanih splenocita za fuzije, poznati su u struci. Fuzioni partneri (npr., ćelije mišjeg mijeloma) i postupci fuzije takođe su poznati.
[0151] Himerna ili humanizovana antitela predmetne objave mogu da se pripreme na osnovu sekvence nehumanog monoklonskog antitela pripremljenog kako je gore opisano. DNK koja kodira teško- i lakolančane imunoglobuline može da se dobije iz nehumanog hibridoma od interesa i inženjeriše, koriščenjem standardnih tehnika molekularne biologije, tako da sadrži nemišje (npr., humane) imunoglobulinske sekvence. Na primer, da bi se stvorilo himerno antitelo, mišji varijabilni regioni mogu da se povežu sa humanim konstantnim regionima, korišćenjem metoda dobro poznatih u struci (vidi npr., U.S. Patent No. 4,816,567, Cabilly et al.). Da bi se stvorilo humanizovano antitelo, mišji CDR regioni mogu da se insertuju u humani okvir, korišćenjem metoda poznatih u struci (vidi npr., U.S. Patent No. 5,225,539, Winter, i U.S. Patent No. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370, Queen et al.).
[0152] Antitela pronalaska su humana monoklonska antitela. Takva humana monoklonska antitela usmerena protiv glipikana-3 mogu da se naprave korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunog sistema umesto sistema miša. Ovi transgeni i transhromozomski miševi uključuju miševe ovde označene kao HuMAb Mouse® i KM Mouse®, respektivno, i zajedno su u ovom tekstu označeni kao "humani Ig" miševi.
[0153] HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) sadrži minilokuse humanog imunoglobulinskog gena koji kodiraju nerearanžirane imunoglobulinske sekvence humanog teškog (μ i γ) i κ lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogene lokuse μ i κ lanca (vidi npr., Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Prema tome, miševi pokazuju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili κ, i u odgovoru na imunizaciju, uvedeni transgeni humanog teškog i lakog lanca podležu klasnom prekopčavanju i somatskoj mutaciji da bi nastala visokoafinitetna humana IgGκ monoklonska antitela (Lonberg, N. et al. (1994), gore; pregled dat u Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, i Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). Pripremanje i korišćenje HuMAb Mouse®, i genomske modifikacije koje takve miševi nose, detaljnije su opisani u Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; i Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Vidi i U.S. Patent No. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; i 5,770,429; svi Lonberg and Kay; U.S. Patent No. 5,545,807, Surani et al.; PCT Publication No. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 i WO 99/45962, svi Lonberg and Kay; i PCT Publication No. WO 01/14424, Korman et al.
[0154] U sledećoj formi, humana antitela objave mogu da se naprave korišćenjem miša koji nosi humane imunoglobulinske sekvence na transgenima i transhromozomima, kao što je miš koji nosi humani transgen teškog lanca i humani transhromozom lakog lanca. Ovaj miš je označen u ovom tekstu kao "KM Mouse®", i opisan je detaljno u PCT Publication WO 02/43478, Ishida et al.
[0155] Pored toga, alternativni transgeni životinjski sistemi koji eksprimiraju humane imunoglobulinske gene raspoloživi su u struci i mogu da se koriste za stvaranje antiglipikan-3 antitela objave. Na primer, može da se koristi alternativni transgeni sistem označen kao Xenomouse (Abgenix, Inc.); takvi miševi opisani su na primer u, U.S. Patent No. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 6,162,963, Kucherlapati et al.
[0156] Pored toga, alternativni transhromozomski životinjski sistemi koji eksprimiraju humane imunoglobulinske gene raspoloživi su u struci i mogu da se koriste za stvaranje antiglipikan-3 antitela objave. Na primer, mogu da se koriste miševi koji nose humani transhromozom teškog lanca i humani transhromozom lakog lanca, označeni kao "TC miševi"; takvi miševi opisani su u Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Pored toga, krave koje nose transhromozome humanog teškog i lakog lanca, opisani su u struci (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) i PCT application No. WO/2002/092812 i mogu da se koriste za stvaranje antiglipikan-3 antitela objave.
[0157] Humana monoklonska antitela objave mogu da se pripreme i korišćenjem metoda prikazivanja na fagima za pretraživanje biblioteka humanih imunoglobulinskih gena. Takvi metodi prikazivanja na fagima za izolovanje humanih antitela utvrđeni su u struci. Vidi na primer: U.S. Patent No. 5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698, Ladner et al.; U.S. Patent No. 5,427,908 i 5,580,717, Dower et al.; U.S. Patent No. 5,969,108 i 6,172,197, McCafferty et al.; i U.S. Patent No. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081, Griffiths et al.
[0158] Humana monoklonska antitela objave mogu da se pripreme i korišćenjem SCID miševa u kojima su rekonstituisane humane imunske ćelije, tako da se posle imunizacije pokreće odgovor humanim antitelima. Takvi miševi opisani su, na primer, u U.S. Patent No. 5,476,996 i 5,698,767, Wilson et al.
Imunizacija "humani Ig" miševa
[0159] Kada se "humani Ig" miševi koriste za stvaranje humanih antitela objave, takvi miševi mogu da se imunizuju prečišćenim ili obogaćenim peparatima glipikan-3 antigena i/ili rekombinantnog glipikana-3, ili ćelijama koje eksprimiraju glipikan-3 ili glipikan-3 fuzioni protein, kako su opisali Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; i PCT Publication WO 98/24884 i WO 01/14424. Poželjno, miševi će u vreme prve infuzije biti stari 6-16 nedelja. Na primer, prečišćeni ili rekombinantni preparat (5-50 μg) glipikan-3 antigena može da se koristi za intraperitonelanu imunizaciju "humani Ig" miševa.
[0160] Detaljni postupci stvaranja potpuno humanih monoklonskih antitela na glipikan-3 opisani su u Primeru 1, dole. Zbirno iskustvo sa različitim antigenima pokazalo je da transgeni miševi odgovaraju na inicijalnu intraperitonealnu (IP) imunizaciju antigenom u kompletnom Freund-ovom adjuvansu, praćenu IP imunizacijama svake druge nedelje (do ukupno 6) antigenom u nekompletnom Freund-ovom adjuvansu. Međutim, nađeno je da su efikasni i drugi adjuvansi pored Freund-ovog. Pored toga, nađeno je da su visoko imunogene i cele ćelije u odsustvu adjuvansa. Tokom imunizacionog protokola, imunski odgovor može da se prati preko uzoraka plazme koji su dobijeni posle uzimanja krvi retroorbitalnim putem. Plazma može da se pregleda pomoću ELISA (kako je opisano dole), i miševi sa dovoljnim titrima antiglipikan-3 humanih imunoglobulina mogu da se koriste za fuzije. Imunski odgovor miševa može da se pojača intravenskim davanjem antigena, 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine. Očekuje se da može biti potrebno obaviti 2-3 fuzije za svaku imunizaciju. Za svaki antigen se tipično imunizuje između 6 i 24 miša. U jednoj formi, mogu se koristiti sojevi miševa HCo7, HCo12 ili HCo17 koji nose humani transgen teškog lanca. Alternativno ili dodatno, KM Mouse® soj može da se koristi. Pored toga, zajedno mogu da se gaje dve ili više ovih linija, da bi se dobio miš sa većim brojem različitih humanih transgena teških lanaca.
Stvaranje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela
[0161] Da bi se stvorili hibridomi koji proizvode humana monoklonska antitela pronalaska, splenociti i/ili ćelije limfnog čvora iz imunizovanih miševa mogu da se izoluju i fuzionišu sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mišjeg mijeloma. Dobijeni hibridomi mogu da se pretražuju u pogledu proizvodnje antigen-specifičnih antitela. Na primer, pojedinačno-ćelijske suspenzije slezinskih limfocita iz imunizovanih miševa mogu da se fuzionišu sa jednom šestinom broja P3X63-Ag8.653 nesekretujućih ćelija mišjeg mijeloma (ATCC, CRL 1580), sa 50% PEG. Alternativno, pojedinačno-ćelijske suspenzije slezinskih limfocita iz imunizovanih miševa mogu da se fuzionišu korišćenjem elektrofuzionih metoda baziranih na električnom polju, korišćenjem CytoPulse velikokomornog elektroporatora za fuziju ćelija (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland). Ćelije se zaseju, u koncentraciji od približno 2 x 105, na mikrotitarske ploče sa ravnim dnom, posle čega sledi inkubacija u trajanju od dve nedelje, u selektivnom mdijumu koji sadrži 20% fetalni Clone Serum, 18% "653" kondicionirani medijum, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamin, 1 mM natrijum-piruvat, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanol, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i 1X HAT (Sigma; HAT je dodat 24 sata posle fuzije). Posle približno dve nedelje, ćelije mogu da se kultivišu u medijumu u kojem je HAT zamenjen sa HT. Pojedinačni bunarčići zatim mogu da se pretražuju ELISA testom na humana monoklonska IgM i IgG antitela. Medijum može da se posmatra kada dođe do ekstenzivnog rasta hibridoma, obično posle 10-14 dana. Hibridomi koji sekretuju antitela mogu da se ponovo zaseju, ponovo pretraže i, ako su i dalje pozitivni za humani IgG, monoklonska antitela mogu da se subkloniraju najmanje dva puta metodom ograničavajućeg razblaženja. Stabilni subklonovi zatim mogu da se kultivišu in vitro da bi u medijumu za kulturu tkiva nastale male količine antitela, za karakterizaciju.
[0162] Da bi se prečistila humana monoklonska antitela, odabrani hibridomi mogu da rastu u dvolitarskim flakonima za centrifugu, za prečišćavanje monoklonskih antitela. Supernatanti mogu da se filtriraju i koncentruju, i zatim izlože afinitetnoj hromatografiji sa protein-A-sefarozom (Pharmacia, Piscataway, N.J.). Eluirani IgG mogu da se provere gel-elektroforezom i tečnom hromatografijom visokih performansi da bi se osigurala čistoća. Pufer može da se zameni PBS-om, i koncentracija može da se odredi pomoću OD280 uz korišćenje ekstinkcionog koeficijenta 1.43. Monoklonska antitela mogu da se alikvotiraju i uskladište na -80°C.
Stvaranje transfektoma koji proizvode monoklonska antitela
[0163] Antitela pronalaska mogu da se proizvedu i u transfektoma-ćelijama-domaćinima, korišćenjem, na primer, kombinacije tehnika rekombinantne DNK i metoda transfekcije gena, kako je dobro poznato u struci (npr., Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
[0164] Na primer, da bi se eksprimirala antitela, ili njihovi fragmenti, DNK koje kodiraju lake i teške lance delimične ili pune dužine, mogu se dobiti standardnim molekularno-biološkim tehnikama (npr., PCR amplifikacija ili cDNK kloniranje, uz korišćenje hibridoma koji eksprimira antitelo od interesa) i DNK mogu da se insertuju u ekspresione vektore tako da ti geni budu operativno povezani sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama. U tom kontekstu, pojam "operativno povezan" treba da označi da je gen antitela vezan u vektoru tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence unutar vektora služe funkciji kojoj su namenjene, a to je regulisanje transkripcije i translacije gena antitela. Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence odabrane su tako da budu kompatibilne sa ćelijom-domaćinom koja se koristi za ekspresiju. Gen lakog lanca antitela i gen teškog lanca antitela mogu da se insertuju u zasebne vektore ili, tipičnije, oba gena se insertuju u isti ekspresioni vektor. Geni antitela insertuju se u ekspresioni vektor standardnim metodima (npr., ligacija komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena antitela i vektoru, ili ligacija tupih krajeva, ako restrikciona mesta nisu prisutna). Varijabilni regioni lakog i teškog lanca antitela opisani u ovom tekstu mogu da se koriste za kreiranje gena antitela pune dužine bilo kog izotipa antitela, njihovim insertovanjem u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantni region teškog lanca i konstantni region lakog lanca željenog izotipa tako da je VH segment operativno povezan sa CH segmentom (segmentima) u vektoru, a VK segment je operativno povezan sa CL segmentom u vektoru. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije-domaćina. Gen lanca antitela može da se klonira u vektor tako da signalni peptid bude u okviru (in-frame) povezan sa amino-terminusom gena lanca antitela. Signalni peptid može da bude imunoglobulinski signalni peptid ili heterologi signalni peptid (tj., signalni peptid iz neimunoglobulinskog proteina).
[0165] Pored gena za lance antitela, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena lanaca antitela u ćeliji-domaćinu. Pojam "regulatorna sekvenca" uključuje promotore, enhensere i druge ekspresione kontrolne elemente (npr., poliadenilacione signale) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena lanaca antitela. Takve regulatorne sekvence opisane su, na primer, u Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymolgy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Stručnjaci u oblasti prepoznaće da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije-domaćina koja će biti transformisana, željenog nivoa ekspresije proteina, itd. Poželjne regulatorne sekvence za ekspresiju u sisarskim ćelijama-domaćinima uključuju virusne elemente koji utiču na visoke nivoe ekspresije proteina u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili enhenseri izvedeni iz citomegalovirusa (cytomegalovirus, CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovirusa, (npr., adenovirusni glavni kasni promotor (adenovirus major late promoter, AdMLP) i polioma. Alternativno, mogu se koristiti nevirusne regulatorne sekvence kao što su ubikvitinski promotor ili β-globinski promotor. Pored toga, mogu se koristiti regulatorni elementi sastavljeni od sekvenci iz različitih izvora, kao što je SRα promotorski sistem, koji sadrži sekvence iz SV40 ranog promotora i dugi terminalni ponovak virusa tipa 1 leukemije humanih T-ćelija (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).
[0166] Pored gena za lance antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu da nose dodatne sekvence kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćeliji-domaćinu (npr., početak replikacije) i gene selektabilnih markera. Selektabilni markerski geni olakšavaju selektovanje ćelija-domaćina u koje je vektor uveden (vidi, npr., U.S. Pat. No 4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017, svi Axel et al.). Na primer, tipično, selektabilni markerski gen daje, ćeliji-domaćinu u koju je vektor uveden, rezistenciju na lekove kao što su G418, higromicin ili metotreksat,. Poželjni selektabilni markerski geni uključuju gen za dihidrofolat-reduktazu (dihydrofolate reductase, DHFR) (za upotrebu u dhfr- ćelijama-domaćinima sa metotreksat selekcijom/amplifikacijom) i neo gen (za G418 selekciju).
[0167] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor (vektori) kodirajući za teške i lake lance transfektuje se u ćeliju-domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici pojma "transfekcija" treba da obuhvate različite tehnike koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju-domaćina, npr., elektroporacija, kalcijum-fosfatna precipitacija, DEAE-dekstran transfekcija i slično. Iako je teorijski moguće da se antitela pronalaska eksprimiraju u prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji-domaćinu, ekspresija entitela u eukariotskim ćelijama i najpoželjnije sisarskim ćelijama-domaćinima najpoželjnija je jer će takve eukariotske ćelije, posebno sisarske ćelije, verovatnije nego prokariotske ćelije, sklopiti i sekretovati ispravno savijeno imunski aktivno antitelo. Saopšteno je da je prokariotska ekspresija gena antitela neefikasna za proizvodnju aktivnih antitela, sa viskim prinosom (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).
[0168] Poželjne sisarske ćelije-domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela pronalaska ukjučuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (Chinese Hamster Ovary, CHO cells) (uključujući dhfr CHO ćelije, opisane u Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, korišćene sa DHFR selektabilnim markerom, npr., kako je opisano u R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), NSO mijeloma ćelije, COS ćelije i SP2 ćelije. Posebno, za upotrebu sa NSO mijeloma ćelijama, drugi poželjni ekspresioni sistem je GS genski ekspresioni sistem objavljen u WO 87/04462 (Wilson), WO 89/01036 (Bebbington) i EP 338,841 (Bebbington). Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvedu u sisarske ćelije-domaćine, antitela se proizvode kultivisanjem ćelija-domaćina tokom vremena dovoljno dugog da se omogući ekspresija antitela u ćelijama-domaćinima ili poželjnije, sekrecija antitela u kultivacioni medijum u kojem ćelije-domaćini rastu. Antitela mogu da se preuzmu iz kultivacionog medijuma korišćenjem standardnih metoda prečišćavanja proteina.
Karakterizacija vezivanja antitela za antigen
[0169] Antitela pronalaska mogu da se testiraju u pogledu vezivanja za glipikan-3 na primer, standardnim ELISA testom. Ukratko, mikrotitarske ploče oblože se prečišćenim glipikanom-3, pri 0.25 μg/ml u PBS, i zatim se blokiraju 5% goveđim serum albuminom u PBS. Razblaženja antitela (npr., razblaženja plazme miševa imunizovanih glipikanom-3) dodaju se u svaki bunarčić i inkubiraju 1-2 sata na 37°C. Ploče se isperu pomoću PBS/Tween i zatim inkubiraju sa sekundarnim reagensom (npr., za humana antitela, kozji antihumani IgG Fc-specifični poliklonski reagens) konjugovanim sa alkalnom fosfatazom, 1 sat na 37°C. Posle ispiranja, ploče se razvijaju sa pNPP supstratom (1 mg/ml) i analiziraju na OD405-650. Poželjno, miševi koji su razvili najviše titre uzeće se za fuzije.
[0170] ELISA test opisan gore takođe može da se koristi za traženje hibridoma koji pokazuju pozitivnu reaktivnost sa glipikan-3 imunogenom. Hibridomi koji se vezuju sa visokim aviditetom za glipikan-3 subkloniraju se i dalje karakterišu. Jedan klon iz svakog hibridoma, koji zadržava reaktivnost roditeljskih ćelija (pokazuje se ELISA testom), može da se odabere za pravljenje 5-10 fiola ćelijske banke uskladištenih na -140°C, i za prečišćavanje antitela.
[0171] Da bi se prečistila antiglipikan-3 antitela, odabrani hibridomi mogu da rastu u dvolitarskim flakonima za centrifugiranje, za prečišćavanje monoklonskih antitela. Supernatanti mogu da se filtriraju i koncentruju da bi se zatim podvrgli afinitetnoj hromatografiji na protein-A-sefarozi (Pharmacia, Piscataway, NJ). Eluirani IgG može da se proveri gel-elektroforezom i tečnom hromatografijom visokih performansi, da bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor može da se zameni PBS-om, i koncentracija može da se odredi pomoću OD280, uz korišćenje ekstinkcionog koeficijenta 1.43. Monoklonska antitela mogu da se alikvotiraju i uskladište na -80°C.
[0172] Da bi se odredilo da li se odabrana antiglipikan-3 monoklonska antitela vezuju za jedinstvene epitope, svako antitelo može da se biotinizuje korišćenjem komercijalno dostupnih reagenasa (Pierce, Rockford, IL). Studije kompeticije uz korišćenje neobeleženih monoklonskih antitela i biotinizovanih monoklonskih antitela mogu da se obave korišćenjem ELISA ploča obloženih glipikanom-3, kako je opisano gore. Vezivanje biotinizovanih mAb može da se detektuje pomoću streptavidin-alkalnofosfatazne probe
[0173] Da bi se odredio izotip prečišćenih antitela, mogu da se obave izotipski ELISA testovi, korišćenjem reagenasa specifičnih za antitela određenog izotipa. Na primer, da bi se odredio izotip humanog monoklonskog antitela, bunarčići mikrotitarskih ploča oblože se antihumanim imunoglobulinom u koncentraciji od 1 μg/ml, preko noći, na 4°C. Posle blokiranja sa 1% BSA, ploče reaguju sa 1 μg/ml ili manje testnih monoklonskih antitela ili prečišćenim izotipskim kontrolama, na temperaturi okoline, jedan do dva sata. Bunarčići zatim reaguju ili sa humanim IgG1- ili sa humanim IgM-specifičnim probama konjugovanim sa alkalnom fosfatazom. Ploče se razvijaju i analiziraju kako je opisano gore.
[0174] Antiglipikan-3 humani IgG mogu dalje da se testiraju u pogledu reaktivnosti sa glipikan-3 antigenom pomoću Western blotovanja. Ukratko, glipikan-3 se pripremi i izloži elektroforezi na poliakrilamidnom gelu, u prisustvu natrijum-dodecil-sulfata. Posle elektroforeze, razdvojeni antigeni se prenesu na nitrocelulozne membrane, blokiraju 10% fetalnim telećim serumomi ispituju monoklonskim antitelima koja se testiraju. Vezivanje humanog IgG detektuje se korišćenjem anti-humanog IgG-alkalne fosfataze i razvijanjem sa tabletama BCIP/NBT supstrata (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).
[0175] Vezujuća specifičnost antitela pronalaska može da se odredi i praćenjem vezivanja antitela za ćelije koje eksprimiraju glipikan-3, na primer protočnom citometrjom. Tipično, ćelijska linija, na primer CHO ćelijska linija, može da se transfektuje ekspresionim vektorom koji kodira transmembransku formu glipikana-3. Transfektovani protein može sadržati obeleživač, kao što je myc-tag, poželjno na N-terminusu, za detekciju korišćenjem antitela na obeleživač. Vezivanje antitela pronalaska za glipikan-3 može da se odredi inkubiranjem transfektovanih ćelija sa antitelom i detektovanjem vezanog antitela. Vezivanje antitela za obeleživač na transfektovanom proteinu može da se koristi kao pozitivna kontrola.
[0176] Specifičnost antitela pronalaska za glipikan-3 može da se izučava još i određivanjem da li se antitelo vezuje za druge proteine (npr. glipikan-1, glipikan-2, glipikan-4 ili glipikan-6) ili samo za glipikan-3, korišćenjem istih metoda kojima je određivano vezivanje za glipikan-3.
Imunokonjugati
[0177] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak uvodi antiglipikan-3 antitelo, ili njegov fragment, konjugovane sa terapijskom komponentom, kao što je citotoksin, lek (npr., imunosupresiv) ili radiotoksin. Takvi konjugati označeni su u ovom tekstu kao "imunokonjugati". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina označeni su kao "imunotoksini". Citotoksin ili citotoksično sredstvo uključuje svako sredstvo koje je pogubno za ćelije (npr ubija ih). Primeri uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum-bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi-antracindion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol i puromicin i njihove analoge ili homologe. Terapijska sredstva uključuju i na primer, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil, dakarbazin), alkilirajuća sredstva (npr., mehloretamin, tiotepa hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin-platinu (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin i antramicin (AMC)), i antimitotička sredstva (npr., vinkristin i vinblastin).
[0178] Drugi poželjni primeri terapijskih citotoksina koji mogu da se konjuguju sa antitelom pronalaska uključuju duokarmicine, kalihemicine, majtanzine i auristatine, i njihove derivate. Primer konjugata antitela sa kalihemicinom je komercijalno dostupan (Mylotarg®; American Home Products).
[0179] Citotoksini mogu da se konjuguju sa antitelima pronalaska korišćenjem linkerske tehnologije raspoložive u struci. Primeri tipova linkera koji se koriste za konjugovanje citotoksina sa antitelom uključuju, ali se ne ograničavaju na hidrazone, tioetre, estre, disulfide i linkere koji sadrže peptide. Može se izabrati linker koji je, na primer, podložan sečenju na niskom pH u lizozomskom kompartmentu ili podložan sečenju proteazama, kao što su proteaze koje se preferencijalno eksprimiraju u tumorskom tkivu, kao što su katepsini (npr., katepsini B, C, D).
[0180] Primeri citotoksina opisani su, na primer, u U.S. Patent No. 6,989,452, 7,087,600 i 7,129,261, i u PCT Application No. PCT/US02/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US06/37793, PCT/US06/060050, PCT/US2006/060711, WO/2006/110476, i u U.S. Patent Application No. 60/891,028. Za dalju diskusiju o tipovima citotoksina, linkera i metoda konjugovanja terapijskih sredstava sa antitelima, vidi i Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Open. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.
[0181] Antitela predmetnog pronalaska takođe mogu da se konjuguju sa radioaktivnim izotopom, da bi se napravila citotoksična radiofarmaceutska sredstva označena i kao radioimunokonjugati. Primeri radioaktivnih izotopa koji mogu da se konjuguju sa antitelima, za dijagnostičku ili terapijsku upotrebu uključuju, ali se ne ograničavaju na jod131, indijum111, itrijum90 i lutecijum177. Metodi pripremanja radioimunokonjugata utvrđeni su u struci. Primeri radioimunokonjugata komercijalno su dostupni, uključujući Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) i Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), a slični metodi mogu da se koriste za pripremanje radioimunokonjugata korišćenjem antitela pronalaska.
[0182] Konjugati antitela pronalaska mogu da se koriste za modifikovanje datog biološkog odgovora, i ne treba shvatiti da je lek-komponenta ograničena na klasična hemijska terapijska sredstva. Na primer, lek-komponenta može da bude protein ili polipeptid koji poseduju željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu uključivati, na primer, enzimski aktivni toksin ili njegov aktivni fragment, na primer abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-γ; ili, modifikatore biološkog odgovora kao što su na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (granulocyte macrophage colony stimulating factor, "GM-CSF"), faktor stimulacije kolonija granulocita (granulocyte colony stimulating factor, "G-CSF"), ili drugi faktori rasta.
[0183] Tehnike konjugovanja takvih terapijskih komponenti sa antitelima dobro su poznate, vidi, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u: Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u: Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u: Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u: Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Bispecifični molekuli
[0184] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak predstavlja bispecifične molekule koji uključuju antiglipikan-3 antitelo, ili njegov fragment, pronalaska. Antitelo pronalaska, ili njegov antigen-vezujući deo, mogu da se derivatizuju ili povežu sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom (npr., drugim antitelom ili ligandom za receptor) da bi se napravio bispecifični molekul koji se vezuje za najmanje dva različita vezujuća mesta ili ciljna molekula. Antitelo pronalaska može zapravo da bude derivatizovano ili povezano sa više nego jednim funkcionalnim molekulom, da bi se napravili multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita vezujuća mesta ili ciljna molekula; takvi multispecifični molekuli takođe treba da budu obuhvaćeni pojmom "bispecifični molekuli", kako se koristi u ovom tekstu. Da bi se kreirao bispecifični molekul pronalaska, antitelo pronalaska može da se funkcionalno poveže (npr., hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim udruživanjem ili na drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula kao što su drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili vezujući mimetik, tako da se dobije bispecifični molekul.
[0185] Prema tome, predmetni pronalazak uključuje bispecifične molekule koji sadrže najmanje jednu prvu vezujuću specifičnost za glipikan-3 i drugu vezujuću specifičnost za drugi ciljni epitop. U posebnoj formi pronalaska, drugi ciljni epitop je Fc receptor, npr., humani FcγRI (CD64) ili humani Fcα receptor (CD89). Prema tome, pronalazak uključuje bispecifične molekule sposobne da se vezju i za FcγR ili FcαR eksprimirajuće efektorske ćelije (npr., monocite, makrofage ili polimorfonuklearne ćelije (polymorphonuclear cells, PMN)), i za ciljne ćelije koje eksprimiraju glipikan-3. Ovi bispecifični molekuli usmeravaju efektorske ćelije ka glipikan-3 eksprimirajućim ćelijama i pokreću Fc receptorima posredovane aktivnosti efektorakih ćelija, kao što su fagocitoza ćelija koje eksprimiraju glipikan-3, ćelijama posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC), oslobađanje citokina, ili generisanje superoksid-anjona.
[0186] U formi pronalaska u kojoj je bispecifični molekul multicpecifičan, molekul može uključivati još i treću vezujuću specifičnost, pored anti-Fc vezujuće specifičnosti i antiglipikan-3 vezujuće specifičnosti. U jednoj formi, treća vezujuća specifičnost je antipojačavajući faktor-deo (enhancement factor, EF), npr., molekul koji se vezuje za površinski protein uključen u citotoksičnu aktivnost i time pojačava imunski odgovor prema ciljnoj ćeliji. "Antipojačavajući faktor-deo" može da bude antitelo, funkcionalni fragment antitela ili ligand koji se vezuje za dati molekul, npr., antigen ili receptor, i time dovodi do pojačanja efekta vezujućih determinanti za Fc receptor ili ciljni ćelijski antigen. "Antipojačavajući faktor-deo" može da se veže za Fc receptor ili antigen ciljne ćelije. Alternativno, antipojačavajući faktor-deo može da se veže za entitet različit od entiteta za koji se vezuju prva i druga vezujuća specifičnost. Na primer, antipojačavajući faktor-deo može da se veže za citotoksičnu T-ćeliju (npr. preko CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ili drugu imunsku ćeliju, što za rezultat ima porast imunskog odgovora prema ciljnoj ćeliji).
[0187] U jednoj formi, bispecifični molekuli objave sadrže kao vezujuću specifičnost najmanje jedno antitelo, ili fragment antitela, uključujući, npr., Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fd, dAb ili jednolančani Fv. Antitelo može takođe da bude lakolančani ili teškolančani dimer, ili bilo koji njegov minimalni fragment, kao Fv ili jednolančani konstrukt, kako je opisano u U.S. Patent No. 4,946,778, Ladner et al.
[0188] U jednoj formi, vezujuća specifičnost za Fcγ receptor obezbeđena je monoklonskim antitelom, čije vezivanje nije blokirano humanim imunoglobulinom G (IgG). Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "IgG receptor" odnosi se na bilo koji od osam gena za γ-lanac, lociranih na hromozomu 1. Ovi geni kodiraju ukupno dvanaest transmembranskih ili solubilnih receptorskih izoformi koje su grupisane u tri Fcγ receptorske klase: FcγRI (CD64), FcγRII(CD32), i FcγRIII (CD16). U jednoj poželjnoj formi, Fcγ receptor je humani visokoafinitetni FcγRI. Humani FcγRI je molekul od 72 kDa, koji pokazuje visok afinitet za monomerni IgG (108-109 M-1).
[0189] Proizvodnja i karakterizacija određenih poželjnih anti-Fcγ monoklonskih antitela opisane su u PCT Publication WO 88/00052 i u U.S. Patent No. 4,954,617, Fanger et al. Ova antitela vezuju se za epitop FcγRI, FcγRII ili FcγRIII na mestu koje je različito od Fcγ vezujućeg mesta receptora i tako, njhovo vezivanje nije suštinski blokirano fiziološkim nivoima IgG. Specifična anti-FcγRI antitela korisna u ovom pronalasku su mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 i mAb 197. Hibridom koji proizvodi mAb 32 raspoloživ je u American Type Culture Collection, ATCC Accession No. HB9469. U drugim formama, anti-Fcγ receptorsko antitelo je humanizovani oblik monoklonskog antitela 22 (H22). Proizvodnja i karakterizacija H22 antitela opisane su u Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 i PCT Publication WO 94/10332, Tempest et al. Ćelijska linija koja proizvodi H22 antitelo deponovana je u American Type Culture Collection pod oznakom HA022CL1 i ima pristupni br. CRL 11177.
[0190] U drugim poželjnim formama, vezujuća specifičnost za Fc receptor data je antitelom koje se vezuje za humani IgA receptor, npr., Fc-alfa receptor (FcαRI (CD89)), čije vezivanje se poželjno ne blokira humanim imunoglobulinom A (IgA). Pojam "IgA receptor" treba da uključi genski proizvod jednog α-gena (FcαRI) lociranog na hromozomu 19. Poznato je da ovaj gen kodira nekoliko alternativno splajsovanih transmembranskih izoformi od 55 do 110 kDa. FcαRI (CD89) se konstitutivno eksprimira na monocitima/makrofagima, eozinofilnim i neutrofilnim granulocitima, ali ne i na neefektorskim ćelijskim populacijama. FcαRI ima srednji afinitet (≈ 5 x 107 M-1) za IgA1 i IgA2, koji raste posle izlaganja citokinima kao što su G-CSF ili GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Opisana su četiri FcαRI-specifična monoklonska antitela, identifikovana kao A3, A59, A62 i A77, koja se vezuju za FcαRI izvan IgA ligand-vezujućeg domena (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).
[0191] FcαRI i FcγRI su poželjni receptori-okidači za upotrebu u bispecifičnim molekulima pronalaska jer (1) eksprimiraju se primarno na imunskim efektorskim ćelijama, npr., monocitima, PMN, makrofagima i dendritskim ćelijama; (2) eksprimiraju se u visokim nivoima (npr., 5 000-100 000 po ćeliji); (3) medijatori su citotoksičnih aktivnosti (npr., ADCC, fagocitoza); i (4) posreduju u pojačanoj antigenskoj prezentaciji antigena, uljučujući sopstvene antigene na koje su usmereni.
[0192] Iako su poželjna humana monoklonska antitela, druga antitela koja mogu da se upotrebe u bispecifičnim molekulima objave su mišja, himerna i humanizovana monoklonska antitela.
[0193] Bispecifični molekuli predmetnog pronalaska mogu da se pripreme konjugovanjem konstituentnih vezujućih specifičnosti, npr., anti-FcR i antiglipikan-3 vezujućih specifičnosti, korišćenjem metoda poznatih u struci. Na primer, svaka vezujuća specfičnost bispecifičnog molekula može da se napravi zasebno i zatim mogu da se konjuguju jedna sa drugom. Kada su vezujuće specifičnosti proteini ili peptidi, za kovalentnu konjugaciju mogu da se koriste različita kuplujuća ili unakrsno-povezujuća sredstva. Primeri unakrsno-povezujućih sredstava uključuju protein-A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate, SATA), 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoevu kiselinu) (5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), DTNB), o-fenilendimaleimid (o-phenylenedimaleimide, oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate, SPDP) i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cikloheksan-1-karboksilat (sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate, sulfo-SMCC) (vidi, npr., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Drugi metodi uključuju one koji su opisani u Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, i Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Poželjna konjugujuća sredstva su SATA i sulfo-SMCC, oba se mogu nabaviti od Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[0194] Kada su vezujuće specifičnosti antitela, ona mogu da se konjuguju sulfihidrilnim povezivanjem C-terminusa zglobnih regiona dva teška lanca. U posebno poželjnoj formi, zglobni region je pre konjugacije modifikovan tako da sadrži neparan broj sulfhidrilnih rezidua, poželjno jednu.
[0195] Alternativno, obe vezujuće specifičnosti mogu biti kodirane istim vektorom i eksprimirane i sklopljene u istoj ćeliji-domaćinu. Ovaj metod je posebno koristan kada je bispecifični molekul mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab’)2 ili ligand x Fab fuizioni protein. Bispecifični molekul pronalaska može da bude jednolančani molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i vezujuću determinantu ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve vezujuće determinante. Bispecifični molekuli mogu sadržati najmanje dva jednolančana molekula. Metodi pripremanja bispecifičnih molekula opisani su, na primer, u U.S. Patent no. 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; i 5,482,858.
[0196] Vezivanje bispecifičnih molekula za specifične ciljeve može da se potvrdi, na primer, enzimskim imunotestom (enzyme-linked immunosorbant assay, ELISA), radioimunotestom (radioimmunoassay, RIA), FACS analizom, biotestom (npr., inhibicija rasta), ili Western blot testom. Svaki od ovih testova uopšteno detektuje prisustvo kompleksa protein-antitelo od posebnog interesa, upotrebom obeleženog reagensa (npr., antitelo) specifičnog za kompleks od interesa. Na primer, kompleksi FcR-antitelo mogu da se detektuju korišćenjem npr., antitela ili fragmenta antitela povezanih sa enzimom, koji prepoznaju i specifično se vezuju za komplekse antitelo-FcR. Alternativno, kompleksi mogu da se detektuju korišćenjem bilo kojeg od različitih drugih imunotestova. Na primer, antitelo može da se radioaktivno obeleži i da se koristi u radioimunotestu (RIA) (vidi, na primer, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986).
[0197] Radioaktivni izotop može da se detektuje, na primer, korišćenjem γ-brojača ili scincilacionog brojača, ili radioautografski.
Farmaceutske smeše
[0198] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje smešu, npr., farmaceutsku smešu koja sadrži jedno ili kombinaciju monoklonskih antitela, ili njihovog antigen vezujućeg dela, predmetnog pronalaska, formulisane zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve smeše mogu da uključuju jedno ili kombinaciju (npr., dva ili više različitih) antitela ili imunokonjugata ili bispecifičnih molekule pronalaska. Na primer, farmaceutska smeša pronalaska može da sadrži kombinaciju antitela (ili imunokonjugata ili bispecifičnih molekula) koji se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili koji imaju kompelementarne aktivnosti.
[0199] Farmaceutske smeše pronalaska mogu da se primene i u kombinacionoj terapiji, tj., u kombinaciji sa drugim sredstvima. Na primer, kombinaciona terapija može da uključuje antiglipikan-3 antitelo predmetnog pronalaska u kombinaciji sa najmanje jednim drugim antiinflamatornim ili imunosupresivnim sredstvom. Primeri terapijskih sredstava koja mogu da se koriste u kombinacionoj terapiji opisani su detaljnije dole, u odeljku o upotrebama antitela pronalaska.
[0200] Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje svaki i sve rastvarače, disperzione medijume, sredstva za oblaganje, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonična sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slično koja su fiziološki prihvatljiva. Poželjno, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr., injekcijom ili infuzijom). Zavisno od puta primene, aktivno jedinjenje tj., antitelo, imunokonjugat ili bispecifični molekul, može biti obloženo materijalom koji će zaštititi jedinjenje od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji bi mogli da inaktiviraju jedinjenje.
[0201] Farmaceutska jedinjenja pronalaska mogu uključivati jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost roditeljskog jedinjenja i ne daje nikakve toksične efekte (vidi, npr., Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one koje su izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina, kao što su alifatične mono- i dikarboksilne kiseline, fenil-supstituisane alkanske kiseline, hidroksialkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one koje su izvedene iz zemno-alkalnih metala kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoksičnih organskih amina, kao što su N,N’-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.
[0202] Farmaceutska smeša pronalaska takođe može uključivati farmaceutski prihvatljivi antioksidant. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanata uključuju: (1) antioksidante rastvorljive u vodi, kao što su askorbinska kiselina, cistein-hidrohlorid, natrijum-bisulfat, natrijum-metabisulfit, natrijum-sulfit i slično; (2) antioksidante rastvorljive u ulju, kao što su askorbil-palmitat, butilisani hidroksianizol (butylated hydroxyanisole, BHA), butilisani hidroksitoluen (butylated hydroxytoluene, BHT), lecitin, propil-galat, alfa-tokoferol i slično; i (3) metal-helirajuća sredstva, kao što su limunska kiselina, etilendiamintetrasirćetna kiselina (ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina i slično.
[0203] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji mogu da se upotrebe u farmaceutskim smešama pronalaska uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen-glikol, polietilen-glikol i slično), i njihove pogodne mešavine, biljna ulja kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre kao što je etil-oleat. Dobra fluidnost može da se održi, na primer, upotrebom materijala za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata.
[0204] Ove smeše mogu sadržati i adjuvanse kao što su prezervansi, sredstva za vlaženje, emulgujuća sredstva i dispergujuća sredstva. Prevencija prisustva mikroorganizama može da se osigura postupcima sterilizacije, gore, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antigljivičnih sredstava, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol-sorbinske kiseline, i slično. Može takođe biti poželjno da se u smeše uključe izotonična sredstva, kao što su šećeri, natrijum-hlorid i slično. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može da se ostvari uključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju kao što su aluminijum-monostearat i želatin.
[0205] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za trenutno pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance poznata je u struci. Osim ako nije pokazano da je neki od uobičajenih medijuma inkompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihova upotreba u farmaceutskim smešama pronalaska. Dopunska aktivna jedinjenja takođe mogu da se inkorporišu u smeše.
[0206] Terapijske smeše tipično moraju biti sterilne i stabilne pod uslovima izrade i skladištenja. Smeša može da se formuliše u vidu rastvora, mikroemulzije, lipozoma, ili druge uređene strukture pogodne za postizanje visoke koncentracije leka. Nosač može da bude rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen-glikol i tečni polietilen-glikol, i slično), i njihove pogodne mešavine. Dobra fluidnost može da se održi, na primer, upotrebom materijala za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzija i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima biće poželjno u smešu uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole kao što su manitol i sorbitol, ili natrijum-hlorid. Produžena apsorpcija injektabilnih smeša može da se ostvari uključivanjem u smešu sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatin.
[0207] Sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme inkorporisanjem željene količine aktivnog jedinjenja u odgovarajući rastavarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih gore, po potrebi, što je praćeno sterilizacionom mikrofiltracijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni prenosnik koji sadrži bazični disperzioni medijum i druge potrebne sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremanje sterilnih injektabilnih rastvora, poželjni metodi pripremanja su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija), koji daju prah aktivnog sastojka i dodatnih željenih sastojaka iz prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0208] Količina aktivnog sastojka koja može da se kombinuje sa nosačkim materijalom da bi se proizvela jedna dozna forma variraće u zavisnosti od subjekta koji se leči i određenog načina primene. Količina aktivnog sastojka koja može da se kombinuje sa nosačkim materijalom da bi se proizvela jedna dozna forma obično će biti količina smeše koja proizvodi terapijski efekat. Obično, od sto procenata, ova količina će varirati od oko 0.01 procenta do oko devedeset devet procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenta do oko 70 procenata, najpoželjnije od oko 1 procenta do oko 30 procenata aktivnog sastojka, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0209] Dozni režimi podešavaju se tako da obezbede optimalni željeni odgovor (npr., terapijski odgovor). Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti nekoliko podeljenih doza tokom vremena ili doza može proporcionalno da se smanjuje ili povećava zavisno od toga šta nalaže terapijska situacija. Posebnu prednost predstavlja formulisanje parenteralne smeše u vidu jedinične dozne forme, da bi se obezbedile jednostavnost primene i uniformnost doziranja. Jedinična dozna forma kako se ovde koristi, odnosi se na fizički zasebne jedinice podešene kao pojedinačne doze za subjekte koji se leče; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja za koju je izračunato da proizvodi željeni terapijski efekat, udruženu sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za jediničnu doznu formu pronalaska određene su i direktno zavise od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapijskog efekta koji treba da se postigne i (b) ograničenja inherentnih struci spravljanja takvog aktivnog jedinjenja za lečenje senzitivnosti kod pojedinaca.
[0210] Za primenu antitela, dozni opsezi su od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i češće 0.01 do 5 mg/kg, telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu biti 0.3 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u opsegu od 1-10 mg/kg. Primer režima tretmana zahteva primenu jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka 3 meseca ili jednom svakih 3 do 6 meseci. Poželjni režimi doziranja za antiglipikan-3 antitelo pronalaska uključuju 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine, intravenskom primenom, uz to da se antitelo daje korišćenjem jednog od sledećih rasporeda: (i) svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg/kg telesne težine jednom, pa zatim 1 mg/kg telesne težine svake tri nedelje.
[0211] U nekim metodima, dva ili više monoklonskih antitela sa različitim vezujućim specifičnostima primenjuju se simultano, i u tom slučaju je doza svakog primenjenog antitela u navedenim opsezima. Antitelo se obično primenjuje u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu biti, na primer, nedeljno, mesečno, svaka tri meseca, ili godišnje. Intervali mogu da budu i nepravilni, zavisno od nivoa antitela za ciljni antigen, izmerenih u krvi pacijenta. U nekim metodima, doziranje se podešava tako da se postigne koncetracija antitela u plazmi od oko 1-1000 μg/ml, a u nekim metodima oko 25-300 μg /ml.
[0212] Alternativno, antitelo može da se primeni u formulaciji sa odloženim oslobađanjem, u tom slučaju je potrebna manje česta primena. Doza i frekvencija variraju u zavisnosti od poluživota antitela u pacijentu. Obično, humana antitela pokazuju najduži poluživot, zatim humanizovana antitela, himerna antitela i nehumana antitela. Doza i frekvencija primene mogu varirati u zavisnosti od toga da li je tretman profilaktički ili terapijski. U profilaksi primenjuje se relativno niska doza, u relativno retkim intervalima, tokom dugog vremenskog perioda. Neki pacijenti nastavljaju da primaju tretman doživotno. U terapiji, ponekad je potrebno davanje relativno visoke doze u relativno kratkim intervalima, dok se napredovanje bolesti ne uspori ili okonča i, poželjno, dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno ublažavanje simptoma bolesti. Posle toga pacijent može da prima profilaktički režim.
[0213] Aktuelni dozni nivoi aktivnih sastojaka u farmaceutskim smešama predmetnog pronalaska mogu da se menjaju tako da se dobije količina aktivnog sastojka efikasna u postizanju željenog terapijskog odgovora za određenog pacijenta, smešu i način primene, bez toksičnosti po pacijenta. Odabrani dozni nivo zavisiće od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost određenih upotrebljenih smeša predmetnog pronalaska, ili njihovih estara, soli ili amida, puta primene, vremena primene, stope ekskrecije određenog upotrebljenog jedinjenja, dužine tretmana, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala upotrebljenih u kombinaciji sa određenim upotrebljenim smešama, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u medicinskoj struci.
[0214] "Terapijski efikasna doza" antiglipikan-3 antitela pronalaska poželjno za rezultat ima smanjenje jačine simptoma bolesti, porast frekvencije i dužine perioda u kojima nema simptoma bolesti, ili sprečavanje ometenosti ili onesposobljenosti usled naleta bolesti. Na primer, za lečenje tumora koji su glipikan-3+, "terapijski efikasna doza" poželjno inhibira rast ćelija ili rast tumora za najmanje oko 20%, poželjnije za najmanje oko 40%, još poželjnije za najmanje oko 60%, i još poželjnije za najmanje oko 80% u odnosu na nelečene subjekte. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može da se procenjuje u animalnim model-sistemima kojima se predviđa efikasnost u humanim tumorima. Alternativno, ova osobina smeše može da se proceni ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija, takva inhibicija mže da se meri in vitro testovima koji su poznati obučenom stručnjaku. "Terapijski efikasna količina terapijskog jedinjenja" može da smanji veličinu tumora, ili da na drugi način ublaži simptome kod subjekta. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti moći će da odredi tu količinu na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, jačina subjektovih simptoma i posebna odabrana smeša ili put primene.
[0215] Smeša predmetnog pronalaska može da se primeni preko jednog ili više puteva primene, korišćenjem jednog ili više metoda primene poznatih u struci. Kao što će obučeni stručnjak razumeti, put i/ili način primene zavisiće od željenih rezultata. Poželjni putevi primene za antitela pronalaska uključuju intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, subkutani, spinalni ili druge parenteralne puteve primene, na primer, injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralna primena", kako se koristi u ovom tekstu, označava načine primene različite od enteralne i površinske primene, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničavanja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.
[0216] Alternativno, antitelo pronalaska može da se primeni neparenteralnim putem kao što su površinski, epidermalni ili mukozni put primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno, ili površinski.
[0217] Aktivna jedinjenja mogu da se pripreme sa nosačima koji će zaštiti jedinjenje od brzog razlaganja, to su na primer, formulacije sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane dostavne sisteme. Mogu da se koriste biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen-vinil- acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Patentirani su mnogi metodi pripremanja takvih formulacija i opšte su poznati stručnjacima u oblasti. Vidi, npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0218] Terapijske smeše mogu da se primene medicinskim uređajima poznatim u struci. Na primer, u poželjnoj formi, terapijska smeša pronalaska može da se primeni uređajem za hipodermalno injektiranje bez igle, kao što je uređaj objavljen u U.S. Patent No. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implanta i modula korisnih u predmetnom pronalasku uključuju: U.S. Patent No. 4,487,603 koji objavljuje implantabilnu mikroinfuzionu pumpu za dostavu leka kontrolisanom stopom; U.S. Patent No. 4,486,194 koji objavljuje terapijski uređaj za davanje leka kroz kožu; U.S. Patent No. 4,447,233 koji objavljuje infuzionu pumpu za lek, koja dostavlja lek sa preciznom stopom infuzije; U.S. Patent No. 4,447,224 koji objavljuje implantabilni infuzioni aparat sa varijabilnim protokom za kontinuiranu dostavu leka; U.S. Patent No. 4,439,196 koji objavljuje osmotski sistem za dostavu leka, koji ima višekomorne kompartmente; i U.S. Patent No. 4,475,196 koji objavljuje osmotski sistem za dostavu leka. Mnogi drugi takvi implanti, dostavni sistemi i moduli poznati su stručnjacima u oblasti.
[0219] U određenim formama, humana monoklonska antitela pronalaska mogu da se formulišu da bi se osigurala dobra distribucija in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (blood-brain barrier, BBB) isključuje mnoga visokohidrofilna jedinjenja. Da bi se osiguralo da će terapijska jedinjenja pronalaska proći BBB (ako se to želi), ona mogu da se formulišu, na primer, u lipozome. Za metode izrade lipozoma vidi, npr., U.S. Patents 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jednu ili više komponenti koje se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, čime se pojačava ciljana dostava leka (vidi, npr., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Primeri ciljajućih komponenti uključuju folat ili biotin (vidi, npr., U.S. Patent 5,416,016, Low et al.); manozide (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antitela (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); surfaktantni protein-A receptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vidi i K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; LJ. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
Upotrebe i metodi
[0220] Antitela, posebno humana antitela, smeše antitela i metodi predmetne objave imaju brojne in vitro i in vivo dijagnostičke i terapijske upotrebe, uključujući dijagnozu i lečenje poremećaja posredovanih glipikanom-3. Na primer, ovi molekuli mogu da se primene na ćelijama u kulturi, in vitro ili ex vivo, ili na humanim subjektima, npr., in vivo, za lečenje, prevenciju i dijagnostikovanje različitih poremećaja. Kako se koristi u ovom tekstu, pojam "subjekt" treba da uključi humane ili nehumane životinje. Nehumane životinje uključuju sve vertebrate, npr., sisare i nesisare, kao što su nehumani primati, ovce, psi, mačke, krave, konji, pilići, vodozemci i gmizavci. Poželjni subjekti uključuju humane pacijente koji imaju poremećaje posredovane aktivnošću glipikana-3. Metodi su posebno pogodni za lečenje humanih pacijenata koji imaju poremećaj udružen sa aberantnom ekspresijom glipikana-3. Kada se antitela na glipikan-3 primene zajedno sa drugim sredstvom, ova dva se mogu primenjivati redom ili simultano.
[0221] Imajući u vidu specifično vezivanje antitela pronalaska za glipikan-3, antitela pronalaska mogu da se koriste za specifično detektovanje ekspresije glipikana-3 na površini ćelija i, pored toga, mogu da se koriste za prečišćavanje glipikana-3 imunoafinitetnim metodom.
[0222] Pored toga, s obzirom na ekspresiju glipikana-3 na tumorskim ćelijama jetre, humana antitela, smeše antitela i metodi predmetne objave mogu da se koriste za lečenje subjekta sa tumorogenim poremećajem jetre, npr., poremećajem koji se karakteriše prisustvom tumorskih ćelija koje eksprimiraju glipikan-3, uključujući, na primer, HCC ćelije.
[0223] U jednoj formi, antitela (npr., humana monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i smeše) pronalaska mogu da se upotrebe za detektovanje nivoa glipikana-3 ili nivoa ćelija koje sadrže glipikan-3 na površini svoje membrane, a ti nivoi onda mogu da se povežu sa određenim simptomima bolesti. Alternativno, antitela mogu da se koriste za inhibiranje ili blokiranje funkcije glipikana-3, što zatim može da se poveže sa prevencijom ili ublažavanjem određenih simptoma bolesti, čime se implicira uloga glipikana-3 kao medijatora oboljenja. Ovo može da se postigne dovođenjem u kontakt uzorka i antiglipikan-3 antitela, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa antitela i glipikana-3. Svi kompleksi antitela i glipikana-3 koji se formiraju u uzorku i kontroli detektuju se i upoređuju.
[0224] U sledećoj formi, antitela (npr., humana monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i smeše) pronalaska mogu da se inicijalno testiraju u pogledu vezujuće aktivnosti udružene sa terapijskom i dijagnostičkom upotrebom in vitro. Na primer, smeše pronalaska mogu da se testiraju korišćenjem testova protočne citometrije opisanih u Primerima, dole.
[0225] Antitela (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli, imunokonjugati i smeše) pronalaska mogu dodatno da se upotrebe u terapiji i dijagnostikovanju bolesti povezanih sa glipikanom-3. Na primer, humana monoklonska antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli i imunokonjugati mogu da se koriste za in vivo ili in vitro pobuđivanje jedne ili više sledećih bioloških aktivnosti: inhibicija rasta i/ili ubijanje ćelija koje eksprimiraju glipikan-3; posredovanje u fagocitozi ili ADCC ćelija koje eksprimiraju glipikan-3 u prisustvu humanih efektorskih ćeelija ili blokiranje glipikan-3 liganda da se veže za glipikan-3.
[0226] U posebnoj formi, antitela (npr., humana monoklonska antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i smeše) koriste se in vivo za lečenje, prevenciju ili dijagnostikovanje različitih bolesti povezanih sa glipikanom-3. Primeri bolesti povezanih sa glipikanom-3 uključuju, između ostalih, HCC i druge kancere jetre.
[0227] Pogodni putevi primene smeša antitela (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) pronalaska in vivo i in vitro dobro su poznati u struci i može ih odabrati prosečno obučeni stručnjak. Na primer, smeše antitela mogu da se primene injekcijom (npr., intravenski ili subkutano). Pogodne upotrebljene doze molekula zavisiće od starosti i težine subjekta i koncentracije i/ili formulacije smeše antitela.
[0228] Kako je ranije opisano, humana antiglipikan-3 antitela pronalaska mogu da se daju istovremeno sa jednim ili više drugih terapijskih sredstava, npr., citotoksičnim sredstvom, radiotoksičnim sredstvom, ili imunosupresivnim sredstvom. Antitelo može da bude povezano sa sredstvom (kao imunokompleks) ili može da se daje odvojeno od sredstva. U ovom drugom slučaju (zasebna primena), antitelo može da se daje pre, posle ili istovremeno sa sredstvom ili može da se daje uporedo sa drugim sredstvom ili može da se daje istovremeno sa drugim poznatim terapijama, npr., antikancerskom terapijom, npr., zračenjem. Takva terapijska sredstva uključuju, između ostalih, antineoplastična sredstva kao što su doksorubicin (adriamicin), cisplatin, bleomicin-sulfat, karmustin, hlorambucil i ciklofosfamid-hidroksiureu, koji su sami efikasni jedino u nivoima koji su toksični ili subtoksični za pacijenta. Cisplatin se intravenski primenjuje kao doza od 100 mg/kg, jednom svake četiri nedelje, a adriamicin se intravenski primenjuje kao doza od 60-75 mg/ml, na 21 dan. Istovremena primena humanih antiglipikan-3 antitela, ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, predmetnog pronalaska sa hemoterapijskim sredstvima obezbeđuje dva antikancerska sredstva koja deluju različitim mehanizmima, čime se ostvaruje citotoksični efekat na humane tumorske ćelije. Takva istovremena primena može da reši probleme koji se javljaju usled rezistencije na lekove ili promene antigenosti tumorskih ćelija što čini da ne reaguju sa antitelom.
[0229] Ciljno-specifične efektorske ćelije, npr., efektorske ćelije vezane za smeše (npr., humana antitela, multispecifične i bispecifične molekule) pronalaska takođe mogu da se koriste kao terapijska sredstva. Efektorske ćelije za ciljanje mogu biti humani leukociti kao što su makrofagi, neutrofili ili monociti. Druge ćelije uključuju eozinofile, ćelije prirodne ubice, i druge ćelije koje nose receptor za IgG ili IgA. Po želji, efektorske ćelije mogu da se dobiju od subjekta koji se leči. Ciljno-specifične efektorske ćelije mogu da se daju u vidu ćelijske suspenzije u fiziološki prihvatljivom rastvoru. Broj primenjenih ćelija može biti reda veličine 108-109, ali variraće u zavisnosti od terapijske svrhe. Uopšteno, količina će biti dovoljna da se dobije lokalizacija na ciljnoj ćeliji, npr., tumorskoj ćeliji koja eksprimira glipikan-3 i da se utiče na ubijanje ćelije, npr., fagocitozom. Putevi primene takođe mogu varirati.
[0230] Terapija ciljno-specifičnim efektorskim ćelijama može da se obavlja zajedno sa drugim tehnikama uklanjanja ciljnih ćelija. Na primer, antitumorska terapija koja koristi smeše (npr., humana antitela, multispecifične i bispecifične molekule) pronalaska i/ili efektorske ćelije "naoružane" ovim smešama, mogu da se koriste zajedno sa hemoterapijom. Dodatno, kombinovana imunoterapija može da se upotrebi za usmeravanje dve različite citotoksične efektorske populacije ka odbacivanju tumorske ćelije. Na primer, antiglipikan-3 antitela povezana sa anti-Fc-gama RI ili anti-CD3 mogu da se koriste zajedno sa IgG- ili IgA-receptor-specifično vezujućim sredstvima.
[0231] Bispecifični i multispecifični molekuli pronalaska mogu da se koriste i za modulaciju nivoa FcγR ili FcγR na efektorskim ćelijama, na primer kaptiranjem i eliminacijom receptora na površini ćelije. Mešavine anti-Fc receptora takođe mogu da se koriste i za tu svrhu.
[0232] Smeše (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) pronalaska koji imaju mesta za vezivanje komplementa, kao što su delovi IgG1, -2, ili -3 ili IgM, koji se vezuju sa komplementom, takođe mogu da se koriste u prisustvu komplementa. U jednoj formi, ex vivo tretman populacije ćelija koja sadrži ciljne ćelije, vezujućim sredstvom pronalaska i odgovarajućim efektorskim ćelijama može da se dopuni dodavanjem komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ciljnih ćelija obloženih vezujućim sredstvom pronalaska može da se poboljša vezivanjem proteina komplementa. U drugoj formi ciljne ćelije obložene smešama (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) pronalaska mogu da se liziraju komplementom. U još jednoj formi, smeše pronalaska ne aktiviraju komplement.
[0233] Smeše (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) pronalaska mogu da se primene i zajedno sa komplementom. U nekim formama, sadašnja objava obezbeđuje smeše koje sadrže humana antitela, multispecifične ili bispecifične molekule i serum ili komplement. Ove smeše mogu biti pogodne kada je kompelement lociran u blizini humana antitela, multispecifičnih ili bispecifičnih molekula. Alternativno antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli pronalaska i komplement ili serum mogu da se primenjuju odvojeno.
[0234] Predmetni pronalazak obuhvata i kitove koji sadrže smeše antitela pronalaska (npr., humana antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli ili imunokonjugati) i uputstva za upotrebu. Kit može sadržati i jedan ili više dodatnih reagenasa, kao što su imunosupresivni reagens, citotoksično sredstvo ili radiotoksično sredstvo, ili jedno ili više dodatnih humanih antitela pronalaska (npr., humano antitelo sa komplementarnom aktivnošću, koje se vezuje za epitop na glipikan-3 antigenu različit od prvog humanog antitela).
[0235] Prema tome, pacijenti koji se leče smešama antitela pronalaska mogu dodatno primati (pre, istovremeno ili posle primene humanog antitela pronalaska) drugo terapijsko sredstvo kao što je citotoksično ili radiotoksično sredstvo, koje pojačava ili naglašava terapijski efekat humanih antitela.
[0236] U drugim formama, subjekt može dodatno biti tretiran sredstvom koje moduliše, npr., pojačava ili inhibira, ekspresiju ili aktivnost Feγ ili Fcγ receptora, na primer, subjekt može da se tretira citokinom. Poželjni citokini za primenu tokom tretmana multispecifičnim molekulom uključuju faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF), faktor stimulacije kolonija granulocita-makrofaga (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) i faktor nekroze tumora (TNF).
[0237] Smeše (npr., humana antitela, multispecifični i bispecifični molekuli) pronalaska mogu da se koriste i za ciljanje ćelija koje eksprimiraju FcγR ili glipikan-3, na primer za obeležavanje tih ćelija. Za takvu upotrebu, vezujuće sredstvo može da se poveže sa detektabilnim molekulom. Prema tome, pronalazak obezbeđuje metod lokalizovanja ex vivo ili in vitro ćelija koje eksprimiraju Fc receptore kao što su FcγR, ili glipikan-3. Detektabilni obeleživač može da bude, npr., radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim ili enzimski kofaktor.
[0238] U posebnoj formi, pronalazak obezbeđuje metode detektovanja prisustva glipikan-3 antitgena u uzorku ili merenje količine glipikan-3 antigena, koji uključuju dovođenje u kontakt uzorka i kontrolnog uzorka sa humanim monoklonskim antitelom ili njegovim antigen-vezujućim delom, koji se specifično vezuju za glipikan-3, pod uslovima koji dopuštaju formiranje kompleksa između antitela, ili njegovog dela, i glipikana-3. Zatim se detektuje formiranje kompleksa, pri čemu razlika u formiranju kompleksa između uzorka i kontrolnog uzorka ukazuje na prisustvo glipikan-3 antigena u uzorku.
[0239] U drugom aspektu, objava obezbeđuje metode lečenja poremećaja posredovanih glipikanom-3 kod subjekta, npr., HCC i drugih kancera jetre.
[0240] U još jednoj formi, imunokonjugati pronalaska mogu da se koriste za usmeravanje jedinjenja (npr., terapijskih sredstava, obeleživača, citotoksina, radiotoksina, imunosupresanata itd.) ka ćelijama koje imaju glipikan-3 receptore na površini, vezivanjem takvih jedinjenja za antitelo. Na primer, antiglipikan-3 antitelo može da se konjuguje sa bilo kojim od toksinskih jedinjenja opisanih u US Patent No. 6, 281, 354 i 6,548,530, US patent publication No. 20030050331, 20030064984, 20030073852, i 20040087497, ili objavljenih u WO 03/022806. Prema tome, objava takođe obezbeđuje metode lokalizovanja ex vivo ili in vivo ćelija koje eksprimiraju glipikan-3 (npr., detektabilnim obeleživačem, kao što su radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim ili enzimski kofaktor). Alternativno, imunokonjugati mogu da se upotrebe za ubijanje ćelija koje imaju glipikan-3 receptore na površini, usmeravanjem citotoksina ili radiotoksina ka glipikanu-3.
[0241] Predmetni pronalazak je dodatno ilustrovan sledećim primerima koji ne treba da budu shvaćeni kao da ograničavaju pronalazak.
PRIMERI
Primer 1: Stvaranje humanih monoklonskih antitela na glipikan-3
Antigen
[0242] Napravljen je rekombinantni fuzioni protein glipikan-3-his koji sadrži vanćelijski domen glipikan-3 proteina, povezan sa neglipikan-3 polipeptidom, histidinskim obeleživačem (tag). Glipikan-3-his je napravljen standardnim rekombinantnim metodima i upotrebljen kao antigen za imunizaciju. Pored toga, CHO ćelije transfektovane glipikan-3-Myc ekspresionim konstruktom i ćelijska linija, Hep-G2, upotrebljene su kao antigeni za imunizaciju.
Transgeni HuMAb Mouse® i KM Mouse®
[0243] Potpuno humana monoklonska antitela na glipikan-3 pripremljena su korišćenjem HCo17 soja transgenih HuMAb Mouse® i KM soja transgenih transhromozomskih miševa, od kojih svaki eksprimira gene humanih antitela. HCo17 soj konstruisan je kako je opisano u WO/2005/058815. KM soj konstruisan je kako je opisano u WO 02/43478.
Imunizacije HuMab miša i KM miša
[0244] Da bi se stvorila potpuno humana monoklonska antitela na glipikan-3, miševi HuMAb Mouse® i KM Mouse® imunizovani su glipikan-3-his proteinom eksprimiranim u CHO-S ćelijama, CHO ćelijama koje eksprimiraju glipikan-3-Myc protein, i Hep-G2 ćelijama. Opšte šeme imunizacije HuMAb Mouse® opisane su u Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 i PCT Publication WO 98/24884. U vreme prve infuzije antigena miševi su bili stari 6-16 nedelja. Prečišćeni rekombinantni preparat (5-25 μg) glipikan-3 fuzionog proteina ili ćelija koje eksprimiraju glipikan-3 (1 x 107 ćelija) upotrebljeni su za imunizovanje svakog HuMab mouse® i KM mouse®.
[0245] Transgeni miševi imunizovani su antigenom u kompletnom Freund-ovom adjuvansu ili Ribi adjuvansu, intraperitonealno (IP), subkutano (Sc) ili preko stopalnih jastučića (foot pad, FP), što je praćeno IP, Sc ili FP imunizacijama na 3-21 dana (do ukupno 12 imunizacija) antigenom u nekompletnom Freund-ovom adjuvansu ili Ribi adjuvansu. Imuni odgovor je praćen analizama krvi uzete retroorbitalnim putem. Plazma je pretraživana ELISA testom (kako je opisano dole) i FACS-om, i miševi sa dovoljnim titrom antiglipikan-3 humanih imunoglobulina korišćeni su za fuzije. Kod miševa je izvršeno pojačanje imunske reakcije antigenom, 3 i 2 dana pre žrtvovanja i izolovanja slezine. Tipično, izvedeno je između deset i 35 fuzija za svaki antigen. Nekoliko tuceta miševa imunizovano je za svaki antigen.
Selekcija HuMab Mouse® ili KM Mouse® koji proizvode antiglipikan-3 antitela
[0246] Da bi se izvršila selekcija HuMab Mouse® ili KM Mouse® koji proizvode antiglipikan-3 antitela koja se vezuju za glipikan-3, serumi imunizovanih miševa testiraju se pomoću ELISA kako su opisali Fishwild, D. et al. (1996) (gore). Ukratko mikrotitarske ploče se oblože prečišćenim rekombinantnim glipikanom-3 u koncentraciji od 1-2 μg/ml u PBS, 50 μl/bunarčiću, inkubiraju na 4°C preko noći, zatim blokiraju sa 200 μl/bunarčiću 5% pilećeg seruma u PBS/Tween (0.05%). Razblaženja plazme miševa imunizovanih glipikanom-3 dodaju se u svaki bunarčić i inkubiraju 1-2 sata na temperaturi okoline. Ploče se isperu pomoću PBS/Tween i zatim inkubiraju sa kozjim antihumanim IgG-Fc poliklonskim antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena (horseradish peroxidase, HRP), 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja, ploče se razvijju ABTS supstratom (Sigma, A-1888, 0.22 mg/ml) i analiziraju spektrofotometrom na OD 415-495.
[0247] Serumi imunizovanih miševa dalje se pretražuju protočnom citometrijom u pogledu vezivanja za ćelijsku liniju koja eksprimira rekombinantni humani glipikan-3. Ukratko, vezivanje antiglipikan-3 antitela procenjuje se inkubiranjem glipikan-3-eksprimirajućih CHO ćelija sa antiglipikan-3 antitelom pri razblaženju 1:20. Ćelije se isperu i vezivanje se detektuje FITC-obeleženim anti-humanim IgG Ab. Analize protočnom citometrijom obavljaju se korišćenjem FACScan protočnog citometra (Becton Dickinson, San Jose, CA). Miševi koji su razvili najviše titre antiglipikan-3 antitela koriste se za fuzije. Fuzije se obavljaju kako je opisano dole i supernatanti hibridoma testiraju se na antiglipikan-3-aktivnost pomoću ELISA i FACS.
Stvaranje hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela na glipikan-3
[0248] Mišji splenociti izolovani iz HuMab mouse® ili KM mouse®, fuzionišu se korišćenjem elektrofuzije na bazi električnog polja, pomoću Cyto Pulse velikokomornog fuzionog elektroporatora (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Dobijeni hibridomi pretražuju se u pogledu proizvodnje antigen-specifičnih antitela. Pojedinačno-ćelijske suspenzije slezinskih limfocita iz imunizovanih miševa fuzionišu se sa SP2/0 nesekretujućim mišjim mijeloma ćelijama (ATCC, CRL 1581), korišćenjem elektrofuzije na bazi električnog polja, pomoću Cyto Pulse velikokomornog fuzionog elektroporatora (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Ćelije se zaseju, pri gustini od približno 1 x 104 ćelija/bunarčiću, na mikrotitarske ploče sa ravnim dnom, posle čega sledi oko dve nedelje inkubacije u selektivnom medijumu koji sadrži 10% fetalni goveđi serum, 10% P388D1 (ATCC, CRL TIB-63) kondicionirani medijum, 3-5% origen (IGEN) u DMEM (Mediatech, CRL 10013, sa visokim sadržajem glukoze, L-glutaminom i natrijum-piruvatom) plus 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-merkaptoetanol, 50 mg/ml gentamicina i 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Posle 1-2 nedelje, ćelije se kultivišu u medijumu u kojem je HAT zamenjen sa HT. Pojedinačni bunarčići se zatim pregledaju pomoću ELISA i FACS (opisano gore) na prisustvo humanih antiglipikan-3 monoklonskih IgG antitela. Kada dođe do ekstenzivnog rasta hibridoma, prati se medijum, obično posle 10-14 dana. Hibridomi koji sekretuju antitela se ponovo zaseju, ponovo pretražuju i ako su i dalje pozitivni na humane IgG, antiglipikan-3 monoklonska antitela, subkloniraju se najmanje dva puta metodom ograničavajućeg razblaženja. Stabilni subklonovi se kultivišu in vitro da se stvore male količine antitela u medijumu za kulturu tkiva, za dalju karakterizaciju.
[0249] Hibridoma klonovi 4A6, 11E7, i 16D10, napravljeni od HuMAb Mouse®, odabrani su za dalju analizu.
Primer 2: Strukturna karakterizacija humanih monoklonskih antitela 4A6, 11E7 i 16D10
[0250] cDNA sekvence koje kodiraju varijabilne regione lakih i teških lanaca 4A6, 11E7, i 16D10 monoklonskih antitela dobijene su iz 4A6, 11E7 i 16D10 hibridoma, respektivno, korišćenjem standardnih tehnika PCR i sekvencionirane su korišćenjem standardnih tehnika sekvencioniranja DNK.
[0251] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 4A6 prikazane su na Slici 1A i u SEQ ID NO:25 odnosno 19.
[0252] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 4A6 prikazane su na Slici 1B i u SEQ ID NO:28 odnosno 22.
[0253] Upoređivanje 4A6 teškolančane imunoglobulinske sekvence sa poznatim teškolančanim imunoglobulinskim sekvencama humane germinativne linije pokazuje da teški lanac 4A6 koristi VH segment iz VH 5-51 humane germinativne linije i JH segment iz JH4b humane germinativne linije. Poravnavanje 4A6 VH sekvence sa VH 5-51 sekvencom germinativne linije pokazano je na Slici 4. Dodatna analiza 4A6 VH sekvence korišćenjem Kabat-ovog sistema determinacije CDR regiona dovela je do delineacije teškolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona, kako je pokazano na Slikama 1A i 4, i u SEQ ID NO:1, 4 i 7, respektivno.
[0254] Upoređivanje 4A6 lakolančane imunoglobulinske sekvence sa poznatim imunoglobulinskim lakolančanim sekvencama humane germinativne linije pokazalo je da 4A6 laki lanac koristi VL segment iz VK A27 humane germinativne linije i JK segment iz JK4 humane germinativne linije. Poravnavanje 4A6 VL sekvence sa VK A27 sekvencom germinativne linije pokazano je na Slici 7. Dodatna analiza 4A6 VL sekvence korišćenjem Kabat-ovog sistema determinacije CDR regiona dovela je do delineacije lakolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona, kako je pokazano na Slikama 1B i 7, i u SEQ ID NO:10,13, i 16, respektivno.
[0255] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 11E7 prikazane su na Slici 2A i u SEQ ID NO:26 odnosno 20.
[0256] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 11E7 prikazane su na Slici 2B i u SEQ ID NO:29 odnosno 23.
[0257] Upoređivanje 11E7 teškolančane imunoglobulinske sekvence sa poznatim imunoglobulinskim teškolančanim sekvencama humane germinativne linije pokazalo je da 11E7 teški lanac koristi VH segment iz VH 5-51 humane germinativne linije i JH segment iz JH4b humane germinativne linije. Poravnavanje 11E7 VH sekvence sa VH 5-51 sekvencom germinativne linije prikazano je na Slici 5. Dodatna analiza 11E7 VH sekvence korišćenjem Kabat-ovog sistema determinacije CDR regiona dovela je do delineacije teškolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona, kako je prikazano na Slikama 2A i 5, i u SEQ ID NO:2, 5 i 8, respektivno.
[0258] Upoređivanje 11E7 lakolančane munoglobulinske sekvence sa poznatim imunoglobulinskim lakolančanim sekvencama humane germinativne linije pokazalo je da 11E7 laki lanac koristi VL segment iz VK A27 humane germinativne linije i JK segment iz JK4 humane germinativne linije. Poravnavanje 11E7 VL sekvence sa VK A27 sekvencom germinativne linije prikazano je na Slici 8. Dodatna analiza 11E7 VL sekvence korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR regiona dovela je do delineacije lakolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona, kako je prikazano na Slikama 2B i 8, i u SEQ ID NO:11, 14 i 17, respektivno.
[0259] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 16D10 prikazane su na Slici 3A i u SEQ ID NO:27 odnosno 21.
[0260] Nukleotidna i aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 16D10 prikazane su na Slici 3B i u SEQ ID NO:30 odnosno 24.
[0261] Upoređivanje 16D10 teškolančane imunoglobulinske sekvence sa poznatim imunoglobulinskim teškolančanim sekvencama humane germinativne linije pokazalo je da 16D10 teški lanac koristi VH segment iz VH 5-51 humane germinativne linije i JH segment iz JH4b humane germinativne linije. Poravnavanje 16D10 VH sekvence sa VH sekvencom 5-51 humane germinativne linije prikazano je na Slici 6. Dodatna analiza 16D10 VH sekvence korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR regiona, dovela je do delineacije teškolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona, kako je prikazano na Slikama 3A i 6, i u SEQ ID NO:3, 6 i 9, respektivno.
[0262] Upoređivanje 16D10 lakolančane imunoglobulinske sekvence sa poznatim imunoglobulinskim teškolančanim sekvencama humane germinativne linije pokazalo je da 16D10 laki lanac koristi VL segment iz VK A27 humane germinativne linije i JK segment iz JK1 humane germinativne linije. Poravnavanje 16D10 VL sa VK A27 sekvencom prikazano je na Slici 9. Dodatna analiza 16D10 VL sekvence korišćenjem Kabat-ovog sistema determinisanja CDR regiona dovela je do delineacije lakolančanih CDR1, CDR2 i CD3 regiona, kako je prikazano na Slikama 3B i 9 i u SEQ ID NO:12, 15 i 18, respektivno.
Primer 3: Karakterizacija vezujuće specifičnosti i kinetike vezivanja antiglipikan-3 humanih monoklonskih antitela
[0263] U ovom primeru, afinitet vezivanja, kinetika i specifičnost antiglipikan-3 antitela ispitivane su Biacore analizom i protočnom citometrijom.
Afinitet vezivanja i kinetika
[0264] Antiglipikan-3 antitela okarakterisana su u pogledu afiniteta i kinetike vezivanja Biacore analizom (Biacore AB, Uppsala, Sweden). Glipikan-3 je kovalentno povezan sa CM5 čipom (karboksimetil-dekstranom obloženi čip), preko primarnih amina, korišćenjem standardne hemije aminskog kuplovanja, a kit je obezbeđen od Biacore. Vezivanje je mereno protokom serije koncentracija antiglipikan-3 monoklonskih antitela u HBS-EP puferu (Biacore AB), pri koncentracijama od 20, 10,5, 2.5 i 1.25 μg/ml i stopi protoka od 40 μl/min. Pozadinsko vezivanje određeno je propuštanjem serija koncetracija IgG1 preko istog čipa. Kinetika udruživanja antigen-antitelo praćena je tokom 3 minuta, a kinetika disocijacije praćena je tokom 10 minuta. Krive asocijacije i disocijacije podešene su na 1:1 Langmuir-ovim modelom vezivanja uz korišćenje BIAevaluation softvera (Biacore AB). KD, kon i koff vrednosti zatim su određene kako je prikazano u Tabeli 1.
Tabela 1: Podaci za Biacore vezivanje, za antiglipikan-3 monoklonska antitela
Antiglipikan-3 antitelo
Afinitet KD x 10-9 (M)
Stopa asoc. kon x 106 (1/Ms)
Stopa disoc. koff x 10-4 1/s
4A6
0.20
1.6
3.2
16D10
0.31
1.8
5.4
11E7
0.40
1.8
7.3
Afinitet vezivanja meren pomoću FACS
[0265] Korišćenjem testa sortiranja fluorescencijom aktiviranih ćelija (fluorescence activated cell sorter, "FACS"), pokazano je da se antiglipikan-3 antitela vezuju za ćelijske površinske glipikan-3 proteine sa visokim afinitetom. HCC ćelijska linija Hep-3B doda se u gustini od 2 x 105 ćelija u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića. 4A6, 11E7, i 16D10 monoklonska antitela dodaju se u početnoj koncentraciji od 20 μg/ml i serijski se razblaže 1:3. Ćelije se isperu i vezivanje se detektuje pomoću FITC-obeleženog anti-humanog IgG Ab. Protočno-citometrijske analize obavljaju se korišćenjem FACSCalibur protočnog citometra (Becton Dickinson, San Jose, CA). Dobijeni afiniteti vezivanja, uneti kao srednji intenzitet fluorescencije (mean fluorescence intensity, "MFI"), pokazani su na Slici 10. Vezujući afinitet antitela vezuje ih za HCC ćelije na koncentraciono-zavisan način. Efikasna koncentracija (effective concentration, "EC50") za svako antitelo određuje se kao koncentracija koja za rezultat ima srednji intenzitet fluorescencije ("MFI") od 50%. U ovom primeru, najjači vezujući afinitet zapažen je sa 4A6 antitelom, koje pokazuje MFI od 0.83. Sledeći najbolji zapaženi afinitet je za 16D10, koji je imao EC50 od 1.39. Najniži zapaženi afinitet od tri antitela bio je za 11E7, koje je imalo EC50 od 1.98.
Vezujuća specifičnost merena pomoću FACS
[0266] Korišćenjem FACS testa pokazano je da se antiglipikan-3 antitela vezuju za ćelijske površinske glipikan-3 proteine sa visokom specifičnošću. HCC ćelijske linije Hep-3B i Hep-G2 rastu u DMEM + 10% FBS u gustini od 1 x 105 ćelija. 4A6, 11E7 i 16D10 monoklonska antitela dodaju se u koncentraciji od 10 μg/ml. Dodatno, tri negativne kontrole analiziraju se za upoređivanje. Ove negativne kontrole su (1) bez bojenja, (2) dodato samo sekundarno antitelo i (3) hIgG1 izotipsko kontrolno antitelo. Ćelije se isperu i vezivanje se detektuje FITC-obeleženim anti-humanim IgG Ab. Protočno-citometrijske analize obavljaju se korišćenjem FACSCalibur protočnog citometra. Slika 11 prikazuje da se antiglipikan-3 antitela vezuju za HCC ćelije sa visokim afinitetom. Nasuprot tome, negativni kontrolni uzorci nisu pokazali vezivanje za HCC ćelije.
[0267] Ćelijska linija ovarijuma kineskog hrčka (CHO) koja stabilno eksprimira glipikan-3 na površini ćelije razvijena je i upotrebljena za određivanje specifičnosti glipikan-3 monoklonskih antitela protočnom citometrijom. CHO ćelije transfektuju se ekspresionim plazmidima koji sadrže cDNK pune dužine, koja kodira glipikan-3. Vezivanje tri antiglipikan-3 monoklonska antitela procenjuje se inkubiranjem transfektovanih ćelija sa svakim od antitela na glipikan-3, u koncentraciji od 10 μg/ml. Ćelije se isperu i vezivanje se detektuje fikoeritrinom obeleženim anti-humanim IgG Ab (BD Biosciences). Sekundarno antitelo samo, koristi se kao negativna kontrola. Rezultati su prikazani na Slici 12. Glipikan-3 monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10 vezala su se za CHO ćelijsku liniju transfektovanu glipikanom-3, ali ne i za roditeljske CHO ćelijske linije. Ovi podaci pokazuju specifičnost monoklonskih antitela za glipikan-3..
Binovanje epitopa antiglipikan-3 monoklonskih antitela putem Biacore
[0268] Binovanje epitopa obavlja se Biacore analizom da bi se odredilo da li se antiglipikan-3 antitela vezuju za preklapajuće epitope. Antitela koja imaju preklapajuće epitope kompetiraće za vezivanje sa glipikanom-3, dok ona sa različitim epitopima neće kompetirati i istovremeno će se vezivati za antigen. Prečišćeni 4A6 i 16D10 imobilišu se na 4000 RU, na CM5 čipu, korišćenjem standardnog protokola aminskog kuplovanja. Glipican-3-his (50 nM) se preinkubira najmanje 1 sat sa 4A6, 11E7, ili 16D10 monoklonskim antitelom pre injektiranja. Koncentracije antitela bile su dvostruka razblaženja počevši od 400 nM. Mešavine antitelo-antigen injektiraju se pri stopi protoka od 5 μl/min, 5 minuta. Svako od 4A6, 11E7 i 16D10 monoklonskih antitela u stanju je da kompetira za vezivanje sa imobilisanim 4A6 i 16D10 antitelima na koncentraciono-zavisan način. Ovo pokazuje da 4A6, 16D10 i 11E7 imaju preklapajuće epitope.
Primer 4: Glipikan-3 antitela vezuju se za kancersko tkivo jetre
[0269] Pokazano je da se antiglipikan-3 monoklonsko antitelo 4A6 vezuje za humana kancerska tkiva jetre. Dobijeni su uzorci biopsije obolelih od kancera jetre i upotrebljena su antitela za imunohistohemijsko bojenje (Cytomyx, MA). Korišćeni su preseci tkiva debljine 5 μm. Posle 30 minuta sušenja na pločici, preseci tkiva se fiksiraju acetonom, na sobnoj temperaturi, 5 minuta. Pločice se isperu u PBS, zatim blokiraju proteinskim blokatorom bez seruma i blokatorom peroksidaze (Dako S2001, CO) i zatim inkubiraju sa kompleksom primarnog antitela, 5 μg/ml, 45 minuta, na sobnoj temperaturi. Pločice se posle toga isperu i inkubiraju 30 minuta sa FITC-konjugovanim sekundarnim antitelom (Jackson Immunoresearch Lab, 109-097-003) i ponovo isperu sa PBS i inkubiraju sa polimernim HRP konjugatima (Dako, CO, K4063), 20 minuta. Hromogen (Dako K3464) se koristi kao supstrat, što kao rezultat daje braon obojenje. Pločice se montiraju u Faramount Aqueous Mounting Media (Dako, S3025). Pokazano je da se 4A6 specifično vezuje za tumorske ćelije jetre. Kako je kao primer dato na Slici 13, 4A6 monoklonsko antitelo specifično boji kancersko tkivo jetre, ali ne i okolno normalno tkivo. Kada se boje monoklonskim antitelima, drugi organi pokazuju negativno ili nespecifično bojenje, a ti organi uključuju uterus, pluća, jetru, bubreg, kolon, cerviks, dojku, kostnu srž, adrenalne žlezde, cerebelum, cerebrum, ezofagus, srce, prostatu, placentu, hipofizu, ovarijum, pankreas, mezotel, pljuvačnu žlezdu, krajnike, kožu, tanko crevo, skeletnu muskulaturu, želudac, slezinu, testis, timus i throideu. Podaci pokazuju da anti-Gpc3 HuMab 4A6 prepoznaje Gcp3 eksprimiran na tumorima jetre.
Primer 5: Aktivnost antiglipikan-3 antitela
[0270] Korišćenjem testa ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela ("ADCC"), pokazano je da monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10 ubijaju Gcp3-pozitivne Hep-G2 ćelije u prisustvu T-ćelija prirodnih ubica.
[0271] Humane efektorske ćelije pripremaju se iz cele krvi na sledeći način. Mononuklearne ćelije periferne krvi čoveka prečiste se iz heparinizovane cele krvi standardnom separacijom na Ficoll-paku. Ćelije se resuspenduju u RPMI 1640 medijumu koji sadrži 10% FBS 200 U/ml humanog IL-2 (PeproTech, NJ) i inkubiraju preko noći na 37°C. Sledećeg dana, ćelije se sakupe i isperu dva puta u RPMI + 1% BSA (testni medijum) i resuspenduju na 1 x 10e6/ml.
[0272] 100 μl ciljnih ćelija, pri 1 x 10e4/bunarčiću, na ploči sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, inkubira se u testnom medijumu preko noći na 37°C. Posle ispiranja ciljnih ćelija, dva puta u testnom medijumu, 100 μl testnog medijuma doda se u svaki bunarčić i inkubira sa 50 μl efektorskih ćelija i 50 μl anti-Gpc3 antitela ili humanog IgG1 kao izotipske kontrole, u finalnoj koncentraciji od 10 μg/ml. Gpc3+ Hep-G2 ćelijska linija testira se na antitelo-specifičnu ADCC za anti-Gpc3 antitela, korišćenjem Takara LDH kita za detekciju citotoksičnosti (Roche, 04744 926001, Switzerland), fluorescentne emisione analize, kako sledi. Ciljna ćelijska linija Hep-G2 inkubira se sa efektorskim ćelijama u odnosu cilja prema efektoru od 1:50. Posle 18 sati inkubacije na 37°C, 100 μl supernatanata sakupi se i prenese na novu ploču sa 96 bunarčića sa ravnim dnom. 100 μl rastvora C doda se u svaki bunarčić i inkubira na sobnoj temperaturi, 30 minuta. Apsorbanca uzoraka na 490 nM meri se pomoću SPECTRAMAX 340 PC (MTX Lab System, VA). % lize određuje se izračunavanjem prosečne apsorbance triplikata i umanjivanjem za vrednost pozadinskog signala.
[0273] Kao što se može videti na Slici 14, svako od 4A6, 11E7 i 16D10 monoklonskih antitela dovodi do specifične lize Hep-3b ćelija T-ćelijama prirodnim ubicama, u poređenju sa hIgG1 izotipskim kontrolnim antitelom.
Primer 6: Internalizacija antiglipikan-3 antitela
[0274] Korišćenjem Hum-Zap testa pokazano je da se monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10 internalizuju u Hep-3b ćelije posle vezivanja za njih. Hum-ZAP test pokazuje internalizaciju antiglipikan-3 monoklonskih antitela preko vezivanja anti-humanih IgG sekundarnih antitela konjugovanih sa toksinom saporinom. (Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100). Prvo, 4A6, 11E7 i 16D10 se vezuju za površinu Hep-3B ćelija. Zatim se Hum-ZAP antitela vezuju za primarna antitela. Zatim se primarno antitelo/Hum-ZAP kompleks internalizuje. Ulaz saporina u ćelije za rezultat ima inhibiciju sinteze proteina i konačno smrt ćeliju.
[0275] Hum-ZAP test sprovodi se na sledeći način. Svaka od ćelija zaseje se pri gustini od 3 x 103 ćelija po bunarčiću. Antiglipikan-3 monoklonska antitela ili izotipski kontrolni humani IgG serijski se razblaže i zatim dodaju ćelijama. Hum-ZAP se zatim doda u koncentraciji od 2 μg/ml i ploče se inkubiraju 96 sati. Vijabilnost ćelija na pločama detektuje se korišćenjem CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay kita (Promega, G7571) i ploče se očitavaju na 490 nm korišćenjem Luminometer (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA). Podaci se analiziraju pomoću Prism (Graphpad). Kao što se može videti na Slici 15, ćelijska smrt je proporcionalna koncentraciji 4A6, 11E7 i 16D10 monoklonskih antitela. Prema tome, antiglipikan-3 monoklonska antitela se efikasno internalizuju u Hep-3b ćelije, u poređenju sa hIgG1 izotipskim kontrolnim antitelom.
[0276] Korišćenjem imunohistohemijskog bojenja takođe je pokazano da se monoklonska antitela 4A6, 11E7 i 16D10 internalizuju u Hep-3b ćelije. Ćelije, sakupljene pomoću rastvora za disocijaciju ćelija, zaseju se pri gustini od 104 ćelija na100 μl medijuma, u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića i inkubiraju sa svakim od monoklonskih antitela u koncentraciji od 5 μg/ml u FACS puferu (PBS + 5% FBS), 30 minuta na ledu. Humana IgG1 izotipska kontrola koristi se kao negativna kontrola. Ćelije se isperu dva puta, resuspenduju u medijumu (100 μl po bunarčiću) i zatim inkubiraju sa kozjim anti-humanim sekundarnim antitelom konjugovanim sa fikoeritrinom (Jackson ImmunoResearch Lab, PA) u razblaženju 1:100, 30 minuta. Ćelije se zatim isperu medijumom i slikaju odmah pod fluorescentnim mikroskopom ili inkubiraju na 37°C za slikanje u kasnijim vremenskim tačkama. Slike ćelijske morfologije i intenzitet imunofluorescencije obojenih ćelija dobijaju se korišćenjem Nikon TE200 kamere, na 0, 30 ili 60 minuta, kako je navedeno na Slici 16. Fluorescencija se zapaža samo u ćelijama koje su obojene sa 4A6, 11E7 i 16D10 antitelima. Ne detektuje se fluorescencija sa IgG1 kontrolnim antitelom.
[0277] Kao što se može videti na Slici 16, na 0 minuta posle dodavanja antitela, ćelije se boje po površini. Posle 30 minuta, ćelije počinju da internalizuju antitela. Posle 60 minuta, antitela su gotovo potpuno internalizovana u ćelije. Ovo pokazuje da se humana antiglipikan-3 monoklonska antitela specifično internalizuju posle vezivanja za glipikan-3-eksprimirajuće HCC ćelije.
Primer 7: Stabilnost antiglipikan-3 antitela
Termička stabilnost
[0278] Termička stabilnost antiglipikan-3 monoklonskih antitela određuje se kalorimetrijskom analizom temperature topljenja 4A6, 11E7 i 16D10 antitela. Kalorimetrijska merenja temperature topljenja (melting temperatures, Tm) obavljaju se na VP-Capillary DSC diferencijalna skenirajućoj mikrokalorimetrijskoj platformi koja se kombinuje sa autosemplerom (MicroCal LLC, Northampton, MA, USA). Zapremina uzoračkih ćelija iznoci 0.144 ml. Podaci o denaturaciji antitela dobijaju se zagrevanjem uzoraka u koncentraciji od 2.3 μM, od 30 do 95°C, pri stopi od 1°C/min, u fosfatom puferisanom slanom rastvoru (PBS), na pH 7.4. Isti pufer se koristi za referentnu ćeliju, da bi se upoređivanjem dobio molarni toplotni kapacitet. Dobijeni termogrami se koriguju po bazalnoj liniji i normalizovani podaci analiziraju na osnovu modela "ne-2-stanja" (non-2-state), korišćenjem softvera Origin v7.0. Kako je pokazano u Tabeli 2, zapaženo je da 16D10 ima najveći stepen termičke stabilnosti od tri antiglipikan-3 monoklonskih antitela.
Tabela 2. Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija
Antiglipikan-3
Tm1 (°C)
Tm2 (°C)
Tm3 (°C)
16D10
72.1
74.3
83.5
4A6
70.7
80.9
83.1
11E7
70.6
82.6
84.9
Hemijska stabilnost merena fluorescentnom spektroskopijom
[0279] Stabilnost 4A6, 11E7 i 16D10 upoređivana je merenjem srednje tačke hemijske denaturacije, fluorescentnom spektroskopijom. Fluorescentna merenja hemijske denaturacije obavljaju se na SPEX Fluorolog 3.22 koji je opremljen Micromax čitačem ploča (SPEX, Edison, NJ). Merenja se obavljaju na uzorcima antitela koji su ekvilibrisani tokom 20 sati u 16 različitih koncentracija guanidin-hidrohlorida u PBS puferu. Merenja su urađena na crnim pločama sa 384 bunarčića niske zapremine, sa nevezujućom površinom (Coming, Acton, MA) i zahtevala su 1 μM antitela u zapremini bunarčića od 12 μl. Fluorescencija je ekscitovana na 280 nm i emisioni spektri su mereni između 320 i 400 nm. Brzina skeniranja bila je 1 sekund po nm i prorezi su podešeni na pojas propuštanja od 5 nm. Merenje pufera kao slepa proba sprovedeno je korišćenjem PBS i automatski je oduzeto od podataka. Podaci su podešeni prema denaturacionom modelu "dva stanja", korišćenjem GraphPad Prism softvera. Kako je pokazano u Tabeli 3, zapaženo je da 16D10 i 4A6 imaju sličnu stabilnost, ali da 11E7 pokazuje dvofazno ispravljanje.
Tabela 3: Hemijska denaturacija određena fluorescentnom spektroskopijom
Klon
Srednja tačka ispravljanja (M)
4A6
2.84
16D10
2.74
11E7
bifazno
[0280] Diskusija o referencama u ovom tekstu treba samo da sumira tvrdnje njihovih autora i ne smatra se da bilo koja od referenci predstavlja stanje tehnike i podnosioci zadržavaju pravo provere preciznosti i važnosti navedenih referenci
[0281] Iako je gornji pronalazak u nekim detaljima opisan ilustracijama i primerima da bi se jasno shvatio, stručnjak u oblasti će, u svetlu uputstava ovog pronalaska, lako prepoznati da je u njemu moguće napraviti određene promene i modifikacije, a da se ne odstupi od duha ili okvira zavisnih zahteva.
Tabela 4. Sažetak liste sekvenci
SEQ ID NO:
SEKVENCA
SEQ ID NO:
SEKVENCA
1
VH CDR1 a.k. 4A6
25
VH n.t. 4A6
2
VH CDR1 a.k. 11E7
26
VH n.t..11E7
3
VH CDR1 a.k. 16D10
27
VH n.t. 16D10
4
VH CDR2 a.k. 4A6
28
VK n.t. 4A6
5
VH CDR2 a.k. 11E7
29
VK n.t. 11E7
6
VH CDR2 a.k. 16D10
30
VK n.t. 16D10
7
VH CDR3 a.k. 4A6
31
VH 5-51 germ. lin. a.k.
8
VH CDR3 a.k. 11E7
32
JH JH4b germ. lin. a.k.
9
VH CDR3 a.k. 16D10
33
Vk A27 germ. lin. a.k.
10
VK CDR1 a.k. 4A6
34
JK JK4 germ. lin. a.k.
11
VK CDR1 a.k. 11E7
35
JK JK1 germ. lin. a.k
12
VK CDR1 a.k. 16D10
36
Glipikan-3 a.k.
13
VK CDR2 a.k. 4A6
14
VK CDR2 a.k. 11E7
15
VK CDR2 a.k. 16D10
16
VK CDR3 a.k. 4A6
17
VK CDR3 a.k. 11E7
18
VK CDR3 a.k. 16D10
19
VH a.k. 4A6
20
VH a.k. 11E7
21
VH a.k: 16D10
22
VK a.k. 4A6
23
VK a.k. 11E7
24
VK a.k. 16D10
LISTA SEKVENCI
[0282]
<110> Medarex Inc.
<120> MONOKLONSKA ANTITELA PROTIV GLIPIKANA-3
<130> P34550EP-PCT
<140> EP08796249.4
<141> 2008-07-17
<150> US 60/959845
<151> 2007-07-17
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
<210> 20
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 351
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 351
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211> 351
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 27
<210> 28
<211> 321
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 28
<210> 29
<211> 321
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 321
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 98
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33
<211> 96
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36
<211> 580
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 408
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 37
<210> 38
<211> 136
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 381
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 408
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 41
<210> 42
<211> 136
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
<210> 43
<211> 381
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45
<211> 408
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 45
<210> 46
<211> 136
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
<210> 47
<211> 381
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 47
<210> 48
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48

Claims (21)

1. Izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeni time, što se biraju iz grupe koja se sastoji od:(i) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koji uključuju:a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:1b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:4;(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:7;(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:10;(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:13; i(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:16.(ii) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koji uključuju:(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:2;(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:5;(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:8;(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:11;(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:14; i(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:17; i(iii) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koji uključuju:(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:3;(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:6;(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:9;(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:12;(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:15; i(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:18;pri čemu se antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo vezuju za Glipikan- 3.
2. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz Zahteva 1, naznačeni time, što uključuju:a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:1b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:4;(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:7;(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:10;(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:13; i(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:16.
3.Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz Zahteva 1, naznačeni time, što uključuju:(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:2;(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:5;(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:8;(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:11;(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:14; i(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:17.
4.Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz Zahteva 1, naznačeni time, što uključuju:(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:3;(b) CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:6;(c) CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:9;(d) CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:12;(e) CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:15; i(f) CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca, koji sadrži SEQ ID NO:18.
5. Izolovano humano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeni time, što se biraju iz grupe koja se sastoji od:i) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koji uključuju:(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22;ii) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koji uključuju:(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23; iiii) antitela, ili njegovog antigen-vezujućeg dela, koji uključuju:(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24;pri čemu se antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, vezuju za Glipikan- 3.
6. Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz Zahteva 5, naznačeni time, što uključuju:(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:19; i(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:22.
7.Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz Zahteva 5, naznačeni time, što uključuju:(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:20; i(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23.
8.Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz Zahteva 5, naznačeni time, što uključuju:(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:21; i(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:24.
9.Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od Zahteva 1-8, naznačeni time, što je pomenuto antitelo hipofukozilovano antitelo.
10.Antitelo iz bilo kojeg od Zahteva 1-9, naznačeno time, što je antitelo pune dužine IgG1 izotipa, ili njegov antigen-vezujući deo.
11.Antitelo iz bilo kojeg od Zahteva 1-9, naznačeno time, što je antitelo pune dužine IgG4 izotipa, ili njegov antigen-vezujući deo.
12. Imunokonjugat, naznačen time, što uključuje antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od prethodnih zahteva, povezane sa terapijskim sredstvom.
13.Imunokonjugat iz Zahteva 12, naznačen time, što je terapijsko sredstvo citotoksin.
14.Imunokonjugat iz Zahteva 12, naznačen time, što je terapijsko sredstvo radioaktivni izotop.
15.Smeša, naznačena time, što uključuje antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od Zahteva 1-11, ili imunokonjugat iz bilo kojeg od Zahteva 12-14, i farmaceutski prihvatljivi nosač.
16.Izolovani molekul nukleinske kiseline, naznačen time, što kodira antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od Zahteva 1-11.
17.Ekspresioni vektor, naznačen time, što sadrži molekul nukleinske kiseline iz Zahteva 16.
18.Ćelija-domaćin, naznačena time, što sadrži ekspresioni vektor iz Zahteva 17.
19.Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, iz bilo kojeg od Zahteva 1-11, naznačeni time, što se upotrebljavaju u metodu inhibiranja rasta tumorskih ćelija koje eksprimiraju glipikan-3, pri čemu metod uključuje dovođenje u kontakt ćelija sa antitelom, ili njegovim antigen-vezujućim delom.
20.Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeni time, što se upotrebljavaju u metodu definisanom u Zahtevu 19, pri čemu su tumorske ćelije poreklom iz tkiva jetre.
21.Antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, naznačeni time, što se upotrebljavaju u metodu definisanom u Zahtevu 19, pri čemu je antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, imunokonjugat
MEP-2016-86A 2007-07-17 2008-07-17 MONOKLONSKA ANTlTELA PROTIV GLIPIKANA-3 ME02345B (me)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95984507P 2007-07-17 2007-07-17
EP08796249.4A EP2178921B1 (en) 2007-07-17 2008-07-17 Monoclonal antibodies against glypican-3
PCT/US2008/070344 WO2009012394A1 (en) 2007-07-17 2008-07-17 Monoclonal antibodies against glypican-3

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ME02345B true ME02345B (me) 2016-08-31

Family

ID=39874207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MEP-2016-86A ME02345B (me) 2007-07-17 2008-07-17 MONOKLONSKA ANTlTELA PROTIV GLIPIKANA-3

Country Status (18)

Country Link
US (2) US8680247B2 (me)
EP (1) EP2178921B1 (me)
JP (2) JP5868593B2 (me)
KR (2) KR101527342B1 (me)
CN (1) CN101815726B (me)
AU (1) AU2008275985B2 (me)
CY (1) CY1117236T1 (me)
DK (1) DK2178921T3 (me)
ES (1) ES2562790T3 (me)
HR (1) HRP20160270T1 (me)
HU (1) HUE028737T2 (me)
ME (1) ME02345B (me)
MX (1) MX2010000537A (me)
PL (1) PL2178921T3 (me)
PT (1) PT2178921E (me)
RS (1) RS54624B1 (me)
SI (1) SI2178921T1 (me)
WO (1) WO2009012394A1 (me)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
IN2014DN10515A (me) 2006-03-31 2015-08-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd
JP5868593B2 (ja) * 2007-07-17 2016-02-24 メダレックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＭｅｄａｒｅｘ， Ｌ．Ｌ．Ｃ． Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３に対するモノクローナル抗体
MX336725B (es) 2007-09-26 2016-01-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de modificacion del punto isoelectrico de anticuerpos medinate la sustitucion de aminoacidos en region de determinacion de complementariedad (cdr).
AR066172A1 (es) * 2007-09-28 2009-07-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo para la preparacion de un anticuerpo antiglipicano 3 con modulada cinetica plasmatica mediante variacion de la semivida plasmatica.
CL2009000647A1 (es) * 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
CN102875677A (zh) * 2009-05-08 2013-01-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 人源化抗egfl7抗体及其使用方法
EP2640740B1 (en) 2010-11-15 2017-03-15 Pieris Pharmaceuticals GmbH Muteins of human lipocalin 2 with affinity for glypican-3 (gpc3)
PT3434767T (pt) 2010-11-30 2026-01-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapêutico indutor de citotoxicidade
MX345399B (es) * 2010-12-28 2017-01-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Metodo de cultivo de celulas animales.
CN103596985B (zh) 2011-04-19 2016-06-08 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) 对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3特异的人单克隆抗体及其用途
US8852599B2 (en) 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
US20140322216A1 (en) * 2011-11-08 2014-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
SG11201407972RA (en) 2012-06-01 2015-01-29 Us Health High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
CN103833852A (zh) * 2012-11-23 2014-06-04 上海市肿瘤研究所 针对磷脂酰肌醇蛋白多糖-3和t细胞抗原的双特异性抗体
SI2956173T1 (sl) 2013-02-14 2017-06-30 Bristol-Myers Squibb Company Spojine tubulizina, postopki pridobivanja in uporaba
MX368016B (es) 2013-08-14 2019-09-13 Univ Rice William M Derivados de uncialamicina, métodos de sintesis y su uso como agentes antitumor.
SG10201803449VA (en) 2013-09-27 2018-05-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for producing polypeptide heteromultimer
US10093746B2 (en) 2014-09-04 2018-10-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3 antibody and uses thereof
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
US10077287B2 (en) 2014-11-10 2018-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Tubulysin analogs and methods of making and use
LT3221346T (lt) 2014-11-21 2020-11-10 Bristol-Myers Squibb Company Antikūnai, apimantys modifikuotas sunkiosios grandinės pastoviąsias sritis
CN104829704B (zh) * 2014-12-15 2016-08-17 河北省科学院生物研究所 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖gpc3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株
ES2747386T3 (es) 2015-01-14 2020-03-10 Bristol Myers Squibb Co Dímeros de benzodiacepina unidos por heteroarileno, conjugados de los mismos y métodos de preparación y uso
WO2016115191A1 (en) 2015-01-14 2016-07-21 Bristol-Myers Squibb Company Benzodiazepine dimers, conjugates thereof, and methods of making and using
JP7082484B2 (ja) 2015-04-01 2022-06-08 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
CN105037540A (zh) * 2015-05-13 2015-11-11 北京比洋生物技术有限公司 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3全人源抗体
AU2016262845B2 (en) 2015-05-18 2020-07-23 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Anti-cancer fusion polypeptide
US10273275B2 (en) 2015-05-18 2019-04-30 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Muteins of human lipocalin 2 with affinity for glypican-3 (GPC3) and methods of use thereof
JP6762485B2 (ja) * 2015-06-24 2020-09-30 学校法人慶應義塾 抗グリピカン−１−免疫抗原受容体
KR102777002B1 (ko) * 2015-08-03 2025-03-05 크라제 메디컬 씨오 리미티드 항글리피칸-3 항체 및 이의 응용
KR101796688B1 (ko) 2015-10-29 2017-12-01 재단법인 목암생명과학연구소 신규 항-글리피칸 3 항체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
JP2019505575A (ja) 2015-12-21 2019-02-28 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ 部位特異的な結合のための変異型抗体
CN105717303A (zh) * 2016-01-29 2016-06-29 山东康力医疗器械科技有限公司 一种用荧光免疫层析法检测磷酯酰肌醇蛋白聚糖3的方法及其试剂盒
TW202214700A (zh) 2016-03-14 2022-04-16 日商中外製藥股份有限公司 用於癌之治療的細胞傷害誘導治療劑
US20170326249A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Antibody-drug conjugate of an anti-glypican-3 antibody and a tubulysin analog, preparation and uses
US10994033B2 (en) 2016-06-01 2021-05-04 Bristol-Myers Squibb Company Imaging methods using 18F-radiolabeled biologics
CN106084041A (zh) * 2016-06-24 2016-11-09 安徽未名细胞治疗有限公司 一种全人源抗GPC3的全分子IgG抗体及其应用
EP3490589A1 (en) 2016-07-26 2019-06-05 Tessa Therapeutics Pte. Ltd. Chimeric antigen receptor
ES2902179T3 (es) 2016-08-19 2022-03-25 Bristol Myers Squibb Co Compuestos de seco-ciclopropapirroloindol, conjugados de anticuerpo-fármaco de los mismos y métodos de elaboración y uso
WO2018075842A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Bristol-Myers Squibb Company Condensed benzodiazepine derivatives and conjugates made therefrom
MX420947B (es) 2017-04-26 2025-02-10 Eureka Therapeutics Inc Constructos que reconocen específicamente glipicano 3 y usos de estos.
MX2019013132A (es) 2017-05-25 2020-01-27 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos que comprenden regiones constantes pesadas modificadas.
CN109988240B (zh) * 2017-12-29 2022-06-28 安源医药科技（上海）有限公司 抗gpc-3抗体及其用途
AU2019277094B2 (en) 2018-05-29 2025-12-18 Bristol-Myers Squibb Company Modified self-immolating moieties for use in prodrugs and conjugates and methods of using and making
AU2019366956B2 (en) 2018-10-23 2025-10-30 Dragonfly Therapeutics, Inc. Heterodimeric Fc-fused proteins
US20220106400A1 (en) 2018-11-28 2022-04-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
BR112021010060B1 (pt) 2018-11-30 2024-03-12 Bristol-Myers Squibb Company Anticorpo que compreende uma extensão c-terminal de cadeia leve que contém glutamina, conjugados do mesmo, e método de preparação de conjugados
WO2020123425A2 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies modified for transglutaminase conjugation, conjugates thereof, and methods and uses
US12404341B2 (en) 2019-03-21 2025-09-02 Agency For Science, Technology And Research Glypican-3 (GPC-3) antibodies
CN112390886B (zh) * 2019-08-16 2022-08-16 原启生物科技(上海)有限责任公司 一种分离的抗原结合蛋白及其用途
WO2021216916A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 Dragonfly Therapeutics, Inc. Formulation, dosage regimen, and manufacturing process for heterodimeric fc-fused proteins
BR112022020716A2 (pt) * 2020-05-07 2022-11-29 Phanes Therapeutics Inc Anticorpos anti-tumor associados ao antígeno e usos dos mesmos
EP4262985A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Ablynx N.V. Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting glypican-3 and t cell receptor
JP2024515201A (ja) * 2021-04-23 2024-04-05 上海復宏漢霖生物技術股▲フン▼有限公司 抗ｇｐｃ３抗体及び使用方法
CN113354737B (zh) * 2021-07-20 2022-11-18 广州爱思迈生物医药科技有限公司 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体及其应用
MX2024002121A (es) * 2021-08-19 2024-07-10 Adicet Therapeutics Inc Métodos para la detección del glipicano-3 unido a la membrana.
WO2023061505A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 Concept To Medicine Biotech Co., Ltd. Anti-glypican 3 antibodies
CN120344270A (zh) 2022-10-07 2025-07-18 Ambrx 公司 药物接头及其抗体缀合物
WO2024094017A1 (zh) * 2022-11-01 2024-05-10 上海齐鲁制药研究中心有限公司 一种针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的双特异性抗体及其应用
AU2024305352A1 (en) 2023-06-12 2025-12-04 Amgen Inc. Lymphotoxin beta receptor agonist binding proteins

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3426001B2 (ja) 1993-09-16 2003-07-14 東芝機械株式会社 ステージ内蔵型雰囲気室装置
EP0822830B1 (en) * 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
ES2312586T3 (es) 2001-06-22 2009-03-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Inhibidor del crecimiento celular que contenga un anticuerpo anti-clipicano 3.
WO2004022597A1 (ja) * 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3の血中可溶化ｎ端ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞに対する抗体
WO2004022595A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha MRL/lprマウスを用いた抗体の作製
AU2002330482A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Perseus Proteomics Inc. Method of diagnosing cancer by detecting gpc3
US7303914B2 (en) 2003-01-30 2007-12-04 Hongyang Wang Monoclonal antibody against human hepatoma and use thereof
CN101562197B (zh) 2003-06-27 2011-08-10 日本电气株式会社 薄膜晶体管、薄膜晶体管基板及电子设备
PL1674111T3 (pl) 2004-07-09 2011-04-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Przeciwciała anty-glipikan 3
KR20130103580A (ko) 2004-08-24 2013-09-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항 글리피칸 3 항체를 이용한 어쥬번트 요법
JP4794457B2 (ja) 2004-10-26 2011-10-19 中外製薬株式会社 糖鎖改変抗グリピカン３抗体
DE602005027258D1 (de) * 2005-03-14 2011-05-12 Us Gov Health & Human Serv Humane monoklonale antikörper gegen hendra- und nipah-viren
EA019344B1 (ru) * 2005-07-01 2014-03-31 МЕДАРЕКС, Эл.Эл.Си. Человеческие моноклональные антитела против лиганда-1 запрограммированной гибели клеток (pd-l1) и их применения
US7744800B2 (en) 2006-01-06 2010-06-29 Molded Fiber Glass Companies Method and apparatus for controlling the stacking height of stackable products during compression molding off stops
BRPI0717902A2 (pt) * 2006-12-01 2013-10-29 Medarex Inc "anticorpo monoclonal humano isolado, composição, conjugado anticorpo-molécula parceria, imunoconjugado, molécula de ácido nucléico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, método para prepar um anticorpo anti-cd22, método para inibir o desenvolvimento de uma célula tumoral que expressa cd22 e método para tratar uma doença inflamatória ou autoimuneem um indivíduo"
JP5868593B2 (ja) * 2007-07-17 2016-02-24 メダレックス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＭｅｄａｒｅｘ， Ｌ．Ｌ．Ｃ． Ｇｌｙｐｉｃａｎ−３に対するモノクローナル抗体
US8852599B2 (en) * 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use

Also Published As

Publication number Publication date
CN101815726B (zh) 2013-04-03
US8680247B2 (en) 2014-03-25
EP2178921A1 (en) 2010-04-28
HUE028737T2 (en) 2017-01-30
MX2010000537A (es) 2010-03-25
JP2010533498A (ja) 2010-10-28
US20140186892A1 (en) 2014-07-03
CN101815726A (zh) 2010-08-25
KR20100056467A (ko) 2010-05-27
RS54624B1 (sr) 2016-08-31
HRP20160270T1 (hr) 2016-05-06
EP2178921B1 (en) 2016-01-06
KR20150038732A (ko) 2015-04-08
AU2008275985A1 (en) 2009-01-22
AU2008275985B2 (en) 2013-09-19
US20100209432A1 (en) 2010-08-19
SI2178921T1 (sl) 2016-05-31
KR101527342B1 (ko) 2015-06-09
CY1117236T1 (el) 2017-04-05
ES2562790T3 (es) 2016-03-08
PL2178921T3 (pl) 2016-06-30
JP2014236734A (ja) 2014-12-18
DK2178921T3 (en) 2016-04-04
KR101570252B1 (ko) 2015-11-19
PT2178921E (pt) 2016-03-23
US9217033B2 (en) 2015-12-22
JP5868593B2 (ja) 2016-02-24
WO2009012394A1 (en) 2009-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8680247B2 (en) Monoclonal antibodies against glypican-3
US9505845B2 (en) Treating lung cancer using human monoclonal antibodies to protein tyrosine kinase 7 (PTK7)
US8097703B2 (en) CD19 antibodies and their uses
US8383118B2 (en) Human monoclonal antibodies to fucosyl-GM1 and methods for using anti-fucosyl-GM1
RS54424B1 (sr) Humana antitela koja se vezuju za cxcr4 i njihove upotrebe
CN101370830A (zh) 抗cd70的人单克隆抗体
AU2013257387A1 (en) Monoclonal antibodies against glypican-3
HK1174828A (en) Human antibodies that bind cxcr4 and uses thereof
BRPI0620553B1 (pt) Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção ligante ao antígeno do mesmo, composição e imunoconjugado
MX2008006792A (en) Human monoclonal antibodies to protein tyrosine kinase 7 ( ptk7 ) and their use