ES2312586T3 - Inhibidor del crecimiento celular que contenga un anticuerpo anti-clipicano 3. - Google Patents
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Abstract
Uso de un anticuerpo anti-glipicano 3 en la fabricación de un medicamento para uso como un agente anticanceroso.
Description
Inhibidor del crecimiento celular que contenga
un anticuerpo anti-glipicano 3.
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La presente invención se refiere al uso de un
anticuerpo anti-glipicano 3.
Se ha información que la familia del glipicano
se presenta como una nueva familia de proteoglicanos de heparán
sulfato que están presentes en las superficies celulares. Hasta la
fecha, se han presentado los 5 tipos de glipicanos (glipicano 1,
glipicano 2, glipicano 3, glipicano 4 y glipicano 5) como miembros
de la familia de los glipicanos. Estos miembros de la familia
tienen proteínas nucleares de tamaño uniforme (aproximadamente 60
kDa), comparten secuencias de cisteína específicas y bien
conservadas y se unen a las membranas celulares a través de
anclajes de glicosil fosfatidil inositol (GPI).
Se ha identificado un gen "Dally" (con
"división anormalmente retrasada") por medio de la selección de
genes de una variante de Drosophila melanogaster que tiene
un patrón de división celular anormal en el desarrollo del sistema
nervioso central. Se sabe que el ADNc de "Dally" representa una
fase de lectura abierta (ORF) que codifica un producto que tiene
una secuencia que muestra homología (una homología del 24 al 26%)
con un proteoglicano transmembrana (GRIP) de un vertebrado que
contiene todas las características de un glipicano. Se ha sugerido
que el gen dally interviene en la regulación del mecanismo del
receptor de dpp (decapentaplegia). Esto sugiere que el glipicano de
un mamífero puede regular la transducción de señales entre TGF y
BMP. Se ha sugerido específicamente que el glipicano puede
funcionar como un receptor común para algunos de los factores de
crecimiento de unión a heparina (por ejemplo, EGF, PDGF, BMP2 y
FGF).
Se ha aislado glipicano 3 como un transcrito en
condiciones de regulación del desarrollo en intestino de rata
(Filmus, J., Church, J. G., y Buick, R.n. (1988) Mol. Cell Biol. 8,
4243-4249), y después se ha identificado como
OCT-5, un proteoglicano de heparán sulfato unido a
GPI de la familia de los glipicanos, que tiene una proteína nuclear
con un peso molecular de 69 kDa (Filmus, J., Shi, W., Wong, Z.-M y
Wong, M.J. (1995) Biochem. J. 311, 561-565).
También en humanos se ha aislado un gen que codifica glipicano 3
como MXR-7 a partir de una línea celular de cáncer
gástrico humano (Hermann Lage et al., Gene 188 (1997)
151-156). Se ha notificado que el glipicano 3 forma
un complejo proteína-proteína con un factor de
crecimiento 2 semejante a insulina para regular la acción del
factor de crecimiento (Pilia, G. et al, (1996) Nat. Genet.
12, 241-247). Este informe sugiere que el glipicano
3 no siempre interacciona con el factor de crecimiento que tiene la
cadena de heparán sulfato.
Existe un informe que sugiere que el glipicano 3
puede utilizarse como un marcador de cáncer hepático
(Hey-Chi Hsu et al., CANCER RESEARCH 57,
5179-5184 (1997). Sin embargo, no hay ningún
descubrimiento que indique una relación clara entre el glipicano 3
y la proliferación de células de carcinoma.
Además, se ha sugerido que el glipicano puede
funcionar como un receptor para endostatina que puede actuar como
un inhibidor de la vascularización (Molecular Cell (2001), 7,
811-822). Sin embargo, todavía no se ha esclarecido
la relación entre esta función y la proliferación celular.
Como se ha descrito arriba, se ha sugerido la
implicación del glipicano 3 en la proliferación celular. Sin
embargo, no se conoce el mecanismo de proliferación celular y
similares, y nunca se ha intentado la aplicación del glipicano 3
para la regulación de la proliferación celular.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un inhibidor del crecimiento celular que contenga un
anticuerpo anti-glipicano 3 como ingrediente
activo.
Como resultado de estudios profundos, los
presentes inventores han completado la presente invención por medio
del descubrimiento de que el anticuerpo
anti-glipicano 3 ejerce actividad inhibidora de la
proliferación celular por ADCC (citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpo) y actividad CDC (citotoxicidad dependiente de
complemento). Además, también se ha pronosticado que los
anticuerpos anti-glipicano 3 ejercen actividad
inhibidora de la proliferación celular por inhibición de la acción
de un factor de crecimiento. Además, los anticuerpos
anti-glipicano 3 también pueden ejercer actividad
inhibidora de la proliferación celular por medio de la unión a
sustancias citotóxicas tales como un isótopo radiactivo, un agente
quimioterapéutico o una toxina derivada de bacterias.
La presente invención es como sigue:
- (1)
- Uso de un anticuerpo anti-glipicano 3 en la fabricación de un medicamento para uso como un agente anticanceroso.
- (2)
- Uso de (1), donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
- (3)
- Uso de (1) o (2), donde el medicamento se usa para tratar o mejorar una afección debida a un cáncer hepático.
- (4)
- Uso de (1), donde el cáncer es cáncer hepático.
- (5)
- Un anticuerpo anti-glipicano 3 para el uso en el tratamiento de cánceres.
- (6)
- El anticuerpo anti-glipicano 3 de (5), donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.
- (7)
- El anticuerpo anti-glipicano 3 de (5) o (6), donde el anticuerpo se usa para tratar o mejorar una afección debida a un cáncer hepático.
- (8)
- El anticuerpo anti-glipicano 3 de (5), donde el cáncer es cáncer hepático.
En la invención, el anticuerpo
anti-glipicano 3 puede actuar como un inhibidor del
crecimiento celular. El anticuerpo anti-glipicano 3
puede tener actividad citotóxica. La actividad citotóxica puede ser
actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC)
o actividad de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC).
El anticuerpo anti-glipicano 3
puede actuar como inhibidor del crecimiento celular, siendo dichas
células células de carcinoma. Las células pueden seleccionarse
entre el grupo consistente en células cancerosas hepáticas, células
cancerosas de pulmón, células cancerosas de mama, células cancerosas
de próstata, células de leucemia, células de linfoma y células de
cáncer pancreático. En un caso, las células pueden ser células de
cáncer hepático. La actividad citotóxica puede ser contra la línea
celular de cáncer hepático HuH-7.
En un caso, el anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal. En otro caso, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado
o un anticuerpo quimérico.
La presente invención se describirá con detalle
más adelante.
Los ejemplos del anticuerpo
anti-glipicano 3 para uso en la presente invención
incluyen un anticuerpo conocido tal como un anticuerpo humanizado,
un anticuerpo humano (documento WO 96/33735), un anticuerpo
quimérico (Publicación de la Patente JP (Kokai) Nº
4-228089 A (1992)) o un anticuerpo de ratón, así
como anticuerpos de la presente invención. Además, un anticuerpo
puede ser un anticuerpo policlonal y preferentemente es un
anticuerpo monoclonal.
El anticuerpo anti-glipicano 3
que se usa en la presente invención puede tener cualquier origen,
puede ser de cualquier tipo (monoclonal o policlonal) y puede estar
en cualquier forma, siempre que sea capaz de inhibir la
proliferación celular.
El anticuerpo anti-glipicano 3
que se usa en la presente invención puede obtenerse por medios
conocidos como un anticuerpo monoclonal o policlonal. Un anticuerpo
anti-glipicano 3 particularmente preferido usado en
la presente invención es un anticuerpo monoclonal procedente de un
mamífero. Los ejemplos del anticuerpo monoclonal procedente de un
mamífero incluyen un anticuerpo producido por un hibridoma y un
anticuerpo producido por un hospedador transformado usando un
vector de expresión que contiene el gen del anticuerpo por técnicas
de ingeniería genética. Este anticuerpo se une a glipicano 3 para
inhibir la proliferación celular.
Un ejemplo de dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal producido por el clon de hibridoma de la presente
invención.
Un hibridoma productor de anticuerpos
monoclonales puede prepararse básicamente usando técnicas conocidas
tales como las que se indican a continuación. Es decir, el hibridoma
puede prepararse realizando inmunización usando glipicano 3 como
inmunógeno de acuerdo con un método de inmunización convencional,
haciendo que los inmunocitos obtenidos de esta manera se fusionen
con células parentales conocidas mediante un método de fusión
celular convencional y después seleccionando células productoras de
anticuerpos monoclonales por un método de selección
convencional.
En concreto, se pueden preparar anticuerpos
monoclonales como se indica a continuación.
Primero se obtiene glipicano 3 humano a usar
como inmunógeno para obtener anticuerpos expresando el gen de
glipicano 3 (MXR7) (secuencia de aminoácidos) como se describe por
Lage, H. et al (Gene 188 (1997),
151-156).
En concreto, la secuencia génica que codifica
glipicano 3 se inserta en un sistema de vector de expresión
conocido, se utiliza para transformar una célula hospedadora
apropiada y después se purifica una proteína glipicano 3 humana
diana humana por un método conocido a partir de las células
hospedadoras o del sobrenadante del cultivo.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Después, esta proteína glipicano 3 purificada se
usa como un inmunógeno. Como alternativa, el péptido parcial de
glipicano 3 puede usarse como antígeno de sensibilización. En este
momento, el péptido parcial puede obtenerse por síntesis química a
partir de la secuencia de aminoácidos del glipicano 3 humano.
El anticuerpo anti-glipicano 3
inhibe la actividad de proliferación celular con la acción ADCC, la
acción CDC y la actividad de un factor de crecimiento. Además, el
anticuerpo anti-glipicano 3 también puede inhibir
la proliferación celular por unión a una sustancia citotóxica tal
como un radioisótopo, un agente quimioterapéutico o una toxina
procedente de bacterias. Por lo tanto, en la presente invención, un
epítopo presente en una molécula de glipicano 3 que se reconoce por
el anticuerpo anti-glipicano 3 no está limitado a un
epítopo particular. El anticuerpo anti-glipicano 3
puede reconocer cualquier epítopo, siempre que el epítopo esté
presente en una molécula de glipicano 3. Por consiguiente, como
antígeno para preparar el anticuerpo anti-glipicano
3 de la presente invención puede usarse cualquier fragmento,
siempre que contenga el epítopo de una molécula de glipicano 3.
El mamífero a inmunizar con un inmunógeno no
está limitado específicamente y se selecciona preferiblemente
considerando la compatibilidad con la célula parental a usar para la
fusión celular. Por ejemplo, generalmente se usan roedores tales
como ratones, ratas, hámsteres, conejos o monos.
Los animales se inmunizan con un inmunógeno de
acuerdo con un método conocido. Por ejemplo, la inmunización se
realiza por un método general en el que en un mamífero se inyecta un
inmunógeno por vía intraperitoneal o subcutánea. En concreto, un
inmunógeno se diluye o se suspende en un volumen apropiado de PBS
(solución salina tamponada con fosfato), solución salina
fisiológica o similar; si es necesario, se mezcla con el producto
un volumen apropiado de un adyuvante convencional tal como adyuvante
completo de Freund; se realiza la emulsión; y después la solución
se administra a mamíferos varias veces cada 4 a 21 días. Además,
también se puede usar un vehículo apropiado para la inmunización
con un inmunógeno.
Los mamíferos se inmunizan como se ha descrito
anteriormente y después se confirma el aumento del título del
anticuerpo deseado en el suero. Posteriormente, se recogen los
inmunocitos de los mamíferos y después se someten a fusión celular.
Un inmunocito preferido particular es un esplenocito.
Como célula acompañante a fusionar con el
inmunocito anterior se usa una célula de mieloma de mamífero. Los
ejemplos de una línea celular de una célula de mieloma que se usa
preferiblemente en esta memoria incluyen diversas líneas celulares
conocidas tales como P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123,
1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in
Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7),
NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol.
(1976) 6, 511-519),
MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell
(1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et
al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St.
Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35,
1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978)
148, 313-323) y R210 (Galfre, G. et al.,
Nature (1979) 277, 131-133).
La fusión celular de los inmunocitos anteriores
con células de mieloma se pueden realizar básicamente de acuerdo
con un método conocido, por ejemplo, el método de Kohler y Milstein
et al (Kohler. G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981)
73, 3-46).
Más concretamente, la fusión celular anterior se
realiza en una solución de cultivo de nutrición convencional en
presencia, por ejemplo, de un acelerador de la fusión celular. Como
acelerador de la fusión celular se usa, por ejemplo,
polietilenglicol (PEG), virus hemaglutinante de Japón (HVJ) o
similares. Si se desea, también puede usarse un adyuvante tal como
dimetilsulfóxido por adicción para mejorar adicionalmente la
eficacia de la fusión.
Puede establecerse para uso en la presente
invención cualquier proporción entre inmunocitos y células de
mieloma. Por ejemplo, es preferible que el número de inmunocitos
sea de 1 a 10 veces mayor que el de las células de mieloma. Como
solución de cultivo a usar para la fusión celular anterior puede
usarse, por ejemplo, una solución de cultivo RPMI1640 o una
solución de cultivo MEM que es apropiada para el crecimiento de la
línea celular de mieloma anterior, u otras soluciones de cultivo
convencionales que se usan para este tipo de cultivo celular.
Además, puede usarse un líquido sérico tal como suero bovino fetal
(FCS) en combinación con dichas soluciones.
La fusión celular se realiza mezclando
suficientemente ciertas cantidades de los inmunocitos anteriores y
células de mieloma en la solución de cultivo anterior, añadiendo una
solución de PEG (por ejemplo, con un peso molecular medio de
aproximadamente 1000 a 6000) (una concentración general del 30 al
60% (p/v)) precalentada a aproximadamente 37ºC y después mezclando
la solución hasta formar las células fusionadas diana (hibridomas).
Posteriormente, se añade sucesivamente una solución de cultivo
apropiada y después se repite una etapa de eliminar el sobrenadante
por centrifugación para retirar de esta manera los reactivos para la
fusión celular o similares que no son favorables para el
crecimiento de los hibridomas.
Los hibridomas obtenidos de esta manera se
seleccionan cultivándolos en una solución de cultivo selectiva
convencional tal como una solución de cultivo HAT (una solución de
cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El
cultivo en la solución de cultivo HAT anterior se continúa durante
un periodo de tiempo suficiente para que mueran las células
(células no fusionadas) distintas de los hibridomas diana
(normalmente, de varios días a varias semanas). Posteriormente, se
realiza un método de dilución limitante convencional para
seleccionar y generar hibridomas monoclonales que produzcan un
anticuerpo diana.
Además de un método con el que se obtienen los
hibridomas anteriores inmunizando animales no humanos con antígenos,
también pueden obtenerse anticuerpos humanos deseados que tienen
actividad de unión a glipicano 3 (véase la Publicación de Patente
japonesa (Kokoku) Nº 1-59878 B (1989))
sensibilizando linfocitos humanos in vitro con glipicano 3,
y haciendo que los linfocitos sensibilizados se fusionen con las
células de mieloma de origen humano que tienen un potencial de
división permanente. Además, el glipicano 3 como antígeno se
administra a un animal transgénico que tiene todos los repertorios
de un gen de anticuerpo humano para obtener células productoras de
anticuerpo anti-glipicano 3 y después pueden
obtenerse los anticuerpos humanos para el glipicano 3 a partir de
las células productoras de anticuerpo anti-glipicano
3 (véanse las Publicaciones de Patente Internacionales Nº WO
94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 y WO 94/02602).
Los hibridomas preparados de esta manera que
producen anticuerpos monoclonales pueden cultivarse con pases
sucesivos en una solución de cultivo convencional o pueden
almacenarse durante un largo periodo en nitrógeno
líquido.
líquido.
Un ejemplo de un método que se emplea para
obtener anticuerpos monoclonales a partir de los hibridomas implica
cultivar los hibridomas y obtener anticuerpos monoclonales en el
sobrenadante de cultivo de acuerdo con un método convencional. Otro
método implica administrar los hibridomas a mamíferos que son
compatibles con los hibridomas para hacer que proliferen y para
obtener anticuerpos monoclonales en el líquido ascítico. El primer
método es adecuado para obtener anticuerpos de alta pureza. Por otro
lado, el segundo método es adecuado para la producción de
anticuerpos en grandes cantidades.
Un anticuerpo monoclonal que se puede usar en la
presente invención es un anticuerpo monoclonal recombinante que se
prepara por clonación del gen de anticuerpo del hibridoma,
incorporando el gen en un vector apropiado, introduciendo el vector
en un hospedador y después haciendo que el hospedador produzca los
anticuerpos monoclonales recombinantes por técnicas de ingeniería
genética (por ejemplo, véase Vandamme, A. M. et al., Eur. J.
Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990). En concreto,
el ARNm que codifica la región variable (V) de un anticuerpo
anti-glipicano 3 se aísla a partir de un hibridoma
que produce el anticuerpo anti-glipicano 3. El ARNm
se aísla por un método conocido tal como un método de
ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J. M. et al.,
Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) o un método AGPC
(Chomczynski, P et al., Anal. Biochem. (1987) 162,
156-159), preparándose de esta manera ARN total.
Después, se prepara el ARNm diana usando un kit de purificación de
ARNm (Pharmacia) o similar. Además, el ARNm también puede
prepararse directamente usando un kit de purificación de ARNm
QuickPrep (Pharmacia).
El ADNc de la región V del anticuerpo se
sintetiza usando la transcriptasa inversa del ARNm obtenido de esta
manera. EL ADNc se sintetiza usando un kit de síntesis de ADNc de
primera cadena de transcriptasa inversa AMV (SEIKAGAKU CORPORATION)
o similar. Además, para sintetizar y amplificar el ADNc pueden
emplearse, por ejemplo, un equipo 5'-Ampli FINDER
RACE (Clontech) y el método 5'-RACE que usa PCR
(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)
85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al. Nucleic
Acids Res (1989) 17, 2919-2932).
Se purifica un fragmento de ADN diana de
producto de PCR obtenido de esta manera y después se liga al ADN
del vector. Además, se prepara un vector recombinante a partir del
producto y después el vector se introduce en Escherichia
coli o similar de forma consecutiva, posteriormente se
seleccionan las colonias preparándose de esta forma el vector
recombinante deseado. La secuencia de nucleótidos del ADN diana
después se confirma por un método conocido, tal como un método de
terminación de cadena con didesoxinucleótido.
Después de obtener una cadena de ADN que
codifica la región V del anticuerpo anti-glipicano 3
diana, este ADN se incorpora en un vector de expresión de contiene
un ADN que codifica la región constante (región C) del anticuerpo
deseado.
Para producir los anticuerpos
anti-glipicano 3 usados en la presente invención, el
gen del anticuerpo se incorpora en un vector de expresión de manera
que el gen se exprese bajo la regulación de la región control de
expresión del gen, por ejemplo, un potenciador y un promotor.
Después, se transforma una célula hospedadora con el vector de
expresión, haciendo que el hospedador exprese el anticuerpo.
Un gen de anticuerpo se puede expresar
incorporando un ADN que codifica la cadena pesada (cadena H) del
anticuerpo o un ADN que codifica la cadena ligera (cadena L) del
anticuerpo por separado en vectores de expresión, y después
transformando simultáneamente una célula hospedadora con los
vectores; o incorporando ADN que codifican la
cadena-H y la cadena-L en un solo
vector de expresión y luego transformando una célula hospedadora con
el vector (véase el documento WO 94/11523).
Además de la célula hospedadora anterior,
también puede usarse un animal transgénico para producir un
anticuerpo recombinante. Por ejemplo, un gen de anticuerpo se
inserta en un gen que codifica una proteína (por ejemplo, caseína
\beta de cabra) que se produce exclusivamente en la leche,
preparándose de esta manera como un gen fusionado. Un fragmento de
ADN que contiene el gen fusionado en el que se ha insertado el gen
del anticuerpo se inyecta en un embrión de cabra y luego dicho
embrión se introduce en una cabra hembra. Los anticuerpos deseados
pueden obtenerse a partir de la leche producida por la cabra
transgénica o la descendencia nacida de la cabra que ha aceptado el
embrión. Además, para aumentar el volumen de leche que contiene el
anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, pueden
administrase hormonas para la cabra transgénica (Ebert, K. M. et
al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
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En la presente invención, además del anticuerpo
anterior, pueden usarse anticuerpos recombinantes de genes
alterados artificialmente tales como anticuerpos quiméricos o
anticuerpos humanizados para, por ejemplo, reducir la
heteroantigenicidad contra un ser humano. Estos anticuerpos
alterados pueden producirse usando un método conocido.
Se pueden obtener anticuerpos quiméricos ligando
el ADN que codifica la región V del anticuerpo anterior a un ADN
que codifica la región C del anticuerpo humano, incorporando el
producto en un vector de expresión y después introduciendo el
vector en un hospedador para hacer que el hospedador produzca los
anticuerpos. Usando este método conocido, pueden obtenerse
anticuerpos quiméricos útiles en la presente invención.
Los anticuerpos humanizados también se denominan
anticuerpos humanos reformados, que se prepararan injertando una
CDR (región determinante de complementariedad) de un mamífero
distinto de un ser humano, tal como un ratón, en la CDR de un
anticuerpo humano. También se conoce la técnica general de
recombinación génica (véase la Publicación de Solicitud de Patente
europea Nº EP 125023 y WO 96/02576).
En concreto, la secuencia de ADN se sintetiza
por el método de PCR usando como cebadores varios oligonucleótidos
que se han preparado para tener una parte que solapa con las
regiones terminales tanto de la CDR de anticuerpo de ratón como de
la región flanqueante (FR) de un anticuerpo humano (véase el método
descrito en WO 98/133388).
Se selecciona la región flanqueante ligada a la
CDR que tiene un buen sitio de unión a antígeno. Si es necesario se
pueden sustituir aminoácidos de la región flanqueante en la región
variable del anticuerpo de manera que la CDR de un anticuerpo
humano reformado forme un sitio de unión al antígeno adecuado (Sato,
K. et al., Cancer Res. (1993) 53,
851-856).
Se usan regiones de un anticuerpo humano para
las regiones C de un anticuerpo quimérico y un anticuerpo
humanizado. Por ejemplo, para la cadena H pueden usarse C\gamma1,
C\gamma2, C\gamma3 o C\gamma4C, y para la cadena L, C\kappa
o C\lambda. Además, para mejorar la estabilidad de los anticuerpos
o la producción de los mismos, puede modificarse la región C del
anticuerpo humano.
Un anticuerpo quimérico consiste en la región
variable de un anticuerpo procedente de un mamífero distinto de un
ser humano y una región constante procedente de un anticuerpo
humano. Sin embargo, un anticuerpo humanizado consiste en la CDR de
un anticuerpo procedente de un mamífero distinto de un ser humano y
la región flanqueante y región C procedentes de un anticuerpo
humano. Como el anticuerpo humanizado se diseña de tal manera que
la antigenicidad sea baja en el cuerpo humano, es útil como
ingrediente activo de un agente terapéutico de la presente
invención.
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El anticuerpo usado en la presente invención no
está limitado a la molécula entera siempre que se una al glipicano
3 y suprima la proliferación celular, y puede ser un fragmento del
anticuerpo o un producto modificado del mismo. Se incluyen tanto un
anticuerpo bivalente como un anticuerpo monovalente. Los ejemplos
del fragmento de un anticuerpo incluyen Fab, F(ab')2, Fv,
Fab/c que tiene un Fab y un Fc completo y un Fv monocatenario
(svFv) donde el Fv de la cadena H o la cadena L se une con un
enlazador apropiado. En concreto, se sintetiza un fragmento de
anticuerpo tratando el anticuerpo con una enzima tal como papaína o
pepsina, o se construyen genes que codifican estos fragmentos de
anticuerpo, los genes se introducen en vectores de expresión y
después los genes se expresan por células hospedadoras adecuadas
(véase, por ejemplo, Co., M.S. et al., J. Immunol. (1994)
152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H.
Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic
Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology
(1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi,
E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663,
Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121,
663-669 y Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991)
9, 132-137).
Se obtiene un scFv por unión de la región V de
la cadena H y la región V de la cadena L de anticuerpos. En los
scFv, la región V de la cadena H y la región V de la cadena L se
unen a través de un enlazador, o preferiblemente un enlazador
peptídico (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). La región V de la
cadena H y la región V de la cadena L de scFv pueden proceder de
cualquiera de los anticuerpos descritos en esta memoria
descriptiva. Como enlazador peptídico para unir las regiones V, por
ejemplo, se usa cualquier péptido monocatenario que comprende de 12
a 19 restos aminoacídicos.
Un ADN que codifica scFv puede obtenerse como se
indica a continuación. La amplificación se realiza por el método de
PCR usando como plantillas el ADN entero o las partes de ADN que
codifican secuencias de aminoácidos deseadas (de un ADN que
codifica la cadena H o la región V de la cadena H del anticuerpo
anterior y un ADN que codifica la cadena L o la región V de la
cadena L), y usando un par de cebadores que especifica los dos
extremos. Después se realiza la amplificación mediante el uso
combinado de un ADN que codifica una parte del enlazador peptídico
y un par de cebadores que especifican que los dos extremos se unan
respectivamente a la cadena H y la cadena L.
Además, una vez que se ha preparado un ADN que
codifica scFv, pueden obtenerse vectores de expresión que contienen
los ADN y hospedadores transformados con los vectores de expresión
de acuerdo con el método convencional. Además, mediante el uso del
hospedador, pueden obtenerse scFv de acuerdo con el método
convencional.
Estos fragmentos de anticuerpo pueden producirse
usando hospedadores obteniendo los genes de los mismos de una forma
similar al método anterior y causando después la expresión de los
genes. El "anticuerpo" de la presente invención también
incluye estos fragmentos de anticuerpo.
Como anticuerpo modificado, pueden usarse
anticuerpos anti-glipicano unidos al
polietilenglicol (PEG) o una de diversas moléculas tales como una
sustancia citotóxica. El "anticuerpo" de la presente invención
también comprende estos anticuerpos modificados. Dicho anticuerpo
modificado se puede obtener modificando químicamente al anticuerpo
obtenido. Además, ya se ha establecido en la técnica un método de
modificación de anticuerpos.
Además, el anticuerpo usado en la presente
invención puede ser un anticuerpo biespecífico. El anticuerpo
biespecífico puede tener sitios de unión a antígeno que reconocen
un epítopo diferente en una molécula de glipicano 3. Como
alternativa, un sitio de unión a antígeno puede reconocer glipicano
3 y el otro sitio de unión a antígeno puede reconocer una sustancia
citotóxica tal como un agente quimioterapéutico, toxinas derivadas
de células, una sustancia radiactiva o similar. En este caso, una
sustancia citotóxica se deja actuar directamente en una célula que
expresa glipicano 3 para dañar específicamente las células
tumorales, de manera que pueda reprimirse la proliferación de las
células tumorales. Un anticuerpo biespecífico puede prepararse por
unión de pares H-L de dos tipos de anticuerpos, y
también puede obtenerse por fusión de hibridomas que producen
diferentes anticuerpos monoclonales para preparar células
fusionadas productoras de anticuerpos biespecíficos. Además, un
anticuerpo biespecífico también puede prepararse por técnicas de
ingeniería genética.
Los genes de anticuerpo construidos como se ha
descrito anteriormente pueden expresarse y por lo tanto obtenerse
por un método conocido. En el caso de células de mamífero, un gen
puede expresarse por medio de la unión funcional a un promotor útil
que se emplea generalmente del gen de anticuerpo a expresar, y por
unión a una señal de poliA cadena abajo en posición 3' del mismo.
Un promotor/potenciador es, por ejemplo, el promotor/potenciador
temprano inmediato del citomegalovirus humano.
Además, los ejemplos de otros
promotores/potenciadores que se pueden usar en la presente invención
para la expresión de anticuerpos incluyen un promotor/potenciador
de un virus tal como retrovirus, un virus de polioma, un adenovirus
o un virus de simio 40 (SV40), o un promotor/potenciador derivado de
células de mamífero tal como el factor de elongación humano 1a
(HEF1a).
Cuando se usa un promotor/potenciador de SV40,
la expresión génica puede realizarse fácilmente por el método de
Mulligan et al (Nature (1979) 277, 108) y cuando se usa un
promotor/potenciador de HEF1a, la expresión génica puede realizarse
fácilmente por el método de Mizushima et al (Nucleic Acids
Res. (1990) 18, 5322).
En el caso de Escherichia coli se unen de
manera funcional un promotor útil que se usa generalmente, una
secuencia señal para la secreción del anticuerpo y el gen del
anticuerpo a expresar, de manera que pueda expresarse el gen. Los
ejemplos de un promotor incluyen un promotor de lacz y un promotor
de araB. Cuando se usa el promotor de lacz, el gen de anticuerpo se
puede expresar por el método de Ward et al (Nature (1098)
341, 544-546; FASEB J. (1992) 6,
2422-2427), o cuando se usa el promotor de araB, el
gen de anticuerpo se puede expresar por el método de Better et
al (1988) 240, 1041-1043).
Como secuencia señal para la secreción de
anticuerpo puede usarse una secuencia señal pelB (Lei, S. P. et
al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) cuando el anticuerpo se
produce en el periplasma de Escherichia coli. Después se
aíslan los anticuerpos producidos en el periplasma, se repliega la
estructura del anticuerpo de manera apropiada y se usa.
El origen de replicación que se puede usar
procede de un SV40, un poliomavirus, un adenovirus, un papilomavirus
bovino (BPV) o similares. Además, para amplificar el número de
copias génicas en un sistema de células hospedadoras, un vector de
expresión puede contener un gen de aminoglucósido transferasa (APH),
un gen de timidina quinasa (TK), un gen de xantina guanina
fosforribosiltransferasa de Escherichia coli (Ecogpt), un gen
de dihidrofolato reductasa (dhfr) o similar como marcador de
selección.
Para producir los anticuerpos usados en la
presente invención se usa cualquier sistema de expresión, tal como
un sistema de células eucariotas o un sistema de células
procariotas. Los ejemplos de células eucariotas incluyen células
animales tales como células de un sistema de células de mamífero
establecido o un sistema de células de insecto, células de hongos
filamentosos y células de levadura. Los ejemplos de células
procariotas incluyen células bacterianas tales como células
Escherichia coli.
Preferiblemente, los anticuerpos que se usan en
la presente invención se expresan en células de mamífero tales como
células CHO, COS, de mieloma, BHK, Vero o HeLa.
Después, una célula hospedadora transformada se
cultiva in vitro o in vivo de manera que la célula
hospedadora produzca un anticuerpo diana. Las células hospedadoras
se cultivan de acuerdo con un método conocido. Por ejemplo, como
solución de cultivo pueden usarse DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM o
similares. Se puede usar en combinación un fluido sérico tal como
suero bovino fetal (FCS).
Los anticuerpos expresados y producidos como se
ha descrito anteriormente pueden aislarse de las células o animales
hospedadores y purificarse a un nivel uniforme. El aislamiento y
purificación de los anticuerpos a usar en la presente invención
pueden realizarse usando columnas de afinidad. Un ejemplo de una
columna que usa una columna de proteína A es Hyper D, POROS,
Sepharose F.F. (Pharmacia). Se pueden usar otros métodos
convencionales de aislamiento y purificación que se emplean para
proteínas y no hay limitación con respecto a su uso. Por ejemplo,
además de la columna de afinidad anterior pueden seleccionarse de
manera apropiada y combinarse para uso una columna de
cromatografía, un filtro, ultrafiltración, un método de
desplazamiento salino, diálisis y similares, de manera que los
anticuerpos pueden aislarse y purificarse (Antibodies A Laboratory
Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory,
1988).
Pueden emplearse medios conocidos para ensayar
la actividad de unión a antígenos del anticuerpo que se usa en la
presente invención (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David
Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) y la actividad para
inhibir la unión del receptor al ligando (Harada, A. et al.,
International Immunology (1993)5,
681-690).
Como método para medir la actividad de unión a
antígeno del anticuerpo anti-glipicano 3 usado en la
presente invención pueden emplearse ELISA (ensayo de
inmunoabsorbente ligado a enzima), EIA (inmunoensayo enzimático),
RIA (radioinmunoensayo) o la técnica de anticuerpos fluorescentes.
Por ejemplo, cuando se emplea el inmunoensayo enzimático, a una
placa recubierta con glipicano 3 se le añade una muestra que
contiene anticuerpos anti-glipicano 3, tal como el
sobrenadante de cultivo de células productoras de anticuerpos
anti-glipicano 3 o anticuerpos purificados. Después
se añade un anticuerpo secundario marcado con una enzima tal como
fosfatasa alcalina. La placa después se incuba y posteriormente se
lava, se añade un sustrato enzimático tal como ácido
p-nitrofenil fosfórico y después se mide la
absorbancia, de manera que puede evaluarse la actividad de unión a
antígeno.
Para confirmar la actividad del anticuerpo usado
en la presente invención se mide la actividad de neutralización de
un anticuerpo anti-glipicano 3.
Los anticuerpos usados en la presente invención
tienen actividad ADCC o actividad CDC como actividad citotóxica.
La actividad ADCC puede medirse mezclando
células efectoras, células diana y anticuerpos
anti-glipicano 3 y después examinando el grado de
ADCC. Como células efectoras pueden usarse, por ejemplo,
esplenocitos de ratón, sangre periférica humana o monocitos
aislados a partir de la médula ósea. Como células diana pueden
usarse, por ejemplo, líneas celulares humanas establecidas tales
como la línea celular humana de cáncer hepático
HuH-7. Las células diana previamente se marcan con
^{51}Cr, se añaden anticuerpos anti-glipicano 3 a
las células y después se realiza la incubación. A continuación se
añaden células efectoras en una relación apropiada entre dichas
células y las células diana y después se realiza una incubación.
Después de la incubación se recoge el sobrenadante y se cuenta la
radiactividad en el sobrenadante, de forma que puede medirse la
actividad ADCC.
La actividad CDC puede medirse mezclando las
células diana marcadas anteriores y los anticuerpos
anti-glipicano 3, añadiendo complementos,
realizando la incubación, cultivando y después contando la
radiactividad en el sobrenadante.
Los anticuerpos necesitan una parte Fc para
ejercer la actividad citotóxica. Cuando el inhibidor del crecimiento
celular de la presente invención utiliza la actividad citotóxica de
un anticuerpo, es necesario que anticuerpo
anti-glipicano 3 usado en la presente invención
contenga la parte Fc.
El anticuerpo anti-glipicano 3
de la presente invención puede usarse en la fabricación de
medicamentos para inhibir la vascularización.
El inhibidor del crecimiento celular de la
presente invención se usa en la fabricación de medicamentos para
tratar o mejorar cánceres.
Los ejemplos preferidos de células de carcinoma
diana del inhibidor del crecimiento celular de la presente
invención incluyen, pero no se limitan específicamente a células de
cáncer hepático, células de cáncer pulmonar, células de cáncer de
colon, células de cáncer mamario, células de cáncer de próstata,
células de leucemia, células de linfoma y células de cáncer
pancreático. Se prefieren particularmente las células de cáncer
hepático.
La dosis eficaz se selecciona del intervalo de
0,001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por administración. Como
alternativa, puede seleccionarse una dosis en el intervalo de 0,01 a
100.000 mg/peso corporal por paciente. Sin embargo, la dosis del
agente terapéutico que contiene los anticuerpos
anti-glipicano 3 de la presente invención no se
limita a estas dosis.
Además, en cuanto al momento de dosificación del
agente terapéutico de la presente invención, el agente puede
administrarse antes o después del inicio de los síntomas clínicos de
una enfermedad.
El agente terapéutico que contiene anticuerpos
anti-glipicano 3 como ingrediente activo de la
presente invención puede formularse de acuerdo con métodos
convencionales (Remington's Pharmaceutical Science, última edición,
Mark Publishing Company, Easton, U.S.A) y puede contener un vehículo
farmacéuticamente aceptable y un aditivo conjuntamente.
Los ejemplos de dichos vehículos y aditivos
farmacéuticos incluyen agua, un disolvente orgánico
farmacéuticamente aceptable, colágeno, alcohol polivinílico,
polivinilpirrolidona, polímero carboxivinílico, carboximetilcelulosa
sódica, poliacrilato sódico, alginato sódico, dextrano soluble en
agua, carboximetilalmidón sódico, pectina, metil celulosa, etil
celulosa, goma xantana, goma arábiga, caseína, agar,
polietilenglicol, diglicerina, glicerina, propilenglicol, vaselina,
parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina de suero
humano (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, y un tensioactivo que sea
aceptable como aditivo farmacéutico.
De acuerdo con la forma de dosificación del
agente terapéutico de la presente invención se selecciona uno o una
combinación apropiada de los aditivos anteriores, pero la invención
no se limita por esto. Por ejemplo, el agente que puede usarse como
preparación farmacéutica para inyección puede prepararse disolviendo
anticuerpos anti-glipicano 3 purificados en un
disolvente tal como una solución fisiológica salina, un tampón o una
solución de glucosa, y después añadiendo un inhibidor de la
adsorción tal como Tween80, Tween20, gelatina o albúmina de suero
humano a la solución. Como alternativa, puede usarse un agente
liofilizado para preparar una forma de dosificación que se disuelve
para la reconstitución antes del uso. Como excipiente para la
liofilización puede usarse un alcohol de azúcar o sacáridos, tales
como manitol o glucosa.
La fig. 1 muestra la actividad ADCC en células
HuH-7 de anticuerpos anti-glipicano
3 (K6534).
La fig. 2 muestra la actividad CDC en células
HuH-7 de anticuerpos anti-glipicano
3 (K6511).
La fig. 3 muestra la expresión de glipicano en
células HuH-7.
La fig. 4A muestra los resultados de un análisis
FACS de la expresión de GPC3 por líneas celulares de cáncer
pulmonar humano. Son los resultados de análisis con anticuerpos
anti-glipicano 3 (K6534).
La fig. 4B muestra los resultados del análisis
FACS de la expresión de GPC3 por líneas celulares de leucemia
humana. Son los resultados de análisis con anticuerpos
anti-glipicano 3 (K6534).
La fig. 4C muestra los resultados del análisis
FACS de la expresión de GPC3 por líneas celulares de linfoma
humano. Son los resultados de análisis con anticuerpos
anti-glipicano 3 (K6534).
La fig. 4D muestra los resultados del análisis
FACS de la expresión de GPC3 por líneas celulares de cáncer de
colon humano. Son los resultados de análisis con anticuerpos
anti-glipicano 3 (K6534).
La fig. 4E muestra los resultados del análisis
FACS de la expresión de GPC3 por líneas celulares de cáncer mamario
humano. Son los resultados de análisis con anticuerpos
anti-glipicano 3 (K6534).
La fig. 4F muestra los resultados del análisis
FACS de la expresión de GPC3 por líneas celulares de cáncer de
próstata humano. Son los resultados de análisis con anticuerpos
anti-glipicano 3 (K6534).
La fig. 4G muestra los resultados del análisis
FACS de la expresión de GPC3 por la línea celular de cáncer
pancreático humano y la línea celular de cáncer hepático humano. Son
los resultados de análisis con anticuerpos
anti-glipicano 3 (K6534).
La presente invención se describirá
adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Sin
embargo, el alcance técnico de la presente invención no se limita
por estos ejemplos o similares.
Ejemplo
1
Se sintetizó un péptido que tenía una secuencia
de aminoácidos (del 355º al 371º aminoácido)
(RQYRSAYYPEDL
FIDKK) de la proteína glipicano-3 humana. El péptido sintético se unió a hemocianina de lapa californiana (KLH) usando un agente de reticulación del tipo de maleinimida benzoiloxi succinimida (MBS), preparándose de esta manera un inmunógeno. Se inmunizaron ratones (BALB/c, hembras, de 6 semanas de edad) 3 veces con el inmunógeno a
100 \mug/ratón. Se ensayaron los títulos de anticuerpo en suero. Un método empleado como método de ensayo de título de anticuerpos implica hacer que el suero diluido reaccione con los péptidos (0,5 \mug) inmovilizados en una placa, realizar la reacción con anticuerpos anti-ratón marcados con HRP, añadir un sustrato y después medir la absorbancia a 450 nm del color desarrollado del color desarrollado de esta manera (un método ELISA en fase sólida de péptidos). Después de confirmar los títulos de anticuerpo, se recogieron los esplenocitos y después se fusionaron (Köhler, G, Milstein, C: Nature, 256: 495 (1975)) con células de mieloma (P3/X63-Ag8), preparándose de esta manera hibridomas. Después se purificaron anticuerpos monoclonales producidos por cinco tipos de hibridomas. La actividad de unión al péptido se midió usando el método ELISA en fase sólida de péptidos y después se seleccionaron anticuerpos IgG1 (en lo sucesivo K6534) y anticuerpos IgG3 (en lo sucesivo K6511) que tenían alta actividad de unión.
FIDKK) de la proteína glipicano-3 humana. El péptido sintético se unió a hemocianina de lapa californiana (KLH) usando un agente de reticulación del tipo de maleinimida benzoiloxi succinimida (MBS), preparándose de esta manera un inmunógeno. Se inmunizaron ratones (BALB/c, hembras, de 6 semanas de edad) 3 veces con el inmunógeno a
100 \mug/ratón. Se ensayaron los títulos de anticuerpo en suero. Un método empleado como método de ensayo de título de anticuerpos implica hacer que el suero diluido reaccione con los péptidos (0,5 \mug) inmovilizados en una placa, realizar la reacción con anticuerpos anti-ratón marcados con HRP, añadir un sustrato y después medir la absorbancia a 450 nm del color desarrollado del color desarrollado de esta manera (un método ELISA en fase sólida de péptidos). Después de confirmar los títulos de anticuerpo, se recogieron los esplenocitos y después se fusionaron (Köhler, G, Milstein, C: Nature, 256: 495 (1975)) con células de mieloma (P3/X63-Ag8), preparándose de esta manera hibridomas. Después se purificaron anticuerpos monoclonales producidos por cinco tipos de hibridomas. La actividad de unión al péptido se midió usando el método ELISA en fase sólida de péptidos y después se seleccionaron anticuerpos IgG1 (en lo sucesivo K6534) y anticuerpos IgG3 (en lo sucesivo K6511) que tenían alta actividad de unión.
Ejemplo
2
Se midieron la actividad ADCC (citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpos) y la actividad CDC
(citotoxicidad dependiente de complemento) de acuerdo con el método
de Current Protocols in Immunology; capítulo 7 Immunologic studies
in humans, Editor, John E, Cologan et al., John Wiley &
Sons, Inc., 1993.
Se extrajo el bazo a partir de un ratón CBA/N (8
semanas de edad, macho) y después se aislaron los esplenocitos en
medio RPMI1640 (GIBCO). Las células se lavaron en el mismo medio que
contenía suero bovino fetal al 10% (FBS, HyClone) y después se
preparó una concentración celular a 5x10^{6}/ml, preparándose de
esta manera las células efectoras.
Se diluyó complemento de cría de conejo
(CEDARLANE) 10 veces en medio DMEM que contenía FBS al 10% (GIBCO),
preparándose de esta manera una solución de complemento.
Se cultivó una línea de células de cáncer
hepático humano HuH-7 (Japanese Collection of
Research Bioresources (JCRB) Nº JCRB0403, Human Science Research
Support Bank (Human Science Kenkyu Shien Bank)) con 0,2 mCi de
^{51}Cr-cromato sódico (Amersham Pharmacia
Biotech) en medio DMEM que contenía FBS al 10% a 37ºC durante 1
hora, realizándose de esta manera el marcaje radiactivo. Después del
marcaje radiactivo, las células se lavaron 3 veces en medio
RPMI1640 que contenía FBS al 10% y se preparó una concentración
celular a 2x10^{5}/ml, obteniéndose de esta manera las células
diana.
Se añadieron 50 \mul de las células diana y de
anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534) a una placa de
fondo en U de 96 pocillos (Beckton Dickinson) y después se dejaron
reaccionar en hielo durante 15 minutos. Después se añadieron
100 \mul de células efectoras y posteriormente se cultivaron dentro de un incubador con gas dióxido de carbono durante 4 horas.
100 \mul de células efectoras y posteriormente se cultivaron dentro de un incubador con gas dióxido de carbono durante 4 horas.
La concentración final de los anticuerpos se
preparó a 0 ó 10 \mug/ml. Después del cultivo, se recogieron 100
\mul
del sobrenadante y después se midió la radiactividad usando un contador gamma (COBRA II AUTO-GAMMA, MODELO D5005, Packard Instrument Company). La actividad citotóxica (%) se calculó usando la fórmula (A-C)(B-C)x100. Aquí "A" representa la radiactividad (cpm) en cada muestra, "B" representa la radiactividad (cpm) en una muestra suplementada con NP-40 al 1% (Nacalai Tesque) y "C" representa la radioactividad (cpm) en una muestra que contiene sólo células diana. El experimento se realizó por duplicado y se calcularon los valores medio.
del sobrenadante y después se midió la radiactividad usando un contador gamma (COBRA II AUTO-GAMMA, MODELO D5005, Packard Instrument Company). La actividad citotóxica (%) se calculó usando la fórmula (A-C)(B-C)x100. Aquí "A" representa la radiactividad (cpm) en cada muestra, "B" representa la radiactividad (cpm) en una muestra suplementada con NP-40 al 1% (Nacalai Tesque) y "C" representa la radioactividad (cpm) en una muestra que contiene sólo células diana. El experimento se realizó por duplicado y se calcularon los valores medio.
Se añadieron 50 \mul de las células diana y de
anticuerpos anti-glipicano 3 (K6511) a una placa de
fondo en U de 96 pocillos (Beckton Dickinson) y después se dejaron
reaccionar en hielo durante 15 minutos. Posteriormente se añadieron
100 \mul de una solución de complemento, seguido de 4 horas de
cultivo en un incubador con gas dióxido de carbono. La
concentración final del anticuerpo fue de 0 ó 3 \mug/ml. Después
del cultivo, se recogieron 100 \mul del sobrenadante y
posteriormente se midió la radiactividad usando un contador gamma.
La actividad citotóxica (%) se calculó de la misma manera que en el
punto en "4. Medición de la actividad ADCC". El experimento se
realizó por duplicado y se calcularon los valores medios.
La Figura 1 muestra la actividad ADCC y la
Figura 2 muestra la actividad CDC. Estos resultados revelaron que
los anticuerpos anti-glipicano 3 ejercen actividad
ADCC y actividad CDC en una línea de células de cáncer hepático
humano HuH-7 y de esta manera inhiben la
proliferación celular.
Ejemplo
3
Se suspendieron aproximadamente 5x10^{5}
células HuH-7 en 100 \mul de FACS/PBS (preparado
disolviendo 1 g de albúmina de suero bovino (SIGMA) en 1 l de
CellWASH (Beckton Dickinson)). Después se añadieron anticuerpos
anti-glipicano 3 (K6511) o IgG2a de ratón
(Biogenesis) como anticuerpos de control a 25 \mug/ml y
posteriormente la solución se dejó en reposo en hielo durante 30
minutos. Después de lavar con FACS/PBS, el producto se suspendió en
100 \mul de FACS/PBS. Se añadieron 4 \mul de Ig de cabra
anti-ratón FITC (Becton Dickinson) y después la
solución se dejó en reposo en hielo durante 30 minutos.
Después de lavar dos veces con FACS/PBS, el
producto se suspendió en 1 ml de FACS/PBS. La intensidad de
fluorescencia de las células se midió usando un citómetro de flujo
(EPICS XL, BECKMAN COULTER).
La Figura 3 muestra el resultado de la
citometría de flujo. Se expresó glipicano 3 en células
HuH-7, lo cual sugiere que los anticuerpos
anti-glipicano 3 se unen al glipicano 3 expresado en
las células inhibiendo de esta manera la proliferación celular
(Fig. 3).
Ejemplo
4
Se analizó la expresión de glipicano 3 (GPC3)
por líneas celulares de cáncer humano (pulmón, colón, recto,
mamario, próstata, leucemia, linfoma, mieloma, páncreas e hígado)
usando FCM.
Las células se cultivaron durante 2 días y
después se sometieron al ensayo. Las células adheridas se recogieron
usando Tripsina-EDTA (Nº de Cat.
25300-054, Lote 14210, GIBCO) que se había diluido
10 veces con tampón de disociación celular (Nº de Cat.
13150-016, Lote 1098554, GIBCO). Las células
recogidas se dejaron reaccionar en hielo con anticuerpos
anti-glipicano 3 (K6534, 600 \mug/ml) o
anticuerpos mIgG2a como control negativo (Biogenesis,
M-IgG2a-i, Lote EA990719A, 1 mg/ml)
(concentración final de anticuerpo de 10 \mug/ml). Después de
lavarse, las células se dejaron reaccionar con anticuerpo Ig
anti-ratón marcado con FITC (Nº de Cat. 349031, BD
PharMingen) en hielo (2 \mul/ensayo). Después de lavar las
células, se midió la intensidad de fluorescencia usando un
citómetro de flujo (EPICS XL, BECKMAN COULTER). Como resultado, se
confirmó la expresión de GPC3 en las líneas de células de cáncer de
pulmón (A549, NCI-H460, NCI-H23,
NCI-H226, DMS114, EKVX, HOP-62 y
NCI-H322 M); las líneas de células de leucemia
P30/OHK, BALL-1, THP-1 y P39/TSU),
las líneas de células de linfoma (MLMA, Ramos y U937); las líneas
de células de cáncer de colon (SW480, COLO205, LoVo y SW837), la
líneas de células de cáncer mamario
(MDA-MB-231,
SK-BR-3 y
MDA-MB-468), las líneas de células
de cáncer de próstata (LNCaP y 22Rv1), la línea de células de
cáncer pancreático (MIAPaCa-2) y la línea de células
de cáncer hepático (hígado) (HepG2). Basándose en estos resultados,
se concluye que el inhibidor del crecimiento celular de la presente
invención es útil para tratar el cáncer de pulmón, cáncer de colon,
cáncer mamario, cáncer de próstata, leucemia, linfoma, cáncer
pancreático y similares.
De acuerdo con la presente invención se
proporciona un anticuerpo anti-glipicano para uso en
el tratamiento de cánceres. Además, de acuerdo con la presente
invención el anticuerpo puede usarse en la inhibición del
crecimiento celular de un carcinoma. El anticuerpo
anti-glipicano 3 se une al glipicano 3 que se
expresa en células HuH-7 de una línea celular de
cáncer hepático humano inhibiendo la proliferación celular.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes
de patente citadas en el presente documento se incorporan como
referencia en su totalidad. Por lo tanto, un especialista en la
técnica entenderá fácilmente que dentro del alcance de la invención
son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente
invención sin apartarse de la idea técnica y el alcance de la
invención descritos en las reivindicaciones adjuntas. La presente
invención pretende incluir estas modificaciones y variaciones.
Claims (8)
1. Uso de un anticuerpo
anti-glipicano 3 en la fabricación de un medicamento
para uso como un agente anticanceroso.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde
el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado
o un anticuerpo quimérico.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2,
donde el medicamento se usa para tratar o mejorar una afección que
se produce como consecuencia de un cáncer hepático.
4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde
el cáncer es cáncer hepático.
5. Un anticuerpo anti-glipicano
3 para uso en el tratamiento de un cáncer.
6. El anticuerpo anti-glipicano
3 de acuerdo con la reivindicación 5, donde el anticuerpo es un
anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo
quimérico.
7. El anticuerpo anti-glipicano
3 de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, donde el anticuerpo se usa
para tratar o mejorar una afección que se produce como resultado de
un cáncer hepático.
8. El anticuerpo anti-glipicano
3 de acuerdo con la reivindicación 5, donde el cáncer es cáncer
hepático.
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