JPWO2019230868A1 - 単ドメイン抗体含有リガンド結合分子 - Google Patents
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Abstract
Description
(A1)リガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子は単ドメイン抗体を含み、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり且つ少なくとも一つの切断サイトが導入されており、当該切断サイトが切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、リガンド結合分子。
(A2)前記切断サイトが切断された状態では、前記リガンドがリガンド結合分子から遊離する、(A1)に記載のリガンド結合分子。
(A3)前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、(A1)または(A2)に記載のリガンド結合分子。
(A4)前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、(A3)に記載のリガンド結合分子。
(A5)前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、(A4)に記載のリガンド結合分子。
(A6)前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、(A4)に記載のリガンド結合分子。
(A7)前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(A3)から(A6)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A8)前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号:2〜82、788〜827で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含む配列である、(A3)から(A7)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A9)前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、(A3)から(A8)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A10)前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(A9)に記載のリガンド結合分子。
(A11)前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、(A9)または(A10)に記載のリガンド結合分子。
(A12)前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(A11)に記載のリガンド結合分子。
(A13)前記単ドメイン抗体はVHH、または単ドメインVH抗体、また単ドメインVL抗体である、(A1)から(A12)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A14)前記単ドメイン抗体はVHHまたは単ドメインVH抗体であり、前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、(A13)に記載のリガンド結合分子: 単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体12番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体31番アミノ酸(Kabatナンバリング)から35b番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体40番アミノ酸(Kabatナンバリング)から47番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から65番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体55番アミノ酸(Kabatナンバリング)から69番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体73番アミノ酸(Kabatナンバリング)から79番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体83番アミノ酸(Kabatナンバリング)から89番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から99番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から102番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体101番アミノ酸(Kabatナンバリング)から113番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。
(A15)前記単ドメイン抗体は単ドメインVL抗体であり、前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、(A13)に記載のリガンド結合分子: 単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から19番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体24番アミノ酸(Kabatナンバリング)から34番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体39番アミノ酸(Kabatナンバリング)から46番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体49番アミノ酸(Kabatナンバリング)から62番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から56番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体89番アミノ酸(Kabatナンバリング)から97番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体96番アミノ酸(Kabatナンバリング)から107番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。
(A16)前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドと結合することで前記リガンドの生物活性を阻害する、(A1)から(A15)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A17)前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドに対する中和活性を有する、(A1)から(A16)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A18)前記リガンド結合分子は、前記切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列を含む単ドメイン抗体のみを含む、(A1)から(A17)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A19)前記リガンド結合分子は更に抗体Fc領域を含む、(A1)から(A18)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A20)前記リガンド結合分子はN末端からC末端に向かって単ドメイン抗体-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を含む、(A1)から(A19)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A21)前記リガンド結合分子は、単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を二つ含む二量体である、(A1)から(A19)に記載のリガンド結合分子。
(A22)前記抗体Fc領域は、配列番号:103〜106で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域、またはこれらのFc領域に改変を加えたFc領域変異体である、(A19)から(A21)に記載のリガンド結合分子。
(A23)前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、(A1)から(A22)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A24)前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、(A1)から(A23)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A25)前記リガンドはCXCL10、IL-12、PD-1、IL-6R、またはIL-1Raである、(A1)から(A24)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A26)前記リガンドと結合している、(A1)から(A25)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A27)前記リガンドと融合されている、(A1)から(A25)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(A28)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、当該リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、(A27)に記載のリガンド結合分子。
(A29)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(A27)または(A28)に記載のリガンド結合分子。
(A30)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(A29)に記載のリガンド結合分子。
(A31)前記リガンドと、(A1)から(A25)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
(A32)前記リガンドと(A1)から(A25)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
(A33)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、前記単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、(A32)に記載の融合タンパク質。
(A34)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(A32)または(A33)に記載の融合タンパク質。
(A35)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(A34)に記載の融合タンパク質。
(A36)N末端からC末端に向かってリガンド-リンカー-リガンド結合分子の順で融合されている、(A34)または(A35)に記載の融合タンパク質。
(B1)リガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子は単ドメイン抗体を含み、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり且つ少なくとも一つのプロテアーゼ切断配列を含み、当該プロテアーゼ切断配列は標的組織特異的プロテアーゼにより切断可能であり、当該プロテアーゼ切断配列が切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、リガンド結合分子。
(B2)前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態では、前記リガンドがリガンド結合分子から遊離する、(B1)に記載のリガンド結合分子。
(B3)前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、(B1)から(B2)のいずれか一つ記載のリガンド結合分子。
(B4)前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、(B1)から(B2)記載のリガンド結合分子。
(B5)前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(B1)から(B4)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B6)前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号:2〜82、788〜827で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含む配列である、(B1)から(B5)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B7)前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、(B1)から(B6)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B8)前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(B7)に記載のリガンド結合分子。
(B9)前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、(B7)または(B8)に記載のリガンド結合分子。
(B10)前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(B9)に記載のリガンド結合分子。
(B11)前記単ドメイン抗体はVHH、または単ドメインVH抗体、または単ドメインVL抗体、である、(B1)から(B10)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B12)前記単ドメイン抗体はVHHまたは単ドメインVH抗体であり、前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、(B11)に記載のリガンド結合分子: 単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体12番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体31番アミノ酸(Kabatナンバリング)から35b番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体40番アミノ酸(Kabatナンバリング)から47番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から65番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体55番アミノ酸(Kabatナンバリング)から69番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体73番アミノ酸(Kabatナンバリング)から79番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体83番アミノ酸(Kabatナンバリング)から89番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から99番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から102番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体101番アミノ酸(Kabatナンバリング)から113番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。
(B13)前記単ドメイン抗体は単ドメインVL抗体であり、前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、(B11)に記載のリガンド結合分子: 単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から19番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体24番アミノ酸(Kabatナンバリング)から34番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体39番アミノ酸(Kabatナンバリング)から46番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体49番アミノ酸(Kabatナンバリング)から62番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から56番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体89番アミノ酸(Kabatナンバリング)から97番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体96番アミノ酸(Kabatナンバリング)から107番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。
(B14)前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドと結合することで前記リガンドの生物活性を阻害する、(B1)から(B13)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B15)前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドに対する中和活性を有する、(B1)から(B14)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B16)前記リガンド結合分子は、前記切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列を含む単ドメイン抗体のみを含む、(B1)から(B15)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B17)前記リガンド結合分子は更に抗体Fc領域を含む、(B1)から(B16)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B18)前記リガンド結合分子はN末端からC末端に向かって単ドメイン抗体-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を含む、(B1)から(B17)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B19)前記リガンド結合分子は、単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を二つ含む二量体である、(B1)から(B17)に記載のリガンド結合分子。
(B20)前記抗体Fc領域は、配列番号:103〜106で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域、またはこれらのFc領域に改変を加えたFc領域変異体である、(B17)から(B19)に記載のリガンド結合分子。
(B21)前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、(B1)から(B20)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B22)前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、(B1)から(B21)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B23)前記リガンドはCXCL10、IL-12、PD-1、IL-6R、またはIL-1Raである、(B1)から(B22)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B24)前記リガンドと結合している、(B1)から(B23)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B25)前記リガンドと融合されている、(B1)から(B23)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(B26)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、当該リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、(B25)に記載のリガンド結合分子。
(B27)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(B25)または(B26)に記載のリガンド結合分子。
(B28)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(B27)に記載のリガンド結合分子。
(B29)前記リガンドと、(B1)から(B23)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
(B30)前記リガンドと(B1)から(B23)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
(B31)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、前記単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、(B30)に記載の融合タンパク質。
(B32)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(B30)または(B31)に記載の融合タンパク質。
(B33)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(B32)に記載の融合タンパク質。
(B34)N末端からC末端に向かってリガンド-リンカー-リガンド結合分子の順で融合されている、(B32)または(B33)に記載の融合タンパク質。
(C1)単ドメイン抗体を含むリガンド結合分子であり、当該単ドメイン抗体はVHHまたは単ドメインVH抗体であり、当該単ドメイン抗体は、下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に切断サイトを有する: 単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体12番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体31番アミノ酸(Kabatナンバリング)から35b番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体40番アミノ酸(Kabatナンバリング)から47番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から65番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体55番アミノ酸(Kabatナンバリング)から69番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体73番アミノ酸(Kabatナンバリング)から79番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体83番アミノ酸(Kabatナンバリング)から89番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から99番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から102番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体101番アミノ酸(Kabatナンバリング)から113番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。
(C2)単ドメイン抗体を含むリガンド結合分子であり、当該単ドメイン抗体は単ドメインVL抗体であり、当該単ドメイン抗体は、下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に切断サイトを有する: 単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から19番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体24番アミノ酸(Kabatナンバリング)から34番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体39番アミノ酸(Kabatナンバリング)から46番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体49番アミノ酸(Kabatナンバリング)から62番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から56番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体89番アミノ酸(Kabatナンバリング)から97番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体96番アミノ酸(Kabatナンバリング)から107番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。
(C3)前記単ドメイン抗体は前記リガンドに結合可能であり、前記切断サイトが切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、(C1)または(C2)に記載のリガンド結合分子。
(C4)前記切断サイトが切断された状態では、前記リガンドが前記リガンド結合分子から遊離する、(C1)から(C3)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C5)前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、(C1)から(C4)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C6)前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、(C5)に記載のリガンド結合分子。
(C7)前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、(C6)に記載のリガンド結合分子。
(C8)前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、(C6)に記載のリガンド結合分子。
(C9)前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、(C5)から(C8)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C10)前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号:2〜82、788〜827で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含む配列である、(C5)から(C9)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C11)前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、(C5)から(C10)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C12)前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(C11)に記載のリガンド結合分子。
(C13)前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、(C11)または(C12)に記載のリガンド結合分子。
(C14)前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、(C13)に記載のリガンド結合分子。
(C15)前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドと結合することで前記リガンドの生物活性を阻害する、(C1)から(C14)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C16)前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドに対する中和活性を有する、(C1)から(C15)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C17)前記リガンド結合分子は、前記切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列を含む単ドメインのみを含む、(C1)から(C16)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C18)前記リガンド結合分子は更に抗体Fc領域を含む、(C1)から(C17)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C19)前記リガンド結合分子はN末端からC末端に向かって単ドメイン抗体-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を含む、(C1)から(C18)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C20)前記リガンド結合分子は、単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を二つ含む二量体である、(C1)から(C18)に記載のリガンド結合分子。
(C21)前記抗体Fc領域は、配列番号:103〜106で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域、またはこれらのFc領域に改変を加えたFc領域変異体である、(C18)から(C20)に記載のリガンド結合分子。
(C22)前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、(C1)から(C21)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C23)前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、(C1)から(C22)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C24)前記リガンドはCXCL10、IL-12、PD-1、IL-6R、またはIL-1Raである、(C1)から(C23)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C25)前記リガンドと結合している、(C1)から(C24)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C26)前記リガンドと融合されている、(C1)から(C24)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
(C27)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、当該リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、(C26)に記載のリガンド結合分子。
(C28)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(C26)または(C27)に記載のリガンド結合分子。
(C29)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(C28)に記載のリガンド結合分子。
(C30)前記リガンドと、(C1)から(C24)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
(C31)前記リガンドと(C1)から(C24)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
(C32)前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、前記単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、(C31)に記載の融合タンパク質。
(C33)前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、(C31)または(C32)に記載の融合タンパク質。
(C34)前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、(C33)に記載の融合タンパク質。
(C35)N末端からC末端に向かってリガンド-リンカー-リガンド結合分子の順で融合されている、(C33)または(C34)に記載の融合タンパク質。
(D1)(A1)から(A27)、(B1)から(B25)、(C1)から(C26)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子を含む、医薬組成物。
(D2)(A1)から(A26)、(B1)から(B24)、(C1)から(C25)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とリガンドを含む、医薬組成物。
(D3)(A31)または(B29)または(C30)に記載の複合体を含む、医薬組成物。
(D4)(A32)から(A36)、(B30)から(B34)、(C31)から(C35)のいずれか一つに記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
(E1)(A1)から(A25)、(B1)から(B24)、(C1)から(C25)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
(E2)単ドメイン抗体を含むリガンド結合分子中の単ドメイン抗体に、プロテアーゼ切断配列を導入することを含む、(E1)に記載の製造方法。
(E3)プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子と、当該単ドメイン抗体と結合可能なリガンドを融合させることを含む、(A32)から(A36)、(B30)から(B34)、(C31)から(C35)のいずれか一つに記載の融合タンパク質の製造方法。
(E4)(A1)から(A25)、(B1)から(B23)、(C1)から(C24)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子をコードするポリヌクレオチド。
(E5)(E4)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(E6)(E4)に記載のポリヌクレオチドもしくは(E5)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(E7)(E6)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(A1)から(A25)、(B1)から(B23)、(C1)から(C24)のいずれか一つに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
(E8)(A32)から(A36)、(B30)から(B34)、(C31)から(C35)のいずれか一つに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(E9)(E8)に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
(E10)(E8)に記載のポリヌクレオチドもしくは(E9)に記載のベクターを含む宿主細胞。
(E11)(E10)に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、(A32)から(A36)、(B30)から(B34)、(C31)から(C35)のいずれか一つに記載の融合タンパク質を製造する方法。
本発明におけるポリペプチドとは、通常、4アミノ酸程度以上の長さを有するペプチド、およびタンパク質を指す。N末端からC末端までペプチド結合でつながるアミノ酸の連鎖を一連のペプチド鎖とする場合、本発明のポリペプチドは、複数の一連のペプチド鎖がS-S結合、疎水性相互作用、イオン結合等の相互作用により形成された複合体タンパク質であっても良い。また、本発明におけるポリペプチドは通常、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、生物由来のポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに含まれる。
本明細書において、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/Vと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記されている。
ポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法(Kunkelら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る(Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357)。例えば、終止コドンの1つであるUAGコドン(アンバーコドン)の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム(Clover Direct(Protein Express))等も好適に用いられる。
(a) 37番、(b)45番、(c)47番、(d) 37番および45番、(e) 37番および47番、(f) 45番および47番、(g) 37番および45番および47番。
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン(それぞれVHおよびVL)は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの相補性決定領域 (CDR) を含む、類似の構造を有する。(例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。)1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。
本明細書で用いられる用語「相補性決定領域」または「CDR」は、配列において超可変であり、および/または構造的に定まったループ(「超可変ループ」)を形成し、および/または抗原接触残基(「抗原接触」)、抗体の可変ドメインまたは単ドメイン抗体の各領域のことをいう。
通常、抗体は6つのCDRを含む:VHに3つ(H1、H2、H3)、およびVLに3つ(L1、L2、L3)である。本明細書での例示的な抗体CDRは、以下のものを含む:
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) CDRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、または94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
(a) アミノ酸残基26-32 (CDR1)、53-55 (CDR2)、および96-101 (CDR3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基31-35b (CDR1)、50-65 (CDR2)、 および95-102 (CDR3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基30-35b (CDR1)、47-58 (CDR2)、および93-101 (CDR3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) CDRアミノ酸残基26-35 (CDR1)、26-35b (CDR1)、49-65 (CDR2)、93-102 (CDR3)、または94-102 (CDR3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
(a) アミノ酸残基26-32 (CDR1)、50-52 (CDR2)、および91-96 (CDR3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) アミノ酸残基24-34 (CDR1)、50-56 (CDR2)、および89-97 (CDR3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) アミノ酸残基27c-36 (CDR1)、46-55 (CDR2)、および89-96 (CDR3)のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに、
(d) CDRアミノ酸残基46-56 (CDR2)、47-56 (CDR2)、48-56 (CDR2)、または49-56 (CDR2)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ。
「フレームワーク」または「FR」は、相補性決定領域 (CDR) 残基以外の、可変ドメイン残基または単ドメイン抗体残基のことをいう。可変ドメインまたは単ドメイン抗体のFRは、通常4つのFRドメイン:FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、CDRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH(またはVL)に現れる:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。単ドメイン抗体においては、CDRおよびFRの配列は、通常次の順序で現れる:FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
本明細書で用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、抗体の可変領域以外の部分を言う。例えば、IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメインを含む重鎖定常領域(CH)が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。天然型抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。「定常領域を含む」との用語は、定常領域の全部を含んでも良く、定常領域の一部を含んでも良い。
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG1の場合、重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン(Gly446-Lys447)は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム(EUインデックスとも呼ばれる)にしたがう。
「ヒンジ領域」あるいは「抗体ヒンジ領域」なる用語は、抗体重鎖におけるEUナンバリング216番目から230番目のアミノ酸で構成される領域、またはその中の一部分を指すことが出来る。
本明細書で用語「単ドメイン抗体」は、そのドメイン単独で抗原結合活性を発揮できる抗体である。単ドメイン抗体は、そのドメイン単独で抗原結合活性を発揮できるかぎりその構造は限定されない。IgG抗体等で例示される通常の抗体は、VHとVLのペアリングにより可変領域を形成された状態では抗原結合活性を示すのに対し、単ドメイン抗体は他のドメインとペアリングすることなく、単ドメイン抗体自身のドメイン構造単独で抗原結合活性を発揮できると知られている。単ドメイン抗体は通常比較的に低分子量を有し、単量体の形態で存在する。いくつかの実施形態では、単ドメイン抗体の形態は、抗体重鎖可変領域もしくは抗体軽鎖可変領域と類似する。
単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科の動物重鎖抗体の可変領域(VHH)、サメのVNARのような、先天的に軽鎖を欠如する抗原結合分子、または抗体のVHドメインのすべてもしくは一部分またはVLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片が挙げられる。抗体のVH/VLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、米国特許第6,248,516号B1等に記載されているようなヒト抗体VHまたはヒト抗体VLから出発して人工的に作製された単ドメイン抗体(以下、単ドメインVH抗体、単ドメインVL抗体)が挙げられる。
a)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる11位のアミノ酸残基はL、M、S、V、Wからなる群から選択される、好ましくはLである)、及び/又は
b)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる37位のアミノ酸残基はF、Y、H、I、L、Vからなる群から選択される、好ましくはFまたはYである)、及び/又は
c)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる44位のアミノ酸残基はG、E、A、D、Q、R、S、Lからなる群から選択される、好ましくはG、EまたはQである、より好ましくはGまたはEである)、及び/又は
d)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる45位のアミノ酸残基はL、R、C、I、L、P、Q、Vからなる群から選択される、好ましくはLまたはRである)、及び/又は
e)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる47位のアミノ酸残基はW、L、F、A、G、I、M、R、S、V、Yからなる群から選択される、好ましくはW、L、FまたはRである)、及び/又は
f)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる83位のアミノ酸残基はR、K、N、E、G、I、M、Q、Tからなる群から選択される、好ましくはKまたはRである、より好ましくはKである)、及び/又は
g)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる84位のアミノ酸残基はP、A、L、R、S、T、D、Vからなる群から選択される、好ましくはPである)、及び/又は
h)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる103位のアミノ酸残基はW、P、R、Sからなる群から選択される、このましくはWである)、及び/又は
i)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる104位のアミノ酸残基はGまたはDである、好ましくはGである)、及び/又は
j)3つの相補性決定領域/配列が間に挿入された4つのフレームワーク領域/配列から成るアミノ酸配列(Kabatナンバリングによる108位のアミノ酸残基はQ、L、Rからなる群から選択される、好ましくはQまたはLである)を含む、ポリペプチドと定義することができる。
k)Kabatナンバリングによる43位〜46位のアミノ酸残基はKEREまたはKQREであるアミノ酸配列;
l)Kabatナンバリングによる44位〜47位のアミノ酸残基はGLEWであるアミノ酸配列;
m)Kabatナンバリングによる83位〜84位のアミノ酸残基はKPまたはEPであるアミノ酸配列。
用語「キメラ」抗体は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。「キメラ単ドメイン抗体」は、単ドメイン抗体の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、単ドメイン抗体の残りの部分が異なった供給源または種に由来する単ドメイン抗体のことをいう。
「ヒト化」抗体は、非ヒトCDRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのCDRは非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。「ヒト化単ドメイン抗体」は、非ヒトCDRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ単ドメイン抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化単ドメイン抗体は、すべてのもしくは実質的にすべてのCDRは非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体において、FR中の残基の一部がヒト抗体のものと対応しない場合も、実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する一例として考えられる。たとえば、単ドメイン抗体の一態様であるVHHをヒト化する場合、FR中の残基の一部をヒト抗体のものと対応しない残基にする必要がある(C Vinckeら、The Journal of Biological Chemistry 284, 3273-3284.)。
ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体(例えば、非ヒト抗体)の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。
「アフィニティ」は、分子(例えば、抗体)の結合部位1個と、分子の結合パートナー(例えば、抗原)との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合アフィニティ」は、ある結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原)の間の1:1相互作用を反映する、固有の結合アフィニティのことをいう。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティは、一般的に、解離定数 (Kd) により表すことができる。アフィニティは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する抗体のことをいい、また逆にいえば、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。
「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS-PAGE、等電点分離法 (isoelectric focusing: IEF)、キャピラリー電気泳動)またはクロマトグラフ(例えば、イオン交換または逆相HPLC)で測定して、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の総説として、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) を参照のこと。
本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体(例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。)を除いて、同一でありおよび/または同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (%) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR) ソフトウェア、またはGENETYX(登録商標)(株式会社ゼネティックス)などの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞(そのような細胞の子孫を含む)のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
本明細書において、用語「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼなどの酵素、通常はエンドペプチダーゼを言う。本発明に用いられるプロテアーゼは、プロテアーゼ切断配列を切断できることのみによって制限され、その種類は特に限定されない。いくつかの実施態様において、標的組織特異的プロテアーゼが使用される。標的組織特異的プロテアーゼは、例えば、
(1)標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(2)標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(3)標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(4)標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。より具体的な実施態様において、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼが使用される。
本明細書で用語「標的組織」は、少なくとも一つの標的細胞を含む組織を意味する。本発明のいくつかの実施態様においては、標的組織は癌組織である。本発明のいくつかの実施態様においては、標的組織は炎症組織である。
・関節リウマチや変形性関節症における関節
・気管支喘息やCOPDにおける肺(肺胞)
・炎症性腸疾患やクローン病や潰瘍性大腸炎における消化器官
・肝臓、腎臓、肺における線維化症における線維化組織
・臓器移植における拒絶反応が起こっている組織
・動脈硬化や心不全における血管、心臓(心筋)
・メタボリック症候群における内臓脂肪
・アトピー性皮膚炎その他皮膚炎における皮膚組織
・椎間板ヘルニアや慢性腰痛における脊髄神経
いくつかの種類の標的組織において、特異的に発現するもしくは特異的に活性化されるプロテアーゼまたは標的組織の疾患状態と関連すると考えられるプロテアーゼ(標的組織特異的プロテアーゼ)が知られている。例えば、国際公開WO2013/128194号、国際公開WO2010/081173号、国際公開WO2009/025846号等で癌組織に特異的に発現するプロテアーゼが開示されている。また、J Inflamm (Lond). 2010; 7: 45.、Nat Rev Immunol. 2006 Jul;6(7):541-50.、Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec;13(12):904-27.、Respir Res. 2016 Mar 4;17:23.、Dis Model Mech. 2014 Feb;7(2):193-203.、Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1824(1):133-45.で炎症と関連すると考えられるプロテアーゼが開示されている。
活性型プロテアーゼの測定方法は、活性化型のプロテアーゼを認識する抗体を用いる方法(PNAS 2013 Jan 2; 110(1): 93-98.)やプロテアーゼが認識するペプチドを蛍光標識し、切断前は消光(クエンチ)しているが、切断後に発光する方法(Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep;9(9):690-701. doi: 10.1038/nrd3053.)を用いて測定されうる。
癌組織特異的プロテアーゼとしては、例えば、国際公開WO2013/128194号、国際公開WO2010/081173号、国際公開WO2009/025846号等で開示される癌組織に特異的に発現するプロテアーゼが挙げられる。
また、癌組織特異的プロテアーゼは、癌細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。癌組織特異的プロテアーゼが癌細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が癌細胞に特異的であるためには、癌組織特異的プロテアーゼは癌組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「癌組織の近傍」とは、癌組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、リガンド結合活性の低下効果を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
別の視点から、癌組織特異的プロテアーゼは、
(i) 癌組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 癌組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 癌細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 癌細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
癌組織特異的プロテアーゼは、1種単独でもよく、2種以上が組み合せられてもよい。癌組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の癌種を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
炎症組織特異的プロテアーゼの種類は、治療対象の炎症組織での発現の特異性が高いほど、副作用低減効果が得られる。炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症組織における濃度が正常組織における濃度の5倍以上高いことが好ましく、10倍以上高いことがより好ましく、100倍以上高いことがさらに好ましく、500倍以上高いことが特に好ましく、1000倍以上高いことが最も好ましい。また、炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症組織における活性が正常組織における活性の2倍以上高いことが好ましく、3倍以上高いこと、4倍以上高いこと、5倍以上高いこと、10倍以上高いことがより好ましく、100倍以上高いことがさらに好ましく、500倍以上高いことが特に好ましく、1000倍以上高いことが最も好ましい。
また、炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。炎症組織特異的プロテアーゼが炎症細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が炎症細胞に特異的であるためには、炎症組織特異的プロテアーゼは炎症組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「炎症組織の近傍」とは、炎症組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、リガンド結合活性の低下効果を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
別の視点から、炎症組織特異的プロテアーゼは、
(i) 炎症組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(ii) 炎症組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
(iii) 炎症細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
(iv) 炎症細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
炎症組織特異的プロテアーゼは、1種単独でもよく、2種以上が組み合せられてもよい。炎症組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の病状を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
所望の結合活性を有する抗体を作製する方法は当業者において公知である。以下に、IL-6Rに結合する抗体(抗IL-6R抗体)を作製する方法が例示される。IL-6R以外の抗原に結合する抗体も下記の例示に準じて適宜作製され得る。単ドメイン抗体を作製する場合、免疫動物の違い等はあるが、下記の例示に準じて適宜作製され得る。
−IL-6Rのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
−免疫抗原を精製する必要が無い
より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール(PEG)、センダイウイルス(HVJ)等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
−グアニジン超遠心法(Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299)
−AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
(1)ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をIL-6R発現細胞に接触させる工程、
(2)IL-6R発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
(3)IL-6R発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
ポリクローナルな抗体発現細胞群より抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv(scFv)を形成することができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入することにより、scFvを表面に発現するファージが取得され得る。このファージと所望の抗原との接触の後に、抗原に結合したファージを回収することによって、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAが回収され得る。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、所望の結合活性を有するscFvが濃縮され得る。
本発明のリガンド結合分子の一側面は、リガンド結合分子中に含まれる単ドメイン抗体でリガンドに結合可能な分子、特に未切断の状態においてリガンドに結合可能な分子である。ここの「結合」は通常、静電力、ファンデルワールス力、水素結合等の非共有結合を主とした相互作用による結合をいう。本発明のリガンド結合分子のリガンド結合態様の好適な例として、それだけに限定されないが、例えば、抗原結合領域、抗原結合分子、抗体、および抗体断片等が抗原に結合するような抗原抗体反応が挙げられる。
リガンド結合分子のリガンドに対する結合活性の評価は、FACS、ELISAフォーマット、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法、BLI(Bio-Layer Interferometry)法(Octet)等、周知の方法によって確認することができる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
ALPHAスクリーンは、ドナーとアクセプターの2つのビーズを使用するALPHAテクノロジーによって下記の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子が、アクセプタービーズに結合した分子と相互作用し、2つのビーズが近接した状態の時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ内のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素はドナービーズ周辺に拡散し、近接しているアクセプタービーズに到達するとビーズ内の化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子が相互作用しないときは、ドナービーズの産生する一重項酸素がアクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
対照のリガンド結合分子としては、例えば、未切断型のリガンド結合分子が挙げられる。
例えば、Octetを用いてリガンドの遊離を検出する場合、リガンドを認識するリガンド検出用抗体をビオチン化し、バイオセンサーと接触させたのちに、サンプル中のリガンドに対する結合を測定することで、リガンドの遊離を検出することができる。具体的には、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後のリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ処理前後のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。また、プロテアーゼとリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないでリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ有無のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。より具体的に、本願実施例中の方法によりリガンドの遊離を検出できる。リガンド結合分子がリガンドと融合され融合タンパク質を形成している場合、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後の融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ処理前後のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。また、プロテアーゼと融合タンパク質が含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないで融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ有無のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。より具体的に、本願実施例中の方法によりリガンドの遊離を検出できる。
プロテアーゼ切断配列は、水溶液中でポリペプチドが標的組織特異的プロテアーゼによって加水分解を受ける際に、該標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に認識される特定のアミノ酸配列である。
プロテアーゼ切断配列は、副作用低減の点から、治療対象の標的組織/細胞においてより特異的に発現している、もしくは治療対象の標的組織/細胞においてより特異的に活性化されている標的組織特異的プロテアーゼにより、高い特異性で加水分解されるアミノ酸配列であることが好ましい。
具体的なプロテアーゼ切断配列としては、例えば、国際公開WO2013/128194号、国際公開WO2010/081173号、国際公開WO2009/025846号等で開示されている上記で例示した癌組織に特異的に発現するプロテアーゼ、炎症組織特異的プロテアーゼ等によって特異的に加水分解される標的配列が挙げられる。既知のプロテアーゼによって特異的に加水分解される標的配列に、適宜アミノ酸変異を導入する等、人工的に改変した配列も使用できる。また、プロテアーゼ切断配列は、Nature Biotechnology 19, 661 - 667 (2001)に記載のような当業者公知の方法で同定したものを用いてもよい。
更に、天然に存在するプロテアーゼ切断配列を用いても良い。例えば、TGFβがプロテアーゼの切断を受けることで潜在型に変化するような、プロテアーゼの切断を受けることで分子形が変わるタンパク質中のプロテアーゼ切断を受ける配列を使用することもできる。
プロテアーゼ切断配列は、上述のように、好適な標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に加水分解されるアミノ酸配列であることがより好ましい。標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に加水分解されるアミノ酸配列の中でも、以下のアミノ酸配列が好ましい。
LSGRSDNH(配列番号:2、MT-SP1、uPAにより切断可能)
PLGLAG(配列番号:3、MMP-2、MMP-9により切断可能)
VPLSLTMG(配列番号:4、MMP-7により切断可能)
プロテアーゼ切断配列として、以下の配列を用いることもできる。
TSTSGRSANPRG(配列番号:5、MT-SP1、uPAにより切断可能)
ISSGLLSGRSDNH(配列番号:6、MT-SP1、uPAにより切断可能)
AVGLLAPPGGLSGRSDNH(配列番号:7、MT-SP1、uPAにより切断可能)
GAGVPMSMRGGAG(配列番号:8、MMP-1により切断可能)
GAGIPVSLRSGAG(配列番号:9、MMP-2により切断可能)
GPLGIAGQ(配列番号:10、MMP-2により切断可能)
GGPLGMLSQS(配列番号:11、MMP-2により切断可能)
PLGLWA(配列番号:12、MMP-2により切断可能)
GAGRPFSMIMGAG(配列番号:13、MMP-3により切断可能)
GAGVPLSLTMGAG(配列番号:14、MMP-7により切断可能)
GAGVPLSLYSGAG(配列番号:15、MMP-9により切断可能)
AANLRN(配列番号:16、MMP-11により切断可能)
AQAYVK(配列番号:17、MMP-11により切断可能)
AANYMR(配列番号:18、MMP-11により切断可能)
AAALTR(配列番号:19、MMP-11により切断可能)
AQNLMR(配列番号:20、MMP-11により切断可能)
AANYTK(配列番号:21、MMP-11により切断可能)
GAGPQGLAGQRGIVAG(配列番号:22、MMP-13により切断可能)
PRFKIIGG(配列番号:23、pro-ウロキナーゼにより切断可能)
PRFRIIGG(配列番号:24、pro-ウロキナーゼにより切断可能)
GAGSGRSAG(配列番号:25、uPAにより切断可能)
SGRSA(配列番号:26、uPAにより切断可能)
GSGRSA(配列番号:27、uPAにより切断可能)
SGKSA(配列番号:28、uPAにより切断可能)
SGRSS(配列番号:29、uPAにより切断可能)
SGRRA(配列番号:30、uPAにより切断可能)
SGRNA(配列番号:31、uPAにより切断可能)
SGRKA(配列番号:32、uPAにより切断可能)
QRGRSA(配列番号:33、tPAにより切断可能)
GAGSLLKSRMVPNFNAG(配列番号:34、カテプシンBにより切断可能)
TQGAAA(配列番号:35、カテプシンBにより切断可能)
GAAAAA(配列番号:36、カテプシンBにより切断可能)
GAGAAG(配列番号:37、カテプシンBにより切断可能)
AAAAAG(配列番号:38、カテプシンBにより切断可能)
LCGAAI(配列番号:39、カテプシンBにより切断可能)
FAQALG(配列番号:40、カテプシンBにより切断可能)
LLQANP(配列番号:41、カテプシンBにより切断可能)
LAAANP(配列番号:42、カテプシンBにより切断可能)
LYGAQF(配列番号:43、カテプシンBにより切断可能)
LSQAQG(配列番号:44、カテプシンBにより切断可能)
ASAASG(配列番号:45、カテプシンBにより切断可能)
FLGASL(配列番号:46、カテプシンBにより切断可能)
AYGATG(配列番号:47、カテプシンBにより切断可能)
LAQATG(配列番号:48、カテプシンBにより切断可能)
GAGSGVVIATVIVITAG(配列番号:49、カテプシンLにより切断可能)
APMAEGGG(配列番号:50、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
EAQGDKII(配列番号:51、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
LAFSDAGP(配列番号:52、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
YVADAPK(配列番号:53、メプリンα、メプリンβにより切断可能)
RRRRR(配列番号:54、フーリンにより切断可能)
RRRRRR(配列番号:55、フーリンにより切断可能)
GQSSRHRRAL(配列番号:56、フーリンにより切断可能)
SSRHRRALD(配列番号:57)
RKSSIIIRMRDVVL(配列番号:58、プラスミノーゲン(Plasminogen)により切断可能)
SSSFDKGKYKKGDDA(配列番号:59、Staphylokinaseにより切断可能)
SSSFDKGKYKRGDDA(配列番号:60、Staphylokinaseにより切断可能)
IEGR(配列番号:61、FactorIXaにより切断可能)
IDGR(配列番号:62、FactorIXaにより切断可能)
GGSIDGR(配列番号:63、FactorIXaにより切断可能)
GPQGIAGQ(配列番号:64、Collagenaseにより切断可能)
GPQGLLGA(配列番号:65、Collagenaseにより切断可能)
GIAGQ(配列番号:66、Collagenaseにより切断可能)
GPLGIAG(配列番号:67、Collagenaseにより切断可能)
GPEGLRVG(配列番号:68、Collagenaseにより切断可能)
YGAGLGVV(配列番号:69、Collagenaseにより切断可能)
AGLGVVER(配列番号:70、Collagenaseにより切断可能)
AGLGISST(配列番号:71、Collagenaseにより切断可能)
EPQALAMS(配列番号:72、Collagenaseにより切断可能)
QALAMSAI(配列番号:73、Collagenaseにより切断可能)
AAYHLVSQ(配列番号:74、Collagenaseにより切断可能)
MDAFLESS(配列番号:75、Collagenaseにより切断可能)
ESLPVVAV(配列番号:76、Collagenaseにより切断可能)
SAPAVESE(配列番号:77、Collagenaseにより切断可能)
DVAQFVLT(配列番号:78、Collagenaseにより切断可能)
VAQFVLTE(配列番号:79、Collagenaseにより切断可能)
AQFVLTEG(配列番号:80、Collagenaseにより切断可能)
PVQPIGPQ(配列番号:81、Collagenaseにより切断可能)
LVPRGS(配列番号:82、Thrombinにより切断可能)
TSGSGRSANARG(配列番号:170、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSQSGRSANQRG(配列番号:171、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSPSGRSAYPRG(配列番号:172、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSGSGRSATPRG(配列番号:173、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSQSGRSATPRG(配列番号:174、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSASGRSATPRG(配列番号:175、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSYSGRSAVPRG(配列番号:176、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSYSGRSANFRG(配列番号:177、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSSSGRSATPRG(配列番号:178、uPA及びMT-SP1により切断可能)
TSTTGRSASPRG(配列番号:179、uPA及びMT-SP1により切断可能)
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:788)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:789)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:790)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:791)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:792)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:793)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:794)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:795)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:796)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:797)
中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:798)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:799)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:800)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:801)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:802)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:803)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:804)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:805)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:806)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:807)
中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:808)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:809)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:810)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:811)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:812)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:813)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:814)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:815)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:816)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8(配列番号:817)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:818)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:819)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸をである;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:820)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:821)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:822)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:823)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:824)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:825)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である;X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X4 はRである;X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である;X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:826)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である;X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAである;X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(配列番号:827)
中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である;X11 は Sである;X1はYである;X2はSおよびTから選択されるアミノ酸である;X3はGである;X4はRである;X5はSである;X6はAおよびEから選択されるアミノ酸である;X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である;X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である;X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
プロテアーゼ切断配列とプロテアーゼの相互作用を確認する方法として、in vitroもしくはin vivoでのプロテアーゼ切断を確認することにより行うことができる。
あるいは、プロテアーゼ切断配列を組み込まれたリガンド結合分子は、プロテアーゼによる酵素的な作用のみならず、pHの変化、温度、酸化還元ストレス等の様々な環境負荷を経て病巣に到達する。このような外部要因に対しても、各プロテアーゼ基質の耐性を比較した情報に基づいて、目的に応じた望ましい性状を備えたプロテアーゼ切断配列を選択することもできる。
(プロテアーゼ切断配列)
(第一可動リンカー)-(プロテアーゼ切断配列)
(プロテアーゼ切断配列)-(第二可動リンカー)
(第一可動リンカー)-(プロテアーゼ切断配列)-(第二可動リンカー)
本実施態様における可動リンカーはペプチドリンカーが好ましい。第一可動リンカーと第二可動リンカーは、それぞれ独立かつ任意的に存在し、少なくとも1つのフレキシブルアミノ酸(Glyなど)を含む同一または異なる可動リンカーである。例えば、プロテアーゼ切断配列が所望のプロテアーゼアクセス性を得られるほどの十分な数の残基(Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Alaなどから任意に選択されるアミノ酸、特にGly、Ser、Asp、Asn、Ala、ことさらGlyおよびSer、特にGlyなど)が含まれる。
このうちグリシンおよびグリシン−セリンポリマーが注目されているが、これらのアミノ酸が比較的構造化されておらず、成分間の中性テザーとして機能しやすいことがその理由である。
グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、
Ser
Gly・Ser(GS)
Ser・Gly(SG)
Gly・Gly・Ser(GGS)
Gly・Ser・Gly(GSG)
Ser・Gly・Gly(SGG)
Gly・Ser・Ser(GSS)
Ser・Ser・Gly(SSG)
Ser・Gly・Ser(SGS)
Gly・Gly・Gly・Ser(GGGS、配列番号:83)
Gly・Gly・Ser・Gly(GGSG、配列番号:84)
Gly・Ser・Gly・Gly(GSGG、配列番号:85)
Ser・Gly・Gly・Gly(SGGG、配列番号:86)
Gly・Ser・Ser・Gly(GSSG、配列番号:87)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:88)
Gly・Gly・Gly・Ser・Gly(GGGSG、配列番号:89)
Gly・Gly・Ser・Gly・Gly(GGSGG、配列番号:90)
Gly・Ser・Gly・Gly・Gly(GSGGG、配列番号:91)
Gly・Ser・Gly・Gly・Ser(GSGGS、配列番号:92)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:93)
Gly・Ser・Ser・Gly・Gly(GSSGG、配列番号:94)
Gly・Ser・Gly・Ser・Gly(GSGSG、配列番号:95)
Ser・Gly・Gly・Ser・Gly(SGGSG、配列番号:96)
Gly・Ser・Ser・Ser・Gly(GSSSG、配列番号:97)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGS、配列番号:98)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGG、配列番号:99)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGGS、配列番号:100)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGGG、配列番号:101)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:88))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:93))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体12番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体31番アミノ酸(Kabatナンバリング)から35b番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体40番アミノ酸(Kabatナンバリング)から47番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から65番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体55番アミノ酸(Kabatナンバリング)から69番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体73番アミノ酸(Kabatナンバリング)から79番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体83番アミノ酸(Kabatナンバリング)から89番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から99番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から102番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体101番アミノ酸(Kabatナンバリング)から113番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。
単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から19番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体24番アミノ酸(Kabatナンバリング)から34番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体39番アミノ酸(Kabatナンバリング)から46番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体49番アミノ酸(Kabatナンバリング)から62番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から56番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体89番アミノ酸(Kabatナンバリング)から97番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体96番アミノ酸(Kabatナンバリング)から107番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。
FcRn結合領域を含む運搬部分は、FcRnのサルベージ経路により細胞内に取り込まれた後に再び血漿中に戻ることが可能である。例えば、IgG分子の血漿中滞留性が比較的長い(消失が遅い)のは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているFcRnが機能しているためである。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分子は、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム内に発現しているFcRnに結合する。FcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへと進みそこで分解されるが、FcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下においてFcRnから解離することで再び血漿中に戻る。
FcRn結合領域は、直接FcRnと結合する領域であることが好ましい。FcRn結合領域の好ましい例として、抗体のFc領域を挙げることができる。しかしながら、アルブミンやIgGなどのFcRnとの結合能を有するポリペプチドに結合可能な領域は、アルブミンやIgGなどを介して間接的にFcRnと結合することが可能であるので、本発明におけるFcRn結合領域はそのようなFcRnとの結合能を有するポリペプチドに結合する領域であってもよい。
例えば、IgG抗体Fc領域におけるEUナンバリング237番目、238番目、239番目、248番目、250番目、252番目、254番目、255番目、256番目、257番目、258番目、265番目、270番目、286番目、289番目、297番目、298番目、303番目、305番目、307番目、308番目、309番目、311番目、312番目、314番目、315番目、317番目、325番目、332番目、334番目、360番目、376番目、380番目、382番目、384番目、385番目、386番目、387番目、389番目、424番目、428番目、433番目、434番目および436番目から選択される少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含む改変Fc領域を使用ことは可能である。
237番目のGlyをMetに置換するアミノ酸置換、
238番目のProをAlaに置換するアミノ酸置換、
239番目のSerをLysに置換するアミノ酸置換、
248番目のLysをIleに置換するアミノ酸置換、
250番目のThrをAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
252番目のMetをPhe、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
254番目のSerをThrに置換するアミノ酸置換、
255番目のArgをGluに置換するアミノ酸置換、
256番目のThrをAsp、Glu、またはGlnに置換するアミノ酸置換、
257番目のProをAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはValに置換するアミノ酸置換、
258番目のGluをHisに置換するアミノ酸置換、
265番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
270番目のAspをPheに置換するアミノ酸置換、
286番目のAsnをAlaまたはGluに置換するアミノ酸置換、
289番目のThrをHisに置換するアミノ酸置換、
297番目のAsnをAlaに置換するアミノ酸置換、
298番目のSerをGlyに置換するアミノ酸置換、
303番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
305番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
307番目のThrをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
308番目のValをAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThrに置換するアミノ酸置換、
309番目のLeuまたはValをAla、Asp、Glu、Pro、またはArgに置換するアミノ酸置換、
311番目のGlnをAla、His、またはIleに置換するアミノ酸置換、
312番目のAspをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
314番目のLeuをLysまたはArgに置換するアミノ酸置換、
315番目のAsnをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
317番目のLysをAlaに置換するアミノ酸置換、
325番目のAsnをGlyに置換するアミノ酸置換、
332番目のIleをValに置換するアミノ酸置換、
334番目のLysをLeuに置換するアミノ酸置換、
360番目のLysをHisに置換するアミノ酸置換、
376番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
380番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
382番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
384番目のAsnまたはSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
385番目のGlyをAspまたはHisに置換するアミノ酸置換、
386番目のGlnをProに置換するアミノ酸置換、
387番目のProをGluに置換するアミノ酸置換、
389番目のAsnをAlaまたはSerに置換するアミノ酸置換、
424番目のSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
428番目のMetをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
433番目のHisをLysに置換するアミノ酸置換、
434番目のAsnをAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、および
436番目のTyrまたはPheをHisに置換するアミノ酸置換
から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、改変Fc領域を使用することは可能である。
237番目のアミノ酸におけるMet、
238番目のアミノ酸におけるAla、
239番目のアミノ酸におけるLys、
248番目のアミノ酸におけるIle、
250番目のアミノ酸におけるAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyr、
252番目のアミノ酸におけるPhe、Trp、またはTyr、
254番目のアミノ酸におけるThr、
255番目のアミノ酸におけるGlu、
256番目のアミノ酸におけるAsp、Glu、またはGln、
257番目のアミノ酸におけるAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはVal、
258番目のアミノ酸におけるHis、
265番目のアミノ酸におけるAla、
270番目のアミノ酸におけるPhe、
286番目のアミノ酸におけるAlaまたはGlu、
289番目のアミノ酸におけるHis、
297番目のアミノ酸におけるAla、
298番目のアミノ酸におけるGly、
303番目のアミノ酸におけるAla、
305番目のアミノ酸におけるAla、
307番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyr、
308番目のアミノ酸におけるAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThr、
309番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Glu、Pro、またはArg、
311番目のアミノ酸におけるAla、His、またはIle、
312番目のアミノ酸におけるAlaまたはHis、
314番目のアミノ酸におけるLysまたはArg、
315番目のアミノ酸におけるAlaまたはHis、
317番目のアミノ酸におけるAla、
325番目のアミノ酸におけるGly、
332番目のアミノ酸におけるVal、
334番目のアミノ酸におけるLeu、
360番目のアミノ酸におけるHis、
376番目のアミノ酸におけるAla、
380番目のアミノ酸におけるAla、
382番目のアミノ酸におけるAla、
384番目のアミノ酸におけるAla、
385番目のアミノ酸におけるAspまたはHis、
386番目のアミノ酸におけるPro、
387番目のアミノ酸におけるGlu、
389番目のアミノ酸におけるAlaまたはSer、
424番目のアミノ酸におけるAla、
428番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyr、
433番目のアミノ酸におけるLys、
434番目のアミノ酸におけるAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyr、および
436番目のアミノ酸におけるHis
から選択される少なくとも1つのアミノ酸を含むFc領域を使用することは可能である。
本明細書において、用語「リガンド」は生物活性を有する分子である。生物活性を有する分子は通常、細胞表面の受容体と相互作用し、それにより生物学的に刺激、阻害、または他の様式で変調することによって機能し、これらは通常は前記受容体を保有する細胞内のシグナル伝達経路に関与すると思われる。
本発明のリガンドは、その結合パートナーに10μM、1μM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、400pM、350pM、300pM、250pM、200pM、150pM、100pM、50pM、25pM、10pM、5pM、1pM、0.5pM、または0.1pM以下の解離定数(KD)で特異的に結合することができる。
さらに、CXC又はアルファのサブファミリーは、第1のシステインに先行するELRモチーフ(Glu-Leu-Arg)の存在によって2つの群:ELR-CXCケモカイン及び非ELR-CXCケモカインに分類されている(たとえば、Clark-Lewis, 上記、 及びBelperio et al., "CXC Chemokines in Angiogenesis(脈管形成におけるCXCケモカイン)," J. Leukoc. Biol. 68:1-8, 2000を参照)。
CXCL10の生物活性を測定する方法として、CXCL10の細胞遊走活性を測定する方法、CXCR3安定発現細胞株を用いたReporter assay(PLoS One. 2010 Sep 13;5(9):e12700.参照)、GPCRシグナル伝達初期に誘導されるB-Arrestin recruitmentを利用したPathHunterTM β-Arrestin recruitment assay等が挙げられる。
サイトカインは、免疫調節性および炎症性の過程に関与する分泌型細胞シグナル伝達タンパク質のファミリーであり、これは神経システムのグリア細胞によっておよび免疫システムの多数の細胞によって分泌される。サイトカインは、タンパク質、ペプチドまたは糖タンパク質に分類することができ、大きくて多様な調節因子ファミリーを包含する。サイトカインは細胞表面受容体に結合して細胞内シグナル伝達を誘発し、これによって酵素の活性調節、いくつかの遺伝子およびその転写因子の上方制御もしくは下方制御、またはフィードバック阻害等が起こりうる。
いくつかの実施態様において、本発明のサイトカインは、インターロイキン(IL)およびインターフェロン(IFN)などの免疫調節因子を含む。適したサイトカインは以下のタイプの1つまたは複数由来のタンパク質を含むことができる:4つのα-ヘリックスバンドルファミリー(これはIL-2サブファミリー、IFNサブファミリーおよびIL-10サブファミリーを含む); IL-1ファミリー(これはIL-1およびIL-8を含む)、ならびにIL-17ファミリー。サイトカインは、細胞免疫反応を増強する1型サイトカイン(例えば、IFN-γ、TGF-βなど)、または抗体反応に有利に働く2型サイトカイン(例えば、IL-4、IL-10、IL-13など)に分類されるものを含むこともできる。
本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子はプロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体のみを含む。本発明の別のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子はFc領域を含む。IgG抗体のFc領域を用いる場合、その種類は限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのFc領域を用いることが可能である。例えば、配列番号:103、104、105、106で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域、またはこれらのFc領域に改変を加えたFc領域変異体を用いることが可能である。また、本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子は抗体定常領域を含む。
本発明のいくつかの実施態様において、未切断状態のリガンド結合分子は、抗原抗体結合によりリガンドと複合体を形成する。より具体的な実施態様において、リガンド結合分子とリガンドとの複合体は、リガンド結合分子とリガンドの非共有結合、例えば抗原抗体結合により形成されている。
したがって、本発明は、リガンド結合分子とリガンドを接触させる工程と、リガンド結合分子にリガンドが結合してなる複合体を回収する工程を含む、複合体の製造方法も提供する。本発明において、リガンド結合分子とリガンドは、両者の結合が可能な条件下で接触させることができる。得られた複合体は、たとえば薬学的に許容される担体と配合することにより、医薬組成物とすることができる。
本発明のいくつかの実施態様において、未切断状態のリガンド結合分子はリガンドと融合され、融合タンパク質を形成した上、当該融合タンパク質内のリガンド結合分子部分とリガンド部分が更に抗原抗体結合により相互作用している。リガンド結合分子とリガンドは、リンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合され得る。融合タンパク質中のリガンド結合分子とリガンドはリンカーを介してまたは介さずに融合されている場合でも、リガンド結合分子部分とリガンド部分の間の非共有結合は依然として存在する。言い換えれば、リガンド結合分子がリガンドと融合されている実施態様においても、リガンド結合分子部分とリガンド部分の間の非共有結合は、リガンド結合分子とリガンドが融合されていない実施態様と類似する。リガンド結合分子が切断されることにより、その非共有結合が減弱する。すなわち、リガンド結合分子とリガンドとの結合は減弱することになる。
本発明の好ましい一実施態様においては、リガンド結合分子とリガンドをリンカーを介して融合させる。リガンド結合分子とリガンドを融合させるとき用いられるリンカーとして、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー(例えば、Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996参照)に開示されるリンカー等を用いることができるが、本実施態様においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。例として、それだけに限定されないが、例えば、ペプチドリンカーの場合:
Ser
Gly・Ser(GS)
Ser・Gly(SG)
Gly・Gly・Ser(GGS)
Gly・Ser・Gly(GSG)
Ser・Gly・Gly(SGG)
Gly・Ser・Ser(GSS)
Ser・Ser・Gly(SSG)
Ser・Gly・Ser(SGS)
Gly・Gly・Gly・Ser(GGGS、配列番号:83)
Gly・Gly・Ser・Gly(GGSG、配列番号:84)
Gly・Ser・Gly・Gly(GSGG、配列番号:85)
Ser・Gly・Gly・Gly(SGGG、配列番号:86)
Gly・Ser・Ser・Gly(GSSG、配列番号:87)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:88)
Gly・Gly・Gly・Ser・Gly(GGGSG、配列番号:89)
Gly・Gly・Ser・Gly・Gly(GGSGG、配列番号:90)
Gly・Ser・Gly・Gly・Gly(GSGGG、配列番号:91)
Gly・Ser・Gly・Gly・Ser(GSGGS、配列番号:92)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:93)
Gly・Ser・Ser・Gly・Gly(GSSGG、配列番号:94)
Gly・Ser・Gly・Ser・Gly(GSGSG、配列番号:95)
Ser・Gly・Gly・Ser・Gly(SGGSG、配列番号:96)
Gly・Ser・Ser・Ser・Gly(GSSSG、配列番号:97)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGS、配列番号:98)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGG、配列番号:99)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGGGS、配列番号:100)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGGGG、配列番号:101)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(GGGGS、配列番号:88))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(SGGGG、配列番号:93))n
[nは1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
本発明のリガンド結合分子とリガンドの融合タンパク質の構造のいくつかの態様を下記に羅列する。下記態様はN末端からC末端の順に記載する。
リガンド - 単ドメイン抗体
リガンド - リンカー - 単ドメイン抗体
リガンド - 単ドメイン抗体 - 抗体定常領域(またはその断片)
リガンド - リンカー - 単ドメイン抗体 - 抗体定常領域(またはその断片)
リガンド - 単ドメイン抗体 - 抗体ヒンジ領域 - 抗体CH2 - 抗体CH3
リガンド - リンカー - 単ドメイン抗体 - 抗体ヒンジ領域 - 抗体CH2 - 抗体CH3
本明細書で用いられる「治療」(および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など)は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、それだけに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの実施態様において、本発明の単ドメイン抗体含有リガンド結合分子は、リガンドの生物活性を制御することができ、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
また本発明は、単ドメイン抗体含有リガンド結合分子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物(薬剤)、単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とリガンドと医薬的に許容される担体を含む医薬組成物(薬剤)、単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とリガンドが融合されている融合タンパク質と医薬的に許容される担体を含む医薬組成物(薬剤)にも関する。
また、本発明において、「リガンド結合分子を含む医薬組成物」との用語は、「リガンド結合分子を治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合分子の使用」と言い換えることも可能である。「リガンド結合分子を含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するためのリガンド結合分子の使用」と言い換えることも可能である。
「リガンド結合分子とリガンドを含む医薬組成物」との用語は、「リガンド結合分子とリガンドを治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合分子とリガンドの使用」と言い換えることも可能である。「リガンド結合分子とリガンドを含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するためのリガンド結合分子とリガンドの使用」と言い換えることも可能である。
「融合タンパク質を含む医薬組成物」との用語は、「融合タンパク質を治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造における融合タンパク質の使用」と言い換えることも可能である。「融合タンパク質を含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するための融合タンパク質の使用」と言い換えることも可能である。
すなわち本発明は、リガンド結合性の単ドメイン抗体含有分子とリガンドを接触させる工程と、当該単ドメイン抗体含有分子とリガンドからなる複合体を回収する工程を含む、リガンド-リガンド結合分子複合体の製造方法も提供する。本発明の複合体は、例えば薬学的に許容される担体と配合することによって、医薬組成物とすることができる。
本発明は、切断された状態でリガンドへの結合が減弱される単ドメイン抗体含有リガンド結合分子、または当該リガンド結合分子とリガンドを融合させた融合タンパク質を製造する方法にも関する。本発明の一実施態様において、リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体に、プロテアーゼ切断配列を導入することを含むリガンド結合分子または融合タンパク質の製造方法が提供される。
該作製方法により得られた単ドメイン抗体は、そのままリガンド結合分子に用いてもよく、得られた単ドメイン抗体を更に別のアミノ酸配列と連結させたものを用いてもよい。
癌組織に発現する抗原を標的としたイムノサイトカインは一般にターゲッティングさせるIgGやscFvの末端に目的のサイトカインを融合させることで作製されてきた(Expert Opin Investig Drugs. 2009 Jul;18(7):991-1000.、Curr Opin Immunol. 2016 Jun;40:96-102.)。IL-2やIL-12やTNFをはじめとするサイトカインは毒性が強いため、これらのサイトカインを癌局所で働かせるために抗体によって癌局所にデリバリーすることで副作用を軽減しつつ、効果を強めることが期待されているが(非特許文献4、5、6)、これらはいずれも全身投与では臨床で十分な効果を示さない、therapeutic windowが狭い、毒性が強く全身投与ができない、などの課題がある。この大きな原因として、イムノサイトカインであっても全身投与したサイトカインは全身に暴露されてしまうため、全身で作用して毒性を発揮しうる、あるいは毒性を回避するために極めて低い用量でしか投与できない、ことが挙げられる。また、癌抗原に結合するイムノサイトカインは、腫瘍中で癌細胞に内在化されて消失してしまうため、場合によっては腫瘍局所にサイトカインを暴露することが困難となる。癌抗原に結合する抗体にIL-2を融合したイムノサイトカインと癌抗原に結合しない抗体にIL-2を融合したイムノサイトカインで抗腫瘍効果は変わらなかったという報告もある(非特許文献7)
この原因として、サイトカインとサイトカインレセプターの親和性が強くないため、プロテアーゼ切断前でもサイトカインがある程度の活性を有してしまうこと、あるいは、プロテアーゼでリンカーが切断された後でも、サイトカインレセプターはサイトカインに結合することができるため、サイトカインの生物活性を阻害してしまうことの2点が挙げられる。
ケモカイン(Nature Immunology 9, 949 - 952 (2008))は、Gタンパク質共役受容体を介してその作用を発現する塩基性タンパク質であり、サイトカインの一群である。受容体を発現する特定の白血球に作用し,その物質の濃度勾配の方向に白血球を遊走させる活性(走化性)を持つ(Nat Cell Biol. 2016 Jan;18(1):43-53.)。ケモカインは炎症部で大量に産生され,血管内から炎症組織内への白血球の遊走をもたらすことが知られている。
ケモカインを制御することで、白血球の遊走をコントロールできることから、癌免疫療法に活用することが可能であると考えられる。固形癌の局所にT細胞や抗原提示細胞やM1マクロファージなどを遊走させることができれば、抗腫瘍効果を引き起こすことが可能であると考えられる。サイトカインは全身投与によっても作用を発揮することができるが、ケモカインは濃度勾配によって濃度の高い組織に細胞を遊走させるため、ケモカインを全身投与しても期待する効果は得られない。そのため、ケモカインの全身投与による癌免疫療法(ケモカイン療法)は現実的ではないと考えられる。
実施例1、2に示したように既報のサイトカイン・ケモカイン療法には以下の課題がある。
1.イムノサイトカインにおいては、抗体によりサイトカインを固形癌にターゲッティングしたとしても、サイトカインは全身で作用するため副作用が生じる、あるいは、副作用を回避するため低用量でしか投与できないため、腫瘍中に高い暴露をすることができない。
2.サイトカインレセプター(あるいは抗体)とサイトカインをプロテアーゼで切断出来るリンカーで繋ぐプロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、サイトカイン活性の中和が不十分でありプロテアーゼ切断前でもサイトカインがある程度の活性を有してしまう。
3.プロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、プロテアーゼでリンカーが切断された後でも、サイトカインレセプター(あるいは抗体)がサイトカインに結合することができるため、サイトカインの生物活性を阻害してしまう。
1.全身においては、サイトカインあるいはケモカインなどのリガンドがリガンド結合分子によって十分に阻害されている(生物活性が最小化されている)。
2.プロテアーゼによる切断によりリガンドの生物活性が回復する(活性型リガンドとなる)。
3.プロテアーゼによる切断によりリガンド結合分子がリガンド結合活性を失う。
図1〜4では切断サイトが導入された単ドメイン抗体を含有するリガンド結合分子の例を示している。
図1で示しているのは、切断サイトが導入された単ドメイン抗体のみを含有するリガンド結合分子の例である。切断サイトが切断されていない状態において、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり、単ドメイン抗体のリガンドに対する親和性が十分に強ければ、リガンドの生物活性は十分に阻害されている。このリガンド結合分子とリガンドを全身投与しても、リガンド結合分子とリガンドの複合体中のリガンドは中和されているためその生物活性を発揮することは無く、またリガンド−リガンド結合分子の複合体はリガンド単体より長い半減期を有する。切断サイトが腫瘍組織特異的プロテアーゼにより切断されるプロテアーゼ切断配列の場合、全身投与されたリガンド結合分子とリガンドが形成された複合体は、腫瘍組織で高発現するプロテアーゼによって単ドメイン抗体中のプロテアーゼ切断配列が切断されると、単ドメイン抗体がリガンドへ結合できなくなり、リガンドの中和は解除され、腫瘍組織において生物学的作用を発揮することが可能である。
5−1 抗ヒトIL-6R単ドメイン抗体を含むポリペプチドへのプロテアーゼ切断配列の導入によるリガンド結合分子の作製
ヒトIL-6Rに対する単ドメイン抗体(配列番号:120)のC末端にと配列番号:121で示す抗体ヒンジ領域と抗体Fc領域配列のN末端を融合させたポリペプチドIL6R90-G1T3dCHdC(配列番号:122)中の単ドメイン抗体にプロテアーゼ切断配列を挿入し、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を作製した。まず、癌特異的に発現しているマトリプターゼ(MT-SP1)で切断されることが報告されているペプチド配列(LSGRSDNH、配列番号:3)を含む配列をポリペプチドIL6R90-G1T3dCHdCに挿入し、表2に示すリガンド結合分子を作製し、Expi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。なおプロテアーゼ切断配列を含まない対照分子としてIL6R90-G1T3dCHdCを発現および精製した。作製されたリガンド結合分子及び対照分子は図3で示すような二量体タンパク質である。
5−2−1 プロテアーゼ処理
実施例5−1で調製されたリガンド結合分子0.1mg/mLに対して、終濃度25nMとなるようにRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systemsm 3946-SE-010)を添加し、37度で一晩保温し、プロテアーゼ処理リガンド結合分子を含む溶液とした。プロテアーゼ未処理リガンド結合分子を含む溶液の作製の条件は、プロテアーゼの代わりにPBSを同体積で加え、同じ条件で保存した条件である。
実施例5−2−1で実施されたプロテアーゼ処理でリガンド結合分子が切断されているかSDS-PAGEで確認した。実施例5−2−1で調製されたプロテアーゼ処理リガンド結合分子/プロテアーゼ未処理リガンド結合分子を含む溶液9μLを3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃で1分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel (4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain (novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図5に示す。図5に示すように、プロテアーゼ切断配列を含まない対照分子(Lane 12、13)がプロテアーゼ処理/未処理関係なく、バンドが同じ位置にあるのに対し、各プロテアーゼ切断配列が導入されたリガンド結合分子はプロテアーゼ処理後のみに生じる新しいバンドがあり、即ち、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子はプロテアーゼ処理で切断されたことが示された。
実施例5−2−1で調製されたプロテアーゼ処理リガンド結合分子/プロテアーゼ未処理リガンド結合分子を含む溶液20μLに対し、PBS60μLを加えてIL-6R結合評価サンプルとした。サンプルのIL-6R結合評価はバイオレイヤー干渉法(BLI法)で測定した。IL-6R結合評価サンプルとIL-6RをTilted bottom (TW384) Microplate (Forte bio, 18-5076)に分注した。Protein Gセンサー(ForteBio, 18-0022)をPBSで水和し、25度の設定でOctet RED 384で測定を実施した。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間抗体をProtein Gセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後ヒト500nM IL-6Rが入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図6に示す。図6に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された各リガンド結合分子を使用する場合、プロテアーゼ未処理リガンド結合分子を使用する場合に比べて、ヒトIL-6R結合量が減少した。
6−1 .プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトIL-6R単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とヒトIL-6Rの融合タンパク質の作製
実施例5−1で作製されたリガンド結合分子のN末端にグリシンとセリンからなる様々なリンカーを介してヒトIL-6R(配列番号:128)のC末端と融合し、リガンド結合分子-IL-6R融合タンパク質を作製した(表3)。これらの融合タンパク質は、当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。作製された融合タンパク質はそれぞれ、表3で示す配列のペプチド鎖を二つ有する二量体タンパク質である。
6−2−1 プロテアーゼ処理
実施例6−1で調製されたリガンド結合分子-IL-6R融合タンパク質0.1mg/mLに対して、終濃度25nMとなるようにRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain(hMT-SP1, R&D systemsm 3946-SE-010)を添加し、37度で一晩保温し、プロテアーゼ処理融合タンパク質を含む溶液とした。プロテアーゼ未処理融合タンパク質を含む溶液の作製条件は、プロテアーゼの代わりにPBSを同体積で加え、同じ条件で保存した条件である。
実施例6−2−1で実施されたプロテアーゼ処理でリガンド結合分子‐IL-6R融合タンパク質が切断されているかSDS-PAGEで確認した。実施例6−2−1で調製されたプロテアーゼ処理融合タンパク質/プロテアーゼ未処理融合タンパク質を含む溶液9μLを3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃で1分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel (4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain (novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図7示す。図7に示すように、プロテアーゼ切断配列を含まない対照分子がプロテアーゼ処理/未処理関係なく、バンドが同じ位置にあるのに対し、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質はプロテアーゼ処理後のみに生じる新しいバンドがあり、即ち、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質はプロテアーゼ処理で切断されたことが示された。
リガンド結合分子に融合されたIL-6Rの遊離を検出する方法として、IL-6Rを認識する単ドメイン抗体含有分子にビオチンを付与し、ビオチン化された抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子に対して遊離IL-6Rの結合を検出する方法を用いた。ビオチン化抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子は以下のように作製された。 IL6R90-G1T3dCH1dC(配列番号:122)と同じ単ドメイン抗体部分配列を有している抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子を調製し、そのC末端にビオチン付加配列(AviTag配列、配列番号:159)を付加したIL6R90-FcBAPdC(配列番号:160)を作製した。IL6R90-FcBAPdCをコードする遺伝子断片を作製し、当業者公知の方法で動物細胞発現用ベクターに導入した。このときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼを発現する遺伝子を同時に導入し、ビオチン標識する目的でビオチンを添加した。遺伝子が導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的のビオチン化抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子(IL6R90-bio)を培養上清中に分泌させた。培養上清から当業者公知の方法でIL6R90-bioを精製した。
融合タンパク質のプロテアーゼ処理によるIL-6R遊離を実施例6−2−3で調製したビオチン化抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子(IL6R90-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法(BLI法)で評価した。
7-1 多様なプロテアーゼ切断配列導入されたIgG抗体の作製
ヒトIL-6Rに対する中和抗体(IgG抗体)であるMRA(重鎖:MRAH-G1T4(配列番号:119)、軽鎖:MRAL-k0(配列番号:118))の発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
MMP-2、MMP-7、MMP-9で切断されることが知られているペプチド配列およびそれらの配列の近傍にグリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーを含むペプチド配列を表5に示す。
これらの改変重鎖とMRA軽鎖を組み合わせて、表6に示すMRA改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
7-1で調製したMRA改変体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトMMP-2( R&D Systems, 902-MP-010 )、リコンビナントヒトMMP-7( R&D Systems, 907-MP-010 )、リコンビナントヒトMMP-9( R&D Systems, 911-MP-010 )を用いた。なお、プロテアーゼは1 mM p-aminophenylmercuric acetate (APMA; abcam, ab112146 ) と混ぜ、37℃でそれぞれ1、24時間活性化させてから使用した。プロテアーゼ 50 nM、100 nM、または 500 nM、抗体50μg/mL、assay buffer(MMP Activity Assay Kit(Fluorometric - Green) (ab112146), Component C: Assay Buffer)または 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7.2 (以下、Tris)、37℃の条件下で20時間反応させた後に、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図11、12、図13に示す。MRA改変体抗体は、それぞれ表2に示すプロテアーゼと反応させている。MMP-2ではMEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4SG1T4/MRAL-k0,MEIVHMP2.1-MEIVHMP2.1G1T4/MRAL-k0, MEIVHMP2.3-MEIVHMP2.3G1T4/MRAL-k0の切断が、MMP-7ではMEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4/MRAL-k0の切断が、MMP-9ではMEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP9G4S-MEIVHG4SMP9G4SG1T4/MRAL-k0の切断が観察された。
8−1. プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトPD-1単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とヒトPD-1の融合タンパク質の作製
ヒトPD-1に結合する単ドメイン抗体にヒト抗体定常領域を融合したPD102C3-G1T3noCyshinge(配列番号:161), PD102C12-G1T3noCyshinge(配列番号:162)を当業者公知の方法で作製した。次に、PD102C3-G1T3noCyshingeと PD102C12-G1T3noCyshingeにプロテアーゼ切断配列を導入したのち、それぞれのN末端をグリシンとセリンからなる様々なリンカーを介してヒトPD-1の細胞外ドメイン(配列番号:163)のC末端と融合し、リガンド結合分子-PD-1融合タンパク質を作製した(表7)。これらの融合タンパク質は、当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。作製された融合タンパク質はそれぞれ、表7で示す配列のペプチド鎖を二つ有する二量体タンパク質である。
8−2−1. プロテアーゼ処理
実施例8−1で調製されたリガンド結合分子-PD-1融合タンパク質0.1mg/mLに対して、終濃度25nMとなるようにRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systemsm 3946-SE-010) を添加し、37度で一晩保温し、プロテアーゼ処理融合タンパク質を含む溶液とした。プロテアーゼ未処理融合タンパク質を含む溶液の作製条件は、プロテアーゼの代わりにPBSを同体積で加え、同じ条件で保存した条件である。
実施例8−2−1で実施されたプロテアーゼ処理でリガンド結合分子‐PD-1融合タンパク質が切断されているかSDS-PAGEで確認した。実施例8−2−1で調製されたプロテアーゼ処理融合タンパク質/プロテアーゼ未処理融合タンパク質を含む溶液9μLを3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃で1分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel (4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain (novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図9示す。図9に示すように、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質はプロテアーゼ処理後のみに生じる新しいバンドがあり、即ち、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質体はプロテアーゼ処理で切断されたことが示された。
リガンド結合分子に融合されたPD-1の遊離を検出する方法として、PD-1を認識する単ドメイン抗体含有分子にビオチンを付与し、ビオチン化された抗PD-1単ドメイン抗体含有分子に対して遊離PD-1の結合を検出する方法を用いた。ビオチン化抗PD-1単ドメイン抗体含有分子は以下のように作製された。PD102C3-G1T3noCyshingeと同じ単ドメイン抗体部分配列を有している単ドメイン抗体含有分子を調製し、そのC末端にビオチン付加配列(AviTag配列、配列番号:159)を付加し、PD102C3-FcBAPdC(配列番号:168)を作製した。 また、PD102C12-G1T3noCyshingeと同じ単ドメイン抗体部分配列を有している抗PD-1単ドメイン抗体含有分子を調製し、そのC末端にビオチン付加配列(AviTag配列、配列番号:159)を付加し、PD102C12-FcBAPdC(配列番号:169)を作製した。PD102C3-FcBAPdC及びPD102C12-FcBAPdCをそれぞれコードする遺伝子断片を作製し、当業者公知の方法で動物細胞発現用ベクターに導入した。このときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼを発現する遺伝子を同時に導入し、ビオチン標識する目的でビオチンを添加した。遺伝子が導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的のビオチン化抗PD-1単ドメイン抗体含有分子(PD1-bio)を培養上清中に分泌させた。培養上清から当業者公知の方法でPD1-bioを精製した。
融合タンパク質のプロテアーゼ処理によるPD-1遊離を実施例8−2−3で調製したビオチン化抗PD-1単ドメイン抗体含有分子(PD1-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法(BLI法)で評価した。
Claims (15)
- リガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子は単ドメイン抗体を含み、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり且つ少なくとも一つの切断サイトが導入されており、当該切断サイトが切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、リガンド結合分子。
- 前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、請求項1に記載のリガンド結合分子。
- 前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、請求項2に記載のリガンド結合分子。
- リガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子は単ドメイン抗体を含み、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり且つ少なくとも一つのプロテアーゼ切断配列を含み、当該プロテアーゼ切断配列は標的組織特異的プロテアーゼにより切断可能 であり、当該プロテアーゼ切断配列が切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、リガンド結合分子。
- 前記プロテアーゼは、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼである、請求項2から請求項4のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ(uPA)、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、請求項2から請求項5のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号:2〜82、788〜827で示す配列、表1に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含む配列である、請求項2から請求項5のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記切断サイトまたは前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態では、前記リガンドがリガンド結合分子から遊離する、請求項1から請求項7のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記単ドメイン抗体はVHH、または単ドメインVH抗体、また単ドメインVL抗体である請求項1から請求項8のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドに対する中和活性を有する、請求項1から請求項10のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
- 前記単ドメイン抗体はVHHまたは単ドメインVH抗体であり、前記切断サイトまたは前記プロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、請求項1から請求項10のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子:
単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体12番アミノ酸(Kabatナンバリング)から17番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体31番アミノ酸(Kabatナンバリング)から35b番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体40番アミノ酸(Kabatナンバリング)から47番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から65番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体55番アミノ酸(Kabatナンバリング)から69番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体73番アミノ酸(Kabatナンバリング)から79番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体83番アミノ酸(Kabatナンバリング)から89番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から99番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体95番アミノ酸(Kabatナンバリング)から102番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体101番アミノ酸(Kabatナンバリング)から113番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。 - 前記単ドメイン抗体は単ドメインVL抗体であり、前記切断サイトまたは前記プロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、請求項1から請求項10のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子:
単ドメイン抗体7番アミノ酸(Kabatナンバリング)から19番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体24番アミノ酸(Kabatナンバリング)から34番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体39番アミノ酸(Kabatナンバリング)から46番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体49番アミノ酸(Kabatナンバリング)から62番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体50番アミノ酸(Kabatナンバリング)から56番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体89番アミノ酸(Kabatナンバリング)から97番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列、単ドメイン抗体96番アミノ酸(Kabatナンバリング)から107番アミノ酸(Kabatナンバリング)までの配列。 - 前記リガンドと、請求項1から請求項12のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
- 前記リガンドと請求項1から請求項12のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
- 請求項1から請求項12のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子、または請求項13に記載の複合体、または請求項14に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
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