WO2019230868A1 - 単ドメイン抗体含有リガンド結合分子 - Google Patents

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amino acid
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antibody
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広幸 石川
達也 加和
奈緒香 廣庭
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中外製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention includes a single domain antibody-containing ligand binding molecule, a method for producing the ligand binding molecule, a pharmaceutical composition containing the ligand binding molecule, a fusion protein containing the ligand binding molecule, a method for producing the fusion protein, and A pharmaceutical composition comprising the fusion protein is provided.
  • Antibodies are attracting attention as pharmaceuticals because of their high stability in plasma and few side effects. Among them, many IgG-type antibody drugs are on the market, and many antibody drugs have been developed (Non-patent Documents 1 and 2).
  • Non-patent Document 3 As conventional cancer therapeutic agents using antibody drugs, Rituxan for CD20 antigen, cetuximab for EGFR antigen, Herceptin for HER2 antigen, etc. have been approved (Non-patent Document 3). These antibody molecules bind to antigens expressed in cancer cells and exert damaging activity against cancer cells by ADCC and signal inhibition.
  • Cytokines delivered to solid tumors by immunocytokines activate immunity to exert antitumor effects. Since cytokines such as IL-2, IL-12, and TNF are highly toxic, it is possible to increase the effect while reducing these side effects by delivering these cytokines locally to the cancer in order to make these cytokines work locally.
  • Non-patent Documents 4, 5, and 6 Although it is expected (Non-patent Documents 4, 5, and 6), all of these have problems in that they are not effective clinically by systemic administration, therapeutic window is narrow, the toxicity is high, and systemic administration is not possible It has not yet been approved as a pharmaceutical product.
  • Non-patent Document 7 A major cause of this is that even cytokines that are administered systemically are exposed to the whole body, even if they are immunocytokines, they can act systemically and exert toxicity, or they can only be administered at very low doses to avoid toxicity Is mentioned. There is also a report that the anti-tumor effect did not change between an immunocytokine in which IL-2 is fused to an antibody that binds to a cancer antigen and an immunocytokine in which IL-2 is fused to an antibody that does not bind to a cancer antigen (Non-patent Document 7).
  • the inventors of the present invention have intensively studied to achieve the above object, and have created a single domain antibody-containing ligand binding molecule containing a cleavage site and a fusion protein containing the ligand binding molecule.
  • the present inventors treat the disease using the ligand-binding molecule, the complex of the ligand-binding molecule and the ligand, a fusion protein containing the ligand-binding molecule, or a pharmaceutical composition containing them.
  • the present inventors have completed the present invention by creating a method for producing the ligand-binding molecule, the complex of the ligand-binding molecule and the ligand, or a fusion protein containing the ligand-binding molecule.
  • (A1) a ligand binding molecule, wherein the ligand binding molecule includes a single domain antibody, the single domain antibody is capable of binding to a ligand and at least one cleavage site is introduced, and the cleavage site is cleaved.
  • Ligand-binding molecule wherein the binding of the ligand-binding molecule to the ligand is less attenuated than the binding of the ligand-binding molecule to the ligand when the cleavage site is uncut.
  • A2 The ligand-binding molecule according to (A1), wherein the ligand is released from the ligand-binding molecule when the cleavage site is cleaved.
  • A3 The ligand-binding molecule according to (A1) or (A2), wherein the cleavage site contains a protease cleavage sequence.
  • A4) The ligand-binding molecule according to (A3), wherein the protease is a target tissue-specific protease.
  • A5 The ligand-binding molecule according to (A4), wherein the target tissue is a cancer tissue, and the target tissue-specific protease is a cancer tissue-specific protease.
  • the ligand-binding molecule according to (A4) wherein the target tissue is an inflammatory tissue, and the target tissue-specific protease is an inflammatory tissue-specific protease.
  • the protease cleavage sequence is a sequence comprising one or a plurality of sequences selected from the sequences shown in SEQ ID NOs: 2-82 and 788-827, and the sequences described in Table 1.
  • (A3) to (A7 The ligand binding molecule according to any one of (1).
  • (A9) The ligand-binding molecule according to any one of (A3) to (A8), wherein a first movable linker is further added to one end of the protease cleavage sequence.
  • (A10) The ligand-binding molecule according to (A9), wherein the first movable linker is a movable linker composed of a glycine-serine polymer.
  • (A11) The ligand-binding molecule according to (A9) or (A10), wherein a second movable linker is further added to the other end of the protease cleavage sequence.
  • (A12) The ligand-binding molecule according to (A11), wherein the second movable linker is a movable linker composed of a glycine-serine polymer.
  • (A13) The ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A12), wherein the single domain antibody is a VHH, a single domain VH antibody, or a single domain VL antibody.
  • the single domain antibody is a VHH or single domain VH antibody, and the cleavage site, the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence and the first movable linker and the second movable
  • the linker is introduced into one or a plurality of positions included in one or a plurality of sequences selected from the following sequences of the single domain antibody:
  • the single domain antibody is a single domain VL antibody, and the cleavage site, the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence and the first movable linker and the second movable linker are The ligand-binding molecule according to (A13), which is introduced at one or a plurality of positions included in one or a plurality of sequences selected from the following sequences of the single domain antibody: Single domain antibody 7th amino acid (Kabat numbering) ) To 19th amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 24th amino acid (Kabat numbering) to 34th amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 39th amino acid (Kabat numbering) to 46th amino acid (Kabat numbering) Sequence up to Kabat numbering, single domain antibody 49 amino acid Sequence
  • (A16) The ligand according to any one of (A1) to (A15), wherein the ligand is a molecule having biological activity, and the single domain antibody inhibits the biological activity of the ligand by binding to the ligand.
  • Ligand binding molecule (A17) The ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A16), wherein the ligand is a molecule having biological activity, and the single domain antibody has neutralizing activity for the ligand. (A18) The ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A17), wherein the ligand-binding molecule contains only a single domain antibody containing the cleavage site or protease cleavage sequence.
  • (A19) The ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A18), wherein the ligand-binding molecule further comprises an antibody Fc region.
  • (A20) The ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A19), wherein the ligand-binding molecule comprises a series of peptide chains consisting of a single domain antibody-antibody Fc region from the N-terminus to the C-terminus. .
  • (A21) The ligand-binding molecule according to (A1) to (A19), wherein the ligand-binding molecule is a dimer comprising two series of peptide chains consisting of a single domain antibody-antibody hinge region-antibody Fc region.
  • the antibody Fc region is an Fc region containing one sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 103 to 106, or an Fc region variant obtained by modifying these Fc regions (A19). ) To (A21).
  • the ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A22), wherein the ligand is a cytokine or a chemokine.
  • the ligand is any one of (A1) to (A23), which is a ligand selected from interleukin, interferon, hematopoietic factor, TNF superfamily, chemokine, cell growth factor, and TGF- ⁇ family.
  • A25 The ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A24), wherein the ligand is CXCL10, IL-12, PD-1, IL-6R, or IL-1Ra.
  • A26 The ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A25), which is bound to the ligand.
  • A27 The ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A25), which is fused with the ligand.
  • A28 The ligand-binding molecule according to (A27), wherein in the state where the ligand-binding molecule is fused with a ligand, the single domain antibody contained in the ligand-binding molecule does not bind to another ligand.
  • A29 The ligand-binding molecule according to (A27) or (A28), wherein the ligand-binding molecule is fused with the ligand via a linker.
  • A30 The ligand-binding molecule according to (A29), wherein the linker does not contain a protease cleavage sequence.
  • A31 A complex formed of the ligand and the ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A25).
  • A32 A fusion protein in which the ligand and the ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A25) are fused.
  • A33 The fusion protein according to (A32), wherein the single domain antibody does not bind to another ligand when the ligand-binding molecule is fused with a ligand.
  • A34 The fusion protein according to (A32) or (A33), wherein the ligand-binding molecule is fused to the ligand via a linker.
  • A35 The fusion protein according to (A34), wherein the linker does not contain a protease cleavage sequence.
  • (A36) The fusion protein according to (A34) or (A35), which is fused in the order of ligand-linker-ligand binding molecule from the N-terminus toward the C-terminus.
  • (B1) a ligand binding molecule, wherein the ligand binding molecule comprises a single domain antibody, the single domain antibody is capable of binding to a ligand and comprises at least one protease cleavage sequence, the protease cleavage sequence being specific for a target tissue
  • the ligand-binding molecule can be cleaved by a specific protease, and the binding of the ligand-binding molecule to the ligand is less than the binding of the ligand-binding molecule to the ligand when the cleavage site is not cleaved.
  • a ligand binding molecule (B2) The ligand-binding molecule according to (B1), wherein the ligand is released from the ligand-binding molecule when the protease cleavage sequence is cleaved. (B3) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B2), wherein the target tissue is a cancer tissue, and the target tissue-specific protease is a cancer tissue-specific protease. (B4) The ligand-binding molecule according to (B1) to (B2), wherein the target tissue is an inflammatory tissue, and the target tissue-specific protease is an inflammatory tissue-specific protease.
  • the ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B4), wherein the protease is at least one protease selected from matriptase, urokinase (uPA), and metalloprotease.
  • the protease cleavage sequence is a sequence comprising one or a plurality of sequences selected from the sequences shown in SEQ ID NOs: 2-82 and 788-827, and the sequences shown in Table 1.
  • B1 to (B5 The ligand binding molecule according to any one of (1).
  • (B7) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B6), wherein a first movable linker is further added to one end of the protease cleavage sequence.
  • (B8) The ligand-binding molecule according to (B7), wherein the first movable linker is a movable linker composed of a glycine-serine polymer.
  • (B9) The ligand-binding molecule according to (B7) or (B8), wherein a second movable linker is further added to the other end of the protease cleavage sequence.
  • (B10) The ligand-binding molecule according to (B9), wherein the second movable linker is a movable linker composed of a glycine-serine polymer.
  • (B11) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B10), wherein the single domain antibody is VHH, a single domain VH antibody, or a single domain VL antibody.
  • the single domain antibody is a VHH or single domain VH antibody, and is the cleavage site, or the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence and the first movable linker and the second movable.
  • the linker is introduced into one or a plurality of positions included in one or a plurality of sequences selected from the following sequences of the single domain antibody: (B11) Ligand-binding molecule: Single domain antibody 7th amino acid ( Sequence from Kabat numbering to 17th amino acid (Kabat numbering), Sequence from single domain antibody 12th amino acid (Kabat numbering) to 17th amino acid (Kabat numbering), Single domain antibody 31st amino acid (Kabat numbering) to 35b Sequence up to amino acid (Kabat numbering), single domain antibody Sequence from amino acid 0 (Kabat numbering) to amino acid 47 (Kabat numbering), single domain antibody 50th amino acid (Kabat numbering) to amino acid 65 (Kabat numbering), single domain antibody 55th amino acid (Kabat numbering) ) To 69 amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 73 amino acid (Kabat numbering) to 79 amino acid (Kabat numbering) sequence, single domain antibody 83 amino acid (K
  • the single domain antibody is a single domain VL antibody, and the cleavage site, the protease cleavage sequence, or the protease cleavage sequence and the first movable linker, or the protease cleavage sequence and the first movable linker and the second movable linker are The ligand binding molecule according to (B11), which is introduced into one or a plurality of positions included in one or a plurality of sequences selected from the following sequences of the single domain antibody: Single domain antibody 7th amino acid (Kabat numbering) ) To 19th amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 24th amino acid (Kabat numbering) to 34th amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 39th amino acid (Kabat numbering) to 46th amino acid (Kabat numbering) Sequence up to Kabat numbering, single domain antibody 49 amino acid Sequence from acid
  • (B14) The ligand according to any one of (B1) to (B13), wherein the ligand is a molecule having biological activity, and the single domain antibody inhibits the biological activity of the ligand by binding to the ligand.
  • Ligand binding molecule (B15) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B14), wherein the ligand is a molecule having biological activity, and the single domain antibody has neutralizing activity for the ligand.
  • (B16) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B15), wherein the ligand-binding molecule contains only a single domain antibody containing the cleavage site or protease cleavage sequence.
  • (B17) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B16), wherein the ligand-binding molecule further comprises an antibody Fc region.
  • (B18) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B17), wherein the ligand-binding molecule comprises a series of peptide chains consisting of a single domain antibody-antibody Fc region from the N-terminus toward the C-terminus. .
  • (B19) The ligand-binding molecule according to (B1) to (B17), wherein the ligand-binding molecule is a dimer comprising two series of peptide chains consisting of a single domain antibody-antibody hinge region-antibody Fc region.
  • the antibody Fc region is an Fc region containing one sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 103 to 106, or an Fc region variant obtained by modifying these Fc regions (B17 ) To (B19).
  • the ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B20), wherein the ligand is a cytokine or a chemokine.
  • the ligand is any one of (B1) to (B21), which is a ligand selected from interleukin, interferon, hematopoietic factor, TNF superfamily, chemokine, cell growth factor, and TGF- ⁇ family.
  • (B23) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B22), wherein the ligand is CXCL10, IL-12, PD-1, IL-6R, or IL-1Ra.
  • (B24) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B23), which is bound to the ligand.
  • (B25) The ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B23), which is fused with the ligand.
  • (B26) The ligand-binding molecule according to (B25), wherein in the state where the ligand-binding molecule is fused with a ligand, the single domain antibody contained in the ligand-binding molecule does not bind to another ligand.
  • (B27) The ligand-binding molecule according to (B25) or (B26), wherein the ligand-binding molecule is fused with the ligand via a linker.
  • (B28) The ligand-binding molecule according to (B27), wherein the linker does not contain a protease cleavage sequence.
  • (B29) A complex formed of the ligand and the ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B23).
  • (B30) A fusion protein in which the ligand and the ligand-binding molecule according to any one of (B1) to (B23) are fused.
  • (B31) The fusion protein according to (B30), wherein the single-domain antibody does not bind to another ligand in a state where the ligand-binding molecule is fused with a ligand.
  • (B32) The fusion protein according to (B30) or (B31), wherein the ligand-binding molecule is fused to the ligand via a linker.
  • (B33) The fusion protein according to (B32), wherein the linker does not contain a protease cleavage sequence.
  • (B34) The fusion protein according to (B32) or (B33), which is fused in the order of ligand-linker-ligand binding molecule from the N-terminus to the C-terminus.
  • (C1) A ligand-binding molecule comprising a single domain antibody, wherein the single domain antibody is a VHH or single domain VH antibody, and the single domain antibody is one contained in one or more sequences selected from the following sequences: Or having a cleavage site at a plurality of positions: single domain antibody from amino acid 7 (Kabat numbering) to amino acid 17 (Kabat numbering), single domain antibody from amino acid 12 (Kabat numbering) to amino acid 17 (Kabat numbering) Sequence from single amino acid 31st amino acid (Kabat numbering) to 35b amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 40th amino acid (Kabat numbering) to 47th amino acid (Kabat numbering), single domain Antibody from amino acid 50 (Kabat numbering) to amino acid
  • (C2) a ligand-binding molecule comprising a single domain antibody, wherein the single domain antibody is a single domain VL antibody, and the single domain antibody is one or more contained in one or more sequences selected from the following sequences: A single-domain antibody from amino acid 7 (Kabat numbering) to amino acid 19 (Kabat numbering), single-domain antibody from amino acid 24 (Kabat numbering) to amino acid 34 (Kabat numbering) Sequence, single domain antibody from amino acid 39 (Kabat numbering) to 46 amino acid (Kabat numbering), single domain antibody from 49 amino acid (Kabat numbering) to 62 amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 50 Amino acid (Kabat numbering) to 56 amino acid (Kabat numbering) Nbaringu) sequence up to, sequences from single domain antibody 89 amino acid number (Kabat numbering) to 97th amino acid (Kabat numbering), sequences of up to 107 amino acid number of single domain antibody # 96 amino acids (Ka
  • the single domain antibody is capable of binding to the ligand, and the binding of the ligand binding molecule to the ligand in a state where the cleavage site is cleaved, and the ligand binding molecule in a state where the cleavage site is not cleaved
  • the ligand-binding molecule according to (C1) or (C2) which is attenuated by binding to the ligand.
  • C4 The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C3), wherein the ligand is released from the ligand-binding molecule when the cleavage site is cleaved.
  • (C5) The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C4), wherein the cleavage site contains a protease cleavage sequence.
  • (C6) The ligand-binding molecule according to (C5), wherein the protease is a target tissue-specific protease.
  • (C7) The ligand-binding molecule according to (C6), wherein the target tissue is a cancer tissue, and the target tissue-specific protease is a cancer tissue-specific protease.
  • (C8) The ligand-binding molecule according to (C6), wherein the target tissue is an inflammatory tissue, and the target tissue-specific protease is an inflammatory tissue-specific protease.
  • the ligand-binding molecule according to any one of (C5) to (C8), wherein the protease is at least one protease selected from matriptase, urokinase (uPA), and metalloprotease.
  • the protease cleavage sequence is a sequence comprising one or a plurality of sequences selected from the sequences shown in SEQ ID NOs: 2-82 and 788-827, and the sequences shown in Table 1.
  • C5 to (C9 The ligand binding molecule according to any one of (1).
  • (C11) The ligand-binding molecule according to any one of (C5) to (C10), wherein a first movable linker is further added to one end of the protease cleavage sequence.
  • (C12) The ligand-binding molecule according to (C11), wherein the first movable linker is a movable linker composed of a glycine-serine polymer.
  • (C13) The ligand-binding molecule according to (C11) or (C12), wherein a second movable linker is further added to the other end of the protease cleavage sequence.
  • (C14) The ligand-binding molecule according to (C13), wherein the second movable linker is a movable linker composed of a glycine-serine polymer.
  • (C15) The ligand according to any one of (C1) to (C14), wherein the ligand is a molecule having biological activity, and the single domain antibody inhibits the biological activity of the ligand by binding to the ligand.
  • (C16) The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C15), wherein the ligand is a molecule having biological activity, and the single domain antibody has neutralizing activity for the ligand.
  • (C17) The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C16), wherein the ligand-binding molecule contains only a single domain containing the cleavage site or protease cleavage sequence.
  • (C18) The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C17), wherein the ligand-binding molecule further comprises an antibody Fc region.
  • (C19) The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C18), wherein the ligand-binding molecule comprises a series of peptide chains consisting of a single domain antibody-antibody Fc region from the N-terminus toward the C-terminus. .
  • (C20) The ligand-binding molecule according to (C1) to (C18), wherein the ligand-binding molecule is a dimer comprising two series of peptide chains consisting of a single domain antibody-antibody hinge region-antibody Fc region.
  • the antibody Fc region is an Fc region containing one sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 103 to 106, or an Fc region variant obtained by modifying these Fc regions (C18 ) To (C20).
  • (C22) The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C21), wherein the ligand is a cytokine or a chemokine.
  • the ligand is any one of (C1) to (C22), which is a ligand selected from interleukin, interferon, hematopoietic factor, TNF superfamily, chemokine, cell growth factor, and TGF- ⁇ family.
  • C24 The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C23), wherein the ligand is CXCL10, IL-12, PD-1, IL-6R, or IL-1Ra.
  • C25 The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C24), which is bound to the ligand.
  • (C26) The ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C24), which is fused with the ligand.
  • (C27) The ligand-binding molecule according to (C26), wherein the single-domain antibody contained in the ligand-binding molecule does not bind to another ligand when the ligand-binding molecule is fused with the ligand.
  • (C28) The ligand-binding molecule according to (C26) or (C27), wherein the ligand-binding molecule is fused with the ligand via a linker.
  • (C29) The ligand-binding molecule according to (C28), wherein the linker does not contain a protease cleavage sequence.
  • (C30) A complex formed of the ligand and the ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C24).
  • (C31) A fusion protein in which the ligand and the ligand-binding molecule according to any one of (C1) to (C24) are fused.
  • (C32) The fusion protein according to (C31), wherein in the state where the ligand-binding molecule is fused with a ligand, the single domain antibody does not bind to another ligand.
  • (C33) The fusion protein according to (C31) or (C32), wherein the ligand-binding molecule is fused to the ligand via a linker.
  • (C34) The fusion protein according to (C33), wherein the linker does not contain a protease cleavage sequence.
  • (C35) The fusion protein according to (C33) or (C34), which is fused in the order of ligand-linker-ligand binding molecule from the N-terminus to the C-terminus.
  • (D1) A pharmaceutical composition comprising the ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A27), (B1) to (B25), and (C1) to (C26).
  • (D2) A pharmaceutical composition comprising the ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A26), (B1) to (B24), and (C1) to (C25) and a ligand.
  • (D3) A pharmaceutical composition comprising the complex according to (A31) or (B29) or (C30).
  • D4) A pharmaceutical composition comprising the fusion protein according to any one of (A32) to (A36), (B30) to (B34), and (C31) to (C35).
  • (E1) A method for producing a ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A25), (B1) to (B24), and (C1) to (C25).
  • (E2) The production method according to (E1), comprising introducing a protease cleavage sequence into a single domain antibody in a ligand-binding molecule containing the single domain antibody.
  • (E3) (A32) to (A36), (B30) to (B34), comprising fusing a ligand binding molecule containing a single domain antibody into which a protease cleavage sequence has been introduced and a ligand capable of binding to the single domain antibody.
  • (E4) A polynucleotide encoding the ligand-binding molecule according to any one of (A1) to (A25), (B1) to (B23), and (C1) to (C24).
  • (E5) A vector comprising the polynucleotide according to (E4).
  • (E6) A host cell comprising the polynucleotide according to (E4) or the vector according to (E5).
  • the ligand according to any one of (A1) to (A25), (B1) to (B23), and (C1) to (C24), comprising a step of culturing the host cell according to (E6) A method for producing a binding molecule.
  • (E8) A polynucleotide encoding the fusion protein according to any one of (A32) to (A36), (B30) to (B34), and (C31) to (C35).
  • (E9) A vector comprising the polynucleotide according to (E8).
  • (E10) A host cell comprising the polynucleotide according to (E8) or the vector according to (E9).
  • (E11) The fusion according to any one of (A32) to (A36), (B30) to (B34), and (C31) to (C35), comprising the step of culturing the host cell according to (E10) A method for producing a protein.
  • a single domain antibody can bind to the ligand when the cleavage site contained in the single domain antibody is not cleaved, and the single domain antibody is cleaved and cannot bind to the ligand when the cleavage site is cleaved. The ligand is released. It is a figure which shows an example of the fusion protein of the ligand binding molecule and ligand of this invention.
  • the single domain antibody in the fusion protein can bind to the ligand in the fusion protein, and in the state in which the cleavage site is cleaved, the single domain antibody is cleaved. Part of the fusion protein containing the ligand is released.
  • the ligand binding molecule is a dimeric protein comprising a single domain antibody-antibody hinge region-antibody Fc region. It is a figure which shows another example of the fusion protein of the ligand binding molecule and ligand of this invention.
  • the ligand binding molecule is a dimeric protein comprising a single domain antibody-antibody hinge region-antibody Fc region. It is a figure which shows the result of SDS-PAGE of a protease treatment ligand binding molecule and a protease untreated ligand binding molecule.
  • the control molecules that do not contain a protease cleavage sequence (Lane 12, 13) are in the same position regardless of whether or not they are treated with protease, whereas the ligand-binding molecules into which each protease cleavage sequence has been introduced only after protease treatment.
  • the gray line indicates the data for the protease-untreated sample
  • the black line indicates the data for the protease-treated sample. It is a figure which shows the result of SDS-PAGE of a protease treatment fusion protein and a protease untreated fusion protein.
  • Each fusion protein containing a single-domain antibody-containing ligand-binding molecule with a protease cleavage sequence introduced after protease treatment, whereas the control molecule without the protease cleavage sequence is in the same position regardless of protease treatment / untreated.
  • FIG. 7 is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 7 is a diagram showing a continuation of FIG. 7-2. It is a figure which shows the continuation of FIG. 7-3. It is the real-time graph which evaluated the coupling
  • FIG. 8 is a diagram showing a continuation of FIG. It is a figure which shows the result of SDS-PAGE of a protease treatment fusion protein and a protease untreated fusion protein.
  • the title of each figure is the name of the measurement sample, the vertical axis shows the relative binding of PD-1 and PD1-bio, and the horizontal axis shows time (s).
  • the gray line indicates the data for the protease-untreated sample, and the black line indicates the data for the protease-treated sample.
  • the polypeptide usually refers to a peptide having a length of about 4 amino acids or more, and a protein.
  • the polypeptide of the present invention has multiple series of peptide chains interacting with SS bonds, hydrophobic interactions, ionic bonds, etc. It may be a complex protein formed by
  • the polypeptide in the present invention is usually a polypeptide comprising an artificially designed sequence, but is not particularly limited, and may be, for example, a biological polypeptide. Further, it may be a natural polypeptide, a synthetic polypeptide, a recombinant polypeptide or the like. Furthermore, fragments of the above polypeptides are also included in the polypeptides of the present invention.
  • Site-directed mutagenesis (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) or overlap extension PCR can be used to modify amino acids in the amino acid sequence of an amino acid-modified polypeptide.
  • a known method such as the above can be appropriately employed.
  • a method for modifying an amino acid to be substituted with an amino acid other than a natural amino acid a plurality of known methods can also be employed (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249, Proc. Natl Acad. Sci. USA (2003) 100 (11), 6353-6357).
  • a cell-free translation system (Clover Direct (Protein Express) in which a tRNA in which an unnatural amino acid is bound to a complementary amber suppressor tRNA of a UAG codon (amber codon), which is one of the stop codons, is also suitable. Used.
  • the meaning of the term “and / or” used in representing an amino acid modification site includes any combination in which “and” and “or” are appropriately combined.
  • “the 37th, 45th, and / or 47th amino acid is substituted” includes the following amino acid variations: (a) 37, (b) 45, (c) 47, (d) 37 and 45, (e) 37 and 47, (f) 45 and 47, (g) 37 And 45 and 47.
  • an expression representing an amino acid modification an expression in which a one-letter code or a three-letter code of an amino acid before and after modification is written before and after a numeral representing a specific position may be used as appropriate.
  • the modification F37V or Phe37Val used for adding an amino acid substitution contained in an antibody variable region represents substitution of Phe at position 37 represented by Kabat numbering to Val. That is, the number represents the position of the amino acid represented by Kabat numbering, and the one-letter code or three-letter code of the amino acid described before is the amino acid before substitution, the one-letter code of the amino acid described thereafter or 3
  • the letter code represents the amino acid after substitution.
  • the modification of P238A or Pro238Ala used when adding an amino acid substitution to the Fc region contained in the antibody constant region represents substitution of Pro at position 238 represented by EU numbering to Ala. That is, the number represents the position of the amino acid represented by EU numbering, and the one-letter code or three-letter code of the amino acid described before it is the amino acid before substitution, the one-letter code of the amino acid described after that or 3 The letter code represents the amino acid after substitution.
  • antibody as used herein is used in the broadest sense and is not limited thereto as long as it exhibits the desired antigen-binding activity, but is not limited to monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecificity Various antibody structures are included, including antibodies (eg, bispecific antibodies) and antibody fragments.
  • Antibody fragment refers to a molecule other than the complete antibody, including a part of the complete antibody that binds to the antigen to which the complete antibody binds.
  • Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab ′, Fab′-SH, F (ab ′) 2, diabody, linear antibodies, single chain antibody molecules (eg, scFv) And multispecific antibodies formed from antibody fragments.
  • full-length antibody “complete antibody”, and “total antibody” are used interchangeably herein and have a structure substantially similar to or defined herein.
  • variable region term “variable region” or “variable domain” refers to the heavy or light chain domain of an antibody involved in binding the antibody to an antigen.
  • Antibody heavy and light chain variable domains typically have similar structures, each domain containing four conserved framework regions (FR) and three complementarity determining regions (CDRs). Have (See, for example, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., WH Freeman and Co., page 91 (2007).) A single VH or VL domain will be sufficient to confer antigen binding specificity.
  • CDR complementarity determining region
  • hypervariable loop a structurally defined loop
  • antigen contact the variable domain of an antibody or each region of a single domain antibody.
  • an antibody contains 6 CDRs: 3 in VH (H1, H2, H3) and 3 in VL (L1, L2, L3).
  • Exemplary antibody CDRs herein include the following: (a) at amino acid residues 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), and 96-101 (H3) The resulting hypervariable loop (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)); (b) at amino acid residues 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), and 95-102 (H3) The resulting CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.
  • 262 732-745 (1996)); (d) CDR amino acid residues 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49 A combination of (a), (b), and / or (c), including -65 (H2), 93-102 (H3), or 94-102 (H3).
  • a single domain antibody contains three CDRs: CDR1, CDR2, CDR3.
  • the CDRs of the single domain antibody illustratively include: (a) Hypervariable loops occurring at amino acid residues 26-32 (CDR1), 53-55 (CDR2), and 96-101 (CDR3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.
  • CDRs occurring at amino acid residues 31-35b (CDR1), 50-65 (CDR2), and 95-102 (CDR3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service , National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
  • CDR3 Antigen contact occurring at amino acid residues 30-35b (CDR1), 47-58 (CDR2), and 93-101 (CDR3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol.
  • the CDRs of the single domain antibody illustratively include: (a) Hypervariable loops occurring at amino acid residues 26-32 (CDR1), 50-52 (CDR2), and 91-96 (CDR3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.
  • CDR Kerbat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service
  • CDR1 amino acid residues 24-34
  • CDR2 amino acid residues 50-56
  • CDR3 amino acid residues 27c-36
  • CDR3 Antigen contact occurring at amino acid residues 27c-36
  • CDR3 Antigen contact occurring at amino acid residues 27c-36
  • CDR2 46-55
  • CDR3 89-96
  • CDR residues and other residues in the variable domain are numbered herein according to Kabat et al. Above.
  • FR “Framework” or “FR” refers to variable domain residues or single domain antibody residues other than complementarity determining region (CDR) residues.
  • the FR of a variable domain or single domain antibody usually consists of four FR domains: FR1, FR2, FR3, and FR4. Accordingly, CDR and FR sequences usually appear in VH (or VL) in the following order: FR1-H1 (L1) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4. In single domain antibodies, the CDR and FR sequences usually appear in the following order: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
  • “Human consensus framework” is a framework showing the most commonly occurring amino acid residues in a selected group of human immunoglobulin VL or VH framework sequences. Usually, the selection of human immunoglobulin VL or VH sequences is from a subgroup of variable domain sequences. Usually, the subgroups of sequences are those in KabatKaet al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. In one embodiment, for VL, the subgroup is subgroup ⁇ I according to Kabat et al. In one embodiment, for VH, the subgroup is subgroup III by Kabat et al.
  • Constant region refers to portions other than the variable region of an antibody.
  • an IgG antibody is an approximately 150,000 dalton heterotetrameric glycoprotein composed of two identical light chains and two identical heavy chains that are disulfide bonded, from the N-terminus toward the C-terminus, Each heavy chain has a variable region (VH), also called a variable heavy chain domain or heavy chain variable domain, followed by a heavy chain constant region (CH) comprising a CH1 domain, a hinge region, a CH2 domain, and a CH3 domain.
  • VH variable region
  • CH heavy chain constant region
  • each light chain has a variable region (VL), also called a variable light chain domain or light chain variable domain, followed by a constant light chain (CL) domain.
  • VL variable region
  • CL constant light chain
  • the light chain of a natural antibody may be assigned to one of two types, called kappa ( ⁇ ) and lambda ( ⁇ ), based on the amino acid sequence of its constant domain.
  • ⁇ kappa
  • ⁇ lambda
  • the term “including a constant region” may include the entire constant region or a part of the constant region.
  • Class of an antibody refers to the type of constant domain or constant region provided in the heavy chain of the antibody.
  • IgA immunoglobulin
  • IgD immunoglobulin D
  • IgE immunoglobulin D
  • IgG immunoglobulin G
  • IgM immunoglobulin M
  • Fc region is used herein to define the C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain that includes at least a portion of the constant region.
  • the term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions.
  • the heavy chain Fc region extends from Cys226 or from Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain.
  • lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) at the C-terminal of the Fc region may or may not be present.
  • the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, According to the EU numbering system (also called EU index) described in MD 1991.
  • Hinge Region or “antibody hinge region” can refer to a region composed of amino acids 216 to 230 in the EU heavy chain, or a part thereof.
  • Single domain antibody is an antibody that can exert antigen-binding activity in its domain alone.
  • the structure of a single domain antibody is not limited as long as the domain alone can exert antigen-binding activity.
  • Normal antibodies exemplified by IgG antibodies and the like show antigen-binding activity in a state where variable regions are formed by pairing VH and VL, whereas single domain antibodies do not pair with other domains, It is known that the antigen-binding activity can be exerted only by the domain structure of a single domain antibody itself.
  • Single domain antibodies usually have a relatively low molecular weight and exist in monomeric form. In some embodiments, the form of a single domain antibody is similar to an antibody heavy chain variable region or antibody light chain variable region.
  • single domain antibodies include, but are not limited to, antigen-binding molecules that naturally lack a light chain, such as, for example, the variable region (VHH) of camelid heavy chain antibodies, shark V NARs , or antibodies Antibody fragments containing all or part of the VH domain or all or part of the VL domain.
  • VHH variable region
  • single domain antibodies that are antibody fragments comprising all or part of the VH / VL domain of an antibody include, but are not limited to, human antibody VH or human antibody as described, for example, in US Pat. No. 6,248,516 B1
  • single domain antibodies hereinafter referred to as single domain VH antibodies, single domain VL antibodies
  • Single domain antibodies can be obtained from animals that can produce single domain antibodies or by immunizing animals that can produce single domain antibodies.
  • animals that can produce single domain antibodies include, but are not limited to, camelids and transgenic animals into which genes that can produce single domain antibodies have been introduced.
  • Camelids include camels, llamas, alpaca, dromedaries and guanacos.
  • transgenic animals into which a gene capable of producing a single domain antibody has been introduced include, but are not limited to, transgenic animals described in International Publication No. WO2015 / 143414 and US Patent Publication No. US2011 / 0123527 A1.
  • a humanized single domain antibody can also be obtained by changing the framework sequence of a single domain antibody obtained from an animal into a human germline sequence or a similar sequence thereto.
  • Humanized single domain antibodies eg, humanized VHH are also one embodiment of the single domain antibodies of the invention.
  • Single domain antibodies can be obtained from animals that can produce single domain antibodies or by immunizing animals that can produce single domain antibodies.
  • animals that can produce single domain antibodies include, but are not limited to, camelids and transgenic animals into which genes that can produce single domain antibodies have been introduced.
  • Camelids include camels, llamas, alpaca, dromedaries and guanacos.
  • transgenic animals into which a gene capable of producing a single domain antibody has been introduced include, but are not limited to, transgenic animals described in International Publication No. WO2015 / 143414 and US Patent Publication No. US2011 / 0123527 A1.
  • a humanized single domain antibody can also be obtained by changing the framework sequence of a single domain antibody obtained from an animal into a human germline sequence or a similar sequence thereto.
  • Humanized single domain antibodies eg, humanized VHH are also one embodiment of the single domain antibodies of the invention.
  • a single domain antibody can be obtained from a polypeptide library containing a single domain antibody by ELISA, panning or the like.
  • polypeptide libraries containing single domain antibodies include, but are not limited to, for example, naive antibody libraries obtained from various animals or humans (eg, Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78), Biochimica et Biophysica Acta-Proteins and Proteomics 2006 1764: 8 (1307-1319)), antibody libraries obtained by immunizing various animals (eg, Journal of Applied Microbiology 2014 117: 2 (528-536)), or various animal or human antibody genes Synthetic antibody libraries (eg, Journal of Biomolecular Screening 2016 21: 1 (35-43), Journal of Biological Chemistry 2016 291: 24 (12641-12657), AIDS 2016 30:11 (1691-1701)) It is done.
  • a cleavage site / protease cleavage sequence is introduced into a single domain antibody, but it can be expressed as a “single domain antibody” regardless of whether or not a cleavage site / protease cleavage sequence is introduced.
  • the single domain antibodies of the invention in some embodiments, generally a) an amino acid sequence consisting of four framework regions / sequences with three complementarity determining regions / sequences inserted between them (the amino acid residue at position 11 by Kabat numbering is a group consisting of L, M, S, V, W) And / or b) an amino acid sequence consisting of four framework regions / sequences with three complementarity determining regions / sequences inserted in between (the amino acid at position 37 by Kabat numbering)
  • the residue is selected from the group consisting of F, Y, H, I, L, V, preferably F or Y), and / or c) three complementarity determining regions / sequences inserted in between
  • An amino acid sequence consisting of four framework regions / sequences (the amino acid residue at position 44 by Kabat numbering is selected from the group consisting of G, E, A, D, Q, R, S, L, preferably G, E Also Q, more preferably G or E), and / or d
  • a single domain antibody comprises any one of the following amino acid sequences consisting of four framework regions / sequences with three complementarity determining regions / sequences inserted between:
  • a polypeptide can be defined: k) an amino acid sequence in which the amino acid residues at positions 43 to 46 according to Kabat numbering are KERE or KQRE; l) an amino acid sequence in which the amino acid residues at positions 44 to 47 according to Kabat numbering are GLEW; m) An amino acid sequence in which the amino acid residues at positions 83 to 84 according to Kabat numbering are KP or EP.
  • Chimeric antibody refers to a portion of the heavy and / or light chain that is derived from a particular source or species, while the remaining portion of the heavy and / or light chain is to a different source or species. It refers to the derived antibody.
  • Chimeric single domain antibody refers to a single domain antibody in which a portion of a single domain antibody is derived from a particular source or species, while the remainder of the single domain antibody is from a different source or species. .
  • Humanized antibody A “humanized” antibody refers to a chimeric antibody comprising amino acid residues from a non-human CDR and amino acid residues from a human FR.
  • a humanized antibody comprises substantially all of at least one, typically two variable domains, wherein all or substantially all CDRs are of a non-human antibody. And all or substantially all FRs correspond to those of human antibodies.
  • “Humanized single domain antibody” refers to a chimeric single domain antibody comprising amino acid residues from non-human CDRs and amino acid residues from human FRs.
  • a humanized single domain antibody has all or substantially all CDRs corresponding to those of a non-human antibody, and all or substantially all FRs corresponding to those of a human antibody.
  • substantially all FRs are considered as examples corresponding to those of a human antibody.
  • VHH which is one embodiment of a single domain antibody
  • a humanized antibody optionally may comprise at least a portion of an antibody constant region derived from a human antibody.
  • a “humanized form” of an antibody refers to an antibody that has undergone humanization.
  • Affinity refers to the total strength of a non-covalent interaction between a binding site of a molecule (eg, an antibody) and a binding partner (eg, an antigen) of the molecule.
  • binding affinity refers to intrinsic binding affinity that reflects a 1: 1 interaction between a member of a binding pair (eg, an antibody and an antigen).
  • the affinity of a molecule X for its partner Y can generally be expressed by the dissociation constant (Kd). Affinity can be measured by conventional methods known in the art, including those described herein. Specific illustrative and exemplary embodiments for measuring binding affinity are described below.
  • An antibody that binds to the same epitope and an antibody that binds to the same epitope refer to an antibody that blocks more than 50% of the reference antibody from binding to its antigen in a competition assay, and conversely, The reference antibody blocks more than 50% of the binding of said antibody to its antigen in a competition assay.
  • An exemplary competition assay is provided herein.
  • Isolated antibody is one that has been separated from components of its original environment.
  • the antibody is, for example, by electrophoresis (eg, SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis) or chromatograph (eg, ion exchange or reverse phase HPLC). Measured and purified to a purity greater than 95% or 99%.
  • electrophoresis eg, SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis
  • chromatograph eg, ion exchange or reverse phase HPLC
  • Monoclonal antibody refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies. That is, the individual antibodies that make up the population are mutated antibodies that can occur (eg, mutated antibodies that contain naturally occurring mutations, or mutated antibodies that occur during the production of monoclonal antibody preparations. Are present in the same amount and / or bind to the same epitope. In contrast to polyclonal antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody of the monoclonal antibody preparation is directed against a single determinant on the antigen.
  • monoclonal indicates the character of the antibody as being obtained from a substantially homogeneous population of antibodies, and is not to be construed as requiring production of the antibody by any particular method.
  • monoclonal antibodies used in accordance with the present invention include, but are not limited to, hybridoma methods, recombinant DNA methods, phage display methods, transgenic animals containing all or part of a human immunoglobulin locus.
  • Such methods and other exemplary methods for making monoclonal antibodies can be made by a variety of techniques, including methods utilizing the methods described herein.
  • Percent (%) amino acid sequence identity with respect to a reference polypeptide sequence is any conservative after aligning the sequences and introducing gaps, if necessary, to obtain maximum percent sequence identity.
  • a substitution is defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to amino acid residues in a reference polypeptide sequence, assuming that substitution is not considered part of the sequence identity.
  • Alignment for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be achieved by various methods within the skill in the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) software, or GENETYX® (stocks). This can be achieved by using publicly available computer software such as Company Genetics.
  • One skilled in the art can determine appropriate parameters for aligning the sequences, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the full length of the sequences being compared.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of multiplying another nucleic acid to which it has been linked.
  • the term includes vectors as self-replicating nucleic acid structures and vectors that are integrated into the genome of the host cell into which it has been introduced.
  • Certain vectors can provide for the expression of nucleic acids to which they are operably linked. Such vectors are also referred to herein as “expression vectors”.
  • host cell refers to cells (including progeny of such cells) into which foreign nucleic acid has been introduced. That means.
  • Host cells include “transformants” and “transformed cells”, including the primary transformed cell and progeny derived from that cell regardless of the passage number.
  • the progeny may not be completely identical in nucleic acid content with the parent cell, and may contain mutations. Also included herein are mutant progeny that have the same function or biological activity as was used when the original transformed cells were screened or selected.
  • protease refers to an enzyme, usually an endopeptidase, such as an endopeptidase or exopeptidase that hydrolyzes peptide bonds.
  • the protease used in the present invention is limited only by being able to cleave the protease cleavage sequence, and the type thereof is not particularly limited. In some embodiments, a target tissue specific protease is used.
  • Target tissue specific proteases are, for example, (1) a protease expressed at a higher level in a target tissue than in a normal tissue; (2) a protease having higher activity in the target tissue than in normal tissue; (3) a protease expressed at a higher level in target cells than in normal cells; (4) a protease having higher activity in target cells than in normal cells; Can point to either.
  • cancer tissue specific proteases or inflammatory tissue specific proteases are used.
  • Target tissue means a tissue containing at least one target cell.
  • the target tissue is a cancer tissue.
  • the target tissue is an inflammatory tissue.
  • cancer tissue means a tissue containing at least one cancer cell.
  • all cell types that contribute to the formation of tumor cells and tumor cells containing endothelial cells such as cancer tissue containing cancer cells and blood vessels.
  • a tumor refers to a tumor tissue nest (a foci of tumor tissue).
  • tumor is generally used to mean a benign or malignant neoplasm.
  • examples of the “inflammatory tissue” include the following. -Joints in rheumatoid arthritis and osteoarthritis-Lungs (alveoli) in bronchial asthma and COPD ⁇ Digestive organs in inflammatory bowel disease, Crohn's disease, and ulcerative colitis ⁇ Fibrotic tissue in fibrosis in the liver, kidney, and lung ⁇ Tissue that has undergone rejection in organ transplantation ⁇ Vessels and heart in arteriosclerosis and heart failure (Myocardium) -Visceral fat in metabolic syndrome-Skin tissue in atopic dermatitis and other dermatitis-Spinal nerve in disc herniation and chronic low back pain
  • Target tissue-specific proteases Proteases that are specifically expressed or specifically activated in several types of target tissues or that are considered to be associated with disease states of the target tissues (target tissue-specific proteases) are known ing.
  • International Publication WO2013 / 128194, International Publication WO2010 / 081173, International Publication WO2009 / 025846, etc. disclose proteases that are specifically expressed in cancer tissues. J Inflamm (Lond). 2010; 7: 45., Nat Rev Immunol. 2006 Jul; 6 (7): 541-50., Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec; 13 (12): 904-27. Respir Res. 2016 Mar 4; 17: 23., Dis Model Mech. 2014 Feb; 7 (2): 193-203., Biochim Biophys Acta. 2012 Jan; 1824 (1): 133-45. Possible proteases are disclosed.
  • proteases that are specifically expressed in the target tissue there are also proteases that are specifically activated in the target tissue.
  • proteases may be expressed in an inactive form and then become active.
  • active proteases may escape inhibition and be specifically activated.
  • the active protease can be assayed by using an antibody that recognizes the activated protease (PNAS 2013 Jan 2; 110 (1): 93-98.) Or by fluorescently labeling the peptide recognized by the protease. Although quenched (quenched), it can be measured using a method of emitting light after cleavage (Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep; 9 (9): 690-701. Doi: 10.1038 / nrd3053.).
  • proteases include, but are not limited to, cysteine protease (including cathepsin family B, L, S, etc.), aspartyl protease (cathepsin D, E, K, O, etc.), serine protease (Including matriptase (including MT-SP1), cathepsins A and G, thrombin, plasmin, urokinase (uPA), tissue plasminogen activator (tPA), elastase, proteinase 3, thrombin, kallikrein, tryptase, chymase ), Metalloproteases (metalloproteases (MMP1-28) including both membrane-bound (MMP14-17 and MMP24-25) and secreted (MMP1-13 and MMP18-23 and MMP26-28)), protease A dis Integr Phosphorus and metalloproteases (ADAM), metalloproteases with AD disintegrin or thrombospondin motif (
  • the target tissue-specific protease can refer to a cancer tissue-specific protease or an inflammatory tissue-specific protease.
  • cancer tissue-specific protease examples include proteases that are specifically expressed in cancer tissues disclosed in International Publication WO2013 / 128194, International Publication WO2010 / 081173, International Publication WO2009 / 025846, and the like. Can be mentioned.
  • the cancer tissue-specific protease is preferably at least 5 times higher than that in normal tissue, more preferably at least 10 times higher, more preferably at least 100 times higher, and more preferably at least 500 times higher. Preferably, it is most preferably 1000 times higher.
  • the cancer tissue-specific protease preferably has an activity in cancer tissue that is 2 times or more higher than that in normal tissue, preferably 3 times or more, 4 times or more, 5 times or more, 10 times or more higher. Is more preferably 100 times or more, particularly preferably 500 times or more, and most preferably 1000 times or more.
  • the cancer tissue-specific protease may be bound to the cell membrane of cancer cells, or may be secreted outside the cell membrane without being bound to the cell membrane. If the cancer tissue-specific protease is not bound to the cell membrane of the cancer cell, the cancer tissue-specific protease is present in or near the cancer tissue in order for the cytotoxicity by immune cells to be specific to the cancer cell. It is preferable that In the present specification, “in the vicinity of cancer tissue” means that the cancer tissue-specific protease cleavage sequence is cleaved and has a range in which the effect of reducing the ligand binding activity is exerted. However, a range that does not damage normal cells as much as possible is preferable.
  • cancer tissue specific proteases are (i) a protease expressed at a higher level in cancer tissue than in normal tissue, (ii) a protease having higher activity in cancer tissue than in normal tissue, (iii) a protease expressed at a higher level in cancer cells than in normal cells; (iv) a protease having higher activity in cancer cells than in normal cells, One of them.
  • One type of cancer tissue-specific protease may be used alone, or two or more types may be combined. The number of types of cancer tissue-specific protease can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of the cancer type to be treated.
  • serine protease and metalloprotease are preferable as the cancer tissue-specific protease
  • matriptase including MT-SP1
  • uPA urokinase
  • metalloprotease is more preferable
  • MT -SP1 uPA
  • MMP-2 MMP-9 are more preferred.
  • the inflammatory tissue-specific protease is preferably at least 5 times higher than that in normal tissue, more preferably at least 10 times higher, more preferably at least 100 times higher, more preferably at least 500 times higher. Preferably, it is most preferably 1000 times higher.
  • the inflammatory tissue-specific protease preferably has an activity in the inflamed tissue more than twice as high as that in the normal tissue, preferably 3 times or higher, 4 times higher, 5 times higher, 10 times higher.
  • the inflammatory tissue-specific protease may be bound to the cell membrane of inflammatory cells, or may be secreted outside the cell membrane without being bound to the cell membrane. If the inflammatory tissue-specific protease is not bound to the cell membrane of the inflammatory cell, the inflammatory tissue-specific protease must be present in or near the inflammatory tissue in order for the immune cell cytotoxicity to be specific to the inflammatory cell.
  • inflamed tissue-specific protease cleaving sequence in the vicinity of the inflamed tissue.
  • a range that does not damage normal cells as much as possible is preferable.
  • inflammatory tissue-specific proteases are (i) a protease expressed at a higher level in inflamed tissue than in normal tissue; (ii) a protease having higher activity in inflamed tissue than in normal tissue, (iii) a protease expressed at a higher level in inflammatory cells than in normal cells, (iv) a protease having higher activity in inflammatory cells than in normal cells, One of them.
  • One type of inflammatory tissue-specific protease may be used alone, or two or more types may be combined. The number of types of inflammatory tissue-specific protease can be appropriately set by those skilled in the art in consideration of the medical condition to be treated.
  • the inflammatory tissue-specific protease is preferably a metalloprotease among the proteases exemplified above, and among metalloproteases, ADAMTS5, MMP-2, MMP-7, MMP-9, and MMP-13 are more preferable. .
  • the anti-IL-6R antibody can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal can be suitably prepared.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by host cells transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • the antibodies mentioned in the present application include “humanized antibodies” and “chimeric antibodies”.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared, for example, as follows by using known techniques. That is, a mammal is immunized according to a normal immunization method using IL-6R protein as a sensitizing antigen. The resulting immune cells are fused with known parental cells by conventional cell fusion methods. Next, hybridomas that produce anti-IL-6R antibodies can be selected by screening monoclonal antibody-producing cells by conventional screening methods.
  • IL-6R protein used as a sensitizing antigen for antibody acquisition can be obtained by expressing the IL-6R gene. That is, an appropriate host cell is transformed by inserting a gene sequence encoding IL-6R into a known expression vector.
  • the desired human IL-6R protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • soluble IL-6R is expressed in order to obtain soluble IL-6R from the culture supernatant.
  • Purified natural IL-6R protein can also be used as a sensitizing antigen as well.
  • the purified IL-6R protein can be used as a sensitizing antigen used for immunization against mammals.
  • a partial peptide of IL-6R can also be used as a sensitizing antigen.
  • the partial peptide can also be obtained by chemical synthesis from the amino acid sequence of human IL-6R. It can also be obtained by incorporating a part of the IL-6R gene into an expression vector for expression.
  • the region and size of IL-6R peptide used as a partial peptide are not particularly limited to a specific embodiment.
  • the number of amino acids constituting the peptide to be sensitized antigen is preferably at least 5 or more, for example 6 or more, or 7 or more. More specifically, a peptide having 8 to 50, preferably 10 to 30 residues can be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein obtained by fusing a desired partial polypeptide or peptide of IL-6R protein with a different polypeptide can be used as a sensitizing antigen.
  • an antibody Fc fragment or a peptide tag can be suitably used.
  • a vector that expresses a fusion protein can be prepared by fusing genes encoding two or more desired polypeptide fragments in-frame and inserting the fusion gene into the expression vector as described above. The method for producing the fusion protein is described in Molecular® Cloning® 2nd® ed.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not limited to a specific animal, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. In general, rodent animals such as mice, rats, hamsters, rabbits, monkeys and the like are preferably used. When obtaining a single domain antibody, a camelid or a transgenic animal into which a gene capable of producing a single domain antibody has been introduced is preferably used.
  • the above animals are immunized with a sensitizing antigen.
  • immunization is performed by administering a sensitizing antigen intraperitoneally or subcutaneously to a mammal.
  • a sensitized antigen diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline at an appropriate dilution ratio is mixed with a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, and emulsified, if desired.
  • the sensitizing antigen is administered to the mammal several times every 4 to 21 days.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • a partial peptide having a low molecular weight when used as a sensitizing antigen, it may be desirable to immunize the sensitizing antigen peptide bound to a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • a hybridoma that produces a desired antibody can be prepared as follows using DNA immunization.
  • DNA immunization a sensitized antigen is expressed in vivo in the immunized animal to which a vector DNA constructed in such a manner that a gene encoding an antigen protein can be expressed in the immunized animal.
  • This is an immunization method in which immune stimulation is given.
  • the following advantages are expected in DNA immunization. -Maintains the structure of membrane proteins such as IL-6R and can provide immune stimulation-No need to purify immune antigens
  • DNA expressing IL-6R protein is administered to an immunized animal.
  • DNA encoding IL-6R can be synthesized by a known method such as PCR.
  • the obtained DNA is inserted into an appropriate expression vector and administered to an immunized animal.
  • the expression vector for example, a commercially available expression vector such as pcDNA3.1 can be suitably used.
  • a method for administering a vector to a living body a generally used method can be used.
  • DNA immunization is performed by introducing gold particles adsorbed with an expression vector into cells of an immunized animal individual using a gene gun.
  • the production of an antibody that recognizes IL-6R can also be produced using the method described in International Publication WO 2003/104453.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Spleen cells can be used as preferred immune cells.
  • Mammalian myeloma cells are used as the cells fused with the immune cells.
  • the myeloma cell is preferably provided with an appropriate selection marker for screening.
  • a selectable marker refers to a trait that can (or cannot) survive under certain culture conditions.
  • Known selection markers include hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency (hereinafter abbreviated as HGPRT deficiency) or thymidine kinase deficiency (hereinafter abbreviated as TK deficiency).
  • HGPRT deficiency hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency
  • TK deficiency thymidine kinase deficiency
  • Cells having HGPRT or TK deficiency have hypoxanthine-aminopterin-thymidine sensitivity (hereinafter abbreviated as HAT sensitivity).
  • HGPRT-deficient or TK-deficient cells can be selected in a medium containing 6 thioguanine, 8 azaguanine (hereinafter abbreviated as 8AG), or 5 'bromodeoxyuridine, respectively.
  • 8AG 8 azaguanine
  • 5 'bromodeoxyuridine normal cells that incorporate these pyrimidine analogs into DNA die.
  • cells deficient in these enzymes that cannot take up these pyrimidine analogs can survive in selective media.
  • G418 resistance confers resistance to 2-deoxystreptamine antibiotics (gentamicin analogs) by a neomycin resistance gene.
  • gentamicin analogs gentamicin analogs
  • myeloma cells suitable for cell fusion are known.
  • Examples of such myeloma cells include P3 (P3x63Ag8.653) (J.JImmunol. (1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1- 7), NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519), MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415), SP2 / 0 ( Nature (1978) 276 (5685), 269-270), FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21), S194 / 5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323), R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133) and the like can be suitably used.
  • P3x63Ag8.653 J.JImmunol. (1979) 123 (4)
  • cell fusion between the immune cells and myeloma cells is performed according to a known method such as the method of Köhler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). More specifically, for example, the cell fusion can be performed in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used, and an auxiliary such as dimethyl sulfoxide is optionally added to increase the fusion efficiency.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be set arbitrarily.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture are used. Serum replacement fluid such as fetal serum (FCS) can be suitably added.
  • FCS fetal serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) preheated to about 37 ° C. is usually 30 to 60%. It is added at a concentration of (w / v).
  • a desired fused cell is formed by gently mixing the mixture.
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of hybridomas can be removed by repeating the operation of adding the appropriate culture solution listed above and removing the supernatant by centrifugation.
  • the hybridoma thus obtained can be selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culture using the HAT culture solution can be continued for a time sufficient for cells other than the desired hybridoma (non-fused cells) to die (usually, sufficient time is several days to several weeks).
  • screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed by the usual limiting dilution method.
  • the hybridoma thus obtained can be selected by using a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • cells having HGPRT or TK deficiency can be selected by culturing in a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). That is, when HAT-sensitive myeloma cells are used for cell fusion, cells that have succeeded in cell fusion with normal cells can selectively proliferate in the HAT medium.
  • the culture using the HAT culture solution is continued for a time sufficient for cells other than the desired hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • a desired hybridoma can be selected by culturing for several days to several weeks. Subsequently, screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody can be performed by conventional limiting
  • Desired antibody screening and single cloning can be suitably performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • a monoclonal antibody that binds to IL-6R can bind to IL-6R expressed on the cell surface.
  • Such monoclonal antibodies can be screened, for example, by FACS (fluorescence-activated cell sorting).
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • cells expressing IL-6R are prepared.
  • Preferred cells for screening are mammalian cells in which IL-6R is forcibly expressed.
  • a non-transformed mammalian cell used as a host cell as a control, the binding activity of the antibody to IL-6R on the cell surface can be selectively detected. That is, a hybridoma that produces an IL-6R monoclonal antibody can be obtained by selecting a hybridoma that produces an antibody that does not bind to host cells but binds to IL-6R forced expression cells.
  • the binding activity of the antibody to the immobilized IL-6R-expressing cells can be evaluated based on the principle of ELISA.
  • IL-6R-expressing cells are immobilized in the well of an ELISA plate.
  • the culture supernatant of the hybridoma is brought into contact with the immobilized cells in the well, and an antibody that binds to the immobilized cells is detected.
  • the monoclonal antibody is derived from a mouse
  • the antibody bound to the cell can be detected by an anti-mouse immunoglobulin antibody.
  • a hybridoma that produces a desired antibody having an ability to bind to an antigen selected by these screenings can be cloned by a limiting dilution method or the like.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution.
  • the hybridoma can also be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method, and a desired monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant.
  • a hybridoma can be administered to a mammal compatible therewith and allowed to proliferate, and a monoclonal antibody can be obtained from the ascites.
  • the former method is suitable for obtaining a highly pure antibody.
  • An antibody encoded by an antibody gene cloned from antibody-producing cells such as the hybridoma can also be suitably used.
  • An antibody encoded by the gene is expressed by incorporating the cloned antibody gene into a suitable vector and introducing it into a host. Methods for isolation of antibody genes, introduction into vectors, and transformation of host cells are already established by, for example, Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767- 775). As described below, methods for producing recombinant antibodies are also known.
  • cDNA encoding a variable region (V region) of an anti-IL-6R antibody is obtained from a hybridoma cell that produces the anti-IL-6R antibody.
  • V region variable region
  • RNA is extracted from the hybridoma.
  • the following method can be used. -Guanidine ultracentrifugation (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299) -AGPC method (Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
  • Extracted mRNA can be purified using mRNA “Purification” Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) or the like.
  • kits for extracting total mRNA directly from cells such as QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) are also commercially available.
  • mRNA can be obtained from the hybridoma.
  • CDNA encoding the antibody V region can be synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA can be synthesized by AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation).
  • the desired cDNA fragment is purified from the obtained PCR product and then ligated with vector DNA.
  • a desired recombinant vector can be prepared from Escherichia coli that has formed the colony. Then, whether or not the recombinant vector has the target cDNA base sequence is confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • cDNA is synthesized using RNA extracted from a hybridoma cell as a template to obtain a 5'-RACE cDNA library.
  • a commercially available kit such as SMART RACE cDNA amplification kit is appropriately used.
  • the antibody gene is amplified by the PCR method using the obtained 5'-RACE ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ cDNA library as a template.
  • Primers for amplifying mouse antibody genes can be designed based on known antibody gene sequences. These primers have different nucleotide sequences for each immunoglobulin subclass. Therefore, it is desirable to determine the subclass in advance using a commercially available kit such as IsoIStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics).
  • primers capable of amplifying genes encoding ⁇ 1, ⁇ 2a, ⁇ 2b, ⁇ 3 as heavy chains and ⁇ chain and ⁇ chain as light chains are provided. Can be used.
  • a primer that anneals to a portion corresponding to a constant region close to the variable region is generally used as the 3 ′ primer.
  • the primer attached to the 5 ′ RACE cDNA library preparation kit is used as the 5 ′ primer.
  • an immunoglobulin comprising a combination of a heavy chain and a light chain
  • Desired antibodies can be screened using the reconstituted immunoglobulin binding activity to IL-6R as an index.
  • the binding of the antibody to IL-6R is more preferably specific.
  • Antibodies that bind to IL-6R can be screened, for example, as follows; (1) contacting an antibody containing a V region encoded by cDNA obtained from a hybridoma with IL-6R-expressing cells; (2) a step of detecting binding between an IL-6R-expressing cell and an antibody, and (3) a step of selecting an antibody that binds to the IL-6R-expressing cell.
  • Methods for detecting binding between antibodies (including single domain antibodies) and IL-6R expressing cells are known. Specifically, the binding between the antibody and the IL-6R-expressing cell can be detected by a technique such as FACS described above. In order to evaluate the binding activity of the antibody, a fixed specimen of IL-6R-expressing cells can be appropriately used.
  • a panning method using a phage vector is also preferably used. Even when a single domain antibody is screened, it can be appropriately screened according to the following examples.
  • an antibody gene is obtained from a polyclonal antibody-expressing cell group as a library of heavy and light chain subclasses, a screening method using a phage vector is advantageous. Genes encoding the variable regions of the heavy chain and the light chain can form a single chain Fv (scFv) by ligating with an appropriate linker sequence. By inserting a gene encoding scFv into a phage vector, a phage expressing scFv on the surface can be obtained.
  • the DNA encoding the scFv having the desired binding activity can be recovered by recovering the phage bound to the antigen. By repeating this operation as necessary, scFv having a desired binding activity can be concentrated.
  • the cDNA is digested with a restriction enzyme that recognizes restriction enzyme sites inserted at both ends of the cDNA.
  • a preferred restriction enzyme recognizes and digests a base sequence that appears infrequently in the base sequence constituting the antibody gene.
  • a restriction enzyme that gives a sticky end.
  • An antibody expression vector can be obtained by inserting the cDNA encoding the V region of the anti-IL-6R antibody digested as described above into an appropriate expression vector.
  • a chimeric antibody is obtained.
  • the chimeric antibody means that the origin of the constant region and the variable region are different.
  • a heterologous chimeric antibody such as mouse-human
  • a human-human homologous chimeric antibody is also included in the chimeric antibody of the present invention.
  • a chimeric antibody expression vector can be constructed by inserting the V region gene into an expression vector having a constant region in advance.
  • a restriction enzyme recognition sequence for a restriction enzyme that digests the V region gene can be appropriately arranged on the 5 ′ side of an expression vector holding a DNA encoding a desired antibody constant region (C region).
  • a chimeric antibody expression vector is constructed by fusing both digested with the same combination of restriction enzymes in-frame.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of the expression control region.
  • An expression control region for expressing an antibody includes, for example, an enhancer and a promoter.
  • An appropriate signal sequence can also be added to the amino terminus so that the expressed antibody is secreted extracellularly.
  • a peptide having the amino acid sequence MGWSCIILFLVATATGVHS can be used as the signal sequence, but other suitable signal sequences are added.
  • the expressed polypeptide can be cleaved at the carboxyl terminal portion of the sequence, and the cleaved polypeptide can be secreted extracellularly as a mature polypeptide.
  • an appropriate host cell is transformed with this expression vector, whereby a recombinant cell expressing a DNA encoding an anti-IL-6R antibody can be obtained.
  • Ligand-binding molecule One aspect of the ligand-binding molecule of the present invention is a molecule that can bind to a ligand with a single domain antibody contained in the ligand-binding molecule, particularly a molecule that can bind to a ligand in an uncut state.
  • “Coupling” here generally refers to bonding by interaction mainly consisting of non-covalent bonds such as electrostatic force, van der Waals force, and hydrogen bond.
  • ligand binding mode of the ligand binding molecule of the present invention include, but are not limited to, for example, antigen-antibody reaction in which an antigen-binding region, an antigen-binding molecule, an antibody, an antibody fragment, and the like bind to an antigen. .
  • Bindable to ligand means that the ligand-binding molecule can bind to the ligand even if the ligand-binding molecule and the ligand are separate molecules, and means that the ligand-binding molecule and the ligand are linked by a covalent bond. do not do. For example, the fact that a ligand and a ligand-binding molecule are covalently bonded via a linker does not mean that the ligand can be bound.
  • binding to a ligand is attenuated means that the ability to bind is attenuated.
  • the ligand-binding molecule may be connected to the ligand via a linker or the like.
  • the ligand-binding molecule of the present invention is limited only by binding to a ligand with a single domain antibody contained in the molecule in an uncleaved state, and is a target ligand in a single domain antibody contained in the molecule in an uncleaved state. Any structure molecule can be used as long as it can bind to the.
  • the cleavage site can be cleaved by, for example, an enzyme, can be reduced by a reducing agent, or can be photodegraded.
  • the cleavage site may be located anywhere in the polypeptide as long as it can be cleaved to reduce the binding of the ligand binding molecule to the ligand. Further, the cleavage site contained in the polypeptide may be one or plural.
  • the ligand-binding molecule of the present invention has weak (ie, attenuated) ligand binding in the cleaved state compared to the uncut state. More specifically, the binding of a single domain antibody to a ligand in a ligand binding molecule of the invention is weaker (ie, attenuated) when the ligand binding molecule is cleaved than when the ligand binding molecule is not cleaved. . Attenuation of ligand binding can be assessed by the ligand binding activity of the ligand binding molecule.
  • Ligand binding molecule binding activity was evaluated using FACS, ELISA format, ALPHA screen (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) and BIACORE method using surface plasmon resonance (SPR) phenomenon, BLI (Bio- It can be confirmed by a known method such as Layer Interferometry (Octet) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
  • the ALPHA screen is implemented according to the following principle by ALPHA technology using two beads of donor and acceptor. Only when the molecule bound to the donor bead interacts with the molecule bound to the acceptor bead and the two beads are in close proximity, a luminescent signal is detected.
  • a photosensitizer in the donor bead excited by the laser converts ambient oxygen into excited singlet oxygen.
  • Singlet oxygen diffuses around the donor bead, and when it reaches an adjacent acceptor bead, it causes a chemiluminescence reaction in the bead, and finally light is emitted.
  • the chemiluminescence reaction does not occur because the singlet oxygen produced by the donor bead does not reach the acceptor bead.
  • a ligand-binding molecule labeled with biotin is bound to donor beads, and a ligand tagged with glutathione S-transferase (GST) is bound to acceptor beads.
  • GST glutathione S-transferase
  • the ligand binding molecule and ligand interact to give a signal of 520-620 nm.
  • Untagged ligand binding molecules compete with the interaction between the tagged ligand binding molecule and the ligand.
  • Relative binding affinity can be determined by quantifying the decrease in fluorescence that results from competition. It is known that a ligand-binding molecule such as an antibody is biotinylated using Sulfo-NHS-biotin or the like.
  • a GST fusion ligand is expressed in a cell or the like holding a vector capable of expressing a fusion gene in which a polynucleotide encoding a ligand and a polynucleotide encoding GST are fused in frame
  • a method of purification using a glutathione column can be appropriately employed.
  • the obtained signal is suitably analyzed by fitting to a one-site competition model using nonlinear regression analysis using software such as GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).
  • the Biacore system takes the shift amount, that is, the mass change at the sensor chip surface on the vertical axis, and displays the time change of mass as measurement data (sensorgram).
  • Kinetics association rate constant (ka) and dissociation rate constant (kd) are obtained from the sensorgram curve, and dissociation constant (KD) is obtained from the ratio of the constants.
  • an inhibition measurement method and an equilibrium value analysis method are also preferably used. Examples of inhibition measurement methods are described in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010, and examples of equilibrium analysis methods are described in Methods Enzymol. 2000; 323: 325-40. Yes.
  • the ability of the ligand-binding molecule to bind to the ligand is reduced, for example, based on the measurement method described above, the amount of ligand binding per test ligand-binding molecule is 50% compared to the control ligand-binding molecule.
  • the amount of ligand binding per test ligand-binding molecule is 50% compared to the control ligand-binding molecule.
  • a binding activity index a desired index may be appropriately used.
  • a dissociation constant (KD) may be used.
  • the dissociation constant (KD) for the ligand of the test ligand binding molecule is larger than the dissociation constant (KD) for the ligand of the control ligand binding molecule, It shows that the binding activity of the test ligand binding molecule to the ligand is weak compared to the control ligand binding molecule.
  • the dissociation constant (KD) for the ligand of the test ligand-binding molecule is more than twice the dissociation constant (KD) for the ligand of the control ligand-binding molecule. , Preferably 5 times or more, 10 times or more, particularly preferably 100 times or more.
  • the control ligand-binding molecule include an uncleaved ligand-binding molecule.
  • the ligand-binding molecule of the present invention releases the ligand from the ligand-binding molecule by cleaving the cleavage site.
  • the linker has no cleavage site, the ligand is released while being connected to the part of the ligand-binding molecule through the linker.
  • the ligand is released from the ligand binding molecule as long as there is a part of the ligand binding molecule that can no longer stably interact with the ligand. It can be said.
  • a method for detecting release of a ligand from a ligand-binding molecule by cleavage of a cleavage site there is a method for detecting a ligand with a ligand detection antibody or the like that recognizes the ligand.
  • the ligand detection antibody preferably binds to the same epitope as the ligand binding molecule.
  • Ligand detection using ligand detection antibodies can be performed by FACS, ELISA format, ALPHA screen (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) and BIACORE method using surface plasmon resonance (SPR) phenomenon, BLI (Bio-Layer Interferometry) method (Octet) Etc. can be confirmed by a well-known method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
  • the ligand detection antibody that recognizes the ligand is biotinylated, and after contacting with the biosensor, the binding to the ligand in the sample is measured, thereby releasing the ligand.
  • the amount of ligand is measured using a ligand detection antibody for a sample containing a ligand-binding molecule and a ligand before or after protease treatment, and the amount of ligand detected in the sample before and after protease treatment is measured. By comparison, release of the ligand can be detected.
  • a sample containing protease, ligand-binding molecule and ligand, and a sample containing ligand-binding molecule and ligand without containing protease measure the amount of ligand using a ligand detection antibody, and sample with or without protease. Ligand release can be detected by comparing the amount of ligand detected in the medium.
  • liberation of the ligand can be detected by the method in the examples of the present application.
  • the amount of ligand is measured using a ligand detection antibody on the sample containing the fusion protein before or after protease treatment, and then treated with protease.
  • Ligand release can be detected by comparing the amount of detected ligand in the samples before and after.
  • the amount of ligand is measured using a ligand detection antibody, and the amount of ligand detected in the sample with or without protease is determined. By comparison, release of the ligand can be detected. More specifically, liberation of the ligand can be detected by the method in the examples of the present application.
  • a method for detecting release from the ligand-binding molecule is a method for detecting the release of the ligand by measuring the biological activity of the ligand in the sample. Can be detected. Specifically, the release of the ligand can be detected by measuring and comparing the biological activity of the ligand with respect to the sample containing the ligand-binding molecule and the ligand before or after the protease treatment.
  • the release of the ligand can be detected by measuring and comparing the biological activity of the ligand with respect to the sample containing the protease, the ligand-binding molecule and the ligand, and the sample containing the protease without the protease and containing the ligand-binding molecule and the ligand.
  • release of the ligand is measured by measuring and comparing the biological activity of the ligand against a sample containing the fusion protein before or after protease treatment. It can be detected.
  • the release of the ligand can be detected by measuring and comparing the biological activity of the ligand with respect to the sample containing the protease and the fusion protein and the sample containing the fusion protein without the protease.
  • the cleavage site contains a protease cleavage sequence and is cleaved by a protease.
  • protease cleavage sequence is a specific amino acid sequence that is specifically recognized by a target tissue-specific protease when the polypeptide is hydrolyzed by the target tissue-specific protease in aqueous solution.
  • the protease cleavage sequence is more specifically expressed in the target tissue / cell to be treated or is more specifically activated in the target tissue / cell to be treated in terms of reducing side effects
  • An amino acid sequence that is hydrolyzed with high specificity by a protease is preferred.
  • Specific protease cleavage sequences include, for example, proteases that are specifically expressed in the above-described cancer tissues disclosed in International Publication WO2013 / 128194, International Publication WO2010 / 081173, International Publication WO2009 / 025846, etc. And a target sequence that is specifically hydrolyzed by an inflammatory tissue-specific protease or the like. Artificially modified sequences such as appropriately introducing amino acid mutations into target sequences that are specifically hydrolyzed by known proteases can also be used.
  • the protease cleavage sequence may be one identified by a method known to those skilled in the art as described in Nature Biotechnology 19, 661-667 (2001). Furthermore, a naturally occurring protease cleavage sequence may be used.
  • a sequence that undergoes protease cleavage in a protein that changes its molecular form by undergoing protease cleavage can be changed into a latent form by undergoing protease cleavage, can also be used.
  • protease cleavage sequences include, but are not limited to, International Publication WO2015 / 116933, International Publication WO2015 / 048329, International Publication WO2016 / 118629, International Publication WO2016 / 179257, International Publication WO2016 / 179285, International Publication WO2016. / 179335, International Publication WO2016 / 179003, International Publication WO2016 / 046778, International Publication WO2016 / 014974, US Patent Publication US2016 / 0289324, United States Patent Publication US2016 / 0311903, PNAS (2000) 97: 7754-7759 ., Biochemical Journal (2010) 426: 219-228., Beilstein J Nanotechnol.
  • the protease cleavage sequence is an amino acid sequence that is specifically hydrolyzed by a suitable target tissue-specific protease, as described above.
  • the amino acid sequences that are specifically hydrolyzed by the target tissue-specific protease the following amino acid sequences are preferred.
  • LSGRSDNH Sequence number: 2, MT-SP1, can be cleaved by uPA
  • PLGLAG SEQ ID NO: 3
  • VPLSLTMG SEQ ID NO: 4
  • the following sequences can also be used as protease cleavage sequences.
  • TSTSGRSANPRG (Sequence number: 5, MT-SP1, can be cut by uPA) ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 6, MT-SP1, can be cleaved by uPA) AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 7, MT-SP1, can be cleaved by uPA) GAGVPMSMRGGAG (SEQ ID NO: 8, can be cleaved by MMP-1) GAGIPVSLRSGAG (SEQ ID NO: 9, can be cleaved by MMP-2) GPLGIAGQ (SEQ ID NO: 10, can be cleaved by MMP-2) GGPLGMLSQS (SEQ ID NO: 11, can be cleaved by MMP-2) PLGLWA (SEQ ID NO: 12, can be cut by MMP-2) GAGRPFSMIMGAG (SEQ ID NO: 13, can be cut by MMP-3) GAGVPLSLTMGAG (SEQ ID NO: 14, can be cleaved
  • the sequence shown in Table 1 can also be used as the protease cleavage sequence.
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids
  • X4 is R
  • X5 is A , D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I, K, K,
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 each represent one amino acid
  • X1 is an amino acid selected from A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W and Y
  • X2 is A , D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, Is an amino acid selected from I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G , H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I, An amino acid selected from K
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, F, L, M, P, Q, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, An amino acid selected from K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H , I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D,
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, E, Is an amino acid selected from F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F , G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I, K, L,
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids
  • X4 is R
  • X5 is A , D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I, K, L, M, N,
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids
  • X4 is R
  • X5 is A , D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is E, F, An amino acid selected from K, M, N
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids
  • X4 is R
  • X5 is A , D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I, K, K,
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids
  • X4 is R
  • X5 is A , D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I, K, K,
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 796)
  • X1 to X8 each represent one amino acid
  • X1 is an amino acid selected from A, G, I, P, Q, S and Y
  • X2 is an amino acid selected from K or T
  • X3 is G
  • X4 is R
  • X5 is S
  • X6 is A
  • X7 is an amino acid selected from H, I and V
  • X8 is selected from H, V and Y It is an amino acid.
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 797)
  • X1 to X8 each represent one amino acid
  • X1 is Y
  • X2 is an amino acid selected from S and T
  • X3 is G
  • X4 is R
  • X5 is S
  • X6 is an amino acid selected from A and E
  • X8 is an amino acid selected from H, P, V and Y;
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids
  • X4 is R
  • X5 is A , D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 SEQ ID NO: 799)
  • X1 to X9 each represent one amino acid
  • X1 is an amino acid selected from A, E, F, G, H, K, M, N, P, Q, W and Y
  • X2 is A , D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, Is an amino acid selected from I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G , H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I, An amino
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, F, L, M, P, Q, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, An amino acid selected from K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H , I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I, K, L, M, N,
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 SEQ ID NO: 801
  • X1 to X9 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, E, Is an amino acid selected from F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F , G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I,
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 802) Wherein X1 to X9 each represent one amino acid, and X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y; X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids; X4 is R; X5 is A , D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W and Y; X6 is A, D, E, F, H, I, K, L,
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids
  • X4 is R
  • X5 is A , D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is E, F, An amino acid selected from K, M
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 each represent one amino acid, and X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids;
  • X4 is R;
  • X5 is A , D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y;
  • X6 is A, D, E, F, H, I,
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 each represent one amino acid
  • X1 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is an amino acid selected from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y are amino acids
  • X4 is R
  • X5 is A , D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y
  • X6 is A, D, E, F, H, I,
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 806)
  • X1 to X9 each represent one amino acid
  • X1 is an amino acid selected from A, G, I, P, Q, S and Y
  • X2 is an amino acid selected from K or T
  • X3 is G
  • X4 is R
  • X5 is S
  • X6 is A
  • X7 is an amino acid selected from H, I and V
  • X8 is selected from H, V
  • Y X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 807)
  • X1 to X9 each represent one amino acid and X1 is Y
  • X2 is an amino acid selected from S and T
  • X3 is G
  • X4 is R
  • X5 is S
  • X6 is an amino acid selected from A and E
  • X8 is an amino acid selected from H, P, V and Y
  • X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R; is there.
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 808)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, An amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, An amino acid
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 809)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, E, F, G, H, K, M , N, P, Q, W and Y
  • X2 is from A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W
  • Y X3 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W
  • Y X4 is R
  • X5 is from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y X6 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 810)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is selected from A, D, F, L, M, P, Q, V, W
  • Y X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y X4 is R
  • X5 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y X6
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 811)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S,
  • X3 is selected from A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 812)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, An amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W and Y
  • X5 is A, D, E, G, I, K, L, M,
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 813)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S,
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, S, S, T, V , W and Y
  • X5 is A, D,
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 814)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S
  • X3 is an amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 815)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, An amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, An amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 816)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, G, I, P, Q, S and Y
  • X2 is an amino acid selected from K or T
  • X3 is G
  • X4 is R
  • X5 is S
  • X6 is A
  • X7 is H
  • I And X8 is an amino acid selected from H, V and Y.
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 (SEQ ID NO: 817)
  • X1 to X11 each represent one amino acid
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is Y
  • X2 is selected from S and T
  • X3 G
  • X4 R
  • X5 is S
  • X6 is an amino acid selected from A and E
  • X7 is an amino acid selected from N and V
  • X8 is An amino acid selected from H, P, V and Y.
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 818)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, An amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, R, R, R, R,
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 819)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, E, F, G, H, K, M , N, P, Q, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W
  • Y X3 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and Y X6 is
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 SEQ ID NO: 820
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is selected from A, D, F, L, M, P, Q, V, W
  • Y X3 is an amino acid selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and
  • Y X4 is R
  • X5 is selected from A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W and
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 821)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S,
  • X3 is selected from A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V,
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 822)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, An amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, V, V
  • X5 is A, D, E, G, H, I, K,
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 823)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, An amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, R, R, R, R,
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 824)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, An amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, R, R, R, R,
  • X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 825)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, D, E, F, G, H, I , K, M, N, P, Q, S, T, W and Y
  • X2 is A, D, E, F, H, K, L, M, P, Q, S, An amino acid selected from T, V, W and Y
  • X3 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V , W and Y
  • X4 is R
  • X5 is A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, R, R, R, R, R,
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 826)
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is A, G, I, P, Q, S and Y
  • X2 is an amino acid selected from K or T
  • X3 is G
  • X4 is R
  • X5 is S
  • X6 is A
  • X7 is H
  • X8 is an amino acid selected from H, V and Y
  • X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R.
  • protease cleavage sequence shown below can also be used: X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 827)
  • X1 to X11 each represent one amino acid
  • X10 is an amino acid selected from I, T and Y
  • X11 is S
  • X1 is Y
  • X2 is selected from S and T
  • X3 is G
  • X4 is R
  • X5 is S
  • X6 is an amino acid selected from A and E
  • X7 is an amino acid selected from N and V
  • X8 is An amino acid selected from H, P, V and Y
  • X9 is an amino acid selected from A, G, H, I, L and R;
  • a protease cleavage sequence may be newly obtained by screening. For example, from the result of crystal structure analysis of a known protease cleavage sequence, a new protease cleavage sequence can be searched by changing the interaction between the cleavage sequence and the active residue / recognition residue of the enzyme. Furthermore, a new protease cleavage sequence can be searched by modifying an amino acid in a known protease cleavage sequence and confirming the interaction with the protease. As another example, protease libraries can be used to display peptide libraries using in vitro display methods such as phage display, ribosome display, etc.
  • the sequence to be cleaved can be searched.
  • a method for confirming the interaction between the protease cleavage sequence and the protease it can be performed by confirming protease cleavage in vitro or in vivo.
  • any of the polypeptides containing the protease cleavage sequence exemplified in Table 1 is useful as a protease substrate that is hydrolyzed by the action of a protease.
  • the protease substrate shown in SEQ ID NOs: 788 to 827 and the protease substrate of Table 1 can be used as a library for selecting those having properties according to the purpose, for example, for incorporation into a ligand-binding molecule.
  • the ligand-binding molecule is selectively cleaved by a protease localized in a lesion, its protease sensitivity can be evaluated.
  • a ligand-binding molecule bound to a ligand may reach a lesion through contact with various proteases after being administered to a living body. Therefore, it is desirable to have sensitivity as high as possible to other proteases while having sensitivity to proteases localized in the lesion.
  • the protease resistance can be known by comprehensively analyzing the sensitivity of each protease substrate in advance to various proteases. Based on the protease resistance spectrum obtained, a protease cleavage sequence with the necessary sensitivity and resistance can be found.
  • a ligand-binding molecule in which a protease cleavage sequence is incorporated reaches a lesion through various environmental loads such as pH change, temperature, redox stress as well as enzymatic action by the protease.
  • a protease cleavage sequence having desirable properties according to the purpose can be selected based on information comparing the resistance of each protease substrate.
  • a mobile linker is further added to either or both ends of the protease cleavage sequence.
  • the mobile linker at one end of the protease cleavage sequence can be referred to as the first mobile linker, and the mobile linker at the other end can be referred to as the second mobile linker.
  • the protease cleavage sequence and the mobile linker comprise one of the following formulas: (Protease cleavage sequence) (First movable linker)-(protease cleavage sequence) (Protease cleavage sequence)-(Second movable linker) (First movable linker)-(protease cleavage sequence)-(second movable linker)
  • the movable linker in this embodiment is preferably a peptide linker.
  • the first movable linker and the second movable linker are each independently and optionally present, and are the same or different movable linkers including at least one flexible amino acid (such as Gly).
  • a sufficient number of residues (Arg, Ile, Gln, Glu, Cys, Tyr, Trp, Thr, Val, His, Phe, Pro, Met, Lys such that the protease cleavage sequence provides the desired protease accessibility.
  • Gly, Ser, Asp, Asn, Ala, etc. amino acids, particularly Gly, Ser, Asp, Asn, Ala, especially Gly and Ser, especially Gly, etc.).
  • a movable linker suitable for use at both ends of a protease cleavage sequence is usually one that improves protease access to the protease cleavage sequence and increases protease cleavage efficiency.
  • Suitable mobile linkers are easily selectable, from 1 amino acid (eg Gly) to 20 amino acids, 2 amino acids to 15 amino acids, 4 amino acids to 10 amino acids, 5 amino acids to 9 amino acids, 6 amino acids to 8 amino acids or 7 amino acids From 8 amino acids and 3 amino acids to 12 amino acids and the like, suitable ones from different lengths can be selected.
  • the movable linker is a 1 to 7 amino acid peptide linker.
  • mobile linkers include, but are not limited to, for example, glycine polymer (G) n, glycine-serine polymers (eg, (GS) n, (GSGGS: SEQ ID NO: 92) n and (GGGS: SEQ ID NO: 83) n, where n is an integer of at least 1), glycine-alanine polymers, alanine-serine polymers, and other mobile linkers well known in the art.
  • G glycine polymer
  • GSGGS glycine-serine polymers
  • GGGS SEQ ID NO: 83
  • Examples of mobile linkers composed of glycine-serine polymers include, but are not limited to: Ser Gly ⁇ Ser (GS) Ser ⁇ Gly (SG) Gly, Gly, Ser (GGS) Gly, Ser, Gly (GSG) Ser ⁇ Gly ⁇ Gly (SGG) Gly, Ser, Ser (GSS) Ser, Ser, Gly (SSG) Ser, Gly, Ser (SGS) Gly, Gly, Gly, Ser (GGGS, SEQ ID NO: 83) Gly, Gly, Ser, Gly (GGSG, SEQ ID NO: 84) Gly, Ser, Gly, Gly (GSGG, SEQ ID NO: 85) Ser, Gly, Gly, Gly (SGGG, SEQ ID NO: 86) Gly, Ser, Ser, Gly (GSSG, SEQ ID NO: 87) Gly, Gly, Gly, Gly, Ser (GGGGS, SEQ ID NO: 88) Gly, Gly, Gly, Ser, Gly
  • cleavage of the cleavage site / protease cleavage sequence in the ligand binding molecule cleaves the single domain antibody in the ligand binding molecule and attenuates binding to the ligand.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is introduced into a single domain antibody in the ligand binding molecule.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is introduced at a residue in the single domain antibody that forms a loop structure and a residue close to the loop structure.
  • the loop structure in a single domain antibody refers to a portion of a single domain antibody that does not form a secondary structure such as ⁇ -helix and ⁇ -sheet.
  • the positions of the residues forming the loop structure and the residues close to the loop structure are specifically: single domain antibody 7th amino acid (Kabat numbering) To amino acid 17 (Kabat numbering), amino acid 12 (Kabat numbering) to amino acid 17 (Kabat numbering), amino acid 31 (Kabat numbering) to amino acid 35b (Kabat numbering), amino acid 40 (Kabat numbering) ) To amino acid 47 (Kabat numbering), amino acid 50 (Kabat numbering) to amino acid 65 (Kabat numbering), amino acid 55 (Kabat numbering) to amino acid 69 (Kabat numbering), amino acid 73 (Kabat) No.
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is introduced at one or more positions contained in one or more sequences selected from the following sequences of the single domain antibody: Is: Single domain antibody from amino acid 7 (Kabat numbering) to amino acid 17 (Kabat numbering), single domain antibody from amino acid 12 (Kabat numbering) to amino acid 17 (Kabat numbering), single domain antibody 31 amino acid Sequence from (Kabat numbering) to 35th amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 40th amino acid (Kabat numbering) to 47th amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 50th amino acid (Kabat numbering) to 65 Sequence from amino acid (Kabat numbering), single domain antibody from amino acid 55 (Kabat numbering) to amino acid 69 (Kabat numbering), single domain antibody from amino acid 73 (Kabat numbering) to amino acid 79 (Kabat numbering) Ma Sequence,
  • the positions of the residues forming the loop structure and the residues close to the loop structure are specifically: single domain antibody 7th amino acid (Kabat numbering) to 19 From amino acid number (Kabat numbering), amino acid number 24 (Kabat numbering) to amino acid number 34 (Kabat numbering), amino acid number 39 (Kabat numbering) to amino acid number 46 (Kabat numbering), amino acid number 49 (Kabat numbering) From amino acid 62 (Kabat numbering), amino acid 50 (Kabat numbering) to amino acid 56 (Kabat numbering), amino acid 89 (Kabat numbering) to amino acid 97 (Kabat numbering), amino acid 96 (Kabat numbering) No. 107 amino acid (Kabat number) Can refer to a range of up ring).
  • the cleavage site / protease cleavage sequence is introduced at one or more positions contained in one or more sequences selected from the following sequences of the single domain antibody: : Single domain antibody 7th amino acid (Kabat numbering) to 19th amino acid (Kabat numbering) sequence, single domain antibody 24th amino acid (Kabat numbering) to 34th amino acid (Kabat numbering) sequence, single domain antibody 39th amino acid Sequence from (Kabat numbering) to 46th amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 49th amino acid (Kabat numbering) to 62nd amino acid (Kabat numbering), single domain antibody 50th amino acid (Kabat numbering) to 56 Sequence from amino acid No.
  • a plurality of cleavage sites / protease cleavage sequences can be provided in the ligand-binding molecule, and for example, can be provided at a plurality of locations in the single domain antibody in the ligand-binding molecule.
  • the ligand binds to an uncleaved ligand binding molecule to inhibit its biological activity.
  • the biological activity of the ligand is inhibited include, but are not limited to, for example, binding of an uncleaved ligand binding molecule to a ligand substantially or significantly interferes or competes with the binding of the ligand to its binding partner. The embodiment which does is mentioned.
  • an antibody having a ligand neutralizing activity or a fragment thereof is used as the ligand binding molecule, the ligand binding molecule bound to the ligand exerts its neutralizing activity, whereby the biological activity of the ligand can be inhibited.
  • the uncleaved ligand-binding molecule can sufficiently neutralize the biological activity of the ligand by binding to the ligand. That is, it is preferred that the biological activity of the ligand bound to the uncleaved ligand binding molecule is lower than the biological activity of the ligand not bound to the uncleaved ligand binding molecule.
  • the biological activity of a ligand bound to an uncleaved ligand binding molecule is 90% less than the biological activity of a ligand not bound to an uncleaved ligand binding molecule.
  • the binding activity of the cleaved ligand-binding molecule to the ligand is lower than the binding activity of the natural binding partner to the ligand (for example, a natural receptor for the ligand) to the ligand.
  • the binding activity between a cleaved ligand-binding molecule and a ligand is 90% or less compared to the amount of binding between a natural binding partner and a ligand in vivo (per unit binding partner).
  • binding amount is 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 1% or less.
  • a binding activity index a desired index may be appropriately used.
  • a dissociation constant (KD) may be used.
  • the dissociation constant (KD) of the cleaved ligand-binding molecule relative to the ligand of the natural binding partner in vivo is compared with the dissociation constant (KD) of the natural binding partner.
  • a large value indicates that the binding activity of the cleaved ligand-binding molecule to the ligand is weak compared to the natural binding partner in vivo.
  • the dissociation constant (KD) for the ligand of the cleaved ligand binding molecule is, for example, 1.1 times or more, preferably 1.5 times or more, compared to the dissociation constant (KD) for the natural binding partner ligand in vivo.
  • ligand-binding molecule after cleavage has low binding activity to the ligand or has almost no binding activity to the ligand, thereby ensuring that the ligand-binding molecule is released after cleavage; It can be expected to prevent rebinding with another ligand molecule.
  • the biological activity of the suppressed ligand is restored after the ligand binding molecule is cleaved.
  • the binding of the cleaved ligand binding molecule to the ligand is attenuated, so that the ligand biological activity inhibiting function of the ligand binding molecule is also attenuated.
  • One skilled in the art can confirm the biological activity of the ligand by known methods, for example, by detecting the binding between the ligand and its binding partner.
  • the uncleaved ligand binding molecule has a longer half-life than the single domain antibody alone.
  • the blood half-life of a ligand-binding molecule is longer than the blood half-life of a single domain antibody alone include, but are not limited to, increasing the molecular weight of a ligand-binding molecule or binding of a single domain antibody to FcRn Or a single domain antibody and an albumin binding moiety, or a single domain antibody and a PEGylated moiety.
  • the half-life of a single-domain antibody alone and a ligand-binding molecule based on the blood half-life in humans.
  • a mouse eg, normal mouse, human antigen-expressing transgenic mouse, human FcRn-expressing transgenic mouse, etc.
  • monkey eg, cynomolgus monkey
  • the blood half-life in humans can be predicted based on the blood half-life in Japan.
  • the molecular weight of the ligand-binding molecule can be increased.
  • the ligand binding molecule has a molecular weight of 60 kDa or more. Molecules with a molecular weight of 60 kDa or more are usually less likely to cause clearance by the kidney and are more likely to have a longer blood half-life when present in the blood (J Biol Chem. 1988 Oct 15; 263 (29 ): 15064-70).
  • One embodiment in which the blood half-life of a ligand-binding molecule is longer than the blood half-life of a single domain antibody alone is to fuse the single domain antibody with a portion having FcRn binding properties.
  • the portion having FcRn binding usually has an FcRn binding region.
  • the FcRn binding region refers to a region having binding property to FcRn, and any structure can be used as long as it has binding property to FcRn.
  • the transport moiety containing the FcRn binding region can be reintroduced into the plasma after being taken up into the cell by the FcRn salvage pathway.
  • the FcRn binding region is preferably a region that directly binds to FcRn.
  • Preferred examples of the FcRn binding region include an antibody Fc region.
  • the FcRn binding region in the present invention can be indirectly bound to FcRn via albumin or IgG
  • the FcRn binding region in the present invention May be a region that binds to such a polypeptide capable of binding to FcRn.
  • the binding activity of the FcRn binding region in the present invention to FcRn, particularly human FcRn, can be measured by a method known to those skilled in the art as described in the section of the binding activity. Can be appropriately determined.
  • the binding activity to human FcRn is KD (Dissociationsconstant), apparent KD (Apparent dissociation constant), dissociation rate kd (Dissociation rate), or apparent kd (Apparent). dissociation: apparent dissociation rate).
  • KD Dissociationsconstant
  • apparent KD Apparent dissociation constant
  • dissociation rate kd Dissociation rate
  • apparent kd Apparent
  • dissociation rate apparent dissociation rate
  • the conditions for measuring the binding activity of the FcRn binding region to FcRn can be appropriately selected by those skilled in the art and are not particularly limited. For example, it can be measured under conditions of MES buffer and 37 ° C. as described in WO2009 / 125825.
  • the measurement of the binding activity of the FcRn binding region of the present invention to FcRn can be performed by a method known to those skilled in the art, and can be performed using, for example, Biacore (GE Healthcare).
  • the FcRn binding region and FcRn binding activity can be measured by using the FcRn binding region or the FcRn binding region containing the FcRn binding region or the FcRn immobilized chip as the analyte. It can be evaluated by flowing.
  • the binding affinity between the FcRn binding region and FcRn may be evaluated at any pH from pH 4.0 to pH 6.5.
  • a pH between pH 5.8 and pH 6.0 close to the pH in the early endosome in vivo, is used to determine the binding affinity between the FcRn binding region and human FcRn.
  • the binding affinity between the FcRn binding region and FcRn may be evaluated at an arbitrary temperature of 10 ° C. to 50 ° C.
  • a temperature between 15 ° C. and 40 ° C. is used to determine the binding affinity between the FcRn binding region and human FcRn. More preferably, from 20 ° C.
  • 35 ° C. such as any one of 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, and 35 ° C. Is also used to determine the binding affinity between the FcRn binding region and FcRn.
  • a temperature of 25 ° C. is a non-limiting example of an embodiment of the present invention.
  • FcRn binding region is not limited thereto, and examples thereof include an IgG antibody Fc region.
  • the type is not limited, and Fc regions such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 can be used.
  • a modified Fc region in which one or more amino acids are substituted can be used as long as it has FcRn binding properties.
  • At least one amino acid selected from No., 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 and 436 It is possible to use a modified Fc region containing an amino acid sequence substituted with the amino acid.
  • the blood half-life of the ligand-binding molecule is longer than the blood half-life of the single domain antibody alone, there is a method of fusing the single domain antibody with an albumin binding moiety. Since albumin does not undergo renal excretion and has FcRn binding properties, it has a long blood half-life of 17 to 19 days (J Clin Invest. 1953 Aug; 32 (8): 746-768.). Therefore, proteins bound to albumin become bulky and indirectly bind to FcRn, which has been reported to increase blood half-life (Antibodies 2015, 4 (3), 141-156).
  • the blood half-life of the ligand-binding molecule is longer than the blood half-life of the single domain antibody alone
  • there is a method of fusing the single domain antibody with a PEGylated moiety It is thought that the protein half-life is prolonged by making the protein bulky by PEGylating the protein and at the same time suppressing the degradation by the protease in the blood (J Pharm Sci. 2008 Oct; 97 (10) : 4167-83.).
  • the ligand binding molecule comprises an antibody Fc region.
  • the ligand binding molecule comprises a CH2 domain and a CH3 domain of a human IgG antibody.
  • the ligand binding molecule comprises a portion that extends from the human IgG1 antibody heavy chain Cys226 or from Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain.
  • lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) at the C-terminal of the Fc region may or may not be present.
  • Ligand As used herein, the term “ligand” is a molecule having biological activity. Biologically active molecules usually function by interacting with cell surface receptors and thereby biologically stimulating, inhibiting, or otherwise modulating, which normally carry the receptors It appears to be involved in intracellular signaling pathways.
  • a ligand includes a desired molecule that exhibits biological activity by interacting with a biomolecule.
  • a ligand means not only a molecule that interacts with a receptor, but also a molecule that exerts biological activity by interacting with the molecule.
  • a receptor that interacts with the molecule Binding fragments and the like are also included in the ligand.
  • a ligand including a ligand binding site of a protein known as a receptor or a site where the receptor interacts with other molecules is included in the ligand in the present invention.
  • soluble receptors, soluble fragments of receptors, extracellular domains of transmembrane receptors, polypeptides containing them, and the like are included in the ligand in the present invention.
  • the ligands of the present invention can typically exhibit desirable biological activity by binding to one or more binding partners.
  • the binding partner of the ligand can be an extracellular, intracellular, or transmembrane protein.
  • the binding partner of the ligand is an extracellular protein, such as a soluble receptor.
  • the ligand binding partner is a membrane-bound receptor.
  • the ligand of the present invention has 10 ⁇ M, 1 ⁇ M, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 pM, 400 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, It can specifically bind with a dissociation constant (KD) of 0.5 pM or 0.1 pM or less.
  • KD dissociation constant
  • molecules having biological activity include, but are not limited to, cytokines, chemokines, polypeptide hormones, growth factors, apoptosis inducers, PAMPs, DAMPs, nucleic acids, or fragments thereof.
  • interleukins, interferons, hematopoietic factors, TNF superfamily, chemokines, cell growth factors, TGF- ⁇ family, myokines, adipokines, or neurotrophic factors can be used as ligands.
  • the ligand is CXCL10, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN-g, MIG , I-TAC, RANTES, MIP-1a, MIP-1b, IL-1R1 (Interleukin-1 receptor, type I), IL-1R2 (Interleukin-1 receptor, type II), IL-1RAcP (Interleukin-1 receptor accessory) protein), or IL-1Ra (protein accession No. NP_776214, mRNA accession No. NM_173842.2) may be used.
  • Chemokines are a family of homogeneous serum proteins between 7-16 kDa and were originally characterized by their ability to induce leukocyte migration. Most chemokines have four distinct cysteines (Cys) and are classified into CXC, or alpha, CC or beta, C or gamma and CX3C or delta chemokine classes, depending on the motif represented by the first two cysteines Has been. Two disulfide bonds are formed between the first and third cysteines and between the second and fourth cysteines.
  • CXC or alpha subfamilies are classified into two groups: ELR-CXC chemokines and non-ELR-CXC chemokines by the presence of the ELR motif (Glu-Leu-Arg) preceding the first cysteine (eg, Clark-Lewis, supra, and Belperio et al., “CXC Chemokines in Angiogenesis,” J. Leukoc. Biol. 68: 1-8, 2000).
  • ELR-CXC chemokines eg, Clark-Lewis, supra, and Belperio et al., “CXC Chemokines in Angiogenesis,” J. Leukoc. Biol. 68: 1-8, 2000.
  • Interferon-inducible protein-10 (IP-10 or CXCL10) is induced by interferon- ⁇ and TNF- ⁇ and produced by keratinocytes, endothelial cells, fibroblasts and monocytes. IP-10 is thought to play a role in the recruitment of activated T cells to sites of tissue inflammation (Dufour, et al., “IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10) -deficient mice) reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking (IFN ⁇ -inducible protein-10 (IP-10: CXCL10) -deficient mice reveal the role of IP-10 in the generation and transport of effector T cells ), "J Immunol., 168: 3195-204, 2002).
  • IP-10 may have a role in hypersensitivity reactions. It may also play a role in the development of inflammatory demyelinating neuropathies (Kieseier, et al., "Chemokines and chemokine receptors in inflammatory demyelinating neuropathies: a central role for IP-10) Chemokines and chemokine receptors in neuropathy: the central role of IP-10), "Brain 125: 823-34, 2002).
  • IP-10 can be used for transplantation of stem cells following transplantation (Nagasawa, T., Int. J. Hematol. 72: 408-11, 2000), stem cell mobilization (Gazitt, Y., J. Hematother Stem Cell Res 10: 229-36, 2001; Hattori et al., Blood 97: 3354-59, 2001) and enhanced anti-tumor immunity (Nomura et al., Int. J. Cancer 91: 597-606, 2001; Mach and Dranoff, Curr. Opin. Immunol. 12: 571-75, 2000).
  • chemokines is discussed (Bruce, L.
  • CXCL10 biological activity can be measured by measuring cell migration activity of CXCL10, Reporter assay using CXCR3 stable expression cell line (see PLoS One. 2010 Sep 13; 5 (9): e12700.), GPCR signal Examples include PathHunter TM ⁇ -Arrestin recruitment assay using B-Arrestin recruitment induced in the early stage of transmission.
  • Interleukin 12 is a heterodimeric cytokine composed of 30 and 40 kD glycosylated polypeptide chains that are disulfide bonded. Cytokines are synthesized and secreted by antigen-presenting cells including dendritic cells, monocytes, macrophages, B cells, Langerhans cells and keratinocytes, and natural killer (NK) cells. IL-12 mediates various biological processes and is referred to as the NK cell stimulating factor (NKSF), T cell stimulating factor, cytotoxic T lymphocyte maturation factor and EBV-transformed B cell line factor. I came.
  • NKSF NK cell stimulating factor
  • T cell stimulating factor T cell stimulating factor
  • cytotoxic T lymphocyte maturation factor cytotoxic T lymphocyte maturation factor
  • EBV-transformed B cell line factor EBV-transformed B cell line factor
  • Interleukin 12 can bind to IL-12 receptors expressed on the cytoplasmic membrane of cells (eg, T cells, NK cells), thereby altering (eg, initiating, blocking) biological processes.
  • IL-12 binding to the IL-12 receptor stimulates proliferation of preactivated T cells and NK cells, and cytotoxic T cells (CTL), NK cells and LAK (lymphokine activation Killer) enhances cytolytic activity of cells, induces the production of ⁇ interferon (IFN ⁇ ) by T cells and NK cells, and of naive Th0 cells (Nive Th0 cell) to Th1 cells producing IFN ⁇ and IL-2 Induces differentiation.
  • CTL cytotoxic T cells
  • NK cells and LAK lymphokine activation Killer
  • IL-12 is absolutely necessary for generating cytolytic cells (eg NK, CTL) and setting cellular immune responses (eg Th1 cell mediated immune responses).
  • cytolytic cells eg NK, CTL
  • cellular immune responses eg Th1 cell mediated immune responses.
  • IL-12 is absolutely important in the generation and regulation of both prophylactic immunity (eg, eradication of infection) and pathological immune responses (eg, autoimmunity).
  • Methods for measuring IL-12 biological activity include measurement of cell proliferation activity of IL-12, STAT4 reporter assay, cell activation by IL-12 (cell surface marker expression, cytokine production, etc.), cell differentiation by IL-12 A method for measuring the promotion of
  • the protein Programmed Death 1 is an inhibitory member of the CD28 family receptor, and the CD28 family also includes CD28, CTLA-4, ICOS and BTLA.
  • PD-1 is expressed on activated B cells, T cells and bone marrow cells (Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82, Bennett et al. (2003) J Immunol 170: 711-8).
  • the first members of the family, CD28 and ICOS were discovered by functional effects on elevated T cell proliferation following addition of monoclonal antibodies (Hutloff et al. (1999) Nature 397: 263-266, Hansen et al. (1980) Immunogenics. 10: 247-260).
  • PD-1 was discovered by screening for differential expression in apoptotic cells (Ishida et al. (1992) EMBO J. 11: 3887-95).
  • Other members of the family, CTLA-4 and BTLA were discovered by screening for differential expression in cytotoxic T lymphocytes and TH1 cells, respectively.
  • CD28, ICOS and CTLA-4 all have unpaired cysteine residues, which allow homodimerization.
  • PD-1 is thought to exist as a monomer and does not have the unpaired cysteine characteristic of other CD28 family members.
  • the PD-1 gene is a gene encoding a 55 kDa type I transmembrane protein that is part of the Ig gene superfamily.
  • PD-1 contains a membrane proximal immune receptor tyrosine inhibition motif (ITIM) and a membrane tyrosine-based switch motif (ITSM).
  • ITIM membrane proximal immune receptor tyrosine inhibition motif
  • ITMS membrane tyrosine-based switch motif
  • PD-1 is structurally similar to CTLA-4 but lacks the MYPPPY motif (SEQ ID NO: 102) that is important for B7-1 and B7-2 binding.
  • Two ligands for PD-1, PD-L1 and PD-L2 have been identified and have been shown to negatively regulate T cell activation when bound to PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34, Latchman et al.
  • Both PD-L1 and PD-L2 are B7 homologs that bind to PD-1 but not to other CD28 family members.
  • PD-L1 a ligand of PD-1
  • the interaction of PD-1 and PD-L1 results in a decrease in tumor infiltrating lymphocytes, a decrease in T cell receptor-mediated proliferation, and immune evasion by cancerous cells (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81: 281-7, Blank et al.
  • PD-1 is an inhibitory member of the CD28 family that is expressed on activated B cells, T cells and bone marrow cells.
  • PD-1-deficient animals develop a variety of autoimmune phenotypes including autoimmune cardiomyopathy and lupus-like syndrome with arthritis and nephritis (Nishimura et al. (1999) Immunity 11: 141-51, Nishimura et al. (2001). ) Science 291: 319-22).
  • PD-1 has been found to play an important role in autoimmune encephalomyelitis, systemic lupus lupus erythematosus, graft-versus-host disease (GVHD), type I diabetes and rheumatoid arthritis (Salama et al. (2003). ) J Exp Med 198: 71-78, Prokunia and Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13: R143, Nielsen et al. (2004) Lupus 13: 510).
  • GVHD graft-versus-host disease
  • PD-1 ITSM was found to be essential in inhibiting BCR-mediated Ca 2+ flux and tyrosine phosphorylation of downstream effector molecules (Okazaki et al. (2001) PNAS 98 : 13866-71).
  • the ligand is a cytokine.
  • Cytokines are a family of secretory cell signaling proteins involved in immunoregulatory and inflammatory processes, which are secreted by glial cells of the nervous system and by many cells of the immune system. Cytokines can be classified as proteins, peptides or glycoproteins and encompass a large and diverse family of regulators. Cytokines bind to cell surface receptors and induce intracellular signal transduction, which can lead to enzyme activity regulation, up- or down-regulation of several genes and their transcription factors, or feedback inhibition.
  • the cytokines of the invention include immunomodulators such as interleukin (IL) and interferon (IFN).
  • IL interleukin
  • IFN interferon
  • Suitable cytokines can include proteins from one or more of the following types: four ⁇ -helix bundle families (including the IL-2 subfamily, the IFN subfamily, and the IL-10 subfamily); IL-1 family (which includes IL-1 and IL-8), and IL-17 family. Cytokines are type 1 cytokines that enhance cellular immune responses (e.g., IFN- ⁇ , TGF- ⁇ , etc.), or type 2 cytokines that favor antibody responses (e.g., IL-4, IL-10, IL-13, etc.) ) Can also be included.
  • the ligand is a chemokine.
  • Chemokines generally act as chemoattractants that recruit immune effector cells to chemokine expression sites. This is considered beneficial for the expression of specific chemokine genes, for example, with cytokine genes, for the purpose of mobilizing other immune system components to the treatment site.
  • chemokines include CXCL10, RANTES, MCAF, MIP1- ⁇ , MIP1- ⁇ .
  • cytokines are also known to have chemoattractant effects and can be classified by the term chemokine.
  • a variant such as cytokine, chemokine (eg, AnnuAnRev Immunol. 2015; 33: 139-67.) Or a fusion protein (eg, Stem Cells Transl Med) as a ligand in some embodiments of the present invention. . 2015 Jan; 4 (1): 66-73.) Can be used.
  • cytokine eg, AnnuAnRev Immunol. 2015; 33: 139-67.
  • a fusion protein eg, Stem Cells Transl Med
  • the ligand is selected from CXCL10, PD-1, IL-12, IL-6R, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, IL-1Ra.
  • the CXCL10, PD-1, IL-12, IL-6R, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, IL-1Ra are naturally occurring CXCL10, PD-1, IL-12, IL-6R, It may have the same sequence as IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAcP, IL-1Ra, and naturally occurring CXCL10, PD-1, IL-12, IL-6R, IL-1R1, IL- It may be a variant having a physiological activity having a natural ligand corresponding to 1R2, IL-1RAcP, or IL-1Ra but having a corresponding natural ligand.
  • the ligand sequence may be artificially modified for various purposes.
  • a modified version of the ligand is obtained by applying a modification that does not undergo protease cleavage (protease resistance). get.
  • the ligand binding molecule comprises only a single domain antibody into which a protease cleavage sequence has been introduced.
  • the ligand binding molecule comprises an Fc region.
  • the type is not limited, and Fc regions such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 can be used.
  • Fc region containing one sequence selected from the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 103, 104, 105, and 106, or an Fc region variant obtained by modifying these Fc regions.
  • the ligand binding molecule comprises an antibody constant region.
  • a single domain antibody and Fc region fusion protein into which a ligand binding molecule protease cleavage sequence has been introduced.
  • the ligand binding molecule comprises a series of peptide chains consisting of a single domain antibody-antibody Fc region with a protease cleavage sequence introduced from the N-terminus to the C-terminus.
  • the ligand binding molecule is a dimeric protein comprising two series of peptide chains consisting of a single domain antibody-antibody hinge region-antibody Fc region into which a protease cleavage sequence has been introduced.
  • the ligand binding molecule is a dimeric protein comprising two series of peptide chains consisting of a single domain antibody-antibody hinge region-antibody CH2-antibody CH3 into which a protease cleavage sequence has been introduced.
  • the uncleaved ligand binding molecule forms a complex with the ligand by antigen-antibody binding.
  • the complex of ligand binding molecule and ligand is formed by non-covalent binding, eg, antigen-antibody binding, between the ligand binding molecule and the ligand. Therefore, the present invention also provides a method for producing a complex, comprising the steps of bringing a ligand-binding molecule into contact with the ligand and recovering a complex in which the ligand is bound to the ligand-binding molecule.
  • the ligand-binding molecule and the ligand can be brought into contact under conditions that allow both to bind.
  • the obtained complex can be made into a pharmaceutical composition, for example, by blending with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the uncleaved ligand-binding molecule is fused with a ligand to form a fusion protein and then a ligand-binding molecule portion in the fusion protein. And the ligand part further interact by antigen-antibody binding.
  • the ligand binding molecule and the ligand can be fused via a linker or not. Even when the ligand binding molecule and the ligand in the fusion protein are fused through or without a linker, there is still a non-covalent bond between the ligand binding molecule portion and the ligand portion.
  • the non-covalent bond between the ligand binding molecule portion and the ligand portion is similar to embodiments where the ligand binding molecule and ligand are not fused. Cleavage of the ligand-binding molecule reduces its non-covalent bond. That is, the binding between the ligand binding molecule and the ligand is attenuated.
  • the ligand binding molecule and the ligand are fused via a linker.
  • the linker used when fusing a ligand-binding molecule and a ligand is disclosed in any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker (see, for example, Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996). However, in this embodiment, a peptide linker is preferable.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • Synthetic compound linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol Bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo-EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (sulfo-DST), bis [2- (succinimideoxycarbonyloxy) Ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (sulfosuccinimidooxycarbonyloxy)
  • the ligand-binding molecule-ligand fusion protein is a fusion protein in which the N-terminus of the ligand-binding molecule and the C-terminus of the ligand are fused with or without a linker.
  • Several embodiments of the structure of the ligand-binding molecule-ligand fusion protein of the present invention are listed below. The following aspects are described in order from the N-terminal to the C-terminal.
  • Ligand-single domain antibody Ligand-linker-single domain antibody
  • Ligand-single domain antibody-antibody constant region or fragment thereof
  • Ligand-Linker-Single domain antibody-Antibody hinge region-Antibody CH2-Antibody CH3
  • treatment is clinical that is intended to alter the natural course of the individual being treated.
  • Desirable effects of treatment include but are not limited to prevention of disease occurrence or recurrence, reduction of symptoms, attenuation of any direct or indirect pathological effects of disease, prevention of metastasis, progression of disease Includes reduced speed, recovery or alleviation of disease state, and remission or improved prognosis.
  • single domain antibody-containing ligand binding molecules of the invention can control the biological activity of the ligand and are used to delay disease onset or slow disease progression.
  • composition or the present invention also comprises a pharmaceutical composition (drug) comprising a single domain antibody-containing ligand binding molecule and a pharmaceutically acceptable carrier, a single domain antibody-containing ligand binding molecule and a ligand, and a pharmaceutically acceptable carrier. It also relates to a pharmaceutical composition (drug) comprising a single domain antibody-containing ligand binding molecule and a fusion protein in which the ligand is fused and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition usually refers to a drug for treatment or prevention of a disease, or examination / diagnosis.
  • the term “pharmaceutical composition containing a ligand-binding molecule” can be rephrased as “a method for treating a disease comprising administering a ligand-binding molecule to a treatment subject”. In other words, the use of a ligand binding molecule in the manufacture of a medicament for the treatment of ".
  • pharmaceutical composition comprising a ligand binding molecule can also be restated as “use of a ligand binding molecule to treat a disease”.
  • composition comprising a ligand-binding molecule and a ligand
  • a method for treating a disease comprising administering a ligand-binding molecule and a ligand to a subject to be treated” or “treating a disease”
  • pharmaceutical composition comprising a ligand binding molecule and a ligand can also be restated as “use of a ligand binding molecule and a ligand to treat a disease”.
  • composition comprising a fusion protein can be rephrased as “a method of treating a disease comprising administering a fusion protein to a subject to be treated”, or “manufacturing a medicament for treating a disease” In other words, “use of fusion protein in”.
  • pharmaceutical composition comprising a fusion protein can also be rephrased as “use of a fusion protein to treat a disease”.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated using methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of sterile solutions with water or other pharmaceutically acceptable liquids, or in the form of suspension injections.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative Or in combination with binders and the like as appropriate, and can be formulated by mixing in unit dosage forms generally required for accepted pharmaceutical practice.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is set so as to obtain an appropriate volume within the indicated range.
  • a sterile composition for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • a vehicle such as distilled water for injection.
  • the aqueous solution for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • Appropriate solubilizers such as alcohol (ethanol, etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (polysorbate 80 (TM), HCO-50, etc.) can be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and / or benzyl alcohol can be used in combination as a solubilizing agent. It can also be formulated with buffers (eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer), soothing agents (eg, procaine hydrochloride), stabilizers (eg, benzyl alcohol and phenol), and antioxidants.
  • buffers eg, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, procaine hydrochloride
  • stabilizers eg, benzyl alcohol and phenol
  • antioxidants antioxidants.
  • the prepared injection solution is usually filled into an appropriate ampoule.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered by parenteral administration.
  • parenteral administration for example, an injection, nasal administration, pulmonary administration, or transdermal administration composition is administered.
  • it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing the ligand binding molecule can be set, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg of body weight per time. Alternatively, for example, a dose of 0.001 to 100000 mg per patient can be set, but the present invention is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., but those skilled in the art can set an appropriate dose and administration method in consideration of these conditions.
  • a composition comprising a ligand binding molecule can be administered to an individual.
  • the ligand-binding molecule administered to an individual binds to the ligand originally present in the individual in the individual, for example, in blood or tissue, and is further transported in vivo while being bound to the ligand.
  • the ligand-binding molecule delivered to the target tissue is cleaved by the target tissue, the binding to the ligand is attenuated, and the ligand bound in the target tissue can be released.
  • the released ligand exerts biological activity in the target tissue and can treat a disease caused by the target tissue.
  • the ligand binding molecule suppresses the biological activity of the ligand when bound to the ligand and the ligand binding molecule is cleaved specifically in the target tissue, without exerting the biological activity of the ligand during transport, Only after being cleaved at the target tissue, the biological activity of the ligand can be exerted to treat the disease, and systemic side effects can be suppressed.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for suppressing or inhibiting the systemic action of an endogenous ligand comprising a ligand-binding molecule as an active ingredient.
  • the present invention relates to the use of a ligand binding molecule in suppressing or inhibiting the systemic action of an endogenous ligand.
  • the present invention further relates to the use of a ligand binding molecule in the manufacture of a pharmaceutical composition for suppressing or inhibiting the systemic action of an endogenous ligand.
  • the systemic action of the endogenous ligand is once suppressed or inhibited by the ligand binding molecule of the present invention and then expressed as a tissue-specific action in the target tissue.
  • a composition comprising a ligand binding molecule and a composition comprising a ligand can be administered to an individual separately or simultaneously.
  • a composition comprising both a ligand binding molecule and a ligand can also be administered to an individual.
  • the ligand binding molecule and the ligand in the composition may form a complex.
  • the ligand binding molecule binds to the ligand administered to the individual and is transported in vivo with the ligand bound.
  • the ligand-binding molecule delivered to the target tissue is cleaved by the target tissue, the binding to the ligand is attenuated, and the ligand bound in the target tissue can be released.
  • the released ligand exerts biological activity in the target tissue and can treat a disease caused by the target tissue.
  • the ligand binding molecule suppresses the biological activity of the ligand when bound to the ligand and the ligand binding molecule is cleaved specifically in the target tissue, without exerting the biological activity of the ligand during transport, Only after being cleaved at the target tissue, the biological activity of the ligand can be exerted to treat the disease, and systemic side effects can be suppressed.
  • a ligand-binding molecule administered to an individual can also bind to a ligand that is originally present in the individual in addition to the ligand that is administered to the individual. It can be transported in vivo while bound. That is, the present invention provides a ligand-ligand binding molecule complex comprising the steps of contacting a ligand-binding single-domain antibody-containing molecule with a ligand and recovering a complex comprising the single-domain antibody-containing molecule and the ligand.
  • a method is also provided.
  • the complex of the present invention can be made into a pharmaceutical composition, for example, by blending with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a fusion protein in which a ligand binding molecule and a ligand are fused can be administered to an individual.
  • the ligand binding molecule and the ligand in the fusion protein form a fusion protein with or without a linker, but the non-covalent bond between the ligand binding molecule portion and the ligand portion is still Exists.
  • Non-covalent binding to is attenuated and the ligand and a portion of the ligand binding molecule are released from the fusion protein.
  • Some of the released ligands and ligand-binding molecules exert the biological activity of the ligand in the target tissue and can treat diseases caused by the target tissue.
  • the ligand binding molecule suppresses the biological activity of the ligand when bound to the ligand and the ligand binding molecule is cleaved specifically to the target tissue, the biological activity of the ligand in the fusion protein during delivery is exerted. Without the treatment, the biological activity of the ligand can be exhibited only after being cleaved by the target tissue, the disease can be treated, and systemic side effects can be suppressed.
  • a method for delivery of a ligand provides the delivery method (delivery method) of a ligand including the process of administering the ligand which bound the ligand conjugate
  • the present invention provides a composition for delivery of a ligand to a target tissue comprising a ligand bound to a ligand conjugate.
  • the present invention further relates to the use of a ligand conjugated with a ligand conjugate in the delivery of a ligand to a target tissue.
  • the invention also relates to the use of a ligand conjugated with a ligand conjugate in the manufacture of a composition for delivery of the ligand to a target tissue.
  • Ligand binding molecule and a method for manufacturing the present invention of the fusion protein to produce a single domain antibody-containing ligand binding molecule or a fusion protein fused to the ligand binding molecule and ligand binding to the ligand is attenuated in disconnected state Also related to the method.
  • a method for producing a ligand binding molecule or a fusion protein comprising introducing a protease cleavage sequence into a single domain antibody contained in a ligand binding molecule.
  • Examples of methods for introducing a protease cleavage sequence into a single domain antibody contained in a ligand binding molecule include insertion of a protease cleavage sequence into the amino acid sequence of a single domain antibody contained in a ligand binding molecule, and inclusion in a ligand binding molecule And a method in which a part of the amino acid sequence of a single domain antibody is replaced with a protease cleavage sequence.
  • “Inserting” the amino acid sequence A into the amino acid sequence B means that the amino acid sequence B is divided into two parts without loss, and the two parts are connected by the amino acid sequence A (ie, “the first half of the amino acid sequence B— A new amino acid sequence such as “Amino acid sequence A-Amino acid sequence B second half” is created. “Introducing” amino acid sequence A into amino acid sequence B refers to dividing amino acid sequence B into two parts and connecting the two parts with amino acid sequence A.
  • one or more amino acid residues including the amino acid residue of the amino acid sequence B adjacent to the amino acid sequence A are deleted, and then the two parts are joined with the amino acid sequence A ( That is, a part of the amino acid sequence B can be replaced with the amino acid sequence A).
  • An example of a method for obtaining a single domain antibody-containing ligand binding molecule is a method for obtaining a single domain antibody having the ability to bind to a ligand.
  • the single domain antibody can be obtained, for example, by a method using a known method for producing a single domain antibody antibody.
  • the single domain antibody obtained by the production method may be used as a ligand-binding molecule as it is, or may be obtained by linking the obtained single domain antibody with another amino acid sequence.
  • a method for producing a single domain antibody is similar to a method for producing an ordinary antibody and is well known to those skilled in the art.
  • the hybridoma method Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)
  • Recombinant methods US Pat. No. 4,816,567
  • It may also be isolated from a phage antibody library (Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)).
  • it may be isolated from a single B cell clone (N. Biotechnol. 28 (5): 253-457 (2011)).
  • the ligand-binding molecule of the present invention can be produced by introducing a protease cleavage sequence into the ligand-binding molecule. More specifically, the ligand binding molecule of the present invention can be produced by introducing a protease cleavage sequence into a single domain antibody in the ligand binding molecule. For ligand binding molecules, it can optionally be confirmed whether the ligand binding molecules are cleaved by treatment with the protease corresponding to the protease cleavage sequence.
  • protease cleavage sequence is cleaved by contacting a molecule with a protease cleavage sequence introduced into a ligand-binding molecule with protease and confirming the molecular weight of the product after protease treatment by electrophoresis such as SDS-PAGE. Can be confirmed.
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding a single domain antibody-containing ligand binding molecule in which binding to a ligand is attenuated in a cleaved state, or a polynucleotide encoding a fusion protein in which the ligand binding molecule and a ligand are fused Also related.
  • the polynucleotide in the present invention is usually carried (inserted) in an appropriate vector and introduced into a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it stably holds the inserted nucleic acid.
  • the cloning vector is preferably a pBluescript vector (Stratagene), but is commercially available.
  • Various vectors can be used.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the ligand-binding molecule or fusion protein of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a ligand-binding molecule in a test tube, E. coli, cultured cells, or an individual organism.
  • a pBEST vector (manufactured by Promega Corp.) For Escherichia coli, pET vector (manufactured by Invitrogen), for cultured cells, pME18S-FL3 vector (GenBank Accession No. AB009864), for organisms, pME18S vector (Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)) Etc. are preferable.
  • the DNA of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current ⁇ ⁇ ⁇ protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, Section IV 11.4-11.11.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing a ligand-binding molecule or fusion protein include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells ( Examples: Drosophila S2, Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) and plant cells can be exemplified.
  • bacterial cells eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus
  • insect cells Examples: Drosophila S2, Spodoptera SF9
  • animal cells eg, CHO, COS, He
  • Vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons.Section 9.1-9.9), lipofectamine method (GIBCO -BRL) and a known method such as a microinjection method.
  • an appropriate secretion signal is incorporated into the ligand binding molecule or fusion protein of interest. be able to. These signals may be endogenous to the ligand binding molecule or fusion protein of interest or may be heterologous signals.
  • the method for producing a ligand-binding molecule or a fusion protein can usually include a step of recovering the ligand-binding molecule or the fusion protein.
  • the medium is recovered in the production method.
  • the ligand-binding molecule or fusion protein of the present invention is produced in a cell, the cell is first lysed, and then the ligand-binding molecule or fusion protein is recovered.
  • ammonium sulfate or ethanol precipitation acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, Known methods including affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography, and lectin chromatography can be used.
  • Example 1 Issues of previously reported immunocytokines and protease-activated cytokines Immunocytokines targeting antigens expressed in cancer tissues have generally been prepared by fusing target cytokines to the ends of IgG or scFv to be targeted (Expert Opin Investig Drugs. 2009 Jul; 18 (7): 991-1000., Curr Opin Immunol. 2016 Jun; 40: 96-102.). Since cytokines such as IL-2, IL-12, and TNF are highly toxic, it is possible to increase the effect while reducing these side effects by delivering these cytokines locally to the cancer in order to make these cytokines work locally.
  • Non-patent Documents 4, 5, and 6 Although it is expected (Non-patent Documents 4, 5, and 6), all of these have problems in that they are not effective clinically by systemic administration, the therapeutic window is narrow, toxicity is high, and systemic administration is not possible. . As a major cause of this, even if it is an immunocytokine, the systemically administered cytokine is exposed to the whole body, so it can act systemically and exert toxicity, or it can only be administered at a very low dose to avoid toxicity, Can be mentioned. In addition, since the immunocytokine that binds to the cancer antigen is internalized by the cancer cells in the tumor and disappears, it may be difficult to expose the cytokine locally to the tumor in some cases.
  • Non-patent Document 7 There is also a report that the anti-tumor effect did not change between an immunocytokine fused with IL-2 to an antibody that binds to a cancer antigen and an immunocytokine fused with IL-2 to an antibody that does not bind to a cancer antigen.
  • a molecule in which a cytokine and a cytokine receptor are bound by a linker cleaved by a protease highly expressed in cancer has been reported. Cytokines are inhibited by a cytokine receptor bound by a linker, but when the linker is cleaved by a protease, the cytokine receptor is released and the cytokine becomes an active substance.
  • a molecule in which TNFalpha and TNFR are joined by a linker that can be cleaved by uPA Cancer Immunol Immunother.
  • IL-2 and IL-2R are cleaved by MMP-2 Molecules linked by linkers (Immunology. 2011 Jun; 133 (2): 206-20) have been reported.
  • cytokines have biological activity even before the cleavage of the linker, and the activity is improved only about 10 times by the cleavage of the linker. This is because the affinity between the cytokine and the cytokine receptor is not strong, so that the cytokine has a certain activity even before the protease is cleaved, or the cytokine receptor binds to the cytokine even after the linker is cleaved by the protease. Therefore, there are two points of inhibiting the biological activity of cytokines.
  • Chemokine (Nature Immunology 9, 949-952 (2008)) is a basic protein that expresses its action via a G protein-coupled receptor, and is a group of cytokines. It is. Acts on specific leukocytes expressing the receptor and has the activity (chemotaxis) to migrate leukocytes in the direction of the concentration gradient of the substance (Nat Cell Biol. 2016 Jan; 18 (1): 43-53.) . Chemokines are known to be produced in large quantities in the inflamed area and cause leukocyte migration from inside the blood vessels into the inflamed tissues. By controlling chemokines, leukocyte migration can be controlled, and it can be used for cancer immunotherapy.
  • T cells, antigen-presenting cells, M1 macrophages, and the like can migrate to the local area of the solid cancer, it is considered possible to cause an antitumor effect.
  • Cytokines can exert their effects even when administered systemically, but chemokines cause cells to migrate to tissues with a high concentration due to a concentration gradient, so that even if chemokines are administered systemically, the expected effects cannot be obtained. Therefore, it is considered that cancer immunotherapy (chemokine therapy) by systemic administration of chemokine is not realistic.
  • Example 3 Concept of a ligand-binding molecule capable of releasing a target tissue-specific ligand into which a protease cleavage sequence has been introduced
  • the previously reported cytokine / chemokine therapy has the following problems. 1. In immunocytokines, even if cytokines are targeted to solid tumors with antibodies, cytokines act systemically, resulting in side effects, or because they can only be administered at low doses to avoid side effects, they are exposed to high levels in tumors. I can't. 2.
  • cytokine activity is insufficiently neutralized, and cytokines have some activity even before protease cleavage . 3.
  • the cytokine receptor or antibody
  • the cytokine receptor can bind to the cytokine even after the linker is cleaved by the protease, thereby inhibiting the biological activity of the cytokine.
  • ligands such as cytokines or chemokines are sufficiently inhibited by ligand binding molecules (biological activity is minimized).
  • Cleavage with a protease restores the biological activity of the ligand (becomes an active ligand).
  • Cleavage with a protease causes the ligand binding molecule to lose ligand binding activity.
  • a molecule whose binding to the ligand is attenuated by cleaving the cleavage site was devised as a pharmaceutical composition satisfying the above conditions. First, a single domain antibody against a ligand is obtained, then a cleavage site is introduced into the single domain antibody, and a ligand-binding molecule containing a single domain antibody containing the cleavage site can be prepared.
  • FIGS. 1-4 show examples of ligand binding molecules containing single domain antibodies introduced with cleavage sites. Shown in FIG. 1 is an example of a ligand binding molecule that contains only a single domain antibody into which a cleavage site has been introduced. When the cleavage site is not cleaved, the single domain antibody can bind to the ligand. If the affinity of the single domain antibody for the ligand is sufficiently strong, the biological activity of the ligand is sufficiently inhibited.
  • the ligand in the ligand-binding molecule-ligand complex is neutralized and thus does not exert its biological activity, and the ligand-ligand binding molecule complex Has a longer half-life than the ligand alone.
  • the cleavage site is a protease cleavage sequence that is cleaved by a tumor tissue-specific protease
  • a complex formed with a ligand binding molecule and a ligand that is administered systemically is cleaved by a protease that is highly expressed in tumor tissue.
  • the single domain antibody can no longer bind to the ligand, neutralizing the ligand is released and can exert a biological effect in the tumor tissue.
  • FIG. 2 shows an example of a fusion polypeptide in which a ligand is fused with a ligand-binding molecule containing only a single domain antibody into which a cleavage site has been introduced.
  • the single domain antibody in the fusion polypeptide can bind to the ligand, and if the affinity of the single domain antibody for the ligand is sufficiently strong, the biological activity of the ligand is sufficiently inhibited. ing. Even when this fusion polypeptide is administered systemically, the ligand in the fusion polypeptide is neutralized and therefore does not exert its biological activity, and the fusion polypeptide has a longer half-life than the ligand alone.
  • the fusion polypeptide administered systemically is fused when the protease cleavage sequence in the single domain antibody is cleaved by a protease that is highly expressed in the tumor tissue.
  • a single domain antibody in a polypeptide can no longer bind to the ligand, neutralizing the ligand, releasing a portion of the fusion polypeptide containing the ligand and allowing it to exert biological effects in tumor tissue .
  • FIGS. 3 and 4 show examples of a ligand-binding molecule containing a single-domain antibody, an antibody hinge region and an antibody Fc region into which a cleavage site has been introduced, and a fusion polypeptide of the ligand-binding molecule and the ligand.
  • the ligand can be neutralized by a single domain antibody in an uncut state, and the ligand can be released in a cleaved state to exert a biological effect. is there.
  • the half-life in the uncut state is longer than in the examples in FIGS. Is expected.
  • Example 5 Anti-human IL-6R single domain antibody-containing ligand-binding molecule introduced with a protease cleavage sequence 5-1 Preparation of Ligand Binding Molecules by Introducing Protease Cleavage Sequence into Polypeptide Containing Anti-human IL-6R Single Domain Antibody At the C-terminus of single domain antibody against human IL-6R (SEQ ID NO: 120), SEQ ID NO: A protease cleavage sequence was inserted into the single domain antibody in the polypeptide IL6R90-G1T3dCHdC (SEQ ID NO: 122) in which the antibody hinge region shown in 121 and the N-terminus of the antibody Fc region sequence were fused, and the protease cleavage sequence was introduced.
  • IL6R90-G1T3dCHdC a sequence containing a peptide sequence (LSGRSDNH, SEQ ID NO: 3) that has been reported to be cleaved by matriptase (MT-SP1) expressed specifically in cancer is inserted into the polypeptide IL6R90-G1T3dCHdC.
  • Ligand binding molecules shown in Table 2 were prepared, expressed by transient expression using Expi293 (Life Technologies), and purified by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • IL6R90-G1T3dCHdC was expressed and purified as a control molecule not containing a protease cleavage sequence.
  • the prepared ligand-binding molecule and control molecule are dimeric proteins as shown in FIG.
  • the molecule had a new band that occurred only after protease treatment, that is, the single domain antibody-containing ligand binding molecule into which each protease cleavage sequence was introduced was cleaved by protease treatment.
  • FIG. 6 shows a real-time connection graph showing the state of the connection. As shown in FIG. 6, when using each ligand-binding molecule into which a protease cleavage sequence was introduced, the amount of human IL-6R binding decreased compared to when using a protease-untreated ligand-binding molecule.
  • Example 6 Preparation and evaluation of a fusion protein (ligand binding molecule-IL-6R fusion protein) of a ligand binding molecule containing an anti-human IL-6R single domain antibody introduced with a protease cleavage sequence and human IL-6R 6-1
  • a fusion protein ligand binding molecule-IL-6R fusion protein
  • the ligand-binding molecule-IL-6R fusion protein was prepared by fusing with the C-terminus of human IL-6R (SEQ ID NO: 128) via various linkers consisting of lysine and serine (Table 3).
  • fusion proteins were expressed by transient expression using Expi293 (Life Technologies) by a method known to those skilled in the art, and purified by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • Expi293 Life Technologies
  • Each of the prepared fusion proteins is a dimeric protein having two peptide chains having the sequences shown in Table 3.
  • a molecule (Table 4) was prepared by fusing the N-terminus of IL6R90-G1T3dCHdC (SEQ ID NO: 122) with the C-terminus of IL-6R via a linker. Went.
  • Each of the prepared control molecules is a dimeric protein having two peptide chains having the sequences shown in Table 4.
  • a control molecule that does not contain a protease cleavage sequence contains a single-domain antibody-containing ligand-binding molecule into which the protease cleavage sequence is introduced, while the band is in the same position regardless of whether or not the protease is treated.
  • Each fusion protein had a new band that occurred only after protease treatment, ie, each fusion protein containing a single domain antibody-containing ligand binding molecule into which each protease cleavage sequence was introduced was shown to be cleaved by protease treatment.
  • biotinylated anti-IL-6R single domain antibody-containing molecule As a method for detecting the release of IL-6R fused to a ligand-binding molecule, biotin was added to a single domain antibody-containing molecule that recognizes IL-6R. A method of detecting binding of free IL-6R to a biotinylated anti-IL-6R single domain antibody-containing molecule was used. A biotinylated anti-IL-6R single domain antibody-containing molecule was prepared as follows.
  • An anti-IL-6R single domain antibody-containing molecule having the same single domain antibody partial sequence as IL6R90-G1T3dCH1dC (SEQ ID NO: 122) was prepared, and a biotin addition sequence (AviTag sequence, SEQ ID NO: 159) at its C-terminus IL6R90-FcBAPdC (SEQ ID NO: 160) to which was added was prepared.
  • a gene fragment encoding IL6R90-FcBAPdC was prepared and introduced into an animal cell expression vector by a method known to those skilled in the art. At this time, a gene expressing EBNA1 and a gene expressing biotin ligase were simultaneously introduced, and biotin was added for the purpose of biotin labeling.
  • IL6R90-bio target biotinylated anti-IL-6R single domain antibody-containing molecule
  • protease-treated fusion protein, protease-untreated fusion protein, and IL6R90-bio prepared in Example 6-2-1 were each dispensed into different wells of Tilted bottom (TW384) Micro plates (ForteBio, 18-5076).
  • a Streptavidin biosensor (ForteBio, 18-5021) was hydrated with PBS and measured on an Octet RED 384 at a setting of 27 ° C. Baseline measurements were performed in wells containing PBS for 30 seconds, after which IL6R90-bio was bound to the Streptavidin sensor for 200 seconds.
  • FIG. 8 shows a real-time connection graph showing the state of the connection.
  • the human that binds to IL6R90-bio in the case of protease treatment compared to the case where the protease was not treated.
  • the amount of IL-6R increased. That is, the protease treatment attenuated the binding activity of the single domain antibody in the fusion protein to IL-6R, and IL-6R was released from the fusion protein.
  • Example 7 Evaluation of introduction of various protease cleavage sequences 7-1
  • MRA heavy chain: MRAH-G1T4 (SEQ ID NO: 119)
  • MRAL-k0 which is a neutralizing antibody (IgG antibody) against human IL-6R (SEQ ID NO: 118)
  • Table 5 shows peptide sequences that are known to be cleaved by MMP-2, MMP-7, and MMP-9, and peptide sequences that include a movable linker composed of a glycine-serine polymer in the vicinity of these sequences.
  • the MRA variants shown in Table 6 are expressed by transient expression using FreeStyle293 cells (Invitrogen) or Expi293 cells (Life technologies) by methods known to those skilled in the art. Purification was performed by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • MMP-2 For MMP-2, MEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4 / MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1T4 / MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4MP1MEHMP4MEHMP4 3-MEIVHMP2.3G1T4 / MRAL-k0 disconnection, MMP-7 with MEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4 / MRAL-k0 disconnection, MMP-9 with MEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4 / MRAL-k0, MEIVHG4MEMP4SG1S4 A k0 cleavage was observed.
  • Example 8 Production and evaluation of a fusion protein (ligand binding molecule-PD-1 fusion protein) of an anti-human PD-1 single domain antibody-containing ligand binding molecule into which a protease cleavage sequence has been introduced and human PD-1 8-1.
  • each of the N-terminal of the extracellular domain of human PD-1 (SEQ ID NO: 163) via various linkers consisting of glycine and serine Fusion with the C-terminus produced a ligand binding molecule-PD-1 fusion protein (Table 7).
  • These fusion proteins were expressed by transient expression using Expi293 (Life Technologies) by a method known to those skilled in the art, and purified by a method known to those skilled in the art using protein A.
  • Each of the prepared fusion proteins is a dimeric protein having two peptide chains having the sequences shown in Table 7.
  • Example 8-2-2 Confirmation of protease cleavage of anti-PD-1 single domain antibody-PD-1 fusion protein (SDS-PAGE) Whether the ligand-binding molecule-PD-1 fusion protein was cleaved by the protease treatment performed in Example 8-2-1 was confirmed by SDS-PAGE.
  • 9 ⁇ L of the solution containing the protease-treated fusion protein / protease-untreated fusion protein prepared in Example 8-2-1 was mixed with 3 ⁇ L of sample buffer and incubated at 95 ° C. for 1 minute.
  • each fusion protein containing a single-domain antibody-containing ligand-binding molecule into which each protease cleavage sequence has been introduced has a new band that occurs only after protease treatment, that is, a single domain into which each protease cleavage sequence has been introduced.
  • Each fusion protein body containing a domain antibody-containing ligand binding molecule was shown to be cleaved by protease treatment.
  • biotinylated anti-PD-1 single domain antibody-containing molecule As a method for detecting the release of PD-1 fused to a ligand-binding molecule, biotinylated anti-PD-1 single domain antibody -containing molecule is biotinylated on a single domain antibody-containing molecule that recognizes PD-1. And a method for detecting binding of free PD-1 to a biotinylated molecule containing an anti-PD-1 single domain antibody was used.
  • a biotinylated anti-PD-1 single domain antibody-containing molecule was prepared as follows.
  • a single-domain antibody-containing molecule having the same single-domain antibody partial sequence as PD102C3-G1T3noCyshinge is prepared, a biotin addition sequence (AviTag sequence, SEQ ID NO: 159) is added to the C-terminus, and PD102C3-FcBAPdC (SEQ ID NO: 168).
  • an anti-PD-1 single domain antibody-containing molecule having the same single domain antibody partial sequence as PD102C12-G1T3noCyshinge is prepared, and a biotin addition sequence (AviTag sequence, SEQ ID NO: 159) is added to the C-terminus thereof, PD102C12-FcBAPdC (SEQ ID NO: 169) was produced.
  • Gene fragments encoding PD102C3-FcBAPdC and PD102C12-FcBAPdC were prepared and introduced into animal cell expression vectors by methods known to those skilled in the art. At this time, a gene expressing EBNA1 and a gene expressing biotin ligase were simultaneously introduced, and biotin was added for the purpose of biotin labeling. Cells into which the gene had been introduced were cultured at 37 ° C. and 8% CO2, and the target biotinylated anti-PD-1 single domain antibody-containing molecule (PD1-bio) was secreted into the culture supernatant. PD1-bio was purified from the culture supernatant by a method known to those skilled in the art.
  • protease-treated fusion protein, protease-untreated fusion protein, and PD1-bio prepared in Example 8-2-1 were each dispensed into different wells of Tilted bottom (TW384) Micro plates (ForteBio, 18-5076).
  • PD102C3-FcBAPdC or PD102C12-FcBAPdC is appropriately selected so that PD1-Bio binds to the same epitope as the single domain antibody in the measurement sample.
  • a Streptavidin biosensor (ForteBio, 18-5021) was hydrated with PBS and measured on an Octet RED 384 at a setting of 27 ° C.
  • FIG. 10 shows a real-time connection graph showing the state of the connection. As shown in FIG.
  • the amount of PD-1 increased. That is, the protease treatment attenuated the binding activity of the single domain antibody in the fusion protein to PD-1, and PD-1 was released from the fusion protein.
  • the ligand-binding molecule of the present invention is transported in vivo with the ligand bound, and is cleaved in the diseased tissue to weaken the binding to the ligand, so that the ligand can be released specifically to the diseased tissue. Can be exposed to.
  • the ligand-binding molecule suppresses the biological activity of the ligand during transportation, the risk of the ligand acting systemically is reduced, and is extremely useful in the treatment of diseases.

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Abstract

本発明は、切断サイトが切断されることでリガンドへの結合活性が減弱する単ドメイン抗体含有リガンド結合分子及びその製造方法、当該リガンド結合分子とリガンドで形成される複合体、当該リガンド結合分子とリガンドを含む融合タンパク質、リガンド結合分子またはリガンド結合分子とリガンドの融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。

Description

単ドメイン抗体含有リガンド結合分子
　本発明は、単ドメイン抗体含有リガンド結合分子、当該リガンド結合分子の製造方法、ならびに当該リガンド結合分子を含む医薬組成物、更に、当該リガンド結合分子を含む融合タンパク質、当該融合タンパク質の製造方法、ならびに当該融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
　抗体は血漿中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献１、および非特許文献２）。
　抗体医薬を用いた癌治療薬として、これまでのCD20抗原に対するリツキサン、EGFR抗原に対するセツキシマブ、HER2抗原に対するハーセプチン等が承認されている（非特許文献３）。これらの抗体分子は、癌細胞に発現している抗原に対して結合し、ADCCやシグナル阻害等によって癌細胞に対する傷害活性を発揮する。
　また、癌細胞に高発現する癌抗原に結合する抗体分子にサイトカインなどの生物活性を有するリガンドを融合させたイムノサイトカインによって、リガンドを固形癌にデリバリーする方法が知られている。イムノサイトカインによって固形癌にデリバリーされたサイトカインが免疫を活性化させることで抗腫瘍効果を発揮する。IL-2、IL-12やTNFをはじめとするサイトカインは毒性が強いため、これらのサイトカインを癌局所で働かせるために抗体によって癌局所にデリバリーすることで副作用を軽減しつつ、効果を強めることが期待されているが（非特許文献４、５、６）、これらはいずれも全身投与では臨床で十分な効果を示さない、therapeutic windowが狭い、毒性が強く全身投与ができない、などの課題があり、未だに医薬品として承認されていない。
　この大きな原因として、イムノサイトカインであっても全身投与したサイトカインは全身に暴露されてしまうため、全身で作用して毒性を発揮しうる、あるいは毒性を回避するために極めて低い用量でしか投与できないことが挙げられる。癌抗原に結合する抗体にIL-2を融合したイムノサイトカインと癌抗原に結合しない抗体にIL-2を融合したイムノサイトカインで抗腫瘍効果は変わらなかったという報告もある（非特許文献７）。
Monoclonal antibody successes in the clinic. Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073-1078 The therapeutic antibodies market to 2008. Pavlou AK, Belsey MJ., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396 Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Weiner LM, Surana R, Wang S., Nat. Rev. Immunol. (2010) 10 (5), 317-327 Cyclophosphamide and tucotuzumab (huKS-IL2) following first-line chemotherapy in responding patients with extensive-disease small-cell lung cancer. Gladkov O, Ramlau R, Serwatowski P, Milanowski J, Tomeczko J, Komarnitsky PB, Kramer D, Krzakowski MJ. Anticancer Drugs. 2015 Nov;26(10):1061-8. Defining the Pharmacodynamic Profile and Therapeutic Index of NHS-IL12 Immunocytokine in Dogs with Malignant Melanoma. Paoloni M, Mazcko C, Selting K, Lana S, Barber L, Phillips J, Skorupski K, Vail D, Wilson H, Biller B, Avery A, Kiupel M, LeBlanc A, Bernhardt A, Brunkhorst B, Tighe R, Khanna C. PLoS One. 2015 Jun 19;10(6):e0129954. Isolated limb perfusion with the tumor-targeting human monoclonal antibody-cytokine fusion protein L19-TNF plus melphalan and mild hyperthermia in patients with locally advanced extremity melanoma. Papadia F, Basso V, Patuzzo R, Maurichi A, Di Florio A, Zardi L, Ventura E, Gonzalez-Iglesias R, Lovato V, Giovannoni L, Tasciotti A, Neri D, Santinami M, Menssen HD, De Cian F. J Surg Oncol. 2013 Feb;107(2):173-9. Antigen specificity can be irrelevant to immunocytokine efficacy and biodistribution. Tzeng A, Kwan BH, Opel CF, Navaratna T, Wittrup KD. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 17;112(11):3320-5.
　本発明は、このような状況に鑑みて為されたものであり、その目的の一つは、サイトカインあるいはケモカイン等のリガンドを標的組織において選択的に活性化させる単ドメイン抗体含有リガンド結合分子、当該リガンド結合分子と当該リガンドの複合体、当該リガンド結合分子を含む融合タンパク質、及びそれらの製造方法を提供することにある。本発明のもう一つの目的は、当該リガンド結合分子、または当該リガンド結合分子と当該リガンドの複合体、または当該リガンド結合分子を含む融合タンパク質を有効成分として含む医薬組成物、及び当該医薬組成物の製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を進めたところ、切断サイトを含む単ドメイン抗体含有リガンド結合分子及び当該リガンド結合分子を含む融合タンパク質を創作した。また、本発明者らは、当該リガンド結合分子、当該リガンド結合分子と当該リガンドの複合体、当該リガンド結合分子を含む融合タンパク質、またはそれらを含む医薬組成物が、当該リガンドを用いて疾患を治療することに有用であることを見出すとともに、当該リガンド結合分子または当該リガンド結合分子と当該リガンドの複合体または当該リガンド結合分子を含む融合タンパク質を投与することを含む疾患の治療に有用であること、及び疾患の治療のための医薬の製造において当該リガンド結合分子または当該リガンド結合分子を含む融合タンパク質が有用であることを見出した。また、本発明者らは、当該リガンド結合分子、または当該リガンド結合分子と当該リガンドの複合体、または当該リガンド結合分子を含む融合タンパク質の製造方法を創作して本発明を完成させた。
　本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に例示的に記載する態様を包含するものである。
（Ａ１）リガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子は単ドメイン抗体を含み、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり且つ少なくとも一つの切断サイトが導入されており、当該切断サイトが切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、リガンド結合分子。
（Ａ２）前記切断サイトが切断された状態では、前記リガンドがリガンド結合分子から遊離する、（Ａ１）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ３）前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、（Ａ１）または（Ａ２）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ４）前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、（Ａ３）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ５）前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、（Ａ４）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ６）前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、（Ａ４）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ７）前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、（Ａ３）から（Ａ６）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ８）前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号：２～８２、７８８～８２７で示す配列、表１に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含む配列である、（Ａ３）から（Ａ７）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ９）前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、（Ａ３）から（Ａ８）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ１０）前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（Ａ９）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ１１）前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、（Ａ９）または（Ａ１０）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ１２）前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（Ａ１１）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ１３）前記単ドメイン抗体はVHH、または単ドメインVH抗体、また単ドメインVL抗体である、（Ａ１）から（Ａ１２）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ１４）前記単ドメイン抗体はVHHまたは単ドメインVH抗体であり、前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、（Ａ１３）に記載のリガンド結合分子： 単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１２番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３５ｂ番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６５番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
（Ａ１５）前記単ドメイン抗体は単ドメインVL抗体であり、前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、（Ａ１３）に記載のリガンド結合分子： 単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体２４番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３４番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から５６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
（Ａ１６）前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドと結合することで前記リガンドの生物活性を阻害する、（Ａ１）から（Ａ１５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ１７）前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドに対する中和活性を有する、（Ａ１）から（Ａ１６）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ１８）前記リガンド結合分子は、前記切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列を含む単ドメイン抗体のみを含む、（Ａ１）から（Ａ１７）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ１９）前記リガンド結合分子は更に抗体Ｆｃ領域を含む、（Ａ１）から（Ａ１８）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ２０）前記リガンド結合分子はＮ末端からＣ末端に向かって単ドメイン抗体-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を含む、（Ａ１）から（Ａ１９）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ２１）前記リガンド結合分子は、単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を二つ含む二量体である、（Ａ１）から（Ａ１９）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ２２）前記抗体Ｆｃ領域は、配列番号：１０３～１０６で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域、またはこれらのFc領域に改変を加えたFc領域変異体である、（Ａ１９）から（Ａ２１）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ２３）前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、（Ａ１）から（Ａ２２）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ２４）前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、（Ａ１）から（Ａ２３）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ２５）前記リガンドはCXCL10、IL-12、PD-1、IL-6R、またはIL-1Raである、（Ａ１）から（Ａ２４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ２６）前記リガンドと結合している、（Ａ１）から（Ａ２５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ２７）前記リガンドと融合されている、（Ａ１）から（Ａ２５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ａ２８）前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、当該リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、（Ａ２７）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ２９）前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、（Ａ２７）または（Ａ２８）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ３０）前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、（Ａ２９）に記載のリガンド結合分子。
（Ａ３１）前記リガンドと、（Ａ１）から（Ａ２５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
（Ａ３２）前記リガンドと（Ａ１）から（Ａ２５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
（Ａ３３）前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、前記単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、（Ａ３２）に記載の融合タンパク質。
（Ａ３４）前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、（Ａ３２）または（Ａ３３）に記載の融合タンパク質。
（Ａ３５）前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、（Ａ３４）に記載の融合タンパク質。
（Ａ３６）Ｎ末端からＣ末端に向かってリガンド-リンカー-リガンド結合分子の順で融合されている、（Ａ３４）または（Ａ３５）に記載の融合タンパク質。
（Ｂ１）リガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子は単ドメイン抗体を含み、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり且つ少なくとも一つのプロテアーゼ切断配列を含み、当該プロテアーゼ切断配列は標的組織特異的プロテアーゼにより切断可能であり、当該プロテアーゼ切断配列が切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、リガンド結合分子。
（Ｂ２）前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態では、前記リガンドがリガンド結合分子から遊離する、（Ｂ１）に記載のリガンド結合分子。
（Ｂ３）前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、（Ｂ１）から（Ｂ２）のいずれか一つ記載のリガンド結合分子。
（Ｂ４）前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、（Ｂ１）から（Ｂ２）記載のリガンド結合分子。
（Ｂ５）前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、（Ｂ１）から（Ｂ４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ６）前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号：２～８２、７８８～８２７で示す配列、表１に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含む配列である、（Ｂ１）から（Ｂ５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ７）前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、（Ｂ１）から（Ｂ６）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ８）前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（Ｂ７）に記載のリガンド結合分子。
（Ｂ９）前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、（Ｂ７）または（Ｂ８）に記載のリガンド結合分子。
（Ｂ１０）前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（Ｂ９）に記載のリガンド結合分子。
（Ｂ１１）前記単ドメイン抗体はVHH、または単ドメインVH抗体、または単ドメインVL抗体、である、（Ｂ１）から（Ｂ１０）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ１２）前記単ドメイン抗体はVHHまたは単ドメインVH抗体であり、前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、（Ｂ１１）に記載のリガンド結合分子： 単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１２番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３５ｂ番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６５番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
（Ｂ１３）前記単ドメイン抗体は単ドメインVL抗体であり、前記切断サイト、または前記プロテアーゼ切断配列、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカー、またはプロテアーゼ切断配列と第一可動リンカーと第二可動リンカーは、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、（Ｂ１１）に記載のリガンド結合分子： 単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体２４番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３４番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から５６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
（Ｂ１４）前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドと結合することで前記リガンドの生物活性を阻害する、（Ｂ１）から（Ｂ１３）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ１５）前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドに対する中和活性を有する、（Ｂ１）から（Ｂ１４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ１６）前記リガンド結合分子は、前記切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列を含む単ドメイン抗体のみを含む、（Ｂ１）から（Ｂ１５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ１７）前記リガンド結合分子は更に抗体Ｆｃ領域を含む、（Ｂ１）から（Ｂ１６）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ１８）前記リガンド結合分子はＮ末端からＣ末端に向かって単ドメイン抗体-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を含む、（Ｂ１）から（Ｂ１７）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ１９）前記リガンド結合分子は、単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を二つ含む二量体である、（Ｂ１）から（Ｂ１７）に記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２０）前記抗体Ｆｃ領域は、配列番号：１０３～１０６で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域、またはこれらのFc領域に改変を加えたFc領域変異体である、（Ｂ１７）から（Ｂ１９）に記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２１）前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、（Ｂ１）から（Ｂ２０）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２２）前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、（Ｂ１）から（Ｂ２１）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２３）前記リガンドはCXCL10、IL-12、PD-1、IL-6R、またはIL-1Raである、（Ｂ１）から（Ｂ２２）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２４）前記リガンドと結合している、（Ｂ１）から（Ｂ２３）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２５）前記リガンドと融合されている、（Ｂ１）から（Ｂ２３）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２６）前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、当該リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、（Ｂ２５）に記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２７）前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、（Ｂ２５）または（Ｂ２６）に記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２８）前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、（Ｂ２７）に記載のリガンド結合分子。
（Ｂ２９）前記リガンドと、（Ｂ１）から（Ｂ２３）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
（Ｂ３０）前記リガンドと（Ｂ１）から（Ｂ２３）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
（Ｂ３１）前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、前記単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、（Ｂ３０）に記載の融合タンパク質。
（Ｂ３２）前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、（Ｂ３０）または（Ｂ３１）に記載の融合タンパク質。
（Ｂ３３）前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、（Ｂ３２）に記載の融合タンパク質。
（Ｂ３４）Ｎ末端からＣ末端に向かってリガンド-リンカー-リガンド結合分子の順で融合されている、（Ｂ３２）または（Ｂ３３）に記載の融合タンパク質。
（Ｃ１）単ドメイン抗体を含むリガンド結合分子であり、当該単ドメイン抗体はVHHまたは単ドメインVH抗体であり、当該単ドメイン抗体は、下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に切断サイトを有する： 単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１２番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３５ｂ番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６５番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
（Ｃ２）単ドメイン抗体を含むリガンド結合分子であり、当該単ドメイン抗体は単ドメインVL抗体であり、当該単ドメイン抗体は、下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に切断サイトを有する： 単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体２４番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３４番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から５６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
（Ｃ３）前記単ドメイン抗体は前記リガンドに結合可能であり、前記切断サイトが切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、（Ｃ１）または（Ｃ２）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ４）前記切断サイトが切断された状態では、前記リガンドが前記リガンド結合分子から遊離する、（Ｃ１）から（Ｃ３）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ５）前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、（Ｃ１）から（Ｃ４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ６）前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、（Ｃ５）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ７）前記標的組織が癌組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは癌組織特異的プロテアーゼである、（Ｃ６）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ８）前記標的組織が炎症組織であり、前記標的組織特異的プロテアーゼは炎症組織特異的プロテアーゼである、（Ｃ６）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ９）前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、（Ｃ５）から（Ｃ８）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１０）前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号：２～８２、７８８～８２７で示す配列、表１に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含む配列である、（Ｃ５）から（Ｃ９）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１１）前記プロテアーゼ切断配列の一端に、第一可動リンカーが更に付加されている、（Ｃ５）から（Ｃ１０）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１２）前記第一可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（Ｃ１１）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１３）前記プロテアーゼ切断配列の他端に、第二可動リンカーが更に付加されている、（Ｃ１１）または（Ｃ１２）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１４）前記第二可動リンカーは、グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーである、（Ｃ１３）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１５）前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドと結合することで前記リガンドの生物活性を阻害する、（Ｃ１）から（Ｃ１４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１６）前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドに対する中和活性を有する、（Ｃ１）から（Ｃ１５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１７）前記リガンド結合分子は、前記切断サイトまたはプロテアーゼ切断配列を含む単ドメインのみを含む、（Ｃ１）から（Ｃ１６）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１８）前記リガンド結合分子は更に抗体Ｆｃ領域を含む、（Ｃ１）から（Ｃ１７）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ１９）前記リガンド結合分子はＮ末端からＣ末端に向かって単ドメイン抗体-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を含む、（Ｃ１）から（Ｃ１８）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２０）前記リガンド結合分子は、単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を二つ含む二量体である、（Ｃ１）から（Ｃ１８）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２１）前記抗体Ｆｃ領域は、配列番号：１０３～１０６で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域、またはこれらのFc領域に改変を加えたFc領域変異体である、（Ｃ１８）から（Ｃ２０）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２２）前記リガンドはサイトカインまたはケモカインである、（Ｃ１）から（Ｃ２１）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２３）前記リガンドは、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、及びTGF-βファミリーから選ばれるリガンドである、（Ｃ１）から（Ｃ２２）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２４）前記リガンドはCXCL10、IL-12、PD-1、IL-6R、またはIL-1Raである、（Ｃ１）から（Ｃ２３）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２５）前記リガンドと結合している、（Ｃ１）から（Ｃ２４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２６）前記リガンドと融合されている、（Ｃ１）から（Ｃ２４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２７）前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、当該リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、（Ｃ２６）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２８）前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、（Ｃ２６）または（Ｃ２７）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ２９）前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、（Ｃ２８）に記載のリガンド結合分子。
（Ｃ３０）前記リガンドと、（Ｃ１）から（Ｃ２４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
（Ｃ３１）前記リガンドと（Ｃ１）から（Ｃ２４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
（Ｃ３２）前記リガンド結合分子がリガンドと融合されている状態では、前記単ドメイン抗体は更に別のリガンドと結合しない、（Ｃ３１）に記載の融合タンパク質。
（Ｃ３３）前記リガンド結合分子は、リンカーを介して前記リガンドと融合されている、（Ｃ３１）または（Ｃ３２）に記載の融合タンパク質。
（Ｃ３４）前記リンカーはプロテアーゼ切断配列を含まない、（Ｃ３３）に記載の融合タンパク質。
（Ｃ３５）Ｎ末端からＣ末端に向かってリガンド-リンカー-リガンド結合分子の順で融合されている、（Ｃ３３）または（Ｃ３４）に記載の融合タンパク質。
（Ｄ１）（Ａ１）から（Ａ２７）、（Ｂ１）から（Ｂ２５）、（Ｃ１）から（Ｃ２６）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子を含む、医薬組成物。
（Ｄ２）（Ａ１）から（Ａ２６）、（Ｂ１）から（Ｂ２４）、（Ｃ１）から（Ｃ２５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子とリガンドを含む、医薬組成物。
（Ｄ３）（Ａ３１）または（Ｂ２９）または（Ｃ３０）に記載の複合体を含む、医薬組成物。
（Ｄ４）（Ａ３２）から（Ａ３６）、（Ｂ３０）から（Ｂ３４）、（Ｃ３１）から（Ｃ３５）のいずれか一つに記載の融合タンパク質を含む、医薬組成物。
（Ｅ１）（Ａ１）から（Ａ２５）、（Ｂ１）から（Ｂ２４）、（Ｃ１）から（Ｃ２５）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
（Ｅ２）単ドメイン抗体を含むリガンド結合分子中の単ドメイン抗体に、プロテアーゼ切断配列を導入することを含む、（Ｅ１）に記載の製造方法。
（Ｅ３）プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子と、当該単ドメイン抗体と結合可能なリガンドを融合させることを含む、（Ａ３２）から（Ａ３６）、（Ｂ３０）から（Ｂ３４）、（Ｃ３１）から（Ｃ３５）のいずれか一つに記載の融合タンパク質の製造方法。
（Ｅ４）（Ａ１）から（Ａ２５）、（Ｂ１）から（Ｂ２３）、（Ｃ１）から（Ｃ２４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子をコードするポリヌクレオチド。
（Ｅ５）（Ｅ４）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（Ｅ６）（Ｅ４）に記載のポリヌクレオチドもしくは（Ｅ５）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（Ｅ７）（Ｅ６）に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、（Ａ１）から（Ａ２５）、（Ｂ１）から（Ｂ２３）、（Ｃ１）から（Ｃ２４）のいずれか一つに記載のリガンド結合分子を製造する方法。
（Ｅ８）（Ａ３２）から（Ａ３６）、（Ｂ３０）から（Ｂ３４）、（Ｃ３１）から（Ｃ３５）のいずれか一つに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（Ｅ９）（Ｅ８）に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（Ｅ１０）（Ｅ８）に記載のポリヌクレオチドもしくは（Ｅ９）に記載のベクターを含む宿主細胞。
（Ｅ１１）（Ｅ１０）に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、（Ａ３２）から（Ａ３６）、（Ｂ３０）から（Ｂ３４）、（Ｃ３１）から（Ｃ３５）のいずれか一つに記載の融合タンパク質を製造する方法。
本発明のリガンド結合分子の一例を示す図である。単ドメイン抗体中に含まれる切断サイトが未切断の状態において、単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり、切断サイトが切断された状態において、単ドメイン抗体は切断されており、リガンドに結合できず、リガンドが放出される。 本発明のリガンド結合分子とリガンドの融合タンパク質の一例を示す図である。単ドメイン抗体中に含まれる切断サイトが未切断の状態において、融合タンパク質中の単ドメイン抗体は融合タンパク質中のリガンドに結合可能であり、切断サイトが切断された状態において、単ドメイン抗体は切断されており、リガンドに結合できず、リガンドを含む融合タンパク質の一部が放出される。 本発明のリガンド結合分子の別の一例を示す図である。この例では、リガンド結合分子が単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体Fc領域を含む二量体タンパク質である。 本発明のリガンド結合分子とリガンドの融合タンパク質の別の一例を示す図である。この例では、リガンド結合分子が単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体Fc領域を含む二量体タンパク質である。 プロテアーゼ処理リガンド結合分子とプロテアーゼ未処理リガンド結合分子のSDS－PAGEの結果を示す図である。プロテアーゼ切断配列を含まない対照分子（Lane 12、13）がプロテアーゼ処理／未処理関係なく、バンドが同じ位置にあるのに対し、各プロテアーゼ切断配列が導入されたリガンド結合分子はプロテアーゼ処理後のみに生じる新しいバンドがあり、即ち、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子はプロテアーゼ処理で切断されたことが示された。 プロテアーゼ処理リガンド結合分子とプロテアーゼ未処理リガンド結合分子のIL-6Rに対する結合を評価したリアルタイム結合グラフである。各図のタイトルは測定サンプルの名前で、縦軸はリガンド結合分子とIL-6Rの相対的結合を示しており、横軸は時間（s）を示している。グレーの線はプロテアーゼ未処理サンプルのデータを示しており、黒の線はプロテアーゼ処理サンプルのデータを示している。 プロテアーゼ処理融合タンパク質とプロテアーゼ未処理融合タンパク質のSDS－PAGEの結果を示す図である。プロテアーゼ切断配列を含まない対照分子がプロテアーゼ処理／未処理関係なく、バンドが同じ位置にあるのに対し、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質はプロテアーゼ処理後のみに生じる新しいバンドがあり、即ち、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質はプロテアーゼ処理で切断されたことが示された。 図７－１の続きを示す図である。 図７－２の続きを示す図である。 図７－３の続きを示す図である。 プロテアーゼ処理融合タンパク質とプロテアーゼ未処理融合タンパク質溶液中に存在する遊離IL-6RのIL6R90-bioへの結合を評価したリアルタイムグラフである。各図のタイトルは測定サンプルの名前で、縦軸はIL-6Rとビオチン化された抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子(IL6R90-bio)の相対的結合を示しており、横軸は時間（s）を示している。グレーの線はプロテアーゼ未処理サンプルのデータを示しており、黒の線はプロテアーゼ処理サンプルのデータを示している。 図８－１の続きを示す図である。 プロテアーゼ処理融合タンパク質とプロテアーゼ未処理融合タンパク質のSDS－PAGEの結果を示す図である。 プロテアーゼ処理融合タンパク質とプロテアーゼ未処理融合タンパク質溶液中に存在する遊離ヒトPD-1のビオチン化された抗PD-1単ドメイン抗体含有分子(PD1-bio)への結合を示すリアルタイムグラフである。各図のタイトルは測定サンプルの名前で、縦軸はPD-1とPD1-bioの相対的結合を示しており、横軸は時間（s）を示している。グレーの線はプロテアーゼ未処理サンプルのデータを示しており、黒の線はプロテアーゼ処理サンプルのデータを示している。 各種プロテアーゼ切断配列が導入されたIgGのプロテアーゼ切断結果を示す図である。 各種プロテアーゼ切断配列が導入されたIgGのプロテアーゼ切断結果を示す図である。 各種プロテアーゼ切断配列が導入されたIgGのプロテアーゼ切断結果を示す図である。
ポリペプチド
　本発明におけるポリペプチドとは、通常、４アミノ酸程度以上の長さを有するペプチド、およびタンパク質を指す。Ｎ末端からＣ末端までペプチド結合でつながるアミノ酸の連鎖を一連のペプチド鎖とする場合、本発明のポリペプチドは、複数の一連のペプチド鎖がS-S結合、疎水性相互作用、イオン結合等の相互作用により形成された複合体タンパク質であっても良い。また、本発明におけるポリペプチドは通常、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、生物由来のポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに含まれる。
アミノ酸
　本明細書において、たとえば、Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/Vと表されるように、アミノ酸は1文字コードまたは3文字コード、またはその両方で表記されている。
アミノ酸改変
　ポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸の改変のためには、部位特異的変異誘発法（Kunkelら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492））やOverlap extension PCR等の公知の方法が適宜採用され得る。また、天然のアミノ酸以外のアミノ酸に置換するアミノ酸の改変方法として、複数の公知の方法もまた採用され得る（Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357）。例えば、終止コドンの１つであるUAGコドン（アンバーコドン）の相補的アンバーサプレッサーtRNAに非天然アミノ酸が結合されたtRNAが含まれる無細胞翻訳系システム（Clover Direct（Protein Express））等も好適に用いられる。
　本明細書において、アミノ酸の改変部位を表す際に用いられる「および/または」の用語の意義は、「および」と「または」が適宜組み合わされたあらゆる組合せを含む。具体的には、例えば「37番、45番、および/または47番のアミノ酸が置換されている」とは以下のアミノ酸の改変のバリエーションが含まれる；
(a) 37番、(b)45番、(c)47番、(d) 37番および45番、(e) 37番および47番、(f) 45番および47番、(g) 37番および45番および47番。
　本明細書において、また、アミノ酸の改変を表す表現として、特定の位置を表す数字の前後に改変前と改変後のアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードを併記した表現が適宜使用され得る。例えば、抗体可変領域に含まれるアミノ酸の置換を加える際に用いられるF37VまたはPhe37Valという改変は、Kabatナンバリングで表される37位のPheのValへの置換を表す。すなわち、数字はKabatナンバリングで表されるアミノ酸の位置を表し、その前に記載されるアミノ酸の1文字コード又は3文字コードは置換前のアミノ酸、そのあとに記載されるアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは置換後のアミノ酸を表す。同様に、抗体定常領域に含まれるFc領域にアミノ酸の置換を加える際に用いられるP238AまたはPro238Alaという改変は、EUナンバリングで表される238位のProのAlaへの置換を表す。すなわち、数字はEUナンバリングで表されるアミノ酸の位置を表し、その前に記載されるアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは置換前のアミノ酸、そのあとに記載されるアミノ酸の1文字コードまたは3文字コードは置換後のアミノ酸を表す。
抗体及び抗体断片
　本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
　「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、それだけに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、scFv）、および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
　用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
可変領域
　用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの相補性決定領域 (CDR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。
ＣＤＲ
　本明細書で用いられる用語「相補性決定領域」または「CDR」は、配列において超可変であり、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）、抗体の可変ドメインまたは単ドメイン抗体の各領域のことをいう。
　通常、抗体は6つのCDRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的な抗体CDRは、以下のものを含む：
　(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
　(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
　(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
　(d) CDRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、または94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
　通常、単ドメイン抗体は3つのCDRを含む：CDR1、CDR2、CDR3。単ドメイン抗体がVHHまたは単ドメインVH抗体の場合、単ドメイン抗体のCDRは、例示的に以下のものを含む：
　(a) アミノ酸残基26-32 (CDR1)、53-55 (CDR2)、および96-101 (CDR3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
　(b) アミノ酸残基31-35b (CDR1)、50-65 (CDR2)、 および95-102 (CDR3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
　(c) アミノ酸残基30-35b (CDR1)、47-58 (CDR2)、および93-101 (CDR3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
　(d) CDRアミノ酸残基26-35 (CDR1)、26-35b (CDR1)、49-65 (CDR2)、93-102 (CDR3)、または94-102 (CDR3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
　単ドメイン抗体が単ドメインVL抗体の場合、単ドメイン抗体のCDRは、例示的に以下のものを含む：
　(a) アミノ酸残基26-32 (CDR1)、50-52 (CDR2)、および91-96 (CDR3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
　(b) アミノ酸残基24-34 (CDR1)、50-56 (CDR2)、および89-97 (CDR3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
　(c) アミノ酸残基27c-36 (CDR1)、46-55 (CDR2)、および89-96 (CDR3)のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
　(d) CDRアミノ酸残基46-56 (CDR2)、47-56 (CDR2)、48-56 (CDR2)、または49-56 (CDR2)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
　別段示さない限り、CDR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
ＦＲ
　「フレームワーク」または「FR」は、相補性決定領域 (CDR) 残基以外の、可変ドメイン残基または単ドメイン抗体残基のことをいう。可変ドメインまたは単ドメイン抗体のFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、CDRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。単ドメイン抗体においては、CDRおよびFRの配列は、通常次の順序で現れる：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
　「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。
定常領域
　本明細書で用語「定常領域」または「定常ドメイン」は、抗体の可変領域以外の部分を言う。例えば、IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメインを含む重鎖定常領域（CH）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。天然型抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。「定常領域を含む」との用語は、定常領域の全部を含んでも良く、定常領域の一部を含んでも良い。
　抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
Fc領域
　本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG１の場合、重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
ヒンジ領域
　「ヒンジ領域」あるいは「抗体ヒンジ領域」なる用語は、抗体重鎖におけるEUナンバリング216番目から230番目のアミノ酸で構成される領域、またはその中の一部分を指すことが出来る。
単ドメイン抗体
　本明細書で用語「単ドメイン抗体」は、そのドメイン単独で抗原結合活性を発揮できる抗体である。単ドメイン抗体は、そのドメイン単独で抗原結合活性を発揮できるかぎりその構造は限定されない。IgG抗体等で例示される通常の抗体は、VHとVLのペアリングにより可変領域を形成された状態では抗原結合活性を示すのに対し、単ドメイン抗体は他のドメインとペアリングすることなく、単ドメイン抗体自身のドメイン構造単独で抗原結合活性を発揮できると知られている。単ドメイン抗体は通常比較的に低分子量を有し、単量体の形態で存在する。いくつかの実施形態では、単ドメイン抗体の形態は、抗体重鎖可変領域もしくは抗体軽鎖可変領域と類似する。
　単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科の動物重鎖抗体の可変領域（VHH）、サメのＶＮＡＲのような、先天的に軽鎖を欠如する抗原結合分子、または抗体のVHドメインのすべてもしくは一部分またはVLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片が挙げられる。抗体のVH／VLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である単ドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、米国特許第6,248,516号B1等に記載されているようなヒト抗体VHまたはヒト抗体VLから出発して人工的に作製された単ドメイン抗体（以下、単ドメインVH抗体、単ドメインVL抗体）が挙げられる。
　単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を産生できる動物から、または単ドメイン抗体を産生できる動物を免疫することにより取得し得る。単ドメイン抗体を産生できる動物の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科動物、単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物（transgenic animals）が挙げられる。ラクダ科動物はラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ等を含む。単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物の例として、それだけに限定されないが、国際公開WO2015/143414号、米国特許公開US2011/0123527号A1に記載の遺伝子導入動物が挙げられる。動物から取得した単ドメイン抗体のフレームワーク配列をヒトジャームライン配列あるいはそれに類似した配列とすることで、ヒト化した単ドメイン抗体を取得することも出来る。ヒト化した単ドメイン抗体（例えば、ヒト化VHH）はまた、本発明の単ドメイン抗体の一実施態様である。
　単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を産生できる動物から、または単ドメイン抗体を産生できる動物を免疫することにより取得し得る。単ドメイン抗体を産生できる動物の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科動物、単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物（transgenic animals）が挙げられる。ラクダ科動物はラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ等を含む。単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物の例として、それだけに限定されないが、国際公開WO2015/143414号、米国特許公開US2011/0123527号A1に記載の遺伝子導入動物が挙げられる。動物から取得した単ドメイン抗体のフレームワーク配列をヒトジャームライン配列あるいはそれに類似した配列とすることで、ヒト化した単ドメイン抗体を取得することも出来る。ヒト化した単ドメイン抗体（例えば、ヒト化VHH）はまた、本発明の単ドメイン抗体の一実施態様である。
　また、単ドメイン抗体は、単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリから、ELISA、パニング等により取得し得る。単ドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリの例として、それだけに限定されないが、例えば、各種動物若しくはヒトから取得したナイーブ抗体ライブラリ（例：Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)、Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319)）、各種動物を免疫することで取得した抗体ライブラリ（例：Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536)）、または各種動物若しくはヒトの抗体遺伝子より作成した合成抗体ライブラリ（例：Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43)、Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)、AIDS 2016 30:11 (1691-1701)）が挙げられる。
　本発明において、単ドメイン抗体中に切断サイト／プロテアーゼ切断配列が導入されている態様があるが、切断サイト／プロテアーゼ切断配列が導入されたか否かに関わらず、「単ドメイン抗体」として表現できる。
　本発明の単ドメイン抗体は、いくつかの実施形態において、概して、
　ａ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる１１位のアミノ酸残基はＬ、Ｍ、Ｓ、Ｖ、Ｗからなる群から選択される、好ましくはＬである）、及び／又は
　ｂ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる３７位のアミノ酸残基はＦ、Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｖからなる群から選択される、好ましくはＦまたはＹである）、及び／又は
　ｃ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＧ、Ｅ、Ａ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌからなる群から選択される、好ましくはＧ、ＥまたはＱである、より好ましくはＧまたはＥである）、及び／又は
　ｄ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＬ、Ｒ、Ｃ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｖからなる群から選択される、好ましくはＬまたはＲである）、及び／又は
　ｅ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる４７位のアミノ酸残基はＷ、Ｌ、Ｆ、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｙからなる群から選択される、好ましくはＷ、Ｌ、ＦまたはＲである）、及び／又は
　ｆ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる８３位のアミノ酸残基はＲ、Ｋ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｍ、Ｑ、Ｔからなる群から選択される、好ましくはＫまたはＲである、より好ましくはＫである）、及び／又は
　ｇ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる８４位のアミノ酸残基はＰ、Ａ、Ｌ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｖからなる群から選択される、好ましくはＰである）、及び／又は
　ｈ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＷ、Ｐ、Ｒ、Ｓからなる群から選択される、このましくはＷである）、及び／又は
　ｉ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる１０４位のアミノ酸残基はＧまたはＤである、好ましくはＧである）、及び／又は
　ｊ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（Kabatナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ、Ｌ、Ｒからなる群から選択される、好ましくはＱまたはＬである）を含む、ポリペプチドと定義することができる。
　より具体的に、排他的ではないが、単ドメイン抗体は下記の３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列のいずれか一つの配列を含むポリペプチドと定義することができる：
　ｋ）Kabatナンバリングによる４３位～４６位のアミノ酸残基はＫＥＲＥまたはＫＱＲＥであるアミノ酸配列；
　ｌ）Kabatナンバリングによる４４位～４７位のアミノ酸残基はＧＬＥＷであるアミノ酸配列；
　ｍ）Kabatナンバリングによる８３位～８４位のアミノ酸残基はＫＰまたはＥＰであるアミノ酸配列。
キメラ抗体
　用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。「キメラ単ドメイン抗体」は、単ドメイン抗体の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、単ドメイン抗体の残りの部分が異なった供給源または種に由来する単ドメイン抗体のことをいう。
ヒト化抗体
　「ヒト化」抗体は、非ヒトCDRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのCDRは非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。「ヒト化単ドメイン抗体」は、非ヒトCDRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ単ドメイン抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化単ドメイン抗体は、すべてのもしくは実質的にすべてのCDRは非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体において、ＦＲ中の残基の一部がヒト抗体のものと対応しない場合も、実質的にすべてのＦＲはヒト抗体のものに対応する一例として考えられる。たとえば、単ドメイン抗体の一態様であるＶＨＨをヒト化する場合、ＦＲ中の残基の一部をヒト抗体のものと対応しない残基にする必要がある（C Vinckeら、The Journal of Biological Chemistry 284, 3273-3284.）。
　ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。
アフィニティ
　「アフィニティ」は、分子（例えば、抗体）の結合部位1個と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。別段示さない限り、本明細書で用いられる「結合アフィニティ」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する、固有の結合アフィニティのことをいう。分子XのそのパートナーYに対するアフィニティは、一般的に、解離定数 (Kd) により表すことができる。アフィニティは、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合アフィニティを測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。
同じエピトープに結合する抗体
　参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する抗体のことをいい、また逆にいえば、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。
単離された抗体
　「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点分離法 (isoelectric focusing: IEF)、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相HPLC）で測定して、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の総説として、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) を参照のこと。
モノクローナル抗体
　本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
配列同一性
　参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR) ソフトウェア、またはGENETYX（登録商標）（株式会社ゼネティックス）などの、公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。
ベクター
　本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
宿主細胞等
　用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
プロテアーゼ
　本明細書において、用語「プロテアーゼ」は、ペプチド結合を加水分解するエンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼなどの酵素、通常はエンドペプチダーゼを言う。本発明に用いられるプロテアーゼは、プロテアーゼ切断配列を切断できることのみによって制限され、その種類は特に限定されない。いくつかの実施態様において、標的組織特異的プロテアーゼが使用される。標的組織特異的プロテアーゼは、例えば、
（１）標的組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
（２）標的組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
（３）標的細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
（４）標的細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかを指すことができる。より具体的な実施態様において、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼが使用される。
標的組織
　本明細書で用語「標的組織」は、少なくとも一つの標的細胞を含む組織を意味する。本発明のいくつかの実施態様においては、標的組織は癌組織である。本発明のいくつかの実施態様においては、標的組織は炎症組織である。
　用語「癌組織」とは、少なくとも一つの癌細胞を含む組織を意味する。したがって、例えば癌組織が癌細胞と血管を含んでいるように、癌細胞および内皮細胞を含む腫瘤（tumor mass）の形成に寄与するすべての細胞型をいう。本明細書において、腫瘤とは腫瘍組織巣（a foci of tumor tissue）をいう。「腫瘍」という用語は、一般に、良性新生物または悪性新生物を意味するために用いられる。
　本明細書において、「炎症組織」とは、例えば、以下が例示的に挙げられる。
　・関節リウマチや変形性関節症における関節
　・気管支喘息やCOPDにおける肺（肺胞）
　・炎症性腸疾患やクローン病や潰瘍性大腸炎における消化器官
　・肝臓、腎臓、肺における線維化症における線維化組織
　・臓器移植における拒絶反応が起こっている組織
　・動脈硬化や心不全における血管、心臓（心筋）
　・メタボリック症候群における内臓脂肪
　・アトピー性皮膚炎その他皮膚炎における皮膚組織
　・椎間板ヘルニアや慢性腰痛における脊髄神経
標的組織特異的プロテアーゼ
　いくつかの種類の標的組織において、特異的に発現するもしくは特異的に活性化されるプロテアーゼまたは標的組織の疾患状態と関連すると考えられるプロテアーゼ（標的組織特異的プロテアーゼ）が知られている。例えば、国際公開WO２０１３／１２８１９４号、国際公開WO２０１０／０８１１７３号、国際公開WO２００９／０２５８４６号等で癌組織に特異的に発現するプロテアーゼが開示されている。また、J Inflamm (Lond). 2010; 7: 45.、Nat Rev Immunol. 2006 Jul;6(7):541-50.、Nat Rev Drug Discov. 2014 Dec;13(12):904-27.、Respir Res. 2016 Mar 4;17:23.、Dis Model Mech. 2014 Feb;7(2):193-203.、Biochim Biophys Acta. 2012 Jan;1824(1):133-45.で炎症と関連すると考えられるプロテアーゼが開示されている。
　標的組織にて特異的に発現するプロテアーゼ以外に、標的組織で特異的に活性化されるプロテアーゼも存在する。例えば、プロテアーゼは不活性型で発現し、その後活性型となる場合があり、多くの組織では活性型プロテアーゼを阻害する物質が存在し、活性化のプロセスと阻害剤の存在によって活性がコントロールされている(Nat Rev Cancer. 2003 Jul;3(7):489-501.)。標的組織において、活性型プロテアーゼが阻害から逃れ、特異的に活性化されることがある。
　活性型プロテアーゼの測定方法は、活性化型のプロテアーゼを認識する抗体を用いる方法（PNAS 2013 Jan 2; 110(1): 93-98.）やプロテアーゼが認識するペプチドを蛍光標識し、切断前は消光（クエンチ）しているが、切断後に発光する方法（Nat Rev Drug Discov. 2010 Sep;9(9):690-701. doi: 10.1038/nrd3053.）を用いて測定されうる。
　限定して解釈されるものではないが、具体的なプロテアーゼとしては、システインプロテアーゼ（カテプシンファミリーＢ、Ｌ、Ｓなどを含む）、アスパルチルプロテアーゼ（カテプシンＤ、Ｅ、Ｋ、Ｏ等）、セリンプロテアーゼ（マトリプターゼ（MT-SP1を含む）、カテプシンＡおよびＧ、トロンビン、プラスミン、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、エラスターゼ、プロテイナーゼ3、トロンビン、カリクレイン、トリプターゼ、キマーゼを含む）、メタロプロテアーゼ（膜結合型（ＭＭＰ１４－１７およびＭＭＰ２４－２５）および分泌型（ＭＭＰ１－１３およびＭＭＰ１８－２３およびＭＭＰ２６－２８）の両方を含むメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ１－２８））、プロテアーゼのＡディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）、Ａディスインテグリンまたはトロンボスポンジンモチーフを有するメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）、メプリン（メプリンα(meprin alpha)、メプリンβ（meprin beta）））、ＣＤ１０（ＣＡＬＬＡ）、ならびに前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、レグマイン、TMPRSS3、TMPRSS4、好中球エラスターゼ（HNE）、ベータセクレターゼ（BACE）、線維芽細胞活性化蛋白質アルファ（FAP）、グランザイムB、 グアニジノベンゾアターゼ（GB）、ヘプシン、ネプリライシン、NS3/4A、HCV-NS3/4、カルパイン、ADAMDEC1、レニン、カテプシンC、カテプシンV/L2、カテプシン X/Z/P、クルジパイン、オツバイン2、カリクレイン関連ペプチダーゼ（KLKs（KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13、KLK14））、骨形成タンパク質1（BMP-1）、活性化プロテインC、血液凝固関連プロテアーゼ（Factor VIIa、Factor IXa、Factor Xa、Factor XIa、Factor XIIa）、HtrA1、ラクトフェリン、マラプシン、PACE4、DESC1、ジペプチジルペプチダーゼ4（DPP-4）、TMPRSS2、カテプシンF、カテプシンH、カテプシンL2、カテプシンO、カテプシンS、グランザイムA、Gepsinカルパイン2、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ2、AMSH-Like Proteases、AMSH、ガンマセクレターゼ、抗プラスミン切断酵素（APCE）、Decysin 1、N-Acetylated Alpha-Linked Acidic Dipeptidase-Like 1（NAALADL1）、フーリン（furin）等が挙げられる。
　別の視点から、標的組織特異的プロテアーゼは、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼを指すことができる。
癌組織特異的プロテアーゼ
　癌組織特異的プロテアーゼとしては、例えば、国際公開WO２０１３／１２８１９４号、国際公開WO２０１０／０８１１７３号、国際公開WO２００９／０２５８４６号等で開示される癌組織に特異的に発現するプロテアーゼが挙げられる。
　癌組織特異的プロテアーゼの種類は、治療対象の癌組織での発現の特異性が高いほど、副作用低減効果が得られる。癌組織特異的プロテアーゼは、癌組織における濃度が正常組織における濃度の５倍以上高いことが好ましく、１０倍以上高いことがより好ましく、１００倍以上高いことがさらに好ましく、５００倍以上高いことが特に好ましく、１０００倍以上高いことが最も好ましい。また、癌組織特異的プロテアーゼは、癌組織における活性が正常組織における活性の２倍以上高いことが好ましく、３倍以上高いこと、４倍以上高いこと、５倍以上高いこと、１０倍以上高いことがより好ましく、１００倍以上高いことがさらに好ましく、５００倍以上高いことが特に好ましく、１０００倍以上高いことが最も好ましい。
　また、癌組織特異的プロテアーゼは、癌細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。癌組織特異的プロテアーゼが癌細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が癌細胞に特異的であるためには、癌組織特異的プロテアーゼは癌組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「癌組織の近傍」とは、癌組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、リガンド結合活性の低下効果を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
　別の視点から、癌組織特異的プロテアーゼは、
　(i) 癌組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(ii) 癌組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
　(iii) 癌細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(iv) 癌細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
　癌組織特異的プロテアーゼは、１種単独でもよく、２種以上が組み合せられてもよい。癌組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の癌種を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
　以上の観点から、癌組織特異的プロテアーゼとしては、上記例示したプロテアーゼの中でも、セリンプロテアーゼとメタロプロテアーゼが好ましく、マトリプターゼ（MT-SP1を含む）、ウロキナーゼ（uPA）とメタロプロテアーゼがより好ましく、MT-SP1、uPA、MMP-2、MMP-9が更に好ましい。
炎症組織特異的プロテアーゼ
　炎症組織特異的プロテアーゼの種類は、治療対象の炎症組織での発現の特異性が高いほど、副作用低減効果が得られる。炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症組織における濃度が正常組織における濃度の５倍以上高いことが好ましく、１０倍以上高いことがより好ましく、１００倍以上高いことがさらに好ましく、５００倍以上高いことが特に好ましく、１０００倍以上高いことが最も好ましい。また、炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症組織における活性が正常組織における活性の２倍以上高いことが好ましく、３倍以上高いこと、４倍以上高いこと、５倍以上高いこと、１０倍以上高いことがより好ましく、１００倍以上高いことがさらに好ましく、５００倍以上高いことが特に好ましく、１０００倍以上高いことが最も好ましい。
　また、炎症組織特異的プロテアーゼは、炎症細胞の細胞膜に結合しているものでもよく、細胞膜に結合しておらず細胞外に分泌されるものでもよい。炎症組織特異的プロテアーゼが炎症細胞の細胞膜に結合していない場合、免疫細胞による細胞傷害が炎症細胞に特異的であるためには、炎症組織特異的プロテアーゼは炎症組織の内部または近傍に存在するものであることが好ましい。本明細書で「炎症組織の近傍」とは、炎症組織特異的プロテアーゼ切断配列が切断されて、リガンド結合活性の低下効果を発揮する範囲内であることを意味する。ただし、できるだけ正常細胞を傷害しない範囲であることが好ましい。
　別の視点から、炎症組織特異的プロテアーゼは、
　(i) 炎症組織にて正常組織より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(ii) 炎症組織にて正常組織より高い活性を有するプロテアーゼ、
　(iii) 炎症細胞にて正常細胞より高レベルで発現するプロテアーゼ、
　(iv) 炎症細胞にて正常細胞より高い活性を有するプロテアーゼ、
のいずれかである。
　炎症組織特異的プロテアーゼは、１種単独でもよく、２種以上が組み合せられてもよい。炎症組織特異的プロテアーゼの種類数は、治療対象の病状を考慮して、当業者が適宜設定することができる。
　以上の観点から、炎症組織特異的プロテアーゼとしては、上記例示したプロテアーゼの中でも、メタロプロテアーゼが好ましく、メタロプロテアーゼの中でも、ADAMTS5、MMP-2、MMP-7、MMP-9、MMP-13がより好ましい。
抗体の作製方法
　所望の結合活性を有する抗体を作製する方法は当業者において公知である。以下に、IL-6Rに結合する抗体（抗IL-6R抗体）を作製する方法が例示される。IL-6R以外の抗原に結合する抗体も下記の例示に準じて適宜作製され得る。単ドメイン抗体を作製する場合、免疫動物の違い等はあるが、下記の例示に準じて適宜作製され得る。
　抗IL-6R抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得され得る。抗IL-6R抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好適に作製され得る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞によって産生されるもの等が含まれる。本願中に言及される抗体には、「ヒト化抗体」や「キメラ抗体」が含まれる。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術を使用することによって、例えば以下のように作製され得る。すなわち、IL-6Rタンパク質を感作抗原として使用して、通常の免疫方法にしたがって哺乳動物が免疫される。得られる免疫細胞が通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合される。次に、通常のスクリーニング法によって、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって抗IL-6R抗体を産生するハイブリドーマが選択され得る。
　具体的には、モノクローナル抗体の作製は例えば以下に示すように行われる。まず、IL-6R遺伝子を発現することによって、抗体取得の感作抗原として使用されるIL-6Rタンパク質が取得され得る。すなわち、IL-6Rをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入することによって適当な宿主細胞が形質転換される。当該宿主細胞中または培養上清中から所望のヒトIL-6Rタンパク質が公知の方法で精製される。培養上清中から可溶型のIL-6Rを取得するためには、例えば、Mullbergら（J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968）によって記載されているような可溶型IL-6Rが発現される。また、精製した天然のIL-6Rタンパク質もまた同様に感作抗原として使用され得る。
　哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として当該精製IL-6Rタンパク質が使用できる。IL-6Rの部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。この際、当該部分ペプチドはヒトIL-6Rのアミノ酸配列より化学合成によっても取得され得る。また、IL-6R遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによっても取得され得る。さらにはタンパク質分解酵素を用いてIL-6Rタンパク質を分解することによっても取得され得るが、部分ペプチドとして用いるIL-6Rペプチドの領域および大きさは特に特別の態様に限定されない。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は少なくとも5以上、例えば6以上、或いは7以上であることが好ましい。より具体的には8～50、好ましくは10～30残基のペプチドが感作抗原として使用され得る。
　また、IL-6Rタンパク質の所望の部分ポリペプチドやペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質が感作抗原として利用され得る。感作抗原として使用される融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどが好適に利用され得る。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子がインフレームで融合され、当該融合遺伝子が前記のように発現ベクターに挿入されることにより作製され得る。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed. （Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58（1989）Cold Spring Harbor Lab. press）に記載されている。感作抗原として用いられるIL-6Rの取得方法及びそれを用いた免疫方法は、WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等にも具体的に記載されている。
　当該感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特定の動物に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が好適に使用される。単ドメイン抗体を取得する場合、ラクダ科動物または単ドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物が好適に使用される。
　公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫される。例えば、一般的な方法として、感作抗原が哺乳動物の腹腔内または皮下に投与によって投与されることにより免疫が実施される。具体的には、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈された感作抗原が、所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントと混合され、乳化された後に、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用され得る。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合した該感作抗原ペプチドを免疫することが望ましい場合もある。
　また、所望の抗体を産生するハイブリドーマは、DNA免疫を使用し、以下のようにしても作製され得る。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現され得るような態様で構築されたベクターDNAが投与された当該免疫動物中で、感作抗原が当該免疫動物の生体内で発現されることによって、免疫刺激が与えられる免疫方法である。蛋白質抗原が免疫動物に投与される一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性が期待される。
　－IL-6Rのような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
　－免疫抗原を精製する必要が無い
　DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るために、まず、IL-6Rタンパク質を発現するDNAが免疫動物に投与される。IL-6RをコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成され得る。得られたDNAが適当な発現ベクターに挿入され、免疫動物に投与される。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターが好適に利用され得る。ベクターを生体に投与する方法として、一般的に用いられている方法が利用され得る。たとえば、発現ベクターが吸着した金粒子が、gene gunで免疫動物個体の細胞内に導入されることによってDNA免疫が行われる。さらに、IL-6Rを認識する抗体の作製は国際公開WO 2003/104453に記載された方法を用いても作製され得る。
　このように哺乳動物が免疫され、血清中におけるIL-6Rに結合する抗体力価の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に供される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用され得る。
　前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
　HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択され得る。これらのピリミジンアナログをDNA中に取り込む正常な細胞は死滅する。他方、これらのピリミジンアナログを取り込めないこれらの酵素を欠損した細胞は、選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。
　このようなミエローマ細胞として、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123 (4), 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1（C. Eur. J. Immunol.（1976）6 (7), 511-519）、MPC-11（Cell（1976）8 (3), 405-415）、SP2/0（Nature（1978）276 (5685), 269-270）、FO（J. Immunol. Methods（1980）35 (1-2), 1-21）、S194/5.XX0.BU.1（J. Exp. Med.（1978）148 (1), 313-323）、R210（Nature（1979）277 (5692), 131-133）等が好適に使用され得る。
　基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて、前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
　より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等が使用され、更に融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定され得る。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用され、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液が好適に添加され得る。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温されたPEG溶液（例えば平均分子量1000から6000程度）が通常30から60％（w/v）の濃度で添加される。混合液が緩やかに混合されることによって所望の融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。次いで、上記に挙げた適当な培養液が逐次添加され、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去され得る。
　このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択され得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、係る十分な時間は数日から数週間である）上記HAT培養液を用いた培養が継続され得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施される。
　このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択され得る。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択され得る。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選択的に増殖し得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、所望のハイブリドーマが選択され得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施され得る。
　所望の抗体のスクリーニングおよび単一クローニングが、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施され得る。例えば、IL-6Rに結合するモノクローナル抗体は、細胞表面に発現したIL-6Rに結合することができる。このようなモノクローナル抗体は、たとえば、FACS（fluorescence activated cell sorting）によってスクリーニングされ得る。FACSは、蛍光抗体と接触させた細胞をレーザー光で解析し、個々の細胞が発する蛍光を測定することによって細胞表面に対する抗体の結合を測定することを可能にするシステムである。
　FACSによって本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングするためには、まずIL-6Rを発現する細胞を調製する。スクリーニングのための好ましい細胞は、IL-6Rを強制発現させた哺乳動物細胞である。宿主細胞として使用した形質転換されていない哺乳動物細胞を対照として用いることによって、細胞表面のIL-6Rに対する抗体の結合活性が選択的に検出され得る。すなわち、宿主細胞に結合せず、IL-6R強制発現細胞に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって、IL-6Rモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが取得され得る。
　あるいは固定化したIL-6R発現細胞に対する抗体の結合活性がELISAの原理に基づいて評価され得る。たとえば、ELISAプレートのウェルにIL-6R発現細胞が固定化される。ハイブリドーマの培養上清をウェル内の固定化細胞に接触させ、固定化細胞に結合する抗体が検出される。モノクローナル抗体がマウス由来の場合、細胞に結合した抗体は、抗マウスイムノグロブリン抗体によって検出され得る。これらのスクリーニングによって選択された、抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等によりクローニングされ得る。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中で継代培養され得る。また、該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存され得る。
　当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から所望のモノクローナル抗体が取得され得る。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖せしめ、その腹水からモノクローナル抗体が取得され得る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに好適なものである。
　当該ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされる抗体遺伝子によってコードされる抗体も好適に利用され得る。クローニングした抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、当該遺伝子によってコードされる抗体が発現する。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は例えば、Vandammeらによって既に確立されている（Eur.J. Biochem.（1990）192 (3), 767-775）。下記に述べるように組換え抗体の製造方法もまた公知である。
　たとえば、抗IL-6R抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗IL-6R抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAが取得される。そのために、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
－グアニジン超遠心法（Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299）
－AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159）
　抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製され得る。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit （GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからmRNAが取得され得る。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAが合成され得る。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によって合成され得る。また、cDNAの合成および増幅のために、SMART RACE cDNA 増幅キット（Clontech製）およびPCRを用いた5’-RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002、Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932）が適宜利用され得る。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入され得る。
　得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製され得る。そして、該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認される。
　可変領域をコードする遺伝子を取得するためには、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使った5’-RACE法を利用するのが簡便である。まずハイブリドーマ細胞より抽出されたRNAを鋳型としてcDNAが合成され、5’-RACE cDNAライブラリが得られる。5’-RACE cDNAライブラリの合成にはSMART RACE cDNA 増幅キットなど市販のキットが適宜用いられる。
　得られた5’-RACE cDNAライブラリを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。公知の抗体遺伝子配列をもとにマウス抗体遺伝子増幅用のプライマーがデザインされ得る。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列である。したがって、サブクラスは予めIso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス）などの市販キットを用いて決定しておくことが望ましい。
　具体的には、たとえばマウスIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１、γ2a、γ2b、γ3、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーが利用され得る。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーには可変領域に近い定常領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、5’ RACE cDNAライブラリ作製キットに付属するプライマーが利用される。
　こうして増幅されたPCR産物を利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンが再構成され得る。再構成されたイムノグロブリンの、IL-6Rに対する結合活性を指標として、所望の抗体がスクリーニングされ得る。たとえばIL-6Rに対する抗体の取得を目的とするとき、抗体のIL-6Rに対する結合は、特異的であることがさらに好ましい。IL-6Rに結合する抗体は、たとえば次のようにしてスクリーニングされ得る；
（１）ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をIL-6R発現細胞に接触させる工程、
（２）IL-6R発現細胞と抗体との結合を検出する工程、および
（３）IL-6R発現細胞に結合する抗体を選択する工程。
　抗体（単ドメイン抗体を含む）とIL-6R発現細胞との結合を検出する方法は公知である。具体的には、先に述べたFACSなどの手法によって、抗体とIL-6R発現細胞との結合が検出され得る。抗体の結合活性を評価するためにIL-6R発現細胞の固定標本が適宜利用され得る。
　結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法も好適に用いられる。単ドメイン抗体をスクリーニングする場合でも、下記例示に準じて適宜スクリーニングされ得る。
　ポリクローナルな抗体発現細胞群より抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv（scFv）を形成することができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入することにより、scFvを表面に発現するファージが取得され得る。このファージと所望の抗原との接触の後に、抗原に結合したファージを回収することによって、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAが回収され得る。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、所望の結合活性を有するscFvが濃縮され得る。
　目的とする抗IL-6R抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化する。更に１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素の挿入が好ましい。上記のように消化された抗IL-6R抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターが取得され得る。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とがインフレームで融合されれば、キメラ抗体が取得される。ここで、キメラ抗体とは、定常領域と可変領域の由来が異なることをいう。したがって、マウス－ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト－ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入することによって、キメラ抗体発現ベクターが構築され得る。具体的には、たとえば、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを保持した発現ベクターの5’側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列が適宜配置され得る。同じ組み合わせの制限酵素で消化された両者がインフレームで融合されることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。
　抗IL-6Rモノクローナル抗体を製造するために、抗体遺伝子が発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込まれる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。また、発現した抗体が細胞外に分泌されるように、適切なシグナル配列がアミノ末端に付加され得る。例えば、シグナル配列として、アミノ酸配列MGWSCIILFLVATATGVHS（配列番号：１）を有するペプチドが使用され得るが、これ以外にも適したシグナル配列が付加される。発現されたポリペプチドは上記配列のカルボキシル末端部分で切断され、切断されたポリペプチドが成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。次いで、この発現ベクターによって適当な宿主細胞が形質転換されることによって、抗IL-6R抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞が取得され得る。
リガンド結合分子
　本発明のリガンド結合分子の一側面は、リガンド結合分子中に含まれる単ドメイン抗体でリガンドに結合可能な分子、特に未切断の状態においてリガンドに結合可能な分子である。ここの「結合」は通常、静電力、ファンデルワールス力、水素結合等の非共有結合を主とした相互作用による結合をいう。本発明のリガンド結合分子のリガンド結合態様の好適な例として、それだけに限定されないが、例えば、抗原結合領域、抗原結合分子、抗体、および抗体断片等が抗原に結合するような抗原抗体反応が挙げられる。
　なおリガンドに結合可能とは、リガンド結合分子とリガンドがたとえ別分子であっても、リガンド結合分子はリガンドに結合可能であることを意味し、共有結合によりリガンド結合分子とリガンドを繋ぐことを意味しない。例えばリガンドとリガンド結合分子がリンカーを介して共有結合されていることをもって、リガンドに結合可能とは言わない。またリガンドとの結合が減弱されるとは、前記結合可能である能力が減弱されることを言う。例えばリガンドとリガンド結合分子がリンカーを介して共有結合されている場合に、そのリンカーが切断されることをもってリガンドとの結合が減弱されるとはみなせない。なお本発明においては、リガンド結合分子がリガンドに結合可能である限り、リガンド結合分子はリンカー等を介してリガンドとつながっていてもよい。
　本発明のリガンド結合分子は、未切断の状態で分子中に含まれる単ドメイン抗体でリガンドに結合することのみで制限され、未切断の状態で分子中に含まれる単ドメイン抗体で目的とするリガンドに結合できる限りどのような構造の分子も使用され得る。
　本発明のリガンド結合分子の一側面は、切断サイトを含むポリペプチドである。切断サイトは、例えば酵素によって切断することが出来るか、また還元剤によって還元することが出来るか、または光分解することが出来る。切断サイトは、切断されることによってリガンド結合分子のリガンドへの結合を減弱できる限り、ポリペプチド中のどの位置に配置されても良い。また、ポリペプチド中に含まれる切断サイトは、一つであっても複数であっても良い。
　また、本発明のリガンド結合分子は、未切断状態と比べて、切断された状態でのリガンド結合が弱い（即ち、減弱されている）。より詳細的には、本発明のリガンド結合分子中の単ドメイン抗体のリガンドに対する結合は、リガンド結合分子未切断状態より、リガンド結合分子が切断された状態でより弱い（すなわち、減弱されている）。リガンド結合の減弱はリガンド結合分子のリガンド結合活性により評価され得る。
リガンドに対する結合活性の評価
　リガンド結合分子のリガンドに対する結合活性の評価は、FACS、ELISAフォーマット、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法、BLI（Bio-Layer Interferometry）法（Octet）等、周知の方法によって確認することができる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
　ALPHAスクリーンは、ドナーとアクセプターの2つのビーズを使用するALPHAテクノロジーによって下記の原理に基づいて実施される。ドナービーズに結合した分子が、アクセプタービーズに結合した分子と相互作用し、2つのビーズが近接した状態の時にのみ、発光シグナルが検出される。レーザーによって励起されたドナービーズ内のフォトセンシタイザーは、周辺の酸素を励起状態の一重項酸素に変換する。一重項酸素はドナービーズ周辺に拡散し、近接しているアクセプタービーズに到達するとビーズ内の化学発光反応を引き起こし、最終的に光が放出される。ドナービーズに結合した分子とアクセプタービーズに結合した分子が相互作用しないときは、ドナービーズの産生する一重項酸素がアクセプタービーズに到達しないため、化学発光反応は起きない。
　例えば、ドナービーズにビオチン標識されたリガンド結合分子が結合され、アクセプタービーズにはグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）でタグ化されたリガンドが結合される。競合するタグ化されていないリガンド結合分子の非存在下では、リガンド結合分子とリガンドは相互作用し520-620 nmのシグナルを生ずる。タグ化されていないリガンド結合分子は、タグ化されたリガンド結合分子とリガンド間の相互作用と競合する。競合の結果表れる蛍光の減少を定量することによって相対的な結合親和性が決定され得る。抗体等のリガンド結合分子をSulfo-NHS-ビオチン等を用いてビオチン化することは公知である。リガンドをGSTでタグ化する方法としては、リガンドをコードするポリヌクレオチドとGSTをコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合した融合遺伝子を発現可能なベクターを保持した細胞等においてGST融合リガンドを発現し、グルタチオンカラムを用いて精製する方法等が適宜採用され得る。得られたシグナルは例えばGRAPHPAD PRISM（GraphPad社、San Diego）等のソフトウェアを用いて非線形回帰解析を利用する一部位競合（one-site competition）モデルに適合させることにより好適に解析される。
　相互作用を観察する物質の一方（リガンド）をセンサーチップの金薄膜上に固定し、センサーチップの裏側から金薄膜とガラスの境界面で全反射するように光を当てると、反射光の一部に反射強度が低下した部分（SPRシグナル）が形成される。相互作用を観察する物質の他方（アナライト）をセンサーチップの表面に流しリガンドとアナライトが結合すると、固定化されているリガンド分子の質量が増加し、センサーチップ表面の溶媒の屈折率が変化する。この屈折率の変化により、SPRシグナルの位置がシフトする（逆に結合が解離するとシグナルの位置は戻る）。Biacoreシステムは上記のシフトする量、すなわちセンサーチップ表面での質量変化を縦軸にとり、質量の時間変化を測定データとして表示する（センサーグラム）。センサーグラムのカーブからカイネティクス：結合速度定数（ka）と解離速度定数(kd）が、当該定数の比から解離定数（KD）が求められる。BIACORE法では阻害測定法や平衡値解析法も好適に用いられる。阻害測定法の例はProc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010において、平衡値解析法の例はMethods Enzymol. 2000;323:325-40.において記載されている。
　リガンド結合分子がリガンドと結合する機能が減弱されているとは、例えば、上記の測定方法に基づいて、被験リガンド結合分子あたりのリガンド結合量が、対照のリガンド結合分子に比較して、50％以下、好ましくは45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、20％以下、15％以下、特に好ましくは10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下の結合量を示すことをいう。結合活性の指標は適宜所望の指標を用いてよいが、例えば解離定数（KD）を用いてよい。結合活性の評価指標として解離定数（KD）を用いる場合、被験リガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）が、対照のリガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）に比較して大きいことが、被験リガンド結合分子のリガンドに対する結合活性が対照のリガンド結合分子に比較して弱いことを示す。リガンドと結合する機能が減弱されているとは、例えば、被験リガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）が、対照のリガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）に比較して、2倍以上、好ましくは５倍以上、１０倍以上、特に好ましくは１００倍以上であることをいう。
　対照のリガンド結合分子としては、例えば、未切断型のリガンド結合分子が挙げられる。
　本発明の一実施態様において、本発明のリガンド結合分子は、切断サイトが切断されることにより、リガンド結合分子からリガンドが遊離する。ここで、リガンドがリンカーを介してリガンド結合分子の一部分と融合しており、該リンカーに切断サイトがない場合は、リガンドは、リガンド結合分子の該一部分とリンカーを介してつながったまま遊離することになる（例えば図２、図４を参照）。このように、リガンドがリガンド結合分子の一部と共に遊離する場合であっても、リガンドとの安定な相互作用が出来なくなったリガンド結合分子の一部がある限り、リガンド結合分子からリガンドが遊離したと言える。
　リガンド結合分子からリガンドが切断サイトの切断により遊離することを検出する方法として、リガンドを認識するリガンド検出用抗体等でリガンドを検出する方法がある。リガンド結合分子が抗体断片である場合、リガンド検出用抗体はリガンド結合分子と同様なエピトープに結合することが好ましい。リガンド検出用抗体を用いるリガンドの検出は、FACS、ELISAフォーマット、ALPHAスクリーン(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)や表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したBIACORE法、BLI（Bio-Layer Interferometry）法（Octet）等、周知の方法によって確認することができる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010)。
　例えば、Octetを用いてリガンドの遊離を検出する場合、リガンドを認識するリガンド検出用抗体をビオチン化し、バイオセンサーと接触させたのちに、サンプル中のリガンドに対する結合を測定することで、リガンドの遊離を検出することができる。具体的には、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後のリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ処理前後のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。また、プロテアーゼとリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないでリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ有無のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。より具体的に、本願実施例中の方法によりリガンドの遊離を検出できる。リガンド結合分子がリガンドと融合され融合タンパク質を形成している場合、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後の融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ処理前後のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。また、プロテアーゼと融合タンパク質が含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないで融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンド検出抗体を用いてリガンドの量を測定し、プロテアーゼ有無のサンプル中のリガンド検出量を比較することでリガンドの遊離を検出することができる。より具体的に、本願実施例中の方法によりリガンドの遊離を検出できる。
　また、リガンド結合分子と結合するときにリガンドの生物活性が阻害される実施態様において、リガンド結合分子から遊離することを検出する方法として、サンプル中のリガンドの生物活性を測定することによりリガンドの遊離を検出できる。具体的には、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後のリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプルに対して、リガンドの生物活性を測定し比較することによりリガンドの遊離を検出できる。また、プロテアーゼとリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないでリガンド結合分子とリガンドが含まれるサンプル対して、リガンドの生物活性を測定し比較することによりリガンドの遊離を検出できる。リガンド結合分子がリガンドと融合され融合タンパク質を形成している場合、プロテアーゼ処理前またはプロテアーゼ処理後の融合タンパク質が含まれるサンプルに対して、リガンドの生物活性を測定し比較することによりリガンドの遊離を検出できる。また、プロテアーゼと融合タンパク質が含まれるサンプル及び、プロテアーゼを含まないで融合タンパク質が含まれるサンプル対して、リガンドの生物活性を測定し比較することによりリガンドの遊離を検出できる。
　本発明の一実施態様において、切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含み、プロテアーゼによって切断される。
プロテアーゼ切断配列
　プロテアーゼ切断配列は、水溶液中でポリペプチドが標的組織特異的プロテアーゼによって加水分解を受ける際に、該標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に認識される特定のアミノ酸配列である。
　プロテアーゼ切断配列は、副作用低減の点から、治療対象の標的組織／細胞においてより特異的に発現している、もしくは治療対象の標的組織／細胞においてより特異的に活性化されている標的組織特異的プロテアーゼにより、高い特異性で加水分解されるアミノ酸配列であることが好ましい。
　具体的なプロテアーゼ切断配列としては、例えば、国際公開WO２０１３／１２８１９４号、国際公開WO２０１０／０８１１７３号、国際公開WO２００９／０２５８４６号等で開示されている上記で例示した癌組織に特異的に発現するプロテアーゼ、炎症組織特異的プロテアーゼ等によって特異的に加水分解される標的配列が挙げられる。既知のプロテアーゼによって特異的に加水分解される標的配列に、適宜アミノ酸変異を導入する等、人工的に改変した配列も使用できる。また、プロテアーゼ切断配列は、Nature Biotechnology 19, 661 - 667 (2001)に記載のような当業者公知の方法で同定したものを用いてもよい。
　更に、天然に存在するプロテアーゼ切断配列を用いても良い。例えば、TGFβがプロテアーゼの切断を受けることで潜在型に変化するような、プロテアーゼの切断を受けることで分子形が変わるタンパク質中のプロテアーゼ切断を受ける配列を使用することもできる。
　プロテアーゼ切断配列の例として、それだけに限定されないが、国際公開WO2015／116933号、国際公開WO2015／048329号、国際公開WO2016／118629号、国際公開WO2016／179257号、国際公開WO2016／179285号、国際公開WO2016／179335号、国際公開WO2016／179003号、国際公開WO2016／046778号、国際公開WO2016／014974号、米国特許公開US2016／0289324号、米国特許公開US2016／0311903号、PNAS (2000) 97: 7754-7759.、Biochemical Journal (2010) 426: 219-228.、Beilstein J Nanotechnol. (2016) 7: 364-373.中で示された配列を用いることができる。
　プロテアーゼ切断配列は、上述のように、好適な標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に加水分解されるアミノ酸配列であることがより好ましい。標的組織特異的プロテアーゼにより特異的に加水分解されるアミノ酸配列の中でも、以下のアミノ酸配列が好ましい。
　LSGRSDNH（配列番号：２、MT-SP1、uPAにより切断可能）
　PLGLAG（配列番号：３、MMP-2、MMP-9により切断可能）
　VPLSLTMG（配列番号：４、MMP-7により切断可能）
　プロテアーゼ切断配列として、以下の配列を用いることもできる。
　TSTSGRSANPRG（配列番号：５、MT-SP1、uPAにより切断可能）
　ISSGLLSGRSDNH（配列番号：６、MT-SP1、uPAにより切断可能）
　AVGLLAPPGGLSGRSDNH（配列番号：７、MT-SP1、uPAにより切断可能）
　GAGVPMSMRGGAG（配列番号：８、MMP-1により切断可能）
　GAGIPVSLRSGAG（配列番号：９、MMP-2により切断可能）
　GPLGIAGQ（配列番号：１０、MMP-2により切断可能）
　GGPLGMLSQS（配列番号：１１、MMP-2により切断可能）
　PLGLWA（配列番号：１２、MMP-2により切断可能）
　GAGRPFSMIMGAG（配列番号：１３、MMP-3により切断可能） 
　GAGVPLSLTMGAG（配列番号：１４、MMP-7により切断可能）
　GAGVPLSLYSGAG（配列番号：１５、MMP-9により切断可能）
　AANLRN（配列番号：１６、MMP-11により切断可能）
　AQAYVK（配列番号：１７、MMP-11により切断可能）
　AANYMR（配列番号：１８、MMP-11により切断可能）
　AAALTR（配列番号：１９、MMP-11により切断可能）
　AQNLMR（配列番号：２０、MMP-11により切断可能）
　AANYTK（配列番号：２１、MMP-11により切断可能）
　GAGPQGLAGQRGIVAG（配列番号：２２、MMP-13により切断可能）
　PRFKIIGG（配列番号：２３、pro-ウロキナーゼにより切断可能）
　PRFRIIGG（配列番号：２４、pro-ウロキナーゼにより切断可能）
　GAGSGRSAG（配列番号：２５、uPAにより切断可能）
　SGRSA（配列番号：２６、uPAにより切断可能）
　GSGRSA（配列番号：２７、uPAにより切断可能）
　SGKSA（配列番号：２８、uPAにより切断可能）
　SGRSS（配列番号：２９、uPAにより切断可能）
　SGRRA（配列番号：３０、uPAにより切断可能）
　SGRNA（配列番号：３１、uPAにより切断可能）
　SGRKA（配列番号：３２、uPAにより切断可能）
　QRGRSA（配列番号：３３、tPAにより切断可能）
　GAGSLLKSRMVPNFNAG（配列番号：３４、カテプシンＢにより切断可能）
　TQGAAA（配列番号：３５、カテプシンＢにより切断可能）
　GAAAAA（配列番号：３６、カテプシンＢにより切断可能）
　GAGAAG（配列番号：３７、カテプシンＢにより切断可能）
　AAAAAG（配列番号：３８、カテプシンＢにより切断可能）
　LCGAAI（配列番号：３９、カテプシンＢにより切断可能）
　FAQALG（配列番号：４０、カテプシンＢにより切断可能）
　LLQANP（配列番号：４１、カテプシンＢにより切断可能）
　LAAANP（配列番号：４２、カテプシンＢにより切断可能）
　LYGAQF（配列番号：４３、カテプシンＢにより切断可能）
　LSQAQG（配列番号：４４、カテプシンＢにより切断可能）
　ASAASG（配列番号：４５、カテプシンＢにより切断可能）
　FLGASL（配列番号：４６、カテプシンＢにより切断可能）
　AYGATG（配列番号：４７、カテプシンＢにより切断可能）
　LAQATG（配列番号：４８、カテプシンＢにより切断可能）
　GAGSGVVIATVIVITAG（配列番号：４９、カテプシンＬにより切断可能）
　APMAEGGG（配列番号：５０、メプリンα、メプリンβにより切断可能）
　EAQGDKII（配列番号：５１、メプリンα、メプリンβにより切断可能）
　LAFSDAGP（配列番号：５２、メプリンα、メプリンβにより切断可能）
　YVADAPK（配列番号：５３、メプリンα、メプリンβにより切断可能）
　RRRRR（配列番号：５４、フーリンにより切断可能）
　RRRRRR（配列番号：５５、フーリンにより切断可能）
　GQSSRHRRAL（配列番号：５６、フーリンにより切断可能）
　SSRHRRALD（配列番号：５７）
　RKSSIIIRMRDVVL（配列番号：５８、プラスミノーゲン（Plasminogen）により切断可能）
　SSSFDKGKYKKGDDA（配列番号：５９、Staphylokinaseにより切断可能）
　SSSFDKGKYKRGDDA（配列番号：６０、Staphylokinaseにより切断可能）
　IEGR（配列番号：６１、FactorIXaにより切断可能）
　IDGR（配列番号：６２、FactorIXaにより切断可能）
　GGSIDGR（配列番号：６３、FactorIXaにより切断可能）
　GPQGIAGQ（配列番号：６４、Collagenaseにより切断可能）
　GPQGLLGA（配列番号：６５、Collagenaseにより切断可能）
　GIAGQ（配列番号：６６、Collagenaseにより切断可能）
　GPLGIAG（配列番号：６７、Collagenaseにより切断可能）
　GPEGLRVG（配列番号：６８、Collagenaseにより切断可能）
　YGAGLGVV（配列番号：６９、Collagenaseにより切断可能）
　AGLGVVER（配列番号：７０、Collagenaseにより切断可能）
　AGLGISST（配列番号：７１、Collagenaseにより切断可能）
　EPQALAMS（配列番号：７２、Collagenaseにより切断可能）
　QALAMSAI（配列番号：７３、Collagenaseにより切断可能）
　AAYHLVSQ（配列番号：７４、Collagenaseにより切断可能）
　MDAFLESS（配列番号：７５、Collagenaseにより切断可能）
　ESLPVVAV（配列番号：７６、Collagenaseにより切断可能）
　SAPAVESE（配列番号：７７、Collagenaseにより切断可能）
　DVAQFVLT（配列番号：７８、Collagenaseにより切断可能）
　VAQFVLTE（配列番号：７９、Collagenaseにより切断可能）
　AQFVLTEG（配列番号：８０、Collagenaseにより切断可能）
　PVQPIGPQ（配列番号：８１、Collagenaseにより切断可能）
　LVPRGS（配列番号：８２、Thrombinにより切断可能）　
　TSGSGRSANARG（配列番号：１７０、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　TSQSGRSANQRG（配列番号：１７１、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　TSPSGRSAYPRG（配列番号：１７２、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　TSGSGRSATPRG（配列番号：１７３、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　TSQSGRSATPRG（配列番号：１７４、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　TSASGRSATPRG（配列番号：１７５、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　TSYSGRSAVPRG（配列番号：１７６、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　TSYSGRSANFRG（配列番号：１７７、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　TSSSGRSATPRG（配列番号：１７８、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　TSTTGRSASPRG（配列番号：１７９、uPA及びMT-SP1により切断可能）
　プロテアーゼ切断配列として、表１で示す配列を用いることもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７８８）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７８９）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７９０）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７９１）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７９２）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７９３）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７９４）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７９５）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７９６）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である；X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である；X3はGである；X4はRである；Ｘ5はＳである；X6はAである；X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である；X8はH, VおよびＹから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：７９７）
　中で、X1からX8はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はYである；X2はSおよびＴから選択されるアミノ酸である；X3はGである；Ｘ４はRである；X5はSである；X6はＡおよびEから選択されるアミノ酸である；X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：７９８）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：７９９）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８００）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８０１）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８０２）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８０３）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８０４）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８０５）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８０６）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である；X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である；X3はGである；X4はRである；Ｘ5はＳである；X6はAである；X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である；X8はH, VおよびＹから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８０７）
　中で、X1からX9はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X1はYである；X2はSおよびＴから選択されるアミノ酸である；X3はGである；Ｘ４はRである；X5はSである；X6はＡおよびEから選択されるアミノ酸である；X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８０８）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８０９）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８１０）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８１１）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８１２）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８１３）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８１４）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８１５）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８１６）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である；X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である；X3はGである；X4はRである；Ｘ5はＳである；X6はAである；X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である；X8はH, VおよびＹから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8（配列番号：８１７）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1はYである；X2はSおよびＴから選択されるアミノ酸である；X3はGである；Ｘ４はRである；X5はSである；X6はＡおよびEから選択されるアミノ酸である；X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である；X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８１８）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８１９）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, E ,F ,G, H, K, M, N, P, Q, W および Yから選択されるアミノ酸をである；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８２０）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, F, L, M, P, Q, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８２１）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８２２）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８２３）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は E, F, K, M, N, P, Q, R, SおよびW から選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８２４）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, F ,G, L, M, P, Q, VおよびWから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８２５）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1 は A, D, E ,F ,G, H, I, K, M, N, P, Q, S, T, W および Yから選択されるアミノ酸である；X2 は A, D, E ,F, H, K, L, M, P, Q, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X3 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X4 はRである；X5 はA, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X6 は A, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X7 は A, D, E, F ,G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W および Yから選択されるアミノ酸である；X8 は A, D, E, F ,G, I, K, N, TおよびWから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８２６）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1はA, G, I, P, Q, SおよびYから選択されるアミノ酸である；X2はKもしくはTから選択されるアミノ酸である；X3はGである；X4はRである；Ｘ5はＳである；X6はAである；X7はH, IおよびVから選択されるアミノ酸である；X8はH, VおよびＹから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　プロテアーゼ切断配列として以下で示すものを用いることもできる：
　X10-X11-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9（配列番号：８２７）
　中で、X1からX11はそれぞれ一つのアミノ酸を表し、X10 は I, Tおよび Yから選択されるアミノ酸である；X11 は Sである；X1はYである；X2はSおよびＴから選択されるアミノ酸である；X3はGである；Ｘ４はRである；X5はSである；X6はＡおよびEから選択されるアミノ酸である；X7はNおよびVから選択されるアミノ酸である；X8はH, P, VおよびYから選択されるアミノ酸である；X9はA, G, H, I, LおよびRから選択されるアミノ酸である。
　上記プロテアーゼ切断配列を使用する以外に、プロテアーゼ切断配列を新たにスクリーニングにより取得しても良い。例えば、既知のプロテアーゼ切断配列の結晶構造解析の結果から、切断配列と酵素の活性残基・認識残基の相互作用を変えて、新たなプロテアーゼ切断配列を探索できる。また、既知のプロテアーゼ切断配列中のアミノ酸に改変を加え、プロテアーゼとの相互作用を確認することにより新たなプロテアーゼ切断配列を探索できる。別の例として、ペプチドライブラリをファージディスプレイ、リボソームディスプレイ等のin vitroディスプレイ法を用いてディスプレイし、またはチップあるいはビーズに固定したペプチドアレイを用いてプロテアーゼとの相互作用を確認することにより、プロテアーゼで切断される配列を探索できる。
　プロテアーゼ切断配列とプロテアーゼの相互作用を確認する方法として、in vitroもしくはin vivoでのプロテアーゼ切断を確認することにより行うことができる。
　たとえば、表1に例示したプロテアーゼ切断配列を含むポリペプチドは、いずれもプロテアーゼの作用によって加水分解されるプロテアーゼ基質として有用である。配列番号：７８８～８２７に示すプロテアーゼ基質及び表１のプロテアーゼ基質は、たとえばリガンド結合分子への組み込みに当たって、目的に応じた性状を備えたものを選択するためのライブラリとして活用することができる。具体的には、リガンド結合分子を病巣に局在するプロテアーゼによって選択的に切断するために、そのプロテアーゼ感受性を評価することができる。リガンドと結合させたリガンド結合分子は、生体に投与された後に、様々なプロテアーゼとの接触を経て、病巣に到達する可能性が有る。したがって、病巣に局在するプロテアーゼには感受性を持ちながら、それ以外のプロテアーゼにはできるだけ高い耐性を持つことが望ましい。目的に応じて、望ましいプロテアーゼ切断配列を選ぶために、予め、各プロテアーゼ基質について、種々のプロテアーゼによる感受性を網羅的に解析すれば、プロテアーゼ耐性を知ることができる。得られたプロテアーゼ耐性スペクトルに基づいて、必要な感受性と耐性を備えたプロテアーゼ切断配列を見出すことができる。
　あるいは、プロテアーゼ切断配列を組み込まれたリガンド結合分子は、プロテアーゼによる酵素的な作用のみならず、ｐＨの変化、温度、酸化還元ストレス等の様々な環境負荷を経て病巣に到達する。このような外部要因に対しても、各プロテアーゼ基質の耐性を比較した情報に基づいて、目的に応じた望ましい性状を備えたプロテアーゼ切断配列を選択することもできる。
　本発明の一実施態様において、プロテアーゼ切断配列のどちらか一端または両端に、可動リンカーを更に付加している。プロテアーゼ切断配列の一端の可動リンカーを第一可動リンカーと呼称することが出来、他端の可動リンカーを第二可動リンカーと呼称することが出来る。特定の実施形態では、プロテアーゼ切断配列と可動リンカーは以下の式のうちの一つを含む。
　　　（プロテアーゼ切断配列）
　　　（第一可動リンカー）-（プロテアーゼ切断配列）
　　　（プロテアーゼ切断配列）-（第二可動リンカー）
　　　（第一可動リンカー）-（プロテアーゼ切断配列）-（第二可動リンカー）
　本実施態様における可動リンカーはペプチドリンカーが好ましい。第一可動リンカーと第二可動リンカーは、それぞれ独立かつ任意的に存在し、少なくとも１つのフレキシブルアミノ酸（Ｇｌｙなど）を含む同一または異なる可動リンカーである。例えば、プロテアーゼ切断配列が所望のプロテアーゼアクセス性を得られるほどの十分な数の残基（Arg、Ile、Gln、Glu、Cys、Tyr、Trp、Thr、Val、His、Phe、Pro、Met、Lys、Gly、Ser、Asp、Asn、Alaなどから任意に選択されるアミノ酸、特にGly、Ser、Asp、Asn、Ala、ことさらGlyおよびSer、特にGlyなど）が含まれる。
　プロテアーゼ切断配列の両端で使用するのに適した可動リンカーは通常、プロテアーゼ切断配列へのプロテアーゼのアクセスを向上し、プロテアーゼの切断効率を上昇させるものである。好適な可動リンカーは容易に選択可能であり、１アミノ酸（Ｇｌｙなど）から２０アミノ酸、２アミノ酸から１５アミノ酸あるいは、４アミノ酸から１０アミノ酸、５アミノ酸から９アミノ酸、６アミノ酸から８アミノ酸または７アミノ酸から８アミノ酸をはじめとして３アミノ酸から１２アミノ酸など、異なる長さのうちからの好適なものを選択できる。本発明のいくつかの実施態様においては、可動リンカーは１から７アミノ酸のペプチドリンカーである。
　可動リンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン－セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ：配列番号：９２）ｎおよび（ＧＧＧＳ：配列番号：８３）ｎを含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、従来技術において周知の他の可動リンカーが挙げられる。
　このうちグリシンおよびグリシン－セリンポリマーが注目されているが、これらのアミノ酸が比較的構造化されておらず、成分間の中性テザーとして機能しやすいことがその理由である。
　グリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーの例として、それだけに限定されないが、例えば、
　Ser
　Gly・Ser（GS）
　Ser・Gly（SG）
　Gly・Gly・Ser（GGS）
　Gly・Ser・Gly（GSG）
　Ser・Gly・Gly（SGG）
　Gly・Ser・Ser（GSS）
　Ser・Ser・Gly（SSG）
　Ser・Gly・Ser（SGS）
　Gly・Gly・Gly・Ser（GGGS、配列番号：８３）
　Gly・Gly・Ser・Gly（GGSG、配列番号：８４）
　Gly・Ser・Gly・Gly（GSGG、配列番号：８５）
　Ser・Gly・Gly・Gly（SGGG、配列番号：８６）
　Gly・Ser・Ser・Gly（GSSG、配列番号：８７）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS、配列番号：８８）
　Gly・Gly・Gly・Ser・Gly（GGGSG、配列番号：８９）
　Gly・Gly・Ser・Gly・Gly（GGSGG、配列番号：９０）
　Gly・Ser・Gly・Gly・Gly（GSGGG、配列番号：９１）
　Gly・Ser・Gly・Gly・Ser（GSGGS、配列番号：９２）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG、配列番号：９３）
　Gly・Ser・Ser・Gly・Gly（GSSGG、配列番号：９４）
　Gly・Ser・Gly・Ser・Gly（GSGSG、配列番号：９５）
　Ser・Gly・Gly・Ser・Gly（SGGSG、配列番号：９６）
　Gly・Ser・Ser・Ser・Gly（GSSSG、配列番号：９７）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGS、配列番号：９８）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGG、配列番号：９９）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGGS、配列番号：１００）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGGG、配列番号：１０１）
　(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS、配列番号：８８）)n
　(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG、配列番号：９３）)n
［nは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子中の切断サイト／プロテアーゼ切断配列が切断されることで、リガンド結合分子中の単ドメイン抗体が分断され、リガンドへの結合が減弱される。
　本発明の一実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列はリガンド結合分子中の単ドメイン抗体内に導入される。いくつかのより具体的な実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は単ドメイン抗体中のループ構造を形成している残基及びループ構造に近い残基の位置に導入される。単ドメイン抗体中のループ構造とは、単ドメイン抗体の中で、α－へリックス、β－シート等の二次的構造を形成しない部分を言う。
　単ドメイン抗体がVHHまたは単ドメインVH抗体である実施態様において、ループ構造を形成している残基及びループ構造に近い残基の位置は、具体的に：単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、１２番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、３１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３５ｂ番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６５番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０２番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの範囲を指すことが出来る。
　単ドメイン抗体がVHHまたは単ドメインVH抗体である実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される：
　単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１２番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３５ｂ番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６５番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
　単ドメイン抗体が単ドメインVL抗体である実施態様において、ループ構造を形成している残基及びループ構造に近い残基の位置は、具体的に：単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、２４番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３４番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から５６番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９７番アミノ酸（Kabatナンバリング）まで、９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの範囲を指すことができる。
　単ドメイン抗体が単ドメインVL抗体である実施態様において、切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される：
　単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体２４番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３４番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から５６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
　切断サイト／プロテアーゼ切断配列は、リガンド結合分子中に複数設けられることが出来、例えば、リガンド結合分子中の単ドメイン抗体内の複数個所に設けることが出来る。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンドは未切断のリガンド結合分子と結合することでその生物活性が阻害される。リガンドの生物活性が阻害される実施態様は限定されないが、その例として、例えば、未切断のリガンド結合分子とリガンドの結合は、リガンドとその結合パートナーの結合を実質的または有意的に妨害または競合する実施態様が挙げられる。リガンド結合分子としてリガンド中和活性を有する抗体またはその断片を使用する場合、リガンドと結合したリガンド結合分子がその中和活性を発揮することでリガンドの生物活性が阻害されることが可能である。
　本発明の一実施態様において、未切断のリガンド結合分子は、リガンドと結合することによりリガンドの生物活性を十分に中和できることが好ましい。即ち、未切断のリガンド結合分子と結合しているリガンドの生物活性が、未切断のリガンド結合分子と結合していないリガンドの生物活性より低いことが好ましい。これに限定されるものではないが、例えば未切断のリガンド結合分子と結合しているリガンドの生物活性が、未切断のリガンド結合分子と結合していないリガンドの生物活性に比較して、90％以下、好ましくは80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、特に好ましくは20％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下であってよい。リガンドの生物活性を十分に中和することにより、リガンド結合分子を投与した場合、標的組織に到達前にリガンドが生物活性を発揮してしまうことを防ぐことが期待できる。
　また本発明の一実施態様において、切断されたリガンド結合分子のリガンドに対する結合活性は、リガンドに対する生体内の天然の結合パートナー（例えばリガンドに対する天然の受容体）のリガンドに対する結合活性よりも低いことが好ましい。これに限定されるものではないが、例えば切断されたリガンド結合分子とリガンドの結合活性は、生体内における天然の結合パートナーとリガンドの結合量（単位結合パートナーあたり）に比較して、90％以下、好ましくは80％以下、70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、特に好ましくは20％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、または1％以下の結合量を示す。結合活性の指標は適宜所望の指標を用いてよいが、例えば解離定数（ＫＤ）を用いてよい。結合活性の評価指標として解離定数（KD）を用いる場合、切断されたリガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）が、生体内における天然の結合パートナーのリガンドに対する解離定数（KD）に比較して大きいことが、切断されたリガンド結合分子のリガンドに対する結合活性が生体内における天然の結合パートナーに比較して弱いことを示す。切断されたリガンド結合分子のリガンドに対する解離定数（KD）は、生体内における天然の結合パートナーのリガンドに対する解離定数（KD）に比較して、例えば１．１倍以上、好ましくは１．５倍以上、２倍以上、５倍以上、１０倍以上、特に好ましくは１００倍以上である。切断後のリガンド結合分子がリガンドに対して低い結合活性しか持たない、もしくはリガンドに対して結合活性をほぼ持たないことにより、リガンド結合分子が切断された後リガンドを遊離させることを保証し、また別のリガンド分子と再度結合してしまうことを防ぐことが期待できる。
　リガンド結合分子が切断された後、抑制されたリガンドの生物活性が回復することが望ましい。切断されたリガンド結合分子のリガンドへの結合が減弱されることで、リガンド結合分子のリガンド生物活性阻害機能も減弱されることが望ましい。当業者は、リガンドの生物活性を既知の方法、例えば、リガンドとその結合パートナーとの結合を検出する方法で確認することが出来る。
　本発明のいくつかの実施態様において、未切断のリガンド結合分子が単ドメイン抗体単体より長い半減期を有する。リガンド結合分子の血中半減期を単ドメイン抗体単体の血中半減期より長くする実施態様の例として、それだけに限定されないが、リガンド結合分子の分子量を大きくすること、または単ドメイン抗体とFcRn結合性を有する部分と融合させること、または単ドメイン抗体とアルブミン結合性を有する部分と融合させること、または単ドメイン抗体とPEG化されている部分と融合させることが挙げられる。
　本発明においては、単ドメイン抗体単体とリガンド結合分子の半減期比較は、ヒトにおける血中半減期で比較することが好ましい。ヒトでの血中半減期を測定することが困難である場合には、マウス（例えば、正常マウス、ヒト抗原発現トランスジェニックマウス、ヒトFcRn発現トランスジェニックマウス、等）またはサル（例えば、カニクイザルなど）での血中半減期をもとに、ヒトでの血中半減期を予測することができる。
　リガンド結合分子の血中半減期を単ドメイン抗体単体の血中半減期より長くする一実施態様として、リガンド結合分子の分子量を大きくすることが挙げられる。好ましい実施態様として、リガンド結合分子の分子量が60kDa以上である。分子量が60kDa以上である分子は通常、血中に存在するとき、腎臓によるクリアランスが発生する可能性が低く、血中半減期が長い可能性が高い（J Biol Chem. 1988 Oct 15;263(29):15064-70参照）。
　リガンド結合分子の血中半減期を単ドメイン抗体単体の血中半減期より長くする一実施態様として、単ドメイン抗体とFcRn結合性を有する部分と融合させることが挙げられる。FcRn結合性を有する部分は、通常FcRn結合領域を有する。FcRn結合領域とは、FcRnへ結合性を持つ領域を言い、FcRnへの結合性を持つ限りどんな構造でも使用可能である。
　FcRn結合領域を含む運搬部分は、FcRnのサルベージ経路により細胞内に取り込まれた後に再び血漿中に戻ることが可能である。例えば、IgG分子の血漿中滞留性が比較的長い（消失が遅い）のは、IgG分子のサルベージレセプターとして知られているFcRnが機能しているためである。ピノサイトーシスによってエンドソームに取り込まれたIgG分子は、エンドソーム内の酸性条件下においてエンドソーム内に発現しているFcRnに結合する。FcRnに結合できなかったIgG分子はライソソームへと進みそこで分解されるが、FcRnへ結合したIgG分子は細胞表面へ移行し血漿中の中性条件下においてFcRnから解離することで再び血漿中に戻る。
　FcRn結合領域は、直接FcRnと結合する領域であることが好ましい。FcRn結合領域の好ましい例として、抗体のFc領域を挙げることができる。しかしながら、アルブミンやIgGなどのFcRnとの結合能を有するポリペプチドに結合可能な領域は、アルブミンやIgGなどを介して間接的にFcRnと結合することが可能であるので、本発明におけるFcRn結合領域はそのようなFcRnとの結合能を有するポリペプチドに結合する領域であってもよい。
　本発明におけるFcRn結合領域のFcRn、特にヒトFcRnに対する結合活性は、前記結合活性の項で述べられているように、当業者に公知の方法により測定することが可能であり、条件については当業者が適宜決定することが可能である。ヒトFcRnへの結合活性は、KD（Dissociation constant：解離定数）、見かけのKD（Apparent dissociation constant：見かけの解離定数）、解離速度であるkd（Dissociation rate：解離速度）、又は見かけのkd（Apparent dissociation：見かけの解離速度）等として評価され得る。これらは当業者公知の方法で測定され得る。例えばBiacore（GE healthcare）、スキャッチャードプロット、フローサイトメーター等を使用され得る。
　FcRn結合領域のFcRnに対する結合活性を測定する際の条件は当業者が適宜選択することが可能であり、特に限定されない。例えば、WO2009/125825に記載されているようにMESバッファー、37℃の条件において測定され得る。また、本発明のFcRn結合領域のFcRnに対する結合活性の測定は当業者公知の方法により行うことが可能であり、例えば、Biacore（GE Healthcare）などを用いて測定され得る。FcRn結合領域とFcRnの結合活性の測定は、FcRn結合領域またはFcRn結合領域を含む運搬部分あるいはFcRnを固定化したチップへ、それぞれFcRnあるいはFcRn結合領域またはFcRn結合領域を含む運搬部分をアナライトとして流すことによって評価され得る。
　測定条件に使用されるpHとして、FcRn結合領域とFcRnとの結合アフィニティは、pH4.0～pH6.5の任意のpHで評価してもよい。好ましくは、FcRn結合領域とヒトFcRnとの結合アフィニティを決定するために、生体内の早期エンドソーム内のpHに近いpH5.8～pH6.0のpHが使用される。測定条件に使用される温度として、FcRn結合領域とFcRnとの結合アフィニティは、10℃～50℃の任意の温度で評価してもよい。好ましくは、FcRn結合領域とヒトFcRnとの結合アフィニティを決定するために、15℃～40℃の温度が使用される。より好ましくは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、および35℃のいずれか1つのような20℃から35℃までの任意の温度も同様に、FcRn結合領域とFcRnとの結合アフィニティを決定するために使用される。25℃という温度は本発明の態様の非限定な一例である。
　FcRn結合領域の一つの例として、それだけに限定されないが、例えば、IgG抗体Fc領域が挙げられる。IgG抗体のFc領域を用いる場合、その種類は限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのFc領域を用いることが可能である。例えば、配列番号：１０３、１０４、１０５、１０６で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域を用いることが可能である。
　また、天然型IgG抗体のFc領域はもちろん、FcRn結合性を有する限り、一つまたはそれ以上のアミノ酸が置換された改変Fc領域も使用可能である。
　例えば、IgG抗体Fc領域におけるEUナンバリング237番目、238番目、239番目、248番目、250番目、252番目、254番目、255番目、256番目、257番目、258番目、265番目、270番目、286番目、289番目、297番目、298番目、303番目、305番目、307番目、308番目、309番目、311番目、312番目、314番目、315番目、317番目、325番目、332番目、334番目、360番目、376番目、380番目、382番目、384番目、385番目、386番目、387番目、389番目、424番目、428番目、433番目、434番目および436番目から選択される少なくとも1つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を含む改変Fc領域を使用ことは可能である。
　より具体的には、IgG抗体Fc領域におけるEUナンバリング
　237番目のGlyをMetに置換するアミノ酸置換、
　238番目のProをAlaに置換するアミノ酸置換、
　239番目のSerをLysに置換するアミノ酸置換、
　248番目のLysをIleに置換するアミノ酸置換、
　250番目のThrをAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
　252番目のMetをPhe、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
　254番目のSerをThrに置換するアミノ酸置換、
　255番目のArgをGluに置換するアミノ酸置換、
　256番目のThrをAsp、Glu、またはGlnに置換するアミノ酸置換、
　257番目のProをAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはValに置換するアミノ酸置換、
　258番目のGluをHisに置換するアミノ酸置換、
　265番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
　270番目のAspをPheに置換するアミノ酸置換、
　286番目のAsnをAlaまたはGluに置換するアミノ酸置換、
　289番目のThrをHisに置換するアミノ酸置換、
　297番目のAsnをAlaに置換するアミノ酸置換、
　298番目のSerをGlyに置換するアミノ酸置換、
　303番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
　305番目のValをAlaに置換するアミノ酸置換、
　307番目のThrをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
　308番目のValをAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThrに置換するアミノ酸置換、
　309番目のLeuまたはValをAla、Asp、Glu、Pro、またはArgに置換するアミノ酸置換、
　311番目のGlnをAla、His、またはIleに置換するアミノ酸置換、
　312番目のAspをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
　314番目のLeuをLysまたはArgに置換するアミノ酸置換、
　315番目のAsnをAlaまたはHisに置換するアミノ酸置換、
　317番目のLysをAlaに置換するアミノ酸置換、
　325番目のAsnをGlyに置換するアミノ酸置換、
　332番目のIleをValに置換するアミノ酸置換、
　334番目のLysをLeuに置換するアミノ酸置換、
　360番目のLysをHisに置換するアミノ酸置換、
　376番目のAspをAlaに置換するアミノ酸置換、
　380番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
　382番目のGluをAlaに置換するアミノ酸置換、
　384番目のAsnまたはSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
　385番目のGlyをAspまたはHisに置換するアミノ酸置換、
　386番目のGlnをProに置換するアミノ酸置換、
　387番目のProをGluに置換するアミノ酸置換、
　389番目のAsnをAlaまたはSerに置換するアミノ酸置換、
　424番目のSerをAlaに置換するアミノ酸置換、
　428番目のMetをAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、
　433番目のHisをLysに置換するアミノ酸置換、
　434番目のAsnをAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyrに置換するアミノ酸置換、および
　436番目のTyrまたはPheをHisに置換するアミノ酸置換
　から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、改変Fc領域を使用することは可能である。
　別の面から見れば、IgG抗体Fc領域における、EUナンバリング
　237番目のアミノ酸におけるMet、
　238番目のアミノ酸におけるAla、
　239番目のアミノ酸におけるLys、
　248番目のアミノ酸におけるIle、
　250番目のアミノ酸におけるAla、Phe、Ile、Met、Gln、Ser、Val、Trp、またはTyr、
　252番目のアミノ酸におけるPhe、Trp、またはTyr、
　254番目のアミノ酸におけるThr、
　255番目のアミノ酸におけるGlu、
　256番目のアミノ酸におけるAsp、Glu、またはGln、
　257番目のアミノ酸におけるAla、Gly、Ile、Leu、Met、Asn、Ser、Thr、またはVal、
　258番目のアミノ酸におけるHis、
　265番目のアミノ酸におけるAla、
　270番目のアミノ酸におけるPhe、
　286番目のアミノ酸におけるAlaまたはGlu、
　289番目のアミノ酸におけるHis、
　297番目のアミノ酸におけるAla、
　298番目のアミノ酸におけるGly、
　303番目のアミノ酸におけるAla、
　305番目のアミノ酸におけるAla、
　307番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Val、Trp、またはTyr、
　308番目のアミノ酸におけるAla、Phe、Ile、Leu、Met、Pro、Gln、またはThr、
　309番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Glu、Pro、またはArg、
　311番目のアミノ酸におけるAla、His、またはIle、
　312番目のアミノ酸におけるAlaまたはHis、
　314番目のアミノ酸におけるLysまたはArg、
　315番目のアミノ酸におけるAlaまたはHis、
　317番目のアミノ酸におけるAla、
　325番目のアミノ酸におけるGly、
　332番目のアミノ酸におけるVal、
　334番目のアミノ酸におけるLeu、
　360番目のアミノ酸におけるHis、
　376番目のアミノ酸におけるAla、
　380番目のアミノ酸におけるAla、
　382番目のアミノ酸におけるAla、
　384番目のアミノ酸におけるAla、
　385番目のアミノ酸におけるAspまたはHis、
　386番目のアミノ酸におけるPro、
　387番目のアミノ酸におけるGlu、
　389番目のアミノ酸におけるAlaまたはSer、
　424番目のアミノ酸におけるAla、
　428番目のアミノ酸におけるAla、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Asn、Pro、Gln、Ser、Thr、Val、Trp、またはTyr、
　433番目のアミノ酸におけるLys、
　434番目のアミノ酸におけるAla、Phe、His、Ser、Trp、またはTyr、および
　436番目のアミノ酸におけるHis
　から選択される少なくとも1つのアミノ酸を含むFc領域を使用することは可能である。
　また、リガンド結合分子の血中半減期を単ドメイン抗体単体の血中半減期より長くする一実施態様として、単ドメイン抗体とアルブミン結合性を有する部分と融合させる方法がある。アルブミンは腎排泄を受けず、かつFcRn結合性を有するため、血中半減期が１７～１９日と長い（J Clin Invest. 1953 Aug; 32(8): 746-768.）。そのためアルブミンと結合しているタンパク質は嵩高くなり、かつ間接的にFcRnと結合することが可能となるため、血中半減期が増加することが報告されている（Antibodies 2015, 4(3), 141-156）。
　更に、リガンド結合分子の血中半減期を単ドメイン抗体単体の血中半減期より長くする一実施態様として、単ドメイン抗体とPEG化されている部分と融合させる方法がある。タンパク質をPEG化することでタンパク質を嵩高くし、同時に血中のプロテアーゼによる分解を抑えることで、タンパク質の血中半減期が延長すると考えられている（J Pharm Sci. 2008 Oct;97(10):4167-83.）。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子は抗体Fc領域を含む。具体的な一実施態様として、リガンド結合分子はヒトIgG抗体のCH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。具体的な一実施態様として、リガンド結合分子は、ヒトIgG１抗体重鎖Cys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで伸びる部分を含む。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。
リガンド
　本明細書において、用語「リガンド」は生物活性を有する分子である。生物活性を有する分子は通常、細胞表面の受容体と相互作用し、それにより生物学的に刺激、阻害、または他の様式で変調することによって機能し、これらは通常は前記受容体を保有する細胞内のシグナル伝達経路に関与すると思われる。
　本明細書においてリガンドには、生体分子と相互作用することにより生物活性を発揮する所望の分子が包含される。例えばリガンドは、受容体に相互作用する分子を意味するだけでなく、当該分子に相互作用することにより生物活性を発揮する分子もリガンドであって、例えば当該分子に相互作用する受容体や、その結合断片などもリガンドに含まれる。例えば、受容体として知られるタンパク質のリガンド結合部位や、当該受容体が他の分子と相互作用する部位を含むタンパク質は、本発明においてリガンドに含まれる。具体的には、可溶性受容体、受容体の可溶性断片、膜貫通型受容体の細胞外ドメイン、およびそれらを含むポリペプチドなどは、本発明においてリガンドに含まれる。
　本発明のリガンドは通常、一つまたは複数の結合パートナーに結合することで、望ましい生物活性を発揮することが出来る。リガンドの結合パートナーは、細胞外、細胞内、または膜貫通タンパク質であることができる。一つの実施形態において、リガンドのその結合パートナーは、細胞外タンパク質、たとえば可溶性受容体である。別の実施形態において、リガンドの結合パートナーは、膜結合型受容体である。
　本発明のリガンドは、その結合パートナーに１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３５０ｐＭ、３００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１５０ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、２５ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、１ｐＭ、０．５ｐＭ、または０．１ｐＭ以下の解離定数（ＫＤ）で特異的に結合することができる。
　生物活性を有する分子の例として、それだけに限定されないが、例えば、サイトカイン、ケモカイン、ポリペプチドホルモン、成長因子、アポトーシス誘導因子、PAMPｓ、DAMPｓ、核酸、またはそれらのフラグメントが挙げられる。詳細な実施形態においては、リガンドとして、インターロイキン、インターフェロン、造血因子、TNFスーパーファミリー、ケモカイン、細胞増殖因子、TGF-βファミリー、マイオカイン、アディポカイン、または神経栄養因子が使用され得る。より詳細な実施形態においては、リガンドとして、CXCL10、IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-β、IFN-g、MIG、I-TAC、RANTES、MIP-1a、MIP-1b、IL-1R1（Interleukin-1 receptor, type I）、IL-1R2（Interleukin-1 receptor, type II）、IL-1RAcP（Interleukin-1 receptor accessory protein）、またはIL-1Ra（タンパク質アクセッションNo. NP_776214、mRNAアクセッションNo. NM_173842.2）が使用され得る。
　ケモカインは、７～１６ｋＤａの間の均質な血清タンパク質のファミリーであり、元来、白血球の遊走を誘導するその能力を特徴とした。ほとんどのケモカインは、４つの特徴的なシステイン（Ｃｙｓ）を有し、最初の２つのシステインによって示されるモチーフによって、ＣＸＣ、又はアルファ、ＣＣ又はベータ、Ｃ又はガンマ及びＣＸ３Ｃ又はデルタのケモカインクラスに分類されている。２つのジスルフィド結合は、第１と第３のシステインの間、及び第２と第４のシステインの間に形成される。一般に、ジスルフィド架橋は必要であると考えられ、Clark-Lewisと共同研究者らは、少なくともCXCL10についてはジスルフィド結合は、ケモカイン活性に決定的であることを報告した（Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem. 269:16075-16081, 1994）。４つのシステインを有することに対する唯一の例外は、リンホタクチンであり、システイン残基を２つしか有さない。従って、リンホタクチンは、１つだけのジスルフィド結合によって機能的構造をなんとか保持する。
　さらに、ＣＸＣ又はアルファのサブファミリーは、第１のシステインに先行するＥＬＲモチーフ（Ｇｌｕ-Ｌｅｕ-Ａｒｇ）の存在によって２つの群：ＥＬＲ-ＣＸＣケモカイン及び非ＥＬＲ-ＣＸＣケモカインに分類されている（たとえば、Clark-Lewis, 上記、 及びBelperio et al., "CXC Chemokines in Angiogenesis（脈管形成におけるＣＸＣケモカイン）," J. Leukoc. Biol. 68:1-8, 2000を参照）。
　インターフェロン誘導性のタンパク質-１０（ＩＰ-１０又はＣＸＣＬ１０）は、インターフェロン-γ及びＴＮＦ-αによって誘導され、角化細胞、内皮細胞、線維芽細胞及び単球によって産生される。ＩＰ-１０は、組織炎症部位への活性化Ｔ細胞の動員において役割を担っていると考えられる（Dufour, et al., "IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10)-deficient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking（ＩＦＮγが誘導可能なタンパク質-１０（ＩＰ-１０：ＣＸＣＬ１０）欠損マウスは、エフェクターＴ細胞の生成及び輸送におけるＩＰ-１０の役割を明らかにする）," J Immunol., 168:3195-204, 2002）。さらに、ＩＰ-１０は、過敏反応に役割を担っている可能性がある。また、炎症性脱髄神経障害の発生にも役割を担っている可能性がある（Kieseier, et al., "Chemokines and chemokine receptors in inflammatory demyelinating neuropathies: a central role for IP-10（炎症性脱髄神経障害におけるケモカイン及びケモカイン受容体：ＩＰ-１０の中心的役割）," Brain 125:823-34, 2002）。
　研究によって、ＩＰ-１０は、移植に続く幹細胞の生着（Nagasawa, T., Int. J. Hematol. 72:408-11, 2000）、幹細胞の動員（Gazitt, Y., J. Hematother Stem Cell Res 10:229-36, 2001; Hattori et al., Blood 97:3354-59, 2001）及び抗腫瘍免疫の亢進（Nomura et al., Int. J. Cancer 91:597-606, 2001; Mach and Dranoff, Curr. Opin. Immunol. 12:571-75, 2000）に有用である可能性があることが示されている。たとえば、当業者に既知の報告の中で、ケモカインの生物活性が議論されている（Bruce, L. et al., "Radiolabeled Chemokine binding assays（放射性標識ケモカイン結合アッセイ）," Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp129-134, Raphaele, B. et al. "Calcium Mobilization," Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp143-148, Paul D. Ponath et al., "Transwell Chemotaxis," Methods in Molecular Biology (2000) vol. 138, pp113-120 Humana Press. Totowa, New Jersey）。
　CXCL10の生物活性として、たとえば、CXCL10受容体（ＣＸＣＲ３）への結合、CXCL10誘導性カルシウム流、CXCL10誘導性細胞走化性、グリコサミノグリカンへのCXCL10の結合およびCXCL10オリゴマー化が挙げられる。
　CXCL10の生物活性を測定する方法として、CXCL10の細胞遊走活性を測定する方法、CXCR3安定発現細胞株を用いたReporter assay（PLoS One. 2010 Sep 13;5(9):e12700.参照）、GPCRシグナル伝達初期に誘導されるB-Arrestin recruitmentを利用したPathHunterTM β-Arrestin recruitment assay等が挙げられる。
　インターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、ジスルフィド結合されている３０と４０ｋＤのグリコシル化ポリペプチド鎖からなるヘテロ二量体のサイトカインである。サイトカインは、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ランゲルハンス細胞および角化細胞ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む抗原提示細胞によって合成され、そして分泌される。ＩＬ－１２は、種々の生物学的プロセスを媒介し、そしてＮＫ細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、Ｔ細胞刺激因子、細胞障害Ｔリンパ球成熟因子およびＥＢＶ－形質転換されたＢ細胞系因子として言及されてきた。
　インターロイキン１２は、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の細胞質膜に発現されたＩＬ－１２受容体に結合し、それによって生物学的プロセスを変える（例えば、開始、阻止する）ことができる。例えば、ＩＬ－１２受容体へのＩＬ－１２の結合は、前活性化されたＴ細胞およびＮＫ細胞の増殖を刺激し、細胞障害性のＴ細胞（ＣＴＬ）、ＮＫ細胞およびＬＡＫ（リンホカイン活性化キラー）細胞の細胞溶解活性を増進し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞によるγインターフェロン（ＩＦＮγ）の生産を誘導し、そしてＩＦＮγおよびＩＬ－２を生産するＴｈ１細胞へのナイーブＴｈ０細胞(ｎａｉｖｅ Ｔｈ０ ｃｅｌｌ)の分化を誘導する。特に、ＩＬ－１２は、細胞溶解細胞（例えばＮＫ、ＣＴＬ）の生成および細胞性免疫応答（例えば、Ｔｈ１細胞媒介の免疫応答）を設定するのに絶対に必要である。かくして、ＩＬ－１２は、予防免疫（例えば、感染症の根絶）と病理学的免疫応答（例えば、自己免疫）の両方の生成および調節において絶対的に重要である。
　IL-12の生物活性を測定する方法として、IL-12の細胞増殖活性の測定、STAT4 レポーターアッセイ、IL-12による細胞活性化（細胞表面マーカー発現、サイトカイン産生等）、IL-12による細胞分化の促進等を測定する方法が挙げられる。
　タンパク質のＰｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｄｅａｔｈ １（ＰＤ－１）は、ＣＤ２８ファミリーレセプターの阻害メンバーであり、ＣＤ２８ファミリーには、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡもまた含まれる。ＰＤ－１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上で発現する（Ｏｋａｚａｋｉら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４：３９１７７９－８２、Ｂｅｎｎｅｔｔら（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）。当該ファミリーの最初のメンバーであるＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体添加後のＴ細胞増殖上昇に及ぼす機能的影響により発見された（Ｈｕｔｌｏｆｆら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９７：２６３－２６６、Ｈａｎｓｅｎら（１９８０）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｓ １０：２４７－２６０）。ＰＤ－１は、アポトーシス細胞中における異なった発現をスクリーニングすることにより発見された（Ｉｓｈｉｄａら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ． １１：３８８７－９５）。当該ファミリーの他のメンバーであるＣＴＬＡ－４とＢＴＬＡは、それぞれ、細胞傷害性Ｔリンパ球とＴＨ１細胞中における異なった発現をスクリーニングすることにより発見された。ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＣＴＬＡ－４は全て、対になっていないシステイン残基を有しており、それらはホモダイマー化を可能にする。対照的に、ＰＤ－１はモノマーとして存在すると考えられており、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに特徴的な対になっていないシステインを有していない。
　ＰＤ－１遺伝子は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部である５５ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質をコードする遺伝子である。ＰＤ－１は、膜近位免疫レセプターチロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および膜遠位のチロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む。ＰＤ－１は、ＣＴＬＡ－４に構造的に類似しているが、Ｂ７－１およびＢ７－２結合に重要なＭＹＰＰＰＹモチーフ（配列番号：１０２）を欠損している。ＰＤ－１に対する２個のリガンドＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２が同定されており、ＰＤ－１に結合するとＴ細胞活性化を負に制御することが明らかとなっている（Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４、Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８、Ｃａｒｔｅｒら（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は両者ともに、ＰＤ－１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７ホモログである。ＰＤ－１の一つのリガンドであるＰＤ－Ｌ１は、様々なヒト癌に豊富に存在している（Ｄｏｎｇら（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ８：７８７－９）。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用の結果、腫瘍浸潤性リンパ球の減少、Ｔ細胞レセプター媒介性増殖の低下、および癌性細胞による免疫回避が起こる（Ｄｏｎｇら（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ． ８１：２８１－７、Ｂｌａｎｋら（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ５４：３０７－３１４、Ｋｏｎｉｓｈｉら（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １０：５０９４－１００）。免疫抑制は、ＰＤ－Ｌ１とのＰＤ－１の局所的相互作用を阻害することにより回復でき、ＰＤ－Ｌ２とのＰＤ－２との相互作用が同様に阻害される時、その効果は付加的である（Ｉｗａｉら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ' ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９９：１２２９３－７、Ｂｒｏｗｎら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７０：１２５７－６６）。
　ＰＤ－１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞上で発現するＣＤ２８ファミリーの阻害メンバーである。ＰＤ－１欠損動物は、自己免疫性心筋症および関節炎および腎炎を伴うループス様症候群を含む様々な自己免疫性表現型を発症する（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４１－５１、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９－２２）。さらに、ＰＤ－１は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性ループスエリテマトーデス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病およびリウマチ性関節炎に重要な役割を果たすことがわかった（Ｓａｌａｍａら（２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：７１－７８、ＰｒｏｋｕｎｉａおよびＡｌａｒｃｏｎ－Ｒｉｑｕｅｌｍｅ（２００４）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ １３：Ｒ１４３、Ｎｉｅｌｓｅｎら（２００４）Ｌｕｐｕｓ １３：５１０）。マウスＢ細胞腫瘍株において、ＰＤ－１のＩＴＳＭは、ＢＣＲ媒介Ｃａ２＋の流れおよび下流エフェクター分子のチロシンリン酸化を阻害する際に必須であることが明らかになった（Ｏｋａｚａｋｉら（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３８６６－７１）。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンドはサイトカインである。
　サイトカインは、免疫調節性および炎症性の過程に関与する分泌型細胞シグナル伝達タンパク質のファミリーであり、これは神経システムのグリア細胞によっておよび免疫システムの多数の細胞によって分泌される。サイトカインは、タンパク質、ペプチドまたは糖タンパク質に分類することができ、大きくて多様な調節因子ファミリーを包含する。サイトカインは細胞表面受容体に結合して細胞内シグナル伝達を誘発し、これによって酵素の活性調節、いくつかの遺伝子およびその転写因子の上方制御もしくは下方制御、またはフィードバック阻害等が起こりうる。
　いくつかの実施態様において、本発明のサイトカインは、インターロイキン(IL)およびインターフェロン(IFN)などの免疫調節因子を含む。適したサイトカインは以下のタイプの1つまたは複数由来のタンパク質を含むことができる：4つのα-ヘリックスバンドルファミリー(これはIL-2サブファミリー、IFNサブファミリーおよびIL-10サブファミリーを含む); IL-1ファミリー(これはIL-1およびIL-8を含む)、ならびにIL-17ファミリー。サイトカインは、細胞免疫反応を増強する1型サイトカイン(例えば、IFN-γ、TGF-βなど)、または抗体反応に有利に働く2型サイトカイン(例えば、IL-4、IL-10、IL-13など)に分類されるものを含むこともできる。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンドはケモカインである。ケモカインは一般に、免疫エフェクター細胞をケモカイン発現部位に動員させる化学誘引物質として作用する。これは、他の免疫系成分を治療部位に動員させる目的で、特定のケモカイン遺伝子を例えばサイトカイン遺伝子とともに発現させるためには有益と考えられる。このようなケモカインには、CXCL10、RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-βが含まれる。当業者には、ある種のサイトカインも化学誘引作用を有することが知られていて、それらをケモカインという用語で分類しうることを認識していると考えられる。
　また、本発明のいくつかの実施態様において、リガンドとしてサイトカイン、ケモカイン等の改変体（例：Annu Rev Immunol. 2015;33:139-67.）やそれらを含む融合タンパク質（例：Stem Cells Transl Med. 2015 Jan; 4(1): 66-73.）を使用することができる。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンドはCXCL10、PD-1、IL-12、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP 、IL-1Raから選ばれる。前記CXCL10、PD-1、IL-12、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP 、IL-1Raは、天然に存在するCXCL10、PD-1、IL-12、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP 、IL-1Raと同じ配列を有していても良く、天然に存在するCXCL10、PD-1、IL-12、IL-6R、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAcP 、IL-1Raと配列が異なるが対応する天然のリガンドを有する生理的活性を保持している改変体であってもよい。リガンドの改変体を取得するには、様々な目的で人為的にリガンド配列に改変を加えてもよく、好ましくはプロテアーゼ切断を受けない（プロテアーゼ抵抗性の）改変を加えることでリガンドの改変体を取得する。
リガンド結合分子の例
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子はプロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体のみを含む。本発明の別のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子はFc領域を含む。IgG抗体のFc領域を用いる場合、その種類は限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのFc領域を用いることが可能である。例えば、配列番号：１０３、１０４、１０５、１０６で示されるアミノ酸配列から選ばれる一つの配列を含むFc領域、またはこれらのFc領域に改変を加えたFc領域変異体を用いることが可能である。また、本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子は抗体定常領域を含む。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体とFc領域の融合タンパク質である。より具体的な実施態様において、リガンド結合分子はＮ末端からＣ末端に向かって、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を含む。別の具体的な実施態様において、リガンド結合分子は、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体Fc領域からなる一連のペプチド鎖を二つ含む二量体タンパク質である。別の具体的な実施態様において、リガンド結合分子は、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体-抗体ヒンジ領域-抗体CH2-抗体CH3からなる一連のペプチド鎖を二つ含む二量体タンパク質である。
リガンドとリガンド結合分子の複合体
　本発明のいくつかの実施態様において、未切断状態のリガンド結合分子は、抗原抗体結合によりリガンドと複合体を形成する。より具体的な実施態様において、リガンド結合分子とリガンドとの複合体は、リガンド結合分子とリガンドの非共有結合、例えば抗原抗体結合により形成されている。
　したがって、本発明は、リガンド結合分子とリガンドを接触させる工程と、リガンド結合分子にリガンドが結合してなる複合体を回収する工程を含む、複合体の製造方法も提供する。本発明において、リガンド結合分子とリガンドは、両者の結合が可能な条件下で接触させることができる。得られた複合体は、たとえば薬学的に許容される担体と配合することにより、医薬組成物とすることができる。
リガンドとリガンド結合分子が融合された融合タンパク質
　本発明のいくつかの実施態様において、未切断状態のリガンド結合分子はリガンドと融合され、融合タンパク質を形成した上、当該融合タンパク質内のリガンド結合分子部分とリガンド部分が更に抗原抗体結合により相互作用している。リガンド結合分子とリガンドは、リンカーを介してまたはリンカーを介さずに融合され得る。融合タンパク質中のリガンド結合分子とリガンドはリンカーを介してまたは介さずに融合されている場合でも、リガンド結合分子部分とリガンド部分の間の非共有結合は依然として存在する。言い換えれば、リガンド結合分子がリガンドと融合されている実施態様においても、リガンド結合分子部分とリガンド部分の間の非共有結合は、リガンド結合分子とリガンドが融合されていない実施態様と類似する。リガンド結合分子が切断されることにより、その非共有結合が減弱する。すなわち、リガンド結合分子とリガンドとの結合は減弱することになる。
　本発明の好ましい一実施態様においては、リガンド結合分子とリガンドをリンカーを介して融合させる。リガンド結合分子とリガンドを融合させるとき用いられるリンカーとして、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、または合成化合物リンカー（例えば、Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができるが、本実施態様においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。例として、それだけに限定されないが、例えば、ペプチドリンカーの場合：
　Ser
　Gly・Ser（GS）
　Ser・Gly（SG）
　Gly・Gly・Ser（GGS）
　Gly・Ser・Gly（GSG）
　Ser・Gly・Gly（SGG）
　Gly・Ser・Ser（GSS）
　Ser・Ser・Gly（SSG）
　Ser・Gly・Ser（SGS）
　Gly・Gly・Gly・Ser（GGGS、配列番号：８３）
　Gly・Gly・Ser・Gly（GGSG、配列番号：８４）
　Gly・Ser・Gly・Gly（GSGG、配列番号：８５）
　Ser・Gly・Gly・Gly（SGGG、配列番号：８６）
　Gly・Ser・Ser・Gly（GSSG、配列番号：８７）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS、配列番号：８８）
　Gly・Gly・Gly・Ser・Gly（GGGSG、配列番号：８９）
　Gly・Gly・Ser・Gly・Gly（GGSGG、配列番号：９０）
　Gly・Ser・Gly・Gly・Gly（GSGGG、配列番号：９１）
　Gly・Ser・Gly・Gly・Ser（GSGGS、配列番号：９２）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG、配列番号：９３）
　Gly・Ser・Ser・Gly・Gly（GSSGG、配列番号：９４）
　Gly・Ser・Gly・Ser・Gly（GSGSG、配列番号：９５）
　Ser・Gly・Gly・Ser・Gly（SGGSG、配列番号：９６）
　Gly・Ser・Ser・Ser・Gly（GSSSG、配列番号：９７）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGS、配列番号：９８）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGG、配列番号：９９）
　Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGGGS、配列番号：１００）
　Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGGGG、配列番号：１０１）
　(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser（GGGGS、配列番号：８８）)n
　(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly（SGGGG、配列番号：９３）)n
［nは１以上の整数である］等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
　合成化合物リンカー（化学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えばN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）などであり、これらの架橋剤は市販されている。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子とリガンドの融合タンパク質はリガンド結合分子のＮ末端とリガンドのＣ末端がリンカーを介してまたはリンカーを介さず融合されてなる融合タンパク質である。
　本発明のリガンド結合分子とリガンドの融合タンパク質の構造のいくつかの態様を下記に羅列する。下記態様はＮ末端からＣ末端の順に記載する。
　リガンド - 単ドメイン抗体
　リガンド - リンカー - 単ドメイン抗体
　リガンド - 単ドメイン抗体 - 抗体定常領域（またはその断片）
　リガンド - リンカー - 単ドメイン抗体 - 抗体定常領域（またはその断片）
　リガンド - 単ドメイン抗体 - 抗体ヒンジ領域 - 抗体CH2 - 抗体CH3
　リガンド - リンカー - 単ドメイン抗体 - 抗体ヒンジ領域 - 抗体CH2 - 抗体CH3
治療
　本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、それだけに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの実施態様において、本発明の単ドメイン抗体含有リガンド結合分子は、リガンドの生物活性を制御することができ、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。
医薬組成物
　また本発明は、単ドメイン抗体含有リガンド結合分子および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物（薬剤）、単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とリガンドと医薬的に許容される担体を含む医薬組成物（薬剤）、単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とリガンドが融合されている融合タンパク質と医薬的に許容される担体を含む医薬組成物（薬剤）にも関する。
　本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査・診断のための薬剤をいう。
　また、本発明において、「リガンド結合分子を含む医薬組成物」との用語は、「リガンド結合分子を治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合分子の使用」と言い換えることも可能である。「リガンド結合分子を含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するためのリガンド結合分子の使用」と言い換えることも可能である。
　「リガンド結合分子とリガンドを含む医薬組成物」との用語は、「リガンド結合分子とリガンドを治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造におけるリガンド結合分子とリガンドの使用」と言い換えることも可能である。「リガンド結合分子とリガンドを含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するためのリガンド結合分子とリガンドの使用」と言い換えることも可能である。
　「融合タンパク質を含む医薬組成物」との用語は、「融合タンパク質を治療対象に投与することを含む疾患の治療方法」と言い換えることも可能であるし、「疾患を治療するための医薬の製造における融合タンパク質の使用」と言い換えることも可能である。「融合タンパク質を含む医薬組成物」との用語を、「疾患を治療するための融合タンパク質の使用」と言い換えることも可能である。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法を用いて製剤化され得る。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用され得る。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化され得る。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定される。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施にしたがって処方され得る。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適切な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）が併用され得る。
　油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び/またはベンジルアルコールも併用され得る。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合され得る。調製された注射液は通常、適切なアンプルに充填される。
　本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物が投与される。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与され得る。
　投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択され得る。リガンド結合分子を含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲に設定され得る。または、例えば、患者あたり0.001～100000 mgの投与量が設定され得るが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子を含む組成物を個体に投与することが出来る。個体に投与されたリガンド結合分子は、個体内、例えば、血中、組織中等で、個体内に元々存在しているリガンドと結合し、リガンドと結合したまま更に生体内で運搬される。標的組織に運搬されたリガンド結合分子は、標的組織にて切断され、リガンドに対する結合が減弱し、標的組織にて結合しているリガンドをリリースすることが出来る。リリースされたリガンドは、標的組織にて生物活性を発揮し、標的組織に起因する疾患を治療することが出来る。リガンド結合分子がリガンドと結合している時リガンドの生物活性を抑制し、かつリガンド結合分子が標的組織特異的に切断される実施態様においては、運搬時のリガンドの生物活性を発揮させることなく、標的組織にて切断されて初めてリガンドの生物活性を発揮させ、疾患を治療することが出来、全身副作用を抑えることが出来る。
　以上の態様によって、本発明のリガンド結合分子を投与する工程を含む、内因性リガンドの全身性の作用を抑制、あるいは阻害する方法が提供される。あるいは本発明は、リガンド結合分子を有効成分として含む、内因性リガンドの全身性の作用を抑制、あるいは阻害するための医薬組成物が提供される。あるいは本発明は、リガンド結合分子の、内因性リガンドの全身性の作用の抑制、あるいは阻害における使用に関する。更に本発明は、リガンド結合分子の、内因性リガンドの全身性の作用を抑制、あるいは阻害するための医薬組成物の製造における使用に関する。これらの態様において、内因性リガンドの全身性の作用は本発明のリガンド結合分子によっていったん抑制あるいは阻害され、その後、標的組織において組織特異的な作用として発現される。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子を含む組成物と、リガンドを含む組成物を別々にまたは同時に個体に投与することが出来る。また、リガンド結合分子とリガンドの両方を含む組成物を個体に投与するもできる。リガンド結合分子とリガンドの両方を含む組成物を個体に投与する場合、当該組成物中のリガンド結合分子とリガンドは複合体を形成していても良い。リガンド結合分子とリガンドの両方を個体に投与した場合、リガンド結合分子は、個体に投与されたリガンドと結合し、リガンドを結合したまま生体内で運搬される。標的組織に運搬されたリガンド結合分子は、標的組織にて切断され、リガンドに対する結合が減弱し、標的組織にて結合しているリガンドをリリースすることが出来る。リリースされたリガンドは、標的組織にて生物活性を発揮し、標的組織に起因する疾患を治療することが出来る。リガンド結合分子がリガンドと結合している時リガンドの生物活性を抑制し、かつリガンド結合分子が標的組織特異的に切断される実施態様においては、運搬時のリガンドの生物活性を発揮させることなく、標的組織にて切断されて初めてリガンドの生物活性を発揮させ、疾患を治療することが出来、全身副作用を抑えることが出来る。個体に投与されたリガンド結合分子は、個体に投与されたリガンド以外に、個体内に元々存在するリガンドとも結合することも可能であり、個体内に元々存在するリガンドまたは個体に投与されたリガンドを結合したまま生体内で運搬することが出来る。
　すなわち本発明は、リガンド結合性の単ドメイン抗体含有分子とリガンドを接触させる工程と、当該単ドメイン抗体含有分子とリガンドからなる複合体を回収する工程を含む、リガンド-リガンド結合分子複合体の製造方法も提供する。本発明の複合体は、例えば薬学的に許容される担体と配合することによって、医薬組成物とすることができる。
　本発明のいくつかの実施態様において、リガンド結合分子とリガンドを融合した融合タンパク質を個体に投与することが出来る。当該いくつかの実施態様において、融合タンパク質中のリガンド結合分子とリガンドはリンカーを介してまたは介さずに融合タンパク質を形成しているが、リガンド結合分子部分とリガンド部分の間の非共有結合は依然として存在する。リガンド結合分子とリガンドを融合した融合タンパク質を個体に投与した場合、融合タンパク質は生体内で運搬され、標的組織で融合タンパク質中のリガンド結合分子部分が切断されることにより、リガンド結合分子部分のリガンドに対する非共有結合が減弱され、リガンド及びリガンド結合分子の一部が融合タンパク質からリリースされる。リリースされたリガンド及びリガンド結合分子の一部は、標的組織にてリガンドの生物活性を発揮し、標的組織に起因する疾患を治療することが出来る。リガンド結合分子がリガンドと結合している時リガンドの生物活性を抑制し、かつリガンド結合分子が標的組織特異的に切断される実施態様においては、運搬時の融合タンパク質中のリガンドの生物活性を発揮させることなく、標的組織にて切断されて初めてリガンドの生物活性を発揮させ、疾患を治療することが出来、全身副作用を抑えることが出来る。
　以上のような態様によって、リガンドのデリバリー（送達）のための方法が提供される。すなわち、本発明は、本発明のリガンド結合体を結合させたリガンドを投与する工程を含む、リガンドの標的組織へのデリバリー方法（送達方法）を提供する。あるいは本発明は、リガンド結合体を結合させたリガンドを含む、リガンドの標的組織へのデリバリー（送達）のための組成物を提供する。更に本発明は、リガンド結合体を結合させたリガンドの、リガンドの標的組織へのデリバリー（送達）における使用に関する。また本発明は、リガンド結合体を結合させたリガンドの、リガンドの標的組織へのデリバリー（送達）のための組成物の製造における使用に関する。
リガンド結合分子及び融合タンパク質の製造方法
　本発明は、切断された状態でリガンドへの結合が減弱される単ドメイン抗体含有リガンド結合分子、または当該リガンド結合分子とリガンドを融合させた融合タンパク質を製造する方法にも関する。本発明の一実施態様において、リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体に、プロテアーゼ切断配列を導入することを含むリガンド結合分子または融合タンパク質の製造方法が提供される。
　リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体中にプロテアーゼ切断配列を導入する方法の例として、リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体のアミノ酸配列中にプロテアーゼ切断配列を挿入する方法や、リガンド結合分子に含まれる単ドメイン抗体のアミノ酸配列の一部をプロテアーゼ切断配列に置き換える方法等が挙げられる。
　アミノ酸配列Ａをアミノ酸配列Ｂ中に「挿入」することは、アミノ酸配列Ｂを欠損させず二つの部分に分け、二つの部分の間をアミノ酸配列Ａで繋げること（即ち、「アミノ酸配列Ｂ前半-アミノ酸配列Ａ-アミノ酸配列Ｂ後半」のようなアミノ酸配列を新たに作ること）を指す。アミノ酸配列Ａをアミノ酸配列Ｂ中に「導入」することは、アミノ酸配列Ｂを二つの部分に分け、二つの部分の間をアミノ酸配列Ａで繋げることを指し、前記アミノ酸配列Ａをアミノ酸配列Ｂ中に「挿入」すること以外に、アミノ酸配列Ａと隣接するアミノ酸配列Ｂのアミノ酸残基を始めとする一つまたは複数のアミノ酸残基を欠損させてからアミノ酸配列Ａで二つの部分を繋げること（即ち、アミノ酸配列Ｂの一部をアミノ酸配列Ａに置き換えること）も可能である。
　単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を取得する方法の例として、リガンドに結合する能力を有する単ドメイン抗体を取得する方法が挙げられる。単ドメイン抗体は、例えば、公知の単ドメイン抗体抗体の作製方法を用いた方法により得られる。
　該作製方法により得られた単ドメイン抗体は、そのままリガンド結合分子に用いてもよく、得られた単ドメイン抗体を更に別のアミノ酸配列と連結させたものを用いてもよい。
　単ドメイン抗体の作製方法は、通常の抗体の作製方法と類似しており、当業者によく知られているが、例えばモノクローナル抗体の場合、ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)）、組換え方法（米国特許第4,816,567号）により製造してもよい。また、ファージ抗体ライブラリから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)）。また、単一のB細胞クローンから単離してもよい (N. Biotechnol. 28(5): 253-457 (2011))。
　リガンド結合分子にプロテアーゼ切断配列を導入することで、本発明のリガンド結合分子を製造し得る。より詳細的に、リガンド結合分子中の単ドメイン抗体にプロテアーゼ切断配列配列を導入することで、本発明のリガンド結合分子を製造し得る。リガンド結合分子に対して、任意的に、当該プロテアーゼ切断配列に対応するプロテアーゼの処理によりリガンド結合分子が切断されるかを確認することが出来る。例えば、リガンド結合分子にプロテアーゼ切断配列を導入した分子をプロテアーゼと接触させ、プロテアーゼ処理後産物の分子量をSDS-PAGE等の電気泳動法で確認することにより、プロテアーゼ切断配列が切断されたか否かを確認することができる。
　また、本発明は、切断された状態でリガンドへの結合が減弱される単ドメイン抗体含有リガンド結合分子をエンコードするポリヌクレオチド、または当該リガンド結合分子とリガンドを融合させた融合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドにも関する。
　本発明におけるポリヌクレオチドは、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のリガンド結合分子または融合タンパク質を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でリガンド結合分子を発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
　上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。リガンド結合分子または融合タンパク質を発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
　宿主細胞において発現したリガンド結合分子または融合タンパク質を小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のリガンド結合分子または融合タンパク質に組み込むことができる。これらのシグナルは目的のリガンド結合分子または融合タンパク質に対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
　リガンド結合分子または融合タンパク質の製造方法は、通常、リガンド結合分子または融合タンパク質を回収する工程を含むことができる。上記製造方法におけるリガンド結合分子または融合タンパク質の回収は、本発明のリガンド結合分子または融合タンパク質が培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のリガンド結合分子または融合タンパク質が細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にリガンド結合分子または融合タンパク質を回収する。
　組換え細胞培養物から本発明のリガンド結合分子または融合タンパク質を回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
　本明細書に記載の１又は複数の実施態様を任意に組み合わせたものも、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本発明に含まれることが当業者には当然に理解される。また、本明細書に記載の１又は複数の実施態様を任意に組み合わせたものを本発明から除外した発明も、当業者の技術常識に基づいて技術的に矛盾しない限り、本明細書において意図され、記載された発明とみなされるべきものである。
　以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。
実施例１　既報のイムノサイトカインおよびプロテアーゼ活性化サイトカインの課題
　癌組織に発現する抗原を標的としたイムノサイトカインは一般にターゲッティングさせるIgGやscFvの末端に目的のサイトカインを融合させることで作製されてきた（Expert Opin Investig Drugs. 2009 Jul;18(7):991-1000.、Curr Opin Immunol. 2016 Jun;40:96-102.）。IL-2やIL-12やTNFをはじめとするサイトカインは毒性が強いため、これらのサイトカインを癌局所で働かせるために抗体によって癌局所にデリバリーすることで副作用を軽減しつつ、効果を強めることが期待されているが（非特許文献４、５、６）、これらはいずれも全身投与では臨床で十分な効果を示さない、therapeutic windowが狭い、毒性が強く全身投与ができない、などの課題がある。この大きな原因として、イムノサイトカインであっても全身投与したサイトカインは全身に暴露されてしまうため、全身で作用して毒性を発揮しうる、あるいは毒性を回避するために極めて低い用量でしか投与できない、ことが挙げられる。また、癌抗原に結合するイムノサイトカインは、腫瘍中で癌細胞に内在化されて消失してしまうため、場合によっては腫瘍局所にサイトカインを暴露することが困難となる。癌抗原に結合する抗体にIL-2を融合したイムノサイトカインと癌抗原に結合しない抗体にIL-2を融合したイムノサイトカインで抗腫瘍効果は変わらなかったという報告もある（非特許文献７）
　イムノサイトカインの大きな課題である全身性の作用を低減させる方法として、サイトカインとサイトカインレセプターの間を癌で高発現するプロテアーゼによって切断されるリンカーで結合させた分子が報告されている。サイトカインはリンカーで結合されたサイトカインレセプターによって阻害されているが、リンカーがプロテアーゼによって切断されるとサイトカインレセプターが遊離し、サイトカインが活性体になる。例としてTNFalphaとTNFRをuPAで切断されるリンカーで結合させた分子（Cancer Immunol Immunother. 2006 Dec;55(12):1590-600.）、IL-2とIL-2RをMMP-2で切断されるリンカーで結合させた分子（Immunology. 2011 Jun;133(2):206-20）などが報告されている。しかしながら、これらの分子はリンカーの切断前であってもサイトカインは生物活性を有しており、リンカーの切断によって活性が約10倍程度しか向上しない。
　この原因として、サイトカインとサイトカインレセプターの親和性が強くないため、プロテアーゼ切断前でもサイトカインがある程度の活性を有してしまうこと、あるいは、プロテアーゼでリンカーが切断された後でも、サイトカインレセプターはサイトカインに結合することができるため、サイトカインの生物活性を阻害してしまうことの2点が挙げられる。
実施例２　ケモカインの癌免疫療法への応用における課題
　ケモカイン（Nature Immunology 9, 949 - 952 (2008)）は、Gタンパク質共役受容体を介してその作用を発現する塩基性タンパク質であり、サイトカインの一群である。受容体を発現する特定の白血球に作用し，その物質の濃度勾配の方向に白血球を遊走させる活性（走化性）を持つ（Nat Cell Biol. 2016 Jan;18(1):43-53.）。ケモカインは炎症部で大量に産生され，血管内から炎症組織内への白血球の遊走をもたらすことが知られている。
　ケモカインを制御することで、白血球の遊走をコントロールできることから、癌免疫療法に活用することが可能であると考えられる。固形癌の局所にT細胞や抗原提示細胞やM1マクロファージなどを遊走させることができれば、抗腫瘍効果を引き起こすことが可能であると考えられる。サイトカインは全身投与によっても作用を発揮することができるが、ケモカインは濃度勾配によって濃度の高い組織に細胞を遊走させるため、ケモカインを全身投与しても期待する効果は得られない。そのため、ケモカインの全身投与による癌免疫療法（ケモカイン療法）は現実的ではないと考えられる。
実施例３　プロテアーゼ切断配列を導入した標的組織特異的リガンドをリリースできるリガンド結合分子のコンセプト
　実施例１、２に示したように既報のサイトカイン・ケモカイン療法には以下の課題がある。
１．イムノサイトカインにおいては、抗体によりサイトカインを固形癌にターゲッティングしたとしても、サイトカインは全身で作用するため副作用が生じる、あるいは、副作用を回避するため低用量でしか投与できないため、腫瘍中に高い暴露をすることができない。
２．サイトカインレセプター（あるいは抗体）とサイトカインをプロテアーゼで切断出来るリンカーで繋ぐプロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、サイトカイン活性の中和が不十分でありプロテアーゼ切断前でもサイトカインがある程度の活性を有してしまう。
３．プロテアーゼによって活性化されるサイトカインにおいては、プロテアーゼでリンカーが切断された後でも、サイトカインレセプター（あるいは抗体）がサイトカインに結合することができるため、サイトカインの生物活性を阻害してしまう。
　この課題を解決するためには以下の条件を満たすことが重要であると考えた。
１．全身においては、サイトカインあるいはケモカインなどのリガンドがリガンド結合分子によって十分に阻害されている（生物活性が最小化されている）。
２．プロテアーゼによる切断によりリガンドの生物活性が回復する（活性型リガンドとなる）。
３．プロテアーゼによる切断によりリガンド結合分子がリガンド結合活性を失う。
　上記条件を満たす医薬組成物として切断サイトが切断されることによってリガンドへの結合が減弱される分子を考案した。まず、リガンドに対する単ドメイン抗体を取得し、次に単ドメイン抗体中に切断サイトを導入し、当該切断サイトを含む単ドメイン抗体を含有するリガンド結合分子を作製することができる。
実施例４　切断サイトが導入された単ドメイン抗体を含有するリガンド結合分子の例
　図１～４では切断サイトが導入された単ドメイン抗体を含有するリガンド結合分子の例を示している。
　図１で示しているのは、切断サイトが導入された単ドメイン抗体のみを含有するリガンド結合分子の例である。切断サイトが切断されていない状態において、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり、単ドメイン抗体のリガンドに対する親和性が十分に強ければ、リガンドの生物活性は十分に阻害されている。このリガンド結合分子とリガンドを全身投与しても、リガンド結合分子とリガンドの複合体中のリガンドは中和されているためその生物活性を発揮することは無く、またリガンド－リガンド結合分子の複合体はリガンド単体より長い半減期を有する。切断サイトが腫瘍組織特異的プロテアーゼにより切断されるプロテアーゼ切断配列の場合、全身投与されたリガンド結合分子とリガンドが形成された複合体は、腫瘍組織で高発現するプロテアーゼによって単ドメイン抗体中のプロテアーゼ切断配列が切断されると、単ドメイン抗体がリガンドへ結合できなくなり、リガンドの中和は解除され、腫瘍組織において生物学的作用を発揮することが可能である。
　図２で示しているのは、切断サイトが導入された単ドメイン抗体のみを含有するリガンド結合分子とリガンドを融合させた融合ポリペプチドの例である。切断サイトが切断されていない状態において、当該融合ポリペプチド中の単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり、単ドメイン抗体のリガンドに対する親和性が十分に強ければ、リガンドの生物活性は十分に阻害されている。この融合ポリペプチドを全身投与しても、融合ポリペプチド中のリガンドは中和されているためその生物活性を発揮することは無く、また融合ポリペプチドはリガンド単体より長い半減期を有する。切断サイトが腫瘍組織特異的プロテアーゼにより切断されるプロテアーゼ切断配列の場合、全身投与された融合ポリペプチドは、腫瘍組織で高発現するプロテアーゼによって単ドメイン抗体中のプロテアーゼ切断配列が切断されると、融合ポリペプチド中の単ドメイン抗体がリガンドへ結合できなくなり、リガンドの中和は解除され、リガンドを含む融合ポリペプチドの一部が放出され、腫瘍組織において生物学的作用を発揮することが可能である。
　図３、図４で示しているのは、切断サイトが導入された単ドメイン抗体と抗体ヒンジ領域と抗体Fc領域を含むリガンド結合分子、及び当該リガンド結合分子とリガンドの融合ポリペプチドの例である。図１、図２の態様と同じように、未切断の状態においてリガンドが単ドメイン抗体により中和されることが可能で、切断状態においてリガンドが放出され生物学的作用を発揮することが可能である。また、図３、図４の例では、未切断状態の複合体もしくは融合ポリペプチドに抗体Fc領域が含まれているため、未切断状態の半減期が図１、図２の例より更に長いことが予想される。
実施例５　プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトIL-6R単ドメイン抗体含有リガンド結合分子
５－１　抗ヒトIL-6R単ドメイン抗体を含むポリペプチドへのプロテアーゼ切断配列の導入によるリガンド結合分子の作製
　ヒトIL-6Rに対する単ドメイン抗体（配列番号：１２０）のC末端にと配列番号：１２１で示す抗体ヒンジ領域と抗体Ｆｃ領域配列のN末端を融合させたポリペプチドIL6R90-G1T3dCHdC（配列番号：１２２）中の単ドメイン抗体にプロテアーゼ切断配列を挿入し、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を作製した。まず、癌特異的に発現しているマトリプターゼ（MT-SP1）で切断されることが報告されているペプチド配列（LSGRSDNH、配列番号：３）を含む配列をポリペプチドIL6R90-G1T3dCHdCに挿入し、表２に示すリガンド結合分子を作製し、Expi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。なおプロテアーゼ切断配列を含まない対照分子としてIL6R90-G1T3dCHdCを発現および精製した。作製されたリガンド結合分子及び対照分子は図３で示すような二量体タンパク質である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
５－２　プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトIL-6R単ドメイン抗体含有リガンド結合分子のヒトIL-6Rに対する結合評価
５－２－１　プロテアーゼ処理
　実施例５－１で調製されたリガンド結合分子0.1mg/mLに対して、終濃度25nMとなるようにRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systemsm 3946-SE-010)を添加し、37度で一晩保温し、プロテアーゼ処理リガンド結合分子を含む溶液とした。プロテアーゼ未処理リガンド結合分子を含む溶液の作製の条件は、プロテアーゼの代わりにPBSを同体積で加え、同じ条件で保存した条件である。
５－２－２　リガンド結合分子のプロテアーゼ切断確認（SDS-PAGE）
　実施例５－２－１で実施されたプロテアーゼ処理でリガンド結合分子が切断されているかSDS-PAGEで確認した。実施例５－２－１で調製されたプロテアーゼ処理リガンド結合分子/プロテアーゼ未処理リガンド結合分子を含む溶液9μLを3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃で1分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel (4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain (novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図５に示す。図５に示すように、プロテアーゼ切断配列を含まない対照分子（Lane 12、13）がプロテアーゼ処理／未処理関係なく、バンドが同じ位置にあるのに対し、各プロテアーゼ切断配列が導入されたリガンド結合分子はプロテアーゼ処理後のみに生じる新しいバンドがあり、即ち、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子はプロテアーゼ処理で切断されたことが示された。
５－２－３　プロテアーゼ処理リガンド結合分子/プロテアーゼ未処理リガンド結合分子のヒトIL-6Rに対する結合評価
　実施例５－２－１で調製されたプロテアーゼ処理リガンド結合分子/プロテアーゼ未処理リガンド結合分子を含む溶液20μLに対し、PBS60μLを加えてIL-6R結合評価サンプルとした。サンプルのIL-6R結合評価はバイオレイヤー干渉法（BLI法）で測定した。IL-6R結合評価サンプルとIL-6RをTilted bottom (TW384) Microplate (Forte bio, 18-5076)に分注した。Protein Gセンサー（ForteBio, 18-0022）をPBSで水和し、25度の設定でOctet RED 384で測定を実施した。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間抗体をProtein Gセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後ヒト500nM IL-6Rが入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図６に示す。図６に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された各リガンド結合分子を使用する場合、プロテアーゼ未処理リガンド結合分子を使用する場合に比べて、ヒトIL-6R結合量が減少した。
実施例６　プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトIL-6R単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とヒトIL-6Rの融合タンパク質（リガンド結合分子‐IL-6R融合タンパク質）の作製及び評価
６－１　.プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトIL-6R単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とヒトIL-6Rの融合タンパク質の作製
　 実施例５－１で作製されたリガンド結合分子のN末端にグリシンとセリンからなる様々なリンカーを介してヒトIL-6R（配列番号：１２８）のC末端と融合し、リガンド結合分子-IL-6R融合タンパク質を作製した（表３）。これらの融合タンパク質は、当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。作製された融合タンパク質はそれぞれ、表３で示す配列のペプチド鎖を二つ有する二量体タンパク質である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　なお、プロテアーゼ切断配列を含まない対照分子として、IL6R90-G1T3dCHdC（配列番号：１２２）のN末端をリンカー介してIL-6RのC末端と融合させた分子（表４）を作製し、発現および精製を行った。作製された対照分子もそれぞれ、表４で示す配列のペプチド鎖を二つ有する二量体タンパク質である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
６－２　リガンド結合分子‐IL-6R融合タンパク質のプロテアーゼによる切断評価
６－２－１ プロテアーゼ処理
　実施例６－１で調製されたリガンド結合分子-IL-6R融合タンパク質0.1mg/mLに対して、終濃度25nMとなるようにRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain(hMT-SP1, R&D systemsm 3946-SE-010)を添加し、37度で一晩保温し、プロテアーゼ処理融合タンパク質を含む溶液とした。プロテアーゼ未処理融合タンパク質を含む溶液の作製条件は、プロテアーゼの代わりにPBSを同体積で加え、同じ条件で保存した条件である。
６－２－２　抗IL-6R単ドメイン抗体‐IL-6R融合タンパク質のプロテアーゼ切断確認（SDS-PAGE）
　実施例６－２－１で実施されたプロテアーゼ処理でリガンド結合分子‐IL-6R融合タンパク質が切断されているかSDS-PAGEで確認した。実施例６－２－１で調製されたプロテアーゼ処理融合タンパク質/プロテアーゼ未処理融合タンパク質を含む溶液9μLを3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃で1分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel (4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain (novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図７示す。図７に示すように、プロテアーゼ切断配列を含まない対照分子がプロテアーゼ処理／未処理関係なく、バンドが同じ位置にあるのに対し、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質はプロテアーゼ処理後のみに生じる新しいバンドがあり、即ち、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質はプロテアーゼ処理で切断されたことが示された。
６－２－３　ビオチン化抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子の作製
　リガンド結合分子に融合されたIL-6Rの遊離を検出する方法として、IL-6Rを認識する単ドメイン抗体含有分子にビオチンを付与し、ビオチン化された抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子に対して遊離IL-6Rの結合を検出する方法を用いた。ビオチン化抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子は以下のように作製された。　IL6R90-G1T3dCH1dC（配列番号：１２２）と同じ単ドメイン抗体部分配列を有している抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子を調製し、そのC末端にビオチン付加配列（AviTag配列、配列番号：１５９）を付加したIL6R90-FcBAPdC（配列番号：１６０）を作製した。IL6R90-FcBAPdCをコードする遺伝子断片を作製し、当業者公知の方法で動物細胞発現用ベクターに導入した。このときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼを発現する遺伝子を同時に導入し、ビオチン標識する目的でビオチンを添加した。遺伝子が導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的のビオチン化抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子（IL6R90-bio）を培養上清中に分泌させた。培養上清から当業者公知の方法でIL6R90-bioを精製した。
６－２－４　プロテアーゼ処理による融合タンパク質からのIL-6R遊離評価
　融合タンパク質のプロテアーゼ処理によるIL-6R遊離を実施例６－２－３で調製したビオチン化抗IL-6R単ドメイン抗体含有分子(IL6R90-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法（BLI法）で評価した。
　実施例６－２－１で調製したプロテアーゼ処理融合タンパク質、プロテアーゼ未処理融合タンパク質、IL6R90-bioをそれぞれTilted bottom (TW384) Micro plates（ForteBio、18-5076）の異なるウェルに分注した。Streptavidinバイオセンサー（ForteBio, 18-5021）をPBSを用いて水和し、27℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間IL6R90-bioをStreptavidinセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後プロテアーゼ処理融合タンパク質またはプロテアーゼ未処理融合タンパク質が入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図８に示す。図８に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子-IL-6R融合タンパク質の場合、プロテアーゼ未処理の場合に比べて、プロテアーゼ処理の場合ではIL6R90-bioに結合するヒトIL-6Rの量が増加した。即ち、プロテアーゼ処理により融合タンパク質中の単ドメイン抗体のIL-6Rに対する結合活性が減弱し、IL-6Rが融合タンパク質から遊離した。
実施例7　多様なプロテアーゼ切断配列導入の評価
7-1　多様なプロテアーゼ切断配列導入されたIgG抗体の作製
　ヒトIL-6Rに対する中和抗体（IgG抗体）であるMRA（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：１１９）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：１１８））の発現ベクターを当業者公知の方法で調製した。
　MMP-2、MMP-7、MMP-9で切断されることが知られているペプチド配列およびそれらの配列の近傍にグリシン-セリンポリマーからなる可動リンカーを含むペプチド配列を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　これらの挿入配列をMRA抗体の重鎖可変領域と定常領域の境界付近に挿入した改変重鎖MEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4（配列番号：１１１）、MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1T4（配列番号：１１２）、MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4SG1T4（配列番号：１１３）、MEIVHG4SMP9G4S-MEIVHG4SMP9G4SG1T4（配列番号：１１４）、MEIVHMP2.1-MEIVHMP2.1G1T4 (配列番号：１１５)、 MEIVHMP2.3-MEIVHMP2.3G1T4 (配列番号：１１６)、MEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4 (重鎖配列番号：１１７)を設計し、これらの改変重鎖をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
　これらの改変重鎖とMRA軽鎖を組み合わせて、表６に示すMRA改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞 (Invitrogen) もしくはExpi293細胞 (Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
7-2．多様なプロテアーゼ切断配列が導入されたIgG抗体のプロテアーゼによる切断の評価
　7-1で調製したMRA改変体がプロテアーゼにより切断されるどうかを検証した。プロテアーゼとしてリコンビナントヒトMMP-2（ R&D Systems, 902-MP-010 ）、リコンビナントヒトMMP-7（ R&D Systems, 907-MP-010 ）、リコンビナントヒトMMP-9（ R&D Systems, 911-MP-010 ）を用いた。なお、プロテアーゼは1 mM p-aminophenylmercuric acetate (APMA; abcam, ab112146 ) と混ぜ、37℃でそれぞれ1、24時間活性化させてから使用した。プロテアーゼ 50 nM、100 nM、または 500 nM、抗体50μg/mL、assay buffer(MMP Activity Assay Kit(Fluorometric - Green) (ab112146), Component C: Assay Buffer）または 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7.2 (以下、Tris)、37℃の条件下で20時間反応させた後に、プロテアーゼによる切断を還元SDS-PAGEによって評価した結果を図１１、１２、図１３に示す。MRA改変体抗体は、それぞれ表2に示すプロテアーゼと反応させている。MMP-2ではMEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.2G4S-MEIVHG4SMP2.2G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP2.4G4S-MEIVHG4SMP2.4G4SG1T4/MRAL-k0,MEIVHMP2.1-MEIVHMP2.1G1T4/MRAL-k0, MEIVHMP2.3-MEIVHMP2.3G1T4/MRAL-k0の切断が、MMP-7ではMEIVHMP7.2-MEIVHMP7.2G1T4/MRAL-k0の切断が、MMP-9ではMEIVHG4SMP2MP9G4S-MEIVHG4SMP2MP9G4SG1T4/MRAL-k0, MEIVHG4SMP9G4S-MEIVHG4SMP9G4SG1T4/MRAL-k0の切断が観察された。
実施例８　プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトPD-1単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とヒトPD-1の融合タンパク質（リガンド結合分子‐PD-1融合タンパク質）の作製及び評価
８－１.　プロテアーゼ切断配列が導入された抗ヒトPD-1単ドメイン抗体含有リガンド結合分子とヒトPD-1の融合タンパク質の作製
　ヒトPD-1に結合する単ドメイン抗体にヒト抗体定常領域を融合したPD102C3-G1T3noCyshinge（配列番号：１６１）, PD102C12-G1T3noCyshinge（配列番号：１６２）を当業者公知の方法で作製した。次に、PD102C3-G1T3noCyshingeと PD102C12-G1T3noCyshingeにプロテアーゼ切断配列を導入したのち、それぞれのN末端をグリシンとセリンからなる様々なリンカーを介してヒトPD-1の細胞外ドメイン（配列番号：１６３）のC末端と融合し、リガンド結合分子-PD-1融合タンパク質を作製した（表７）。これらの融合タンパク質は、当業者公知の方法でExpi293 (Life Technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。作製された融合タンパク質はそれぞれ、表７で示す配列のペプチド鎖を二つ有する二量体タンパク質である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
８－２.　リガンド結合分子‐PD-1融合タンパク質のプロテアーゼによる切断評価
８－２－１. プロテアーゼ処理
　実施例８－１で調製されたリガンド結合分子-PD-1融合タンパク質0.1mg/mLに対して、終濃度25nMとなるようにRecombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (hMT-SP1, R&D systemsm 3946-SE-010) を添加し、37度で一晩保温し、プロテアーゼ処理融合タンパク質を含む溶液とした。プロテアーゼ未処理融合タンパク質を含む溶液の作製条件は、プロテアーゼの代わりにPBSを同体積で加え、同じ条件で保存した条件である。
８－２－２. 抗PD-1単ドメイン抗体‐PD-1融合タンパク質のプロテアーゼ切断確認（SDS-PAGE）
　実施例８－２－１で実施されたプロテアーゼ処理でリガンド結合分子‐PD-1融合タンパク質が切断されているかSDS-PAGEで確認した。実施例８－２－１で調製されたプロテアーゼ処理融合タンパク質/プロテアーゼ未処理融合タンパク質を含む溶液9μLを3μLのサンプルバッファーと混合し、95℃で1分間保温した。次にMini-PROTEAN TGX gel (4-20% 15well) (Bio-Rad #456-1096)を用いて電気泳動を行い、Sample Blue Safe Stain (novex, LC6065)でタンパク質を染色した。その結果を図９示す。図９に示すように、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質はプロテアーゼ処理後のみに生じる新しいバンドがあり、即ち、各プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子を含む各融合タンパク質体はプロテアーゼ処理で切断されたことが示された。
８－２－３.　ビオチン化抗PD-1単ドメイン抗体含有分子の作製
　リガンド結合分子に融合されたPD-1の遊離を検出する方法として、PD-1を認識する単ドメイン抗体含有分子にビオチンを付与し、ビオチン化された抗PD-1単ドメイン抗体含有分子に対して遊離PD-1の結合を検出する方法を用いた。ビオチン化抗PD-1単ドメイン抗体含有分子は以下のように作製された。PD102C3-G1T3noCyshingeと同じ単ドメイン抗体部分配列を有している単ドメイン抗体含有分子を調製し、そのC末端にビオチン付加配列（AviTag配列、配列番号：１５９）を付加し、PD102C3-FcBAPdC（配列番号：１６８）を作製した。 また、PD102C12-G1T3noCyshingeと同じ単ドメイン抗体部分配列を有している抗PD-1単ドメイン抗体含有分子を調製し、そのC末端にビオチン付加配列（AviTag配列、配列番号：１５９）を付加し、PD102C12-FcBAPdC（配列番号：１６９）を作製した。PD102C3-FcBAPdC及びPD102C12-FcBAPdCをそれぞれコードする遺伝子断片を作製し、当業者公知の方法で動物細胞発現用ベクターに導入した。このときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼを発現する遺伝子を同時に導入し、ビオチン標識する目的でビオチンを添加した。遺伝子が導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的のビオチン化抗PD-1単ドメイン抗体含有分子（PD1-bio）を培養上清中に分泌させた。培養上清から当業者公知の方法でＰＤ1-bioを精製した。
８－２－４　プロテアーゼ処理による融合タンパク質からのPD-1遊離評価
　融合タンパク質のプロテアーゼ処理によるPD-1遊離を実施例８－２－３で調製したビオチン化抗PD-1単ドメイン抗体含有分子(PD1-bio) を用いてバイオレイヤー干渉法（BLI法）で評価した。
　実施例８－２－１で調製したプロテアーゼ処理融合タンパク質、プロテアーゼ未処理融合タンパク質、PD1-bioをそれぞれTilted bottom (TW384) Micro plates（ForteBio、18-5076）の異なるウェルに分注した。PD1-Bioは、測定サンプル中の単ドメイン抗体と同じエピトープに結合するように、適宜PD102C3-FcBAPdCまたはPD102C12-FcBAPdCが選択される。Streptavidinバイオセンサー（ForteBio, 18-5021）をPBSを用いて水和し、27℃の設定でOctet RED 384で測定が行われた。PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後200秒間PD1-bioをStreptavidinセンサーに結合させた。再度PBSが入ったウェルで30秒間ベースライン測定を実施し、その後プロテアーゼ処理融合タンパク質またはプロテアーゼ未処理融合タンパク質が入ったウェルで180秒間結合を測定し、PBSが入ったウェルで180秒間解離を測定した。結合の様子を示すリアルタイム結合グラフを図１０に示す。図１０に示す通り、プロテアーゼ切断配列が導入された単ドメイン抗体含有リガンド結合分子-PD-1融合タンパク質の場合、プロテアーゼ未処理の場合に比べて、プロテアーゼ処理の場合ではPD1-bioに結合するヒトPD-1の量が増加した。即ち、プロテアーゼ処理により融合タンパク質中の単ドメイン抗体のPD-1に対する結合活性が減弱し、PD-1が融合タンパク質から遊離した。
　前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
　本発明のリガンド結合分子は、リガンドを結合したまま生体内で運搬され、疾患組織において切断されてリガンドへの結合が弱まり、リガンドを疾患組織特異的にリリースできるので、疾患組織を特異的にリガンドに暴露することができる。また、当該リガンド結合分子は運搬時にリガンドの生物活性を抑制していることから、リガンドが全身的に作用してしまう恐れが減少し、疾患の治療に極めて有用である。

Claims (15)

  1. 　リガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子は単ドメイン抗体を含み、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり且つ少なくとも一つの切断サイトが導入されており、当該切断サイトが切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、リガンド結合分子。
  2. 　前記切断サイトはプロテアーゼ切断配列を含む、請求項１に記載のリガンド結合分子。
  3. 　前記プロテアーゼは標的組織特異的プロテアーゼである、請求項２に記載のリガンド結合分子。
  4. 　リガンド結合分子であって、当該リガンド結合分子は単ドメイン抗体を含み、当該単ドメイン抗体はリガンドに結合可能であり且つ少なくとも一つのプロテアーゼ切断配列を含み、当該プロテアーゼ切断配列は標的組織特異的プロテアーゼにより切断可能 であり、当該プロテアーゼ切断配列が切断された状態で当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合が、当該切断サイトが未切断の状態での当該リガンド結合分子の前記リガンドに対する結合より減弱される、リガンド結合分子。
  5. 　前記プロテアーゼは、癌組織特異的プロテアーゼまたは炎症組織特異的プロテアーゼである、請求項２から請求項４のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
  6. 　前記プロテアーゼは、マトリプターゼ、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、およびメタロプロテアーゼから選択される少なくとも一つのプロテアーゼである、請求項２から請求項５のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
  7. 　前記プロテアーゼ切断配列は、配列番号：２～８２、７８８～８２７で示す配列、表１に記載の配列から選ばれる一つまたは複数の配列を含む配列である、請求項２から請求項５のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
  8. 　前記切断サイトまたは前記プロテアーゼ切断配列が切断された状態では、前記リガンドがリガンド結合分子から遊離する、請求項１から請求項７のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
  9. 　前記単ドメイン抗体はVHH、または単ドメインVH抗体、また単ドメインVL抗体である請求項１から請求項８のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
  10. 　前記リガンドは生物活性を有する分子であり、前記単ドメイン抗体は前記リガンドに対する中和活性を有する、請求項１から請求項１０のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子。
  11. 　前記単ドメイン抗体はVHHまたは単ドメインVH抗体であり、前記切断サイトまたは前記プロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、請求項１から請求項１０のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子：
    　単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１２番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３５ｂ番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６５番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体７３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から７９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８３番アミノ酸（Kabatナンバリング）から８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９５番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体１０１番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１１３番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
  12. 　前記単ドメイン抗体は単ドメインVL抗体であり、前記切断サイトまたは前記プロテアーゼ切断配列は、前記単ドメイン抗体の下記配列から選ばれる一つまたは複数の配列に含まれる一つまたは複数の位置に導入される、請求項１から請求項１０のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子：
    　単ドメイン抗体７番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１９番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体２４番アミノ酸（Kabatナンバリング）から３４番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体３９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から４６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体４９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から６２番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体５０番アミノ酸（Kabatナンバリング）から５６番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体８９番アミノ酸（Kabatナンバリング）から９７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列、単ドメイン抗体９６番アミノ酸（Kabatナンバリング）から１０７番アミノ酸（Kabatナンバリング）までの配列。
  13. 　前記リガンドと、請求項１から請求項１２のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子とで形成されている複合体。
  14. 　前記リガンドと請求項１から請求項１２のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子が融合されている融合タンパク質。
  15. 請求項１から請求項１２のいずれかの一項に記載のリガンド結合分子、または請求項１３に記載の複合体、または請求項１４に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
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