CN111712518A - 对免疫球蛋白样转录物3(ilt3)具有特异性的抗体及其用途 - Google Patents

对免疫球蛋白样转录物3(ilt3)具有特异性的抗体及其用途 Download PDF

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Abstract

描述了对免疫球蛋白样转录物3(ILT3)，也称为白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(LILRB4)，具有特异性的人源化、非混杂单克隆抗体。

Description

对免疫球蛋白样转录物3(ILT3)具有特异性的抗体及其用途
发明背景
(1)发明领域
本发明提供了对在髓性免疫细胞的表面上表达的抑制性受体免 疫球蛋白样转录物3(ILT3)具有特异性的非混杂单克隆抗体。
(2)相关技术的描述
免疫球蛋白样转录物3(ILT3)，命名为CD85k，也称为白细胞 免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(LILRB4)和白细胞免疫球蛋白样 受体5(LIR-5)，是包含细胞质免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM) 基序并参与免疫应答的下调的I型膜蛋白(Cella等，J Exp Med.185(10)：1743-51(1997)；Samarisdis等，Eur J Immunol 27(3)： 660-665(1997))。ILT3的表达在致耐受性树突状细胞上被上调。 该基因是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员，其见于在染 色体区域19q13.4处的基因簇中。所编码的蛋白质属于LIR受体的亚 家族B类，其包含两个或四个细胞外免疫球蛋白结构域、跨膜结构域 和两个至四个ITIM。
ILT3由髓样抗原呈递细胞(APC)选择性表达，例如单核细胞、 巨噬细胞和树突状细胞，例如在IL-10或维生素D3存在下分化的单 核细胞衍生的树突状细胞。ILT3由447个氨基酸组成，预测的分子 量为约47kD。ILT3的氨基末端部分以23个氨基酸的疏水信号肽开始，随后是包含两个C2型免疫球蛋白超家族结构域的胞外结构域， 具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列，减去C端His标记。(猕猴 ILT3细胞外结构域具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列)。ILT3的推 定跨膜结构域由21个氨基酸组成，其后是167个氨基酸的长胞质区， 其特征是存在由26个氨基酸残基间隔开的基序，令人联想到在KIR 中确定的作为蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-1的结合位点的ITIM基序 (天然-杀伤细胞Ig受体)。ILT3在免疫细胞上表达，在那里其与抗 原呈递细胞上的MHC I类分子结合，并转导抑制免疫应答的刺激的 负信号。该受体还可以在抗原捕获和呈递中起作用。ILT3被认为是 控制炎症响应和细胞毒性，以帮助集中免疫应答和限制自身反应性。 已鉴定出编码ILT3的不同亚型的多种转录物变体。
公开了使用抗体来调节ILT3活性以及用于抑制移植排斥或用于 癌症或传染病治疗的应用的专利公布包括美国公布号20090202544， 20150110714，20150139986和20170267759；和国际公布号 WO2013043569，WO2013181438，WO2014116846，WO2016049641，WO2016127427，WO2018089300和WO2018148494。令人感兴趣是 国际公布号WO2017015227，其公开了CD166，也称为淋巴细胞粘附 分子(ALCAM)，它是ILT3的配体，并且在一些实施方式中提供了 治疗癌症的方法，该方法包括针对CD166或ALCAM的抗体。还令 人感兴趣的是美国专利号7777008和8901281，其公开了用于各种各 样治疗的单克隆抗体9B11，其中期望的是上调用于抗癌治疗的免疫 系统和下调用于抑制移植排斥的免疫系统。
虽然专利公布公开了抗ILT3抗体，但在一些情况下没有具体抗 体被公开或多种具体抗体被公开，其在一些情况下被显示是混杂的且 与一种或多种ILT3相关受体如LILRA6和ILT8交叉反应。混杂抗 ILT3抗体可以具有脱靶效应，这可以具有使其对治疗应用的使用成 为禁忌的不期望的效应。因此需要特异性结合ILT3且对其他相关受 体没有可测量的乱交的抗体和抗原结合片段。
发明内容
本发明提供了单克隆抗体和抗原结合片段，其特异性结合免疫球 蛋白样转录物3(ILT3)，而与密切相关的蛋白质(例如，ILT5，ILT7， ILT8，或ILT11)没有可测量的结合，如通过以下测定的：(ⅰ)使用10μg/mL抗体或抗原结合片段的细胞ELISA，或(ii)使用10μg/mL抗体或抗原结合片段的Biacore。在特定实施方式中，所述抗体和抗 原结合片段特异性结合人ILT3和猕猴ILT3两者。这些抗体和抗原结 合片段能够拮抗ILT3活性，从而增强树突状细胞的激活和T细胞的 初免(priming)。被耐受的树突状细胞和骨髓衍生抑制细胞(MDSC)也响应于这些抗体。此外，这些抗体在人源化NSGTM小鼠模型系统 (杰克逊实验室，巴港，缅因州)中的体内研究显示，这些抗体可以 具有减少肿瘤负荷和将细胞表型转移到更加激活的状态的能力。
在临床试验的样品，ILT3表达，如PD-L1、LAG-3和GEP标签， 被发现与对抗PD-1抗体(派姆单抗)的响应性相关联。在某些癌症 类型中，循环中的可溶性ILT3也增加。总之，本发明的抗ILT3抗体 可用于治疗特定癌症，或者是作为单一疗法治疗，或者是与抗PD-1 和/或抗PD-L1抗体组合，以增强对抗PD-1或抗PD-L1抗体的响应 性，特别是在癌症对抗PD-1或抗PD-L1单一疗法无响应的癌症治疗 中。在特定的实施方式中，本发明提供了嵌合的或人源化的抗ILT3 抗体。在某些实施方式中，抗体可以是与本文公开的抗体竞争结合本 文公开的ILT3表位的全人抗体。
本发明提供了抗体或抗原结合片段，其包含具有重链互补决定区 (HC-CDR)1、2和3的重链可变VH结构域的一个、两个或三个互 补决定区(CDR)，和具有LC-CDR1、2和3的轻链可变结构域VL的一个、两个或三个CDR，其中所述抗体或抗原结合片段能够特异性 结合人ILT3，其中所述抗体或抗原结合片段的结合可以通过细胞 ELISA或Biacore测定。
在另一个实施方式中，所述抗体或抗原结合片段与人ILT3上的 表位结合或与所公开的抗体竞争结合人ILT3上的表位，其中所述表 位包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8所述氨基酸序列中的一个或 多个内的至少一个氨基酸。在另一个的实施方式中，所述抗体或抗原 结合片段与人ILT3上的表位结合或与所公开的抗体竞争结合人ILT3 上的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8所述 氨基酸序列中的一个或多个。在另一个的实施方式中，所述抗体或抗 原结合片段与人ILT3上的表位结合或与所公开的抗体竞争结合人ILT3上的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8 所述氨基酸序列。在特定实施方式中，通过氢氘交换质谱法 (HDX-MS)分析来确定所述表位。
本发明进一步提供了结合人ILT3的抗体或抗原结合片段，其包 含重链(HC)，其中重链可变结构域(VH)包含具有选自SEQ ID NO: 22、49、57、65、73、81、89、97和105的氨基酸序列的重链互补决 定区(HC-CDR)3，或具有与选自SEQ ID NO:22、49、57、65、73、 81、89、97和105的氨基酸序列具有3、2或1个差异的氨基酸序列。 在一些实施方式中，所述氨基酸序列差异是保守改变/置换。在特定的 实施方式中，所述结合人ILT3的抗体或抗原结合片段包含重链(HC)， 其中重链可变结构域(VH)包含具有选择选自SEQ ID NO:23、49、 57、65、73、81、89、97和105的氨基酸序列的重链互补决定区 (HC-CDR)3，或具有与选自SEQ ID NO:23、49、57、65、73、81、 89、97和105的氨基酸序列具有3、2或1个差异的氨基酸序列。在 特定的实施方式中，所述氨基酸序列差异是保守改变/置换。
在另一个实施方式中，所述抗体或抗原结合片段与人ILT3上的 表位结合或与所公开的抗体竞争结合人ILT3上的表位，其中所述表 位包含来自SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8所述氨基酸序列中的一 个或多个的至少一个氨基酸。在另一个的实施方式中，所述抗体或抗 原结合片段与人ILT3上的表位结合或与所公开的抗体竞争结合人 ILT3上的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8 所述氨基酸序列中的一个或多个。在另一个的实施方式中，所述抗体 或抗原结合片段与人ILT3上的表位结合或与所公开的抗体竞争结合人ILT3上的表位，其中所述表位包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7和 8所述氨基酸序列。在特定实施方式中，通过氢氘交换质谱法 (HDX-MS)分析来确定所述表位。
本发明进一步提供了结合人ILT3的抗体或抗原结合片段，其包 含(a)HC，其具有可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:17、 47、55、63、71、79、87、95或103所示氨基酸序列的可变结构域互 补决定区(HC-CDR)1；具有SEQ ID NO:18、48、56、64、72、80、 88、96或104所示氨基酸序列的HC-CDR2；具有SEQ ID NO:23、 49、57、65、73、81、89、97或105所示氨基酸序列的HC-CDR3； 及其其中所述HC-CDR中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体；和(b)轻链(LC)，其具有可 变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:27、50、58、66、74、82、 90、98或106所示氨基酸序列的可变结构域互补决定区(LC-CDR) 1；具有SEQ ID NO:43、51、59、67、75、83、91、99或107所示 氨基酸序列的LC-CDR2；具有SEQ ID NO:44、60、68、76、84、92、 100或108所示氨基酸序列的LC-CDR3；及其其中所述LC-CDR中的 一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合 的变体。在特定的实施方式中，所述氨基酸序列差异是保守改变/置换。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，HC-CDR1具 有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列；HC-CDR2具有SEQ ID NO:19、 20或21所示氨基酸序列；HC-CDR3具有SEQ IDNO:23所示氨基酸 序列；和LC-CDR1具有SEQ ID NO:34、35、36、37、38、39、40、 41或42所示氨基酸序列；LC-CDR2具有SEQ ID NO:43所示氨基酸 序列；和LC-CDR3具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列；及其其中 HC-CDR和LC-CDR中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体。在特定的实施方式中，所述氨基酸 序列差异是保守改变/置换。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，HC-CDR1具 有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列；HC-CDR2具有SEQ ID NO:20 所示氨基酸序列；HC-CDR3具有SEQ ID NO:23所示氨基酸序列； 和LC-CDR1具有SEQ ID NO:41所示氨基酸序列；LC-CDR2具有 SEQ ID NO:43所示氨基酸序列；和LC-CDR3具有SEQ ID NO:44 所示氨基酸序列；及其其中HC-CDR和LC-CDR中的一个或多个具 有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体。在特定的实施方式中，所述氨基酸序列差异是保守改变/置换。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，所述抗体或抗 原结合片段包含(a)VH，其具有选自人VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、 和VH6家族，及其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸 置换、添加、缺失或其组合的变体的框架；和(b)VL，其具有选自 人Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6、Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ4、Vλ5、Vλ6、 Vλ7、Vλ8、Vλ9、和Vλ10家族，及其具有1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体的框架。在特定的 实施方式中，所述氨基酸序列差异是保守改变/置换。
在特定实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含(a)VH，其 具有人VH1家族框架或其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个 氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体；和(b)VL，其具有人Vκ5 家族框架或其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、 添加、缺失或其组合的变体。在特定的实施方式中，所述氨基酸序列 差异是保守改变/置换。
在所述抗体的另一个实施方式中，所述抗体包含人IgG1、IgG2、 IgG3或IgG4 HC恒定区或其与天然IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种 型HC恒定结构域的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体。在特定方面，恒 定结构域可包含C-末端赖氨酸或可缺少C-末端赖氨酸或C-末端甘氨 酸-赖氨酸二肽。
在特定的实施方式中，重链恒定结构域是具有人IgG1同种型， 其已被修饰以具有减少的或很小的效应子功能。在进一步的方面，很 小的效应子功能是由于效应子较低(effector-less)Fc突变，其可包含 或由如使用Kabat编号确定的突变N297A或D265A/N297A组成，在 这种情况下很小的效应子功能是由于无糖基化(aglycosylation)(参 见例如，SEQ ID NO:211所示氨基酸序列，其中N297A突变对应于 氨基酸位置180；D265A突变(如果存在的话)将对应于氨基酸位置148)。在特定方面，IgG1已被修饰为包含或由如使用Kabat编号确 定的L234A，L235A和D265S突变组成，以使Fc效应子较低(参见 例如SEQ IDNO:12或13所示氨基酸序列，其中L234A，L235A和 D265S突变分别对应于氨基酸位置117、118和148)。
在另一方面，HC恒定结构域具有人IgG4同种型，并且该同种型 还包含脯氨酸取代位置228(EU编号)处的丝氨酸残基，其对应于 SEQ ID NO:9或10的位置108(丝氨酸在位置108)。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，所述抗体包含 人κ或λLC恒定结构域或其与天然人κ或λLC恒定结构域的氨基酸 序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添 加、缺失或其组合的变体。在特定的实施方式中，所述氨基酸序列差 异是保守改变/置换。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，所述抗体包含 (ⅰ)VH，其具有选自人VH1、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6家族的 框架和人IgG1或IgG4 HC恒定结构域或其与天然人IgG1或IgG4同 种型HC恒定结构域的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体；和(ⅱ)VL，其 具有选自人Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6、Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ4、 Vλ5、Vλ6、Vλ7、Vλ8、Vλ9和Vλ10家族的框架和人κ或λLC恒定结 构域或其与天然人κ或λLC恒定结构域的氨基酸序列相比包含1、2、 3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变 体。在特定的实施方式中，所述氨基酸序列差异是保守改变/置换。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，所述抗体包含 (i)具有人VH2家族框架的VH和具有人Vκ5家族框架的VL；(ii) 人IgG1或IgG4 HC恒定结构域或其与天然人IgG1或IgG4同种型 HC恒定结构域的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体；和(iii)人κLC 恒定结构域或其与天然人κLC恒定结构域的氨基酸序列相比包含1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合 的变体。在特定的实施方式中，所述氨基酸序列差异是保守改变/置换。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，所述抗体包含 (i)具有人VH1家族框架的VH和具有人Vκ5家族框架的人VL；(ii) 人IgG4 HC恒定结构域或其与天然人IgG4同种型HC恒定结构域的 氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置 换、添加、缺失或其组合的变体；和(iii)人κLC恒定结构域或其 与天然人κLC恒定结构域的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、 7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体。在特定的 实施方式中，所述氨基酸序列差异是保守改变/置换。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，所述抗体或抗 原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70；SEQ IDNO:77和SEQ ID NO:78；SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94；或SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102所 示氨基酸序列的VH和VL。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，所述抗体或抗 原结合片段包含具有SEQ ID NO:117、118、119、123、124或125 所示氨基酸序列的VH；和具有SEQ ID NO:126、127、128、129、130、 131、132、133、134、135、136、137、138、139、140或141所示氨 基酸序列的VL。
在所述抗体或抗原结合片段的另一个实施方式中，所述抗体或抗 原结合片段包含具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的VH；和具有 SEQ ID NO:140所示氨基酸序列的VL。
在所述抗体的另一个实施方式中，所述抗体包含HC恒定结构域， 其包含SEQ IDNO:9、10、11、12或13所示氨基酸序列。在特定方 面，包含SEQ ID NO:9、11、12或13所示氨基酸序列的HC恒定结 构域可以缺少C端赖氨酸或C端甘氨酸-赖氨酸二肽。在特定实施方 式中，HC恒定结构域包含SEQ ID NO:10所示氨基酸序列。
在所述抗体的另一个实施方式中，所述抗体包含LC恒定结构域， 其包含SEQ IDNO:14所示氨基酸序列。
在所述抗体的另一个实施方式中，所述抗体包含HC，所述HC 包含SEQ ID NO:142、143、144、148、149、150、167、168、169、 170、174、175、176、177、178、182、183、184、185、186、187、 191、192或193的氨基酸序列。在特定方面，包含SEQ ID NO:142、 143、144、148、149、150、167、168、169、170、174或175所示氨 基酸序列的HC可以缺少C端赖氨酸。或C端甘氨酸-赖氨酸二肽。 在特定实施方式中，HC包含如SEQ ID NO:143或177所示氨基酸序 列。在特定的实施方式中，如SEQ ID NO:177所示HC进一步缺少C 端甘氨酸。
在所述抗体的另一个实施方式中，所述抗体包含LC，所述LC 包含SEQ ID NO:151、152、153、154、155、156、157、158、159、 160、161、162、163、164、165或166所示氨基酸序列。在特定的实 施方式中，所述LC包含SEQ ID NO:165所示氨基酸序列。
在所述抗体的另一个实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NO: 143所示氨基酸序列的HC和含有SEQ ID NO:165所示氨基酸序列的 LC。在特定方面，包含SEQ ID NO:143所示氨基酸序列的HC缺少 C端赖氨酸残基或C端甘氨酸-赖氨酸二肽。
本发明进一步提供了嵌合、人源化或重组人抗体或抗原结合片 段，其与人ILT3上的表位结合，其中所述表位包含SEQ ID NO:3、4、 5、6、7和8所示氨基酸序列内的至少一个氨基酸。在另一个实施方 式中，所述嵌合、人源化或重组人抗体或抗原结合片段与人ILT3上 的表位结合，所述表位包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8所示氨 基酸序列。在这些实施方式中，通过氢氘交换质谱法(HDX-MS)分 析来确定所述表位。
本发明进一步提供了结合ILT3的嵌合、人源化或重组人抗体或 抗原结合片段，其中所述结合交叉阻断抗体或与所述抗体竞争结合， 所述抗体包含具有SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链。在另一个实施方式中，交叉阻断 抗体或与所述抗体竞争的所述嵌合、人源化或重组人抗体或抗原结合 片段结合包含SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8所示氨基酸序列的ILT3 上的表位，所述抗体包含具有SEQ IDNO:15所示氨基酸序列的重链 和具有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链。
本发明进一步提供了一种组合物，其包含本文公开或要求保护的 抗体或抗原结合片段中的任一种的一种或多种和药学上可接受的载 体。
本发明进一步提供了一种用于治疗受试者的癌症的方法，所述方 法包括向所述受试者施用足以治疗所述受试者的癌症的有效量的本 文公开或要求保护的抗体或抗原结合片段。
在另一个实施方式中，所述癌症是胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺 癌、头颈癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢 癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈 癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、 小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤 或血液组织癌。
本发明还提供了一种用于治疗受试者的癌症的方法，其包括向所 述受试者同时或连续施用本文中公开的抗体或抗原结合片段与PD-1、 PD-L1和/或PD-L2的一种或多种抑制剂或拮抗剂的组合。在一个实 施方式中，PD-1的拮抗剂是与人PD-1结合并阻断PD1与人PD-L1 和PD-L2结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，PD-L1 或PD-L2的拮抗剂是与人PD-L1或PD-L2结合并阻断人PD-L1或 PD-L2与PD1结合的抗体或其抗原结合片段。
在另一个实施方式中，所述抗PD1拮抗剂是抗PD-1抗体，其是 纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、西米普利单 抗(cemiplimab)或pidilizumab，且所述PD-L1抑制剂是杜鲁麦单抗 (durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿伐单抗(avelumab)、 YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。
本发明进一步提供了本文公开或要求保护的抗体或抗原结合片 段，其用于治疗受试者的癌症。
在另一个实施方式中，所述癌症是胰腺癌，黑素瘤，乳腺癌，肺 癌，头颈癌，支气管癌，结直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢 癌，膀胱癌，脑癌或中央神经系统癌，周围神经系统癌，食道癌，宫 颈癌，子宫或子宫内膜癌，口腔或咽癌癌，肝癌，肾癌，睾丸癌，胆 道癌，小肠或阑尾癌，唾液腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌，骨肉瘤，软 骨肉瘤或血液学组织癌。
本发明进一步提供了本文公开或要求保护的抗体或抗原结合片 段，其用于治疗受试者的癌症，其中所述治疗还包含PD-1，PD-L1 和/或PD-L2的一种或多种抑制剂或拮抗剂。
在一个实施方式中，所述PD-1的拮抗剂是与人PD-1结合并阻断 PD1与PD-L1和PD-L2结合的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，所述PD-L1或PD-L2的拮抗剂是与人PD-L1 或PD-L2结合并阻断人PD-L1或PD-L2与PD1结合的抗体或其抗原 结合片段。
在另一个实施方式中，所述抗PD-1抗体是纳武单抗，派姆单抗， 西米普利单抗，或pidilizumab，且所述PD-L1抑制剂是杜鲁麦单抗， 阿特珠单抗，阿伐单抗，YW243.55.S70，MPDL3280A，MEDI-4736， MSB-0010718C，或MDX-1105。
本发明进一步提供了本文公开或要求保护的抗体或抗原结合片 段的用于治疗癌症用途。
本发明进一步提供了本文公开或要求保护的抗体或抗原结合片 段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在另一个实施方式中，所述癌症是胰腺癌，黑素瘤，乳腺癌，肺 癌，头颈癌，支气管癌，结直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，卵巢 癌，膀胱癌，脑癌或中央神经系统癌，周围神经系统癌，食道癌，宫 颈癌，子宫或子宫内膜癌，口腔或咽癌癌，肝癌，肾癌，睾丸癌，胆 道癌，小肠或阑尾癌，唾液腺癌，甲状腺癌，肾上腺癌，骨肉瘤，软 骨肉瘤或血液学组织癌。
本发明进一步提供了一种组合物，其包含上述抗体或抗原结合片 段中的任一种和药学上可接受的载体。在特定实施方式中，该组合物 包含包含具有C端赖氨酸的重链的抗体和包含缺少C端赖氨酸的重 链的抗体的混合物。在特定的实施方式中，该组合物包含本文公开的 抗体，其中主要的抗体形式包含具有C端赖氨酸的重链。在特定的实 施方式中，该组合物包含本文公开的抗体，其中主要的抗体形式包含 缺少C端赖氨酸的重链。在特定的实施方式中，该组合物包含本文公 开的抗体，其中该组合物中约100％的所述抗体包含缺少C端赖氨酸 的重链。
附图说明
图1A，图1B，图1C，图1D，图1E和图1F显示了本文公开的 抗ILT3抗体中的多种对单克隆抗体9B11和小鼠IgG1(mIGgG1)的 选择性的比较，使用基于细胞的ELISA格式。表达人ILT3(图1A)， 猕猴ILT3(图1B)，人ILT5(图1C)，人ILT7(图1D)，人ILT8 (图1E)，或人ILT11(图1F)的CHO-K1细胞各自用单克隆抗体 p40B5(LB179.40B5.1A1)，p49C6(LB181.49C6.1A1)，和p52B8 (lb181.52B8.1B1)；抗体9B11(具有SEQ ID NO:33(轻链)和SEQ ID NO:34(重链)的氨基酸序列的美国专利号7,777,008)和小鼠IgG1 测试。
图2A显示关于mAb 10的变体的结合亲和力，等电点，单体种 类纯度和热稳定性测量的数据特性。术语：“huILT3”是指人ILT3； “rhILT3”是指猕猴ILT3；“pI”是指等电点；“Tm”是指热展开曲线的温 度中点；“Tagg”是指热聚集曲线的中点；“SEC”是指尺寸排阻超高效 液相色谱法。
图2B显示mAb 10(M64V VH1 IgG4)的人源化轻链变体的SEC 纯度与熔融温度的关系。VL1-VL8分别指具有SEQ ID NO:126-133所 示氨基酸序列的变体。
图3A显示由嵌合抗ILT3 52B8小鼠52B8 VH亲本/人IgG4 (S228P)：小鼠52B8亲本VL/人κ抗体(“c58B2”；mAb 73)结合 的人ILT3胞外结构域氨基酸残基的氘标记差示热图。这些六肽结构 域，其包含由所述抗体结合的表位(残基18-23(ISWGNS；SEQ ID NO: 3)，残基64-69(IPSMTE；SEQ ID NO:4)，残基96-101(MTGAYS； SEQ ID NO:5)，残基124-131(QSRSPMDT；SEQ ID NO:6)，残 基152-159(AQQHQAEF；SEQ ID NO:7)和残基184-187(LLSH；SEQ ID NO:8))，位于ILT3细胞外结构域的D1和D2结构域的边 界附近。该具有C端His标签的人细胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
图3B显示人ILT3的细胞外结构域的表面结构模型的第一视图和 第二视图。模型的暗区显示了包含被c58B8(mAb 73)结合的人 ILT3-His表位的六肽结构域的位置。
图3C是显示在ILT3细胞外结构域上的表位的位置的带状图： ISWGNS(SEQ ID NO:3)，IPSMTE(SEQ ID NO:4)，MTGAYS (SEQ ID NO:5)，QSRSPMDT(SEQ ID NO:6)，AQQHQAEF(SEQ ID NO:7)和LLSH(SEQ ID NO:8)。
图3D显示被抗体ZM4.1结合的人ILT3细胞外结构域氨基酸残 基的氘标记差示热图。
图3E显示被抗体DX446结合的人ILT3细胞外结构域氨基酸残 基的氘标记差示热图被。
图3F显示被抗体DX439结合的人ILT3细胞外结构域氨基酸残 基的氘标记差示热图。
图3G显示被抗体9B11结合的人ILT3细胞外结构域氨基酸残基 的氘标记差示热图。
图4显示了在人源化肿瘤模型(Panc08.13和SK-MEL-5)中的多 个剂量之后，在血液中的游离c52B8(mAb 73)浓度。游离c52B8 浓度用圆圈和正方形表示。虚线表示在C57BL/6J小鼠中静脉推注(IV bolus)施用1、3、10或30mg/kg的人源化IgG4后的模拟历史抗体 水平。
图5A显示了人树突状细胞(DC)功能测定法，展示了抗ILT3 抗体嵌合抗体，其中与IgG4 Fc(c52B8；mAb 73)，IgG1 Fc(mAb 78) 或IgG1(N297A)Fc(mAb 76)融合的来自p52B8的VH和VL具有 可比的激活树突状细胞(DC)的能力。制备了人未成熟DC，并在5 天内用GM-CSF(1000U/mL)和IL-4(1000U/mL)分化为CD11c+ 树突状细胞。将这些细胞用IL-10，LPS(革兰氏阴性细菌细胞壁组分 和TLR4配体(Raetz et al.Ann.Rev.Biochem.71:635–700(2002))， 和不同浓度的所指示的抗体处理42个小时。显示的数据为两次技术 重复的平均值和s.d.。该实验代表四次独立研究。对照IgG没有效果 (未示出)。
图5B和图5C显示人源化52B8(lot 26AVY；mAb 46)与c52B8 (mAb 73)在使用来自两个不同健康人类供体的DC的人DC功能测 定法中不可区分。显示的数据是两次技术重复的平均值和s.d.。显示 的数据代表了使用这两个供体的三次独立研究。
图6A和图6B显示了抗ILT3抗体c52B8(mAb 73)和人源化抗 ILT3抗体52B8(mAb46；lot 26AVY)降低了骨髓衍生抑制细胞 (MDSC)的抑制能力。用4:1的T细胞与MDSC之比进行该T细胞 抑制测定。显示的数据是在T细胞测定步骤的水平上的三个技术重复 的平均值和s.d.。显示的实验代表使用来自相同两个供体的PBMC的 两次独立研究，具有定性地相似的结果。
图7显示c52B8抑制携带SK-MEL-5皮下肿瘤的SK-MEL-5人 -NSG小鼠中的SK-MEL-5肿瘤的生长。动物基于移植后第21天的肿 瘤体积被随机分配到治疗，在第21天开始每周一次皮下给予20毫克 /千克的c52B8或同种型对照。顶部图显示的数据是平均值和std.误差(每组九只)。个体动物肿瘤生长曲线显示在中间图和底部图中。对 照组和52B8组两者中体重均下降到相似的程度。该研究代表三次独 立研究。
图8A，图8B，图8C和图8D显示c52B8在肿瘤生长和免疫激 活方面在SK-MEL-5hu-NSG模型中的效果。图8A显示肿瘤生长曲 线。图8B显示在第2剂量后7天收集的TIL的CyTOF定量：CD4+调节性T细胞％和在CD4+T细胞上的CD69表达水平；图8C显示在 研究结束时收获的血浆中的sHLA-G水平；图8D显示肿瘤中的人 CD3+T细胞浸润的IHC分析，每组中4个肿瘤。
图9A，图9B，图9C和图9D显示c52B8和派姆单抗组合在Panc 08.13人-NSG小鼠中的效果。图9A显示肿瘤生长曲线。图9B显示 来自在研究结束时收获的肿瘤的CD4+ T细胞上的调节性T细胞％和 CD69表达水平的CyTOF定量；图9C显示在终点血液样品中的血浆 sHLA-G水平；图9D显示用10plex MSD(Meso Scale Discovery)定 量的在终点血液样品中的血浆IFNγ和IL-8水平。
图10显示在MDSC/T细胞抑制测定中，在4:1的T细胞与MDSC 的比率下，人源化抗ILT3抗体52B8(mAb 46)将MDSC的抑制能 力降低到与嵌合抗ILT3抗体c52B8(mAb 73)可比的程度。
图11显示使用从人类供体D001003835获得的MDSC细胞，在 MDSC/T细胞抑制测定中，在4:1或8:1的T细胞与MDSC的比率下， 人源化抗ILT3抗体52B8(mAb 46)和派姆单抗组合的效果。
图12显示使用从人类供体D001003180获得的MDSC细胞，在 MDSC/T细胞抑制测定中，在8:1的T细胞与MDSC的比率下，人源 化抗ILT3抗体52B8(mAb 46)和派姆单抗组合的效果。
图13显示使用从人类供体D001003507获得的MDSC细胞，在 MDSC/T细胞抑制测定中，在4:1的T细胞与MDSC的比率下，人源 化抗ILT3抗体52B8(mAb 46)和派姆单抗组合的效果。
图14显示使用从人类供体D001003428获得的MDSC细胞，在 MDSC/T细胞抑制测定中，在8:1的T细胞与MDSC的比率下，人源 化抗ILT3抗体52B8(mAb 46)和派姆单抗组合的效果。
图15显示了人源化抗ILT3抗体52B8(mAb46)和派姆单抗组 合在IL-10极化的人单核细胞衍生树突状细胞与同种异基因CD8+ T 细胞的混合淋巴细胞反应中的效果，孵育四天后测量培养物上清液中 的干扰素γ(IFNγ)作为T细胞激活的读出。
具体实施方式
本发明提供了对在髓性免疫细胞的表面上表达的抑制性受体免 疫球蛋白样转录物3(ILT3)具有特异性的非混杂单克隆抗体。
定义
“免疫球蛋白样转录物3”(在本文中缩写为“ILT3”，并且也称为 LIR-5，LILRB4，或CD85k)，如本文所用并且除非另有指明，是指 ILT3家族的人类成员，其由髓样抗原呈递细胞(APC)如单核细胞， 巨噬细胞和树突状细胞(例如，在存在IL-10或维生素D3的情况下分化的单核细胞衍生树突状细胞)选择性表达。
如本文所用，“抗体”是指完整的免疫球蛋白，包括重组产生的形 式，并且包括表现出期望的生物学活性的抗体的任何形式。因此，它 以最广泛的意义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克 隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，人源 化抗体，全人源抗体，双对位抗体，人源化骆驼科重链抗体和非人/ 人嵌合抗体。“亲本抗体”是在抗体出于预期用途而修饰之前，如用作 人治疗性抗体的非人抗体的人源化，通过使免疫系统暴露于抗原而获 得的抗体。
在一个实施方式中，“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少 两个重链(HC)和两个轻链(LC)的糖蛋白，或其抗原结合部分。 每条重链由重链可变区或结构域(在本文中缩写为VH)和重链恒定 区或结构域组成。在某些天然存在的IgG，IgD和IgA抗体中，重链恒定区由三个结构域CH1，CH2和CH3组成。在某些天然存在的抗 体中，每个轻链均由轻链可变区或结构域(在这里缩写为VL)和轻 链恒定区域或结构域组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。人VH包括六个家族成员：VH1，VH2，VH3，VH4，VH5和VH6，和人VL家 族包括16个家族成员：Vκ1，Vκ2，Vκ3，Vκ4，Vκ5，Vκ6，Vλ1，Vλ2，， Vλ3，Vλ4，Vλ5，Vλ6，Vλ7，Vλ8，Vλ9，和Vλ10。这些家庭成员中的 每一个都可以进一步分为特定的亚型。
可以将VH和VL区进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)， 其间散布着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由 三个CDR区和四个FR区组成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序 排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链 的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫 球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种各样细胞(例 如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。对每个结构域 分配氨基酸通常是根据以下的定义：Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Kabat,et al.；National Institutes of Health, Bethesda,Md.；5th ed.；NIH Publ.No.91-3242(1991)；Kabat(1978) Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat,et al.,(1977)J.Biol.Chem. 252:6609-6616；Chothia,et al.,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或 Chothia,et al.,(1989)Nature 342:878-883。
通常，尽管抗体包含六个CDR，VH上三个，VL上三个，但现有 技术认识到，在大多数情况下，重链的CDR3区是抗体特异性的主要 决定因素，单独基于重链的CDR3的特异性抗体产生的实例是本领域 已知的(例如，Beiboer et al.,J.Mol.Biol.296:833-849(2000)；Klimka et al.,British J.Cancer 83:252-260(2000)；Rader et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915(1998)；Xu et al.,Immunity 13:37-45(2000). 参见Kabat etal.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda, Md.(按照序列定义抗体的CDR区)；还参见Chothia and Lesk(1987)J. Mol.Biol.196:901-917(按照结构定义抗体的CDR区))。
表1中所示的以下一般规则可用于确定抗体序列中的CDR。存在 极少数的例子，其中这些几乎不变的特征不出现；然而Cys残基是最 保守的特征。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure DEST_PATH_IMAGE002
通常，基本抗体结构单元包含四聚体。每个四聚体包括两对相同 的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70 kDa)。每条链的氨基末端部分包括约100至110个或更多氨基酸的 可变区，主要负责抗原识别。重链的羧基末端部分可以定义恒定区， 该恒定区主要负责抗体的效应子功能。通常，人类轻链分为κ和λ轻 链。此外，人类重链通常被分类为μ，δ，γ，α或ε，并且将抗体的同 种型分别定义为IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。在轻链和重链中，可 变区和恒定区由约12个或更多个氨基酸的“J”区相连，重链还包括约10个氨基酸的“D”区。通常参见Fundamental Immunology,Ch.7(Paul, W.,ed.,2nded.Raven Press,N.Y.(1989)。
抗体的重链可以包含或可以不包含末端赖氨酸(K)残基，或者 末端甘氨酸和赖氨酸(GK)残基。因此，在本文的抗ILT3抗体的特 定实施方式中，其包含缺少末端赖氨酸，但以甘氨酸残基终止的本文 所示的重链恒定区氨基酸序列，进一步包括其中也缺少末端甘氨酸残 基的实施方式。这是因为末端赖氨酸以及有时甘氨酸和赖氨酸一起可 以在抗体表达期间被切割，或者当引入人体时被切割掉，而对抗体功 效、稳定性或免疫原性没有明显的不利影响。在一些情况下，编码所 述重链的核酸分子可以有意地省略编码末端赖氨酸的密码子或编码 末端赖氨酸和甘氨酸的密码子。
如本文所用，“抗原结合片段”是指抗体的片段，即保留与由全长 抗体结合的抗原特异性结合的能力的抗体片段，例如保留一个或多个 CDR区的片段。抗体结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；单链抗体分子，例如scFv；纳米抗体和由抗体 片段形成的多特异性抗体。
如本文所用，“Fab片段”包含一条轻链和CH1以及一条重链的可 变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“Fab片段” 可以是抗体的木瓜蛋白酶切割的产物。
如本文所用，“Fab'片段”包含一条轻链和一条重链的一部分或片 段，其包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的 区域，使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形 成F(ab')2分子。
如本文所用，“F(ab')2片段”包含两条轻链和两条重链，所述两条 轻链和两条重链包含VH结构域和CH1和CH2结构域之间的恒定区 的一部分，使得链间二硫键在两个重链之间形成。因此，F(ab')2片段 由两个Fab'片段组成，两个Fab'片段通过两条重链之间的二硫键结合 在一起。“F(ab')2片段”可以是抗体的胃蛋白酶切割的产物。
如本文所用，“Fv区”包括来自重链和轻链两者的可变区，但是缺 少恒定区。
这些和其他潜在的构造方法在Chan&Carter(2010)Nat.Rev. Immunol.10:301中描述。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的 常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。抗 原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或 化学裂解来产生。
如本文中所使用的，“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域 的两个重链片段。所述两个重链片段由两个或更多个二硫键和由CH3 结构域的疏水性相互作用而保持在一起。
如本文所用，“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片 段，该片段包含与同一条多肽链中的轻链可变结构域(VL)连接的重 链可变结构域(VH-VL或VL-VH)。通过使用太短以至于不允许同一 条链上两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互 补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097； WO 93/11161；和Holliger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448中有更全面的描述。对于工程化抗体变体的综述，一般参 见Holliger and Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23:1126-1136。
如本文所用，“双特异性抗体”是具有两个不同的重/轻链对并因此 具有两个不同的结合位点的人工杂合抗体。例如，双特异性抗体可包 含第一重链/轻链对，其包含第一抗体的一条重链和一条轻链，其至少 包含本文公开的抗ILT3抗体的六个CDR或其中六个CDR中的一个 或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的实 施方式，以及第二重/轻链对，其包含对ILT3以外的感兴趣的抗原具 有特异性的第二抗体的一条重链和一条轻链。双特异性抗体可以通过 多种方法产生，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如 Songsivilai,et al.,(1990)Clin.Exp.Immunol.79:315-321,Kostelny,etal.,(1992)J Immunol.148:1547-1553。另外，双特异性抗体可以形成 为“双抗体”(Holliger,et al.,(1993)PNAS USA 90:6444-6448)或 "Janusins"(Traunecker,et al.,(1991)EMBO J.10:3655-3659and Traunecker,et al.,(1992)Int.J.Cancer Suppl.7:51-52)。
如本文所用，“分离的”抗体或其抗原结合片段至少部分地不含来 自产生它们的细胞或细胞培养物的其他生物分子，这样的生物分子包 括核酸，蛋白质，脂质，碳水化合物或其他材料如细胞碎片和生长培 养基。分离的抗体或抗原结合片段可以进一步至少部分地不含表达系 统组分，例如来自宿主细胞或其生长培养基的生物分子。通常，术语 “分离的”并非旨在指完全不存在这样的生物分子或不存在水，缓冲液 或盐，也不是指包含所述抗体或片段的药物制剂的成分。
如本文所用，“单克隆抗体”是指基本上均质的抗体群体，即，除 了可以以少量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的抗体分 子在氨基酸序列上是相同的。相比之下，常规(多克隆)抗体制品通 常包括在其可变结构域中具有通常对不同表位具有特异性的不同氨 基酸序列的多种不同抗体。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本 上同质的抗体群体获得，而不解释为要求通过任何特定方法生产所述 抗体。例如，可以通过首先由Kohler et al.(1975)Nature 256:495描 述的杂交瘤方法来制备根据本发明使用的单克隆抗体，或可以通过重 组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。还可以使 用例如Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628和Marks et al.(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单 克隆抗体”。也参见Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731。
如本文所用，“嵌合抗体”是具有来自第一抗体的可变结构域和来 自第二抗体的恒定结构域的抗体，其中(i)第一和第二抗体来自不同 物种(U.S.Pat.No.4,816,567；和Morrison et al.,(1984)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 81:6851-6855)或(ii)所述第一和第二抗体是来自不 同同种型，例如，来自IgG1抗体的可变结构域和来自IgG4抗体的恒 定结构域。一方面，可变结构域获自非人抗体，例如小鼠抗体(“亲 本抗体”)，恒定结构域序列获自人抗体。在另一方面，可变结构域 是来自小鼠抗体的人源化可变结构域和人抗体的恒定结构域。
如本文所用，“人源化抗体”是指包含来自人和非人(例如鼠，大 鼠)抗体的序列的抗体形式。通常，人源化抗体将包含至少一个且通 常是两个可变结构域的全部，其中高变环对应于非人免疫球蛋白的那 些，并且所有或基本上所有框架(FR)区是那些人免疫球蛋白序列的 序列。人源化抗体可任选地包含人免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一 部分。
“人源化”(也称为“重塑”或“CDR移植”)现已成为一种成熟的技 术，用于降低异种来源(通常是啮齿动物)的单克隆抗体(mAb)的 免疫原性并改善效应子功能(ADCC，补体激活，C1q结合)。使用 分子生物学技术对工程mAb进行工程改造，但是，将啮齿动物互补 决定区(CDR)进行简单的CDR移植到人框架中通常会导致原始mAb 的结合亲和力和/或特异性丧失。为了使抗体人源化，人源化抗体的设 计包括变体，例如CDR残基中的保守氨基酸置换，以及从啮齿动物 mAb残基向人构架区的反向取代(反向突变)。可以通过序列比较进 行结构分析或通过分析可变区3D结构的同源性模型来识别或识别位 置。亲和力成熟的过程最近已使用噬菌体文库来改变所选位置的氨基 酸。类似地，已经使用许多方法来选择移植啮齿动物CDR的最合适 的人框架。随着抗体结构已知参数的数据集的增加，这些技术的完善和精细化也随之增加。可以使用来自单个抗体的共有序列或种系序 列，或来自几种不同人单克隆抗体的每个轻链或重链可变区内的框架 序列片段。人源化的另一种方法是仅用人类单克隆抗体中发现的最常 见残基修饰啮齿动物序列的表面残基，这种方法被称为“重铺表面”或 “饰面”。人或人源化抗体通常在人中基本上是非免疫原性的。
如本文所用，“非人氨基酸序列”相对于抗体或免疫球蛋白是指氨 基酸序列，其是非人类哺乳动物的氨基酸序列的特性。该术语不包括 从全人抗体文库获得的抗体或免疫球蛋白的氨基酸序列，其中文库中 的多样性是通过计算机产生的(参见，例如，美国专利号8,877,688 或8,691,730)。
如本文所用，“效应子功能”指那些生物活性可归因于抗体的Fc 区，其随抗体同种型改变。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和 补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的 细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；和B细胞活化。
如本文所用，“保守修饰的变体”或“保守置换”是指氨基酸被具有 相似特征(例如电荷，侧链大小，疏水性/亲水性，主链构象和刚性等) 的其他氨基酸置换，使得可以经常进行更改而不改变蛋白质的生物学 活性。本领域技术人员认识到，通常，多肽的非必要区域中的单个氨 基酸置换基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson et al.(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co., p.224(4th Ed.))。另外，结构或功能上相似的氨基酸的取代不太可 能破坏生物活性。示例性保守置换在表2阐述。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
如本文所用，术语“表位”或“抗原决定簇”是指免疫球蛋白或抗体 特异性结合的抗原(例如ILT3)上的位点。蛋白质抗原内的表位既 可以由连续氨基酸(通常为线性表位)形成，也可以由蛋白质三级折 叠并置的非连续氨基酸(通常为构象表位)形成。由连续氨基酸形成 的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂时保留，而由三级折叠形成的 表位通常在用变性溶剂处理时丢失。连续的线性表位包含在抗原上的 肽结构域，该肽结构域包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14或15个氨基酸。非连续构象表位包含被抗体结合的抗原上的 一个或多个肽结构域或区域，并散布有未被该抗体结合的一个或多个 氨基酸或肽结构域，每个结构域独立地包含至少3、4、5、6、7，8、 9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。确定给定抗体结合哪些表位 的方法(即表位作图)是本领域众所周知的，包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定法，其中测试重叠或连续的肽(例如来自ILT3)与给定 的抗体(例如抗ILT3抗体)的反应性。确定表位的空间构象的方法 包括本领域和本文所述的技术，例如X射线晶体学，二维核磁共振和 HDX-MS(例如，参见Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996))。
术语“表位作图”是指使用本领域和本文所述的技术，例如X射线 晶体学，二维核磁共振和X射线晶体学，鉴定涉及抗体-抗原识别的 抗原上的分子决定簇的过程。氢氘交换质谱法(HDX-MS)。
术语“结合相同表位”涉及两种或更多种抗体，是指抗体结合相同 段的氨基酸残基或氨基酸片段的组合，如通过给定的方法测定。确定 抗体是否与本文所述的抗体结合“ILT3上的相同表位”的技术包括表 位作图方法，例如对抗原:抗体复合物晶体进行X射线分析，从而提 供表位的原子分辨率，和HDX-MS。监视抗体与抗原片段(例如蛋白 水解片段)或抗原突变变异的结合的其他方法，其中结合的丧失是由 抗原序列内氨基酸残基的修饰导致，通常认为是表位成分的指示(例 如丙氨酸扫描诱变--Cunningham&Wells(1985)Science244：1081)。 另外，也可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于感兴趣的抗体从组合噬菌体展示肽库中亲和分离特定短肽的能力。
“与另一种抗体竞争结合靶标，例如ILT3”的抗体是指抑制(部分 或完全)另一种抗体与靶标，即ILT3的结合的抗体。可以使用已知 的竞争实验来确定两种抗体是否彼此竞争结合靶标，即，一种抗体是 否以及在何种程度上抑制另一种抗体与靶标的结合。在某些实施方式 中，抗体与另一抗体竞争并抑制另一抗体与靶标的结合至少10％， 20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％。抑制或竞 争的水平可能会有所不同，具体取决于哪种抗体是“封闭抗体”(即首 先与靶标孵育的冷抗体)。竞争测定法可以例如在EdHarlow and David Lane,Cold Spring Harb Protoc；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277or in Chapter 11of"Using Antibodies"by Ed Harlow and David Lane, Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA 1999描述。竞争性抗体结合相同的表位，重叠的表位或邻近的表位(例 如，通过位阻证明)。
其他竞争性结合测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)， 固相直接或间接酶免疫测定(EIA)，夹心竞争测定(参见Stahli等， Methods in Enzymology9：242(1983))；等等。固相直接生物素- 抗生物素蛋白EIA(参见Kirkland等，J.Immunol.137：3614(1986))； 固相直接标记测定法，固相直接标记夹心测定法(见Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))； 使用1-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel et al.,Mol.Immunol. 25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等， Virology 176：546(1990))；和直接标记RIA(Moldenhauer等， Scand.J.Immunol.32：77(1990))。
如本文所用，就抗原或分子例如人ILT3而言，“特异性结合”是 指抗体或其他配体全部或部分与人ILT3的优先结合，而不是与其他 分子，特别是在人血液或血清中发现的分子。抗体通常以高亲和力特 异性结合其关联抗原，这可通过10-7至10-11M或更小的解离常数(KD) 反映出来，任何大于10-6M的KD通常被看作是表示非特异性结合。 如本文所用，与人ILT3“特异性结合”或“特异性结合”的抗体是指以高 亲和力与人ILT3结合的抗体，这意味着KD为10-7M或更小，在特 定实施方式中，KD为10-8M或更小，或5×10-9M或更小，或10-8M至10-11M或更小，但不以可测量的结合与紧密相关的蛋白如人ILT5，人 ILT7，人ILT8，和人ILT11结合，如在细胞ELISA或Biacore分析 中使用10μg/mL抗体确定的。
如本文所用，如果抗原与给定抗原表现出高度的氨基酸序列同一 性，例如，如果其与给定抗原的氨基酸序列表现出至少80％，至少 90％，至少90％，95％，至少97％或至少99％或更大的氨基酸序列同 一性，则抗原与给定抗原“基本上相同”。举例来说，特异性结合人ILT3 的抗体也可以与来自某些非人灵长类物种(例如猕猴或食蟹猴)的 ILT3交叉反应。
如本文所用，“分离的核酸分子”是指基因组，mRNA，cDNA或 合成来源的DNA或RNA或其某种组合，其与在自然界中发现了分离 的多核苷酸的多核苷酸的全部或部分不相关。或与本质上未连接的多 核苷酸连接。为了本公开的目的，应当理解，“包含”特定核苷酸序列 的核酸分子不包含完整的染色体。除特定序列外，“包含”特定核酸序 列的分离的核酸分子可包括多达十个或甚至多达二十个或更多个其 他蛋白质或其部分或片段的编码序列，或可包括控制所记载的核酸序 列的编码区的表达的可操作连接的调控序列，和/或可以包括载体序 列。
如本文所用，“治疗”是指向患有一种或多种疾病的受试者或患者 内部或外部施用治疗剂，例如含有本发明的任何抗体或其抗原结合片 段的组合物。该药剂对其具有治疗活性或预防活性的症状或疑似疾 病。通常，以有效减轻被治疗的受试者或人群中的一种或多种疾病症 状的量施用所述药物，无论是通过以任何临床可测量的程度诱导此类 症状的消退还是抑制其发展。有效减轻任何特定疾病症状的治疗剂的 量可以根据诸如疾病状态，患者的年龄和体重以及药物在受试者中引 起期望的反应的能力等因素而变化。可以通过医师或其他熟练的医疗 保健提供者通常使用的任何临床测量来评估疾病症状是否得到缓解， 以评估该症状的严重程度或进展状态。该术语进一步包括推迟与病症 有关的症状的发展和/或减轻该病症的症状的严重性。该术语还包括改 善现有的无法控制或不想要的症状，预防其他症状以及改善或预防此 类症状的根本原因。因此，该术语表示已经向患有病症，疾病或症状 或具有发展这种病症，疾病或症状的潜力的人或动物受试者赋予了有 益的结果。
如本文所用，“治疗”如其适用于人类或兽医受试者，是指治疗性 治疗以及诊断应用。“治疗”当应用于人或兽医受试者，涵盖使或本发 明的抗体或抗原结合片段接触人或动物受试者。
如本文所用，“治疗有效量”是指足以在被治疗的受试者中实现所 需效果的特定物质的量。例如，这可以是当与派姆单抗共同施用时抑 制ILT3活化所必需的量或对于增强派姆单抗应答性所必需的量。
如本文所用，术语“PD-1”是指程序性死亡1(PD-1)蛋白，其是 T细胞调节剂的扩展的CD28/CTLA-4家族的抑制成员(Okazaki等 (2002)Curr Opin Immunol 14：391779-82；Bennett等(2003)J. Immunol.170：711-8)。CD28家族的其他成员包括CD28，CTLA-4， ICOS和BTLA。PD-1基因编码55kDa的I型跨膜蛋白(Agata等， (1996)Int Immunol.8：765-72)。已经确定了PD-1的两个配体PD-L1 (B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，其已显示在与PD-1结合后下调T细胞活化(Freeman等(2000(J.Exp.Med.192：1027-34；Carter等 (2002)Eur.J.Immunol.32：634-43)。PD-1被称为负调节TCR信 号的免疫抑制蛋白(Ishida，Y.等(1992)EMBO J.11：3887-3895； Blank，C.等(Epub 2006年12月29日).Immunol.Immunother.56 (5)：739-745)。PD-1和PD-L1之间的相互作用可以充当免疫检查点，其例如可以导致肿瘤浸润淋巴细胞减少，T细胞受体介导的增 殖减少和/或癌细胞的免疫逃逸(Dong等(2003)J.Mol.Med.81： 281-7；Blank等(2005)CancerImmunol.Immunother.54：307-314； Konishi等(2004)Clin.Cancer Res.10：5094-100)。可以通过抑制 PD-1与PD-L1或PD-L2的局部相互作用来逆转免疫抑制。当PD-1 与PD-L2的相互作用也被阻断时，这种作用是加和性的(Iwai等 (2002)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 99：12293-7；Brown等(2003J. Immunol.170：1257-66)。
抗体和抗原结合片段
本发明提供了分离的嵌合的，人源化和人抗体和抗原结合片段， 其特异性结合ILT3，且与密切相关的蛋白质(例如，ILT5，ILT7，ILT8， 和ILT11)没有可测量的结合，如使用10μg/mL抗体在细胞ELISA 或Biacore测定法确定的。抗ILT3抗体增加抗原呈递细胞和树突状细 胞的活性，降低单核细胞阻遏物的活性，并增加T细胞的启动。因此， 本发明还包括使用抗ILT3抗体在单一疗法治疗癌症的用途和与抗 PD-1或抗PD-L1抗体，用于在第一，二线或三线疗法中治疗癌症的 用途。
抗ILT3抗体包含按照氨基酸序列由本文公开的任何抗体，并包 括任何抗体，其包含(i)按照氨基酸序列由本文公开的抗体的至少一 个，两个，三个，四个，五个，或六个CDR；或(ii)虽然没有本文 公开的CDR氨基酸序列，但其与本发明公开的抗体结合ILT3上的相同表位，且可调节ILT3受体信号，使得该抗体增加抗原呈递细胞和 树突状细胞的活性，减少抑制单核细胞的活性，并增加T细胞的启动 能力。在具体的方面，所述抗体没有与人ILT5，人ILT7，人ILT8， 和人ILT11可测量的结合，如使用10μg/mL抗体在细胞ELISA或在Biacore测定中确定的。该术语特定地排除了包含以下抗体的至少一 个CDR的抗体：抗体ZM4.1或抗体9B11或美国专利号7,777,008和 8,901,281或美国专利号20090202544，20150110714。20150139986， 和20170267759；以及国际公布WO2013043569，WO2013181438，WO2014116846，WO2016049641，WO2016127427，WO2018089300 和WO2018148494中公开的任何其他抗体。
抗ILT3抗原结合片段等包括包含分子的任何蛋白质或肽，所述 分子包含(i)按照氨基酸序列由本文公开的抗ILT3抗体的至少一部 分，(ii)按照氨基酸序列由本文公开的抗体的至少一个，两个，三 个，四个，五个，或六个CDR，或(iii)虽然没有本文公开的CDR 氨基酸序列，但其与本发明公开的抗体结合ILT3上的相同表位，且 可调节ILT3受体信号，使得该抗原结合片段增加抗原呈递细胞和树 突状细胞的活性，减少抑制单核细胞的活性，并增加T细胞的启动能 力。在具体的方面，所述抗原结合片段没有与人ILT5，人ILT7，人ILT8，和人ILT11可测量的结合，如使用10μg/mL该抗ILT3抗原结 合片段在细胞ELISA或在Biacore测定中确定的。该术语特定地排除 了包含以下抗体的至少一个CDR的抗原结合片段：抗体ZM4.1或抗 体9B11或美国专利号7,777,008和8,901,281或美国专利号20090202544，20150110714。20150139986，和20170267759；以及国 际公布WO2013043569，WO2013181438，WO2014116846，WO2016049641，WO2016127427，WO2018089300和WO2018148494 中公开的任何其他抗体。
在进一步的实施方式中，抗ILT3抗体包括任何抗体，其包含(i) 按照氨基酸序列由本文公开的抗体的至少HC-CDR3；或(ii)虽然没 有本文公开的HC-CDR3氨基酸序列，但其与本发明公开的抗体结合 ILT3上的相同表位，且可调节ILT3受体信号，使得该抗体增加抗原 呈递细胞和树突状细胞的活性，减少抑制单核细胞的活性，并增加T 细胞的启动能力。在具体的方面，所述抗体没有与人ILT5，人ILT7， 人ILT8，和人ILT11可测量的结合，如使用10μg/mL抗体在细胞 ELISA或在Biacore测定中确定的。该术语特定地排除了包含以下抗体的至少一个CDR的抗体：抗体ZM4.1或抗体9B11或美国专利号 7,777,008和8,901,281或美国专利号20090202544，20150110714。 20150139986，和20170267759；以及国际公布WO2013043569， WO2013181438，WO2014116846，WO2016049641，WO2016127427，WO2018089300和WO2018148494中公开的任何其他抗体。
抗ILT3抗原结合片段等包括包含分子的任何蛋白质或肽，所述 分子包含(i)按照氨基酸序列由本文公开的抗ILT3抗体的至少一部 分，(ii)按照氨基酸序列由本文公开的抗体的至少HC-CDR3，或(iii) 虽然没有本文公开的HC-CDR3氨基酸序列，但其与本发明公开的抗 体结合ILT3上的相同表位，且可调节ILT3受体信号，使得该抗原结 合片段增加抗原呈递细胞和树突状细胞的活性，减少抑制单核细胞的 活性，并增加T细胞的启动能力。在具体的方面，所述抗原结合片段 没有与人ILT5，人ILT7，人ILT8，和人ILT11可测量的结合，如使 用10μg/mL该抗ILT3抗原结合片段在细胞ELISA或在Biacore测定 中确定的。该术语特定地排除了包含以下抗体的至少一个CDR的抗 原结合片段：抗体ZM4.1或抗体9B11或美国专利号7,777,008和 8,901,281或美国专利号20090202544，20150110714。20150139986，和20170267759；以及国际公布WO2013043569，WO2013181438， WO2014116846，WO2016049641，WO2016127427，WO2018089300 和WO2018148494中公开的任何其他抗体。
在特定的实施方式中，抗ILT3抗体是人或人源化抗ILT3抗体或 抗原结合片段或嵌合抗ILT3抗体或抗原结合片段，其包含本文公开 的抗ILT3抗体分子的HC-CDR3或如表3所示的H3-CDR3。
在特定的实施方式中，抗ILT3抗体是人或人源化抗ILT3抗体或 抗原结合片段或嵌合抗ILT3抗体或抗原结合片段，其包含本文公开 的或表3中的HC-CDR1，HC-CDR2，HC-CDR3，LC-CDR1，LC-CDR2 和LC-CDR3。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
在特定实施方式中，抗ILT3抗体是人或人源化抗ILT3抗体或抗 原结合片段或嵌合抗ILT3抗体或抗原结合片段，在每种情况下均包 含具有重链互补决定区(HC-CDR)3的重链可变结构域(VH)，其 包含选自SEQ ID NO:22、49、57、65、73、81、89、97和105的氨 基酸序列，或具有与选自SEQ ID NO:22、49、57、65、73、81、89、 97和105的氨基酸序列具有3、2或1个差异的氨基酸序列。在另一 个实施方式中，抗体或抗原结合片段结合人ILT3上的表位，其中该 表位包含选自SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8的氨基酸序列中的一 个或多个的至少一个氨基酸。在另一个实施方式中，抗体或抗原结合 片段结合人ILT3上的表位，其中该表位包含SEQ ID NO:3、4、5、6、 7和8所示的氨基酸序列。在特定实施方式中，氨基酸序列差异是保 守改变/置换。
在特定的实施方式中，抗ILT3抗体是本文公开的人源化或嵌合 的抗ILT3抗体。在特定实施方式中，抗ILT3抗体是人或人源化抗ILT3 抗体或抗原结合片段或嵌合抗ILT3抗体或抗原结合片段，其结合由 本文公开的抗ILT3抗体结合的相同表位或与本文公开的抗ILT3抗体 竞争结合，且所述抗体包含本文公开的抗ILT3抗体的少于三个CDR 或不含本文公开的抗ILT3抗体的CDR。
本发明进一步提供了抗体或其抗原结合片段，其包含(i)抗免疫 球蛋白样转录物3(ILT3)抗体的至少六个互补决定区(CDR)；或 (ii)抗ILT3抗体的至少六个CDR，其中六个CDR中的一个或多个 具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或组合；其中抗ILT3 抗体的六个CDR包含具有SEQ ID NO:17、47、55、63、71、79、87、 95或103所示氨基酸序列的重链(HC)-CDR1；具有SEQ ID NO:18， 48，56，64，72，80，88，96，或104所示氨基酸序列的HC-CDR2； 具有SEQ ID NO:22、49、57、65、73、81、89、97或105所示氨基 酸序列的HC-CDR3；具有SEQ ID NO:27、50、58、66、74、82、90、 98或106所示氨基酸序列的轻链(LC)-CDR1；具有SEQID NO:43、 51、59、67、75、83、91、99或107所示氨基酸序列的LC-CDR2； 具有SEQ ID NO:44、60、68、76、84、92、100或108所示氨基酸 序列的LC-CDR3；并且，其中所述抗体或抗原结合片段特异性结合 人或猕猴ILT3或人和猕猴ILT3两者。在特定的实施方式中，氨基酸 序列差异是保守改变/置换。
在特定的实施方式中，本发明提供了抗体或抗原结合片段，其包 含抗ILT3抗体的六个CDR，所述抗ILT3抗体包含具有SEQ ID NO: 17所示氨基酸序列的重链(HC)-CDR1；具有SEQ ID NO:19、20 或21所示氨基酸序列的HC-CDR2；具有SEQ ID NO:23、24、25或 26所示氨基酸序列的HC-CDR3；具有SEQ ID NO:34、35、36、37、 38、39、40、41或42所示氨基酸序列的轻链(LC)-CDR1；具有SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR2；和具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在特定的实施方式中，本发明提供了抗体或抗原结合片段，其包 含抗ILT3抗体的六个CDR，所述抗ILT3抗体具有具有SEQ ID NO: 17所示氨基酸序列的重链(HC)-CDR1；具有SEQ ID NO:20所示 氨基酸序列的HC-CDR2；具有SEQ ID NO:23所示氨基酸序列的 HC-CDR3；具有SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的轻链(LC)-CDR1； 具有SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的LC-CDR2；和具有SEQ ID NO: 44所示氨基酸序列的LC-CDR3。
在具体实施方式中，本发明提供了上述抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变结构域(VH)，其具有选自 以下的框架：人类VH1，VH2，VH3，VH4，VH5和VH6家族，及其具 有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或 其组合的变体；和(b)轻链可变结构域(VL)，其具有选自以下的 框架：人Vκ1，Vκ2，Vκ3，Vκ4，Vκ5，Vκ6，Vλ1，Vλ2，，Vλ3，Vλ4， Vλ5，Vλ6，Vλ7，Vλ8，Vλ9，和Vλ10家族，及其具有1，2，3，4，5， 6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体。
在特定的实施方式中，本发明提供上述抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体包含人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4重链(HC)恒定结构 域或其变体，其包含与天然IgG1，IgG2，IgG3或IgG4同种型的氨基 酸序列相比，1、2、3、4、5，6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、 缺失或其组合。
在特定的实施方式中，本发明提供上述抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体包含人κ或λ轻链恒定结构域或其变体，其包含与天然人 κ或λ轻链结构域的氨基酸序列相比，1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10个氨基酸的取代，添加，缺失或其组合。
在具体实施方式中，本发明提供了上述抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体包含(i)人重链可变结构域(VH)，其具有选自人VH3 家族的框架，和人轻链可变结构域(VL)，其具有选自人Vκ1，Vκ3， 和Vκ4家族的框架；(ii)人IgG1或IgG4重链(HC)恒定结构域或 其与天然IgG1或IgG4同种型的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体；(iii) 人κ或λ轻链恒定结构域或其与天然人κ或λ轻链结构域的氨基酸序 列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、 缺失或其组合的变体。在特定的实施方式中，氨基酸序列差异是保守 改变/置换。
在特定的实施方式中，本发明提供了上述抗体或抗原结合片段， 其中该抗体或抗原结合片段包含具有以下氨基酸序列所示的重链可 变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)：分别为SEQ ID NO:15 和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:53 和SEQ ID NO:54；SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:69 和SEQ ID NO:70；SEQ IDNO:77和SEQ ID NO:78；分别为SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94；SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102。
在特定的实施方式中，本发明提供了上述抗体或抗原结合片段， 其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:117、118、119、 120、121、122、123、124或125所示氨基酸序列的重链可变结构域 (VH)以及具有SEQ ID NO:126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140或141所示氨基酸序列的 轻链可变结构域(VL)。
在特定的实施方式中，本发明提供了上述抗体或抗原结合片段， 其中该抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序 列的重链可变结构域(VH)和具有SEQID NO:140所示氨基酸序列 的轻链可变结构域(VL)。
在特定的实施方式中，本发明提供上述抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体包含重链(HC)恒定结构域，所述恒定结构域包含SEQ ID NO:9、10、11、12或13所示氨基酸序列以及SEQ ID NO:9、11、 12或13的变体，其中HC缺少C端赖氨酸或甘氨酸赖氨酸。
在特定的实施方式中，本发明提供上述抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体包含轻链(LC)恒定结构域，所述轻链恒定结构域包含 SEQ ID NO:14所示氨基酸序列。
在特定的实施方式中，本发明提供上述抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体包含重链(HC)，所述重链包含SEQ ID NO:142、143、 144、148、149、150、167，168、169、170、174、175、176、177、 178、182、183、184、185、186、187、191、192或193的氨基酸序 列，以及包含SEQ ID NO:143，144，148，149，150，167，168，169， 170，174，或175的氨基酸序列的HC的变体，其中HC缺少C-末端 赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸。
在特定的实施方式中，本发明提供了上述抗体或抗原结合片段， 其中所述抗体包含轻链(LC)，所述轻链(LC)包含SEQ ID NO:151、 152、153、154、155、156，157、158、159、160、161、162、163、 164、165或166所示氨基酸序列。
在特定的实施方式中，本发明提供上述抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体包含重链(HC)，所述重链包含SEQ ID NO:142、143、 144、148、149、150、167，168、169、170、174、175、176、177、 178、182、183、184、185、186、187、191、192或193的氨基酸序 列；和轻链(LC)，所述轻链包含SEQ ID NO:151、152、153、154、 155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166 所示氨基酸序列，以及包含SEQ ID NO:143、144、148、148、149、 150、167、168、169、170、174或175的氨基酸序列的HC的变体， 其中HC缺少C端赖氨酸或甘氨酸赖氨酸。
在特定的实施方式中，本发明提供了选自表4所示抗体的抗体。
在特定的实施方式中，本发明提供了上述抗体或抗原结合片段， 其中所述抗体包含具有SEQ ID NO:143所示氨基酸序列的重链(HC) 和包含SEQ ID NO:165所示氨基酸序列的轻链(LC)，以及其中HC 缺少C端赖氨酸或甘氨酸赖氨酸的变体。
在特定的实施方式中，本发明提供上述抗体或抗原结合片段，其 中所述抗体包含人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4重链(HC)恒定结构 域或其与天然IgG1，IgG2，IgG3或IgG4同种型的氨基酸序列相比， 包含1、2、3、4、5，6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失 或其组合的变体，及其其中HC缺少末端赖氨酸或甘氨酸赖氨酸的辩 题。
在一些实施方式中，不同的恒定结构域可融合到包含本文所提供 的CDR的VL和VH区域。在特定实施方式中，可以将包含本文提供 的CDR的VH区与人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4重链(HC)恒定结 构域或其与天然或野生型IgG1，IgG2，IgG3或IgG4同种型的氨基酸 序列相比包含1、2、3、4、5、6、7，8，9或10个氨基酸置换、添 加、缺失，或其组合的变体，以及其中HC缺少变体C端赖氨酸或甘 氨酸赖氨酸的变体融合。
在特定的实施方式中，抗ILT3抗体(或抗原结合片段)具有改 变的效应子功能，并且可以包含除天然(野生型)人IgG1以外的重 链恒定结构域，例如具有消除或最小化一种或多种效应子功能的突变 的人IgG1，包括结合补体，人IgG4或杂合人IgG1/人IgG4的能力，以及其中HC缺少C端赖氨酸或甘氨酸-赖氨酸的变体。
虽然天然人类IgG1抗体提供长半衰期和效应物功能，如补体激 活和抗体依赖性细胞的细胞毒性，但这样的活性可能对于抗体的所有 用途并不是期望的。因此，在特定实施方式中，期望的是重链恒定结 构域或Fc具有很小的或减少的效应子功能(“效应子较低”)。在那 些情况下，抗ILT3 HC可变结构域可以与通常已知是效应子较低的人 IgG4恒定结构域融合，或者已经突变成效应子较低的IgG1恒定结构 域融合。与包含野生型IgGFc区的多肽相比，这些效应子较低的分子 与人FcγRIIIA，FcγRIIA和Fcγ.RI的结合极小或减少，其中与人 FcγRIIIA，FcγRIIA和FcγRI的亲和力相较于包含野生型IgG恒定结 构域的多肽降低了1.15至100倍，其中所述分子诱导的抗体依赖性细 胞介导的细胞毒性(ADCC)是包含野生型人IgG1型恒定结构域的 多肽诱导的ADCC的0-20％。
因此，在特定的实施方式中，本发明包括包含人IgG4恒定结构 域的嵌合或人源化抗ILT3抗体及其抗原结合片段。在另一个实施方 式中，可以将人IgG4恒定结构域修饰为与天然(野生型)人IgG4恒 定结构域(Swiss-Prot登录号P01861.1)在EU系统中对应于位置228 的位置不同，并且Kabat系统中的第241位，其中HC恒定结构域第 108位(Ser108)的天然丝氨酸被脯氨酸(Pro)取代，例如参见SEQ ID NO:9。该修饰防止在位置106的半胱氨酸(Cys106)和位置109 的半胱氨酸(Cys109)之间形成潜在的链间二硫键，这对应于EU系 统中的Cys226和Cys229以及Kabat系统中的Cys239和Cys242，可 能会干扰适当的链内二硫键形成。参见Angal et al.Mol.Imunol. 30:105(1993)；还参见(Schuurman等，Mol.Immunol.38：1-8，(2001)； SEQ ID NO:14和41)。在特定的实施方式中，人IgG4恒定结构域 除S228P取代外还可包括L235E取代。
在一个其它实施方式中，嵌合或人源化抗ILT3抗体可以融合到 修饰的人IgG1恒定结构域，其已经被修饰为是效应子较低的。在一 个实施方式中，人IgG1 HC可以包含人IgG2 HC残基在位置233-236 和IgG4 HC残基在位置327，330和331的置换以极大降低ADCC和 CDC(Armour et al.,Eur J Immunol.29(8):2613-24(1999)；Shields et al., J BiolChem.276(9):6591-604(2001))。在特定实施方式中，抗体包含 人IgG1重链(HC)恒定结构域或其变体，其与天然IgG的氨基酸序 列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、 缺失或其组合，其提供了具有降低的或很小的效应子功能的抗体。在 特定方面，IgG1已被修饰为包含L234A，L235A和D265S突变或由 L234A，L235A和D265S突变组成，以使Fc效应子较低。在美国专 利号8,969,526中可以找到可用于使IgG1 Fc效应子较低的其他突变。
在另一个实施方式中，将人IgG1 HC修饰为在HC的297位附近 缺少天冬酰胺(Asn)残基的N-糖基化。N-糖基化的共有序列是 Asn-Xaa-Ser/Thr(其中Xaa是除Pro以外的任何氨基酸)；在IgG1 中，N-糖基化共有序列是Asn-Ser-Thr。可以通过用另一种氨基酸例 如Gln的密码子代替编码HC的核酸分子中第297位的Asn的密码子 来实现修饰。可替换地，密码子的Ser可以与密码子为Pro取代或密 码子对苏氨酸可以与除了密码子的Ser任何密码子来代替，例如， N297A或N297D。这种修饰的IgG1分子几乎没有或没有可检测的效 应子功能。或者，所有三个密码子均被修饰。
在另一个实施方式中，修饰人IgG1恒定结构域以包含一个或多 个选自E233P，L234A，L235A，L235E，N297A，N297D，D265S和 P331S的氨基酸置换，其中所述残基是根据Kabat的EU索引编号， 并且其中所述多肽显示出与包含野生型IgG恒定结构域区的多肽相比，与人FcγRIIIa的和/或对FcγRIIa和/或FcγRI降低的亲和力。在 特定实施方式中，人IgG恒定结构域包含例如SEQ ID NO:4所示的 L234A，L235A和D265S的取代。在特定的实施方式中，人IgG1恒 定结构域在位置Pro329处包含氨基酸置换和至少一个其他氨基酸置 换E233P，L234A，L235A，L235E，N297A，N297D，D265S和P331S。 这些和其他替代在WO9428027；WO2004099249；WO20121300831, U.S.Patent Nos.9,708,406；8,969,526；9,296,815；Sondermann et al. Nature 406,267-273(20Jul.2000)中公开。
在本发明的一个实施方式中，所述抗ILT3抗体或抗原结合片段 包括实施方式，其中六个CDR中的一个或多个具有一个，两个，或 三个氨基酸置换、添加、缺失，或其组合，包括全四聚体结构，其具 有两个轻链和两个重链(包括恒定区)。每个轻链/重链对的可变区形 成抗体结合位点。因此，通常，完整的抗体具有两个结合位点。除了 双特异性抗体外，两个结合位点通常相同。
在特定的实施方式中，本发明提供了表4中所示的抗ILT3抗体。 除了在VH的101位上包含色氨酸残基的置换的那些抗体以外，本文 公开的抗体结合人ILT3。
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如实施例4中所述，通过氢-氘交换质谱法(HDX-MS)进行的表 位映射显示，本文公开的抗ILT3抗体结合至ILT3的细胞外结构域的 D1和D2结构域之间的边界附近的细胞外结构域上的表位。使用 HDX-MS确定的该表位表明，由本文公开的抗ILT3抗体结合的表位 包含或由选自SEQ ID NO:3，4，5，6，7，和8的肽结构域氨基酸序 列中的一个或多个内的至少一个氨基酸组成。在进一步的实施方式 中，所述表位包含或由选自SEQ ID NO:3，4，5，6，7，和8的肽结 构域氨基酸序列中的一个或多个组成。在某些实施方式中，所述表位 包含或由选自SEQ ID NO:3，4，5，6，7，和8的肽结构域氨基酸序 列中的每一个组成且在HDX-MS中确定。在具体实施方式中，所述 表位包含或由选自SEQ ID NO:3，4，5，6，7，和8的肽结构域氨基 酸序列中的一个或多个组成。在特定实施方式中，所述表位包含或由 SEQ ID NO:3，4，5，6，7，和8所示的肽结构域组成。
本发明还提供了嵌合的、人源化的或人抗体或抗原结合片段，其 结合ILT3上的表位，其中所述表位包含或由包含如通过氢-氘交换质 谱测定(HDX-MS)分析确定的SEQ IDNO:3，4，5，6，7，和8所 示氨基酸序列显示的氨基酸序列的肽结构域中的一个或多个内的至少一个氨基酸组成。
在另一个实施方式中，本发明进一步提供了与ILT3上的表位结 合的嵌合的、人源化或人抗体或抗原结合片段，其中所述表位包含或 由SEQ ID NO:3，4，5，6，7，和8中的一个或多个显示的肽结构域 内的氨基酸组成。在某些实施方式中，所述表位包含或由如通过HDX-MS确定且示于图3A的热图中确定的肽结构域中的每一个组 成。
本发明进一步提供了嵌合的、人源化或人抗体或抗原结合片段， 其交叉阻断抗体与ILT3上的表位结合，所述抗体包含具有SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链可变结构域和具有SEQ ID NO:16所示 氨基酸序列的轻链可变结构域。在进一步的实施方式中，所述表位包 含或由肽结构域中的一个或多个内的至少一个氨基酸组成，所述肽结 构域包含或由如通过氢-氘交换质谱测定(HDX-MS)分析确定的SEQ ID NO:3，4，5，6，7，和8所示氨基酸序列显示的氨基酸序列组成。 在进一步的实施方式中，所述表位包含或由SEQ ID NO:3，4，5，6， 7，和8中的一个或多个所示的肽结构域内的氨基酸组成。在某些实 施方式中，所述表位包含或由如通过HDX-MS确定的肽结构域中的 每一个中的至少一个氨基酸组成。
本发明进一步提供了双特异性抗体和抗原结合片段，其包含结合 ILT3的第一抗体或抗原结合片段和结合ILT3以外的分子的第二抗体 或抗原结合片段，其中第一抗体或抗原结合片段至少包含具有选自 SEQ ID NO:22，49，57、65，73，81，89，97，和105的氨基酸序 列，或具有与选自SEQ ID NO:22、49、57、65、73、81、89、97和 105的氨基酸序列具有3、2或1个差异的氨基酸序列的HC-CDR3， 其中第一抗体结合ILT3表位，所述表位包含SEQ IDNO:3，4，5，6， 7，和8的序列内的氨基酸，和第二抗体结合ILT3以外的分子，及其 使用方法。
本发明进一步提供了双特异性抗体和抗原结合片段，其包含结合 ILT3的第一抗体或抗原结合片段和结合ILT3以外的分子的第二抗体 或抗原结合片段，其中第一抗体或抗原结合片段至少包含抗ILT3抗 体或其其中所述CDR中的一个或多个具有一个，两个，或三个氨基 酸置换、添加、缺失，或其组合实施方式的六个CDR，并且其中所述 第一抗体结合ILT3表位，所述表位包含SEQ ID NO:3，4，5，6，7， 和8的序列内的氨基酸，和第二抗体结合ILT3以外的分子，及其使 用方法。
本发明进一步提供了双互补位抗体(对同一抗原上的不同表位具 有结合特异性的抗体)，其具有第一抗体的第一重链/轻链对，其包含 至少HC-CDR3，所述所述HC-CDR3具有选自SEQ ID NO:22、49、 57、65、73、81、89、97和105的氨基酸序列，或具有与选自SEQ IDNO:22，49，57、65，73，81，89，97，和105的氨基酸序列具有3、 2或1个差异的氨基酸序列；其中所述第一重链/轻链对结合ILT3表 位，所述表位包含SEQ ID NO:3，4，5，6，7，和8的序列内的氨基 酸，并且所述第二抗体结合ILT3以外的分子，第二抗体的第二重链/ 轻链对具有不同于由第一重/轻链对识别的表位的针对抗ILT3表位的 特异性。
本发明进一步提供了双互补位抗体(对同一抗原上的不同表位具 有结合特异性的抗体)，其具有第一抗体的第一重链/轻链对，其包含 抗ILT3抗体或其其中CDR中的一个或多个具有一个，两个，或三个 氨基酸置换、添加、缺失，或其组合的实施方式的至少六个CDR，其 中所述第一抗体结合ILT3表位，所述表位包含SEQ ID NO:3，4，5， 6，7，和8的序列内的氨基酸，其中所述第一重链/轻链对结合ILT3 表位，所述表位包含SEQ ID NO:3，4，5，6，7，和8的序列内的氨 基酸，和所述第二抗体结合ILT3以外的分子，第二抗体的第二重链/轻链对具有不同于由第一重/轻链对识别的表位的针对抗ILT3表位的 特异性。
药物组合物与施用
为了制备抗ILT3抗体或其抗原结合片段的药物或无菌组合物， 将抗体或其抗原结合片段与药学上可接受的载体或赋形剂混合。参 见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences and U.S.Pharmacopeia: National Formulary,MackPublishing Company,Easton,PA(1984)和 U.S.Pharmacopeial Convention(USP)12601Twinbrook Parkway, Rockville,MD 20852-1790,USA，在网上持续更新。
治疗和诊断试剂的制剂可通过以下形式与药用载体，赋形剂或稳 定剂混合来制备，例如，冷冻干燥粉末，浆液，水溶液或悬浮液(参 见，例如，Hardman,et al.(2001)Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,NY； Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New York,NY；Avis,et al.(eds.) (1993)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,MarcelDekker,NY；Lieberman,et al.(eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms:DisperseSystems,Marcel Dekker,NY； Weiner and Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity andSafety,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY)。
在另一个实施方式中，根据Physicians'DeskReference2017(ThomsonHealthcare；第75版(2002年11月1日))将包含本文 公开的抗体或抗体片段的组合物施用于受试者。施用抗体分子的方法 是本领域已知的，并在下面描述。所使用的分子的合适剂量将取决于 受试者的年龄和体重以及所使用的特定药物。抗ILT3抗体或抗原结合片段的剂量和治疗方案可以由技术人员确定。在某些实施方式中， 抗ILT3抗体或抗原结合片段以约1至30mg/kg，例如约5至25mg/kg， 约10至20的剂量通过注射(例如，皮下或静脉内)施用。mg/kg， 约1至5mg/kg或约3mg/kg。在一些实施方式中，抗ILT3抗体或抗 原结合片段以约1mg/kg，约3mg/kg或10mg/kg，约20mg/kg，约 30mg/kg或约40mg/kg。在一些实施方式中，以约1-3mg/kg或约 3-10mg/kg的剂量施用抗ILT3抗体或抗原结合片段。在一些实施方式 中，以约0.5-2、2-4、2-5、5-15或5-20mg/kg的剂量施用抗ILT3抗 体或抗原结合片段。给药时间表可以从例如每周一次到每2、3或4 周一次变化。在一个实施方式中，每隔一周以约10至20mg/kg的剂 量施用抗ILT3抗体或抗原结合片段。
给药方式可以变化。合适的给药途径优选是肠胃外或皮下的。其 他给药途径可包括口服，经粘膜，皮内，直接心室内，静脉内，鼻内， 吸入，吹入或动脉内。
在特定实施方式中，抗ILT3抗体或其抗原结合片段可以通过侵 入性途径例如通过注射来施用。在本发明的其他实施方式中，抗ILT3 抗体或其抗原结合片段或其药物组合物可以静脉内，皮下，动脉内或 通过吸入，气雾剂递送施用。通过非侵入性途径(例如口服；例如在 丸剂，胶囊或片剂中)的给药也在本发明的范围内。
组合物可以与本领域已知的医疗装置一起施用。例如，本发明的 药物组合物可以通过用皮下注射针注射来施用，所述皮下注射针包括 例如预填充的注射器或自动注射器。
本文公开的药物组合物还可以与无针皮下注射装置一起施用；优 选地，可以使用无针皮下注射装置。例如美国专利号6,620,135中公 开的设备；6,096,002；5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413； 4,941,880；4,790,824或4,596,556。
本文公开的药物组合物也可以通过输注施用。施用药物组合物的 众所周知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603公开了 一种用于以受控的速率分配药物的可植入的微输液泵；美国专利 No.4,447,233公开了一种用于以精确的输注速率输送药物的药物输注 泵。美国专利号4,447,224公开了一种用于连续药物输送的可变流量 可植入输注设备。美国专利。美国专利4,439,196公开了一种具有多 腔室的渗透药物输送系统。许多其他此类植入物，递送系统和模块是 本领域技术人员众所周知的。
施用方案取决于几个因素，包括治疗性抗体的血清或组织更新 率，症状水平，治疗性抗体的免疫原性以及生物基质中靶细胞的可及 性。优选地，所述给药方案递送足够的治疗性抗体以实现目标疾病状 态的改善，同时最小化不希望的副作用。因此，所递送的生物制剂的 量部分取决于特定的治疗性抗体和所治疗病症的严重性。有选择适当 剂量的治疗性抗体的指南(参见，例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios ScientificPub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991) Monoclonal Antibodies,Cytokines andArthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodies andPeptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert, etal.(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom et al.(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon et al.(2001)New Engl.J.Med. 344:783-792；Beniaminovitz et al.(2000)New Engl.J.Med. 342:613-619；Ghosh et al.(2003)New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky et al.(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602)。
调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如， 可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据 治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。以剂量单位形式配制肠 胃外组合物是特别有利的，以易于给药和剂量均匀。如本文所用，剂 量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的 单位；例如，单位剂量。每个单元包含预定量的活性化合物，该活性 化合物经计算可与所需的药物载体一起产生所需的治疗效果。本文所 述的剂量单位形式的规范由(a)抗体或抗体结合片段的独特特征和 要实现的特定治疗效果，以及(b)配制领域中固有的局限性直接决 定。这种活性分子用于治疗个体的敏感性。(参见，例如，Yang,et al. (2003)NewEngl.J.Med.349:427-434；Herold,et al.(2002)New Engl.J. Med.346:1692-1698；Liu,et al.(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych. 67:451-456；Portielji,et al.(20003)Cancer Immunol.Immunother. 52:133-144)。
本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段的用途
与相关ILT不混杂的本文公开的抗ILT3抗体和抗原结合片段可 以使用常规免疫测定法例如酶用于特异性检测人ILT3(例如，在诸 如血清或血浆的生物样品中)，连锁免疫吸附测定(ELISA)，放射 免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。本发明因此提供一种方法，用于检测人ILT3，包括与生物样品相接触的生物样品中的抗ILT3抗 体或抗原结合片段，并检测任一抗ILT3抗体或抗原结合片段结合到 人ILT3或未结合的本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段，从而检 测生物样品中的人ILT3。所述抗ILT3抗体或抗原结合片段直接或间接地用可检测物质标记，以促进结合或未结合的检测抗ILT3抗体或 抗原结合片段在本文中公开。合适的可检测物质包括各种酶，辅基， 荧光物质，发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化 物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；等等。合适的修 复基团复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物 素。合适的荧光材料的例子包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素， 若丹明，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的实例 包括鲁米诺；合适的放射性材料的实例包括125I,131I,35S和3H。
除了标记抗ILT3抗体或抗原结合片段外，人ILT3可以通过竞争 性免疫测定法在生物体液中进行测定，方法是使用标记有可检测物质 的ILT3标准品和未标记的抗人ILT3抗ILT3抗体或公开的抗原结合 片段。在该测定中，将生物学样品，标记的ILT3标准品和抗ILT3抗 体或抗原结合片段合并，并确定与本文公开的未标记的抗ILT3抗体 或抗原结合片段结合的标记ILT3标准物的量。生物样品中人ILT3的 量是成反比结合于标记的标准ILT3的抗ILT3抗体或抗原结合片段的 量。
在本文中公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段还可以用来检测来 自除人以外的物种的ILT3，特别是来自灵长类的ILT3(例如，食蟹 猴或猕猴)。
体内上调免疫反应的方法
本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段可以被用作免疫刺激组 合物，例如，单独使用或作为疫苗的一部分或组合治疗，促进B细胞 和/或T细胞的活化，例如，无论是Th1细胞或Th2细胞激活。即， 本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段可以用作与目的抗原组合使 用的佐剂，以增强体内针对该目的抗原的免疫应答。例如，为了刺激 的抗体或细胞免疫应答于感兴趣(例如，用于疫苗接种目的)的抗原， 本文中公开抗ILT3抗体或抗原结合片段可以是共给药(例如，共给 药在在相同或不同的组合物中同时进行，或在时间上相继进行，以使 免疫反应增强)。本文公开的目的抗原和抗ILT3抗体或抗原结合片 段可以一起配制为单一药物组合物或单独的组合物。在一个实施方式 中，将本文公开的目的抗原和抗ILT3抗体或抗原结合片段同时施用 于受试者。或者，在某些情况下，可能需要先施用抗原，然后再施用 本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段，反之亦然(例如，在自然 引发Th1反应的抗原的情况下，有利于首先单独施用抗原以刺激Th1 反应，然后单独或与抗原增强一起施用本文公开的抗ILT3抗体或抗 原结合片段以将免疫反应转变为Th2反应)。在优选的实施方式中， 本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段在用抗原引发时，即在第一 次抗原施用时施用。例如，第-3，-2，-1、0，+1，+2，+3天。本文 公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段的特别优选的给药天是-1天。
在一个实施方式中，本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段与 目的抗原一起施用。目的抗原是期望对其进行免疫应答的抗原。例如， 感兴趣的抗原是抗原能够刺激免疫保护在一个由从该抗原衍生传染 剂针对攻击受试者。还考虑给予本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合 片段以增加免疫应答而无需给予抗原。
因此，感兴趣的示例性抗原包括衍生自感染因子的那些，其中针 对该抗原的免疫应答用于预防或治疗该因子引起的疾病。这样的抗原 包括但不限于病毒，细菌，真菌或寄生虫蛋白以及任何其他蛋白，糖 蛋白，脂蛋白，糖脂等。感兴趣的抗原还包括那些对有风险获得或被 诊断患有肿瘤的受试者提供益处的抗原。所述受试者优选是哺乳动 物，最优选是人。
感兴趣的典型抗原可以分类如下：蛋白质抗原，例如铜蓝蛋白和 血清白蛋白；和细菌抗原，例如海胆酸，鞭毛抗原，荚膜多糖，细胞 外细菌产物和毒素；糖蛋白和糖脂；病毒，例如动物，植物和细菌病 毒；与正常组织相比，结合的和合成的抗原，例如蛋白质/半抗原结合 物，是由肿瘤优先表达的分子；合成多肽；核酸，例如核糖核酸和脱 氧核糖核酸。如本文所用，术语“感染剂”，包括表达抗原的任何试剂， 其引发宿主的细胞免疫应答。可以认为有用的病毒抗原的非限制性实 例包括但不限于流感病毒的核蛋白(NP)和HIV的Gag蛋白。其他 异源抗原包括但不限于HIVEnv蛋白或其组成部分gp120和gp41， HIVNef蛋白和HIVPol蛋白，逆转录酶和蛋白酶。此外，其他病毒抗 原，例如埃博拉病毒(EBOV)抗原，例如EBOVNP或糖蛋白(GP)， 在分子的粘蛋白区域中全长或GP缺失(Yang等，NatMED6：886(2000)，小痘抗原，肝炎A，B或C病毒，人类鼻病毒如2型或14 型，单纯疱疹病毒，2型脊髓灰质炎病毒或3，手足口病病毒(FMDV)， 狂犬病病毒，轮状病毒，流感病毒，柯萨奇病毒，人乳头瘤病毒(HPV) (例如16型乳头瘤病毒)，其E7蛋白以及含有E7蛋白或其表位的 片段；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)可被使用。感兴趣的抗原不必 限于病毒来源的抗原。寄生虫抗原，诸如，例如，疟疾抗原都包括在 内，是真菌抗原，细菌抗原和肿瘤抗原。来源于细菌抗原的实例是百 日咳博德特氏菌来源的那些(例如P69蛋白和丝状血凝素(FHA)抗 原)，霍乱弧菌，炭疽芽孢杆菌，和大肠杆菌的抗原，如大肠杆菌 (E.coli)热升abile毒素B亚基(LT-B)，大肠杆菌K88抗原，和 产肠毒素的大肠杆菌(E.coli)的抗原。抗原的其它实例包括曼氏血吸虫P28谷胱甘肽S-转移酶抗原(P28抗原)和吸虫，支原体，蛔虫， 绦虫，抗原沙眼衣原体和疟疾寄生虫，例如，寄生虫属疟原虫或巴贝 斯虫，例如恶性疟原虫，以及编码上述抗原的免疫原性表位的肽。
如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”是指影响宿主生物中肿瘤生长 或转移的抗原。肿瘤相关抗原可以是由肿瘤细胞表达的抗原，或者可 以是由非肿瘤细胞表达的抗原，但是当这样表达时，可以促进肿瘤细 胞的生长或转移。肿瘤抗原和肿瘤相关抗原的类型包括任何已知或迄 今为止未知的肿瘤抗原，包括但不限于白血病中的bcr/abl抗原，与宫 颈癌有关的致癌病毒的HPVE6和E7抗原，MAGE1和MZ2-黑色素 瘤中或与之相关的E抗原，以及乳腺癌中或与之相关的MVC-1和 HER-2抗原。
可以通过施用包含本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段的组 合物来治疗或预防的感染，疾病或病症，包括其中宿主免疫反应起到 预防感染，疾病或病症作用的任何感染，疾病或病症。紊乱。可以通 过施用包含本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段的组合物来治疗 或预防的疾病，病症或感染，包括但不限于由或引起的任何感染，疾 病或病症。由生物恐怖主义，李斯特菌病，埃博拉病毒，SARS，小 痘，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎，人为引起的疾病和病症引起的 或与之相关的真菌，寄生虫，病毒或细菌，疾病，病症或感染轮状病 毒，流感，柯萨奇病毒，人乳头瘤病毒，SIV，疟疾，癌症(例如肿 瘤)引起的或与之相关的鼻病毒，HIV和AIDS，疱疹，脊髓灰质炎， 脊髓灰质炎，口蹄疫，狂犬病，疾病或失调由百日咳博德特氏菌，霍 乱弧菌，炭疽杆菌，大肠杆菌，吸虫，支原体，弧虫，绦虫，沙眼衣 原体和疟原虫等引起或与之相关的疾病或病症。
免疫应答肿瘤细胞
调节性T细胞通过抑制针对自身免疫性疾病和癌症的免疫反应， 在维持免疫学自耐受性中起重要作用。因此，在一个实施方式中，上 调免疫应答对于增强癌症中的免疫应答将是有益的。因此，本文公开 的抗ILT3抗体或抗原结合片段可以被在恶性肿瘤的治疗中用于抑制 肿瘤生长或转移。本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段可以全身 或局部施用于肿瘤部位。
在一实施方式中，人ILT3功能的调节可用于诱导肿瘤免疫。一 个ILT3结合分子可以施用于具有患者的肿瘤细胞(例如，肉瘤，黑 色素瘤，淋巴瘤，白血病，神经母细胞瘤，癌)，以克服在所述受试 者的肿瘤特异性耐受性。
如本文所用，术语“肿瘤性疾病”的特征在于恶性肿瘤生长或处于 以良性过度增殖和增生性细胞为特征的疾病状态。术语“瘤形成”的一 般医学含义是指“新细胞生长”，其导致对正常生长控制(例如肿瘤细 胞生长)的反应性丧失。
如本文所用，术语“过度增殖”，“增生性”可互换使用，并且是指 那些细胞中的异常状态或状况，其特征快速增殖或肿瘤。“恶性”和“肿 瘤性”的术语意味着包括所有类型的过度增殖性的增长，增生性生长， 癌性生长或致癌过程，转移性的组织或恶性转化的细胞，组织或器官， 而与组织病理类型或侵入。阶段中的“增生”是指经历生长的异常高的 速率的细胞。然而如本文所用，术语“瘤形成”和“增生”可以互换使用， 如其上下文所揭示，通常指经历异常细胞生长速率的细胞，瘤和增生 包括“肿瘤”，其可以是良性，恶变前或恶性的。
术语“瘤形成”，“增生”和“肿瘤”通常被称为“癌症”，它是100多 种以细胞失控，异常生长为特征的疾病的总称。癌症的例子包括但不 限于：乳腺癌；结肠；非小细胞肺，头和颈部；大肠肺；前列腺；子 房；肾黑色素瘤胃肠道(例如胰腺和胃)癌；和成骨肉瘤。
胰腺癌，黑素瘤，乳腺癌，肺癌，：在一个实施方式中，所述癌 症选自头颈癌，支气管癌，结直肠癌，前列腺癌，胰腺癌，胃癌，卵 巢癌，泌尿膀胱癌，脑或中枢神经系统癌(例如，胶质母细胞瘤)， 周围神经系统癌，食道癌，宫颈癌，子宫或子宫内膜癌，口腔或咽癌，肝癌，肾癌，睾丸癌，胆道癌癌，小肠或阑尾癌，唾液腺癌，甲状腺 癌，肾上腺癌，骨肉瘤，软骨肉瘤和血液组织癌。
对传染原的免疫反应
免疫应答的上调可以是增强现有免疫应答或引发初始免疫应答 的形式。例如，在病毒感染的情况下，通过调节ILT3增强免疫反应 可能是有用的。由于本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段可起到 增强免疫反应的作用，因此在病原体例如细菌和病毒的更快速或彻底 清除将是有益的情况下，它们将在治疗上有用。
如本文所用，术语“病毒感染”包括以下生物体的感染，所述生物 体包括但不限于HIV(例如，HIV-1和HIV-2)，人疱疹病毒，巨细 胞病毒(特别是人)，轮状病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒，水痘带状疱 疹病毒，乙型肝炎病毒，例如乙型肝炎病毒，甲型肝炎病毒，丙型肝 炎病毒和戊型肝炎病毒，副粘病毒：呼吸道合胞病毒，副流感病毒， 麻疹病毒，腮腺炎病毒，人乳头瘤病毒(例如HPV6，11、16、18等)， 黄病毒(例如黄热病病毒，登革热病毒，T传脑炎病毒，日本脑炎病 毒)或流感病毒。
如本文所用，术语“细菌感染”包括各种细菌生物的感染，包括革 兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。例子包括但不限于，包括淋病奈瑟氏球 菌和脑膜炎奈瑟氏球菌的奈瑟氏球菌，包括肺炎链球菌，化脓性链球 菌，无乳链球菌，变形链球菌的链球菌；嗜血杆菌属，包括B型流感 嗜血杆菌，不可分型流感嗜血杆菌，杜克嗜血杆菌；莫拉氏菌，包括 卡他莫拉氏菌，也称为卡他布拉氏菌；博德特氏菌，包括百日咳博德 特氏菌，副百日咳博德特氏菌和支气管败血性博德特氏菌；分枝杆菌 属，包括结核分枝杆菌，牛分枝杆菌，麻风分枝杆菌，鸟分枝杆菌， 副结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌；军团菌属物种，包括嗜肺乳杆菌； 大肠杆菌，包括肠毒性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌，肠致病性大肠 杆菌；霍乱弧菌，包括霍乱弧菌，志贺氏菌，包括S.sonnei，痢疾链 球菌，弗氏链球菌；耶尔森氏菌，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫 耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，空肠弯曲菌，包括空肠弯曲杆菌和 大肠杆菌。沙门氏菌，包括伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，霍乱沙 门氏菌，肠炎沙门氏菌；李斯特菌属，包括单核细胞增生李斯特菌； 幽门螺杆菌，包括幽门螺杆菌；假单胞菌属物种包括铜绿假单胞菌， 葡萄球菌属物种包括金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌；肠球菌，包括 粪肠球菌，粪肠球菌；梭状芽胞杆菌，包括破伤风梭菌，肉毒梭菌， 艰难梭菌；芽孢杆菌属，包括炭疽杆菌；棒杆菌属，包括白喉衣原体； 伯氏疏螺旋体(Borrelia spp.)，包括B.burgdorferi，B.garinii，B.afzelii， B.andersonii，B.hermsii；埃里希氏菌，包括E.equi和人类粒细胞埃 希氏菌病的病原；立克次体属，包括R.rickettsii；衣原体属，包括沙 眼衣原体，肺炎衣原体，鹦鹉热衣原体；Leptsiraspp。，包括L. interrogans；梅毒螺旋体，包括梅毒螺旋体，齿状螺旋体，猪痢疾螺 旋体。优选的细菌包括但不限于利斯特氏菌，分枝杆菌，分枝杆菌(例 如结核)，炭疽，沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。
在另一个实施方式中，T细胞可以从患者中移除，并接触在体外 用抗ILT3抗体或抗原结合片段在本文中公开，任选地与一个激活信 号(例如，抗原加APC或多克隆抗体)和再引入患者。
本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段也可以预防性地用于针 对各种病原体的疫苗中。可以通过用病毒蛋白以及本文公开的抗ILT3 抗体或抗原结合片段进行疫苗接种来诱导针对病原体例如病毒的免 疫。或者，表达载体即编码基因在本文中公开的抗原和抗ILT3抗体 或抗原结合片段，例如，痘苗病毒表达载体工程化以表达编码核酸的 病毒蛋白和编码核酸的在本文中公开的抗ILT3抗体或抗原结合片 段，可用于疫苗接种。疫苗可能有用的病原体包括，例如，乙型肝炎， 丙型肝炎，爱泼斯坦-巴尔病毒，巨细胞病毒，HIV-1，HIV-2，结核 病，疟疾和血吸虫病。
本发明进一步包括与诊断或治疗剂缀合的本文公开的抗ILT3抗 体或抗原结合片段。本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段可作为 临床测试程序的一部分用于诊断，例如监测肿瘤的发生或进展，以例 如确定给定治疗方案的功效。检测可以通过将抗体偶联到可检测物质 来促进。可检测物质的实例包括各种酶，辅基，荧光材料，发光材料， 生物发光材料，放射性材料，使用各种正电子发射断层摄影术的正电 子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。可检测的物质可以使用本领 域已知的技术通过中间体(例如本领域已知的连接子)直接或间接地 偶联或结合到结合分子上。美国专利美国专利号4,741,900公开了可 以与结合分子结合的金属离子。合适的酶的例子包括辣根过氧化物 酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；等等。合适的修复 基团复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素。 合适的荧光材料的例子包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，若丹 明，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白。发光材料的实例包括 鲁米诺；生物发光材料的例子包括萤光素酶，萤光素和水母发光蛋白； 合适的放射性材料的实例是125I，131I，和99Tc。
此外，本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段可以缀合至治疗 性部分，例如细胞毒素，例如细胞生长抑制或杀细胞剂，治疗剂或放 射性金属离子，例如α-发射剂，例如，例如213Bi。细胞毒素或细胞 毒性剂包括任何对细胞有害的物质。实例包括紫杉醇，细胞松弛素B， 短杆菌肽D，溴化乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替诺泊苷， 长春新碱，长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基蒽醌二酮， 米托蒽醌，米曲霉素，前睾酮，肌酐丁卡因，利多卡因，普萘洛尔和 嘌呤霉素及其类似物或同系物。治疗剂包括但不限于抗代谢药(例如甲氨蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶脱羧嗪)， 烷基化剂(例如甲氧乙胺，噻菌胺氯安定，美法仑，卡莫汀(BSNU) 和洛莫斯汀(CCNU)，环硫磷，白消安，二溴甘露醇，链脲佐菌素， 丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类药物(例 如柔红霉素(以前为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如放线菌素))， 博来霉素，光神霉素和蒽霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春 新碱和长春碱)。
本发明进一步涉及涉及对动物，优选哺乳动物，最优选人类患者 施用本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段的疗法，以治疗，检测 和/或预防以下一种或多种：本文公开的疾病，失调或状况。本发明的 治疗化合物包括但不限于本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段。 所述抗ILT3抗体或抗原结合片段本文公开可被用于治疗，诊断，抑 制或预防与ILT3的异常活性，包括相关的疾病，障碍或病症，包括 但不限于，任何一种或多种疾病，紊乱的或此处所述的条件。
本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段可有利地与其他单克隆 或嵌合结合分子，或与淋巴因子或造血生长因子(例如，IL-2，IL-3 和IL-7)组合使用。例如，其用于增加与结合分子相互作用的效应细 胞的数量或活性。
本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段可以单独给药或与其他 类型的治疗联合使用，例如免疫刺激治疗或旨在控制活化免疫细胞 (例如癌细胞或病原体)靶标增殖的治疗。示例性疗法包括例如放射 疗法，化学疗法，激素疗法，免疫疗法和抗肿瘤剂，抗生素和免疫球 蛋白。
出于治疗目的，可以将本文公开的n抗ILT3抗体或抗原结合片 段施用于人类受试者。而且，本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片 段可以施用于表达ILT3的非人类哺乳动物，为了兽医目的或作为人 类疾病的动物模型，结合分子与ILT3交叉反应(例如灵长类)。
组合方式
本文的抗ILT3抗体或抗原结合片段可以以未偶联形式使用或与 第二试剂偶联，所述第二试剂例如细胞毒性药物，放射性同位素或蛋 白质例如蛋白质毒素或病毒蛋白质。该方法包括：将单独的或与细胞 毒性药物缀合的本文的抗ILT3抗体或抗原结合片段施用于需要这种 治疗的受试者。本文的抗ILT3抗体或抗原结合片段可用于递送多种 治疗剂，例如细胞毒性部分，例如治疗药物，放射性同位素，植物， 真菌或细菌来源的分子或生物蛋白(例如蛋白质毒素)或颗粒(例如 重组病毒颗粒，例如通过病毒外壳蛋白)，或其混合物。
其他组合疗法
本文公开的抗ILT3抗体或抗原结合片段可与其它疗法组合使 用。例如，组合疗法可包括包含与一种或多种其他治疗剂例如一种或 多种抗癌剂，细胞毒性或细胞抑制剂，激素治疗，疫苗和/或其他免疫 疗法共同配制和/或共同施用的抗ILT3抗体或抗原结合片段的组合 物。在其它实施方式中，抗ILT3抗体或其抗原结合片段与其它治疗 性治疗方式，包括外科手术，放射，冷冻手术，和/或热疗施用。这样 的组合疗法可以有利地利用较低剂量的所给予的治疗剂，从而避免了 与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
“与...组合”并不意味着暗示必须同时施用治疗和/或治疗剂和/或 配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本文所述的范围内。所述抗 ILT3抗体或其抗原结合片段可以被同时与施用一个或多个其它附加 疗法或治疗剂之前或之后。所述抗ILT3抗体或其抗原结合片段和其 它药剂或治疗方案可以以任何次序施用。通常，每种药剂将以针对该 药剂确定的剂量和/或时间表施用。还将认识到，在该组合中使用的另 外的治疗剂可以单一组合物一起施用或以不同组合物分开施用。通 常，期望以不超过单独使用它们的水平的组合使用另外的治疗剂。在 一些实施方式中，组合使用的水平将低于单独使用的水平。
在某些实施方式中，本文所述的抗ILT3抗体或其抗原结合片段 与程序性死亡受体1(PD-1)或其配体PD-L1和PD-L2的一种或多种 检验点抑制剂或拮抗剂组合施用。所述抑制剂或拮抗剂可以是抗体， 抗原结合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或寡肽。在一些实施方式中， 抗PD-1抗体选自纳武单抗(OPDIVO，Bristol Myers Squibb，纽约， 纽约)，派姆单抗(KEYTRUDA，Merck Sharp&Dohme Corp， Kenilworth，NJUSA)，cetiplimab(Regeneron，Tarrytown)，NY) 或pidilizumab(CT-011)。在一些实施方式中，PD-1抑制剂是免疫 粘附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融 合的PD-L1或PD-L2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素。在一 些实施方式中，PD-1抑制剂是AMP-224。在一些实施方式中，PD-L1 抑制剂是抗PD-L1抗体，例如杜鲁麦单抗(IMFINZI，Astrazeneca， Wilmington，DE)，阿特珠单抗(TECENTRIQ，Roche，苏黎世， CH)或阿伐单抗(BAVENCIO，EMD Serono，Billerica，MA)。在 一些实施方式中，抗PD-L1结合拮抗剂选自YW243.55.S70， MPDL3280A，MEDI-4736，MSB-0010718C或MDX-1105。
MDX-1105，也称为BMS-936559，是WO2007/005874中所述的 抗PD-L1抗体。抗体YW243.55.S70是描述于WO2010/077634的抗 PD-L1(重链和轻链可变区序列分别如SEQ IDNO:20和21所示)。
纳武单抗，也称为OPDIVO，MDX-1106-04，ONO-4538，或 BMS-936558，是全人IgG4抗PD-1抗体，在WO2006/121168和美国 专利8008449中描述。
派姆单抗，也称为KEYTRUDA，Ambrolizumab，MK-3475或 SCH-900475，是人源化抗PD-1抗体，在美国专利号8,354,509和 WO2009/114335中描述，和例如例如在Hamid,etal.,New England J. Med.369(2):134-144(2013)中公开。派姆单抗的重链和轻链分别由SEQ ID Nos:225和226所示氨基酸序列表示。
Pidilizumab，也称为CT-011(CureTech)，是与PD-1结合的人 源化IgG1单克隆抗体。Pidilizumab和其他人源化抗PD-1单克隆抗体 在WO2009/101611中公开。其他抗PD-1抗体包含AMP514 (Amplimmune)，尤其是例如美国专利8609089；美国公开号 2010028330；和美国公开号20120114649中公开的抗PD-1抗体。
AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如，在WO2010/027827 和WO2011/066342中公开)是一种PD-L2Fc融合可溶性受体，其阻 断PD-1和B7-H1之间的相互作用。
MDPL3280A(Genentech/Roche)是与PD-L1结合的人Fc优化 IgG1单克隆抗体。MDPL3280A和其他针对PD-L1的人单克隆抗体在 美国专利号7,943,743和美国公开号20120039906中公开。
其他抗PD-L1结合剂包括YW243.55.S70(重链和轻链可变区在 WO2010/077634中示为SEQ ID NO:20和21)和MDX-1105(也称为 BMS-936559)。它和其他抗PD-L1结合剂在WO2007/005874中公开。
试剂盒
还提供了包含一种或多种组分的试剂盒，所述组分包括但不限于 本文所述的抗ILT3抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种其他组 分，包括但不限于另一种治疗剂。如本文所述。抗体或片段和/或治疗 剂可以在药物组合物中配制为纯组合物或与药学上可接受的载体组 合。
在一个实施方式中，试剂盒在一个容器中(例如，在无菌玻璃或 塑料小瓶中)包含抗ILT3抗体或其抗原结合片段或其药物组合物， 并且在另一容器中(例如，在无菌中)包含另一种治疗剂。玻璃或塑 料瓶)。
在另一个实施方式中，所述试剂盒包含所述的组合抗ILT3抗体 或其抗原结合片段或其药物组合物结合一起配制，任选地，在药物组 合物中，在单一、公共容器中。
如果试剂盒包括用于肠胃外给药于受试者的药物组合物，则试剂 盒可以包括用于进行这种给药的装置。例如，试剂盒可包括一个或多 个皮下注射针头或如上所述的其他注射装置。因此，本发明包括试剂 盒，其包括注射装置和抗ILT3抗体或其抗原结合片段，例如，其中 注射装置包括抗体或片段，或者其中抗体或片段在单独的容器中。
试剂盒可以包括包装插页，该包装插页包括关于试剂盒中的药物 组合物和剂型的信息。通常，这样的信息帮助患者和医生有效且安全 地使用封闭的药物组合物和剂型。例如，可以在插入物中提供以下有 关本发明组合的信息：药代动力学，药效学，临床研究，功效参数， 适应症和用法，禁忌症，警告，注意事项，不良反应，过量，适当的 剂量和给药方式提供的适当存储条件，参考，制造商/分销商信息和专 利信息。
制备抗体及其抗原结合片段的方法
本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段也可以重组产生。在 该实施方式中，可以将编码抗体分子的核酸分子插入载体(质粒或病 毒)中，并转染或转化到宿主细胞中，在该宿主细胞中可以从宿主细 胞表达和分泌该核酸分子。产生重组抗体的几种方法是本领域已知 的。
在具体的方面，本发明提供了编码HC和LC的核酸分子，其中 所述HC包含本文公开的抗ILT3抗体的至少HC-CDR3或其其中 HC-CDR3具有一个，两个，或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组 合的实施方式。在进一步的实施方式中，HC和/或LC可变区框架包 含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失 或其组合。
在具体的方面，本发明提供了编码HC和LC的核酸分子，其中 所述HC包含本文公开的抗ILT3抗体的HC-CDR1，2和3或其其中 HC-CDR1、2和3中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、 添加、缺失或其组合的实施方式，并且其中所述LC包含本文公开的 抗ILT3抗体的LC-CDR1、2和3或其其中HC-CDR1、2和3中的一 个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的 实施方式。在进一步的实施方式中，HC和/或LC可变区框架包含0、 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组 合。
在具体的方面，本发明提供包含第一表达载体，其包含编码HC 的核酸分子，所述HC包含本文公开的抗ILT3抗体的至少HC CDR 或其其中三个HC CDR中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸 置换、添加、缺失或其组合的实施方式，和/或其中HC可变区框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失 或其组合，以及第二表达载体，其包含编码LC的核酸分子，所述LC 包含本文公开的抗ILT3抗体的至少LC CDR或其其中三个LC CDR 中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其 组合的实施方式，和/或其中LC可变区框架包含0、1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10个氨基酸置换，添加，缺失或其组合。
在具体的方面，本发明提供了编码为VH和VL的核酸分子，其中 VH包含本文公开的抗ILT3抗体的至少HC-CDR3或其其中所述HC-CDR3具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合 的实施方式。在进一步的实施方式中，VH和/或VL可变区框架包含0、 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组 合。
在具体的方面，本发明提供了编码为VH和VL的核酸分子，其中 所述HC包含本文公开的抗ILT3抗体的HC-CDR1，2和3或其其中 HC-CDR1，2和3中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、 添加、缺失或组合的实施方式，和其中所述VL包含本文公开的抗ILT3抗体的LC-CDR1、2和3或其其中其中HC-CDR1、2和3中的一个 或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的实 施方式。在进一步的实施方式中，VH和/或VL可变区框架包含0、1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合。
在具体的方面，本发明提供了编码VH的核酸分子，所述VH包 含本文公开的抗ILT3抗体的HC CDR或其其中三个HC CDR中的一 个或多个具有一个，两个，或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合 的实施方式，和/或其中VH和/或VL可变区框架包含0、1、2、3、4、 5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合，以及编码 VL的核酸分子，所述VL包含本文公开的抗ILT3抗体的LC CDR或 其其中三个LC CDR中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置 换、添加、缺失或其组合的实施方式，和/或其中VH和/或VL可变区 框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替换，添加， 缺失或其组合。
可用作表达抗体或片段的宿主的哺乳动物细胞系是本领域众所 周知的，并且包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许 多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，NSO， SP2细胞，HeLa细胞，小仓鼠肾(BHK)细胞，猴肾细胞(COS)， 人肝细胞癌细胞(例如HepG2)，A549细胞，3T3细胞，人胚肾293 (HEK-293)细胞和许多其他细胞系。通过确定哪些细胞系具有高表 达水平来选择特别优选的细胞系。可以使用的其他细胞系是昆虫细胞 系，例如Sf9细胞，两栖细胞，细菌细胞，植物细胞，丝状真菌细胞 (例如里氏木霉)和酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)。 在特定方面，宿主细胞可以是原核宿主细胞，例如大肠杆菌。
当重组表达载体，其包括核酸分子编码重链或其抗原结合部分或 片段，所述轻链和/或抗原结合片段被引入到宿主细胞中，所述抗体是 通过培养所述宿主细胞产生的条件下，和为足以允许抗体在宿主细胞 中表达的时间，或更优选地，将抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养 基中。可以从培养基中回收抗体，并进一步纯化或加工以产生本发明 的抗体。
在具体的方面，宿主细胞用包含表达载体转染，所述表达载体包 含核酸分子，其编码HC和LC，其中所述HC包含本文公开的抗ILT3 抗体的HC-CDR3或其其中所述HC-CDR3具有一个、两个或三个氨 基酸置换、添加、缺失或其组合的实施方式。在进一步的实施方式中， HC和/或LC可变区框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 个氨基酸置换、添加、缺失或其组合。
在具体的方面，宿主细胞用表达载体转染，所述表达载体包含核 酸分子，其编码HC和LC，其中所述HC包含本文公开的抗ILT3抗 体的HC-CDR1，2和3或其其中HC-CDR1、2和3中的一个或多个 具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的实施方式， 并且其中所述LC包含本文公开的抗ILT3抗体的LC-CDR1、2和3 或其其中HC-CDR1、2和3中的一个或多个具有一个、两个或三个氨 基酸置换、添加、缺失或其组合的实施方式。在进一步的实施方式中， HC和/或LC可变区框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10 个氨基酸置换、添加、缺失或其组合。
在具体的方面，宿主细胞用第一表达载体和第二表达载体转染， 所述第一表达载体包含核酸分子，其编码HC，所述HC包含本文公 开的抗ILT3抗体的HC CDR或其其中三个HCCDR中的一个或多个 具有一个，两个，或三个氨基酸置换、添加、缺失，或其组合的实施 方式，和/或其中HC可变区框架包括0，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个酸取代，添加，缺失或其组合，所述第二表达载体包含核酸 分子，其编码LC，所述LC包含本文公开的抗ILT3抗体的LCCDR 或其其中三个LC CDR中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸 的取代，添加，缺失或其组合的实施方式，和/或其中LC可变区框架 包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸替换，添加，缺 失或其组合。
在特定方面，用表达载体转染宿主细胞，所述表达载体包含编码 VH和VL的核酸分子，其中VH至少包含本文公开抗ILT3抗体的 HC-CDR3或其实施方式，其中所述HC-CDR3具有1、2或3个氨基 酸置换、添加、缺失或其组合。在进一步的实施方式中，VH和/或VL可变区框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、 添加、缺失或其组合。
在具体的方面，用包含核酸分子的表达载体转染宿主细胞，所述 核酸分子编码VH和VL，其中VH包括本文公开的抗ILT3抗体的 HC-CDR1，2和3或其其中HC-CDR1、2和3中的一个或多个具有一 个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的实施方式，并且 其中VL包含本文公开的抗ILT3抗体的LC-CDR 1、2和3或其其中 LC-CDR1、2和3中的一个或多个具有1、2或3个氨基酸置换、添 加、缺失或其组合的实施方式。在进一步的实施方式中，VH和/或VL可变区框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、 添加、缺失或其组合。
在特定方面，用包含第一表达载体和第二表达载体转染宿主细 胞，所述第一表达载体包含核酸分子，其编码VH，所述VH包含本文 公开的抗ILT3抗体的至少HC CDR或其其中三个HC CDR中的一个 或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的实施方式，和/或其中VH可变区框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10氨基酸置换、添加、缺失或其组合，所述第二表达载体包含核 酸分子，其编码VL，所述VL本文公开的抗ILT3抗体的至少LC CDR 或其中三个LC CDR中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸的 取代，添加，缺失或其组合的实施方式，和/或其中VL可变区框架包 含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换，添加，缺失， 或其组合。
在特定实施方式中，HC和LC或VH和VL表达为融合蛋白，其 中HC和LC的N端与前导序列融合，以促进抗体通过分泌途径的运 输。可以使用的前导序列的例子包括MSVPTQVLGLLLLWLTDARC (SEQ ID NO:12)或MEWSWVFLFFLSVTTGVHS(SEQ ID NO:11)。
本发明进一步提供了包含核酸分子的质粒或病毒载体，其编码本 文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段。本发明进一步提供了一种 质粒或病毒载体，其包含编码本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合 片段的HC或其其中3个CDR中的一个或多个具有一个、两个或三 个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的实施方式的核酸分子，和/或其 中HC可变区框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10氨基酸 置换、添加、缺失或其组合，以及编码本文公开的抗ILT3抗体或其 抗原结合片段的LC或其其中三个CDR中的一个或多个具有一个、 两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的实施方式的核酸分子 或，和/或其中LC可变区框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或10个氨基酸置换位置，添加，缺失或其组合。
本发明进一步提供了质粒或病毒载体，包含编码本文公开的抗 ILT3抗体或其抗原结合片段的HC的核酸分子，和质粒或病毒载体， 其包含编码本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段的LC的核酸 分子。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含质粒或病毒载体，其包含 核酸分子，其编码本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段的HC 或本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段的实施方式，其中3个 CDR中的一个或多个具有一个，两个，或三个氨基酸置换、添加、缺 失，或其组合，和/或其中的HC可变区框架包括0，1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失，或其组合，和质粒或 病毒载体，其包含核酸分子，其编码本文公开的抗ILT3抗体或其抗 原结合片段的LC或本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段的实 施方式，其中3个CDR中的一个或多个具有一个，两个，或三个氨 基酸置换、添加、缺失，或其组合，和/或其中LC可变区框架包括0， 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失，或其 组合。在特定的实施方式中，宿主细胞是CHO或HEK-293宿主细胞。
本发明进一步提供了包含核酸分子的质粒或病毒载体，其编码本 文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段。本发明进一步提供了质粒 或病毒载体，其包含编码本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段 的VH或抗ILT3抗体或其抗原结合片段的实施方式的核酸分子，其中 三个CDR中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、 缺失或其组合，和/或其中VH框架包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、 9或10个氨基酸酸取代，添加，缺失，或其组合，和编码本文公开的 抗ILT3抗体或其抗原结合片段的VL或抗ILT3抗体或其抗原结合片段的实施方式的核酸分子，其中三个CDR中的一个或多个具有一个、 两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合，和/或其中VL框架包 含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸酸取代，添加，缺 失，或其组合。
本发明进一步提供了包含编码本文公开的抗ILT3抗体或其抗原 结合片段的VH的核酸分子或抗原结合片段的质粒或病毒载体和包含 编码本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段的VL的核酸分子或抗 原结合片段的质粒或病毒载体。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含质粒或病毒载体，其包含 核酸分子，其编码本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段的VH或本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段的实施方式，其中3个 CDR中的一个或多个具有一个，两个，或三个氨基酸置换、添加、缺 失，或其组合，和/或其中的VH可变区框架包括0，1、2、3、4、5、 6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失，或其组合，和质粒或 病毒载体，其包含核酸分子，其编码本文公开的抗ILT3抗体或其抗 原结合片段的VL或本文公开的抗ILT3抗体或其抗原结合片段的实施 方式，其中3个CDR中的一个或多个具有一个，两个，或三个氨基 酸置换、添加、缺失，或其组合，和/或其中VL可变区框架包括0，1、 2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失，或其组合。在特定的实施方式中，宿主细胞是CHO或HEK-293宿主细胞。
可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗ILT3抗体或其 抗原结合片段。此外，可以使用多种已知技术来增强来自生产细胞系 的本发明抗体(或其中的其他部分)的表达。例如，谷氨酰胺合成酶 基因表达系统(GS系统)是在某些条件下增强表达的常用方法。
通常，在特定细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白将具有糖基化 模式，该糖基化模式是在细胞系或转基因动物中产生的糖蛋白的特征 (参见例如Croset等，J.Biotechnol.161：336-348)。(2012))。 因此，抗体的特定糖基化模式将取决于用于产生抗体的特定细胞系或 转基因动物。但是，由本文提供的核酸分子编码或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体均独立于抗体可能具有的糖基化模式而构成本 发明。
下面的实施例意在促进对本发明的进一步理解。
一般方法
Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982&1989 2nd Edition,2001 3rd Edition)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)RecombinantDNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)描述了分子生物学中 的标准方法。标准方法也出现在Ausbel,et al.(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York, NY，描述了细菌细胞中的克隆和DNA诱变(第1卷)，哺乳动物细 胞和酵母中的克隆(第2卷)，糖缀合物和蛋白质表达(第3卷)和 生物信息学(第4卷)。
描述了用于蛋白质纯化的方法，其包括免疫沉淀，色谱，电泳， 离心和结晶(Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science, Vol.1,John Wileyand Sons,Inc.,New York)。描述了化学分析，化 学修饰，翻译后修饰，融合蛋白的产生，蛋白的糖基化(参见例如 Coligan,et al.(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel,et al.(2001)Current Protocolsin Molecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY, NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多 克隆和单克隆抗体的产生，纯化和片段化(Coligan,et al.(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlowand Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY；Harlow and Lane,supra)。 表征配体/受体相互作用的标准技术是可用的(参见，例如，Coligan,et al.(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,JohnWiley,Inc., New York)。
可以制备单克隆抗体，多克隆抗体和人源化抗体(参见，例如， Sheperd and Dean(eds.)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ. Press,New York,NY；Kontermannand Dubel(eds.)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow andLane(1988) Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter,et al.(2000)J. Immunol.165:6205；He,et al.(1998)J.Immunol.160:1029；Tang et al. (1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca et al.(1997)J.Biol.Chem. 272:10678-10684；Chothia et al.(1989)Nature 342:877-883；Foote and Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；U.S.Pat.No.6,329,511)。
人源化的替代方法是使用在噬菌体上展示的人抗体文库或转基 因小鼠中的人抗体文库(Vaughan et al.(1996)Nature Biotechnol. 14:309-314；Barbas(1995)NatureMedicine 1:837-839；Mendez et al. (1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboomand Chames(2000) Immunol.Today 21:371-377；Barbas et al.(2001)Phage Display:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork；Kay et al.(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A LaboratoryManual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin et al.(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。
抗体可以偶联至例如小药物分子，酶，脂质体，聚乙二醇(PEG)。 抗体可用于治疗，诊断，试剂盒或其他目的，并且包括例如偶联至染 料，放射性同位素，酶或金属(例如胶体金)的抗体(参见，例如， Le Doussal et al.(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibelliniet al.(1998) J.Immunol.160:3891-3898；Hsing and Bishop(1999)J.Immunol. 162:2804-2811；Everts et al.(2002)J.Immunol.168:883-889)。
可以使用流式细胞术的方法，其包括荧光激活细胞分选(FACS) (参见，例如，Owens,et al.(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan (2001)Flow Cytometry,2nd ed.；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro (2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。 适用于例如例如用作诊断试剂的适于修饰核酸的荧光试剂包括核酸 引物和探针，多肽和抗体(Molecular Probes(2003)Catalogue, Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St. Louis,MO)。
描述了免疫系统组织学的标准方法(参见，例如， Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt,et al.(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis, et al.(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
提供了用于确定例如抗原性片段，前导序列，蛋白质折叠，功能 域，糖基化位点和序列比对的软件包和数据库(例如，参见GenBank, Vector
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Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；
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(TimeLogic Corp., Crystal Bay,Nevada)；Menne,et al.(2000)Bioinformatics 16:741-742； Menne,et al.(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren,et al.(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
纯度测定：在ACQUITY UPLC H-Class系统上进行尺寸排阻超高 效液相色谱(SE-UPLC)或(SEC)。所用柱为ACQUITY UPLC Protein BEH SEC柱(部件号186005225，1.7微米，200埃，4.6毫米×150毫 米)来自Waters(米尔福德，马萨诸塞州)。使用柱温度为25℃， 在1毫克/毫米下10微升样品使用0.5毫升/分钟的系统流速注入。使 用的流动相是100mM磷酸钠，200mM氯化钠和0.02％叠氮化钠， pH7.0。在214和280nm处对数据进行定量，并使用Empower3软件 进行分析。使用购自Waters(马萨诸塞州米尔福德)的BEH200 SEC 蛋白质标准混合物(部件号186006518)，并以10ug的剂量注射，测 量USP Resolution，理论塔板和拖尾。
NANO-DSF(商品名为改性差示扫描荧光的方法来确定蛋白质的 稳定性，采用固有色氨酸或酪氨酸荧光)：热解折叠曲线的温度中点 Tm和热聚合曲线的中点Tagg使用PRTherm Control v2.0.4软件控制 的Prometheus NT.48差示扫描荧光计(NanotemperTechnologies)通 过NANO-DSF测定。激发功率为40％，温度以1℃/min的速率从20℃ 增加到至95℃。自动测量Tm和Tagg。通过在20mM乙酸钠pH5.5 缓冲液中稀释至1mg/mL来制备样品，并通过毛细管作用将其吸入 Prometheus玻璃毛细管(PR-L002)中。
毛细管等电聚焦(cIEF)：cIEF是使用用于仪器控制和数据分析 的iCE CFR软件4.1.1在得自Protein Simple(San Jose，CA)的iCE3 系统上进行。使用的cIEF滤芯为Fc包被的(Protein Simple，101701)， 并根据制造商的说明进行制备。制备由40μg分析物和1％v/v 3-10 Pharmalyte，0.5％v/v 8-10.5Pharmalyte，0.5％v/v 5-8Pharmalyte(GEHealthcare)，37.5％v/v 8.0M尿素(Sigma-Aldrich)，35％v/v 1％甲 基纤维素和1μl各自的5.85和9.22pI标志物(Protein Simple)的200 μL样品。样品注入60秒。等电聚焦参数是1500V持续1分钟和3000V 持续8分钟。使用内部pI标记作为两点校准标准品，自动测量pI。校准后的数据通过使用Empower3转换为Empower格式进行进一步分 析和量化并进行分析。
实施例1
杂交瘤克隆52B8是通过标准的小鼠和大鼠免疫接种以及杂交瘤 选择鉴定的。通常，在标准的四周足垫免疫中，用人ILT3-HIS重组 蛋白对Balb/C小鼠或大鼠进行免疫，以产生超免疫反应。来自引流 淋巴结的主体淋巴细胞与P3骨髓瘤融合伴侣的电融合产生了永生化 杂交瘤。杂交瘤上清液在基于初级细胞的ELISA结合测定中筛选人 CHO-人ILT3细胞。在基于细胞的ELISA形式中二次筛选CHO亲本， CHO-ILT3 SNP，CHO-rhesus ILT3，CHO-ILT5，CHO-ILT8和 CHO-ILT11细胞(参见实施例2)。在ILT3特异性和猕猴阳性杂交 瘤细胞上通过有限稀释进行亚克隆。扩增亚克隆以产生纯化的蛋白 质，以使能够进行Biacore分析和功能筛选的额外测试。表5显示了 10种杂交瘤克隆，其产生归入一起并对人ILT3具有高亲和力的抗体， 如分别由实施例2和4公开的进行的CELISA和Biacore所示。
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Figure DEST_PATH_IMAGE013
表6显示从上述克隆获得的mAb的重链和轻链可变结构域的氨 基酸序列。
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为了最终指导先导抗体的选择，对抗体进行了进一步的分析，并 在一组生物功能，生物物理和理化分析中进行了再评估。最后，使用 人SKMEL5黑色素瘤攻击的人源化小鼠，在体内生物学证据肿瘤回 归研究中测试了抗体。
实施例2
各种抗ILT3抗体的选择性
使用基于细胞的ELISA(cELISA)来显示表5中所示的各种亲 本抗ILT3抗体和人源化抗ILT3单克隆抗体9B11(美国专利号 7,777,008中公开，其具有SEQ ID NO:33(轻链)和SEQ ID NO:34 (重链)的氨基酸序列)的选择性。
使用基于细胞的ELISA格式测试了小鼠抗人ILT3抗体与人ILT3 的结合以及与猕猴ILT3，人ILT5，人ILT7，人ILT8和人ILT11表 达CHO-K1细胞的交叉反应性。CHO-K1细胞在50μL的DMEM/F12， 10％BCS和庆大霉素(CHO-K1介质)中接种于96孔组织培养板中。 在测定前两天以2×104细胞/孔或在测定前一日以4×104细胞/孔将细胞 铺板。在添加测试样品之前，从孔中除去培养基。将纯化的抗体在 CHO-K1培养基中连续稀释，然后添加到CHO-K1平板中。将样品在 室温下孵育30-60分钟，并使用Biotek EL405x Select CW洗板机上的 细胞洗涤程序，用PBS/05％Tween-20将板洗涤3次。使用在CHO-K1 培养基中以1:2000稀释度加入的HRP偶联山羊抗小鼠IgG(Southern Biotechcat#1031-05)二抗检测结合，并在室温下孵育30-60分钟。 如上洗涤测定板并用TMB显影，并用TMB终止溶液终止(KPL目 录号50-85-06)。测定在450nm-620nm处的吸光度。小鼠IgG1(MIgG1) 作为对照。
结果示于图1A、1B、1C、1D和1E中。这些图表明，来自克隆 p40B5，p49C6和p52B8的代表性抗体对ILT3具有特异性，并且不与 ILT5，ILT7，ILT8和ILT11交叉反应或与之结合。来自克隆p49C6 和p52B8的抗体，来自其它克隆的抗体，能够结合猕猴ILT3。基于 (1)其与人ILT3的高度亲和力，(2)缺少与其他ILT家族成员的 结合，以及(3)与猕猴ILT3的交叉反应性，选择p52B8克隆进行体 内表征。
实施例3
将亲本小鼠52B8重链(VH)和轻链(VL)可变结构域序列与人 种系序列进行比较。选择与小鼠抗体的框架紧密同源的人框架序列。
小鼠抗人ILT3 mAb 52B8克隆的小鼠VH结构域在亚组III和J 区的JH4中对人重链种系3-07得分很高。基于结构上的考虑，引入 了两个框架置换(R87K和A97G)以维持与亲本抗体等同的结合。 该抗体克隆的小鼠VL结构域在κ亚组I中对人轻链种系1-O2得分很 高。将小鼠52B8 CDR工程化到J区的1-O2和JK2的可变轻链序列 上。基于结构上的考虑，引入了三个框架置换(M4L，S64A和G72R)。
为了产生人源化变体，将人源化VH序列克隆到编码人IgG4 S228P重链恒定结构域的载体中，并将人源化VL结构域克隆到编码κ 轻链恒定结构域的载体中。总共设计了两个人性化的VH(VH1和VH2) 和8个人性化的VL。小鼠52B8的计算机序列和结构分析表明，分子上有六个潜在的“热点”：VH-CDR2(M64)和VH-CDR3(W101)中 的两个潜在的氧化位点，VH-CDR2(D62)中的一个潜在的异构化位 点，VL-CDR1(N34)中的一个潜在的脱酰胺位点，VL-CDR1(D30) 和VL-CDR2(D59)中的两个潜在异构化位点。M64被修饰为V64 或L64，其保持了良好的理化特性和结合/功能。
图2A提供了表格，其显示了关于所设计的人源化变体的结合亲 和力，等电点，单体种类纯度和热稳定性测量的数据特征。Biacore 用于测量结合亲和力，cIEF用于测量pI，纯度通过SE-UPLC确定， Tm和Tgg通过Nano-DSF确定。图2B显示了各种人源化轻链变体的SEC纯度与熔融温度的关系。将数据绘制为从八个人源化轻链变体中 的每一个获得的值，表明VL5具有最高的纯度和热稳定性两者。基于 图2A和图2B的数据，VL5被选择用于轻链。
对瞬时CHO细胞中产生的人源化VH1 M64V/VL5进行了初步研 究。在未配制的人源化52B8 VH1 M64V/VL5上同时进行50℃孵育和 高pH胁迫的强制脱酰胺条件显示VL-CDR1中LC N34的脱酰胺(分 别为4.0％和7.2％)，且HC-CDR3中W101氧化在1×光胁迫暴露下 为15.4％。用Biacore SPR分析评估N34置换Q34维持对人和猕猴ILT3 的结合亲和力和通过DCTNFα产生分析评估功能活性；然而，如通 过Biacore SPR测定所确定的，W101残基的置换导致结合的显著损 失。
总结，人源化52B8是抗ILT3 mAb(52B8 VH1 M64V/VL5 N34Q IgG4 S228P/κ)，包含在VL中的一个框架置换(M4L)和在VH中的 一个框架置换(A97G)。
实施例4
使用Biacore T200系统(GE Healthcare，Piscataway，NJ)通过 表面等离振子共振测量了抗人ILT3克隆对人或猕猴ILT3-His标记的 重组蛋白的结合动力学和亲和力。使用HBS-EP+缓冲液(BR-1006-69) 作为运行缓冲液。按照制造商的说明，通过胺偶联化学方法将抗人 Fc抗体(Human Fc Capture Kit，BR100839，GE Healthcare)固定在 Series SCM5传感器芯片(BR100530或29149603，GE Healthcare) 上的所有四个流通池中。流通池1用作背景扣除的参考，不用于捕获。 上面列出的抗人ILT3抗体(在HBS-EP+缓冲液中稀释至1μg/mL)在 流动池2、3和4中的抗人Fc捕获表面上以10μL/mL注射10秒，这 导致在60-70RU六点的范围内的抗体捕获水平，范围为20nM至 0.31nM的2倍稀释系列的人或猕猴ILT3-His蛋白和两个零 (HBS-EP+)以50μL/mL在参比和捕获抗体表面上注射180秒的结合， 然后是600秒的解离。在每个注射循环后，以10μL/分钟的流速使用 3M MgCl2溶液的30秒第二注射再生所有四个流动池。在Biacore T200 评估软件(2.0版)中，扣除参比的传感图拟合至1:1Langmuir结合 模型以确定结合(ka)和解离(kd)速率常数和平衡解离常数KD (＝kd/ka)。
表7总结了抗人ILT3抗体与重组人或猕猴ILT3的结合动力学和 亲和力。
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实施例5
结合人ILT3的嵌合抗ILT3 52B8小鼠VH/人IgG4(S228P): 小鼠VL/人κ(“c58B8”；mAb 73)通过氢氘交换(HDX)质谱进行 的表位映射
通过使用氢氘交换质谱(HDX-MS)分析来确定抗体与人ILT3 细胞外结构域的接触区域。HDX-MS测量氘在蛋白质的酰胺主链中的 掺入，并且这种掺入的变化受氢的溶剂暴露的影响。进行单独的抗原 的样品和结合的抗体的样品中的氘交换水平的比较，以确定可以与抗 体接触的ILT3细胞外结构域上的区域。具有C端His标签的人ILT3 细胞外结构域(人ILT3-His)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
His-标记的人ILT3-His胞外结构域与抗体c58B8(mAb 73)一起 预先孵育，c58B8是嵌合抗ILT3 52B8小鼠VH M64V/人IgG4(S228P): 小鼠VL/人κ，其包含具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的HC和具 有SEQ ID NO:116所示氨基酸序列的LC，之后在氘缓冲液中孵育。使用3k MWCO离心柱将人ILT3-His和抗体进行缓冲液交换至PBS pH7.4。将人ILT3-His(80pmol/μL)与等体积的抗体(40pmol/μL) 混合，或作为未结合的对照，PBS pH7.4。在开始标记实验之前，将 结合的抗体的样品和未结合的对照在室温下孵育1小时。
为了将样品进行氘标记，2μL样品与25μL PBS在氧化氘中混合， pH 7.6。标记时间点为30、300、3000、6000或12000秒。在设定时 间后，将25μL标记混合物添加到30μL冷淬灭缓冲液(8M尿素， 150mM TCEP)中。将淬灭的样品在1.5℃下孵育2分钟。53μL然后 注入柱冷却室，其中将样品经过胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱，将所得的 肽装载到捕获柱。三分钟后，启动分析梯度和质谱仪。通过将2μL的 人ILT3-His与108μL氘化变性缓冲液(4M尿素，150mMTCEP，在 99.5％的氧化氘中)一起孵育，产生完全氘化样品。将样品在37℃下 孵育过夜。然后55μL被直接注射到柱室中，并获取数据。
采集未标记样品的LC-MS/MS数据，并在进行氘标记之前进行搜 索，以验证蛋白质的成功消化并生成肽列表。使用Proteome Discoverer 1.4和SEQUEST HT搜索算法(ThermoFisher Scientific)对数据库进 行数据搜索。所使用的蛋白质数据库是连接到酵母酿酒酵母数据库的 人ILT3-His序列。
标记后，55μL样品等份被施加到NovaBioAssays胃蛋白酶/蛋白 酶XIII柱，随后是Waters CSH C18保护柱和Waters CSH C18 1x50mm 分析柱上的色谱，在含有2％乙腈、0.1％TFA的上样缓冲液中。通过 质谱测量氘掺入到人ILT3-His细胞外结构域中。猝灭：8M尿素， 150mM TCEP；标记缓冲液：PBS，pH 7.6；空白缓冲液：PBS，pH7.4。 质谱仪是ThermoScientific Orbitrap-Elite。为了测量氘标记的样品， 将质谱仪设置为以120,000的分辨力，1E6的目标离子数和500毫秒 的最大离子注入时间，在轨道阱中获取一个全扫描MS数据。为了获 得用于肽鉴定的MS/MS数据，将质谱仪设置为以120,000的分辨力 采集一个完整的扫描谱，然后在离子阱中采集十个数据依赖性MS/MS 光谱。
所用液相色谱系统是用于分析柱梯度的Waters nano ACQUITY 和用于样品消化和装载的Waters 515等度泵。对于样品的消化和上 样，所用的缓冲液为2％乙腈和0.1％三氟乙酸，流速为100μL/min。 对于分析梯度，缓冲液为缓冲液A)在水中的0.1％甲酸，和缓冲液B) 在乙腈中的0.1％甲酸。梯度以40μL/min在10分钟内从2％B到36％B， 然后用80％B洗涤1.5分钟，然后在2％B下重新平衡3分钟。然后通 过使梯度在2％和80％B之间循环三次洗涤柱，每步1分钟，然后在 2％B下最终平衡5分钟。捕获柱是Waters Vanguard C18 BEH 1.7μm 保护柱，分析柱是Waters C18 BEH300，1.7μm 1×50mm柱。
氘标记的样品处理是通过Leaptec H/D-X PAL系统完成的。标记 样品盘温度设置为25℃，淬灭盘温度设置为1.5℃，阱和分析柱室设 置为1.5℃。固定的胃蛋白酶柱(胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱 NBA2014002，2.1x30mm，NovaBioAssay)在室温下保持在柱室的外 部。
抗体结合的人ILT3-His氨基酸残基的氘标记差示热图示于图3A。HDX质谱表明，本文公开的抗体和与所述抗体交叉竞争的其他 抗体家族结合表位，该表位包含或由以下组成：ILT3的氨基酸残基 18-23(ISWGNS；SEQ ID NO:3)，64-69(IPSMTE；SEQ ID NO:4)， 96-101(MTGAYS；SEQ ID NO:5)，124-131(QSRSPMDT；SEQ ID NO:6)，152-159(AQQHQAEF；SEQ IDNO:7)和184-187(LLSH； SEQ ID NO:8)中的一个或多个中的至少一个氨基酸。图3B显示了人ILT3细胞外结构域的三维表面结构模型的第一视图和第二视图， 显示受保护的氨基酸残基。这些受保护的氨基酸残基包含跨越细胞外 结构域的D1和D2结构域之间的边界的分裂或不连续的表位。图3C是带状图，显示了表位在人ILT3细胞外结构域上的位置。黑色的残基被保护以免被抗体标记。白色的残基未显示在标记方面的变化，深 灰色的残基未从其获取数据。平均每个残基的氘标记差异，并将其映 射到ILT3的晶体结构上(Cheng et al.,“Crystal structure of leukocyte Ig-like receptor LILRB4(ILT3/LIR-5/CD85k):amyeloid inhibitory receptor involved in immune tolerance.”J Biol Chem 286:18013-25 (2011))。
使用抗体ZM4.1，DX439，DX446和9B11进行了类似的HDX 映射实验。ZM4.1抗体可商购自ThermoFisher Scientific,Carlsbad,CA 或BioLegend,San Diego,CA。抗体DX439和DX446已在 WO2018089300中公开，抗体9B11已在美国专利7,777,008中公开。 在这些抗体中，仅观察到抗体ZM4.1结合与本发明的抗体结合的表位 部分重叠的表位。然而，归类研究显示抗体ZM4.1没有交叉阻断本发 明的抗体的结合。图3D，3E，3F和3G显示了抗体ZM4.1，DX439， DX446和9B11与人ILT3的结合的热图。
实施例6
嵌合抗ILT3 52B8小鼠VH/人IGg4(S228P):小鼠VL/人κ (“c58B8”；mAb 73)在NSG小鼠中的药代动力学
在Panc08.13人-NSG小鼠模型和SK-MEL-5人CD34+-NSG小鼠 模型中评价嵌合抗ILT3 52B8小鼠VH/人IgG4(S228P):小鼠VL/人κ (c85B8；mAb 73)的药代动力学。
SK-MEL-5是人黑素瘤衍生细胞系，可以生长为皮下肿瘤。Panc 08.13是人类胰腺癌衍生的肿瘤细胞系。Panc 08.13人-NSG模型已显 示对派姆单抗和ipilimumab治疗敏感。与Panc 08.13模型相比， SK-MEL-5模型在肿瘤中具有强大而多样的髓样浸润。两种模型均显 示肿瘤和脾脏中人CD14+髓样细胞上增加的ILT3表达。
基于ECL的靶标捕获免疫分析用于定量人源化小鼠血浆中的抗 体。使用生物素化的重组ILT3作为捕获试剂，并使用Southern Biotech (cat#9190-01)的sulfoTAG标记的小鼠抗huIgG(Fc特异性)作为 检测试剂，建立了该测定法。校准品和QC均在纯C57BL/6血浆中制 备，并在平板中测试时稀释100倍。该测定法已经合格，该测定法的 LLOQ测定为40ng/mL，MRD为100。
在Panc08.13 hu-NSG小鼠模型中，对于前三个剂量每周一次和对 于第四个剂量在第三个剂量后两周，IP给予20mg/kg的抗体，与或不 与派姆单抗(5mg/kg)一起。在第三个剂量之前(Ctrough)和在第 三个剂量之后24小时(Cmax)收集血液样品。还在第四个剂量之后 的第5天和第6天收集末期血液样品。在SK-MEL-5 huCD34+-NSG 小鼠模型中，通过IP每周以2和20mg/kg施用抗体。在第三剂量前 (Ctrough)和第三次剂量后24h(Cmax)收集血液样品。还在第三 剂量之后的第3天和第7天收集末期血液样品。通过抗原捕获测定法 确定游离的(未结合的)抗体浓度。
药代动力学参数是从历史IgG4抗体数据(在C57BL/6J小鼠中静 脉推注施用1、3、10、30mg/kg的人源化IgG4抗体)产生，所研究 的剂量的抗体的Phoenix NLME.PK曲线是基于所产生的药代动力学 参数来模拟。
历史IgG4抗体数据的PK分析显示AUC和所研究的剂量之间的 线性关系(参见图4)。在包括跨不同测试剂量的c52B8的线性PK、 不同小鼠品系之间没有PK差异、抗体IP给药后的快速吸收和100％ 的生物利用度的假设下，基于历史IgG4抗体数据模拟了所研究的剂量的c52B8的PK曲线。结果表明，在Panc08.13人-NSG模型和 SK-MEL-5 huCD34+-NSG模型两者中，在20mg/kg的模拟曲线均遵 循观察到的c52B8浓度。
实施例7
抗ILT3单克隆抗体激活树突状细胞并降低骨髓衍生抑制细胞 (MDSCs)的抑制能力
冷冻，融化分离自新鲜白细胞的人PBMC，并通过阴性选择纯化 CD14+单核细胞。纯化的细胞与GM-CSF(1000U/mL)和IL4 (1000U/mL)一起培养5天。然后在添加有或没有抗ILT3抗体的 IL-10(50ng/mL)和LPS(1ug/mL)的情况下，将这些未成熟的DC 进一步培养42小时。TNFα在培养上清液中测量。
滴定实验表明，c52B8当在极化步骤期间添加时，引起培养基中 TNFα分泌的剂量依赖性增加，而对照IgG4没有(对照是针对RSV 的市售抗体的变体，商品名Synagis)(图5A)。产生TNFα水平的 半数最大增加所需的抗体浓度(EC50)为约1.9纳克/毫升。对于其 中p58B8的VH和VL与具有人IgG1框架(mAb 78)或N297A突变 的人IgG1框架(mAb 76)的Fc融合的嵌合变体而言，这没有什么不 同。这些数据表明，在该测定中，Fc受体结合在功能活性中不发挥任 何作用。相对于Fc受体结合的独立性控制了这种测定法中的激活机 制是通过识别用抗体装饰的培养物中的其他DC而变得被激活的DC 的可能性，其会是与ILT3无关的机制。
图5B和5C显示在两个供体中在c52B8(mAb 73)和人源化抗 ILT3 mAb 52B8 VH1M64 V/VL5 N34Q IgG4 S228P/κ(mAb 46)之间 在功能活性方面没有差异显著。如所示，在DC的极化期间添加抗体 c52B8，但不在T细胞初免期间，DC更好地能够激活T细胞以增殖，类似于不耐受IL10的DC。当抗体c52B8在T细胞初免期间添加，但 不在DC极化期间，T细胞更好地能够响应于后续的再刺激。在人源 化后，在相同的测定法中测试了保留与嵌合体相当的结合的变体，发 现它们是有活性的，它们之间的效力没有有意义的差异。这些数据表明，用c52B8生成的数据是代表如果使用人源化mAb 46会有的数据。
实施例8
抗ILT3抗体降低骨髓衍生抑制细胞(MDSC)的抑制能力
不归因于任何特定理论或假说，我们假设生产性T细胞对肿瘤的 反应在某些情况下可受到未成熟和抑制性髓样细胞的存在的限制。这 些细胞表达ILT3，我们假设ILT3以抑制方式发挥作用以维持特征为 低HLA-DR表达、IL-10产生以及T细胞激活和增殖的有效抑制的未 成熟状态。建立基于人PBMC与SKMEL5肿瘤细胞体外共培养的模 型，然后纯化MDSC并测试其抑制自体CD8+T细胞增殖的能力，使 得能够探索ILT3生物学的这一方面。这个例子表明，c52B8和人源 化52B8(mAb 46)能够损害T细胞抑制表型的获得(或维持)。
为了生成MDSC，健康人PBMC与SKMEL5细胞和20ng/mL的 GM-CSF一起培养7天。通过基于阳性抗体的磁珠选择收集CD33+ 细胞，然后在多克隆刺激物存在的情况下，按所示比率与纯化自体 CD8+T细胞共培养3天。在共培养和T细胞抑制步骤两者中，培养 物包含c52B8(mAb 73)，人源化52B8(mAb 46)，或同种型对照 抗体(1μg/mL)。以T细胞与MDSC的比率为4:1进行T细胞抑制 测定，并测量产生的干扰素γ(INFγ)的量。
图6A和图6B示例了人源化52B8和c52B8在MDSC模型中在 一定比率的T细胞与MDSC下的活性，其中这些抗体的作用最为明 显，表明该等抗体以可比的方式降低了MDSC的抑制能力。这些数 据进一步表明，用c52B8生成的数据是代表使用人源化mAb 46会发 现的数据。
实施例9
抗ILT3抗体cC52B8抑制携带SK-MEL-5皮下肿瘤的SK-MEL-5hu-NSG小鼠中的SK-MEL-5肿瘤生长
每周一次对携带已确立的皮下肿瘤的小鼠全身性施用c52B8提 供了肿瘤生长的抑制(图7)。在植入后第21天根据肿瘤体积将动物 随机分配至治疗组，并从第21天开始每周一次向其皮下给药20mg/kg c52B8(mAb 73)或同种型对照。左图中显示的数据是平均和std.误 差(每组九只)。右图显示了个体动物肿瘤生长曲线。对照组和52B8 组两者中的体重下降到相似的程度。该研究代表了三次独立研究。
在三个独立的研究中，肿瘤生长的抑制程度一致且相似，且与抗 ILT4的作用非常相似。迄今为止测试的其他机制(例如抗PD-1，抗 ILT4，抗CD27，抗GITR)均未提供回归，导致我们推测肿瘤停滞可 代表该模型的基础。这明显不同于通常用于临床前功效测定的小鼠同 基因模型。
实施例10
c52B8处理后SK-MEL-5hu-NSG中的免疫激活
为了了解介导肿瘤功效的免疫机制，分析了肿瘤浸润免疫细胞并 测量了血液中的测量的sHLA-G水平。用c52B8(2和20mg/kg i.p.QW) 处理小鼠。根据在mini-PK和使用历史研究的模拟中检测到的Cmax和Ctrough水平来选择抗体剂量。收集血样用于PK，sHLA-G和细胞因 子分析。使用CyTOF进行TIL分析以同时检测36个标记物。固定终 末肿瘤样品并用于人CD3+ T细胞IHC分析。在用20mpk 52B8处理 的小鼠中观察到百分之三十的肿瘤生长抑制作用。然而，由于与人源 化肿瘤模型相关的较大可变性，未检测到统计学显著性差异。52B8适度的肿瘤疗效是与肿瘤CD4+CD127-CD25+ T抑制细胞(21％相比 于14％)和血液sHLA-G水平的适度降低以及肿瘤中T细胞的激活的 增加(CD69强度，14相比于23)相关联。如图8所示，对于c52B8 处理未检测到细胞因子变化。
实施例11
抗ILT3抗体c52B8与派姆单抗组合在Panc08.13 hu-NSG模型中 的效果：肿瘤功效和免疫激活
在Panc08.13 hu-NSG模型中评估了抗ILT3抗体c52B8。用作单 一药物的52B8显示对肿瘤生长抑制很小的作用。当52B8与派姆单 抗组合使用时，人源化小鼠的五个群(五个不同的人供体)中的一个 具有50％的肿瘤生长抑制(TGI)，且该TGI与增加的T细胞激活和IFNγ生产和降低的血液sHLA-G水平相关联，如图9A，图9B，图 9C和图9D所示。
实施例12
抗ILT3抗体52B8与派姆单抗的组合在MDSC/T细胞抑制测定 中的效果
在MDSC/T细胞抑制测定中，与和不与派姆单抗一起的人源化抗 ILT3抗体52B8(mAb 46)实现了增加T细胞活性。当mAb 46与派 姆单抗组合使用时，效果是加和性的。
为了生成MDSC，来自特定供体的健康人PBMC与SKMEL5细 胞和20ng/mL的GM-CSF一起培养七天。用52B8(1μg/mL)或同种 型对照抗体(1μg/mL)处理培养物。用抗CD33磁性微珠和LS柱分 离(Miltenyi Biotec，德国)收集CD33+细胞，然后在多克隆刺激物 存在下，以指定比率与纯化自体CD8+ T细胞共培养3天。使用基于 阴性抗体的磁珠选择(Stem CellTechnologies，加拿大)从健康人 PBMC中分离自体CD8+T细胞，然后与CD33+髓样细胞以8:1的比 率(T细胞:MDSC)在96孔板中共培养2天。在共培养和T细胞抑 制步骤两者中，培养物包含人源化52B8(mAb 46)或同种型对照抗 体(IgG4)(1μg/mL)单独或与派姆单抗(2μg/mL)组合。用同种 型对照抗体将每种处理中的总抗体浓度调节至3ug/mL。T细胞增殖是 由多克隆刺激性抗CD3/CD28珠和IL2诱导。使用MSD ELISA (Mesoscale Discovery，MD)，在培养物上清液中确定IFNγ水平。 用4:1或8:1的T细胞与MDSC之比进行T细胞抑制测定，并测量产生的干扰素γ(INFγ)的量。结果示于图10-14中。
图10显示在MDSC/T细胞抑制测定中，使用从来自两个不同人 类供体(分别为D00100385和D001003507)的PBMC获得的MDSC， 人源化抗ILT3抗体52B8(mAb 46)将MDSC的抑制能力降低到与 嵌合抗ILT3抗体c52B8(mAb 73；lot 26AVY)可比的程度。
图11-14显示，在MDSC/T细胞抑制测定法中，(a)使用从来 自人类供体D001003835的PBMC获得的MDSC，在4:1或8:1的T 细胞与MDSC比率下(图11)；(b)使用从来自人类供体D001003180 的PBMC获得的MDSC，在4:1或8:1的MDSC与T细胞的比率下(图 12)；(c)使用从来自人类供体D001003507的PBMC获得的MDSC， 在4:1或8:1的T细胞与MDSC的比率下(图13)；和使用从来自人 类供体的PBMC获得的MDSC，在8:1的T细胞与MDSC的比率下 (图14)，人源化抗ILT3抗体52B8(mAb 46)与派姆单抗组合以 与每一者相比在更高水平上降低了T细胞激活的MDSC抑制。结果 总结在表8和9中。如图10-13和表8和9所示，将抗ILT3抗体52B8与派姆单抗组合，产生了使T细胞的激活相对于单独使用派姆单抗或 52B8可实现的相比增加的加和效应。如所示，相对于其他治疗，该 组合的IFNγ的增加的范围为41％至74％。这些结果表明，派姆单抗 与52B8的组合不导致T细胞激活的过度或不受控制的增加。
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实施例13
抗ILT3抗体52B8与派姆单抗组合在极化IL-10DC和同种异基 因CD8+ T细胞的混合淋巴细胞反应中的效果
在该实施例中，IL-10极化人单核细胞衍生树突状细胞和同种异 基因CD8+ T细胞的混合淋巴细胞反应培养4天，随后测量培养物上 清液中的干扰素γ(IFNγ)作为T细胞激活的读出。在该实验中，在 9个同种异基因供体对中，将派姆单抗，52B8或两者的组合的活性与 同种型对照抗体(在两种情况下均为IgG4)进行了比较。
来自三个CD14+单核细胞供体的单核细胞衍生树突状细胞(DC) -IL10 DC分化七天(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和IL4 五天，然后IL10两天，有和没有IgG4(lot92ASJ)，有和没有1μg/mL 的52B8(Lot 41BAB))以产生DC129，DC226和DC196。分离来 自三个供体的CD8+细胞，并从这三个供体在1:5的DC:T细胞比率下 在96孔格式中建立混合白细胞反应(MLR)(30k DC vs 150k CD8+ T细胞)，其中用和不用IgG4(lot 92ASJ)；用和不用2μg/mL的派 姆单抗(lot 42ASN)处理细胞。IgG4或52B8也以1μg/mL加回到 MLR中。结束以9个MLR对的IL10 DC:CD8+ T细胞：
DC129 vs T30，T3788和T3259
DC226 vs T30，T3788和T3259
DC196 vs T30，T3788和T3259
在第4天收集IFNγ上清液并使用Meso Scale Discovery(MSD) 定量。在第5天收集额外的上清液部分，收集细胞并染色PD1和PDL1 表达。在分化的第7天(就在MLR设置之前)进行树突状细胞染色。 MLR测定进行第5天的CD8+ T细胞的T细胞染色。
图15显示所有供体对合并到一个图中的结果(每个标记是供体 配对)。如所示，将52B8与派姆单抗组合实现了T细胞耐受性的逆 转，从而导致CD8+ T细胞的激活的统计学显著性增加。
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尽管本文参照示出的实施方式描述了本发明，但是应当理解本发 明不限于此。具有本领域普通技术且可以获得本文的教导的那些人将 认识到其范围内的其他修改和实施方式。因此，本发明仅由本文所附 的权利要求书限制。
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Claims (38)

1.一种结合人免疫球蛋白样转录物3(ILT3)的抗体或抗原结合片段，其包含：
重链(HC)，其中重链可变结构域(VH)包含重链互补决定区(HC-CDR)3，其具有选自SEQID NO:22、49、57、65、73、81、89、97和105的氨基酸序列，或具有与选自SEQ ID NO:22、49、57、65、73、81、89、97和105的氨基酸序列有3、2或1个差异的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段结合人ILT3上的表位，其中所述表位包含来自SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8所述氨基酸序列中的一个或多个的至少一个氨基酸。
3.一种结合人免疫球蛋白样转录物3(ILT3)的抗体或抗原结合片段，其包含：
(a)重链(HC)，其具有可变结构域(VH)，其包含具有SEQ ID NO:17、47、55、63、71、79、87、95或103所示氨基酸序列的可变结构域互补决定区(HC-CDR)1；具有SEQ ID NO:18、48、56、64、72、80、88、96或104所示氨基酸序列的HC-CDR2；具有SEQ ID NO:23、49、57、65、73、81、89、97或105所示氨基酸序列的HC-CDR3；及其其中所述HC-CDR中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体；和
(b)轻链(LC)，其具有可变结构域(VL)，其包含具有SEQ ID NO:27、50、58、66、74、82、90、98或106所示氨基酸序列的可变结构域互补决定区(LC-CDR)1；具有SEQ ID NO:43、51、59、67、75、83、91、99或107所示氨基酸序列的LC-CDR2；具有SEQ ID NO:44、60、68、76、84、92、100或108所示氨基酸序列的LC-CDR3；及其其中所述LC-CDR中的一个或多个具有一个、两个或三个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体。
4.根据权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述HC-CDR1具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列；所述HC-CDR2具有SEQ ID NO:19、20或21所示氨基酸序列；和所述HC-CDR3具有SEQ ID NO:23所示氨基酸序列；和
(b)所述LC-CDR1具有SEQ ID NO:34、35、36、37、38、39、40、41或42所示氨基酸序列；所述LC-CDR2具有SEQ ID NO:43所示氨基酸序列；和所述LC-CDR3具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述HC-CDR1具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列；所述HC-CDR2具有SEQ ID NO:20所示氨基酸序列；和所述HC-CDR3具有SEQ ID NO:23所示氨基酸序列；和
(b)所述LC-CDR1具有SEQ ID NO:41所示氨基酸序列；所述LC-CDR2具有SEQ ID NO:43所示氨基酸序列；和所述LC-CDR3具有SEQ ID NO:44所示氨基酸序列。
6.根据权利要求3、4或5所述的抗体或抗原结合片段，其中所述VH包含选自人VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、和VH6，及其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体的框架；并且，所述VL包含选自人Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6、Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ4、Vλ5、Vλ6、Vλ7、Vλ8、Vλ9、和Vλ10，及其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体的框架。
7.根据权利要求3、4、5或6所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 HC恒定区或其与天然IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型恒定结构域的氨基酸序列相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体的HC。
8.根据权利要求6或7所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含具有人κ或λLC恒定结构域或其与天然人κ或λ轻链恒定结构域的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体的LC。
9.根据权利要求5所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含：
(ⅰ)VH，其具有选自人VH1、VH2、VH3、VH4、VH5和VH6的框架和人IgG1或IgG4 HC恒定结构域或其与天然IgG1或IgG4同种型HC恒定结构域的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体；和，
(ⅱ)VL，其具有选自人Vκ1、Vκ2、Vκ3、Vκ4、Vκ5、Vκ6、Vλ1、Vλ2、Vλ3、Vλ4、Vλ5、Vλ6、Vλ7、Vλ8、Vλ9和Vλ10的框架和人κ或λLC恒定结构域或其与天然人κ或λLC恒定结构域的氨基酸序列相比包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换、添加、缺失或其组合的变体。
10.根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含分别具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46；SEQ ID NO:53和SEQID NO:54；SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62；SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70；SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78；SEQ ID NO:85和SEQ ID NO:86；SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94；或SEQ IDNO:101和SEQ ID NO:102所示氨基酸序列的VH和VL。
11.根据权利要求6所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:117、118、119、123、124或125所示氨基酸序列的VH；和具有SEQ ID NO:126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140或141所示氨基酸序列的VL。
12.根据权利要求11所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:118所示氨基酸序列的VH；和具有SEQ ID NO:140所示氨基酸序列的VL。
13.根据权利要求9、10、11或12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含重链(HC)恒定结构域，其包含SEQ ID NO:9、10、11、12或13所示氨基酸序列。
14.根据权利要求9、10、11或12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链(LC)恒定结构域，其包含SEQ ID NO:14所示氨基酸序列。
15.根据权利要求9、10、11或12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含重链(HC)，所述重链包含SEQ ID NO:142、143、144、148、149、150、167、168、169、170、174、175、176、177、178、182、183、184、185、186、187、191、192或193的氨基酸序列。
16.根据权利要求9、10、11、12、13、14或15所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链(LC)，所述轻链(LC)包含SEQ ID NO:151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165或166所示氨基酸序列。
17.根据权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:143所示氨基酸序列的重链(HC)和含有SEQ ID NO:165所示氨基酸序列的轻链(LC)，及其其中所述HC缺少C端赖氨酸残基或C端甘氨酸-赖氨酸的变体。
18.一种嵌合、人源化或重组人抗体或抗原结合片段，其与人免疫球蛋白样转录物3(ILT3)上的表位结合，其中所述表位包含来自SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8所示氨基酸序列中的一个或多个的至少一个氨基酸。
19.一种嵌合、人源化或重组人抗体或抗原结合片段，其交叉阻断抗体与人免疫球蛋白样转录物3(ILT3)结合或与所述抗体竞争结合人免疫球蛋白样转录物3(ILT3)，所述抗体包含含有SEQ ID NO:15所示氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链。
20.一种组合物，其包含：
根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段和药学上可接受的载体。
21.一种用于治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求20所述的组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤或血液组织癌。
23.一种用于治疗受试者的癌症的方法，其包括：
向所述受试者同时或连续施用根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段与PD-1、PD-L1和/或PD-L2的一种或多种抑制剂或拮抗剂的组合。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗PD-1抗体是派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗和pidilizumab。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述PD-L1抑制剂是杜鲁麦单抗、阿特珠单抗、阿伐单抗、YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C或MDX-1105。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤或血液组织癌。
27.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其用于治疗受试者的癌症，包括向所述受试者施用所述抗体或抗原结合片段。
28.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其用于治疗受试者的癌症，包括PD-1、PD-L1和/或PD-L2的一种或多种抑制剂或拮抗剂。
29.根据权利要求28所述的抗体或抗原结合片段，其中所述PD-1、PD-L1和/或PD-L2的一种或多种抑制剂或拮抗剂是选自派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗和pidilizumab的抗PD-1抗体。
30.根据权利要求28所述的抗体或抗原结合片段，其中所述PD-1、PD-L1和/或PD-L2的一种或多种抑制剂或拮抗剂是选自杜鲁麦单抗、阿特珠单抗、阿伐单抗、YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736、MSB-0010718C和MDX-1105的PD-L1抑制剂。
31.根据权利要求27或28所述的抗体或抗原结合片段，其中所述癌症是胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤或血液组织癌。
32.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段在癌症治疗中的用途。
33.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
34.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症是胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、头颈癌、支气管癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌、脑或中枢神经系统癌、外周神经系统癌、食道癌、宫颈癌、子宫或子宫内膜癌、口腔或咽癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、胆道癌、小肠或阑尾癌、唾液腺癌、甲状腺癌、肾上腺癌、骨肉瘤、软骨肉瘤或血液组织癌。
35.一种编码权利要求1-19中任一项所述的抗ILT3抗体或抗原结合片段的核酸分子。
36.一种载体，其包含权利要求35所述的核酸分子。
37.一种宿主细胞，其包含权利要求36所述的载体。
38.一种用于生产根据权利要求1-19中任一项所述的抗体或抗原结合片段的方法，其包括：
(a)提供包含权利要求35所述的载体的宿主细胞；
(b)在能够表达由所述载体编码的所述抗体或抗原结合片段的条件下在培养基中培养所述宿主细胞；和，
(c)从所述培养基获得所述抗体或抗原结合片段以提供所述抗体或抗原结合片段。
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