CN113613676A - 包含对抗原的结合活性因mta而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子及用于获得该抗原结合结构域的文库 - Google Patents

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Abstract

本公开的问题为提供抗原结合分子、编码该抗原结合分子的多核苷酸、包含该多核苷酸的载体、保有该载体的细胞、包含各自不同的多种该抗原结合分子的文库、包含该抗原结合分子的药物组合物、筛选该抗原结合分子的方法、及制备其的方法等，其中所述抗原结合分子的抗原结合活性相应于靶组织特异性的低分子化合物的浓度而变化。本发明人发现了作为肿瘤组织特异性的低分子化合物的甲硫腺苷(MTA)，创建了针对抗原的结合活性依赖于MTA的浓度而变化的抗原结合结构域或包含该抗原结合结构域的抗原结合分子，进一步创建了含有各自不同的多个抗原结合结构域或包含该抗原结合结构域的抗原结合分子的文库，发现了通过应用该文库可以解决上述问题。通过应用本公开的抗原结合分子，可以靶组织特异性地治疗以靶组织(例如肿瘤组织)为原因的各种疾病(例如癌)。

Description

包含对抗原的结合活性因MTA而变化的抗原结合结构域的抗 原结合分子及用于获得该抗原结合结构域的文库
技术领域
本公开涉及包含针对抗原的结合活性依赖于甲硫腺苷(Methylthioadenosine，MTA)而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子、该抗原结合结构域或该抗原结合分子的制备方法及筛选方法、用于获得该抗原结合结构域或该抗原结合分子的文库及其设计方法、以及包含该抗原结合分子的药物组合物。另外，本公开也涉及用于有效地获得针对抗原的结合活性依赖于低分子化合物而变化的抗原结合结构域的文库的设计方法。进一步，本公开也涉及与MTA特异性结合的抗原结合分子及利用该抗原结合分子的MTA浓度测定方法及疾病的诊断方法。
背景技术
抗体由于在血浆中的稳定性高、副作用也少，因而作为药品受到关注。其中IgG型的抗体药物已经大量上市，当前还有大量的抗体药物正在开发(非专利文献1和非专利文献2)。
作为使用抗体药物的癌治疗药，迄今为止的针对CD20抗原的利妥昔单抗(美罗华，Rituxan)、针对EGFR抗原的西妥昔单抗、针对HER2抗原的赫赛汀等已被认可(非专利文献3)。这些抗体分子与癌细胞中表达的抗原结合，通过ADCC等发挥针对癌细胞的细胞毒性。已知这种基于ADCC等的细胞毒性依赖于表达于治疗用途抗体的靶细胞的抗原数目(非专利文献4)，因此从治疗用途抗体的效果的观点出发，优选作为靶的抗原的表达量高。但是，即便抗原的表达量高，当抗原在正常组织表达时，针对正常细胞也会发生ADCC等的毒性，因而副作用成为大问题。因此，作为癌症治疗药的治疗用途抗体所靶向的抗原，优选在癌细胞中特异性表达。
获得发挥基于ADCC活性的细胞毒性的抗体药物的成功后，报道了通过下述等而发挥强效细胞毒性的第二代改良抗体分子：通过除去天然型人IgG1的Fc区的N型糖链的岩藻糖而实现ADCC活性的增强(非专利文献5)、通过天然型人IgG1的Fc区的氨基酸置换而增强对FcγRIIIa的结合所实现的ADCC活性的增强(非专利文献6)等。作为除了通过上述的NK细胞介导的ADCC活性以外的机制对癌细胞发挥伤害活性的抗体药物，还报道了下述等发挥更强效的细胞毒性的改良抗体分子：将具有强效的细胞毒性的药物与抗体缀合而成的Antibody Drug Conjugate(ADC)(非专利文献7)、和通过将T细胞招募至癌细胞而发挥对癌细胞的毒性的低分子抗体(非专利文献8)等。
对这些发挥更强效细胞毒性的抗体分子而言，即使对抗原的表达不多的癌细胞也可发挥细胞毒性，另一方面，对抗原的表达少的正常组织却也同样地发挥细胞毒性。实际上，与为针对EGFR抗原的天然型人IgG1的西妥昔单抗相比，为针对CD3和EGFR的双特异性抗体的EGFR-BiTE能够通过将T细胞招募至癌细胞而对癌细胞发挥强效的细胞毒性，从而发挥抗肿瘤效果。另一方面，也确认到由于EGFR在正常组织中也有表达，因而在将EGFR-BiTE施用于食蟹猴时出现出严重的副作用(非专利文献9)。另外，Bivatuzumab Mertansine为针对癌细胞中高表达的CD44v6的抗体与Mertansine结合而成的ADC，由于CD44v6在正常组织中也有表达因而在临床上观察到严重的皮肤毒性和肝毒性(非专利文献10)。
认为在这种使用对抗原的表达少的癌细胞也可以发挥强效细胞毒性的抗体的情况下，需要靶抗原为高度癌特异性表达，但如赫赛汀的靶抗原HER2，或西妥昔单抗的靶抗原EGFR在正常组织中也有表达那样，以高度癌特异性进行表达的癌抗原的数目是有限的。因此，虽然能够强化对癌的细胞毒性，但对正常组织的细胞伤害作用导致的副作用也成为问题。
另外，最近，显示通过抑制有助于癌中的免疫抑制的CTLA4而增强肿瘤免疫的艾匹利木单抗(ipilimumab)对于转移性黑素瘤使总存活期延长(非专利文献11)。然而由于艾匹利木单抗全身性地抑制CTLA4，因而虽然肿瘤免疫得到增强，但显示出全身性的、因免疫受到活化所致的自身免疫疾病样的严重副作用却成为问题(非专利文献12)。
作为可适用于第二代抗体药物的技术，开发有各种技术，报道了使效应功能、抗原结合能力、药物动力学、稳定性提高，或者使免疫原性风险降低的技术等(非专利文献13)，但几乎没有报道用于解决如上所述的副作用的、能够实现抗体药物对靶组织特异性地作用的技术。例如，对于癌组织或炎性组织之类的病变部位，报道有利用了这些疾病组织中的pH为酸性条件的pH依赖性抗体(专利文献1、2)。然而，相比于正常组织，癌组织或炎性组织中的pH的降低(即，氢离子浓度的上升)很小，制作检测分子量极小的氢离子的浓度的微小上升而作用的抗体较为困难，并且也存在破骨细胞骨吸收区等正常组织或对象病变以外的组织中也有pH为酸性条件的情形，认为以pH的条件作为对病变部位特异性的环境因子进行利用还存在许多问题。另一方面，报道有通过被在癌组织或炎性组织之类的病变部位表达的蛋白酶切割从而开始发挥抗原结合活性的抗体的制作方法(专利文献3)。但是，认为存在以下问题：利用蛋白酶进行的抗体切割是不可逆的，因此在该病变部位切割后的抗体会随着血流返回正常组织，在正常组织中也能够与抗原结合。另外，认为这样的蛋白酶在癌特异性方面也存在问题。为了解决这样的问题，报告了相应于疾病组织特异性的化合物的浓度，针对抗原的结合活性发生变化的抗原结合分子(专利文献4、5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第WO2003/105757号
专利文献2：国际公开第WO2012/033953号
专利文献3：国际公开第WO2010/081173号
专利文献4：国际公开第WO2013/180200号
专利文献5：国际公开第WO2015/083764号
非专利文献
非专利文献1：Monoclonal antibody successes in the clinic.Janice MReichert,Clark J Rosensweig,Laura B Faden&Matthew C Dewitz,Nat.Biotechnol.(2005)23,1073-1078
非专利文献2：The therapeutic antibodies market to 2008.Pavlou AK,Belsey MJ.,Eur.J.Pharm.Biopharm.(2005)59(3),389-396
非专利文献3：Monoclonal antibodies:versatile platforms for cancerimmunotherapy.Weiner LM,Surana R,Wang S.，Nat.Rev.Immunol.(2010)10(5),317-327
非专利文献4：Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies.Lewis GD,Figari I,Fendly B,Wong WL,Carter P,Gorman C,Shepard HM,Cancer Immunol.Immunotherapy(1993)37,255-263
非专利文献5：Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generationtherapeutic antibodies.Satoh M,Iida S,Shitara K.,Expert Opin.Biol.Ther.(2006)6(11),1161-1173
非专利文献6：Optimizing engagement of the immune system by anti-tumorantibodies:an engineer's perspective.Desjarlais JR，Lazar GA,Zhukovsky EA,ChuSY.,Drug Discov.Today(2007)12(21-22),898-910
非专利文献7：Antibody-drug conjugates:targeted drug delivery forcancer.Alley SC,Okeley NM,Senter PD.,Curr.Opin.Chem.Biol.(2010)14(4),529-537
非专利文献8：BiTE:Teaching antibodies to engage T-cells for cancertherapy.Baeuerle PA,Kufer P,Bargou R.,Curr.Opin.Mol.Ther.(2009)11(1),22-30
非专利文献9：T cell-engaging BiTE antibodies specific for EGFRpotently eliminate KRAS-and BRAF-mutated colorectal cancer cells.LutterbueseR,Raum T,Kischel R,Hoffmann P,Mangold S,Rattel B,Friedrich M,Thomas O,Lorenczewski G,Rau D,Schaller E,Herrmann I，Wolf A,Urbig T,Baeuerle PA,KuferP.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2010)107(28),12605-12610
非专利文献10：Phase I trial with the CD44v6-targeting immuno conjugatebivatuzumab mertansine in head and neck squamous cell ca rcinoma.RiechelmannH,Sauter A,Golze W,Hanft G，Schroen C，Hoermann K,Erhardt T,Gronau S.,OralOncol.(2008)44(9),823-829
非专利文献11：Ipilimumab in the treatment of melanoma.Trinh VA,HwuWJ.,Expert Opin.Biol.Ther.,(2012)Apr 14(doi:10.1517/14712598.2012.675325)
非专利文献12：IPILIMUMAB-A NOVEL IMMUNOMODUL ATING THERAPY CAUSINGAUTOIMMUNE HYPOPHYSITIS:A CASE REPORT AND REVIEW.Juszczak A,Gupta A,Karavitaki N,Middleton MR,Grossman A.,Eur.J.Endocrinol.(2012)Apr 10(do i:10.1530/EJE-12-0167)
非专利文献13：Antibody engineering for the development of the rapeuticantibodies.Kim SJ,Park Y,Hong HJ.,Mol.Cells.(2005)20(1),17-29
发明概述
发明要解决的问题
本公开新发现了在疾病组织中特异性地存在或产生的低分子化合物，并提供与靶抗原的结合受该低分子化合物依赖性地控制的抗原结合分子(低分子化合物开关抗原结合分子)，进一步，目的之一为提供短时间有效获得该抗原结合分子的方法。
用于解决问题的办法
本发明人为实现上述目的进行深入研究，结果新发现了作为癌组织中特异性的低分子化合物的甲硫腺苷(MTA)，进一步创建了包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子。另外，本发明人发现该抗原结合分子或包含该抗原结合分子的药物组合物在癌症治疗中有用，同时发现，其在包含施用该抗原结合分子的癌治疗中有用，及该抗原结合分子在制备用于癌症治疗的药物中有用。
另外，本发明人创建了筛选及制备针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的方法。另外，本发明人成功制备了能够高效筛选针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的文库。本发明人进一步成功制成了能够筛选针对抗原的结合活性依赖于MTA和/或除了MTA以外的低分子化合物而变化的抗原结合结构域的文库，也创建了针对前述抗原的结合活性依赖于MTA和/或除了MTA以外的低分子化合物而变化的抗原结合结构域的筛选方法及制备方法。
进一步，本发明人也成功获得了针对MTA本身特异性结合的抗原结合分子。
本公开基于这样的发现，具体地，包含以下示例性地记载的方案。
[A1]抗原结合分子，其包含针对抗原的结合活性依赖于5’-甲硫腺苷(MTA)而变化的抗原结合结构域。
[A2]抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域在MTA存在下的针对前述抗原的结合活性与在不存在MTA的条件下的针对前述抗原的结合活性不同。
[A3][A1]或[A2]所述的抗原结合分子，其中，该抗原结合分子中包含的抗原结合结构域的针对前述抗原的结合活性不被腺苷实质性地影响。
[A4][A1]至[A3]所述的抗原结合分子，其中，该抗原结合分子中包含的抗原结合结构域的针对前述抗原的结合活性不被S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)实质性地影响。
[A5][A1]至[A4]所述的抗原结合分子，其中，该抗原结合分子中包含的抗原结合结构域的针对前述抗原的结合活性不被AMP、ADP或ATP实质性地影响。
[A6][A1]或[A2]所述的抗原结合分子，其中，该抗原结合分子中包含的抗原结合结构域的针对前述抗原的结合活性也依赖于腺苷而变化。
[A7][A1]、[A2]或[A6]所述的抗原结合分子，其中，该抗原结合分子中包含的抗原结合结构域的针对前述抗原的结合活性也依赖于S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)而变化。
[A8][A1]、[A2]、[A6]或[A7]所述的抗原结合分子，其中，该抗原结合分子中包含的抗原结合结构域的针对前述抗原的结合活性也依赖于AMP、ADP和/或ATP而变化。
[A9][A1]至[A8]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域包含抗体可变区或/和单结构域抗体。
[A10][A1]至[A9]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合分子是抗体。
[A11][A1]至[A10]中任一项所述的抗原结合分子，其包含抗体Fc区。
[A12][A11]所述的抗原结合分子，其中，前述抗体Fc区是天然型Fc区或改变Fc区。
[A13][A1]至[A12]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域在MTA存在下的针对抗原的结合活性比前述抗原结合结构域在不存在MTA的条件下的针对抗原的结合活性强。
[A14][A1]至[A12]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域在MTA存在下的针对抗原的结合活性比前述抗原结合结构域在不存在MTA的条件下的针对抗原的结合活性弱。
[A15][A1]至[A14]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域具有与MTA相互作用的氨基酸残基。
[A16][A15]所述的抗原结合分子，其中，前述与MTA相互作用的氨基酸残基在前述抗原结合结构域与抗原结合的状态中，与MTA相互作用。
[A17][A15]或[A16]所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域包含抗体可变区或单结构域抗体，前述与MTA相互作用的氨基酸残基位于前述抗体可变区或前述单结构域抗体的CDR中。
[A18][A15]至[A17]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区，前述与MTA相互作用的氨基酸残基是位于前述抗体可变区的氨基酸序列内选自下列的至少一个以上的氨基酸位点的组的氨基酸残基：以Kabat编号精确确定的重链34位、35a位、47位、52位、52e位、101位、轻链32位、34位、36位、46位、49位、50位、89位、90位、91位及96位的氨基酸位点。
[A19][A15]至[A18]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自重链W34、C35a、W47、F52、Y52e、E101、轻链R32、S34、Y36、L46、Y49、S50、A89、G90、L91、及P96(Kabat编号)中的至少一个以上的氨基酸。
[A20][A1]至[A19]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自下述氨基酸的组中至少一个以上的氨基酸(Kabat编号)：
位于重链30位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链31位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链32位的A；
位于重链33位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链34位的W；
位于重链35位的M；
位于重链35a位的C；
位于重链50位的C；
位于重链51位的I；
位于重链52位的F；
位于重链52a位的A；
位于重链52b位的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V中的任一种；
位于重链52c位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链52d位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链52e位的Y；
位于重链52f位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链52g位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链53位的S；
位于重链54位的G；
位于重链55位的G；
位于重链56位的S；
位于重链57位的T；
位于重链58位的Y；
位于重链59位的Y；
位于重链60位的A；
位于重链61位的S；
位于重链62位的W；
位于重链63位的A；
位于重链64位的K；
位于重链65位的G；
位于重链95位的G；
位于重链96位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链97位的G；
位于重链98位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链99位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链100位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链100a位的G；
位于重链100b位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链100c位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链101位的E；
位于重链102位的L；
位于轻链24位的Q；
位于轻链25位的S；
位于轻链26位的S；
位于轻链27位的E；
位于轻链27a位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链28位的V；
位于轻链29位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链30位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链31位的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V中的任一种；
位于轻链32位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链33位的L；
位于轻链34位的S；
位于轻链49位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链50位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链51位的A；
位于轻链52位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链53位的T；
位于轻链54位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链55位的P；
位于轻链56位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链89位的A；
位于轻链90位的G；
位于轻链91位的L；
位于轻链92位的Y；
位于轻链93位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链94位的G；
位于轻链95位的N；
位于轻链95a位的I；
位于轻链96位的P；
位于轻链97位的A。
[A21][A15]至[A17]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区，前述与MTA相互作用的氨基酸残基是位于前述抗体可变区的氨基酸序列内选自下列的至少一个以上的氨基酸位点的组的氨基酸残基：以Kabat编号精确确定的重链34位、47位、50位、58位、95位、98位、99位、100a位、轻链28位、91位、95b位、95c位及96位的氨基酸位点。
[A22][A15]至[A17]、及[A21]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自重链W34、W47、C50、Y58、E95、F98、G99、G100a、轻链Y28、T91、F95b、Y95c、及F96(Kabat编号)中的至少一个以上的氨基酸。
[A23][A1]至[A17]的任一项或[A21]至[A22]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自下述氨基酸的组中的至少一个以上的氨基酸(Kabat编号)：
位于重链31位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链32位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链33位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链34位的W；
位于重链35位的M；
位于重链35a位的C；
位于重链50位的C；
位于重链51位的I；
位于重链52位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链52a位的S；
位于重链53位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链54位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链55位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链56位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链57位的T；
位于重链58位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链59位的Y；
位于重链60位的A；
位于重链61位的S；
位于重链62位的W；
位于重链63位的V；
位于重链64位的N；
位于重链65位的G；
位于重链95位的E；
位于重链96位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链97位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链98位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链99位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链100位的S；
位于重链100a位的G；
位于重链100b位的A；
位于重链100c位的L；
位于重链101位的N；
位于重链102位的L；
位于轻链24位的H；
位于轻链25位的S；
位于轻链26位的S；
位于轻链27位的K；
位于轻链27a位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链27b位的V；
位于轻链28位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链29位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链30位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链31位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链32位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链33位的L；
位于轻链34位的A；
位于轻链49位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链50位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链51位的A；
位于轻链52位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链53位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链54位的L；
位于轻链55位的A；
位于轻链56位的S；
位于轻链89位的Q；
位于轻链90位的G；
位于轻链91位的T；
位于轻链92位的Y；
位于轻链93位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链94位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95a位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95b位的F；
位于轻链95c位的Y；
位于轻链96位的F；
位于轻链97位的A。
[A24][A15]至[A17]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区，前述与MTA相互作用的氨基酸残基是位于前述抗体可变区的氨基酸序列内选自下列的至少一个以上的氨基酸位点的组的氨基酸残基：以Kabat编号精确确定的重链33位、50位、52位、54位、56位、57位、58位、99位、100位、100a位、轻链91位、95c位、及96位的氨基酸位点。
[A25][A15]至[A17]、及[A24]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自重链A33、I50、G52、D54、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a、轻链S91、Y95c、及N96(Kabat编号)中的至少一个以上的氨基酸。
[A26][A1]至[A17]的任一项或[A24]至[A25]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自下述氨基酸的组中的至少一个以上的氨基酸(Kabat编号)：
位于重链26位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链28位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链29位的A或L中的任一种；
位于重链30位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链31位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链32位的D、E、F、H、N、P、R或Y中的任一种；
位于重链33位的A、I、P、T或V中的任一种；
位于重链34位的A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链35位的G；
位于重链50位的D、I或V中的任一种；
位于重链51位的I；
位于重链52位的G；
位于重链53位的A、D、E、G、I、K、Q或R中的任一种；
位于重链54位的D、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链55位的A、D、E、F、G或H中的任一种；
位于重链56位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链57位的A、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T或V中的任一种；
位于重链58位的W；
位于重链59位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链60位的P；
位于重链61位的A、F、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链62位的W；
位于重链63位的V；
位于重链64位的K；
位于重链65位的A、F或G；
位于重链95位的G；
位于重链96位的A、E、F、G、H、K、L、Q、R、S、T、W或Y中的任一种；
位于重链97位的A、F、H、K、N、W或Y中的任一种；
位于重链98位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链99位的A、D、E、G、H、Q或S中的任一种；
位于重链100位的F或Y；
位于重链100a位的N、T或V
位于重链100b位的N；
位于重链100c位的A；
位于重链100d位的F或W；
位于重链101位的D；
位于重链102位的P；
位于轻链24位的Q；
位于轻链25位的S；
位于轻链26位的S；
位于轻链27位的Q；
位于轻链27e位的S；
位于轻链27f位的V；
位于轻链28位的A、E、F、H、I、K、L、N、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链29位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链30位的N；
位于轻链31位的N；
位于轻链32位的A、E、F、G、H、S或Y中的任一种；
位于轻链33位的L；
位于轻链34位的S；
位于轻链50位的D；
位于轻链51位的A；
位于轻链52位的S；
位于轻链53位的T；
位于轻链54位的L；
位于轻链55位的A；
位于轻链56位的S；
位于轻链89位的H；
位于轻链90位的G；
位于轻链91位的A、S或T中的任一种；
位于轻链92位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链93位的A、D、E、F、G、H、L、N、Q、R、S、T、V或Y中的任一种；
位于轻链94位的A、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95a位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95b位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95c位的A、F、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链96d位的D；
位于轻链96位的N；
位于轻链97位的A或G；
位于轻链98位的A、F、I、L或V。
[A27][A1]至[A26]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原是除了MTA以外的分子、或作为除了MTA以外的分子而在人生物体内具有免疫原性的分子。
[A28][A1]至[A27]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原是肽、多肽、蛋白质中的任一种。
[A29][A1]至[A28]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合分子进一步具有第2抗原结合结构域，前述第2抗原结合结构域对第2抗原具有结合活性，所述第2抗原与前述抗原结合结构域结合的抗原不同。
[A30][A29]所述的抗原结合分子，其中，前述第2抗原结合结构域针对前述第2抗原的结合活性不被MTA实质性地影响。
[A31][A29]所述的抗原结合分子，其中，前述第2抗原结合结构域针对前述第2抗原的结合活性依赖于MTA而变化。
[A32][A31]所述的抗原结合分子，其中，前述第2抗原结合结构域在MTA存在下的针对前述第2抗原的结合活性与前述第2抗原结合结构域在不存在MTA的条件下的针对前述第2抗原的结合活性不同。
[A33][A1]至[A32]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原是膜型分子或可溶型分子。
[A34][A33]所述的抗原结合分子，其中，前述抗原是膜型分子并且是在疾病组织中表达的抗原。
[A35][A33]所述的抗原结合分子，其中，前述抗原是可溶型分子并且是在癌组织中表达的抗原。
[A36][A35]所述的抗原结合分子，其中，前述在癌组织中表达的抗原是表达于癌细胞的抗原，或者由癌组织中的癌间质细胞、免疫组织表达的抗原。
[A37][A35]或[A36]所述的抗原结合分子，其中，前述癌组织是MTA积累的癌组织。
[A38][A35]至[A37]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述癌组织中编码MTA磷酸化酶(MTAP)的基因缺失或者表达降低、或具有降低酶活性的突变或者剪接变体。
[A39][A35]至[A37]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述癌组织中MTAP的活性缺失或降低。
[A40][A1]至[A39]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原是膜型分子，前述抗原结合分子针对表达前述抗原的细胞显示细胞毒性。
[A41][A40]所述的抗原结合分子，其显示选自ADCC活性、ADCP活性或CDC活性之中的至少1个以上的细胞毒性。
[A42][A1]至[A39]所述的抗原结合分子，其针对前述抗原具有激动剂活性。
[A43][A29]至[A32]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原与前述第2抗原中的一个是在靶细胞中表达的抗原，另一个是在效应细胞中表达的抗原。
[A44][A43]所述的抗原结合分子，其中，前述靶细胞是癌细胞。
[A45][A44]所述的抗原结合分子，其中，前述癌细胞是编码MTAP的基因缺失或者表达降低的、或具有降低酶活性的突变或者剪接变体的癌细胞，或是存在于前述编码MTAP的基因缺失或者表达降低的、或具有降低酶活性的突变或者剪接变体的癌细胞周围的癌细胞。
[A46][A43]所述的抗原结合分子，其中，前述靶细胞是除了存在于编码MTAP的基因缺失或者表达降低的、或具有降低酶活性的突变或者剪接变体的癌细胞的周围的癌细胞以外的细胞。
[A47][A43]所述的抗原结合分子，其中，前述除了存在于癌细胞的周围的癌细胞以外的细胞是癌相关成纤维细胞(CAF)或肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。
[A48][A43]至[47]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述效应细胞是T细胞。
[A49][A48]所述的抗原结合分子，其中，在前述效应细胞中表达的抗原是T细胞受体(TCR)复合体。
[A50][A48]或[A49]中任一项所述的抗原结合分子，其中，在前述效应细胞中表达的抗原是CD3。
[A51][A48]至[A50]中任一项所述的抗原结合分子，其中，通过活化效应细胞引起针对靶细胞的细胞毒性。
[A52][A48]至[A51]中任一项所述的抗原结合分子，其具有TDCC活性。
[A53][A1]至[A39]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原是可溶型分子，前述抗原结合分子针对前述抗原显示中和活性。
[A54][A1]至[A53]中任一项所述的抗原结合分子，其中，前述抗原结合结构域在不存在MTA的条件下对前述抗原的KD值与前述抗原结合结构域在MTA存在下对前述抗原的KD值不同。
[A55]药物组合物，其包含[A1]至[A54]中任一项所述的抗原结合分子。
[A56]用于癌症的治疗的药物组合物，其包含[A1]至[A55]中任一项所述的抗原结合分子作为有效成分。
[A57][A56]所述的药物组合物，其中，前述癌中，MTA在组织中积累。
[A58][A56]至[A57]中任一项所述的药物组合物，其中，前述癌中编码MTAP的基因缺失或者表达降低、或具有降低酶活性的突变或者剪接变体。
[A59][A56]至[A58]中任一项所述的药物组合物，其中，前述癌中，MTAP的活性缺失或降低。
[A60]制备[A1]至[A54]中任一项所述的抗原结合分子的方法。
[A61]多核苷酸，其编码[A1]至[A52]中任一项所述的抗原结合分子。
[A62]载体，其包含[A61]所述的多核苷酸。
[A63]细胞，其保有[A62]所述的载体。
[A64]抗原结合分子，其为培养[A63]所述的细胞、并从培养上清液回收而成。
[G1][A1]至[A54]中任一项所述的抗原结合分子，与不依赖于MTA的浓度结合的对照抗原结合分子相比，所述抗原结合分子具有更高的血浆中滞留性，和/或具有更低的血浆中抗原积累能力。
[G2]药物制剂，其包含[G1]所述的抗原结合分子及药学上允许的载体。
[G3]抗原结合分子的制备方法，其中与对照抗原结合分子相比，所述抗原结合分子具有更高的血浆中滞留性、和/或具有更低的血浆中抗原积累能力，
所述方法包括：(a)制备抗原结合活性随着MTA的浓度提高而增加的抗原结合分子的步骤，及(b)测定(a)中制备的抗原结合分子的血浆中滞留性、和/或血浆中抗原积累能力的步骤。
本公开另外包含以下示例性地记载的方案。
[B1]文库，其包含：序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子、或/和编码序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸，该文库主要包含：包含具有与MTA相互作用的氨基酸残基的抗原结合结构域的抗原结合分子、或/和编码前述抗原结合分子的核酸。
[B2][B1]所述的文库，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区。
[B3][B2]所述的文库，其包含：序列彼此不同的多个抗体可变区改变体，该抗体可变区改变体具有与位于具有针对MTA的结合活性的抗体可变区未改变体中的1个或多个氨基酸位点的氨基酸不同的氨基酸；
或/和分别编码序列彼此不同的多个抗体可变区改变体的核酸，其中该抗体可变区改变体具有与位于抗体可变区未改变体中的1个或多个氨基酸位点的氨基酸不同的氨基酸，该未改变体具有针对MTA的结合活性。
[B4][B3]所述的文库，其中，前述抗体可变区改变体中的具有与前述抗体可变区未改变体不同的氨基酸的氨基酸位点是选自下述氨基酸位点的组中的一个或多个氨基酸位点：
1)与前述抗体可变区未改变体中不参与与MTA的结合的氨基酸位点对应的氨基酸位点，
2)与前述抗体可变区改变体相比，不使前述抗体可变区改变体与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点，及
3)容易有助于前述抗体可变区改变体针对抗原的MTA依赖性结合的氨基酸位点。
[B5][B3]所述的文库，其中，前述抗体可变区改变体中的具有与前述抗体可变区未改变体不同的氨基酸的氨基酸位点是选自下述氨基酸位点的组中的一个或多个氨基酸位点：
1)与前述抗体可变区未改变体中不参与与MTA的结合的氨基酸位点对应的氨基酸位点，
2)与前述抗体可变区改变体相比，不使前述抗体可变区改变体与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点，
3)与前述抗体可变区未改变体的表面露出的氨基酸位点对应的氨基酸位点，及
4)与位于前述抗体可变区未改变体中在MTA结合/非结合时结构变化率较大的区域的氨基酸位点对应的氨基酸位点。
[B6][B3]至[B5]中任一项所述的文库，其中，前述抗体可变区的未改变体不与腺苷或/和S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)实质性地结合。
[B7][B3]至[B6]中任一项所述的文库，其中，前述抗体可变区的未改变体是下述任一：
a)包含SEQ ID NO:46所示的重链可变区和SEQ ID NO:47所示的轻链可变区的抗体可变区；
b)包含SEQ ID NO:50所示的重链可变区和SEQ ID NO:51所示的轻链可变区的抗体可变区；
c)包含SEQ ID NO:48所示的重链可变区和SEQ ID NO:49所示的轻链可变区的抗体可变区；
d)包含SEQ ID NO:52所示的重链可变区和SEQ ID NO:53所示的轻链可变区的抗体可变区。
[B8][B2]所述的文库，其中，前述多个抗体可变区包含下列项：
包含XAXWMC(SEQ ID NO:65)的H-CDR1；
包含CIFAXXXYXXSGGSTYYASWAKG(SEQ ID NO:66)的H-CDR2；
包含GXGXXXGXXDEL(SEQ ID NO:67)的H-CDR3；
包含QSSEXVXXXXLS(SEQ ID NO:68)的L-CDR1；
包含XAXTXPX(SEQ ID NO:69)的L-CDR2；及
包含AGLYXGNIPA(SEQ ID NO:70)的L-CDR3；
其中X指任意氨基酸，存在于不同位置的X可以不是同种氨基酸。
[B9][B2]所述的文库，其中，前述多个抗体可变区包含下列项：
包含XAXWMC(SEQ ID NO:65)的H-CDR1；
包含CIFAX1XXYXXSGGSTYYASWAKG(SEQ ID NO:71)的H-CDR2；
包含GXGXXXGXXDEL(SEQ ID NO:67)的H-CDR3；
包含QSSEXVXXX1XLS(SEQ ID NO:72)的L-CDR1；
包含XAXTXPX(SEQ ID NO:69)的L-CDR2；及
包含AGLYXGNIPA(SEQ ID NO:70)的L-CDR3；
其中X是任意氨基酸，
X1是选自A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及V的氨基酸，存在于不同位置的X或者X1可以不是同种氨基酸。
[B10][B2]所述的文库，其中，前述多个抗体可变区包含下列项：
包含XXAXWMC(SEQ ID NO:73)的H-CDR1；
包含CIFAX1XXYXXSGGSTYYASWAKG(SEQ ID NO:71)的H-CDR2；
包含GXGXXXGXXDEL(SEQ ID NO:67)的H-CDR3；
包含QSSEXVXXX1XLS(SEQ ID NO:72)的L-CDR1；
包含XAXTXPX(SEQ ID NO:69)的L-CDR2；及
包含AGLYXGNIPA(SEQ ID NO:70)的L-CDR3；
其中X是任意氨基酸，
X1是选自A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及V的氨基酸，存在于不同位置的X或者X1可以不是同种氨基酸。
[B11][B2]所述的文库，其中，前述多个抗体可变区是包含下述的抗体可变区：
包含XXXWMC(SEQ ID NO:74)的H-CDR1；
包含CIXSXXXXTXYASWVNG(SEQ ID NO:75)的H-CDR2；
包含EXXXXSGALNL(SEQ ID NO:76)的H-CDR3；
包含HSSKXVXXXXXLA(SEQ ID NO:77)的L-CDR1；
包含XAXXLAS(SEQ ID NO:78)的L-CDR2；及
包含QGTYXXXXFYFA(SEQ ID NO:79)的L-CDR3；
X指任意氨基酸，存在于不同位置的X可以不是同种氨基酸。
[B12][B3]至[B5]中任一项所述的文库，其中，前述抗体可变区的未改变体针对腺苷也具有结合活性。
[B13][B12]所述的文库，其中，前述抗体可变区的未改变体针对(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、AMP、ADP或/和ATP也具有结合活性。
[B14][B3]至[B5]、[B12]中任一项所述的文库，其中，前述抗体可变区的未改变体是具有SEQ ID NO:31所示的重链可变区和SEQ ID NO:32所示的轻链可变区的抗体可变区。
[B15][B2]所述的文库，其中，前述多个抗体可变区包含下列项：
包含X2X3X4X5G(SEQ ID NO:80)的H-CDR1；
包含X6IGX7X8X9X10X11WX12PX13WVKX14(SEQ ID NO:81)的H-CDR2；
包含GX15X16X17X18X19X20NAX21DP(SEQ ID NO:82)的H-CDR3；
包含QSSQSVX22X23NNX24LS(SEQ ID NO:83)的L-CDR1；
包含DASTLAS(SEQ ID NO:84)的L-CDR2；及
包含HGX25X26X27X28X29X30X31X32DNX33(SEQ ID NO:85)的L-CDR3；
其中X2是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X3是选自D、E、F、H、K、N、P、R及Y的氨基酸，
X4是选自A、I、P、T及V的氨基酸，
X5是选自A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X6是选自D、I及V的氨基酸，
X7是选自A、D、E、G、I、K、Q及R的氨基酸，
X8是选自D、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X9是选自A、D、E、F、G、H及S的氨基酸，
X10是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X11是选自A、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T及V的氨基酸，
X12是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X13是选自A、F、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X14是选自A、F及G的氨基酸，
X15是选自A、E、F、G、H、K、L、Q、R、S、T、W及Y的氨基酸，
X16是选自F、H、K、N、W及Y的氨基酸，
X17是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X18是选自A、D、E、G、H、Q及S的氨基酸，
X19是选自F及Y的氨基酸，
X20是选自N、T及V的氨基酸，
X21是选自F及W的氨基酸，
X22是选自A、E、F、H、I、K、L、N、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X23是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X24是选自A、E、F、G、H、S及Y的氨基酸，
X25是选自A、S及T的氨基酸，
X26是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X27是选自A、D、E、F、G、H、L、N、Q、R、S、T、V及Y的氨基酸，
X28是选自A、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X29是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y的氨基酸，
X30是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、V、W及Y的氨基酸，
X31是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X32是选自A、F、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X33是选自A及G的氨基酸。
[B16]文库，其从[B15]所述的文库浓缩核酸而成，该核酸编码包含与MTA结合的抗原结合结构域的抗原结合分子。
[B17][B16]所述的文库，其中，前述抗原结合结构域针对MTA的结合是在抗原不存在下针对MTA的结合。
[B18][B16]或[B17]所述的文库，其中，前述浓缩包含以下步骤(1)～(2)：
(1)使从[B15]所述的文库展示的抗原结合结构域与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的抗原结合结构域的步骤。
[B19]文库，其从[B15]所述的文库浓缩核酸而成，该核酸编码与腺苷结合的抗原结合结构域。
[B20][B19]所述的文库，其中，前述抗原结合结构域针对腺苷的结合是在抗原不存在下针对腺苷的结合。
[B21][B19]或[B20]所述的文库，其中，前述浓缩包含以下步骤(1)～(2)：
(1)使从[B15]所述的文库展示的抗原结合结构域与腺苷接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与腺苷结合的抗原结合结构域的步骤。
本公开另外包含以下示例性地记载的方案。
[C1]文库的制备方法，其包含以下步骤(a)及(b)：
(a)在具有针对MTA的结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(vi)中至少一个以上的氨基酸位点的步骤：
(i)在前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于下列区域的氨基酸位点：将前述抗原结合结构域与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构进行比较时，所述区域的结构变化率较大；
(iii)不参与与MTA的结合的氨基酸位点；
(iv)不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点；
(v)在前述抗原结合结构域所属的动物物种中具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点；或
(vi)在经典结构的形成中不重要的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸，及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，该多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有氨基酸改变。
[C2][C1]所述的制备方法，其中，前述步骤(b)的氨基酸改变满足以下(1)至(3)中至少一个以上：
(1)在比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构的情形中，该改变后氨基酸所位于的氨基酸位点的结构变化率较大；
(2)在比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构的情形中，不由该改变后氨基酸的存在而使前述抗原结合结构域改变体的结构变化被抑制；
(3)与前述抗原结合结构域未改变体相比，具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体针对MTA的结合活性没有显著减弱。
[C3][C1]至[C2]中任一项所述的制备方法，其中，前述具有针对MTA的结合活性的抗原结合结构域不与腺苷实质性地结合。
[C4][C3]所述的制备方法，其中，前述具有针对MTA的结合活性的抗原结合结构域不与(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、AMP、ADP或/和ATP结合。
[C5]文库，其通过[C1]至[C4]中任一项所述的制备方法制备。
[C6]文库的制备方法，其包含以下步骤(a)及(b)：
(a)在具有针对低分子化合物的结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(ii)中的至少一个的氨基酸位点的步骤：
(i)前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于下列区域的氨基酸位点：将前述抗原结合结构域与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构进行比较时，所述区域的结构变化率较大；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸，及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，该多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有氨基酸改变。
[C7][C5]所述的制备方法，其中，前述步骤(b)的氨基酸改变满足以下(1)至(3)中至少一个以上：
(1)在将具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构进行比较的情形中，该改变后氨基酸所位于的氨基酸位点的结构变化率较大；
(2)在将具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构进行比较的情形中，前述抗原结合结构域改变体的结构变化不由该改变后氨基酸的存在而被抑制；
(3)与前述抗原结合结构域未改变体相比，具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体针对前述低分子化合物的结合活性没有显著减弱。
[C8]文库的制备方法，其包含以下步骤(a)及(b)：
(a)在与低分子化合物相互作用的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(iv)中的至少一个的氨基酸位点的步骤：
(i)前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于下列区域的氨基酸位点：将前述抗原结合结构域与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物时的结构进行比较时，所述区域的结构变化率较大；
(iii)不参与与前述低分子化合物的结合的氨基酸位点；
(iv)不使与前述低分子化合物的结合显著减弱的氨基酸位点；
(v)在前述抗原结合结构域所属的动物物种中具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点；或
(vi)在经典结构的形成中不重要的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸，及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，该多个改变体序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有满足以下(1)至(2)中至少一个的氨基酸改变：
(1)在将具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构进行比较情形中，该改变后氨基酸所位于的氨基酸位点的结构变化率较大；
(2)在将具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构进行比较情形中，前述抗原结合结构域改变体的结构变化不由该改变后氨基酸的存在而被抑制。
[C9][C6]至[C8]中任一项所述的制备方法，其中，前述低分子化合物选自从腺苷、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)中选择的至少一个。
[C10]文库，其通过[C6]至[C8]中任一项所述的制备方法制备。
本公开另外包含以下示例性地记载的方案。
[D1]筛选抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域。
[D2][D1]所述的方法，其包含将抗原结合结构域在第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性和在与第1浓度不同的浓度(第2浓度)的MTA存在下针对抗原的结合活性进行比较。
[D3][D1]或[D2]所述的方法，其包含选择抗原结合分子的步骤，该抗原结合分子包含在第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性和在第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性不同的抗原结合结构域。
[D4][D2]至[D3]中任一项所述的方法，其包含选择抗原结合分子的步骤，该抗原结合分子包含在前述第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比在前述第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性高的抗原结合结构域。
[D5][D2]至[D3]中任一项所述的方法，其包含选择抗原结合分子的步骤，该抗原结合分子包含在前述第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比前述第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性低的抗原结合结构域。
[D6][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使包含抗原结合结构域的抗原结合分子在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA的存在下的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
[D7][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使包含抗原结合结构域的抗原结合分子在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(d)将在前述步骤(c)中的抗原结合活性弱于前述步骤(b)中确认与抗原结合的基准的，包含抗原结合结构域的抗原结合分子分离的步骤。
[D8][D6]或[D7]所述的方法，其中，在进行前述(a)步骤之前，确认抗原结合结构域能够与MTA结合。
[D9][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)在第1浓度的MTA存在下使包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子不与抗原结合的步骤，
(c)使前述不与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子在第2浓度的MTA存在下与抗原结合的步骤，及
(d)将前述步骤(c)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子分离的步骤。
[D10][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
[D11][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(d)将前述步骤(c)中的抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的，包含抗原结合结构域的抗原结合分子分离的步骤。
[D12][D10]或[D11]所述的方法，其在前述(a)步骤之前包含以下步骤(1)至(2)：
(1)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
其中在前述步骤(a)中在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的文库是展示了前述步骤(1)及(2)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库。
[D13][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)在第1浓度的MTA存在下使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中不与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)使前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子在第2浓度的MTA存在下与抗原结合的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
[D14][D2]至[D8]中任一项所述的方法，其中，前述第1浓度是比前述第2浓度高的浓度。
[D15][D1]所述的方法，其包含将抗原结合结构域在MTA存在下的针对抗原的结合活性和MTA不存在下针对抗原的结合活性进行比较。
[D16][D1]或[D15]所述的方法，其包含选择在MTA存在下针对抗原的结合活性和MTA不存在下针对抗原的结合活性不同的抗原结合结构域的步骤。
[D17][D1]或[D15]所述的方法，其包含选择在MTA存在下针对抗原的结合活性比MTA不存在下针对抗原的结合活性高的抗原结合结构域的步骤。
[D18][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使包含抗原结合结构域的抗原结合分子在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
[D19][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使包含抗原结合结构域的抗原结合分子在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(d)将前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中确认与抗原结合的基准的，包含抗原结合结构域的抗原结合分子进行分离的步骤。
[D20][D18]或[D19]所述的方法，其中，在进行前述(a)步骤之前，确认包含抗原结合结构域的抗原结合分子能够与MTA结合。
[D21][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)在MTA存在下使包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子不与抗原结合的步骤，
(c)使前述不与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子在不存在MTA的条件下与抗原结合的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
[D22][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
[D23][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(d)将在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的，包含抗原结合结构域的抗原结合分子进行分离的步骤。
[D24][D22]或[D23]所述的方法，其在前述(a)步骤之前包含以下步骤(1)至(2)：
(1)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
其中前述步骤(a)中在MTA存在下与抗原接触的文库是展示了前述步骤(1)及(2)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库。
[D25][D1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)在MTA存在下使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中不与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)使前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子在不存在MTA的条件下与抗原结合的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
[D26][D10]至[D14]或[D22]至[D25]中任一项所述的方法，其中，前述展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库是天然人抗体展示文库、或合成人抗体展示文库、或[B1]至[B14]中任一项所述的文库、或[C5]所述的文库。
[D27][D1]至[D26]中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区或者单结构域抗体。
本公开另外包含以下示例性地记载的方案。
[F1]制备包含抗原结合结构域的抗原结合分子的方法，该抗原结合分子针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化。
[F2][F1]所述的方法，其包含将抗原结合结构域在第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性和在与第1浓度不同的浓度(第2浓度)的MTA存在下针对抗原的结合活性进行比较。
[F3][F1]或[F2]所述的方法，其包含选择在第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性与在第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性不同的抗原结合结构域的步骤。
[F4][F2]至[F3]中任一项所述的方法，其包含选择在前述第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比在前述第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性高的抗原结合结构域的步骤。
[F5][F2]至[F3]中任一项所述的方法，其包含选择在前述第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比在前述第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性低的抗原结合结构域的步骤。
[F6][F3]至[F5]中任一项所述的方法，其进一步包含培养导入了包含载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码前述选择的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F7][F1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使抗原结合结构域在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F8][F1]所述的方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使抗原结合结构域在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(d)将在前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中确认与抗原结合的基准的抗原结合结构域进行分离的步骤，及
(e)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F9][F7]或[F8]所述的方法，其中，在进行前述(a)步骤之前，确认抗原结合结构域能够与MTA结合。
[F10][F1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(e)：
(a)在第1浓度的MTA存在下使抗原结合结构域与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域不与抗原结合的步骤，
(c)使前述不与抗原结合的抗原结合结构域在第2浓度的MTA存在下与抗原结合的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F11][F1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使展示了抗原结合结构域的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F12][F1]所述的方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使展示了抗原结合结构域的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F13][F11]或[F12]所述的方法，其在前述(a)步骤之前包含以下步骤(1)至(2)：
(1)使展示了抗原结合结构域的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的抗原结合结构域的步骤，
前述步骤(a)中在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的文库是展示了前述步骤(1)及(2)中选择的抗原结合结构域的文库。
[F14][F1]所述的方法，其包含以下的步骤(a)～(e)：
(a)使展示了抗原结合结构域的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)使前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在第2浓度的MTA存在下与抗原结合的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F15][F2]至[F14]中任一项所述的方法，其中，前述第1浓度是比前述第2浓度高的浓度。
[F16][F1]所述的方法，其包含将抗原结合结构域在MTA存在下的针对抗原的结合活性与MTA不存在下针对抗原的结合活性进行比较。
[F17][F1]或[F16]所述的方法，其包含选择在MTA存在下针对抗原的结合活性与MTA不存在下针对抗原的结合活性不同的抗原结合结构域的步骤。
[F18][F1]或[F16]所述的方法，其包含选择在MTA存在下针对抗原的结合活性比MTA不存在下针对抗原的结合活性高的抗原结合结构域的步骤。
[F19][F16]至[F18]中任一项所述的方法，其进一步包含下列步骤：培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子，其中在所述载体中，编码包含前述选择的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F20][F1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使抗原结合结构域在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F21][F1]所述的方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使抗原结合结构域在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(d)将前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中确认与抗原结合的基准的抗原结合结构域进行分离的步骤，及
(e)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F22][F20]或[F21]所述的方法，其在进行前述(a)步骤之前确认抗原结合结构域能够与MTA结合。
[F23][F1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(e)：
(a)在MTA存在下使抗原结合结构域与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域不与抗原结合的步骤，
(c)使前述不与抗原结合的抗原结合结构域在不存在MTA的条件下与抗原结合的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F24][F1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使展示了抗原结合结构域的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F25][F1]所述的方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使展示了抗原结合结构域的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F26][F24]或[F25]所述的方法，其在前述(a)步骤之前包含以下步骤(1)至(2)：
(1)使展示了抗原结合结构域的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的抗原结合结构域的步骤，
前述步骤(a)中在MTA存在下与抗原接触的文库是展示了前述步骤(1)及(2)中选择的抗原结合结构域的文库。
[F27][F1]所述的方法，其包含以下步骤(a)～(e)：
(a)在MTA存在下使展示了抗原结合结构域的文库与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)使前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在不存在MTA的条件下与抗原结合的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，其中在所述载体中，包含编码前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接。
[F28][F11]至[F15]或[F24]至[F27]中任一项所述的方法，其中，前述展示了抗原结合结构域的文库是天然人抗体展示文库、或合成人抗体展示文库、或[B1]至[B14]中任一项所述的文库、或[C5]所述的文库。
[F29][F1]至[F28]中任一项所述的方法，其中，前述抗原结合结构域是抗体可变区或者单结构域抗体。
本公开另外包含以下示例性地记载的方案。
[E1]抗原结合分子，其与MTA特异性结合。
[E2][E1]所述的抗原结合分子，其为与MTA结合的抗原结合分子，该抗原结合分子不与腺苷实质性地结合。
[E3][E1]或[E2]所述的抗原结合分子，其为与MTA结合的抗原结合分子，该抗原结合分子不与(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、AMP、ADP或/和ATP实质性地结合。
[E4]MTA浓度测定方法，其应用[E1]至[E3]中任一项所述的抗原结合分子。
[E5][E4]所述的测定方法，其中，前述MTA浓度是组织中的MTA浓度。
[E6][E4]或[E5]中任一项所述的测定方法，其利用抗原抗体反应测定MTA浓度。
[E7][E4]至[E5]中任一项所述的测定方法，其应用免疫组织染色法。
[E8][E4]至[E5]中任一项所述的测定方法，其应用成像法。
[E9][E4]至[E5]中任一项所述的测定方法，其应用体内成像法。
[E10]疾病的诊断方法，其应用[E1]至[E3]中任一项所述的抗原结合分子。
[E11][E10]所述的方法，其中，前述诊断是判断疾病的患病有无、或预测针对疾病的治疗效果。
[E12][E10]至[E11]中任一项所述的方法，其中，前述疾病是癌。
[E13][E12]所述的方法，其中，前述癌是癌组织中有MTA积累的癌。
[E14][E12]或[E13]中任一项所述的方法，其中，前述癌是编码MTAP的基因缺失或者表达降低的、或具有使酶活性降低的突变或者剪接变体的癌组织。
[E15]疾病的诊断试剂盒，其包含[E1]至[E3]中任一项所述的抗原结合分子。
[E16][E15]所述的试剂盒，其中，前述诊断是判断疾病的患病有无、或预测针对疾病的治疗效果。
[E17][E15]至[E16]中任一项所述的试剂盒，其中，前述疾病是癌。
[E18][E17]所述的试剂盒，其中，前述癌在癌组织中有MTA积累。
发明的效果
本公开的包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子、以及包含该分子的药物组合物在正常组织、血液中并不全身性地作用，而是在癌中可逆地作用，由此可以避免副作用的同时发挥药效，治疗癌。
进一步，只要使用本公开的包含多种包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库，其中，所述包含抗原结合结构域的抗原结合分子的序列彼此不同，且针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化，则能够在短时间内，高效获得如上所述的对于癌组织特异性疾病的治疗有用的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的各种抗原结合分子。
附图简述
[图1]是显示各细胞株的细胞内MTA浓度的图。纵轴是细胞内MTA浓度，横轴是细胞株名及MTAP的缺失状况。MTAP-意味着MTAP缺失细胞株，MTAP+意味着MTAP非缺失株。
[图2]是显示培养各细胞株的培养液中的MTA浓度的图。纵轴是培养液中的MTA浓度，横轴是培养时间和细胞株名和MTAP的缺失状况。MTAP-意味着MTAP缺失细胞株，MTAP+意味着MTAP非缺失株。
[图3]是显示在预先添加MTA的培养基中培养各细胞株时，培养液中MTA浓度的图。纵轴是培养液中的MTA浓度，横轴是培养时间。各点显示测定的各数据。左侧的图显示培养MTAP非缺失细胞HT-1376时培养液中的MTA浓度，右侧的图显示培养MTAP非缺失细胞SK-MES-1时培养液中的MTA浓度。
[图4]是显示患癌小鼠的肿瘤中的MTA浓度的图。纵轴是肿瘤中的MTA浓度，横轴是移植到小鼠中的细胞株名。各点显示测定的各数据。
[图5]是显示人临床样品中的MTAP DNA量与组织中MTA浓度的关系的图。左侧的图显示测定膀胱癌的临床样品的结果，右侧的图显示测定食道癌的临床样品的结果。图中的各点显示各个临床样品，浅色的点表示组织中MTA浓度低于检测界限的样品。纵轴是组织中的MTA浓度，横轴是从MTAP基因的Ct值减去ΨX4基因的Ct值的ΔCt。
[图6]是显示患癌小鼠的组织中的细胞外MTA浓度的图。左侧的图显示肿瘤中的细胞外MTA浓度，右侧的图显示作为正常组织的肝脏中的细胞外MTA浓度。纵轴是组织中的细胞外MTA浓度，横轴是移植到小鼠中的细胞株名。各点显示测定的各数据，中空的点是MTA定量下限值以下的数据。
[图7]是显示在MTA或腺苷的不同浓度下的、C03H-BH076N17/C03L-KT0针对hIL-6R的结合量的图。纵轴显示每固相抗体量的hIL-6R结合量，横轴显示MTA或腺苷的浓度。
[图8]是显示SMB0002hFab与腺苷的结合的样式的图。图中，该抗体的重链以黑色、轻链以灰色、腺苷以球棒模型显示。与腺苷形成相互作用的氨基酸残基以棍状模型显示。虚线和其数值显示各氨基酸残基与腺苷之间的氢键、CH-π相互作用、或π-π相互作用间的距离。此外，单位以
Figure BDA0003265595920000451
显示。
[图9]是从SMB0002hFab的结晶结构的非对称单位中包含的、SMB0002hFab_1与SMB0002hFab_2这2种分子中提取了可变区，并重合的图。图中，SMB0002hFab_1以灰色显示，SMB0002hFab_2以黑色显示。
[图10]是从SMB0002hFab的结晶结构的非对称单位中的2种分子之中的1种分子SMB0002hFab_1、和SMB0002hFab与腺苷的复合体(SMB0002hFab-腺苷复合体)中提取了腺苷和可变区，并重合的图。图中，SMB0002hFab_1以灰色显示、SMB0002hFab-腺苷复合体以黑色显示。
[图11]是从SMB0002hFab的结晶结构的非对称单位中的2种分子之中的1种分子SMB0002hFab_2、和SMB0002hFab与腺苷的复合体(SMB0002hFab-腺苷复合体)中提取腺苷和可变区，并重合的图。图中，SMB0002hFab_2以灰色显示、SMB0002hFab-腺苷复合体以黑色显示。
[图12]是显示重链可变区噬菌体展示文库针对MTA淘选后获得的克隆群针对MTA的结合量的图。纵轴显示不将MTA为固相时、横轴显示将MTA为固相时基于噬菌体ELISA的吸光度。
[图13]是显示轻链可变区噬菌体展示文库针对MTA淘选后获得的克隆群针对MTA的结合量的图。纵轴显示不将MTA为固相时、横轴显示将MTA为固相时通过噬菌体ELISA的吸光度。
[图14]是显示基于SPR的在MTA或腺苷存在下的、依赖于MTA与抗原结合的抗体分别针对hIL-6R、hIL-6、hIgA的结合量的图。纵轴显示结合量(-100至200RU)，横轴显示反应时间(-100至1200秒，0秒是抗原反应开始时间)。
[图15]是从MTA0303Fab与MTA的复合体的结晶结构提取了可变区与MTA的图。图中，该抗体的重链以黑色显示、轻链以灰色显示、MTA以球棒模型显示。
[图16]是显示MTA0303Fab与MTA的结合的样式的图。图中，该抗体的重链以黑色显示、轻链以灰色显示、MTA以球棒模型显示。与MTA形成相互作用的氨基酸残基以棍状模型显示。虚线及其数值显示各氨基酸残基与MTA间的氢键、CH-π相互作用、π-π相互作用、硫-π相互作用间的距离。此外，单位以
Figure BDA0003265595920000461
显示。
[图17]是显示MTA0303Fab与MTA的结合的样式的图。图中，该抗体的重链以黑色显示、轻链以灰色显示、MTA以球棒模型显示。与MTA形成相互作用的氨基酸残基以棍状模型显示。虚线及其数值显示氨基酸残基与MTA间的氢键距离。此外，单位以
Figure BDA0003265595920000462
显示。
[图18]是从MTA0330Fab与MTA的复合体的结晶结构中提取可变区与MTA的图。图中，该抗体的重链以黑色显示、轻链以灰色显示、MTA以球棒模型显示。
[图19]是显示MTA0303Fab与MTA的结合的样式的图。图中，该抗体的重链以黑色显示、轻链以灰色显示、MTA以球棒模型显示。与MTA形成相互作用的氨基酸残基以棍状模型显示。虚线及其数值显示各氨基酸残基与MTA间的氢键、CH-π相互作用、或π-π相互作用间的距离。此外，单位以
Figure BDA0003265595920000471
显示。
[图20]是MTA0303Fab与MTA的复合体的结晶结构的图。图中，该抗体的重链以黑色显示、轻链以浅灰色显示、MTA以棍状模型显示。该抗体的重链中包含的异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸的Cα原子以深灰色的球显示。轻链中包含的异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸的Cα原子以白色的球显示。
[图21]是MTA0330Fab与MTA的复合体的结晶结构的图。图中，该抗体的重链以黑色显示、轻链以浅灰色显示、MTA以棍状模型显示。该抗体的重链中包含的异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸的Cα原子以深灰色的球显示。轻链中包含的异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸的Cα原子以白色的球显示。
[图22]显示MTA0303Fab的MTA结合状态与非结合状态的1H-15N TROSY谱的重合。图中结合状态的谱以黑色显示、非结合状态以灰色显示。
[图23]显示MTA0303Fab的MTA结合状态与非结合状态的1H-13C SOFAST-HMQC谱的重合。图中结合状态的谱以黑色显示、非结合状态以灰色显示。
[图24]显示MTA0330Fab的MTA结合状态与非结合状态的1H-15N TROSY谱的重合。是结合状态的谱以黑色显示、非结合状态以灰色显示的图。
[图25]显示MTA0330Fab的MTA结合状态与非结合状态的1H-13C SOFAST-HMQC谱的重合。图中结合状态的谱以黑色显示、非结合状态以灰色显示。
[图26]是显示在不存在低分子的正常环境中低分子开关抗体(Small moleculeswitch antibody)不与抗原结合，而在低分子以高浓度存在的靶组织中与抗原结合的图。
[图27]是显示低分子通过夹在低分子抗体与抗原的复合体中而发挥开关功能的图。若低分子不存在，则抗体与抗原的相互作用不充分，抗体无法与抗原结合，但若低分子存在，则通过被夹在抗体与抗原之间，使得抗体能够与抗原结合。
[图28]是显示试验在MTA或ADO存在下或不存在下的情况，具有MTA依赖性地与IL-6R结合的抗原结合结构域及与CD3结合的抗原结合结构域的双特异性抗体T细胞活化能力的图，所述试验应用了NFAT-RE-luc2-Jurkat细胞进行。X轴显示抗体的浓度(μg/mL)，Y轴显示相对发光量(RLU)。
[图29]是显示应用BiacoreT200测定的、在不同MTA浓度下的MTA依赖性地与IL-6R结合的抗IL-6R抗体针对hIL-6R的结合量的图。纵轴显示每固相抗体量的hIL-6R结合量，横轴显示MTA的浓度。
[图30]是显示应用Octet RED384系统测定的、MTA依赖性地与IL-6R结合的抗IL-6R抗体针对抗原(hIL-6R)的结合量的经时变化的传感图。上段及下段的部分图分别显示在100μM及10μM的MTA情况的测定结果。
具体实施方式
提供以下的定义和详细说明，用于使本说明书中说明的本公开容易理解。
氨基酸
本说明书中，例如，以表示为Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、Val/V的方式，将氨基酸用单字母密码或三字母密码、或其两者来标记。
氨基酸的改变
为了改变抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可以适宜采用位点特异性突变诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。此外，作为置换为除了天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸突变方法，还可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006)35,225-249、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2003)100(11),6353-6357)。还可优选使用例如：在包含作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀(amber)密码子)的互补琥珀(amber)抑制物tRNA上结合有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct(Protein Express))等。
本说明书中，表示氨基酸的改变位点时所用的“和/或”一词的含义包括“和”与“或”适宜组合的所有组合。具体地，例如“33位、55位和/或96位的氨基酸被置换”包含以下的氨基酸改变的变体：(a)33位、(b)55位、(c)96位、(d)33位和55位、(e)33位和96位、(f)55位和96位、(g)33位和55位和96位。
此外，本说明书中，作为表示氨基酸的改变的表述，也可以适宜使用在表示特定位置的数字的前后一并记有改变前与改变后的氨基酸的单字母密码或三字母密码的表述。例如，在加入抗体可变区所含的氨基酸的置换时所使用的N100bL或Asn100bLeu这一改变表示将以Kabat编号表示的100b位的Asn置换成Leu。即，数字表示以Kabat编号表示的氨基酸的位置，记载于其之前的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示置换前的氨基酸、记载于其之后的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示置换后的氨基酸。同样地，在对抗体恒定区所含的Fc区加入氨基酸的置换时使用的P238D或Pro238Asp这一改变表示将以EU编号表示的238位的Pro置换为Asp。即，数字表示以EU编号表示的氨基酸的位置，记载于其之前的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示置换前的氨基酸，记载于其之后的氨基酸的单字母密码或三字母密码表示置换后的氨基酸。
抗原
本说明书中，“抗原”只要含有抗原结合结构域所结合的表位，则其结构并不限于特定的结构。在某些方案中，抗原是4个氨基酸以上的肽、或多肽、或蛋白质。作为抗原，可示例如下述的分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧代-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIAALK-2、激活素RIB ALK-4、激活素RIIA、激活素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(addressin)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整合素、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨素(Osteogenin)、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素(bombesin)、骨衍生神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、PD1、PDL1、LAG3、TIM3、半乳凝素-9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子(衰变促进因子)、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxin 1、Ephrin B2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵胞激素、断裂因子(fractalkine)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生长抑制素)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep B gp120、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-21、IL-23、IL-27、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整合素α2、整合素α3、整合素α4、整合素α4/β1、整合素α4/β7、整合素α5(αV)、整合素α5/β1、整合素α5/β3、整合素α6、整合素β1、整合素β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择素、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C粘附因子、NCA 90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素-3、神经营养素-4、或神经营养素-6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙黏蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(泛特异性的TGF-β)、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RIICD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a黏附素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TLR(Toll-like receptor)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达Lewis-Y相关碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整合素、冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor，血管性血友病因子)、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、激肽释放酶原、RON、TMEM16F、SOD1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、备解素、硬骨素(sclerostin)、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、因子V、因子Va、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子VIIIa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子XI、因子XIa、因子XII、因子XIIa、因子XIII、因子XIIIa、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓调节蛋白、TAPI、tPA、纤溶酶原、纤溶酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、LPA、S1P以及用于激素和生长因子的受体。作为抗原，优选为癌组织中的癌细胞，免疫细胞，基质细胞等中表达的抗原。
在上述抗原的示例中还记载有受体，这些受体当以可溶形式存在于生物体液中的情形，也可以作为本公开的包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子所结合的抗原而使用。作为这样的可溶型受体的非限定的一个方案，例如可示例，由Mullberg等(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)记载的为可溶型IL-6R的、由SEQ ID NO:1所示的IL-6R多肽序列中第1至第357位氨基酸构成的蛋白。
上述抗原的示例中包括表达于细胞膜的膜型分子、和由细胞分泌到细胞外的可溶型分子。本公开的包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子当结合于由细胞分泌的可溶型分子时，作为该抗原结合分子，优选如后所述具有中和活性。
对于可溶型分子所存在的溶液没有限定，该可溶型分子可以存在于生物体液、即充满生物体内的脉管或组织，细胞空间的所有的液体。在非限定的一个方案中，本公开的抗原结合分子所结合的可溶型分子可以存在于细胞外液中。细胞外液就脊椎动物而言，是指血浆、组织间液、淋巴液、致密结缔组织、脑脊髓液、髓液、穿刺液、或关节液等骨和软骨中的成分、肺泡液(支气管肺泡清洗液)、腹水、胸水、心包液、囊内液、或眼房水(房水)等细胞透过液(细胞的主动运输、分泌活动的结果产生的各种腺腔内的液体、和消化道管腔等其它体腔内液)的总称。
本公开的包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子当与表达于细胞膜的膜型分子结合时，作为该抗原结合分子的优选实例，可举出如后所述具有细胞毒性的，或者与细胞伤害性物质结合的，或具有与细胞伤害性物质的结合能力的抗原结合分子。此外，作为非限定的一个方案，也可优选举出如下抗原结合分子：所述抗原结合分子中，替代具有细胞毒性、或者与细胞伤害性物质结合或具有与细胞伤害性物质的结合能力的性质而具有中和活性，或除了这些性质之外还具有中和活性。
抗原结合结构域
本说明书中，“抗原结合结构域”只要与目标抗原结合，则可以使用任意结构的结构域。作为这类结构域的实例，可优选举出例如：抗体的重链和轻链的可变区、生物体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸左右的被称为A结构域的组件(module)(国际公开WO2004/044011、WO2005/040229)、含有10Fn3结构域的Adnectin(国际公开WO2002/032925)，其中10Fn3结构域与在细胞膜表达的糖蛋白fibronectin中的蛋白进行结合、以构成ProteinA的包含58个氨基酸的3螺旋的束(bundle)的IgG结合结构域为构架的Affibody(国际公开WO1995/001937)、具有含33个氨基酸残基的转角与2个反向平行螺旋和环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat：AR)的分子表面露出的区域即DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(国际公开WO2002/020565)、Anticalin等4个环区域，所述4个环区域支持了嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向上扭曲的桶结构的单侧(国际公开WO2003/029462)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得免疫系统且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variablelymphocyte receptor(VLR))的富集亮氨酸残基重复序列(leucine-rich-repeat(LRR))组件反复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片结构的凹陷区域(国际公开WO2008/016854)。
作为本公开的抗原结合结构域的优选实例，可举出抗原结合结构域，其含有抗体的重链和轻链的可变区。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scFv(单链Fv)”、“单链抗体”、“Fv”、“scFv2(单链Fv 2)”、“Fab”或“F(ab')2”等。
抗原结合分子
本公开中，包含抗原结合结构域的抗原结合分子以最广义的含义使用，具体地，只要它们含有抗原结合结构域，则包括各种分子类型。抗原结合分子可以是仅由抗原结合结构域组成的分子，也可以是包含抗原结合结构域及其它结构域的分子。例如，在抗原结合分子是抗原结合结构域与Fc区结合而成的分子的情形，作为实例，举出完全抗体、抗体片段。抗体中可包含单一的单克隆抗体(包括激动剂及拮抗剂抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体等。对将以现有的稳定的α/β桶蛋白质结构等的立体结构用作构架(支架)、仅将其一部分结构制成文库而用于构建抗原结合结构域的构架分子(Scaffold molecules)而言，也包括在本公开的抗原结合分子中。
抗体
本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制造的免疫球蛋白。抗体可从天然存在其的血浆、血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清液中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全合成。作为抗体的实例，优选可举出：免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类。作为人的免疫球蛋白，已知有IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本公开的抗体中可包含这些同种型中的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。作为人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242中，但在本公开中可以是其中的任一种。特别是，作为人IgG1的序列，以EU编号表示的356-358位氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。此外，作为人Igκ(Kappa)恒定区和人Igλ(Lambda)恒定区，由基因多态性形成的多个同种异型序列记载在Sequences of proteins of immunological interest,NIH Publication No.91-3242中，本公开中可以是其中的任一种。
EU编号及Kabat编号
根据本公开中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute ofHealth,Bethesda,Md.,1987年和1991年)。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表示。
可变区
术语“可变区”或“可变结构域”是指参与使抗体与抗原结合的抗体的重链或轻链的结构域。对于天然型抗体的重链及轻链的可变结构域(分别是VH及VL)，通常，各结构域包含4个保守的框架区(FR)及3个超变区(HVR)，具有类似的结构。(例如，参考Kindt etal.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)。)以1个VH或VL结构域，大致充分赋予抗原结合特异性。进一步，对与某个特定的抗原结合的抗体而言，也可以使用来自与该抗原结合的抗体的VH或VL结构域分别筛选VL或VH结构域的互补的文库而分离。例如，参考Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson et al.,Nature 352:624-628(1991)。
超变区
本说明书中应用的术语“超变区”或“HVR”指抗体的可变结构域的各区，其在序列中形成超变(“互补决定区”或“CDR”(complementarity determining region))、和/或结构上确定的环(“超变环”)、和/或包含抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含6个HVR：VH中3个(H1、H2、H3)、及VL中3个(L1、L2、L3)。本说明书中的示例性的HVR包含以下：
(a)氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、及96-101(H3)处产生的超变环(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)、及95-102(H3)处产生的CDR(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health，Bethesda,MD(1991))；
(c)氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)、及93-101(H3)处产生的抗原接触(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)包含HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)、及94-102(H3)的(a)、(b)和/或(c)的组合。
除非在其它段另有显示，HVR残基及可变结构域中的其它残基(例如，FR残基)在本说明书中按照上述的Kabat等赋予编号。
框架
“框架”或“FR”指除超变区(HVR)残基以外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常包含4个FR结构域：FR1、FR2、FR3、及FR4。与其相应，HVR及FR的序列通常以下列顺序表现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
Fc区
Fc区包含来源于抗体重链恒定区的氨基酸序列。Fc区是从以EU编号表示的大约216位氨基酸的木瓜蛋白酶切割位点的铰链区N末端开始，包含该铰链、CH2和CH3结构域的抗体重链恒定区的一部分。Fc区可由人IgG1获得，但并不限于IgG的特定的亚类。作为该Fc区的优选实例，可举出如下所述在pH酸性范围内具有对FcRn的结合活性的Fc区。另外，该Fc区的优选实例还可举出如下所述具有对Fcγ受体的结合活性的Fc区。作为这种Fc区的非限定的一个方案，可例示人IgG1(SEQ ID NO:5)、IgG2(SEQ ID NO:6)、IgG3(SEQ ID NO:7)、或IgG4(SEQ ID NO:8)所示的Fc区。
低分子化抗体
本公开所使用的抗体并不限于抗体的全长分子，也可以是低分子化抗体或其修饰物。低分子化抗体包括全长抗体(例如，完整IgG等完整抗体)的一部分缺失的抗体片段，只要具有针对抗原的结合活性则没有特别限定。本公开的低分子化抗体只要是全长抗体的一部分则没有特别限定，但优选含有重链可变区(VH)或/和轻链可变区(VL)。VH或VL的氨基酸序列可以有置换、缺失、添加及/或者插入。进一步，只要具有针对抗原的结合活性，则可以使VH或/和VL的一部分缺失。另外，可变区可以被嵌合化或人源化。作为抗体片段的具体例，可举出例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv等。此外，作为低分子化抗体的具体例，可举出例如：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv(单链Fv)、双抗体、sc(Fv)2(单链(Fv)2)等。这些抗体的多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)也包含在本公开的低分子化抗体中。
抗体片段可以通过将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶进行处理而产生，或者可以构建编码这些抗体片段的基因，并将其导入表达载体，然后通过适当的宿主细胞来表达(参考例如，Co等(J.Immunol.(1994)152,2968-2976)、Better及Horwitz(Methods inEnzymology(1989)178,476-496)、Plueckthun及Skerra等(Methods in Enzymology(1989)178,476-496)、Lamoyi(Methods in Enzymology(1989)121,652-663)、Rousseaux等(Methods in Enzymology(1989)121,663-669)及Bird等(TIBTECH(1991)9,132-137))。
双抗体指通过基因融合构建的二价(bivalent)的低分子化抗体(Holliger等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90，6444-6448(1993)、欧洲公开公报EP404097、及PCT公开公报WO1993/011161等)。双抗体是由2条多肽链构成的二聚体，通常，对于各多肽链，VL和VH在同一链中通过短至彼此不能结合程度的例如5个残基左右的接头结合。对于编码于同一多肽链上的VL与VH，由于它们之间的接头短，因而无法形成单链可变区片段，从而形成二聚体，所以双抗体具有2个抗原结合位点。
scFv可通过连接抗体的H链可变区与L链可变区来获得。该scFv中，H链可变区与L链可变区通过接头、优选肽接头而连接(Huston等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,5879-5883)。scFv中的H链可变区及L链可变区可以来自本说明书中作为抗体记载的任一抗体。作为连接可变区的肽接头，没有特别限制，但可使用例如由3至25个残基左右组成的任意的单链肽，此外，还可使用后述的肽接头等。作为可变区的连接方法，可利用如上所述的PCR法。可以通过PCR法扩增编码scFv的DNA，该PCR法中，以编码前述抗体的H链或H链可变区的DNA序列、以及编码L链或L链可变区的DNA序列中的编码全部或所期望的氨基酸序列的DNA部分为模板，并使用具有与其两端的序列对应的序列的一对引物。随后，组合编码肽接头部分的DNA、以及具有以使其两端分别与H链、L链连接的方式设计的序列的一对引物，进行PCR反应，由此可获得具有所期望序列的DNA。另外，一旦制备编码scFv的DNA，则可根据常规方法获得含有其的表达载体、和由该表达载体转化的重组细胞，另外，可通过培养其结果得到的重组细胞并使编码该scFv的DNA表达来获得该scFv。
sc(Fv)2是通过接头等将2个VH和2个VL结合成为单链的低分子化抗体(Hudson等(J.Immunol.Methods(1999)231,177-189)。sc(Fv)2例如可通过将scFv用接头连接来制备。
另外，优选下述抗体，其特征在于，2个VH和2个VL以单链多肽的N末端侧为起点，按照VH、VL、VH、VL([VH]接头[VL]接头[VH]接头[VL])的顺序排列。2个VH和2个VL的顺序并不特别限于上述配置，可以按照任意顺序排列。例如还可举出如下所述的配置。
-[VL]接头[VH]接头[VH]接头[VL]
-[VH]接头[VL]接头[VL]接头[VH]
-[VH]接头[VH]接头[VL]接头[VL]
-[VL]接头[VL]接头[VH]接头[VH]
-[VL]接头[VH]接头[VL]接头[VH]
作为将抗体可变区结合的接头，可以使用与前述抗原结合分子一项中记载的接头相同的接头。例如，作为本公开中特别优选的sc(Fv)2的方案，可举出例如以下的sc(Fv)2。
-[VH]肽接头(15氨基酸)[VL]肽接头(15氨基酸)[VH]肽接头(15氨基酸)[VL]
在将4个抗体可变区结合时，通常需要3个接头，可以全部使用相同的接头，也可以使用不同的接头。
为了获得这种低分子化抗体，可以将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等进行处理而产生抗体片段；或者构建编码这些抗体片段或低分子化抗体的DNA，并将其导入表达载体，然后通过适当的宿主细胞来表达(参考例如，Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968-2976；Better，M.and Horwitz,A.H.，Methods Enzymol.(1989)178,476-496；Pluckthun,A.and Skerra,A.,Methods Enzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi,E.,MethodsEnzymol.(1986)121,652-663；Rousseaux,J.et al.,Methods Enzymol.(1986)121，663-669；Bird,R.E.and Walker,B.W.,Trends Biotechnol.(1991)9,132-137)。
另外，作为本公开中抗体的非限定的一个方案，也可举出：将识别抗原而不是识别T细胞受体的抗体或其片段与T细胞的信号结构域的融合体整合至T细胞而得的嵌合型抗原受体(Chimeric antigen receptor)以及整合有该嵌合型抗原受体的T细胞，但不限于此。
单结构域抗体
作为本发明的抗原结合结构域的优选实例之一，可举出单结构域抗体(sdAb)。
本说明书中的术语“单结构域抗体”只要其结构域能够单独发挥抗原结合活性则其结构没有限定。以IgG抗体等示例的通常的抗体以通过VH与VL的配对形成可变区的状态显示抗原结合活性，与其相对，已知单结构域抗体不与其它结构域配对，能够以单结构域抗体自身的结构域结构单独发挥抗原结合活性。单结构域抗体通常具有比较低的分子量，以单聚体的形式存在。
作为单结构域抗体的实例，可列举例如，如骆驼科动物的VHH、鲨鱼的VNAR的先天欠缺轻链的抗原结合分子，或包含抗体的VH结构域的全部或者一部分或VL结构域的全部或者一部分的抗体片段，但不仅限于此。作为包含抗体的VH/VL结构域的全部或者一部分的抗体片段的单结构域抗体的实例，可列举例如，如美国专利第6,248,516号B1等中记载的从人抗体VH或人抗体VL起始人工制备的单结构域抗体，但不仅限于此。在本发明的几个实施方案中，1个单结构域抗体具有3个CDR(CDR1、CDR2及CDR3)。
单结构域抗体可以从能够产生单结构域抗体的动物获得、或通过免疫能够产生单结构域抗体的动物获得。作为能够产生单结构域抗体的动物的实例，可列举例如，骆驼科动物、导入了能够产生单结构域抗体的基因的基因导入动物(转基因动物)，但不仅限于此。骆驼科动物包含骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼(dromedaries)及红褐色美洲驼(大羊驼，guanacos)等。作为导入了能够产生单结构域抗体的基因的基因导入动物的实例，可列举国际公开WO2015/143414号、美国专利公开US2011/0123527号A1中记载的基因导入动物，但不仅限于此。通过将从动物获得的单结构域抗体的框架序列形成为人种系序列或者与其类似的序列，也能够获得人源化的单结构域抗体。另外，人源化的单结构域抗体(例如，人源化VHH)是本发明的单结构域抗体的一个实施方案。“人源化单结构域抗体”指包含来自非人CDR的氨基酸残基及来自人FR的氨基酸残基的嵌合单结构域抗体。在某些方案中，对于人源化单结构域抗体，全部或者实质性全部的CDR与非人抗体的CDR对应，并且全部或者实质性全部的FR与人抗体的FR对应。在人源化抗体中，FR中的残基的一部分不与人抗体的FR对应的情形也考虑为实质性全部的FR与人抗体的FR对应的一个实例。例如，在将单结构域抗体的一个方案VHH进行人源化的情形中，有必要使FR中的残基的一部分为不与人抗体的FR对应的残基(C Vincke等，The Journal of Biological Chemistry 284,3273-3284.)。
另外，单结构域抗体可以从包含单结构域抗体的多肽文库通过ELISA、淘选等获得。作为包含单结构域抗体的多肽文库的实例，可列举例如，从各种动物或人获得的天然抗体文库(实例：Methods in Molecular Biology 2012 911(65-78)、Biochimica etBiophysica Acta-Proteins and Proteomics 2006 1764:8(1307-1319))、通过免疫各种动物获得的抗体文库(实例：Journal of Applied Microbiology 2014 117:2(528-536))、或从各种动物或人的抗体基因制备的合成抗体文库(实例：Journal of BiomolecularScreening 2016 21:1(35-43)、Journal of Biological Chemistry 2016 291:24(12641-12657)、AIDS 2016 30:11(1691-1701))，但不仅限于此。
针对抗原具有所期望的结合活性的抗体的制备方法
制备对包含MTA的低分子化合物没有依赖性、针对与低分子化合物不同的分子的抗原具有所期望的结合活性的抗体的方法是本领域技术人员公知的。以下示例制备与IL-6R结合的抗体(抗IL-6R抗体)的方法。与IL-6R以外的抗原结合的抗体也可以根据下述示例而适宜制备。
抗IL-6R抗体可以使用公知的手段作为多克隆或单克隆抗体获得。作为抗IL-6R抗体，可优选制备来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包括：由杂交瘤产生的单克隆抗体、和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体进行了转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。应予说明，本申请发明的单克隆抗体中包括“人源化抗体”和“嵌合抗体”。
产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下所示来制备。即，使用IL-6R蛋白作为敏化抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。接着，通过通常的筛选方法筛选单克隆的抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗IL-6R抗体的杂交瘤。
具体地，单克隆抗体的制备例如如下所示地进行。首先，表达其核苷酸序列公开在SEQ ID NO:2中的IL-6R基因，由此可得到由SEQ ID NO:1表示的IL-6R蛋白，其用作获得抗体的敏化抗原。即，将编码IL-6R的基因序列插入公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清液中纯化所期望的人IL-6R蛋白。为了从培养上清液中获得可溶型的IL-6R，代替由SEQ ID NO:1表示的IL-6R蛋白，表达了例如，如通过Mullberg等(J.Immunol.(1994)152(10),4958-4968)所记载的可溶型IL-6R、即，由SEQ IDNO:1表示的IL-6R多肽序列中的第1至357个氨基酸构成的蛋白质。另外，纯化的天然的IL-6R蛋白也可以同样地用作敏化抗原。
作为用于免疫哺乳动物的敏化抗原，可使用该纯化IL-6R蛋白。另外，IL-6R的部分肽也可以用作敏化抗原。此时，该部分肽也可以根据人IL-6R的氨基酸序列通过化学合成获得。另外，也可以通过将IL-6R基因的一部分整合至表达载体并进行表达来获得。进一步，还可以使用蛋白分解酶分解IL-6R蛋白来获得，用作部分肽的IL-6R肽的区域和大小并不特别限于特定的方案。对于优选的区域，可以从相当于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中第20-357个氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为敏化抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体地，可以将8～50、优选10～30个残基的肽用作敏化抗原。
另外，也可以将IL-6R蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作敏化抗原。为了制备用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fc片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制备：将编码所期望的两种或两种以上的多肽片段的基因进行框内融合，将该融合基因如前所述地插入表达载体。融合蛋白的制备方法记载于Molecular Cloning 2nd ed.(Sambrook,J et al.,Molecular Cloning 2nded.,9.47-9.58(1989)Cold Spring Harbor Lab.press)。用作敏化抗原的IL-6R的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于国际公开WO2003/000883、WO2004/022754、WO2006/006693等中。
作为用该敏化抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的适应性来选择。通常优选使用啮齿类的动物，例如，小鼠、大鼠、仓鼠、或兔、猴等。
按照公知的方法将上述动物用敏化抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过将敏化抗原注射至哺乳动物的腹腔内或皮下施用来实施免疫。具体地，将用PBS(磷酸缓冲盐水，Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的敏化抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该敏化抗原对哺乳动物每4至21天施用数次。另外，免疫敏化抗原时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作敏化抗原时，有时期望将与白蛋白、匙孔血蓝蛋白等载体蛋白质结合的该敏化抗原肽进行免疫。
另外，产生所期望抗体的杂交瘤也可使用DNA免疫如下制备。DNA免疫是指下述免疫方法：被施用了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，敏化抗原在该免疫动物的生物体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白质抗原施用免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下优越性。
-能够维持IL-6R那样的膜蛋白的结构而赋予免疫刺激。
-无需纯化免疫抗原。
为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物施用表达IL-6R蛋白的DNA。编码IL-6R的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA插入适当的表达载体，施用免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如pcDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体施用生物体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金粒子用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进一步，识别IL-6R的抗体的制备也可以采用国际公开WO2003/104453中记载的方法来制备。
如此将哺乳动物免疫，确认到血清中与IL-6R结合的抗体效价的上升后，从哺乳动物采集免疫细胞，供于细胞融合。作为优选的免疫细胞，可使用特别是脾细胞。
作为与前述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物指能够在特定培养条件下存活(或不能存活)的性质。选择标记物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(以下简称为HGPRT缺陷)、或胸苷激酶缺陷(以下简称为TK缺陷)等。具有HGPRT、TK缺陷的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而发生死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也进行增殖。
HGPRT缺陷、TK缺陷的细胞各自可通过含有6硫代鸟嘌呤、8氮杂鸟嘌呤(以下简称为8AG)、或5'溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合入这些嘧啶类似物的正常细胞死亡。另一方面，无法整合这些嘧啶类似物的缺乏这些酶的细胞可以在选择培养基中存活。此外，被称为G418抗性的选择标记物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
作为这样的骨髓瘤细胞，可优选使用例如，P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123(4),1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(C.Eur.J.Immunol.(1976)6(7),511-519)、MPC-11(Cell(1976)8(3),405-415)、SP2/0(Nature(1978)276(5685),269-270)、F0(J.Immunol.Methods(1980)35(1-2),1-21)、S194/5.XX0.BU.1(J.Exp.Med.(1978)148(1),313-323)、R210(Nature(1979)277(5692),131-133)等。
基本上，根据公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Methods Enzymol.(1981)73,3-46)，进行前述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。
更具体地，前述细胞融合可以例如在细胞融合促进剂的存在下，在通常的营养培养液中实施。作为融合促进剂，可使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进一步为了提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂使用。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞为1至10倍。作为用于前述细胞融合的培养液，使用例如适于前述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进一步可适宜添加胎牛血清(FCS)等血清补液。
对于细胞融合，将前述免疫细胞和骨髓瘤细胞在前述培养液中以规定量充分混合，将预先加热至约37℃的PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)通常以30至60％(w/v)的浓度添加。通过缓缓混合混合液，形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。随后，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
这样得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来选择。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够的时间，所述时间足以使除了所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡(通常，所述足够的时间为数天至数周)。随后，通过常规的有限稀释方法实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
如此得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标记物的选择培养液来选择。例如，具有HGPRT、TK缺陷的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地增殖。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够的时间，所述时间足以使除了所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡。具体地，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。随后，可通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，与IL-6R结合的单克隆抗体能够与细胞表面表达的IL-6R结合。这类单克隆抗体可通过例如FACS(荧光活化细胞分选系统)来筛选。FACS是可以用激光分析与荧光抗体接触的细胞，测定各细胞发出的荧光从而可以测定抗体对细胞表面的结合的系统。
为了利用FACS来对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达IL-6R的细胞。优选用于筛选的细胞是强制表达IL-6R的哺乳动物细胞。通过作为对照使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞，可以选择性地检测到抗体对细胞表面的IL-6R的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、而与IL-6R强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，可以获得产生IL-6R单克隆抗体的杂交瘤。
或者，可以基于ELISA的原理来评价抗体对固定化的IL-6R表达细胞的结合活性。例如，将IL-6R表达细胞固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清液与孔内的经固定细胞接触，检出与经固定细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检出。通过这些筛选选择出的产生对抗原具有结合能力的所期望的抗体的杂交瘤，可以通过有限稀释方法等进行克隆。
这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。另外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。
按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清液中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤施用具有对其适应性的哺乳动物并使其增殖，从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于获得高纯度的抗体。
也可以适宜地使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因整合至适当的载体中，导入宿主，由该基因表达其所编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入、以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等确立(Eur.J.Biochem.(1990)192(3),767-775)。另外，如下所述的重组抗体的制备方法也是公知的。
例如，由产生抗IL-6R抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IL-6R抗体的可变区(V区)的cDNA。为此，通常首先从杂交瘤提取总RNA。作为用于从细胞提取mRNA的方法，例如，可使用如下所述的方法。
-胍超速离心法(Biochemistry(1979)18(24),5294-5299)
-AGPC法(Anal.Biochem.(1987)162(1),156-159)
提取的mRNA可使用mRNA Purification试剂盒(GE Healthcare Bioscience制)等纯化。或者，市售有QuickPrep mRNA Purification试剂盒(GE Healthcare Bioscience制)等这样的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒。使用这样的试剂盒，可从杂交瘤获得mRNA。可以由所得mRNA使用反转录酶来合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA Synthesis试剂盒(生化学工业社制)等合成。另外，为了合成和扩增cDNA，可以适宜采用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制)和使用了PCR的5'-RACE法(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85(23),8998-9002、Nucleic AcidsRes.(1989)17(8),2919-2932)。进一步，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。
从所得PCR产物纯化目标cDNA片段，随后与载体DNA连接。如此制备重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，对于该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列，可以通过公知的方法，例如，双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5'-RACE法，其中使用了用于可变区基因扩增的引物。首先，将从杂交瘤细胞提取的RNA作为模板来合成cDNA，获得5'-RACE cDNA文库。5'-RACE cDNA文库的合成中可适宜地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。
以所得的5'-RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列，可设计用于小鼠抗体基因扩增的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的碱基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒(RocheDiagnostics)等市售试剂盒来预先确定亚类。
具体地，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用下述引物，其能够扩增编码作为重链的γ1、γ2a、γ2b、γ3、作为轻链的κ链和λ链的基因。为了扩增IgG的可变区基因，通常，3'侧的引物采用退火到相当于接近可变区的恒定区的部分的引物。另一方面，5'侧的引物采用5'RACE cDNA文库制备试剂盒所附带的引物。
用这样扩增的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白的针对IL-6R的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如，为了获得针对IL-6R的抗体时，进一步优选抗体对IL-6R的结合是特异性的。与IL-6R结合的抗体例如可如下所述进行筛选。
(1)使包含由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与表达IL-6R的细胞接触的步骤，
(2)检测IL-6R表达细胞与抗体的结合的步骤，及
(3)选择与IL-6R表达细胞结合的抗体的步骤。
检测抗体与IL-6R表达细胞的结合的方法是公知的。具体地，通过如前所述的FACS等方法，可检测出抗体与IL-6R表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适宜利用IL-6R表达细胞的固定标本。
作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可适宜采用淘选法，其利用了噬菌体载体。从多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库的形式获得抗体基因时，利用噬菌体载体的筛选方法是有利的。编码重链和轻链的可变区的基因可通过用适当的接头序列连接而形成单链Fv(scFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原结合的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所期望结合活性的scFv。
得到目标的编码抗IL-6R抗体的V区的cDNA后，通过识别插入该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶，将该cDNA消化。优选的限制酶识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现频率低的碱基序列。为了进一步将1拷贝的消化片段以正确方向插入载体，优选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上所述消化的编码抗IL-6R抗体的V区的cDNA插入适当的表达载体，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区)的基因与编码前述V区的基因进行框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也包括在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入前述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体地，例如，可在保有编码所期望抗体恒定区的DNA的表达载体的5'侧适宜地配置消化前述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。
为了制备抗IL-6R单克隆抗体，抗体基因以在表达调控区的调控下进行表达的方式被整合至表达载体中。用于表达抗体的表达调控区包含例如增强子和启动子。另外，可以在氨基酸末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:3)的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切割，被切割的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。随后，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗IL-6R抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别整合于不同的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体同时转化(co-transfect)相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，也可以将编码H链和L链的DNA整合于单一的表达载体中，由此转化宿主细胞(参考国际公开WO 1994/011523)。
用于将分离的抗体基因导入适当的宿主来制备抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞、或真菌细胞。具体地，作为动物细胞可示例如下的细胞。
(1)哺乳类细胞：CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、COS(猴肾细胞株)、骨髓瘤(Sp2/0、NS0等)、BHK(幼仓鼠肾细胞系)、Hela、Vero、HEK293(携带已剪切腺病毒(Ad)5DNA的人胚肾细胞系)、PER.C6细胞(用5型腺病毒(Ad5)E1A和E1B基因转化的人胚胎视网膜细胞系)等(Current Protocols in Protein Science(May,2001,Unit 5.9,表5.9.1))
(2)两栖类细胞：非洲爪蟾卵母细胞等
(3)昆虫细胞：sf9、sf21、Tn5等。
或者，作为植物细胞，基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达系统是公知的。在植物细胞的转化中，可以适宜使用进行了愈伤组织培养的细胞。
进一步，作为真菌细胞，可以使用如下细胞。
-酵母：酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母(pichia)属。
-丝状真菌：黑曲霉菌(Aspergillus niger)等曲霉(Aspergillus)属。
另外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适宜利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化可向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。
对重组抗体的产生而言除了上述宿主细胞之外，也可以利用转基因动物。即，可以从导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内插入于编码乳汁中固有产生的蛋白质的基因的内部，而构建为融合基因形式。作为分泌至乳汁中的蛋白质，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎，再将该进行了注入的胚胎导入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。另外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊施用激素(Bio/Technology(1994),12(7),699-702)。
对人施用本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该抗原结合分子中的抗原结合结构域，可以适宜采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，该基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工改造。基因重组型抗体包含例如人源化(Humanized)抗体等。这些改造抗体可使用公知方法适宜制造。
作为制备针对特定的低分子化合物具有所期望的结合活性的抗体的方法，可以通过与通常的制备与蛋白抗原结合的抗体的方法同样的方法，获得针对低分子化合物具有所期望的结合活性的抗体。作为用于获得针对低分子化合物的抗体的敏化抗原的制备方法的一个方案，可例示使Mariculture匙孔血蓝蛋白(KLH)与低分子化合物连接的方法。作为制备用于获得针对MTA的抗体的非限定的敏化抗原的一个实例，可例示6’-MTA-匙孔血蓝蛋白(6’-MTA-KLH)。Mariculture匙孔血蓝蛋白(KLH)是辅助T细胞上表达的T细胞受体能够识别的抗原性高的蛋白质，已知其活化抗体的产生，因此，期望通过与MTA连接使针对MTA的抗体的产生亢进。与KLH连接的低分子化合物不限于MTA，可以对于能够合成的各种低分子化合物以同样的方法制备敏化抗原，作为非限定的实例，可例示AMP、ADP、ATP、腺苷或SAH等。国际公开WO2013/180200号中也对低分子化合物免疫原的设计进行了公开。
另外，与低分子化合物进行连接的抗原不限于KLH，可以使用与例如生物素等连接的物质作为敏化抗原，进一步，除KLH、生物素以外，如果能与低分子化合物连接，则可以使用。
本公开另外包含以下示例性地记载的方案。
[1]生物素化MTA。
[2]生物素-2’-MTA。
[3]6’-MTA-生物素。
[4][1]至[3]所述的生物素化MTA在用于筛选与MTA结合的抗原结合分子中的用途。
[5][1]至[3]所述的生物素化MTA作为用于获得与MTA结合的抗原结合分子的免疫原的用途。
[6]应用[1]至[3]所述的生物素化MTA而筛选与MTA结合的抗原结合分子的方法。
多特异性抗原结合分子或多互补位(multiparatopic)的抗原结合分子
从其反应特异性的观点考虑，将具有如下特征且包含至少两个抗原结合结构域的抗原结合分子称作多特异性抗原结合分子：其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合，其至少一个其它的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合。该抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的两种抗原结合结构域与两个不同的表位结合时，该抗原结合分子被称作双特异性抗原结合分子。此外，该抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的三种抗原结合结构域与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作三特异性抗原结合分子。
与抗原分子中的第一表位结合的抗原结合结构域中的互补位和与结构不同于第一表位的第二表位结合的抗原结合结构域中的互补位的结构彼此不同。所以，从其结构特异性的观点考虑，具有如下特征且包含至少两个抗原结合结构域的抗原结合分子被称作多互补位的抗原结合分子：其至少一个抗原结合结构域与抗原分子中的第一表位结合，其至少一个其它的抗原结合结构域与抗原分子中的第二表位结合。该抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的两种抗原结合结构域与两个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作双互补位的抗原结合分子。此外，该抗原结合分子通过一分子的该抗原结合分子所含的三种抗原结合结构域与三个不同表位结合时，该抗原结合分子被称作三互补位的抗原结合分子。
双特异性抗体及其制备方法
包含一个或多个抗原结合结构域的多价的多特异性或多互补位的抗原结合分子，及其制备方法还记载在Conrath等(J.Biol.Chem.(2001)276(10)7346-7350)、Muyldermans(Rev.Mol.Biotech.(2001)74,277-302)及Kontermann R.E.(2011)BispecificAntibodies(Springer-Verlag)等非专利文献、以及国际公开WO1996/034103或WO1999/023221等专利文献等中。通过利用其中记载的多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法，可以制备本公开的抗原结合分子。
作为如上所述的多特异性或多互补位的抗原结合分子及其制备方法的一个方案，以下示例双特异性抗体及其制备方法。双特异性抗体是包含与不同表位进行特异性结合的两种可变区的抗体。IgG型双特异性抗体可由通过融合两种产生IgG抗体的杂交瘤而产生的杂交的杂交瘤(quadroma)所分泌(Milstein等(Nature(1983)305,537-540)。
利用上述抗体一项中记载的重组方法制备双特异性抗体时，可以采用将编码包含两种目标可变区的重链的基因导入细胞中使其共表达的方法。但是，仅仅考虑这种共表达方法中的重链的组合，也会形成下述的(i)、(ii)、(iii)的组合以2：1：1的分子数的比例存在的混合物：(i)包含与第一表位结合的可变区的重链和包含与第二表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合、(ii)只是包含与第一表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合、(iii)只是包含与第二表位结合的可变区的重链形成一对的重链组合。从这三种重链组合的混合物中纯化包含目标重链组合的抗原结合分子是困难的。
利用这种重组方法制备双特异性抗体时，通过对构成重链的CH3结构域进行适当的氨基酸置换的改变，可以优先分泌包含异源性组合的重链的双特异性抗体。具体地，有下述方法：将存在于一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链置换成更大的侧链(knob(意为“突起”))，将存在于另一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链置换成更小的侧链(hole(意为“空隙”))，从而使突起能够配置在间隙内，以促进异种的重链形成和抑制同种的重链形成(国际公开WO1996027011、Ridgway等(Protein Engineering(1996)9,617-621)、Merchant等(Nat.Biotech.(1998)16，677-681))。
此外，还已知通过将控制多肽的缔合或由多肽构成的异源多聚体的缔合的方法用于重链的缔合来制备双特异性抗体的技术。即，在双特异性抗体的制备中可以采用下述方法：通过改变形成重链内的界面的氨基酸残基，而控制使得具有相同序列的重链的缔合被抑制，且形成序列不同的两个重链(国际公开WO2006/106905)。这样的方法在制备双特异性抗体时也可以采用。
癌
本说明书中，术语“癌”通常用于表示恶性新生物，其可以是转移性或非转移性。例如，作为由消化道、皮肤等上皮组织产生的癌瘤的非限定性实例，可示例：脑肿瘤、皮肤癌、头颈部癌、食道癌、肺癌、胃癌、十二指肠癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肝癌、大肠癌、结肠癌、膀胱癌和卵巢癌等。此外，作为由肌肉等非上皮性组织(间质)产生的肉瘤的非限定性实例，可示例：骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、和血管肉瘤等。进一步，作为来源于造血器官的血液癌的非限定性实例，可示例：包括霍奇金淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)和非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin's lymphoma)的恶性淋巴瘤，包括急性髓细胞性白血病(acute myelocytic leukemia)或慢性髓细胞性白血病(chronic myelocytic leukemia)、和急性淋巴性白血病(acute lymphatic leukemia)或慢性淋巴性白血病(chronic lymphatic leukemia)的白血病，以及多发性骨髓瘤(multiple myeloma)。本说明书中广泛使用的术语“新生物”还意指新产生的任何病变组织肿瘤。本公开中，新生物引起肿瘤的形成，其以部分地血管形成为特征。新生物可以是良性的，例如血管瘤、神经胶质瘤、畸胎瘤等，或者是恶性的，例如癌瘤、肉瘤、胶质细胞瘤、星状胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤等。
术语“癌组织”意指含有至少一种癌细胞的组织。因此，例如癌组织含有癌细胞和血管那样，其是指有助于含有癌细胞和内皮细胞的肿瘤(tumor mass)的形成的所有的细胞型。本说明书中，肿瘤是指肿瘤组织病灶(a foci of tumor tissue)。术语“肿瘤”通常用于意指良性新生物或恶性新生物。
本公开中，“有MTA积累的癌组织”意味着与正常组织比较，在前述癌组织中检测到更多量的MTA的癌组织，作为成为比较对象的正常组织的非限定的一个实例，可以示例癌组织的相邻正常组织、健康人的组织。
另外，代谢MTA的甲硫腺苷磷酸化酶(MTAP：methylthioadenosinephosphorylase)缺失的癌组织、MTAP的功能降低的癌组织也是有MTA积累的癌组织的一个方式。具体地，编码MTAP的基因缺失或者表达降低的癌组织、表达使MTAP的活性降低的突变或者剪接变体的癌组织、或MTAP的酶活性降低的癌组织是有MTA积累的癌组织的一个方式。MTAP的表达或功能的降低能够通过与正常组织比较而确定，作为成为比较对象的正常组织的非限定的一个实例，可以示例癌组织的相邻正常组织、健康人的组织。
癌症相关成纤维细胞(CAF)
本公开中的“癌症相关成纤维细胞(CAF)”是癌组织周边部位存在的内皮细胞等具有多样起源的异源性的集合。作为非限定的CAF的特征，有癌细胞的增殖促进、血管新生的促进、癌细胞的脉管浸润促进、通过免疫应答的控制等构建对癌症的进展有利的微小环境等。进一步，作为非限定的CAF的一个方案，可例示表达选自下列的标记物的细胞：α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、肌腱蛋白-C(tenascin-C，TN-C)、骨膜蛋白(periostin，POSTN)、NG2硫酸软骨素蛋白聚糖(NG2)、血小板衍生生长因子受体(PDGFR)、波形蛋白(vimentin)、结蛋白(desmin)、成纤维细胞特异性蛋白-1(FSP1)、纤连蛋白。
肿瘤相关巨噬细胞(TAM)
本公开中的“肿瘤相关巨噬细胞(TAM)”是指癌组织及其周边部位存在的巨噬细胞。可示例例如，与成纤维细胞、血管内皮细胞等一起形成癌症的微小环境的巨噬细胞群体(population)。作为非限定的TAM的特征，可例示通过促进抗炎症性因子的产生、调节性T细胞的浸润而抑制抗肿瘤免疫等，通过各种血管新生因子的产生诱导新生血管。进一步，作为非限定的TAM的一个方案，可例示表达选自下列的标记物的细胞：CD163、CD204、IL-10、TGF-β、前列腺素E2。
效应细胞
本公开中，“效应细胞”可以以包括T细胞(CD4+(辅助淋巴细胞)T细胞和/或CD8+(细胞毒性)T细胞)、多核白细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞)、单核白细胞、巨噬细胞、组织细胞或自然杀伤细胞(NK细胞)、NK样T细胞、库普弗细胞、朗格汉斯细胞、或淋巴因子活化杀伤细胞(LAK细胞)等白细胞、B淋巴细胞、或者树突细胞或巨噬细胞等抗原呈递细胞的最广义的含义来使用，作为优选的效应细胞的实例，可举出CD8+(细胞毒性)T细胞、NK细胞、或巨噬细胞。只要是表达于效应细胞的细胞膜的膜型分子，则可以用作本公开的抗原结合分子所含的至少1个抗原结合结构域所结合的抗原，作为优选的膜型分子，作为非限定性实例可示例构成TCR的多肽、CD3、CD2、CD28、CD44、CD16、CD32、CD64、或NKG2D或者NK细胞活化配体。
甲硫腺苷(MTA：Methylthioadenosine)
本说明书中应用的术语“MTA”指甲硫腺苷(Methylthioadenosine)，具体地，指下述化学式所示的化合物。
[化学式1]
Figure BDA0003265595920000791
MTA类似体(analogs)
本说明书中应用的术语“MTA类似体”指与MTA具有一部分共同结构的除MTA以外的低分子化合物。作为MTA类似体，可示例分子中具有腺苷作为共同骨架的低分子化合物，另外示例腺苷中的第5位的碳处具有包含硫原子、氧原子的侧链的低分子化合物。进一步，作为MTA类似体，优选列举例如，S-腺苷蛋氨酸(SAM：S-adenoshylmethionine)、S-腺苷高半胱氨酸(SAH：S-adenosylhomocystein、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸)等多胺生物合成途径的代谢物(Stevens等(J Chromatogr A.2010 May 7；1217(19):3282-8))，但不限于这些。
[化学式2]
Figure BDA0003265595920000801
[化学式3]
Figure BDA0003265595920000802
另外，作为MTA类似体的非限定的一个方案，可列举腺苷、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)。
[化学式4]
Figure BDA0003265595920000803
[化学式5]
Figure BDA0003265595920000811
[化学式6]
Figure BDA0003265595920000812
[化学式7]
Figure BDA0003265595920000813
低分子化合物
本公开中应用的术语“低分子化合物”指生物体中存在的除“生物体高分子”以外的天然来源的化学物质或者非天然来源的化学物质。作为低分子化合物，列举例如，天然存在、或者人工合成的分子量为10000以下的化合物，优选地分子量为1000以下的化合物，但不限于这些。作为低分子化合物的非限定的方案，可例示例如，癌组织特异性化合物、炎症组织特异性的化合物、非天然化合物。
癌组织特异性化合物
本说明书中应用的术语“癌组织特异性化合物(癌组织特异化合物)”指与非癌组织比较在癌组织中差异地存在的化合物。
例如，在多个实施方式中，对癌组织特异性化合物而言，可以是由定性的癌组织特异性所规定的化合物，所述定性的癌组织特异性为存在于癌组织但不存在于非癌组织中，或者不存在于癌组织但存在于非癌组织中等。在其它的实施方式中，癌组织特异性化合物可以是由定量的癌组织特异性所规定的化合物，所述定量的癌组织特异性为以与非癌组织相比为不同浓度(例如，高浓度或低浓度)存在于癌组织中等。例如，癌组织特异性化合物以任意浓度差异地存在。但通常，癌组织特异性化合物可以以增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍、或其以上，至无限大(即，于非癌组织中不存在的情形)的浓度存在；或者通常可以以减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或直至至少100％(即，表示不存在)的浓度存在。优选癌组织特异性化合物以统计学上显著的浓度(即，以使用Welch's t检验或Wilcoxon秩和检验中的任一者来确定的方式，p值为小于0.05和/或q值为小于0.10)差异地存在。作为癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，可示例下述化合物，其是由如下所述的癌组织所含的癌细胞、免疫细胞、基质细胞特有的代谢活性所产生的癌组织特异性代谢产物(癌组织特异性代谢产物；癌细胞特异性代谢产物、浸润于癌组织的免疫细胞特异性代谢产物、癌基质细胞特异性代谢产物。
癌组织特异性代谢产物
术语“代谢”是指在生物的组织内产生的化学变化，包括“同化”和“异化”。同化是指分子的生物合成或积累，异化是指分子的分解。“代谢产物”是起因于物质代谢的中间体或生成物。“一次代谢产物”是指与细胞或生物的成长或者繁殖的过程直接相关的代谢产物；“二次代谢产物”是指与它们的成长或者繁殖的过程不直接相关，而是生物合成与细胞或生物中共同的生命现象不直接相关的物质的代谢结果所产生的抗生素或色素等产物。代谢产物可以是“生物高分子”的代谢产物，也可以是“低分子”的代谢产物。“生物高分子”是包含一种以上的重复单元的高分子。生物高分子通常见于生物系统，可举出：分子量为大约5000以上的分子，所述分子形成生物的细胞和粘附于其的细胞间基质、组织间基质等结构物，特别是多糖类(碳水化物等)和肽(该术语以包括多肽和蛋白的方式使用)和多核苷酸、同样地，它们的类似物、例如由氨基酸类似物或者非氨基酸基团构成的化合物，或者含有氨基酸类似物或者非氨基酸基团的化合物。
作为本说明书中记载的非限定的一个方案的癌组织特异性代谢产物，可优选举出癌细胞特异性的低分子代谢产物(Eva Gottfried,Katrin Peter and Marina P.Kreutz,From Molecular to Modular Tumor Therapy(2010)3(2)，111-132)。进一步，也包括浸润于癌组织的免疫细胞所大量产生的代谢产物或支持癌细胞的生存和/或成长的基质细胞(癌基质细胞或癌间质成纤维细胞(CAF))所大量产生的代谢产物。作为浸润的免疫细胞，可示例树突细胞、抑制性树突细胞、抑制性T细胞、耗竭性T细胞(exhausted T cell)、骨髓系来源的抑制细胞(myeloma derived suppressor cell、MDSC)等。另外，本发明的代谢产物中还包括存在于癌组织的细胞(癌细胞、免疫细胞、基质细胞)由于凋亡、坏死等而发生细胞死亡时从细胞内释放至细胞外的化合物。
为了鉴定癌细胞特异性代谢产物，除了转录组水平的分析(例如，可例示Dhanasekaran等(Nature(2001)412，822-826)、Lapointe等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2004)101,811-816或Perou等(Nature(2000)406,747-752等)或者蛋白质组水平的分析(例如，Ahram等(Mol.Carcinog.(2002)33,9-15、Hood等(Mol.Cell.Proteomics(2005)4，1741-1753)之外，还适宜使用以代谢学轮廓分析为中心的代谢学(Metabolomics)分析。即，为了鉴定被测试样中的代谢产物，可以使用单独和/或组合使用高压液相色谱(HPLC)、核磁共振(NMR)(Brindle等(J.Mol.Recognit.(1997)10，182-187)、质谱法(Gates及Sweeley(Clin.Chem.(1978)24,1663-1673)(GC/MS及LC/MS))和ELISA等的代谢学轮廓分析。
通过这些研究阐明，因使癌细胞能够在低的氧压条件下生长的代谢产物(例如葡萄糖或氧)和生长因子的浓度梯度发生改变而构成的肿瘤内的异质性(Dang及Semenza(Trends Biochem.Sci.(1999)24,68-72))。在这些研究中，为了理解肿瘤的恶性度的不同程度所致的能量利用通路的变化，也使用了细胞株模型(Vizan等(Cancer Res.(2005)65,5512-5515)。作为代谢学平台技术的构成要素的非限定的一个方案，可例示Lawton等(Pharmacogenomics(2008)9,383)中记载的试样提取、分离、检出、分光分析、数据标准化、类特异性代谢产物的描述、通路测绘、确认、和候补代谢产物的功能性表征。通过这些方法可以鉴定所期望的癌组织中的癌细胞特异性代谢产物。
炎症组织特异性化合物
本说明书中使用的术语“炎症组织特异性的化合物(炎症组织特异性化合物)”是指与非炎症组织相比，在炎症组织中差异地存在的化合物。本说明书中，例如如下示例性举出“炎症组织”。
·风湿性关节炎、变形性关节炎中的关节
·支气管哮喘、COPD中的肺(肺胞)
·炎性肠疾病、克隆病、溃疡性结肠炎中的消化器官
·肝脏、肾脏、肺的纤维化病中的纤维化组织
·脏器移植中的发生了排斥反应的组织
·动脉硬化、心力衰竭中的血管、心脏(心肌)
·代谢综合征中的内脏脂肪
·特应性皮炎等皮炎中的皮肤组织
·椎间盘脱出、慢性腰痛中的脊髓神经
炎症组织特异性代谢产物
炎症组织特异性代谢产物是指浸润于炎性组织的免疫细胞大量产生的代谢产物、和在炎症组织中受伤的正常细胞特异性地大量产生的代谢产物。作为浸润的免疫细胞，可例示效应T细胞、成熟树突细胞、嗜中性粒细胞、颗粒细胞(肥大细胞)、嗜碱性粒细胞等。另外，本发明中的代谢产物还包括：炎症组织中存在的细胞(免疫细胞、正常细胞)由于凋亡、坏死等而发生细胞死亡时从细胞内释放至细胞外的化合物。
本说明书中使用的术语“非天然化合物”是指非天然来源的化学物质和其代谢物。作为发明的一个方案，是具有在从生物体外施用至生物体内后在靶组织聚集的性质的非天然来源的化学物质和其代谢物。作为非天然化合物，可例示(1)卡培他滨(Capecitabine(Xeloda))和作为其代谢物的5-FU(fluorouracil，氟尿嘧啶)、以及(2)TH-302和溴化异磷酰胺氮芥(Br-IPM)等。5-FU是卡培他滨(Capecitabine(Xeloda))的代谢物，已知由作为癌组织特异性代谢酶的胞苷脱氨酶与胸苷磷酸化酶所代谢(Desmoulin F.et al.Drug MetabDispos.2002)。另外，还已知TH-302通过如在癌组织周边那样的低氧条件下被还原而转换为Br-IPM(Duan JX,et al.J Med Chem.2008)。例如，在施用卡培他滨(capecitabine(xeloda))时，由于被癌特异性代谢酶等代谢为5-FU，因而癌局部的5-FU的浓度变高(Desmoulin F.et al.Drug Metab Dispos.2002)，所以认为通过以5-FU为开关的抗体，可以仅在癌局部选择性地与靶抗原结合。另外，除了代谢酶以外，认为还可以使用由于在癌特异性的低氧环境、酸性环境条件下而生成的分子作为开关。例如，TH-302(Duan JX,et al.JMed Chem.2008)在低氧条件下被代谢为Br-IPM，因而认为利用以Br-IPM为开关的抗体，可以仅在癌局部选择性地与靶抗原结合。例如，作为将非天然化合物施用至生物体的方法，可举出口服施用，滴眼施用、透皮施用、经鼻施用、经静脉施用、经肺施用等公知的施用方法，但不限于这些。
作为本公开中低分子化合物的非限定性方案，可例示例如，MTA、SAM、SAH、腺苷、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)等。
作为本公开中低分子化合物的非限定性方案，进一步示例以下的化合物：
(1)乳酸、琥珀酸、柠檬酸等糖酵解系统、或柠檬酸循环的一次代谢产物
作为本发明中使用的低分子化合物、或癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出乳酸、琥珀酸、柠檬酸等与在存在于周围的非癌部组织相比，在癌组织中以更高浓度存在的葡萄糖代谢的结果生成的一次代谢产物。一直以来，已知就表征为丙酮酸激酶、己糖激酶、和乳酸脱氢酶(LDH)等糖酵解系统(Embden-Myerhof通路)酶的向上调节(上调)的糖酵解系统表现型而言，作为瓦伯格效应是实体瘤的特征。
即，认为在肿瘤细胞中，并非M1同种型，而是在厌氧条件下的糖酵解(erobicglycolysis)所需的M2同种型的丙酮酸激酶的高表达对于生物体内的肿瘤细胞的生长起有利作用(Christofk等(Nature(2008)452,230-233)。由丙酮酸激酶生成的丙酮酸受到乳酸的反馈抑制，该乳酸是厌氧条件下的乳酸脱氢酶(LDH)的平衡反应的结果生成的。据称通过该反馈抑制引起线粒体中的呼吸(柠檬酸循环)的促进、和细胞增殖抑制，因此LDH、己糖激酶、和葡萄糖转运体(GLUT)的向上调节对于肿瘤细胞的增殖起到重要作用(Fantin等(Cancer Cell(2006)9,425-434))。据说葡萄糖通过糖酵解系统而代谢，其最终代谢产物乳酸与质子一起被共同输送至肿瘤的周围，结果肿瘤周边组织的pH变为酸性条件。已知糖酵解系统的最终产物乳酸、因线粒体中的呼吸的促进而生成的琥珀酸和柠檬酸在癌组织中积累(Teresa等(Mol.Cancer(2009)8,41-59))。作为本发明中所使用的低分子化合物、癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出通过这样的糖酵解系统的代谢而生成的一次代谢产物即乳酸、琥珀酸、柠檬酸等。此外，还已知由于细胞死亡，在细胞内以高浓度存在的琥珀酸漏出至细胞外(Nature Immunology,(2008)9,1261-1269)。因此认为在细胞死亡频繁发生的癌组织中，琥珀酸的浓度是上升的。
(2)丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸
已知除了上述的葡萄糖代谢以外，在需要连续供给对于厌氧条件下的生物高分子的生物合成而言所需的必需氨基酸和非必需氨基酸的肿瘤细胞中，氨基酸代谢也在变化。谷氨酰胺是在其侧链含有二个氮的作为氮转运体作用的，在生物体中分布最广泛的氨基酸。谷氨酰胺向细胞内摄入的速度上升的肿瘤细胞据称作为谷氨酰胺陷阱(glutaminetrap)发挥作用。这种谷氨酰胺的摄入和向谷氨酸和乳酸转换的活性的上升被称作“谷氨酰胺分解(glutaminolysis)”，被认为是经转化的(肿瘤)细胞的特征(Mazurek及Eigenbrodt(Anticancer Res.(2003)23,1149-1154、以及Mazurek等(J.Cell.Physiol.(1999)181,136-146))。其结果，癌患者表现出血浆中谷氨酰胺的水平的减少，另一方面表现出谷氨酸浓度的增加(Droge等(Immunobiology(1987)174,473-479)。继而，通过肺癌组织的经13C放射标记的葡萄糖的代谢研究，在13C标记琥珀酸、13C标记丙氨酸、13C标记谷氨酸、及13C标记柠檬酸的浓度间观察到相关。作为本发明中所使用的低分子化合物、癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，优选可举出通过这种谷氨酰胺分解等而在癌组织中以高浓度积累的丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等。
(3)犬尿氨酸(kynurenine)等氨基酸的代谢产物
吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)是在黑素瘤、结肠癌、和肾癌等许多癌中高表达的色氨酸代谢酶(Uyttenhove等(Nat.Med.(2003)9，1269-127)，已知存在二个同种型(Lob等(CancerImmunol.Immunother.(2009)58,153-157))。IDO催化色氨酸转换为犬尿氨酸(以下述式表示)，是烟酰胺核苷酸(NAD)的从头合成通路的最初的酶。此外，在不表达IDO的神经胶质瘤中，通过肝脏的色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)而由色氨酸生成犬尿氨酸(Opitz等(Nature(2011)478,7368,197-203))。另外IDO在浸润于癌组织的树突细胞中也有表达，树突细胞也产生犬尿氨酸(J.Immunol.(2008)181,5396-5404)。另外，IDO在癌组织的骨髓系来源的抑制细胞(MDSC)中也有表达，MDSC也产生犬尿氨酸(Yu等(J.Immunol.(2013)190，3783-3797))。
[化学式8]
Figure BDA0003265595920000881
已知犬尿氨酸抑制同种T细胞应答(Frumento等(J.Exp.Med.(2002)196,459-468)，并且提出下述机制，其中，肿瘤细胞通过上述抑制避开抗肿瘤免疫应答，同时通过犬尿氨酸作为表达于神经胶质瘤的芳烃受体的内源性配体发挥作用的自分泌增殖机制，神经胶质瘤细胞的增殖得到促进(Opitz等(同上所述))。犬尿氨酸通过犬尿氨酸酶转变为邻氨基苯甲酸(由下述式表示)，及通过犬尿氨酸3-羟化酶转变为3-羟基犬尿氨酸(由下述式表示)。邻氨基苯甲酸和3-羟基犬尿氨酸均转变为形成NAD的前体的3-羟基邻氨基苯甲酸。
[化学式9]
Figure BDA0003265595920000882
[化学式10]
Figure BDA0003265595920000883
犬尿氨酸通过犬尿氨酸氨基转移酶转变为犬尿酸(由下述式表示)。作为本发明中使用的低分子化合物、癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物的非限定的一个方案，优选可举出这种犬尿氨酸，及其代谢产物，即邻氨基苯甲酸、3-羟基犬尿氨酸、和犬尿酸等氨基酸的代谢产物。
[化学式11]
Figure BDA0003265595920000891
(4)前列腺素E2(Prostaglandin E2)等花生四烯酸的代谢产物
前列腺素E2(PGE2)(由下述式表示)是包含由环氧合酶(COX)-1/2合成的前列腺素和血栓烷的前列腺素类的被称作花生四烯酸的代谢物(Warner及Mitchell(FASEB J.(2004)18,790-804))。促进PGE2结肠癌细胞的增殖，并抑制其凋亡(Sheng等(Cancer Res.(1998)58,362-366))。已知在许多癌细胞中，环氧合酶的表达是变化的。即，主要发现了COX-1几乎在所有的组织中构成性地表达，而与之相对，COX-2在肿瘤中通过某种炎性细胞因子和癌基因被诱导(Warner及Mitchell(同前所述))。还报道了COX-2的过表达与乳腺癌的预后不良(Denkert等(Clin.Breast Cancer(2004)4,428-433)、和卵巢癌的急速疾病进展(Denker等(Mod.Pathol.(2006)19,1261-1269)有关联性。另外，浸润于癌组织的抑制性T细胞也产生前列腺素E2(Curr.Med.Chem.(2011)18,5217-5223)。已知花生四烯酸的代谢物的前列腺素、白细胞三烯等低分子化合物作为控制癌的自分泌和/或旁分泌性增殖的刺激因子起作用(Nat.Rev.Cancer(2012)12(11)782-792)。作为本发明中使用的低分子化合物、癌组织特异性化合物、特别是癌细胞特异性代谢产物或浸润于癌组织的免疫细胞特异性代谢物的非限定的一个方案，优选可举出这种前列腺素E2等花生四烯酸的代谢产物。除了前列腺素E2以外，血栓烷A2(TXA2)在大肠癌等癌组织中的产生是亢进的(J.Lab.Clin.Med.(1993)122,518-523)，可作为本发明的花生四烯酸的代谢产物的非限定的一个方案而优选列举。
[化学式12]
Figure BDA0003265595920000901
另外，已知在风湿性关节炎、变形性关节炎中，PGE2浓度高(Eur.J.Clin.Pharmacol.(1994)46,3-7.、Clin.Exp.Rheumatol.(1999)17,151-160、Am.J.Vet.Res.(2004)65,1269-1275.)。作为本发明中使用的低分子化合物、炎症组织特异性的化合物、特别是炎症细胞特异性代谢产物、浸润于炎症组织的免疫细胞特异性代谢物的非限定的一个方案，优选可举出这种前列腺素E2等花生四烯酸的代谢产物。
(5)腺苷、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)等具有嘌呤环结 构的核苷
已知若癌细胞发生细胞死亡则细胞内的大量ATP漏出至细胞外。因此，癌组织中的ATP浓度与正常组织相比显著地高(PLoS One.(2008)3,e2599)。多种类型的细胞逸出ATP、ADP和AMP类型的腺嘌呤核苷酸。经由细胞外-5'-核苷酸酶(eco-5'-nucleotidase)(CD73)之类的细胞表面的细胞外酶代谢(Resta和Thompson(Immunol.Rev.(1998)161,95-109)以及Sadej等(Melanoma Res.(2006)16，213-222)。腺苷是以低浓度在细胞外环境构成性地存在的嘌呤核苷，报道了在发现于实体癌的低氧组织中，细胞外腺苷浓度的显著增加(Blay和Hoskin(Cancer Res.(1997)57,2602-2605)。CD73表达于肿瘤和免疫细胞的表面(Kobie等(J.Immunol.(2006)177,6780-6786)，在乳腺癌(Canbolat等(Breast Cancer Res.Treat.(1996)37,189-193)、胃癌(Durak等(Cancer Lett.(1994)84,199-202)、胰腺癌(Flocke和Mannherz(Biochim.Biophys.Acta(1991)1076,273-281)和成胶质细胞瘤(Bardot等(Br.J.Cancer(1994)70,212-218))中观察到活性的上升。有提出对癌组织中的腺苷的积累而言，可能起因于细胞质的5'-核苷酸酶所致的AMP的脱磷酸而引起的细胞内腺苷生成增加(Headrick和Willis(Biochem.J.(1989)261,541-550)。进一步，浸润于癌组织的抑制性T细胞等也表达ATP分解酶，从而产生腺苷(Proc.Natl.Acad.Sci.(2006)103(35),13132-13137、Curr.Med.Chem.(2011)18,5217-5223)。认为产生的腺苷通过A2A受体等腺苷受体而使癌组织成为免疫抑制性环境(Curr.Med.Chem.(2011),18,5217-23)。作为本发明中使用的低分子化合物、癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢在癌组织中以高浓度积累的ATP、ADP、AMP、或腺苷等。进一步，腺苷通过腺苷脱氨酶分解为肌苷，因而肌苷以高浓度积累。
另外，已知在发生了起因于支气管哮喘的炎症的肺胞中，ATP的浓度高(Nat.Med.(2007)13,913-919)。另外，还已知在发生了起因于COPD的炎症的肺胞中，ATP的浓度高(Am.J.Respir.Crit.Care Med.(2010)181，928-934)。另外，观察到在风湿性关节炎患者的关节液中腺苷的浓度高(Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis(2004)36 877-882)。进一步，已知在因GVHD而发生了排斥反应的组织中ATP的浓度高(Nat.Med.(2010)16，1434-1438)。另外，还已知在肺、肝脏、肾脏的纤维化组织中，腺苷的浓度亢进(FASEB J.(2008)22,2263-2272、J.Immunol.(2006)176,4449-4458、J.Am.Soc.Nephrol.(2011)22(5),890-901、PLoS ONE J.(2010)5(2),e9242)。另外观察到在肺纤维症患者的纤维化组织中ATP的浓度上升(Am.J.Respir.Crit.Care Med.(2010)182,774-783)。作为本发明中使用的低分子化合物、炎症性组织特异性的化合物的非限定的一个方案，优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢在炎症组织中以高浓度积累的ATP、ADP、AMP或腺苷等。进一步，腺苷被腺苷脱氨酶分解为肌苷，因而肌苷以高浓度积累。
(6)尿酸
尿酸是生物体内的嘌呤核苷的代谢途径的产物，且游离于血液或间质腔等的细胞外。另外，近年来已明确从癌组织等病变部位存在的死细胞游离出尿酸(Nat.Med.(2007)13,851-856)。作为本发明中使用的低分子化合物、癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，还优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢而在癌组织中以高浓度积累的尿酸。
另外，近年来已明确从进行坏死(necrosis)的细胞游离出的尿酸促进炎性应答(J.Clin.Invest.(2010)120(6)，1939-1949)。作为本发明中使用的低分子化合物、炎症组织特异性的化合物的非限定的一个方案，还优选可举出通过这种ATP等嘌呤核苷酸的代谢而在炎性组织中以高浓度积累的尿酸。
(7)1-甲基烟酰胺
已知在多个人癌组织中，酶烟酰胺N-甲基转移酶有高表达。本酶由烟酰胺产生稳定代谢物1-甲基烟酰胺时，会消耗作为甲基供体的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基，因此提出通过伴随癌细胞中SAM浓度的减少的损害DNA的甲基化能力的机制，烟酰胺N-甲基转移酶的高表达有助于肿瘤化(tumorigenesis)(Ulanovskaya等(Nat.Chem.Biol.(2013)9(5)300-306))。已知该酶的稳定代谢产物1-甲基烟酰胺分泌至癌细胞的细胞外(Yamada等(J.Nutr.Sci.Vitaminol.(2010)56,83-86))，作为本发明中使用的低分子化合物、癌组织特异性化合物的非限定的一个方案，还优选可举出这种通过烟酰胺的代谢而在癌组织以高浓度积累的1-甲基烟酰胺等。
本公开中的低分子化合物能够与抗原结合分子相互作用。能够与低分子化合物相互作用的抗原结合分子中的氨基酸残基可以存在于抗原结合分子中的抗原结合结构域，也可以存在于抗原结合结构域以外的位点。作为抗原结合分子中与低分子化合物相互作用的位点，可例示抗原结合结构域，但不限于此。
与抗原特异性结合的抗原结合结构域
本说明书中，“与抗原特异性结合的抗原结合结构域”用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位为特异性的情形。另外，当抗原结合结构域所结合的表位包含在多个不同的抗原中时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子能够与含有该表位的各种抗原结合。此处，不实质性地结合是指按照上述结合活性一项所记载的方法确定，特异性结合分子对于前述对象分子以外的分子的结合活性显示为：结合活性为相对于前述对象分子的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选30％以下、特别优选15％以下。在抗原结合结构域为针对抗原的结合活性依赖于MTA或除了MTA以外的低分子化合物而变化的抗原结合结构域的情形中，对该抗原结合结构域针对抗原的结合而言，在该抗原结合结构域针对抗原的结合活性高的条件(例如，MTA的特定浓度下或MTA不存在下、MTA以外的低分子化合物的特定浓度下或除了MTA以外的低分子化合物不存在下)下测定。
抗原结合活性及抗原结合活性的确认方法
术语“结合活性(binding activity)”指分子(例如，抗体)的1个或其以上的结合位点与分子的结合配偶(例如，抗原)之间非共价结合的相互作用的合计强度。此处，“结合活性(binding activity)”不严格限于某结合对的成员(例如，抗体与抗原)间的1：1相互作用。例如，结合对的成员反映1价的1：1相互作用时，结合活性指固有的结合亲和力(“affinity”)。当结合对的成员可为1价的结合及多价的结合两者时，结合活性为这些的结合力的总和。分子X对其配偶Y的结合活性通常可以通过解离常数(KD)或“每单位配体量的分析物结合量”表示。结合活性可通过包含本说明书中记载的那种的，该技术领域中已知的通常方法测定。除了靶组织特异性的化合物的浓度以外的条件，可以由本领域技术人员适宜确定。
关于用于测定结合活性的具体的实例及示例性的方案，在下面陈述。
抗原结合分子的结合活性
在特定的方案中，本说明书中提供的抗原结合分子是抗体，抗体的结合活性(binding activity)是≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M以下，例如10-8M～10-13M，例如10-9M～10-13M)的解离常数(KD)。
在一个方案中，抗体的结合活性(binding activity)应用以表面等离子共振分析法为测定原理的、使用例如BIACORE(注册商标)T200或BIACORE(注册商标)4000(GEHealthcare,Uppsala,瑞典)的配体捕获法。机器操作应用BIACORE(注册商标)ControlSoftware。在一个方案中，按照供应商的指示使用胺偶联法试剂盒(GE Healthcare,Uppsala，瑞典)，将用于配体捕获的分子例如抗标签抗体、抗IgG抗体、蛋白A等固相化在涂覆了羧甲基葡聚糖的传感器芯片(GE Healthcare,Uppsala,瑞典)中。将配体捕获分子用合适pH的10mM乙酸钠溶液稀释，以合适的流速及注入时间注入。结合活性测定使用含有0.05％聚山梨醇酯20(另外的名称为Tween(注册商标)-20)的缓冲液作为测定用缓冲液，以流速10-30μL/分、测定温度优选地25℃、37℃进行测定。在用于进行配体捕获的分子将抗体作为配体捕获而实施测定时，注入抗体并捕获目的量后，注入了使用用于测定的缓冲液制备的抗原和/或Fc受体的梯度稀释物(分析物)。在用于进行配体捕获的分子作为配体而捕获抗原及或Fc受体而实施测定时，注入抗原及或Fc受体并捕获了目的量后，注入使用用于测定的缓冲液制备的抗体的梯度稀释物(分析物)。
在一个方案中，应用BIACORE(注册商标)评价软件分析测定结果。对动力学参数(kinetics parameter)算出而言，应用了1:1结合的模型，通过同时拟合结合及解离的传感图而实施，可以计算结合速度(kon或者ka)、解离速度(koff或者kd)、平衡解离常数(KD)。当结合活性弱、特别是解离快、难于算出动力学参数时，也可以应用稳态模型计算平衡解离常数(KD)。作为结合活性的其它参数，也可算出特定浓度的分析物的结合量(RU)除以配体的捕获量(RU)而成的“每单位配体量的分析物结合量”。
在一个方案中，抗体的结合活性可以通过以生物膜层干涉(Bio-LayerInterferometry,BLI)法为测定原理的例如Octet RED96e系统或Octet RED 384系统(PallForteBio)等测定。通过按照供应商的指示使用，可以进行抗原抗体反应的定性的结合特性分析、动力学分析。作为具体的测定方法的非限定的一个方案，可以通过在Protein A(ProA)生物芯片(Pall ForteBio)中使抗体固相化后，以抗原为分析物相互作用测定抗体抗原间的结合量的变化。例如，测定在MTA存在下与抗原结合的抗体与抗原的结合量时，作为结合相，可以在用以终浓度0、10、100μM的浓度添加了MTA的20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4稀释的包含3000nM的分析物的缓冲液中测定抗体与分析物的结合反应，作为解离相，可以通过应用与不含分析物的结合相同样的缓冲液测定抗体与分析物的解离反应。进一步，作为解离相，通过应用包含与结合相为同浓度的分析物、不含MTA的缓冲液，能够对MTA存在下抗体与抗原的结合在不存在MTA的条件下可逆地解离进行经时观察。
作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型分子时可以使用kd(解离速度常数)，在抗原为膜型分子时可以使用表观kd(Apparent dissociation rate constant：表观解离速度常数)。kd(解离速度常数)、和表观kd(表观解离速度常数)可通过本领域技术人员公知的方法测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、流式细胞仪等。
当被测抗原结合分子包含针对抗原的结合活性依赖于低分子化合物而变化的抗原结合结构域，在测定所述被测抗原结合分子针对抗原的结合活性时，被测抗原结合分子与抗原的相互作用可以在低分子化合物的特定浓度下或者不存在下进行。
在特定的低分子化合物不存在的条件不显示抗原结合活性的抗原结合分子在该低分子化合物存在下显示该针对抗原的结合活性时，结合活性可以在该低分子化合物存在下评价。同样地，在特定的低分子化合物存在下不显示针对抗原的结合活性、在该低分子化合物不存在下显示该针对抗原的结合活性时，结合活性可以在该低分子化合物不存在下评价。当在特定的低分子化合物以低浓度存在的条件的抗原结合活性高于该低分子化合物以高浓度存在的条件的抗原结合活性时，结合活性可以在该低分子化合物以高浓度存在的条件评价。同样地，在特定的低分子化合物以高浓度存在的条件的抗原结合活性低于该低分子化合物以低浓度存在的条件的抗原结合活性时，结合活性可以在该低分子化合物以低浓度存在的条件评价。对于抗原与抗原结合分子的结合活性赋予影响的条件而言，不限于低分子化合物存在下/不存在下、该低分子化合物的浓度，可示例离子浓度、离子组成或温度等，但不限于这些。进一步，也当然可以在前述不同多个因子进行组合的条件下评价结合活性。
表位
意指存在于抗原中的抗原决定基的表位意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。本公开中抗原结合分子所结合的抗原上的位点可以通过评价该抗原结合分子的结合的有无来定义。
表位可通过其结构来定义。另外，也可以通过对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原的结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来精确确定表位。另外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来精确确定表位。
线性表位是下述表位，其包含氨基酸一级序列得到识别的表位。在固有序列中，线性表位典型地含有至少3个氨基酸，和最普通地含有至少5个，例如约8至约10个，6至20个氨基酸。
与线性表位相对，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位的氨基酸的一级序列并非是被识别表位的单一规定成分(例如，表位中，氨基酸的一级序列并不必须被规定表位的抗体所识别)。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体对肽或蛋白质的三维结构进行识别。例如，蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链变得并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法包括例如：X射线结晶学、二维核磁共振分光学以及位点特异性自旋标记和电子顺磁共振分光学，但并不限定于此。例如，参考Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology(1996)、第66卷、Morris(编)。
与表位结合的抗原结合结构域的结构被称为互补位。表位和互补位通过在表位和互补位之间发生作用的氢键、静电力、范德华力、疏水键等稳定地结合。该表位与互补位之间的结合力被称为亲和力(affinity)。多个抗原与多个抗原结合分子结合时的结合力的总和被称为亲合力(avidity)。包含多个抗原结合结构域的(即多价的)抗体等与多个表位结合时，结合力(affinity)协同地发挥作用，因此亲合力比亲和力高。
以下示例了确认由含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子进行的与表位的结合的方法，而确认由含有针对除IL-6R以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子进行的与表位的结合的方法也可基于下述示例而适宜实施。
例如，含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别存在于IL-6R分子中的线性表位可例如如下确认。为了上述目的，合成了包含构成IL-6R的细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。该肽可化学性地合成。或者，可以利用IL-6R的cDNA中编码相当于细胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因工程方法得到。接着，对包含构成细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽与含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子之间的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于在该抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合中的由线性肽造成的抑制水平，可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。
另外，对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对立体结构表位进行识别而言，可以如下所述来确认。为了上述目的制备了表达IL-6R的细胞。可举出：含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子在与IL-6R表达细胞接触时强烈地与该细胞结合，另一方面该抗原结合分子不与经固定化的包含构成IL-6R细胞外结构域的氨基酸序列的线性肽实质性地结合的情形等。此处，不实质性地结合是指，对人IL-6R表达细胞的结合活性的80％以下、通常50％以下、优选30％以下、特别优选15％以下的结合活性。
作为测定含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性的方法，可举出例如：Antibodies ALaboratory Manual记载的方法(EdHarlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988)359-420)。即，可通过以IL-6R表达细胞为抗原的ELISA或FACS(荧光激活细胞分选，fluorescence activated cellsorting)的原理来进行评价。
在ELISA形式中，对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性而言，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地评价。即，将被测多肽复合体添加至固定有IL-6R表达细胞的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体，检出与细胞结合的被测抗原结合分子。或者在FACS中，制备被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于IL-6R表达细胞的抗体结合效价(titer)，由此可以比较被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性。
被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测出。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置。
FACSCantoTM II
FACSAriaTM
FACSArrayTM
FACSVantageTM SE
FACSCaliburTM(均为BD Biosciences公司的商品名)
EPICS ALTRA HyPerSort
Cytomics FC 500
EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为Beckman Coulter公司的商品名)。
例如，作为含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子对抗原的结合活性的优选测定方法的一个实例，可举出以下方法。首先，将表达IL-6R的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分子用合适的缓冲液适宜稀释，由此将该抗原结合分子制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接着，通过FACSCalibur(BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST Software(BD公司)进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。
与相同表位结合的抗体
对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子与某抗原结合分子共有表位而言，可通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优选的交叉阻断试验。
具体地，在交叉阻断试验中，将包被于微量滴定板的孔上的IL-6R蛋白在候选竞争抗原结合分子的存在下、或不存在下孵育后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IL-6R蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对包被有IL-6R蛋白的孔的结合活性越降低。
经由IL-6R蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子可通过使用亲和素过氧化酶缀合物和合适的底物而测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标记物质进行标记。具体地，放射标记或荧光标记等是公知的。
与在候选竞争抗原结合分子复合体的不存在条件下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20％、优选至少20-50％、进一步优选至少50％的含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质性地结合于相同表位、或者针对相同的表位的结合进行竞争的抗原结合分子。
在鉴定含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，对被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表位而言，能够通过比较两抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入了氨基酸突变而得的肽的结合活性进行评价。
作为这种测定结合活性的方法，可通过例如，在前述ELISA形式中，比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为除了ELISA以外的方法，也可以通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，从而测定对结合于该柱的该突变肽的结合活性。使突变肽以例如与GST的融合肽形式而吸附于柱的方法是公知的。
另外，鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表位可通过以下方法来评价。首先，制备表达IL-6R的细胞和表达在表位中导入了突变的IL-6R的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，向用合适的缓冲液洗涤后所得细胞悬浮液添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur(BD公司)来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10μg/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELLQUEST Software(BD公司)进行分析而得的荧光强度、即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。
本方法中，例如“不与突变IL-6R表达细胞实质性地结合”可通过以下方法判断。首先，将与表达突变IL-6R的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子用标记抗体染色。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中作为流式细胞仪使用FACSCalibur时，所得的荧光强度可以使用CELL QUEST Software进行分析。由多肽复合体存在下和不存在下的几何平均值，通过下述式1计算该比较值(ΔGeo-Mean)，由此可以求出抗原结合分子的结合造成的荧光强度的增加比例。
(式1)
ΔGeo-Mean＝Geo-Mean(多肽复合体存在下)/Geo-Mean(多肽复合体不存在下)
将通过分析得到的、反映被测抗原结合分子对突变IL-6R表达细胞的结合量的几何平均比较值(突变IL-6R分子ΔGeo-Mean值)，与反映被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合量的ΔGeo-Mean比较值进行比较。此时，对求相对于突变IL-6R表达细胞和IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度而言，特别优选制备为彼此相同或者实质上相同的浓度。将预先确定为识别IL-6R中的表位的抗原结合分子用作对照抗原结合分子。
对被测抗原结合分子相对于突变IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值而言，只要小于被测抗原结合分子相对于IL-6R表达细胞的ΔGeo-Mean比较值的至少80％、优选50％、进一步优选30％、特别优选15％，则认为“不与突变IL-6R表达细胞实质性地结合”。求得Geo-Mean值(几何平均)的计算式记载于CELL QUEST Software User’sGuide(BDbiosciences公司)。通过对比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。
在评价包含针对抗原的结合活性依赖于低分子化合物而变化的抗原结合结构域的被测抗原结合分子间是否竞争/与同一表位结合时，被测抗原结合分子与抗原的相互作用可以在低分子化合物的特定浓度下或者不存在下进行，优选使在被测抗原结合分子间，低分子化合物的浓度条件成为相同。
针对抗原的结合活性依赖于低分子化合物而变化的抗原结合结构域
本说明书中，“针对抗原的结合活性依赖于低分子化合物而变化的抗原结合结构域”意指所述抗原结合结构域在不同低分子化合物浓度存在下，针对与前述低分子化合物不同的分子的抗原，结合活性发生变化的抗原结合结构域。
针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域
本公开中针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域是在MTA浓度的不同条件下，针对与MTA不同的分子的抗原的结合活性不同的抗原结合结构域。这些抗原结合结构域所结合的抗原可以是膜型分子，也可以是可溶型分子。另外，这些抗原结合结构域所结合的抗原是在疾病组织中表达的抗原，更优选地在癌组织中表达的抗原，进一步优选地在有MTA积累的癌组织中表达的抗原。在癌组织中表达的抗原可以是表达于癌细胞的抗原，也可以是由癌组织中的癌间质细胞、免疫组织表达的抗原。
作为针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的非限定的一个实例，可以示例：在MTA存在下针对抗原的结合活性比MTA不存在下针对抗原的结合活性强的抗原结合结构域，以及在MTA存在下针对抗原的结合活性比前述抗原结合结构域在不存在MTA的条件下针对抗原的结合活性弱的抗原结合结构域。
只要对本公开的MTA存在下的抗原结合活性比MTA不存在下的抗原结合活性强的抗原结合结构域而言，其在MTA不存在下的针对抗原的结合活性比MTA存在下的针对抗原的结合活性弱，则对在MTA不存在下针对抗原的结合活性与MTA存在下针对抗原的结合活性的比没有特别限定，优选地，针对抗原的MTA不存在下的KD(Dissociation constant：解离常数)与存在下的KD的比即KD(MTA不存在下)/KD(MTA存在下)的值是2以上，进一步优选地KD(MTA不存在下)/KD(MTA存在下)的值是10以上，进一步优选地KD(MTA不存在下)/KD(MTA存在下)的值是40以上。KD(MTA不存在下)/KD(MTA存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制备，则可以为400、1000、10000等任意值。当在不存在MTA的条件下未观察到针对抗原的结合活性时，该上限是无限大的数值。
在MTA存在下针对抗原的结合活性比MTA不存在下针对抗原的结合活性强的抗原结合结构域中，包含在MTA不存在下不与抗原实质性地结合的抗原结合结构域。
只要对本公开的MTA存在下的抗原结合活性比MTA不存在下的抗原结合活性弱的抗原结合结构域而言，其在MTA不存在下的针对抗原的结合活性比MTA存在下的针对抗原的结合活性强，则对在MTA不存在下针对抗原的结合活性与MTA存在下针对抗原的结合活性的比没有特别限定，优选地，针对抗原的MTA存在下的KD(Dissociation constant：解离常数)与不存在下的KD的比即KD(MTA存在下)/KD(MTA不存在下)的值是2以上，进一步优选地10以上，进一步优选地40以上。KD(MTA存在下)/KD(MTA不存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制备，则可以为400、1000、10000等任意值。当在MTA存在下未观察到针对抗原的结合活性时，该上限是无限大的数值。
当MTA存在下针对抗原的结合活性比前述抗原结合结构域在不存在MTA的条件下的针对抗原的结合活性弱的抗原结合结构域的情形中，包含在MTA存在下不与抗原实质性地结合的抗原结合结构域。
另外，作为显示本公开的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)在MTA不存在下针对抗原的结合活性与存在下针对抗原的结合活性的比的其它指标，例如，也可以适宜使用解离速度常数kd(Dissociation rate constant：解离速度常数)。替代KD(解离常数)而使用kd(解离速度常数)来作为表示结合活性之比的指标时，在MTA不存在下针对抗原的kd(解离速度常数)与MTA存在下的kd(解离速度常数)的比、即kd(MTA不存在下)/kd(MTA存在下)的值，优选地是2以上，进一步优选地5以上，进一步优选地10以上，更优选地30以上。Kd(MTA不存在下)/kd(MTA存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制备，则可以为50、100、200等任意值。当MTA不存在下，由于在未观察到抗原结合活性时解离也不发生，故该上限为无限大的数值。
在MTA存在下的条件可以设定适宜的MTA浓度，作为非限定的一个实例，可以将例如100μM的MTA存在的条件视为MTA存在下的条件。另外，作为本公开中记载为“MTA存在下”的MTA浓度的非限定的一个方案，可以适用作为后述区别MTA的低浓度及高浓度的阈值而示例的浓度。
作为针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的非限定的一个实例，可例示高浓度MTA存在下的抗原结合活性比低浓度的MTA存在下的抗原结合活性强的抗原结合结构域，高浓度的MTA存在下的抗原结合活性比低浓度的MTA存在下的抗原结合活性弱的抗原结合结构域。
只要对本公开的高浓度的MTA存在下的抗原结合活性比低浓度的MTA存在下的抗原结合活性强的抗原结合结构域而言，其在MTA低浓度存在下针对抗原的结合活性比MTA高浓度存在下针对抗原的结合活性弱，则对在MTA低浓度存在下针对抗原的结合活性与在MTA高浓度存在下针对抗原的结合活性的比没有特别限定，但优选地，针对抗原的在MTA低浓度存在下的KD(Dissociation constant：解离常数)与在高浓度存在下的KD的比即KD(MTA低浓度存在下)/KD(MTA高浓度存在下)的值是2以上，进一步优选地，KD(MTA低浓度存在下)/KD(MTA高浓度存在下)的值是10以上，进一步优选地，KD(MTA低浓度存在下)/KD(MTA高浓度存在下)的值是40以上。KD(MTA低浓度存在下)/KD(MTA高浓度存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制备，则可以是400、1000、10000等任意值。当在MTA低浓度存在下未观察到针对抗原的结合活性时，该上限是无限大的数值。
高浓度的MTA存在下的抗原结合活性比低浓度的MTA存在下的抗原结合活性强的抗原结合结构域中，包含在低浓度的MTA存在下不与抗原实质性地结合的抗原结合结构域。
只要对本公开的高浓度的MTA存在下的抗原结合活性比低浓度的MTA存在下的抗原结合活性弱的抗原结合结构域而言，其在MTA低浓度存在下针对抗原的结合活性比在MTA高浓度存在下针对抗原的结合活性强，则对在MTA低浓度存在下针对抗原的结合活性与MTA在高浓度存在下针对抗原的结合活性的比没有特别限定，优选地，针对抗原的MTA高浓度存在下的KD(Dissociation constant：解离常数)与低浓度存在下的KD的比即KD(MTA高浓度存在下)/KD(MTA低浓度存在下)的值是2以上，进一步优选地是10以上，进一步优选地是40以上。KD(MTA高浓度存在下)/KD(MTA低浓度存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制备，则可以是400、1000、10000等任意值。在MTA高浓度存在下未观察到针对抗原的结合活性时，该上限是无限大的数值。
在高浓度的MTA存在下的抗原结合活性比低浓度的MTA存在下的抗原结合活性弱的抗原结合结构域中，包含在高浓度的MTA存在下不与抗原实质性地结合的抗原结合结构域。
另外，作为表示本公开的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA低浓度存在下针对抗原的结合活性与高浓度存在下针对抗原的结合活性的比的其它指标，例如，也可以适宜使用解离速度常数kd(Dissociation rate constant：解离速度常数)。使用kd(解离速度常数)替代KD(解离常数)来作为表示结合活性之比的指标时，在MTA低浓度存在下针对抗原的kd(解离速度常数)与MTA高浓度存在下的kd(解离速度常数)的比、即kd(MTA低浓度存在下)/kd(MTA高浓度存在下)的值优选地是2以上，进一步优选地是5以上，进一步优选地是10以上，更优选地是30以上。Kd(MTA低浓度存在下)/kd(MTA高浓度存在下)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制备，则可以是50、100、200等任意值。在MTA低浓度存在下未观察到针对抗原的结合活性时，由于解离也不发生，故该上限为无限大的数值。
作为评价结合活性的方法，除了上述测定KD值的方法以外，也可以应用评价相对结合活性的方法。作为这样的非限定的方法的一个实例，通常已知应用流式细胞仪、ELISA、毛细管电泳、或液相色谱等的方法，但不限于这些。另外，例如，通过以Biacore算出KD值的抗原结合结合分子作为参考分子进行比较，即使存在无法直接算出KD值的情况，也可以评价被测分子比参考分子的结合活性强、或者结合活性弱这样的相对结合活性。
在区别MTA的低浓度及高浓度的阈值的非限定的一个方案中，作为阈值，低浓度条件可以由10nM、1nM、100pM、10pM、1pM或0M的值中适宜设定。对应于所设定的阈值，高浓度条件可以由各阈值的至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少103倍、至少104倍、至少105倍、至少106倍的值中适宜设定。
作为本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的非限定的一个方案，可列举该抗原结合结构域的针对抗原的结合活性不被选自腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM、AMP、ADP、ATP中的一个或多个低分子化合物实质性地影响的抗原结合结构域。此处，前述腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM、AMP、ADP、ATP在分子中具有腺苷作为共同骨架，是与MTA类似的化合物。认为本公开中抗原结合结构域的针对抗原的结合活性不被这些类似分子的存在实质性地影响，结合活性仅依赖于MTA而变化的抗原结合分子通常难以获得。然而，本公开中，构建了如后述各种实施例示例性记载的用于获得依赖于MTA与抗体结合的抗体的文库，筛选该文库，由此成功获得了具有优异的MTA依赖特异性的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域MTA特异性依赖地与抗原结合，且不显示对于具有与MTA类似的结构的低分子化合物为依赖性的抗原结合。
本说明书中，“针对抗原的结合活性不被低分子化合物实质性地影响”指该低分子化合物存在下抗原结合结构域的抗原结合活性与该低分子化合物不存在下抗原结合结构域的抗原结合活性是彼此的至少0.5倍～2倍。
在非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性不被腺苷实质性地影响。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性不被S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)实质性地影响。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性不被SAM实质性地影响。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性不被腺苷、AMP、ADP、ATP中的任一种实质性地影响。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性不被腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)中的任一种实质性地影响。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性不被腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM中的任一种实质性地影响。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性不被腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM、AMP、ADP、ATP中的任一种实质性地影响。
作为本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的非限定的一个方案，可列举针对抗原的结合活性也依赖于选自腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM、AMP、ADP、ATP中的一个或多个低分子化合物而变化的抗原结合结构域。
在非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性也依赖于腺苷而变化。对于结合活性依赖于MTA与腺苷两个分子而变化的抗原结合结构域，虽然不受特定理论拘束，可以理解的是，针对抗原的结合活性是通过与MTA和腺苷两个分子中共同的结构相互作用，而由此变化的。该情形中，即使在评价结合活性的溶剂中MTA的浓度减少，而腺苷的浓度以超出由MTA浓度减少引起的结合活性降低的程度的浓度存在时，可能结合活性得到维持，或者可以被检测到较强。另外，在即使在评价结合活性的溶剂中MTA的浓度增加，而腺苷的浓度降低超过了由MTA浓度增加引起的结合活性增加的程度时，可能结合活性得以维持，或者可以被检测到较低。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性也依赖于S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)变化。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性也依赖于SAM变化。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性也依赖于腺苷、AMP、ADP、ATP中的任一种而变化。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性也依赖于腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)中的任一种而变化。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性也依赖于腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM中的任一种而变化。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合活性也依赖于腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM、AMP、ADP、ATP中的任一种而变化。
作为本公开中针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的非限定的一个方案，可例示包含抗体可变区或/和单结构域抗体的抗原结合结构域。
作为非限定的一个方案，可示例下列抗原结合分子：本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自下述氨基酸的组中的至少一个以上的氨基酸。(Kabat编号)：
位于重链30位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链31位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链32位的A；
位于重链33位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链34位的W；
位于重链35位的M；
位于重链35a位的C；
位于重链50位的C；
位于重链51位的I；
位于重链52位的F；
位于重链52a位的A；
位于重链52b位的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V中的任一种；
位于重链52c位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链52d位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链52e位的Y；
位于重链52f位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链52g位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链53位的S；
位于重链54位的G；
位于重链55位的G；
位于重链56位的S；
位于重链57位的T；
位于重链58位的Y；
位于重链59位的Y；
位于重链60位的A；
位于重链61位的S；
位于重链62位的W；
位于重链63位的A；
位于重链64位的K；
位于重链65位的G；
位于重链95位的G；
位于重链96位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链97位的G；
位于重链98位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链99位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链100位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链100a位的G；
位于重链100b位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链100c位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链101位的E；
位于重链102位的L；
位于轻链24位的Q；
位于轻链25位的S；
位于轻链26位的S；
位于轻链27位的E；
位于轻链27a位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链28位的V；
位于轻链29位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链30位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链31位的A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T或V中的任一种；
位于轻链32位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链33位的L；
位于轻链34位的S；
位于轻链49位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链50位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链51位的A；
位于轻链52位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链53位的T；
位于轻链54位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链55位的P；
位于轻链56位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链89位的A；
位于轻链90位的G；
位于轻链91位的L；
位于轻链92位的Y；
位于轻链93位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链94位的G；
位于轻链95位的N；
位于轻链95a位的I；
位于轻链96位的P；
位于轻链97位的A。
作为非限定的其它的方案，可示例下列抗原结合分子：本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区可示例包含选自下述氨基酸中的至少一个以上的氨基酸。(Kabat编号)：
位于重链31位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链32位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链33位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链34位的W；
位于重链35位的M；
位于重链35a位的C；
位于重链50位的C；
位于重链51位的I；
位于重链52位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链52a位的S；
位于重链53位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链54位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链55位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链56位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链57位的T；
位于重链58位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链59位的Y；
位于重链60位的A；
位于重链61位的S；
位于重链62位的W；
位于重链63位的V；
位于重链64位的N；
位于重链65位的G；
位于重链95位的E；
位于重链96位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链97位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链98位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链99位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链100位的S；
位于重链100a位的G；
位于重链100b位的A；
位于重链100c位的L；
位于重链101位的N；
位于重链102位的L；
位于轻链24位的H；
位于轻链25位的S；
位于轻链26位的S；
位于轻链27位的K；
位于轻链27a位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链27b位的V；
位于轻链28位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链29位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链30位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链31位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链32位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链33位的L；
位于轻链34位的A；
位于轻链49位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链50位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链51位的A；
位于轻链52位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链53位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链54位的L；
位于轻链55位的A；
位于轻链56位的S；
位于轻链89位的Q；
位于轻链90位的G；
位于轻链91位的T；
位于轻链92位的Y；
位于轻链93位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链94位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95a位的A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95b位的F；
位于轻链95c位的Y；
位于轻链96位的F；
位于轻链97位的A。
作为非限定的进一步方案，可示例下列抗原结合分子：本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区可示例包含选自下述氨基酸中的至少一个以上的氨基酸。(Kabat编号)：
位于重链26位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链28位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链29位的A或L中的任一种；
位于重链30位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链31位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链32位的D、E、F、H、N、P、R或Y中的任一种；
位于重链33位的A、I、P、T或V中的任一种；
位于重链34位的A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链35位的G；
位于重链50位的D、I或V中的任一种；
位于重链51位的I；
位于重链52位的G；
位于重链53位的A、D、E、G,I、K、Q或R中的任一种；
位于重链54位的D、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链55位的A、D、E、F、G或H中的任一种；
位于重链56位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链57位的A、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T或V中的任一种；
位于重链58位的W；
位于重链59位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链60位的P；
位于重链61位的A、F、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链62位的W；
位于重链63位的V；
位于重链64位的K；
位于重链65位的A、F或G；
位于重链95位的G；
位于重链96位的A、E、F、G、H、K、L、Q、R、S、T、W或Y中的任一种；
位于重链97位的A、F、H、K、N、W或Y中的任一种；
位于重链98位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于重链99位的A、D、E、G、H、Q或S中的任一种；
位于重链100位的F或Y；
位于重链100a位的N、T或V
位于重链100b位的N；
位于重链100c位的A；
位于重链100d位的F或W；
位于重链101位的D；
位于重链102位的P；
位于轻链24位的Q；
位于轻链25位的S；
位于轻链26位的S；
位于轻链27位的Q；
位于轻链27e位的S；
位于轻链27f位的V；
位于轻链28位的A、E、F、H、I、K、L、N、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链29位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链30位的N；
位于轻链31位的N；
位于轻链32位的A、E、F、G、H、S或Y中的任一种；
位于轻链33位的L；
位于轻链34位的S；
位于轻链50位的D；
位于轻链51位的A；
位于轻链52位的S；
位于轻链53位的T；
位于轻链54位的L；
位于轻链55位的A；
位于轻链56位的S；
位于轻链89位的H；
位于轻链90位的G；
位于轻链91位的A、S或T中的任一种；
位于轻链92位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链93位的A、D、E、F、G、H、L、N、Q、R、S、T、V或Y中的任一种；
位于轻链94位的A、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95a位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95b位的A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链95c位的A、F、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y中的任一种；
位于轻链96d位的D；
位于轻链96位的N；
位于轻链97位的A或G；
位于轻链98位的A、F、I、L或V。
本公开中抗原结合结构域可以具有与MTA相互作用的氨基酸残基。与MTA相互作用的氨基酸残基可以在与抗原结合结构域中的抗原直接相互作用的界面存在，也可以在除其以外的部分存在。“与抗原直接相互作用的界面”指通过结晶结构分析等手法分析的抗原与抗原结合结构域的复合体的结构中，抗原与抗原结合分子彼此接近的位点。作为前述抗原与抗原结合分子彼此接近的距离，可以示例
Figure BDA0003265595920001181
的距离，在抗原与抗原结合分子的复合体的结构中，“抗原与抗原结合分子彼此接近”指复合体中相对接近的位点，不限于前述示例的距离。与MTA相互作用的氨基酸残基可以是抗原结合分子与抗原结合状态中与MTA相互作用的残基，也可以是在抗原不存在状态中与MTA相互作用的残基。进一步，与MTA相互作用的氨基酸残基可以是在抗原结合分子与抗原结合的状态、抗原不存在的状态中都与MTA相互作用的残基。另外，与MTA相互作用的氨基酸残基可以是抗原结合结构域中的仅1个残基，也可以存在多个残基。
在抗原结合结构域包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区的方案中，与MTA相互作用的氨基酸在抗体可变区中可以在CDR中存在，也可以在FR中存在。在抗原结合结构域包含单结构域抗体的方案中，与MTA相互作用的氨基酸在单结构域抗体中可以在CDR中存在，也可以在FR中存在。
抗原结合结构域中与MTA相互作用的氨基酸残基可以通过MTA与包含抗原结合结构域的抗原结合分子二者的复合体、或MTA、抗原、包含抗原结合结构域的抗原结合分子的三者复合体的结晶结构分析、使用NMR的立体结构分析、或氨基酸的突变导入等方法来鉴定。
作为本公开的非限定的一个方案，可以根据MTA与抗原结合分子二者的复合体的结晶结构分析来鉴定与MTA相互作用的抗原结合分子的氨基酸残基。此处，“与MTA相互作用”是指：形成抗原结合分子的氨基酸中的侧链或主链的原子，以能够对MTA结合活性造成效果的距离与低分子化合物的原子形成抗原结合分子-MTA间相互作用的状态，或者在抗原结合分子中的抗原结合结构域包含抗体重链可变区及抗体轻链可变区的方案中，某氨基酸残基有助于MTA的结合(包括使CDR环等的立体结构稳定，稳定至MTA结合时的构型等间接性影响)的状态，以及满足这两者的状态。
对于本说明书中“形成分子间相互作用的状态”，例如，可以根据MTA与抗原结合分子二者的复合体的结晶结构分析，基于构成形成抗原结合分子的氨基酸的侧链或主链的非氢原子与构成MTA的非氢原子的原子间距离来判定。例如，上述原子间距离优选为
Figure BDA0003265595920001191
Figure BDA0003265595920001192
或者
Figure BDA0003265595920001193
以内，但并不限定于此。进一步优选上述原子间距离为
Figure BDA0003265595920001194
Figure BDA0003265595920001195
或者
Figure BDA0003265595920001196
以内。
更具体地，基于立体结构上的原子间距离与所形成的分子间相互作用的种类以及原子的种类的信息，可以判定发生了直接相互作用的可能性。为了进一步准确，可以根据突变为Ala或Gly等氨基酸残基的突变导入对低分子化合物的活性造成的影响而进行判断，但并不限定于此。
对于本说明书中的“间接性影响的状态”，例如，也可以通过根据MTA与抗原结合分子二者的复合体的立体结构详细分析各氨基酸残基的构型、与周围残基的分子间相互作用的状况，从而推定是否间接性影响了MTA的结合，为了进一步准确，可以根据突变为Ala或Gly等氨基酸残基的突变导入对MTA的活性造成的影响而进行判断。
作为本公开的非限定的一个方案，可以根据MTA、抗原、抗原结合分子三者的复合体的结晶结构分析来鉴定与MTA相互作用的抗原结合分子的氨基酸残基。此处，“与MTA相互作用”是指：形成抗原结合分子的氨基酸中的侧链或主链的原子，在抗原存在下以能够对MTA结合活性造成效果的距离与低分子化合物的原子形成抗原结合分子-MTA间相互作用的状态，或者在抗原结合分子中的抗原结合结构域包含抗体重链可变区及抗体轻链可变区的方案中，某氨基酸残基有助于MTA的结合(包括使CDR环等的立体结构在抗原存在下稳定，稳定至MTA结合时的构型等间接性影响)的状态，以及满足这两者的状态。
对于本说明书中“形成分子间相互作用的状态”，例如，可以根据MTA、抗原、抗原结合分子三者的复合体的结晶结构分析，在抗原存在下基于构成形成抗原结合分子的氨基酸的侧链或主链的非氢原子与构成MTA的非氢原子的原子间距离来判定。例如，上述原子间距离优选为
Figure BDA0003265595920001201
Figure BDA0003265595920001202
或者
Figure BDA0003265595920001203
以内，但并不限定于此。进一步优选的上述原子间距离为
Figure BDA0003265595920001204
或者
Figure BDA0003265595920001205
以内。
更具体地，基于立体结构上的原子间距离与所形成的分子间相互作用的种类以及原子的种类的信息，可以判定发生了直接相互作用的可能性。为了进一步准确，可以根据突变为Ala或Gly等氨基酸残基的突变导入对低分子化合物的活性造成的影响而进行判断，但并不限定于此。
对于本说明书中的“间接性影响的状态”，例如，也可以通过根据MTA、抗原、抗原结合分子三者的复合体的立体结构详细分析各氨基酸残基的构型、与周围残基的分子间相互作用的状況，从而推定是否间接性影响了在抗原存在下MTA的结合，为了进一步准确，可以根据突变为Ala或Gly等氨基酸残基的突变导入对MTA的活性造成的影响而进行判断。
作为非限定的一个方案，可示例下列抗原结合结构域：抗原结合结构域是抗体可变区，前述与MTA相互作用的氨基酸残基是前述抗体可变区的氨基酸序列中、位于选自Kabat编号精确确定的重链34位、35a位、47位、52位、52e位、101位、轻链32位、34位、36位、46位、49位、50位、89位、90位、91位及96位的氨基酸位点的至少一个以上的氨基酸位点的氨基酸残基。
作为非限定的一个方案，可例示下列抗原结合结构域：前述抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自重链W34、C35a、W47、F52、Y52e、E101、轻链R32、S34、Y36、L46、Y49、S50、A89、G90、L91、及P96(Kabat编号)中的至少一个以上的氨基酸。
另外，作为非限定的一个方案，可示例下列抗原结合结构域：抗原结合结构域是抗体可变区，与MTA相互作用的氨基酸残基是前述抗体可变区的氨基酸序列中、位于选自Kabat编号精确确定的重链34位、47位、50位、58位、95位、98位、99位、100a位、轻链28位、91位、95b位、95c位及96位的氨基酸位点的至少一个以上的氨基酸位点的氨基酸残基。
作为非限定的一个方案，可例示下列抗原结合结构域：前述抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自重链W34、W47、C50、Y58、E95、F98、G99、G100a、轻链Y28、T91、F95b、Y95c、及F96(Kabat编号)中的至少一个以上的氨基酸。
另外，作为与MTA相互作用的抗原结合结构域的非限定的一个方案，可示例下列抗原结合结构域：前述抗原结合结构域是抗体可变区，前述与MTA相互作用的氨基酸残基是前述抗体可变区的氨基酸序列中、位于选自Kabat编号精确确定的重链33位、50位、52位、54位、56位、57位、58位、99位、100位、100a位、91位、95c位、及96位的氨基酸位点的至少一个以上的氨基酸位点的氨基酸残基。
另外，可示例下列抗原结合结构域：前述抗原结合结构域是抗体可变区，该抗体可变区包含选自重链A33、I50、G52、D54、S56、T57、W58、G99、Y100、T100a、轻链S91、Y95c、及N96(Kabat编号)中的至少一个以上的氨基酸。
包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子
在非限定的一个方案中，本公开中包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子是包含抗体Fc区的分子。本公开的抗原结合分子中包含的抗体Fc区可以是天然型Fc区，也可以是经改变的Fc区。作为天然型Fc区，可例示由人IgG1(SEQ ID NO:5)、IgG2(SEQ ID NO:6)、IgG3(SEQ ID NO:7)、或IgG4(SEQ ID NO:8)表示的Fc区。
本发明的抗原结合分子可包含介导Fcγ受体结合和/或FcRn结合的Fc区的至少一部分。例如，在非限定的一个方案中，抗原结合分子可以是抗体或Fc融合蛋白。融合蛋白是指包含含有第一氨基酸序列的多肽的嵌合多肽，该含有第一氨基酸序列的多肽与在天然情况下不会自然连接的具有第二氨基酸序列的多肽连接。例如，融合蛋白可以包括多肽，该多肽包含编码Fc区的至少一部分(例如，赋予与Fcγ受体结合的Fc区部分和/或赋予与FcRn结合的Fc区部分)的氨基酸序列。氨基酸序列可存在于一起转移到融合蛋白中的各个蛋白中、或者它们通常可存在于同一蛋白中，但会进入融合多肽中的新的重组中。融合蛋白例如可通过化学合成来制作，或通过制作以所期望的关系编码肽区的多核苷酸并将表达其的基因进行重组的方法来制作。
本公开的抗原结合分子中的各结构域可以通过多肽键直接连接，也可经由接头连接。作为接头，可以使用能通过基因工程导入的任意肽接头、或合成化合物接头(例如，Holliger等(Protein Engineering(1996)9(3),299-305))中公开的接头等，本公开中优选肽接头。肽接头的长度没有特别限定，本领域技术人员可根据目的适当选择，优选长度为5个氨基酸以上(上限没有特别限定，通常为30个氨基酸以下，优选20个氨基酸以下)，特别优选为15个氨基酸。
例如，在肽接头的情形中，优选可举出：
Ser
Gly·Ser
Gly·Gly·Ser
Ser·Gly·Gly
Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:19)
Ser·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:20)
Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:21)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:22)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:23)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:24)
Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:25)
Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly(SEQ ID NO:26)
(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser(SEQ ID NO:21))n
(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly(序列编号22))n
[n为1以上的整数]等。其中，本领域技术人员根据目的可以适当选择肽接头的长度或序列。
合成化学物接头(化学交联剂)是通常用于肽的交联的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、辛二酸双(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代双(丙酸琥珀酰亚胺酯)(DSP)、二硫代双(丙酸磺基琥珀酰亚胺酯)(DTSSP)、乙二醇双(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)(EGS)、乙二醇双(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺酯)(磺基-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-DST)、双[2-(琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基-BSOCOES)等，这些交联剂有市售。
使用多个连接各结构域的接头时，可全部使用同种的接头，也可使用不同种的接头。此外，除了上述记载中示例的接头之外，也可适当使用例如具有His标签、HA标签、myc标签、FLAG标签等肽标签的接头。此外，也可优选利用通过氢键、二硫键、共价键、离子性相互作用或这些键的组合而相互结合的性质。例如，利用抗体的CH1与CL间的亲和性，或者在异源Fc区缔合时利用以上述双特异性抗体为来源的Fc区。此外，还可优选利用在结构域间形成的二硫键。
为了通过肽键连接各结构域，将编码该结构域的多核苷酸进行框内连接。作为将多核苷酸进行框内连接的方法，限制性片段的连接或融合PCR、重叠PCR等方法是公知的，在本公开的抗原结合分子的制备中也可适宜单独或组合使用这些方法。本公开中，术语“被连接”、“被融合”、“连接”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过包括上述化学结合方法或重组方法在内的所有方法来连接两个以上的多肽等组分或成分以形成一个结构。框内融合是指，在两个以上的组分(element)或成分为多肽时，以维持该多肽的正确阅读框的方式连接的、用于形成更长的阅读框的两个以上的阅读框单位的连接。将二分子的Fab用作抗原结合结构域时，对该抗原结合结构域与包含Fc区的恒定区不是经由接头而是通过肽键进行框内连接而成的作为本公开的抗原结合分子的抗体而言，可以作为本公开的优选抗原结合分子来使用。
在其它的情形中，本公开提供具有高血浆中滞留性的抗原结合分子。在某些情形中，该抗原结合分子随着MTA的浓度增高而抗原结合活性增加。在某些方案中，与非靶组织中的抗原结合活性相比，该抗原结合分子在靶组织中的抗原结合活性更高。在几种情形中，抗原结合分子是抗体。不限于特定的理论，但上述的血浆中的动态的变化可以如下解释。随着抗原结合分子依赖于MTA的浓度的抗原结合活性提高，该抗原结合分子在靶组织以外的组织中的抗原结合能力降低。其结果，该抗原结合分子在靶组织以外的组织中的抗原依赖性的消失(清除)成为降低。在生物体内的大部分组织(除靶组织以外的组织)中，抗原依赖性的消失(清除)降低从总体看来与该抗原结合分子的高血浆中滞留性相关。
本发明中抗原结合分子是否具有高血浆中滞留性的判断可以通过与作为对照的抗原结合分子的相对比较来进行。在几个方案中，与作为对照的抗原结合分子相比，随着MTA的浓度提高而抗原结合活性增加的抗原结合分子具有高血浆中滞留性。在一个方案中，作为对照的抗原结合分子是不具有依赖于MTA的浓度的抗原结合活性的抗原结合分子。在特定的方案中，不具有依赖于化合物的浓度的抗原结合活性的抗原结合分子意味着，在MTA存在下与不存在下的抗原结合活性的差是例如小于2倍、小于1.8倍、小于1.5倍、小于1.3倍、小于1.2倍、或小于1.1倍的抗原结合分子。根据比较的观点，期望本公开的抗原结合分子与作为对照的抗原结合分子在足够量MTA的存在下，抗原结合活性彼此实质性地相等。
此处，认为生物体内检测的抗原结合分子的抗原依赖性消失的大小相应于血浆中存在的抗原与抗原结合分子的量的平衡而变化。一般认为，血浆中存在的抗原越多/抗原结合分子越少，抗原结合分子的抗原依赖性的消失越容易检测，相反，血浆中存在的抗原越少/抗原结合分子越多，抗原结合分子的抗原依赖性的消失越难检测。本公开的抗原结合分子不必在所有条件显示高血浆中滞留性，在检测足够的抗原依赖性消失的合适条件下显示高血浆中滞留性即可。在血浆中的抗原量少的情形中，也可以通过任何人为手段增加抗原量，然后评价血浆中滞留性。
其它的情形中，本发明提供血浆中抗原积累能力低的抗原结合分子。在进一步的情形中，该抗原结合分子随着MTA的浓度提高抗原结合活性增加。在特定的方案中，MTA是靶组织特异性的化合物。在进一步的方案中，与非靶组织中的抗原结合活性相比，该抗原结合分子在靶组织中的抗原结合活性更高。在几种情形中，抗原结合分子是抗体。不限于特定的理论，上述的血浆中的动态变化可以如下解释。随着抗原结合分子依赖于MTA的浓度抗原结合活性提高，该抗原结合分子在靶组织以外的组织中的抗原结合能力降低。其结果，该抗原结合分子在靶组织以外的组织中形成抗原-抗体复合体的能力降低。一般地，已知抗体等抗原结合分子一旦与抗原结合，则抗原的清除降低，血浆中的抗原浓度升高(抗原积累)。在生物体内的大部分组织(除靶组织以外的组织)中，抗原-抗体复合体的形成能力降低从总体看来与抗原的低积累(换言之，抗原结合分子的抗原积累能力低)相关。对本发明中抗原结合分子的血浆中抗原积累能力是否低的判断而言，可以通过与作为对照的抗原结合分子的相对比较进行。在几个方案中，与作为对照的抗原结合分子相比，随着MTA的浓度提高而抗原结合活性增加的抗原结合分子的血浆中抗原积累能力低。在一个方案中，作为对照的抗原结合分子是不具有依赖于MTA的浓度的抗原结合活性的抗原结合分子。在特定的方案中，不具有依赖于MTA的浓度的抗原结合活性的抗原结合分子意味着，在该化合物存在下与不存在下的抗原结合活性的差例如小于2倍、小于1.8倍、小于1.5倍、小于1.3倍、小于1.2倍、或小于1.1倍的抗原结合分子。根据比较的观点，期望本发明的抗原结合分子与作为对照的抗原结合分子在足够量化合物的存在下，抗原结合活性彼此实质性地相等。
此处，认为生物体内形成的抗原-抗体复合体的量依赖于血浆中存在的抗原及抗体的量。一般地，认为血浆中的抗原、抗体量越增加，形成的抗原-抗体复合体量也增加，相反，血浆中的抗原、抗体量越减少，形成的抗原-抗体复合体量也减少。本发明的抗原结合分子不必在所有条件下显示低的血浆中抗原积累能力，在形成足够的抗原-抗体复合体的合适的条件下显示低的血浆中抗原积累能力即可。在血浆中的抗原量少的情形中，也可以通过任何人为手段增加抗原量，然后评价血浆中滞留性。
Fcγ受体(FcγR)
Fcγ受体(也记为FcγR)是指可与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体Fc区结合的受体，实质上指Fcγ受体基因所编码的蛋白家族的任意成员。就人而言，该家族包含：包括同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131。即，FcγRIIa(H)和FcγRIIa(R))、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158。即，FcγRIIIa(V)和FcγRIIIa(F))和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)；以及任何未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限定于此。FcγR可来源于任意的生物，包括人、小鼠、大鼠、兔和猴，但并不限定于此。小鼠FcγR类中包括：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(FcγRIV、CD16-2)、以及任意的未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限定于此。作为这种Fcγ受体的优选实例，可举出：人FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、FcγRIIb(CD32)、FcγRIIIa(CD16)和/或FcγRIIIb(CD16)。人FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：9(NM_000566.3)和10(NP_000557.1)中；人FcγRIIa(同种异型H131)的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：11(BC020823.1)和12(AAH20823.1)(同种异型R131是SEQ ID NO：12的166位的氨基酸被置换为Arg的序列)中；FcγRIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：13(BC146678.1)和14(AAI46679.1)中；FcγRIIIa的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：15(BC033678.1)和16(AAH33678.1)中；和FcγRIIIb的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO：17(BC128562.1)和18(AAI28563.1)中(括号内示出RefSeq等数据库注册编号)。Fcγ受体对IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区是否具有结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选(Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay)或利用表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103(11),4005-4010)。
包括FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)以及包括同种型FcγRIIIa(含有同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(含有同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)中，与IgG的Fc区结合的α链和具有在细胞内传导活化信号的ITAM的共有γ链缀合。另一方面，包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)自身的细胞质结构域中含有ITAM。这些受体表达于巨噬细胞、肥大细胞、抗原呈递细胞等众多免疫细胞。通过这些受体与IgG的Fc区结合而传递的活化信号使得巨噬细胞吞噬能力、炎性细胞因子的产生、肥大细胞的脱粒、抗原呈递细胞的功能亢进受到促进。如上所述，具有传导活化信号能力的Fcγ受体在本说明书中也称为活性型Fcγ受体。
另一方面，在FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)自身的细胞质内结构域中含有传递抑制型信号的ITIM。B细胞中，FcγRIIb和B细胞受体(BCR)的交联使得来自BCR的活化信号受到抑制，结果BCR的抗体产生受到抑制。巨噬细胞中，FcγRIII与FcγRIIb的交联使得吞噬能力和炎性细胞因子的产生能力受到抑制。如上所述，具有传导抑制信号能力的Fcγ受体在本说明书中也称为抑制型Fcγ受体。
Fc区对FcγR的结合活性
如上所述，作为本公开的抗原结合分子所含的Fc区，可举出具有Fcγ受体结合活性的Fc区。作为这种Fc区的非限定的一个方案，可例示人IgG1(SEQ ID NO:5)、IgG2(SEQ IDNO:6)、IgG3(SEQ ID NO:7)、或IgG4(SEQ ID NO:8)所示的Fc区。Fcγ受体对IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区是否具有结合活性，除了上述记载的FACS或ELISA形式之外，还可通过ALPHA筛选(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)或利用表面等离子共振(SPR)现象的BIACORE法等来确认(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103(11),4005-4010)。
ALPHA筛选是通过使用供体和受体这2种珠的ALPHA技术基于下述原理来实施。仅在结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子发生生物学相互作用，2种珠接近的状态时可检测出发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周围的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散至供体珠周围，到达接近的受体珠时，引起珠内的化学发光反应，最终发出光。结合于供体珠的分子和结合于受体珠的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不会到达受体珠，因而不会引起化学发光反应。
例如，将含有经生物素标记的Fc区的抗原结合分子与供体珠结合，将经谷胱甘肽S转移酶(GST)标签化的Fcγ受体与受体珠结合。在包含竞争的Fc区改变体的抗原结合分子的非存在下，具有天然型Fc区的抗原结合分子与Fcγ受体发生相互作用，产生520-620nm的信号。含有没有标签的Fc区改变体的抗原结合分子与具有天然型Fc区的抗原结合分子竞争与Fcγ受体间的相互作用。通过对反映竞争结果的荧光的减少进行定量，可以确定相对结合亲和性。使用Sulfo-NHS-生物素等来将抗体等抗原结合分子生物素化是公知的。作为用GST将Fcγ受体标签化的方法，可适宜地采用下述方法：将编码Fcγ受体的多核苷酸和编码GST的多核苷酸进行框内融合而成的融合基因可操作地与载体连接，在保持有该载体的细胞等中进行表达，使用谷胱甘肽柱来进行纯化。所得的信号可以通过使用例如GRAPHPADPRISM(GraphPad公司、San Diego)等软件，与利用非线性回归分析的单位点竞争(one-sitecompetition)模型拟合而适宜地分析。
将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感器芯片的金薄膜上，若从传感器芯片的背侧照射光以使在金薄膜和玻璃的界面发生全反射，则反射光的一部分会形成反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(分析物)加载于传感器芯片的表面，配体和分析物若结合，则固定的配体分子的质量增加，传感器芯片表面的溶剂的折射率发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生偏移(shift)(相反，若结合发生解离，则信号的位置会返回)。Biacore系统将上述偏移的量、即传感器芯片表面的质量变化作为纵轴，将质量的时间变化作为测定数据表示(传感图)。由传感图的曲线可求出动力学参数：结合速度常数(ka)和解离速度常数(kd)，由此该常数之比可求出亲和性(KD)。BIACORE法中还优选使用抑制测定法。抑制测定法的实例记载在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(2006)103(11),4005-4010中。
Fcγ受体(FcγR)结合改变Fc区
作为本公开所含的Fc区，除了人IgG1(SEQ ID NO:5)、IgG2(SEQ ID NO:6)、IgG3(SEQ ID NO:7)、或IgG4(SEQ ID NO:8)所示的Fc区之外，还可适宜使用FcγR结合改变Fc区，所述FcγR结合改变Fc区的Fcγ受体结合活性高于天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性。本说明书中，“天然型人IgG的Fc区”意指与SEQ ID NO:5、6、7或8所示的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc区的EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链的Fc区。这种FcγR结合改变Fc区可通过改变天然型人IgG的Fc区的氨基酸来制作。FcγR结合改变Fc区的FcγR结合活性是否比天然型人IgG的Fc区的FcγR结合活性高，这可以采用上述结合活性一项中记载的方法来适当实施。
本公开中，Fc区的“氨基酸的改变”或“氨基酸改变”包括改变成与起始Fc区的氨基酸序列不同的氨基酸序列。只要起始Fc区的修饰改变体可以在pH中性范围与人Fcγ受体结合，则可使用任何Fc区作为起始Fc区。此外，将已进行了改变的Fc区作为起始Fc区并进一步进行了改变而得到的Fc区也可优选用作本公开的Fc区。起始Fc区可指多肽自身、含有起始Fc区的组合物或编码起始Fc区的氨基酸序列。起始Fc区可包括抗体一项中概述的通过重组产生的公知的Fc区。起始Fc区的起源没有限定，可以由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、和非人灵长类中的生物。在其它方案中，起始Fc区还可由食蟹猴、狨猴、恒河猴、黑猩猩、或人中获得。优选起始Fc区可由人IgG1获得，但不限于IgG的特定类别。这意味着可以适宜使用人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的Fc区来作为起始Fc区。意指同样地，在本说明书中也可以将来源于前述任意生物的IgG的任意种类或亚类的Fc区优选用作起始Fc区。天然存在的IgG的变体或修饰型的实例记载于公知文献(Curr.Opin.Biotechnol.(2009)20(6),685-91、Curr.Opin.Immunol.(2008)20(4),460-470、Protein Eng.Des.Sel.(2010)23(4),195-202、国际公开WO2009/086320、WO2008/092117、WO2007/041635、和WO2006/105338)中，但并不受其限定。
作为改变的实例，包括一个以上的突变，例如置换成与起始Fc区的氨基酸不同的氨基酸残基的突变、或者向起始Fc区的氨基酸中插入一个以上的氨基酸残基或从起始Fc区的氨基酸中缺失一个以上的氨基酸等。优选改变后的Fc区氨基酸序列包含含有非天然产生的Fc区的至少一部分的氨基酸序列。这种变体与起始Fc区必然具有不足100％的序列同一性或相似性。在优选的实施方案中，变体具有与起始Fc区的氨基酸序列为约75％～小于100％的氨基酸序列同一性或类似性、更优选为约80％～小于100％、更优选为约85％～小于100％、更优选为约90％～小于100％、最优选为约95％～小于100％的同一性或类似性的氨基酸序列。在本公开的非限定的一个方案中，起始Fc区和本公开的FcγR结合改变Fc区之间具有至少1个氨基酸的差异。起始Fc区与本公开的FcγR结合改变Fc区的氨基酸的不同可优选通过特别是上述的以EU编号精确确定的氨基酸残基位置的特定氨基酸的不同来鉴定。这种变体的制作方法示例于“氨基酸的改变”一项。
本公开的抗原结合分子所含的、Fcγ受体结合活性高于天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性的FcγR结合改变Fc区(FcγR结合改变Fc区)可通过任意方法获得，具体地，可通过被用作起始Fc区的人IgG型免疫球蛋白的氨基酸的改变来获得该FcγR结合改变Fc区。作为用于改变的优选的IgG型免疫球蛋白的Fc区，可举出例如，SEQ ID NO:5、6、7或8所示的人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4、和它们的改变体)的Fc区。
对于改变为其它氨基酸，只要Fcγ受体结合活性较天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性高，则任何位置的氨基酸均可改变。在抗原结合分子作为人Fc区包含人IgG1的Fc区的情况下，优选包含带来以下效果的改变：Fcγ受体结合活性高于天然型人IgG的Fc区(其中，在EU编号297位结合的糖链为含岩藻糖的糖链)的Fcγ受体结合活性。作为这种氨基酸的改变，例如在国际公开WO2007/024249、WO2007/021841、WO2006/031370、WO2000/042072、WO2004/029207、WO2004/099249、WO2006/105338、WO2007/041635、WO2008/092117、WO2005/070963、WO2006/020114、WO2006/116260和WO2006/023403等中有报道。
对测定本公开的抗原结合分子所含的Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合活性的pH条件而言，可以适宜使用pH酸性范围至pH中性范围的条件。作为测定本公开的抗原结合分子所含的Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合活性的条件的pH酸性范围至pH中性范围，通常意指pH5.8～pH8.0。优选为由pH6.0～pH7.4的任意pH值表示的范围，优选从pH6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3和7.4中选择，特别优选为与癌组织的pH接近的pH6.15～7.4(Vaupel等(Cancer Res.(1989)49，6449-6665))。作为在测定条件中使用的温度，Fcγ受体结合结构域与人Fcγ受体的结合亲和性可在10℃～50℃的任意温度下进行评价。为了确定人Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合亲和性，优选使用15℃～40℃的温度。更优选，诸如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、和35℃中的任一者的20℃至35℃的任意温度也同样用于确定Fcγ受体结合结构域与Fcγ受体的结合亲和性。25℃的温度是本公开的方案的非限定的一个实例。
本说明书中，FcγR结合改变Fc区的Fcγ受体结合活性较天然型Fc区的Fcγ受体结合活性高是指，FcγR结合改变Fc区的FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一者的人Fcγ受体结合活性比天然型Fc区对这些人Fcγ受体的结合活性高。例如，基于上述分析方法，与作为对照的包含人IgG的天然型Fc区的抗原结合分子的结合活性进行比较，包含FcγR结合改变Fc区的抗原结合分子的结合活性显示出105％以上、优选110％以上、115％以上、120％以上、125％以上、特别优选130％以上、135％以上、140％以上、145％以上、150％以上、155％以上、160％以上、165％以上、170％以上、175％以上、180％以上、185％以上、190％以上、195％以上、2倍以上、2.5倍以上、3倍以上、3.5倍以上、4倍以上、4.5倍以上、5倍以上、7.5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、60倍以上、70倍以上、80倍以上、90倍以上、100倍以上的结合活性。作为天然型Fc区，既可以使用起始Fc区，也可以使用相同亚类的抗体的天然型Fc区。
本公开中，作为对照的人IgG的天然型Fc区，优选使用与以EU编号表示的第297位的氨基酸结合的糖链为含岩藻糖的糖链的天然型人IgG的Fc区。对与以EU编号表示的第297位的氨基酸结合的糖链是否为含岩藻糖的糖链而言，可以采用已知的方法(Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeuticantibodies.Satoh M,Iida S,Shitara K.,Expert Opin.Biol.Ther.(2006)6(11),1161-1173)。例如，通过下述的方法，可以判定与天然型人IgG的Fc区结合的糖链是否为含岩藻糖的糖链。通过使N-糖苷酶F(Roche diagnostics)与被测天然型人IgG反应，糖链从被测天然型人IgG中游离出来(Weitzhandler等(J.Pharma.Sciences(1994)83,12,1670-1675)。接着，将与乙醇反应而除去了蛋白的反应液(Schenk等(J.Clin.Investigation(2001)108(11)1687-1695)的浓缩干燥固形物用2-氨基吡啶进行荧光标记(Bigge等(Anal.Biochem.(1995)230(2)229-238)。将经过使用纤维素过滤筒的固相提取进行了脱试剂的、经荧光标记的2-AB化糖链通过正相层析进行分析。通过观察所检测的色谱图的峰，可以判定与人IgG的天然型Fc区结合的糖链是否是含岩藻糖的糖链。
作为对照的包含相同亚类的抗体的天然型Fc区的抗原结合分子，可以适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于SEQ ID NO:5(数据库注册编号AAC82527.1的N末端添加有A)、序列编号6(数据库注册编号AAB59393.1的N末端添加有A)、序列编号7(数据库注册编号CAA27268.1)、及序列编号8(数据库注册编号AAB59394.1的N末端添加有A)。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，来验证包含被测Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
具有选择性Fcγ受体结合活性的Fc区
此外，作为本公开中优选使用的Fcγ受体结合结构域的实例，还优选举出：具有对特定Fcγ受体的结合活性较其它Fcγ受体结合活性高的性质的Fcγ受体结合结构域(具有选择性Fcγ受体结合活性的Fcγ受体结合结构域)。作为抗原结合分子使用抗体(使用Fc区作为Fcγ受体结合结构域)时，由于一分子的抗体只能与一分子的Fcγ受体结合，因此一分子的抗原结合分子在与抑制型Fcγ受体结合的状态下无法与其它活性型FcγR结合，在与活性型Fcγ受体结合的状态下也无法与其它活性型Fcγ受体或抑制型Fcγ受体结合。
对活性型Fcγ受体的结合活性较对抑制型Fcγ受体的结合活性高的Fc区
如上所述，作为活性型Fcγ受体，优选可举出：包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)、包含FcγRIIa以及FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)。此外，作为抑制型Fcγ受体的优选实例，可举出FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)。
本说明书中，作为对特定的Fcγ受体的结合活性较其以外的Fcγ受体结合活性高的实例，可举出例如，对活性型Fcγ受体的结合活性高于对抑制型Fcγ受体的结合活性的情形。此时是指Fc区对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一种人Fcγ受体的结合活性高于对FcγRIIb的结合活性。例如，是指基于上述分析方法，含有Fc区的抗原结合分子对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一种人Fcγ受体的结合活性表现出对FcγRIIb的结合活性的105％以上、优选110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特别优选150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％％以上、250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上的结合活性。对活性型Fcγ受体的结合活性较对抑制型Fcγ受体的结合活性高的Fc区而言，可优选包含在抗原结合结构域与膜型分子结合的本公开的抗原结合分子中。已知含有这种Fc区的IgG1抗体中后述的ADCC活性增强，因此含有该Fc区的抗原结合分子可用作本公开的药物组合物中所含的抗原结合分子。
在本公开的非限定的一个方案中，作为对活性型Fcγ受体的结合活性较对抑制型Fcγ受体的结合活性高(对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性)的Fc区的实例，优选可举出：选自前述以EU编号表示的221位、222位、223位、224位、225位、227位、228位、230位、231位、232位、233位、234位、235位、236位、237位、238位、239位、240位、241位、243位、244位、245位、246位、247位、249位、250位、251位、254位、255位、256位、258位、260位、262位、263位、264位、265位、266位、267位、268位、269位、270位、271位、272位、273位、274位、275位、276位、278位、279位、280位、281位、282位、283位、284位、285位、286位、288位、290位、291位、292位、293位、294位、295位、296位、297位、298位、299位、300位、301位、302位、303位、304位、305位、311位、313位、315位、317位、318位、320位、322位、323位、324位、325位、326位、327位、328位、329位、330位、331位、332位、333位、334位、335位、336位、337位、339位、376位、377位、378位、379位、380位、382位、385位、392位、396位、421位、427位、428位、429位、434位、436位及440位中的至少一个以上的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。
对抑制型Fcγ受体的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高的Fc区
本说明书中，作为对特定Fcγ受体的结合活性较对其以外的Fcγ受体的结合活性高的实例，可举出例如，对抑制型Fcγ受体的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高的情形。此时是指Fc区对FcγRIIb的结合活性较对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一种人Fcγ受体的结合活性高。例如，是指基于上述分析方法，含有Fc区的抗原结合分子对FcγRIIb的结合活性表现出对FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一种人Fcγ受体的结合活性的105％以上、优选110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特别优选150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％％以上、250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以上的结合活性。对抑制型Fcγ受体的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高的Fc区可优选包含在抗原结合结构域与可溶型分子结合的本公开的抗原结合分子中。
在本公开的非限定的一个方案中，作为对抑制型Fcγ受体的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高(对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性)的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的238或328的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。
另外，在本公开的非限定的一个方案中，作为对抑制型Fcγ受体的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高(对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性)的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。此外，作为对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性的Fc区，还可以适宜选择US2009/0136485中记载的Fc区或改变。
另外，在本公开的非限定的一个方案中，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。
进而，在本公开的非限定的一个方案中，可优选举出PCT/JP2012/054624中所示例的改变为下述任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238位的Pro置换为Asp、以及以EU编号表示的237位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Phe、以EU编号表示的267位的氨基酸为Val、以EU编号表示的267位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly、以EU编号表示的326位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的326位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Met、以EU编号表示的239位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的267位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的234位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的234位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的237位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的237位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Met、以EU编号表示的237位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的330位的氨基酸为Lys、以EU编号表示的330位的氨基酸为Arg、以EU编号表示的233位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ser、以EU编号表示的326位的氨基酸为Thr、以EU编号表示的323位的氨基酸为Ile、以EU编号表示的323位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的323位的氨基酸为Met、以EU编号表示的296位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的330位的氨基酸为Met。
糖链经修饰的Fc区
作为本公开所提供的抗原结合分子所含的Fc区，还可包含下述Fc区：其是以与Fc区结合的糖链的组成中结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例变高的方式、或添加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区的比例变高的方式进行了修饰的Fc区。已知若从与抗体Fc区结合的N-糖苷结合复合型糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺除去岩藻糖残基，则对FcγRIIIa的亲和性增强(非专利文献6)。已知含有这种Fc区的IgG1抗体中后述的ADCC活性增强，因此含有该Fc区的抗原结合分子可用作本公开的药物组合物中所含的抗原结合分子。作为从与抗体Fc区结合的N-糖苷结合复合型糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺除去了岩藻糖残基的抗体，例如是如下所述的抗体：
经糖基化修饰的抗体(国际公开WO1999/054342等)、
添加于糖链的岩藻糖缺陷的抗体(国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。
更具体地，作为从与抗体Fc区结合的N-糖苷结合复合型糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺除去了岩藻糖残基的抗体的不同的非限定的一个方案，为了制作添加于糖链的岩藻糖缺陷的抗体(国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)，改变待接受糖链修饰的多肽的形成糖链结构的活性，结果制作对糖链添加岩藻糖的能力低的宿主细胞。通过在该宿主细胞中表达所期望的抗体基因，可以从该宿主细胞的培养液中回收该糖链中的岩藻糖缺陷的该抗体。作为形成多肽的糖链结构的活性，可举出选自下述中的酶或转运体的活性作为非限定的优选实例：岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.152)、岩藻糖转运体(SLC35C1)、GMD(GDP-甘露糖-4,6-脱水酶)(EC 4.2.1.47)、Fx(GDP-酮-6-脱氧甘露糖-3,5-表异构酶，4-还原酶)(EC 1.1.1.271)、和GFPP(GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶)(EC2.7.7.30)。这些酶或转运体只要可以发挥其活性，则不必精确指定其结构。本说明书中，将能够发挥这些活性的蛋白称为功能性蛋白。作为改变这些活性的方法的非限定的一个方案，可举出这些活性的缺失。为了制作这些活性缺失的宿主细胞，可以适宜采用破坏这些功能性蛋白的基因使之不能发挥功能的方法等公知的方法(国际公开WO2000/061739、WO2002/031140、WO2006/067913等)。这种活性缺失的宿主细胞可通过破坏对CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、Y0骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞、HEK293细胞、或杂交瘤细胞等为内源性的这些功能性蛋白的基因，使之不能发挥功能的方法等来制作。
包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体(国际公开WO2002/079255等)是公知的。在非限定的一个方案中，为了制作包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体，制备表达下述基因的宿主细胞，该基因编码具有GnTIII(β-1,4-甘露糖基-糖蛋白，4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶)(EC2.4.1.144)活性或GalT(β-1,4-半乳糖基转移酶)(EC 2.4.1.38)活性的功能性蛋白。在其它非限定的优选的一个方案中，制作除了前述功能性蛋白之外，还共表达编码具有人ManII(甘露糖苷酶II)(3.2.1.114)活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTI(β-1,2-乙酰葡糖胺基转移酶I)(EC 2.4.1.94)活性的功能性蛋白的基因、编码具有GnTII(β-1，2-乙酰葡糖胺基转移酶II)(EC 2.4.1.143)活性的功能性蛋白的基因、编码具有ManI(甘露糖苷酶)(EC 3.2.1.113)活性的功能性蛋白的基因、和α-1,6-岩藻糖基转移酶(EC 2.4.1.68)的宿主细胞(国际公开WO2004/065540)。
通过对如上所述的对糖链添加岩藻糖的能力低的宿主细胞、和具有形成含有平分型GlcNAc结构的糖链的活性的宿主细胞转染含有抗体基因的表达载体，分别可制作从与抗体Fc区结合的N-糖苷结合复合型糖链还原末端的N-乙酰葡萄糖胺除去了岩藻糖残基的抗体、和包含具有平分型GlcNAc的糖链的抗体。这些抗体的制造方法也可以适用于含有改变Fc区的抗原结合分子的制造方法，所述改变Fc区是以与本公开的Fc区结合的糖链的组成中结合有岩藻糖缺陷糖链的Fc区的比例变高的方式、或添加有平分型N-乙酰葡糖胺的Fc区的比例变高的方式经修饰的改变Fc区。通过这种制造方法制作的与本公开的抗原结合分子所含的Fc区结合的糖链的组成可通过前述“Fcγ受体(FcγR)结合改变Fc区”中记载的方法来确认。
包含二分子的FcRn及一分子的活性型Fcγ受体这四者的异复合体
通过FcRn和IgG抗体的结晶学研究，认为FcRn-IgG复合体是由一分子的IgG对两分子的FcRn而构成，在位于IgG的Fc区两侧的CH2和CH3结构域的接触面附近，发生二分子的结合(Burmeister等(Nature(1994)372,336-343)。另一方面，如PCT/JP2012/058603的实施例3中所确认，明确了抗体的Fc区可以形成包含二分子的FcRn和一分子的活性型Fcγ受体这四者的复合体(PCT/JP2012/058603)。该异复合体的形成是对包含在pH中性范围条件下具有FcRn结合活性的Fc区的抗原结合分子的性质进行分析，其结果明确了的现象。
本公开并不受特定理论的束缚，但认为通过包含抗原结合分子所含的Fc区与两分子的FcRn以及一分子的活性型Fcγ受体这四者的异复合体的形成，会对将抗原结合分子施用至生物体内时的抗原结合分子在该生物体内的药代动力学(血浆中滞留性)、以及针对被施用抗原结合分子的免疫应答(免疫原性)带来如下所述的影响。免疫细胞上除了各种活性型Fcγ受体之外还表达有FcRn，这暗示抗原结合分子在免疫细胞上形成这种四者复合体会提高对免疫细胞的亲和性，进而使细胞内结构域缔合而增强内化信号，促进摄入至免疫细胞中。提示了对于抗原呈递细胞也同样，通过在抗原呈递细胞的细胞膜上形成四者复合体，可将抗原结合分子容易地摄入抗原呈递细胞中。通常，被摄入抗原呈递细胞中的抗原结合分子在抗原呈递细胞内的溶酶体中被分解并被呈递至T细胞。其结果，通过在抗原呈递细胞的细胞膜上形成上述四者复合体，抗原呈递细胞对抗原结合分子的摄入得到促进，因此有可能使抗原结合分子的血浆中滞留性变差。此外同样还可能诱发免疫应答(变差)。
因此，认为在将形成这种四者复合体的能力降低的抗原结合分子施用生物体时，该抗原结合分子的血浆中滞留性将提高，该生物体的免疫应答的诱发会被抑制。作为这种抑制包含抗原呈递细胞的免疫细胞上的该复合体的形成的抗原结合分子的优选方案，可举出以下三种。
抑制异复合体的形成的抗原结合分子
(方案1)包含下述Fc区的抗原结合分子，该Fc区具有pH中性范围条件下的FcRn结 合活性、且对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低
方案1的抗原结合分子通过与二分子FcRn结合而形成三者复合体，但不形成包含活性型FcγR的复合体。对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低的Fc区可通过如上所述进行改变天然型Fc区的氨基酸来制作。改变Fc区对活性型FcγR的结合活性是否较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低，可使用前述结合活性一项中记载的方法适宜实施。
作为活性型Fcγ受体，优选可举出：包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)、包含FcγRIIa(包括同种异型R131和H131)以及同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)。
本说明书中，Fc区改变体对活性型Fcγ受体的结合活性较天然型Fc区对活性型Fcγ受体的结合活性低是指，Fc区改变体对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一种人Fcγ受体的结合活性较天然型Fc区对这些人Fcγ受体的结合活性低。例如是指，基于上述分析方法，与作为对照的包含天然型Fc区的抗原结合分子的结合活性进行比较，包含Fc区改变体的抗原结合分子的结合活性显示出95％以下、优选90％以下、85％以下、80％以下、75％以下、特别优选70％以下、65％以下、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下的结合活性。作为天然型Fc区，既可以使用起始Fc区，也可以使用野生型抗体的不同同种型的Fc区。
此外，天然型对活性型FcγR的结合活性优选是指人IgG1对Fcγ受体的结合活性，为了降低对Fcγ受体的结合活性，除了上述改变以外，还可通过对人IgG2、人IgG3、人IgG4改变同种型来实现。此外，除了上述改变以外，通过用大肠杆菌等不添加糖链的宿主来表达包含具有Fcγ受体结合活性的Fc区的抗原结合分子，也可以降低对Fcγ受体的结合活性。
作为包含作为对照的Fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于：SEQ ID NO:5(RefSeq注册编号AAC82527.1的N末端添加有A)、SEQ ID NO:6(RefSeq注册编号AAB59393.1的N末端添加有A)、SEQ ID NO:7(RefSeq注册编号CAA27268.1)、SEQ ID NO:8(RefSeq注册编号AAB59394.1的N末端添加有A)。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，来验证包含该Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
在本公开的非限定的一个方案中，作为对活性型FcγR的结合活性较天然型Fc区对活性型FcγR的结合活性低的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的234、235、236、237、238、239、270、297、298、325、328、及329中的任意一个以上的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区，但Fc区的改变并不限于上述改变，也可以是例如Cur.Opin.in Biotech.(2009)20(6),685-691中记载的脱糖链(N297A,N297Q)、IgG1-L234A/L235A、IgG1-A325A/A330S/P331S、IgG1-C226S/C229S、IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A、IgG1-L234F/L235E/P331S、IgG1-S267E/L328F、IgG2-V234A/G237A、IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S、IgG4-L235A/G237A/E318A、IgG4-L236E等改变、和国际公开WO2008/092117中记载的G236R/L328R、L235G/G236R、N325A/L328R、N325L/L328R等改变、以及EU编号233位、234位、235位、237位的氨基酸的插入、国际公开WO2000/042072中记载的位置的改变。
此外，在本公开的非限定的一个方案中，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸的下述任一者以上改变的Fc区：
234位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr或Trp中的任一种，
235位的氨基酸改变为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val或Arg中的任一种，
236位的氨基酸改变为Arg、Asn、Gln、His、Leu、Lys、Met、Phe、Pro或Tyr中的任一种，
237位的氨基酸改变为Ala、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Pro、Ser、Thr、Val、Tyr或Arg中的任一种，
238位的氨基酸改变为Ala、Asn、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Thr、Trp或Arg中的任一种，
239位的氨基酸改变为Gln、His、Lys、Phe、Pro、Trp、Tyr或Arg中的任一种，
265位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一种，
266位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一种，
267位的氨基酸改变为Arg、His、Lys、Phe、Pro、Trp或Tyr中的任一种，
269位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一种，
270位的氨基酸改变为Ala、Arg、Asn、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一种，
271位的氨基酸改变为Arg、His、Phe、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一种，
295位的氨基酸改变为Arg、Asn、Asp、Gly、His、Phe、Ser、Trp或Tyr中的任一种，
296位的氨基酸改变为Arg、Gly、Lys或Pro中的任一种，
297位的氨基酸改变为Ala，
298位的氨基酸改变为Arg、Gly、Lys、Pro、Trp或Tyr中的任一种，
300位的氨基酸改变为Arg、Lys或Pro中的任一种，
324位的氨基酸改变为Lys或Pro中的任一种，
325位的氨基酸改变为Ala、Arg、Gly、His、Ile、Lys、Phe、Pro、Thr、TrpTyr、或者Val中的任一种，
327位的氨基酸改变为Arg、Gln、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val中的任一种，
328位的氨基酸改变为Arg、Asn、Gly、His、Lys或Pro中的任一种，
329位的氨基酸改变为Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、Tyr、Val或Arg中的任一种，
330位的氨基酸改变为Pro或Ser中的任一种，
331位的氨基酸改变为Arg、Gly或Lys中的任一种，或者
332位的氨基酸改变为Arg、Lys或Pro的任一。
(方案2)包含下述Fc区的抗原结合分子，该Fc区具有pH中性范围条件下的FcRn结 合活性、且对抑制型FcγR的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高
方案2的抗原结合分子可通过与二分子的FcRn和一分子的抑制型FcγR结合而形成含有它们四者的复合体。然而，由于一分子的抗原结合分子只能与一分子的FcγR结合，因而一分子的抗原结合分子在与抑制型FcγR结合的状态下无法与其它活性型FcγR结合。进而，据报道，在与抑制型FcγR结合的状态下被摄入细胞内的抗原结合分子会被再循环至细胞膜上，从而避免细胞内的分解(Immunity(2005)23,503-514)。即，认为对抑制型FcγR具有选择结合活性的抗原结合分子无法形成引起免疫应答的原因的包含活性型FcγR和两分子的FcRn的异复合体。
作为活性型Fcγ受体，优选可举出：包含FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)、包含FcγRIIa(包括同种异型R131和H131)以及同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)。此外，作为抑制型Fcγ受体的优选实例，可举出FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)。
本说明书中，对抑制型FcγR的结合活性较对活性型Fcγ受体的结合活性高是指，Fc区改变体对FcγRIIb的结合活性较对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一种人Fcγ受体的结合活性高。例如，是指基于上述分析方法，含有Fc区改变体的抗原结合分子对FcγRIIb的结合活性表现出对FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa和/或FcγRIIIb中的任一种人Fcγ受体的结合活性的105％以上、优选110％以上、120％以上、130％以上、140％以上、特别优选150％以上、160％以上、170％以上、180％以上、190％以上、200％％以上、250％以上、300％以上、350％以上、400％以上、450％以上、500％以上、750％以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上的结合活性。
最优选的是对FcγRIIb的结合活性较对FcγRIa、FcγRIIa(包括同种异型R131和H131)和FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)的均高。FcγRIa对天然型IgG1的亲和性极高，因而认为在生物体内大量的内源性IgG1使得结合达到饱和，所以认为即使对FcγRIIb的结合活性比对FcγRIIa和FcγRIIIa的高、比对FcγRIa的低，也可能抑制该复合体的形成。
作为包含作为对照的Fc区的抗原结合分子，可适宜使用具有IgG单克隆抗体的Fc区的抗原结合分子。该Fc区的结构记载于：SEQ ID NO:5(RefSeq注册编号AAC82527.1的N末端添加有A)、SEQ ID NO:6(RefSeq注册编号AAB59393.1的N末端添加有A)、SEQ ID NO:7(RefSeq注册编号CAA27268.1)、SEQ ID NO:8(RefSeq注册编号AAB59394.1的N末端添加有A)。另外，使用包含某特定同种型的抗体Fc区的抗原结合分子作为被测物质时，通过使用具有该特定同种型的IgG单克隆抗体Fc区的抗原结合分子作为对照，可验证包含该Fc区的抗原结合分子的Fcγ受体结合活性的效果。如上所述，适当选择包含已被证实Fcγ受体结合活性高的Fc区的抗原结合分子。
在本公开的非限定的一个方案中，作为对抑制型FcγR具有选择性结合活性的Fc区的实例，优选可举出前述Fc区的氨基酸中以EU编号表示的238或328的氨基酸被改变为与天然型Fc区不同的氨基酸的Fc区。此外，作为对抑制型Fcγ受体具有选择性结合活性的Fc区，还可以适宜选择US2009/0136485中记载的Fc区或改变。
另外，在本公开的非限定的一个方案中，优选可举出前述Fc区的以EU编号表示的氨基酸被改变为下述中的任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238的氨基酸为Asp、或328的氨基酸为Glu。
进而，在本公开的非限定的一个方案中，可优选举出改变为下述任一者以上的Fc区：以EU编号表示的238位的Pro置换为Asp、以及以EU编号表示的237位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Phe、以EU编号表示的267位的氨基酸为Val、以EU编号表示的267位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的271位的氨基酸为Gly、以EU编号表示的326位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Gln、以EU编号表示的326位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Met、以EU编号表示的239位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的267位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的234位的氨基酸为Trp、以EU编号表示的234位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的237位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的237位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的237位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的237位的氨基酸为Met、以EU编号表示的237位的氨基酸为Tyr、以EU编号表示的330位的氨基酸为Lys、以EU编号表示的330位的氨基酸为Arg、以EU编号表示的233位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的268位的氨基酸为Glu、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ser、以EU编号表示的326位的氨基酸为Thr、以EU编号表示的323位的氨基酸为Ile、以EU编号表示的323位的氨基酸为Leu、以EU编号表示的323位的氨基酸为Met、以EU编号表示的296位的氨基酸为Asp、以EU编号表示的326位的氨基酸为Ala、以EU编号表示的326位的氨基酸为Asn、以EU编号表示的330位的氨基酸为Met。
(方案3)包含下述Fc区的抗原结合分子，其中，构成Fc区的二个多肽的一方具有pH 中性范围条件下的FcRn结合活性，另一方不具有pH中性范围条件下的FcRn结合能力活性
方案3的抗原结合分子可通过与一分子的FcRn和一分子的FcγR结合而形成三者复合体，但不形成包含二分子的FcRn和一分子的FcγR的四者的异复合体。作为本方案3的抗原结合分子所含的、构成Fc区的二个多肽的一方具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性，另一多肽不具有pH中性范围条件下的FcRn结合能力活性的Fc区，还可适宜使用来源于双特异性抗体(bispecific抗体)的Fc区。双特异性抗体是指对不同抗原具有特异性的二种抗体。IgG型双特异性抗体可由通过融合两种产生IgG抗体的杂交瘤而产生的杂交的杂交瘤(quadroma)来分泌(Milstein等(Nature(1983)305,537-540)。
通过使用前述抗体一项中记载的重组方法来制造上述方案3的抗原结合分子时，可采用将编码构成目标的二种Fc区的多肽的基因导入细胞并使它们共表达的方法。然而，制造的Fc区会形成下述Fc区以2：1：1的分子数的比例存在的混合物：构成Fc区的二个多肽的一方具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性，另一多肽不具有pH中性范围条件下的FcRn结合能力活性的Fc区；构成Fc区的二个多肽的双方均具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性的Fc区；构成Fc区的二个多肽的双方均不具有pH中性范围条件下的FcRn结合活性的Fc区。难以由3种IgG纯化包含目标组合的Fc区的抗原结合分子。
使用这种重组手法制造方案3的抗原结合分子时，可以通过对构成Fc区的CH3结构域施加适当的氨基酸置换的改变，优先分泌出包含异源组合Fc区的抗原结合分子。具体地，有下述方法：将存在于一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链置换成更大的侧链(knob(意为“突起”))、将存在于另一条重链的CH3结构域的氨基酸侧链置换成更小的侧链(hole(意为“空隙”))，从而使突起能够配置在间隙内，以促进异种的H链形成和抑制同种的H链形成(国际公开WO1996027011、Ridgway等(Protein Engineering(1996)9,617-621)、Merchant等(Nat.Biotech.(1998)16,677-681))。
此外，还已知通过将控制多肽的缔合、或由多肽构成的异种多聚体的缔合的方法用于构成Fc区的二个多肽的缔合来制作双特异性抗体的技术。即，通过改变构成Fc区的二个多肽内的形成界面的氨基酸残基，而控制使得抑制构成具有相同序列的Fc区的多肽的缔合、且形成构成序列不同的二个Fc区的多肽复合体的方法可用于双特异性抗体的制作(国际公开WO2006/106905)。具体地，在制造本公开的方案3的抗原结合分子时，作为非限定的一个方案，可采用前述双特异性抗体及其制作方法一项中记载的方法。
期待与能够形成四者复合体的抗原结合分子相比，上述方案1～3的抗原结合分子均可使免疫原性降低、并使血浆中滞留性提高。
FcRn
与属于免疫球蛋白超家族的Fcγ受体不同，人FcRn在结构上与主要组织不相容性复合体(MHC)I类的多肽结构类似，与I类的MHC分子具有22至29％的序列同一性(Ghetie等，Immunol.Today(1997)18(12),592-598)。FcRn表达为异源二聚体，其由与可溶性β或轻链(β2微球蛋白)复合而成的跨膜α或重链构成。如MHC那样，FcRn的α链包含3个细胞外结构域(α1、α2、α3)，短的细胞质结构域将蛋白锚定于细胞表面。α1和α2结构域与抗体的Fc区中的FcRn结合结构域相互作用(Raghavan等(Immunity(1994)1,303-315)。
FcRn在哺乳动物的母体胎盘或卵黄囊中表达，其参与IgG从母体向胎儿的转移。此外，表达有FcRn的啮齿类新生儿的小肠中，FcRn参与母体IgG从所摄取的初乳或乳中穿过刷状边缘上皮的移动。FcRn在多种物种的大量的其它组织以及各种内皮细胞系中表达。其也在人成年血管内皮、肌肉血管系和肝窦毛细血管中有表达。认为FcRn与IgG结合，将其再循环至血清中，由此起到维持血浆中的IgG浓度的作用。通常，FcRn对IgG分子的结合为严格地pH依赖性，在小于7.0的pH酸性范围内可观察到最佳结合。
以含有SEQ ID NO:28所示信号序列的多肽为前体的人FcRn在生物体内(SEQ IDNO:29中记载了含有信号序列的该多肽)与人β2-微球蛋白形成复合体。与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn可利用通常的重组表达方法来制备。本公开的Fc区对这种与β2-微球蛋白形成复合体的可溶型人FcRn的结合活性是可以评价的。本公开中，若无特别记载，则人FcRn指为能够与本公开的Fc区结合的形态，作为实例，可举出人FcRn与人β2-微球蛋白的复合体。
作为本公开与恒定区改变技术的组合的方案，可举出与酸性pH下的FcRn结合增强改变Fc技术(WO2002060919、WO2004035752、WO2000042072)、中性pH下的FcRn结合增强改变Fc技术(WO2011122011、WO2012133782)、抑制型Fcγ受体选择的结合增强技术(WO2012115241、WO2013125667)、活性型Fcγ受体选择的结合增强技术(ADCC活性增强技术)(WO2013002362)、降低类风湿因子的结合活性的技术(WO2013046704)等抗体改变技术的组合。
作为本公开与可变区改变技术的非限定的组合方案，可举出与pH依赖性抗体(WO2009125825)、钙依赖性抗体(WO2012073992)等改变技术的组合。
本公开中抗原结合分子可以具有与MTA相互作用的氨基酸残基。与MTA相互作用的氨基酸残基可以在抗原结合分子中的抗原结合结构域中存在，也可以在抗原结合结构域以外的位点存在。另外，与MTA相互作用的氨基酸残基可以是抗原结合分子中的仅1个残基，也可以存在多个残基。
作为与MTA相互作用的氨基酸残基所位于的位点，可示例抗原结合结构域。进一步，作为包含与MTA相互作用的氨基酸残基的抗原结合分子的非限定的一个方案，可示例抗体。与MTA相互作用的氨基酸残基可存在于抗体的恒定区和/或可变区，进一步，可存在于抗体可变区中的CDR、FR中，但不限于任一种。
作为与MTA相互作用的氨基酸残基所位于的位点，可示例与抗原结合分子的抗原结合结构域不同的部分。通过与抗原结合分子的抗原结合结构域不同的部分的氨基酸残基与MTA相互作用，抗原结合结构域的结构变化，间接地抗原结合活性可以依赖于MTA而变化。
抗原结合分子中与MTA相互作用的氨基酸残基可以通过MTA与抗原结合分子二者的复合体或MTA、抗原、抗原结合分子的三者复合体的结晶结构分析、使用NMR的立体结构分析、或氨基酸的突变导入等方法来鉴定。
作为本公开中包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的非限定的一个方案，可示例抗体。
本公开中，抗原结合分子具有2个以上的多个抗原结合结构域，进一步，可以对多个不同抗原同时结合。
作为非限定的一个方案，本公开的抗原结合分子进一步具有第2抗原结合结构域，前述第2抗原结合结构域对与前述抗原结合结构域所结合的抗原不同的第2抗原具有结合活性。
在抗原结合分子具有不同的多个抗原结合结构域的情形中，其中至少一个抗原结合结构域可以具有针对抗原的结合活性依赖于MTA或除了MTA以外的低分子化合物而变化的抗原结合结构域，也可以抗原结合分子所包含的全部抗原结合结构域是针对抗原的结合活性依赖于MTA或除了MTA以外的低分子化合物而变化的抗原结合结构域。另外，可以是多个抗原结合结构域的针对抗原的结合活性依赖于各自不同的低分子化合物而变化的抗原结构域，也可以是一个抗原结合分子中，针对抗原的结合活性依赖于低分子化合物而变化的抗原结合结构域，与针对抗原的结合活性不受低分子化合物的浓度影响的抗原结合结构域同时存在。
在又一个方案中，前述第2抗原结合结构域针对前述第2抗原的结合活性不被MTA实质性地影响。
在又一个方案中，前述第2抗原结合结构域针对前述第2抗原的结合活性依赖于MTA而变化。在更详细的一个方案中，前述第2抗原结合结构域在MTA存在下针对前述第2抗原的结合活性与前述第2抗原结合结构域在不存在MTA的条件下针对前述第2抗原的结合活性不同。
作为具有2个以上的多个抗原结合结构域、进一步可与多个不同抗原同时结合的抗原结合分子的非限定的示例，可列举双特异性抗体，但不限于此。
作为本公开中非限定的双互补位抗原结合分子的一个方案，可示例下述双抗体或sc(Fv)2，其中，互补位彼此不同，一个互补位与结合至癌细胞或浸润于癌组织的细胞等的细胞膜的膜型分子上存在的表位结合，另一个互补位与表达于效应细胞细胞膜的膜型分子中存在的表位结合。上述双抗体或sc(Fv)2中，一个互补位对结合至癌细胞或浸润于癌组织的细胞等的细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性可以依赖于MTA而变化，一个互补位对结合至效应细胞细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性可以依赖于MTA而变化，另外，两个互补位的结合活性可以依赖于MTA而变化。在一个互补位对结合至癌细胞或浸润于癌组织的细胞等的细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性、与一个互补位对结合至效应细胞细胞膜的膜型分子上存在的表位的结合活性中的仅任一方依赖于MTA而变化的情形中，针对抗原的结合活性不依赖于MTA而变化的抗原结合结构域也可以是针对抗原的结合活性依赖于除了MTA以外的低分子化合物(例如，癌组织特异性化合物、非天然低分子化合物)而变化的抗原结合结构域。
作为与效应细胞的细胞膜结合的膜型分子，可示例TCR复合体、CD3、CD3e，但不限于这些。
在一个互补位与结合至癌细胞或浸润于癌组织的细胞等(也称为靶细胞)的细胞膜的膜型分子上存在的表位结合，另一互补位与表达于效应细胞的细胞膜的膜型分子中存在的表位结合的双互补位抗原结合分子的一个方案中，该双互补位抗原结合分子与靶细胞和效应细胞双方结合，从而活化效应细胞，可以对靶细胞产生细胞毒性。在效应细胞是T细胞的情形中，产生的细胞毒性是T细胞所致的细胞毒性(T-cell-dependent cytotoxicity:TDCC)活性。
细胞毒性物质
为了本公开的抗原结合分子与癌细胞结合而发挥细胞毒性，细胞毒性物质可以结合于抗原结合分子。作为细胞毒性物质，可以是以下示例的化学治疗剂，也可以是CurrOpin Chem Biol(2010)14,529-37或国际公开2009/140242中公开的化合物，这些化合物通过适当的接头等与抗原结合分子结合。将本公开的抗原结合分子用作药物组合物时，可以在将该抗原结合分子施用对象(被测者、患者等)前，使这些细胞毒性物质与该抗原结合分子结合，也可以在施用前后或同时施用这些细胞毒性物质。
另外，后述的结合有化学治疗剂、毒性肽或放射性化学物质等细胞毒性物质的修饰抗原结合分子修饰物也可适宜地用作本公开的具有细胞毒性的抗原结合分子。这种修饰抗原结合分子(以下，称为抗原结合分子药物缀合物)可通过对所得抗原结合分子进行化学修饰而获得。另外，作为抗原结合分子的修饰方法，可适宜使用在抗体药物缀合物等领域中已经确立的方法。此外，结合有毒性肽的修饰抗原结合分子可通过将编码该毒性肽的基因与编码本公开的抗原结合分子的基因框内连接得到的融合基因在适当的宿主细胞中表达后，从该细胞的培养液中分离而获得。
与本公开的抗原结合分子结合的化学治疗剂可以示例：阿扎立平(azaribine)、阿那曲唑(anastrozole)、阿扎胞苷(azacytidine)、博莱霉素(bleomycin)、波替单抗(bortezomib)、苔藓抑素-1(bryostatin-1)、白消安(busulfan)、喜树碱(camptothecin)、10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin)、卡莫司汀(carmustine)、塞来昔布(celebrex)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、顺铂(cisplatin)、伊立替康(irinotecan)、卡铂(carboplatin)、克拉曲滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、多西他赛(docetaxel)、放射菌素D(dactinomycin)、柔红霉素葡萄糖醛酸化物(daunomycin glucuronide)、柔红霉素(daunorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)、阿霉素(doxorubicin)、阿霉素葡萄糖醛酸化物(doxorubicin glucuronide)、表阿霉素(epirubicin)、乙炔基雌二醇(ethinyl estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依托泊苷葡萄糖醛酸化物(etoposide glucuronide)、氟苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟他胺(flutamide)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟羟甲睾酮(fluoxymesterone)、吉西他滨(gemcitabine)、己酸羟孕酮(hydroxyprogesteronecaproate)、羟基脲(hydroxyurea)、去甲氧基柔红霉素(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、甲酰四氢叶酸(leucovorin)、洛莫司汀(lomustine)、美登醇(maytansinoid)、氮芥(mechlorethamine)、醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、丁酸苯酯(phenylbutyrate)、强的松(prednisone)、甲苄肼(procarbazine)、紫杉醇(paclitaxel)、喷司他丁(pentostatin)、司莫司丁(semustine)、链脲菌素(streptozocin)、它莫西芬(tamoxifen)、紫杉醇类(taxanes)、紫杉醇(taxol)、丙酸睾酮(testosterone propionate)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、三胺硫磷(thiotepa)、替尼泊苷(teniposide)、拓扑替康(topotecan)、脲嘧啶氮芥(uracil mustard)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春新碱(vincristine)。
本公开中，优选的化学治疗剂为低分子的化学治疗剂。低分子的化学治疗剂在与本公开的抗原结合分子结合后，干涉抗原结合分子的功能的可能性也低。本公开中，低分子的化学治疗剂通常具有100～2000，优选200～1000的分子量。这里示例的化学治疗剂均为低分子的化学治疗剂。这些本公开中的化学治疗剂包括在生物体内转化为活性化学治疗剂的前药。前药的活化可以是酶转化，也可以是非酶转化。
另外，作为与本公开的抗原结合分子结合的细胞毒性物质，还可示例假单胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)、肥皂草素-s6(Saporin-s6)、白喉毒素(Diphtheriatoxin)、海葵毒素(Cnidarian toxin)等毒性肽(毒素)或放射碘(Radioiodine)、光敏剂(Photosensitizer)。作为毒性肽的实例，例如，优选可举出下述毒性肽。
白喉毒素A链(Diphtheria toxin A Chain)(Langone等(Methods in Enzymology(1983)93,307-308))；
假单胞菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin)(Nature Medicine(1996)2,350-353)；
蓖麻毒素链(Ricin A Chain)(Fulton等(J.Biol.Chem.(1986)261,5314-5319)、Sivam等(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等、(J.Immunol.Methods(1990)135，15-24、Wawrzynczak等(Cancer Res.(1990)50，7519-7562)、及Gheeite等(J.Immunol.Methods(1991)142,223-230))；
无糖链蓖麻毒素A链(Deglicosylated Ricin A Chain)(Thorpe等(Cancer Res.(1987)47，5924-5931))；
相思豆毒素A链(Abrin A Chain)(Wawrzynczak等(Br.J.Cancer(1992)66,361-366)、Wawrzynczak等(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、Sivam等(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、及Thorpe等(Cancer Res.(1987)47,5924-5931))；
白树毒素(Gelonin)(Sivam等(Cancer Res.(1987)47,3169-3173)、Cumber等(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)、Wawrzynczak等(Cancer Res.,(1990)50,7519-7562)、及Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
美洲商陆抗病毒蛋白(PAP-s；来源于种子的美洲商陆抗病毒蛋白)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
ブリオジン(Briodin)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
皂草素(Saporin)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
木鳖子苷(Momordin)(Cumber等(J.Immunol.Methods(1990)135,15-24)；Wawrzynczak等(Cancer Res.(1990)50,7519-7562)、及Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
木鳖糖蛋白(Momorcochin)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
石竹素32(Dianthin 32)(Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.(1992)89,341-346))；
石竹素30(Dianthin 30)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
莫迪素(Modeccin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195，1-8))；
槲寄生凝集素(Viscumin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
蒴莲素(Volkesin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
商陆毒蛋白(Dodecandrin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
小麦毒蛋白(Tritin)(Stirpe F.,Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；
丝瓜素(Luffin)(Stirpe F.，Barbieri L.(FEBS letter(1986)195,1-8))；及
栝楼子毒蛋白(Trichokirin)(Casellas等(Eur.J.Biochem.(1988)176,581-588)、及Bolognesi等(Clin.exp.Immunol.,(1992)89,341-346))。
细胞毒性及细胞毒性的测定方法
在本公开的非限定的一个方案中，提供包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域并对在其细胞膜上表达膜型分子的细胞具有细胞毒性的抗原结合分子、和含有该抗原结合分子作为有效成分的药物组合物。本公开中，细胞毒性可举出例如：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)、补体依赖性细胞毒性(complement-dependent cytotoxicity：CDC)和T细胞所致的细胞毒性(T-cell-dependent cytotoxicity:TDCC)活性及抗体依赖性细胞吞噬(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis：ADCP)活性等。本公开中，CDC活性意指补体系统所致的细胞毒性。另外，ADCC活性意指，免疫细胞等通过表达于该免疫细胞的Fcγ受体而结合至含有与表达于靶细胞的细胞膜的膜型分子结合的抗原结合结构域的抗原结合分子的Fc区，且该免疫细胞对靶细胞造成伤害的活性。另外，TDCC活性意指，通过应用包含与表达于靶细胞的细胞膜的膜型分子结合的抗原结合结构域、及针对T细胞上的T细胞受体(TCR)复合体的构成亚基的任一的抗原结合结构域，特别地与CD3ε链结合的抗原结合结构域的双特异性抗体使靶细胞与T细胞接近，从而T细胞对靶细胞造成伤害的活性。目标抗原结合分子具有ADCC活性、CDC活性、TDCC活性或ADCP活性与否，可通过公知的方法测定。
具体地，首先，实施效应细胞、补体溶液、靶细胞的制备。
(1)效应细胞的制备
由摘取自CBA/N小鼠等的脾脏，在RPMI1640培养基(Invitrogen)中分离出脾脏细胞。将经含10％胎牛血清(FBS、HyClone)的相同培养基洗涤的该脾脏细胞的浓度调整至5×106/mL，由此可制备效应细胞。
(2)补体溶液的制备
用含10％FBS的培养基(Invitrogen)将Baby Rabbit Complement(CEDARLANE)稀释10倍，由此可以制备补体溶液。
(3)靶细胞的制备
将表达抗原的细胞与0.2mCi的51Cr-铬酸钠(GE Healthcare Bio-Sciences)一起在含10％FBS的DMEM培养基中于37℃培养1小时，由此可将该靶细胞放射性标记。放射性标记后，用含10％FBS的RPMI1640培养基洗涤3次，将细胞的浓度制备为2×105/mL，由此可制备该靶细胞。
ADCC活性或CDC活性可通过以下所述的方法测定。ADCC活性的测定时，使加入至96孔U底培养板(Becton Dickinson)的各50μl的靶细胞与抗原结合分子在室温反应15分钟。然后，将加入有效应细胞100μl的该培养板在二氧化碳培养箱内静置4小时。抗原结合分子的终浓度可以设定为例如0或10μg/ml等的浓度。静置后，使用伽马计数器(COBRAII AUTO-GAMMA、MODEL D5005、Packard Instrument Company)测定由各孔回收的100μl上清的放射活性。使用测定值，基于(A-C)/(B-C)x100的计算式可计算细胞毒性(％)。A表示各试样的放射活性(cpm)、B表示加入了1％NP-40(nacalai tesque)的试样的放射活性(cpm)、C表示仅含靶细胞的试样的放射活性(cpm)。
另一方面，CDC活性的测定时，使加入至96孔平底培养板(Becton Dickinson)的各50μl的靶细胞与抗原结合分子在冰上反应15分钟。然后，将加入补体溶液100μl的该培养板在二氧化碳培养箱内静置4小时。抗原结合分子的终浓度可设定为例如0或3μg/mL等的浓度。静置后，使用伽马计数器测定由各孔回收的100μl上清的放射活性。细胞毒性可与ADCC活性测定相同地计算。
ADCP活性可以通过下述方法测定。用PKH26染料标记试剂盒(Sigma公司)进行表达抗原的靶细胞的标记。将靶细胞用胰蛋白酶溶液剥离，用PBS洗涤。将剥离的细胞用稀释剂C悬浮至1x107个细胞/ml，将PKH26染料原液(1mM)用稀释剂C稀释至8μM，马上添加与细胞悬浮液等量的染料稀释液。在室温放置5分钟后，加入含有10％FBS的RPMI1640进行2次洗涤，从而制备靶细胞。将作为被测物质的抗原结合分子用靶细胞的培养基稀释至20μg/ml，将前述靶细胞以2x106个细胞/100μl/管分配，混合。抗原结合分子的终浓度可以设定例如0或10μg/ml等的浓度。在冰上静置30分钟后，弃去上清，用培养液洗涤2次，悬浮于培养液500μL中。从效应细胞去除上清，在与前述抗原结合分子混合的靶细胞悬浮液中加入效应细胞并混合。在CO2培养箱中培养3小时后，用胰蛋白酶-EDTA剥离细胞，回收细胞。在回收的细胞中加入例如FITC标记抗CD11b抗体，在冰上静置30分钟。静置后弃去上清，用培养液洗涤2次后，将回收的细胞悬浮于300μl的培养液，例如用FACS Calibur(Becton Dickinson公司)进行测定。在CD11b阳性巨噬细胞细胞中，通过将PKH26阳性级分评价为吞噬阳性细胞，可以测定ADCP活性。
TDCC活性可以通过下述方法测定。将人外周血单核细胞(下文称为人PBMC)用作效应细胞，可以测定被测抗体的TDCC活性。
(1)人PBMC溶液的制备
应用预先注入500μl的5000单位/5ml的肝素溶液的注射器，从健康人收集外周血50ml。将用PBS稀释至2倍的该外周血4等分，加入预先注入15ml的Ficoll-Paque PLUS进行离心操作的Leucosep淋巴细胞分离管(GE Healthcare)。在分配了该外周血的分离管中以1000g的速度在室温进行离心分离操作10分钟后，分取单核细胞级分层。通过包含10％FBS的RPMI-1640(10％FBS/RPMI-1640)将该各分层中包含的细胞洗涤1次后，将该细胞在各靶细胞的培养液中悬浮为该细胞密度为2x106个细胞/ml。将该细胞悬浮液作为效应细胞提供于以后的实验。
(2)LDH游离试验(TDCC活性)
TDCC活性可以用LDH释放法(LDH细胞毒性检测试剂盒：TAKARA)评价。首先，将用各靶细胞的培养液稀释为终浓度的4倍的各浓度(0.000004、0.00004、0.0004、0.004、0.04、0.4、4、40μg/ml)的抗体溶液在96孔U底平板的各孔中各自添加50μl。然后，将用各靶细胞的培养液制备为2x105个细胞/ml的靶细胞各自接种50μl(1x104个细胞/孔)，在室温静置15分钟。将各孔中加入了(1)中制备的各靶细胞的培养液中制备的人PBMC溶液各100μl(2x105个细胞/孔)的该平板在5％二氧化碳培养箱中于37℃静置约24小时后，进行离心操作。将该平板的各孔中的100μl培养上清液转移至96孔平底平板。将前述LDH CytotoxicityDetection试剂盒的催化剂溶液溶解于1ml的H2O，与染料溶液以1:45混合。将催化剂溶液及染料溶液的混合溶液以100μl/孔分配于转移了培养上清液的96孔平底平板，在室温静置15-30分钟。用平板读数器测定490-492nm的吸光度。对照波长设为600-620nm，从490-492nm的吸光度将其减去。减去仅培养液的孔(空白)的平均值用于下式。
基于下式：
细胞毒性(TDCC)(％)＝((A-B)-C))×100/(D-C)
可以求出细胞毒性。此处，A为靶细胞、效应细胞、抗体的混合的吸光度，B为效应细胞的吸光度，C为靶细胞的吸光度，D为靶细胞中添加了Triton X-100的吸光度。
T细胞的活化及T细胞的活化能力的测定方法
在本公开的非限定的一个方案中，提供包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域、与T细胞上的T细胞受体(TCR)复合体的构成亚基中的任一进行结合从而具有T细胞的活化能力的抗原结合分子，及包含该抗原结合分子作为有效成分的药物组合物。通过应用包含与表达于靶细胞的细胞膜的膜型分子结合的抗原结合结构域、及针对T细胞上的T细胞受体(TCR)复合体的构成亚基的任一的抗原结合结构域、特别地与CD3ε链结合的抗原结合结构域的双特异性抗体使靶细胞与T细胞接近，可以诱导T细胞的活化。T细胞的活化能力的测定可以应用例如GloResponse NFAT-RE-Luc2 Jurkat细胞(Promega)测定。前述细胞中整合通过作为活化T细胞的核因子(NFAT)应答序列的NFAT应答元件(NFAT-RE)诱导表达的荧光素酶报告基因，表达于Jurkat的细胞膜的TCR复合体的活化可以通过测定报告蛋白的表达检测。通过应用该细胞，可以测定可活化TCR复合体的TCR配体、抗TCR抗体、抗CD3抗体引起的T细胞活化能力。对于T细胞的活化能力的测定，也可以构建不限于应用前述细胞的方法导入了同样的NFAT应答元件(NFAT-RE)及报告蛋白质的T细胞系的细胞并应用其测定。另外，T细胞的活化能力的测定不限于前述方法，例如，可以通过流式细胞术、基因表达分析法进行CD69、CD25等T细胞活化标记物的表达确认，也可以通过测定TNF-α、IFN-γ、IL-6及IL-2等活化的T细胞分泌的细胞因子进行，但不限于这些方法，只要是能够测定T细胞的活化的方法，可以不依赖使用的细胞株、测定方法使用。
作为具体的T细胞的活化能力的测定方法的非限定的一个方案，下文示例具有与靶抗原hIL-6R结合的抗原结合结构域和与CD3结合的抗原结合结构域的双特异性抗体的T细胞的活化能力的测定方法。使用NFAT-RE-luc2-Jurkat细胞作为人T细胞株，使用在CT26中强制表达hIL-6R的CT26/hIL-6R作为hIL-6R表达细胞株。NFAT-RE-luc2-Jurkat细胞及CT26/hIL-6R细胞可以以细胞密度分别为3×106个细胞/mL、1×106个细胞/mL悬浮于分析缓冲液使用，但细胞密度和各细胞的混合比也可以相应于用于评价的细胞种类增减使用。384孔平板的各孔中分别各添加10μl制备的人T细胞株及hIL-6R表达细胞株的悬浮液，进一步，添加10μl制备的抗体溶液。在5％CO2培养箱中于37℃静置6小时后，测定该样品的荧光素酶活性，从而可以评价人T细胞株的活化能力。荧光素酶活性的测定可以使用市售的荧光素酶活性测定试剂(Bio-Glo荧光素酶分析系统，Promega)实施，只要能够测定荧光素酶活性，可以不限于应用的试剂使用。
中和活性及中和活性的测定方法
在本公开的非限定的一个方案中，提供药物组合物，该组合物含有抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合分子含有针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域，且对该膜型分子具有中和活性。在本公开的非限定的其它的一个方案中，提供药物组合物，该组合物含有抗原结合分子作为有效成分，该抗原结合分子含有针对抗原的结合活性依赖于低分子化合物而变化的抗原结合结构域，并且除了对在其细胞膜上表达膜型分子的细胞具有细胞毒性之外，还对该膜型分子具有中和活性。通常，中和活性是指对病毒或毒素等对细胞具有生物学活性的配体的该生物学活性的抑制活性。即，具有中和活性的物质是指与该配体或该配体所结合的受体结合、抑制该配体与受体的结合的物质。与配体的结合被中和活性阻断的受体变得不能通过该受体发挥生物学活性。抗原结合分子为抗体时，具有这种中和活性的抗体通常被称作中和抗体。某被测物质的中和活性可通过在该被测物质的存在或不存在下的条件之间比较配体存在下的生物学活性来测定。
例如，考虑为IL-6受体的主要配体的物质优选可举出SEQ ID NO:27所示的IL-6。其氨基末端形成细胞外结构域的I型膜蛋白即IL-6受体会与由IL-6诱导了二聚体化的gp130受体一起形成异源四聚体(Heinrich等(Biochem.J.(1998)334,297-314))。由于该异源四聚体的形成，与gp130受体缀合的Jak被活化。Jak进行自身磷酸化与受体的磷酸化。受体和Jak的磷酸化位点对Stat3之类的属于具有SH2的Stat家族的分子、MAP激酶、PI3/Akt、其它的具有SH2的蛋白或接头发挥结合位点的功能。接着，结合于gp130受体的Stat被Jak磷酸化。经磷酸化的Stat形成二聚体而移动至核内，调节靶基因的转录。Jak或Stat还可经由其它种类的受体而参与信号级联。解除控制的IL-6的信号级联在自身免疫疾病的病态或炎症、多发性骨髓瘤或前列腺癌等癌中被观察到。可作为癌基因起作用的Stat3在许多癌中恒定地活化。在前列腺癌与多发性骨髓瘤中，来自IL-6受体的信号级联与来自上皮生长因子受体(EGFR)家族成员的信号级联之间存在串扰(Ishikawa等(J.Clin.Exp.Hematopathol.(2006)46(2),55-66))。
这种细胞内的信号级联根据细胞种类而不同，因此可以根据目标靶细胞适宜设定靶分子，并不限定于上述因子。通过测定生物体内信号的活化，可以评价中和活性。此外，还可以将对存在于生物体内信号级联的下游的靶基因的转录诱导作用作为指标来检测生物体内信号的活化。靶基因的转录活性的变化可通过报告测定(reporter assay)的原理来检测。具体地，在靶基因的转录因子或启动子区域的下游配置GFP(Green FluorescenceProtein，绿色荧光蛋白)或荧光素酶等报告基因，并测定其报告活性，由此可以以报告活性的方式测定转录活性的变化。生物体内信号的活化的测定试剂盒可适宜使用市售品(例如，Mercury Pathway Profiling Luciferase System(Clontech)等)。
进一步，作为测定作用于通常在促进细胞增殖的方向上工作的信号级联的EGF受体家族等受体配体的中和活性的方法，可通过测定目标细胞的增殖活性来评价抗原结合分子的中和活性。例如，作为评价或测定相对于例如HB-EGF等其增殖被EGF家族的生长因子所促进的细胞的增殖的、基于抗HB-EGF抗体的中和活性的抑制效果的方法，可适宜使用以下的方法。作为在试管内评价或测定该细胞增殖抑制活性的方法，可以采用以活细胞对添加于培养基中的[3H]标记胸苷的摄入作为DNA复制能力的指标来进行测定的方法。作为更简便的方法，还可采用在显微镜下测量将台盼蓝等色素排除至细胞外的能力的色素排除法或MTT法。后者利用了活细胞具有将作为四唑盐的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)转变为蓝色的甲
Figure BDA0003265595920001611
产物的能力。
更具体地，将被测抗体与配体一起添加至被测细胞的培养液中，经过一定时间后，将MTT溶液加入培养液中，静置一定时间，由此使MTT进入细胞。结果，黄色化合物MTT被细胞内线粒体内的琥珀酸脱氢酶转变为蓝色的化合物。使该蓝色产物溶解并显色后测定其吸光度，从而作为活细胞数的指标。除了MTT以外，MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂也有市售(nacalai tesque等)而可适宜使用。在活性测定时，可以与抗HB-EGF抗体相同地使用与抗HB-EGF抗体具有相同的同种型但不具有该细胞增殖抑制活性的结合抗体作为对照抗体，通过抗HB-EGF抗体较对照抗体显示更强的细胞增殖抑制活性来判定活性。
作为用于评价活性的细胞，还可适宜使用例如：其增殖被HB-EGF促进的细胞即卵巢癌细胞RMG-1细胞株、利用以表达的方式结合了编码将人EGFR的细胞外结构域与小鼠G-CSF受体的细胞内结构域框内融合得到的融合蛋白hEGFR/mG-CSFR的基因的载体转化的小鼠Ba/F3细胞等。这样，本领域技术人员通过适宜选择用于评价活性的细胞，可以用于测定前述的细胞增殖活性。
本公开中“包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子”施用于生物体时可以获得正向的药理作用。
人源化抗体的制备方法
对人施用本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该抗原结合分子中的抗原结合结构域，可以适宜采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，该基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工改变。基因重组型抗体包含例如人源化(Humanized)抗体等。这些改变抗体可使用公知方法适宜制造。
为了制作本说明书中记载的抗原结合分子中的抗原结合结构域而使用的抗体的可变区通常由被4个框架区域(FR)夹持的3个互补决定区(complementarity-determiningregion；CDR)构成。CDR是实质上决定抗体结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便是在具有不同结合特异性的抗体之间也多显示高度的同一性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体。
人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体地，作为人以外的动物，小鼠、兔等的抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体地，不限于这些，但作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如Overlap Extension PCR。Overlap Extension PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的碱基序列。针对4个FR分别准备引物。通常，对于将小鼠CDR移植到人FR中，选择与小鼠FR同一性高的人FR，在维持CDR功能方面被认为有利。即，通常优选使用下述人FR，其包含与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。CDR的来源不限于小鼠和兔，可以从所有非人动物的抗体选择。
另外，连接的碱基序列被设计为彼此框内连接。通过各引物单独地合成人FR。结果得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列被设计为彼此重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分彼此退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR通过小鼠CDR序列而连接。
最终3个CDR和4个FR连接得到的可变区域基因，通过会与其5'末端和3'末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上所述得到的DNA和编码人抗体C区域的DNA以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主中建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参考欧洲专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。
通过定性或者定量地测定并评价如上所述制作的人源化抗体对抗原的结合活性，可以适宜地选择人抗体FR，以便通过CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适抗原结合位点的方式来置换FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR导入氨基酸序列的突变。具体地，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分碱基序列的突变。通过这类引物合成的FR中导入了碱基序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸置换的突变型抗体对抗原的结合活性，可以选择具有所期望性质的突变FR序列(Cancer Res.，(1993)53，851-856)。
药物组合物
根据本公开，提供包含抗原结合分子的药物组合物，该抗原结合分子为了在避免副作用的同时发挥药效而在正常组织或血液中不进行全身性地作用，并在癌中作用。本公开的药物组合物中包含的抗原结合分子依赖于MTA控制对靶抗原的结合，因此，例如，在该抗原结合分子以癌组织中的抗原为靶时，不能与癌组织的癌细胞、免疫细胞、基质细胞等中表达的抗原，或者癌组织中分泌的抗原结合，因此在避免对正常组织的细胞毒性作用、中和作用等所致的副作用的同时，发挥对癌的强效细胞毒性作用、增殖抑制作用、免疫亢进作用等。例如，含有对表达于T细胞的CD3的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域、与表达于癌细胞的EGFR结合的抗原结合结构域的双特异性抗原结合分子或双互补位抗原结合分子不与正常组织中表达的EGFR结合，但与癌细胞中表达的EGFR结合，因而在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。即，依赖于MTA与存在于癌细胞附近的T细胞上表达的CD3结合，但不与存在于癌细胞附近以外的T细胞上表达的CD3结合，因而将存在于癌细胞附近的T细胞活化，而在避免副作用的同时发挥强效的抗肿瘤效果。
这样在癌组织中与抗原结合，但在其以外的正常组织或血液中不与抗原结合的抗原结合分子在避免副作用的同时发挥药效。本公开提供的将包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子(也称为作为开关MTA与抗原结合的抗原结合分子、MTA开关抗原结合分子(MTA switch antigen binding molecule))可以在MTA不存在的正常环境不与抗原结合，而在MTA以高浓度存在的癌组织中与抗原结合。
示例夹在本公开的抗原结合分子(所含的互补位)与抗原(所含的表位)中、或者通过与本公开的抗原结合分子结合而使抗原结合分子的针对抗原的互补位的结构发生变化，从而发挥开关功能的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合分子。若MTA不存在，则本公开的抗原结合分子所含的互补位与抗原所含的表位的相互作用变得不充分，本公开的抗原结合分子无法与抗原结合，但若MTA存在，则通过夹在本公开的抗原结合分子所含的互补位与抗原所含的表位之间，或通过使互补位的结构发生变化，在MTA以高浓度存在的癌组织中与抗原结合的该抗原结合分子可以对表达该抗原的细胞发挥药效(图26、图27)。本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域中与MTA相互作用的氨基酸残基存在时，MTA容易夹在抗原结合分子中包含的互补位与抗原中包含的表位之间，或者互补位的结构容易变化。另外，与作为此开关的MTA的结合是可逆的，因此认为借助这些MTA的开关的本公开的抗原结合分子对抗原的结合的控制是可逆的。可以与这样癌组织中的癌细胞或免疫细胞等病原细胞结合、或与癌组织中分泌的抗原结合发挥药效的本公开的抗原结合分子作为药物组合物有用。本公开的药物组合物中可包含药学上相容的载体。
本公开中，药物组合物通常是指用于疾病的治疗或预防，或检查、诊断的药剂。另外，本公开中，“包含含有针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的药物组合物”的术语既可以说成“包括对治疗对象施用包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的疾病的治疗方法”，也可以说成“包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子在制备用于治疗疾病的药物中的用途”。另外，还可将“包含含有针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的药物组合物”的术语说成“包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子在治疗疾病中的用途”。
本公开的药物组合物可使用本领域技术人员公知的方法来进行制剂化。例如，可以以水或其以外的药学上可相容的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以适宜组合药理学上相容的载体或介质、具体地、适宜组合灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等，以通常所认可的制药实践所要求的单位用量形态进行混和，由此进行制剂。设定这些制剂中的有效成分量，以便可得到指示范围的适当容量。
用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水之类的载体按照通常的制剂实践来进行制备。作为注射用水溶液，可举出例如生理盐水、包含葡萄糖或其它辅助药(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠)的等渗液。可以并用适当的溶解助剂，例如，醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50等)。
油性液可举出芝麻油、大豆油，还可以并用苯甲酸苄酯和/或苯甲醇作为溶解助剂。此外，还可以与缓冲剂(例如、磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液)、止痛剂(例如、盐酸普鲁卡因)、稳定剂(例如、苯甲醇和苯酚)、抗氧化剂配合。所制备的注射液通常填充于适当的安瓿中。
本公开的药物组合物优选通过非口服给药来施用。施用例如注射剂型、经鼻施用剂型、经肺施用剂型、经皮施用型的组合物。通过例如静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等可全身或局部施用。
施用方法可根据患者的年龄、症状而适宜选择。含有抗原结合分子的药物组合物的施用量可设定为例如对于一次给药体重每1kg为0.0001mg至1000mg的范围。或者，可设定例如每个患者为0.001～100000mg的施用量，本公开不受上述数值的限制。施用量和施用方法根据患者的体重、年龄、症状等而改变，本领域技术人员可以考虑这些条件设定适当的施用量和施用方法。
依赖于MTA结合的抗原结合分子的利用方法
本公开中依赖于MTA结合的抗原结合分子可以与各种现有的药物用途技术组合。作为这样的技术的组合的非限定的一个方案，可例示利用依赖于MTA结合的抗原结合分子的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)的制备。作为CAR-T的非限定性制备方法之一，列举下列方法：将能够与肿瘤关联抗原特异性结合的抗原结合分子连接于TCR的细胞外结构域，另外，将以增强T细胞的活化为目的将CD28等共刺激分子的信号结构域连接于细胞内的嵌合受体通过基因改变技术导入以T细胞为主的效应细胞。作为前述与肿瘤关联抗原特异性结合的抗原结合分子，通过使用本公开中依赖于MTA结合的抗原结合分子，CAR-T细胞可以以MTA积累的肿瘤组织特异性地与抗原结合。
另外，作为可以与本公开的依赖于MTA结合的抗原结合分子组合的技术的非限定的实例，可列举应用病毒载体等将编码依赖于MTA结合的抗原结合分子的核酸整合到生物体内，直接表达该抗原结合分子的方法。作为病毒载体，可例示腺病毒，但不限于此。另外，不应用病毒载体，通过电穿孔法或直接施用核酸的方法等，也可以将编码依赖于MTA结合的抗原结合分子的核酸直接整合到生物体内，也可以通过将基因改变的细胞施用于生物体使该抗原结合分子分泌表达，使该抗原结合分子连续地在生物体内分泌。
寡核苷酸
本说明书中应用的“寡核苷酸”通常不足约200个核苷酸长，但不一定如此，通常指单链的合成多核苷酸。术语“寡核苷酸”及“多核苷酸”彼此不排斥。与多核苷酸有关的上述的说明等同且完全适用于寡核苷酸。本说明书中，“寡核苷酸”及“核酸”互换使用。
“编码包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的分离的多核苷酸”指编码包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的1个或多个多核苷酸分子，包括置于1个载体或分开的载体中的多核苷酸分子及存在于宿主细胞中的1个或多个位置的多核苷酸分子。该抗原结合分子是抗体时，前述多核苷酸指编码抗体的重链及轻链(或其片段)的1个或多个多核苷酸分子，包括置于1个载体或分开的载体中的多核苷酸分子，及存在于宿主细胞中的1个或多个位置的多核苷酸分子。
载体
本说明书中应用的术语“载体”指可以增加与其连接的另1个核酸的核酸分子。此术语包括作为自身复制核酸结构的载体，及导入了该载体的宿主细胞的基因组中整合的载体。某些载体可以进行与其可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本说明书中也称为“表达载体”。表达载体可以通过应用病毒的方法或电穿孔法等导入宿主细胞，但表达载体的导入不限于在生物体外的导入，也可以将载体直接导入生物体。
宿主细胞
术语“宿主细胞”、“宿主细胞株”、及“宿主细胞培养物”可以彼此交换应用，指导入了外来核酸的细胞(包括这样的细胞的后代)。宿主细胞包括“转化体”及“转化细胞”，其中包括原代的转化细胞及来自该细胞的后代(不论其传代数)。后代、亲本细胞和核酸的内容可以不完全相同，也可以包含突变。具有与筛选或选择起初的转化细胞时应用的那些相同的功能或生物学活性的突变体后代也包含在本说明书中。
重组的方法及组成
例如，如美国专利第4,816,567号记载的，抗原结合分子可以应用重组的方法和组成进行制备。在一个方案中，提供本说明书中记载的编码包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的分离的核酸。在针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域包含抗体可变区的方案中，这样的核酸也可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含VH的氨基酸序列(例如，抗体的轻链和/或重链)。在进一步的方案中，提供包含这样的核酸的1个或多个载体(例如，表达载体)。在进一步的方案中，提供包含这样的核酸的宿主细胞。在这样的方案中的一个中，宿主细胞包含：(1)载体，其包含：编码包含抗原结合分子的VL的氨基酸序列及包含抗原结合分子的VH的氨基酸序列的核酸，或(2)第一载体，其包含：编码包含抗原结合分子的VL的氨基酸序列的核酸；和第二载体，其包含：编码包含抗原结合分子的VH的氨基酸序列(例如，转化的)。在一个方案中，宿主细胞是真核细胞(例如，中国仓鼠卵巣(CHO)细胞)或淋巴系统的细胞(例如，Y0、NS0、Sp2/0细胞))。在一个方案中，提供制备包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的方法，其包括：在对包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的表达优选的条件下，如上述培养包含编码该抗原结合分子的核酸的宿主细胞，及任选从宿主细胞(或宿主细胞培养培养基)回收该抗体。
为了重组制备包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子，分离编码(例如，上述那种等)抗原结合分子的核酸，进一步为了克隆和/或在宿主细胞中表达，将其插入1个或多个载体。这样的核酸将应用常规顺序容易地分离及确定序列(例如，在抗体的情形中，应用可以与编码抗体的重链及轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
对编码包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的载体的克隆或表达优选的宿主细胞包含本说明书中记载的原核细胞或真核细胞。例如，抗体也可以在细菌中制备，特别是在不需要糖基化及Fc效应器功能的情形中。关于在细菌中抗体片段及多肽的表达，例如，参考美国专利第5,648,237号、第5,789,199号、及第5,840,523号。(此外，也参考关于大肠杆菌中抗体片段的表达记载的Charlton,Methods inMolecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ,2003),pp.245-254。)表达后，包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子也可以从细菌细胞糊分离到可溶性级分中，此外可以进一步纯化。
除了原核生物，还包含伴随部分或完全的人糖基化模式使抗原结合分子产生、糖基化途径“人源化”的菌类及酵母的株，丝状真菌或酵母等的真核微生物是抗原结合分子编码载体的优选克隆或表达宿主。参考Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)及Liet al.,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
另外，来自多细胞生物(无脊椎生物及脊椎生物)的那种是用于糖基化的抗原结合分子的表达的优选宿主细胞。无脊椎生物细胞的实例包含植物及昆虫细胞。鉴定了用于与昆虫细胞的接合、特别是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转化的多数杆状病毒株。
植物细胞培养物也可以用作宿主。例如，参考美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、及第6,417,429号(记载了用于在转基因植物中产生抗原结合分子的PLANTIBODIES(商标)技术)。
另外，脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，以浮游状态增殖适应的哺乳动物细胞株是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞株的其它实例是：用SV40转化的猴肾CV1株(COS-7)；人胎儿性肾株(Graham et al.,J.Gen Virol.36:59(1977)等中记载的293或293细胞)；仔仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持(sertoli)细胞(Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)等中记载的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo系大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳癌(MMT 060562)；TRI细胞(例如，Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中记载)；MRC5细胞；及FS4细胞等。其它有用的哺乳动物宿主细胞株包括包含DHFR-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))的中国仓鼠卵巣(CHO)细胞；及Y0、NS0、及Sp2/0等骨髓瘤细胞株。作为对抗原结合分子产生优选的特定的哺乳动物宿主细胞株的概述，例如，参考Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。另外，宿主细胞的实例不限于动物细胞株。当然可以使用以从生物体提取的效应细胞和间质干细胞(MSC)为首的各种细胞作为宿主细胞。
包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的 筛选方法
本公开提供筛选包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的方法。根据本公开的记载事项，可以获得针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。作为获得方法的非限定的一个方案，以下示例几个其具体实例。
例如，为了确认在第1浓度的MTA存在下抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性与在第2浓度的MTA存在下抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性不同，进行比较第1浓度的MTA存在下及第2浓度的MTA存在下抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性。为了选择针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域，进行，选择第1浓度的MTA存在下及第2浓度的MTA存在下抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性不同的抗原结合结构域。第1浓度与第2浓度是不同浓度，这些浓度的任一方可以设为0(即，MTA不存在)。
第1浓度设定为比第2浓度高的浓度时，可例示以下的获得方法。
为了获得MTA高浓度存在下抗原结合活性比MTA低浓度存在下抗原结合活性高的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)，选择第1浓度的抗原结合活性比第2浓度的抗原结合活性高的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。
在获得MTA存在下抗原结合活性比MTA不存在下抗原结合活性高的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)中，将第2浓度设定为0的基础上，选择第1浓度的抗原结合活性比第2浓度的抗原结合活性高的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。
在选择第1浓度的MTA存在下抗原结合活性比第2浓度的MTA存在下抗原结合活性高的抗原结合结构域中，只要第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性高，则第1浓度的MTA存在下抗原结合活性与第2浓度的MTA存在下抗原结合活性的差没有特别限定，优选地，第1浓度的MTA存在下抗原结合活性是第2浓度的MTA存在下抗原结合活性的2倍以上，进一步优选地10倍以上，更优选地40倍以上。该抗原结合活性的差的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制备，可以为400倍、1000倍、10000倍等所有值。在第2浓度的MTA存在下观察不到针对抗原的结合活性的情形中，此上限为无限大的数值。
在获得MTA高浓度存在下抗原结合活性比MTA低浓度存在下抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)中，选择第1浓度的抗原结合活性比第2浓度的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。
在获得MTA存在下抗原结合活性比MTA不存在下抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)中，将第2浓度设定为0的基础上，选择第1浓度的抗原结合活性比第2浓度的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。
在选择第1浓度的MTA存在下抗原结合活性比第2浓度的MTA存在下抗原结合活性低的抗原结合结构域中，只要第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性低，第1浓度的MTA存在下抗原结合活性与第2浓度的MTA存在下抗原结合活性的差没有特别限定，优选地，第2浓度的MTA存在下抗原结合活性是第1浓度的MTA存在下抗原结合活性的2倍以上，进一步优选地10倍以上，更优选地40倍以上。该抗原结合活性的差的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制备，可为400倍、1000倍、10000倍等所有值。在第1浓度的MTA存在下没有观察到针对抗原的结合活性的情形中，此上限为无限大的数值。
进一步本公开中，“MTA存在下针对抗原的结合活性比MTA不存在下针对抗原的结合活性高”的表述也可以表述为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA不存在下针对抗原的结合活性比MTA存在下针对抗原的结合活性低”。另外，本公开中，有时也将“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA不存在下针对抗原的结合活性比MTA存在下针对抗原的结合活性低”记载为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA不存在下针对抗原的结合活性比MTA存在下针对抗原的结合活性弱”。
进一步本公开中，称为“第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比前述第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性高”及“第1浓度是比前述第2浓度高的浓度”的表述也可以表述为“MTA的高浓度存在下针对抗原的结合活性比MTA的低浓度存在下针对抗原的结合活性高”、或“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA的低浓度存在下针对抗原的结合活性比MTA的高浓度存在下针对抗原的结合活性低”。另外，本公开中，有时也将“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA的低浓度存在下针对抗原的结合活性比MTA的高浓度存在下针对抗原的结合活性低”记载为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA的低浓度存在下针对抗原的结合活性比MTA的高浓度存在下针对抗原的结合活性弱”。
对于测定针对抗原的结合活性时除了MTA的浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜选择，并无特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)与抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型分子时，通过对固定有抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的芯片加载抗原作为分析物，可以评价对可溶型分子的结合活性；在抗原为膜型分子时，通过对固定有抗原的芯片加载抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)作为分析物，可以评价对膜型分子的结合活性。
与上述的MTA同样，对于包含MTA类似体的其它低分子化合物，也可以比较抗原结合结构域(或抗原结合分子)在不同低分子化合物浓度的抗原结合活性。作为这样的低分子化合物的具体实例，例如，可以示例S-腺苷蛋氨酸(SAM：S-adenoshylmethionine)、S-腺苷高半胱氨酸(SAH：S-adenosylhomocystein、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸)等多胺生物合成途径的代谢产物(Stevens等(J Chromatogr A.2010 May 7；1217(19):3282-8))，此外嘌呤核苷酸代谢途径中的代谢产物AMP、ADP、ATP或者腺苷等，但不限于这些。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使包含抗原结合结构域的抗原结合分子在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使包含抗原结合结构域的抗原结合分子在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中的抗原结合活性比前述步骤(b)中确认了与抗原结合的基准弱的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使包含能够与MTA结合的抗原结合结构域的抗原结合分子在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使包含能够与MTA结合的抗原结合结构域的抗原结合分子在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性比前述步骤(b)中确认了与抗原结合的基准弱的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)在第1浓度的MTA存在下使包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子不与抗原结合的步骤，
(c)将前述不与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子在第2浓度的MTA存在下与抗原结合的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下(1)至(c)的步骤：
(1)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(a)使展示了前述步骤(1)及(2)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下(1)至(d)的步骤：
(1)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(a)使展示了前述步骤(1)及(2)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于第2浓度的MTA存在下的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)第1浓度的MTA存在下使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中不与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)使前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子在第2浓度的MTA存在下与抗原结合的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使包含抗原结合结构域的抗原结合分子在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使包含抗原结合结构域的抗原结合分子在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性比前述步骤(b)中确认了与抗原结合的基准弱的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使包含能够与MTA结合的抗原结合结构域的抗原结合分子在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使包含能够与MTA结合的抗原结合结构域的抗原结合分子在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性比前述步骤(b)中确认了与抗原结合的基准弱的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)在MTA存在下使包含抗原结合结构域的抗原结合分子与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述包含抗原结合结构域的抗原结合分子不与抗原结合的步骤，
(c)使前述不与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子在不存在MTA的条件下与抗原结合的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(c)：
(a)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)；
(a)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下(1)至(c)的步骤：
(1)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(a)使展示了前述步骤(1)及(2)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(c)分离前述步骤(b)中解离的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下(1)至(d)的步骤：
(1)使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(a)使展示了前述步骤(1)及(2)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子置于不存在MTA的条件的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的筛选方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)在MTA存在下使展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中不与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤，
(c)使前述步骤(b)中选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子在不存在MTA的条件下与抗原结合的步骤，及
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
作为展示了包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库，可以使用天然人抗体展示文库、合成人抗体展示文库、或后述通过本公开完成的文库。
通过前述筛选方法筛选的本公开的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以是任意的抗原结合结构域(或抗原结合分子)，例如，可以筛选上述的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域(或抗原结合分子)，也可以筛选氨基酸序列被置换的抗原结合结构域(或抗原结合分子)。
包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的 制备方法
本公开的一个侧面提供包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子的制备方法。
按照本公开的记载事项，可以获得针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。作为获得方法的非限定的一个方案，以下示例几个其具体实例。
例如，为了确认在第1浓度的MTA存在下抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性与第2浓度的MTA存在下抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性不同，比较第1浓度的MTA存在下及第2浓度的MTA存在下抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性。为了选择针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域，进行，选择第1浓度的MTA存在下及第2浓度的MTA存在下抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)对抗原的结合活性不同的抗原结合结构域。第1浓度与第2浓度是不同浓度，这些的浓度的任一方可以设为0(即，MTA不存在)。
第1浓度设定为比第2浓度高的浓度的情形中，可例示以下的获得方法。
为了获得MTA高浓度存在下抗原结合活性比MTA低浓度存在下抗原结合活性高的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)，选择第1浓度的抗原结合活性比第2浓度的抗原结合活性高的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。
在获得MTA存在下抗原结合活性比MTA不存在下抗原结合活性高的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)中，将第2浓度设定为0的基础上，选择第1浓度的抗原结合活性比第2浓度的抗原结合活性高的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。
在选择第1浓度的MTA存在下抗原结合活性比第2浓度的MTA存在下抗原结合活性高的抗原结合结构域中，只要第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性高，第1浓度的MTA存在下抗原结合活性与第2浓度的MTA存在下抗原结合活性的差没有特别限定，优选地，第1浓度的MTA存在下抗原结合活性是第2浓度的MTA存在下抗原结合活性的2倍以上，进一步优选地10倍以上，更优选地40倍以上。该抗原结合活性的差的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制备，可以为400倍、1000倍、10000倍等所有值。在第2浓度的MTA存在下观察不到针对抗原的结合活性的情形中，此上限为无限大的数值。
在获得MTA高浓度存在下抗原结合活性比MTA低浓度存在下抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)中，选择第1浓度的抗原结合活性比第2浓度的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。
在获得MTA存在下抗原结合活性比MTA不存在下抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)中，将第2浓度设定为0的基础上，选择第1浓度的抗原结合活性比第2浓度的抗原结合活性低的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)。
在选择第1浓度的MTA存在下抗原结合活性比第2浓度的MTA存在下抗原结合活性低的抗原结合结构域中，只要第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性低，对第1浓度的MTA存在下抗原结合活性与第2浓度的MTA存在下抗原结合活性的差没有特别限定，优选地，第2浓度的MTA存在下抗原结合活性是第1浓度的MTA存在下抗原结合活性的2倍以上，进一步优选地10倍以上，更优选地40倍以上。该抗原结合活性的差的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制备，可为400倍、1000倍、10000倍等任何值。在第1浓度的MTA存在下没有观察到针对抗原的结合活性的情形中，此上限为无限大的数值。
通过培养导入了编码选择的包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞，从细胞的培养液回收抗原结合分子，可以制备包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子。
进一步本公开中，称为“MTA存在下针对抗原的结合活性比MTA不存在下针对抗原的结合活性高”的表述也可以表述为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA不存在下针对抗原的结合活性比MTA存在下针对抗原的结合活性低”。另外，本公开中，有时也将“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA不存在下针对抗原的结合活性比MTA存在下针对抗原的结合活性低”记载为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA不存在下针对抗原的结合活性比MTA存在下针对抗原的结合活性弱”。
进一步本公开中，称为“第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性比前述第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性高”及“第1浓度是比前述第2浓度高的浓度”的表述也可以表述为“MTA的高浓度存在下针对抗原的结合活性比MTA的低浓度存在下针对抗原的结合活性高”、或“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA的低浓度存在下针对抗原的结合活性比MTA的高浓度存在下针对抗原的结合活性低”。另外，本公开中，有时也将“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA的低浓度存在下针对抗原的结合活性比MTA的高浓度存在下针对抗原的结合活性低”记载为“抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的MTA的低浓度存在下针对抗原的结合活性比MTA的高浓度存在下针对抗原的结合活性弱”。
对于测定抗原结合活性时的MTA的浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜选择，并无特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、37℃的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore(GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)与抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型分子时，通过对固定有抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)的芯片加载抗原作为分析物，可以评价对可溶型分子的结合活性；在抗原为膜型分子时，通过对固定有抗原的芯片加载抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)作为分析物，可以评价对膜型分子的结合活性。
与上述的MTA同样，对于包含MTA类似体的其它低分子化合物，也可以比较抗原结合结构域(或抗原结合分子)在不同低分子化合物浓度的抗原结合活性。作为这样的低分子化合物的具体实例，例如，可以示例S-腺苷蛋氨酸(SAM：S-adenoshylmethionine)、S-腺苷高半胱氨酸(SAH：S-adenosylhomocystein、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸)等多胺生物合成途径的代谢产物(Stevens等(J Chromatogr A.2010 May 7；1217(19):3282-8))，此外嘌呤核苷酸代谢途径中的代谢产物AMP、ADP、ATP或者腺苷等，但不限于这些。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使抗原结合结构域在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使抗原结合结构域在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性比前述步骤(b)中确认了与抗原结合的基准弱的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使可以与MTA结合的抗原结合结构域在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使可以与MTA结合的抗原结合结构域在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性比前述步骤(b)中确认了与抗原结合的基准弱的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(e)：
(a)在第1浓度的MTA存在下使抗原结合结构域与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域不与抗原结合的步骤，
(c)使前述不与抗原结合的抗原结合结构域在第2浓度的MTA存在下与抗原结合的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使展示了抗原结合结构域的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使展示了抗原结合结构域的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下(1)～(d)的步骤：
(1)使展示了抗原结合结构域的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的抗原结合结构域的步骤，
(a)使展示了前述步骤(1)及(2)中选择的抗原结合结构域的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下(1)～(e)的步骤：
(1)使展示了抗原结合结构域的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的抗原结合结构域的步骤，
(a)使展示了前述步骤(1)及(2)中选择的抗原结合结构域的文库在第1浓度的MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域置于第2浓度的MTA存在下的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(e)：
(a)在第1浓度的MTA存在下使展示了抗原结合结构域的文库与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)使前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在第2浓度的MTA存在下与抗原结合的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使抗原结合结构域在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使抗原结合结构域在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性比前述步骤(b)中确认了与抗原结合的基准弱的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使可以与MTA结合的抗原结合结构域在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使可以与MTA结合的抗原结合结构域在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域与抗原结合的步骤，
(c)将与前述抗原结合的前述抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性比前述步骤(b)中确认了与抗原结合的基准弱的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(e)：
(a)在MTA存在下使抗原结合结构域与抗原接触的步骤，
(b)确认前述步骤(a)中前述抗原结合结构域不与抗原结合的步骤，
(c)使前述不与抗原结合的抗原结合结构域在不存在MTA的条件下与抗原结合的步骤，
(d)前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域を分离する步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(d)：
(a)使展示了抗原结合结构域的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下的步骤(a)～(e)；
(a)使展示了抗原结合结构域的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下(1)至(d)的步骤：
(1)使展示了抗原结合结构域的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的抗原结合结构域的步骤，
(a)使展示了前述步骤(1)及(2)中选择的抗原结合结构域的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)将前述步骤(a)中结合的抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(c)分离前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域的步骤，及
(d)培养导入了编码包含前述步骤(c)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下(1)至(e)的步骤：
(1)使展示了抗原结合结构域的文库与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的抗原结合结构域的步骤，
(a)使展示了前述步骤(1)及(2)中选择的抗原结合结构域的文库在MTA存在下与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)将前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域置于不存在MTA的条件的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中选择的基准的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
在非限定的一个方案中，本公开提供抗原结合分子的制备方法，其包含以下步骤(a)～(e)：
(a)在MTA存在下使展示了抗原结合结构域的文库与抗原接触的步骤，
(b)选择前述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，
(c)使前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域在不存在MTA的条件下与抗原结合的步骤，
(d)分离前述步骤(c)中与抗原结合的抗原结合结构域的步骤，及
(e)培养导入了编码包含前述步骤(d)中分离的抗原结合结构域的抗原结合分子的多核苷酸可操作地连接的载体的细胞、从细胞的培养液回收包含抗原结合结构域的抗原结合分子的步骤。
作为展示了抗原结合结构域的文库，可以使用天然人抗体展示文库、合成人抗体展示文库、或通过后述本公开完成的文库。
本公开的制备方法中，分离的抗原结合结构域是由文库中选择得到时，如后述实施例中所述，编码该抗原结合结构域的多核苷酸通过通常的基因扩增由噬菌体等病毒分离。另外，如此分离的抗原结合结构域或抗体是由杂交瘤等细胞的培养液中选择得到时，如前述抗体一项中所示，抗体基因等通过通常的基因扩增由该细胞分离。
通过前述的制备方法制备的本公开的抗原结合分子可以是所有抗原结合分子，例如，可以制备具有天然序列的抗原结合分子，也可以制备置换了氨基酸序列的抗原结合分子。
文库
本说明书中“文库”是指序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子、或/和编码序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸或多核苷酸。文库中包含的包含抗原结合结构域的抗原结合分子、或/和编码包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸的序列不是单一的序列，是序列彼此不同的多个抗原结合分子或/和编码序列彼此不同的多个抗原结合分子的核酸。
根据某一个方案，本公开的抗原结合结构域(或包含该结构域的抗原结合分子)可以从文库获得，该文库主要包含：抗原结合结构域中包含使针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的至少一个氨基酸残基的序列彼此不同的多个抗原结合分子、或/和编码序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸。以下对于文库进行示例，所述文库主要包含：抗原结合结构域中包含使针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的至少一个氨基酸残基的序列彼此不同的多个抗原结合分子、或/和编码序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸。
对于包含具有使针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的氨基酸残基的抗原结合结构域的抗原结合分子文库，针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域及包含这样的抗原结合结构域的抗原结合分子可以有效获得。作为本说明书中“文库”的方案，不仅提供能够有效获得包含MTA开关抗原结合结构域、即MTA存在下与靶抗原结合但MTA不存在下不与靶抗原结合的抗原结合结构域的抗原结合分子、或包含高浓度MTA存在下与靶抗原结合但低浓度MTA存在下不与靶抗原结合的抗原结合结构域的抗原结合分子的文库，也能够提供能够有效获得包含MTA逆开关抗原结合结构域、即MTA不存在下与靶抗原结合但MTA存在下不与靶抗原结合的抗原结合结构域的抗原结合分子、及包含低浓度MTA存在下与靶抗原结合但高浓度MTA存在下不与靶抗原结合的抗原结合结构域的抗原结合分子的文库。
在本公开中一个实施方式中，可以制备本公开的抗原结合分子与异种多肽的融合多肽。在某一实施方式中，融合多肽可以通过与病毒外壳蛋白、例如选自pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI及其突变体的病毒外壳蛋白的至少一部融合得到。
在某实施方案中，本公开的抗原结合分子可以是ScFv、Fab片段、F(ab)2或F(ab')2，在另一个实施方案中，提供主要包含序列彼此不同的多个融合多肽的文库，该融合多肽是这些抗原结合分子与异源多肽的融合多肽。具体地，提供主要包含序列彼此不同的多个融合多肽的文库，该融合多肽是这些抗原结合分子与病毒外壳蛋白，例如选自pIII、pVIII、pVII、pIX、Soc、Hoc、gpD、pVI和其突变体的病毒外壳蛋白的至少一部分融合得到的融合多肽。本公开的抗原结合分子还可以包含二聚体化结构域。在某实施方案中，前述二聚体化结构域可以存在于抗体的重链或轻链可变区与病毒外壳蛋白的至少一部分之间。该二聚体化结构域中可以包含至少1个二聚体化序列、和/或1个或多个包含半胱氨酸残基的序列。该二聚体化结构域可优选与重链可变区或恒定区的C末端连接。二聚体化结构域，取决于前述抗体可变区是否是以与病毒的外壳蛋白成分的融合多肽成分的形式制作的(二聚体化结构域的后面不具有琥珀终止密码子)，或取决于前述抗体可变区是否是主要以不含病毒外壳蛋白成分的方式制作的(例如，二聚体化结构域的后面具有琥珀终止密码子)，可以呈现各种结构。前述抗体可变区主要是以与病毒的外壳蛋白成分的融合多肽的形式制作时，通过1个或多个二硫键和/或单一的二聚体化序列而实现二价呈递。
作为本公开的文库的非限定的一个方案，列举具有1.2×108以上的多样性的文库，即，包含1.2×108以上的序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子、或编码序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸的文库。
本说明书中，“序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子”记载中的“序列彼此不同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列彼此不同。即，文库中的彼此不同的序列的数量反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被称为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库为106至1012，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至1014。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体粒子的实际数目通常比文库大小大10至10000倍。该超过倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至10000个。所以，本公开中的“序列彼此不同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列彼此不同，更具体意指序列彼此不同的抗原结合分子存在106至1014个分子、优选107至1012个分子、进一步优选108至1011、特别优选108至1010。
另外，本公开的主要包含序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子、或/和编码序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸的文库的记载中的术语“多个”，对于例如，本公开的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒，通常是指这些物质的两种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面相互不同，则表示该物质存在2种以上。作为实例，可举出氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到氨基酸突变的突变体。例如，特定的氨基酸位点的氨基酸以外具有实质上相同、优选为相同序列的2个以上的抗原结合分子时，抗原结合分子存在多个。在其它实例中，如果编码特定的氨基酸位点的氨基酸的碱基以外具有实质上相同、优选为相同序列的2个以上的多核苷酸分子，则多核苷酸分子存在多个。
进一步，本公开的主要包含序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子、或/和编码序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸的文库的记载中的术语“主要包含”反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合分子对抗原的结合活性依赖于MTA而不同的抗原结合分子的数量。具体地，优选表现出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在104个分子。此外，更优选本公开的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在105个分子的文库中获得。进一步优选本公开的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在106个分子的文库中获得。特别优选本公开的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在107个分子的文库中获得。还优选本公开的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在108个分子的文库中获得。在其它表现中，也可适宜地表现为文库中的序列不同的独立克隆的数量中，抗原结合结构域对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合分子的比例。具体地，本公开的抗原结合结构域可以由显示这种结合活性的抗原结合分子占文库中的序列不同的独立克隆的数量的10-6％％至80％、优选10-5％至60％、更优选10-4％至40％的文库获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形中也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表现。此外，病毒的情形中也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表现。作为本公开的非限定的一个方案，结合多个抗原结合分子的抗原为1种时，显示这种结合活性的抗原结合分子在文库中优选存在至少10个分子、100个分子、1000个分子、104个分子、105个分子、106个分子、107个分子或108个分子。另外，更优选本公开的抗原结合结构域可由显示这种结合活性的抗原结合分子至少存在10个分子的文库获得。进一步优选本公开的抗原结合结构域可由显示这种结合活性的抗原结合分子至少存在100个分子的文库获得。特别优选本公开的抗原结合结构域可由显示这种结合活性的抗原结合分子至少存在1000个分子的文库获得。
在一个侧面中，本公开提供了包含多个抗体可变区或/和编码抗体可变区的核酸的文库。
在非限定的一个方案中，本公开的文库中包含的或者本公开的文库中包含的核酸编码的多个抗体可变区是包含下述的抗体可变区：
包含XAXWMC(SEQ ID NO:65)的H-CDR1；
包含CIFAXXXYXXSGGSTYYASWAKG(SEQ ID NO:66)的H-CDR2；
包含GXGXXXGXXDEL(SEQ ID NO:67)H-CDR3；
包含QSSEXVXXXXLS(SEQ ID NO:68)的L-CDR1；
包含XAXTXPX(SEQ ID NO:69)的L-CDR2；及
包含AGLYXGNIPA(SEQ ID NO:70)的L-CDR3。
此处，X指任意氨基酸，存在于不同位置的X可以是同种氨基酸，也可以不是同种氨基酸。
在非限定的一个方案中，本公开的文库中包含的或者本公开的文库中包含的核酸编码的多个抗体可变区是包含下述的抗体可变区：
包含XAXWMC(SEQ ID NO:65)的H-CDR1；
包含CIFAX1XXYXXSGGSTYYASWAKG(SEQ ID NO:71)的H-CDR2；
包含GXGXXXGXXDEL(SEQ ID NO:67)的H-CDR3；
包含QSSEXVXXX1XLS(SEQ ID NO:72)的L-CDR1；
包含XAXTXPX(SEQ ID NO:69)的L-CDR2；及
包含AGLYXGNIPA(SEQ ID NO:70)的L-CDR3。
此处，X是任意氨基酸，X1是选自A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及V的氨基酸。进一步，存在于不同位置的X或者X1可以是同种氨基酸，也可以不是同种氨基酸。
在非限定的一个方案中，本公开的文库中包含的或者本公开的文库中包含的核酸编码的多个抗体可变区是包含下述的抗体可变区：
包含XXAXWMC(SEQ ID NO:73)的H-CDR1；
包含CIFAX1XXYXXSGGSTYYASWAKG(SEQ ID NO:71)的H-CDR2；
包含GXGXXXGXXDEL(SEQ ID NO:67)的H-CDR3；
包含QSSEXVXXX1XLS(SEQ ID NO:72)的L-CDR1；
包含XAXTXPX(SEQ ID NO:69)的L-CDR2；及
包含AGLYXGNIPA(SEQ ID NO:70)的L-CDR3。
此处，X是任意氨基酸，X1是选自A、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T及V的氨基酸。进一步，存在于不同位置的X或者X1可以是同种氨基酸，也可以不是同种氨基酸。
在非限定的一个方案中，本公开的文库中包含的或者本公开的文库中包含的核酸编码的多个抗体可变区是包含下述的抗体可变区：
包含XXXWMC(SEQ ID NO:74)的H-CDR1；
包含CIXSXXXXTXYASWVNG(SEQ ID NO:75)的H-CDR2；
包含EXXXXSGALNL(SEQ ID NO:76)的H-CDR3；
包含HSSKXVXXXXXLA(SEQ ID NO:77)的L-CDR1；
包含XAXXLAS(SEQ ID NO:78)的L-CDR2；及
包含QGTYXXXXFYFA(SEQ ID NO:79)的L-CDR3。
此处，X指任意氨基酸，存在于不同位置的X可以是同种氨基酸，也可以不是同种氨基酸。
在非限定的一个方案中，本公开的文库中包含的或者本公开的文库中包含的核酸编码的多个抗体可变区是包含下述的抗体可变区：
包含X2X3X4X5G(SEQ ID NO:80)的H-CDR1；
包含X6IGX7X8X9X10X11WX12PX13WVKX14(SEQ ID NO:81)的H-CDR2；
包含GX15X16X17X18X19X20NAX21DP(SEQ ID NO:82)的H-CDR3；
包含QSSQSVX22X23NNX24LS(SEQ ID NO:83)的L-CDR1；
包含DASTLAS(SEQ ID NO:84)的L-CDR2；及
包含HGX25X26X27X28X29X30X31X32DNX33(SEQ ID NO:85)的L-CDR3；
X2是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X3是选自D、E、F、H、K、N、P、R及Y的氨基酸，
X4是选自A、I、P、T及V的氨基酸，
X5是选自A、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X6是选自D、I及V的氨基酸，
X7是选自A、D、E、G、I、K、Q及R的氨基酸，
X8是选自D、E、F、G、H、I、K、L、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X9是选自A、D、E、F、G、H及S的氨基酸，
X10是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X11是选自A、D、E、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T及V的氨基酸，
X12是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X13是选自A、F、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X14是选自A、F及G的氨基酸，
X15是选自A、E、F、G、H、K、L、Q、R、S、T、W及Y的氨基酸，
X16是选自F、H、K、N、W及Y的氨基酸，
X17是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X18是选自A、D、E、G、H、Q及S的氨基酸，
X19是选自F及Y的氨基酸，
X20是选自N、T及V的氨基酸，
X21是选自F及W的氨基酸，
X22是选自A、E、F、H、I、K、L、N、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X23是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X24是选自A、E、F、G、H、S及Y的氨基酸，
X25是选自A、S及T的氨基酸，
X26是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X27是选自A、D、E、F、G、H、L、N、Q、R、S、T、V及Y的氨基酸，
X28是选自A、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X29是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y的氨基酸，
X30是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、V、W及Y的氨基酸，
X31是选自A、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X32是选自A、F、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W及Y的氨基酸，
X33是选自A及G的氨基酸。
未改变体(模板，template)
在本公开的一个方案中，包含具有使针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的氨基酸残基的抗原结合结构域的抗原结合分子文库中的抗原结合结构域是抗体可变区，对该文库中包含的或者该文库中包含的核酸编码的“多个抗原结合分子”中包含的抗原结合结构域而言，包含与位于对MTA具有结合活性的抗体可变区未改变体中的1个或多个氨基酸位点的氨基酸具有不同氨基酸的、序列彼此不同的多个抗体可变区改变体。
在非限定的一个方案中，前述抗体可变区未改变体是对MTA具有结合活性的抗体可变区。在详细的一个方案中，本公开的抗体可变区未改变体也可以是不与腺苷或/和S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)实质性地结合的抗体可变区。在详细的其它方案中，本公开的抗体可变区未改变体也可以是对腺苷也具有结合活性的抗体可变区。另外，本公开的抗体可变区未改变体也可以是对(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、AMP、ADP或/和ATP也具有结合活性的抗体可变区。
对MTA具有结合活性的抗体可变区未改变体可以从对MTA具有结合活性的抗体获得。
由于可以在设计包含具有使针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的氨基酸残基的抗原结合结构域的抗原结合分子的文库时作为起始分子使用，本说明书中有时也称为“模板”或“template”。
在非限定的一个方案中，本公开的抗体可变区未改变体也可以是下述任一：
a)包含SEQ ID NO:46所示的重链可变区和SEQ ID NO:47所示的轻链可变区的抗体可变区；
b)包含SEQ ID NO:50所示的重链可变区和SEQ ID NO:51所示的轻链可变区的抗体可变区；
c)包含SEQ ID NO:48所示的重链可变区和SEQ ID NO:49所示的轻链可变区的抗体可变区；
d)包含SEQ ID NO:52所示的重链可变区和SEQ ID NO:53所示的轻链可变区的抗体可变区；
e)具有SEQ ID NO:31所示的重链可变区和SEQ ID NO:32所示的轻链可变区的抗体可变区。
关于本公开中制作文库时使用的起始分子(模板、template)的获得方法(筛选方法)，这些抗原结合结构域等可以任意制备，可以使用预先存在的抗原结合结构域或抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤、或来自免疫动物的B细胞制作的抗体或文库、由通过例如但不限于适当连接了包含MTA的低分子化合物的免疫原性高的T细胞表位肽等与佐剂的缀合物(conjugate)免疫的动物的B细胞等免疫细胞制作的抗体或文库等。作为该T细胞表位肽的非限定的一个实例，可优选举出来源于破伤风毒素的p30辅助肽(由SEQ ID NO:4所示，也称为Fragment C(FrC))等。
作为通过前述的筛选方法获得的本发明的抗原结合结构域的非限定的一个方案，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scFv(单链Fv)”、“单链抗体(single chain antibody)”、“Fv”、“scFv2(单链Fv 2)”、“Fab”或“F(ab')2”或IgG等，也可以使用由它们构成的文库。
进一步，作为通过前述的筛选方法获得的本发明的抗原结合结构域或者抗原结合分子的制备法的非限定的1个方案，可以采用下述方法：使用前述文库，通过淘选制备对低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子。作为文库，并不限定于此，可使用噬菌体展示文库、核糖体展示文库、mRNA展示文库、cDNA展示文库、CIS展示文库、大肠杆菌展示文库、革兰氏阳性菌展示文库、酵母展示文库、哺乳类细胞展示文库、病毒展示文库、体外病毒展示文库等。
作为通过前述淘选制备对低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域或抗原结合分子的方法的1个方案，可以使用固定化于珠子等载体的低分子化合物。经固定化的低分子化合物可以通过使以通过接头与生物素化学连接的状态合成的低分子化合物与固定有链霉亲和素、中性亲和素的珠子或板接触的方法；将与牛血清白蛋白(BSA)等佐剂通过共价键而连接的低分子化合物通过疏水相互作用而与珠子或板接合的方法等来制作，但并不限定于此。这些方法已经公知(J Immunol Methods.2003 Sep；280(1-2):139-55、BMCBiotechnol.2009 Jan 29；9:6.doi:10.1186/1472-6750-9-6)。通过回收这些经固定化的对低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域或者抗原结合分子，可以制备对低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域或者抗原结合分子。
或者，作为前述通过淘选制备对低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域或者抗原结合分子的方法的另外的1个方案，可以使用经荧光标记的低分子化合物、经生物素标记的低分子化合物以及经荧光标记的链霉亲和素(或中性亲和素或亲和素)。使呈递于细胞等的表面的文库与该经荧光标记的低分子化合物、或经生物素标记的低分子化合物以及经荧光标记的链霉亲和素(或中性亲和素或亲和素)接触后，通过使用荧光活化细胞分选(FACS)法，可以制备对该低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域或者抗原结合分子。这些方法已经公知(Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Sep 26；97(20):10701-5.)。
另外，作为通过前述筛选方法获得的本公开的抗原结合结构域或者抗原结合分子的制备法的非限定的1个方案，可以使用预先存在的对低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域。例如，并不限定于此，以MTA为例时，可应用具有与MTA的结合活性的抗原结合结构域、针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域、具有与MTA相互作用的氨基酸残基的抗原结合结构域。
改变体
本公开中“改变体”指与亲本序列的未改变体相比，有至少1个或其以上的氨基酸被置换的亲本序列的各个不同改变体。
在一个方案中，为了制备本公开的抗体可变区改变体，为了制备前述的抗体可变区未改变体的重链可变区或轻链可变区的序列、或者CDR序列或框架序列中包含的抗原结合分子，可以适宜采用位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1985)82,488-492))或重叠延伸PCR等公知方法。
在非限定的一个方案中，本公开的文库中包含的抗体可变区改变体具有与抗体可变区未改变体不同的氨基酸的氨基酸位点位于重链和/或轻链的CDR1、CDR2、和/或CDR3。在非限定的其它的一个方案中，前述抗体可变区改变体具有与抗体可变区未改变体不同的氨基酸的氨基酸位点位于重链和/或轻链的FR1、FR2、FR3和/或FR4。
只要抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列与MTA相互作用的氨基酸包含在重链和/或轻链的抗原结合结构域，任何框架序列都可以使用。框架序列的起源没有限定，可以由非人动物的任意生物或人获得。优选地，作为任意生物，优选可举出选自小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼、和非人灵长类中的生物。在特别地优选的实施方式中，抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列期望具有人的生殖细胞系框架序列。因此，在本公开的一个方案中，如果框架序列完全为人的序列，在施用人(例如疾病的治疗)的情形中，认为本公开的抗原结合分子几乎不引起或完全不引起免疫原性反应。根据上述含义，本发明的“含有生殖细胞系的序列”意指本发明的框架序列的一部分与任意的人的生殖细胞系框架序列的一部分相同。具体地，本发明的框架序列优选与生殖细胞系序列具有至少50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、或100％以上的同源性。例如，在本公开的抗原结合分子的重链FR2序列为多个不同的人的生殖细胞系框架序列的重链FR2序列组合得到的序列时，该抗原结合分子也是本公开的“含有生殖细胞系的序列”的抗原结合分子。另外，本公开的抗原结合分子的框架序列是经置换的序列时，该抗原结合分子也是本发明的“含有生殖细胞系的序列”的抗原结合分子。作为这种经置换的序列的实例，特别可举出：人的生殖细胞系框架序列的一部分氨基酸被置换成使抗原结合分子对抗原的结合活性根据MTA和/或腺苷的存在或不存在而变化的氨基酸的序列。
作为框架的实例，例如优选列举现在已知的完全人型框架区的序列，其包含在V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中。这些框架区域的序列能够适宜用作本公开的抗原结合分子中所含的生殖细胞系序列。生殖细胞系序列可基于其相似性来分类(Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams及Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)及Cox等(Nat.Genetics(1994)7,162-168))。可以从分类为7个亚类的Vκ、分类为10个亚类的Vλ、分类为7个亚类的VH中适宜选择合适的生殖细胞系序列。
完全人型VH序列并不仅限于下述，优选可举出例如：VH1亚类(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69)、VH2亚类(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3亚类(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4亚类(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5亚类(VH5-51)、VH6亚类(VH6-1)、VH7亚类(VH7-4、VH7-81)的VH序列等。它们也记载于公知文献(Matsuda等(J.Exp.Med.(1998)188,1973-1975))等中，本领域技术人员可以基于它们的序列信息适宜设计本公开的抗原结合分子。也可优选使用它们以外的完全人型框架或框架的亚区域。
完全人型Vκ序列并不仅限于下述序列，优选可举出例如：分类为Vk1亚类的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、L11、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、O2、O4、O8、O12、O14、O18，分类为Vk2亚类的A1、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、O1、O11，分类为Vk3亚类的A11、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25，分类为Vk4亚类的B3，分类为Vk5亚类的B2(本说明书中也称为Vk5-2))、分类为Vk6亚类的A10、A14、A26等(Kawasaki等(Eur.J.Immunol.(2001)31,1017-1028)、Schable及Zachau(Biol.Chem.Hoppe Seyler(1993)374,1001-1022)及Brensing-Kuppers等(Gene(1997)191,173-181))。
完全人型的Vλ序列并不仅限于下述序列，优选可举出例如：分类为VL1亚类的V1-2、V1-3、V1-4、V1-5、V1-7、V1-9、V1-11、V1-13、V1-16、V1-17、V1-18、V1-19、V1-20、V1-22，分类为VL1亚类的V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19，分类为VL3亚类的V3-2、V3-3、V3-4，分类为VL4亚类的V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6，分类为VL5亚类的V5-1、V5-2、V5-4、V5-6等(Kawasaki等(Genome Res.(1997)7,250-261))。
通常，这些框架序列根据一个或其以上的氨基酸残基的区别而彼此不同。作为本公开中使用的完全人型框架的实例，并不仅限于此，另外还可举出KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY、POM等(例如，前述的Kabat等(1991)及Wu等(J.Exp.Med.(1970)132,211-250))。
本公开并不受特定理论的束缚，认为生殖细胞系序列的使用有望排除大多数个体中的有害免疫反应的一个理由如下。通常的免疫反应中产生的亲和性成熟步骤的结果造成免疫球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的CDR的附近，对框架区的残基也造成影响。这些框架的突变在生殖细胞系基因中不存在，此外成为患者的免疫原性的可能性也小。另一方面，通常的人群暴露于生殖细胞系基因所表达的框架序列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些生殖细胞系框架在患者中的免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性达到最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性生殖细胞系基因的集合中选择。
另外，在本公开的非限定的一个方案中，为了提高抗原结合分子的稳定性，也可以适宜改变包含CDR区域和/或框架区域的可变区的氨基酸。作为这样的氨基酸的非限定的一个方案，可示例1位、5位、10位、30位、48位、58位的氨基酸。更具体地，可示例1位的Gln、5位的Gln、10位的Asp、30位的Asn、48位的Leu、58位的Asn。为了提高抗体的稳定性，可以将这些氨基酸置换为生殖细胞系序列中所含的对应的氨基酸。作为这样的生殖细胞系的非限定的一个方案的序列，可示例VH3-21的序列。在该情形中，可以将1位的Gln置换为Glu、5位的Gln置换为Val、10位的Asp置换为Gly、30位的Asn置换为Ser、48位的Leu置换为Val、58位的Asn置换为Tyr。
改变体中的氨基酸改变位点
在非限定的一个方案中，前述抗原结合结构域改变体具有与抗原结合结构域未改变体不同的氨基酸的氨基酸位点是选自下述氨基酸位点的一个或多个氨基酸位点：
1)与前述抗原结合结构域未改变体中不参与与MTA的结合的氨基酸位点对应的氨基酸位点，
2)与前述抗原结合结构域改变体比较，没有显著减弱前述抗原结合结构域改变体与MTA的结合的氨基酸位点，及
3)容易有助于前述抗原结合结构域改变体对抗原的MTA依赖性结合的氨基酸位点。
在非限定的一个方案中，前述抗原结合结构域改变体具有与抗原结合结构域未改变体不同的氨基酸的氨基酸位点是选自下述氨基酸位点的一个或多个氨基酸位点：
1)与前述抗原结合结构域未改变体中不参与与MTA的结合的氨基酸位点对应的氨基酸位点，
2)与前述抗原结合结构域改变体比较，没有显著减弱前述抗原结合结构域改变体与MTA的结合的氨基酸位点，
3)与前述抗原结合结构域未改变体的表面露出的氨基酸位点对应的氨基酸位点，及
4)与位于前述抗原结合结构域未改变体中在MTA结合/非结合时结构变化率较大的区域的氨基酸位点对应的氨基酸位点。
可以多样化的氨基酸位点
对于前述抗原结合结构域未改变体的序列具有与抗原结合结构域改变体的序列不同的氨基酸的氨基酸位点，在设计文库时，作为可以设计为包含多样氨基酸的位点，本公开中，也称为“可以多样化的氨基酸位点”。可以多样化的氨基酸位点可以包含以下：
(i)抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于比较抗原结合结构域与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构时结构变化率较大的区域的氨基酸位点；
(iii)不参与与MTA的结合的氨基酸位点；
(iv)不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点；
(v)在抗原结合结构域所属的动物物种中，具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点；
(vi)对经典结构的形成不重要的氨基酸位点；
(vii)容易有助于抗原结合结构域改变体对抗原的MTA依赖性结合的氨基酸位点。
不参与与MTA的结合的氨基酸位点
本公开中“不参与与MTA的结合的氨基酸位点”可以通过MTA与抗原结合分子的复合体的结晶结构分析、使用NMR的立体结构分析、或氨基酸的突变导入等方法来鉴定。作为本公开的非限定的一个方案，可以根据MTA与抗原结合分子的复合体的结晶结构分析来鉴定不参与与MTA的结合的抗原结合分子的氨基酸残基、特别地不参与与MTA的结合的抗原结合结构域的氨基酸残基。此处，“参与与MTA的结合”指，在抗原结合结构域是抗体可变区的情形中，形成抗体可变区的H链或者L链的氨基酸中的侧链或者主链的原子以能够对结合活性造成效果的距离与MTA的原子形成了分子间相互作用的状态，或者某氨基酸残基有助于包括使CDR环等的立体结构稳定，稳定至MTA结合时的构型等的间接性影响的与MTA的结合的状态，以及满足这两者的状态。
在其它的一个方案中，对于不参与与MTA的结合的氨基酸位点的判定，也可以考虑为，从参与与MTA的结合的氨基酸位点之中选择的，任一个以上的氨基酸位点以外的氨基酸位点。
关于本说明书中“形成分子间相互作用的状态”，在抗原结合结构域是抗体可变区的情形中，例如，可以根据MTA与抗原结合分子的复合体的结晶结构分析，基于构成形成抗体可变区的H链或者L链的氨基酸的侧链或者主链的非氢原子与构成MTA的非氢原子的原子间距离来判定。例如，上述原子间距离优选为
Figure BDA0003265595920002071
Figure BDA0003265595920002072
或
Figure BDA0003265595920002073
以内，但并不限定于此。进一步优选的上述原子间距离为
Figure BDA0003265595920002074
或
Figure BDA0003265595920002075
以内。
更详细地，基于立体结构上的原子间距离与所形成的分子间相互作用的种类以及原子的种类的信息，可以判定发生了直接相互作用的可能性。更准确地，可以根据改变为Ala或Gly等氨基酸残基的突变导入对MTA的活性造成的影响而判断，但并不限定于此。
关于本说明书中的“间接性影响的状态”，例如，也可以通过根据MTA与抗原结合分子的复合体的立体结构详细分析各氨基酸残基的构型、与周围残基的分子间相互作用的状況，从而推定是否间接性影响了MTA的结合，更准确地，可以根据改变为Ala或Gly等氨基酸残基的突变导入对MTA的活性造成的影响而判断。
作为本公开的一个方案，可以选择即使将鉴定为不参与MTA的结合的残基置换为其它氨基酸也能够以适当程度维持与MTA的结合的氨基酸。藉此，可以设计所选择的氨基酸出现在所选择的残基中的文库。此时，可以以形成鉴定为不参与MTA的结合的残基被置换为彼此不同的氨基酸的抗原结合分子的集合的方式设计主要包含多个抗原结合分子的文库。
不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点
作为本公开中的非限定的一个方案，“不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点”可以通过氨基酸突变导入的方法鉴定。例如，全面改变可变区的氨基酸，各改变体对MTA的结合通过采用Biacore等的公知方法来测定，各改变体对MTA的结合活性(亲和力)以KD值的形式算出。将该KD值与作为亲本序列的未改变体的KD值进行比较，将显示出高于一定基准的结合的改变位置判定为“不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点”。例如，使用Biacore等公知方法的测定的结果，各改变体对MTA的结合活性(亲和力)以KD值的形式算出，作为重链的位点，MTA结合能力没有因改变而低于未改变体的1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2的结合能力的那些、以及作为轻链的位点，MTA结合能力没有因改变而低于未改变体的1/100、1/50、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6、1/5、1/4、1/3或1/2的结合能力的那些判定为不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点，但并不限于上述基准。或者，不与作为亲本序列的未改变体的KD值进行比较，而将各改变体对MTA的结合活性(亲和力)以KD值的形式算出，将作为重链的位点的不低于10mM、1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM的结合能力的那些，以及作为轻链的位点的不低于10mM、1mM、100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、1nM、100pM、10pM、或1pM的结合能力的那些判定为不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点，但并不限于上述基准。未改变及改变体对MTA的结合活性的测定可以从本领域技术人员公知的方法(Biacore、ELISA、ECL等)中适宜选择来实施。
在其它的一个方案中，对于没有显著减弱与MTA的结合的氨基酸位点的判定，也可以考虑为，除了从参与与MTA的结合的氨基酸位点之中选择的任一个以上的氨基酸位点以外的氨基酸位点。
容易有助于MTA依赖性结合的氨基酸位点
本公开中“容易有助于MTA依赖性结合的氨基酸位点”可以通过MTA与抗原结合分子的复合体的结晶结构分析、使用NMR的立体结构分析、或氨基酸的突变导入等方法来鉴定或推定。作为推定“容易有助于MTA依赖性结合的氨基酸位点”的非限定的方法，可例示鉴定抗原结合分子蛋白的表面露出的氨基酸残基所位于的氨基酸位点、或者位于比较MTA结合时与非结合时结构变化的区域的氨基酸位点的方法。
抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点
本公开中“抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点”指位于蛋白质的立体结构上的表面的氨基酸位点。对于包含抗原结合结构域的抗原结合分子单体、或MTA与抗原结合分子的复合体，通过结晶结构分析、使用NMR的立体结构分析等方法，可以鉴定位于抗原结合结构域的蛋白质表面的氨基酸残基及氨基酸位点。作为鉴定抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点的非限定的一个方法，列举通过算出溶剂露出表面积(可及表面积，Accessible surface area)鉴定表面露出的氨基酸位点的方法。
通过将这样的、位于抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点的氨基酸置换为多种氨基酸，期待获得与各种抗原分子的结合活性。如此，可以设计在这样的氨基酸位点出现多种氨基酸的文库。此情形中，可以设计主要包含多个抗原结合分子的文库，使得成为抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点具有不同氨基酸的抗原结合分子的集合。
位于抗原结合结构域的MTA结合/非结合时结构变化率较大的区域的氨基酸位点
本公开中“抗原结合结构域的MTA结合/非结合时结构变化率较大的区域”可以通过下列鉴定，应用结晶结构分析、使用NMR的立体结构分析等方法，进行比较包含抗原结合结构域的抗原结合分子单体、及MTA与抗原结合分子的复合体的结构，从而鉴定结构变化的区域。
另外，“位于抗原结合结构域的MTA结合/非结合时结构变化率较大的区域的氨基酸位点”也可以通过比较包含抗原结合结构域的抗原结合分子单体、及MTA与抗原结合分子的复合体的结构直接鉴定。在抗原结合结构域是抗体可变区的情形中，基于与MTA结合的时的抗体H链及L链的结构、和不与MTA结合时的抗体H链、L链结构重合时计算的MTA结合时/非结合时的各氨基酸残基的Cα原子间的距离，可以判定该氨基酸残基所位于的氨基酸位点是否是“位于抗原结合结构域的MTA结合/非结合时结构变化率较大的区域的氨基酸位点”。例如，可以将MTA结合时/非结合时的Cα原子间的距离是可变区全部氨基酸残基的MTA结合时/非结合时的Cα原子间距离的平均值以上的氨基酸残基所位于的氨基酸位点判定为“位于抗原结合结构域的MTA结合/非结合时结构变化率较大的区域的氨基酸位点”，但不限于此。
通过将这样的、位于抗原结合结构域的MTA结合/非结合时结构变化率较大的区域的氨基酸位点的氨基酸置换为多种氨基酸，期待获得MTA依赖性的抗原结合活性。如此，可以设计在这样的氨基酸位点出现多种氨基酸的文库。此情形中，可以设计主要包含多个抗原结合分子的文库，使得成为位于抗原结合结构域的MTA结合/非结合时结构变化率较大的区域的氨基酸位点具有不同氨基酸的抗原结合分子的集合。
具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点
本公开中“具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点”是指在亲本序列所属的动物物种的抗体储存库(repertoire)中，作为被确认以1％以上的出现频率存在的氨基酸的种类而被确认了2种以上的氨基酸位点。
本公开中“在抗原结合结构域所属的动物物种中，具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点”是指在该未改变体所来自的动物物种的基因上确认的抗体基因序列的储存库中确认到多样性的氨基酸位点。作为一个实例，该未改变体来自人时，未改变体所属的动物物种的抗体储存库是指在人的基因上确认到的抗体基因序列的储存库，该未改变体来自兔时，未改变体所属的动物物种的抗体储存库是指在兔的基因上所确认到的抗体基因序列的储存库，但并不限定于此。但是，不包括虽然在基因上存在，但由于终止/起始密码子的存在或移码而实际上没有作为抗体表达的序列。
该未改变体来自非人动物时，可以依照常规方法将其人源化，该方法是本领域技术人员广泛公知的(欧洲专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576、WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735、WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388、Cancer Res.,(1993)53,851-856、BBRC.,(2013)436(3):543-50等)。该未改变体依照常规方法进行人源化后实施文库化时，本公开中未改变体所属的动物物种的抗体储存库中，实施人源化之前的抗原结合结构域与实施人源化后的抗原结合结构域两者均可作为抗原结合结构域处理，随之，可以将实施人源化之前的抗原结合结构域所来自的动物物种与人这两者的储存库作为同一动物物种适用。作为一个实例，并不限定于此，当实施人源化之前的抗原结合结构域来自兔时，未改变体所属的动物物种的抗体储存库是指在人和/或兔的基因上确认到的抗体基因序列的储存库。但是，不包括虽然在基因上存在，但由于终止/起始密码子的存在或移码而实际上没有作为抗体表达的序列。
作为一个实例，未改变体所属的动物物种的抗体储存库可以通过参考已知的数据库来研究，但并不限定于此。具有氨基酸出现频率多样性的位点通常存在于CDR区。一个方案中，在确定公知和/或天然抗体的非常多样的位置时，Kabat,Sequences of ProteinsofImmunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.)(1987年及1991年)所提供的数据是有效的。此外，因特网上的多个数据库(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/、http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)中提供有收集的大量人轻链和重链的序列以及其配置，这些序列及其配置的信息对于确定本公开中非常多样的位置有用。
另外，作为另一方案，未改变体所属的动物物种的抗体储存库也可以通过克隆由该生物物种获得的抗体基因并分析序列来研究。作为一个实例，并不限定于此，关于人的抗体储存库，可以通过对由来自正常人淋巴细胞的抗体基因构建、且其储存库由不含偏差的抗体序列即天然序列构成的天然文库的序列进行分析来研究。(Gejima等(HumanAntibodies(2002)11,121-129)及Cardoso等(Scand.J.Immunol.(2000)51,337-344))。研究储存库时，理想的是对至少100种、优选200种、进一步优选400种以上的序列进行分析。
并不限定于此，本公开中未改变体所属的动物物种的抗体储存库更优选地期望对未改变体所属的种系的亚类实施研究。作为框架的实例，可将例如V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中所包括的、现在已知的完全人型框架区域的序列适宜用作本公开的抗原结合分子所含的生殖细胞系的序列。生殖细胞系的序列可基于其相似性来分类为亚类(Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)Williams及Winter(Eur.J.Immunol.(1993)23,1456-1461)及Cox等(Nat.Genetics(1994)7,162-168)。作为一个实例，关于人的抗体中重链可变区报道了7种亚类、关于Vκ报道了7种亚类、关于Vλ报道了10种亚类，关于各氨基酸位点可以通过分析未改变体所属的亚类内的氨基酸的储存库来研究，但并不特别限于该方案。
对经典结构的形成不重要的氨基酸位点
本公开中“对经典结构的形成不重要的氨基酸位点”中，抗体的经典结构表示抗体重链和轻链的主要为CDR1、2的立体结构的成簇，而结构可根据抗体的亚类、CDR的长度和序列来分类。各经典结构中，对于维持结构重要的残基已经公知，通过参考Chothia等(J.Mol.Biol.(1992)227，799-817)、Al-Lazikani等(J.Mol.Biol.(1997)273,927-948)、Tomlinson等(J.Mol.Biol.(1992)227,776-798)等的报道，可以鉴定该亲本抗原结合分子所分类的经典结构、和对其结构重要的残基。
另外，在抗体以外的抗原结合结构域中也存在对结构的维持重要的残基是公知的，并不限定于此，通过制备的突变体的结构分析等，可以鉴定各抗原结合结构域中对于形成经典结构不重要的氨基酸位点。
制备的文库
作为本公开的一个方案，提供通过包含以下步骤(a)及(b)的方法制备的文库：
(a)在对MTA具有结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(vi)中至少一个以上的氨基酸位点的步骤：
(i)前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于将前述抗原结合结构域与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构进行比较时结构变化率较大的区域的氨基酸位点；
(iii)不参与与MTA的结合的氨基酸位点；
(iv)不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点；
(v)在前述抗原结合结构域所属的动物物种中具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点；或
(vi)对经典结构的形成不重要的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，所述多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有氨基酸改变。
作为本公开的一个方案，提供通过以下步骤(a)及(b)制备的文库。
(a)在对MTA具有结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(vi)中至少一个以上的氨基酸位点的步骤：
(i)前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于将前述抗原结合结构域与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构进行比较时结构变化率较大的区域的氨基酸位点；
(iii)不参与与MTA的结合的氨基酸位点；
(iv)不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点；
(v)在前述抗原结合结构域所属的动物物种中具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点；或
(vi)对经典结构的形成不重要的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，所述多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有氨基酸改变，
步骤(b)的氨基酸改变满足以下(1)至(3)中至少一个以上：
(1)比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构时，该改变后氨基酸所位于的氨基酸位点的结构变化率较大；
(2)比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构时，前述抗原结合结构域改变体的结构变化不由该改变后氨基酸的存在而被抑制；
(3)与前述抗原结合结构域未改变体相比，具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体没有显著减弱对MTA的结合活性。
本公开中“1个或多个氨基酸”并不特别限定氨基酸的数量，可以是2种以上的氨基酸、5种以上的氨基酸、10种以上的氨基酸、15种以上的氨基酸或20种氨基酸。
本公开中“设计包含分别编码序列彼此不同的、前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸的文库”包括，例如，利用NNK、TRIM Library等(Gonzalez-Munoz A et al.MAbs2012,Lee CV et al.J Mol Biol.2004,Knappik A.et al.J Mol Biol.2000,Tiller T etal.MAbs 2013)的公知的文库技术，设计包含将特定位点的氨基酸改变为所期望的氨基酸的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的多个改变体的文库，但并不特别限于该方案。本公开中“改变体”指与亲本序列的未改变体相比，至少1个或者其以上的氨基酸被置换的亲本序列的各个不同改变体。
在制备本公开中“序列彼此不同的、前述抗原结合结构域的多个改变体”的步骤中，在鉴定的氨基酸位点之中，关于CDR1及CDR2的位点，可以置换为生殖细胞系中的出现频率为10％以上、9％以上、8％以上、7％以上、6％以上、5％以上、4％以上、3％以上、2％以上或者1％以上的氨基酸，关于CDR3的位点，可以置换为生殖细胞系中的出现频率为10％以上、9％以上、8％以上、7％以上、6％以上、5％以上、4％以上、3％以上、2％以上或者1％以上的氨基酸，来制作各改变体，但并不限定于此。
在制备本公开中“序列彼此不同的、前述抗原结合结构域的多个改变体”的步骤中，可以制备改变体，使得鉴定的氨基酸位点的氨基酸被置换的改变体与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构进行比较时，该置换后氨基酸所位于的氨基酸位点的结构变化率较大，但不限于此。
在制备本公开中“序列彼此不同的、前述抗原结合结构域的多个改变体”的步骤中，可以制备改变体，使得比较鉴定的氨基酸位点的氨基酸被置换的改变体与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构时，通过存在该置换后氨基酸，改变体与MTA结合引起的结构变化不受抑制，但不限于此。
在制备本公开中“序列彼此不同的、前述抗原结合结构域的多个改变体”的步骤中，可以制备改变体，使得鉴定的氨基酸位点的氨基酸被置换的改变体对MTA的结合活性与未改变体相比没有显著减弱，但不限于此。
浓缩的文库
在非限定的一个方案中提供文库，本公开的文库是浓缩了编码包含与MTA结合的抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸的文库。
本公开中“浓缩”是指与实施浓缩操作前的文库相比，使编码具有目标活性的改变体的核酸的存在比率上升。编码具有目标活性的改变体的核酸的存在比率上升的状态称为“浓缩的”。
作为一个实例，并不限定于此，浓缩编码与MTA结合的抗原结合分子的核酸可以如下实现：通过淘选使编码具有与MTA的结合活性的抗原结合分子的核酸的存在比率上升。更具体地，作为一个实例，使将含有多个抗原结合分子的文库通过噬菌体展示法呈递于表面的噬菌体与MTA接触并通过洗涤操作将呈递不具有结合活性的分子的噬菌体和未呈递分子的噬菌体除去后仅回收呈递维持结合的抗原结合分子的噬菌体，由此可通过淘选使编码具有与MTA的结合活性的抗原结合分子的核酸的存在比率上升，但并不限定于此。这样的方法即包含以下(1)～(2)的步骤的方法：
(1)使从文库展示的抗原结合结构域与MTA接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与MTA结合的抗原结合结构域的步骤。
编码具有目标活性的抗原结合分子的核酸的存在比率与实施浓缩操作前的文库相比，优选上升1.1倍以上。更优选通过使编码具有目标活性的抗原结合分子的核酸的存在比率上升1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、4倍以上、10倍以上、25倍以上、100倍以上，可以由此制造本公开中记载的文库。在非限定的一个方案中，对用这样的方法浓缩的文库中的抗原结合分子对MTA的结合活性而言，在与MTA不同种类的分子即抗原不存在下也显示。
作为浓缩对象的文库，只要包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域，不限定其种类。更具体地，列举天然人抗体展示文库、合成人抗体展示文库、按照后述本说明书的方法设计的文库、本说明书实施例中记载的文库，但不限于这些。
作为其它的一个实例，但不限于这些，浓缩编码与腺苷结合的抗原结合分子的核酸可以如下实现：通过淘选使编码具有针对腺苷的结合活性的抗原结合分子的核酸的存在比率上升。更具体地，作为一个实例，使将含有多个抗原结合分子的文库通过噬菌体展示法呈递于表面的噬菌体与腺苷接触并通过洗涤操作将呈递不具有结合活性的分子的噬菌体和未呈递分子的噬菌体除去后仅回收呈递维持结合的抗原结合分子的噬菌体，由此可通过淘选使编码具有针对腺苷的结合活性的抗原结合分子的核酸的存在比率上升，但并不限定于此。这样的方法即包含以下(1)～(2)的步骤的方法：
(1)使从文库展示的抗原结合结构域与腺苷接触的步骤，及
(2)选择前述步骤(1)中与腺苷结合的抗原结合结构域的步骤。
编码具有目标活性的抗原结合分子的核酸的存在比率与实施浓缩操作前的文库相比，优选上升1.1倍以上。更优选使编码具有目标活性的抗原结合分子的核酸的存在比率上升1.2倍以上、1.5倍以上、2倍以上、4倍以上、10倍以上、25倍以上、100倍以上，由此可以制造本公开中记载的文库。在非限定的一个方案中，在与腺苷不同种类的分子即抗原不存在下也显示用这样的方法浓缩的文库中的抗原结合分子针对腺苷的结合活性。
作为浓缩对象的文库，只要包含针对抗原的结合活性依赖于腺苷而变化的抗原结合结构域，不限定其种类。更具体地，但不限于这些，列举天然人抗体展示文库、合成人抗体展示文库、按照本说明书的文库制备方法制备的文库、本说明书中记载的文库。
文库的制备方法
本公开另外涉及制备上述说明的本公开包含的各种方案的“文库”的方法。
本公开涉及的“文库的制备方法”不限于如下示例的任意特定的方法，也包含任意方法，只要是能够制备上述本公开的“文库”的方法即可。
作为本公开涉及的“文库的制备方法”，例如，可列举以下示例的方法。
另外，以下示例的“文库的制备方法”中的各特定事项具有如关于从上述本公开的“文库”“浓缩的”详述的技术意义。
作为本公开的一个方案，提供包含以下的步骤(a)及(b)的文库的制备方法：
(a)在对MTA具有结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(vi)中至少一个以上的氨基酸位点的步骤：
(i)前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于将前述抗原结合结构域与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构进行比较时结构变化率较大的区域的氨基酸位点；
(iii)不参与与MTA的结合的氨基酸位点；
(iv)不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点；
(v)在前述抗原结合结构域所属的动物物种中具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点；或
(vi)对经典结构的形成不重要的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，所述多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有氨基酸改变。
作为本公开的一个方案，提供包含以下的步骤(a)及(b)的文库的制备方法：
(a)在对MTA具有结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(vi)中至少一个以上的氨基酸位点的步骤：
(i)前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于将前述抗原结合结构域与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构进行比较时结构变化率较大的区域的氨基酸位点；
(iii)不参与与MTA的结合的氨基酸位点；
(iv)不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点；
(v)在前述抗原结合结构域所属的动物物种中具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点；或
(vi)对经典结构的形成不重要的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，所述多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有氨基酸改变。
步骤(b)的氨基酸改变满足以下(1)至(3)中至少一个以上：
(1)比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构时，该改变后氨基酸所位于的氨基酸位点的结构变化率较大；
(2)比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构时，前述抗原结合结构域改变体的结构变化不由该改变后氨基酸的存在而被抑制；
(3)与前述抗原结合结构域未改变体相比，具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体没有显著减弱对MTA的结合活性。
在本公开的一个侧面，不限于编码具有与MTA相互作用的氨基酸残基的抗原结合结构域的文库的制备方法，也提供了编码具有与各种低分子化合物相互作用的氨基酸残基的抗原结合结构域的文库的制备方法。
以下示例的文库的制备方法中的各特定事项具有与上述详述的M文库的制备方法同样的技术意义，本领域技术人员通过将“MTA”替换为“低分子化合物”，可以理解各种特定事项的意义。
作为一个方案，提供包含以下的步骤(a)及(b)的文库的制备方法：
(a)在对低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(ii)中至少一个以上的氨基酸位点的步骤：
(i)前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于比较前述抗原结合结构域与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构时结构变化率较大的区域的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，所述多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有氨基酸改变。
在一个方案中，提供包含以下的步骤(a)及(b)的文库的制备方法：
(a)在对低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(ii)中至少一个以上的氨基酸位点的步骤：
(i)前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于比较前述抗原结合结构域与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构时结构变化率较大的区域的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，所述多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有氨基酸改变。
步骤(b)的氨基酸改变满足以下(1)至(3)中至少一个以上：
(1)比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构时，该改变后氨基酸所位于的氨基酸位点的结构变化率较大；
(2)比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构时，前述抗原结合结构域改变体的结构变化不由该改变后氨基酸的存在而被抑制；
(3)与前述抗原结合结构域未改变体相比，具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体没有显著减弱对前述低分子化合物的结合活性。
作为一个方案，提供包含以下的步骤(a)及(b)的文库的制备方法：
(a)在对低分子化合物具有结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(vi)中至少一个以上的氨基酸位点的步骤：
(i)前述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于比较前述抗原结合结构域与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构时结构变化率较大的区域的氨基酸位点；
(iii)不参与与前述低分子化合物的结合的氨基酸位点；
(iv)不使与前述低分子化合物的结合显著减弱的氨基酸位点；
(v)在前述抗原结合结构域所属的动物物种中具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点；或
(vi)对经典结构的形成不重要的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，该文库包含在前述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸及分别编码前述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，所述多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有满足以下的(1)至(2)中至少一个的氨基酸改变：
(1)比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构时，该改变后氨基酸所位于的氨基酸位点的结构变化率较大；
(2)比较具有该氨基酸改变的抗原结合结构域改变体与前述低分子化合物结合时的结构和不与前述低分子化合物结合时的结构时，前述抗原结合结构域改变体的结构变化不由该改变后氨基酸的存在而被抑制。
MTA特异性结合的抗原结合分子
本公开另外涉及与MTA特异性结合的抗原结合分子。作为与MTA特异性结合的抗原结合分子的非限定的一个实例，可例示与选自S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM、AMP、ADP、ATP中的一个或多个低分子化合物不实质性地结合的抗原结合分子。
此处，不实质性地结合按照本说明书结合活性一项中记载的方法确定，是指对于前述MTA以外的低分子化合物，显示对前述MTA的结合活性的85％以下、通常50％以下、优选地30％以下、特别优选地20％以下的结合活性。
在非限定的一个方案中，本公开的与MTA特异性结合的抗原结合分子与腺苷不实质性地结合。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的与MTA特异性结合的抗原结合分子与S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)不实质性地结合。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的与MTA特异性结合的抗原结合分子与SAM不实质性地结合。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的与MTA特异性结合的抗原结合分子与腺苷、AMP、ADP、ATP中的任一都不实质性地结合。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的与MTA特异性结合的抗原结合分子与腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)中的任一都不实质性地结合。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的与MTA特异性结合的抗原结合分子与腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM中的任一都不实质性地结合。
在其它的非限定的一个方案中，本公开的与MTA特异性结合的抗原结合分子与腺苷、S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)、SAM、AMP、ADP、ATP中的任一都不实质性地结合。
作为本公开中与MTA特异性结合的抗原结合分子的非限定的一个方案，列举包含下列任一项的抗原结合分子：
a)包含SEQ ID NO:46所示的重链可变区和SEQ ID NO:47所示的轻链可变区的抗体可变区；
b)包含SEQ ID NO:50所示的重链可变区和SEQ ID NO:51所示的轻链可变区的む抗体可变区；
c)包含SEQ ID NO:48所示的重链可变区和SEQ ID NO:49所示的轻链可变区的抗体可变区；
d)包含SEQ ID NO:52所示的重链可变区和SEQ ID NO:53所示的轻链可变区的抗体可变区。
作为本公开中与MTA特异性结合的抗原结合分子的非限定的一个方案，列举与MTA结合的分离的抗体。
在上述的方案的任意中，与MTA特异性结合的抗原结合分子是人源化的。在一个方案中，与MTA特异性结合的抗原结合分子包含上述的方案的任意中的HVR，并且进一步包含受体人框架(例如，人免疫球蛋白框架或人共有框架)。进一步，上述的与MTA特异性结合的抗原结合分子可以以增强对MTA的结合活性为目的导入氨基酸改变，也可以导入用于进一步提高对特定的低分子化合物的特异性的改变。导入氨基酸改变的目的不限于上述，可以导入用于任意目的的改变。
在其它的情形中，与MTA特异性结合的抗原结合分子包含相对于SEQ ID NO:46、48、50、52的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性的重链可变区序列。在特定的方案中，相对于参考序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的重链可变区序列包含置换(例如，保守置换)、插入、或缺失，但包含该序列的与MTA特异性结合的抗原结合分子保有与MTA结合的能力。在特定的方案中，在SEQ ID NO:46、48、50、52中置换、插入和/或缺失总计1个至10个氨基酸。
在其它的情形中，与MTA特异性结合的抗原结合分子包含相对于SEQ ID NO:47、49、51、53的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的轻链可变区序列。在特定的方案中，相对于参考序列，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的轻链可变区序列包含置换(例如，保守置换)、插入、或缺失，但包含该序列的与MTA特异性结合的抗原结合分子保有与MTA结合的能力。在特定的方案中，在SEQ ID NO:47、49、51、53中置换、插入和/或缺失总计1个至10个氨基酸。
在其它的情形中，提供与MTA特异性结合的抗原结合分子，其包含上述的方案的任意中的重链可变区、及上述的方案的任意中的轻链可变区。在一个方案中，抗体也包含，在SEQ ID NO:46、48、50、52及SEQ ID NO:47、49、51、53中的重链可变区序列及轻链可变区序列分别包含该序列的翻译后修饰的序列。翻译后修饰包含重链或者轻链N末端的谷氨酰胺或者谷氨酸的焦谷氨酰基化而成的焦谷氨酸修饰，但不限于此。
用于诊断以及检测的方法及组合物
在特定的方案中，本说明书中提供的与MTA特异性结合的抗原结合分子的任意对检测生物学样品中MTA的存在有用。本说明书中应用的术语“检测”包含定量的或定性的检测。在特定的方案中，生物学样品包含细胞或组织，例如癌组织。
在一个方案中，提供用于在诊断方法或检测方法中使用的与MTA特异性结合的抗原结合分子。在进一步的情形中，提供检测生物学样品中MTA的存在的方法。在特定的方案中，此方法包括，在允许与MTA特异性结合的抗原结合分子与MTA的结合的条件下，使本说明书中记载的与MTA特异性结合的抗原结合分子和生物学样品接触，以及检测与MTA特异性结合的抗原结合分子和MTA之间是否形成复合体。这样的方法可以是体外方法或体内方法。在一个方案中，对于与MTA特异性结合的抗原结合分子，例如在MTA是用于选择患者的生物标记物的情形中，可以应用包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域的抗原结合分子，用于选择适于治疗的被测体。另外，作为其它的一个方案，也可以在预测对患者的治疗效果的方法中应用。
作为用于选择被测体的应用的非限定的一个方案，可例示对是否为MTA积累的癌的判断。本公开中，通过验证MTA在癌组织中积累，可以通过检测组织中或/和末梢中的MTA诊断是否患有这些癌。
另外，作为用于预测治疗效果的应用的非限定的一个方案，可以通过检测组织中或/和末梢中的MTA间接诊断癌组织的缩小或恶化。
在特定的方案中，提供与标记的MTA特异性结合的抗原结合分子。标记包含直接检测的标记或部分(例如，荧光标记、显色标记、高电子密度标记、化学发光标记、及放射性标记)以及例如通过酶反应或分子间相互作用间接检测的部分(例如酶或配体)，但不限于此。示例性的标记包含以下：放射性同位素32P，14C，125I，3H及131I，稀土类螯合物等荧光团或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，萤火虫荧光素酶及细菌荧光素酶(美国专利第4,737,456号)等荧光素酶，荧光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase:HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，单糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)，尿酸氧化酶及黄嘌呤氧化酶等杂环氧化酶，与应用过氧化氢而氧化色素前体的酶(例如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶)连接的物质，生物素/亲和素，旋转标记，噬菌体标记，稳定的自由基类，以及与它们类似的物质，但不限于此。
另外，本公开中记载的氨基酸序列中所含的氨基酸有时也在翻译后受到修饰(例如，N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰基化而修饰成为焦谷氨酸是本领域技术人员熟知的修饰)，这种氨基酸经翻译后修饰的情形自然也包含在本公开中记载的氨基酸序列中。
本领域技术人员应理解，只要基于本领域技术人员的技术常识在技术上不矛盾，则任意组合本说明书记载的1个或多个方案而成的方案也包含在本发明中。
应予说明，本说明书中引用的全部现有技术文献作为参考并入本说明书中。
实施例
以下通过实施例具体说明本公开，但本公开并不受这些实施例所限制。
[实施例1]肿瘤组织及正常组织中MTA积累量的分析
作为实验中使用的细胞株，从ATCC购入HCC827、HPAC、HT-1376、NCI-H2228、SK-LU-1、SK-MES-1、U-87 MG，从Dainippon购入Mia-PaCa2，从NCI购入KM12，从JCRB购入KM12-Luc，从RIKEN购入PK-1。关于除KM12-Luc以外的细胞株，参考Barretina J等Nature.(2012)483:603-7.公开的细胞株的SNPs比对数据组，判定了MTAP缺失状态。KM12-Luc不包含在此数据组中，由于是KM12的衍生株，视为其MTAP缺失状态与KM12相同。
(1-1)MTAP缺失/非缺失细胞的细胞内MTA浓度的测定
将MTAP缺失细胞的Mia-PaCa2、NCI-H2228、SK-LU-1、U-87 MG、及MTAP非缺失细胞的HCC827、HPAC、KM12-Luc以106个散布在75cm2瓶中，培养48小时。用胰蛋白酶剥离细胞并回收，在回收的细胞中加入H2O，通过超声处理实施细胞破碎得到细胞破碎液。在细胞破碎液中加入细胞破碎液3倍量的MeOH，旋涡处理(Vortex)并进一步通过离心除去残渣(Debris)，用LC-MS(TSQ vantage,ThermoFisher)测定离心后上清中的MTA浓度。参考Reinoso RF etal.,Drug Metab Dispos.2001 Apr；29(4Pt 1):453-9.的论文报告，将细胞体积假定为每106个细胞4.0μL，从离心后上清中的MTA浓度算出细胞内MTA浓度。如图1所示可知，与MTAP非缺失细胞相比，MTAP缺失细胞的任意都具有高细胞内MTA浓度。
(1-2)MTAP缺失/非缺失细胞的培养液中MTA浓度的测定
将MTAP缺失细胞的Mia-PaCa2、NCI-H2228、SK-LU-1、U-87 MG及MTAP非缺失细胞的HCC827、KM12-Luc以106个散布在75cm2瓶中，加入14mL培养基培养。在24、48小时的各时点回收培养液，在回收的培养液中加入3倍量的MeOH，离心除去残渣后获得上清，用LC-MS(LTQVelos及TSQ vantage,ThermoFisher)测定获得的培养液上清中的MTA浓度。其结果，在MTAP缺失细胞的培养液中观察到MTA浓度的经时上升(MTA的积累)。另一方面，在MTAP非缺失细胞的HCC827的培养液中，任意时点MTA都低于5nM的检测界限，MTAP非缺失细胞的KM12-Luc的培养液中的MTA浓度也略微高于5nM(图2)。
(1-3)MTAP非缺失细胞进行的细胞外MTA的摄入
根据MTAP缺失细胞的培养液中的MTA浓度经时增加，推测具有从细胞内向细胞外的MTA移动途径。但是，对于MTAP非缺失细胞，尽管预想细胞内具有～1uM的MTA(图1)，培养液中的MTA浓度非常低(图2)。为了获得与未见到MTAP非缺失细胞培养液中的MTA积累的理由相关的线索，将MTAP非缺失细胞的HT-1376、SK-MES-1以3x105个散布在6孔板中，加入3mL培养基，温育24hr使细胞粘附。其后，在培养液中加入MTA溶液使得MTA浓度为100nM，培养规定时间(MTA:Sigma,Catalog No.D5011-100MG)。在0、4、24、48、72小时的各时点回收培养液，用LC-MS测定回收的培养液中的MTA浓度时，观察到培养开始后培养液中的MTA浓度经时减少(图3)。提示当细胞能够使用MTAP代谢MTA时，细胞外的MTA吸收到细胞中，迅速消失。
(1-4)MTA的血液清除
研究用MTA添加培养基培养MTAP非缺失细胞时，培养液中的MTA经历迅速消失，在正常组织中MTA也被吸收至细胞而迅速消失。
从小鼠采取新鲜血液。在预先以37℃加温的小鼠血液中添加MTA的稳定同位体(SIL-MTA)使得终浓度为5ng/mL，5秒后添加等量的乙腈。在用乙腈除蛋白的血液样品中添加甲醇以及内标物质，用LC-MS/MS分析离心过滤后的滤液，测定SIL-MTA添加5秒后的小鼠血液中SIL-MTA浓度。应用在小鼠血液与乙腈等量混合的溶液中添加SIL-MTA使得终浓度为5ng/mL的样品，测定SIL-MTA浓度，将其作为SIL-MTA浓度的初期值。从SIL-MTA浓度的初期值与SIL-MTA添加5秒后小鼠血液中SIL-MTA浓度，算出SIL-MTA从血液的消失速度常数，消失速度常数乘以每小鼠单位体重的血液量(85mL/kg)算出的全血液清除推定为46685mL/h/kg。从此结果可知，小鼠血液中添加的MTA从血液迅速消失。
(1-5)小鼠中MTA的体内清除
根据实施例(1-4)的研究提示了体外MTA血液清除大，因此，为了研究实际在体内MTA的清除是否也大，实施了MTA的药物动态试验。为了与内源性MTA区别，被测物质应用了SIL-MTA。在NOD-scid小鼠中以恒定速度静脉内施用0.1～100μg/min/kg、25mL/kg(n＝3)的SIL-MTA，施用开始后2、5、10、30分钟采取血液。采取血液后，以12000rpm、5分钟、4℃离心除去细胞，得到血浆。用LC-MS/MS测定血浆中SIL-MTA浓度。从施用开始后30分钟的血浆中SIL-MTA浓度与SIL-MTA的施用速度算出的SIL-MTA全身清除是38961mL/h/kg以上，表明体内MTA也迅速从血浆消失。
(1-6)患癌小鼠模型的肿瘤中的MTA浓度测定
将MTAP缺失细胞的Mia-PaCa2与MTAP非缺失细胞的PK-1移植到NOD SCID小鼠的皮下制备患癌小鼠，在肿瘤体积为188～347mm3的时点采取肿瘤(n＝3)。添加肿瘤重量的3倍量的甲醇用不锈钢珠均质化，以12000rpm、10分钟离心分离得到上清。用75％甲醇10倍稀释得到的上清，添加包含内标物质的水溶液以10000rpm、10分钟离心分离。用滤器过滤上清，对滤液进行LC-MS/MS分析测定MTA浓度，从滤液中的MTA量与肿瘤重量计算肿瘤中的MTA浓度(pmol/g组织)。其结果，在移植了MTAP缺失细胞的Mia-PaCa2的NOD SCID小鼠中检测到高的肿瘤中MTA浓度(图4)。
(1-7)人临床样品中MTAP DNA量及MTA浓度的测定
研究了从Asterand公司及ILS公司购入的膀胱癌8例、与食道癌10例的新鲜冷冻临床样品中是否可见伴有MTAP缺失的MTA积累。
(1-7-1)人临床样品中的MTAP DNA量分析
用QIAamp Fast DNA Tissue试剂盒[QIAGEN,cat.no.51404]从临床样品提取DNA。以提取的DNA为模板，用RealTime-PCR法进行MTAP的基因区域的扩增，求出MTAP基因的Ct值。Ct值是扩增DNA量达到阈值为止的PCR循环数，初期DNA量少则为大的值。为了补正实验间的扩增效率差异，按照M’soka TJ等(Leukemia(2000)14,935-940)，也求出其它染色体上的MTAP假基因的ΨX4的Ct值。对于各样品，从MTAP基因的Ct值减去ΨX4基因的Ct值求出ΔCt。
(1-7-2)人临床样品中的MTA浓度分析
添加临床样品重量的3倍量的甲醇用不锈钢珠均质化，以12000rpm、10分钟离心分离得到上清。用75％甲醇10倍稀释得到的上清，添加包含内标物质的水溶液以10000rpm、10分钟离心分离。用滤器过滤上清，对滤液进行LC-MS/MS分析测定MTA浓度，从滤液中的MTA量与临床样品重量计算各样品的组织中的MTA浓度(pmol/g组织)。关于低于检测界限(30pmol/g组织)的样品，将检测下限的值作为测定值。
(1-7-3)人临床样品中的MTAP DNA量与MTA浓度的相关性分析
以ΔCt值为横轴、组织中的MTA量为纵轴作图，分析MTAP DNA量与MTA浓度的相关性(图5)。在膀胱癌临床样品与食道癌临床样品的任一中，ΔCt都变大，即，随着组织中MTAPDNA量变少，观察到MTA浓度变大。
(1-8)通过微透析测定患癌小鼠模型组织中MTA浓度
将MTAP缺失细胞Mia-PaCa2与MTAP非缺失细胞KM12移植到BALB/c nu/nu小鼠的皮下，制成患癌小鼠(下文称为Mia-PaCa2模型、KM12模型)。在移植的肿瘤体积为200mm3以上的时点，在异氟烷麻醉下，将微透析探针插入肿瘤及肝脏(作为对照的正常组织)，采取组织间液。用LC-MS/MS法定量探针插入后90-120分钟采取的组织间液中的MTA浓度。制备BSA溶液(0、1、10、100mg/mL)中添加已知浓度MTA的标准溶液，根据从微透析的探针回收的MTA浓度与标准溶液的MTA浓度的比，算出MTA回收率。相对于采取的组织间液中的MTA浓度，以MTA回收率(16.3％)补正，算出组织中的细胞外MTA浓度。
关于肿瘤中的细胞外MTA浓度，Mia-PaCa2模型比KM12模型高，提示MTA从MTAP缺失细胞排出到了间质液(图6)。另一方面，关于肝脏中细胞外MTA浓度，在两组患癌小鼠模型间没有见到差异。根据以上结果推定，MTA从MTAP缺失细胞排出，但来自MTAP缺失细胞的MTA迅速从体内消失，因此正常组织中的细胞外MTA浓度保持为较低。
[实施例2]
从天然文库或者合成文库获得依赖于MTA与抗原结合的抗体
(2-1)用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体的淘选
从以人的天然抗体储存库为模板的文库，筛选了在MTA存在下对人IL-6受体(hIL-6R)显示结合活性的抗体。
以从人PBMC制备的聚A RNA、市售人聚A RNA等为模板，按照本领域技术人员公知的方法，构建了包含呈递彼此不同的人抗体序列的Fab结构域的多个噬菌体的天然人抗体噬菌体展示文库(称为天然文库)。
另外，按照本领域技术人员公知的方法，基于参考人的天然抗体储存库人为地设计的设计(design)，构建了包含呈递彼此不同的人抗体序列的Fab结构域的多个噬菌体的合成人抗体噬菌体展示文库(称为合成文库)。
具体地，对保有构建的噬粒载体的大肠杆菌，使其感染M13KO7TC(WO2015046554A1)或者M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体)(PROGEN Biotechnik)，从在30℃培养一晩的上清回收噬菌体。在进行噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，将沉淀的噬菌体的集合用TBS稀释，从而制备了抗体呈递噬菌体文库液。
淘选通过以下的方法实施。在该噬菌体文库液中添加BSA使得终浓度为4％。为了按需要在不存在MTA的条件下与hIL-6R结合除去抗体，将固定了0.1nmol的生物素标记hIL-6R的磁珠与制备的噬菌体文库液混合，在室温反应60分钟后，用磁力架从分离的珠回收噬菌体溶液。在回收的噬菌体文库液0.8mL中加入0.1nmol的生物素标记hIL-6R与终浓度100μM的MTA，在室温反应60分钟。在此反应液中加入用BSA封闭的磁珠(NeutrAvidin珠(TAMAGAWA SEIKI)或者Dynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo FisherScientific))，在室温反应15分钟。将珠用0.5mL的TBS/0.1％Tween20洗涤2次或3次、用TBS洗涤1次或2次。其后，将添加了TBS的珠在室温悬浮，用磁力架从分离的珠回收噬菌体溶液。此操作重复2次或3次后，混合洗脱的噬菌体溶液。在回收的噬菌体溶液中加入最终浓度1mg/mL的胰蛋白酶。将回收的噬菌体添加于为对数增殖期(OD600为0.4-0.7)的20mL的大肠杆菌株ER2738。在37℃进行1小时上述大肠杆菌的搅拌培养，从而用噬菌体感染大肠杆菌。将大肠杆菌接种于225mm x 225mm的平板。此一系列操作追加重复3次。
(2-2)评价通过噬菌体ELISA淘选后获得的噬菌体集合在MTA存在下的hIL-6R结合 活性
从淘选得到的大肠杆菌的各单一菌落，分别按照常规方法(Methods mol.Biol.(2002)178,133-145)，回收含有噬菌体的培养上清液。应用超级噬菌体作为辅助噬菌体，回收抗体多价呈递噬菌体。应用NucleoFast96(MACHERY-NAGEL)，对回收的噬菌体培养上清液进行超滤。
按以下的顺序将用TBS或包含终浓度100μM的MTA的TBS稀释的噬菌体供给ELISA。在链霉抗生物素包被的384孔微板(greiner)中添加10μl包含生物素标记hIL-6R的TBS，静置1小时以上。用TBST洗涤该平板的各孔后，各孔用80μL的0.2％脱脂奶-TBS封闭1小时以上。用TBST洗涤各孔后，在该孔中加入制备的噬菌体静置一小时，从而使呈递于噬菌体的抗体在不存在MTA的条件下或者存在下与生物素标记hIL-6R结合。用TBST或者包含终浓度100μM的MTA的TBST洗涤该孔后，在该孔中加入TBS或包含终浓度100μM的MTA的TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(GE Healthcare)，静置一小时。用TBST或者包含终浓度100μM的MTA的TBST洗涤该孔后，加入TMB单一溶液(ZYMED)，一定时间后，通过添加硫酸终止溶液的显色反应后，测定450nm波长的吸光度。分析的结果，在评价的384个克隆中，确认了有4个克隆的在100μM的MTA存在下与MTA不存在下呈递对hIL-6R的结合活性变化的抗体的噬菌体。
(2-3)依赖于MTA与抗原结合的抗体的表达和纯化
将实施例(2-2)中确认的、在100μM的MTA存在下与MTA不存在下对hIL-6R的结合活性变化的抗体的重链及轻链的可变区序列分别插入具有重链抗体恒定区序列(SEQ ID NO:56)或者轻链κ恒定区序列(SEQ ID NO:39)的动物表达用质粒。应用引物(SEQ ID NO:44及45)分析扩增的抗体基因的碱基序列时，鉴定了一种抗体可变区序列(重链可变区：SEQ IDNO:54、轻链可变区：SEQ ID NO:55)。应用参考实施例1的方法表达抗体(C03H-BH076N17/C03L-KT0)。
(2-4)应用表面等离子共振的MTA存在下抗原结合活性的评价
应用Biacore T200(GE Healthcare)，评价C03H-BH076N17/C03L-KT0与hIL-6R的抗原抗体反应中MTA与腺苷的影响。作为流动缓冲液，应用TBS、0.02％(w/v)Tween20、pH7.4。在传感器芯片CM5(GE Healthcare)上通过胺偶联法固定ProA/G(Pierce)，在其上固定抗体后，以各种抗原作为分析物进行相互作用，从而观察抗原抗体间的结合量的变化。抗原的稀释中，使用了流动缓冲液及流动缓冲液中分别添加了MTA、或腺苷中的任一的缓冲液，制备为多梯度的浓度系列。参数的算出应用了Biacore T200评价软件(GEHealthcare)。
将MTA或者腺苷的不同浓度下C03H-BH076N17/C03L-KT0针对hIL-6R的结合量在图7中显示。对于C03H-BH076N17/C03L-KT0，确认MTA浓度越高，针对hIL-6R显示了越强的结合活性。另外，在腺苷存在下，在任一浓度都未观察到与hIL-6R的结合。因此，显示C03H-BH076N17/C03L-KT0是特异依赖于MTA与hIL-6R结合的抗体。
[实施例3]
用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体的、以人源化SMB0002为模板的文库的设计
(3-1)人源化SMB0002的MTA结合性评价
根据MTA与腺苷的结构的类似性，与腺苷结合的抗体具有与MTA交差反应的可能性，与MTA交差反应的腺苷抗体具有可以作为用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体设计文库时的模板抗体使用的可能性。为了验证是否能够将报告为与腺苷结合的人源化SMB0002(重链可变区：SEQ ID NO:31；轻链可变区：SEQ ID NO:32)用作用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体设计文库时的模板抗体，应用Biacore T200(GE Healthcare)分析人源化SMB0002针对MTA的结合性。
在预先固定了链霉抗生物素的传感器芯片SA(GE Healthcare)中，结合作为生物素化的抗人IgG CH1分子的CaptureSelectTM生物素抗-IgG-CH1缀合物(Thermo fisherscientific)，其中捕获人源化SMB0002，使MTA(sigma-aldrich)或腺苷(Wako)与人源化SMB0002相互作用。作为流动缓冲液，应用50mM Tris-HCl,150mM NaCl(Takara,T903),0.02％(w/v)Tween20，5％DMSO。MTA或腺苷以流速100μL/min与人源化SMB0002相互作用42秒，其后将其用流动缓冲液从抗体解离。相互作用在37℃测定，MTA或腺苷的稀释使用与流动缓冲液相同的缓冲液。
基于从测定得到的传感图算出的动力学参数即结合速度常数ka(1/Ms)、及解离速度常数kd(1/s)，算出解离常数KD(M)。或者，应用稳态分析法(Steady state analysis)，算出解离常数KD(M)。各参数的算出中应用Biacore T200评价软件(GE Healthcare)。
通过此测定，如表1确定人源化SMB0002针对MTA及腺苷的结合活性，确认人源化SMB0002不仅针对腺苷、也针对MTA具有结合活性。
[表1]
Figure BDA0003265595920002331
(3-2)人源化SMB0002的X线结晶结构分析
分析人源化SMB0002的Fab片段(SMB0002hFab)单独，及SMB0002hFab与腺苷的复合体的结晶结构。
(3-2-1)用于结晶化的人源化SMB0002全长抗体的制备
用于结晶化的人源化SMB0002全长抗体的制备及纯化通过本领域技术人员公知的方法进行。
(3-2-2)用于SMB0002hFab的结晶结构分析的Fab片段的制备
对于SMB0002hFab，将人源化SMB0002全长抗体通过Endoproteinase Lys-C(Roche、目录编号11047825001)限制消化，随后，通过应用加载至用于除去Fc片段的蛋白A柱(MabSlect SuRe、GE Healthcare)、阳离子交换柱(HiTrap SP HP、GE Healthcare)、及凝胶过滤柱(Superdex200 16/60、GE Healthcare)之类的常规方法而制备。合并包含Fab片段的级分，保存在-80℃。
(3-2-3)SMB0002hFab与腺苷复合体的结晶的制备
应用用本领域技术人员公知的方法纯化、浓缩至约13mg/mL的SMB0002hFab，通过坐滴蒸汽扩散法在5℃进行结晶。储存溶液包含0.1M磷酸氢二钠·柠檬酸pH 4.2、40％w/v聚乙二醇200。
(3-2-4)从SMB0002hFab与腺苷的复合体的结晶收集X线衍射数据及确定结构
将得到的结晶用液氮冷冻，用高能量加速器研究机构的放射光设施光子工厂的BL-17A测定了X线衍射数据。测定中，通常将结晶在-178℃的氮气流下放置从而维持在冷冻状态。应用与光束线连接的Pilatus 6M检测器(DECTRIS)，将结晶1次回转0.25°并收集总计720张X线衍射图像。用Xia2(J.Appl.Cryst.(2010).43,186-190)处理得到的衍射图像，获得至分辨率
Figure BDA0003265595920002332
的衍射强度数据。结晶学的统计值在表2中显示。
应用得到的X线衍射强度数据，以已知的Fab的结晶结构作为搜索模型，应用Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)实施分子置换法，确定初期结构。其后，通过Coot(Acta Cryst.D66:486-501(2010))和Refmac5(Acta Cryst.D67:355-467(2011))重复模型构建和精密化，得到最终的精密化坐标。结晶学的统计值在表2中显示。
(3-2-5)SMB0002hFab的结晶的制备
将用本领域技术人员公知的方法纯化的SMB0002hFab通过尿素变性后，通过透析法再折叠，随后，通过凝胶过滤色谱(Superdex200 10/300 increase、GE Healthcare)纯化。应用浓缩至约13mg/mL的SMB0002hFab，通过坐滴蒸汽扩散法在20℃进行结晶化。储存溶液包含0.1M Morpheus缓冲液2pH 7.5、37.5％w/v M1K3350、0.1M Morpheus羧酸(Morpheus、Molecular Dimensions)。
(3-2-6)从SMB0002hFab的结晶收集X线衍射数据及结构确定
用液氮冷冻得到的结晶，用高能量加速器研究机构的放射光设施光子工厂的BL-17A测定X线衍射数据。测定中，通常将结晶在-178℃的氮气流下放置从而维持在冷冻状态。应用与光束线连接的Pilatus 6M检测器(DECTRIS)，将结晶1次回转0.25°并收集总计4320张X线衍射图像。用autoPROC(Acta Cryst.D67:293-302(2011))处理得到的衍射图像，获得至分辨率
Figure BDA0003265595920002341
的衍射强度数据。结晶学的统计值在表2中显示。
应用得到的X线衍射强度数据，以已知的Fab的结晶结构作为搜索模型，应用Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)实施分子置换法，确定初期结构。其后，通过Coot(Acta Cryst.D66:486-501(2010))和Refmac5(Acta Cryst.D67:355-467(2011))重复模型构建和精密化，得到最终的精密化坐标。结晶学的统计值在表2中显示
[表2]
X线数据收集和精密化统计值
Figure BDA0003265595920002351
a；Rmerge＝∑hk1∑j|Ij(hk1)-<I(hkl)>|/∑hk1∑j|Ij(hk1)|，此处，Ij(bk1)和<I(hk1)>分别是具有指数hk1的测定j的强度和反射的平均强度。
b；R因子＝∑hk1|Fcalc(hk1)|-|Fobs(hk1)|/∑hk1|Fobs(hk1)|，此处，Fobs和Fcalc分别是观测的和计算的结构因子的振幅。
c；Rfree为用随机除去的反射的5％算出。
(3-2-7)SMB0002hFab与腺苷的相互作用位点的鉴定
SMB0002hFab与腺苷的复合体(SMB0002hFab-腺苷复合体)的结晶结构的非对称单位中包含2个SMB0002hFab与腺苷的复合体。两者的结构可以良好地重合。以下说明的图8仅用一者分子制成。
根据SMB0002hFab-腺苷复合体的结晶结构可知，腺苷主要在该抗体Fab片段的重链和轻链间形成的口袋中，以腺嘌呤环部分朝向口袋里的形式结合。
如图8中显示，腺苷的腺嘌呤环部分由人源化SMB0002的轻链S91、N96及重链A33、I50、Y100的各侧链以及重链T100a、G99的各主链识别。特别地，腺嘌呤环的1位N与抗体轻链N96的侧链之间，及腺嘌呤环的6位的NH2与抗体轻链N96及S91的侧链、抗体重链T100a的主链的羰基氧之间，以及腺嘌呤环的7位N与抗体重链T100a的主链的酰胺NH之间形成氢键。另外，腺嘌呤环的8位CH与抗体重链G99的主链的羰基氧之间形成弱的氢键。进一步，腺嘌呤环与抗体重链A33、I50、Y100的各侧链之间形成称为CH-π或π-π等利用腺嘌呤环部分的π电子的相互作用。另外，核糖部分的3’位的O与抗体重链D54、S56的各侧链形成氢键。进一步，除这些相互作用外，腺苷由抗体重链T57、G52、W58、N100b、F100d、抗体轻链Y95c包围，形成范德华相互作用。通过这些相互作用，推定腺苷被人源化SMB0002识别。此外，Fab的氨基酸的残基编号赋予基于了Kabat编号赋予方案。
另外，如实施例(3-1)所示可知，人源化SMB0002不仅与腺苷、也与MTA结合。由于腺苷与MTA的分子结构具有类似的部分，从人源化SMB0002与腺苷的结晶结构，可以考察MTA与人源化SMB0002结合时的结合样式。对于腺苷与人源化SMB0002的结晶结构，腺苷的核糖5’位OH与腺嘌呤环部分3位的N之间形成分子内氢键，但在MTA中，其硫代甲基不能形成本相互作用。为了维持腺嘌呤环部分或核糖部分与人源化SMB0002之间形成的相互作用、且MTA与人源化SMB0002结合，需要MTA的硫代甲基位于从腺嘌呤环部分离开的方向。其结果，推测硫代甲基比腺苷的核糖5’位OH更位于重链CDR2及轻链CDR3附近，且其存在于抗体的表面侧。因此，与腺苷相比，认为MTA对于抗原的结合更容易形成直接的相互作用。
(3-2-8)SMB0002hFab与SMB0002hFab-腺苷复合体的结晶结构的比较
SMB0002hFab的结晶结构的非对称单位包含2个SMB0002hFab分子(分子1、分子2)。对于图9，如显示了从分子1(SMB0002hFab_1)与分子2(SMB0002hFab_2)提取可变区的重合的图9所示，显示两者的结构中，重链CDR1的结构与重链和轻链之间的扭曲角度不同。
根据显示了SMB0002hFab-腺苷复合体的结晶结构与SMB0002hFab_1重合的图10，可知两者的结构可以良好重合，推定SMB0002hFab_1可能采取与腺苷结合时同样的结构。另一方面，SMB0002hFab_2的结构与结合腺苷的复合体的结构不同，推定为不结合腺苷时的结构。
图11是显示了SMB0002hFab-腺苷复合体的结晶结构与SMB0002hFab_2的结晶结构的重合的图。提示人源化SMB0002的结构可能通过腺苷的结合固定为如SMB0002hFab-腺苷复合体那样的1个结构。具体地，重链CDR1的结构及重链和轻链之间的扭曲角度由于腺苷的结合而变化。
通过腺苷固定化的人源化SMB0002的结构与处于除其以外的状态的人源化SMB0002的结构不同，认为这对于依赖于腺苷与抗原结合的抗体中的依赖于腺苷的抗原结合是重要的。
也即，认为在依赖于腺苷与抗原结合的抗体中，抗原可以与采取通过腺苷固定化的结构的抗体结合，另一方面，在腺苷不存在下，抗原难以与抗体结合。因此，期望伴有腺苷的结合产生结构变化的区域的利用对于依赖于腺苷的抗原结合能力的发挥是有效的。认为利用通过腺苷的结合而固定的抗体的抗原结合界面，对于依赖于腺苷的抗原结合能力的发挥是重要的。
根据以上人源化SMB0002的结晶结构分析的结果，选出了不深度参与腺苷的结合的氨基酸位点，或者认为容易参与依赖于腺苷与抗原结合的氨基酸位点(抗体蛋白的表面露出的氨基酸残基所位于的氨基酸位点、或者位于腺苷结合时结构变化的抗体区域的氨基酸位点)。
(3-3)用于以人源化SMB0002为模板的文库设计的一个置换改变体的全面评价
根据结晶结构分析的结果，推定了人源化SMB0002中不深度参与人源化SMB0002对腺苷或者MTA的结合的氨基酸位点，或者认为容易参与依赖于腺苷与抗原结合或者依赖于MTA与抗原结合的氨基位点。即使将这些位点的氨基酸改变为与人源化SMB0002不同的氨基酸，也认为保持与MTA或者腺苷的相互作用的可能性高，因此，认为是用于文库设计的可以多样化的氨基酸位点。在可以多样化的氨基酸位点中，为了鉴定即使配置也不影响抗体与腺苷或者MTA的相互作用的氨基酸的种类，全面制备了将人源化SMB0002的这些可以多样化的氨基酸位点的氨基酸改变了一个的、人源化SMB0002-置换改变体。
基于重链之中与腺苷相互作用相关的考察的可以多样化的氨基酸位点(表中，记载为“Kabat”的以Kabat编号表示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”，在人源化SMB0002的该位点出现的氨基酸)及改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”)在表3中显示。
[表3]
Figure BDA0003265595920002391
基于轻链之中与腺苷相互作用相关的考察的可以多样化的氨基酸位点(表中，记载为“Kabat”的以Kabat编号表示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”，在人源化SMB0002的该位点出现的氨基酸)及改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”)在表4中显示。
[表4]
Figure BDA0003265595920002401
基于重链之中与腺苷相互作用相关的考察的可以多样化的氨基酸位点(表中，以记载为“Kabat”的Kabat编号表示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”，在人源化SMB0002的该位点出现的氨基酸)及改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”)在表5中显示。
[表5]
Figure BDA0003265595920002411
基于轻链之中与腺苷相互作用相关的考察的可以多样化的氨基酸位点(表中，记载为“Kabat”的以Kabat编号表示的位点)以及该位点的改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”，在人源化SMB0002的该位点出现的氨基酸)及改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”)在表6中显示。
[表6]
Figure BDA0003265595920002421
用Biacore T200(GE Healthcare)的方法测定、分析了人源化SMB0002或其一个置换改变体的针对腺苷或MTA的结合。在传感器芯片上捕获了分析对象的抗体，观察与腺苷或MTA的相互作用。
对于在传感器芯片上捕获的抗体，添加了腺苷稀释液/MTA稀释液和作为空白的流动缓冲液，观察了腺苷/MTA与抗体的结合。其后使流动缓冲液流动，观察腺苷/MTA从抗体的解离。各参数的算出中应用了Biacore T200评价软件(GE Healthcare)。
测定的结果，将各改变体针对腺苷和MTA的亲和力作为KD值算出。作为亲本抗体的人源化SMB0002针对腺苷的KD值与改变了重链的各改变体针对腺苷的KD值的比(作为亲本抗体的人源化SMB0002针对腺苷的KD值/改变了重链的各改变体针对腺苷的KD值)在表7中显示，作为亲本抗体的人源化SMB0002针对腺苷的KD值与改变了轻链的各改变体针对腺苷的KD值的比(作为亲本抗体的人源化SMB0002针对腺苷的KD值/改变了轻链的各改变体针对腺苷的KD值)在表8中显示。作为亲本抗体的人源化SMB0002针对MTA的KD值与改变了重链的各改变体针对MTA的KD值的比(作为亲本抗体的人源化SMB0002针对MTA的KD值/改变了重链的各改变体针对MTA的KD值)在表9中显示，作为亲本抗体的人源化SMB0002针对MTA的KD值与改变了轻链的各改变体针对MTA的KD值的比(作为亲本抗体的人源化SMB0002针对MTA的KD值/改变了轻链的各改变体针对MTA的KD值)在表10中显示。
[表7]
Figure BDA0003265595920002441
[表8]
Figure BDA0003265595920002451
[表9]
Figure BDA0003265595920002461
[表10]
Figure BDA0003265595920002471
(3-4)以人源化SMB0002为模板的文库的设计
设计文库时，基于一个置换改变体的全面评价得到的信息，将满足以下的条件之中至少一个的氨基酸作为可以多样化使用的氨基酸选出。
条件1)不深度参与针对MTA或者腺苷的结合的氨基酸；
条件2)预期腺苷结合时和非结合时人源化SMB0002的结构变化率较大的氨基酸。
将亲本抗体(人源化SMB0002)针对MTA的KD值与该位点改变为该氨基酸的重链改变体针对MTA的KD值的比(亲本抗体针对MTA的KD值/该位点改变为该氨基酸的重链改变体针对MTA的KD值)是0.4以上的改变氨基酸，轻链改变体针对MTA的KD值的比(亲本抗体针对MTA的KD值/该位点改变为该氨基酸的轻链改变体针对MTA的KD值)是0.1以上的改变氨基酸判定为条件1)中不深度参与针对MTA的结合的氨基酸，作为可以多样化使用的氨基酸选出。
将亲本抗体(人源化SMB0002)针对腺苷的KD值与该位点改变为该氨基酸的重链改变体针对腺苷的KD值的比(亲本抗体针对腺苷的KD值/该位点改变为该氨基酸的重链改变体针对腺苷的KD值)是0.4以上的改变氨基酸、轻链改变体针对腺苷的KD值的比(亲本抗体针对腺苷的KD值/该位点改变为该氨基酸的轻链改变体针对腺苷的KD值)是0.1以上的改变氨基酸，判定为条件1)中不深度参与针对腺苷的结合的氨基酸，作为可以多样化使用的氨基酸选出。
当重链的Kabat编号32位的氨基酸是D或者E时，或33位的氨基酸是V或者I或者T时，判定该氨基酸是满足条件2的氨基酸，作为可以多样化使用的氨基酸选出。
通过设计了在选出的可以多样化的氨基酸之中出现了至少任一个以上的氨基酸的文库，从而构建了用于获得依赖于MTA或者腺苷与抗原结合的抗体的文库(下文称为S02文库)。S02文库的重链中氨基酸多样化的氨基酸位点、以及该位点中的氨基酸储存库在表11中显示。S02文库的轻链中氨基酸多样化的氨基酸位点，以及该位点中的氨基酸储存库在表12中显示。在表中，分别地，记载为“Kabat”的Kabat编号所表示的位点表示氨基酸多样化的氨基酸位点，记载为“天然序列”的氨基酸表示该位点中未改变体人源化SMB0002的氨基酸，记载为“可以文库化的氨基酸”的氨基酸表示该位点中的氨基酸储存库。设计了以下文库，其中在重链中包含的各可以多样化的氨基酸位点中，在选出的氨基酸储存库中包含的氨基酸之中出现了至少任一个的。另外，设计了以下文库，其中在轻链中包含的各可以多样化的氨基酸位点中，在选出的氨基酸储存库中包含的氨基酸之中出现了至少任一个。
[表11]
Figure BDA0003265595920002481
[表12]
Figure BDA0003265595920002491
[实施例4]
用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体的文库的构建及该文库依赖于MTA与抗原结合的抗体的获得
(4-1)用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体的文库的构建
(4-1-1)重链或者轻链可变区噬菌体展示文库的构建
设计的S02文库中的重链可变区部分利用TRIM技术(Tiller T et al.MAbs 2013)进行基因合成，与人源化SMB0002的轻链可变区序列(SEQ ID NO:32)组合，导入至具有来自人IgG的CH1序列及来自人IgG的轻链恒定区序列的合适的噬粒载体中。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建了用于获得依赖于MTA或者腺苷与抗原结合的抗体的重链可变区噬菌体展示文库。
设计的S02文库中的轻链可变区部分利用TRIM技术(Tiller T et al.MAbs 2013)进行了基因合成，与人源化SMB0002的重链可变区序列(SEQ ID NO:64)组合，导入至具有来自人IgG的CH1序列及来自人IgG的轻链恒定区序列的合适的噬粒载体。将该噬粒载体通过电穿孔法导入大肠杆菌，从而构建了用于获得依赖于MTA或者腺苷与抗原结合的抗体的轻链可变区噬菌体展示文库。
(4-1-2)应用重链及轻链可变区噬菌体展示文库的与MTA结合的抗体组的浓缩
为了浓缩与MTA结合的抗体组，应用生物素化标记MTA(Biotin-2’-MTA)，分别从实施例(4-1-1)中构建的重链可变区噬菌体展示文库、轻链可变区噬菌体展示文库实施了淘选。
具体地，使保有所构建的重链可变区噬菌体展示文库或轻链可变区噬菌体展示文库的噬粒载体的大肠杆菌感染了M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体(hyperphage))(PROGENBiotechnik)，在25℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的集合用TBS稀释，从而制备抗体多价呈递噬菌体文库液。
应用固定于磁珠的Biotin-2’-MTA在2个条件下实施淘选。在抗体多价呈递噬菌体文库液中添加BSA使得终浓度为4％。作为磁珠，应用NeutrAvidin珠(TAMAGAWA SEIKI)或者Dynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)。将用BSA封闭的磁珠与终浓度10μM的Biotin-2’-MTA在室温反应30分钟，从而对磁珠固定Biotin-2’-MTA。将固定了Biotin-2’-MTA的磁珠用TBST洗涤3次，在第一条件下，在洗涤的磁珠中添加制备的抗体多价呈递噬菌体文库液0.4mL，在第二条件下，在洗涤的磁珠中添加与1mM的腺苷共存状态的制备的抗体多价呈递噬菌体文库液0.4mL，在室温反应60分钟。将珠用400μL的TBST洗涤3次，用TBS洗涤2次。其后，将加入了包含终浓度1mg/mL的胰蛋白酶的TBS 0.5mL的珠在室温悬浮15分钟，洗脱噬菌体。应用磁力架分离了珠，回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体添加至对数生长期(OD600为0.4-0.7)的20mL的大肠杆菌株ER2738。在37℃进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将大肠杆菌接种于225mm x 225mm的板。这一系列操作重复追加3次，分别从重链可变区噬菌体展示文库、轻链可变区噬菌体展示文库浓缩与MTA结合的抗体组。
(4-1-3)通过噬菌体ELISA淘选后获得的克隆群针对生物素化MTA的结合活性的评 价
从感染了呈递实施例(4-1-2)中浓缩的与MTA结合的抗体组中的抗体的噬菌体的大肠杆菌的单一菌落中，按照常规方法(Methods mol.Biol.(2002)178,133-145)回收了含有噬菌体的培养上清液。通过使用超级噬菌体作为辅助噬菌体，回收了抗体多价呈递噬菌体，进行ELISA。在链霉抗生物素包被的384孔微板(greiner)中添加了含有Biotin-2’-MTA的TBS 10μL，静置1小时以上。用TBST洗涤该平板的各孔后，各孔用80μL的0.2％脱脂奶-TBS封闭了1小时以上。用TBST洗涤各孔后，在各孔中加入制备的噬菌体静置一小时，从而使呈递于噬菌体的抗体与Biotin-2’-MTA结合。用TBST洗涤各孔后，在各孔中加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(GE Healthcare)静置一小时。用TBST洗涤各孔后，加入TMB single溶液(ZYMED)，一定时间后通过添加硫酸终止溶液的显色反应后，测定450nm波长的吸光度。分析的结果，确认到多个呈递与Biotin-2’-MTA结合的抗体的噬菌体。噬菌体ELISA的结果在图12(从重链可变区噬菌体展示文库浓缩的抗体组)，图13(从轻链可变区噬菌体展示文库浓缩的抗体组)，表13中显示。由ELISA的结果显示，在通过实施例(4-1-2)的淘选浓缩的抗体组中含有多个MTA结合抗体。
[表13]
Figure BDA0003265595920002511
(4-1-4)用噬菌体ELISA评价的克隆的抗体序列分析
关于用噬菌体ELISA评价的克隆，分析应用引物(SEQ ID NO:33及34)扩增的抗体基因的碱基序列。分析的结果显示，用噬菌体ELISA评价的192个克隆中的抗体序列重复样品为2个克隆以下，即使经实施例(4-1-2)的浓缩，文库也保持了高的序列多样性。
(4-1-5)利用对MTA的淘选构建用于获得依赖于MTA与抗体结合的抗体的文库
对于实施例(4-1-2)中浓缩的MTA结合抗体组，预期通过组合该抗体组中包含的改变重链和改变轻链制备的Fab呈递噬菌体文库也包含了多个保持针对MTA的结合的抗体，认为能够构建用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体的文库。
用本领域技术人员公知的方法，从感染了呈递实施例(4-1-2)中浓缩的MTA结合抗体组的噬菌体的大肠杆菌提取了抗体基因。对于从重链可变区噬菌体文库浓缩的抗体组，用能够扩增重链可变区的引物(SEQ ID NO:34，35)扩增了重链可变区基因。对于从轻链可变区噬菌体文库浓缩的抗体组，通过限制酶处理而除去人源化SMB0002的重链可变区序列，制备了包含轻链可变区文库基因与来自人IgG的轻链恒定区序列与来自人IgG的CH1序列的噬粒片段。通过在前述噬粒载体片段中插入从重链可变区文库扩增的重链可变区基因，构建导入了重链/轻链可变区文库基因的噬粒载体。将该载体通过电穿孔导入大肠杆菌，由此呈递包含人抗体可变区和恒定区的Fab结构域，构建用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体的文库(下文称为MTA浓缩S02文库)。
(4-2)依赖于MTA与抗原结合的抗体的获得
在MTA存在下，从实施例(4-1-5)中构建的MTA浓缩S02文库，筛选了分别针对人IL-6受体(hIL-6R)、人IL-6(hIL-6)、人IgA(hIgA)显示结合活性的抗体。
具体地，使保有构建的MTA浓缩S02文库的噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体)(PROGEN Biotechnik)，在25℃培养一晩，从上清回收噬菌体。在进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG，并将由此得到的沉淀的噬菌体的集合用TBS稀释，从而制备了抗体多价呈递噬菌体文库液。
分别实施了应用固定于磁珠的hIL-6R、hIL-6、hIgA的淘选。在抗体多价呈递噬菌体文库液中添加BSA使得终浓度为4％。在添加了BSA的抗体多价呈递噬菌体文库液0.8mL中加入0.1nmol的生物素标记抗原与终浓度100μM的MTA，在室温反应60分钟，加入用BSA封闭的磁珠，在室温反应15分钟。作为磁珠，应用NeutrAvidin珠(TAMAGAWA SEIKI)或者Dynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)。将磁珠用0.8mL的包含终浓度100μM的MTA的TBST洗涤2次或者3次，用包含终浓度100μM的MTA的TBS洗涤1次或者2次。其后，将加入了0.25mL的TBS的珠在室温悬浮，用磁力架分离珠，洗脱噬菌体溶液。分离的珠再度加入0.25mL的TBS，将珠在室温悬浮，用磁力架分离珠，洗脱噬菌体溶液。混合2次洗脱的噬菌体溶液。在回收的噬菌体溶液中加入最终浓度1mg/mL的胰蛋白酶。将回收的噬菌体添加至为对数增殖期(OD600为0.4-0.7)的20mL的大肠杆菌株ER2738。在37℃进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，由此使噬菌体感染大肠杆菌。将大肠杆菌接种于225mm x225mm的平板。这一系列操作追加重复3次。
(4-3)通过噬菌体ELISA的淘选后获得的克隆群的MTA存在下的抗原结合活性的评 价
按照常规方法(Methods mol.Biol.(2002)178,133-145)，从实施例(4-2)的淘选得到的大肠杆菌的单一菌落回收了含有噬菌体的培养上清液。应用超级噬菌体作为辅助噬菌体，回收了抗体多价呈递噬菌体。应用NucleoFast96(MACHERY-NAGEL)，对回收的噬菌体培养上清液进行超滤。具体地，在NucleoFast96的各孔中添加培养上清液各0.2mL，在6000g进行40分钟离心分离除去流通物(flowthrough)。其后，将H2O 0.2mL添加于各孔，在6000g进行20分钟离心分离除去流通物。其后，将TBS 0.2mL添加于各孔，在室温静置5分钟后，回收抗体多价呈递噬菌体溶液。
在MTA不存在下的噬菌体ELISA如下进行。按以下的顺序将用TBS稀释的噬菌体进行ELISA。在链霉抗生物素包被的384孔微板(greiner)中添加10μl包含生物素标记抗原的TBS静置1小时以上。用TBST洗涤该平板的各孔后，各孔用80μL的0.02％脱脂奶-TBS封闭1小时以上。用TBST洗涤各孔后，在各孔中加入回收的抗体多价呈递噬菌体静置一小时，从而使呈递于噬菌体的抗体在不存在MTA的条件下与生物素标记抗原结合。用TBST洗涤各孔后，在各孔中加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(GE Healthcare)静置一小时。用TBST洗涤该孔后，加入TMB single溶液(ZYMED)，一定时间后通过添加硫酸终止溶液的显色反应，之后测定450nm波长的吸光度。
在MTA存在下的噬菌体ELISA如下进行。按以下的顺序将用包含终浓度100μM的MTA的TBS稀释的噬菌体供给ELISA。在链霉抗生物素包被的384孔微板(greiner)中添加10μl包含生物素标记抗原的TBS静置1小时以上。用TBST洗涤该平板的各孔后，各孔用80μL的0.02％脱脂奶-TBS封闭1小时以上。用TBST洗涤各孔后，在各孔中加入回收的抗体多价呈递噬菌体静置一小时，从而使呈递于噬菌体的抗体在MTA存在下与生物素标记抗原结合。用包含终浓度100μM的MTA的TBST洗涤各孔后，在各孔中加入用包含终浓度100μM的MTA的TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(GE Healthcare)静置一小时。将该孔用包含终浓度100μM的MTA的TBST洗涤后，加入TMB single溶液(ZYMED)，一定时间后通过添加硫酸终止溶液的显色反应后，测定450nm波长的吸光度。
分析的结果，根据分别应用生物素标记人IL-6受体(hIL-6R)、人IL-6(hIL-6)、人IgA(hIgA)的淘选，确认多个依赖于MTA与抗原结合的抗体。噬菌体ELISA的结果在表14中显示。获得多个对任何抗原在MTA存在下都能够与抗原结合、在不存在MTA的条件下不能与抗原结合的克隆。在这些克隆中，有依赖于腺苷和MTA的双方与抗原结合的抗体，也可以获得在腺苷存在下不显示对抗原的结合的克隆(特异依赖于MTA与抗原结合的抗体)。因此，显示了从MTA浓缩S02文库可以获得特异依赖于MTA与抗原结合，不显示对于具有与MTA类似的结构的低分子化合物为依赖性的抗原结合，具有优异的MTA依赖特异性的抗体。
[表14]
Figure BDA0003265595920002551
(4-4)依赖于MTA与抗原结合的抗体的序列分析
对于用噬菌体ELISA评价的几个抗体群，分析应用引物(SEQ ID NO:33及34)扩增的抗体基因的碱基序列。
(4-5)依赖于MTA与抗原结合的抗体的表达和纯化
将抗体的重链可变区和轻链可变区序列各自分别插入至具有重链抗体恒定区序列(SEQ ID NO:38)或者轻链κ恒定区序列(SEQ ID NO:39)的动物表达用质粒。将表15表示的抗体用参考实施例1的方法表达、纯化。
[表15]
Figure BDA0003265595920002561
(4-6)应用表面等离子共振评价MTA存在下的抗体抗原结合活性
应用Biacore T200(GE Healthcare)评价了实施例(4-5)中纯化的抗体与靶抗原的抗原抗体反应中MTA与腺苷的影响。作为流动缓冲液，应用了20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4，在25℃测定。在传感器芯片CM4上通过胺偶联法固定ProA/G，在其上固定抗体后，将各种抗原作为分析物使其相互作用，从而观察抗原抗体间的结合量的变化。抗原的稀释中，使用了流动缓冲液及在流动缓冲液中以各自终浓度100μM的浓度添加了MTA或腺苷中的任一的缓冲液。另外，以数个梯度的浓度系列制备抗原，从对各抗原浓度的传感图通过单循环动力学分析算出各克隆的解离常数KD。参数的算出应用了BiacoreT200评价软件(GE Healthcare)。在100μM MTA存在下各克隆的解离常数KD在表16中显示。另外，未观察到在100μM腺苷存在下与抗原的结合。
[表16]
Figure BDA0003265595920002571
将在100μM MTA或者100μM腺苷存在下与不存在下各克隆对抗原的结合量在图14中显示。如图14所示，各克隆在100μM MTA存在下与抗原结合，但在不存在MTA的条件下不与抗原结合。据此确认，纯化的各抗体具有依赖于MTA与抗原结合的性质。
(4-7)依赖于MTA结合的抗体的MTA依赖性T细胞活化能力的评价
为了确认依赖于MTA结合的抗体依赖于MTA起作用，应用依赖于MTA结合的抗体评价了在MTA存在下及不存在下T细胞的活化能力。评价中应用了包含实施例(4-5)中克隆的MTA依赖性抗hIL-6R抗体(6RS2T007H-F760mnN17/6RS2T007L-KT0)、及抗CD3抗体(重链可变区：SEQ ID NO:40、重链恒定区：SEQ ID NO:42、轻链可变区：SEQ ID NO:41、轻链恒定区：SEQ ID NO:39)的抗hIL-6R/hCD3双特异性抗体。
上述MTA依赖性抗hIL-6R抗体及抗CD3抗体分别按照参考实施例1的方法制备。混合获得的MTA依赖性抗IL-6R抗体及抗CD3抗体，在25mM 2-MEA(2-巯基乙基胺)存在下在37℃反应90分钟，从而制备具有两个抗体的重链及轻链、具有依赖于MTA与hIL-6R结合的抗原结合结构域和与CD3结合的抗原结合结构域的双特异性抗体。将制备的双特异性抗体通过透析与PBS溶剂置换后，应用分光光度计测定280nm的吸光度。从得到的吸光度的测定值，应用通过参考实施例1中记载的PACE法算出的吸光系数，算出纯化抗体的浓度。抗体用包含10％FBS的RPMI1640培养基(分析缓冲液)或包含MTA或者腺苷的分析缓冲液稀释，用于T细胞活化能力的评价。
在T细胞的活化能力的评价中，作为人T细胞株使用了NFAT-RE-luc2-Jurkat细胞，作为hIL-6R表达细胞株应用了在CT26中强制表达hIL-6R的CT26/hIL-6R。将NFAT-RE-luc2-Jurkat细胞及CT26/hIL-6R细胞在分析缓冲液中悬浮使用，使得细胞密度分别为3×106个细胞/mL、1×106个细胞/mL。在384孔平板的各孔中分别每10μl添加制备的人T细胞株及hIL-6R表达细胞株的悬浮液，进一步添加10μl制备的抗体溶液。在5％CO2培养箱中于37℃静置6小时。测定静置后该样品的荧光素酶活性，从而评价人T细胞株的活化能力。荧光素酶活性的测定中应用市售的荧光素酶活性测定试剂(Bio-Glo荧光素酶分析系统、Promega)实施。将荧光素酶发光底物30μl添加至静置后的平板的孔，进一步静置10分钟后，通过Envision(PerkinElmer)测定孔的发光量。将各孔的测定值除以抗体未添加的对照孔的测定值，得到的值作为发光倍数作为评价T细胞活化能力的指标。
评价MTA或者腺苷存在下、不存在下制备的双特异性抗体的T细胞活化能力的结果在图28中显示。如图28所示，与MTA不存在下比较，在300μM MTA存在下，确认制备的双特异性抗体强力活化T细胞。进一步，与300μM腺苷存在下比较，在300μM MTA存在下，确认强力活化了T细胞，据此确认了制成的具有依赖于MTA与hIL-6R结合的抗原结合结构域和与CD3结合的抗原结合结构域的双特异性抗体依赖于MTA、且MTA特异性地活化T细胞。
(4-8)依赖于MTA结合的抗体的MTA依赖性结合的验证
关于实施例(4-5)中克隆的依赖于MTA结合的抗hIL-6R抗体(6RS2T007H-F760mnN17/6RS2T007L-KT0)，应用Biacore T200(GE Healthcare)验证了MTA浓度依赖性的抗原结合量的变化。测定应用了MTA以终浓度0.1、1、10、100μM的浓度添加的20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4作为流动缓冲液，在25℃测定。使用Series SSensor Chip CM4作为传感器芯片，通过胺偶联法固定ProA/G，在其上使抗体固相化后，将hIL-6R作为分析物使其相互作用，从而测定抗原抗体间的结合量的变化。在抗原的稀释中，应用流动缓冲液。各MTA浓度的抗体的抗原结合量变化在图29中显示。由此结果，确认了依赖于MTA结合的抗体相应于MTA浓度与抗原的结合量梯度变化，确认了MTA的浓度依赖性结合。
另外，应用Octet RED384系统(Forte Bio)，验证了依赖于MTA结合的抗体相应于MTA浓度的降低而可逆地从抗原解离。在Protein A生物传感器(Forte Bio)中将抗体固相化后，在结合相中将hIL-6R作为分析物使其相互作用，测定了抗原抗体间的结合量的变化。作为结合相，使用了包含MTA以终浓度10、100μM的浓度添加的20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4稀释的3000nM的分析物的缓冲液。在解离相中，使用包含与结合相相同浓度的分析物、MTA与结合相相同浓度添加的溶液和不添加MTA的缓冲液。显示从结合相至解离相对抗原的结合量的经时变化的传感图在图30中显示。图中的w/MTA显示解离相中包含与结合相相同浓度的MTA，w/o MTA显示解离相中不包含MTA。据此结果确认，包含MTA的溶液中维持了与解离相中的分析物的结合，与之相对，不包含MTA的溶液中与分析物的解离速度增加，确认了对于依赖于MTA结合的抗体与抗原的结合在MTA存在下与不存在下，结合活性能够可逆地变化。
[实施例5]通过兔B细胞克隆的抗MTA抗体的获得及评价
(5-1)通过兔B细胞克隆的抗MTA抗体的获得
(5-1-1)用于获得抗MTA抗体的免疫原的设计
作为对兔免疫的免疫原，应用了6’-MTA-匙孔血蓝蛋白(6’-MTA-KLH)。Mariculture匙孔血蓝蛋白(KLH)是辅助T细胞上表达的T细胞受体能够识别的抗原性高的蛋白质，已知其对抗体产生进行活化，因此，期待通过与MTA连接增强针对MTA的抗体的产生。
另外，制备了代替KLH使生物素与MTA连接的6’-MTA-生物素。
(5-1-2)用于获得抗MTA抗体的免疫原的合成
(2R,3R,4S,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(氯甲基)氧杂环戊烷-3,4-二醇
[化学式13]
Figure BDA0003265595920002601
在氮气氛下在(2R,3R,4S,5R)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(羟基甲基)氧杂环戊烷-3，4-二醇(16.08g，60.17mmol，1当量)的乙腈溶液(210mL)中加入吡啶(9.78mL，2.0当量)。在此溶液中在0℃边搅拌边缓慢滴加亚硫酰氯(22.2mL，5.0当量)，在5℃6小时、然后在25℃过夜搅拌。将溶液用甲醇：水＝5：1(v/v，360mL)稀释，进一步用28％氨水(30mL)中和。过滤收集析出的固体，干燥，以白色固体形式得到(2R,3R,4S,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(氯甲基)氧杂环戊烷-3,4-二醇(12.0g，收率70％)。
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，ppm)δ8.35(s，1H)，8.17(s，1H)，7.30(s，2H)，5.94(d，J＝5.6Hz，1H)，5.60(d，J＝6.0Hz，1H)，5.46(d，J＝5.2Hz，1H)，4.76(q，J＝5.6Hz，1H)，4.23(q，J＝4.8Hz，1H)，4.14-4.06(m，1H)，3.96(dd，J＝11.6，5.1Hz，1H)，3.85(dd，J＝11.6，6.4Hz，1H)。
(2R,3R，4S，5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷- 3,4-二醇
[化学式14]
Figure BDA0003265595920002611
在(2R,3R,4S,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-(氯甲基)氧杂环戊烷-3,4-二醇(10.0g，35.0mmol，1当量)N,N-二甲基甲酰胺溶液(300mL)中加入甲硫醇钠(14.73g，210mmol，3.0当量)，在氮气氛下于50℃搅拌2小时。将反应溶液在减压下浓缩，得到的残渣用水(500mL)稀释。将溶液的pH用4N盐酸调节至7，过滤收集析出的固体，以白色固体形式得到(2R，3R,4S,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-3,4-二醇(7.0g，收率67％)。
LC-MS(ES，m/z)：298[M+H]+
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，ppm)δ8.36(s，1H)，8.16(s，1H)，7.28(s，2H)，5.90(d，J＝5.7Hz，1H)，5.52(d，J＝5.7Hz，1H)，5.37-5.31(m，1H)，4.76(q，J＝5.0Hz，1H)，4.16(q，J＝3.6Hz，1H)，4.04(td，J＝6.3，3.6Hz，1H)，2.94-2.71(m，2H)，2.06(s，3H)。
9-[(3aR,4R,6S,6aS)-2,2-二甲基-6-[(甲基硫烷基)甲基]-四氢-2H-呋喃并[3, 4-d][1,3]间二氧杂环戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-胺
[化学式15]
Figure BDA0003265595920002621
于0℃在(2R,3R,4S,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-3,4-二醇(7.0g，23.54mmol，1.0当量)的丙酮溶液(500mL)中添加2,2-二甲氧基丙烷(19.55g，187.71mmol，3.0当量)及对甲苯磺酸(7.91g，45.93mmol，2.0当量)，于25℃搅拌4小时。用1N氨水将溶液的pH调节至7后，将溶液在减压下浓缩。残渣用溶解于乙酸乙酯(200mL)的蒸馏水(100mL)洗涤2次，有机层在减压下浓缩。残渣用硅胶柱(二氯甲烷：甲醇＝10：1)纯化，以白色固体形式得到9-[(3aR,4R,6S,6aS)-2,2-二甲基-6-[(甲基硫烷基)甲基]-四氢-2H-呋喃并[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-胺(6.0g，收率76％)。
LC-MS(ES，m/z)：338[M+H]+
1H-NMR(300MHz，Chloroform-d，ppm)δ8.32(s，1H)，7.91(s，1H)，6.06(d，J＝2.2Hz，1H)，5.89(s，2H)，5.49(dd，J＝6.4，2.2Hz，1H)，5.04(dd，J＝6.4，3.2Hz，1H)，4.45-4.33(m，1H)，2.75(qt，J＝18.4，9.8Hz，2H)，2.08(s，3H)，1.59(s，3H)，1.38(s，3H)。
6-([9-[(3aR,4R,6S,6aS)-2,2-二甲基-6-[(甲基硫烷基)甲基]-四氢-2H-呋喃并 [3,4-d][1,3]间二氧杂环戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-基]氨基)己酸乙酯
[化学式16]
Figure BDA0003265595920002631
于25℃在9-[(3aR,4R，6S,6aS)-2,2-二甲基-6-[(甲基硫烷基)甲基]-四氢-2H-呋喃并[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-胺(2.0g，5.93mmol，1当量)的N，N-二甲基甲酰胺溶液(17mL)中加入氢化钠(60％，248mg，6.2mmol，1.05当量)，在氮气氛下搅拌2小时。缓慢滴加6-溴己酸乙酯(1.38g，6.19mmol，1.05当量)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(4mL)，在60℃搅拌2小时。将反应混合物注入100mL冰水中，用乙酸乙酯(100mL)提取。在减压下浓缩有机层，得到的残渣用硅胶柱(乙酸乙酯：石油醚＝1：1)纯化，以白色固体形式得到6-([9-[(3aR,4R,6S,6aS)-2,2-二甲基-6-[(甲基硫烷基)甲基]-四氢-2H-呋喃并[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-基]氨基)己酸乙酯(1.4g，收率49％)。
LC-MS(ES，m/z)：480[M+H]+
6-([9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]- 9H-嘌呤-6-基]氨基)己酸
[化学式17]
Figure BDA0003265595920002632
在6-([9-[(3aR,4R,6S,6aS)-2,2-二甲基-6-[(甲基硫烷基)甲基]-四氢-2H-呋喃并[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊烯-4-基]-9H-嘌呤-6-基]氨基)己酸乙酯(450mg，0.94mmol，1当量)的四氢呋喃溶液(7mL)中加入1N盐酸(3.5mL)，在50℃搅拌6小时。将反应液在减压下浓缩，残渣用蒸馏水(8mL)稀释，收集析出的固体。得到的粗产物用制备型HPLC(岛津HPLC-10，XBridge Shield RP18 OBD柱，5μm，19mm x 150mm，移动相水(含有0.05％氨水)及乙腈，梯度5.0-20.0％，检测UV254nm)纯化，以白色固体形式得到6-([9-[(2R,3R,4S，5S)-3，4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]-9H-嘌呤-6-基]氨基)己酸(159.5mg，41％)。
LC-MS(ES，m/z)：412[M+H]+
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，ppm)δ11.81(s，1H)，8.35(s，1H)，8.22(s，1H)，7.82(s，1H)，5.90(d，J＝5.7Hz，1H)，5.49(s，1H)，5.31(s，1H)，4.75(t，J＝5.3Hz，1H)，4.16(t，J＝4.3Hz，1H)，4.04(ddd，J＝6.9，5.8，3.7Hz，1H)，3.47(s，2H)，2.94-2.74(m，2H)，2.20(t，J＝7.3Hz，2H)，2.07(s，3H)，1.56(dp，J＝25.6，7.4Hz，4H)，1.33(qd，J＝8.4，6.0Hz，2H)。
6-([9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]- 9H-嘌呤-6-基]氨基)-N-(丙-2-炔-1-基)己酰胺
[化学式18]
Figure BDA0003265595920002641
在6-([9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]-9H-嘌呤-6-基]氨基)己酸(580mg，1.41mmol，1当量)的二氯甲烷溶液(20mL)中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(542mg，2.83mmol，2.0当量)、二异丙基乙胺(910mg，7.04mmol，5.0当量)及丙-2-炔-1-胺(388mg，7.04mmol，5.0当量)，于25℃搅拌3天。将溶液用100mL的蒸馏水稀释，收集析出的固体并干燥，以白色固体形式得到6-([9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]-9H-嘌呤-6-基]氨基)-N-(丙-2-炔-1-基)己酰胺，其不进一步纯化而用于下一步骤(420mg，收率66％)。
N-[[1-(2-[2-[2-(2-[5-[(3aS，4S，6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑 烷-4-基]戊酰胺]乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-6-([9- [(2R,3R,4S,5S)-3，4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]-9H-嘌呤-6-基] 氨基)己酰胺
[化学式19]
Figure BDA0003265595920002651
在6-([9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]-9H-嘌呤-6-基]氨基)-N-(丙-2-炔-1-基)己酰胺(100mg，0.22mmol，1当量)的四氢呋喃(3mL)及叔丁醇(3mL)的溶液中加入N-(2-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-5-((3aS，4S,6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(99.1mg，0.22mmol，1.0当量)、CuSO4 5H2O(55.5mg，0.22mmol，1.0当量)、抗坏血酸钠(1M水溶液、7滴)，于20℃搅拌16小时。将溶液用20mL乙酸乙酯稀释，用15mL的蒸馏水分配。将有机层在减压下浓缩，得到的粗产物用制备型HPLC(岛津HPLC-10，XBridge Shield RP18 OBD柱，5μm，19mm x150mm，移动相水(含有10mmol/L NH4HCO3+0.1％氨水)及乙腈，梯度16.0-27.0％，检测UV220nm)纯化，以白色固体形式得到N-[[1-(2-[2-[2-(2-[5-[(3aS,4S，6aR)-2-氧代-六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑烷-4-基]戊酰胺]乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基]-6-([9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]-9H-嘌呤-6-基]氨基)己酰胺。(57.4mg，收率29％)。
LC-MS(ES，m/z)：893[M+H]+
1H-NMR(400MHz，DMSO-d6，ppm)δ8.35(s，1H)，8.25(dd，J＝13.4，7.7Hz，2H)，7.89-7.78(m，3H)，6.41(s，1H)，6.35(s，1H)，5.90(d，J＝5.7Hz，1H)，5.48(d，J＝6.0Hz，1H)，5.31(d，J＝5.0Hz，1H)，4.75(q，J＝5.6Hz，1H)，4.49(t，J＝5.3Hz，2H)，4.29(dd，J＝14.3，6.7Hz，3H)，4.20-4.08(m，2H)，4.04(td，J＝6.3，3.7Hz，1H)，3.80(t，J＝5.3Hz，2H)，3.55-3.27(m，14H)，3.23-3.04(m，3H)，2.94-2.74(m，3H)，2.58(d，J＝12.4Hz，1H)，2.14-2.02(m，7H)，1.53(ddtd，J＝35.3，28.2，13.8，7.6Hz，8H)，1.38-1.22(m，4H)。
6-([9-[(2R,3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]- 9H-嘌呤-6-基]氨基)己酸的匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合物(6’-MTA-KLH)
在6-([9-[(2R，3R,4S,5S)-3,4-二羟基-5-[(甲基硫烷基)甲基]氧杂环戊烷-2-基]-9H-嘌呤-6-基]氨基)己酸(4.94mg，0.012mmol，1当量))的DMSO(200μl)溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.30mg，0.012mmol，1.0当量)、羟基-2,5-二氧代吡咯烷-3-磺酸钠盐(2.61mg，0.012mmol，1.0当量)，于20℃搅拌2小时。取得此溶液50μl，于4℃加入KLH(10mg，ThermoFisher Scientific公司，77600)的磷酸缓冲液(pH8.4，0.95μL)，缓慢搅拌，于4℃静置24小时。将含有得到的缀合物的溶液直接用于动物免疫。
(5-1-3)通过兔B细胞克隆的抗MTA抗体的筛选
应用了实施例(5-1-2)中合成的6’-MTA-KLH，将兔用本领域技术人员公知的方法免疫。从经免疫的兔的血液或脾脏采取的细胞悬浮液，用autoMACS Pro Separator和FACSAria(BD)选择了在未标记腺苷共存下也具有MTA结合活性的细胞的候补物。随后，应用了选择的细胞的培养上清液中分泌的抗体对细胞进行筛选。具体地，通过ELISA法，评价了对6’-MTA-生物素的结合活性的有无、及未标记MTA共存下与6’-MTA-生物素的结合活性的有无。以分泌与6’-MTA-生物素结合、在未标记MTA共存下与有无腺苷的共存无关抑制与6’-MTA-生物素的结合的抗体为指标选择了细胞，用PCR法从选择的细胞获得了重链可变区基因及轻链可变区基因。从获得的可变区基因表达了组合人IgG1重链恒定区、及人轻链恒定区的抗体。
(5-1-4)从兔B细胞克隆得到的克隆的序列分析
关于实施例(5-1-3)中获得的抗体分析了应用引物(SEQ ID NO:44及45)扩增的抗体基因的碱基序列。序列在以下的表17中显示。
[表17]
Figure BDA0003265595920002671
(5-2)从兔B细胞克隆得到的克隆针对MTA及其类似体的结合活性的评价
为了验证从兔B细胞克隆得到的克隆是否与MTA特异性结合，用Biacore T200(GEHealthcare)分析了针对MTA及其类似体的结合性。
对于预先固定了蛋白A的Sensor chip Protein A(GE healthcare)、或预先固定了链霉抗生物素的Sensor chip SA(GE Healthcare)中结合了生物素化的抗人IgG CH1分子即CaptureSelect Biotin Anti-IgG-Fc(Hu)(Thermo fisher scientific)的固定化表面，捕获了目的抗体，使MTA(sigma-aldrich)或MTA类似体进行相互作用。作为MTA类似体，根据与MTA的结构类似性及MTAP缺失细胞株的患癌小鼠的肿瘤组织内浓度，选择了腺苷(Wako)(肿瘤组织内测定浓度：182nM)及S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸，(SAH)(sigma-aldrich)(肿瘤组织内测定浓度：30nM)。流动缓冲液应用20mM ACES-NaOH,150mM NaCl,0.05％Tween20,0.05％DMSO。使MTA或腺苷或SAH以流速30μL/min相互作用120秒，其后用流动缓冲液进行解离。相互作用在25℃进行测定，MTA及其类似体的稀释应用了与流动缓冲液相同的缓冲液。
基于从测定中得到的传感图算出的动力学参数即结合速度常数ka(1/Ms)，及解离速度常数kd(1/s)算出了解离常数KD(M)。或者，应用稳态分析法(Steady state analysis)算出了解离常数KD(M)。各参数的算出应用了Biacore T200评价软件(GE Healthcare)。
通过此测定，如表18确定各抗体针对MTA及其类似体的结合活性，确认选择的抗体的任一都针对MTA具有高选择性。
[表18]
Figure BDA0003265595920002681
(5-3)抗MTA抗体MTA0303的X线结晶结构分析
分析了MTA0303的Fab片段(MTA0303Fab)与甲硫腺苷(MTA)的复合体(MTA0303Fab-MTA)的结晶结构。
(5-3-1)用于结晶化的MTA0303全长抗体的制备
用于结晶化的MTA0303全长抗体的制备及纯化通过本领域技术人员公知的方法进行。
(5-3-2)用于MTA0303Fab的结晶结构分析的Fab片段的制备
将MTA0303全长抗体通过Endoproteinase Lys-C(Roche、目录编号11047825001)进行限制消化，随后，应用了加载至用于除去Fc片段的蛋白A柱(MabSlect SuRe、GEHealthcare)、阳离子交换柱(HiTrap SP HP、GE Healthcare)、及凝胶过滤柱(Superdex7516/60、GE Healthcare)的传统方法，制备了MTA0303Fab。合并了包含Fab片段的级分，保存在-80℃。
(5-3-3)MTA0303Fab与MTA的复合体(MTA0303Fab-MTA复合体)的结晶的制备
对而结晶言，应用用本领域技术人员公知的方法纯化、浓缩至约16mg/mL的MAT0303Fab中以终浓度2mM与MTA混合的溶液，通过组合了播种法与株式会社创晶中进行的飞秒激光照射(J.Appl.Phys.42:L798-L800(2003))的坐滴蒸汽扩散法，于5℃进行。储存溶液中包含0.1M HEPES pH 7.5、70％v/v(+/-)-2-甲基-2,4-戊二醇。
(5-3-4)从MTA0303Fab-MTA复合体的结晶收集X线衍射数据及确定结构
将得到的结晶用液氮冷冻，用Paul Scherrer研究所的放射光设施Swiss LightSource X10SA测定了X线衍射数据。在测定中，结晶通常置于-178℃的氮气流下而维持冷冻状态。应用了与光束线连接的Pilatus 6M检测器(DECTRIS)，使结晶1次回转0.25°，并收集总计720张X线衍射图像。用autoPROC(Acta Cryst.D67:293-302(2011))处理得到的衍射图像，获得至分辨率
Figure BDA0003265595920002691
的衍射强度数据。结晶学的统计值示于表19。
应用得到的X线衍射强度数据，将已知的Fab的结晶结构作为检索模型，应用Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)实施了分子置换法，确定初期结构。其后，重复通过Coot(Acta Cryst.D66:486-501(2010))与Refmac5(Acta Cryst.D67:355-467(2011))的模型构建和精密化，得到最终的精密化坐标。结晶学的统计值示于表19。
(5-3-5)MTA0303Fab与MTA的相互作用位点的鉴定
通过图20中显示MTA0303Fab-MTA复合体的结晶结构，知晓MTA以在MTA0303Fab的重链和轻链之间形成的口袋中，硫代甲基部分朝向口袋里的形式结合。另外，如图15所示，MTA以被重链CDR2盖住，深埋在里面的方式结合。
如图16中所示，MTA的腺嘌呤环部分由该抗体的轻链R32、S50、L91、重链W34、Y52e的各侧链识别。特别地，腺嘌呤环的7位N与重链Y52e的侧链之间、以及腺嘌呤环的2位CH与轻链S50的侧链之间形成氢键。进一步，腺嘌呤与重链W34及轻链R32、L91的各侧链之间利用被称为CH-π、π-π等的腺嘌呤环部分的π电子形成相互作用。另外，核糖部分的3’位的O与轻链Y36的侧链之间、及核糖部分的2’位的O与轻链S34及重链E101的各侧链之间形成氢键。硫代甲基部分利用在重链W34、W47、F52的各侧链之间的CH-π相互作用、硫原子与π电子之间形成的相互作用来识别。进一步，除了这些相互作用，MTA也被重链C35a、轻链L46、Y49、A89、G90、P96包围，形成范德华相互作用。通过这些相互作用，推定MTA由该抗体强力识别。
另外，如图17所示，该抗体的重链CDR2形成特征性的螺旋结构。根据结晶结构知晓，该2级结构中包含的重链Y52e的侧链形成MTA的腺嘌呤环部分与氢键。认为此相互作用的形成可能作为构成螺旋结构的触发器。因此认为，该抗体的结构可能伴随MTA的结合而变化。
认为MTA不存在下该抗体的结构与MTA存在下该抗体的结构不同对MTA依赖性与抗原结合是重要的。即，蛋白质抗原可以仅与伴随MTA的结合结构变化的抗体结合，另一方面，在MTA不存在下，该抗体的结构与MTA存在下的结构不同，因此，假定在MTA不存在的状态，蛋白质抗原不能与抗体结合。因此，期望对伴随MTA的结合产生结构变化的区域的利用而言，对MTA依赖性抗原结合能力的发挥是有效的。该抗体中，考虑伴随MTA的结合重链CDR2的结构变化，因此，期望通过重链CDR2的利用获得依赖于MTA与抗原结合的抗体。另外，对Fab的氨基酸的残基编号赋予而言，基于Kabat编号赋予方案。
(5-4)抗MTA抗体MTA0330的X线结晶结构分析
分析了MTA0330的Fab片段(MTA0330Fab)与MTA的复合体(MTA0330Fab-MTA)的结晶结构。
(5-4-1)用于结晶化的MTA0330全长抗体的制备
用于结晶化的MTA0330全长抗体的制备及纯化通过本领域技术人员公知的方法进行。
(5-4-2)用于MTA0330Fab的结晶结构分析的Fab片段的制备
将MTA0303全长抗体通过Endoproteinase Lys-C(Roche、目录编号11047825001)进行限制消化，随后，应用加载至用于除去Fc片段的蛋白A柱(MabSlect SuRe、GEHealthcare)、阳离子交换柱(HiTrap SP HP、GE Healthcare)、及凝胶过滤柱(Superdex7516/60、GE Healthcare)的传统方法，制备了MTA0330Fab。合并包含Fab片段的级分，保存在-80℃。
(5-4-3)MTA0330Fab和MTA的复合体(MTA0330Fab-MTA复合体)的结晶的制备
对结晶而言应用了用本领域技术人员公知的方法纯化、浓缩至约13.3mg/mL的MAT0330 Fab中以终浓度2mM与MTA混合的溶液，通过坐滴蒸汽扩散法，于20℃进行。储存溶液包含30.0％w/v P550MME_P20K、0.1M Morpheus缓冲液1pH 6.5、60mM MorpheusDivalents(Morpheus、Molecular Dimensions)。
(5-4-4)从MTA0330Fab-MTA复合体的结晶收集X线衍射数据及结构确定
将得到的结晶用液氮冷冻，用Paul Scherrer研究所的放射光设施Swiss LightSource X10SA测定X线衍射数据。测定中，结晶通常置于-178℃的氮气流下而维持冷冻状态。应用与光束线连接的Pilatus6M检测器(DECTRIS)，使结晶1次回转0.25°，并收集总计1440张X线衍射图像。用autoPROC(Acta Cryst.D67:293-302(2011))处理得到的衍射图像，获得了至分辨率
Figure BDA0003265595920002711
的衍射强度数据。结晶学的统计值示于表19。
应用得到的X线衍射强度数据，将已知的Fab的结晶结构作为检索模型，通过应用Phaser(J.Appl.Cryst.(2007)40,658-674)的分子置换法，确定初期结构。其后，重复通过Coot(Acta Cryst.D66:486-501(2010))与Refmac5(Acta Cryst.D67:355-467(2011))的模型构建和精密化，得到最终的精密化坐标。结晶学的统计值示于表19。
[表19]
X线数据收集和精密化统计值
Figure BDA0003265595920002721
a；Rmerge＝∑hk1∑j|Ij(hk1)-<I(hk1)>|/∑hk1∑j|Ij(hk1)|，此处，Ij(hk1)和<I(hk1)>分别是具有指数hk1的测定j的强度和反射的平均强度。
b；R因子＝∑hk1|Fcalc(hk1)|-|Fobs(hk1)|/∑hk1|Fobs(hk1)|，此处，Fobs和Fcalc分别是观测的和计算的结构因子的振幅。
c；Rfree为用随机除去的反射的5％算出。
(5-4-5)MTA0330 Fab和MTA的相互作用位点的鉴定
根据图21所示MTA0330Fab-MTA复合体的结晶结构知晓，MTA以在MTA0330Fab的重链和轻链之间形成的口袋中，硫代甲基部分朝向口袋里的形式结合，另外，如图18所示，以MTA的腺嘌呤环部分从该抗体的表面露出的形式结合。
如图19所示，MTA的腺嘌呤环部分通过该抗体的轻链F95b及重链F98的各侧链之间形成π-π相互作用识别。另外，核糖部分通过2’位的O及3’位的O与重链E95的侧链形成氢键识别。硫代甲基部分与轻链F96的侧链之间形成CH-π相互作用。进一步，除了这些相互作用，MTA被重链W34、W47、C50、Y58、G99、G100a及轻链Y28、T91、Y95c包围，形成范德华相互作用。通过这些相互作用，推定MTA由该抗体强力识别。此外，对Fab的氨基酸的残基编号赋予而言，基于Kabat编号赋予方案。
(5-5)抗MTA抗体MTA0303及MTA0330的NMR分析
(5-5-1)用于NMR的MTA0303及MTA0330全长抗体的制备
用于NMR的MTA0303及MTA0330全长抗体的制备及纯化通过本领域技术人员公知的方法进行。但是，为了实施氨基酸的稳定同位素标记，在培养基中添加了200mg/L[d-13CH3,15N,2H]异亮氨酸、300mg/L[d2-13CH3,2H,15N]亮氨酸、190mg/L[g1-13CH3,2H,15N]缬氨酸、360mg/L[b-13CH3，2H,15N]丙氨酸、60mg/Lβ-氯-L-丙氨酸。
(5-5-2)用于MTA0303Fab及MTA0330Fab的NMR分析的Fab片段的制备
将MTA0303的Fab片段(MTA0303Fab)及MTA0330的Fab片段(MTA0330Fab)通过Lys-C(Roche、目录编号11 047 825 001)进行限制消化，随后，通过应用加载至用于除去Fc片段的蛋白A柱(MabSlect SuRe、GE Healthcare)的传统方法制备。合并包含Fab片段的级分，用5mM d-柠檬酸盐,pH6.5,20mM NaCl,5％D2O置换，浓缩至0.15mM～0.3mM。
(5-5-3)MTA0303Fab及MTA0330Fab的NMR谱测定
应用实施例(5-5-2)中制备的样品，用AvanceIII 600(Bruker公司)测定了NMR谱。测定温度设为305K。为了获得1H-15N TROSY谱及1H-13C SOFAST-HMQC谱，分别应用trosyetf3gpiasi、sfhmqcf2gpph脉冲程序(Bruker公司标准脉冲程序)。谱的傅里叶变换使用TopSpin(Bruker公司)。
(5-5-4)MTA0303Fab与MTA的复合体(MTA0303Fab-MTA复合体)及MTA0330Fab与MTA 的复合体(MTA0330Fab-MTA复合体)的NMR谱测定
在实施例(5-5-2)中制备的物质中添加了MTA使得终浓度为0.4mM，用Avance III600测定了NMR谱。测定温度设为305K。为了获得1H-15N TROSY谱及1H-13C SOFAST-HMQC谱，分别应用trosyetf3gpiasi、sfhmqcf2gpph脉冲程序(Bruker公司标准脉冲程序)。谱的傅里叶变换使用TopSpin(Bruker公司)。
(5-5-5)MTA0303Fab与MTA0303Fab-MTA复合体的1H-15N TROSY谱比较
应用NMR谱表示软件Sparky(UCSF)，将MTA0303Fab的NMR谱与MTA0303Fab-MTA复合体的NMR谱重合后，进行了谱的比较。结果在图22中显示。MTA结合状态与非结合状态的化学位移为1个峰以上，变化的信号有17个。
(5-5-6)MTA0303Fab与MTA0303Fab-MTA复合体的1H-13C SOFAST-HMQC谱比较
应用NMR谱表示软件Sparky(UCSF)，将MTA0303Fab的NMR谱与MTA0303Fab-MTA复合体的NMR谱重合后，进行谱的比较。结果在图23中显示。MTA结合状态与非结合状态的化学位移为1个峰以上，变化的信号有20个。
(5-5-7)MTA0330Fab和MTA0330Fab-MTA复合体的1H-15N TROSY谱比较
应用NMR谱表示软件即Sparky(UCSF)，将MTA0330Fab的NMR谱与MTA0330Fab-MTA复合体的NMR谱重合后，进行谱的比较。结果在图24中显示。MTA结合状态与非结合状态的化学位移为1个峰以上，变化的信号有7个。
(5-5-8)MTA0330Fab与MTA0330Fab-MTA复合体的1H-13C SOFAST-HMQC谱比较
应用NMR谱表示软件即Sparky(UCSF)，将MTA0330Fab的NMR谱与MTA0330Fab-MTA复合体的NMR谱重合后，进行谱的比较。结果在图25中显示。MTA结合状态与非结合状态的化学位移为1个峰以上，变化的信号有7个。
[实施例6]以从兔B细胞克隆得到的抗MTA抗体为模板的文库的设计
以实施例5中获得的抗MTA抗体的MTA0303、MTA0330为模板，设计用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体的文库。
(6-1)从兔B细胞克隆得到的抗体MTA0303与MTA0330的人源化
MTA0303与MTA0330的人源化用本领域技术人员公知的方法实施(欧洲专利公开EP239400、国际公开WO1996/00257、WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735、WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388、Cancer Res.,(1993)53,851-856,BBRC.,(2013)436(3):543-50等)。人源化抗体的序列在以下的表20中显示。
[表20]
Figure BDA0003265595920002751
人源化MTA0303、人源化MTA0330用参考实施例1所示方法表达及纯化。
(6-2)应用了表面等离子共振的人源化MTA0303与人源化MTA0330的MTA结合活性 评价
为了验证人源化MTA0303、人源化MTA0330是否与MTA特异性结合，应用BiacoreT200(GE Healthcare)分析了针对MTA及MTA类似体(腺苷、SAH)的结合性。
对于预先固定了蛋白A的Sensor chip Protein A(GE healthcare)、或预先固定了链霉抗生物素的Sensor chip SA(GE Healthcare)中结合了生物素化的抗人IgG CH1分子即CaptureSelect Biotin Anti-IgG-Fc(Hu)(Thermo fisher scientific)的固定化表面，捕获目的抗体，使MTA(sigma-aldrich)、或腺苷(Wako)、或S-(5'-腺苷)-L-高半胱氨酸(SAH)(sigma-aldrich)相互作用。流动缓冲液应用20mM ACES-NaOH，150mM NaCl,0.05％Tween20,0.05％DMSO。MTA或腺苷或SAH以流速30μL/min相互作用120秒，其后，用流动缓冲液进行解离。相互作用在25℃测定，MTA或腺苷或SAH的稀释使用了与流动缓冲液相同的缓冲液。
基于从测定中得到的传感图算出的动力学参数即结合速度常数ka(1/Ms)、及解离速度常数kd(1/s)，算出解离常数KD(M)。或者，应用稳态分析法(Steady state analysis)算出了解离常数KD(M)。各参数的算出应用了Biacore T200评价软件(GE Healthcare)。
通过此测定，如表21确定了各抗体针对MTA及MTA类似体的结合活性，确认了人源化抗体的任一都对MTA具有高选择性。
[表21]
Figure BDA0003265595920002761
(6-3)人源化MTA0303改变体的全面评价
根据实施例(5-3)的MTA0303结晶结构分析的结果，推定了人源化MTA0303中不深度参与与MTA的结合的氨基酸位点、或者认为容易参与与抗原的MTA依赖性结合的抗体可变区的氨基酸位点。认为这些位点即使多样化，保持针对MTA的结合性的可能性也高，因此，考虑为用于文库的多样化位点的候选物。为了鉴定推定的位点中实际不深度参与与MTA的结合的位点，制备了针对各位点的氨基酸的Ala/Val置换改变体。
各MTA0303重链改变体的改变的位点(表中，记载为“Kabat”的以Kabat编号表示的位点)、及该位点中改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”的氨基酸)及改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)在表22中显示。
[表22]
Figure BDA0003265595920002771
各MTA0303轻链改变体的改变的位点(表中，记载为“Kabat”的以Kabat编号表示的位点)，以及该位点中改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”的氨基酸)及改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)在表23中显示。
[表23]
Figure BDA0003265595920002781
应用Biacore T200(GE Healthcare)评价了制备的改变体与MTA的结合活性。作为流动缓冲液，应用了20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4，于25℃测定。在传感器芯片CM4上通过胺偶联法将ProA/G固定，在其上将抗体固相化后，将MTA作为分析物使其相互作用，从而观察MTA与抗体间的结合量的变化。MTA的稀释使用了流动缓冲液，从对以数个梯度的浓度系列制备的针对MTA浓度的传感图，通过单循环动力学分析算出了各克隆的解离常数KD。参数的算出应用Biacore T200评价软件(GE Healthcare)。人源化MTA0303针对MTA的解离常数KD与各改变体针对MTA的解离常数KD的比(人源化MTA0303针对MTA的KD/各改变体针对MTA的KD)在表22(MTA0303重链改变体)，表23(MTA0303轻链改变体))中显示。
(6-4)以人源化MTA0303为模板的文库设计
文库设计时，基于得到的信息，在进行了结合评价的改变体中，将满足以下的条件的位点作为可以多样化的氨基酸位点选出：
根据改变体的全面评价的结果，不深度参与针对MTA的结合的氨基酸位点。
位于重链的氨基酸位点内、氨基酸残基存在于抗体的表面侧、其侧链露出抗体表面、其氨基酸残基位于假定的抗原结合面、或推定不深度参与与小分子的结合的氨基酸残基、亲本抗体(人源化MTA0303)针对MTA的KD值是该位点的氨基酸改变的MTA0303改变体针对MTA的KD值的50％以上的氨基酸位点、或亲本抗体(人源化MTA0303)针对MTA的KD值是该位点的氨基酸改变的MTA0303改变体针对MTA的KD值的70％以上的氨基酸位点，判定为满足条件1的可以多样化的氨基酸位点。
通过对在判定的可以多样化的氨基酸位点中出现至少任一个以上的可以文库化的氨基酸的文库进行设计，构建用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体的文库。作为可以文库化的氨基酸采用了全部种类的氨基酸，根据X线结晶结构分析的结果，除去了仅关于重链S52b、轻链N31，预期在MTA结合时抑制抗体的结构变化的氨基酸。
将人源化MTA0303的重链中可以多样化的氨基酸位点、以及该位点中的氨基酸储存库在表24中显示。将人源化MTA0303的轻链中可以多样化的氨基酸位点、以及该位点中的氨基酸储存库在表25中显示。表中，分别地，记载为“Kabat”的以Kabat编号表示的位点表示了可以多样化的氨基酸位点，记载为“天然序列”的氨基酸表示该位点中人源化MTA0303的氨基酸，记载为“可以文库化的氨基酸”的氨基酸表示该位点中可以多样化的氨基酸。设计了文库，其中在重链的各可以多样化的氨基酸位点中，表中的氨基酸储存库中包含的氨基酸之中出现至少任一个。构建了文库，其中在轻链的各可以多样化的氨基酸位点中，表中的氨基酸储存库中包含的氨基酸之中出现至少任一个。
[表24]
Figure BDA0003265595920002801
[表25]
Figure BDA0003265595920002802
(6-5)人源化MTA0330改变体的全面评价
根据实施例(5-4)的MTA0330结晶结构分析的结果，推定了人源化MTA0330中不深度参与与MTA的结合的氨基酸位点、或者认为容易参与与抗原的MTA依赖性结合的抗体可变区的氨基酸位点。认为这些位点即使多样化，保持针对MTA的结合性的可能性也高，因此，考虑为用于文库的多样化位点的候选物。为了鉴定推定的位点中实际不深度参与与MTA的结合的位点，制备了针对各位点的氨基酸的Ala置换改变体。
将各MTA0330重链改变体的改变的位点(表中，记载为“Kabat”以的Kabat编号表示的位点)、及该位点的改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”的氨基酸)及改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)在表26中显示。
[表26]
Figure BDA0003265595920002811
将各MTA0330轻链改变体的改变的位点(表中，以记载为“Kabat”的Kabat编号表示的位点)、及该位点中改变前的氨基酸(表中记载为“天然序列”的氨基酸)及改变后的氨基酸(表中记载为“改变氨基酸”的氨基酸)在表27中显示。
[表27]
Figure BDA0003265595920002812
应用Biacore T200(GE Healthcare)评价了制备的改变体与MTA的结合活性。作为流动缓冲液，应用20mM ACES、150mM NaCl、0.05％(w/v)Tween20、pH7.4，于25℃测定。在传感器芯片CM4上通过胺偶联法将ProA/G固定化，在其上将抗体固相化后，将MTA作为分析物使其相互作用，从而观察MTA与抗体间的结合量的变化。MTA的稀释使用了流动缓冲液，从对以数个梯度的浓度系列制备的MTA浓度的传感图，通过单循环动力学分析算出了各克隆的解离常数KD。参数的算出应用Biacore T200评价软件(GE Healthcare)。人源化MTA0330针对MTA的解离常数KD与各改变体针对MTA的解离常数KD的比(人源化MTA0330针对MTA的KD/各改变体针对MTA的KD)在表26(MTA0330重链改变体)、表27(MTA0330轻链改变体)中显示。
(6-6)以人源化MTA0303和人源化MTA0330为模板的文库设计
对文库进行设计时，基于得到的信息在结合评价的改变体中，将满足以下的条件的位点作为可以多样化的氨基酸位点选出：
根据改变体的全面评价的结果，不深度参与针对MTA的结合的氨基酸位点。
将位于重链的、亲本抗体(人源化MTA0330)针对MTA的KD值是该位点的氨基酸改变的MTA0330改变体针对MTA的KD值的40％以上的氨基酸位点，或位于轻链的、亲本抗体(人源化MTA0330)针对MTA的KD值是该位点的氨基酸改变的MTA0330改变体针对MTA的KD值的70％以上的氨基酸位点，判定为满足条件1的可以多样化的氨基酸位点。
通过设计了在判定的可以多样化的氨基酸位点中出现至少任一个以上的可以文库化的氨基酸的文库，构建了用于获得依赖于MTA与抗原结合的抗体的文库。作为可以文库化的氨基酸，采用了全部种类的氨基酸。
将人源化MTA0330的重链中可以多样化的氨基酸位点、以及该位点中的氨基酸储存库在表28中显示。人源化MTA0330的轻链中可以多样化的氨基酸位点、以及该位点中的氨基酸储存库在表29中显示。表中，分别地，记载为“Kabat”的以Kabat编号表示的位点表示可以多样化的氨基酸位点，记载为“天然序列”的氨基酸表示该位点中人源化MTA0330的氨基酸，记载为“可以文库化的氨基酸”的氨基酸表示该位点中可以多样化的氨基酸。设计了文库，其中在重链的各可以多样化的氨基酸位点中，表中的氨基酸储存库中包含的氨基酸之中出现至少任一个。构建了文库，其中在轻链的各可以多样化的氨基酸位点中，表中的氨基酸储存库中包含的氨基酸之中出现至少任一个。
[表28]
Figure BDA0003265595920002831
[表29]
Figure BDA0003265595920002832
(6-7)从以人源化MTA0330为模板的文库获得MTA依赖性抗体
(6-7-1)人源化MTA0330重链或者轻链可变区噬菌体展示文库的构建
基因合成了以实施例(6-6)中构建的人源化MTA0330为模板设计的重链可变区文库，将合成的人源化MTA0330的重链可变区导入至包含人源化MTA0330的轻链可变区、及来自人IgG的重链CH1序列及来自人IgG的轻链恒定区序列的噬粒载体。用同样的方法基因合成了以人源化MTA0330为模板设计的轻链可变区文库，将合成的人源化MTA0330的轻链可变区导入包含人源化MTA0330的重链可变区、及来自人IgG的重链CH1序列及来自人IgG的轻链恒定区序列的噬粒载体。将制成的上述噬粒载体通过电穿孔导入大肠杆菌，从而构建了可以获得能够依赖于MTA与抗原结合的重链、轻链可变区的噬菌体展示文库。
(6-7-2)通过应用重链及轻链可变区噬菌体展示文库的淘选获得与MTA结合的抗 体
为了从实施例(6-7-1)中构建的重链可变区、轻链可变区的各自噬菌体展示文库获得具有与MTA结合的抗体可变区的噬菌体的集合，用生物素化标记MTA实施了淘选。具体地，对保有构建的噬粒载体的大肠杆菌，感染了M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体)(PROGENBiotechnik)，在25℃培养一晩，从上清回收噬菌体。进行了噬菌体产生的大肠杆菌的培养液用TBS进行溶剂置换，制备了抗体多价呈递噬菌体文库液。
应用磁珠中固定化的抗原实施了淘选。该噬菌体文库液中添加12％的BSA。作为磁珠，应用了NeutrAvidin珠(TAMAGAWA SEIKI)或者Dynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)。将用BSA封闭的磁珠与终浓度5.7μM的Biotin-6’-MTA与0.91mM的腺苷加入制备的噬菌体文库液0.3mL，在室温反应60分钟。珠用400μL的TBST洗涤2次，用TBS洗涤1次。其后，将加入最终浓度1mg/mL的胰蛋白酶的TBS 0.5mL的珠在室温悬浮15分钟。应用磁力架从分离的珠回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体添加至为对数增殖期(OD600为0.4-0.7)的大肠杆菌株ER2738。通过于37℃进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，用噬菌体感染大肠杆菌。此一系列操作进一步追加重复1次。
(6-7-3)利用对MTA的淘选构建用于获得MTA依赖性抗体的文库
对于分别从重链、轻链可变区噬菌体展示文库获得的针对MTA结合的重链及轻链的集合，预期通过组合其集合中的重链和轻链制备的Fab呈递噬菌体文库也包含多数维持针对MTA结合的克隆，认为能够构建可以更高效获得MTA依赖性抗体的文库。
用本领域技术人员公知的方法，从感染了针对MTA淘选获得的重链、轻链各自的噬菌体文库的大肠杆菌提取了基因。在淘选后的重链可变区噬菌体文库中，应用能够扩增重链可变区的引物(SEQ ID NO:88、89)扩增了重链可变区基因。
通过限制酶处理取得淘选后轻链可变区噬菌体文库中人源化MTA0330的重链可变区序列，制备包含轻链可变区文库基因、来自人IgG的轻链恒定区序列及来自人IgG的CH1序列的噬粒片段。通过在包含制备的轻链可变区文库基因的噬粒载体片段中插入重链可变区文库基因，构建导入了重链/轻链可变区文库基因的噬粒载体。将此载体通过电穿孔导入大肠杆菌，从而呈递了包含人抗体可变区与恒定区的Fab结构域，构建了能够获得可以依赖于MTA与抗原结合的抗体的文库。
(6-7-4)从M30文库获得MTA依赖性抗体的淘选
从构建的用于获得MTA依赖性抗体的噬菌体展示文库(称为M30文库)，筛选了在MTA存在下针对人IL-6受体(hIL-6R)、人IL-6(hIL-6)、人IgA(hIgA)各自显示结合活性的抗体。
具体地，对保有构建的噬粒载体的大肠杆菌感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体)(PROGEN Biotechnik)，于25℃培养一晩，从上清回收噬菌体。将进行噬菌体产生的大肠杆菌的培养液用TBS进行溶剂置换，制备了抗体多价呈递噬菌体文库液。
将磁珠中固定化的各自抗原用作其它条件而实施了淘选。在该噬菌体文库液中添加了10％的BSA。在制备的噬菌体文库液0.8mL中加入0.1nmol的生物素标记抗原与终浓度100μM的MTA，于室温反应60分钟。作为磁珠，应用NeutrAvidin珠(TAMAGAWA SEIKI)或者Dynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)。将用BSA封闭的磁珠加入噬菌体与抗原的反应液，于室温反应15分钟。珠用0.8mL的TBST洗涤2次或者3次，用TBS洗涤1次或者2次。其后，将加入0.25mL的TBS的珠在室温悬浮，用磁力架从分离的珠回收噬菌体溶液。此操作再度重复后，混合分2次洗脱的噬菌体溶液。在回收的噬菌体溶液中加入最终浓度1mg/mL的胰蛋白酶。将回收的噬菌体添加至为对数增殖期(OD600为0.4-0.7)的大肠杆菌株ER2738。通过于37℃进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，用噬菌体感染大肠杆菌。将大肠杆菌接种于225mm x 225mm的平板。此一系列操作追加重复2次。
(6-7-5)通过流式细胞术评价MTA存在下的抗原结合活性
将淘选得到的重链及轻链的可变区序列插入具有重链抗体恒定区序列(SEQ IDNO:86)或者轻链κ恒定区序列(SEQ ID NO:87)的动物表达用质粒。在接种的Expi293株(Thermo Fisher Scientific)中，通过电穿孔法导入制备的质粒。回收在CO2培养箱(37℃、8％CO2、1000rpm)中培养4天的培养上清液。
将培养上清液按以下的顺序进行利用流式细胞术的抗原结合评价。在384孔微板(greiner)中添加了将各生物素标记抗原固相化的磁珠、培养上清液、0.1％BSA/5mMMg2CL2/PBS或者包含终浓度100μM的MTA的0.1％BSA/5mM Mg2CL2/PBS，静置30分钟以上。该平板的珠用0.1％BSA/5mM Mg2CL2/PBS或包含100μM的MTA的0.1％BSA/5mM Mg2CL2/PBS洗涤后，该孔中加入以PBS或者包含终浓度100μM的MTA的0.1％BSA/5mM Mg2CL2/PBS稀释的DyLight488标记抗人Fc抗体(invitrogen)，静置30分钟以上。该孔用0.1％BSA/5mM Mg2CL2/PBS或者包含终浓度100μM的MTA的0.1％BSA/5mM Mg2CL2/PBS洗涤后，用iQue screener(Intellicyt)测定了样品的荧光强度。分析的结果，对于分别应用了生物素标记hIL-6R、hIL-6、hIgA进行淘选的各条件，确认了多个依赖于MTA与抗原结合的抗体。结果在表31中显示。
[表31]
Figure BDA0003265595920002871
据此结果，获得了对序列及结构均不同的多个抗原在MTA存在下能够与抗原结合、在不存在MTA的条件下不能与抗原结合的多个克隆。另外，获得的克隆全部在腺苷存在下不对抗原显示结合，因此显示了能够获得MTA特异性且MTA浓度依赖性地与抗原结合的抗体。
[实施例7]用于获得依赖于腺苷与抗原结合的抗体的文库的构建
(7-1)应用重链及轻链可变区噬菌体展示文库浓缩与腺苷结合的抗体组
为了浓缩与腺苷结合的抗体组，应用了Biotin-2’-腺苷与Biotin-5’-腺苷的混合物(Biotin-腺苷混合物)，分别从实施例(4-1-1)中构建的重链可变区噬菌体展示文库、轻链可变区噬菌体展示文库实施了淘选。
具体地，对于保有构建的重链可变区噬菌体展示文库或轻链可变区噬菌体展示文库的噬粒载体的大肠杆菌，使其感染M13KO7ΔpIII(称为超级噬菌体)(PROGENBiotechnik)，于25℃培养一晩，从上清回收噬菌体。将通过在进行噬菌体产生的大肠杆菌的培养液中添加2.5M NaCl/10％PEG沉淀的噬菌体的集合用TBS稀释，从而制备了抗体多价呈递噬菌体文库液。
实施了应用磁珠中固定化的Biotin-腺苷混合物的淘选。在抗体多价呈递噬菌体文库液中添加BSA使得终浓度为4％。作为磁珠，应用了NeutrAvidin珠(TAMAGAWA SEIKI)或者Dynabeads MyOne StreptAvidin T1(Thermo Fisher Scientific)。通过将用BSA封闭的磁珠与终浓度10μM的Biotin-腺苷混合物在室温反应30分钟，使Biotin-腺苷混合物固相化于磁珠。在固相化有用TBST洗涤3次的Biotin-腺苷混合物的磁珠中，加入了制备的抗体多价呈递噬菌体文库液0.8mL，于室温反应60分钟。珠用400μL的TBST洗涤2次、用TBS洗涤1次。其后，将加入包含终浓度1mg/mL的胰蛋白酶的TBS 0.5mL的珠于室温悬浮15分钟，洗脱了噬菌体。应用磁力架分离珠，回收噬菌体溶液。将回收的噬菌体添加至为对数增殖期(OD600为0.4-0.7)的20mL的大肠杆菌株ER2738。通过于37℃进行上述大肠杆菌的搅拌培养1小时，用噬菌体感染大肠杆菌。将大肠杆菌接种于225mm x 225mm的平板。此一系列操作追加重复1次，分别从重链可变区噬菌体展示文库、轻链可变区噬菌体展示文库浓缩了与腺苷结合的抗体组。
(7-2)通过噬菌体ELISA评价淘选后获得克隆群对生物素化腺苷的结合活性
按照常规方法(Methods mol.Biol.(2002)178,133-145)，从感染了呈递实施例(7-1)中浓缩的与腺苷结合的抗体组中的抗体的噬菌体的大肠杆菌的单个菌落，回收了含有噬菌体的培养上清液。应用超级噬菌体作为辅助噬菌体，回收了抗体多价呈递噬菌体，进行ELISA。在链霉抗生物素包被的384孔微板(greiner)中添加10μL包含Biotin-腺苷混合物的TBS，静置1小时以上。该平板的各孔用TBST洗涤后，各孔用80μL的0.2％脱脂奶-TBS封闭1小时以上。各孔用TBST洗涤后，在各孔中加入制备的噬菌体，静置一小时，从而使呈递于噬菌体的抗体与Biotin-腺苷混合物结合。各孔用TBST洗涤后，在各孔中加入用TBS稀释的HRP结合抗M13抗体(GE Healthcare)，静置一小时。各孔用TBST洗涤后，加入TMB single溶液(ZYMED)，一定时间后通过添加硫酸终止溶液的显色反应后，测定450nm波长的吸光度。分析的结果，确认了多个呈递与Biotin-2’-腺苷结合的抗体的噬菌体。将噬菌体ELISA的结果在表30中显示。根据ELISA的结果显示，通过实施例(7-1)的淘选浓缩的抗体组中，包含多个腺苷结合抗体。
[表30]
Figure BDA0003265595920002891
(7-3)利用对腺苷的淘选构建用于获得依赖于腺苷与抗体结合的抗体的文库
对于实施例(7-2)中浓缩的腺苷结合抗体组，预期通过组合该抗体组中包含的改变重链与改变轻链制备的Fab呈递噬菌体文库中也包含多个维持对腺苷结合的抗体，认为能够构建用于获得依赖于腺苷与抗原结合的抗体的文库。
用本领域技术人员公知的方法，从感染了呈递实施例(7-2)中浓缩的腺苷结合抗体组的噬菌体的大肠杆菌提取了抗体基因。对于从重链可变区噬菌体文库浓缩的抗体组，应用能够扩增重链可变区的引物(SEQ ID NO:34、35)扩增了重链可变区基因。对于轻链可变区噬菌体文库及从该文库浓缩的抗体组，通过限制酶处理而除去人源化SMB0002的重链可变区序列，制备了包含轻链可变区文库基因与来自人IgG的轻链恒定区序列与来自人IgG的CH1序列的噬粒片段。通过在前述噬粒载体片段中插入从重链可变区文库扩增的重链可变区基因，构建导入了重链/轻链可变区文库基因的噬粒载体。通过电穿孔将此载体导入大肠杆菌，由此呈递包含人抗体可变区与恒定区的Fab结构域，构建了用于获得依赖于腺苷与抗原结合的抗体的文库(腺苷浓缩S02文库)。
[参考实施例1]抗体的表达与纯化
应用以下的方法表达了抗体蛋白。在来自接种的人胎儿肾细胞FreeStyle293株或Expi293株(Thermo Fisher Scientific)中，将制备的质粒通过转染法导入。应用rProteinA Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)或MonoSpin ProA(GL science)，用本领域技术人员公知的方法，从CO2培养箱(37℃、8％CO2、1000rpm)中培养4天的培养上清液纯化了抗体。应用分光光度计测定了纯化的抗体溶液的280nm的吸光度。用通过PACE法从得到的测定值算出的吸光系数，算出了纯化抗体的浓度(Protein Science(1995)4，2411-2423)。
工业实用性
本公开的针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域及包含该抗原结合结构域的抗原结合分子、以及包含其的药物组合物不在正常组织、血液中进行全身作用，通过在癌症中与靶抗原结合并作用，在避免副作用的同时发挥药效，可以治疗癌症。
进一步，若应用包含本公开的、序列彼此不同的多个针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗原结合分子的文库，可以短时间，高效地获得针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域，及包含该抗原结合结构域的抗原结合分子。
Figure IDA0003265595970000011
Figure IDA0003265595970000021
Figure IDA0003265595970000031
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Claims (15)

1.抗原结合分子，其包含针对抗原的结合活性依赖于5’-甲硫腺苷(MTA)而变化的抗原结合结构域。
2.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合结构域在MTA存在下的针对所述抗原的结合活性与在不存在MTA的条件下的针对所述抗原的结合活性不同。
3.权利要求1或2所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合结构域包含抗体可变区或/和单结构域抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原结合结构域在MTA存在下的针对抗原的结合活性比所述抗原结合结构域在不存在MTA的条件下的针对抗原的结合活性强。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗原结合分子，其中，所述抗原是膜型分子并且是在癌组织表达的抗原。
6.药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗原结合分子。
7.文库，其主要包含：序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子、或/和编码序列彼此不同的多个包含抗原结合结构域的抗原结合分子的核酸，其中所述抗原结合结构域是与MTA相互作用的抗原结合结构域。
8.根据权利要求7所述的文库，其中，所述抗原结合结构域是抗体可变区。
9.根据权利要求8所述的文库，其包含：序列彼此不同的多个抗体可变区改变体，所述改变体具有与位于抗体可变区未改变体中的1个或多个氨基酸位点的氨基酸不同的氨基酸，所述抗体可变区未改变体具有针对MTA的结合活性；或/和分别编码序列彼此不同的多个抗体可变区改变体的核酸，所述改变体具有与位于抗体可变区未改变体中的1个或多个氨基酸位点的氨基酸不同的氨基酸，所述抗体可变区未改变体具有针对MTA的结合活性。
10.文库的制备方法，其包含以下步骤(a)及(b)：
(a)在具有针对MTA的结合活性的抗原结合结构域中，鉴定满足以下(i)至(vi)中至少一个以上的氨基酸位点的步骤：
(i)在所述抗原结合结构域的表面露出的氨基酸位点；
(ii)位于下列区域的氨基酸位点：将所述抗原结合结构域与MTA结合时的结构和不与MTA结合时的结构进行比较时，所述区域的结构变化率较大；
(iii)不参与与MTA的结合的氨基酸位点；
(iv)不使与MTA的结合显著减弱的氨基酸位点；
(v)在所述抗原结合结构域所属的动物物种中具有氨基酸出现频率的多样性的氨基酸位点；或
(vi)在经典结构的形成中不重要的氨基酸位点；
(b)设计文库的步骤，所述文库包含在所述抗原结合结构域中编码未改变体的核酸，及分别编码所述抗原结合结构域的多个改变体的核酸，
所述多个改变体的序列彼此不同，并在步骤(a)中鉴定的1个或多个氨基酸位点具有氨基酸改变。
11.筛选抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域。
12.根据权利要求11所述的方法，其包含选择在第1浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性与在第2浓度的MTA存在下针对抗原的结合活性不同的抗原结合结构域的步骤。
13.制备抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子包含针对抗原的结合活性依赖于MTA而变化的抗原结合结构域。
14.抗原结合分子，其与MTA特异性结合。
15.疾病的诊断试剂盒，其包含权利要求14所述的抗原结合分子。
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