BR122022019229B1 - Métodos para produção e para triagem de um anticorpo que compreende um domínio de ligação ao antígeno que compreende regiões variáveis de cadeias pesada e leve do anticorpo, cuja atividade de ligação ao antígeno na presença de um composto específico para o tecido alvo é maior do que a atividade de ligação ao antígeno na ausência do referido composto - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se à produção de moléculas de ligação a antígeno que contêm um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo. Uso de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção permite que várias doenças que se originam de um tecido alvo sejam tratadas de uma maneira específica para o tecido alvo.

Description

Campo da Técnica

[001] A presente invenção provê moléculas de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo; métodos de produção e métodos de avaliação para as moléculas de ligação a antígeno; e composições farmacêuticas contendo as moléculas de ligação a antígeno.

Técnica Antecedente

[002] Os anticorpos estão chamando a atenção como agentes far macêuticos uma vez que eles são altamente estáveis em plasma e têm poucos efeitos colaterais. Em particular, vários agentes farmacêuticos de anticorpo tipo IgG estão disponíveis no mercado, e muitos agentes farmacêuticos de anticorpo estão atualmente sob desenvolvimento (Documentos de Não Patente 1 e 2).

[003] Como agentes terapêuticos para câncer usando agentes far macêuticos de anticorpo, Rituxam contra um antígeno CD20, cetuxi- mabe contra um antígeno EGFR, Herceptina contra um antígeno HER2 e similar foram aprovados até agora (Documento de Não Patente 3). Essas moléculas de anticorpo se ligam a antígenos expressos em células de câncer e exibem atividade citotóxica contra células de câncer por ADCC e similar. Tal atividade citotóxica por ADCC e etc são conhecidos depender do número de antígenos expressos em células direcionadas pelos anticorpos terapêuticos (Documento de Não Patente 4); desta maneira, nível de expressão alto do antígeno alvo é preferível do ponto de vista dos efeitos dos anticorpos terapêuticos. No entanto, mesmo se o nível de expressão de antígeno for alto, quando antígenos são expressos em tecidos normais, atividade citotóxica mediada por ADC, etc, será exercida contra células normais, e então efeitos colaterais se tornarão um grande problema. Desta maneira, antígenos direcionados por anticorpos terapêuticos usados como agentes terapêuticos para câncer são preferivelmente antígenos especificamente expressos em células de câncer. Por exemplo, moléculas de anticorpo contra o antígeno EpCAM que é conhecido como um antígeno de câncer têm sido consideradas promissoras como agentes terapêuticos para câncer. No entanto, o an- tígeno EpCAM é conhecido ser expresso no pâncreas também e, na prática, administração de anticorpos anti-EpCAM em testes clínicos foi relatado causar pancreatite como um efeito colateral devido à atividade citotóxica com relação ao pâncreas (Documento de Não Patente 5).

[004] Seguindo o sucesso de agentes farmacêuticos de anticorpo que exercem atividade citotóxica pela atividade de ADCC, uma segunda geração de moléculas de anticorpo aperfeiçoadas que exercem atividade citotóxica forte através do aumento da atividade de ADCC através da remoção de fucose de cadeias de açúcar tipo N na região Fc de IgG humana nativa (Documento de Não Patente 6), aumento da atividade de ADD através do aumento da ligação com relação a FcYRIIIa através de substituição de aminoácidos na região Fc de IgG1 humana nativa (Documento de Não Patente 7) e similar foi relatada. Como agentes farmacêuticos de anticorpo que exercem atividade citotóxica contra células de câncer através de um mecanismo que não a atividade de ADCC mencionada acima mediada por células NK, moléculas que exercem uma atividade citotóxica mais forte, tal como um conjugado de anticorpo-fármaco (ADC) (Antibody-Drug Conjugate) onde um anticorpo é conjugado com um fármaco tendo atividade citotóxica potente (Docu-mento de Não Patente 8), e um anticorpo de peso molecular baixo que exerce atividade tóxica contra células de câncer através do recrutamento de células T para células de câncer, foram também relatados.

[005] Tais moléculas de anticorpo exercendo uma atividade citotó- xica mais forte podem exercer atividade citotóxica contra células de câncer que não têm muita expressão de antígeno, mas por outro lado, elas exercerão atividade citotóxica similar contra tecidos normais com expressão de antígeno baixa. Na realidade, em comparação com cetuxi- mabe que é uma IgG1 humana natural contra um antígeno EGFR, EGFR-BiTE, que é um anticorpo biespecífico contra CD3 e EGFR, pode exercer uma atividade citotóxica potente contra células de câncer através do recrutamento de células T para células de câncer e exerce efeitos antitumor. Por outro lado, uma vez que EGFR é expresso também em tecidos normais, quando EGFR-BiTE é administrado a macacos ci- nomólogos, efeitos colaterais sérios apareceram (Documento de Não Patente 10). Ainda, bivatuzumabe mertansina, uma ADC formada através de ligação de mertansina a um anticorpo contra CD44v6 que é altamente expresso em células de câncer, foi mostrado causar toxidez da pele e toxidez hepática severas em prática clínica porque CD44v6 é expresso também em tecidos normais (Documento de Não Patente 11).

[006] Quando anticorpos que podem exercer uma atividade citotó- xica potente contra células de câncer tendo expressão de antígeno baixa são usados como tal, o antígeno alvo precisa ser expresso de uma maneira altamente específica de câncer. No entanto, uma vez que HER2 e EGFR, que são antígenos alvo de Herceptina e cetuximabe, respectivamente, são também expressos em tecidos normais, o número de antígenos de câncer expressos de uma maneira altamente específica de câncer é pensado ser limitado. Desta maneira, embora seja possível reforçar a atividade citotóxica contra câncer, os efeitos colaterais que ocorrem devido às ações citotóxicas contra tecidos normais podem se tornar problemáticos.

[007] Ainda, recentemente, ipilimumabe que aumenta a imunidade do tumor através da inibição de CTLA4 que contribui para a imunossu- pressão em câncer foi mostrado prolongar a sobrevivência geral de me-lanoma metastático (Documento de Não Patente 12). No entanto, uma vez que ipulimumabe inibe CTLA4 sistemicamente, enquanto imunidade de tumor é aumentada, a emergência de efeitos colaterais severos tal como doença autoimune devido à ativação sistêmica do sistema imune está se tornando um problema (Documento de Não Patente 13).

[008] Por outro lado, como agentes farmacêuticos de anticorpo contra doenças além do câncer, agentes farmacêuticos de anticorpo que exercem efeitos terapêuticos através de inibição de citocinas infla-matórias em doenças inflamatórias/autoimunes são conhecidos (Documento de Não Patente 14). Por exemplo, Remicade e Humira que se direcionam a TNF e Actemra que se direciona à IL-6R exibem efeitos terapêuticos altos contra artrite reumatoide, mas, por outro lado, neutralização sistêmica dessas citocinas levou à observação de infecção como efeitos colaterais (Documento de Não Patente 15).

[009] Várias técnicas foram desenvolvidas como técnicas que po dem ser aplicadas a agentes farmacêuticos de anticorpo de segunda geração. Embora técnicas para aperfeiçoamento das funções efetoras, habilidade de ligação a antígeno, farmacocinética e estabilidade ou técnicas para redução de riscos imunogênicos tenham sido relatadas (Documento de Não Patente 16), há dificilmente quaisquer relatos sobre técnicas que permitam ação específica de tecido alvo de agentes farmacêuticos de anticorpo para superar tais efeitos colaterais. Por exemplo, com relação a lesões tais como tecidos cancerosos e tecidos inflamatórios, anticorpos dependentes do pH que fazem uso da condição de pH ácido nesses tecidos alvo foram relatados (Documentos de Patente 1 e 2). No entanto, a diminuição de pH (isto é, aumento em concentração de íon de hidrogênio) em tecidos cancerosos e tecidos inflamatórios comparado com tecidos normais é pouca, e uma vez que é difícil produzir anticorpos que agem através da detecção de um ligeiro aumento na concentração de íons de hidrogênio que têm um peso molecular extre-mamente pequeno, e também porque condições de pH ácido podem ser encontradas em tecidos normais tal como região de reabsorção óssea osteoclástica ou em tecidos que não a lesão de interesse, uso de con-dições de pH como um fator ambiental específico de lesão foi considerado enfrentar muitos desafios. Por outro lado, métodos para produção de anticorpos que exercem atividade de ligação a antígeno apenas após eles serem clivados por uma protease expressa em sítios de lesão tais como tecidos cancerosos e tecidos inflamatórios foram relatados (Documento de Patente 3). No entanto, uma vez que clivagem de anticorpos por proteases é irreversível, quando anticorpos que foram clivados no sítio de lesão entram na corrente sanguínea e retornam para tecidos normais, eles podem se ligar a antígenos em tecidos normais também, e isso é considerado ser um problema. Ainda, especificidade para câncer de tais proteases é também pensada ter problemas que precisam ser endereçados. Desta maneira, técnicas que permitem ação de reversão em sítios de inflamação ou câncer (sítios de lesão) sem ação sistêmica em tecidos normais e sangue para exercício de eficácia de fármaco enquanto evitando efeitos colaterais não são conhecidas.

Documentos da Técnica Anterior Documentos de Patente

[0010] [Documento de patente 1] WO 2003/105757

[0011] [Documento de patente 2] WO 2012/033953

[0012] [Documento de patente 3] WO 2010/081173

[0013] [Documentos de Não patente]

[0014] [Documento de Não patente 1] Monoclonal antibody suc cesses in the clinic. Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1073 - 1078

[0015] [Documento de Não patente 2] The therapeutic antibodies market to 2008. Pavlou AK, Belsey MJ., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389-396

[0016] [Documento de Não patente 3] Monoclonal antibodies: ver satile platforms for cancer immunotherapy. Weiner LM, Surana R, Wang S., Nat. Rev. Immunol. (2010) 10 (5), 317-327

[0017] [Documento de Não patente 4] Differential responses of hu man tumor cell lines to anti-p185HER2 monoclonal antibodies. Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, Shepard HM, Cancer Immunol. Immunotherapy (1993) 37, 255-263

[0018] [Documento de Não patente 5] ING-1, a monoclonal antibody targeting Ep-CAM in patients with advanced adenocarcinomas. de Bono JS, Tolcher AW, Forero A, Vanhove GF, Takimoto C, Bauer RJ, Hammond LA, Patnaik A, White ML, Shen S, Khazaeli MB, Rowinsky EK, LoBuglio AF, Clin. Cancer Res. (2004) 10 (22), 7555-7565

[0019] [Documento de Não patente 6] Non-fucosylated therapeutic antibodies as next-generation therapeutic antibodies. Satoh M, Iida S, Shitara K., Expert Opin. Biol. Ther. (2006) 6 (11), 1161-1173

[0020] [Documento de Não patente 7] Optimizing engagement of the immune system by anti-tumor antibodies: an engineer's perspective. Desjarlais JR, Lazar GA, Zhukovsky EA, Chu SY., Drug Discov. Today (2007) 12 (21-22), 898-910

[0021] [Documento de Não patente 8] Antibody-drug conjugates: targeted drug delivery for cancer. Alley SC, Okeley NM, Senter PD., Curr. Opin. Chem. Biol. (2010) 14 (4), 529-537

[0022] [Documento de Não patente 9] BiTE: Teaching antibodies to engage T-cells for cancer therapy. Baeuerle PA, Kufer P, Bargou R., Curr. Opin. Mol. Ther. (2009) 11 (1), 22-30

[0023] [Documento de Não patente 10] T cell-engaging BiTE anti bodies specific for EGFR potently eliminate KRAS- and BRAF-mutated colorectal cancer cells. Lutterbuese R, Raum T, Kischel R, Hoffmann P, Mangold S, Rattel B, Friedrich M, Thomas O, Lorenczewski G, Rau D, Schaller E, Herrmann I, Wolf A, Urbig T, Baeuerle PA, Kufer P., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2010) 107 (28), 12605-12610

[0024] [Documento de Não patente 11] Phase I trial with the CD44v6-targeting immunoconjugate bivatuzumab mertansine in head and neck squamous cell carcinoma. Riechelmann H, Sauter A, Golze W, Hanft G, Schroen C, Hoermann K, Erhardt T, Gronau S. oual Oncol. (2008) 44 (9), 823-829

[0025] [Documento de Não patente 12] Ipilimumab in the treatment of melanoma. Trinh VA, Hwu WJ., Expert Opin. Biol. Ther., (2012) Apr 14 (doi:10.1517/14712598.2012.675325)

[0026] [Documento de Não patente 13] IPILIMUMAB - A NOVEL IM MUNOMODULATING THERAPY CAUSING AUTOIMMUNE HY- POPHYSITIS: A CASE REPORT AND REVIEW. Juszczak A, Gupta A, Karavitaki N, Middleton MR, Grossman A., Eur. J. Endocrinol. (2012) Apr 10 (doi: 10.1530/EJE-12-0167)

[0027] [Documento de Não patente 14] The Japanese experience with biologic therapies for rheumatoid arthritis. Takeuchi T, Kameda H., Nat. Rev. Rheumatol. (2010) 6 (11), 644-652

[0028] [Documento de Não patente 15] Current evidence for the management of rheumatoid arthritis with biological disease-modifying antirheumatic drugs: a systematic literature review informing the EULAR recommendations for the management of RA. Nam JL, Winthrop KL, van Vollenhoven RF, Pavelka K, Valesini G, Hensor EM, Worthy G, Landewe R, Smolen JS, Emery P, Buch MH., Ann. Rheum. Dis. (2010) 69 (6), 976986

[0029] [Documento de Não patente 16] Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Mol. Cells. (2005) 20 (1), 17-29

Sumário da Invenção Problemas a Serem Resolvidos pela Invenção

[0030] A presente invenção foi obtida em vista das circunstâncias acima. Um objetivo da presente invenção é prover composições farmacêuticas que sejam úteis para tratamento de doenças que se originam de tecidos alvo e seus ingredientes ativos. Outro objetivo é prover métodos de avaliação para as composições farmacêuticas e ingredientes ativos, bem como seus métodos de produção.

Meios para Resolver os Problemas

[0031] Os presentes inventores conduziram estudos dedicados para atingir os objetivos descritos acima. Como resultado, eles geraram moléculas de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração do composto específico de tecido alvo. Ainda, os presentes inventores constataram que as moléculas de ligação a antígeno ou composições farmacêuticas compreendendo as moléculas de ligação a antígeno são úteis para tratamento de doenças que se originam de um tecido alvo, e que elas são também úteis para tratamento de doenças se originando de tecidos alvo que inclui administração das moléculas de ligação a antígeno. Eles também constataram que as moléculas de liga-ção a antígeno são úteis na produção de agentes farmacêuticos para tratamento de doenças que se originam de tecidos alvo. Ainda, os presentes inventores produziram métodos de avaliação e métodos de produção para as moléculas de ligação a antígeno, e desta maneira finalizaram a presente invenção.

[0032] Mais especificamente, a presente invenção provê o que se gue:

[0033] [1] Uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo.

[0034] [2] A molécula de ligação a antígeno de [1], onde o tecido alvo é um tecido canceroso.

[0035] [3] Molécula de ligação a antígeno de [2], onde o composto específico para um tecido canceroso é um metabolito específico para uma célula de câncer, um metabolito específico para uma célula imune que infiltrou em um tecido canceroso ou um metabolito específico para uma célula estromal em um tecido canceroso.

[0036] [4] A molécula de ligação a antígeno [1], onde o tecido alvo é um tecido inflamado.

[0037] [5] A molécula de ligação a antígeno de [4], onde o composto específico para um tecido inflamado é um metabolito específico para uma célula imune que infiltrou em um tecido inflamado ou um metabolito específico para uma célula normal que foi danificada em um tecido inflamado.

[0038] [6] A molécula de ligação a antígeno de [1], onde o composto é pelo menos um composto selecionado de um nucleosídeo tendo uma estrutura de anel purina, um aminoácido e seu metabolito, um lipídeo e seu metabolito, um metabolito primário de glicometabolismo e nicotina- mida e seu metabolito.

[0039] [7] A molécula de ligação a antígeno de [6], onde o composto é pelo menos um composto selecionado de adenosina, trifosfato de ade- nosina, inosina, alanina, ácido glutâmico, ácido aspártico, quinurenina, prostaglandina E2, ácido succínico, ácido cítrico e 1-metilnicotinamida.

[0040] [8] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [1] a [7], onde o antígeno é uma molécula tipo membrana.

[0041] [9] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [1] a [8], a qual é uma molécula de ligação a antígeno que tem uma atividade de neutralização.

[0042] [10] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [1] a [9], a qual é uma molécula de ligação a antígeno que tem uma atividade citotóxica.

[0043] [11] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [1] a [10], a qual compreende uma região Fc.

[0044] [12] A molécula de ligação a antígeno de [11], onde a região Fc é uma região Fc contida na região constante de SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8.

[0045] [13] A molécula de ligação a antígeno de [11], onde a região Fc compreende uma região Fc de ligação a FCYR que tem uma atividade de ligação a receptor de FCY maior do que a atividade de ligação a receptor de FCY de região Fc de IgG humana nativa.

[0046] [14] A molécula de ligação a antígeno de [13], onde pelo me nos um ou mais aminoácidos são selecionados do grupo consistindo nos aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido da região Fc de ligação a FcyR alterada são diferentes dos aminoácidos da região Fc de IgG humana nativa.

[0047] [15] A molécula de ligação a antígeno de [14], a qual compre ende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 221; Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido na posição 222; Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido na posição 223; Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido na posição 224; Glu, Lys ou Trp para o aminoácido na posição 225; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 227; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 228; Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido na posição 230; Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 231; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 232; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 233; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 234; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 235; Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 236; Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 237; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 238; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 239; Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido na posição 240; Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 241; Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 243; His para o aminoácido na posição 244; Ala para o aminoácido na posição 245; Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido na posição 246; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 247; Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido na posição 249; Glu ou Gln para o aminoácido na posição 250; Phe para o aminoácido na posição 251; Phe, Met ou Tyr para o aminoácido na posição 254; Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido na posição 255; Ala, Met ou Pro para o aminoácido na posição 256; Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido na posição 258; Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido na posição 260; Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido na posição 262; Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido na posição 263; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 264; Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 265; Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido na posição 266; Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 267; Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido na posição 268; Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 269; Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 270; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 271; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 272; Phe ou Ile para o aminoácido na posição 273; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 274; Leu ou Trp para o aminoácido na posição 275; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 276; Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido na posição 278; Ala para o aminoácido na posição 279; Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 280; Asp, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 281; Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 282; Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o aminoácido na posição 283; Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 284; Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 285; Glu, Gly, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 286; Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido na posição 288; Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 290; Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido na posição 291; Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 292; Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 293; Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 294; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 295; Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido na posição 296; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 297; Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 298; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 299; Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido na posição 300; Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido na posição 301; Ile para o aminoácido na posição 302; Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido na posição 303; Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido na posição 304; Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 305; Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 311; Phe para o aminoácido na posição 313; Leu para o aminoácido na posição 315; Glu ou Gln para o aminoácido na posição 317; His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 318; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 320; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o ami- noácido na posição 322; Ile para o aminoácido na posição 323; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 324; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 325; Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 326; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 327; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 328; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 329; Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 330; Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o ami- noácido na posição 331; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 332; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 333; Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 334; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 335; Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 336; Glu, His ou Asn para o aminoácido na posição 337; Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoá- cido na posição 339; Ala ou Val para o aminoácido na posição 376; Gly ou Lys para o aminoácido na posição 377; Asp para o aminoácido na posição 378; Asn para o aminoácido na posição 379; Ala, Asn ou Ser para o aminoácido na posição 380; Ala ou Ile para o aminoácido na posição 382; Glu para o aminoácido na posição 385; Thr para o aminoácido na posição 392; Leu para o aminoácido na posição 396; Lys para o aminoácido na posição 421; Asn para o aminoácido na posição 427; Phe ou Leu para o aminoácido na posição 428; Met para o aminoácido na posição 429; Trp para o aminoácido na posição 434; Ile para o aminoácido na posição 436; e Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido na posição 440 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido da região Fc de ligação a FCYR alterada.

[0048] [16] A molécula de ligação a antígeno de [11], onde a região Fc é modificada de maneira que haja uma proporção maior de região Fc ligada por uma cadeia de açúcar deficiente em fucose em uma composição de cadeia de açúcar ligada na posição 297, de acordo com numeração EU, da região Fc, ou então que haja uma proporção maior de região Fc com uma N-acetilglicosamina bifurcada adicionada.

[0049] [17] Molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [11] e [13] a [16], onde a atividade de ligação a FcRn da região Fc sob uma condição de faixa de pH ácido é aumentada comparado com a atividade de ligação a FcRn da região Fc de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0050] [18] A molécula de ligação a antígeno de [17], onde a região Fc é uma região Fc com substituição de pelo menos um ou mais amino- ácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos nas posições 238, 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442 e 447, de acordo com a numeração EU, na sequência de ami- noácido da região Fc compreendida na região constante de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0051] [19] A molécula de ligação a antígeno de [18], onde a região Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: Leu para o aminoácido na posição 238; Leu para o aminoácido na posição 244; Arg para o aminoácido na posição 245; Pro para o aminoácido na posição 249; Gln ou Glu para o aminoácido na posição 250; Arg, Asp, Glu ou Leu para o aminoácido na posição 251; Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 252; Ser ou Thr para o aminoácido na posição 254; Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido na posição 255; Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 256; Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido na posição 257; Asp para o aminoácido na posição 258; Ser para o aminoácido na posição 260; Leu para o aminoácido na posição 262; Lys para o aminoácido na posição 270; Leu ou Arg para o aminoácido na posição 272; Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o ami- noácido na posição 279; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 283; Asn para o aminoácido na posição 285; Phe para o aminoácido na posição 286; Asn ou Pro para o aminoácido na posição 288; Val para o aminoácido na posição 293, Ala, Glu, Gln ou Met para o aminoácido na posição 307; Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val ou Trp para o aminoácido na posição 311; Pro para o aminoácido na posição 309; Ala, Asp ou Pro para o aminoácido na posição 312; Ala ou Leu para o aminoácido na posição 314; Lys para o aminoácido na posição 316; Pro para o aminoácido na posição 317; Asn ou Thr para o aminoácido na posição 318; Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido na posição 332; Asn, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 339; Pro para o aminoácido na posição 341; Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 343; Arg para o aminoácido na posição 375; Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido na posição 376; Lys para o aminoácido na posição 377; Asp, Asn ou Val para o aminoácido na posição 378; Ala, Asn, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 380; Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 382; Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 385; Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 386; Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 387; Asn, Pro ou Ser para o aminoácido na posição 389; Asn para o aminoácido na posição 423; Asn para o aminoácido na posição 427; Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 428; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 430; His ou Asn para o aminoácido na posição 431; Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro ou Ser para o aminoácido na posição 433; Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met ou Thr para o aminoácido na posição 436; Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 438; Lys para o aminoácido na posição 440; Lys para o aminoácido na posição 442; e Ile, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 308; conforme indicado pela numeração EU, na sequência de aminoácido da região Fc compreendida na região constante de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0052] [20] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [1] a [19], onde o domínio de ligação a antígeno é um domínio de ligação a antígeno multiespecífico ou multiparatópico.

[0053] [21] A molécula de ligação a antígeno de [20], onde um antí- geno ligado por pelo menos um dos domínios de ligação a antígeno é uma molécula tipo membrana expressa em uma membrana de célula de câncer, e um antígeno ligado por pelo menos um dos domínios de ligação a antígeno é uma molécula tipo membrana expressa em uma membrana de célula efetora.

[0054] [22] A molécula de ligação a antígeno de [21], onde a célula efetora é uma célula NK, um macrófago ou uma célula T.

[0055] [23] A molécula de ligação a antígeno de [21] ou [22], onde a molécula tipo membrana expressa em uma membrana de célula efe- tora é um polipeptídeo de constituição de TCR, CD2, CD3, CD28, CD44, CD16, CD32, CD64 ou NKG2D.

[0056] A molécula de ligação a antígeno de [20], onde um antígeno ligado por pelo menos um dos domínios de ligação a antígeno é uma molécula tipo membrana expressa em uma membrana de célula de câncer, e um antígeno ligado por pelo menos um dos domínios de ligação a antígeno é uma substância citotóxica.

[0057] [25] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [20] a [24], onde a molécula de ligação a antígeno é um fragmento de anticorpo.

[0058] [26] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [1] a [24], onde a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.

[0059] [27] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [1] a [7], onde o antígeno é uma molécula solúvel.

[0060] [28] A molécula de ligação a antígeno de [27], a qual é uma molécula de ligação a antígeno tendo uma atividade de neutralização.

[0061] [29] A molécula de ligação a antígeno de [27] ou [28], a qual compreende uma região Fc.

[0062] [30] A molécula de ligação a antígeno de [29], onde a região Fc é uma região Fc compreendida na região constante de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0063] [31] A molécula de ligação a antígeno de [29], onde a ativi dade de ligação a FcRn da região Fc sob uma condição de faixa de pH ácido é aumentada comparado com a atividade de ligação a FcRn da região Fc compreendida na região constante de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0064] [32] A molécula de ligação a antígeno de [31], onde a região Fc é uma região Fc com substituição de pelo menos um ou mais amino- ácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos nas posições 238, 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442 e 447, de acordo com a numeração EU, na sequência de ami- noácido da região Fc compreendida na região constante de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0065] [33] A molécula de ligação a antígeno de [32], onde a região Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: Leu para o aminoácido na posição 238; Leu para o aminoácido na posição 244; Arg para o aminoácido na posição 245; Pro para o aminoácido na posição 249; Gln ou Glu para o aminoácido na posição 250; Arg, Asp, Glu ou Leu para o aminoácido na posição 251; Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 252; Ser ou Thr para o aminoácido na posição 254; Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido na posição 255; Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 256; Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido na posição 257; Asp para o aminoácido na posição 258; Ser para o aminoácido na posição 260; Leu para o aminoácido na posição 262; Lys para o aminoácido na posição 270; Leu,ou Arg para o aminoácido na posição 272; Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o ami- noácido na posição 279; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 283; Asn para o aminoácido na posição 285; Phe para o aminoácido na posição 286; Asn ou Pro para o aminoácido na posição 288; Val para o aminoácido na posição 293, Ala, Glu, Gln ou Met para o aminoácido na posição 307; Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val ou Trp para o aminoácido na posição 311; Pro para o aminoácido na posição 309; Ala, Asp ou Pro para o aminoácido na posição 312; Ala ou Leu para o aminoácido na posição 314; Lys para o aminoácido na posição 316; Pro para o aminoácido na posição 317; Asn ou Thr para o aminoácido na posição 318; Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido na posição 332; Asn, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 339; Pro para o aminoácido na posição 341; Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 343; Arg para o aminoácido na posição 375; Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido na posição 376; Lys para o aminoácido na posição 377; Asp, Asn ou Val para o aminoácido na posição 378; Ala, Asn, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 380; Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 382; Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 385; Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 386; Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 387; Asn, Pro ou Ser para o aminoácido na posição 389; Asn para o aminoácido na posição 423; Asn para o aminoácido na posição 427; Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 428; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 430; His ou Asn para o aminoácido na posição 431; Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro ou Ser para o aminoácido na posição 433; Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met ou Thr para o aminoácido na posição 436; Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 438; Lys para o aminoácido na posição 440; Lys para o aminoácido na posição 442; e Ile, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 308; conforme indicado pela numeração EU, na sequência de aminoácido da região Fc compreendida na região constante de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0066] [34] A molécula de ligação a antígeno de [29], onde a ativi dade de ligação a FcRn da região Fc sob uma condição de faixa de pH neutro é aumentada comparado com a atividade de ligação a FcRn da região Fc compreendida na região constante de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0067] [35] A molécula de ligação a antígeno de [34], onde a região Fc é uma região Fc com substituição de pelo menos um ou mais amino- ácidos selecionados do grupo consistindo em aminoácidos nas posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 de acordo com a numeração EU, na sequência de aminoácido da região Fc compreendida na região constante da SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0068] [36] A molécula de ligação a antígeno de [35], onde a região Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: Met para o aminoácido na posição 237; Ile para o aminoácido na posição 248; Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 250; Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 252; Thr para o aminoácido na posição 254; Glu para o aminoácido na posição 255; Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido na posição 256; Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoácido na posição 257; His para o aminoácido na posição 258; Ala para o aminoácido na posição 265; Ala ou Glu para o aminoácido na posição 286; His para o aminoácido na posição 289; Ala para o aminoácido na posição 297; Ala para o aminoácido na posição 303; Ala para o aminoácido na posição 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido na posição 308; Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg para o aminoácido na posição 309; Ala, His ou Ile para o aminoácido na posição 311; Ala ou His para o aminoácido na posição 312; Lys ou Arg para o aminoácido na posição 314; Ala, Asp ou His para o aminoácido na posição 315; Ala para o aminoácido na posição 317; Val para o aminoácido na posição 332; Leu para o aminoácido na posição 334; His para o aminoácido na posição 360; Ala para o aminoácido na posição 376; Ala para o aminoácido na posição 380; Ala para o aminoácido na posição 382; Ala para o aminoácido na posição 384; Asp ou His para o aminoácido na posição 385; Pro para o aminoácido na posição 386; Glu para o aminoácido na posição 387; Ala ou Ser para o aminoácido na posição 389; Ala para o aminoácido na posição 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 428; Lys para o aminoácido na posição 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; e His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido na posição 436 conforme indicado pela numeração EU, na sequência de aminoácido da região Fc de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[0069] [37] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [29] e [31] a [36], onde a região Fc tem uma atividade de ligação maior com um receptor de FCY inibidor do que com um receptor de FCY ativador.

[0070] [38] A molécula de ligação a antígeno de [37], onde o recep tor de FCY inibidor é um FcYRIIb humano.

[0071] Molécula de ligação a antígeno de [37] a [38], onde o recep tor de Fcy de ativação é FcyRIa humano, FcyRIIa humano (R), FcyRIIa humano (H), FcyRIIIa humano (V) ou FcyRIIIa humano (F).

[0072] [40] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [37] a [39], onde o aminoácido na posição 238 ou 328 (numeração EU) da região Fc inclui um aminoácido que é diferente do aminoácido da região Fc de IgG humana nativa.

[0073] [41] A molécula de ligação a antígeno de [40], onde o amino- ácido na posição 238 indicado por numeração EU na região Fc é Asp ou o aminoácido na posição 328 é Glu.

[0074] [42] A molécula de ligação a antígeno de [40] ou [41], a qual compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em: Asp para o aminoácido na posição 233; Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 234; Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 237; Asp para o aminoácido na posição 239; Ala, Gln ou Val para o aminoácido na posição 267; Asn, Asp ou Glu para o aminoácido na posição 268; Gly para o aminoácido na posição 271; Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 326; Arg, Lys ou Met para o aminoácido na posição 330; Ile, Leu ou Met para o aminoácido na posição 323; e Asp para o aminoácido na posição 296 de acordo com numeração EU, na sequência de aminoácido da região Fc.

[0075] [43] A molécula de ligação a antígeno de qualquer um de [27] a [42], onde a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo.

[0076] [44] Um método para produção da molécula de ligação a an- tígeno de qualquer um de [1] a [43], o qual compreende seleção de um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo.

[0077] [45] Um método de avaliação da molécula de ligação a antí- geno de qualquer um de [1] a [43], o qual compreende seleção de um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo.

[0078] [46] Uma composição farmacêutica compreendendo a molé cula de ligação a antígeno de qualquer um de [1] a [43].

Breve Descrição dos Desenhos

[0079] A figura 1 mostra que um anticorpo permutador de molécula pequena não se liga a antígenos em um ambiente normal onde as moléculas pequenas não estão presentes, mas se liga aos antígenos no tecido alvo onde as moléculas pequenas estão presentes em uma concentração alta.

[0080] A figura 2 mostra que a molécula pequena funciona como um permutador ao se encaixar entre o anticorpo antimolécula pequena e o antígeno. Se a molécula pequena estiver ausente, a interação anticorpo- antígeno é insuficiente e o anticorpo não pode se ligar ao antígeno, mas se a molécula pequena estiver presente, o anticorpo pode se ligar ao antígeno ao ter a molécula pequena posta entre o anticorpo e o antí- geno.

[0081] A figura 3 é uma figura mostrando o resultado de ELISA para a ligação do anticorpo à IL-6 humana. O eixo vertical mostra os valores de absorbância que avaliam a atividade de ligação à IL-6 humana de cada um dos anticorpos na presença ou ausência de cada uma das moléculas pequenas.

[0082] A figura 4 é um sensorgrama mostrando a interação entre 4 μmol/L de IL-6 humana e A11 na presença ou ausência de 100 μmol/L de quinurenina.

[0083] A figura 5 mostra um gráfico que avalia mudança na resposta de ligação a A11 imobilizado sobre Sensorchip CM5, onde interação é permitida acontecer por 60 segundos com 1 μmol/L de IL-6 como o ana- lito. O eixo vertical mostra mudança na resposta (RU) antes e após interação com IL-6, e o eixo horizontal mostra a concentração de quinurenina (μmol/L) contida na solução neste momento.

[0084] A figura 6 mostra um gráfico que avalia a resposta a H01 que foi imobilizado em Sensorchip CM5, quando interação é permitida acontecer por 60 segundos com 1 μmol/L de IL-6 como o analito. O eixo vertical mostra mudança na resposta (RU) antes e após interação com IL-6 e o eixo horizontal mostra a concentração de quinurenina contida na solução (μmol/L) neste momento.

[0085] A figura 7 mostra um gráfico que avalia a resposta à IL-6 que foi imobilizada em Sensorchip CM5, quando interação é permitida acontecer por 60 segundos com 0,1 μmol/L de A11 como o analito. O eixo vertical mostra mudança na resposta (RU) antes e após interação com A11, e o eixo horizontal mostra a concentração de quinurenina contida na solução (μmol/L).

[0086] A figura 8 mostra um gráfico obtido permitindo que A11 inte raja com IL-6 imobilizada em Sensorchip CM5 na presença de 100 μmol/L de quinurenina, e então observação da dissociação de A11 de IL-6 na presença de um tampão contendo 100 μmol/L de quinurenina ou na presença de um tampão que não contém quinurenina. Na figura, o eixo vertical mostra valores normalizados através da definição da quantidade de A11 ligado na presença de 100 μmol/L de quinurenina como 100 e o eixo horizontal mostra a passagem de tempo (em segundos) a partir do início da interação.

[0087] A figura 9 mostra um sensorgrama obtido permitindo que 800, 400, 200, 100, 50 ou 25 nmol/L de quinurenina interajam com IL-6 imobilizada em um sensorchip. O eixo vertical mostra mudança na quantidade de IL-6 ligada por quinurenina (RU) (a resposta no início do experimento de interação foi definida como 0) e o eixo horizontal mostra a passagem de tempo do início do experimento de interação.

[0088] A figura 10 mostra a estrutura de 2’-Adenosina-PEG-peptí- deo que é um análogo de adenosina usado para imunização de coelhos.

[0089] A figura 11 mostra a estrutura de 5’-Adenosina-PEG-peptí- deo que é um análogo de adenosina usado para imunização de coelhos.

[0090] A figura 12 mostra a estrutura de 2’-Adenosina-PEG-biotina produzida substituindo a porção peptídeo por biotina do análogo de ade- nosina usado para imunização de coelhos.

[0091] A figura 13 mostra a estrutura de 5’-Adenosina-PEG-biotina produzida substituindo a porção peptídeo por biotina do análogo de ade- nosina usado para imunização de coelhos.

[0092] A figura 14 é um gráfico onde o eixo vertical mostra o valor (N_ligação_100) obtido dividindo a quantidade de ligação na interação de cada anticorpo com 2’-Adenosina-PEG-biotina pelo nível de captura (RU) de cada anticorpo, e o eixo horizontal mostra o valor (N_estabii- dade_100) obtido dividindo o valor obtido 60 segundos após dissociação de 2’-Adenosina-PEG-biotina de cada anticorpo após interação com 2’-Adenosina-PEG-biotina através do nível de captura (RU) de cada anticorpo.

[0093] A figura 15A indica sensorgramas de análises baseadas em ressonância de plasmon de superfície que mostram que clone SMB0002 se liga (interage com) à adenosina. Os sensorgramas mostram as interações entre SMB002 e o antígeno em 7,81, 31,3, 125 e 500 mM em ordem a partir da parte inferior.

[0094] A figura 15B indica sensorgramas de análises baseadas em ressonância de plasmon de superfície que mostram que clone SMB0002 se liga a (interage com) ATP. Os sensorgramas mostram as interações entre SMB0002 e o antígeno em 78,1, 313, 1250 e 500 nM em ordem a partir da parte inferior.

[0095] A figura 15C indica sensorgramas de análises baseadas em ressonância de plasmon de superfície que mostram que clone SMB0089 se liga à (e interage com) adenosina. Os sensorgramas mostram as interações entre SMG0089 e o antígeno em 7,81, 31,3, 125 e 500 nM em ordem a partir da parte inferior.

[0096] A figura 15D indica sensorgramas de análises baseadas em ressonância de plasmon de superfície que mostram que clone SMB0089 se liga a (e interage com) ATP. Os sensorgramas mostram as interações entre SMB0089 e ao antígeno em 78,1, 313, 1250 e 5000 nM em ordem a partir da parte inferior.

[0097] A figura 15E indica sensorgramas de análises baseadas em ressonância de plasmon de superfície que mostram que clone SMB0104 se liga à (e interage com) adenosina. Os sensorgramas mostram as interações entre SMB0104 e o antígeno em 7,81, 31,3 e 500 nM em ordem a partir da parte inferior.

[0098] A figura 15F indica sensorgramas de análises baseadas em ressonância de plasmon de superfície que mostram que clone SMB0104 se liga a (e interage com) ATP. Os sensorgramas mostram as interações entre SMB0104 e o antígeno em 78,1, 313, 1250 e 5000 nM em ordem a partir da parte inferior.

[0099] A figura 16 indica sensorgramas de análises baseadas em ressonância de plasmon de superfície que mostram que clone SMB0171 se liga a (e interage com) ATP. Os sensorgramas mostram as interações entre SMB0171 e o antígeno em 5 e 50 μM em ordem a partir da parte inferior.

[00100] A figura 17 indica os resultados de ELISA competitivo que mostram que clone SMB0002 se liga à adenosina e ATP.

[00101] A figura 18 mostra um gráfico que avalia a habilidade de inibição de ATP com relação à ligação de antígenos marcados com biotina (uma mistura de 5’-Adenosina-PEG-biotina e ATP-PEG-biotina) através de ATNLSA1-4_D12.

[00102] A figura 19 mostra o conceito de biblioteca de anticorpo racionalmente projetada que pode obter anticorpos de permuta adeno- sina/ATP contra qualquer antígeno, onde a biblioteca é feita de porções de região variável de anticorpo que contatam com os antígenos de maneira que adenosina ou ATP é posicionada entre o anticorpo e o antí- geno.

[00103] A figura 20 mostra o conceito de uma biblioteca de anticorpo de coelho imunizado com adenosina que fornece anticorpos de permuta de adenosina/ATP contra qualquer antígeno e onde adenosina ou ATP é intercalada entre o anticorpo e o antígeno.

[00104] A figura 21 é uma figura mostrando o resultado de ELISA para ligação do anticorpo à IL-6 humana. O eixo vertical mostra a atividade de ligação de cada anticorpo à IL-6 humana dependendo da presença ou ausência de aminoácidos ou metabolitos de aminoácido (qui- nurenina, triptofano, fenilalanina, ácido antranílico, 3-hidroxiquinurenina e ácido quinurênico), apresentada como valores de absorbância em um comprimento de onda de 450 nm.

[00105] A figura 22 é uma figura mostrando o resultado de ELISA para ligação do anticorpo à IL-6 humana. O eixo vertical mostra a atividade de ligação do anticorpo I6NMSC1-3_#03 à IL-6 humana dependendo da presença ou ausência de cada molécula pequena (ATP, ade- nosina, inosina, PGE2, ácido succínico, ácido láctico, quinurenina e um coquetel de molécula pequena), apresentada como valores de atividade específica calculados a partir dos valores de absorbância em comprimento de onda de 450 nm.

[00106] A figura 23 é uma figura mostrando o resultado de ELISA para ligação do anticorpo à IL-6 humana. O eixo vertical mostra a atividade de ligação do anticorpo I6NMSC1-3_#17 à IL-6 humana dependendo da presença ou ausência de cada molécula pequena (ATP, ade- nosina, inosina, PGE2, ácido succínico, ácido láctico, quinurenina e um coquetel de molécula pequena), apresentada como valores de atividade específica calculados a partir dos valores de absorbância em comprimento de onda de 450 nm.

[00107] A figura 24 é uma figura mostrando o resultado de ELISA para ligação do anticorpo à HSA. O eixo vertical mostra a atividade de ligação do anticorpo HSNMSC1-4_#22 à HSA dependendo da presença ou ausência de cada molécula pequena (ATP, adenosina, inosina, PGE2, ácido succínico, ácido láctico, quinurenina e um coquetel de molécula pequena), apresentada como valores de absorbância em comprimento de onda de 450 nm.

[00108] A figura 25 é uma figura mostrando o resultado de ELISA realizado no clone I6DL2C5-4_0,76, que foi obtido da biblioteca de anticorpo racionalmente projetada contra IL-6 humana na presença ou ausência de ATP e/ou adenosina a 1 mM. O eixo vertical mostra o valor de absorbância que avalia atividade de ligação do anticorpo à IL-6 humana. Os resultados obtidos quando usando Fago Auxiliar M13KO7 são apresentados como o controle negativo.

[00109] A figura 26 é uma figura mostrando o resultado de ELISA realizado no clone HSDL3C5-4_015, que foi obtido a partir de biblioteca de anticorpo racionalmente projetada contra albumina de soro humano na presença ou ausência de ATP e/ou adenosina a 1 mM. O eixo vertical mostra o valor de absorbância que avalia a atividade de ligação do anticorpo à albumina de soro humano. Os resultados obtidos quando usando Fago Auxiliar M13KO7 são apresentados como o controle ne-gativo.

[00110] A figura 27 é uma figura mostrando o resultado de ELISA realizado nos clones 6RAD2C1-4_011 e 6RAD2C1-4_076, que foram obtidos da biblioteca de anticorpo racionalmente projetada contra receptor de IL-6 humana na presença ou ausência de ATP e/ou adenosina (escrita como ADO) a 1 mM, e na presença ou ausência de um coquetel de molécula pequena (SC) (Small-Molecule Cocktail). O eixo vertical mostra valores de absorbância que avaliam a atividade de ligação do anticorpo ao receptor de IL-6 humano. Os resultados obtidos quando usando Fago Auxiliar M13KO7 são apresentados como o controle negativo.

[00111] A figura 28 é uma figura mostrando o resultado de ELISA para ligação de clone 6RNMSC1-2_F02 a IL-6R humano. O eixo vertical mostra os valores de absorbância que avaliam a atividade de ligação do anticorpo a IL-6R humano na presença ou ausência de cada molécula pequena.

[00112] A figura 29 é uma figura mostrando o resultado de ELISA para ligação de clone 6RNMSC1-3_G02 a IL-6R humano. O eixo vertical mostra os valores de absorbância que avaliam a atividade de ligação do anticorpo a IL-6R humano na presença ou ausência de cada molécula pequena.

[00113] A figura 30 é uma figura mostrando o resultado de ELISA para ligação de um anticorpo a IL-6R humano. O eixo vertical mostra os valores de absorbância que avaliam a atividade de ligação do anticorpo a IL-6R humano na presença ou ausência de cada aminoácido ou me- tabolito de aminoácido.

[00114] A figura 31 apresenta sensorgramas mostrando a interação entre 6RNMSC1-2_F02 e 1 μmol/L de IL-6R na presença de 100 μmol/L de quinurenina, na presença de 10 mmol/L de ATP e na ausência de quinurenina e ATP. A linha sólida indica a interação na presença de qui- nurenina, a linha pontilhada indica a interação na presença de ATP e a linha tracejada indica a interação nas suas ausências.

[00115] A figura 32 é um gráfico obtido permitindo que 6RNMSC1- 2_F02 interaja com IL-6R imobilizado em Sensorchip CM5 na presença de 100 μmol/L de quinurenina, e então observação da dissociação de 6RNMSC1-2_F02 de IL-6R na presença de um tampão contendo 100 μmol/L de quinurenina ou na presença de um tampão que não contém quinurenina. Na figura, o eixo vertical mostra valores normalizados através da definição da quantidade de 6RNMSC1-2_F02 ligado na presença de 100 μmol/L de quinurenina como 100, e o eixo horizontal mostra a passagem de tempo (em segundos) desde o início da interação. A linha sólida mostra a dissociação de 6RNMSC1-2_F02 de IL-6R na presença de quinurenina e a linha pontilhada mostra a dissociação de 6RNMSC1- 2_F02 de IL-6R na ausência de quinurenina.

[00116] A figura 33 é um gráfico produzido permitindo que 5 μg/L de 6RNMSC1-2_F02 interajam como um analito por 180 segundos e avali-ação da resposta a IL-6R imobilizado em Sensorchip CM5. O eixo vertical mostra mudança em resposta (RU) antes e após interação de 6RNMSC1-2_F02 e o eixo horizontal mostra a concentração (μmol/L) de quinurenina contida na solução.

[00117] A figura 34 é uma figura mostrando avaliação da ligação de anticorpos a IL-6R humano tipo membrana por FCM. O painel superior mostra resultados obtidos na presença de quinurenina e o painel inferior mostra resultados obtidos na ausência de quinurenina. O eixo horizontal mostra a intensidade de fluorescência e o eixo vertical mostra a contagem de célula.

[00118] A figura 35A mostra a atividade de ADCC de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas em relação a células expressando os antígenos. Ela mostra a atividade de ADCC de clone 6RNMSC1-2_F02, que se liga a hIL-6R na presença de quinure- nina, com relação a células BaF expressando hIL-6R na presença (tri-ângulos) ou ausência (círculos) de quinurenina. Os triângulos e círculos abertos mostram os valores medidos e os triângulos e círculos cheios mostram os valores médios.

[00119] A figura 35B mostra a atividade de ADCC de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas com relação a células que expressam o antígeno. Ela mostra a atividade de ADCC de MRA, que se liga a hIL-6R sem importar a presença de quinurenina, com relação a células BaF expressando hIL-6R na presença (triângulos) ou ausência (círculos) de quinurenina. Os triângulos e círculos abertos mostram os valores medidos e os triângulos e círculos cheios mostram os valores médios.

[00120] A figura 36 mostra a atividade de ADCC de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas em relação a células expressando o antígeno. Ela mostra a atividade de ADCC de clone 6RNMSC1-2_F02 em relação a células BaF expressando hIL-6R na presença (triângulos) e ausência (círculos) de 6RNMSC1-2_F02 que se liga a hIL-6R na presença de quinurenina. O eixo horizontal mostra a concentração de quinurenina e o eixo vertical mostra a atividade de ADCC (%). Os valores médios e desvios padrão de atividade de ADCC são mostrados.

[00121] A figura 37 é uma figura mostrando o resultado de ELISA para a ligação de clone 6RNMSC1-2_F02 em soro de camundongo a IL-6R humano. O eixo vertical mostra os valores de absorbância que avaliam as atividades de ligação do anticorpo a IL-6R humano na presença ou ausência de quinurenina.

[00122] A figura 38 é uma figura mostrando o resultado de ELISA realizado com clone I6RLSA1-6_011, que foi obtido da biblioteca de anticorpo racionalmente projetada, contra IL-6 humana na presença ou ausência de ATP e adenosina a 10 mM. O eixo vertical mostra o valor de absorbância que avalia a atividade de ligação do anticorpo à IL-6 hu-mana. Os resultados obtidos quando usando um clone obtido da biblioteca de anticorpo racionalmente projetada e mostrando atividade de li-gação à IL-6 humana sem importar a presença de moléculas pequenas são apresentados como o controle positivo. Os resultados obtidos quando usando o Fago Auxiliar M13KO7 são apresentados como o controle negativo.

[00123] A figura 39 é uma figura mostrando o resultado de ELISA realizado com clones 6RRLSA1-6_037 e 6RRLSA1-6_045, que foram obtidos de biblioteca de anticorpo racionalmente projetada, contra o receptor de IL-6 humana na presença ou ausência de ATP e adenosina a 10 mM. O eixo vertical mostra o valor de absorbância que avalia a atividade de ligação dos anticorpos ao receptor de IL-6 humana. Os resultados obtidos quando usando o Fago Auxiliar M13KO7 são apresentados como o controle negativo.

[00124] A figura 40 é uma figura mostrando o resultado de ELISA realizado em 96 clones obtidos através de panning da biblioteca de anticorpo racionalmente projetada quatro vezes contra IgA-Fc humano usando uma exibição de fago de anticorpo multivalente. Os valores de absorbância que avaliam a atividade de ligação dos anticorpos a IgA-Fc humano na ausência de ATP e adenosina são mostrados no eixo vertical, e os valores de absorbância que avaliam a atividade de ligação dos anticorpos a IgA-Fc humano na presença de ATP e adenosina são mostrados no eixo horizontal.

[00125] A Figura 41 é uma figura mostrando o resultado de ELISA realizado em 96 clones obtidos através de panning da biblioteca de anticorpo racionalmente projetada quatro vezes contra IgA-Fc humano usando uma exibição de fago de anticorpo monovalente. Os valores de absorbância que avaliam a atividade de ligação dos anticorpos a IgA-Fc humano na ausência de ATP e adenosina são mostrados no eixo vertical e os valores de absorbância que avaliam a atividade de ligação dos anticorpos a IgA-Fc humano na presença de ATP e adenosina são mostrados no eixo horizontal.

[00126] A figura 42 é uma figura mostrando o resultado de ELISA realizado no clone IADL3C5-4_048 obtido da biblioteca de anticorpo ra-cionalmente projetada contra IgA-Fc humano na presença ou ausência de ATP e adenosina a 1 mM. O eixo vertical mostra o valor de absor- bância que avalia atividade de ligação do anticorpo a IgA-Fc humano. Os resultados obtidos quando usando um clone obtido da biblioteca de anticorpo racionalmente projetada e mostrando atividade de ligação com relação a IgA-Fc humano sem importar a presença de moléculas pequenas são apresentados como o controle positivo. Os resultados obtidos quando usando o Fago Auxiliar M13KO7 são apresentados como o controle negativo.

[00127] A figura 43 é um gráfico mostrando o nível de ligação (resposta de ligação (RU)) quando cada clone a 1 μM foi feito interagir por 120 segundos com IL-6R imobilizado em Sensorchip CM5 na presença ou ausência de cada uma das moléculas pequenas a 1 mM.

[00128] A figura 44A mostra a atividade de ADCC de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas com relação a células expressando o antígeno. Ela é uma figura mostrando a atividade de ADCC do clone 6RAD2C1-4_030, que se liga à hIL-6R na presença de ATP, com relação a células CHO expressando hIL_6R na pre-sença (triângulos) ou ausência (círculos) de ATP. Os triângulos e círculos abertos mostram os valores medidos e os triângulos e círculos cheios mostram os valores médios.

[00129] A figura 44B mostra a atividade de ADCC de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas com relação a células expressando o antígeno. Ela é uma figura mostrando a atividade de ADCC de clone 6RAD2C1-4_011, que se liga a hIL-6R na presença de ATP, com relação a células CHO expressando hIL-6R na pre-sença (triângulos) ou ausência (círculos) de ATP. Os triângulos e círculos abertos mostram os valores medidos e os triângulos e círculos cheios mostram os valores médios.

[00130] A figura 44C mostra a atividade de ADCC de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas com relação a células expressando o antígeno. Ela é uma figura mostrando a atividade de ADCC de MRA, que se liga a hIL-6R sem importar a presença ou ausência de ATP, com relação a células CHO expressando na presença (triângulos) ou ausência (círculos) de ATP. Os triângulos e círculos abertos mostram os valores medidos e os triângulos e círculos cheios mostram os valores médios.

[00131] A figura 45 é uma figura mostrando o resultado de ELISA realizado no clone HSADSA1-6_020 obtido da biblioteca de anticorpo racionalmente projetada contra HSA na presença ou ausência de ATP e adenosina a 10 mM. O eixo vertical mostra o valor de absorbância que avalia atividade de ligação do anticorpo à HSA. Os resultados obtidos quando usando um clone obtido da biblioteca de anticorpo racionalmente projetada e mostrando atividade de ligação à HSA sem importar a presença de moléculas pequenas são apresentados como o controle positivo. Os resultados obtidos quando usando o Fago Auxiliar M13KO7 são apresentados como o controle negativo.

[00132] Modo para Realizar a Invenção

[00133] As definições e descrição detalhada abaixo são providas para facilitar a compreensão da presente invenção ilustrada aqui.

Aminoácidos

[00134] Aqui, aminoácidos são descritos por códigos de uma ou três letras ou ambos, por exemplo, Ala/A, Leu/L, Arg/R, Lys/K, Asn/N, Met/M, Asp/D, Phe/F, Cys/C, Pro/P, Gln/Q, Ser/S, Glu/E, Thr/T, Gly/G, Trp/W, His/H, Tyr/Y, Ile/I ou Val/V.

Alteração de aminoácidos

[00135] Para alteração de aminoácido na sequência de aminoácido de uma molécula de ligação a antígeno, métodos conhecidos tais como métodos de mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) e PCR de extensão de sobreposição podem ser apropriadamente empregados. Ainda, vários métodos conhecidos podem ser também empregados como métodos de alteração de aminoácido para substituição para aminoácidos não naturais (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249; e Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2003) 100 (11), 6353-6357). Por exemplo, é adequado usar um sistema de tradução livre de célula (Clover Direct (Protein Express)) contendo um tRNA que tem um aminoácido não natural ligado a um tRNA supressor de âmbar complementar de um dos códons de parada, o códon UAG (códon âmbar).

[00136] No presente pedido, o significado do termo “e/ou” quando descrevendo o sítio de alteração de aminoácido inclui toda combinação onde “e” e “ou” são adequadamente combinados. Especificamente, por exemplo, “os aminoácidos nas posições 33, 55 e/ou 96 são substituídos” inclui a variação de alterações de aminoácido que segue:

[00137] aminoácido(s) na (a) posição 33, (b) posição 55, (c) posição 96, (d) posições 33 e 55, (e) posições 33 e 96, (f) posições 55 e 96 e (g) posições 33, 55 e 96.

[00138] Ainda, aqui, como uma expressão mostrando alteração de aminoácidos, uma expressão que mostra antes e após um número indicando uma posição específica, códigos de uma letra ou três letras para aminoácidos antes e após alteração, respectivamente, podem ser usados apropriadamente. Por exemplo, a alteração N100bL ou Asn100bLeu usada quando substituindo um aminoácido contido em uma região variável de anticorpo indica a substituição de Asn na posição 100b (de acordo com numeração Kabat) com Leu. Isto é, o número mostra a posição de aminoácido de acordo com numeração Kabat, o código de aminoácido de uma letra ou três letras escrito antes do número mostra o aminoácido antes da substituição, e o código de aminoácido de uma letra ou três letras escrito após o número mostra o aminoácido após substituição. Similarmente a alteração P238D ou Pro238Asp usada quando substituindo um aminoácido da região Fc contida em uma região constante de anticorpo indica substituição de Pro na posição 238 (de acordo com numeração EU) com Asp. Isto é, o número mostra a posição de aminoácido de acordo com a numeração EU, o código de aminoácido de uma letra ou três letras escrita antes do número mostra o aminoácido antes da substituição e o código de aminoácido de uma letra ou três letras escrito após o número mostra o aminoácido após substituição.

Antígenos

[00139] Aqui, “antígenos” não são particularmente limitados em sua estrutura, contanto que eles compreendam epítopos aos quais domínios de ligação a antígeno se ligam. Em outras palavras, antígenos podem ser substâncias inorgânicas ou orgânicas. Outros antígenos incluem, por exemplo, as moléculas abaixo: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1a, 8- iso-PGF2a, 8-oxo-dG, receptor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, ac- tivina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina RIA, acti- vina RIA ALK-2, activina RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK- 1, ALK-7, alfa-1-antitripsina, antagonista alfa-V/beta-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, AS-PARTIC, peptídeo atrial natriurético, av/b3 integrina, Axl, b2M, B7-1, B7- 2, B7-H, fator de estimulação de linfócito B (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b- ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP- 2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bombe- sina, fator neutrófico derivado de osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator de complemento 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calci- tonina, cAMP, antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno associado a câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsina D, ca- tepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteína p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina botulínica, toxina de Clostridium perfringens, CKb8- 1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, PD1, PDL1, LAG3, TIM3, galectina-9, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno associado a tumor citoque- ratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, fator regulador de complemento (fator de aceleração de declínio), des (1-3)-IGF-I (IGF-1 cerebral), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA- A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, encefalinase, eNOS, Eot, eotaxina 1, EpCAM, efrina B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selectina, ET-1, fator IIa, fator VII, fator VIIIc, fator IX, proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio de estimulação de folículo, frac- talcina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GITR, glucagon, Glut4, glicoproteína IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormônio de liberação do hormônio do crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), glicoproteína envelope gB HB-EGF, HCC, HCMV, glicoproteína envelope gH HCMV, HCMV UL, fator de crescimento hematopoiético (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), vírus herpes simplex (HSV) glicoproteína gB, glicoproteína gD HSV, HGFA, antígeno associado a melanoma de peso molecular alto (HMW-MAA) (high molecular weight melanoma-associated antigen), gp120 HIV, alça V3 gp 120 HIV IIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovírus humano (HCMV) (Human Cytomegalovirus), hormônio do crescimento humano (HGH) (Human Growth Hormone), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, receptor de IgA, IgE, IGF, proteína de ligação a IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL- 8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-21, IL-23, IL-27, interferon (INF)-alfa, INF-beta, INF-gama, inibina, iNOS, cadeia A da insulina, cadeia B da insulina, fator de crescimento 1 tipo insulina, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina alfa4/beta1, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5 (alfa V), integrina alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa6, integrina beta1, integrina beta2,interferon gama, IP-10, I-TAC, JE, calicreína 2, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 11, calicreína 12, calicreína 14, calicreína 15, calicreína L1, calicreína L2, calicreína L3, calicreína L4, KC, KDR, fator de crescimento de que- ratinócito (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, LBP, LDGF, LECT2, lefty, antígeno Lewis-Y, antí- geno associado Lewis-Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteína, LIX, LKN, Lptn, L-selectina, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superfície pulmonar, hormônio luteinizante, receptor de linfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALOPROTEASES, receptor de MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alfa, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mu- cina (Muc1), MUC18, substância de inibição Mulleriana, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C aderina, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrofina-3, -4 ou -6, neurturina, fator de crescimento de nervo (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormônio paratireoide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fosfatase alcalina placentária (PLAP) (placental alkaline phosphatase), PlGF, PLP, PP14, proinsulina, prorelaxina, proteína C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) (prostate-specific membrane antigen), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadeia A da relaxina, relaxina, renina, vírus sincicial respiratório (RSV) (respiratory syncytial vírus) F, RSV Fgp, Ret, fator reumatoide, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, albumina do soro, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 glicoproteína associada a tumor-72 (tumor-associated glycoprotein-72), TARC, TCA-3, receptor de célula T (por exemplo, receptor alfa/beta de célula T), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina tipo PLAP do testículo, TfR, TGF, TGF- alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Específico, TGF-betaRI (ALK-5), TGF- betaRII, TGF-betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF- beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombina, Ck-1 do timo, hormônio de estimulação da tireoide, Tie, TIMP, TIQ, fator de tecido, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alfa, TNF-alfabeta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3) , TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (ligante Apo-2 TRAIL, TL2), TNFSF11 (ligante ODF, OPG TRANCE/RANK), TNFSF12 (ligante Apo-3 TWEAK, ligante DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (ligante HVEM LIGHT, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (ligante GITR ligante AITR, TL6), TNFSF1A (Conectina TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligante gp34, TXGP1), TNFSF5 (ligante CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (ligante Fas ligante Apo-1, ligante APT1), TNFSF7 (ligante CD27 CD70), TNFSF8 (ligante CD30 CD153), TNFSF9 (ligante 4-1BB ligante CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TLR1 (receptor 1 tipo Tolll), TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TSG, TSLP, antígeno associado a tumor CA125, antígeno associado a tumor expressando carboidratos associados a Lewis-Y TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urocinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Caderina, VE- caderina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno de vírus, VLA, VLA-1, VLA-4, integrina VNR, fator von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Ad, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, LDL oxidado, PCSK9, precalicreína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromogranina A, Cromogranina B, tau, VAP1, quininogênio de peso molecular alto, IL- 31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, fator B, fator D, fator H, properdina, esclerostina, fibrinogênio, fibrina, protrombina, trombina, fator de tecido, fator V, fator Va, fator VII, fator VIIa, fator VIII, fator VIIIa, fator IX, fator IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator XIa, fator XII, fator XIIa, fator XIII, fator XIIIa, TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA e S1P; e receptores para hormônio e fatores de crescimento. Antígenos preferidos são antígenos que são expressos em células de câncer, células estromais ou similares presentes em tecidos cancerosos ou tecidos inflamatórios.

[00140] Embora receptores sejam mencionados como exemplos dos antígenos mencionados acima, quando esses receptores existem em formas solúveis em fluidos biológicos, eles podem ser usados como an- tígenos que se ligam à molécula de ligação a antígeno da presente invenção, que contém um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração do composto específico de tecido alvo. Um exemplo de uma modalidade não limitante de tal receptor solúvel é o IL-6R solúvel, que é uma proteína que consiste nos aminoácidos nas posições 1 a 357 na sequência de poli- peptídeo de IL-6R de SEQ ID NO:1 conforme descrito em Mullberg e outros (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968).

[00141] Moléculas do tipo membrana expressas em membranas celulares e moléculas solúveis secretadas a partir de células para o exterior das células estão incluídas nos exemplos dos antígenos mencionados acima. Quando a molécula de ligação a antígeno da presente invenção, que contém um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração do composto específico de tecido alvo, se liga a uma molécula solúvel secretada a partir das células, é preferível que a molécula de ligação a antígeno tenha atividade de neutralização conforme descrito mais tarde.

[00142] Os fluidos onde as moléculas solúveis existem não são limitados e as moléculas solúveis podem existir em fluidos biológicos ou mais especificamente em todos os fluidos que enchem o espaço entre tecidos e células ou vasos em organismos. Em uma modalidade não limitante, as moléculas solúveis às quais moléculas de ligação a antí- geno da presente invenção se ligam podem estar presentes no fluido extracelular. Em vertebrados, fluido extracelular é um termo geral para plasma, fluido intersticial, linfo, tecido conectivo compacto, fluido cerebrospinal, fluido espinal, fluido de punção, fluido sinovial ou componentes similares no osso e cartilagem, fluido alveolar (fluido de lavagem broncoalveolar), fluido peritoneal, fluido pleural, efusão pericardial, fluido de cisto, humor aquoso (hidatoide) ou fluidos transcelulares (vários fluidos nas cavidades glandulares e fluidos na cavidade do trato digestivo ou outros fluidos de cavidade corporal produzidos como um resultado de transporte ativo/atividades secretoras de células).

[00143] Quando uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo se liga a uma molécula tipo membrana expressa em uma membrana celular, exemplos adequados da molécula de ligação a antígeno incluem moléculas de ligação a antígeno que têm atividade citotóxica, se ligam a uma substância citotóxica ou têm a habilidade em se ligar a uma substância citotóxica, conforme descrito mais tarde. Ainda, moléculas de ligação a antígeno tendo uma atividade de neutralização ao invés das propriedades de ter uma atividade citotóxica, ligação a uma substância citotóxica ou tendo a habilidade em se ligar a uma substância citotóxica; ou em adição a essas propriedades são também exemplos adequados de uma modalidade não limitante.

Epítopos

[00144] “Epítopo” significa um determinante antigênico em um antí- geno, e se refere a um sítio antigênico ao qual o domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno aqui apresentada se liga. Desta forma, por exemplo, o epítopo pode ser definido de acordo com sua estrutura. Alternativamente, o epítopo pode ser definido de acordo com a atividade de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno que reconhece o epítopo. Quando o antígeno é um peptídeo ou polipeptídeo, o epítopo pode ser especificado pelos resíduos de aminoácido que formam o epítopo. Alternativamente, quando o epítopo é uma cadeia de açúcar, o epítopo pode ser especificado por sua estrutura de cadeia de açúcar específica.

[00145] Um epítopo linear é um epítopo que contém um epítopo cuja sequência de aminoácidos primária foi reconhecida. Tal epítopo linear contém, tipicamente, pelo menos três e o mais comumente pelo menos cinco, por exemplo, cerca de 8 a cerca de 10 ou 6 a 20 aminoácidos em uma sequência específica.

[00146] Ao contrário do epítopo linear, um “epítopo conformacional” é um epítopo no qual a sequência de aminoácido primária contendo o epítopo não é o único determinante do epítopo reconhecido (por exemplo, a sequência de aminoácido primária de um epítopo conforma- cional não é necessariamente reconhecida por um anticorpo que define o epítopo). Os epítopos conformacionais podem conter um número maior de aminoácidos em comparação aos epítopos lineares. Um anticorpo que reconhece um epítopo conformacional reconhece a estrutura tridimensional de um peptídeo ou proteína. Por exemplo, quando uma molécula de proteína se dobra e forma uma estrutura tridimensional, as cadeias principais do aminoácido e/ou polipeptídeo que formam um epí- topo conformacional ficam alinhadas e o epítopo é tornado passível de reconhecimento pelo anticorpo. Os métodos para determinar as conformações do epítopo incluem, por exemplo, cristalografia de raios X, ressonância magnética nuclear bidimensional, marcação spin de sítio-específica e ressonância paramagnética de elétrons, mas não são limitados a estes. Vide, por exemplo Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.).

[00147] A estrutura do domínio de ligação de antígeno que se liga a um epítopo é chamada um parátopo. Um epítopo e um parátopo se ligam com estabilidade através da ação de ligações de hidrogênio, força eletrostática, força van der Waals, ligações hidrofóbicas e similar entre o epítopo e o parátopo. Esta força de ligação entre o epítopo e o pará- topo é chamada afinidade. A soma total de força de ligação quando uma pluralidade de antígenos e uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno se ligam é referida como avidez. Quando um anticorpo compreendendo uma pluralidade de domínios de ligação a antígeno (isto é, anticorpo multivalente) ou similar se liga a uma pluralidade de epítopos, a afinidade age sinergicamente, e então a avidez se torna maior do que a afinidade.

Atividade de ligação

[00148] Exemplos de um método para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R são descritos a seguir. De acordo com os exemplos abaixo, os métodos para avaliar a ligação do epítopo por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno para um antígeno diferente de IL-6R também podem ser conduzidos apropriadamente.

[00149] Por exemplo, pode-se confirmar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo linear na molécula de IL-6R, por exemplo, como mencionado abaixo. Um peptídeo linear que compreende uma sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular de IL-6R é sintetizado para o propósito acima. O peptídeo pode ser sintetizado quimicamente, ou pode ser obtido por técnicas de engenharia genética usando uma região que codifica a sequência de aminoácido que corresponde ao domínio extracelular em um cDNA de IL-6R. Então, uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R é avaliada quanto à sua atividade de ligação a um peptídeo linear que compreende a sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular. Por exemplo, um peptídeo linear imobilizado pode ser usado como um antígeno por ELISA para avaliar a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno com relação ao peptídeo. Alternativamente, a atividade de ligação com relação a um peptídeo linear pode ser avaliada com base no nível com que o peptídeo linear inibe a ligação da molécula de ligação ao antígeno a células que expressam IL-6R. Estes testes podem demonstram a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno com relação ao peptídeo linear.

[00150] Pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo conformacional da seguinte forma. Células que expressam IL-6R são preparadas para o propósito acima. Pode-se determinar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R reconhece um epítopo conformacional quando ela se liga fortemente a células que expressam IL-6R mediante contato, mas não se liga substancialmente a um peptídeo linear imobilizado que compreende uma sequência de aminoácidos que forma o domínio extracelular de IL-6R. Na presente invenção, “não se liga subs-tancialmente” significa que a atividade de ligação é 80% ou menos, geralmente, 50% ou menos, de preferência 30% ou menos, e particularmente, de preferência, 15% ou menos em comparação à atividade de ligação às células que expressam IL-6R humano.

[00151] Os métodos para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R a células que expressam IL-6R incluem, por exemplo, os métodos descritos em Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Espe-cificamente, a avaliação pode ser feita com base no princípio do ELISA ou classificação celular ativada por fluorescência (FACS) (Fluorescence Activated Cell Sorting) usando células que expressam IL-6R como antí- geno.

[00152] No formato ELISA, a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao an- tígeno de IL-6R às células que expressam IL-6R pode ser avaliada quantitativamente comparando os níveis de sinal gerado por reação en- zimática. Especificamente, um complexo polipeptídico de teste é adicionado a uma placa de ELISA sobre a qual as células que expressam IL- 6R são imobilizadas. Então, a molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células é detectada usando um anticorpo marcado com enzima que reconhece a molécula de ligação ao antígeno de teste. Alternativamente, quando FACS é usado, uma série de diluições de uma molécula de ligação ao antígeno de teste é preparada, e o título de ligação do anticorpo para células que expressam IL-6R pode ser determinado para comparar a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno de teste às células que expressam IL-6R.

[00153] A ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste a um antígeno expresso sobre a superfície de células suspensas em tampão ou similares pode ser detectada usando um citômetro de fluxo. Os citômetros de fluxo conhecido incluem, por exemplo, os seguintes dispositivos:

[00154] FACSCanto® II

[00155] FACSAria®

[00156] FACSArray®

[00157] FACSVantage® SE

[00158] FACSCalibur® (todos são nomes comerciais da BD Bioscien ces)

[00159] EPICS ALTRA HyPerSort

[00160] Cytomics FC 500

[00161] EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

[00162] Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (todos são nomes co merciais da Beckman Coulter).

[00163] Os métodos preferenciais para avaliar a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R a um antígeno incluem, por exemplo, o método que segue. Primeiro, células que expressam IL-6R são reagidas com uma molécula de ligação ao antígeno de teste, e, então, elas são tingidas com um anticorpo secundário marcado com FITC que reconhece a molécula de ligação ao antígeno. A molécula de ligação ao an- tígeno de teste é diluída apropriadamente com um tampão adequado para preparar a molécula em uma concentração desejada. Por exemplo, a molécula pode ser usada em uma concentração dentro da faixa de 10 μg/ml a 10 ng/ml. Então, a intensidade de fluorescência e a contagem de células são determinadas usando FACSCalibur (BD). A intensidade de fluorescência é obtida por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o Valor Geométrico Médio reflete a quantidade de anticorpo ligado às células. Ou seja, a atividade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno de teste, que é representada pela quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada, pode ser determinada mediante a medição do Valor Geométrico Médio.

[00164] Pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R compartilha um epítopo comum com outra molécula de ligação ao antígeno com base na competição entre as duas moléculas pelo mesmo epítopo. A competição entre as moléculas de ligação ao antígeno pode ser detectada por um ensaio de bloqueio cruzado ou similares. Por exemplo, o ensaio ELISA competitivo é um ensaio de bloqueio cruzado de preferência.

[00165] Especificamente, em ensaio de bloqueio cruzado, a proteína IL-6R imobilizada aos poços de uma placa de microtitulação é pré-incu- bada na presença ou ausência de uma molécula de ligação ao antígeno competidora candidata e, então, uma molécula de ligação ao antígeno de teste é adicionada a ela. A quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada à proteína IL-6R nos poços está correlacionada indiretamente com a capacidade de ligação de uma molécula de ligação ao antígeno competidora candidata que compete pela ligação ao mesmo epítopo. Ou seja, quanto maior a afinidade da molécula de ligação ao antígeno competidora pelo mesmo epítopo, menor será a atividade de ligação da molécula de ligação ao antígeno de teste aos poços revestidos com a proteína IL-6R.

[00166] A quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada aos poços através da proteína IL-6R pode ser facilmente determinada através de marcação da molécula de ligação ao antígeno ante-cipadamente. Por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno marcada com biotina é medida usando um conjugado de avidina/pero- xidase e um substrato adequado. Em particular, o ensaio de bloqueio cruzado que usa marcadores de enzima como peroxidase é chamado “ensaio ELISA competitivo”. A molécula de ligação ao antígeno também pode ser marcada com outras substâncias de marcação que permitem a detecção ou medição. Especificamente, radiomarcadores, marcadores fluorescentes, e similares, são conhecidos.

[00167] Quando a molécula de ligação ao antígeno competidora candidata pode bloquear a ligação por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao antígeno de IL-6R em pelo menos 20%, de preferência ao menos 20 a 50%, e com mais preferência pelo menos 50% em comparação à atividade de ligação em um experi-mento de controle conduzido na ausência da molécula de ligação ao antígeno competidora, é determinado que a molécula de ligação ao an- tígeno de teste se liga substancialmente ao mesmo epítopo ligado pela molécula de ligação ao antígeno competidora, ou compete pela ligação ao mesmo epítopo.

[00168] Quando a estrutura de um epítopo ligado por uma molécula de ligação ao antígeno de teste contendo um domínio de ligação ao an- tígeno de IL-6R já tiver sido identificada, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao antígeno de teste e controle compartilham um epítopo comum através da comparação das atividades de ligação das duas mo-léculas de ligação ao antígeno a um peptídeo preparado pela introdução de mutações de aminoácido no peptídeo que forma o epítopo.

[00169] Para medir as atividades de ligação acima, por exemplo, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle a um peptídeo linear no qual uma mutação é introduzida são comparadas no formato ELISA acima. Além dos métodos ELISA, a atividade de ligação ao peptídeo mutante ligado a uma coluna pode ser determinada por fazer as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle fluírem na coluna, e, então, quantificar a molécula de ligação ao antígeno eluída na solução de eluição. Os métodos para adsorver um peptídeo mutante para uma coluna, por exemplo, sob a forma de um peptídeo de fusão de GST, são conhecidos.

[00170] Alternativamente, quando o epítopo identificado é um epí- topo conformacional, pode-se avaliar se as moléculas de ligação ao an- tígeno de teste e de controle compartilham um epítopo comum por meio do método que segue. Primeiro, células que expressam IL-6R e células que expressam IL-6R com uma mutação introduzida no epítopo são preparadas. As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são adicionadas a uma suspensão de células preparada por suspensão dessas células em um tampão adequado, como PBS. A seguir, as sus-pensões de células são lavadas apropriadamente com um tampão, e um anticorpo marcado com FITC que reconhece as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle é adicionado a elas. A intensidade de fluorescência e o número de células tingidas com o anticorpo marcado são determinados usando FACSCalibur (BD). As moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle são diluídas apropriadamente usando um tampão adequado e são usadas nas concentrações desejadas. Por exemplo, elas podem ser usadas a uma concentração dentro da faixa de 10 μg/ml a 10 ng/ml. A intensidade de fluorescência é determinada por análise usando programa CELL QUEST (BD), isto é, o Valor Geométrico Médio reflete a quantidade de anticorpo marcado ligado às células. Ou seja, as atividades de ligação das moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle, que são representadas pela quantidade de anticorpo marcado ligado, podem ser determinadas mediante a medição do Valor Geométrico Médio.

[00171] No método acima, pode-se avaliar se uma molécula de ligação ao antígeno “não se liga substancialmente às células que expressam IL-6R mutante”, por exemplo, por meio do seguinte método. Primeiro, as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle ligadas às células que expressam IL-6R mutante são tingidas com um anticorpo marcado. Então, a intensidade de fluorescência das células é determinada. Quando FACSCalibur é usado para a detecção da fluorescência por citometria de fluxo, a intensidade de fluorescência determinada pode ser analisada usando o programa CELL QUEST. A partir dos Valores Geométricos Médios na presença e na ausência do complexo de polipeptídeo, o valor de comparação ^média-Geo) pode ser calculado de acordo com a Fórmula 1 abaixo para determinar a proporção de aumento na intensidade de fluorescência como resultado da ligação pela molécula de ligação ao antígeno. Fórmula 1:

[00172] O valor de comparação da Média Geométrica (valor da Δmé- dia-Geo para a molécula de IL-6R mutante) determinado pela análise acima, que reflete a quantidade de uma molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células que expressam IL-6R mutante, é comparado com o valor de comparação da Δmédia-Geo que reflete a quantidade da molécula de ligação ao antígeno de teste ligada às células que expressam IL-6R. Nesse caso, as concentrações da molécula de ligação ao antígeno de teste usadas para determinar os valores de comparação da Δmédia-Geo para células que expressam IL-6R e células que expressam IL-6R mutante são particularmente de preferência ajustadas para serem iguais ou substancialmente iguais. Uma molécula de ligação ao antígeno que foi confirmada como reconhecendo um epítopo em IL-6R é usada como uma molécula de ligação ao antígeno de controle.

[00173] Se o valor de comparação da Δmédia-Geo de uma molécula de ligação ao antígeno de teste para células que expressam o IL-6R mutante for menor que o valor de comparação da Δmédia-Geo da molécula de ligação ao antígeno de teste para células que expressam IL-6R em pelo menos 80%, de preferência 50%, com mais preferência, 30%, e particularmente, de preferência, 15% então, a molécula de ligação ao antígeno de teste “não se liga substancialmente às células que expressam IL-6R mutante”. A fórmula para determinar o valor da média- Geo (média geométrica) está descrita no guia do usuário do programa CELL QUEST (BD biosciences). Quando a comparação mostra que os valores de comparação são substancialmente equivalentes, pode-se determinar que o epítopo para as moléculas de ligação ao antígeno de teste e de controle é o mesmo.

Tecido Alvo

[00174] O termo “tecido alvo” conforme aqui usado se refere a um tecido contendo células carregando antígenos aos quais as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção se ligam de uma maneira dependente de compostos. Ele é um tecido que fornece efeitos farmacológicos positivos para o organismo carregando o tecido, quando as moléculas de ligação a antígeno se ligam a uma molécula do tipo membrana expressa nas células ou se ligam a uma molécula solúvel presente no tecido. Neste caso, a expressão “efeitos farmacológicos positivos” se refere a efeitos que abrandam, aliviam, melhoram ou curam sintomas causados por sítios patológicos contendo o tecido alvo para o organismo carregando o tecido. Quando os sintomas são causados por tumores malignos tal como câncer, uma modalidade não limitante de um mecanismo que fornece tal efeito farmacológico é, por exemplo, atividade citotóxica e inibição de crescimento contra células de câncer, e imunoestimulação em tecidos cancerosos. No caso de doenças inflamatórias, exemplos de tal modalidade não limitante do mecanismo incluem imunossupressão e atividade em bloquear ações de citocinas inflamatórias em tecidos inflamatórios.

Compostos específicos de tecido canceroso

[00175] O termo “composto específico para um tecido canceroso” conforme aqui usado se refere a um composto diferencialmente presente em tecidos cancerosos comparado com tecidos não cancerosos. Aqui, o termo “câncer” é geralmente usado para descrever neoplasmas malignos, que podem ser metastáticos ou não metastáticos. Exemplos não limitantes de carcinomas desenvolvidos a partir de tecidos epiteliais tal como pele ou trato digestivo incluem tumor cerebral, câncer de pele, câncer de cabeça e pescoço, câncer esofageal, câncer de pulmão, câncer de estômago, câncer duodenal, câncer de mama, câncer de próstata, câncer cervical, câncer endometrial, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer de cólon, câncer de bexiga e câncer de ovário. Exemplos não limitantes de sarcomas desenvolvidos a partir de tecidos não epiteliais (intersticiais) tais como músculos incluem osteos- sarcoma, condrossarcoma, rabdomiossarcoma, leiomiossarcoma, lipos- sarcoma e angiossarcoma. Exemplos não limitantes de câncer hematológico derivado de órgãos hematopoiéticos incluem linfomas malignos incluindo linfoma de Hodgkin e linfoma não Hodgkin; leucemia incluindo leucemia mielocítica aguda ou leucemia mielocítica crônica e leucemia linfática aguda ou leucemia linfática crônica; e mieloma múltiplo. O termo “neoplasma” amplamente usado aqui se refere a qualquer tumor de tecido doente recém-formado. Na presente invenção, neoplasmas causam formação de tumores, que são parcialmente caracterizados por angiogênese. Neoplasmas podem ser benignos tal como hemangioma, glioma ou teratoma ou malignos tal como carcinoma, sarcoma, glioma, astrocitoma, neuroblastoma ou retinoblastoma.

[00176] O termo “tecido canceroso” se refere a um tecido contendo pelo menos uma célula de câncer. Desta maneira, uma vez que tecidos cancerosos contêm células de câncer e vasos sanguíneos, ele se refere a todos os tipos de célula contribuindo para a formação de uma massa de tumor contendo células de câncer e células endoteliais. Aqui, “massa de tumor” se refere a um foco de tecido de tumor. O termo “tumor” é geralmente usado para significar um neoplasma benigno ou um neoplasma maligno.

[00177] Por exemplo, em várias modalidades, compostos específicos de tecido canceroso podem ser compostos definidos por propriedades qualitativas de tecidos cancerosos tal como estando presentes em tecidos cancerosos, mas ausentes em tecidos não cancerosos, ou estando ausentes em tecidos cancerosos, mas presentes em tecidos não cancerosos. Em outras modalidades, compostos específicos de tecido canceroso podem ser compostos definidos por propriedades quantitativas de tecidos cancerosos tal como estando presentes em tecidos cancerosos em uma concentração diferente (por exemplo, concentração maior ou concentração menor) daquela em tecidos não cancerosos. Por exemplo, compostos específicos de tecido cancerosos estão presentes diferencialmente em concentrações arbitrárias. Em geral, compostos específicos de tecido canceroso podem estar presente em uma concentração aumentada em cerca de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 2- vezes, pelo menos 5-vezes, pelo menos 10-vezes, pelo menos 50-ve- zes, pelo menos 100-vezes, pelo menos 103-vezes, pelo menos 104- vezes, pelo menos 105-vezes pelo, menos 106-vezes, ou mais, ou até o infinito (isto é, quando o composto está ausente em tecidos não cancerosos). Alternativamente, eles podem geralmente estar presentes em uma concentração menor em pelo menos pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% (isto é, ausente). Preferivelmente, compostos específicos de tecido canceroso estão diferencialmente presentes em concentrações estatisticamente significantes (isto é, conforme determinado usando ou teste t de Welch ou teste da soma de classificação Wilcoxon, o valor p é menos do que 0,05 e o valor q é menos do que 0,01). Exemplos de uma modalidade não limitante de um composto específico de tecido canceroso incluem compostos que são metabolitos específicos de tecido canceroso produzidos por atividades metabólicas características de células de câncer, células imunes ou células estromais contidas em tecidos cancerosos, tais como aquelas descritas abaixo (me- tabolitos específicos de tecido canceroso, metabolitos específicos de célula cancerosa, metabolitos específicos para células imunes que infiltraram em tecidos cancerosos e metabolitos específicos de célula es- tromal cancerosa).

Metabolitos específicos de tecido canceroso

[00178] O termo “metabolismo” se refere a mudanças químicas que acontecem em tecidos biológicos e incluem “anabolismo” e “catabolismo”. Anabolismo se refere à biossíntese ou acúmulo de moléculas e catabolismo se refere à degradação de moléculas. “Metabolitos” são intermediários ou produtos que se originam do metabolismo. “Metabolitos primários” se refere a metabolitos envolvidos diretamente no processo de crescimento ou proliferação de células ou organismos. “Metabolitos secundários” se refere a produtos que não estão diretamente envolvidos em tais processos de crescimento ou proliferação, e são produtos tais como pigmentos ou antibióticos que são produzidos como um resultado de metabolismo que biossintetiza substâncias que não estão diretamente envolvidas em fenômenos biológicos comuns a células e organismos. Os metabolitos podem ser metabolitos de “biopolímeros” ou eles podem ser metabolitos de “moléculas pequenas”. “Biopolíme- ros” são polímeros compreendendo um ou mais tipos de unidades de repetição. Biopolímeros são geralmente encontrados em sistemas biológicos, e exemplos incluem células formando o organismo e matrizes intercelulares que aderem a elas, moléculas tendo um peso molecular de aproximadamente 5000 ou mais que formam estruturas tais como matrizes intersticiais, particularmente polissacarídeos (carboidratos e similar), peptídeos (este termo é usado de maneira a incluir polipeptídeos e proteínas) e polinucleotídeos e similarmente seus análogos tais como compostos que são compostos de ou incluindo análogos de aminoácido ou grupos não aminoácidos. “Moléculas pequenas” se refere a substâncias químicas naturais que não “biopolímeros” que existem in vivo. Exemplos adequados de uma modalidade não limitante de um metabo- lito específico de tecido canceroso descrito aqui incluem metabolitos de molécula pequena específicos de célula cancerosa (Eva Gottfried, Ka- trin Peter e Marina P. Kreutz, De Molecular to Modular Tumor Therapy (2010) 3 (2), 111-132). Ainda, metabolitos que são altamente produzidos por células imunes que infiltram em tecidos cancerosos e metaboli- tos que são altamente produzidos por células estromais que apoiam a sobrevivência e/ou crescimento de células cancerosas (células cancerosas estromais ou fibroblastos estromais associados a câncer (CAF) (Cancer Associated Stromal Fibroblasts)) estão também incluídos. Células imunes infiltrantes são, por exemplo, células dendríticas, células dendríticas inibidoras, células T inibidoras, células T exauridas e células supressoras derivadas de mieloma (MDSC) (Myeloma Derived Supressor Cells). Ainda, metabolitos da presente invenção incluem compostos liberados do interior das células para o externor das células quando células presentes em tecidos cancerosos (células cancerosas, células imunes ou células estromais) morrem devido à apoptose, necrose ou similar.

[00179] Para identificar metabolitos específicos de célula de câncer, análises metabolômicas que focaram em traçado de perfil metabólico podem ser adequadamente usadas, em adição a análises no nível de transcriptoma (por exemplo, Dhanasekaran e outros (Nature (2001) 412, 822-826), Lapointe e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2004) 101, 811-816) ou Perou e outros (Nature (2000) 406, 747-752)) e análises no nível de proteoma (por exemplo, Ahram e outros (Mol. Carcinog. (2002) 33, 9-15), Hood e outros (Mol. Cell. Proteomics (2005) 4, 1741-1753)). Mais especificamente, para identificar metabolitos em amostras de teste, traçado de perfil metabólico que usa cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) (high-pressure liquid chromatography), ressonância magnética nuclear (NMR) (nuclear magnetic resonance) (Brindle e ou-tros (J. Mol. Recognit. (1997) 10, 182-187), espectrometria de massa (Gates e Sweeley (Clin. Chem. (1978) 24, 1663-1673) (GC/MS e LC/MS)) e ELISA ou similar individualmente e/ou em combinação pode ser usado apropriadamente.

[00180] Esses estudos elucidaram a heterogeneidade dentro dos tumores constituídos que resulta da mudança do gradiente de concentração de fatores de crescimento e metabolitos (glicose, oxigênio ou similar) que permite crescimento de célula cancerosa sob condições de pressão de oxigênio baixa (Dang e Semenza (Trends Biochem. Sci. (1999) 24, 68-72)). Nesses estudos, modelos de linhagem celular são também usados para compreender a mudança em curso de utilização de energia dependendo dos níveis de malignidade diferentes de tumores (Vizan e outros (Cancer Res. (2005) 65, 5512-5515)). Exemplos de uma modalidade não limitante dos componentes técnicos da plataforma metabolômica incluem extração da amostra, separação, detecção, análise espectroscópica, normalização de dados, descrição de metabolitos específicos de classe, mapeamento de curso, confirmação e caracterização funcional de metabolismos candidatos descritos por Lawton e outros (Pharmacogenomics (2008) 9, 383). Esses métodos permitem identificação de metabolitos específicos de célula cancerosa em tecidos cancerosos desejados.

[00181] Exemplos de uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido canceroso ou metabolitos específicos de tecido canceroso usados na presente invenção incluem preferivelmente pelo menos um composto selecionado dos compostos abaixo. Pelo menos um composto significa que em adição a casos onde a atividade de ligação a antígeno de um mesmo domínio de ligação a antígeno descrito abaixo depende de um tipo de composto específico de tecido canceroso ou metabolito, casos onde ela depende de vários tipos de compostos específicos de tecido canceroso ou metabolito estão incluídos. (1) Metabolitos primários do ciclo Krebs ou do sistema glicolítico tais como ácido láctico, ácido succínico e ácido cítrico

[00182] Exemplos preferidos de uma modalidade não limitante de um composto específico de tecido canceroso, particularmente um metabo- lito específico de célula cancerosa, usado na presente invenção incluem metabolitos primários tais como ácido láctico, ácido succínico e ácido cítrico, que são produzidos como um resultado de metabolismo de glicose, e estão presentes em concentrações maiores em tecidos cancerosos comparado com seus tecidos não cancerosos circundantes. O fe- nótipo do sistema glicolítico, que é caracterizado como uma suprarregu- lagem de enzimas do sistema glicolítico (curso Embden-Meyerhof) tais como piruvato cinase, hexocinase e ácido láctico desidrogenase (LDH) (Lactic Acid Dehydrogenase), tem sido convencionalmente conhecido ser uma característica de tumores sólidos como efeito Warburg.

[00183] Isto é, em células de tumor, expressão alta de isoforma de piruvato cinase M2 que é necessária para glicólise anaeróbica, e não isoforma M1, é considerada estar trabalhando vantajosamente para o crescimento de células de tumor in vivo (Christofk e outros (Nature (2008) 452, 230-233). Ácido pirúvico produzido pela piruvato cinase á submetido à inibição de feedback por ácido láctico produzido como um resultado de reação de equilíbrio por ácido láctico desidrogenase (LDH) sob condições anaeróbicas. Uma vez que a inibição de feedback causa promoção de respiração em mitocôndria (ciclo Krebs) e inibição de crescimento celular, suprarregulagem de LDH, hexocinase e transportador de glicose (GLUT) é dita desempenhar um papel importante em proliferação de células de câncer (Fantin e outros (Cancer Cell (2006) 9, 425434)). A glicose é metabolizada pelo sistema glicolítico, e o ácido láctico metabólico final é transportado junto com prótons para os arredores do tumor, e como resultado, o pH dos tecidos circundando o tumor é dito se tornar ácido. Ácido láctico, que é o produto final do curso glicolítico, bem como ácido succínico e ácido cítrico produzidos pela promoção de respiração em mitocôndria são conhecidos ser acumulados em tecidos cancerosos (Teresa e outros (Mol. Cancer (2009) 8, 41-59)). Exemplos de uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido canceroso, particularmente metabolitos específicos de célula cancerosa, usados na presente invenção incluem preferivelmente metabolitos primários tais como ácido láctico, ácido succínico e ácido cítrico produzidos por metabolismo pelo curso glicolítico. Ainda, ácido succínico que está presente em alta concentração em células é conhecido vazar para o exterior das células quando da morte celular (Nature Immunology (2008) 9, 1261-1269). Desta maneira, a concentração de ácido succí- nico é pensada ser aumentada em tecidos cancerosos onde morte celular ocorre frequentemente. (2) Aminoácidos tais como alanina, ácido glutâmico e ácido aspártico

[00184] Além do metabolismo de glicose mencionado acima, o metabolismo de aminoácido é também conhecido ser alterado em células de tumor que requerem fornecimento contínuo de aminoácidos essenciais e aminoácidos não essenciais que são necessários para a biossíntese de biopolímeros sob condições anaeróbicas. Glutamina que contém dois nitrogênios em sua cadeia lateral age como um transportador de nitrogênio, e é um aminoácido que é mais amplamente distribuído em um organismo. Células de tumor, onde a taxa de absorção de gluta- mina em células é aumentada, são ditas estar funcionando como uma armadilha de glutamina. Tal aumento na absorção de glutamina e atividade de conversão em ácido glutâmico e ácido láctico é chamada “glu- taminólise” e é considerada ser uma característica de células transformadas (tumor) (Mazurek e Eigenbrodt (Anticancer Res. (2003) 23, 11491154); e Mazurek e outros (J. Cell. Physiol. (1999) 181, 136-146)). Como um resultado, pacientes com câncer mostram um aumento em concentração de ácido glutâmico enquanto mostrando uma diminuição em nível de glutamina no plasma (Droge e outros (Immunobiology (1987) 174, 473-479)). Ainda, correlação foi observada entre concentrações de ácido succínico marcado com 13C, alanina marcada com 13C, ácido glu- tâmico marcado com 13C e ácido cítrico marcado com 13C em estudos sobre metabolismo de glicose radiomarcada com 13C em tecidos cancerosos de pulmão. Exemplos adequados de uma modalidade não limi- tante de compostos específicos de tecido canceroso usados na presente invenção incluem alanina, ácido glutâmico e ácido aspártico que acumulam em altas concentrações em tecidos cancerosos através de glutaminólise e similar. (3) Metabolito de aminoácido tal como quinurenina

[00185] Indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) é uma enzima de metabo- lização de triptofano que é altamente expressa em muitos cânceres tais como melanoma, câncer de cólon e câncer de rim (Uyttenhove e outros (Nat. Med. (2003) 9, 1269-127)); e é conhecida por ter duas isoformas (Lob e outros (Cancer Immunol. Immunother. (2009) 58, 153-157)). IDO catalisa a conversão de triptofano em quinurenina (mostrada como Composto 1) e é a primeira enzima no curso de novo de nucleotídeo nicotinamida (NAD). Ainda, em glioma que não expressa IDO, quinure- nina é produzida a partir de triptofano por triptofano 2,3-dioxigenase (TDO) no fígado (Opitz e outros (Nature (2011) 478, 7368, 197-203)). IDO é também expressa em células dendríticas infiltradas em tecidos cancerosos, e células dendríticas produzidas por quinurenina (J. Immunol. (2008) 181, 5396-5404). IDO é também expressa em células supressoras derivadas de mieloide (MDSC) em tecidos cancerosos e MDSC também produz quinurenina (Yu e outros (J. Immunol. (2013) 190, 3783-3797)).

[00186] A quinurenina é conhecida suprimir o mesmo tipo de resposta de célula T (Frumento e outros (J. Exp. Med. (2002) 196, 459468); e um mecanismo foi sugerido, onde células de tumor evadem as respostas imunes antitumor através de tal inibição, e proliferação de células glioma é promovida através de um mecanismo de proliferação au- tócrino onde quinurenina age como um ligante endógeno para o receptor de hidrocarboneto de arila expressão em gliomas (Optiz e outros (mencionado acima)). A quinurenina é convertida em ácido antranílico (mostrado como Composto 2) através de quinurenidase e em 3-hidroxi- quinurenina (mostrado como Composto 3) através de quinurenina 3-hi- droxilase. Ácido antranílico e 3-hidroxiquinurenina são ambos convertidos em ácido 3-hidroxiantranílico, o precursor de NAD.

[00187] A quinurenina é convertida em ácido quinurênico (mostrado como Composto 4) através de quinurenina aminotransferase. Exemplos de uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido canceroso, particularmente metabolitos específicos de célula de câncer, usados na presente invenção incluem preferivelmente metabolitos de aminoácido tais como quinurenina e seus metabolitos tais como ácido antranílico, 3-hidroxiquinurenina e ácido quinurênico. Composto 4 (4) Metabolitos de ácido araquidônico tal como prostaglandina E2

[00188] A prostaglandina E2 (PGE2) (Composto 5) é um metabolito de ácido araquidônico chamado um prostanoide, que inclui tromboxana e prostaglandina com síntese por ciclooxigenase (COX)-1/2 (Warner e Mitchell (FASEB J. (2004) 18, 790-804)). PGE2 promove a proliferação de células de câncer de cólon e suprime sua apoptose (Sheng e outros (Cancer Res. (1998) 58, 362-366)). A expressão de ciclooxigenase é conhecida ser alterada em muitas células cancerosas. Mais especificamente, enquanto COX-1 é expressa constitutivamente em quase todos os tecidos, COX-2 foi verificada ser induzida principalmente por certos tipos de citocinas inflamatórias e genes de câncer em tumores (Warner e Mitchel (mencionado acima)). Ainda, superexpressão de COX-2 foi relatada estar relacionada com prognóstico ruim para câncer de mama (Denkert e outros (Clin. Breast Cancer (2004) 4, 428-433)) e progressão de doença rápida para câncer ovariano (Denker e outros (Mod. Pathol. (2006) 19, 1261-1269)). Células T inibidoras que infiltraram em tecidos cancerosos também produzem prostaglandina E2 (Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223). Moléculas pequenas tais como os metabolitos de ácido araquidônico prostaglandina e leucotrienos são conhecidas agir como um fator estimulante que regula crescimento autócrino e/ou parácrino de câncer (Nat. Rev. Cancer (2012) 12 (11) 782-792). Exemplos de uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido canceroso usados na presente invenção, particularmente metabo- litos específicos de célula cancerosa e metabolitos específicos de célula imune que infiltraram em tecidos cancerosos, incluem preferivelmente metabolitos de ácido araquidônico tal como prostaglandina E2. Além da prostaglandina E2, produção de tromboxana A2 (TXA2) é aumentada em tecidos cancerosos tais como tecidos cancerosos colorretais (J. Lab. Clin. Med. (1993) 122, 518-523) e tromboxana A2 pode ser adequadamente apresentada como uma modalidade não limitante de um metabo- lito de ácido araquidônico da presente invenção. (5) Nucleosídeos carregando uma estrutura de anel purina tais como adenosina, trifosfato de adenosina (ATP), difosfato de adenosina (ADP) e monofosfatos de adenosina (AMP)

[00189] Quando células cancerosas sofrem morte celular, uma grande quantidade de ATP na célula é conhecida vazar para o exterior das células. Desta maneira, a concentração de ATP é notadamente maior em tecidos cancerosos do que em tecidos normais (PLoS One. (2008) 3, e2599). Tipos múltiplos de célula liberam nucleotídeos de ade- nina na forma de ATP, ADP e AMP. Metabolismo acontece através de uma enzima extracelular sobre a superfície celular tal como 5’-nucleoti- dase extracelular (ecto-5’-nucleotidase) (CD73) (Resta e Thompson (Immunol. Rev. (1998) 161, 95-109) e Sadej e outros (Melanoma Res. (2006) 16, 213-222). A adenosina é um nucleosídeo de purina que existe constitutivamente em concentração baixa no ambiente extracelu- lar, mas em tecidos hipóxicos encontrados em cânceres sólidos, um aumento notável na concentração de adenosina extracelular foi relatado (Blay e Hoskin (Cancer Res. (1997) 57, 2602-2605). CD73 é expresso na superfície de células imunes e tumores (Kobie e outros (J. Immunol. (2006) 177, 6780-6786)) e sua atividade foi verificada ser aumentada em câncer de mama (Canbolat e outros (Breast Cancer Res. Treat. (1996) 37, 189-193)), câncer de estômago (Durak e outros (Cancer Lett. (1994) 84, 199-202)), câncer pancreático (Flocke e Mannherz (Biochim. Biophys. Acta (1991) 1076, 273-281) e glioblastoma (Bardot e outros (Br. J. Cancer (1994) 70, 212-218)). Foi proposto que o acúmulo de ade- nosina em tecidos cancerosos pode ser causado por um aumento na produção de adenosina intracelular através de desfosforilação de AMP por 5’-nucleotidase no citoplasma (Headrick e Willis (Biochem. J. (1989) 261, 541-550)). Ainda, células T inibidoras e similar que infiltraram em tecidos cancerosos também expressam ATPase e produzem adenosina (Proc. Natl. Acad. Sci. (2006) 103 (35), 13132-13137; Curr. Med. Chem. (2011) 18, 5217-5223). A adenosina produzida é considerada estar fornecendo ao tecido canceroso um ambiente imunossupressivo através de receptores de adenosina tal como o receptor A2A (Curr. Med. Chem. (2011), 18, 5217-23). Exemplos de uma modalidade não limitante do composto específico de tecido canceroso usado na presente invenção incluem preferivelmente ATP, ADP, AMP e adenosina que acumulam em alta concentração em tecidos cancerosos através de metabolismo de nucleotídeos de purina tal como ATP. Ainda, uma vez que adenosina é degradada para inosina através de adenosina desaminase, inosina acumula em concentração alta. (6) Ácido úrico

[00190] Ácido úrico é um produto do curso metabólico de nucleosí- deos de purina in vivo e é liberado para o exterior de células tal como o espaço intersticial e sangue. No últimos anos, ele foi verificado ser liberado a partir de células mortas que estão presentes em sítios de lesões tais como tecidos cancerosos (Nat. Med. (2007) 13, 851-856). Exemplos de uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido canceroso usados na presente invenção incluem preferivelmente ácido úrico que acumula em concentração alta em tecidos cancerosos devido a metabolismo de nucleotídeos de purina tal como ATP. (7) 1-Metil nicotinamida

[00191] A enzima nicotinamida N-metil transferase é conhecida ser altamente expressa em vários tecidos cancerosos humanos. Quando esta enzima produz o metabólito estável 1-metilnicotinamida de nicoti- namida, o grupo metila de S-adenosilmetionina (SAM) que serve como um doador de metila é consumido; desta maneira, a expressão alta de nicotinamida N-metiltransferase foi sugerida contribuir para tumorigê- nese através de um mecanismo que prejudica a habilidade de metilação de DNA acompanhando uma diminuição na concentração de SAM em células cancerosas (Ulanovskaya e outros (Nat. Chem. Biol. (2013) 9 (5) 300-306)). O metabolito estável desta enzima, 1-metilnicotinamida, é conhecido ser secretado para o exterior de células cancerosas (Yamada e outros (J. Nutr. Sci. Vitaminol. (2010) 56, 83-86), e exemplos preferidos de uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido usados na presente invenção incluem 1-metilnicotinamida e similar que acumulam em concentração alta em tecidos cancerosos através de metabolismo de nicotinamida. Compostos específicos de tecido inflamatório

[00192] O termo “composto específico para tecido inflamatório” conforme aqui usado se refere a um composto que está presente diferencialmente em tecidos inflamatórios comparado com tecidos não inflamatórios. Aqui, exemplos adequados de “tecidos inflamatórios” incluem: juntas com artrite reumatoide ou osteoartrite; pulmões (alvéolos) com asma brônquica ou COPD; órgãos digestivos de doença intestinal inflamatória, doença de Crohn ou colite ulcerativa; tecidos fibróticos de fibrose do fígado, rim ou pulmão; tecidos sofrendo reação de rejeição em transplante de órgão; vasos sanguíneos e coração (miocárdio) em arteriosclerose ou falência cardíaca; gordura visceral em síndrome metabólica; tecidos de pele em dermatite atópica ou outra dermatite; e nervos espinhais em herniação de disco ou dor nas costas crônica. Metabolitos específicos de tecido inflamatório

[00193] “Metabolito específico de tecido inflamatório” se refere a me- tabolitos altamente produzidos por células imunes que infiltraram em te-cidos inflamatórios e metabolitos altamente produzidos por células especificamente normais que foram danificadas em tecidos inflamatórios. Exemplos de células imunes infiltrantes incluem células T efetoras, células dendríticas maduras, neutrófilos, células granulares (mastócitos) e basófilos. Ainda, metabolitos na presente invenção incluem compostos que são liberados do interior das células para o exterior das células quando as células que estão presentes em tecidos inflamatórios (células imunes e células normais) morrem através de apoptose, necrose ou similar.

[00194] Exemplos de uma modalidade não limitante dos compostos específicos de tecido inflamatórios ou metabolitos específicos de tecido inflamatório usados na presente invenção incluem preferivelmente pelo menos um composto selecionado dos compostos abaixo. Pelo menos um composto significa incluir casos onde a atividade de ligação a antí- geno de um mesmo domínio de ligação a antígeno descrito abaixo depende do tipo de composto específico de tecido inflamatório ou metabo- lito, bem como casos onde depende de vários tipos de compostos específicos de tecido inflamatório ou metabolitos. (1) Metabolitos de ácido araquidônico tal como prostaglandina E2

[00195] A concentração de PGE2 é conhecida ser alta em artrite reu- matoide e osteoartrite (Eur. J. Clin. Pharmacol. (1994) 46, 3-7.; Clin. Exp. Rheumatol. (1999) 17, 151-160; Am. J. Vet. Res. (2004) 65, 12691275). Exemplos de uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido inflamatórios, particularmente metabolitos específicos de tecido inflamatórios e metabolitos específicos para células imunes que infiltram em tecidos inflamatórios usados na presente invenção in-cluem preferivelmente metabolitos de ácido araquidônico tal como pros- taglandina E2. (2) Nucleosídeos carregando uma estrutura de anel purina tais como adenosina, trifosfato de adenosina (ATP), difosfato de adenosina (ADP) e monofosfatos de adenosina (AMP)

[00196] A concentração de ATP é conhecida por ser alta em alvéolos pulmonares onde inflamação causada por asma brônquica está acontecendo (Nat. Med. (2007) 13, 913-919). A concentração de ATP é também conhecida ser alta em alvéolos pulmonares onde inflamação causada por COPD está acontecendo (Am. J. Respir. Crit. Care Med. (2010) 181, 928-934). Ainda, a concentração de adenosina foi observada ser alta no fluido de junta de pacientes com artrite reumatoide (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2004) 36, 877-882). Ainda, concentração de ATP é conhecida ser alta em tecidos onde uma reação de rejeição está acontecendo devido a GVHD (Nat. Med. (2010) 16, 1434-1438). A concentração de adenosina é conhecida ser aumentada em tecidos fibróticos do fígado, rim e pulmão (FASEB J. (2008) 22, 2263-2273; J. Immunol. (2006) 176,4449-4458; J. Am. Soc. Nephrol. (2011) 22 (5), 890-901; PLoS ONE J. (2010) 5 (2), e9242). Ainda, a concentração de ATP foi observada ser aumentada em tecidos fibróticos de pacientes com fibrose pulmonar (Am. J. Respir. Crit. Care Med. (2010) 182, 774-783). Exemplos de uma modalidade não limitante de um composto específico de tecido inflamatório usado na presente invenção incluem adequadamente ATP, ADP, AMP, adenosina e similar que acumulam em concentração alta em tecidos inflamatórios através de metabolismo de tais nucleotídeos de purina tal como ATP. Ainda, inosina acumula em concentração alta devido à degradação de adenosina por adenosina de- saminase para produzir inosina. (3) Ácido úrico

[00197] Ácido úrico é um produto do curso metabólico de nucleosí- deos de purina in vivo e é liberado para o exterior de células tal como o espaço intersticial e sangue. Nos últimos anos, ácido úrico liberado de células sofrendo necrose foi verificado promover resposta inflamatória (J. Clin. Invest. (2010) 120 (6), 1939-1949). Exemplos de uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido inflamatório a serem usados na presente invenção incluem adequadamente ácido úrico que acumula em concentração alta em tecidos inflamatórios devido a metabolismo de nucleotídeos de purina tal como ATP. Domínio de Ligação de Antígeno

[00198] Na presente invenção, um “domínio de ligação ao antígeno” pode ter qualquer estrutura contanto que ele se ligue a um antígeno de interesse. Tais domínios incluem, de preferência, por exemplo:

[00199] regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo;

[00200] um módulo de cerca de 35 aminoácidos chamado domínio A que está contido na proteína de membrana celular in vivo Avímero (Publicação Internacional No. WO 2004/044011, Publicação Internacional No. WO 2005/040229);

[00201] Adnectina contendo o domínio 10Fn3 que se liga à porção de proteína da fibronectina, uma glicoproteína expressa sobre a membrana ce-lular (WO 2002/032925);

[00202] Aficorpo que é composto por um feixe de três hélices com 58 aminoácidos com base na estrutura do domínio de ligação à IgG da proteína A (Publicação Internacional No. WO 1995/001937);

[00203] Proteínas de Repetição de Anquirina Projetadas (DARPins) (Design Ankyrin Repeat Proteins) que são uma região exposta na superfície molecular das repetições de anquirina (AR) (Ankyrin Repeat) que têm uma estrutura na qual uma subunidade que consiste em uma volta compreendendo 33 resíduos de aminoácido, duas hélices antipa- ralelas e um laço é repetidamente empilhada (Publicação Internacional No. WO 2002/020565);

[00204] Anticalinas e similares, que são domínios que consistem em quatro laços que suportam um lado de uma estrutura de barril composta por oito fitas antiparalelas dispostas circularmente que são altamente con-servadas entre as moléculas de lipocalina tal como lipocalina associada à gelatinase de neutrófilo (NGAL) (Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin) (Publicação Internacional No. WO 2003/029462); e

[00205] A região côncava formada pela estrutura de folha paralela dentro da estrutura com formato de ferradura constituída por repetições empi-lhadas do módulo de repetições ricas em leucina (LRR) do receptor de linfócito variável (VLR) que não tem a estrutura da imunoglobulina e é usada no sistema de imunidade adquirida em vertebrados sem mandíbulas como o peixe lampery e congro (Publicação Internacional No. WO 2008/016854). Os domínios de ligação ao antígeno preferenciais da presente invenção incluem, por exemplo, aqueles tendo regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo. Os exemplos preferenciais de domínios de ligação ao antígeno incluem “Fv de cadeia única (scFv)”, “anticorpo de cadeia única”, “Fv”, “Fv 2 de cadeia úni-ca (scFv2)”, “Fab”, e “F(ab’)2”.

[00206] Os domínios de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção podem se ligar a um epítopo idêntico. Tal epítopo idêntico pode estar presente, por exemplo, em uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Alternativamente, cada um dos domínios de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção pode se ligar a um epítopo diferente. Aqui, o epítopo diferente pode estar presente em, por exemplo, uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

Especificidade

[00207] “Específico” significa que uma das moléculas que se liga especificamente não se liga substancialmente a moléculas que não a única ou pluralidade de moléculas contrapartes que ela se liga. Ainda, “específico” é também usado quando um domínio de ligação a antígeno é específico para um epítopo particular dentre epítopos múltiplos em um antígeno. Quando um epítopo ligado por um domínio de ligação a antí- geno está contido em antígenos diferentes múltiplos, moléculas de ligação a antígeno contendo o domínio de ligação a antígeno podem se ligar a vários antígenos que têm o epítopo. Aqui “não se liga substancialmente” é determinado de acordo com o método descrito na seção mencionada acima sobre atividade de ligação, e se refere à atividade de ligação de uma molécula que se liga especificamente a uma molécula que não a molécula contraparte, onde a atividade de ligação não é mais do que 80%, normalmente não mais do que 50%, preferivelmente não mais do que 30% ou particularmente preferivelmente não mais do que 15% da atividade de ligação com sua molécula contraparte.

Atividade citotóxica

[00208] Em uma modalidade não limitante, a presente invenção provê moléculas de ligação a antígeno que compreendem um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido canceroso, e que tem atividade citotóxica contra células expressando uma molécula do tipo membrana em sua membrana celular; e composições farmacêuticas compreendendo essas moléculas de ligação a antígeno como um ingrediente ativo. Na presente invenção, atividade citotóxica inclui, por exemplo, atividade de citotoxidez mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), atividade de citotoxidez dependente de complemento (CDC) e atividade citotóxica por células T. Na presente invenção, atividade de CDC se refere à atividade citotóxica pelo sistema de complemento. Por outro lado, atividade de ADCC se refere à atividade de células imunes para danificar células alvo quando as células imunes e similar se ligam à região Fc de moléculas de ligação a antí- geno compreendendo um domínio de ligação a antígeno que se liga a uma molécula do tipo membrana expressa na membrana celular de cé-lulas alvo através de um receptor de FCY expresso nas células imunes. Se uma molécula de ligação a antígeno de interesse tem uma atividade de ADCC ou se ela tem uma atividade de CDC pode ser determinado usando métodos conhecidos (por exemplo, Current Protocols in Immunology, Capítulo 7. Immunologic studies in humans, Editor, Coligan e outros (1993)).

[00209] Especificamente, células efetoras, solução de complemento e células alvos são primeiro preparadas. (1) Preparação de células efetoras

[00210] O baço é removido de um camundongo CBA/N ou similar e as células do baço são dispersas em um meio RPMI1640 (Invitrogen). Após as células serem lavadas no mesmo meio contendo soro bovino fetal 10% (FBS, HyClone), células efetoras são preparadas ajustando a concentração de célula do baço para 5 x 106 /mL. (2) Preparação de solução de complemento

[00211] Complemento de Coelho Bebê (CEDARLANE) é diluído 10 vezes em um meio de cultura (Invitrogen) contendo FBS 10% para preparar uma solução de complemento. (3) Preparação de células alvo

[00212] As células alvo podem ser radioativamente marcadas através de cultura de células expressando o antígeno com 0,2 mCi de cro- mato de sódio 51Cr (GE Healthcare Bio-Sciences) em um meio DMEM contendo FBS 10% por uma hora a 37° C. Após marcação radioativa, as células são lavada três vezes em um meio RPMI1640 contendo FBS 10% e as células alvo podem ser preparadas ajustando a concentração de célula para 2 x 105 /mL.

[00213] Atividade de ADCC ou atividade de CDC pode ser medida através do método descrito abaixo. No caso de medição de atividade de ADCC, 50 μL de cada uma da célula alvo e da molécula de ligação a antígeno são adicionados a uma placa de fundo em U de 96 cavidades (Becton Dickinson) e deixados reagir por 15 minutos em temperatura ambiente. Então, 100 μL de células efetoras são adicionados à placa e esta placa é posta em uma incubadora de dióxido de carbono por quatro horas. A concentração final da molécula de ligação a antígeno pode ser ajustada, por exemplo, para 0 μg/mL ou 10 μg/mL. Após incubação, 100 μL do sobrenadante são coletados de cada cavidade, e a radioatividade é medida com um contador gama (COBRAII AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company). A atividade citotóxica (%) pode ser calculada usando os valores medidos de acordo com a equação: (AC) / (B-C) x 100. A representa a radioatividade (cpm) em cada amostra, B representa a radioatividade (cpm) em uma amostra à qual NP-40 1% (Nacalai Tesque) foi adicionado e C representa a radioatividade (cpm) de uma amostra contendo as células alvo sozinhas.

[00214] Entretanto, no caso de medição de atividade de CDC, 50 μL de célula alvo e 50 μL de uma molécula de ligação a antígeno são adicionados a uma placa de fundo plano de 96 cavidades (Becton Dickinson) e deixados reagir por 15 minutos em gelo. Então, 100 μL de uma solução de complemento são adicionados à placa e esta placa é posta em uma incubadora de dióxido de carbono por quatro horas. A concentração final da molécula de ligação a antígeno pode ser ajustada, por exemplo, para 0 μg/mL ou 3 μg/mL. Após incubação, 100 μL de sobre- nadante são coletados de cada cavidade e a radioatividade é medida com um contador gama. A atividade citotóxica pode ser calculada da mesma maneira que na determinação da atividade de ADCC.

[00215] As moléculas de ligação a antígeno modificadas descritas por último às quais substâncias citotóxicas tais como agentes quimiote- rapêuticos, peptídeos tóxicos ou substâncias químicas radioativas foram ligados podem ser também adequadamente usadas como as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção tendo atividade ci- totóxica. Tais moléculas de ligação a antígeno modificadas (daqui em diante referidas como “conjugado de molécula de ligação a antígeno- fármaco”) podem ser obtidas modificando quimicamente as moléculas de ligação a antígeno obtidas. Métodos que já foram estabelecidos no campo de conjugados de anticorpo-fármaco e similar podem ser usados apropriadamente como um método para modificação de moléculas de ligação a antígeno. Ainda, uma molécula de ligação a antígeno modifi-cada com um peptídeo tóxico ligado pode ser obtida expressando em uma célula hospedeiro apropriada um gene de fusão produzido através de ligação de um gene codificando o peptídeo tóxico em estrutura com um gene codificando uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção e então isolando a molécula da solução de cultura das células.

Atividade de neutralização

[00216] A presente invenção provê em uma modalidade não limitante uma composição farmacêutica que induz uma resposta imune, compre-endendo como um ingrediente ativo uma molécula de ligação a antígeno que contém um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido canceroso e tem uma atividade de neutralização contra uma molécula do tipo membrana. Em outra modalidade não limitante, a presente invenção provê uma composição farmacêutica que induz uma resposta imune, compreendendo como um ingrediente ativo uma molécula de ligação a antígeno que contém um domínio de ligação a antí- geno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido canceroso e tem uma atividade de neutralização contra uma molécula do tipo membrana em adição a uma atividade citotóxica contra células expressando a molécula do tipo membrana em sua membrana celular. Em geral, uma atividade de neutralização se refere a uma atividade de inibição da atividade biológica de um ligante que tem uma atividade biológica com relação a células, tais como vírus e toxinas. Desta maneira, uma substância tendo uma atividade de neutralização se refere a uma substância que se liga a um ligante ou um receptor ao qual o ligante se liga e inibe a ligação entre o ligante e o receptor. Um receptor cuja ligação ao ligante foi bloqueada pela atividade de neutralização não será capaz de exibir a atividade biológica através do receptor. Quando a molécula de ligação a an- tígeno é um anticorpo, o anticorpo tendo tal atividade de neutralização é geralmente chamado um anticorpo de neutralização. A atividade de neutralização de uma substância de teste pode ser medida comparando as atividades biológicas na presença de um ligante entre condições quando a substância de teste está presente ou ausente.

[00217] Um exemplo adequado de um ligante principal para o receptor de IL-6 é IL-6, que é mostrada na SEQ ID NO: 27. O receptor de IL- 6, que é uma proteína de membrana tipo I cujo terminal amino forma o domínio extracelular, forma um hetero-tetrâmero com o receptor gp130 que foi induzido por IL-6 dimerizar (Heinrich e outros (Biochem. J. (1998) 334, 297-314)). Formação do heterotetrâmero ativa Jak associada com o receptor gp130. Jak realiza autofosforilação e fosforilação de receptor. Os sítios de fosforilação do receptor e de Jak servem como sítios de ligação para moléculas pertencentes à família Stat tendo SH2 tal como Stat3 e para as MAP cinases, PI3/Akt, e outras proteínas e adaptadores tendo SH2. Em seguida, Stat que se ligou ao receptor gp130 é fosfori- lada por Jak. A Stat fosforilada dimeriza e se desloca para o núcleo e regula a transcrição de genes alvo. Jak e Stat podem também estar envolvidas na cascata de sinalização através de receptores de outras classes. Uma cascata de sinalização de IL-6 desregulada é observada em inflamação e condições patológicas de doenças autoimunes e cânceres tais como câncer de próstata e mieloma múltiplo. Stat3 que pode agir como um oncogene é constitutivamente ativada em muitos cânceres. Em câncer de próstata e mieloma múltiplo, há uma ligação entre a cascata de sinalização do receptor de IL-6 e a cascata de sinalização de membros da família de receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR) (Epidermal Growth Factor Receptor) (Ishikawa e outros (J. Clin. Exp. Hematopathol. (2006) 46 (2), 55-66)).

[00218] Tais cascatas de sinalização intracelular são diferentes para cada tipo de célula; desta maneira, uma molécula alvo apropriada pode ser ajustada de acordo com cada uma das células alvo de interesse, e a molécula alvo não é limitada aos fatores mencionados acima. A atividade de neutralização pode ser avaliada através da medição da ativação de sinal in vivo. Ainda, ativação de sinais in vivo pode ser também detectada usando como um indicador a ação de indução de transcrição em um gene alvo que existe a jusante da cascata de sinalização in vivo. Uma mudança na atividade de transcrição de um gene alvo pode ser detectada através do princípio de um ensaio de repórter. Especificamente, um gene repórter tal como a proteína verde fluorescente (GFP) ou luciferase é posto a jusante de um fator de transcrição ou uma região promotora do gene alvo; e uma mudança em atividade de transcrição pode ser medida em termos de atividade de repórter através da medição da atividade repórter. Estojos comercialmente disponíveis para medição da atividade de sinal in vivo podem ser adequadamente usados (por exemplo, o Mercury Pathway Profiling Luciferase System (Clontech)).

[00219] Ainda, como um método para medição da atividade de neutralização em um ligante de receptor na família de receptor de EGF e similar que age em uma cascata de sinalização que tipicamente funciona com relação ao aumento da proliferação celular, atividade de neutralização de uma molécula de ligação a antígeno pode ser avaliada através da medição da atividade de proliferação das células alvo. Por exemplo, o método que segue é adequadamente usado como um método para medição ou avaliação de efeitos inibidores com base na atividade de neutralização de um anticorpo anti-HB-EGF contra a proliferação de células cuja proliferação é promovida pelos fatores de cresci-mento da família EGF tal como HB-EGF. Como um método para avaliação ou medição da atividade de inibição de proliferação celular em um tubo de teste, um método que mede a incorporação por células vivas de timidina marcada com [3H] adicionada ao meio de cultura como um índice da habilidade de replicação de DNA é usado. Como um método mais conveniente, um método de exclusão de corante que mede sob um microscópio a habilidade de uma célula em liberar um corante tal como azul tripano para o exterior da célula ou o método MTT é usado. O último faz uso da habilidade de células vivas em converter brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT), que é um sal de tetrazólio, em um produto de azul formazano. Mais especificamente, um anticorpo de teste é adicionado junto com um ligante à solução de cultura de uma célula de teste; e após um certo período de tempo ter decorrido, uma solução de MTT é adicionada à cultura e esta é deixada descansar por uma certa quantidade de tempo para deixar a célula incorporar MTT. Como resultado, MTT que é um composto amarelo é convertido em um composto azul através de succinato desidrogenase na mitocôndria da célula. Após este produto azul ser dissolvido para coloração, sua absorbância é medida e usada como um indicador do número de células viáveis. Além de MTT, reagentes tais como MTS, XTT, WST-1 e WST-8 estão também comercialmente disponíveis (Nacalai Tesque e similar) e podem ser adequadamente usados. Para medição da atividade, um anticorpo de ligação que tem o mesmo isotipo que o anticorpo anti-HB-EGF, mas não tem a atividade de inibição de proliferação, pode ser usado como um anticorpo controle da mesma maneira que o anticorpo anti-HB-EGF, e o anticorpo anti-HB-EGF é julgado ter a atividade quando ele mostra uma atividade de inibição de proliferação de célula mais forte do que o anticorpo controle.

[00220] Como células para avaliação de atividade, por exemplo, células mostrando proliferação promovida por HG-EGF tal como a linhagem de célula RMG-1 que é uma linhagem de célula de câncer de ovário podem ser adequadamente usadas; e células Ba/F3 de camundongo transformadas com um vetor onde um gene codificando hEGFR/mG- CSFR, que é uma proteína de fusão do domínio extracelular de EGFR humano fundido em estrutura com o domínio extracelular do receptor de G-CSF de camundongo, é ligado de maneira a permitir expressão, podem ser também adequadamente usadas. Desta maneira, aqueles versados na técnica podem apropriadamente selecionar células para ava-liação de atividade para medir a atividade de proliferação celular mencionada acima.

Anticorpo

[00221] Na presente invenção, “anticorpo” se refere a uma imunoglobulina natural ou uma imunoglobulina produzida por síntese parcial ou completa. Os anticorpos podem ser isolados de fontes naturais como plasma e soro de ocorrência natural ou sobrenadantes de cultura de hibridomas produtores de anticorpo. Alternativamente, os anticorpos podem ser sintetizados parcial ou completamente usando técnicas tal como recombinação genética. Os anticorpos preferenciais incluem, por exemplo, anticorpos de um isotipo ou subclasse de imuno- globulina que pertence a ele. As imunoglobulinas humanas conhecidas incluem anticorpos das nove classes a seguir (isotipos): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, e IgM. Desses isotipos, os anticorpos da presente invenção incluem IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Várias sequências de halotipo de regiões constantes de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana e IgG4 humana devido a polimorfismos de gene são descritas em “Sequences of proteins of immunological interest”, Publicação NIH No. 91-3242. Qualquer uma de tais sequências pode ser usada na presente invenção. Em particular, para a sequência de IgG1 humana, a sequência de aminoácido nas posições 356 a 358 conforme indicado pela numeração EU pode ser DEL ou EEM. Várias sequências de aló- tipo devido a polimorfismos genéticos foram descritas em “Sequences of proteins of immunological interest”, NIH Publication No. 91-3242 para a região constante IgK humana (Kappa) e região constante IgÀ (Lambda) e qualquer uma das sequências pode ser usada na presente invenção.

[00222] Os métodos para produzir um anticorpo com a atividade de ligação desejada são conhecidos pelos versados na técnica. Abaixo se encontra um exemplo que descreve um método para produzir um anticorpo que se liga ao IL-6R (anticorpo anti-IL-6R). Anticorpos que se ligam a antígeno diferente de IL-6R também podem ser produzidos de acordo com o exemplo descrito a seguir.

[00223] Os anticorpos anti-IL-6R podem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais usando métodos conhecidos. Os anticorpos anti-IL-6R produzidos são, de preferência, anticorpos monoclonais derivados de mamíferos. Tais anticorpos monoclonais derivados de mamífero incluem anticorpos produzidos por hibridomas ou células hospedeiro transformadas com um vetor de expressão que transporta um gene do anticorpo através de técnicas de engenharia genética. “Anticor-pos humanizados” ou “anticorpos quiméricos” estão incluídos nos anticorpos monoclonais da presente invenção.

[00224] Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal podem ser produzidos usando técnicas conhecidas, por exemplo, conforme descrito abaixo. Especificamente, mamíferos são imunizados por métodos de imunização convencionais usando uma proteína IL-6R como um antígeno de sensibilização. As células imunes resultantes são fundidas com células parentais conhecidas por métodos de fusão celular convencionais. Então, os hibridomas que produzem um anticorpo anti-IL-6R podem ser selecionados por triagem das células produtoras de anticorpo monoclonal usando métodos de triagem convencionais.

[00225] Especificamente, os anticorpos monoclonais são preparados conforme mencionado abaixo. Primeiro, o gene de IL-6R cuja sequência de nucleotídeos é revelada na SEQ ID NO: 2 pode ser expresso para produzir uma proteína IL-6R mostrada na SEQ ID NO: 1, que será usada como um antígeno de sensibilização para a preparação do anticorpo. Ou seja, uma sequência gênica que codifica IL-6R é inserida em um vetor de expressão de conhecido, e as células hospedeiro adequadas são transformadas com este vetor. A proteína IL-6R humana desejada é purificada a partir das células hospedeiro ou seus sobrenadantes de cultura por métodos conhecidos. De modo a obter IL-6R solúvel a partir dos sobrenadantes de cultura, por exemplo, uma proteína que consiste nos aminoácidos nas posições 1 a 357 na sequência de polipeptídeos de IL-6R da SEQ ID NO: 1, tal como descrito em Mullberg e outros (J. Immunol. (1994) 152 (10), 4958-4968), é expressa como um IL-6R solúvel, ao invés da proteína IL-6R da SEQ ID NO: 1. A proteína IL-6R natural purificada também pode ser usada como um antígeno de sensibilização.

[00226] A proteína IL-6R purificada pode ser usada como um antí- geno de sensibilização para imunização de mamíferos. Um peptídeo de IL-6R parcial pode também ser usado como um antígeno de sensibilização. Nesse caso, um peptídeo parcial pode ser preparado por síntese química com base na sequência de aminoácidos do IL-6R humano ou por inserir um gene IL-6R parcial em um vetor de expressão para expressão. Alternativamente, um peptídeo parcial pode ser produzido por degradar uma proteína IL-6R com uma protease. O comprimento e a região do peptídeo de IL-6R parcial não se limitam a modalidades particulares. Uma região preferencial pode ser selecionada arbitrariamente a partir da sequência de aminoácidos nas posições de aminoácido 20 a 357 na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. O número de ami- noácidos que formam um peptídeo a ser usado como um antígeno de sensibilização é, de preferência, pelo menos cinco ou mais, seis ou mais, ou sete ou mais. Mais especificamente, um peptídeo com 8 a 50 resíduos, com mais preferência, 10 a 30 resíduos, pode ser usado como um antígeno de sensibilização.

[00227] Para o antígeno de sensibilização, alternativamente, é possível usar uma proteína de fusão preparada por fundir um polipeptídeo ou peptídeo parcial desejado da proteína IL-6R com um polipeptídeo diferente. Por exemplo, fragmentos Fc do anticorpo e marcadores de peptídeo são usados, de preferência, para produzir proteínas de fusão a serem usadas como antígenos de sensibilização. Os vetores para expressão de tais proteínas de fusão podem ser construídos por fundir na estrutura genes que codificam dois ou mais fragmentos do polipeptídeo desejado e inserir o gene de fusão em um vetor de expressão, conforme descrito acima. Métodos para produzir proteínas de fusão são descritos em Molecular Cloning 2a ed. (Sambrook, J e outros, Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Os métodos para preparar IL-6R para ser usada como um antígeno de sensibilização e métodos de imunização usando IL-6R são descritos especificamente nos WO 2003/000883, WO 2004/022754, WO 2006/006693, e similares.

[00228] Não há limitação específica aos mamíferos a serem imunizados com o antígeno de sensibilização. Entretanto, é preferencial selecionar os mamíferos por considerar sua compatibilidade com as células progenitoras a serem usadas para a fusão celular. Em geral, roedores como camundongos, ratos, e hamsters, coelhos e macacos são preferencialmente usados.

[00229] Os animais acima são imunizados com um antígeno de sensibilização por métodos conhecidos. Em geral, os métodos de imunização feitos incluem, por exemplo, a administração com injeção intraperi-toneal ou subcutânea de um antígeno de sensibilização nos mamíferos. Especificamente, um antígeno de sensibilização é diluído apropriadamente com PBS (solução salina tamponada com fosfato), solução salina fisiológica, ou similares. Se for desejado, um adjuvante convencional como adjuvante completo de Freund é misturado com o antígeno, e a mistura é emulsionada. A seguir, o antígeno de sensibilização é administrado a um mamífero várias vezes em intervalos de 4 a 21 dias. Veículos adequados podem ser usados na imunização com o antígeno de sensibilização. Em particular, quando um peptídeo parcial de baixo peso molecular é usado como o antígeno de sensibilização, é algumas vezes desejável acoplar o peptídeo do antígeno de sensibilização a uma proteína carreadora como albumina ou hemocianina do molusco lapa cali- forniana para a imunização.

[00230] Alternativamente, hibridomas que produzem um anticorpo desejado podem ser preparados usando imunização com DNA, como mencionado abaixo. A imunização com DNA é um método de imunização que confere estimulação imunológica mediante expressão de um antígeno de sensibilização em um animal imunizado como um resultado da administração de um vetor de DNA construído para permitir a expressão de um gene que codifica a proteína do antígeno no animal. Em comparação aos métodos de imunização convencionais nos quais um antígeno proteico é administrado aos animais a serem imunizados, espera-se que a imunização com DNA seja superior pelo fato que: - estimulação imunológica pode ser fornecida enquanto se mantém a estrutura de uma proteína membrânica como IL-6R; e - não há necessidade de purificar o antígeno para imunização.

[00231] De modo a preparar um anticorpo monoclonal da presente invenção usando imunização com DNA, primeiro, um DNA que expressa uma proteína IL-6R é administrado a um animal a ser imunizado. O DNA que codifica IL-6R pode ser sintetizado por métodos conhecidos como PCR. O DNA obtido é inserido em um vetor de expressão adequado, e, então, ele é administrado a um animal a ser imunizado. De preferência, os vetores de expressão usados incluem, por exemplo, vetores de expressão disponíveis comercialmente como pcDNA3.1. Os vetores podem ser administrados a um organismo usando métodos convencionais. Por exemplo, a imunização com DNA é feita pelo uso de um pistola de genes para introduzir as partículas de ouro revestidas com vetor de expressão em células no corpo de um animal a ser imunizado. Os anticor-pos que reconheceram IL-6R também podem ser produzidos pelos métodos descritos no WO 2003/104453.

[00232] Após imunizar um mamífero, conforme descrito acima, o aumento no título de um anticorpo de ligação a IL-6R é confirmado no soro. A seguir, as células imunes são coletadas do mamífero, e, então, submetidas à fusão celular. Em particular, esplenócitos são usados, de preferência, como células imunes.

[00233] Uma célula de mieloma de mamífero é usada como uma célula a ser fundida com as células imunes acima mencionadas. As células de mieloma compreendem, de preferência, um marcador de seleção adequado para triagem. Um marcador de seleção confere características às células para sua sobrevivência (ou morte) sob uma condição de cultura específica. Deficiência em hipoxantina-guanina fosforribosil- transferase (deste ponto em diante no presente documento abreviada como deficiência de HGPRT) e deficiência em timidina quinase (deste ponto em diante no presente documento abreviada como deficiência de TK) são conhecidos como marcadores de seleção. Células com deficiência de HGPRT ou TK têm sensibilidade à hipoxantina-aminopterina- timidina (deste ponto em diante no presente documento abreviada como sensibilidade à HAT). As células sensíveis à HAT não sintetizam o DNA em um meio de seleção com HAT e são então mortas. Entretanto, quando as células são fundidas com células normais, elas podem continuar a síntese de DNA usando a via de salvamento das células normais e, portanto, elas podem crescer mesmo no meio de seleção de HAT.

[00234] As células deficientes em HGPRT e deficientes em TK podem ser selecionadas em um meio contendo 6-tioguanina, 8-azagua- nina (deste ponto em diante no presente documento abreviada como 8AG) ou 5’-bromodeoxiuridina, respectivamente. As células normais são mortas porque elas incorporam estes análogos de pirimidina no seu DNA. Entretanto, células que são deficientes nestas enzimas podem sobreviver no meio de seleção, uma vez que elas não podem incorporar estes análogos de pirimidina. Além disso, um marcador de seleção chamado de resistência a G418 fornecido pelo gene de resistência à neo- micina confere resistência aos antibióticos de 2-desoxiestreptamina (análogos de gentamicina). Diversos tipos de células de mieloma que são adequadas para fusão celular são conhecidos.

[00235] Por exemplo, células de mieloma que incluem as seguintes células pode ser preferencialmente usadas: P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550); P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7); NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519); MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415); SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270); FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21); S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323); R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), etc.

[00236] Fusões celulares entre os imunócitos e células de mieloma são essencialmente executadas usando métodos conhecidos, por exemplo, um método por Kohler e Milstein e outros (Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46).

[00237] Mais especificamente, a fusão celular pode ser executada, por exemplo, em um meio de cultura convencional na presença de um agente promotor de fusão celular. Os agentes promotores de fusão in-cluem, por exemplo, polietileno glicol (PEG) e vírus Sendai (HVJ). Se necessário, uma substância auxiliar como sulfóxido de dimetila também é adicionada para aprimorar a eficiência da fusão.

[00238] A razão entre as células imunes e as células de mieloma pode ser determinada como desejado, de preferência, por exemplo, uma célula de mieloma para cada um a dez imunócitos. Os meios de cultura a serem usados para as fusões celulares incluem, por exemplo, meios que são adequados para o cultivo de linhagens celulares de mi- eloma, como meio RPMI1640 e meio MEM, e outro meio de cultura convencional usado para este tipo de cultura celular. Além disso, suplemento de soro como soro fetal de bovino (FSB) pode ser adicionado, de preferência, ao meio de cultura.

[00239] Para a fusão celular, quantidades predeterminadas das células imunes acima e células de mieloma são bem misturadas no meio de cultura acima. A seguir, uma solução de PEG (por exemplo, o peso molecular médio é cerca de 1.000 a 6.000) preaquecida para cerca de 37°C é adicionada a isto a uma concentração de geralmente 30% a 60% (p/v). Ela é suavemente misturada para produzir as células de fusão desejadas (hibridomas). A seguir, um meio de cultura adequado acima mencionado é adicionado gradualmente às células, e ele é centrifugado repetidamente para remover o sobrenadante. Desta forma, agentes de fusão celular e similares que são desfavoráveis para o crescimento do hibridoma podem ser removidos.

[00240] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados por cultura usando um meio seletivo convencional, por exemplo, meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cultura contínua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente. Tipicamente, o período são vários dias a várias semanas. A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos de diluição limitantes convencionais.

[00241] Os hibridomas assim obtidos podem ser selecionados usando um meio de seleção com base no marcador de seleção possuído pelo mieloma usado para a fusão celular. Por exemplo, células defi-cientes em HGPRT ou TK podem ser selecionadas por cultura usando o meio HAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). Especificamente, quando as células de mieloma sensíveis a HAT são usadas para a fusão celular, as células fundidas de forma bem- sucedida com as células normais podem proliferar seletivamente no meio HAT. Células diferentes dos hibridomas desejados (células não fundidas) podem ser mortas por cultura contínua no meio HAT acima por um período de tempo suficiente. Especificamente, os hibridomas desejados podem ser selecionados por cultura geralmente por vários dias até várias semanas. A seguir, os hibridomas que produzem o anticorpo desejado são selecionados e clonados de modo único por métodos de diluição limitantes convencionais.

[00242] Os anticorpos desejados podem ser, de preferência, selecionados e clonados isoladamente por métodos de triagem com base na reação antígeno/anticorpo conhecida. Por exemplo, um anticorpo monoclonal ligação a IL-6R pode se ligar à IL-6R expressa sobre a superfície celular. Tal anticorpo monoclonal pode ser selecionado por seleção de célula ativada por fluorescência (FACS). O FACS é um sistema que avalia a ligação de um anticorpo a uma superfície celular pela análise das células colocadas em contato com um anticorpo fluorescente usando um feixe de laser, e medindo a fluorescência emitida pelas células individuais.

[00243] Para selecionar hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal da presente invenção por FACS, células que expressam IL-6R são primeiro preparadas. As células preferencialmente usadas para a seleção são células de mamífero nas quais a IL-6R é expresso de forma forçada. Como controle, a atividade de um anticorpo de se ligar a IL-6R da superfície celular pode ser detectada seletivamente usando células de mamífero não-transformadas como células hospedeiro. Especificamente, hibridomas que produzem um anticorpo monoclonal anti-IL-6R podem ser isolados pela seleção de hibridomas que produzem um anticorpo que se liga às células forçadas a expressar IL-6R, mas não às células hospedeiro.

[00244] Alternativamente, a atividade de um anticorpo de se ligar às células que expressam IL-6R imobilizadas pode ser avaliada com base no princípio do ELISA. Por exemplo, células que expressam IL-6R são imobilizadas nas cavidades de uma placa de ELISA. Os sobrenadantes de cultura dos hibridomas são colocados em contato com as células imobilizadas nas cavidades, e os anticorpos que se ligam às células imobilizadas são detectados. Quando os anticorpos monoclonais são derivados de camundongo, anticorpos ligados às células podem ser detectados usando um anticorpo de imunoglobulina anticamundongo. Os hibridomas que produzem um anticorpo desejado que possui a capacidade de ligação ao antígeno são selecionados pela triagem acima, e eles podem ser clonados por um método de diluição limitante ou similares.

[00245] Os hibridomas produtores de anticorpo monoclonal assim preparados podem ser subcultivados em um meio de cultura convencional e armazenados em nitrogênio líquido durante um longo período.

[00246] Os hibridomas acima são cultivados por um método convencional e os anticorpos monoclonais desejados podem ser preparados a partir dos sobrenadantes de cultura. Alternativamente, os hibridomas são administrados e cultivados em mamíferos compatíveis, e os anticorpos monoclonais são preparados a partir da ascite. O método anterior é adequado para preparar anticorpos com alta pureza.

[00247] Anticorpos codificados por genes de anticorpo que são clo- nados a partir de células que produzem anticorpos como os hibridomas acima também podem ser preferencialmente usados. Um gene de anticorpo clonado é inserido em um vetor adequado, e ele é introduzido em um hospedeiro para expressar o anticorpo codificado pelo gene. Os mé-todos para isolar genes de anticorpo, inserir os genes em vetores e transformar células hospedeiro já foram estabelecidos, por exemplo, por Vandamme e outros (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775). Métodos para produzir anticorpos recombinantes também são conhecidos, conforme descrito abaixo.

[00248] Por exemplo, um cDNA que codifica a região variável (região V) de um anticorpo anti-IL-6R é preparado a partir de células de hibri- doma que expressam o anticorpo anti-IL-6R. Para este propósito, o RNA total é primeiro extraído dos hibridomas. Os métodos usados para a extração de mRNAs das células incluem, por exemplo: - o método de ultracentrifugação de guanidina (Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299), e - o método de AGPC (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156159)

[00249] Os mRNAs extraídos podem ser purificados usando o kit de purificação de mRNA (GE Healthcare Bioscience) ou similares. Alterna-tivamente, kits para extrair mRNA total diretamente das células, como o kit de purificação de mRNA QuickPrep (GE Healthcare Bioscience) também estão comercialmente disponíveis. Os mRNAs podem ser preparados a partir de hibridomas que usam tais kits. Os cDNAs que codificam a região V do anticorpo podem ser sintetizados a partir dos mRNAs pre-parados usando uma transcriptase reversa. Os cDNAs podem ser sintetizados usando o kit de síntese de cDNA de primeiro filamento de transcriptase reversa AMV (Seikagaku Co.) ou similares. Além disso, o kit de amplificação de cDNA SMART RACE (Clontech) e o método 5’- RACE baseado em PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932) podem ser apropriadamente usados para sintetizar e amplificar cDNAs. Em tal processo de síntese de cDNA, os sítios de enzima de restrição adequados descritos a seguir podem ser introduzidos em ambas as extremidades de um cDNA.

[00250] O fragmento de cDNA de interesse é purificado a partir do produto de PCR resultante, e, então, ele é ligado a um DNA vetor. O vetor recombinante é então construído e introduzido em E. coli ou similares. Após seleção de colônia, o vetor recombinante desejado pode ser preparado a partir da E. coli formadora de colônia. A seguir, testa-se se o vetor recombinante tem a sequência de nucleotídeos de cDNA de interesse por um método conhecido como o método de terminação de cadeia com nucleotídeo didesóxi.

[00251] O método 5’-RACE que usa iniciadores para amplificar o gene da região variável é usado convenientemente para isolar o gene que codifica a região variável. Primeiro, uma biblioteca de cDNA 5’- RACE é construída por síntese de cDNA usando RNAs extraídos de células de hibridoma como um molde. Um kit disponível para comercialização como o kit de amplificação de cDNA SMART RACE é usado apropriadamente para sintetizar a biblioteca de cDNA 5’-RACE.

[00252] O gene do anticorpo é amplificado por PCR usando a biblioteca de cDNA 5’-RACE preparada como um modelo. Iniciadores para amplificar o gene de anticorpo de camundongo podem ser projetados com base em sequências do gene do anticorpo conhecidas. As sequências de nucleotídeos dos iniciadores variam dependendo da subclasse de imunoglobulina. Portanto, é preferencial que a subclasse seja determinada com antecedência usando um kit disponível para comercialização como o kit para isotipagem de anticorpo monoclonal de camun-dongo Iso Strip (Roche Diagnostics).

[00253] Especificamente, por exemplo, iniciadores que permitem a amplificação de genes que codificam as cadeias pesadas y1, Y2a, Y2b, e Y3 e as cadeias leves K e Y são usados para isolar genes que codificam IgG de camundongo. Em geral, um iniciador que anela para um sítio da região constante próximo da região variável é usado como um iniciador do lado 3’ para amplificar um gene da região variável de IgG. Entretanto, um iniciador ligado a um kit de construção da biblioteca de cDNA 5’ RACE é usado como um iniciador do lado 5’.

[00254] Os produtos de PCR assim amplificados são usados para reformar as imunoglobulinas compostas de uma combinação de cadeias pesadas e leves. Um anticorpo desejado pode ser selecionado usando a atividade de ligação de IL-6R de uma imunoglobulina reformada como um indicador. Por exemplo, quando o objetivo é isolar um anticorpo contra IL-6R, é mais preferencial que a ligação do anticorpo a IL-6R seja específica. Um anticorpo ligação a IL-6R pode ser selecionado, por exemplo, por uma das seguintes etapas: (1) colocar uma célula que expressa IL-6R em contato com um anticorpo que compreende a região V codificada por um cDNA isolado de um hibridoma; (2) detectar a ligação do anticorpo à célula que expressa IL- 6R; e (3) selecionar um anticorpo que se liga à célula que expressa IL-6R.

[00255] Métodos para detectar a ligação de um anticorpo a células que expressam IL-6R são conhecidos. Especificamente, a ligação de um anticorpo a células que expressam IL-6R pode ser detectada pelas técnicas descritas acima como FACS. As amostras imobilizadas de células que expressam IL-6R são usadas apropriadamente para avaliar a atividade de ligação de um anticorpo.

[00256] Os métodos de triagem de anticorpos preferenciais que usam a atividade de ligação como um indicador incluem, também, métodos de panning usando vetores de fago. Os métodos de triagem usando vetores de fago são vantajosos quando os genes de anticorpo são isolados a partir de bibliotecas das subclasses de cadeia pesada e cadeia leve de uma população de células que expressa um anticorpo policlonal. Os genes que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve podem ser ligados por uma sequência ligante ade-quada para formar um Fv de cadeia única (scFv). Os fagos que apresentam scFv na sua superfície podem ser produzidos por inserir um gene que codifica scFv em um vetor de fago. Os fagos são colocados em contato com um antígeno de interesse. Então, um DNA codificando scFv que tem a atividade de ligação de interesse pode ser isolado por coletar os fagos ligados ao antígeno. Este processo pode ser repetido conforme necessário para enriquecer o scFv que tem a atividade de ligação de interesse.

[00257] Após o isolamento do cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-IL-6R de interesse, o cDNA é digerido com enzimas de restrição que reconhecem os sítios de restrição introduzidos em ambas as extremidades do cDNA. As enzimas de restrição preferenciais reconhecem e clivam uma sequência de nucleotídeos que ocorre na sequência de nucleotídeos do gene do anticorpo em uma baixa frequência. Além disso, um sítio de restrição para uma enzima que produz uma extremidade adesiva é introduzido, de preferência, em um vetor para inserir um fragmento digerido de cópia única na orientação correta. O cDNA que codifica a região V do anticorpo anti-IL-6R é digerido conforme descrito acima, e ele é inserido em um vetor de expressão adequado para construir um vetor de expressão do anticorpo. Nesse caso, se um gene que codifica a região constante do anticorpo (região C) e um gene que codifica a região V acima forem fundidos na estrutura na estrutura, um anticorpo quimérico é obtido. Na presente invenção, “anticorpo quimérico” significa que a origem da região constante é diferente daquela da região variável. Desta forma, em adição aos anticorpos heteroquiméricos de camundongo/humanos, anticorpos aloquiméricos humano/humano estão incluídos nos anticorpos quiméricos da presente invenção. Um vetor de expressão de anticorpo quimérico pode ser construído por inserir o gene da região V acima em um vetor de expressão que já tem a região constante. Especificamente, por exemplo, uma sequência de reconhecimento para uma enzima de restrição que corta o gene da região V acima pode ser apropriadamente colocada no lado 5’ de um vetor de expressão que transporta um DNA que codifica uma região constante desejada do anticorpo. Um vetor de expressão de anticorpo quimérico é construído por fundir na estrutura os dois genes digeridos com a mesma combinação de enzimas de restrição.

[00258] Para produzir um anticorpo monoclonal anti-IL-6R, os genes do anticorpo são inseridos em um vetor de expressão para que os genes sejam expressos sob o controle de uma região reguladora da expressão. A região reguladora da expressão para expressão do anticorpo inclui, por exemplo, potencializadores e promotores. Além disso, uma se-quência de sinal adequada pode ser ligada à terminação amino para que o anticorpo expresso seja secretado para o lado de fora das células. Nos Exemplos abaixo, um peptídeo que tem a sequência de aminoáci- dos MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 3) é usado como uma sequência de sinal. Entretanto, outras sequências de sinal adequadas podem ser ligadas. O polipeptídeo expresso é clivado na terminação car- boxila da sequência acima, e o polipeptídeo resultante é secretado para o lado de fora das células como um polipeptídeo maduro. Então, as células hospedeiro adequadas são transformadas com o vetor de expres-são, e células recombinantes que expressam o DNA que codifica o anticorpo anti-IL-6R são obtidas.

[00259] Os DNAs que codificam a cadeia pesada do anticorpo (cadeia H) e a cadeia leve (cadeia L) são inseridos separadamente em diferentes vetores de expressão para expressar o gene do anticorpo. Uma molécula de anticorpo que tem as cadeias H e L pode ser expressa por co-transfectar a mesma célula hospedeiro com vetores nos quais os genes da cadeia H e da cadeia L são inseridos, respectivamente. Alternativamente, as células hospedeiro podem ser transformadas com um único vetor de expressão no qual os DNAs que codificam as cadeias H e L são inseridos (consulte WO 1994/011523).

[00260] Há várias combinações de célula hospedeiro/vetor de expressão conhecidas para a preparação de anticorpos por introduzir genes de anticorpos isolados em hospedeiros adequados. Todos estes sistemas de expressão são aplicáveis ao isolamento dos domínios de ligação ao antígeno da presente invenção. As células eucarióticas adequadas usadas como células hospedeiro incluem células animais, células vegetais e células fúngicas. Especificamente, as células animais incluem, por exemplo, as seguintes células.

[00261] (1) células de mamífero: CHO (linhagem de célula de ovário de hamster Chinês), COS (Linhagem de célula de rim de macaco), mi- eloma (Sp2/0, NS0, etc), BHK (linhagem de célula de rim de hamster bebê), HeLa, Vero ou HEK293 (linhagem de célula de rim embriônico humano com DNA de adenovírus compartilhado (Ad)5), célula PER.C6 (linhagem de célula retinal embriônica humana transformada com genes E1A e E1B de Adenovírus Tipo 5 (Ad5) e similar (Current Protocols in Protein Science (maio de 2001; Unidaide 5.9, Tabela 5.9.1);

[00262] (2) células de anfíbio: o-ócitos de Xenopus ou similares; e

[00263] (3) células de inseto: sf9, sf21, Tn5 ou similares.

[00264] Além disso, como uma célula vegetal, um sistema de expressão gênica de anticorpo que usa células derivadas do gênero Nicotiana, como Nicotiana tabacum, é conhecido. Células cultivadas do calo podem ser usadas apropriadamente para transformar células vegetais.

[00265] Além disso, as seguintes células podem ser usadas como células fúngicas:

[00266] - leveduras: o gênero Saccharomyces, como Saccha- romyces serevisiae, e o gênero Pichia, como Pichia pastoris; e

[00267] - fungos filamentosos: o gênero Aspergillus, como Asper gillus niger.

[00268] Além disso, os sistemas de expressão de genes de anticorpo que utilizam células procarióticas também são conhecidos. Por exemplo, quando se usa células bacterianas, células de E. coli, células de Bacillus subtilis, e similares, podem ser adequadamente utilizadas na presente invenção. Vetores de expressão transportando os genes de anticorpo de interesse são introduzidos nestas células por transfecção. As células transfectadas são cultivadas in vitro, e o anticorpo desejado pode ser preparado a partir da cultura de células transformadas.

[00269] Além das células hospedeiro descritas acima, animais trans- gênicos também podem ser usados para produzir um anticorpo recom- binante. Ou seja, o anticorpo pode ser obtido a partir de um animal no qual o gene que codifica o anticorpo de interesse é introduzido. Por exemplo, o gene de anticorpo pode ser construído como um gene de fusão por inserção na estrutura em um gene que codifica uma proteína produzida especificamente no leite. β-caseina de cabra ou similares pode ser usada, por exemplo, como a proteína secretada no leite. Os fragmentos de DNA contendo o gene fundido inserido com o gene do anticorpo são injetados em um embrião de cabra, e, então, este embrião é introduzido em uma cabra fêmea. Os anticorpos desejados podem ser obtidos como uma proteína fundida com a proteína do leite a partir do leite produzido pela cabra transgênica nascida da cabra receptora do embrião (ou sua progênie). Além disso, para aumentar o volume de leite contendo o anticorpo desejado produzido pela cabra transgênica, hormônios podem ser administrados à cabra transgênica, como necessário (Ebert, K. M. e outros, Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).

[00270] Quando uma molécula de ligação ao antígeno aqui descrita é administrada a um ser humano, um domínio de ligação ao antígeno derivado de um anticorpo geneticamente recombinante que foi alterada artificialmente para reduzir a antigenicidade heteróloga contra um ser humano e similares pode ser usada apropriadamente como o domínio de ligação ao antígeno da molécula de ligação a antígeno. Tais anticorpos geneticamente recombinantes incluem, por exemplo, anticorpos hu-manizados. Estes anticorpos alterados são produzidos apropriadamente por métodos conhecidos.

[00271] Uma região variável do anticorpo usada para produzir o domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno aqui descrita é formada geralmente por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que são separadas por quatro regiões estruturais (FRs). A CDR é uma região que determina substancialmente a especificidade de ligação de um anticorpo. As sequências de aminoáci- dos das CDRs são altamente diversas. Por outro lado, as sequências de aminoácidos formadoras de FR têm frequentemente alta identidade mesmo entre anticorpos com diferentes especificidades de ligação. Portanto, geralmente, a especificidade de ligação de um determinado anticorpo pode ser introduzida em outro anticorpo por enxerto de CDR.

[00272] Um anticorpo humanizado também é chamado de anticorpo humano reformado. Especificamente, os anticorpos humanizados pre-parados por enxerto da CDR de um anticorpo animal não humano, como um anticorpo de camundongo a um anticorpo humano e similares, são conhecidos. Técnicas de engenharia genética comuns para se obter anticorpos humanizados também são conhecidas. Especificamente, por exemplo, PCR por extensão de sobreposição é conhecida como um mé-todo para enxertar uma CDR de anticorpo de camundongo em uma FR humana. Na PCR por extensão de sobreposição, uma sequência de nu- cleotídeos que codifica uma CDR de anticorpo de camundongo a ser enxertada é adicionada a iniciadores para sintetizar uma FR de anticorpo humano. Os iniciadores são preparados para cada uma das quatro FRs. Geralmente se considera que quando se enxerta uma CDR de camundongo em uma FR humana, selecionar uma FR humana que tem alta identidade a uma FR de camundongo é vantajoso para manter a função da CDR. Ou seja, é geralmente preferencial usar uma FR humana que compreende uma sequência de aminoácidos que tem alta identidade à sequência de aminoácidos da FR adjacente à CDR de camundongo a ser enxertada.

[00273] As sequências de nucleotídeos a serem ligadas são projetadas de modo a estarem conectadas umas às outras na estrutura. As FRs humanas são sintetizadas individualmente usando os respectivos iniciadores. Como resultado, são obtidos produtos nos quais o DNA que codifica a CDR de camundongo é ligado aos DNAs que codificam a FR individual. Sequências de nucleotídeos que codificam a CDR de camundongo de cada produto são projetadas para que elas se sobreponham umas às outras. A seguir, uma reação de síntese de filamento complementar é conduzida para anelar as regiões CDR sobrepostas dos produtos sintetizados usando um gene de anticorpo humano como molde. As FRs humanas são ligadas através das sequências de CDR de camundongo por esta reação.

[00274] O gene da região V de extensão completa, no qual três CDRs e quatro FRs são essencialmente ligadas, é amplificado usando iniciadores que anelam com a sua extremidade 5’ ou 3’, que são adicionados com sequências de reconhecimento de enzimas de restrição adequadas. Um vetor de expressão para um anticorpo humanizado pode ser produzido por inserir o DNA obtido conforme descrito acima e um DNA que codifica uma região C de anticorpo humano em um vetor de expressão para que eles se liguem na estrutura. Após o vetor recombinante ser transfectado para um hospedeiro para estabelecer as células recom- binantes, as células recombinantes são cultivadas, e o DNA que codifica o anticorpo humanizado é expresso para produzir o anticorpo humanizado na cultura celular (consulte, publicação de patente europeia N° EP 239400 e Publicação de Patente internacional n° WO 1996/002576).

[00275] Ao medir qualitativamente ou quantitativamente e avaliar a atividade de ligação ao antígeno do anticorpo humanizado produzido conforme descrito acima, pode-se selecionar adequadamente FRs de anticorpo humano que permitem que as CDRs formem um sítio de ligação ao antígeno favorável quando ligadas através das CDRs. Os resíduos de aminoácido nas FRs podem ser substituídos como necessário, para que as CDRs de um anticorpo humano reformado formem um sítio de ligação ao antígeno adequado. Por exemplo, mutações na sequência de aminoácidos podem ser introduzidas nas FRs por aplicar o método de PCR usado para enxertar uma CDR de camundongo em uma FR humana. Mais especificamente, mutações parciais na sequência de nu- cleotídeos podem ser introduzidas em iniciadores que anelam para a FR. Mutações na sequência de nucleotídeos são introduzidas nas FRs sintetizadas pelo uso de tais iniciadores. As sequências de FR mutantes que possuem as características desejadas podem ser selecionadas mediante a medição e avaliação da atividade do anticorpo mutante com aminoácido substituído para se ligar ao antígeno pelo método acima mencionado (Cancer Res. (1993) 53: 851-856).

[00276] Alternativamente, os anticorpos humanos desejados podem ser obtidos pela imunização de animais transgênicos que possuem todo o repertório de genes de anticorpos humanos (consulte WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) por imunização com DNA.

[00277] Além disso, técnicas para preparar anticorpos humanos por panning usando bibliotecas de anticorpos humanos também são conhecidas. Por exemplo, a região V de um anticorpo humano é expressa como um anticorpo de cadeia única (scFv) na superfície do fago pelo método de apresentação em fago. Os fagos que expressam um scFv que se liga ao antígeno podem ser selecionados. A sequência de DNA que codifica a região V do anticorpo humano que se liga ao antígeno pode ser determinada através da análise dos genes dos fagos selecionados. A sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno é determinada. Um vetor de expressão é preparado por fundir a sequência da região V na estrutura com a sequência da região C de um anticorpo humano desejado e inserir isto em um vetor de expressão adequado. O vetor de expressão é introduzido em células adequadas para expressão, como aquelas descritas acima. O anticorpo humano pode ser produzido por expressão do gene que codifica o anticorpo humano nas células. Esses métodos já são conhecidos (consulte WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).

[00278] Em adição às técnicas descritas acima, técnicas de clonagem de células B (identificação de cada sequência codificante do anticorpo, clonagem e seu isolamento; uso na construção do vetor de ex-pressão de modo a preparar cada anticorpo (IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4, em particular); e similares) tal como descrito em Bernasconi e outros (Science (2002) 298: 2199-2202) ou no WO 2008/081008 podem ser apropriadamente usadas para isolar os genes de anticorpo. Numeração EU e Numeração Kabat

[00279] De acordo com os métodos usados na presente invenção, posições de aminoácido atribuídas a anticorpo CDR e FR são especificadas de acordo com a numeração Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987 e 1991)). Aqui, quando uma molécula de ligação a antígeno é um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, aminoácidos de região variável são indicados por numeração Kabat, enquanto aminoácidos de região constante são indicadas pela numeração EU com base nas posições de aminoácido de Kabat. Domínios de ligação a antígeno dependentes de um composto específico de tecido alvo

[00280] Para obter um domínio de ligação a antígeno (ou molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto especí-fico de tecido alvo ou, mais especificamente, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) dependente de um composto específico de tecido alvo, os métodos indicados na seção acima sobre atividade de ligação podem ser apropriadamente aplicados. Como uma modalidade não limitante, alguns exemplos específicos dos métodos são apresentados abaixo. Por exemplo, para confirmar que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o antígeno) na presença de um composto específico de tecido alvo se torna maior do que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) na ausência do composto, as atividades de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno (ou a molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) na presença e ausência do composto específico de tecido alvo ou na presença de concentrações altas e baixas do composto são comparadas. Em outra modalidade não limitante, por exemplo, para confirmar que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antí- geno contendo o domínio) na presença de uma concentração alta de um composto específico de tecido alvo se torna maior do que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) na presença de uma concentração baixa do composto, as atividades de ligação a antí- geno do domínio de ligação a antígeno (ou a molécula de ligação a an- tígeno contendo o domínio) na presença de concentrações altas e baixas do composto específico de tecido alvo são comparadas.

[00281] Ainda, na presente invenção, a expressão “a atividade de ligação a antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo é maior do que a atividade de ligação a antígeno na ausência do composto” pode ser alternativamente expressa como “a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) na ausência de um composto específico de tecido alvo é menor do que a atividade de ligação a antígeno na presença do composto”. Ainda, na presente invenção, “a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) na ausência de um composto específico de tecido alvo é menor do que a atividade de ligação a antígeno na presença do composto” pode ser alter-nativamente descrita como “a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) na ausência de um composto específico de tecido alvo é mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno na presença do composto”.

[00282] Ainda, na presença invenção, a expressão “a atividade de ligação a antígeno na presença de uma concentração alta de um composto específico de tecido alvo é maior do que a atividade de ligação a antígeno na presença de uma concentração baixa do composto” pode ser alternativamente expressa como “a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo é menor do que a atividade de ligação a antígeno na presença de uma concentração alta do composto”. Na presente invenção, “a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo é menor do que a atividade de ligação a antígeno na presença de uma concentração alta do composto” pode ser alternativamente descrita como “a atividade de ligação a antí- geno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo é mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno na presença de uma concentração alta do composto”.

[00283] Condições quando medindo atividade de ligação a antígeno que não a concentração de um composto específico de tecido alvo não são particularmente limitadas, e podem ser selecionadas apropriadamente por aqueles versados na técnica. Por exemplo, é possível medir sob condições de tampão de HEPES e 37° C. Por exemplo, Biacore (GE Healthcare) ou similar pode ser usado para medição. Quando o antí- geno é uma molécula solúvel, a atividade de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domino) para se ligar à molécula solúvel pode ser determinada através da carga do antígeno como um analito em um chip imobilizado com o domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio). Alternativamente, quando o antígeno é uma molécula do tipo membrana, a atividade de ligação com relação à molécula do tipo membrana pode ser determinada carregando o domínio de ligação a antí- geno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) como um analito em um chip imobilizado com o antígeno.

[00284] Contanto que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) contido em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção na ausência de um composto específico de tecido alvo seja mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno na presença do composto específico de tecido alvo, a razão entre a atividade de ligação a antígeno na ausência do composto e a atividade de ligação a antígeno na presença do composto não é particularmente limitada. No entanto, o valor de KD (na ausência do composto) / KD (na presença do composto), que é uma razão de constante de dissociação (KD) contra um antígeno na ausência do composto específico de tecido alvo para KD na presença do composto, é preferivelmente 2 ou maior, mais preferivelmente 10 ou maior e ainda mais preferivelmente 40 ou maior. O limite superior do valor de KD (na ausência do composto) / KD (na presença do composto) não é particularmente limitado, e pode ser qualquer valor, por exemplo, 400, 1.000 ou 10.000, contanto que ele possa ser provido pelas tecnologias daqueles versados na técnica. Quando atividade de ligação a antígeno não é observada na ausência do composto específico de tecido alvo, o valor do limite superior é infinito.

[00285] Contanto que a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) contido em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção na presença de uma concentração baixa de um específico para tecido alvo seja mais fraca do que a atividade de ligação a antígeno na presença de uma concentração alta do composto específico de tecido alvo, a razão entre a atividade de ligação a antígeno na presença de uma concentração baixa do composto e a atividade de li-gação a antígeno na presença de uma concentração alta do composto não é particularmente limitada. No entanto, o valor de KD (na presença de uma concentração baixa do composto) / KD (na presença de uma concentração alta do composto), que é uma razão de constante de dissociação (KD) contra um antígeno na presença de uma concentração baixa do composto específico de tecido alvo para KD na presença de uma concentração alta do composto, é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 10 ou mais e ainda mais preferivelmente 40 ou mais. O limite superior do valor de KD (na presença de uma concentração baixa do composto) / KD (na presença de uma concentração alta do composto) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor, por exemplo, 400, 1.000 ou 10.000, contanto que ele possa ser provido pelas tecnologias daqueles versados na técnica. Quanto a atividade de ligação a antígeno não é observada na presença de uma concentração baixa do composto específico de tecido alvo, o valor do limite superior é infinito.

[00286] Para o valor de atividade de ligação a antígeno, se o antí- geno for uma molécula solúvel, constante de dissociação (KD) pode ser usada; e se o antígeno for uma molécula do tipo membrana, constante de dissociação aparente (KD aparente) pode ser usada. A constante de dissociação (KD) e a constante de dissociação aparente (KD aparente) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare), um gráfico Scatchard, um citômetro de fluxo ou similar.

[00287] Como outro indicador que mostra a razão entre a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) da presente invenção na ausência de um composto específico de tecido alvo e a atividade de ligação a antígeno na presença do composto, por exemplo, constante da taxa de dissociação kd pode ser adequadamente usada. Quando a constante da taxa de dissociação (kd) é usada ao invés da constante de dissociação (KD) como um indicador que mostra a razão de atividade de ligação, o valor de kd (na ausência do composto) / kd (na presença do composto), que é a razão entre kd (constante da taxa de dissociação) para um antígeno na ausência de um composto específico de tecido e kd na presença do composto, é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, ainda mais preferivelmente 10 ou mais e ainda mais preferivelmente 30 ou mais. O limite superior do valor de kd (na ausência do composto) / kd (na presença do composto) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor, por exemplo, 50, 100 ou 200, contanto que ele possa ser provido pelo conhecimento técnico comum daqueles versados na técnica. Quando atividade de ligação a an- tígeno não é observada na ausência do composto específico de tecido, não há nenhuma dissociação e o valor do limite superior se torna infinito.

[00288] Como outro indicador que mostra a razão entre a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) da presente invenção na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo e a atividade de ligação a antígeno na presença de uma concentração alta do composto, por exemplo, constante da taxa de dissociação pode ser adequadamente usada. Quando a constante da taxa de dissociação (kd) é usada ao invés da constante de dissociação (KD) como um indicador mostrando a razão de atividade de ligação, o valor de kd (na presença de uma concentração baixa do composto) / kd (na presença de uma concentração alta do composto), que é a razão entre kd (constante de taxa de dissociação) para um antígeno na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo e kd na presença de uma concentração alta do composto, é preferivelmente 2 ou mais, mais preferivelmente 5 ou mais, ainda mais pre-ferivelmente 10 ou mais e ainda mais preferivelmente 30 ou mais. O limite superior do valor de kd (na presença de uma concentração baixa do composto) / kd (na presença de uma concentração alta do composto) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor, por exemplo, 50, 100 ou 200, contanto que ele possa ser provido pelo conhecimento técnico comum daqueles versados na técnica. Quando atividade de ligação a antígeno não é observada na presença de uma concentração baixa do composto específico de tecido alvo, não há nenhuma dissociação e o valor do limite superior se torna infinito.

[00289] Para o valor de atividade de ligação a antígeno, se o antí- geno for uma molécula solúvel, constante de taxa de dissociação (kd) pode ser usada; e se o antígeno for uma molécula do tipo membrana, constante de taxa de dissociação aparente (kd) aparente pode ser usada. A constante de taxa de dissociação (kd) e constante de taxa de dissociação aparente (kd aparente) podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare), um citômetro de fluxo ou similar. Na presente invenção, quando medindo a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) em uma certa concentração do composto específico de tecido alvo, condições que não a concentração da concentração de composto são preferivelmente iguais.

[00290] Por exemplo, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno(ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na ausência de um composto específico de tecido do que na presença do composto pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) que compreende as etapas de:

[00291] (a) determinação da atividade de ligação a antígeno de do mínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) na ausência de um composto específico de tecido alvo;

[00292] (b) determinação da atividade de ligação a antígeno dos do mínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) na presença do composto específico de tecido alvo; e

[00293] (c) seleção de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno) com atividade de ligação a antígeno menor na ausência do composto específico de tecido alvo do que na presença do composto.

[00294] Por exemplo, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno(ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo do que na presença de uma concentração alta do composto, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) que compreende as etapas de:

[00295] (a) determinação da atividade de ligação a antígeno de do mínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo;

[00296] (b) determinação da atividade de ligação a antígeno dos do mínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) na presença de uma concentração alta do composto específico de tecido alvo; e

[00297] (c) seleção de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno) com atividade de ligação a antígeno menor na presença de uma concentração baixa do composto específico de tecido alvo do que na presença de uma concentração alta do composto.

[00298] Ainda, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antí- geno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na ausência de um composto específico de tecido do que na presença do composto, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) ou uma biblioteca dos mesmos que compreende as etapas de:

[00299] (a) contato dos domínios de ligação a antígeno (o moléculas de ligação a antígeno) ou uma biblioteca dos mesmos com um antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo;

[00300] (b) colocação dos domínios de ligação a antígeno (ou molé culas de ligação a antígeno) que se ligam ao antígeno na dita etapa (a) na ausência do composto;

[00301] (c) isolamento de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno) que dissociou na dita etapa (b).

[00302] Ainda, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antí- geno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo do que na presença de uma concentração alta do composto, pode ser obtido através da avaliação dos domínios de ligação a antí- geno (ou moléculas de ligação a antígeno) ou uma biblioteca dos mesmos que compreende as etapas de:

[00303] (a) contato dos domínios de ligação a antígeno (o moléculas de ligação a antígeno) ou uma biblioteca dos mesmos com um antígeno na presença de uma concentração alta de um composto específico de tecido alvo;

[00304] (b) colocação dos domínios de ligação a antígeno (ou molé culas de ligação a antígeno) que se ligam ao antígeno na dita etapa (a) na presença de uma concentração baixa do composto;

[00305] (c) isolamento de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno) que dissociou na dita etapa (b).

[00306] Alternativamente, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na ausência de um composto específico de tecido alvo do que na presença do composto, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) ou uma biblioteca dos mesmos que compreende as etapas de:

[00307] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno (ou moléculas de ligação a antígeno) com um antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo;

[00308] (b) seleção de domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) que não se ligam ao antígeno na dita etapa (a);

[00309] (c) permitir que os domínios de ligação a antígeno (ou molé culas de ligação a antígeno) selecionados na dita etapa (b) se liguem ao antígeno na presença do composto; e

[00310] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno) que se liga ao antígeno na dita etapa (c).

[00311] Alternativamente, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo do que na presença de uma concentração alta do composto, pode ser obtido através da avaliação de domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) ou uma biblioteca dos mesmos que compreende as etapas de:

[00312] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno (ou moléculas de ligação a antígeno) com um antígeno na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo;

[00313] (b) seleção de domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) que não se ligam ao antígeno na dita etapa (a);

[00314] (c) permitir que os domínios de ligação a antígeno (ou molé culas de ligação a antígeno) selecionados na dita etapa (b) se liguem ao antígeno na presença de uma concentração alta do composto; e

[00315] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno) que se liga ao antígeno na dita etapa (c).

[00316] Ainda, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antí- geno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno inferior na ausência de um composto específico de tecido alvo do que na presença do composto, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de:

[00317] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno (ou moléculas de ligação a antígeno) com uma coluna imobilizada em antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo;

[00318] (b) eluição de um domínio de ligação a antígeno (ou molécula de ligação a antígeno) que se liga à coluna na dita etapa (a) da coluna na ausência do composto; e

[00319] (c) isolamento do domínio de ligação a antígeno (ou molé cula de ligação a antígeno) eluído na dita etapa (b).

[00320] Ainda, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antí- geno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno inferior na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo do que na presença de uma concentração alta do composto, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de:

[00321] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno (ou moléculas de ligação a antígeno) com uma coluna imobilizada em antígeno na presença de uma concentração alta de um composto específico de tecido alvo;

[00322] (b) eluição de um domínio de ligação a antígeno (ou molé cula de ligação a antígeno) que se liga à coluna na dita etapa (a) da coluna na presença de uma concentração baixa do composto; e

[00323] (c) isolamento do domínio de ligação a antígeno (ou molé cula de ligação a antígeno) eluído na dita etapa (b).

[00324] Ainda, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antí- geno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na ausência de um composto específico de tecido alvo do que na presença do composto, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de:

[00325] (a) permitir que uma biblioteca de domínios de ligação a an- tígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) passe por uma coluna imobilizada em antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo;

[00326] (b) coleta de um domínio de ligação a antígeno (ou molécula de ligação a antígeno) eluído sem ligação à coluna na dita etapa (a);

[00327] (c ) permitir que o domínio de ligação a antígeno (ou molécula de ligação a antígeno) coletado na dita etapa (b) se ligue ao antí- geno na presença do composto; e

[00328] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno (ou mo lécula de ligação a antígeno) que se liga ao antígeno na dita etapa (c).

[00329] Ainda, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antí- geno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo do que na presença de uma concentração alta do composto, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de:

[00330] (a) permitir que uma biblioteca de domínios de ligação a an- tígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) passe por uma coluna imobilizada em antígeno na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo;

[00331] (b) coleta de um domínio de ligação a antígeno (ou molécula de ligação a antígeno) eluído sem ligação à coluna na dita etapa (a);

[00332] (c ) permitir que o domínio de ligação a antígeno (ou molécula de ligação a antígeno) coletado na dita etapa (b) se ligue ao antí- geno na presença de uma concentração alta do composto; e

[00333] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno (ou mo lécula de ligação a antígeno) que se liga ao antígeno na dita etapa (c).

[00334] Ainda, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antí- geno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na ausência de um composto específico de tecido alvo do que na pre-sença do composto, pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de:

[00335] (a) contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) na presença de um composto específico de tecido alvo;

[00336] (b) obtenção de um domínio de ligação a antígeno (ou molé cula de ligação a antígeno) que se liga ao antígeno na dita etapa (a);

[00337] (c) colocação do domínio de ligação a antígeno (ou molécula de ligação a antígeno) obtido na etapa (b) na ausência do composto; e

[00338] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno (ou mo lécula de ligação a antígeno) cuja atividade de ligação a antígeno na dita etapa (c) é mais fraca do que aquela da referência selecionada na dita etapa (b).

[00339] Ainda, em uma modalidade provida pela presente invenção, um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antí- geno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo do que na presença de uma concentração alta do composto pode ser obtido através de um método de avaliação compreendendo as etapas de:

[00340] (a) contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) na presença de uma concentração alta de um composto específico de tecido alvo;

[00341] (b) obtenção de um domínio de ligação a antígeno (ou molé cula de ligação a antígeno) que se liga ao antígeno na dita etapa (a);

[00342] (c) colocação do domínio de ligação a antígeno (ou molécula de ligação a antígeno) obtido na etapa (b) na presença de uma concentração baixa do composto; e

[00343] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno (ou mo lécula de ligação a antígeno) cuja atividade de ligação a antígeno na dita etapa (c) é mais fraca do que aquela da referência selecionada na dita etapa (b).

[00344] As etapas mencionadas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes. Desta maneira, a presente invenção provê um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na ausência de um composto específico de tecido alvo do que na presença do composto, ou um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo o domínio) com atividade de ligação a antígeno menor na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo do que na presença de uma concentração alta do composto, obtido através de métodos de avaliação que compreendem ainda a etapa de repetição das etapas (a) a (c) ou (a) a (d) duas ou mais vezes nos métodos de avaliação mencionados acima. O número de repetições de etapas (a) a (c) ou (a) a (d) não é particularmente limitado, e é geralmente dez ou menos.

[00345] Nos métodos de avaliação da presente invenção, um composto específico de tecido alvo pode ser um composto definido por especificidade de tecido alvo quantitativa tal como presença no tecido alvo em uma concentração (por exemplo, concentração alta ou concentração baixa) diferente da concentração em tecidos não alvo. Por exemplo, um composto específico de tecido alvo está diferentemente presente em quaisquer concentrações. No entanto, em geral, um composto específico de tecido alvo pode estar presente em uma concentração aumentada em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 100%, pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos 2-vezes, pelo menos 5-vezes, pelo menos 10-vezes, pelo menos 50-vezes, pelo menos 100- vezes, pelo menos 103-vezes, pelo menos 104-vezes, pelo menos 105- vezes, pelo menos 106-vezes ou mais, ou até infinito (quando o com-posto está ausente em tecidos não alvo).

[00346] O limiar diferenciando concentrações baixas e altas pode ser ajustado apropriadamente de acordo com o composto. Por exemplo, em uma modalidade não limitante do limiar de ATP ou adenosina, o limiar para uma condição de concentração baixa pode ser selecionado apropriadamente dos valores de 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM ou 0 M. Dependendo do limiar predeterminado, a condição de concentração alta pode ser ajustada apropriadamente em um valor selecionado de pelo menos pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos duas vezes, pelo menos cinco-vezes, pelo menos 10-vezes, pelo menos 50-vezes, pelo menos 100-vezes, pelo menos 103-vezes, pelo menos 104-vezes, pelo menos 105-vezes e pelo menos 106-vezes do valor de cada limiar. Ainda, em uma modalidade não limitante de PGE2, o limiar para uma condição de concentração baixa pode ser selecionado apropriadamente a partir dos valores de 10 pM, 1 pM, 100 fM, 10 fM, 1 fM e 0 M. Dependendo do limiar predeterminado, a condição de concentração alta pode ser ajustada apropriadamente em um valor selecionado de pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos duas vezes, pelo menos cinco-vezes, pelo menos 10-vezes, pelo menos 50-vezes, pelo menos 100-vezes, pelo menos 103-vezes, pelo menos 104-vezes, pelo menos 105-vezes e pelo menos 106-vezes do valor de cada limiar. Ainda, em uma modalidade não limi- tante de Quinurenina, o limiar para uma condição de concentração baixa pode ser selecionado apropriadamente dos valores de 10 μM, 1 μM, 100 nM, 10 nM e 1 nM e 0 M. Dependendo do limiar predeterminado, a condição de concentração alta pode ser ajustada apropriadamente em um valor selecionado de pelo menos 110%, pelo menos 120%, pelo menos 130%, pelo menos 140%, pelo menos 150%, pelo menos duas vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 103-vezes, pelo menos 104-vezes, pelo menos 105-vezes e pelo menos 106-vezes o valor de cada limiar.

[00347] A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno) pode ser medida através de um método conhecido daqueles versados na técnica, e condições outras que não a concentração de um composto específico de tecido alvo podem ser ajustadas apropriadamente por um versado na técnica. A atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno) pode ser avaliada como constante de dissociação (KD), constante de dissociação apa-rente (KD aparente), constante de taxa de dissociação (kd), constante de taxa de dissociação aparente (kd aparente), etc. Elas podem ser determinadas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, por exemplo, usando Biacore (GE Healthcare), o gráfico Scatchard, FACS ou similar.

[00348] Na presente invenção, a etapa de seleção de um anticorpo ou um domínio de ligação a antígeno com atividade de ligação a antí- geno maior na presença de um composto específico de tecido alvo do que na ausência do composto tem o mesmo significado que a etapa de seleção de um anticorpo ou um domínio de ligação a antígeno com atividade de ligação a antígeno menor na ausência de um composto específico de tecido alvo do que na presença do composto.

[00349] Na presente invenção, a etapa de seleção de um anticorpo ou um domínio de ligação a antígeno com atividade de ligação a antí- geno maior na presença de uma concentração alta de um composto específico de tecido alvo do que na presença de uma concentração baixa do composto tem o mesmo significado que a etapa de seleção de um anticorpo ou um domínio de ligação a antígeno com atividade de ligação a antígeno menor na ausência de um composto específico de tecido alvo do que na presença do composto.

[00350] Contanto que atividade de ligação a antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo seja menor do que a atividade de ligação a antígeno na presença do composto, a diferença entre atividade de ligação a antígeno na presença do composto e atividade de ligação a antígeno na ausência do composto não é particularmente limi-tada, mas, preferivelmente, a atividade de ligação a antígeno na presença do composto com relação à atividade de ligação a antígeno na ausência do composto é duas vezes ou mais, mais preferivelmente 10 vezes ou mais, e ainda mais preferivelmente 40 vezes ou mais. O limite superior da diferença entre as atividades de ligação a antígeno não é particularmente limitado, contanto que ele possa ser produzido através das técnicas daqueles versados na técnica, qualquer valor tal como 400 vezes, 1000 vezes ou 10000 vezes é possível. Na ausência de um composto específico de tecido alvo, quando atividade de ligação a antígeno não é observada, este limite superior compreende infinito.

[00351] Os domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno contendo os domínios) da presente invenção que devem ser avaliados através dos métodos de avaliação descritos acima podem ser quaisquer domínio de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a an- tígeno); e, por exemplo, os domínios de ligação a antígeno mencionados acima (ou moléculas de ligação a antígeno) podem ser avaliados. Por exemplo, domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) tendo sequências de ocorrência natural podem ser avaliados, e domínios de ligação a antígeno (ou moléculas de ligação a antígeno) com sequências de aminoácido substituídas podem ser avaliados.

Biblioteca

[00352] De acordo com uma certa modalidade, o domínio de ligação a antígeno (ou uma molécula de ligação a antígeno contendo este domínio) da presente invenção pode ser obtido de uma biblioteca compreendendo principalmente uma pluralidade de moléculas de ligação a an- tígeno tendo sequências diferentes umas das outras, onde pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno com relação a um antígeno dependendo de um composto específico de tecido alvo está contido no domínio de ligação a antígeno. Exemplos do composto incluem (1) metabolitos primários do ciclo Krebs ou do curso glicolítico tal como lactose, ácido succínico ou ácido cítrico, (2) aminoácidos tal como alanina, ácido glutâmico ou as- paragina, (3) quinurenina e seus metabolitos de aminoácido tais como ácido antranílico, 3-hidroxiquinurenina e ácido quinurênico, (4) metabo- litos de ácido araquidônico tal como prostaglandina E2 e (5) nucleosí- deos carregando uma estrutura de anel purina tais como adenosina, tri- fosfato de adenosina (ATP), difosfato de adenosina (ADP) e monofos- fatos de adenosina (AMP). Abaixo se encontram exemplos de tal biblioteca compreendendo principalmente uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno tendo sequências diferentes uma das outras, onde pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno com relação a antígenos dependentes de adenosina e/ou ATP que são compostos específicos de tecido alvo está contido no domínio de ligação a antígeno.

[00353] Aqui, uma “biblioteca” se refere a uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno ou uma pluralidade de polipeptídeos de fusão contendo moléculas de ligação a antígeno ou ácidos nucleicos ou polinucleotídeos codificando suas sequências. As sequências de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno ou uma pluralidade de polipeptídeos de fusão contendo moléculas de ligação a antígeno em uma biblioteca não são idênticas, mas são diferentes umas das outras.

[00354] Aqui, a expressão “sequências são diferentes umas das outras” na frase “uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras” significa que as sequências de moléculas de ligação a antígeno em uma biblioteca são diferentes umas das outras. Especificamente, em uma biblioteca, o número de sequências diferentes umas das outras reflete o número de clones independentes com sequências diferentes e pode também ser referido como “tamanho da biblioteca”. O tamanho da biblioteca de uma biblioteca de exibição de fago convencional varia de 106a 1012. O tamanho da biblioteca pode ser aumentado até 1014 através do uso de técnicas conhecidas tal como exibição de ribossomo. No entanto, o número real de partículas de fago usado em seleção por panning de uma biblioteca de fago é em geral 10 a 10.000 vezes maior do que o tamanho da biblioteca. Esta multiplicidade em excesso é também referida como “o número de equivalentes de biblioteca” e significa que há 10 a 10.000 clones individuais que têm a mesma sequência de aminoácido. Desta maneira, na presente invenção, a expressão “sequências são diferentes umas das outras” significa que as sequências de moléculas de ligação a antígenos independentes em uma biblioteca, excluindo equivalentes de biblioteca, são diferentes umas das outras. Mais especificamente, o acima significa que há 106 a 104 moléculas de ligação a antígeno cujas sequências são diferentes umas das outras, preferivelmente 107 a 1012 moléculas, mais preferivelmente 108 a 1011 moléculas e particularmente preferivelmente 108 a 1010 moléculas cujas sequências são diferentes umas das outras.

[00355] Aqui, as expressões “uma pluralidade de” na frase “uma biblioteca composta principalmente de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno” se referem geralmente a, no caso de, por exemplo, moléculas de ligação a antígeno, polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo, vetores ou vírus da presente invenção, um grupo de dois ou mais tipos da substância. Por exemplo, quando duas ou mais substâncias são diferentes umas das outras em uma característica particular, isso significa que há dois ou mais tipos da substância. Tais exemplos podem incluir, por exemplo, aminoácidos mutantes observa-dos em posições de aminoácido específicas em uma sequência de ami- noácido. Por exemplo, onde há duas ou mais moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são substancialmente iguais ou preferivelmente iguais exceto por resíduos flexíveis ou exceto pelos aminoácidos mutantes particulares em posições hipervariáveis expostas na superfície, há uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Em outro exemplo, quando há duas ou mais moléculas de polinucleotídeo cujas sequências são substancialmente iguais ou preferivelmente iguais exceto por nucleotídeos codificando resíduos flexíveis ou nucleotídeos codificando aminoácidos mu- tantes de posições hipervariáveis expostos na superfície, há uma plura-lidade de moléculas de polinucleotídeo da presente invenção.

[00356] Ainda, aqui, a expressão “principalmente composta de” na frase “uma biblioteca composta principalmente de uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno” reflete o número de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo, dentre clones independentes com sequências diferentes em uma biblioteca. Especificamente, é preferível que haja pelo menos 104 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação em uma biblioteca. Mais preferivelmente, domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 105 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Ainda mais preferivelmente, domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca contendo pelo menos 106 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Particularmente preferivelmente, domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca contendo pelo menos 107 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Ainda mais preferivelmente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca contendo pelo menos 108 moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação. Alternativamente, isso pode ser também preferivelmente expresso como a razão do número de moléculas de ligação a antígeno onde atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno varia dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP com relação ao número de clones independentes tendo sequências diferentes em uma biblioteca. Especificamente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca onde moléculas de ligação a antígeno tendo tal atividade de ligação são responsáveis por 0,1% a 80%, preferivelmente 0,5% a 60%, mais preferivelmente 1% a 40%, ainda mais preferivelmente 2% a 20% e particularmente preferivelmente 4% a 10% de clones independentes com sequências diferentes na biblioteca. No caso de polipeptídeos de fusão, moléculas de polinucleotídeo ou vetores, expressões similares podem ser possíveis usando o número de moléculas ou a razão para o número total de moléculas. No caso de vírus, expressões similares podem também ser possíveis usando o número de virions ou a razão para número total de virions. Aminoácidos que mudam a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adeno- sina e/ou ATP

[00357] Domínios ou anticorpos de ligação a antígeno da presente invenção avaliados através dos métodos de avaliação descritos acima podem ser preparados de qualquer maneira. É possível usar anticorpos preexistentes, bibliotecas preexistentes (bibliotecas de fago, etc), anticorpos ou bibliotecas preparados a partir de hibridomas obtidos através da imunização de animais ou de células B de animais imunizados e anticorpos ou bibliotecas preparados a partir de células imunes tais como células B de animais imunizados por um conjugado onde adenosina ou ATP é adequadamente ligado a um agente adjuvante tal como um pep- tídeo de epítopo de célula T altamente imunogênico. Um exemplo não limitante do peptídeo de epítopo de célula T inclui adequadamente pep- tídeo auxiliar p30 derivado da toxina do tétano (mostrado em SEQ ID NO: 4 e também referido como fragmento C (FrC)).

[00358] Exemplos de aminoácidos que mudam a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP conforme acima descrito incluen aminoácidos que formam um motivo de ligação de adenosina e/ou ATP. As posições do aminoácido onde os aminoácidos mencionados acima estão contidos no domínio de ligação a antígeno não estão limitadas a nenhuma posição específica. Enquanto a atividade de ligação a antí- geno do domínio de ligação a antígeno é mudada dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP, qualquer posição na região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve formando o domínio de ligação a antígeno é possível. Mais especificamente, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca compreendendo principalmente moléculas de ligação a antígeno tendo sequências diferentes umas das outras, onde os aminoácidos que mudam a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP estão contidos no domínio de ligação a antígeno da cadeia pesada. Em uma modalidade não limitante, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca compreendendo principalmente moléculas de ligação a antígeno tendo sequências diferentes umas das outras, onde os amino- ácidos que mudam a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP estão contidos em CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da cadeia pesada. Em outra modalidade não limitante, os domínios de ligação a an- tígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca com- prendendo principalmente moléculas de ligação a antígeno tendo sequências diferentes umas das outras, onde os aminoácidos que mudam a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP estão contidos em FR1, FR2, FR3 e/ou FR4 da cadeia pesada.

[00359] Ainda, em uma modalidade da presente invenção, domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca compreendendo principalmente moléculas de ligação a antí- geno tendo sequências diferentes umas das outras, onde os aminoáci- dos que mudam a atividade de ligação a antígeno da molécula de liga-ção a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP estão contidos no domínio de ligação a antígeno da cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em uma modalidade não limitante, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca compreendendo principalmente moléculas de ligação a antígeno tendo sequências diferentes umas das outras, onde os amino- ácidos que mudam a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP estão contidos em CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da cadeia pesada e/ou cadeia leve. Em outra modalidade não limitante, os domínios de ligação a antígeno da presente invenção podem ser obtidos de uma biblioteca compreendendo principalmente moléculas de ligação a antí- geno tendo sequências diferentes umas das outras, onde os aminoáci- dos que mudam a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP estão contidos em FR1, FR2, FR3 e/ou FR4 da cadeia pesada e/ou cadeia leve.

[00360] Em uma modalidade não limitante, exemplos de tais amino- ácidos incluem qualquer um ou mais aminoácidos selecionados de ami- noácidos nas posições 52, 52a, 53, 96, 100a e 100c contidos na região variável de cadeia pesada. Também, em uma modalidade não limitante, exemplos de tais aminoácidos incluem um ou mais aminoácidos selecionados de aminoácidos incluindo Ser na posição 52, Ser na posição 52a, Arg na posição 53, Gly na posição 96, Leu na posição 100a e Trp na posição 100c contida na região variável de cadeia pesada.

[00361] Qualquer sequência de estrutura principal pode ser usada como a sequência de estrutura principal das regiões variáveis de cadeia leve e/ou cadeia pesada de uma molécula de ligação a antígeno contanto que os aminoácidos que mudam a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP estejam contidos no domínio de ligação a antígeno da cadeia pesada e/ou cadeia leve. A origem das sequências de estrutura principal não é limitada, e elas podem ser obtidas de organismos humanos ou não humanos. Tais organismos incluem preferivelmente camundongos, ratos, porquinhos-da-índia, hamsters, gerbilos, gatos, coelhos, cachorros, cabras, ovelha, bovinos, cavalos, camelos e organismos selecionados de primatas não humanos. Em uma modalidade particularmente preferida, as sequências de estrutura principal da região variável de cadeia leve e/ou cadeia pesada de uma molécula de ligação a antígeno têm preferivelmente sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana. Desta maneira, em uma modalidade da presente invenção, se as sequências de estrutura principal inteiras forem sequencais humanas, é pensado que uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção induz pouca ou nenhuma resposta imunogênica quando ela é administrada a humanos (por exemplo, para tratar doenças). Na percepção acima, a expressão “contendo uma sequência de linhagem germinativa” na presente invenção significa que uma parte das sequências de estrutura principal da presente invenção é idêntica a uma parte de quaisquer sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana. Por exemplo, quando a sequência de FR2 de cadeia pesada de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção é uma combinação de sequência de FR2 de cadeia pesada de sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana diferentes, tal molécula é também uma molécula de ligação a an- tígeno “contendo uma sequência de linhagem germinativa” na presente invenção. Mesmo quando as sequências de estrutura principal de mo-léculas de ligação a antígeno da presente invenção são sequências com substituições, elas são moléculas de ligação a antígeno “contendo uma sequência de linhagem germinativa” da presente invenção. Exemplos de tais sequências com substituições incluem, em particular, sequências onde aminoácidos de parte das sequências de estrutura principal de linhagem germinativa humana foram substituídos com aminoácidos que mudam a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP.

[00362] Exemplos preferidos das estruturas principais incluem, por exemplo, sequências de região de estrutura principal integralmente humanas atualmente conhecidas, que estão incluídas no website de V- Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) ou outras. Essas sequências de região de estrutura principal podem ser apropriadamente usadas como uma sequência de linhagem germinativa humana contida em uma mo-lécula de ligação de antígeno da presente invenção. As sequências de linhagem germinativa podem ser categorizadas de acordo com sua similaridade (Tomlinson e outros (J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798); Williams e Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461); Cox e outros (Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). Sequências de linhagem germina- tiva apropriadas podem ser selecionadas de VK, que é agrupada em sete subgrupos; VÁ, que é agrupada em dez subgrupos; e VH, que é agrupada em sete subgrupos.

[00363] Sequências VH integralmente humanas incluem preferivelmente, mas não estão limitadas a, por exemplo, sequências VH de: subgrupo VH1 (por exemplo, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 e VH1-69); subgrupo VH2 (por exemplo, VH2-5, VH2-26 e VH2-70); subgrupo VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3- 20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3- 48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 e VH3-74); subgrupo VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59 e VH4-61); subgrupo VH5 (VH5-51); subgrupo VH6 (VH6-1); e subgrupo VH7 (VH7-4 e VH7-81).

[00364] Esses são também descritos em documentos conhecidos (Matsuda e outros (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) e similar, e então versados na técnica podem projetar apropriadamente moléculas de ligação de antígeno da presente invenção com base na informação dessas sequências. É também preferível usar outras estruturas principais integralmente humanas ou sub-regiões de estrutura principal.

[00365] Sequências VK integralmente humanas incluem Preferivelmente, mas não estão limitadas a, por exemplo: A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 e O18 agrupados no subgrupo Vk1; A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1 e O11, agrupados no subgrupo Vk2; A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20 e L25, agrupados nos subgrupo Vk3; B3, agrupado no subgrupo Vk4; B2 (aqui também referido como Vk5-2), agrupado no subgrupo Vk5; e A10, A14 e A26, agrupados no subgrupo Vk6 (Kawasaki e outros (Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028); Schable e Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022); Brensing- Kuppers outros (Gene (1997) 191, 173-181)).

[00366] Sequências VÀ integralmente humanas incluem preferivelmente, mas não estão limitadas a, por exemplo: V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 e V1-22, agrupados no subgrupo VL1; V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 e V2-19, agrupados no subgrupo VL1; V3-2, V3-3 e V3-4, agrupados nos subgrupo VL3; V4-1, V4-2, V4-3, V4-4 e V4-6, agrupados nos subgrupo VL4; e V5-1, V5-2, V5-4 e V5-6, agrupados no subgrupo VL5 (Kawasaki e outros (Genome Res. (1997) 7, 250-261)).

[00367] Normalmente, essas sequências de estrutura principal são diferentes umas das outras em um ou mais resíduos de aminoácido. Essas sequências de estrutura principal podem ser usadas em combinação com “pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP” da pre-sente invenção. Outros exemplos de estruturas principais integralmente humanas usadas em combinação com “pelo menos um resíduo de ami- noácido que altera a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP” da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (por exemplo, Kabat e outros (1991) supra; Wu e outros (J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).

[00368] Sem ser limitado por uma teoria particular, uma razão para a expectativa que o uso de sequências de linhagem germinativa precluda respostas imunes adversas na maioria dos indivíduos é acreditada ser como segue. Como um resultado do processo de maturação por afinidade durante respostas imunes normais, mutação somática ocorre frequentemente nas regiões variáveis da imunoglobulina. Tais mutações ocorrem principalmente em torno de CDRs cujas sequências são hiper- variáveis, mas também afetam resíduos de regiões de estrutura principal. Tais mutações de estrutura principal não existem nos genes da li-nhagem germinativa, e também elas são menos prováveis de ser imu- nogênicas em pacientes. Por outro lado, a população humana normal é exposta à maioria da sequências de estrutura principal expresas a partir de genes da linhagem germinativa. Como um resultado de imunotole- rância, essas estruturas principais de linhagem germinativa são esperadas ter baixa ou nenhuma imunogenicidade em pacientes. Para maximizar a possibilidade de imunotolerância, genes de codificação de região variável podem ser selecionados de um grupo de genes de linhagem germinativa funcional de ocorrência comum.

[00369] Métodos conhecidos tal como mutagênese direcionada a sítio (Kunkel e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492) e PCR por sobreposição e extensão podem ser apropriadamente empregados para produzir as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção onde as sequências de região variável descritas acima, sequências de região variável de cadeia pesada ou leve, sequências de CDR ou sequências de estrutura principal contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antí- geno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP.

[00370] Por exemplo, uma biblioteca que contém uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes umas das outras pode ser construída através da combinação de regiões variáveis de cadeia pesada preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com uma região variável de cadeia leve selecionada como uma sequência de CDR e/ou sequência de estrutura principal contendo originalmente pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação a antígeno do domínio de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP.

[00371] Alternativamente, uma sequência de região variável de cadeia pesada e/ou cadeia leve selecionada como uma sequência de CDR e/ou uma sequência de estrutura principal contendo originalmente pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP conforme acima mencionado pode ser projetada para conter vários resíduos de aminoácido que não o(s) resíduo(s) de aminoácido acima. Aqui, tais resíduos são referidos como “resíduos flexíveis”. O número e a posição de resíduos flexíveis não são particularmente limitados contanto que a atividade de ligação a antígeno da molécula de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo da concentração de um composto específico de tecido. Especificamente, as sequências de CDR e/ou sequências de FR da cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Os resíduos flexíveis e aqueles resíduos que podem ser substituídos em outros aminoácidos para produção de biblioteca podem ser identificados através de introdução de mutações ou através de análise de estrutura de cristal de complexos formados entre um anticorpo e adenosina e/ou ATP. Por exemplo, a partir de análise de estrutura de cristal de complexos formados entre um anticorpo e adenosina e/ou ATP, resíduos no anticorpo que estão envolvidos em ligação à adenosina e/ou ATP podem ser identificados. Podem ser selecionados aminoácidos que podem manter ligação aos compostos em um nível apropriado mesmo quando os resíduos que foram identificados como não estando envolvidos em ligação à adenosina e/ou ATP são substituídos em outros aminoácidos. Desta maneira, é possível projetar uma biblioteca que tem os aminoáci- dos selecionados para os resíduos selecionados. Neste caso, uma biblioteca pode ser projetada compreendendo principalmente moléculas de ligação a antígenos múltiploss para ser uma montagem de moléculas de ligação a antígeno onde resíduos identificados como não estando envolvidos em ligação à adenosina e/ou ATP foram substituídos com aminoácidos que são diferentes uns dos outros. Isto é, a combinação de resíduos flexíveis individuais substituídos com aminoácidos que são diferentes uns dos outros pode prover diversidade de sequência em moléculas de ligação a antígeno contendo os resíduos flexíveis.

[00372] Moléculas de ligação a antígeno podem ser projetadas para incluir resíduos onde pelo menos um dos resíduos identificados estar envolvidos em ligação à adenosina e/ou ligação de ATP se torna qualquer resíduo selecionado do resíduo ou outros resíduos que são diferentes do resíduo. Em uma modalidade não limitante, exemplos de ami- noácidos identificados como estando envolvidos em ligação à adeno- sina e/ou ATP podem incluir um ou mais aminoácidos selecionados de aminoácidos nas posições 52, 52a, 53, 96, 100a e 100c na região vari-ável de cadeia pesada. Em uma modalidade não limitante, exemplos de tais aminoácidos incluem um ou mais aminoácidos selecionados de ami- noácidos incluindo Ser na posição 52, Ser na posição 52a, Arg na posição 53, Gly na posição 96, Leu na posição 100a e Trp na posição 100c contidos na região variável de cadeia pesada. Por exemplo, quando Leu na posição 100a mencionada acima é identificado estar envolvido em ligação à adenosina e/ou ATP, o resíduo de aminoácido na posição 100a nas moléculas de ligação a antígeno incluídas na biblioteca pode ser qualquer resíduo de aminoácido selecionado dos resíduos flexíveis de His, Met, Leu, Arg, Trp ou Tyr, em adição a Leu.

[00373] Em uma modalidade não limitante, exemplos dos resíduos flexíveis podem incluir aminoácidos nas posições 31, 32, 33, 35, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a e 100b contidos na região variável de cadeia pesada. Em outra modalidade não limitante, exemplos de tais aminoácidos podem incluir aminoácidos nas posições 26, 27, 27a, 27b, 27c, 28, 29, 31, 32, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95a, 96 e 97 contidos na região variável de cadeia leve.

[00374] Em uma modalidade não limitante, exemplos dos resíduos flexíveis mencionados acima podem incluir os aminoácidos que seguem contidos na região variável de cadeia pesada: Asp, Gly, Asn, Ser, Arg ou Thr para o aminoácido na posição 31; Ala, Phe, His, Asn, Ser ou Tyr para o aminoácido na posição 32; Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Asn, Gln, Pro, Ser, Arg, Trp, Val, Tyr ou Thr para o aminoácido na posição 33; His, Ser, Thr, Tyr ou Asn para o aminoácido na posição 35; Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Asn, Gln, Pro, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr ou Ser para o aminoácido na posição 50; Ala, Glu, Asp, Gly, Leu, Thr, Ser, Arg ou Asn para o aminoácido na posição 55; Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Gln, Pro, Ser, Thr, Trp, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 56; Ala, Lys, Arg, Thr ou Ile para o aminoácido na posição 57; Asp, Gly, Phe, His, Ser, Thr, Tyr ou Asn para o aminoácido na posição 58; Leuou Tyr para o aminoácido na posição 59; Ala, Ile, Lys, Met, Leu, Arg, Trp, Val, Tyr ou Phe para o aminoácido na posição 95; Ala, Asp, Asn ou Ser para o aminoácido na posição 96; Ala, Asp, Gly, Ile, His, Lys, Met, Leu, Asn, Ser, Val, Tyr ou Arg para o aminoácido na posição 97; Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Met, Leu, Asn, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr ou Lys para o aminoácido na posição 98; Ala, Glu, Asp, Phe, His, Lys, Asn, Gln, Ser, Arg, Trp, Val, Tyr ou Gly para o aminoácido na posição 99; Ala, Glu, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Asn, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr ou Asp para o aminoácido na posição 100; Ala, Phe, Ile, His, Lys, Met, Arg, Trp, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 100a; ou Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr ou Asn para o aminoácido na posição 100b.

[00375] Em uma modalidade não limitante, exemplos dos resíduos flexíveis mencionados acima podem incluir os aminoácidos que seguem contidos na região variável de cadeia leve: Ala, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 26; Thr ou Ser para o aminoácido na posição 27; Gly, Asn, Thr ou Ser para o aminoácido na posição 27a; Asn ou Asp para o aminoácido na posição 27b; Ile ou Val para o aminoácido na posição 27c; Asp ou Gly para o aminoácido na posição 28; Ala, Asp, Phe, Ser, Arg, Thr, Tyr ou Gly para o aminoácido na posição 29; Glu, Asp, Lys ou Asn para o aminoácido na posição 31; Ala, Asp, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 32; Asp, Gly, Lys, Asn, Gln, Ser, Arg, Tyr ou Glu para o aminoácido na posição 50; Asp, Gly, Lys, Asn, Thr ou Val para o aminoácido na posição 51; Ala, Asp, Asn, Thr ou Ser para o aminoácido na posição 52; Glu, Asp, His, Asn, Gln, Ser, Tyr ou Lys para o aminoácido na posição 53; Lys ou Arg para o aminoácido na posição 54; Leu ou Pro para o aminoácido na posição 55; Ala, Gly, Phe, Leu, Asn, Gln, Thr, Val, Tyr ou Ser para o aminoácido na posição 89; Ala, Leu, Thr, Val ou Ser para o aminoácido na posição 90; Ala, Asp, Phe, His, Lys, Asn, Ser, Arg, Thr, Trp, Val ou Tyr para o ami- noácido na posição 91; Glu, Asp, Ser, Arg, Thr, Val, Tyr ou Ala para o aminoácido na posição 92; Ala, Asp, Ile, Asn, Ser, Arg, Thr, Val, Tyr ou Gly para o aminoácido na posição 93; Ala, Asp, Gly, Ile, Asn, Arg, Thr ou Ser para o aminoácido na posição 94; Ala, Glu, Asp, Gly, Phe, Ile, His, Lys, Met, Leu, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Trp, Val, Tyr ou Asn para o aminoácido na posição 95; Ala, Glu, Asp, Gly, Ile, His, Lys, Leu, Gln, Pro, Ser, Arg, Thr, Tyr ou Asn para o aminoácido na posição 95a; Ala, Asp, Gly, Phe, His, Lys, Leu, Asn, Gln, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 96; ou Ala, Gly, Ile, Met, Leu, Ser ou Val para o aminoácido na posição 97.

[00376] Aqui, “resíduo flexível” se refere a variações de resíduo de aminoácido presentes em posições de aminoácido hipervariáveis de regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada onde vários aminoácidos diferentes existem, quando as sequências de aminoácido de anticorpos conhecidos e/ou nativos ou domínios de ligação a antígeno são compa- radoss. As posições hipervariáveis estão geralmente localizadas nas re-giões de CDR. Em uma modalidade, os dados providos por Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda Md., 1987 e 1991) são úteis para determinação das posições hipervariáveis em anticorpos conhecidos e/ou nativos. Ainda, bancos de dados na Internet (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/ e http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html) proveem muitas sequências coletadas de cadeias leves e cadeias pesadas humanas e suas localizações. A informação sobre sequências e localizações é útil para determinação das posições hipervariáveis na presente invenção. De acordo com a presente invenção, quando uma certa posição de aminoácido tem preferivelmente cerca de 2 a cerca de 20, preferivelmente cerca de 3 a cerca de 19, preferivelmente cerca de 4 a cerca de 18, preferivelmente 5 a 17, preferivelmente 6 a 16, preferivelmente 7 a 15, preferivelmente 8 a 14, preferivelmente 9 a 13 e preferivelmente 10 a 12 possíveis variações de resíduo de aminoácido, a posição pode ser dita ser hipervari- ável. Em algumas modalidades, uma certa posição de aminoácido pode ter preferivelmente pelo menos cerca de 2, preferivelmente pelo menos cerca de 4, preferivelmente pelo menos cerca de 6, preferivelmente pelo menos cerca de 8, preferivelmente cerca de 10 e preferivelmente cerca de 12 variações de resíduo de aminoácido possíveis.

[00377] Uma biblioteca da presente invenção que contém uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno tendo sequências diferentes umas das outras pode ser construída combinando regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada com as regiões variáveis de cadeia leve mencionadas acima introduzidas com pelo menos um resíduo de aminoá- cido que muda a atividade de ligação a antígeno dos domínios de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP. Similarmente, uma biblioteca da presente invenção que contém uma pluralidade de moléculas de ligação a antígeno tendo sequências diferentes umas das outras pode também ser produzida combinando as regiões variáveis de cadeia pesada introduzidas com pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação a antí- geno dos domínios de ligação a antígeno dependendo da presença ou ausência de adenosina e/ou ATP, e tendo os outros resíduos de amino- ácido projetados como resíduos flexíveis.

[00378] Quando regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatorizada e regiões variáveis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de ami- noácido que altera a atividade de ligação a antígeno de uma molécula de ligação a antígeno dependendo da concentração do composto específico de tecido alvo foi introduzido são combinadas conforme acima descrito, as sequências das regiões variáveis de cadeia leve podem ser projetadas para conter resíduos flexíveis da mesma maneira que a descrita acima. O número e a posição de tais resíduos flexíveis não são particularmente limitados a modalidades particulares contanto que a atividade de ligação a antígeno de moléculas de ligação a antígeno da presente invenção varie dependendo da presença ou ausência de ade- nosina e/ou ATP. Especificamente, as sequências de CDR e/ou sequên-cias de FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis.

[00379] As regiões variáveis de cadeia pesada preferidas a serem combinas incluem, por exemplo, bibliotecas de região variável aleatori- zadas. Métodos conhecidos são combinados conforme apropriado para produzir uma biblioteca de região variável aleatorizada. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída com base em genes de anticorpo derivados de linfócitos de animais imunizados com um antígeno específico, pacientes com infecções, pessoas com um título de anticorpo elevado em sangue como um resultado de vacinação, pacientes com câncer, ou pacientes com doença au- toimune, pode ser preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada.

[00380] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca sintética produzida substituindo as sequências de CDR de genes V em DNA genômico ou genes V remodelados funcionais com um conjunto de oligonucleotídeos sintéticos contendo sequências codificando conjuntos de códon de um comprimento apropriado pode ser também preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada. Neste caso, uma vez que diversidade de sequência é observada na sequência de CDR3 de cadeia pesada, é também possível substituir a sequência de CDR3 apenas. Um critério para dar origem à diversidade em aminoácidos na região variável de uma molécula de ligação a antígeno é que a diversidade é dada a resíduos de aminoácido nas posições expostas à superfície na molécula de ligação a antígeno. A posição exposta à superfície se refere a uma posição que é considerada ser capaz de ser exposta sobre a superfície e/ou contatada com um antígeno, com base em estrutura, conjunto de estruturas e/ou estrutura modelada de uma molécula de ligação a antígeno. Em geral, tais posições são CDRs. Preferivelmente, posições expostas à superfície são determinadas usando coordenadas de um modelo tridimensional de uma molécula de ligação a antígeno usando um programa de computador tal como o programa InsightII (Accelrys). Posições expostas à superfície podem ser determinadas usando algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). Determinação de posições expostas à superficie pode ser realizada usando software adequado para modelagem de proteína e informação de estrutura tridimensional obtida de um anticorpo. Software que pode ser usado para esses propósitos inclui preferivelmente SYBYL Biopolymer Module software (Tripos Associates). Geralmente ou preferivelmente, quando um algo-ritmo requer um parâmetro de tamanho de entrada de usuário, o “tamanho” de uma sonda que é usada no cálculo é ajustado em cerca de 1,4 Angstrom ou menor em raio. Ainda, métodos para determinação de regiões expostas à superfície e áreas usando software para computadores pessoais são descritos em Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).

[00381] Ainda, em uma modalidade não limitante da presente invenção, aminoácidos da região variável incluindo a região de CDR e/ou a região de estrutura principal podem ser alterados apropriadamente para aperfeiçoar a estabilidade do anticorpo. Em uma modalidade não limi- tante, exemplos de tais aminoácidos podem incluir os aminoácidos de posições 1, 5, 10, 30, 48 e 58. Mais especificamente, exemplos podem incluir Gln na posição 1, Gln na posição 5, Asp na posição 10, Ans na posição 30, Leu na posição 48 e Asn na posição 58. Para o aperfeiçoamento de estabilidade de anticorpo, esses aminoácidos podem substituir aminoácidos correspondentes contidos em uma sequência de linhagem germinativa. Em uma modalidade não limitante, um exemplo de tal sequência de linhagem germinativa pode ser a sequência VH3-21. Neste caso, Gln de posição 1 pode ser substituído com Glu, Gln de posição 5 pode ser substituído com Val, Asp de posição 10 pode ser substituído com Gly, Asn de posição 30 pode ser substituído com Ser, Leu de posição 48 pode ser substituído com Val e Asn de posição 58 pode ser substituído com Tyr.

[00382] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca pura que é construída de genes de anticorpo derivados de linfócitos de indivíduos saudáveis e consiste em sequências puras que são sequências de anticorpo que não têm predisposições em seu repertório pode ser particularmente preferivelmente usada como uma biblioteca de região variável aleatorizada (Gejima e outros, (Human Antibodies (2002) 11, 121-129); Cardoso e outros (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). Aqui, “uma sequência de aminoácido compreendendo uma sequência pura” se refere a uma sequência de aminoácido obtida a partir de tal biblioteca pura.

Região Fc

[00383] Uma região Fc contém uma sequência de aminoácido derivada da região constante de cadeia pesada de um anticorpo. Uma região Fc é uma porção da região constante de cadeia pesada de anticorpo que inclui a extremidade N-terminal da região de dobra, que é o sítio de clivagem de papaína, em um aminoácido em torno da posição 216 (indicado pela numeração EU) e os domínios de dobra, CH2 e CH3. As regiões Fc podem ser obtidas de IgG1 humana; no entanto, elas não são limitadas a nenhuma subclasse de IgG específica. Exemplos preferidos das regiões de Fc incluem regiões de Fc tendo atividade de ligação de FcRn em uma faixa de pH ácido conforme descrito abaixo. Exemplos preferidos das regiões Fc incluem regiões Fc tendo atividade de ligação a receptor de FCY conforme descrito abaixo. Em uma modalidade não limitante, exemplos de tais regiões Fc incluem as regiões Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 5), IgG2 (SEQ ID NO: 6), IgG3 (SEQ ID NO: 7) ou IgG4 (SEQ ID NO: 8). Receptor de FCY (FCYR)

[00384] “Receptor de Fcy” (também chamado “FcyR”) se refere a um receptor capaz de se ligar à região Fc de anticorpos IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 monoclonais; e significa todos os membros pertencentes à família de proteínas substancialmente codificados por genes recepotes de Fcy. Em humanos, a família inclui FcyRI (CD64) incluindo isoformas FcyRIa, FcyRib e FcyRIc; FcyRII (CD32) incluindo isoformas FcyRIIa (incluindo alotipos H131 e R131, i.e., FcyRIIa(H) e FcyRIIa(R)), FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) e FcyRIIc; e FcyRIII (CD16) incluindo a isoforma FcyRIIIa (incluindo alotipos V158 e F158, i.e., FcyRIIIa(V) e FcyRIIIa(F)) e FcyRIIIb (incluindo alotipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb- NA2); bem como todas as isoformas FcyRs, FcyR humanas não identi-ficadas, e seus alótipos; mas a família não é limitada a esses exemplos. Sem ser limitado a eles, FcyRs incluem aqueles derivados de humanos, camundongos, ratos, coelhos e macacos. FcyRs podem ser derivados de qualquer organismo. FcyRs de camundongo incluem FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16) e FcyRIII-2 (FcyRIV, CD16-2), bem como todas as isoformas FCYRS, FCYR de camundongo não identificadas, e seus alótipos, mas eles não são limitados a esses exemplos. Exemplos preferidos de tais receptores de FCY incluem FCYRI (CD64), FcYRIIa (CD32), FcYRIIb (CD32), FcYRIIIa (CD16) e/ou FcYRIIIb (CD16). A sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FCYRI humano são mostradas nas SEQ ID NOs: 9 (NM_000566.3) e 10 (NP_000557.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e a sequência de aminoácido de FcYRIIa humano (alotipo H131) são mostradas nas SEQ ID NOs: 11 (BC020823.1) e 12 (AAH20823.1), respectivamente (alótipo R131 é uma sequência onde o aminoácido na posição 166 de SEQ ID NO:12 é substituído com Arg); a sequência de po- linucleotídeo e sequência de aminoácido de FcYIIb são mostradas nas SEQ ID NOs: 13 (BC146678.1) e 14 (AAI46679.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e sequência de aminoácido de FcYRIIIa são mostradas nas SEQ ID NOs: 15 (BC033678.1) e16 (AAH33678.1), respectivamente; e a sequência de nucleotídeo e sequência de amino- ácido de FcYRIIIb são mostradas nas SEQ ID NOs: 17 (BC128562.1) e18 (AAI28563.1), respectivamente (número de acesso RefSeq ou simi-lar é mostrado em parênteses). Se um receptor de FcY tem atividade de ligação à região Fc de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 monoclonal pode ser avaliada através de avaliação ALPHA (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), métodos BIACORE baseados em ressonância de plasmon de superfície (SPR) (Surface Plasmon Resonance) e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010), em adição aos formatos FACS e ELISA descritos acima.

[00385] Em FcYRI (CD64) incluindo FcYRIa, FcYRIb e FcYRIc e FcYRIII (CD16) incluindo as isoformas FcYRIIIa (incluindo alotipos V158 e F158) e FcYRIIIb (incluindo alotipos FcYRIIIb-NA1 e FcYRIIIb-NA2), a cadeia α que se liga à região Fc de IgG está associada com cadeia Y comum tendo ITAM responsável pela transdução de sinal de ativação intracelular. Entretanto, o domínio citoplásmico de FCYRII (CD32) incluindo isoformas FcYRIIa (incluindo alótipos H131 e R131) e FCYRIIC contém ITAM. Esses receptores são expressos em muitas células imunes tais como macrófagos, mastócitos e células apresentando antígeno. O sinal de ativação transduzido quando da ligação desses receptores à região Fc de IgG resulta em aumento da atividade fagocítica de macró- fagos, produção de citocina inflamatória, degradação de mastócito e a função aumentada de células apresentando antígeno. Receptores de FcY tendo a habilidade em transduzir o sinal de ativação conforme descrito acima são daqui em diante referidos como receptores de FCY de ativação.

[00386] Entretanto, o domínio intracitoplásmico de FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) contém ITIM responsável pela transdução de sinais inibidores. A reticulação entre FcyRIIb e receptor de célula B (BCR) em células B suprime o sinal de ativação de BCR, que resulta em supressão de produção de anticorpo através de BCR. A reticulação de FcyRIII e FcyRIIb em macrófagos suprime a atividade fagocítica e a produção de citocina inflamatória. Receptores de Fcy tendo a habilidade em transduzir o sinal inibidor conforme acima descrito são aqui referidos como receptor de Fcy inibidor. Atividade de Ligação de FCYR de região Fc

[00387] Conforme acima mencionado, regiões Fc tendo uma atividade de ligação de receptor de Fcy são exemplos de regiões Fc compreendidas nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Uma modalidade não limitante de tal região Fc inclui a região Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 5), IgG2 (SEQ ID NO: 6), IgG3 (SEQ ID NO: 7) ou IgG4 (SEQ ID NO: 8). Se um receptor de Fcy tem habiidade de ligação à região Fc de um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 monoclonal pode ser avaliada através de avaliação ALPHA, metodo BIACORE baseado em ressonância de plasmon de superfície (SPR) e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103(11), 4005-4010), em adição aos formatos FACS e ELISA descritos acima.

[00388] Avaliação ALPHA é realizada através da tecnologia ALPHA baseada no princípio descrito abaixo usando dois tipos de contas: contas doadoras e aceitadoras. Um sinal luminescente é detectado apenas quando moléculas ligadas às contas doadoras interagem biologicamente com moléculas ligadas às contas aceitadoras e quando as duas contas estão localizadas em proximidade grande. Excitado por feixe de laser, o fotossensibilizador em uma conta doadora converte oxigênio ao redor da conta em oxigênio singleto excitado. Quando o oxigênio sin- gleto difunde ao redor das contas doadoras e atinge as contas aceitadoras localizadas em proximidade grande, uma reação quimiolumines- cente dentro das contas aceitadoras é induzida. Esta reação resulta por fim em emissão de luz. Se moléculas ligadas às contas doadoras não interagirem com moléculas ligadas às contas aceitadoras, o oxigênio singleto produzido por contas doadoras não atinge as contas aceitadoras e reação quimioluminescente não ocorre.

[00389] Por exemplo, uma molécula de ligação a antígeno marcada com biotina compreendendo região Fc é imobilizada nas contas doadoras e receptor de FCY marcado com S-transferase (GST) é imobilizado nas contas aceitadoras. Na ausência de uma molécula de ligação a an- tígeno compreendendo uma variante da região Fc competitiva, receptor de Fcy interage com uma molécula de ligação a antígeno compreen-dendo uma região Fc nativa, incluindo um sinal de 520 a 620 nm como um resultado. A molécula de ligação a antígeno tendo uma variante de região Fc não marcada compete com a molécula de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc nativa para a interação com receptor de Fcy. A afinidade de ligação relativa pode ser determinada através da quantificação da redução de fluorescência como um resultado de competição. Métodos para biotinilação das moléculas de ligação a antígeno tais como anticorpos usando Sulfo-NHS-biotina ou similar são conhecidos. Métodos apropriados para adição do marcador GST a um receptor de FCY incluem métodos que envolvem polipeptídeos de fusão codificando FCY e GST em estrutura, expressando o gene fundido usando células introduzidas com um vetor ao qual o gene está operavelmente ligado, e então purificação usando uma coluna de glutationa. O sinal induzido pode ser preferivelmente analisado, por exemplo, ajustando a um modelo de competição de um sítio baseado em análise de regressão não linear usando software tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego).

[00390] Uma das substâncias para observação de sua interação é imobilizada como um ligante sobre a camada fina de ouro de um sensor chip. Quando luz é lançada na superfície traseira do sensor chip de ma-neira que reflexo total ocorre na interface entre a camada fina de ouro e vidro, a intensidade de luz refletida é parcialmente reduzida em um certo sítio (sinal SPR). A outra substância para observação de sua interação é injetada como um analito na superfície do sensor chip. A massa de molécula ligante imobilizada aumenta quando o analito se liga ao li- gante. Isso altera o índice de refração de solvente sobre a superfície do sensor chip. A mudança em índice de refração causa uma mudança po- sicional de sinal de SPR (por outro lado, a dissociação muda o sinal de volta para a posição original). No sistema Biacore, a quantidade de mu-dança descrita acima (isto é, a mudança de massa na superfície do sensorchip) é representada em gráfico no eixo vertical, e então a mudança de massa com o tempo é mostrada como dados medidos (sen- sorgrama). Parâmetros cinéticos (constante de taxa de associação (ka) e constante de taxa de dissociação (kd)) são determinadas a partir da curva de sensorgrama e afinidade (KD) é determinada a partir da razão entre essas constantes. Ensaio de inibição é preferivelmente usado nos métodos BIACORE. Exemplos de tal ensaio de inibição são descritos em Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2006) 103(11), 4005-4010. Regiões Fc com ligação a receptor de FCY (FCYR) alterada

[00391] Em adição à região Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO: 5), IgG2 (SEQ ID NO: 6), IgG3 (SEQ ID NO: 7) ou IgG4 (SEQ ID NO: 8), uma região Fc com uma ligação a Fcy alterada, que tem uma atividade de ligação a receptor de Fcy maior do que a região Fc de uma IgG humana nativa pode ser apropriadamente usada como uma região Fc incluída na presente invenção. Aqui, “região Fc de uma IgG humana nativa” se refere a uma região Fc onde a cadeia de açúcar ligada à posição 297 (numeração EU) da região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana mostrada nas SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8 é uma cadeia de açúcar contendo fucose. Tais regiões Fc com ligação a FcyR alterada podem ser produzidas alterando aminoácidos da região Fc de uma IgG humana nativa. Se a atividade de ligação de FcyR de uma região Fc com ligação a FcyR é maior do que aquela de uma região Fc de uma IgG humana nativa pode ser determinada apropriadamente usando métodos descritos na seção mencionada acima sobre atividade de ligação.

[00392] Na presente invenção, “alteração de aminoácidos” ou “alteração de aminoácido” de uma região Fc inclui alteração em uma sequência de aminoácido que é diferente daquela da região Fc de partida. A região Fc de partida pode ser qualquer região Fc, contanto que uma variante modificada da região Fc de partida possa se ligar a receptor de Fcy humano em uma faixa de pH neutro. Ainda, uma região Fc alterada de uma região Fc de partida que já tinha sido alterada pode ser também usada preferivelmente como uma região Fc da presente invenção. A “região Fc de partida” pode se referir ao polipeptídeo em si, uma composição compreendendo a região Fc de partida ou uma sequência de ami- noácido codificando a região Fc de partida. Regiões Fc de partida podem compreender regiões Fc conhecidas produzidas através de recom- binação descrita rapidamente na seção “Anticorpos”. A origem de regiões Fc de partida não é limitada, e elas podem ser obtidas de organismos humanos ou não humanos. Tais organismos incluem preferivelmente camundongos, ratos, porquinhos-da-índia, hamsters, gerbilos, gatos, coelhos, cachorros, cabras, ovelha, bovinos, cavalos, camelos e organismos selecionados de primatas não humanos. Em outra modalidade, regiões Fc de partida podem ser também obtidas de macacos ci- nomólogos, saguis, macacos rhesus, chimpanzés ou humanos. Regiões Fc de partida podem ser obtidas preferivelmente de IgG1 humana; no entanto, elas não são limitadas a nenhuma classe de IgG particular. Isso significa que uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana pode ser usada apropriadamente como uma região Fc de partida, e aqui também significa que uma região Fc de uma classe ou subclasse de IgG arbitrária derivada de qualquer um dos organismos descritos acima pode ser preferivelmente usada como uma região Fc de partida. Exemplos de variantes ou formas alteradas de IgG nativa são descritos em documentos publicados

[00393] (Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; Publicações Internacionais Nos. WO 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 e WO 2006/105338); no entanto, elas nao sao limitadas aos exemplos.

[00394] Exemplos de alterações incluem aquelas com uma ou mais mutações, por exemplo, mutações através de substituição de resíduos de aminoácido de regiões Fc de partida por resíduos de aminoácido di-ferentes através da inserção de um ou mais resíduos de aminoácido nas regiões Fc de partida, ou através de deleção de um ou mais aminoáci- dos a partir da região Fc de partida. Preferivelmente, as sequências de aminoácido de regiões Fc alteradas compreendem pelo menos uma parte da sequência de aminoácido de uma região Fc não nativa. Tais variantes têm necessariamente identidade ou similaridade de sequência de menos do que 100% com sua região Fc de partida. Em uma modalidade preferida, as variantes têm identidade ou similaridade de sequência de aminoácido de cerca de 75% ou menos do que 100%, mais preferivelmente cerca de 80% a menos do que 100%, ainda mais preferivelmente cerca de 85% a menos de 100%, ainda mais preferivelmente cerca de 90% a menos do que 100% e ainda mais preferivelmente cerca de 95% a menos do que 100% com a sequência de aminoácido de sua região Fc de partida. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, pelo menos um aminoácido é diferente entre uma região Fc alterada de ligação a FCYR da presente invenção e sua região Fc de partida. Diferença de aminoácido entre uma região Fc alterada de ligação a FCYR da presente invenção e sua região Fc de partida pode ser também preferivelmente especificada com base nas diferenças de aminoá- cido específicas nas posições de aminoácido específicas descritas acima através de numeração EU. Exemplos de métodos de preparação de tais variantes são mostrados na seção “Alteração de aminoácidos”.

[00395] Incluída nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção, uma região Fc com ligação a FcyR alterada, que tem uma ati-vidade de ligação a receptor de FcyR maior do que aquela de uma região Fc de uma IgG humana nativa (uma região Fc alterada em ligação a FcyR), pode ser obtida através de qualquer método. Especificamente, a região Fc com ligação a FcyR alterada pode ser obtida alterando os aminoácidos de uma imunoglobulina humana tipo IgG usada como uma região Fc de partida. Regiões Fc preferidas das imunoglobulinas tipo IgG para alteração incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas mostradas na SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8 (IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, respectivamente, e suas variantes).

[00396] Aminoácidos de quaisquer posições podem ser alterados para outros aminoácidos, contanto que a atividade de ligação com relação ao receptor de Fcy seja maior do que aquela da região Fc de uma IgG humana nativa. Quando a molécula de ligação a antígeno contém uma região Fc IgG1 humana como a região Fc humana, ela contém pre- ferivelmente uma alteração que fornece o efeito de uma atividade de ligação a receptor de FCY maior do que a região Fc de uma IgG humana nativa, onde a cadeia de açúcar ligada na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo ribose. Tais alterações de aminoácido foram relatadas, por exemplo, em publicações internacionais tais como WO2007/024249, WO2007/021841, WO2006/031370, WO2000/042072, WO2004/029207, WO2004/099249, WO2006/105338, WO2007/041635, WO2008/092117, WO2005/070963, WO2006/020114, WO2006/116260 e WO2006/023403.

[00397] Exemplos de tais aminoácidos que podem ser alterados incluem pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 (numeração EU). Uma região Fc (região Fc com ligação a FcyR alterada) tendo uma atividade de ligação a receptor de Fcy maior do que aquela de uma região Fc de uma IgG humana nativa pode ser obtida através da alteração desses aminoácidos.

[00398] Exemplos de alterações particularmente preferidas para uso na presente invenção incluem pelo menos uma ou mais alterações de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em:

[00399] Lys ou Tyr para o aminoácido de posição 221;

[00400] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido de posição 222;

[00401] Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido de posição 223;

[00402] Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido de posição 224;

[00403] Glu, Lys ou Trp para o aminoácido de posição 225;

[00404] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido de posição 227;

[00405] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido de posição 228;

[00406] Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido de posição 230;

[00407] Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido de posição 231;

[00408] Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido de posição 232;

[00409] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 233;

[00410] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 234;

[00411] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 235;

[00412] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 236;

[00413] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 237;

[00414] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 238;

[00415] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 239;

[00416] Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido de posição 240;

[00417] Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 241;

[00418] Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 243;

[00419] His para o aminoácido de posição 244;

[00420] Ala para o aminoácido de posição 245;

[00421] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido de posição 246;

[00422] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o ami- noácido de posição 247;

[00423] Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido de posição 249;

[00424] Glu ou Gln para o aminoácido de posição 250;

[00425] Phe para o aminoácido de posição 251;

[00426] Phe, Met ou Tyr para o aminoácido de posição 254;

[00427] Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido de posição 255;

[00428] Ala, Met ou Pro para o aminoácido de posição 256;

[00429] Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido de posição 258;

[00430] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido de posição 260;

[00431] Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido de posição 262;

[00432] Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido de posição 263;

[00433] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 264;

[00434] Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 265;

[00435] Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido de posição 266;

[00436] Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 267;

[00437] Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido de posição 268;

[00438] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 269;

[00439] Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 270;

[00440] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 271;

[00441] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 272;

[00442] Phe ou Ile para o aminoácido de posição 273;

[00443] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 274;

[00444] Leu ou Trp para o aminoácido de posição 275;

[00445] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 276;

[00446] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido de posição 278;

[00447] Ala para o aminoácido de posição 279;

[00448] Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido de posição 280;

[00449] Asp, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido de posição 281;

[00450] Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido de posição 282;

[00451] Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido de posição 283;

[00452] Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido de posição 284;

[00453] Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 285;

[00454] Glu, Gly, Pro ou Tyr para o aminoácido de posição 286;

[00455] Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido de posição 288;

[00456] Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoá- cido de posição 290;

[00457] Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido de posição 291;

[00458] Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido de posição 292;

[00459] Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 293;

[00460] Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 294;

[00461] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 295;

[00462] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido de posição 296;

[00463] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 297;

[00464] Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 298;

[00465] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 299;

[00466] Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido de posição 300;

[00467] Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido de posição 301;

[00468] Ile para o aminoácido de posição 302;

[00469] Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido de posição 303;

[00470] Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido de posição 304;

[00471] Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido de posição 305;

[00472] Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido de posição 311;

[00473] Phe para o aminoácido de posição 313;

[00474] Leu para o aminoácido de posição 315;

[00475] Glu ou Gln para o aminoácido de posição 317;

[00476] His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoá- cido de posição 318;

[00477] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 320;

[00478] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 322;

[00479] Ile para o aminoácido de posição 323;

[00480] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 324;

[00481] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 325;

[00482] Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 326;

[00483] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 327;

[00484] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 328;

[00485] Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 329;

[00486] Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 330;

[00487] Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 331;

[00488] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 332;

[00489] Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido de posição 333;

[00490] Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro ou Thr para o aminoácido de posição 334;

[00491] Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 335;

[00492] Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido de posição 336;

[00493] Glu, His ou Asn para o aminoácido de posição 337;

[00494] Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido de posição 339;

[00495] Ala ou Val para o aminoácido de posição 376;

[00496] Gly ou Lys para o aminoácido de posição 377;

[00497] Asp para o aminoácido de posição 378;

[00498] Asn para o aminoácido de posição 379;

[00499] Ala, Asn ou Ser para o aminoácido de posição 380;

[00500] Ala ou Ile para o aminoácido de posição 382;

[00501] Glu para o aminoácido de posição 385;

[00502] Thr para o aminoácido de posição 392;

[00503] Leu para o aminoácido de posição 396;

[00504] Lys para o aminoácido de posição 421;

[00505] Asn para o aminoácido de posição 427;

[00506] Phe ou Leu para o aminoácido de posição 428;

[00507] Met para o aminoácido de posição 429;

[00508] Trp para o aminoácido de posição 434;

[00509] Ile para o aminoácido de posição 436; e

[00510] Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido de posição 440;

[00511] conforme indicado por numeração EU na região Fc. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado; um aminoácido pode ser alterado em apenas um sítio ou aminoácidos po-dem ser alterados em dois ou mais sítios. Exemplos de combinações para alterações de aminoácido em dois ou mais sítios incluem aqueles descritos na Tabela 1 (Tabelas 1-1 a 1-3).

[00512] A tabela 1-2 é uma continuação da Tabela 1-1. Tabela 1-2

[00513] A Tabela 1-3 é uma continuação da Tabela 1-2. Tabela 1-3

[00514] Para as condições de pH para medir a atividade de ligação do domínio de ligação de receptor de FCY e o receptor de FCY contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção, condições em uma faixa de pH ácido ou em uma faixa de pH neutro podem ser usadas adequadamente. A faixa de pH ácido ou faixa de pH neutro, como uma condição para medir a atividade de ligação do domínio de ligação de receptor de Fcy e o receptor de Fcy contido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção, geralmente indica pH 5,8 a pH 8,0. Preferivelmente, ela é uma faixa indicada com valores de pH arbitrários entre pH 6,0 e pH 7,4; e preferivelmente ela é selecionada de pH 6,0, pH 6,1, pH 6,2, pH 6,3, pH 6,4, pH 6,5, pH 6,6, pH 6,7, pH 6,8, pH 6,9, pH 7,0, pH 7,1, pH 7,2, pH 7,3 e pH 7,4; e particularmente preferivelmente ela é pH 6,15a 7,4, que está próximo do pH de tecidos cancerosos (Vau- pel e outros, Cancer Res. (1989) 49, 6449-6665). Com relação à temperatura usada como uma condição de medição, a afinidade de ligação entre um domínio de ligação de receptor de FCY e um receptor de FCY humano pode ser avaliada em qualquer temperatura entre 10° C e 50° C. Preferivelmente, uma temperatura entre 15° C e 40° C é usada para determinar a afinidade de ligação entre um domínio de ligação a receptor de Fcy humano e receptor de Fcy. Mais preferivelmente, qualquer temperatura entre 20° C e 35° C, tal como qualquer temperatura única de a partir de 20°C, 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C e 35°C pode ser similarmente usada para determinar a afinidade de ligação entre um domínio de ligação de receptor de Fcy e um receptor de Fcy. Uma temperatura de 25° C é um exemplo não limitante em uma modalidade da presente invenção.

[00515] Aqui, “região Fc com ligação a FcyR alterada tem uma atividade de ligação a receptor de Fcy maior do que a região Fc nativa” significa que a atividade de ligação a receptor de Fcy humano da região Fc com ligação a Fcy alterada com relação a qualquer um dos receptores de Fcy humanos de FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, e/ou FcyRIIIb é maior do que a atividade de ligação da região Fc nativa com relação a esses receptor de Fcy humanos. Por exemplo, quer dizer que com base no método analítico descrito acima, em comparação com a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc de IgG humana nativa, a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc com ligação a Fcy alterada é 105% ou mais, preferivelmente 110% ou mais, 115% ou mais, 120% ou mais, 125% ou mais, particularmente preferivelmente 130% ou mais, 135% ou mais, 140% ou mais, 145% ou mais, 150% ou mais, 155% ou mais, 160% ou mais, 165% ou mais, 170% ou mais, 175% ou mais, 180% ou mais, 185% ou mais, 190% ou mais, 195% ou mais, 2-vezes ou mais, 2,5-vezes ou mais, 3-vezes ou mais, 3,5-vezes ou mais, 4-ve- zes ou mais, 4,5-vezes ou mais, 5-vezes ou mais, 7,5-vezes ou mais, 10-vezes ou mais, 20-vezes ou mais, 30-vezes ou mais, 40-vezes ou mais, 50-vezes ou mais, 60-vezes ou mais, 70-vezes ou mais, 80-vezes ou mais, 90-vezes ou mais ou 100-vezes ou mais. A região Fc de partida pode ser usada como uma região Fc nativa, e regiões Fc nativas de anticorpos da mesma subclasse podem ser também usadas.

[00516] Na presente invenção, uma região Fc de uma IgG humana nativa onde a cadeia de açúcar ligada ao aminoácido na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fucose, é adequadamente usada como uma região Fc nativa de IgG humana a ser usada como um controle. Se ou não a cadeia de açúcar ligada ao aminoácido na posição 297 (numeração EU) é uma cadeia de açúcar contendo fu-cose pode ser determinado usando a técnica descrita no Documento de Não Patente 6. Por exemplo, é possível determinar se ou não a cadeia de açúcar ligada à região Fc de IgG humana nativa é uma cadeia de açúcar contendo fucose através de um método tal como o descrito abaixo. Cadeia de açúcar é dissociada de uma IgG humana nativa a ser testada, através da reação da IgG humana nativa com N-glicosidase F (Roche Diagnostics) (Weitzhandler e outros (J. Pharma. Sciences (1994) 83, 12, 1670-1675)). Em seguida, um concentrado seco de uma solução de reação a partir da qual proteína foi removida através de reação com etanol (Schenk e outros (J. Clin. Investigation (2001) 108 (11) 1687-1695)) é fluorescentemente marcado com 2-aminopiridina (Bigge e outros (Anal. Biochem. (1995) 230 (2) 229-238)). Reagentes são removidos através de extração de sólido usando um cartucho de celulose e a cadeia de açúcar modificada com 2-AB fluorescentemente marcada é analisada através de cromatografia de fase normal. É possível determinar se ou não a cadeia de açúcar ligada à região Fc nativa de uma IgG humana é uma cadeia de açúcar contendo fucose através da ob-servação dos picos de cromatograma detectados.

[00517] Como uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc nativa de um anticorpo da mesma subclasse, que deve ser usada como um controle, uma molécula de ligação a antígeno tendo uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal pode ser adequadamente usada. As estruturas das regiões Fc são descritas na SEQ ID NO: 5 (A é adicionado ao terminal N de No. de Acesso no Banco de Dados AAC82527.1), SEQ ID NO: 6 (A é adicionado ao terminal N de No. de Acesso no Banco de Dados AAB59393.1), SEQ ID NO: 7 (No. de Acesso no Banco de Dados CAA27268.1) e SEQ ID NO: 8 (A é adicionado ao terminal N do No. de Acesso no Banco de Dados AAB59394.1). Ainda, quando uma molécula de ligação a antígeno contendo contendo uma região Fc de um isotipo de anticorpo particular é usada como a substância de teste, o efeito da molécula de ligação a antígeno contendo a região Fc de teste sobre atividade de ligação a receptor de FCY é testado usando como um controle uma molécula de ligação a antígeno tendo uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal deste isotipo particular. Desta maneira, moléculas de ligação a antígeno contendo uma região Fc à qual atividade de ligação a receptor de Fcy é demonstrada ser alta são adequadamente selecionadas. Regiões Fc tendo uma atividade de ligação seletiva com relação ao receptor de FCY

[00518] Exemplos de domínios de ligação a receptor de Fcy adequados para uso na presente invenção incluem domínios de ligação a receptor de Fcy tendo uma atividade de ligação maior a um receptor de Fcy particular do que outros receptor de Fcy (domínios de ligação a receptor de Fcy tendo uma atividade de ligação seletiva para um receptor de FCY). Quando um anticorpo é usado como a molécula de ligação a antígeno (quando uma região Fc é usada como o domínio de ligação a receptor de Fcy), uma molécula de anticorpo única pode apenas se ligar a uma molécula de receptor de Fcy única. Desta maneira, uma molécula de ligação a antígeno única não pode se ligar a outros FcyRs de ativação em um estado ligado a receptor de Fcy inibidor, e não pode se ligar a outros receptor de Fcy de ativação ou receptor de Fcy inibidor em um estado ligado a receptor de Fcy de ativação. Regiões Fc com uma atividade de ligação maior com relação a um receptor de Fc de ativação do que a atividade de ligação com relação a um receptor de FCY inibidor

[00519] Conforme acima descrito, receptor de Fcy de ativação preferidos incluem FcyRI (CD64) incluindo FcyRIa, FcyRib e FcyRIc; FcyRIIa; e FcyRIII (CD16) incluindo FcyRIIIa (incluindo alotipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alotipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2). Entretanto, exemplos preferidos de receptor de Fcy inibidor incluem FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2).

[00520] Aqui, um exemplo de um caso onde a atividade de ligação com relação a um certor receptor de Fcy é maior do que a atividade de ligação com relação a outro receptor de Fcy é o caso onde a atividade de ligação com relação a um receptor de Fcy de ativação é maior do que a atividade de ligação com relação a um receptor de Fcy inibidor. Neste caso, a atividade de ligação da região Fc com relação a qualquer um dos receptor de Fcy humanos de FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb é dita ser maior do que a atividade de ligação com relação a FcyRIIb. Por exemplo, isso significa que, com base em um método analítico descrito acima, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno contendo a região Fc com relação a qualquer um dos receptor de Fcy humanos, FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb, é 105% ou mais, preferivelmente 110% ou mais, 120% ou mais, 130% ou mais, 140% ou mais, particularmente preferivelmente 150% ou mais, 160% ou mais, 170% ou mais, 180% ou mais, 190% ou mais, 200% ou mais, 250% ou mais, 300% ou mais, 350% ou mais, 400% ou mais, 450% ou mais, 500% ou mais, 750% ou mais, 10-vezes ou mais, 20-vezes ou mais, 30-vezes ou mais, 40-vezes ou mais, 50-vezes ou mais, 60-vezes, 70-vezes, 80-vezes, 90-vezes ou 100-vezes ou mais comparado com a atividade de ligação com relação a FcYRIIb. A região Fc com uma atividade de ligação maior com relação à ativação de receptor de FCY do que os receptor de FCY inibidor pode ser favoravelmente incluída em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujo domínio de ligação a antígeno se liga a uma molécula do tipo membrana. Anticorpos IgG contendo tais regiões Fc são conhecidos aumentar a atividade de ADCC mencionada abaixo. Desta maneira, moléculas de ligação a an- tígeno contendo a região Fc são também úteis como moléculas de ligação a antígeno a serem incluídas nas composições farmacêuticas da presente invenção.

[00521] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos da região Fc com uma atividade de ligação maior com relacao a receptor de Fcy de ativação do que receptor de Fcy inibidor (ou tendo uma atividade de ligação seletiva com relação a receptor de Fcy inibidor) incluem preferivelmente regiões Fc onde pelo menos um ou mais ami- noácidos selecionados do grupo consistindo nos aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 indicadas pela numeração EU mencionada acima, foram alterados para aminoácidos diferentes daqueles da região Fc nativa.

[00522] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos da região Fc com uma atividade de ligação maior com relação a receptores de FCY de ativação do que receptores de FCY inibidores (ou tendo uma atividade de ligação seletiva com relação a receptor de FCY inibidor) incluem preferivelmente regiões Fc onde aminoácidos múltiplos indicados nas Tabelas 1-1 a 1-3 foram alterados para aminoácidos diferentes daqueles da região Fc nativa. Regiões Fc cuja atividade de ligação com relação a um receptor de FCY inibidor é maior do que a atividade de ligação com relação a um receptor de FCY de ativação

[00523] Aqui, um exemplo de um caso onde atividade de ligação com relação a um certo receptor de Fcy é maior do que a atividade de ligação com relação a outro receptor de Fcy é o caso onde a atividade de ligação com relação a um receptor de Fcy inibidor é maior do que a atividade de ligação com relação a um receptor de Fcy de ativação. Neste caso, a atividade de ligação da região Fc com relação a FcyRIIb é dita ser maior do que a atividade de ligação com relação a qualquer um dos receptor de Fcy humanos de FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb. Por exemplo, isso significa que, com base no método analítico descrito acima, a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno contendo a região Fc com relação a FcyRIIb é 105% ou mais, preferivelmente 110% ou mais, 120% ou mais, 130% ou mais, 140% ou mais, particularmente preferivelmente 150% ou mais, 160% ou mais, 170% ou mais, 180% ou mais, 190% ou mais, 200% ou mais, 250% ou mais, 300% ou mais, 350% ou mais, 400% ou mais, 450% ou mais, 500% ou mais, 750% ou mais, 10-vezes ou mais, 20-vezes ou mais, 30-vezes ou mais, 40-vezes ou mais, 50-vezes, 60-vezes, 70-vezes, 80-vezes, 90- vezes ou 100-vezes ou mais comparado com a atividade de ligação com relação a qualquer um dos receptor de FCY humanos de FcYRIa, FcYRIIa, FcYRIIIa e/ou FcYRIIIb. A região Fc com uma atividade de ligação maior com relação a receptor de Fcy inibidor do que receptor de Fcy de ativação pode ser favoravelmente incluída em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção cujo domínio de ligação a antígeno se liga a uma molécula solúvel.

[00524] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos da região Fc com uma atividade de ligação maior com relação a receptor de Fcy inibidor do que receptor de Fcy de ativação (ou tendo uma atividade de ligação seletiva com relação a receptor de Fcy inibidor) incluem preferivelmente regiões Fc onde, dos aminoácidos da região Fc acima, os aminoácidos em 238 e 328 indicados pela numeração EU são alterados para os aminoácidos diferentes daqueles da região Fc nativa.

[00525] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos da região Fc com uma atividade de ligação maior com relação a receptor de Fcy inibidor do que para receptor de Fcy de ativação (ou tendo uma atividade de ligação seletiva com relação a receptor de Fcy inibidor) incluem preferivelmente regiões Fc alteradas em qualquer um ou mais dos aminoácidos na região Fc acima conforme indicado pela numeração EU: o aminoácido na posição 238 (indicado pela numeração EU) é alterado para Asp; e o aminoácido na posição 328 (indicado pela numeração EU) é alterado para Glu. Ainda, como as regiões Fc tendo uma atividade de ligação seletiva com relação a receptor de Fcy inibidor, as regiões Fc ou alterações descritas na US 2009/0136485 podem ser adequadamente selecionadas.

[00526] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, exemplos preferidos incluem regiões Fc alteradas em qualquer um ou mais dos aminoácidos na região Fc acima conforme indicado pela numeração EU: o aminoácido na posição 238 (indicado pela numeração EU) para Asp; e o aminoácido na posição 328 (indicado pela numeração EU) para Glu.

[00527] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, exemplos preferidos incluem regiões Fc que têm uma ou mais das alterações exemplificadas no PCT/JP2012/054624; substituição de Pro na posição 238 (indicado pela numeração EU) com Asp; alteração do aminoácido na posição 237 (indicado pela numeração EU) para Trp; alteração do aminoácido na posição 237 (indicado pela numeração EU) para Phe; alteração do aminoácido na posição 267 (indicado pela numeração EU) para Val; alteração do aminoácido na posição 267 (indicado pela numeração EU) para Gln; alteração do aminoácido na posição 268 (indicado pela numeração EU) para Asn; alteração do aminoácido na posição 271 (indicado pela numeração EU) para Gly; alteração do aminoácido na posição 326 (indicado pela numeração EU) para Leu; alteração do aminoácido na posição 326 (indicado pela numeração EU) para Gln; alteração do aminoácido na posição 326 (indicado pela numeração EU) para Glu; alteração do aminoácido na posição 326 (indicado pela numeração EU) para Met; alteração do aminoácido na posição 239 (indicado pela numeração EU) para Asp; alteração do aminoácido na posição 267 (indicado pela numeração EU) para Ala; alteração do ami- noácido na posição 234 (indicado pela numeração EU) para Trp; alteração do aminoácido na posição 234 (indicado pela numeração EU) para Tyr; alteração do aminoácido na posição 237 (indicado pela numeração EU) para Ala; alteração do aminoácido na posição 237 (indicado pela numeração EU) para Asp; alteração do aminoácido na posição 237 (indicado pela numeração EU) para Glu; alteração do aminoácido na posição 237 (indicado pela numeração EU) para Leu; alteração do aminoá- cido na posição 237 (indicado pela numeração EU) para Met; alteração do aminoácido na posição 237 (indicado pela numeração EU) para Tyr; alteração do aminoácido na posição 330 (indicado pela numeração EU) para Lys; alteração do aminoácido na posição 330 (indicado pela numeração EU) para Arg, alteração do aminoácido na posição 233 (indicado pela numeração EU) para Asp, alteração do aminoácido na posição 268 (indicado pela numeração EU) para Asp, alteração do amino- ácido na posição 268 (indicado pela numeração EU) para Glu, alteração do aminoácido na posição 326 (indicado pela numeração EU) para Asp, alteração do aminoácido na posição 326 (indicado pela numeração EU) para Ser, alteração do aminoácido na posição 326 (indicado pela numeração EU) para Thr, alteração do aminoácido na posição 323 (indicado pela numeração EU) para Ile, alteração do aminoácido na posição 323 (indicado pela numeração EU) para Leu, alteração do aminoácido na posição 323 (indicado pela numeração EU) para Met, alteração do ami- noácido na posição 296 (indicado pela numeração EU) para Asp, alteração do aminoácido na posição 326 (indicado pela numeração EU) para Ala, alteração do aminoácido na posição 326 (indicado pela numeração EU) para Asn e alteração do aminoácido na posição 330 (indicado pela numeração EU) para Met. Regiões Fc com cadeias de açúcar modificadas

[00528] Regiões Fc contidas nas moléculas de ligação a antígeno providas pela presente invenção podem incluir regiões Fc que foram modificadas de maneira que a composição das regiões Fc ligadas à cadeia de açúcar tem uma porcentagem alta de regiões Fc ligadas à cadeia de açúcar deficiente em fucose ou uma alta porcentagem de regiões Fc adicionadas à N-acetilglicosamina bifurcadas. Remoção de resíduo fucose de N-acetilglicosamina na extremidade de redução das cadeias de açúcar do complexo de ligação de N-glicosídeo ligadas à região Fc de anticorpo é conhecida aumentar a afinidade a FcYRIIIa (Documento de Não Patente 6). É conhecido que para anticorpos IgG1 contendo tais regiões Fc, a atividade de ADCC mencionada abaixo é aumentada; desta maneira, moléculas de ligação a antígeno contendo tais regiões Fc são úteis como moléculas de ligação a antígeno a serem contidas em composições farmacêuticas da presente invenção. Exemplos de anticorpos com resíduo fucose removido de N-acetilglicosamina na extremidade de redução de cadeias de açúcar do complexo de ligação de N-glicosídeo ligadas às regiões Fc de anticorpo são anticorpos tais como:

[00529] anticorpos modificados por glicosilação (por exemplo, WO 1999/054342); e

[00530] anticorpos deficientes em fucose ligada a cadeias de açúcar (por exemplo, WO 2000/061739, WO 2002/031140 e WO 2006/067913).

[00531] Mais especificamente, para produzir anticorpos deficientes em fucose ligada a cadeias de açúcar (por exemplo, WO 2000/061739, WO 2002/031140 e WO 2006/067913) como outra modalidade não limi- tante de anticorpos com resíduo fucose removido de N-acetilglicosa- mina na extremidade de redução de cadeias de açúcar de complexo de ligação a N-glicosídeo ligadas às regiões Fc de anticorpo, células hospedeiro tendo uma baixa habilidade de adicionar fucose às cadeias de açúcar são produzidas alterando a atividade de formação da estrutura da cadeia de açúcar do polipeptídeo a ser glicosilado. Anticorpos que não têm fucose em suas cadeias de açúcar podem ser coletados da cultura das células hospedeiro através da expressão de um gene de anticorpo desejado nas células hospedeiro. Exemplos não limitantes adequados da atividade para formar a estrutura da cadeia de açúcar de um polipeptídeo incluem a atividade de um transportador ou uma enzima selecionado do grupo consistindo em fucosiltransferase (EC 2.4.1.152), transportador de fucose (SLC35C1), GMD (GDP-manose- 4,6-desidratase) (EC 4.2.1.47), Fx (GDP-ceto-6-desoximanose-3,5-epi- merase, 4-redutase) (EC 1.1.1.271) e GFPP (GDP-β-L-fucose pirofos- forilase (EC 2.7.7.30). Contanto que essas enzimas ou transportadores possam exibir suas atividades, suas estruturas não são necessariamente especificadas. Aqui, proteínas que podem exibir essas atividades são referidas como “proteínas funcionais”. Em uma modalidade não limitante, métodos para alteração dessas atividades incluem deleção dessas atividades. Para produzir células hospedeiro deficientes nessas atividades, métodos conhecidos tal como um método para des-truir os genes dessas proteínas funcionais para torná-las incapazes de fucionar podem ser apropriadamente empregados (por exemplo, WO2000/061739, WO2002/031140 e WO2006/067913). Células hospedeiro deficientes em tais atividades podem ser produzidas, por exemplo, através de um método que destrói os genes dessas proteínas funcionais endógenas para células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6, células HEK293, células de hibridoma, ou similar, de maneira que os genes sejam incapazes de funcionar.

[00532] Anticorpos que têm uma cadeia de açúcar contendo GlcNAc bifurcada (WO2002/079255, etc) são conhecidos. Em uma modalidade não limitante, células hospedeiro para expressão de um gene que codifica uma proteína funcional tendo atividade de GnTIII (β-1,4-manosil- glicoproteína 4-β-N-acetilglicosaminiltransferase) (EC 2.4.1.144) ou ati-vidade de GalT (β-1,4-galactosiltranserase (EC 2.4.1.39) são produzidas para preparar anticorpos que têm cadeias de açúcar contendo Glc- NAc bifurcada. Em outra modalidades não limitante adequada, células hospedeiro que co-expressam, em adição às proteínas funcionais mencionadas acima, um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de ManII humana (manosidase II) (3.2.1.114), um gene codificando uma proteína funcional tendo tividade de GnTI (β-1,2-acetilglico- saminiltransferase I) (EC 2.4.1.94), um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de GnTII (β-1,2-acetilglicosaminiltransferase II) (EC 2.4.1.143), um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de ManI (manosidase) (EC 3.2.1.113) e α-1,6-fucosil transferase (EC 2.4.1.68) são produzidas (WO 2004/065540).

[00533] Anticorpos com resíduo fucose removido de N-acetilglicosa- mina na extremidade de redução de cadeias de açúcar do complexo de ligação de N-glicosídeo ligadas às regiões Fc de anticorpo e anticorpos tendo cadeias de açúcar contendo GlcNAc bifurcada podem ser produzidos, respectivamente, através de transfecção de um vetor de expressão contendo o gene de anticorpo em células hospedeiro com uma baixa habilidade em adicionar fucose a cadeias de açúcar e em células hospedeiro tendo a atividade para formar cadeias de açúcar contendo estrutura de GlcNAc bifurcada. Métodos para produção desses anticorpos podem ser aplicados a métodos de produção de moléculas de ligação a antígeno contendo regiões Fc alteradas que foram modificadas de maneira que a composição das regiões Fc ligadas à cadeia de açúcar da presente invenção tem uma porcentagem alta de regiões Fc ligadas à cadeia de açúcar deficientes em fucose ou uma porcentagem maior de regiões Fc adicionadas à N-acetilglicosamina bifurcada. A composição das regiões Fc ligadas à cadeia de açúcar contidas nas moléculas de ligação a antígeno da presente invenção produzidas através de tais métodos de produção pode ser avaliada através do método descrito em “regiões Fc com ligação a receptor de FCY (FCYR) alterada” acima. Moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas ou moléculas de ligação a antígeno multiparatrópicas

[00534] Uma molécula de ligação a antígeno compreendendo pelo menos dois domínios de ligação a antígeno onde pelo menos um dos domínios de ligação a antígeno se liga a um primeiro epítopo em uma molécula antigênica, e pelo menos outro dos domínios de ligação a an- tígeno se liga a um segundo epítopo na molécula antigênica, é chamada “molécula de ligação a antígeno multiespecífica” do ponto de vista de sua especificidade de reação. Quando dois tipos de domínios de ligação a antígeno contidos em uma molécula de ligação a antígeno única permitem ligação a dois epítopos diferentes pela molécula de ligação a antígeno, esta molécula é chamada “molécula de ligação a antígeno bi- específica”. Quando três tipos de domínios de ligação a antígeno contidos em uma molécula de ligação a antígeno única permitem ligação a três epítopos diferentes pela molécula de ligação a antígeno, esta molécula de ligação a antígeno é chamada “molécula de ligação a antígeno triespecífica”.

[00535] Um parátopo no domínio de ligação a antígeno que se liga ao primeiro epítopo na molécula de antígeno e um parátopo no domínio de ligação de antígeno que se liga ao segundo epítopo que é estruturalmente diferente do primeiro epítopo têm estruturas diferentes. Desta maneira, uma molécula de ligação a antígeno compreendendo pelo menos dois domínios de ligação a antígeno onde pelo menos um dos domínios de ligação a antígeno se liga a um primeiro epítopo em uma molécula de antígeno, e pelo menos outro do domínio de ligação a antígeno se liga a um segundo epítopo na molécula de antígeno, é chamada “molécula de ligação a antígeno multiparatópica” do ponto de vista de especificidade de sua estrutura. Quando dois tipos de domínios de ligação a antígeno contidos em uma molécula de ligação a antígeno permitem ligação a dois epítopos diferentes pela molécula de ligação a antígeno, esta molécula é chamada “molécula de ligação a antígeno biparatópica”. Quando três tipos de domínios de ligação a antígeno contidos em uma molécula de ligação a antígeno única permitem ligação a três epítopos diferentes pela molécula de ligação a antígeno, esta molécula é chamada “molécula de ligação a antígeno triparatópica”.

[00536] Moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas ou multipa- ratópicas mutivalentes compreendendo um ou mais domínios de ligação a antígeno e métodos para sua preparação são descritas nos documentos de não patente tais como Conrath e outros (J. Biol. Chem. (2001) 276 (10) 7346-7350), Muyldermans (Rev. Mol. Biotech. (2001) 74, 277- 302) e Kontermann R.E. (2011) Bispecific Antibodies (Springer-Verlag) e em documentos de patente tais como WO1996/034103 e WO1999/023221. As moléculas de ligação a antígeno da presente invenção podem ser produzidas usando moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas ou multiparatópicas, e seus métodos de preparação descritos nesses documentos.

Anticorpos biespecíficos e métodos para sua produção

[00537] Em uma modalidade, anticorpos biespecíficos e métodos para produção deles são mencionados abaixo como exemplos das moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas ou multiparatópicas mencionadas acima e métodos para sua preparação. Anticorpos biespecífi- cos são anticorpos compreendendo dois tipos de regiões variáveis que se ligam especificamente a epítopos diferentes. Anticorpos biespecífi- cos do tipo IgG podem ser secretados de um hibridoma híbrido (qua-droma) produzido por fusão de dois tipos de hibridomas que produzem anticorpos IgG (Milstein e outros, Nature (1983) 305, 537-540).

[00538] Quando um anticorpo biespecífico é produzido usando técnicas de recombinação tais como aquelas descritas na seção mencionada acima sobre anticorpos, pode ser adotado um método que introduz genes codificando cadeias pesadas contendo os dois tipos de regiões variáveis de interesse em células que os co-expressam. No entanto, mesmo quando apenas a combinação de cadeia pesada é considerada, tal método de co-expressão produzirá uma mistura de (i) uma combinação de um par de cadeias pesadas onde uma das cadeias pesadas con-tém uma região variável que se liga a um primeiro epítopo e a outra cadeia pesada contém uma região variável que se liga a um segundo epítopo, (ii) uma combinação de um par de cadeias pesadas que inclui apenas cadeias pesadas contendo uma região variável que se liga ao primeiro epítopo e (iii) uma combinação de um par de cadeias pesadas que inclui apenas cadeias pesadas contendo uma região variável que se liga ao segundo epítopo, que estão presentes em uma razão molecular de 2:1:1. É difícil purificar moléculas de ligação a antígeno contendo a combinação desejada de cadeias pesadas da mistura de três tipos de combinações de cadeia pesada.

[00539] Quando produzindo anticorpos biespecíficos usando tais técnicas de recombinação, anticorpos biespecíficos contendo uma combinação heteromérica de cadeias pesadas podem ser preferivelmene se- cretados através da adição de substituições de aminoácido apropriadas nos domínios CH3 constituindo as cadeias pesadas. Especificamente, este método é conduzido substituindo um aminoácido no domínio CH3 de uma das cadeias pesadas por um aminoácido tendo uma cadeia lateral maior (protuberância (que significa “bojo”)), e substituindo um ami- noácido no domínio CH3 da outra cadeia pesada por uma cadeia lateral menor (orifício (que significa “vazio”)) de maneira que a protuberância é posta no orifício. Isso promove formação de cadeia pesada heteromé- rica e inibe simultaneamente formação de cadeia pesada homomérica (Publicação Internacional No. WO 1996027011; Ridgway e outros, Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).

[00540] Ainda, há também técnicas conhecidas para produção de um anticorpo biespecífico através da aplicação de métodos para controle de associação de polipeptídeo ou associação de multímeros heteromé- ricos formados por polipeptídeo à associação entre as cadeias pesadas. Especificamente, métodos para controle da formação de cadeia pesada podem ser empregados para produzir um anticorpo biespecífico (Publicação Internacional No. WO 2006/106905), onde resíduos de aminoá- cido formando a interface entre as cadeias pesadas são alterados para inibir a associação entre as cadeias pesadas tendo a mesma sequência e permitir a formação de cadeias pesadas de sequências diferentes. Tais métodos podem ser usados para geração de anticorpos biespecíficos.

[00541] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos constituindo uma região Fc derivada de um anticorpo biespecífico descrito acima podem ser adequadamente usados como uma região Fc a ser incluída na molécula de ligação a antígeno. Mais especificamente, é preferível usar dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Cys para o aminoácido na posição 349 e Trp para o aminoácido na posição 366 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos; e Cys para o aminoácido na posição 356, Ser para o aminoácido na posição 366, Ala para o aminoácido na posição 368 e Val para o aminoácido na posição 407 conforme indicado pela numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo.

[00542] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Asp para o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos e Lys para o ami- noácido na posição 399 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo, podem ser adequadamente usados como a região Fc. Na modalidade acima, o aminoácido na posição 409 pode ser Glu ao invés de Asp e o aminoácido na posição 399 pode ser Arg ao invés de Lys. Além disso, em adição ao aminoácido Lys na posição 399, Asp pode ser adequadamente adicionado como o amino- ácido na posição 360 ou Asp pode ser adequadamente adicional como o aminoácido na posição 392.

[00543] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Glu para o aminoácido na posição 370 de acordo com a nume-ração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos e Lys para o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo, podem ser adequadamente usados como a região Fc.

[00544] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Glu para o aminoácido na posição 439 de acordo com numera-ção EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Lys para o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido no outro polipeptídeo, podem ser adequadamente usados como a região Fc.

[00545] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, qualquer uma das modalidades indicadas abaixo de combinações dos acima pode ser adequadamente usada como a região Fc:

[00546] (i) dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Asp para o aminoácido na posição 409 e Glu para o ami- noácido na posição 370 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Lys para o aminoácido na posição 399 e Lys para o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 de acordo com nume-ração EU pode ser Asp ao invés de Glu, e o aminoácido Asp na posição 392, pode ser usado ao invés do aminoácido Glu na posição 370 de acordo com a numeração EU);

[00547] (ii) dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Asp para o aminoácido na posição 409 e Glu para o ami- noácido na posição 439 de acordo com a numeração EU da sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos; e Lys para o aminoácido na posição 399 e Lys para o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo (nesta modalidade, o aminoácido Asp na posição 360, o aminoácido Asp na posição 392 ou o aminoácido Asp na posição 439 podem ser usados ao invés do aminoácido Glu na posição 439 de acordo com a numeração EU).

[00548] (iii) dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Glu para o aminoácido na posição 370 e Glu para o ami- noácido na posição 439 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Lys para o aminoácido na posição 357 e Lys para o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo; ou

[00549] dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Asp para o aminoácido na posição 409, Glu para o ami- noácido na posição 370 e Glu para o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos; e Lys para o aminoácido na posição 399, Lys para o ami- noácido na posição 357 e Lys para o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro po- lipeptídeo (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 não pode ser substituído com Glu, e ainda, quando o aminoácido na posição 370 não é substituído com Glu, o aminoácido na posição 439 pode ser Asp ao invés de Glu, ou o aminoácido Asp na posição 392, podem ser usados ao invés do aminoácido Glu na posição 439, de acordo com a numeração EU).

[00550] Ainda, em outra modalidade não limitante da presente invenção, pode ser também adequado usar dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Lys para o aminoácido na po-sição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos e Arg para o aminoácido na posição 435 e Glu para o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo.

[00551] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, pode ser também adequado usar dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Lys para o aminoácido na posição 356 e Lys para o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Glu para o aminoácido na posição 370, Arg para o aminoácido na posição 435 e Glu para o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração Eu na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo.

[00552] Ainda, em adição às tecnologias mencionadas acima de associação de cadeias pesadas heterólogas, tecnologia CrossMab que é conhecida como uma tecnologia para associação de cadeias leves he- terólogas, onde uma cadeia leve formando uma região variável que se liga a um primeiro epítopo e uma cadeia leve formando uma região va-riável que se liga a um segundo epítopo são respectivamente associadas com uma cadeia pesada formando uma região variável que se liga ao primeiro epítopo e uma cadeia pesada formando uma região variável que se liga ao segundo epítopo (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2011) 108, 11187-11192)), pode ser também usada para produzir as moléculas de ligação a antígeno multiespecíficas e multiparatópicas providas pela presente invenção. Ainda, Fab-Arm Exchange que é conhecida como uma tecnologia para associação de cadeias pesadas heterólogas, onde uma cadeia pesada formando uma região variável que se liga a um primeiro epítopo e uma cadeia pesada formando uma região variável que se liga a um segundo epítopo utilizando essas cadeias pesadas IgG4 heterólogas trocam uma com a outra (Labrijn e outros (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013) 110, 5145-5150), WO2008119353), pode também ser usada para produzir as moléculas de ligação a antígeno multiespecífi- cas ou multiparatópicas providas pela presente invenção.

Células efetoras

[00553] Na presente invenção, o termo “células efetoras” pode ser usado no sentido mais amplo incluindo células T (células T CD4+ (linfó- cito auxiliar) e/ou células T CD8+ (citotóxicas), leucócitos multinucleares (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastócitos), monócitos, macrófagos, histiocitose ou leucócitos tais como células assassinas naturais (células NK), células T tipo NK, células Kupffer, células Langerhans ou células assassinas ativadas por linfocina (células LAK), linfócitos B ou células apresentando antígenos tais como células dendríticas ou macrófagos. Exemplos preferidos de células efetoras incluem células T CD8+ (citotó- xicas), células NK ou macrófagos. Moléculas do tipo membrana expressas na membrana celular de células efetoras podem ser usadas como antígenos aos quais pelo menos um domínio de ligação a antígeno con-tido na molécula de ligação a antígeno da presente invenção se liga. Exemplos não limitantes de uma molécula do tipo membrana preferida podem ser CD3, CD2, CD28, CD44, CD16, CD32, CD64 ou NKG2D, ligantes de ativação de célula NK ou polipeptídeos constituindo TCR.

Substâncias citotóxicas

[00554] A fim de que moléculas de ligação a antígeno da presente invenção se liguem a células cancerosas e exibam atividade citotóxica, substâncias citotóxicas podem ser ligadas a moléculas de ligação a an- tígeno. As substâncias citotóxicas podem ser agentes quimioterapêuti- cos exemplificados abaixo ou compostos revelados em Curr Opin Chem Biol (2010) 14, 529-37 e WO 2009/140242; e esses compostos são ligados a moléculas de ligação a antígeno através de ligantes apropriados e similar. Quando moléculas de ligação a antígeno da presente invenção são usadas como composições farmacêuticas, essas substâncias citotóxicas podem ser ligadas às moléculas de ligação a antígeno antes da administração ou elas podem ser administradas antes, após ou ao mesmo tempo que as moléculas de ligação a antígeno são administradas a indivíduos (indivíduos de teste, pacientes e similar).

[00555] As moléculas de ligação a antígeno modificadas descritas por último às quais substâncias citotóxicas tais como agentes quimiote- rapêuticos, peptídeos tóxicos ou substâncias químicas radioativas foram ligados podem ser também usadas preferivelmente como moléculas de ligação a antígeno da presente invenção tendo atividade cito- tóxica. Tais moléculas de ligação a antígeno modificadas (daqui em diante referidas como conjugado de molécula de ligação a antígeno-fár- maco) podem ser obtidas modificando quimicamente as moléculas de ligação a antígeno obtidas. Métodos que já foram estabelecidos no campo de conjugados de anticorpo-fármaco e similar podem ser usados apropriadamente como métodos para modificação de moléculas de ligação a antígeno. Ainda, uma molécula de ligação a antígeno modificada à qual um peptídeo tóxico é ligado pode ser obtida expressando em células hospedeiro apropriadas um gene fundido produzido por ligação de um gene codificando o peptídeo tóxico em estrutura com um gene codificando uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção, e então isolando-a da cultura celular.

[00556] Exemplos de agentes quimioterapêuticos ligados às moléculas de ligação a antígeno da presente invenção podem incluir: azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicina, bortezomibe, briostatina-1, bussul- fam, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clo- rambucil, cisplatina, irinotecano, carboplatina, cladribina, ciclophosfa- mida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, daunomicina glucuronida, daunortubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorrubi- cina, doxorrubicina glucuronida, epirrubicina, etinil estradiol, estramus- tina, etoposídeo, etoposídeo glucuronida, floxuridina, fludarabina, fluta- mida, fluoruracila, fluoximesterona, gemcitabina, hidroxiprogesterona caproato, hidroxiureia, idarrubicina, ifosfamida, leucovorina, lomustina, maitansinoide, mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, ace-tato de megestrol, melfalam, mercaptopurina, metotrexato, mitoxan- trona, mitramicina, mitomicina, mitotano, fenilbutirato, prednisona, pro- carbazina, paclitaxel, pentostatina, semustina, estreptozocina, tamoxi- feno, taxanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, teniposídeo, topotecanu, uracil mostarda, vinblastina, vinorrel- bina e vincristina.

[00557] Na presente invenção, agentes quimioterapêuticos preferidos são agentes quimioterapêuticos de peso molecular baixo. Agentes quimioterapêuticos de peso molecular baixo são improváveis interferir com a função das moléculas de ligação a antígeno mesmo após eles se ligarem a moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Na presente invenção, agentes quimioterapêuticos de peso molecular baixo geralmente têm um peso molecular de 100 a 2000, preferivelmente 200 a 1000. Os agentes quimioterapêuticos exemplificados aqui são todos agentes quimioterapêuticos de peso molecular baixo. Os agentes qui- mioterapêuticos da presente invenção incluem profármacos que são convertidos em agentes quimioterapêuticos ativos in vivo. Ativação de profármaco pode ser conversão enzimática ou conversão não enzimá- tica.

[00558] Além disso, substâncias citotóxicas que são ligadas a moléculas de ligação a antígeno da presente invenção incluem, por exemplo, peptídeos tóxicos (toxinas) tais como exotoxina A de Pseudomonas, Sa- porina-s6, toxina da Difteria, toxina Cnidariana; radioiodo; e fotossensi- bilizadores. Exemplos adequados de peptídeos tóxicos incluem o que segue:

[00559] Cadeia A da toxina da Difteria (Langone e outros (Methods in Enzymology (1983) 93, 307-308));

[00560] Exotoxina da Pseudomonas (Nature Medicine (1996) 2, 350353);

[00561] Cadeia da Ricina (Cadeia A da Ricina) (Fulton e outros (J. Biol. Chem. (1986) 261, 5314-5319), Sivam e outros (Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173), Cumber e outros (J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24), Wawrzynczak e outros (Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562) e Gheeite e outros (J. Immunol. Methods (1991) 142, 223-230));

[00562] Cadeia A da Ricina Desglicosilada (Thorpe e outros (Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931));

[00563] Cadeia A da Abrina (Wawrzynczak e outros (Br. J. Cancer (1992) 66, 361-366), Wawrzynczak e outros (Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562), Sivam e outros (Cancer Res. (1987) 47, 3169-3173) e Thorpe e outros (Cancer Res. (1987) 47, 5924-5931));

[00564] Gelonin (Sivam e outros (Cancer Res. (1987) 47, 31693173), Cumber e outros (J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24), Wawrzynczak e outros (Cancer Res. (1990) 50, 7519-7562) e Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));

[00565] PAP-s; proteína antiviral Pokeweed de sementes (Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));

[00566] Briodina (Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));

[00567] Saporina (Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));

[00568] Momordin (Cumber e outros (J. Immunol. Methods (1990) 135, 15-24); Wawrzynczak e outros (Cancer Res. (1990) 50, 75197562); e Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));

[00569] Momorcochina (Bolognesi e outros (Clin. exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));

[00570] Diantiona 32 (Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol. (1992) 89, 341-346));

[00571] Diantina 30 (Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 18));

[00572] Modecina (Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 18));

[00573] Viscumina (Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 18));

[00574] Volquesina (Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1- 8));

[00575] Dodecandrina (Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8));

[00576] Tritina (Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8));

[00577] Lufina (Stirpe F., Barbieri L. (FEBS letter (1986) 195, 1-8)); e

[00578] Trichoquirina (Casellas e outros (Eur. J. Biochem. (1988) 176, 581-588) Bolognesi e outros (Clin. Exp. Immunol., (1992) 89, 341346)).

Molécula de Ligação a Antígeno

[00579] Na presente invenção, “uma molécula de ligação a antígeno compreendendo um domínio de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo é maior do que na ausência do composto específico de tecido alvo” é usada no sentido mais amplo; e, especificamente, inclui vários tipos de moléculas contanto que elas mostrem atividade de ligação a antí- geno. Moléculas onde um domínio de ligação a antígeno é ligado a uma região Fc incluem, por exemplo, anticorpos. Anticorpos podem incluir anticorpos monoclonais simples (incluindo anticorpos agonísticos e anticorpos antagonísticos), anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e similar. Alternativamente, quando usados como fragmentos de anticorpo, eles incluem preferivelmente domínios de ligação a antígeno e fragmentos de ligação a antígeno (por exemplo, Fab, F(ab’)2, scFv e Fv). Moléculas de base onde estruturas tridimensionais, tal como estrutura de proteína de barril α/β estável já conhecida, são usadas como uma base e apenas algumas porções das estruturas são feitas em bibliotecas para construir domínios de ligação a antígeno estão também incluídas em moléculas de ligação a antígeno da presente invenção.

[00580] Uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção pode conter pelo menos algumas porções de uma região Fc que faz a mediação da ligação a receptor de FCY e/ou FcRn. Em uma modalidade não limitante, a molécula de ligação a antígeno inclui, por exemplo, anticorpos e proteínas de fusão Fc. Uma proteína de fusão se refere a um polipeptídeo quimérico compreendendo um polipeptídeo tendo uma primeira sequência de aminoácido que é ligada a um polipeptídeo tendo uma segunda sequência de aminoácido que não ligaria naturalmente na natureza. Por exemplo, uma proteína de fusão pode compreender um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido de pelo menos uma porção de uma região Fc (por exemplo, uma porção de uma região Fc responsável pela ligação ao receptor de Fcy e/ou uma porção de uma região Fc responsável pela ligação a FcRn). As sequências de aminoácido podem estar presentes em proteínas separadas que são transportadas juntas para uma proteína de fusão ou geralmente podem estar presentes em uma proteína única; no entanto, elas estão incluídas em um novo rearranjo em um polipeptídeo de fusão. Proteínas de fusão podem ser produzidas, por exemplo, através de síntese química ou através de técnicas de recombinação genética para expressar um polinu- cleotídeo codificando regiões de peptídeo em uma disposição desejada.

[00581] Domínios respectivos da presente invenção podem ser ligados através de ligantes ou diretamente através de ligação de peptídeo. Os ligantes compreendem ligantes de peptídeo arbitrários que podem ser introduzidos através de engenharia genética, ligantes sintéticos e ligantes revelados, por exemplo, em Holliger e outros, Protein Engineering (1996) 9(3), 299-305. No entanto, ligantes de peptídeo são preferidos na presente invenção. O comprimento dos ligantes de peptídeo não é particularmente limitado, e pode ser adequadamente selecionado por aqueles versados na técnica de acordo com o propósito. O comprimento é preferivelmente cinco aminoácidos ou mais (sem limitação particular, o limite superior é geralmente 30 aminoácidos ou menos, preferivel-mente 20 aminoácidos ou menos) e particularmente preferivelmente 15 aminoácidos.

[00582] Por exemplo, tais ligantes de peptídeo incluem preferivelmente: Ser Gly-Ser Gly-Gly-Ser Ser-Gly-Gly Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 19) Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 20) Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 21) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 22) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 23) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 24) Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 25) Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 26) (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 21))n (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 22))n onde n é um inteiro de 1 ou maior. O comprimento ou sequências de ligantes de peptídeo pode ser selecionado então por aqueles versados na técnica dependendo do propósito.

[00583] Ligantes sintéticos (agentes de reticulação químicos) são rotineiramente usados para reticular peptídeos, e, por exemplo: N-hidroxi succinimida (NHS), Suberato de dissuccinimidila (DSS), Suberato de bis(sulfosuccinimidil) (BS3), ditiobis(succinimidil propionato) (DSP), ditiobis(sulfossuccinimidil propionato) (DTSSP), etileno glicol bis(succinimidil succinato) (EGS), etileno glicol bis(sulfossuccinimidil succinato) (sulfo-EGS), tartrato de dissuccinimidila (DST), tartrato de dissulfosuccinimidila (sulfo-DST), bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (BSOCOES), e bis[2-(sulfosuccinimidoxicarboniloxi)etil] sulfona (sulfo-BSOCOES). Esses agentes de reticulação estão comercialmente disponíveis.

[00584] Quando ligantes múltiplos para ligação dos respectivos domínios são usados, eles podem ser todos do mesmo tipo ou podem ser de tipos diferentes. Em adição aos ligantes exemplificados acima, ligan- tes com marcadores de peptídeo tais como marcador His, marcador HA, marcador myc e marcador FLAG podem ser também adequadamente usados. Ainda, ligação hidrogênio, ligação dissulfeto, ligação covalente, interação iônica e propriedades de ligação uns com os outros como um resultado de sua combinação podem ser adequadamente usadas. Por exemplo, a afinidade entre CH1 e CL de anticorpo pode ser usada, e regiões Fc se originando dos anticorpos biespecíficos descritos acima podem ser também usadas para associação da região Fc hetero. Além disso, ligações dissulfeto formadas entre domínios podem também ser adequadamente usadas.

[00585] A fim de ligar os respectivos domínios através de ligação de peptídeo, polinucleotídeos codificando os domínios são ligados juntos em estruturas. Métodos conhecidos para ligação de polinucleotídeos em estrutura incluem técnicas tais como ligação de fragmentos de restrição, PCR por fusão e PCR por sobreposição. Tais métodos podem ser apropriadamente usados sozinhos ou em combinação para construir moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Na presente invenção, os termos “ligado” e “fundido” ou “ligação” e “fusão” são usados intercomutavelmente. Esses termos significam que dois ou mais elementos ou componentes tais como polipeptídeos são ligados para formar uma estrutura única através de qualquer meio incluindo os meios de ligação química descritos acima e técnicas de recombinação genética. Fusão em estrutura significa, quando dois ou mais elementos ou componentes são polipeptídeos, ligação de duas ou mais unidades de estruturas de leitura para formar uma estrutura de leitura mais longa contínua enquanto mantendo as estruturas de leitura corretas dos poli- peptídeos. Quando duas moléculas de Fab são usadas como um domínio de ligação de antígeno, um anticorpo, que é uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção onde o domínio de ligação a antí- geno é ligado em estrutura a uma região constante incluindo uma região Fc através de ligação de peptídeo sem ligante, pode ser usado como uma molécula de ligação de antígeno preferida da presente invenção. Anticorpo de peso molecular baixo

[00586] Os anticorpos usados na presente invenção não são limitados a moléculas de anticorpo de comprimento integral e podem ser anticorpos de peso molecular baixo (minicorpos) e produtos modificados dos mesmos. Um anticorpo de peso molecular baixo inclui um fragmento de anticorpo que não tem uma porção de um anticorpo de comprimento integral (por exemplo, anticorpo integral tal como IgG integral); e não é particularmente limitado contanto que ele tenha uma atividade de ligação a antígeno. O anticorpo de peso molecular baixo da presente invenção não é particularmente limitado contanto que ele seja uma porção de um anticorpo de comprimento integral, mas preferivelmente compreenda uma região variável de cadeia pesada (VH) e/ou uma região variável de cadeia leve (VL). A sequência de aminoácido de VH ou VL pode ter substituição(ões), deleção(ões), adição(ões) e/ou inserção(ões). Ainda, contanto que ele tenha uma atividade de ligação a antígeno, VH e/ou VL podem ser parcialmente deletados. A região variável pode ser quimerizada ou humanizada. Exemplos específicos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, Fab’, F(ab’)2 e Fv. Exemplos específicos de anticorpos de peso molecular baixo incluem Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv (Fv de cadeia única), diacorpo e sc(Fv)2 (cadeia única (Fv)2). Multímeros desses anticorpos (por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâme- ros e polímeros) são também incluídos nos anticorpos de peso molecular baixo da presente invenção.

[00587] Fragmentos de anticorpo podem ser produzidos através de tratamento de um anticorpo com uma enzima tal como papaína e pep- sina. Alternativamente, genes codificando esses fragmentos de anticorpo podem ser construídos, inseridos em vetores de expressão e então expressos em células hospedeiro apropriadas (vide, por exemplo, Co e outros, (J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976); Better e Horwitz (Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496), Plueckthun e Skerra (Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496); Lamoyi (Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663); Rousseaux (Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669); e Bird, e outros, TIBTECH (1991) 9, 132-137).

[00588] Um diacorpo se refere a um anticorpo de peso molecular baixo bivalente construído através de fusão de gene (Hollinger e outros, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993)); EP 404,097; WO 1993/11161; e similar). Um diacorpo é um dímero composto de duas cadeias de polipeptídeo. Em geral, em cada cadeia de polipeptídeo constituindo o dímero, VL e VH são ligados por um ligante dentro da mesma cadeia. O ligante em um diacorpo é geralmente curto o suficiente para prevenir ligação entre VL e VH. Especificamente, os resíduos de aminoácido constituindo o ligante são, por exemplo, de cerca de cinco resíduos. Um ligante entre VL e VH que são codificados pela mesma cadeia de polipeptídeo é muito curto para formar um fragmento de região variável de cadeia única, e um dímero é formado entre as cadeias de polipeptídeo. Como resultado, diacorpos têm dois sítios de ligação de antígeno.

[00589] scFv pode ser obtido através de ligação da região V de cadeia H e região V de cadeia L de um anticorpo. Em scFv, a região V de cadeia H e a região V de cadeia L são ligadas através de um ligante, preferivelmente um ligante de peptídeo ((Huston, e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). A região V de cadeia H e a região V de cadeia L de scFv podem ser derivadas de qualquer um dos anticorpos descritos aqui. O ligante de peptídeo para ligação das regiões V não é particularmente limitado; e por exemplo, qualquer peptídeo de cadeia única consistindo em 3 a 25 resíduos ou mais ou ligantes de peptídeo descritos depois ou similar podem ser usados como o ligante. Métodos de PCR tais como aqueles descritos acima podem ser usados para ligação das regiões V. DNA codificando scFv pode ser amplificado através de um método de PCR usando como um modelo ou DNA integral ou um DNA parcial codificando uma sequência de aminoácido desejada, que é selecionado de uma sequência de DNA codificando a cadeia H ou a região V de cadeia H do anticorpo mencionado acima, e um DNA codificando a cadeia L ou a região V de cadeia L do anticorpo mencionado acima; e usando um par de primers tendo sequências corres-pondendo às sequências das duas extremidades. Em seguida, um DNA tendo a sequência desejada pode ser obtido através da realização de uma reação de PCR usando uma combinação de um DNA codificando a porção ligante de peptídeo, e um par de primers tendo sequências projetadas de maneira que ambas as extremidades do DNA serão ligadas à cadeia H e à cadeia L, respectivamente. Uma vez o DNA de codificação de scFv sendo construído, vetores de expressão tendo o DNA e células recombinantes transformadas com o vetor de expressão podem ser obtidos de acordo com métodos convencionais. Ainda, os scFv podem ser obtidos através de cultura das células recombinantes resultantes para expressar o DNA codificando scFv.

[00590] Sc(Fv)2 é um anticorpo de peso molecular baixo preparado através da ligação de duas VHs e duas VLs com ligantes ou de maneira a formar uma cadeia única (Hudson e outros (J. Immunol. Methods 1999; 231: 177-189)). sc(Fv)2 pode ser produzido, por exemplo, ligando scFv com um ligante.

[00591] Além disso, anticorpos onde duas VHs e duas VLs são dispostas na ordem de VH, VL, VH e VL partindo do lado N-terminal de um polipeptídeo de cadeia única ([VH]-ligante-[VL]-ligante-[VH]-ligante- [VL]) são preferidos. A ordem das duas VHs e das duas VLs não é particularmente limitada à disposição mencionada acima e elas podem ser dispostas em qualquer ordem. Exemplos incluem as disposições que seguem: [VL]-ligante-[VH]-ligante-[VH]-ligante-[VL] [VH]-ligante-[VL]-ligante-[VL]-ligante-[VH] [VH]-ligante-[VH]-ligante-[VL]-ligante-[VL] [VL]-ligante-[VL]-ligante-[VH]-ligante-[VH] [VL]-ligante-[VH]-ligante-[VL]-ligante-[VH]

[00592] Um ligante similar ao ligante descrito na seção “Moléculas de ligação a antígeno” acima pode ser usado como o ligante para ligação das regiões variáveis de anticorpo. Uma modalidade particularmente preferida de sc(Fv)2 na presente invenção inclui, por exemplo, o sc(Fv)2 que segue: - [VH]-ligante de peptídeo (15 aminoácidos)-[VL]-ligante de peptídeo (15 aminoácidos)-[VH]-ligante de peptídeo (15 aminoácidos)- [VL]

[00593] Tipicamente, três ligantes são requeridos para ligar quatro regiões variáveis de anticorpo. Os ligantes a serem usados podem ser do mesmo tipo ou tipos diferentes. Exemplos de uma modalidade não limitante de um anticorpo de peso molecular baixo na presente invenção incluem um diacorpo ou sc(Fv)2, onde os parátopos são diferentes uns dos outros; um dos parátopos se liga a um epítopo em uma molécula do tipo membrana que se liga a uma membrana de célula cancerosa; e o outro parátopo se liga a um epítopo na molécula do tipo membrana ex-pressa na membrana celular de células efetoras. No diacorpo mencionado acima ou sc(Fv)2, a atividade de ligação de um parátopo que se liga a um epítopo em uma molécula do tipo membrana que se liga a uma membrana de célula cancerosa pode depender de um composto específico de tecido canceroso, a atividade de ligação de um dos parátopos com relação a um epítopo em uma molécula do tipo membrana que se liga a uma membrana de célula efetora pode depender de um composto específico de tecido canceroso ou as atividades de ligação de ambos os parátopos podem depender de um composto especí-fico de tecido canceroso.

[00594] Uma modalidade não limitante de um anticorpo de peso molecular baixo na presente invenção inclui, por exemplo, um diacorpo ou sc(Fv)2, onde os parátopos são diferentes uns dos outros; um dos pa- rátopos se liga a um epítopo em uma molécula do tipo membrana que se liga a uma membrana de célula cancerosa; e o outro parátopo se liga a um epítopo em uma substância citotóxica. No diacorpo ou sc(Fv)2 mencionado acima, a atividade de ligação de um dos parátopos que se liga a um epítopo em uma molécula do tipo membrana que se liga a uma membrana de célula cancerosa pode depender de um composto específico de tecido canceroso, a atividade de ligação do outro parátopo que se liga a um epítopo em uma substância citotóxica pode depender de um composto específico de tecido canceroso ou as atividades de ligação de ambos os parátopos podem depender de um composto específico de tecido canceroso.

[00595] Tal anticorpo de peso molecular baixo pode ser obtido através do tratamento de um anticorpo com uma enzima tal como papaína ou pepsina para gerar fragmentos de anticorpo ou através da constru-ção de DNAs que codificam esses fragmentos de anticorpo ou anticorpos de peso molecular baixo, inserção deles em vetores de expressão e então expressão deles em células hospedeiro apropriadas (vide, por exemplo, Co, M. S. e outros, J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. e Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. e Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. e outros, Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; e Bird, R. E. e Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137). FcRn

[00596] Diferente do receptor de FCY pertencente à superfamília de imunoglobulina, FcRn humano é estruturalmente similar a polipeptídeos do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I, exibindo 22% a 29% de identidade de sequência com moléculas MHC classe I (Ghetie e outros, Immunol. Today (1997) 18 (12): 592-598). FcRn é expresso como um heterodímero consistindo em cadeia β ou leve solúvel (β2 microglobulina) complexada com cadeia α ou pesada de transmem- brana. Igual ao MHC, a cadeia α de FcRn compreende três domínios extracelulares (α1, α2 e α3) e seu domínio citoplásmico curto ancora a proteína na superfície celular. Os domínios α1 e α2 interagem com o domínio de ligação de FcRN da região Fc do anticorpo (Raghavan et al., Immunity (1994) 1: 303-315).

[00597] FcRn é expresso em placenta maternal e saco vitelino de mamíferos, e está envolvido em transferência de IgG da mãe-para-o- feto. Ainda, em intestino delgado neonatal de roedores, onde FcRn é expresso, FcRn está envolvido em transferência de IgG maternal através do epitélio da borda em escova a partir do colostro ou leite ingerido. FnRn é expresso em uma variedade de outros tecidos e sistemas de célula endotelial de várias espécies. FcRn é também expresso em en- dotélios humanos adultos, vasos sanguíneos musculares e capilares si- nusoidais hepáticos. FcRn é acreditado desempenhar um papel na manutenção da concentração de IgG no plasma através da mediação da reciclagem de IgG para o soro quando da ligação à IgG. Tipicamente, ligação de FcRn a moléculas de IgG é estritamente dependente do pH. A ligação ótima é observada em uma faixa de pH ácido abaixo de 7,0.

[00598] FnRn humano cujo precursor é um polipeptídeo tendo a sequência de sinal de SEQ ID NO: 28 (o polipeptídeo com a sequência de sinal é mostrado na SEQ ID NO: 29) forma um complexo com β2-micro- globulina humana in vivo. FcRn humano solúvel complexado com β2- microglobulina é produzido usando técnicas de expressão recombinan- tes convencionais. Regiões Fc da presente invenção podem ser avaliadas quanto à sua atividade de ligação a tal FcRn humano solúvel com- plexado com β2-microglobulina. Aqui, a menos que de outro modo especificado, FcRn humano se refere a uma forma capaz de se ligar a uma região Fc da presente invenção. Exemplos incluem um complexo entre FcRn humano e β2-microglobulina humana. Atividade de ligação da região Fc a FcRn, em particular, FcRn humano

[00599] A atividade de ligação de uma região Fc da presente invenção a FcRn, FcRn humano em particular, pode ser medida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica, conforme descrito na seção “Atividade de Ligação” acima. Aqueles versados na técnica podem determinar apropriadamente as condições que não pH. A atividade de ligação a antígeno e a atividade de ligação a FcRn humano de uma molécula de ligação a antígeno podem ser avaliadas com base na constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD), taxa de dissociação (kd), taxa de dissociação aparente (kd) e similar. Essas podem ser medidas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, Biacore (GE healthcare), gráfico Scatchard ou citômetro de fluxo pode ser usado.

[00600] Quando a atividade de ligação a FcRn humano de uma região Fc da presente invenção é medida, condições que não o pH não são particularmente limitadas, e podem ser apropriadamente selecionadas por aqueles versados na técnica. As medições podem ser realizadas, por exemplo, a 37°C usando tampão MES, conforme descrito na Publicação Internacional No. WO 2009125825. Alternativamente, a atividade de ligação a FcRn humano de uma região Fc da presente invenção pode ser medida através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica e pode ser medida usando, por exemplo, Biacore (GE Healthcare) ou similar. A atividade de ligação de uma região Fc da presente invenção a FcRn humano pode ser avaliada despejando, como um analito, FcRn humana, uma região Fc, ou uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção contendo a região Fc em um chip imobilizado com uma região Fc, uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção contendo a região Fc ou FcRn humano.

[00601] Uma faixa de pH neutro como a condição onde a região Fc contida em uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção tem a atividade de ligação a FcRn significa pH 6,7 a pH 10,0 em geral. Preferivelmente, a faixa de pH neutro é uma faixa indicada com valores de pH arbitrários entre pH 7,0 e pH 8,0, e é preferivelmente selecionada de pH 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 e 8,0, e é particularmente preferivelmente pH 7,4 que é próximo do pH do plasma (sangue) in vivo. Quando a afinidade de ligação entre o domínio de ligação a FcRn humano e FcRn humano em pH 7,4 é muito baixa para avaliar, pH 7,0 pode ser usado ao invés de pH 7,4. Aqui, uma faixa de pH ácido como a condição onde a região Fc contida em uma molécula de ligação a an- tígeno da presente invenção tem a atividade de ligação a FcRn significa pH 4,0 a pH 6,5 em geral. Preferivelmente, a faixa de pH ácido significa pH 5,5 a pH 6,5, particularmente preferivelmente pH 5,8 a pH 6,0, que é próximo do pH no endossoma inicial in vivo. Com relação à temperatura usada como a condição de medição, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação a FcRn humano e FcRn humano pode ser avaliada em qualquer temperatura entre 10° C e 50° C. Preferivelmente, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação a FcRn humano e FcRn humano pode ser determinada a 15° C a 40° C. Mais preferivelmente, a afinidade de ligação entre o domínio de ligação a FcRn humano e FcRn humano pode ser determinada da mesma maneira em uma temperatura arbitrária entre 20° C e 35° C, tal como qualquer temperatura de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 e 35°C. Em uma modalidade da presente invenção, a temperatura inclui, mas não está limitada a, por exemplo, 25° C.

[00602] De acordo com o Journal of Immunology (2009) 182, 76637671, a atividade de ligação a FcRn humano de IgG1 humana nativa em uma faixa de pH ácido (pH 6,0) é 1,7 μM (KD) e a atividade é quase não detectável em uma faixa de pH neutro. Desta maneira, em uma modalidade preferida, as moléculas de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido é 20 μM (KD) ou mais forte podem ser avaliadas. Em uma modalidade mais preferida, as moléculas de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido é 2,0 μM (KD) ou mais forte podem ser avaliadas. Em uma modalidade ainda mais preferida, as moléculas de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano em uma faixa de pH ácido é 0,5 μM (KD) ou mais forte podem ser avaliadas. Os valores KD mencionados acima são determinados através dos métodos descritos no Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671 (através da imobilização da molécula de ligação a antí- geno em um chip e carregamento de FcRn humano como um analito). Região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido

[00603] Uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido pode ser também preferivelmente usada como a região Fc contida em uma molécula de ligação a antígeno pro-vida pela presente invenção. Em geral, anticorpos IgG são conhecidos ter retenção no plasma longa através de ligação a FcRn. Ligação entre IgG e FcRn é observada apenas sob condições ácidas (pH 6,0) e a ligação é dificilmente observada sob condições neutras (pH 7,4). Anticorpos IgG são não especificamente incorporados a células, mas eles re-tornam para a superfície celular através de ligação a FcRn no endos- somo sob condições ácidas endossomais, e então dissociam de FcRn sob condições neutras em plasma. Quando mutações são introduzidas na região Fc de IgG para eliminar a ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, os anticorpos não são reciclados a partir do interior do endossomo para o plasma. Desta maneira, retenção no plasma do anticorpo é notadamente prejudiciada. Um método para aperfeiçoamento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido foi relatado como um método para aperfeiçoamento de retenção no plasma de anticorpos IgG. Aperfeiçoamento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido através da introdução de substituições de ami- noácido na região Fc de anticorpo IgG pode aumentar a eficiência de reciclagem a partir do interior do endossomo para o plasma, e como resultado, retenção no plasma é aperfeiçoada.

[00604] A presente invenção não é restrita a uma teoria particular, mas, por exemplo, quando uma molécula de ligação a antígeno provida pela presente invenção se liga a um antígeno do tipo membrana ex-presso em células de câncer contidas em tecidos cancerosos, pode ser possível suprimir continuamente proliferação de célula cancerosa con-forme descrito abaixo. Mesmo após células cancerosas expressando uma molécula tipo membrana, à qual uma molécula de ligação a antí- geno da presente invenção é ligada na presença de uma concentração alta de um composto específico de tecido canceroso, serem danificadas por atividade citotóxica mediada pela molécula de ligação a antígeno, o antígeno pode ainda estar ligado ao domínio de ligação de antígeno na molécula de ligação a antígeno. Das moléculas de ligação a antígeno não especificamente incorporadas a células, aquelas que liberam o antígeno na presença de uma concentração baixa do composto específico de tecido canceroso retornam para a superfície celular através de ligação a FcRn no endossoma sob condições ácidas dentro do endos- soma, e então dissociam de FcRn sob condições neutras em plasma. Na presença de uma alta concentração de um composto específico de tecido canceroso, as moléculas de ligação a antígeno da presente invenção recicladas desta maneira podem se ligar novamente aos seus antígenos que são moléculas do tipo membrana expressas em células cancerosas.

[00605] A presente invenção não é restrita a uma teoria particular, mas, por exemplo, quando um antígeno solúvel ligado por moléculas de ligação a antígeno providas pela presente invenção é um ligante que regula positivamente ativação de células inflamatórias ou proliferação de células alvo contidas em um tecido alvo, pode ser possível suprimir proliferação de células alvo ou ativação de células inflamatórias conforme descrito abaixo. Moléculas de ligação a antígeno da presente invenção ligadas à molécula solúvel, isto é, seu antígeno, são não espe-cificamente incorporadas às células na presença de uma concentração alta de compostos específicos de tecido alvo. Isso é seguido por liberação do antígeno na presença de uma concentração baixa de compostos específicos de tecido alvo, as moléculas de ligação a antígeno retornam para a superfície celular através de ligação a FcRn no endossomo sob condições ácidas dentro do endossomo, e então as moléculas de liga-ção a antígeno se dissociam de FcRn sob condições neutras em plasma. As moléculas de ligação a antígeno da presente invenção recicladas desta maneira podem se ligar novamente a moléculas solúveis, isto é, seu antígeno, na presença de uma concentração alta de compostos específicos de tecido alvo. Por outro lado, os antígenos que dissociam das moléculas de ligação a antígeno na presença de uma concentração baixa dos compostos específicos de tecido alvo são degradados no lisossoma. A concentração do antígeno solúvel diminui conforme ele passa pelo estágio de reciclagem. Desta maneira, é considerado que proliferação de célula cancerosa ou ativação de célula inflamatória pode ser suprimida.

[00606] Na presente invenção, regiões Fc preferidas têm uma atividade de ligação a FcRn em uma condição de faixa de pH ácido. Quando uma região Fc tem originalmente uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, o domínio pode ser usado como ele é. Quando o domínio tem uma atividade de ligação a FcRn fraca ou nenhuma sob uma condição de faixa de pH ácido, uma região Fc tendo uma atividade de ligação a FcRn desejada pode ser obtida através da alteração de aminoácidos de uma molécula de ligação a antígeno. Regiões Fc tendo uma atividade de ligação a FcRn desejada ou aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido podem ser também adequadamente obtidas alterando os aminoácidos de uma região Fc. Alte-rações de aminoácido de uma região Fc que resultam em tal atividade de ligação desejada podem ser encontradas comparando a atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, antes e após alteração de aminoácido. Aqueles versados na técnica podem alterar apropriadamente os aminoácidos usando técnicas conhecidas similares às técnicas mencionadas acima usadas para modificar a atividade de ligação a receptor de FCY.

[00607] Regiões Fc compreendidas nas moléculas de ligação a antí- geno da presente invenção, que têm uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, podem ser obtidas através de qualquer método. Especificamente, domínios de ligação a FcRn tendo uma atividade de ligação a FcRn ou uma atividade de ligação a FcRn aumentada sob uma condição de faixa de pH ácido podem ser obtidos alterando os aminoácidos de uma imunoglobulina humana tipo IgG usada como uma região Fc de partida. Regiões Fc preferidas de uma imunoglobulina tipo IgG para alteração incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e suas variantes). Contanto que a região Fc tenha uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido ou possa aumentar a atividade de ligação a FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido, aminoácidos em qualquer posição podem ser alterados para outros aminoácidos. Quando a molécula de ligação a antígeno contém a região Fc de IgG1 humana como a região Fc, é preferido que a região Fc resultante con-tenha uma alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de IgG humana de partida. Aminoácidos que permitem tal alteração incluem, por exemplo, aminoácidos de posições 252, 254, 256, 309, 311, 325, 433 e/ou 434 de acordo com a numeração EU, e seus aminoácidos de combinação nas posições 253, 310, 435 e/ou 426 conforme descrito no WO 1997/034631. Exemplos favoráveis incluem aminoácidos de posições 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 e/ou 447 conforme indicado pela numeração EU conforme descrito no WO 2000/042072. Similarmente, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal alteração incluem aminoácidos de posições 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 e/ou 436 de acordo com a numeração EU conforme descrito no WO 2002/060919. Ainda, aminoácidos que permitem tal alteração incluem, por exemplo, aminoácidos de posições 250, 314 e 428 de acordo com a numeração EU conforme descrito no WO2004/092219. Ainda, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal alteração incluem ami- noácidos de posições 238, 244, 245, 249, 252, 256, 257, 258, 260, 262, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 307, 311, 312, 316, 317, 318, 332, 339, 341, 343, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 423, 427, 430, 431, 434, 436, 438, 440 e/ou 442 conforme descrito no 2006/020114. Ainda, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal alteração incluem aminoácidos de posições 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 e/ou 436 de acordo com a numeração EU conforme descrito no WO 2010/045193. Alteração desses aminoácidos aumenta a ligação a FcRn da região Fc de uma imunoglobulina tipo IgG sob uma condição de faixa de pH ácido.

[00608] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humano inclui pelo menos uma ou mais alterações de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em:

[00609] Arg ou Leu para o aminoácido de posição 251;

[00610] Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido de posição 252;

[00611] Ser ou Thr para o aminoácido de posição 254;

[00612] Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido de posição 255;

[00613] Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu ou Thr para o aminoácido de posição 256;

[00614] Ile ou Thr para o aminoácido de posição 308;

[00615] Pro para o aminoácido de posição 309;

[00616] Glu, Leu ou Ser para o aminoácido de posição 311;

[00617] Ala ou Asp para o aminoácido de posição 312;

[00618] Ala ou Leu para o aminoácido de posição 314;

[00619] Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido de posição 385;

[00620] Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido de posição 386;

[00621] Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido de posição 387;

[00622] Asn, Pro ou Ser para o aminoácido de posição 389;

[00623] Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido de posição 428;

[00624] Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro ou Ser para o aminoácido de po sição 433;

[00625] His, Phe ou Tyr para o aminoácido de posição 434; e

[00626] Arg, Asn, His, Lys, Met ou Thr para o aminoácido de posição 436, conforme indicado pela numeração EU. Entretanto, o número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado; e

[00627] aminoácido pode ser alterado em apenas um sítio ou amino- ácidos podem ser alterados em dois ou mais sítios.

[00628] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn em uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana podem ser alterações incluindo Ile para o aminoácido de posição 308, Pro para o aminoácido de posição 309 e/ou Glu para o aminoácido de posição 311 de acordo com numeração EU. Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Thr para o aminoá- cido de posição 308, Pro para o aminoácido de posição 309, Leu para o aminoácido de posição 311, Ala para o aminoácido de posição 312 e/ou Ala para o aminoácido de posição 314. Ainda, outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Ile ou Thr para o aminoácido de posição 308, Pro para o aminoácido de posição 309, Glu, Leu ou Ser para o aminoácido de posição 311, Ala para o aminoácido de posição 312 e/ou Ala ou Leu para o aminoácido de posição 314. Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Thr para o aminoácido de posição 308, Pro para o aminoácido de posição 309, Ser para o ami- noácido de posição 311, Asp para o aminoácido de posição 312 e/ou Leu para o aminoácido de posição 314.

[00629] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG humana podem ser alterações incluindo Leu para o aminoácido de posição 251, Tyr para o aminoácido de posição 252, Ser ou Thr para o aminoácido de posição 254, Arg para o aminoácido de posição 255 e/ou Glu para o aminoácido de posição 256 de acordo com a numeração EU.

[00630] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana podem ser alterações incluindo Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido de posição 428, Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro ou Ser para o aminoácido de posição 433, His, Phe ou Tyr para o aminoácido de posição 434 e/ou Arg, Asn, His, Lys, Met ou Thr para o aminoácido de posição 436 de acordo com numeração EU. Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir His ou Met para o aminoácido de posição 428 e/ou His ou Met para o aminoácido de posição 434.

[00631] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana podem ser alterações incluindo Arg para o aminoácido de posição 385, Thr para o aminoácido de posição 386, Arg para o amino- ácido de posição 387 e/ou Pro para o aminoácido de posição 389 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Asp para o aminoácido de posição 385, Pro para o aminoácido de posição 386 e/ou Ser para o aminoácido de posição 389.

[00632] Ainda, quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação de região Fc de partida de IgG1 humana inclui pelo menos uma ou mais alterações de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em:

[00633] Gln ou Glu para o aminoácido de posição 250; e

[00634] Leu ou Phe para o aminoácido de posição 428 de acordo com numeração EU. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado; e aminoácido pode ser alterado em apenas um sítio ou aminoácidos podem ser alterados em dois sítios.

[00635] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana podem ser alterações incluindo Gln para o aminoácido de posição 25 e/ou Leu ou Phe para o aminoácido de posição 428 de acordo com numeração EU. Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Glu para o aminoácido de posição 250 e/ou Leu ou Phe para o aminoácido de posição 428.

[00636] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana inclui pelo menos duas ou mais alterações de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em: Asp ou Glu para o aminoácido de posição 251; Tyr para o aminoácido de posição 252; Gln para o aminoácido de posição 307; Pro para o aminoácido de posição 308; Val para o aminoácido de posição 378; Ala para o aminoácido de posição 380; Leu para o aminoácido de posição 428; Ala ou Lys para o aminoácido de posição 430; Ala, His, Ser ou Tyr para o aminoácido de posição 434; e Ile para o aminoácido de posição 436, conforme indicado por numeração EU. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado; e aminoácido pode ser alterado em apenas dois sítios ou ami- noácidos podem ser alterados em três ou mais sítios.

[00637] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana podem ser alterações incluindo Gln para o aminoácido de posição 307 e Ala ou Ser para o aminoácido de posição 434 de acordo com numeração EU. Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Pro para o aminoácido de posição 308 e Ala para o amino- ácido de posição 434. Ainda, outra modalidade não limitante dessa al-teração pode incluir Tyr para o aminoácido de posição 252 e Ala para o aminoácido de posição 434. Uma modalidade não limitante diferente desta alteração pode incluir Val para o aminoácido de posição 378 e Ala para o aminoácido de posição 434. Outra modalidade não limitante diferente desta alteração pode incluir Leu para o aminoácido de posição 428 e Ala para o aminoácido de posição 434. Outra modalidade não limitante diferente desta alteração pode incluir Ala para o aminoácido de posição 434 e Ile para o aminoácido de posição 436. Ainda, outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Pro para o aminoá- cido de posição 308 e Tyr para o aminoácido de posição 434. Ainda, outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Gln para o aminoácido de posição 307 e Ile para o aminoácido de posição 436.

[00638] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana podem ser alterações incluindo qualquer um d e Gln para o aminoácido de posição 307, Ala para o aminoácido de posição 380 e Ser para o aminoácido de posição 434 de acordo com a numeração EU. Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Gln para o aminoácido de posição 307, Ala para o aminoácido de posição 380 e Ala para o aminoácido de posição 434. Ainda, outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Tyr para o aminoácido de posição 252, Pro para o aminoácido de posição 308 e Tyr para o aminoácido de posição 434. Uma modalidade não limitante diferente desta alteração pode incluir Asp para o aminoácido de posição 251, Gln para o aminoá- cido de posição 307 e His para o aminoácido de posição 434.

[00639] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana incluem alterações de pelo menos dois ou mais aminoá- cidos selecionados do grupo consistindo em:

[00640] Leu para o aminoácido de posição 238;

[00641] Leu para o aminoácido de posição 244;

[00642] Arg para o aminoácido de posição 245;

[00643] Pro para o aminoácido de posição 249;

[00644] Tyr para o aminoácido de posição 252;

[00645] Pro para o aminoácido de posição 256;

[00646] Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido de posição 257;

[00647] Asp para o aminoácido de posição 258;

[00648] Ser para o aminoácido de posição 260;

[00649] Leu para o aminoácido de posição 262;

[00650] Lys para o aminoácido de posição 270;

[00651] Leu ou Arg para o aminoácido de posição 272;

[00652] Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 279;

[00653] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 283;

[00654] Asn para o aminoácido de posição 285;

[00655] Phe para o aminoácido de posição 286;

[00656] Asn ou Pro para o aminoácido de posição 288;

[00657] Val para o aminoácido de posição 293;

[00658] Ala, Glu ou Met para o aminoácido de posição 307;

[00659] Ala, Ile, Lys, Leu, Met, Val ou Trp para o aminoácido de po sição 311;

[00660] Pro para o aminoácido de posição 312;

[00661] Lys para o aminoácido de posição 316;

[00662] Pro para o aminoácido de posição 317;

[00663] Asn ou Thr para o aminoácido de posição 318;

[00664] Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido de posição 332;

[00665] Asn, Thr ou Trp para o aminoácido de posição 339;

[00666] Pro para o aminoácido de posição 341;

[00667] Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido de po sição 343;

[00668] Arg para o aminoácido de posição 375;

[00669] Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido de posição 376;

[00670] Lys para o aminoácido de posição 377;

[00671] Asp ou Asn para o aminoácido de posição 378;

[00672] Asn, Ser ou Thr para o aminoácido de posição 380;

[00673] Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 382;

[00674] Asn para o aminoácido de posição 423;

[00675] Asn para o aminoácido de posição 427;

[00676] Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido de posição 430;

[00677] His ou Asn para o aminoácido de posição 431;

[00678] Phe, Gly, His, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 434;

[00679] Ile, Leu ou Thr para o aminoácido de posição 436;

[00680] Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido de posição 438;

[00681] Lys para o aminoácido de posição 440; e

[00682] Lys para o aminoácido de posição 442 de acordo com a nu meração EU. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado e aminoácido em apenas dois sítios pode ser alterado e aminoácidos em três ou mais sítios podem ser alterados.

[00683] Quando a região Fc de IgG1 humana é compreendida como a região Fc, uma modalidade não limitante da alteração que resulta no efeito de aumento da ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana podem ser alterações incluindo Ile para o aminoácido de posição 257 e Ile para o aminoácido de posição 311 de acordo com numeração EU. Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Ile para o aminoácido de posição 275 e His para o aminoácido de posição 434. Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Val para o aminoácido de posição 376 e His para o aminoácido de posição 434. Regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob condições de faixa de pH neutro

[00684] Ainda, em outra modalidade não limitante, moléculas de ligação a antígeno podem ser avaliadas compreendendo uma região Fc com a característica de ter uma atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro ao invés da característica descrita acima de ter uma atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH ácido. Em uma modalidade preferida, moléculas de ligação a antígeno podem ser avaliadas compreendendo uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro é 40 μM (KD) ou mais forte. Em uma modalidade mais preferida, moléculas de ligação a antígeno podem ser avaliadas compreendendo uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro é 15 μM (KD) ou mais forte.

[00685] Ainda, em outra modalidade não limitante, moléculas de ligação a antígeno podem ser avaliadas compreendendo uma região Fc com a característica de ter uma atividade de ligação a FcRn humana na faixa de pH neutro em adição à característica descrita acima de ter uma atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH ácido. Em uma modalidade preferida, moléculas de ligação a antígeno podem ser avaliadas compreendendo uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro é 40 μM (KD) ou mais forte. Em uma modalidade mais preferida, moléculas de ligação a antígeno podem ser avaliadas compreendendo uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro é 15 μM (KD) ou mais forte.

[00686] Na presente invenção, regiões Fc preferidas têm uma atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH ácido e/ou faixa de pH neutro. Quando uma região Fc tem originalmente uma atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH ácido e/ou faixa de pH neutro, ela pode ser usada como é. Quando uma região Fc tem uma atividade de ligação a FcRn humano fraca ou nenhuma na faixa de pH ácido e/ou faixa de pH neutro, moléculas de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc tendo uma atividade de ligação a FcRn humano desejada podem ser obtidas através da alteração dos aminoácidos da região Fc compreendida nas moléculas de ligação a antígeno. Regiões Fc tendo uma atividade de ligação a FcRn humano desejada na faixa de pH ácido e/ou pH neutro podem ser também adequadamente obtidas através da alteração dos aminoácidos de uma região Fc humana. Alternativamente, moléculas de ligação a antígeno compreendendo uma região Fc tendo uma atividade de ligação a FcRn humano podem ser obtidas alterando aminoácidos de uma região Fc que tem originalmente uma atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH ácido e/ou faixa de pH neutro. Alterações de aminoácido de uma região Fc humana que resultam em tal atividade de ligação desejada podem ser encontradas com-parando a atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH ácido e/ou faixa de pH neutro antes e após alteração de aminoácido. Aqueles versados na técnica podem alterar apropriadamente aminoácidos usando métodos conhecidos.

[00687] Na presente invenção, “alteração de aminoácidos” ou “alteração de aminoácido” de uma região Fc inclui alteração em uma sequência de aminoácido que é diferente daquela da região Fc de partida. A região Fc de partida pode ser qualquer região Fc, contanto que uma variante modificada da região Fc de partida possa se ligar a FcRn humano em uma faixa de pH ácido (isto é, a região Fc de partida não precisa ter necessariamente uma atividade para se ligar a FcRn humano em uma faixa de pH neutro). Exemplos de regiões Fc de partida incluem preferivelmente regiões Fc de anticorpos IgG, isto é, regiões Fc nativas. Ainda, uma região Fc alterada modificada de uma região Fc de partida que já foi modificada pode ser também usada preferivelmente como uma região Fc alterada da presente invenção. A “região Fc de partida” pode se referir ao próprio polipeptídeo, uma composição compreendendo a região Fc de partida ou uma sequência de aminoácido codificando a região Fc de partida. Regiões Fc de partida podem compreender uma região Fc de anticorpo IgG conhecida produzida através de re- combinação descrita rapidamente na seção “Anticorpos”. A origem de regiões Fc de partida não é limitada, e elas podem ser obtidas de organismos humanos ou não humanos. Tais organismos incluem preferivelmente camundongos, ratos, porquinhos-da-índia, hamsters, gerbi- los, gatos, coelhos, cachorros, cabras, ovelha, bovinos, cavalos, camelos e organismos selecionados de primatas não humanos. Em outra modalidade, região Fc de partida podem ser também obtidas de macacos cinomólogos, saguis, macacos rhesus, chimpanzés ou humanos. Regiões Fc de partida podem ser obtidas preferivelmente de IgG1 humana; no entanto, elas não são limitadas a nenhuma subclasse de IgG parti-cular. Isso significa que uma região Fc representada por IgG1 humana (SEQ ID NO: 5), IgG2 (SEQ ID NO: 6), IgG3 (SEQ ID NO: 7) ou IgG4 (SEQ ID NO: 8) pode ser usada apropriadamente como uma região Fc de partida, e aqui também significa que uma região Fc de uma classe ou subclasse de IgG arbitrária derivada de quaisquer organismos descritos acima pode ser preferivelmente usada como uma região Fc de partida. Exemplos de variantes de IgG de ocorrência natural ou formas alteradas são descritos em documentos publicados (Curr. Opin. Bio- technol. (2009) 20 (6): 685-91; Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460470; Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4): 195-202; Publicações Inter-nacionais Nos. WO 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 e WO 2006/105338); no entanto, elas não são limitadas aos exemplos.

[00688] Exemplos de alterações incluem aquelas com uma ou mais mutações, por exemplo, mutações através de substituição de resíduos de aminoácidos de regiões Fc de partida por resíduos de aminoácido diferentes, através da inserção de um ou mais resíduos de aminoácido em aminoácidos de regiões Fc de partida ou através de deleção de um ou mais aminoácidos de aminoácidos de regiões Fc de partida. Preferi-velmente, as sequências de aminoácido de regiões Fc alteradas compreendem pelo menos uma parte da sequência de aminoácido de uma região Fc não nativa. Tais variantes devem ter identidade ou similaridade de sequência de menos do que 100% com sua região Fc de partida. Em uma modalidade preferida, as variantes têm identidade ou similaridade de sequência de aminoácido de cerca de 75% a menos do que 100%, mais preferivelmente cerca de 80% a menos do que 100%, ainda mais preferivelmente cerca de 85% a menos do que 100%, ainda mais preferivelmente cerca de 90% a menos do que 100% e ainda mais preferivelmente cerca de 95% a menos do que 100% com a sequência de aminoácido de sua região Fc de partida. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, pelo menos um aminoácido é diferente entre uma região Fc alterada da presente invenção e sua região Fc de partida. Diferença de aminoácido entre uma região Fc alterada e sua região Fc de partida pode ser também preferivelmente especificada com base em diferenças de aminoácido nas posições de resíduo de amino- ácido particulares descritas acima conforme indicado pela numeração EU. Métodos para produção de tais variantes são exemplificados na seção “Alterações de aminoácido”.

[00689] Regiões Fc compreendidas nas moléculas de ligação a antí- geno da presente invenção que têm uma atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro podem ser obtidas através de qualquer método. Especificamente, moléculas de ligação a antígeno podem ser avaliadas compreendendo uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro é 20 μM (KD) ou mais forte; em uma modalidade mais favorável, uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro é 2,0 μM (KD) ou mais forte; e em uma modalidade ainda mais favorável, uma região Fc cuja atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro é 0,5 μM (KD) ou mais forte como um resultado de alteração de aminoácidos de uma imuno- globulina humana tipo IgG usada como uma região Fc de partida. Regiões Fc preferidas de imunoglobulinas tipo IgG para alteração incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas tais como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 mostradas nas SEQ ID NOs: 5, 6, 7 e 8, respectivamente, e suas variantes.

[00690] Quando uma molécula de ligação a antígeno compreendendo a região Fc de IgG1 humana como a região Fc, exemplos adequados de aminoácidos que podem ser alterados para obter os efeitos desejados mencionados acima sobre ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro através da alteração de aminoácidos de uma imu- noglobulina humana tipo IgG como uma região Fc de partida incluem aminoácidos de posições 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 e/ou 447 de acordo com a numeração EU conforme descrito no WO 2000/042072. Similarmente, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal alteração incluem aminoácidos de posições 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 e/ou 436 de acordo com a numeração EU conforme descrito no WO 2002/060919. Ainda, aminoácidos que permitem tal alteração incluem, por exemplo, aminoácidos de posições 250, 314 e 428 de acordo com numeração EU conforme descrito no WO2004/092219. Ainda, exemplos favoráveis de aminoácidos que permitem tal alteração incluem aminoá- cidos de posições 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 e/ou 436 de acordo com a numeração EU conforme descrito no WO 2010/045193. Alteração desses aminoácidos aumenta a ligação a FcRn da região Fc de uma imunoglobulina tipo IgG sob uma condição de faixa de pH neutro.

[00691] Regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro podem ser também obtidas através da alteração de aminoácidos de imunoglobulina humana de tipo IgG usados como a região Fc de partida. As regiões Fc de imunoglobulinas tipo IgG adequadas para alteração incluem, por exemplo, aquelas de IgGs humanas tais como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 respectivamente representadas por SEQ ID NOs: 5, 6, 7 e 8 e suas formas alteradas. Aminoácidos de quaisquer posições podem ser alterados para outros aminoácidos, contanto que as regiões Fc tenham a atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro ou possam aumentar a atividade de ligação a FcRn humano na faixa neutra. Quando a molécula de ligação a antígeno contém a região Fc de IgG1 humana como a região Fc humana, é preferido que a região Fc resultante contenha uma alteração que resulte no efeito de aumento da ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro comparado com a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humano. Aminoácidos que permitem tal alteração incluem, por exemplo, aminoá- cidos das posições que seguem: 221 a 225, 227, 228, 230, 232, 233 a 241, 243 a 252, 254 a 260, 262 a 272, 274, 276, 278 a 289, 291 a 312, 315 a 320, 324, 325, 327 a 339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375 a 378, 380, 382, 385 a 387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426 a 438, 440 e 442 de acordo com numeração EU. Alteração desses aminoácidos aumenta a ligação a FcRn humano da região Fc de imunoglobulina tipo IgG na faixa de pH neutro.

[00692] Daquelas descritas acima, alterações que aumentam a ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro são apropriadamente selecionadas para uso na presente invenção. Aminoácidos particularmente preferidos das regiões Fc alteradas incluem, por exemplo, aminoácidos de posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 de acordo com o sistema de numeração EU. A atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro da região Fc contida em uma molécula de ligação a antígeno pode ser aumentada substituindo pelo menos um aminoácido selecionado dos aminoácidos acima por um amino- ácido diferente.

[00693] Alterações particularmente preferidas incluem, por exemplo:

[00694] Met para o aminoácido na posição 237;

[00695] Ile para o aminoácido na posição 248;

[00696] Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 250;

[00697] Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 252;

[00698] Thr para o aminoácido na posição 254;

[00699] Glu para o aminoácido na posição 255;

[00700] Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido na posição 256;

[00701] Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido na posição 257;

[00702] His para o aminoácido na posição 258:

[00703] Ala para o aminoácido na posição 265;

[00704] Ala ou Glu para o aminoácido na posição 286;

[00705] His para o aminoácido na posição 289;

[00706] Ala para o aminoácido na posição 297;

[00707] Ala para o aminoácido na posição 303;

[00708] Ala para o aminoácido na posição 305;

[00709] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 307;

[00710] Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido na posição 308;

[00711] Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg para o aminoácido na posição 309;

[00712] Ala, His ou Ile para o aminoácido na posição 311;

[00713] Ala ou His para o aminoácido na posição 312;

[00714] Lys ou Arg para o aminoácido na posição 314;

[00715] Ala, Asp ou His para o aminoácido na posição 315;

[00716] Ala para o aminoácido na posição 317;

[00717] Val para o aminoácido na posição 332;

[00718] Leu para o aminoácido na posição 334;

[00719] His para o aminoácido na posição 360;

[00720] Ala para o aminoácido na posição 376;

[00721] Ala para o aminoácido na posição 380;

[00722] Ala para o aminoácido na posição 382;

[00723] Ala para o aminoácido na posição 384;

[00724] Asp ou His para o aminoácido na posição 385;

[00725] Pro para o aminoácido na posição 386;

[00726] Glu para o aminoácido na posição 387;

[00727] Ala ou Ser para o aminoácido na posição 389;

[00728] Ala para o aminoácido na posição 424;

[00729] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 428;

[00730] Lys para o aminoácido na posição 433;

[00731] Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; e

[00732] His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido na posição 436 da região Fc de acordo com a numeração EU. Entretanto, o número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado e um ami- noácido em apenas um sítio pode ser alterado, e aminoácidos em dois ou mais sítios podem ser alterados. Essas combinações de alterações de aminoácido incluem, por exemplo, aquelas descritas nas Tabelas 21 a 2-33. Tabela 2-1

[00733] A Tabela 2-2 é uma continuação da Tabela 2-1. Tabela 2-2

[00734] Tabela 2-3 é uma continuação da Tabela 2-2. Tabela 2-3

[00735] Tabela 2-4 é uma continuação da Tabela 2-3. Tabela 2-4

[00736] Tabela 2-5 é uma continuação da Tabela 2-4. Tabela 2-5

[00737] Tabela 2-6 é uma continuação da Tabela 2-5. Tabela 2-6

[00738] Tabela 2-7 é uma continuação da Tabela 2-6. Tabela 2-7

[00739] Tabela 2-8 é uma continuação da Tabela 2-7.

[00740] Tabela 2-9 é uma continuação da Tabela 2-8. Tabela 2-9

[00741] Tabela 2-10 é uma continuação da Tabela 2-9. Tabela 2-10

[00742] Tabela 2-11 é uma continuação da Tabela 2-10. Tabela 2-11

[00743] Tabela 2-12 é uma continuação da Tabela 2-11. Tabela 2-12

[00744] Tabela 2-13 é uma continuação da Tabela 2-12. Tabela 2-13

[00745] Tabela 2-14 é uma continuação da Tabela 2-13. Tabela 2-14

[00746] Tabela 2-15 é uma continuação da Tabela 2-14. Tabela 2-15

[00747] Tabela 2-16 é uma continuação da Tabela 2-15. Tabela 2-16

[00748] Tabela 2-17 é uma continuação da Tabela 2-16. Tabela 2-17

[00749] Tabela 2-18 é uma continuação da Tabela 2-17. Tabela 2-18

[00750] Tabela 2-19 é uma continuação da Tabela 2-18. Tabela 2-19

[00751] Tabela 2-20 é uma continuação da Tabela 2-19. Tabela 2-20

[00752] Tabela 2-21 é uma continuação da Tabela 2-20. Tabela 2-21

[00753] Tabela 2-22 é uma continuação da Tabela 2-21. Tabela 2-22

[00754] Tabela 2-23 é uma continuação da Tabela 2-22. Tabela 2-23

[00755] Tabela 2-24 é uma continuação da Tabela 2-23. Tabela 2-24

[00756] Tabela 2-25 é uma continuação da Tabela 2-24. Tabela 2-25

[00757] Tabela 2-26 é uma continuação da Tabela 2-25. Tabela 2-26

[00758] Tabela 2-27 é uma continuação da Tabela 2-26. Tabela 2-27

[00759] Tabela 2-28 é uma continuação da Tabela 2-27. Tabela 2-28

[00760] Tabela 2-29 é uma continuação da Tabela 2-28. Tabela 2-29

[00761] Tabela 2-30 é uma continuação da Tabela 2-29. Tabela 2-30

[00762] Tabela 2-31 é uma continuação da Tabela 2-30. Tabela 2-31

[00763] Tabela 2-32 é uma continuação da Tabela 2-31. Tabela 2-32

[00764] Tabela 2-33 é uma continuação da Tabela 2-32. Tabela 2-33 Heterocomplexo compreendendo as quatro moléculas incluindo duas moléculas de FcRn e uma molécula de receptor de FCY de ativação

[00765] Estudos cristalográficos de FcRn com anticorpos IgG demonstraram que um complexo FcRn-IgG é composto de uma molécula de IgG para duas moléculas de FcRn, e as duas moléculas são pensadas se ligar ao redor da interface dos domínios CH2 e CH3 localizados em ambos os lados da região Fc de IgG (Burmeister et al. (Nature (1994) 372, 336-343)). Entretanto, conforme demonstrado no Exemplo 3 do PCT/JP2012/058603, a região Fc de anticorpo foi demonstrada ser capaz de formar um complexo compreendendo as quatro moléculas incluindo duas moléculas de FcRn e uma molécula de receptor de Fcy de ativação (PCT/JP2012/058603). Esta formação de heterocomplexo é um fenômeno que foi revelado como um resultado de análise das propriedades de moléculas de ligação a antígeno contendo uma região Fc tendo uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro.

[00766] Embora a presente invenção não seja limitada a um princípio particular, pode ser considerado que as moléculas de ligação a antígeno administradas in vivo produzam os efeitos descritos abaixo sobre a far- macocinética in vivo (retenção no plasma) das moléculas de ligação a antígeno e uma resposta imune (imunogenicidade) às moléculas de ligação a antígeno administradas, como um resultado da formação de heterocomplexos contendo as quatro moléculas incluindo a região Fc contida nas moléculas de ligação a antígeno, duas moléculas de FcRn e uma molécula de receptor de FCY de ativação. Em adição aos vários tipos de receptor de FCY de ativação, FcRn é expresso em células imunes. É sugerido que a formação de tais complexos tetraméricos em células imunes pelas moléculas de ligação a antígeno promova incorporação de moléculas de ligação a antígeno em células imunes através do aumento de afinidade com relação a células imunes e causando associação de domínios intracelulares para aumentar o sinal de internaliza- ção. O mesmo também se aplica a células apresentando antígeno e a possibilidade que moléculas de ligação a antígeno sejam provavelmente incorporadas a células apresentando antígeno através da formação de complexos tetraméricos na membrana celular de células apresentando antígeno. Em geral, moléculas de ligação a antígeno incorporadas a cé-lulas apresentando antígeno são degradadas nos lisossomas das células apresentando antígeno e são apresentadas às células T. Como resultado, retenção no plasma de moléculas de ligação a antígeno pode ser piorada porque incorporação de moléculas de ligação a antígeno a células apresentando antígeno é promovida pela formação dos complexos tetraméricos descritos acima na membrana celular das células apresentando antígeno. Similarmente, uma resposta imune pode ser induzida (agravada).

[00767] Por esta razão, é concebível que quando uma molécula de ligação a antígeno tendo habilidade menor em formar tais complexos tetraméricos é administrada in vivo, retenção no plasma das moléculas de ligação a antígeno melhoraria, e indução de resposta imune in vivo seria suprimida. Modalidades preferidas de tais moléculas de ligação a antígeno que inibem a formação desses complexos em células imunes incluindo células apresentando antígeno são, por exemplo, as três modalidades descritas abaixo. Moléculas de ligação a antígeno que inibem a formação de heterocom- plexos (Modalidade 1) Uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro e cuja atividade de ligação com relação a FCYR de ativação é menor do que a atividade de ligação de uma região Fc nativa com relação a FCYR de ativação

[00768] A molécula de ligação a antígeno da Modalidade 1 forma um complexo trimérico através de ligação a duas moléculas de FcRn; no entanto, ela não forma nenhum complexo contendo FcyR de ativação. Uma região Fc cuja atividade de ligação com relação a FcyR de ativação é menor do que a atividade de ligação de uma região Fc nativa com relação a FcyR de ativação pode ser preparada alterando os aminoáci- dos da região Fc nativa conforme descrito acima. Se a atividade de ligação com relação a FcyR de ativação da região Fc alterada for menor doque a atividade de ligação com relação a FcyR de ativação da região Fc nativa pode ser apropriadamente testado usando os métodos descritos na seção “Atividade de Ligação” acima.

[00769] Receptor de Fcy de ativação preferidos incluem FcyRI (CD64) que inclui FcyRIa, FcyRIb e FcyRIc; FcyRIIa (incluído alótipos R131 e H131); e FcyRIII (CD16) que inclui isoformas FcyRIIIa (incluindo alotipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alotipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2).

[00770] Aqui, “uma atividade de ligação da variante da região Fc com relação a um receptor de Fcy de ativação é menor do que a atividade de ligação da região Fc nativa com relação a um receptor de Fcy de ativação” significa que a atividade de ligação da variante de região Fc com relação a qualquer um dos receptor de Fcy humanos (FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb) é menor do que a atividade de ligação da região Fc nativa com relação a receptor de Fcy humanos). Por exemplo, quer dizer que com base no método analítico descrito acima, a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno contendo uma variante de região Fc comparada com a atividade de ligação de uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc nativa como um controle é 95% ou menos, preferivelmente 90% ou menos, 85% ou menos, 80% ou menos, 75% ou menos, e particularmente preferivelmente 70% ou menos, 65% ou menos, 60% ou menos, 55% ou menos, 50% ou menos, 45% ou menos, 40% ou menos, 35% ou menos, 30% ou menos, 25% ou menos, 20% ou menos, 15% ou menos, 10% ou menos, 9% ou menos, 8% ou menos, 7% ou menos, 6% ou menos, 5% ou menos, 4% ou menos, 3% ou menos, 2% ou menos ou 1% ou menos. Como uma região Fc nativa, uma região Fc de partida pode ser usada, e regiões Fc de anticorpos do tipo selvagem de isotipos diferentes podem ser também usadas.

[00771] Entretanto, a atividade de ligação da forma nativa com relação a um FCYR de ativação é preferivelmente uma atividade de ligação com relação ao receptor de FCY para IgG1 humana. Ao invés de realizar as alterações descritas acima, atividade de ligação com relação ao receptor de Fcy pode ser diminuída mudando o isotipo para IgG2 humano, IgG3 humano ou IgG4 humano. Alternativamente, além da realização das alterações descritas acima, a atividade de ligação com relação a um receptor de Fcy pode ser também diminuída através da expressão da molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc tendo a atividade de ligação com relação ao receptor de Fcy em hospedeiros que não adicionam cadeias de açúcar tal como Escherichia coli.

[00772] Para a molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc controle, uma molécula de ligação a antígeno tendo uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal pode ser apropriadamente usada. As estruturas de tais regiões Fc são mostradas na SEQ ID NO: 5 (A é adicionado ao terminal N de No. de Acesso RefSeq AAC82527.1), SEQ ID NO: 6 (A é adicionado ao terminal N de No. de Acesso RefSeq AAB59393.1), SEQ ID NO: 7 (RefSeq No. CAA27268.1) e SEQ ID NO: 8 (A é adicionado ao terminal N de No. de Acesso RefSeq AAB59394.1). Ainda, quando uma molécula de ligação a antígeno contendo uma re-gião Fc de um isotipo de anticorpo particular é usada como uma substância de teste, efeito sobre a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno contendo a região Fc com relação a um receptor de FCYR é testado usando a molécula de ligação a antígeno tendo uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal de um isotipo particular como um controle. Desta maneira, moléculas de ligação a antígeno contendo uma região Fc cuja atividade de ligação com relação ao receptor de Fcy foi demonstrada ser alta são adequadamente selecionadas.

[00773] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos preferidos de regiões Fc cuja atividade de ligação com relação a um FcyR de ativação é menor do que a atividade de ligação da região Fc nativa com relação a um FcyR de ativação incluem regiões Fc com alterações de um ou mais aminoácidos em qualquer uma das posições 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325, 328 e 329 conforme indicado pela numeração EU nos aminoácidos de uma região Fc descrita acima para serem diferente daquelas da região Fc nativa. As alterações na região Fc não são limitadas ao exemplo acima, e elas podem ser, por exemplo, modificações tais como desglicosilação (N297A e N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1-A325A/A330S/P331S, IgG1- C226S/C229S, IgG1-C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1- L234F/L235E/P331S, IgG1-S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2- H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A e IgG4- L236E descritos em Cur. Opin. in Biotech. (2009) 20 (6), 685-691; alterações tais como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R e N325L/L328R descritas no WO 2008/092117; inserções de aminoácidos nas posições 233, 234, 235 e 237 de acordo com a numeração EU; e alterações nas posições descritas no WO 2000/042072.

[00774] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos de uma região Fc incluem regiões Fc tendo uma ou mais das alterações que seguem conforme indicado por numeração EU em uma região Fc mencionada acima:

[00775] Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 234;

[00776] Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Arg para o aminoácido na posição 235;

[00777] Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 236;

[00778] Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr ou Arg para o aminoácido na posição 237;

[00779] Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp ou Arg para o aminoácido na posição 238;

[00780] Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr ou Arg para o aminoácido na posição 239;

[00781] Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 265;

[00782] Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 266;

[00783] Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 267;

[00784] Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 269;

[00785] Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 270;

[00786] Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 271;

[00787] Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 295;

[00788] Arg, Gly, Lys ou Pro para o aminoácido na posição 296;

[00789] Ala para o aminoácido na posição 297;

[00790] Arg, Gly, Lys, Pro, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 298;

[00791] Arg, Lys ou Pro para o aminoácido na posição 300;

[00792] Lys ou Pro para o aminoácido na posição 324;

[00793] Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 325;

[00794] Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 327;

[00795] Arg, Asn, Gly, His, Lys ou Pro para o aminoácido na posição 328;

[00796] Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val ou Arg para o aminoácido na posição 329;

[00797] Pro ou Ser para o aminoácido na posição 330;

[00798] Arg, Gly ou Lys para o aminoácido na posição 331; ou

[00799] Arg, Lys ou Pro para o aminoácido na posição 332. (Modalidade 2) Uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc tendo atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro e cuja atividade de ligação com relação a um FCYR inibidor é maior do que a atividade de ligação com relação a um receptor de FCY de ativação

[00800] Através de ligação a duas moléculas de FcRn e uma molécula de FcyR inibidor, a molécula de ligação a antígeno da Modalidade 2 pode formar um complexo compreendendo essas quatro moléculas. No entanto, uma vez que uma molécula de ligação a antígeno única pode se ligar com apenas uma molécula de FcyR, a molécula de ligação a antígeno única em um estado ligado a um FcyR inibidor não pode se ligar a outros FcyRs de ativação. Ainda, foi relatado que uma molécula de ligação a antígeno que é incorporada a células em um estado ligado a um FCYR inibidor é reciclada na membrana celular, e então escapa da degradação dentro das células (Immunity (2005) 23, 503-514). Mais especificamente, é considerado que moléculas de ligação a antígeno tendo atividade de ligação seletiva com relação a FcyR inibidor não podem formar heterocomplexos contendo um FcyR de ativação e duas moléculas de FcRn, que causa uma resposta imune.

[00801] Receptores de Fcy de ativação preferidos incluem FcyRI (CD64) que inclui FcyRIa, FcyRIb e FcyRIc; FcyRIIa (incluindo alótipos R131 e H131); e FcyRIII (CD16) que inclui isoformar FcyRIIIa (incluindo alotipos V158 e F158) e FcyRIIIb (incluindo alotipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2). Entretanto, exemplos de receptor de Fcy inibidor preferidos incluem FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2).

[00802] Aqui, “uma atividade de ligação com relação a um FcyR inibidor é maior do que a atividade de ligação com relação a um receptor de Fcy de ativação” significa que a atividade de ligação da variante de região Fc com relação a FcyRIIb é maior do que a atividade de ligação com relação a qualquer um dos receptor de Fcy humanos, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb. Por exemplo, quer dizer que com base no método analítico descrito acima, a atividade de ligação com relação a FcyRIIb da molécula de ligação a antígeno contendo uma variante de região Fc comparado com a atividade de ligação com relação a qualquer um dos receptor de Fcy humanos, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb é 105% ou mais, preferivelmente 110% ou mais, 120% ou mais, 130% ou mais, 140% ou mais, e particularmente preferivel- mente150% ou mais, 160% ou mais, 170% ou mais, 180% ou mais, 190% ou mais, 200% ou mais, 250% ou mais, 300% ou mais, 350% ou mais, 400% ou mais, 450% ou mais, 500% ou mais, 750% ou mais, 10 vezes ou mais, 20 vezes ou mais, 30 vezes ou mais, 40 vezes ou mais, 50 vezes ou mais.

[00803] Sobretudo preferivelmente, a atividade de ligação com relação a FcYRIIb é maior do que cada uma das atividades de ligação com relação a FcYRIIa (incluindo alotipos R131 e H131) e FcYRIIIa (incluindo alotipos V158 e F158). FcYRIa mostra uma afinidade notadamente alta com IgG1 nativa; desta maneira, a ligação é pensada ser saturada in vivo devido à presença de uma quantidade grande de IgG1 endógena. Por esta razão, inibição de formação de complexo pode ser possível mesmo se a atividade de ligação com relação a FcYRIIb for maior do que as atividades de ligação com relação a FcYRIIa e FcYRIIIa e menor do que a atividade de ligação com relação a FcYRIa.

[00804] Como uma molécula de ligação a antígeno controle contendo uma região Fc, moléculas de ligação a antígeno tendo uma região Fc de um anticorpo IgG monoclonal podem ser apropriadamente usadas. As estruturas de tais regiões Fc são mostradas na SEQ ID NO: 5 (A é adicionado ao terminal N do No. de Acesso RefSeq AAC82527.1), SEQ ID NO: 6 (A é adicionado ao terminal N do No. de Acesso RefSeq AAB59393.1), SEQ ID NO: 7 (No. Acesso RefSeq CAA27268.1) e SEQ ID NO: 8 (A é adicionado ao terminal N do No. de Acesso RefSeq AAB59394.1). Ainda, quando uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc de um isotipo de anticorpo particular é usada como a substância de teste, efeito sobre a atividade de ligação da molécula de ligação a antígeno contendo região Fc com relação a um receptor de FcY é testada usando uma molécula de ligação a antígeno tendo a região Fc de um anticorpo IgG monoclonal de um isotipo particular como um controle. Desta maneira, moléculas de ligação a antígeno contendo uma região Fc cuja atividade de ligação a antígeno com relação ao re-ceptor Fc foi demonstrada ser alta são apropriadamente selecionadas.

[00805] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, exemplos preferidos de regiões Fc tendo uma atividade de ligação seletiva com relação a um FcYR inibidor incluem regiões Fc onde dentre os aminoácidos de uma região Fc descrita acima, o aminoácido em 238 ou 328 conforme indicado pela numeração EU é alterado para um ami- noácido diferente daquele da região Fc nativa. Ainda, como uma região Fc tendo uma atividade de ligação seletiva com relação a um receptor de FCY inibidor, as regiões Fc ou alterações descritas na US 2009/0136485 podem ser apropriadamente selecionadas.

[00806] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, um exemplo preferido é uma região Fc tendo uma ou mais das alterações que seguem conforme indicado pela numeração EU em uma região Fc mencionada acima: o aminoácido na posição 238 é Asp; ou o aminoá- cido na posição 328 é Glu.

[00807] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, exemplos de uma região Fc preferida incluem regiões Fc tendo uma substituição de Pro na posição 238 de acordo com a numeração EU com Asp e tendo uma ou mais das alterações:

[00808] alteração do aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU para Trp, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Phe, o aminoácido na posição 267 de acordo com a numeração EU é Val, o aminoácido na posição 267 de acordo com a numeração EU é Gln, o aminoácido na posição 268 de acordo com a numeração EU é Asn, o aminoácido na posição 271 de acordo com a numeração EU é Gly, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Leu, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Gln, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Glu, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Met, o aminoácido na posição 239 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 267 de acordo com a numeração EU é Ala, o aminoácido na posição 234 de acordo com a numeração EU é Trp, o aminoácido na posição 234 de acordo com a numeração EU é Tyr, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Ala, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Glu, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Leu, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Met, o aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU é Tyr, o aminoácido na posição 330 de acordo com a numeração EU é Lys, o aminoácido na posição 330 de acordo com a numeração EU é Arg, o aminoácido na posição 233 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 268 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 268 de acordo com a numeração EU é Glu, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Ser, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Thr, o aminoácido na posição 323 de acordo com a numeração EU é Ile, o aminoácido na posição 323 de acordo com a numeração EU é Leu, o aminoácido na posição 323 de acordo com a numeração EU é Met, o aminoácido na posição 296 de acordo com a numeração EU é Asp, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Ala, o aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU é Asn e o aminoácido na posição 330 de acordo com a numeração EU é Met. (Modalidade 3) Uma molécula de ligação a antígeno contendo uma região Fc, onde um dos dois polipeptídeos constituindo a região Fc tem uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro e o outro polipeptídeo não tem atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro

[00809] Através da ligação de uma molécula de FcRn e uma molécula de FCYR, a molécula de ligação a antígeno da Modalidade 3 pode formar um complexo trimérico; no entanto, ela não forma nenhum hete- rocomplexo compreendendo quatro moléculas incluindo duas moléculas de FcRn e uma molécula de FCYR. Como uma região Fc onde um dos dois polipeptídeos constituindo a região Fc tem uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro e o outro não tem nenhuma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro contida na molécula de ligação a antígeno da Modalidade 3, regiões Fc derivadas de anticorpos biespecíficos podem ser adequadamente usadas. Anticorpos biespecíficos são dois tipos de anticorpos tendo especificidades com relação a antígenos diferentes. Anticorpos biespecíficos de um tipo IgG podem ser secretados de hibridomas híbridos (quadromas) resultantes de fusão de dois tipos de hibridomas produzindo anticorpos IgG (Milstein e outros (Nature (1983) 305, 537-540).

[00810] Quando uma molécula de ligação a antígeno da Modalidade 3 descrita acima é produzida através do uso de técnicas de recombina- ção tais como aquelas descritas na seção “Anticorpos” acima, pode ser usado um método onde genes codificando os polipeptídeos que constituem os dois tipos de regiões Fc de interesse são transfectados em cé-lulas que os co-expressam. No entanto, as regiões Fc produzidas serão uma mistura onde o que segue existirá em uma razão molecular de 2:1:1: uma região Fc onde um dos dois polipeptídeos constituindo a região Fc tem uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro e o outro polipeptídeo não tem nenhuma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro; uma região Fc onde os dois polipeptídeos constituindo a região Fc têm ambos uma atividade de ligação a FcRn sob uma condição de faixa de pH neutro; e uma região Fc onde ambos os polipeptídeos constituindo a a região Fc não têm atividade de ligação a Fc sob uma condição de faixa de pH neutro. É difícil purificar moléculas de ligação a antígeno contendo a combinação desejada de regiões Fc dos três tipos de IgGs.

[00811] Quando produzindo as moléculas de ligação a antígeno de Modalidade 3 usando tais técnicas de recombinação, as moléculas de ligação a antígeno compreendendo uma combinação heteromérica de regiões Fc podem ser preferivelmente secretadas através da adição de substituições de aminoácido apropriadas nos domínios CH3 constituindo as regiões Fc. Especificamente, este método é conduzido subs-tituindo um aminoácido no domínio CH3 de uma das cadeias pesadas por um aminoácido de cadeia lateral maior (protuberância (que significa “bojo”)), e substituindo um aminoácido no domínio CH3 da outra cadeia pesada por uma cadeia lateral menor (orifício (que significa “vazio”)) de maneira que a protuberância é posta no orifício. Isso promove formação de cadeia H heteromérica e inibe simultaneamente formação de cadeia H homomérica (WO 1996027011; Ridgway et al., Protein Engineering (1996) 9, 617-621; Merchant et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677-681).

[00812] Ainda, há também técnicas conhecidas para produção de um anticorpo biespecífico através da aplicação de métodos para controle de associação de polipeptídeo ou associação de multímeros heteromé- ricos formados por polipeptídeo para a associação entre dois polipeptí- deos que constituem uma região Fc. Especificamente, métodos para controle de associação de polipeptídeo podem ser empregados para produzir um anticorpo específico (WO 2006/106905), onde resíduos de aminoácido formando a interface entre dois polipeptídeos que constituem a região Fc são alterados para inibir a associação entre regiões Fc tendo a mesma sequência, e permitir a formação de complexos de poli- peptídeo formados por duas regiões Fc de sequências diferentes. Especificamente, os métodos na seção descrita acima sobre anticorpos biespecíficos e métodos para produção dos mesmos podem ser usados como uma modalidade não limitante para preparação da molécula de ligação a antígeno da Modalidade 3 da presente invenção.

[00813] Essas moléculas de ligação a antígeno das Modalidades 1 a 3 são todas esperadas ser capazes de reduzir a imunogenicidade e melhorar a retenção no plasma comparado com moléculas de ligação a antígeno capazes de formar complexos tetraméricos. Métodos para produção de domínios de ligação a antígeno

[00814] A presente invenção provê métodos para produção de domínios de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo é maior do que a atividade de ligação a antígeno na ausência do composto.

[00815] Mais especificamente, a presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (e) abaixo:

[00816] (a) determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo;

[00817] (b) determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno na presença do composto específico de tecido alvo;

[00818] (c) seleção de um domínio de ligação a antígeno cuja ativi dade de ligação a antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo é menor do que na presença do composto;

[00819] (d) cultura das células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) é operavelmente ligado; e

[00820] (e) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (d).

[00821] A presente invenção também provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (e) abaixo:

[00822] (a) determinação da atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo;

[00823] (b) determinação da atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação a antígeno na presença de uma concentração alta do composto específico de tecido alvo;

[00824] (c) seleção de um domínio de ligação a antígeno cuja ativi dade de ligação de antígeno na presença de uma concentração baixa do composto específico de tecido alvo é menor do que na presença de uma concentração alta do composto;

[00825] (d) cultura das células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação de antígeno selecionado em (c) é operavelmente ligado; e

[00826] (e) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (d).

[00827] Ainda, a presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de (a) e (e) abaixo:

[00828] (a) contato dos domínios de ligação a antígeno ou suas bibli otecas com um antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo;

[00829] (b) colocação dos domínios de ligação a antígeno que se li garam ao antígeno na dita etapa (a) na ausência do composto;

[00830] (c ) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que foi dissociado na dita etapa (b);

[00831] (d) cultura das células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) é operavelmente ligado; e

[00832] (e) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (d).

[00833] Ainda, a presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (e) abaixo:

[00834] (a) contato dos domínios de ligação a antígeno ou suas bibli otecas com um antígeno na presença de uma alta concentração de composto específico de tecido alvo;

[00835] (b) colocação dos domínios de ligação a antígeno que se li gam ao antígeno na dita etapa (a) na presença de uma concentração baixa do composto;

[00836] (c) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que dis socia na dita etapa (b);

[00837] (d) cultura das células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) é operavelmente ligado; e

[00838] (e) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (d).

[00839] A presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de (a) a (f) abaixo:

[00840] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno com um antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo;

[00841] (b) seleção de domínios de ligação a antígeno que não se ligam ao antígeno na dita etapa (a);

[00842] (c ) permitir que os domínios de ligação a antígeno selecionados na dita etapa (b) se liguem ao antígeno na presença do composto;

[00843] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno na dita etapa (c);

[00844] (e) cultura das células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (d) é operavelmente ligado; e

[00845] (f) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00846] A presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (f) abaixo:

[00847] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno com um antígeno na presença de uma concentração baixa de composto específico de tecido alvo;

[00848] (b) seleção de domínios de ligação a antígeno que não se ligam ao antígeno na dita etapa (a);

[00849] (c ) permitir que os domínios de ligação a antígeno selecionados na dita etapa (b) se liguem ao antígeno na presença de uma alta concentração do composto;

[00850] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno na dita etapa (c);

[00851] (e) cultura das células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (d) é operavelmente ligado; e

[00852] (f) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00853] A presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (e) abaixo:

[00854] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno com uma coluna imobilizada com antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo;

[00855] (b) eluição dos domínios de ligação a antígeno que se ligam à coluna na dita etapa (a) da coluna na ausência do composto;

[00856] (c) isolamento do domínio de ligação a antígeno eluído na dita etapa (b);

[00857] (d) cultura de células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) é operavelmente ligado; e

[00858] (e) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (d).

[00859] A presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (e) abaixo:

[00860] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno com uma coluna imobilizada com antígeno na presença de uma concentração alta de composto es-pecífico de tecido alvo;

[00861] (b) eluição dos domínios de ligação a antígeno que se ligam à coluna na dita etapa (a) da coluna na presença de uma concentração baixa do composto;

[00862] (c ) isolamento de um domínio de ligação a antígeno eluído na dita etapa (b);

[00863] (d) cultura de células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) é operavelmente ligado; e

[00864] (e) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (d).

[00865] A presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (f) abaixo:

[00866] (a) permitir que uma biblioteca de domínios de ligação de an- tígeno passe por uma coluna imobilizada com antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo;

[00867] (b) coleta de domínios de ligação a antígeno que são eluídos sem ligação à coluna na etapa (a);

[00868] (c) permitir que os domínios de ligação a antígeno coletados na etapa (b) se liguem ao antígeno na presença do composto;

[00869] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno na etapa (c);

[00870] (e) cultura das células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno seleci- oando em (d) é operavelmente ligado; e

[00871] (f) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00872] A presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (f) abaixo:

[00873] (a) permitir que uma biblioteca de domínios de ligação a an- tígeno passe por uma coluna imobilizada com antígeno na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo;

[00874] (b) coleta dos domínios de ligação a antígeno que são eluí- dos sem ligação à coluna na dita etapa (a);

[00875] (c) permitir que os domínios de ligação de antígeno coleta dos na dita etapa (b) se liguem ao antígeno na presença de uma concentração alta do composto;

[00876] (d) isolamento de um domínio de ligação de antígeno q eu se liga ao antígeno na dita etapa (c);

[00877] (e) culturas das células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (d) é operavelmente ligado; e

[00878] (f) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00879] Ainda, a presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (f) abaixo:

[00880] (a) contato de um antígeno com uma biblioteca de domínio de ligação a antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo;

[00881] (b) obtenção de domínios de ligação a antígeno que se ligam ao antígeno na etapa (a);

[00882] (c) colocação do domínio de ligação de antígeno obtido na etapa (b) na ausência do composto;

[00883] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno cuja ati vidade de ligação a antígeno na etapa (e) é mais fraca do que a referência selecionada na etapa (b);

[00884] (e) cultura das células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação de antígeno selecionado na etapa (d) é operavelmente ligado; e

[00885] (f) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00886] A presente invenção provê um método para produção de um domínio de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas (a) a (f) abaixo:

[00887] (a) contato de um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno na presença de uma concentração alta de um composto específico de tecido alvo;

[00888] (b) obtenção de domínios de ligação a antígeno que se ligam ao antígeno na etapa (a);

[00889] (c ) colocação dos domínios de ligação de antígeno obtidos na etapa (b) na presença de uma concentração baixa do composto;

[00890] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno cuja ati vidade de ligação a antígeno na etapa (c) é mais fraca do que a referência selecionada na etapa (b);

[00891] (e) cultura de células transfectadas com um vetor ao qual um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação de antígeno selecionado em (d) é operavelmente ligado; e

[00892] (f) coleta de um domínio de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00893] Os termos “células”, “linhagem de célula” e “cultura de célula” são usados sinonimamente aqui, e tal nomeação pode incluir todas as progênies das células ou linhagem de célula. Desta maneira, por exemplo, os termos “transformante” e “células transformadas” incluem culturas e células alvo primárias derivadas delas sem importar o número de passagens. Ainda, é compreendido que devido a mutações intencionais ou acidentais, o teor de DNA não é sempre exatamente o mesmo em todas as progênies. Progênies de mutantes tendo substancialmente a mesma função ou atividade biológica tais como aquelas avaliadas nas células transformadas inicialmente podem ser também incluídas. Quando a descrição pretende se referir a uma nomeação diferente, a intenção pode ser tornar óbvia a partir do contexto da descrição. Células que são apropriadas para uso são adequadamente selecionadas de células descritas na seção “Anticorpos” acima.

[00894] Quando se referindo à expressão de uma sequência de codificação, o termo “sequências controle” se refere a sequências de nu- cleotídeo de DNA necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências controle que são adequadas para procariontes incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, um sítio de ligação de ribossoma e, possivelmente, outras sequências ainda que pobremente compreendidas. Células eucarióticas são conhecidas utilizar promotores, sinais de poliadenilação e potenci- alizadores para a expressão de uma sequência de codificação.

[00895] Para um ácido nucleico, o termo “operavelmente ligado” significa que o ácido nucleico é posto em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou líder secretor é operavelmente ligado a DNA para um polipeptídeo se ele for expresso como uma proteína precursora que participa na secreção do polipeptídeo. Um promotor ou aumentador é operavel- mente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência. Um sítio de ligação de ribossoma é operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de maneira a facilitar tradução. Em geral, “operavelmente ligado” significa que as sequências de DNA sendo ligadas são contíguas e, no caso de um líder secretor, contíguas e em estrutura de leitura. No entanto, promotores não têm que ser contíguos. Ligação é realizada através de ligação em sítios de restrição adequados. Se tais sítios não existirem, os adaptadores de oligonucleotídeo sintéticos ou ligantes são usados de acordo com prática convencional. Ainda, ácidos nucleicos ligados podem ser produzidos através da técnica de PCR de extensão de sobreposição mencionada acima.

[00896] “Ligação” se refere ao processo de formação de ligações fos- fodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico. Para ligação dos dois fragmentos, as extremidades dos fragmentos devem ser compatíveis umas com as outras. Em alguns casos, as extremidades serão diretamente compatíveis após digestão com endonuclease. No entanto, pode ser necessário primeiro converter as extremidades escalonadas geralmente produzidas após digestão com endonuclease em extremidades cegas para torna-las compatíveis para ligação. Para cegar as extremidades, o DNA é tratado em um tampão adequado por pelo menos 15 minutos a 15° C com cerca de 10 unidades de fragmento Klenow de polimerase de DNA I ou polimerase de DNA T4 na presença dos quatro trifosfatos de desoxirribonucleotídeo. O DNA é então purificado através de extração de fenol-clorofórmio e precipitação com etanol ou através de purificação com sílica. Os fragmentos de DNA que devem ser ligados são postos em solução em quantidades equimolares. A solução conterá ATP, tampão de ligase e uma ligase tal como ligase de DNA T4 em cerca de 10 unidades por 0,5 μg de DNA. Se o DNA tiver que ser ligado em um vetor, o vetor é primeiro linearizado através de digestão com a endonuclease(s) de restrição apropriada. O fragmento linearizado é então tratado com fosfatase alcalina bacteriana ou fosfatase intestinal de bezerro para prevenir autoligação do fragmento durante a etapa de liga-ção.

[00897] Nos métodos de produção da presente invenção, um domínio de ligação a antígeno que tem uma atividade de ligação a antígeno maior na presença de um composto específico de tecido alvo do que na sua ausência, que foi selecionado através do método descrito na seção acima “Domínio de ligação a antígeno dependendo de um composto específico para um tecido alvo”, é isolado. Por exemplo, quando um domínio de ligação a antígeno isolado desta maneira foi selecionado a partir de uma biblioteca, o polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno é isolado através de amplificação de gene geral a partir de um vírus tal como um fago, conforme descrito nos Exemplos abaixo. Ainda, quando um domínio de ligação a antígeno ou um anticorpo isolado desta maneira foi selecionado de meios de cultura de células tais como hibri- domas, o gene de anticorpo ou similar pode ser isolado através de amplificação de gene geral a partir das células conforme mostrado na seção “Anticorpos” acima. Métodos para produção de moléculas de ligação a antígeno

[00898] A presente invenção provê métodos para produção de moléculas de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo é maior do que a atividade de ligação a antígeno na ausência do composto.

[00899] Mais especificamente, a presente invenção provê um método para produção de moléculas de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00900] (a) determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo;

[00901] (b) determinação da atividade de ligação a antígeno de um domínio de ligação a antígeno na presença do composto específico de tecido alvo;

[00902] (c ) seleção de um domínio de ligação a antígeno com atividade de ligação a antígeno menor na ausência do composto específico de tecido alvo do que na presença do composto;

[00903] (d) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00904] (e) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e

[00905] (f) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00906] A presente invenção também provê um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00907] (a) determinação da atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo;

[00908] (b) determinação da atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação a antígeno na presença de uma concentração alta do composto específico de tecido alvo;

[00909] (c) seleção de um domínio de ligação a antígeno cuja ativi dade de ligação de antígeno na presença de uma concentração baixa do composto específico de tecido alvo é menor do que na presença de uma concentração alta do composto;

[00910] (d) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00911] (e) cultura de células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e

[00912] (f) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00913] Ainda, a presente invenção provê um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00914] (a) contato dos domínios de ligação a antígeno ou uma bibli oteca dos mesmos com um antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo;

[00915] (b) colocação dos domínios de ligação a antígeno que se li gam ao antígeno na dita etapa (a) na ausência do composto;

[00916] (c ) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que foi dissociado na dita etapa (b);

[00917] (d) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00918] (e) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e

[00919] (f) coleta de uma molécula de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00920] Ainda, a presente invenção provê um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00921] (a) contato dos domínios de ligação a antígeno ou suas bibli otecas com um antígeno na presença de uma alta concentração de composto específico de tecido alvo;

[00922] (b) colocação dos domínios de ligação a antígeno que se li gam ao antígeno na dita etapa (a) na presença de uma concentração baixa do composto;

[00923] (c) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que dis socia na dita etapa (b);

[00924] (d) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00925] (e) cultura de células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e

[00926] (f) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00927] A presente invenção provê um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00928] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno com um antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo;

[00929] (b) seleção de domínios de ligação a antígeno que não se ligam ao antígeno na dita etapa (a);

[00930] (c) permitir que os domínios de ligação a antígeno seleciona dos na dita etapa (b) se liguem ao antígeno na presença do composto;

[00931] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno na dita etapa (c);

[00932] (e) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (d) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00933] (f) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (e) é operavelmente ligado; e

[00934] (g) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00935] A presente invenção provê um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00936] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno com um antígeno na presença de uma concentração baixa de composto específico de tecido alvo;

[00937] (b) seleção de domínios de ligação a antígeno que não se ligam ao antígeno na dita etapa (a);

[00938] (c) permitir que os domínios de ligação a antígeno seleciona dos na dita etapa (b) se liguem ao antígeno na presença de uma alta concentração do composto;

[00939] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno na dita etapa (c);

[00940] (e) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (d) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00941] (f) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (e) é operavelmente ligado; e

[00942] (g) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (f).

[00943] A presente invenção provê um método para produção de uma molécula de ligação de antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00944] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno com uma coluna imobilizada com antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo;

[00945] (b) eluição dos domínios de ligação a antígeno que se ligam à coluna na dita etapa (a) da coluna na ausência do composto;

[00946] (c) isolamento do domínio de ligação a antígeno eluído na dita etapa (b);

[00947] (d) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00948] (e) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e

[00949] (f) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00950] A presente invenção provê um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00951] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno com uma coluna imobilizada com antígeno na presença de uma concentração alta de composto específico de tecido alvo;

[00952] (b) eluição dos domínios de ligação a antígeno que se ligam à coluna na dita etapa (a) da coluna na presença de uma concentração baixa do composto;

[00953] (c) isolamento de um domínio de ligação a antígeno eluído na dita etapa (b);

[00954] (d) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00955] (e) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (d) é operavelmente ligado; e

[00956] (f) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (e).

[00957] A presente invenção provê um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00958] (a) permitir que uma biblioteca de domínios de ligação de an- tígeno passe por uma coluna imobilizada com antígeno na ausência de um composto específico de tecido alvo;

[00959] (b) coleta de domínios de ligação a antígeno que são eluídos sem ligação à coluna na etapa (a);

[00960] (c) permitir que os domínios de ligação a antígeno coletados na etapa (b) se liguem ao antígeno na presença do composto;

[00961] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno que se liga ao antígeno na etapa (c);

[00962] (e) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (d) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00963] (f) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (e) é operavelmente ligado; e

[00964] (g) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (f).

[00965] A presente invenção provê um método para produção de moléculas de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00966] (a) permitir que uma biblioteca de domínios de ligação a an- tígeno passe por uma coluna imobilizada com antígeno na presença de uma concentração baixa de um composto específico de tecido alvo;

[00967] (b) coleta dos domínios de ligação a antígeno que são eluí- dos sem ligação à coluna na dita etapa (a);

[00968] (c) permitir que os domínios de ligação de antígeno coleta dos na dita etapa (b) se liguem ao antígeno na presença de uma concentração alta do composto;

[00969] (d) isolamento de um domínio de ligação de antígeno que se liga ao antígeno na dita etapa (c);

[00970] (e) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecionado em (d) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00971] (f) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (e) é operavelmente ligado; e

[00972] (g) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (f).

[00973] Ainda, a presente invenção provê um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, o qual compreende as etapas de:

[00974] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antígeno com um antígeno na presença de um composto específico de tecido alvo;

[00975] (b) obtenção de domínios de ligação a antígeno que se ligam ao antígeno na dita etapa (a);

[00976] (c) colocação dos domínios de ligação a antígeno obtidos na dita etapa (b) na ausência do composto;

[00977] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno cuja ati vidade de ligação a antígeno na dita etapa (c) é mais fraca do que a referência selecionada na etapa (b);

[00978] (e) ligação de polinucleotídeos codificando o domínio de li gação a antígeno selecionado em (d) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00979] (f) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (e) é operavelmente ligado; e

[00980] (g) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (f).

[00981] A presente invenção provê um método para produção de uma molécula de ligação a antígeno, a qual compreende as etapas de:

[00982] (a) contato de uma biblioteca de domínios de ligação a antí- geno com um antígeno na presença de uma concentração alta de um composto específico de tecido alvo;

[00983] (b) obtenção de domínios de ligação a antígeno que se ligam ao antígeno na dita etapa (a);

[00984] (c) colocação dos domínios de ligação a antígeno obtidos na dita etapa (b) na presença de uma concentração baixa do composto;

[00985] (d) isolamento de um domínio de ligação a antígeno cuja ati vidade de ligação a antí-geno na etapa (c) é mais fraca do que a referência selecionada na etapa (b);

[00986] (e) ligação de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno selecio-nado em (d) a um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc;

[00987] (f) cultura das células introduzidas com um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (e) é operavelmente ligado; e

[00988] (g) coleta de moléculas de ligação a antígeno a partir de um meio de cultura das células culturadas em (f).

[00989] Uma modalidade não limitante da região Fc cuja sequência de polinucleotídeo é ligada a um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a antígeno é, por exemplo, a região Fc contida na região constante de um anticorpo IgG1 humano (SEQ ID NO: 5), IgG2 (SEQ ID NO: 6), IgG3 (SEQ ID NO: 7) ou IgG4 (SEQ ID NO: 8). Uma região Fc é uma porção da região constante de cadeia pesada de um anticorpo, partindo da extremidade N-terminal da região de dobra, que corresponde ao sítio de clivagem de papaína em um aminoácido em torno da posição 216 de acordo com a numeração EU, e contém os domínios de dobra, CH2 e CH3. A região Fc pode ser obtida a partir de IgG1 humano, mas não é limitada a nenhuma subclasse particular de IgG.

[00990] Uma modalidade não limitante da região Fc cuja sequência de polinucleotídeo é ligada a um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a antígeno inclui, por exemplo, regiões Fc cuja atividade de ligação a receptor de FCY é maior do que a atividade de ligação a receptor de FCY da região Fc de uma IgG humana nativa. Exemplos de tais regiões Fc incluem regiões Fc onde pelo menos um ou mais amino- ácidos selecionados do grupo consistindo nos aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440, de acordo com a numeração EU, são diferentes dos resíduos de aminoácido correspondentes de acordo com numeração EU na região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[00991] Ainda, uma modalidade não limitante da região Fc mencionada acima inclui, por exemplo, regiões Fc compreendendo pelo menos uma ou mais alterações de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em:

[00992] alteração do aminoácido na posição 221 para Lys ou Tyr;

[00993] alteração do aminoácido na posição 222 para Phe, Trp, Glu ou Tyr;

[00994] alteração do aminoácido na posição 223 para Phe, Trp, Glu ou Lys;

[00995] alteração do aminoácido na posição 224 para Phe, Trp, Glu ou Tyr;

[00996] alteração do aminoácido na posição 225 para Glu, Lys ou Trp;

[00997] alteração do aminoácido na posição 227 para Glu, Gly, Lys ou Tyr;

[00998] alteração do aminoácido na posição 228 para Glu, Gly, Lys ou Tyr;

[00999] alteração do aminoácido na posição 230 para Ala, Glu, Gly ou Tyr;

[001000] alteração do aminoácido na posição 231 para Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr;

[001001] alteração do aminoácido na posição 232 para Glu, Gly, Lys ou Tyr;

[001002] alteração do aminoácido na posição 233 para Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001003] alteração do aminoácido na posição 234 para Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001004] alteração do aminoácido na posição 235 para Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001005] alteração do aminoácido na posição 236 para Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001006] alteração do aminoácido na posição 237 para Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001007] alteração do aminoácido na posição 238 para Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001008] alteração do aminoácido na posição 239 para Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001009] alteração do aminoácido na posição 240 para Ala, Ile, Met ou Thr;

[001010] alteração do aminoácido na posição 241 para Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr;

[001011] alteração do aminoácido na posição 243 para Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr;

[001012] alteração do aminoácido na posição 244 para His;

[001013] alteração do aminoácido na posição 245 para Ala;

[001014] alteração do aminoácido na posição 246 para Asp, Glu, His ou Tyr;

[001015] alteração do aminoácido na posição 247 para Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr;

[001016] alteração do aminoácido na posição 249 para Glu, His, Gln ou Tyr;

[001017] alteração do aminoácido na posição 250 para Glu ou Gln;

[001018] alteração do aminoácido na posição 251 para Phe;

[001019] alteração do aminoácido na posição 254 para Phe, Met ou Tyr;

[001020] alteração do aminoácido na posição 255 para Glu, Leu ou Tyr;

[001021] alteração do aminoácido na posição 256 para Ala, Met ou Pro;

[001022] alteração do aminoácido na posição 258 para Asp, Glu, His, Ser ou Tyr;

[001023] alteração do aminoácido na posição 260 para Asp, Glu, His ou Tyr;

[001024] alteração do aminoácido na posição 262 para Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr;

[001025] alteração do aminoácido na posição 263 para Ala, Ile, Met ou Thr;

[001026] alteração do aminoácido na posição 264 para Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr;

[001027] alteração do aminoácido na posição 265 para Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001028] alteração do aminoácido na posição 266 para Ala, Ile, Met ou Thr;

[001029] alteração do aminoácido na posição 267 para Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001030] alteração do aminoácido na posição 268 para Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp;

[001031] alteração do aminoácido na posição 269 para Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001032] alteração do aminoácido na posição 270 para Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr;

[001033] alteração do aminoácido na posição 271 para Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001034] alteração do aminoácido na posição 272 para Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001035] alteração do aminoácido na posição 273 para Phe ou Ile;

[001036] alteração do aminoácido na posição 274 para Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001037] alteração do aminoácido na posição 275 para Leu ou Trp;

[001038] alteração do aminoácido na posição 276 para Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001039] alteração do aminoácido na posição 278 para Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp;

[001040] alteração do aminoácido na posição 279 para Ala;

[001041] alteração do aminoácido na posição 280 para Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr;

[001042] alteração do aminoácido na posição 281 para Asp, Lys, Pro ou Tyr;

[001043] alteração do aminoácido na posição 282 para Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr;

[001044] alteração do aminoácido na posição 283 para Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr;

[001045] alteração do aminoácido na posição 284 para Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr;

[001046] alteração do aminoácido na posição 285 para Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr;

[001047] alteração do aminoácido na posição 286 para Glu, Gly, Pro ou Tyr;

[001048] alteração do aminoácido na posição 288 para Asn, Asp, Glu ou Tyr;

[001049] alteração do aminoácido na posição 290 para Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr;

[001050] alteração do aminoácido na posição 291 para Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr;

[001051] alteração do aminoácido na posição 292 para Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr;

[001052] alteração do aminoácido na posição 293 para Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001053] alteração do aminoácido na posição 294 para Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001054] alteração do aminoácido na posição 295 para Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001055] alteração do aminoácido na posição 296 para Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val;

[001056] alteração do aminoácido na posição 297 para Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001057] alteração do aminoácido na posição 298 para Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001058] alteração do aminoácido na posição 299 para Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr;

[001059] alteração do aminoácido na posição 300 para Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp;

[001060] alteração do aminoácido na posição 301 para Asp, Glu, His ou Tyr;

[001061] alteração do aminoácido na posição 302 para Ile;

[001062] alteração do aminoácido na posição 303 para Asp, Gly ou Tyr;

[001063] alteração do aminoácido na posição 304 para Asp, His, Leu, Asn ou Thr;

[001064] alteração do aminoácido na posição 305 para Glu, Ile, Thr ou Tyr;

[001065] alteração do aminoácido na posição 311 para Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr;

[001066] alteração do aminoácido na posição 313 para Phe;

[001067] alteração do aminoácido na posição 315 para Leu;

[001068] alteração do aminoácido na posição 317 para Glu ou Gln;

[001069] alteração do aminoácido na posição 318 para His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr;

[001070] alteração do aminoácido na posição 320 para Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001071] alteração do aminoácido na posição 322 para Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001072] alteração do aminoácido na posição 323 para Ile;

[001073] alteração do aminoácido na posição 324 para Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001074] alteração do aminoácido na posição 325 para Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001075] alteração do aminoácido na posição 326 para Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001076] alteração do aminoácido na posição 327 para Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001077] alteração do aminoácido na posição 328 para Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001078] alteração do aminoácido na posição 329 para Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001079] alteração do aminoácido na posição 330 para Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001080] alteração do aminoácido na posição 331 para Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001081] alteração do aminoácido na posição 332 para Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001082] alteração do aminoácido na posição 333 para Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr;

[001083] alteração do aminoácido na posição 334 para Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro ou Thr;

[001084] alteração do aminoácido na posição 335 para Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr;

[001085] alteração do aminoácido na posição 336 para Glu, Lys ou Tyr;

[001086] alteração do aminoácido na posição 337 para Glu, His ou Asn;

[001087] alteração do aminoácido na posição 339 para Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr;

[001088] alteração do aminoácido na posição 376 para Ala ou Val;

[001089] alteração do aminoácido na posição 377 para Gly ou Lys;

[001090] alteração do aminoácido na posição 378 para Asp;

[001091] alteração do aminoácido na posição 379 para Asn;

[001092] alteração do aminoácido na posição 380 para Ala, Asn ou Ser;

[001093] alteração do aminoácido na posição 382 para Ala ou Ile;

[001094] alteração do aminoácido na posição 385 para Glu;

[001095] alteração do aminoácido na posição 392 para Thr;

[001096] alteração do aminoácido na posição 396 para Leu;

[001097] alteração do aminoácido na posição 421 para Lys;

[001098] alteração do aminoácido na posição 427 para Asn;

[001099] alteração do aminoácido na posição 428 para Phe ou Leu;

[001100] alteração do aminoácido na posição 429 para Met;

[001101] alteração do aminoácido na posição 434 para Trp;

[001102] alteração do aminoácido na posição 436 para Ile; e

[001103] alteração do aminoácido na posição 440 para Gly, His, Ile, Leu ou Tyr;

[001104] de acordo com a numeração EU, nos resíduos de aminoá- cido da região Fc contidos na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. O número de aminoácidos alterados não é particularmente limitado; um aminoácido em apenas um sítio pode ser alterado ou aminoácidos em dois ou mais sítios podem ser alterados. Combinações de alterações de aminoácido em dois ou mais sítios incluem, por exemplo, aquelas descritas na Tabela 1 (Tabela 1-1 até a Tabela 1-3).

[001105] Uma modalidade não limitante da região Fc cuja sequência de nucleotídeo é ligada a um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a antígeno é, por exemplo, uma região Fc tendo atividade de ligação com relação a um receptor de FCY inibidor que é maior do que a atividade de ligação com relação a um receptor de FCY de ativação. Especificamente, uma modalidade não limitante de tais regiões Fc é uma região Fc cuja atividade de ligação a FcyRIIb é maior do que a atividade de ligação com relação a qualquer um dos receptor de Fcy humanos FcyRIa, FcyRIIa, FcyRIIIa e/ou FcyRIIIb.

[001106] Uma modalidade não limitante da região Fc mencionada acima inclui preferivelmente, por exemplo, uma região Fc onde o ami- noácido em 238 ou 328 de acordo com a numeração EU na região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8, é alterado para um aminoácido diferente daquele da região Fc nativa. Um exemplo preferido de tais regiões Fc é uma região Fc tendo uma ou mais das alterações que seguem: alteração do aminoácido na posição 238 para Asp, e alteração do aminoácido na posição 328 para Glu, de acordo com a numeração EU, na região Fc mencionada acima.

[001107] Em ainda outra modalidade não limitante da região Fc mencionada acima, exemplos preferidos incluem regiões Fc tendo uma ou mais das alterações exemplificadas no PCT/JP2012/054624: substituição de Pro na posição 238 de acordo com a numeração EU com Asp, alteração do aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU para Trp, alteração do aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU para Phe, alteração do aminoácido na posição 267 de acordo com a numeração EU para Val, alteração do aminoácido na posição 267 de acordo com a numeração EU para Gln, alteração do ami- noácido na posição 268 de acordo com a numeração EU para Asn, alteração do aminoácido na posição 271 de acordo com a numeração EU para Gly, alteração do aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU para Leu, alteração do aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU para Gln, alteração do aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU para Glu, alteração do ami- noácido na posição 326 de acordo com a numeração EU para Met, alteração do aminoácido na posição 239 de acordo com a numeração EU para Asp, alteração do aminoácido na posição 267 de acordo com a numeração EU para Ala, alteração do aminoácido na posição 234 de acordo com a numeração EU para Trp, alteração do aminoácido na posição 234 de acordo com a numeração EU para Tyr, alteração do ami- noácido na posição 237 de acordo com a numeração EU para Ala, alte-ração do aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU para Asp, alteração do aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU para Glu, alteração do aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU para Leu, alteração do aminoácido na posição 237 de acordo com a numeração EU para Met, alteração do ami- noácido na posição 237 de acordo com a numeração EU para Tyr, alteração do aminoácido na posição 330 de acordo com a numeração EU para Lys, alteração do aminoácido na posição 330 de acordo com a numeração EU para Arg, alteração do aminoácido na posição 233 de acordo com a numeração EU para Asp, alteração do aminoácido na posição 268 de acordo com a numeração EU para Asp, alteração do ami- noácido na posição 268 de acordo com a numeração EU para Glu, alteração do aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU para Asp, alteração do aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU para Ser, alteração do aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU para Thr, alteração do aminoácido na posição 323 de acordo com a numeração EU para Ile, alteração do amino- ácido na posição 323 de acordo com a numeração EU para Leu, alteração do aminoácido na posição 323 de acordo com a numeração EU para Met, alteração do aminoácido na posição 296 de acordo com a numeração EU para Asp, alteração do aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU para Ala, alteração do aminoácido na posição 326 de acordo com a numeração EU para Asn e alteração do aminoácido na posição 330 de acordo com a numeração EU para Met.

[001108] Uma modalidade não limitante da região Fc cuja sequência de polinucleotídeo é ligada a um polinucleotídeo codificando um domíio de ligação a antígeno inclui regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido. Aminoácidos que podem sofrer tal alteração incluem, por exemplo, aminoácidos nas posições 252, 254, 256, 309, 311, 315, 433 e/ou 434 de acordo com a numeração EU e aminoácidos nas posições 253, 310, 435 e/ou 426 que são combinados com os ami- noácidos acima, conforme descrito no WO 1997/034631. Exemplos preferidos incluem aminoácidos nas posições 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439 e/ou 447 (numeração EU) conforme descrito no WO 2000/042072. Similarmente, exemplos preferidos de aminoácidos que podem sofrer tal alteração incluem aminoácidos nas posições 251, 252, 254, 255, 256, 308, 309, 311, 312, 385, 386, 387, 389, 428, 433, 434 e/ou 436 de acordo com a numeração EU conforme descrito no WO 2002/060919. Ainda, aminoácidos que podem sofrer tal alteração são, por exemplo, aminoácidos nas posições 250, 314 e 428 de acordo com a numeração EU conforme descrito no WO 2004/092219. Ainda, exemplos preferidos de aminoácidos que podem sofrer tal alteração incluem aminoácidos nas posições 238, 244, 245, 249, 252, 256, 257, 258, 260, 262, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 307, 311, 312, 316, 317, 318, 332, 339, 341, 343, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 423, 427, 430, 431, 434, 436, 438, 440 e/ou 442 conforme descrito no WO 2006/020114. Ainda, exemplos preferidos de aminoácidos que podem sofrer tal alteração incluem aminoácidos nas posições 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 e/ou 436 de acordo com a numeração EU conforme descrito no WO 2010/045193.

[001109] Uma modalidade não limitante da região Fc mencionada acima inclui, por exemplo, regiões Fc tendo pelo menos uma ou mais alterações de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em:

[001110] alteração do aminoácido da posição 251 para Arg ou Leu;

[001111] alteração do aminoácido da posição 252 para Phe, Ser, Thr ou Tyr;

[001112] alteração do aminoácido da posição 254 para Ser ou Thr;

[001113] alteração do aminoácido da posição 255 para Arg, Gly, Ile ou Leu;

[001114] alteração do aminoácido da posição 256 para Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu ou Thr;

[001115] alteração do aminoácido da posição 308 para Ile ou Thr;

[001116] alteração do aminoácido da posição 309 para Pro;

[001117] alteração do aminoácido da posição 311 para Glu, Leu ou Ser;

[001118] alteração do aminoácido da posição 312 para Ala ou Asp;

[001119] alteração do aminoácido da posição 314 para Ala ou Leu;

[001120] alteração do aminoácido da posição 385 para Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr;

[001121] alteração do aminoácido da posição 386 para Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr;

[001122] alteração do aminoácido da posição 387 para Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr;

[001123] alteração do aminoácido da posição 389 para Asn, Pro ou Ser;

[001124] alteração do aminoácido da posição 428 para Leu, Met, Phe, Ser ou Thr;

[001125] alteração do aminoácido da posição 433 para Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro ou Ser;

[001126] alteração do aminoácido da posição 434 para His, Phe ou Tyr; e

[001127] alteração do aminoácido da posição 436 para Arg, Asn, His, Lys, Met ou Thr,

[001128] de acordo com a numeração EU, nos resíduos de aminoá- cido da região Fc contidos na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado; um aminoácido em apenas um sítio pode ser alterado ou aminoácidos em dois ou mais sítios podem ser alterados.

[001129] Outra modalidade não limitante da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humano inclui regiões Fc onde o aminoácido na posição 308 é Ile, o aminoácido na posição 309 é Pro e/ou o aminoácido na posição 311 é Glu, de acordo com a numeração EU, nos resíduos de aminoácido da região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. Outra modalidade não limitante desta região Fc pode incluir regiões Fc contendo Thr para o aminoácido de posição 308, Pro para o aminoácido de posição 309, Leu para o aminoácido de posição 311, Ala para o aminoácido de posição 312 e/ou Ala para o aminoácido de posição 314. Ainda, outra mo-dalidade não limitante desta alteração pode incluir regiões Fc contendo Ile ou Thr para o aminoácido de posição 308, Pro para o aminoácido de posição 309, Glu, Leu ou Ser para o aminoácido de posição 311, Ala para o aminoácido de posição 312 e/ou Ala ou Leu para o aminoácido de posição 314. Uma modalidade não limitante diferente desta alteração pode incluir regiões Fc contendo Thr para o aminoácido de posição 308, Pro para o aminoácido de posição 309, Ser para o aminoácido de posição 311, Asp para o aminoácido de posição 312 e/ou Leu para o ami- noácido de posição 314.

[001130] Outra modalidade não limitante da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humano inclui, por exemplo, regiões contendo Leu para o aminoácido de posição 251, Tyr para o aminoácido de posição 252, Ser ou Thr para o aminoácido de posição 254, Arg para o aminoácido de posição 255 e/ou Glu para o aminoácido de posição 256, de acordo com numeração EU, nos resíduos de amino- ácido da região Fc incluídos na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[001131] Uma modalidade não limitante diferente da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana inclui, por exemplo, regiões Fc contendo Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o amino- ácido de posição 428, Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro ou Ser para o aminoá- cido de posição 433, His, Phe ou Tyr para o aminoácido de posição 434 e/ou Arg, Asn, His, Lys, Met ou Thr para o aminoácido de posição 436, de acordo com numeração EU, nos resíduos de aminoácido da região Fc incluídos na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. Além disso, outra modalidade não limitante desta alteração inclui regiões Fc contendo His ou Met para o aminoácido de posição 428 e/ou His ou Met para o aminoácido de posição 434.

[001132] Outra modalidade não limitante diferente da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana pode ser, por exemplo, alterações incluindo Arg para o aminoácido de posição 385, Thr para o aminoácido de posição 386, Arg para o aminoácido de posição 387 e/ou Pro para o aminoácido de posição 389, de acordo com numeração EU, nos resíduos de aminoácido da região Fc incluí-dos na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. Outra modalidade não limitante desta alteração inclui regiões Fc contendo Asp para o aminoácido de posição 386, Pro para o aminoácido de posição 386 e/ou Ser para o aminoácido de posição 389.

[001133] Outra modalidade não limitante da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana inclui regiões Fc contendo pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em

[001134] Gln ou Glu para o aminoácido de posição 250; e

[001135] Leu ou Phe para o aminoácido de posição 428, de acordo com numeração EU,

[001136] nos resíduos de aminoácido da região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[001137] Outra modalidade não limitante da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana inclui, por exemplo, regiões Fc contendo Gln para o aminoácido de posição 250 e/ou Leu ou Phe para o aminoácido de posição 420, de acordo com numeração EU, nos resíduos de aminoácido da região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou . Outra modalidade não limitante desta alteração pode incluir Glu para o aminoácido de posição 250 e/ou Leu ou Phe para o aminoácido de posição 428.

[001138] Outra modalidade não limitante da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana inclui regiões Fc contendo pelo menos dois ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:

[001139] Asp ou Glu para o aminoácido de posição 251;

[001140] Tyr para o aminoácido de posição 252;

[001141] Gln para o aminoácido de posição 307;

[001142] Pro para o aminoácido de posição 308;

[001143] Val para o aminoácido de posição 378;

[001144] Ala para o aminoácido de posição 380;

[001145] Leu para o aminoácido de posição 428;

[001146] Ala ou Lys para o aminoácido de posição 430;

[001147] Ala, His, Ser ou Tyr para o aminoácido de posição 434; e

[001148] Ile para o aminoácido de posição 436;

[001149] de acordo com a numeração EU, nos resíduos de aminoá- cido da região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[001150] Outra modalidade não limitante da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana inclui, por exemplo, regiões Fc contendo Gln para o aminoácido de posição 307 e Ala ou Ser para o aminoácido de posição 434, de acordo com numeração EU, nos resíduos de aminoácido da região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. Outra modalidade não limitante desta região Fc inclui regiões Fc contendo Pro para o aminoácido de posição 308 e Ala para o aminoácido de posição 434. Ainda, outra modalidade não limitante desta região Fc inclui regiões Fc contendo Tyr para o aminoácido de posição 252 e Ala para o aminoácido de posição 434. Uma modalidade não limitante diferente desta região Fc inclui regiões Fc contendo Val para o aminoácido de posição 378 e Ala para o aminoácido de posição 434. Outra modalidade não limitante diferente desta região Fc inclui alterações incluindo Leu para o aminoácido de posição 428 e Ala para o aminoácido de posição 434. Outra modalidade não limitante diferente desta região Fc inclui regiões Fc contendo Ala para o aminoácido de posição 434 e Ile para o aminoácido de posição 436. Ainda, outra modalidade não limitante desta alteração inclui regiões Fc contendo Pro para o aminoácido de posição 308 e Tyr para o aminoácido de posição 434. Ainda, outra modalidade não limitante desta alteração inclui regiões Fc contendo Gln para o aminoácido de posição 307 e Ile para o aminoácido de posição 436.

[001151] Outra modalidade não limitante da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana inclui regiões Fc contendo qualquer uma de Gln para o aminoácido de posição 307, Ala para o aminoácido de posição 380 e Ser para o aminoácido de posição 434, de acordo com numeração EU, nos resíduos de aminoácido da re-gião Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. Outra modalidade não limitante desta região Fc inclui regiões Fc contendo Gln para o aminoácido de posição 307, Ala para o aminoácido de posição 380 e Ala para o aminoácido de posição 434. Ainda, outra modalidade não limitante desta região Fc inclui regiões Fc contendo Tyr para o aminoácido de posição 252, Pro para o aminoácido de posição 308 e Tyr para o aminoácido de posição 434. Uma modalidade não limi- tante diferente desta região Fc inclui regiões Fc contendo Asp para o aminoácido de posição 251, Gln para o aminoácido de posição 307 e His para o aminoácido de posição 434.

[001152] Outra modalidade não limitante da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana inclui pelo menos uma ou mais alterações de aminoácido selecionadas do grupo consistindo em:

[001153] alteração do aminoácido de posição 238 para Leu;

[001154] alteração do aminoácido de posição 244 para Leu;

[001155] alteração do aminoácido de posição 245 para Arg;

[001156] alteração do aminoácido de posição 249 para Pro;

[001157] alteração do aminoácido de posição 252 para Tyr;

[001158] alteração do aminoácido de posição 256 para Pro;

[001159] alteração do aminoácido de posição 257 para Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val;

[001160] alteração do aminoácido de posição 258 para Asp;

[001161] alteração do aminoácido de posição 260 para Ser;

[001162] alteração do aminoácido de posição 262 para Leu;

[001163] alteração do aminoácido de posição 270 para Lys;

[001164] alteração do aminoácido de posição 272 para Leu ou Arg;

[001165] alteração do aminoácido de posição 279 para Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr;

[001166] alteração do aminoácido de posição 283 para Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr;

[001167] alteração do aminoácido de posição 285 para Asn;

[001168] alteração do aminoácido de posição 286 para Phe;

[001169] alteração do aminoácido de posição 288 para Asn ou Pro;

[001170] alteração do aminoácido de posição 293 para Val;

[001171] alteração do aminoácido de posição 307 para Ala, Glu ou Met;

[001172] alteração do aminoácido de posição 311 para Ala, Ile, Lys, Leu, Met, Val ou Trp;

[001173] alteração do aminoácido de posição 312 para Pro;

[001174] alteração do aminoácido de posição 316 para Lys;

[001175] alteração do aminoácido de posição 317 para Pro;

[001176] alteração do aminoácido de posição 318 para Asn ou Thr;

[001177] alteração do aminoácido de posição 332 para Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp;

[001178] alteração do aminoácido de posição 339 para Asn, Thr ou Trp;

[001179] alteração do aminoácido de posição 341 para Pro;

[001180] alteração do aminoácido de posição 343 para Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr;

[001181] alteração do aminoácido de posição 375 para Arg;

[001182] alteração do aminoácido de posição 376 para Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val;

[001183] alteração do aminoácido de posição 377 para Lys;

[001184] alteração do aminoácido de posição 378 para Asp ou Asn;

[001185] alteração do aminoácido de posição 380 para Asn, Ser ou Thr;

[001186] alteração do aminoácido de posição 382 para Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr;

[001187] alteração do aminoácido de posição 423 para Asn;

[001188] alteração do aminoácido de posição 427 para Asn;

[001189] alteração do aminoácido de posição 430 para Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr;

[001190] alteração do aminoácido de posição 431 para His ou Asn;

[001191] alteração do aminoácido de posição 434 para Phe, Gly, His, Trp ou Tyr;

[001192] alteração do aminoácido de posição 436 para Ile, Leu ou Thr;

[001193] alteração do aminoácido de posição 438 para Lys, Leu, Thr ou Trp;

[001194] alteração do aminoácido de posição 440 para Lys; e

[001195] alteração do aminoácido de posição 442 para Lys;

[001196] de acordo com numeração EU, nos resíduos de aminoácido da região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado e aminoácidos em apenas dois sítios podem ser alterados e aminoácidos em três ou mais sítios podem ser alterados.

[001197] Outra modalidade não limitante da região Fc cuja atividade de ligação a FcRn na faixa de pH ácido é mais forte do que a atividade de ligação da região Fc de partida de IgG1 humana inclui regiões Fc contendo Ile para o aminoácido de posição 257 e Ile para o aminoácido de posição 311, de acordo com a numeração EU, nos resíduos de ami- noácido da região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. Outra modalidade não limitante desta região Fc inclui regiões Fc contendo Ile para o aminoácido de posição 257 e His para o aminoácido de posição 434. Outra modalidade não limitante desta região Fc inclui regiões Fc contendo Val para o aminoácido de posição 376 e His para o aminoácido de posição 434.

[001198] Uma modalidade não limitante da região Fc cuja sequência de polinucleotídeo é ligada a um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação a antígeno inclui, por exemplo, regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro. Exemplos de regiões Fc tendo atividade de ligação a FcRn humano na faixa de pH neutro incluem regiões Fc onde pelo menos um ou mais aminoácidos nas posições selecionadas do grupo consistindo nas posições 221-225, 227, 228, 230, 232, 233-241, 243-252, 254-260, 262-272, 274, 276, 278-289, 291-312, 315-320, 324, 325, 327-339, 341, 343, 345, 360, 362, 370, 375-378, 380, 382, 385-387, 389, 396, 414, 416, 423, 424, 426-438, 440 e 442, de acordo com numeração EU, são substituídos nos resíduos de aminoácido da região Fc incluída na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

[001199] Outra modalidade não limitante da região Fc mencionada acima tendo atividade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro inclui regiões Fc onde os aminoácidos nas posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436, de acordo com a numeração EU, são substituídos nos resíduos de aminoácido da região Fc contida na região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. Através da substituição de pelo menos um aminoácido selecionado desses amino- ácidos com um aminoácido diferente, a região Fc incluída na molécula de ligação a antígeno pode se ligar a FcRn humano na faixa de pH neutro.

[001200] Outra modalidade não limitante da região Fc mencionada acima tendo atividade de ligação a FcRn na faixa de pH neutro inclui regiões Fc contendo pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:

[001201] Met para o aminoácido de posição 237;

[001202] Ile para o aminoácido de posição 248;

[001203] Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 250;

[001204] Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 252;

[001205] Thr para o aminoácido de posição 254;

[001206] Glu para o aminoácido de posição 255;

[001207] Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido de posição 256;

[001208] Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido de posição 257;

[001209] His para o aminoácido de posição 258:

[001210] Ala para o aminoácido de posição 265;

[001211] Ala ou Glu para o aminoácido de posição 286;

[001212] His para o aminoácido de posição 289;

[001213] Ala para o aminoácido de posição 297;

[001214] Ala para o aminoácido de posição 303;

[001215] Ala para o aminoácido de posição 305;

[001216] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 307;

[001217] Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido de posição 308;

[001218] Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg para o aminoácido de posição 309;

[001219] Ala, His ou Ile para o aminoácido de posição 311;

[001220] Ala ou His para o aminoácido de posição 312;

[001221] Lys ou Arg para o aminoácido de posição 314;

[001222] Ala, Asp ou His para o aminoácido de posição 315;

[001223] Ala para o aminoácido de posição 317;

[001224] Val para o aminoácido de posição 332;

[001225] Leu para o aminoácido de posição 334;

[001226] His para o aminoácido de posição 360;

[001227] Ala para o aminoácido de posição 376;

[001228] Ala para o aminoácido de posição 380;

[001229] Ala para o aminoácido de posição 382;

[001230] Ala para o aminoácido de posição 384;

[001231] Asp ou His para o aminoácido de posição 385;

[001232] Pro para o aminoácido de posição 386;

[001233] Glu para o aminoácido de posição 387;

[001234] Ala ou Ser para o aminoácido de posição 389;

[001235] Ala para o aminoácido de posição 424;

[001236] Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 428;

[001237] Lys para o aminoácido de posição 433;

[001238] Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido de posição 434; e

[001239] His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido de posição 436;

[001240] de acordo com a numeração EU. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado e o aminoácido em apenas um sítio pode ser alterado ou aminoácidos em dois ou mais sítios podem ser alterados. Combinações dessas alterações de aminoácido incluem, por exemplo, aquelas descritas nas Tabelas 2-1 a 2-33.

[001241] Uma modalidade não limitante da região Fc cuja sequência de polinucleotídeo é ligada a um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a antígeno inclui, por exemplo, regiões Fc cuja atividade de ligação com relação a FCYR é menor do que aquela da região Fc nativa com relação a um FCYR de ativação. Outra modalidade não limi- tante da região Fc inclui preferivelmente, por exemplo, regiões Fc onde um ou mais aminoácidos nas posições 234, 235, 236, 237, 238, 239, 270, 297, 298, 325, 328 e 329 de acordo com a numeração EU são alterados para aminoácidos que são diferentes daquelese da região Fc nativa de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. As alterações na região Fc não são limitadas ao exemplo acima e elas podem ser, por exemplo, alterações tais como desglicosilação (N297A e N297Q), IgG1-L234A/L235A, IgG1- A325A/A330S/P331S, IgG1-C226S/C229S, IgG1- C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, IgG1-L234F/L235E/P331S, IgG1- S267E/L328F, IgG2-V234A/G237A, IgG2-H268Q/V309L/A330S/A331S, IgG4-L235A/G237A/E318A e IgG4-L236E descritas em Cur. Opin. in Biotech. (2009) 20 (6), 685-691; alterações tais como G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, e N325L/L328R descritas no WO 2008/092117; inserções de aminoácido nas posições 233, 234, 235 e 237 de acordo com a numeração EU; e alterações nas posições descritas no WO 2000/042072.

[001242] Outra modalidade não limitante da região Fc mencionada acima cuja atividade de ligação com relação a FcyR de ativação é menor do que a atividade de ligação da região Fc nativa com relação a FcyR de ativação inclui regiões Fc compreendendo pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados do grupo consistindo em:

[001243] Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 234;

[001244] Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Arg para o aminoácido na posição 235;

[001245] Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 236;

[001246] Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr ou Arg para o aminoácido na posição 237;

[001247] Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Thr, Trp ou Arg para o aminoácido na posição 238;

[001248] Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr ou Arg para o aminoácido na posição 239;

[001249] Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 265;

[001250] Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 266;

[001251] Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 267;

[001252] Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 269;

[001253] Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 270;

[001254] Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 271;

[001255] Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoá- cido na posição 295;

[001256] Arg, Gly, Lys ou Pro para o aminoácido na posição 296;

[001257] Ala para o aminoácido na posição 297;

[001258] Arg, Gly, Lys, Pro, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 298;

[001259] Arg, Lys ou Pro para o aminoácido na posição 300;

[001260] Lys ou Pro para o aminoácido na posição 324;

[001261] Ala, Arg, Gly, His, Ile, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 325;

[001262] Arg, Gln, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr ou Val para o aminoácido na posição 327;

[001263] Arg, Asn, Gly, His, Lys ou Pro para o aminoácido na posição 328;

[001264] Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val ou Arg para o aminoácido na posição 329;

[001265] Pro ou Ser para o aminoácido na posição 330;

[001266] Arg, Gly ou Lys para o aminoácido na posição 331; ou

[001267] Arg, Lys ou Pro para o aminoácido na posição 332;

[001268] de acordo com numeração EU. O número de aminoácidos a ser alterado não é particularmente limitado, e o aminoácido em apenas um sítio pode ser alterado ou aminoácidos em dois ou mais sítios podem ser alterados.

[001269] Em uma modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos formando uma região Fc que são derivados de um anticorpo biespecífico conforme acima descrito podem ser adequadamente usados como a região Fc a ser incluída em uma molécula de ligação a antígeno. Mais especificamente, é preferido usar dois polipep- tídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Cys para o aminoácido na posição 349 e Trp para o aminoácido na posição 366 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos; e Cys para o aminoácido na posição 356, Ser para o ami- noácido na posição 366, Ala para o aminoácido na posição 368 e Val para o aminoácido na posição 407 conforme indicado pela numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo.

[001270] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Asp para o aminoácido na posição 409 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Lys para o aminoácido na posição 399 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo, podem ser adequadamente usados como a região Fc. Na modalidade acima, o aminoácido na posição 409 pode ser Glu ao invés de Asp e o aminoácido na posição 399 pode ser Arg ao invés de Lys. Além disso, em adição ao aminoácido Lys na posição 399, Asp pode ser adequadamente adicionado como o ami- noácido na posição 360 ou Aspo pode ser adequadamente adicionado como o aminoácido na posição 392.

[001271] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Glu para o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Lys para o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo, podem ser adequadamente usados como a região Fc.

[001272] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Glu para o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Lys para o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo, podem ser adequadamente usados como a região Fc.

[001273] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, qualquer uma das combinações das modalidades mencionadas acima, conforme mostrado abaixo, podem ser adequadamente usadas como a região Fc:

[001274] (i) dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Asp para o aminoácido na posição 409 e Glu para o ami- noácido na posição 370 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Lys para o aminoácido na posição 399 e Lys para o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU pode ser Asp ao invés de Glu, e o aminoácido Asp na posição 392 de acordo com a numeração EU pode ser usado ao invés do aminoácido Glu na posição 370 de acordo com a numeração EU);

[001275] (ii) dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Asp para o aminoácido na posição 409 e Glu para o ami- noácido na posição 439 de acordo com a numeração EU da sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos; e Lys para o aminoácido na posição 399 e Lys para o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo (nesta modalidade, o aminoácido Asp na posição 360 de acordo com a numeração EU, o aminoácido Asp na posição 392 de acordo com a numeração EU ou o aminoácido Asp na posição 439 de acordo com a numeração EU podem ser usados ao invés do aminoácido Glu na posição 439 de acordo com a numeração EU);

[001276] (iii) dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Glu para o aminoácido na posição 370 e Glu para o ami- noácido na posição 439 de acordo com a numeração Eu na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Lys para o aminoácido na posição 357 e Lys para o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo; ou

[001277] dois polipeptídeos que constituem uma região Fc, e que compreendem Asp para o aminoácido na posição 409, Glu para o ami- noácido na posição 370 e Glu para o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos; e Lys para o aminoácido na posição 399, Lys para o ami- noácido na posição 357 e Lys para o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo (nesta modalidade, o aminoácido na posição 370 de acordo com a numeração EU pode não ser substituído com Glu e, ainda, quando o aminoácido na posição 370 não é substituído com Glu, o ami- noácido na posição 439 pode ser Asp ao invés de Glu, ou ou aminoácido Asp na posição 392 pode ser usado ao invés do aminoácido Glu na posição 439).

[001278] Ainda, em outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Lys para o aminoácido na posição 356 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido de um dos polipeptídeos, e Arg para o aminoácido na posição 435 e Glu para o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro po- lipeptídeo podem ser também adequadamente usados.

[001279] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, dois polipeptídeos que constituem uma região Fc e que compreendem Lys para o aminoácido na posição 356 e Lys para o aminoácido na posição 357 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoá- cido de um dos polipeptídeos e Glu para o aminoácido na posição 370, Arg para o aminoácido na posição 435 e Glu para o aminoácido na posição 439 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoácido do outro polipeptídeo podem ser também adequadamente usados.

[001280] Moléculas de ligação a antígeno da presente invenção são isoladas de meios de cultura de células transformadas com um vetor de expressão desejado onde um polinucleotídeo codificando um domínio de ligação a antígeno e um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo contendo uma região Fc, que foram ligados da maneira descrita acima, são operavelmente ligados.

[001281] Quando a região Fc contida na molécula de ligação a antí- geno da presente invenção é uma região Fc que foi modificada de maneira que a porcentagem da região Fc à qual uma cadeia de açúcar deficiente em fucose foi ligada, ou N-acetilglicosamina bifurcada foi ligada, se tornará maior, as células hospedeiro transformadas mencionadas acima que são adequadamente usadas são células hospedeiro que têm pouca habilidade em adicionar fucose a cadeias de açúcar como um resultado de modificação da atividade em formar a estrutura da cadeia de açúcar de um polipeptídeo a ser modificado com a cadeia de açúcar (por exemplo, WO 2000/061739, WO 2002/031140 e WO 2006/067913). Em uma modalidade não limitante de tais células hospedeiro, células hospedeiro deficientes na atividade de uma enzima ou transportador selecionado do grupo consistindo em fucosiltransferase (EC 2.4.1.152), transportador de fucose (SLC35C1), GMD (GDP-ma- nose-4,6-desidratase) (EC 4.2.1.47), Fx (GDP-ceto-6-desoximanose- 3,5-epimerase, 4-redutase) (EC 1.1.1.271) e GFPP (GDP-β-L-fucose pi- rofosforilase (EC 2.7.7.30), podem ser adequadamente usadas (por exemplo, WO 2000/061739, WO 2002/031140 e WO 2006/067913). Células hospedeiro deficientes em tal atividade podem ser produzidas, por exemplo, através de um método que destrói os genes dessas proteínas funcionais endógenas para células CHO, células BHK, células NS0, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camun-dongo P3X63, células PER, células PER.C6, células HEK293, células de hibridoma ou similar de maneira que elas sejam incapazes de funcionar.

[001282] Quando a região Fc contida na molécula de ligação a antí- geno da presente invenção é uma região Fc tendo uma cadeia de açúcar contendo um GlcNA bifurcado, as células transformadas descritas acima que são adequadamente usadas são células hospedeiro expressando um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de GnTIII (β-1,4-manosil-glicoprotepina 4-β-N-acetilglicosaminiltransfe- rase) (EC2.4.1.144) ou atividade de GalT (β-1,4-galactosiltransferase) (EC 2.4.1.38) para produzir anticorpos que têm cadeias de açúcar contendo GlcNAc bifurcado (WO2002/079255 e similar). Em outra modalidade não limitante adequada, células hospedeiro que co-expres- sam, em adição às proteínas funcionais mencionadas acima, um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de ManII (manosi- dase) humana (3.2.1.114), um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de GnTI (β-1,2-acetilglicosaminiltransferase I) (EC 2.4.1.94), um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de GnTII (β-1,2-acetilglicosaminiltransferase II) (EC 2.4.1.143), um gene codificando uma proteína funcional tendo atividade de ManI (EC 3.2.1.113) e α-1,6-fucosil transferase (EC 2.4.1.68) são adequadamente usadas (WO2004/065540).

[001283] As moléculas de ligação a antígeno da presente invenção são produzidas usando métodos que seguem os métodos para produção de anticorpos, tal como isolamento do meio de cultura das células mencionadas acima, que são descritas na seção “Anticorpos” acima. Uma modalidade não limitante dos polipeptídeos mencionados acima contendo uma região Fc incluem, por exemplo, a região constante de anticorpo de SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8. Uma modalidade não limitante das moléculas de ligação a antígeno da presente invenção é, por exemplo, uma molécula de anticorpo de comprimento integral.

Composições Farmacêuticas

[001284] A presente invenção provê composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de ligação a antígeno que não age sistemi- camente no sangue ou tecidos normais, mas age sobre lesões tais como câncer e sítios inflamados, para exibir eficácia de fármaco enquanto evitando efeitos colaterais. A molécula de ligação a antígeno contida na composição farmacêutica da presente invenção se liga a um antígeno expresso em células de câncer, células imunes, células estromais ou similar em tecidos cancerosos; um antígeno secretado em tecidos cancerosos; ou um antígeno expresso por células imunes ou similar em células inflamatórias; e um antígeno secretado em tecidos inflamatórios; e não pode se ligar a antígenos expressos em tecidos normais; desta maneira efeitos colaterais devido à atividade citotóxica, atividade de neutralização ou similar contra tecidos normais são evitados; e ao mesmo tempo, efeitos citotóxicos potentes, efeitos de supressão de crescimento e ação de potencialização da imunidade sobre cânceres, ou efeitos imunossupressores contra células inflamatórias em tecidos inflamatórios, são exibidos. Por exemplo, uma molécula de ligação a antígeno biespecífica ou biparatópica contendo um domínio de ligação a antígeno que se liga a EGFR expresso em células de câncer e um domínio de ligação a antígeno que se liga a CD3 expresso em células T de uma maneira dependente de um composto específico de tecido canceroso não se liga a EGFR expresso em tecidos normais, mas se liga a EGFR expresso em células de câncer; desta maneira exibindo efeitos antitumor potentes enquanto evitando efeitos colaterais. Especifica-mente, embora a molécula de ligação a antígeno se ligue a CD3 expresso em células T na vizinhança de células de câncer de uma maneira dependente de um composto específico de tecido canceroso, a molécula não se liga a CD3 expresso em células T que não estão na vizinhança de células de câncer. Desta maneira, a molécula ativa células T na vizinhança de células de câncer, exibindo efeitos antitumor potentes enquanto evitando efeitos colaterais.

[001285] Tais moléculas de ligação a antígeno que se ligam a um an- tígeno em tecidos alvo, mas não em outros tecidos normais e sangue, exibem eficácia de fármaco enquanto evitando efeitos colaterais. Moléculas de ligação a antígeno providas pela presente invenção, com ligação a um antígeno usando uma molécula pequena presente em concentrações altas em tecidos alvo in vivo como um permutador, a saber, moléculas pequenas permutam moléculas de ligação a antígeno, não se ligam ao antígeno em um ambiente normal onde molécula pequena não está presente, mas podem se ligar ao antígeno em tecidos alvo onde a molécula pequena está presente em concentrações altas.

[001286] Uma modalidade não limitante de tais moléculas de ligação a antígeno que permutam para molécula pequena incluem moléculas de ligação a antígeno dependentes de composto, específicas de tecido canceroso ou específicas de tecido inflamatório; e um composto específico de tecido canceroso ou específico de tecido inflamatório tais como adenosina, 5’-trifosfato de adenosina (ATP), inosina, quinurenina, pros- taglandina E2 (PGE2), ácido succínico e ácido láctico, que estão presentes em uma alta concentração em tecidos cancerosos ou tecidos in-flamatórios e capazes de funcionar como um permutador, provê uma função de permuta ao ser intercalado entre a molécula de ligação a an- tígeno da presente invenção (o parátopo contido no mesmo) e o antí- geno (o epítopo contido no mesmo). Na ausência do composto, a interação entre o parátopo na molécula de ligação a antígeno da presente invenção e o epítopo no antígeno não é suficiente para a molécula de ligação a antígeno da presente invenção ser capaz de se ligar ao antí- geno. Na presença do composto, o composto se interpõe entre o pará- topo na molécula de ligação a antígeno da presente invenção e o epí- topo no antígeno; e a molécula de ligação a antígeno que se ligou ao antígeno em um tecido alvo tal como tecido canceroso ou tecido inflamatório, onde o composto está presente em uma concentração alta, pode exibir eficácia de fármaco em células expressando o antígeno. Além disso, uma vez que esta ligação do composto permutador é reversível, a ligação de uma molécula de ligação a antígeno da presente invenção a um antígeno por meio desses compostos permutadores pode ser controlada de uma maneira reversível. Desta maneira, moléculas de ligação a antígeno da presente invenção que podem exibir eficácia de fármaco em um sítio de lesão tal como tecido canceroso ou tecido inflamatório através de ligação a células patogênicas tais como células cancerosas ou células imunes em um tecido canceroso ou tecido inflamatório ou através de ligação a um antígeno secretado em um tecido canceroso ou tecido inflamatório são úteis como composições farmacêuticas. As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender um carreador farmaceuticamente aceitável.

[001287] Na presente invenção, as composições farmacêuticas se referem geralmente a agentes farmacêuticos para tratamento ou prevenção ou teste e diagnóstico de doenças. Ainda, na presente invenção, a frase “composição farmacêutica contendo uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo” pode ser repara- fraseada como “método para tratamento de uma doença que compreende administração a um indivíduo a ser tratado uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo” ou repara- fraseada como “uso de uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo na produção de um agente farmacêutico para tratamento de uma doença”. Ainda, a frase “composição farmacêutica contendo uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antígeno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo” pode ser reparafraseada como “uso de uma molécula de ligação a antígeno cuja atividade de ligação a antí- geno varia dependendo da concentração de um composto específico de tecido alvo, para tratamento de uma doença”.

[001288] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas através de métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, elas podem ser usadas parenteralmente, na forma de injeções de soluções ou suspensões estéreis incluindo água ou outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, tais composições podem ser formuladas misturando na forma de dose unitária requerida na prática de fabricação de remédio geralmente aprovada, combinando apropriadamente com carreadores ou meios farma- cologicamente aceitáveis, especificamente com água estéril, solução salina fisiológica, óleo vegetal, emulsificante, suspensão, tensoativo, es- tabilizante, agente saborizante, excipiente, veículo, conservante, ligante ou similar. Em tais formulações, a quantidade de ingrediente ativo é ajustada para obter uma quantidade apropriada em uma faixa predeter-minada.

[001289] Composições estéreis para injeção podem ser formuladas usando veículos tal como água destilada para injeção, de acordo com prática de formulação padrão. Soluções aquosas para injeção incluem, por exemplo, solução salina fisiológica e soluções isotônicas contendo dextrose ou outros adjuvantes (por exemplo, D-sorbitol, D-manose, D- manitol e cloreto de sódio). É também possível usar em combinação solubilizantes apropriados, por exemplo, álcoois (etanol e similar), poli- álcoois (propileno glicol, polietileno glicol e similar), tensoativos não iô- nicos (polissorbato 80®, HCO-50 e similar).

[001290] Óleos incluem óleo de gergelim e óleos de soja. Benzoato de benzila e/ou álcool de benzila podem ser usados em combinação como solubilizadores. É também possível combinar tampões (por exemplo, tampão de fosfato e tampão de acetato de sódio), agentes calmantes (por exemplo, cloridrato de procaína), estabilizadores (por exemplo, álcool de benzila e fenol) e/ou antioxidantes. Ampolas apropriadas são cheias com as injeções preparadas.

[001291] As composições farmacêuticas da presente invenção são preferivelmente administradas parenteralmente. Por exemplo, as composições na forma de dosagem para injeções, administração transnasal, administração transpulmonar ou administração transdermal são administradas. Por exemplo, elas podem ser administradas sistemicamente ou localmente através de injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou similar.

[001292] Métodos de administração podem ser apropriadamente selecionados em consideração da idade e sintomas do paciente. A dose de uma composição farmacêutica contendo uma molécula de ligação a antígeno pode ser, por exemplo, de a partir de 0,0001 a 1.000 mg/kg para cada administração. Alternativamente, a dose pode ser, por exemplo, de a partir de 0,001 a 100.000 mg por paciente. No entanto, a presente invenção não é limitada pelos valores numéricos descritos acima. As doses e os métodos de administração variam dependendo do peso do paciente, idade, sintomas e similar. Aqueles versados na técnica podem ajustar doses e métodos de administração apropriados em consideração dos fatores descritos acima.

[001293] Os aminoácidos contidos nas sequências de aminoácido da presente invenção podem ser pós-traducionalmente modificados (por exemplo, a modificação de uma glutamina N-terminal em um ácido piro- glutâmico através de piroglutamilação é bem conhecida daqueles versados na técnica). Naturalmente, tais aminoácidos pós-traducional- mente modificados estão incluídos nas sequências de aminoácido na presente invenção.

[001294] Todos os documentos da técnica anterior mencionados no presente relatório são aqui incorporados a título de referência.

[001295] Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita com os Exemplos; no entanto, a presente invenção não deve ser limitada a eles.

Exemplos

[001296] [Exemplo 1] Conceito de anticorpos que se ligam a antígenos através de moléculas pequenas servindo como um permutador, que es-tão presentes em concentrações altas em tecidos alvo

[001297] A fim de exercer eficácia de fármaco enquanto evitando efeitos adversos, há a necessidade de tecnologia de descoberta de fár- maco que funcione em lesões tal como câncer ou sítios inflamatórios sem agir sistemicamente em tecidos ou sangue normal. Moléculas de anticorpo que se ligam a antígenos expressos em células de câncer, mas não incapazes de se ligar aos antígenos expressos em tecidos nor-mais após administração, podem exercer efeitos citotóxicos fortes contra câncer enquanto evitando efeitos adversos sobre tecidos normais como um resultado de ação citotóxica. Por exemplo, moléculas de ligação a antígeno que foram alteradas do EGFR-BiTE descrito acima (Do-cumento de Não Patente 9), que não podem se ligar a EGFR expresso em tecidos normais, mas são capazes de ligação a EGFR expresso em células cancerosas, podem exercer um efeito antitumor forte enquanto evitando efeitos adversos. Entretanto, BiTE exerce um efeito antitumor através de recrutamento e ativação de células T através de CD3 (Documento de Não Patente 8); e se for possível conferir EGFR-BiTE com a propriedade de ligação a CDE3 expresso em células T na vizinhança de células de câncer, mas não a CD3 expresso em células T fora da vizi-nhança de células de câncer, EGFR-BiTE alterado para ter propriedade pode ativar células T em câncer e então pode exercer efeitos antitumor fortes enquanto evitando efeitos adversos.

[001298] No entanto, isso não é limitado apenas a agentes farmacêuticos de anticorpo contra câncer. Quando uma molécula de anticorpo se liga e inibe citocinas no fluido sinovial de juntas inflamadas em artrite reumatoide, mas não inibe sistemicamente as citocinas, a molécula pode exercer efeitos terapêuticos potentes contra doenças inflamató- rias/autoimunes tal como artrite reumatoide, enquanto evitando riscos aumentados de infecção devido à neutralização sistêmica de citocinas.

[001299] Conforme acima descrito, anticorpos que se ligam a antíge- nos em tecidos cancerosos, mas não a antígenos em outros tecidos tais como tecidos normais e sangue, podem exercer eficácia de fármaco enquanto evitando efeitos adversos. No entanto, anticorpos ideais tendo tais propriedades não foram relatados até agora. Entretanto, conforme mostrado na figura 1, moléculas de anticorpo que se ligam a antígenos através de moléculas pequenas, como um permutador, que estão pre-sentes em concentrações altas em tecidos cancerosos in vivo (isto é, anticorpos permutadores de molécula pequena), não se ligam a antíge- nos em ambientes na ausência de tais moléculas pequenas; e elas podem se ligar a antígenos em tecidos alvo onde as moléculas pequenas estão presentes em concentrações altas.

[001300] No desenvolvimento de tais anticorpos permutadores de molécula pequena, primeiro foi pesquisar por moléculas pequenas que estão presentes em concentração alta em tecidos cancerosos e são consideradas ser úteis como um permutador. O resultado sugere que ade- nosina, trifosfato de adenosina (5’-trifosfato de adenosina (ATP), inosina, quinurenina, prostaglandina E2 (PGE2), ácido succínico e ácido láctico eram promissores como um permutador. Cada uma dessas moléculas pequenas é ou produzida por células cancerosas, ou liberadas de células cancerosas após morte celular, ou produzidas por células imunes, etc, infiltrando em tecidos cancerosos, e então elas estão presentes em concentrações altas em tecidos cancerosos; no entanto, elas estão presentes em concentrações baixas em tecidos normais e sangue em comparação com tecidos cancerosos. Se essas moléculas pequenas puderem ser intercaladas em um complexo entre um anticorpo e um antígeno de maneira conforme mostrado na figura 2, as moléculas pequenas podem realizar a função permutadora. Especificamente, na ausência de moléculas pequenas, a interação antígeno-anticorpo é insuficiente e o anticorpo não pode se ligar ao seu antígeno. Entretanto, na preencha de uma molécula pequena, o anticorpo pode se ligar a seu antígeno através de uma molécula pequena intercalada entre o anticorpo e o antígeno. Em outras palavras, na presença de uma concentração baixa de moléculas pequenas, a interação antígeno-anti- corpo é insuficiente e o anticorpo não pode se ligar a seu antígeno, en-quanto na presença de uma concentração alta de moléculas pequenas, o anticorpo pode se ligar a seu antígeno através de uma molécula pequena intercalada entre o anticorpo e o antígeno. Ainda, a ligação de moléculas pequenas como um permutador é reversível, e a regulagem de ligação a antígeno pelo permutador de molécula pequena é também reversível.

[001301] Neste contexto, primeiro, os presentes inventores tentaram isolar anticorpos permutadores de molécula pequena contra IL-6 (Br. J. Haematol. (2011) 152 (5), 579-92) que é relatada estar envolvida em crescimento de célula cancerosa.

[001302] [Exemplo 2] Aquisição de anticorpos que se ligam à IL-6 humana na presença de moléculas pequenas de uma biblioteca de anti-corpo humana usando técnicas de exibição de fago

[001303] (2-1) Construção de uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros

[001304] Uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos consistindo em fagos múltiplos que apresentam os domínios Fab de an-ticorpos humanos cujas sequências eram diferentes umas das outras foi construída usando como um modelo RNA poliA preparado a partir de PBMC humana, RNA poliA humano comercialmente disponíveis ou similar de acordo com um método conhecido daqueles versados na técnica.

[001305] (2-2) Aquisição de anticorpos que se ligam à IL-6 humana na presença de moléculas pequenas a partir da biblioteca através de panning de conta

[001306] A biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros construída conforme descrito em (2-1) foi avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação a antígeno na presença de moléculas pequenas, especificamente através de coleta de fagos exibindo anticorpos que na presença de moléculas pequenas exibem atividade de ligação a antígeno a antígenos capturados por contas. Fagos foram coletados de uma suspensão de fago eluída das contas na ausência de moléculas pequenas. Neste método de preparação, o antí- geno usado era IL-6 humana marcada com biotina.

[001307] Fagos produzidos em E. coli contendo o vetor de fagemídeo construído para exibição de fago foram purificados através de um método convencional. Então, uma suspensão de biblioteca de fago foi preparada através de diálise dos fagos contra TBS. Em seguida, BSA foi adicionado em uma concentração final de 4% à suspensão de biblioteca de fago. Panning foi realizado usando contas magnéticas imobilizadas em antígeno. As contas magnéticas usadas eram contas revestidas NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) ou contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).

[001308] Para isolar eficientemente anticorpos permutadores de molécula pequena que dependem de moléculas pequenas que podem ser-vir como um permutador em tecidos cancerosos, panning foi realizado para enriquecer anticorpos que se ligam a antígenos na presença de uma solução mista de moléculas pequenas (adenosina, trifosfato de adenosina (5’-trifosfato de adenosina (ATP)), inosina, quinurenina, pros- taglandina E2 (PGE2), ácido succínico e ácido láctico (daqui em diante referido como um coquetel de molécula pequena (SC)), mas não na ausência de SC.

[001309] Especificamente, junto com 250 pmol de antígeno marcado com biotina, SC contendo sal de sal de dissódio de trifosfato de adeno- sina (ATP-Na), adenosina, inosina, ácido succínico e ácido láctico em uma concentração final de 1 mM, prostaglandina E2 (PGE2) em uma concentração final de 1 μM e quinurenina em uma concentração final de 100 μM, que tinha sido ajustado para ser de pH 7,4, com NaOH, foi contatado com a suspensão de biblioteca de fago preparada por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à suspensão de biblioteca de fago e o complexo antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas em tem-peratura ambiente por 15 minutos. Após lavagem uma vez com SC/TBS (TBS contendo SC), as contas foram combinadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina. Imediatamente após suspensão das contas em temperatura ambiente por 15 minutos, a suspensão de fago foi coletada a partir das contas isoladas usando um suporte magnético. A suspensão de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmico (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi infectada com o fago através de incubação da E. coli acima com agitação suave a 37° C por uma hora. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados a partir do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido para biblioteca de fago.

[001310] A primeira rodada de panning foi realizada para coletar fagos que são capazes de se ligar na presença de moléculas pequenas, enquanto as segunda e subsequentes rodadas de panning foram realizadas para enriquecer fagos que são capazes de se ligar a antígenos na presença de SC. Especificamente, a suspensão de biblioteca de fago preparada foi misturada com 40 pmol de antígeno marcado com biotina, SC e NaOH, e contatada com as moléculas pequenas e antígenos por 60 minutos em temperatura ambiente. Contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e deixadas se ligar ao complexo antígeno- fago por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas com 1 ml de SC/TBST e SC/TBS. Então, imediatamente após 0,5 ml de TBS ter sido adicionado para suspender as contas em temperatura ambiente, uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. Após esse tratamento ser repetido, as duas suspensões de fago separadamente eluídas foram misturadas juntas. Então, as contas resultantes foram combinadas com 0,5 ml de TBS e agitadas em temperatura ambiente por cinco minutos. Uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. Através da adição de 5 μl de 100 mg/ml de tripsina à suspensão de fago coletada, a proteína pIII (proteína pIII derivada de fago auxiliar) que não exibe Fab foi clivada de fagos, e a habilidade de fatos que não exibem Fab em infectar E. coli foi eliminada. Os fagos coletados da suspensão de fago tripnizada foram adicionados a 10 ml de linhagem de E. coli ER2738 na fase de crescimento logarítmico (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada a 37° C por uma hora sob agitação suave para infectar fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Os dois tipos de E. coli infectadas obtidos através da segunda rodada de panning foram misturados em quantidades iguais neste ponto de tempo. Então, os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma suspensão de biblioteca de fago. Panning foi realizado três vezes para isolar anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno na presença de SC.

[001311] (2-3) Aquisição de anticorpos que se ligam à IL-6 humana na presença de moléculas pequenas da biblioteca usando um método de seleção negativo

[001312] A biblioteca de exibição de fago construída de anticorpos humanos puros foi avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação a antígeno na presença de moléculas pequenas. Como uma primeira etapa de avaliação, a biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros foi contatada com antígeno-estreptavidina marcado com biotina na ausência de moléculas pequenas para eliminar fagos exibindo anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno mesmo na ausência de moléculas pequenas. Então panning foi realizado na presença de moléculas pequenas da mesma maneira. Desta maneira, avaliação foi realizada quanto a anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno na presença de moléculas pequenas. IL-6 marcada com biotina foi usada como o antígeno.

[001313] Os fagos foram produzidos em E. coli retendo fagemídeo de exibição de fago construído. Os fagos produzidos foram purificados através de um método convencional, e então uma suspensão de biblioteca de fago foi preparada através de diálise dos fagos contra TBS. Então, BSA foi adicionado à suspensão de biblioteca de fago em uma concentração final de 4%. As contas magnéticas usadas eram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvi- din) ou contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Strep-tavidin). Panning foi realizado usando contas magnéticas imobilizadas com antígeno.

[001314] Junto com 250 pmol de antígeno marcado com biotina, SC contendo ATP-Na, adenosina, inosina, ácido succínico e ácido láctico em uma concentração final de 1 mM, PGE2 em uma concentração final de 1 μM, e quinurenina em uma concentração final de 100 μM, cujo pH foi ajustado para 7,4 com NaOH, foi adicionada e contatada com a suspensão de biblioteca de fago preparada por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à suspensão de biblioteca de fago, e o complexo antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. Após lavar uma vez com SC/TBS, as contas foram combi-nadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina. Imediatamente após a suspensão das contas em temperatura ambiente por 15 minutos, a suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A suspensão de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmico (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada a 37° C por uma hora com agitação suave para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido de biblioteca de fago.

[001315] A primeira rodada de panning foi realizada para coletar fagos que são capazes de ligação na presença de SC, enquanto as segunda e subsequentes rodadas de panning foram realizadas para enriquecer fagos que são capazes de ligação a antígeno na presença de SC. Especificamente, 250 pmol de antígeno biotinilado foram adicionados a contas Sera-Mag NeutrAvidin bloqueadas com BSA para ligação em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com TBS. A suspensão de biblioteca de fago submetida a bloqueio com BSA foi adicionada às contas e deixada se ligar a elas em temperatura ambiente por uma hora. Os fagos que não se ligaram aos antíge- nos ou contas foram coletados através de isolamento das contas usando um suporte magnético. 40 pmol de antígeno marcado com bio-tina, SC e NaOH foram adicionados aos fagos coletados. Desta maneira, a biblioteca de fago foi contatada com as moléculas pequenas em SC em temperatura ambiente por 60 minutos. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à mistura de antígeno marcado, SC e biblioteca de fago, e deixadas se ligar ao complexo de antí- geno-fago por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas com 1 ml de SC/TBST e SC/TBS. Então, 0,5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina foi adicionado à mistura. Após a suspensão misturada ter sido agitada em temperatura ambiente por 20 minutos, fagos foram coletados das contas que tinham sido separadas usando um suporte magnético. Os fagos coletados foram adicionados a 10 ml de linhagem de E. coli ER2738 na fase de crescimento logarítmico (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada a 37° C por uma hora sob agitação suave para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Panning foi realizado três vezes para isolar anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno na presença de SC.

[001316] (2-4) Avaliação de atividade de ligação na presença de mo léculas pequenas através de ELISA de fago

[001317] Sobrenadantes de cultura contendo fagos foram coletados de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) a partir de colônias únicas de E. coli obtidas através do método descrito acima. Os sobrenadantes de cultura coletados foram tratados através de ultrafiltragem usando NucleoFast 96 (MACHEREY-NAGEL). 100 μL dos sobrenadantes de cultura coletados foram adicionados a cada cavidade de NucleoFas96 e centrifugados (4500 g por 45 minutos) para remover porção de fluxo. 100 μl de H2O foram adicionados a cada cavidade, e novamente o NucleoFast 96 foi centrifugado (4500 g por 30 minutos) para lavagem. Após 100 μl de TBS terem sido adicionados, o NucleoFast 96 foi deixado descansar por cinco minutos em temperatura ambiente. Finalmente, uma suspensão de fago foi coletada a partir do sobrenadante em cada cavidade.

[001318] Após adição de TBS ou SC/TBS, os fagos purificados foram submetidos a ELISA através do procedimento que segue. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μl de TBS contendo o antígeno marcado com biotina. Após o antígeno ser removido através de lavagem de cada cavidade da placa com TBST, as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de leite desnatado 2%-TBS por uma hora ou mais. Leite desnatado 2%-TBS foi removido, e então os fagos purificados, preparados, foram adicionados a cada cavidade. A placa foi deixada descansar a 37° C por uma hora para permitir ligação de fagos de exibição de anticorpo ao antígeno na presença ou ausência de SC em cada cavidade. Após cada cavidade ter sido lavada com TBST ou SC/TBST, o anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS ou SC/TBS foi adicionado a ela, e a placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com TBST ou SC/TBST, a solução única TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade, e a reação cromogênica na solução foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm.

[001319] ELISA de fago de 96 clones isolados revelou um clone “I6NMSC1-3_A11”, que tem atividade de ligação à IL-6 humana como um antígeno na presença de um coquetel de molécula pequena.

[001320] [Exemplo 3] Avaliação de anticorpos que se ligam a antíge- nos na presença de moléculas pequenas

[001321] (3-1) Expressão e purificação de anticorpos que se ligam à IL-6 humana

[001322] Genes foram amplificados a partir do clone I6NMSC1-3_A11 que tinha sido avaliado ter atividade de ligação a antígeno na presença de SC usando primers específicos (SEQ ID NOs: 110 e 112) através de ELISA de fago conforme descrito no Exemplo 2. As sequências de nu- cleotídeo dos genes foram analisadas (as sequências de cadeia pesada e cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 30 e 31, respectivamente). O gene codificando a região variável de I6NMSC1-3_A11 foi inserido em um plasmídeo de expressão animal para IgG1 hu- mana/Lambda, enquanto cada um dos genes codificando as regiões variáveis de anticorpo IL-6 anti-humano conhecido CLB8-F1 (a cadeia pesada e a cadeia leve são SEQ ID NOs: 32 e 33, respectivamente) e as regiões variáveis de anticorpo glipicano 3 anti-humano GC413 (a cadeia pesada e a cadeia leve são SEQ ID NOs: 34 e 35, respectivamente) como um controle negativo foi inserido em um plasmídeo de expressão animal para IgG1 humano/kappa. Anticorpos foram expressos usando o método descrito abaixo. FreeStyle 293-F (Invitrogen) que é derivada de células de rim fetal humanas foram suspensas em uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/ml em Meio de Expressão de FreeStyle 293 (Invitrogen) e separadas em alíquotas em 3 ml em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. O DNA de plasmídeo foi transfectado em células através de lipofecção. A partir dos sobrenadantes de cultura após quatro dias de cultura em uma incubadora de CO2 (37° C, C02 8%, 90 rpm), anticorpos foram purificados através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences). A absorbância de soluções de anticorpos purificados foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A partir dos valores obtidos através de medição, as concentrações de anticorpos purificados foram calculadas usando um coeficiente de extinção de-terminado através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 24112423).

[001323] (3-2) Identificação de moléculas pequenas necessárias para ligação à IL-6 humana dos anticorpos obtidos

[001324] Três tipos de anticorpo: I6NMSC1-3 isolado (daqui em diante referido como A11) e CLB8-F1 e GC413 como controles foram subme-tidos a ELISA sob as nove condições descritas na Tabela 3. Entretanto, cada molécula pequena foi apropriadamente preparada nas concentrações mostradas na Tabela 3 usando os tampões indicados na Tabela 4. IL-6 humana marcada com biotina foi usada como o antígeno.

[001325] Primeiro, uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora ou mais com 100 μl de PBS contendo o antígeno marcado com biotina. Após lavagem com o Tampão de lavagem para remover antígeno não ligado da placa, cada cavidade foi bloqueada por uma hora ou mais com 250 μl de Tampão de Bloqueio. O Tampão de Bloqueio foi removido de cada cavidade. As IgGs purificadas foram preparadas para 2,5 μg/ml em um Tampão de Amostra contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 3, e cada uma foi separada a 100 μl para cada cavidade da placa. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de cada IgG ao antígeno em cada cavidade. Após lavagem com um Tampão de Lavagem contendo as moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 3, um anticorpo IgG anti-humano conjugado a HRP (BIOSOURCE) diluído com um Tampão de Amostra contendo as mesmas moléculas pequenas foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com um Tampão de Lavagem cada molécula pequena, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm.

[001326] O resultado de medição é mostrado na figura 3. O resultado mostrou que a absorbância de CLB8-F1 era constante sem importar o tipo ou presença de molécula pequena, enquanto a absorbância de I6NMSC1-3_11 foi notadamente menor sob a condição 9 (sem moléculas pequenas) comparado com sob condição 8 (a solução de doquetel de molécula pequena completa). Similar a ELISA de fago, esse resultado mostrou que I6NMSC1-3_11 tinha a propriedade que sua ligação a antígeno é alterada dependendo da presença de moléculas pequenas. Entretanto, I6NMSC1-3_11 mostrou absorbância equivalente sob condição 7 (na presença de 100 μM de quinurenina) àquela sob a condição 8; no entanto, a absorbância foi notadamente menor sob outras condições. Esse resultado demonstra que I6NMSC1-3_11 é um anticorpo que se liga à IL-6 humana como um antígeno na presença de quinurenina, mas não na ausência de quinurenina.

[001327] [Exemplo 4] Avaliação do efeito de quinurenina sobre ligação de IL-6 humana através de ressonância de plasmon de superfície

[001328] (4-1) Avaliação de quinurenina quanto à sua função permu- tadora em ligação à IL-6 humana

[001329] Usando Biacore T200 (GE Healthcare), A11 foi analisada quanto à sua interação com IL-6 humana (Kamakura Techno-Science, Inc.) em reação antígeno-anticorpo. Sensor chip CM5 (GE Healthcare) foi imobilizado com uma quantidade apropriada de proteína A/G (Invitrogen) através de acoplamento amina. Anticorpos de interesse foram capturados pelo chip para permitir interação à IL-6 como um antí- geno. Os dois tipos de tampões de processamento usados foram 10 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCI, 0,05% (p/v) Tween 20, 100 μmol/l de quinurenina, pH 7,4 e 10 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, 0,05% (p/v) Tween 20, pH 7,4. A interação com IL-6 como um antígeno foi avaliada a 37° C. O tampão usado para diluir IL-6 foi o mesmo tampão de processamento que aquele descrito acima.

[001330] Uma solução diluída de IL-6 humana e um tampão de processamento como um blank foram injetados em uma taxa de fluxo de 5 μl/min por três minutos para permitir interação de IL-6 humana com A11 capturado no sensor chip. Então, o tampão de processamento foi injetado em uma taxa de fluxo de 5 μl/min por três minutos. Após observação de dissociação de IL-6 humana a partir do anticorpo, 10 mmol/l gli- cina-HCl (pH 1,5) foram injetados em uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 30 segundos para regenerar o sensor chip. A constante de dissociação KD (M) de A11 foi calculada para IL-6 humana com base na constante de taxa de associação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (1/s), ambas são parâmetros cinéticos calculados a partir do sen- sorgrama obtido através da medição. Cada parâmetro foi calculado usando o Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare).

[001331] Os sensorgramas para a interação entre A11 e 4 μmol/l de IL-6 humana obtida através da medição na presença ou ausência de 100 μmol/l de quinurenina são mostrados na figura 4. Conforme mostrado na figura 4, A11 ligado à IL-6 na presença de 100 μmol/l de quinu- renina; no entanto, na ausência de quinurenina, a ligação de IL-6 era não detectável. Isso demonstra que A11 tem a propriedade que ele se liga à IL-6 através de quinurenina como um permutador. Entretanto, a constante de dissociação KD de A11 foi 1.0E-6 mol/l na presença de 100 μmol/l de quinurenina.

[001332] (4-2) Avaliação quanto ao efeito de concentração de quinu- renina sobre ligação à IL-6 humana

[001333] Então, o efeito de concentração de quinurenina sob reação antígeno-anticorpo entre A11 e IL-6 humana foi avaliado usando Biacore T200 (GE Healthcare). O tampão de processamento usado era 10 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, 0,05% (p/v) Tween 20, pH 7,4. Reacao antígeno-anticorpo entre A11 e IL-6 humana foi avaliada a 25° C. A11 foi imobilizado no sensor chip CM5 através de acoplamento amina, e como um analito IL-6 foi diluído para 1 μmol/l com 10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4 contendo quinu- renina em várias concentrações, e deixada interagir por 60 segundos para observar mudanças na quantidade de ligação. O resultado é mostrado na figura 5. Esse resultado demonstrou que quanto maior a concentração de quinurenina como um permutador, mais IL-6 se liga a A11.

[001334] Em seguida, o mesmo experimento que o descrito acima foi realizado para avaliar o efeito de concentração de quinurenina sobre reação antígeno-anticorpo entre IL-6 humana e o anticorpo de ligação à IL-6 humana H01 (a cadeia pesada e a cadeia leve são SEQ ID NOs: 36 e 37, respectivamente) imobilizado no sensorchip CM5, que foi derivado de uma biblioteca e serviu como um controle para a função per- mutadora de quinurenina em A11. O resultado é mostrado na figura 6. Esse resultado confirmou que para o anticorpo anti-IL-6 H01 controle derivado de uma biblioteca, sua ligação à IL-6 não é alterada mesmo se a concentração de quinurenina mudar.

[001335] Então, o efeito da concentração de quinurenina como um permutador na ligação divalente de A11 à IL-6 foi avaliado usando Bia- core T200 (GE Healthcare). O tampão de processamento foi usado como 10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4. A reação antígeno-anticorpo entre A11 e IL-6 humana foi avaliada a 25° C. IL-6 foi imobilizada em sensor chip CM5 através de acoplamento amina, e como um analito A11 foi diluído para 0,1 μmol/l com 10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) Tween 20, pH 7,4, contendo várias concentrações de quinurenina, e deixados interagir por 60 segundos para observar mudanças na quantidade de ligação covalente de A11 à IL-6. O resultado é mostrado na Tabela 7. Neste sistema de ensaio, A11 é esperado se ligar de uma maneira divalente uma vez que IL-6 é imobilizada em um sensor chip. Com tal sistema de ensaio onde A11 reconhece IL-6 de uma maneira divalente, a quantidade de A11 ligado à IL-6 foi também observada aumentar com uma concentração de quinurenina maior. Esse resultado demonstrou que A11 tem a propriedade que em sua ligação divalente, ele se liga também à IL-6 através de quinurenina como um permutador.

[001336] (4-3) Efeito de quinurenina como um permutador sobre a dis sociação de anticorpos de IL-6 humana

[001337] Usando Biacore T200 (GE Healthcare), A11 ligado à IL-6 na presença de quinurenina foi testado para avaliar se na ausência de qui- nurenina ele se dissocia de uma maneira dependente da concentração de quinurenina. O tampão de processamento usado foi 10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4, e 100 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4, 100 μmol/l de quinurenina. O ensaio foi realizado a 25° C. IL-6 foi imobilizada em sensor chip CM5 através de acoplamento amina, e como um analito A11 foi diluído para 0,1 μmol/l com 10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4, contendo 100 μmol/l de quinurenina e deixada interagir por 60 segundos. Então, a dissociação de IL-6 foi monitorada com cada tipo de tampão de processamento. A fim de comparar o grau de dissociação entre as respectivas condições de tampão de processamento, as quantidades de IL-6 ligada a A11 foram normalizadas e comparadas tendo o valor na presença de 100 μmol/l de quinurenina como 100. Um sensorgrama representando a interação entre A11 e IL-6 após normalização é mostrado na figura 8. O resultado mostrado na figura 8 demonstra que A11 tem a propriedade que ele se liga à IL-6 na presença de quinurenina e então se dissocia rapidamente de IL-6 na ausência de quinurenina. Especificamente, a regulação mediada por quinurenina da ligação de anticorpo à IL-6 humana por quinurenina foi demonstrada ser completamente reversível.

[001338] Esses resultados demonstram que A11 é um anticorpo que se liga à IL-6 na presença de quinurenina através de quinurenina como um permutador, mas é dissociada de IL-6 na ausência de quinurenina. Foi também confirmado que é possível ter regulagem ON/OFF integral de A11 de maneira que ele não tem nenhuma atividade de ligação à IL- 6 humana na ausência de quinurenina. A função de permuta era esperada ser obtida da maneira tal como mostrado na figura 2.

[001339] (4-4) Avaliação de quinurenina quanto à sua ligação à IL-6 humana

[001340] A interação entre IL-6 (Kamakura Techno-Science, Inc.) e quinurenina foi analisada usando Biacore T200 (GE Healthcare). Sensor chip CM5 (GE Healthcare) foi imobilizado com cerca de 5000 RU de IL- 6 através de acoplamento amina e 800, 400, 200, 100, 50 ou 25 nmol/l de quinurenina foram deixados interagir com IL-6. O tampão de processamento usado foi 10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4. Todas as medições para a interação descrita acima foram realizadas a 25° C. Quinurenina foi diluída usando tampão de processamento. O sensorgrama obtido mostrando a interação entre IL-6 e quinurenina é mostrado na figura 9.

[001341] Cerca de 5000 RU de IL-6 foram imobilizados no experimento descrito acima. Os pesos moleculares de IL-6 e quinurenina eram cerca de 20000 g/mol e cerca de 200 g/mol, respectivamente. Desta maneira, no máximo cerca de 50 RU de quinurenina eram esperados interagir. Sob a condição de medição descrita acima, no entanto, interação óbvia com IL-6 não era detectável mesmo quando quinurenina foi deixada interagir em uma concentração máxima de 800 nmol/l.

[001342] Com base no resultado do Exemplo descrito acima, a KD de quinurenina para formação do complexo consistindo em A11, IL-6 e qui- nurenina é estimada ser várias dezenas de nM a vários nM. Isso também sugere que se hipoteticamente quinurenina interage diretamente com IL-6, a interação seria observada sem ambiguidade quando quinu- renina fosse deixada interagir a 800 nmol/l. O resultado descrito acima implica a possibilidade que quinurenina não interage diretamente com IL-6, mas interage com A11 ou o complexo A11-IL-6 em várias dezenas de nM.

[001343] [Exemplo 5] Aquisição de anticorpos antiadenosina através de clonagem de célula B de coelho

[001344] (5-1) Projeto de imunógeno para construir biblioteca de liga ção à adenosina

[001345] O imunógeno usado em imunização de coelhos era 2’-Ade- nosina-PEG-peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano (2’-Adenosina- PEG-peptídeo) mostrado na figura 10 e 5’-Adenosina-PEG-peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano (5’-Adenosina-PEG-peptídeo) mostrados na figura 11. O peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano consiste na sequência de aminoácido FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 4), e é um peptídeo identificado como um epítopo de receptor de célula T expresso em células T auxiliares (Eur. J. Immunol. (1989) 19, 2237-2242). O peptídeo é conhecido ativar produção de anticorpo (J. Immunol. (1992) 149, 717-721). Quando ligado à adenosina, o peptídeo serve como um adjuvante e então é esperado aumentar a produção de anticorpos contra adenosina. A ligação entre adenosina e o peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano foi projetada ser através de PEG de maneira que epítopos de anticorpos contra adenosina podem dificilmente conter o peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano. A adenosina é um metabolito de ATP, e uma vez que os grupos fosfato de ATP são ligados ao grupo 5’ hidroxila de adenosina, anticorpos que não reconhecem o grupo 5’ hidroxila de adenosina como um epítopo podem também se ligar a ATP em adição à adenosina. Isto é, seria mais fácil obter anticorpos que podem se ligar a ambos adenosina e ATP usando como um imunógeno 5’-Adenosina-PEG-peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano, enquanto seria mais fácil obter anticorpos que se ligam à adeno- sina, mas não a ATP, usando como um imunógeno 2’-Adenosina-PEG- peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano. Por esta razão, os dois tipos de imunógenos que contêm o peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano ligado à posição 2’ ou 5’ de adenosina foram preparados da maneira descrita em (5-2).

[001346] Ainda, 2’-Adenosina-PEG-biotina (figura 12) e 5’-Adenosina- PEG-biotina (figura 13), onde biotina é conjugada ao invés do peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano, foram produzidas conforme descrito abaixo. Ao avaliar a ligação a esses dois tipos de Adenosina-PEG-bio- tina, os anticorpos podem ser testados para demonstrar que seus epí- topos não contêm o peptídeo auxiliar p30 da Toxina do tétano.

[001347] (5-2) Síntese de imunógenos para preparar biblioteca de li gação à adenosina

[001348] 2’-Adenosina-PEG-peptídeo (conjugado de adenosina 2’- PEG-peptídeo ou 2’-(PEG-peptídeo)adenosina) e 2’-Adenosina-PEG- biotina (conjugado de adenosina 2’-PEG-biotina ou 2’-(PEG-bio- tina)adenosina) foram sintetizados da maneira descrita abaixo. A 2’- Adenosina-PEG-peptídeo e 2’-Adenosina-PEG-biotina sintetizados foram analisados ou fracionados sob as condições abaixo.

[001349] As condições de análise de LCMS são mencionadas como abaixo.

[001350] As condições de HPLC preparativa são descritas abaixo. Tabela 6

[001351] (5-2) Síntese de composto 006 (Boc-Phe-Asn-Asn-Phe-Thr (tBu)-Val-Ser (tBu)-Phe-Trp (Boc)-Lue-Arg (Pbf)-Val-Pro-Lys (Boc)-Val- Ser (tBu)-Ala-Ser (tBu)-His (Trt)-Leu-Glu (tBu)-OH) [Composto 6]

[001352] Síntese de peptídeo foi realizada através do método Fmoc usando um sintetizador de peptídeo (Multipep RS; Intavis). Todos os aminoácidos Fmoc foram comprados da WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. O procedimento detalhado do tratamento estava no manual junto com o sintetizador.

[001353] Fmoc-Glu(tBu)-OH ligado em seu terminal C à resina 2-clo- rotritila (250 mg/coluna, 30 colunas, 11,7 mmol), uma solução de N,N- dimetilformamida contendo vários aminoácidos de Fmoc (0,6 mol/l) e 1- hidroxi-7-azabenzotriazol (0,375 mol/l) e uma solução de N,N-dimetilfor- mamida (10% v/v) de diisopropilcarbodiimida foram carregados no sin- tetizador. A reação de síntese foi realizada usando como uma solução de desproteção de Fmoc uma solução de N,N-dimetilformamida (20% v/v) contendo piperidina e 5% (p/v) de ureia. Após a resina ter sido lavada com N,N-dimetilformamida, desproteção de Fmoc foi realizada, seguido por um ciclo de reação de condensação de aminoácido Fmoc. Este ciclo foi repetido para alongar peptídeos na superfície da resina. Após alongamento, a resina foi lavada com trifluoretanol. Os peptídeos foram clivados da resina através da adição de trifluoretanol/diclorome- tano (= 1/1). Desta maneira, o composto 0,06 (7,2 g) foi obtido como um produto bruto.

[001354] LCMS(ESI)m/z = 1185(M+3H)3+

[001355] Tempo de retenção: 1,24 minuto (Condição de análise, SQDAA05)

[001356] (5-2-2) Síntese de comsoto 007 [Composto 7]

[001357] Uma suspensão de adenosina (2,00 g, 7,48 mmol) em N,N- dimetilformamida (40 ml) foi esfriada para 0o C e hidreto de sódio 60% (0,42 g, 10,48 mmol) foi adicionado a ela. A mistura de reação foi aitada por uma hora a 0o C. Após adição de bromoacetato de metila (0,76 ml, 8,01 mmol), a mistura de reação resultante foi agitada por cinco horas em temperatura ambiente e ácido acético (1 ml) e metanol (3 ml) foram adicionados a ela. A mistura de reação foi concentrada sob pressão re-duzida. O resíduo resultante foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel de fase normal (diclorometano/metanol). Desta maneira, o composto 007 (0,93 g, 37%) foi obtido.

[001358] LCMS(ESI) m/z = 340(M+H)+

[001359] Tempo de retenção: 0,27 minuto (Condição de análise, SQDFA05)

[001360] (5-2-3) Síntese do composto 008 [Composto 8]

[001361] Cloreto de t-butildimetilsilila (999 mg, 6,63 mol) e imidazol (722 mg, 10,61 mol) foram adicionados a uma solução de piridina (8 ml) de composto 007 (900 mg, 2,65 mmol). A mistura de reação foi agitada por quatro horas em temperatura ambiente e extraída com acetato de etila/água. A camada orgânica extraída foi lavada com uma solução de cloreto de sódio saturada e seca em sulfato de sódio anidro. Após filtragem, a camada orgânica foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel de fase normal (diclorometano/metanol). Desta maneira, o composto 008 (1,17 g, 78%) foi obtido.

[001362] LCMS(ESI)m/z = 568(M+H)+

[001363] Tempo de retenção: 1,10 minuto (Condição de análise, SQDFA05)

[001364] (5-2-4) Síntese de composto 009 [Composto 9]

[001365] Hidróxido de lítio (61 mg, 2,55 mmol) dissolvido em água (0,17 ml) foi adicionado a uma solução de composto 008 (290 mg, 0,511 mmol) e metanol (0,34 ml)/tetraidrofurano (0,34 ml). A mistura de reação foi agitada por 30 minutos em temperatura ambiente. A mistura foi neutralizada com ácido clorídrico 1 M e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo concentrado foi extraído com acetato de etila/água. A camada orgânica resultante foi lavada com uma solução de cloreto de sódio saturada e seca em sulfato de sódio anidro. Após filtragem, a camada orgânica foi concentrada sob uma pressão reduzida. Desta maneira, o composto 009 (319 mg, 90%) foi obtido.

[001366] LCMS(ESI)m/z = 552(M-H)-

[001367] Tempo de retenção: 0,97 minuto (Condição de análise, SQDFA05)

[001368] (5-2-5) Síntese de compostos 010 e 011 [

[001369] 1-Hidroxibenzotriazol (75 mg, 0,553 mmol) e cloridrato de 1- etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida (106 mg, 0,553 mmol) foram adicionados a uma solução de N,N-dimetilformamida (1,5 ml) de composto 009 (255 mg, 0,460 mmol) e ela foi agitada por três minutos em temperatura ambiente. O-(2-aminoetil)-O’-2-azidoetil)nonaetileno glicol (291 mg, 0,553 mmol) foi adicionado à mistura de reação e ela foi agitada por três horas em temperatura ambiente. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo resultante foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel de fase reversa (solução de acetato de amônio 10 mM aquosa/metanol). Os compostos 010 (177 mg, 4%) e 011 (72 mg, 19%) foram obtidos. Composto 10

[001370] LCMS(ESI)m/z = 1063(M+H)+

[001371] Tempo de retenção: 0,98 minuto (Condição de análise, SQDFA05) Composto 11

[001372] LCMS(ESI)m/z = 949(M+H)+

[001373] Tempo de retenção: 0,67 minuto (Condição de análise SQDFA05)

[001374] (5-2-6) Síntese de composto 012 [Composto 12]

[001375] Paládio sobre carbono 10% (34 mg) foi adicionado a uma solução de composto 010 (170 mg, 0,160 mmol) em etanol (1 ml). A mistura de reação foi agitada por duas horas sob atmosfera de hidrogênio e novamente paládio sobre carbono 10% (34 mg) foi adicionado a ela. A mistura de reação foi agitada por duas horas sob uma atmosfera de hidrogênio para completar a reação. O filtrado da solução de reação foi concentrado sob pressão reduzida. O composto 012 (34 mg, 95%) foi obtido.

[001376] LCMS(ESI)m/z = 1037(M+H)+

[001377] Tempo de retenção: 0,70 minuto (Condição de análise SQDFA05)

[001378] (5-2-7) Síntese de compostos 013 e 014

[001379] O composto 006 (354 mg, 0,110 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (13 mg, 0,100 mol) e cloridrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-car- bodi-imida (19 mg, 0,100 mol) foram adicionados a uma solução de composto 012 (86 mg, 0,083 mmol) em N,N-dimetilformamida (1,5 ml) e ela foi agitada por duas horas em temperatura ambiente. O filtrado da mistura de reação foi purificado através de condição preparativa A descrita na Tabela 6. Uma mistura de compostos 013 e 014 (72 mg) foi obtida. Composto 013

[001380] LCMS(ESI)m/z = 1525(M+3H)3+, 1144(M+4H)4+

[001381] Tempo de retenção: 1,13 minuto (Condição de análise, SQDAA50) Composto 014

[001382] LCMS(ESI)m/z = 1444(M+3H)3+, 1083(M+4H)4+

[001383] Tempo de retenção: 1,02 minuto (Condição de análise, SQDAA50)

[001384] (5-2-8) Síntese de 2’-Adenosina-PEG-peptídeo (conjugado de adenosina 2’-PEG-peptídeo ou 2’-(PEG-peptídeo)adenosina (Composto 015) [Composto 15]

[001385] Ácido trifluoracético (16 ml), diclorometano (8 ml), água (1,3 ml) e tetraidropropilsilano (1,3 ml) foram adicionados à mistura de compostos 013 e 014 (42 mg) e foi agitada por seis horas em temperatura ambiente. O resíduo obtido através da concentração da mistura de reação sob pressão reduzida foi purificado através de condição B preparativa descrita na Tabela 6. Desta maneira, o composto 015 (10 mg) foi obtido.

[001386] LCMS(ESI)m/z = 1090(M+3H)3+, 818(M+4H)4+

[001387] Tempo de retenção: 0,52 minuto (Condição de análise, SQDAA50)

[001388] (5-2-9) Síntese de composto 016 [Composto 016]

[001389] Paládio sobre carbono 10% (34 mg) foi adicionado a uma solução de composto 011 (70 mg, 0,074 mmol) em etanol (1 ml) e a mistura de reação foi agitada por cinco horas sob atmosfera de hidrogênio. O filtrado da mistura de reação foi concentrado sob pressão reduzida. Desta maneira, o composto 016 (58 mg, 85%) foi obtido.

[001390] LCMS(ESI)m/z = 923(M+H)+

[001391] Tempo de retenção: 0,50 minuto (Condição de análise SQDFA05)

[001392] (5-2-10) Síntese de composto 017 [Composto 17]

[001393] D-biotin N-succinimidila (24 mg, 0,069 mmol) e trietilamina (13 μl, 0,094 mol) foram adicionadas a uma solução de composto 016 (58 mg, 0,063 mmol) em N,N-dimetilformamida (1 ml) e foi agitada por duas horas em temperatura ambiente. Então, após D-biotin N-succini- midila (5 mg, 0,015 mmol) ser adicionada, a reação foi terminada quando de 1,5 hora de agitação em temperatura ambiente. A mistura de reação foi purificada através de cromatografia de coluna de sílica gel de fase reversa (solução de acetato de amônio 10 mM aquosa/metanol). O Composto 017 (50 mg, 69%) foi obtido.

[001394] LCMS(ESI)m/z = 1149(M+H)+

[001395] Tempo de retenção: 1,04 minuto (Condição de análise, SQDFA05)

[001396] (5-2-11) Síntese de 2’-Adenosina-PEG-biotina (conjugado de adenosina 2’-PEG-biotina ou 2’-(PEG-biotina)adenosina (Composto 018) [Composto 18]

[001397] Uma solução de fluoreto de tetra-n-butilamônio 1 M em te- traidrofurano (65 μl, 0,065 mmol) foi adicionada a uma solução de composto 017 (62 mg, 0,054 mmol) em tetraidrofurano (2 ml) e ela foi agitada em temperatura ambiente por uma hora. Então, fluoreto de tetra-n- butilamônio 1 M em solução de tetraidrofurano (20 μl, 0,020 mmol) foi adicionado e a reação foi completada através de agitação em temperatura ambiente por uma hora. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica gel de fase reversa (solução de ácido fórmico aquosa 0,1%/ácido fórmico 0,1% em acetonitrila). Composto 18 (12 mg, 21%) foi obtido.

[001398] LCMS(ESI)m/z = 1035(M+H)+

[001399] Tempo de retenção: 0,71 min (Condição de análise, SQDAA05)

[001400] Ainda, 5’-Adenosina-PEG-peptídeo e 5’-Adenosina-PEG-bi- otina foram também sintetizadas através da mesma reação.

[001401] (5-3) Produção de anticorpos de ligação à adenosina em ani mais e avaliação de anticorpo

[001402] Coelhos foram imunizados com 2’-Adenosina-PEG-peptídeo e/oou 5’-Adenosina-PEG-peptídeo através de um método convencional. Candidatos para células com atividade de ligação à adenosina foram selecionados de suspensões de células coletadas de sangue dos coelhos imunizados, usando autoMACS Pro Separator e FACSAria (BD) que usa atividade de Adenosina-PEG-biotina e expressão de IgG de coelho como indicadores. Então, avaliação foi realizada com anticorpos secretados nos sobrenadantes da cultura das células selecionadas. Na avaliação, ELISA foi realizado para avaliar a presença de atividade de ligação à Adenosina-PEG-biotina. ELISA foi também realizado para avaliar se adenosina, quando adicionada em combinação com Adeno- sina-PEG-bitoina em um nível de 1000 vezes ou mais aquele de Ade- nosina-PEG-biotina, suprime a ligação à Adenosina-PEG-biotina. As regiões variáveis de cadeia H e a cadeia L foram isoladas através de PCR a partir de células selecionadas usando como um indicador a presença de atividade de ligação à Adenosina-PEG-biotina bem como supressão de ligação à Adenosina-PEG-biotina por adenosina adicionada em combinação com Adenosina-PEG-biotina. As regiões variáveis obtidas foram expressas em combinação com uma região constante de cadeia pesada IgG1 humana e uma região constante de cadeia leve humana.

[001403] (5-4) Aquisição de células B para preparar biblioteca imune de ligação à adenosina

[001404] As células foram coletadas dos baços de coelhos imunizados com 2’-Adenosina-PEG-peptídeo da Toxina do tétano e 5’-Adenosina- PEG-peptídeo da Toxina do tétano. A partir das suspensões celulares, candidatos para células de atividade de ligação à adenosina foram se-lecionados usando autoMACS Pro Separator e FACSAria (BD) com a presença de ligação à Adenosina-PEG-biotina bem como a expressão de IgG de coelho ou IgM como indicadores. As células selecionadas foram lavadas com PBS(-) e os peletes de célula preparados foram usados para construir bibliotecas imunes.

[001405] [Exemplo 6] Avaliação de clones obtidos através de clonagem de célula B de coelho

[001406] (6-1) Avaliação de clones obtidos através de clonagem de célula B de coelho quanto à sua atividade de ligação a 2’-Adenosina- PEG-Biotina

[001407] Clones obtidos de clonagem de célula B de coelho foram avaliados quanto à sua atividade de ligação à adenosina através do método SPR. A reação antígeno-anticorpo entre os clones e 2’-Adenosina- PEG-Biotina foi cineticamente analisada usando Biacore 4000 (GE Healthcare). Sensor chip CM5 (GE Healthcare) foi imobilizado com uma quantidade apropriada de proteína A/G (Invitrogen) através de acoplamento amina. Anticorpos de interesse foram capturados pelo chip. Então, após 100 nmol/l de 2’-adenosina-PEG-Biotina terem sido interagidos como um analito por 60 segundos, a dissociação do analito foi monitorada e medida por 60 segundos. O tampão de processamento usado foi HBS-P+ (GE Healthcare). Todas as medições foram realizadas a 25° C. O analito foi diluído usando o tampão de processamento.

[001408] Os respectivos anticorpos foram comparados quanto à sua atividade de ligação a 2’-Adenosina-PEG-Biotina usando como um indi-cador o valor (N_ligação_100) de divisão de quantidade de ligação quando da interação com 2’-Adenosina-PEG-Biotina pela quantidade de captura (RU) para cada anticorpos, e o valor (N_estabilidade_100) de divisão da quantidade de dissociação de 2’-Adenosina-PEG-Biotina de cada anticorpo por 60 segundos após a interação com 2’-Adenosina- PEG-Biotina pela quantidade de captura (RU) para cada anticorpo. Com relação a anticorpos para os quais a quantidade de captura foi 1500 RU ou menos, sua ligação não foi suficientemente detectável e então eles foram excluídos dos indivíduos a serem testados. O resultado é mostrado na figura 14. O resultado mostrado na figura 14 demonstra que o método de clonagem de célula B forneceu clones de ligação à adeno- sina com várias afinidades.

[001409] (6-2) Avaliação de clones de ligação à 2’-Adenosina-PEG- Biotina quanto à sua atividade de ligação à adenosina e ATP e análise de sequência dos clones

[001410] Clones que foram demonstrados se ligar à 2’-Adenosina- PEG-Biotina foram avaliados quanto à sua ligação à adenosina e ATP através de SPR e ELISA competitivo.

[001411] (6-2-1) Avaliação através de SPR de clones de ligação à 2’- Adenosina-PEG-Biotina quanto à sua ligação à adenosina e ATP

[001412] Usando Biacore T200 (GE Healthcare), anticorpos SMB0002, SMB0089 e SMB0104 obtidos através do método de clona-gem de célula B foram analisados quanto à sua interação com adeno- sina e ATP em reação de antígeno-anticorpo. Sensor chip CM5 (GE Healthcare) foi imobilizado com uma quantidade apropriada de proteína A/G (Invitrogen) através de acoplamento amina. Os anticorpos de interesse foram capturados pelo chip para permitir interação à adenosina ou ATP como um antígeno. O tampão de processamento usado era 10 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4. Todas as medições foram realizadas a 25° C. Os antígenos foram diluídos usando o tampão de processamento.

[001413] Com relação a SMB0002, SMB0089 e SMB0104, as soluções de antígeno diluídas e o tampão de processamento como um blank foram injetados em uma taxa de fluxo de 20 μl/min por dois minutos para permitir interação de cada antígeno com os anticorpos capturados no sensor chip. Então, o tampão de processamento foi injetado em uma taxa de fluxo de 20 μl/min por três minutos, e dissociação dos antígenos a partir dos anticorpos foi observada. Em seguida, 10 mmol/l de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados em uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 30 segundos para regenerar o sensor chip. A constante de taxa de associação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (1/s), ambos são parâmetros cinéticos, foram calculadas a partir dos sensorgramas obtidos através da medição. A constante de dissociação KD (M) foi calculada com base nessas constantes. Cada parâmetro foi calculado usando o Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare).

[001414] O resultado mostrou que clones múltiplos incluindo SMB0002, SMB0089 e SMB0104 se ligaram a ambos adenosina e ATP. Os sensorgramas observados para avaliar cada clone quanto à sua ligação em concentrações de adenosina de 500, 125, 31,3 e 7,81 nM ou em concentrações de ATP de 5000, 1250, 313 e 78,1 nM são mostrados na Fig. 15. Conforme mostrado na Fig. 15, SMB0002, SMB0089 e SMB0104 foram demonstrados se ligar a ambos adenosina e ATP. KDs de SMB0002, SMB0089 e SMB0104 foram 9,3E-9, 6,9E-9 e 4,1E-8 (mol/l) para adenosina e 1,0E-5, 8,8E-7 e 1.4E-7 (mol/l) para ATP, respectivamente.

[001415] Da mesma maneira usando Biacore 4000 (GE Healthcare), anticorpo SMB0171 obtido através de clonagem de célula B foi analisado quanto à interação com adenosina e ATP em reação antígeno- anticorpo. Sensor chip CM5 (GE Healthcare) foi imobilizado com uma quantidade apropriada de proteína A/G (Invitrogen) através de acoplamento amina. Anticorpos de interesse foram capturados pelo chip para permitir interação com adenosina ou ATP como um antígeno. O tampão de processamento usado era HBS-P+ (GE Healthcare). Todas as medições foram realizadas a 25° C. Os antígenos foram diluídos usando o tampão de processamento.

[001414] Com relação a SMB0171, soluções de antígeno diluídas e o tampão de processamento como o blank foram injetadas em uma taxa de fluxo de 10 μl/min por um minuto para permitir interação de cada antígeno com anticorpos capturados no sensor chip. Então, o tampão de processamento foi injetado em uma taxa de fluxo de 10 μl/min por três minutos, e dissociação do anticorpo a partir dos antígenos foi observada. Então, 10 mmol/l de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados em uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 30 segundos para regenerar o sensor chip. A constante de taxa de associação ka (1/MS) e a constante de taxa de dissociação kd (1/s), ambas são parâmetros cinéticos, foram calculadas a partir dos sensorgramas obtidos através de medição. A constante de dissociação KD (M) foi calculada com base nessas constantes. Cada parâmetro foi calculado usando o Biacore 4000 Evaluation Software (GE Healthcare).

[001415] O resultado mostrou que SMB0171 se liga a ATP. Os sen- sorgramas observados na avaliação de cada clone quanto à sua ligação em concentrações de ATP de 50 e 5 μM são mostrados na figura 16. Conforme mostrado na figura 16, SMB0171 foi demonstrado se ligar a ATP. KD de SMB0171 para ATP foi 5,9E-6 (mol/l).

[001416] (6-2-2) Avaliação de clones de ligação à 2’-Adenosina-PEG- Biotina quanto à sua ligação à adenosina e ATP através de ELISA competitivo Anticorpos que demonstraram se ligar a 2’-Adenosina-PEG-Biotina foram diluídos para 1 μg/ml com PBS e adicionados a cada cavidade de uma MAXISorp de 384 cavidades (Nunc). Para imobilizar os anticorpos, a placa foi deixada descansar por uma hora ou mais em temperatura ambiente. Após os anticorpos diluídos com PBS terem sido removidos de cada cavidade, TBS contendo BSA 1% foi adicionado a elas e a placa foi deixada descansar por uma hora ou mais. Então, o TBS (pH 7,4) contendo BSA 1% foi removido da placa. 2’-Adenosina-PEG-Biotina di-luído para 50 nM com PBS, uma mistura de 2’-Adenosina-PEG-Biotina e adenosina diluída para 50 nM e 500 μM respectivamente com PBS, uma mistura de 2’-Adenosina-PEG-Biotina e adenosina diluída para 50 nM e 500 μM respectivamente com PBS, uma mistura de 2’-Adenosina- PEB-Biotina e ATP diluída para 50 nM e 500 μM respectivamente com PBS ou PBS sozinho foi adicionado à placa. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora e então lavada três vezes com 80 μl de PBS contendo 0,05% de Tween-20. Então Estreptavi- dina-HRP (Thermo fisher scientific) diluída 20000 vezes com PBS foi adicionada a cada cavidade e a placa foi deixada descansar por uma hora ou mais em temperatura ambiente. Após a placa ter sido lavada três vezes com 80 μl de PBS contendo 0,05% de Tween-20, um substrato cromogênico (substrato de peroxidase ABTS) foi adicionado a cada cavidade. Após a placa ter sido incubada por uma hora, desenvolvimento de cor em solução de cada cavidade foi avaliada através da medição de absorbância a 405 nm usando SpectraMax da Molecular Device.

[001420] Conforme mostrado na figura 17, o resultado mostrou que a ligação de SMB0002 a 2’-Adenosina-PEG-Biotina foi inibida pela adição de quantidades em excesso de adenosina e ATP. Desta maneira, os clones de anticorpo foram demonstrados se ligar não apenas a 2’-Ade- nosina-PEG-Biotina, mas também a ambas adenosina e ATP.

[001421] (6-2-3) Análise de sequência de clones identificados como ligantes de adenosina e ATP através de SPR

[001422] As sequências de aminoácido de clones demonstrados se ligar a ambos adenosina e ATP são mostradas na Tabela 7.

[001417] [Exemplo 7] Aquisição de anticorpos que se ligam à adeno- sina e/ou ATP de biblioteca de anticorpo humana usando técnicas de exibição de fago

[001418] (7-1) Construção de biblioteca de exibição de fago de anti corpos humanos puros

[001419] Uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos consistindo em fagos múltiplos que apresentam os domínios Fab de an-ticorpos humanos cujas sequências eram diferentes umas das outras foi construída usando, como um modelo, RNA poliA preparado a partir de PBMC humano, RNA poliA humano comercialmente disponível, ou similar de acordo com um método conhecido daqueles versados na técnica.

[001420] (7-2) Aquisição de anticorpos que se ligam à adenosina e/ou ATP de biblioteca através de panning de conta

[001421] A biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros construídas conforme descrito em (7-1) foi avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação a antígeno, especificamente, através da coleta de fagos que exibem anticorpos com atividade de lgi- acao a antígenos capturados por contas. ATP biotinilado, 2’-adenosina- PEG-Biotina e 5’-Adenosina-PEG-Biotina foram usados como antíge- nos.

[001422] Fagos produzidos em E. coli contendo o vetor de fagemídeo construído para exibição de fago foram purificados através de um método convencional, e então dialisados contra TBS para preparar uma suspensão de biblioteca de fago. Então, BSA foi adicionado em uma concentração final de 4% à suspensão. Panning foi realizado usando contas magnéticas imobilizadas em antígeno. As contas magnéticas usadas eram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera- Mag SpeedBeads NeutrAvidin) e contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).

[001423] Em seguida, 250 pmol de ATP biotinilado, 2’-adenosina- PEG-Biotina e 5’-adenosina-PEG-Biotina foram adicionados à suspensão de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, a suspensão de biblioteca de fago foi contatada com adenosina e ATP por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à suspensão de biblioteca de fago e o complexo de fago com adenosina e/ou ATP foi deixada se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas uma vez com TBS. Então as contas foram combinadas com 0, 5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina. Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A suspensão de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crecimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada a 37° C por uma hora sob agitação suave para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados a partir do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido de biblioteca de fago.

[001424] Uma segunda rodada de panning foi realizada para também enriquecer fagos que são capazes de se ligar à adenosina e/ou ATP. A suspensão de biblioteca de fago preparada foi contatada com adeno- sina e ATP por 60 minutos em temperatura ambiente através da adição de 50 pmol de cada ATP biotinilado, 2’-Adenosina-PEG-Biotina e 5’- Adenosina-PEG-Biotina. Então, as contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à suspensão de biblioteca de fago e o complexo de fago com adenosina e/ou ATP foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com TBST e duas vezes com TBS. Então, as contas foram combinadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina. Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A suspensão de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada a 37° C por uma hora com agitação suave para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido de biblioteca de fago.

[001425] Através do mesmo procedimento, panningo foi realizado três vezes para obter anticorpos que são capazes de se ligar à adenosina e/ou ATP. Na quarta rodada de panning, lavagem com TBST e lavagem com TBS foram realizadas cinco vezes.

[001426] (7-3) Avaliação de atividade de ligação à adenosina e ATP por ELISA de fago

[001427] A partir de colônias únicas de E. coli obtidas através de panning conforme descrito no Exemplo acima, sobrenadantes de cultura contendo fagos foram coletados de acordo com um método convencional (Method Mol. Biol. (2002) 178, 133-145). Os sobrenadantes de cultura coletados foram tratados através de ultrafiltragem usando Nucle- oFast 96 (MACHERY-NAGEL). 100 μl dos sobrenadantes de cultura foram adicionados a cada cavidade de NucleoFast 96 e centrifugados a 4500 g por 45 minutos para remover fluxo. Após adição de 100 μl de H2O, a NucleoFast 96 foi lavada através de centrifugação a 4500 g por 30 minutos. Após adição de 100 μl de TBS, a NucleoFast 96 foi deixada descansar por cinco minutos em temperatura ambiente. Então, suspensões de fago foram coletadas a partir dos sobrenadantes.

[001428] Fagos purificados, aos quais TBS foi adicionado, foram submetidos à ELISA através do procedimento que segue. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora com 100 μl de TBS contendo antígenos marcados com biotina (uma mistura de quantidades iguais de 2’-adenosina-PEG- biotina, 5’-adenosina-PEG-biotina e ATP-PEG-biotina). Após os antíge- nos serem removidos de cada cavidade da placa através de lavagem com TBST (TBS conendo Tween-20 0,1%), as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de leite desnatado 2%/TBS por uma hora ou mais. Leite desnatado 2%/TBS foi removido e então fagos purificados, preparados, foram adicionados a cada cavidade. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir que o anticorpo exibido pelo fago se ligase a antígenos em cada cavidade. Após lavagem com TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com TBST, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição da absorbância a 450 nm.

[001429] Das 192 colônias submetidas a ELISA de fago, 106 clones que têm a habilidade em se ligar a qualquer um ou dois ou todo os três de 2’-adenosina-PEG-biotina, 5’-adenosina-PEG-biotina e ATP-PEG-bi- otina foram obtidos.

[001430] Em seguida, para o propósito de confirmação de qual antí- geno de 2’-adenosina-PEG-biotina, 5’-adenosina-PEG-biotina e ATP- PEG-biotina esses clones têm habilidade em se ligar, os fagos purificados diluídos com TBS foram submetidos a ELISA através do procedi-mento que segue. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora com 100 μl de TBS contendo um antígeno marcado com biotina (2’-adenosina-PEG-biotina, 5’-adenosina-PEG-biotina e ATP-PEG-biotina). Após os antígenos serem removidos através de lavagem de cada cavidade da placa com TBST, as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de leite desnatado 2%/TBS por uma hora ou mais. Leite desnatado 2%/TBS foi removido e então fagos purificados, preparados, foram adicionados a cada cavidade. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de fagos exibindo anticorpo a antígenos em cada cavidade. Após lavagem com TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com TBST, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição da absorbância a 450 nm. O resultado de ELISA de fago é mostrado na Tabela 8 abaixo.

[001431] Dentre os clones submetidos à ELISA de fago, um clone foi demonstrado se ligar a dois ou mais tipos de antígenos. Seu gene foi amplificado com primers específicos usando o fragmento de anticorpo como um modelo. A sequência de nucleotídeo do gene foi analisada. Este clone tinha a habilidade em se ligar a ambos 5’-Adenosina-PEG- biotina e ATP-PEG-biotina, e foi chamada ATNLSA1-4_D12. A sequência da região variável de cadeia pesada de anticorpo ATNLSA1-4_D12 é mostrada na SEQ ID NO: 46 e sua sequência de região variável de cadeia leve é mostrada na SEQ ID NO: 47.

[001432] (7-4) Avaliação de atividade de ligação à adenosina e ATP através de ELISA de fago competitivo

[001433] Com base na estrutura de 5’-Adenosina-PEG-biotina e ATP- PEG-biotina, restou a possibilidade que clone ATNLSA1-4_D12 (região variável de cadeia pesada, SEQ ID NO: 46; cadeia leve, SEQ ID NO: 47), que foi demonstrado pelo resultado de ELISA de fago ter a habilidade em se ligar a ambos 5’-Adenosina-PEG-biotina e ATP-biotina, reconhece o marcador biotina ou porção PEG. Desta maneira, para demonstrar que ATNLSA1-4_D12 não é um anticorpo que reconhece o marcador biotina ou PEG, se a ligação a antígeno é inibida por adeno- sina ou ATP foi testada através de ELISA de fago usando ATNLSA1- 4_D12 e clone de ligação à IL-6R FP1 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 48; cadeia leve, SEQ ID NO: 49) preparado como um controle negativo. ATNLSA1-4_D12 e PF1 foram cada um diluídos com TBS e submetidos a ELISA através do procedimento que segue.

[001434] Uma placa de microticulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora com 100 μl de TBS contendo antígenos marcados com biotina (uma mistura de 5’-adenosina- PEG-biotina e ATP-PEG-biotina). Após os antígenos terem sido removidos através de lavagem de cada cavidade da placa com TBST, as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de leite desnatado 2%/TBS por uma hora ou mais. Leite desnatado 2%/TBS foi removido e então fagos purificados, preparados, foram adicionados a cada cavidade. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação dos fagos de exibição de anticorpo aos antígenos em cada cavidade. Então, TBS que não contém antígeno ou que contém diluições seriais de ATP de uma quantidade igual até 10000 vezes aquela do antígeno foi adicionado às cavidades. Para a competição do antígeno imobilizado com ATP, a placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora. Então, após lavagem com TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com TBST, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através de medição da absorbância a 450 nm.

[001435] O resultado da medição é mostrado na figura 18. Foi demonstrado que quanto maior a concentração de ATP, menor o grau de desenvolvimento de cor para ATNLSA1-4_D12 na presença de uma quantidade em excesso de ATP. Desta maneira, a ligação entre ATN- LSA1-4_D12 e seu antígeno foi demonstrada ser inibida de uma maneira dependente da concentração de ATP. Entretanto, em um experimento controle com PF1 como um controle negativo, sua ligação a an- tígeno não foi detectada sem importar a concentração de ATP. A constatação acima demonstra que ATNLSA1-4_D12 é um anticorpo que tem a habilidade em se ligar a ATP, mas não reconhece o marcador biotina ou PEG.

[001436] (7-5) Expressão e purificação de anticorpos que se ligam a ATP e adenosina

[001437] Usando primers específicos, os genes foram amplificados a partir de clone ATNLSA1-4_D12 que tinha sido avaliado ter atividade de ligação com ATP e adenosina pelo ELISA de fago descrito no Exemplo 7. As sequências de nucleotídeo dos genes foram analisadas (as sequências de cadeia pesada e cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 46 e 47, respectivamente). O gene codificando a região variável de ATNLSA1-4_D12 foi inserido em um plasmídeo de expressão animal para IgG1 humana/Lambda. O anticorpo foi expresso usando o método descrito abaixo. Células FreeStyle 293-F derivadas de célula de rim fetal humana (Invitrogen) foram suspensas em uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/ml em Meio de Expressao de FreeStyle 293 (Invitro- gen) e separadas em alíquotas em 3 ml em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. O plasmídeo construído foi introduzido nas células através de lipofecção. Após quatro dias de cultura em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 8%, 90 rpm), o anticorpo foi purificado dos sobrena- dantes de cultura através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences). Absorbância das soluções de anticorpo purificado foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A partir dos valores obtidos através da medição, a concentração do anticorpo purificado foi calculada usando um coeficiente de extinção determinado através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

[001438] (7-6) Avaliação do anticorpo de ligação a ATP e adenosina quanto à sua ligação a ATP e adenosina através de ressonância de plasmon de superfície

[001439] Biacore T200 (GE Healthcare) foi usado para analisar a interação de D12, onde a região constante de IgG é ligada à região variável de clone ATNLSA1-4_D12 com atividade de ligação a ATP e adenosina, em reação antígeno-anticorpo. Sensor chip M5 ou CM4 (GE Healthcare) foi imobilizado com uma quantidade apropriada de proteína A (Life Technologies) através de acoplamento amina. O anticorpo de interesse foi capturado pelo chip para permitir interação com ATP (Wako), adeno- sina (Wako) ou ADP (difosfato de adenosina) (Wako) como um antí- geno. O tampão de processamento usado foi Tris-HCl 50 mM (Takara, T903), NaCl 500 mM, Tween 20 0,01% (p/v). O antígeno foi deixado interagir por 30 segundos em uma taxa de fluxo de 30 μl/min e foi dissociado por 30 segundos. A interação com o antígeno foi avaliada a 15° C. O antígeno foi diluído usando o mesmo tampão de processamento.

[001440] A constante de dissociação KD (M) foi calculada com base na constante de taxa de associação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (1/s), ambas são parâmetros cinéticos calculados a partir do sensorgrama obtido através da medição. Alternativamente, a constante de dissociação KD (M) foi calculada usando análise de estado uniforme. Cada parâmetro foi calculado usando o Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare).

[001441] Para calcular a KD para adenosina, a resposta de ligação foi avaliada em várias concentrações de adenosina na presença ou ausência de 20 μmol/l de ADP. Ainda, a resposta de ligação foi separadamente avaliada na presença de 20 μmol/l de ADP. A resposta (R) para ligação à adenosina específica foi obtida subtraindo o valor de resposta de ligação na presença de ADP sozinho da resposta de ligação a várias concentrações de adenosina na presença de ADP, e então subtraindo o valor resultante, que é suposto corresponder aos componentes de ligação não específicos, do valor de resposta de ligação à adenosina na ausência de ADP. A partir de uma curva onde concentração de ade- nosina é representada em gráfico no eixo X e R calculado de acordo com a Fórmula 2 é representado em gráfico no eixo Y, o valor de KD para adenosina foi determinado através do método de quadrados mínimos usando a função Solver do Office Excell 2007 (Microsoft). (Fórmula 2) R = Rmax x conc/(KD + conc)

[001442] Na Fórmula 2, conc representa concentração de adenosina (mol/l) enquanto Rmax representa o valor de resposta esperada para a ligação máxima de adenosina a anticorpo. Os valores de resposta medidos foram extraídos usando Scrubber2 (BioLogics, Inc.).

[001443] A KD de D12 determinada através da medição descrita acima foi 8,5 μmol/l para ATP, 0,25 μmol para ADP ou 1100 μmol/l para ade- nosina. Esse resultado demonstra que D12 tem atividade de ligação a ATP, ADP e adenosina; e ele sugere também que D12 tem atividade de ligação a AMP (monofosfatos de adenosina) e cAMP (monofosfatos de adenosina cíclico).

[001444] [Exemplo 8] Projeto de biblioteca usando anticorpos anti- ATP/adenosina para preparar anticorpos permutadores ATP/adenosina

[001445] Em tecidos cancerosos e tecidos inflamados, não apenas a adenosina, mas também a concentração de ATP é conhecida ser alta. Desta maneira, é benéfico usar anticorpos para os quais ambos adeno- sina e ATP (referidos como ATP/adenosina neste Exemplo) podem servir como um permutador (especificamente, anticorpos que podem se ligar a antígenos quando adenosina ou ATP é apresentado em uma con-centração alta) bem como anticorpos para os quais ou adenosina ou ATP sozinho serve como um permutador. ATNLSA1-4_D12 descrito no Exemplo 7-4 é um anticorpo que se liga a ATP/adenosina. Conforme mostrado na figura 19, ATP/adenosina é pensada estar encaixada entre o anticorpo e o seu antígeno alvo, e então o anticorpo compreende uma região variável de anticorpo que entra em contato com o antígeno alvo. Desta maneira, os presentes inventores conceberam que bibliotecas de anticorpo sintéticas que podem isolar anticorpos que permutam ATP/adenosina cuja atividade de ligação a antígenos arbitrários é alterada dependendo da presença de ATP/adenosina poderiam ser cons-truídas através de coleta, como uma biblioteca, de segmentos de região variável de anticorpo que são capazes de estabelecer contato com um antígeno alvo e manutenção da ligação a ATP/adenosina.

[001446] A estrutura de cristal do complexo entre ATP e ATP/anti- corpo para adenosina ATNLSA1-4_D12 obtido de uma biblioteca de an-ticorpo humana conforme descrito no Exemplo 7-4 foi analisada. O resultado de análise de estrutura de cristal revelou o modo de reconhecimento de adenosina (ou ATP) pelo anticorpo bem como identificação de resíduos de aminoácido que são considerados não estar substancialmente envolvidos em ligação à adenosina (ou ATP) na região variável de anticorpo. Resíduos de aminoácido que foram identificados estar in-timamente envolvidos na ligação à adenosina (ATP) são Ser52, Ser52a, Arg53, Gly96, Leu100a e Trp100c (numeração Kabat) na cadeia pesada.

[001447] No projeto de tal biblioteca, as posições que satisfazem pelo menos uma das condições descritas abaixo foram selecionadas como adequadas para a construcão de biblioteca.

[001448] Condição 1: uma posição que não está intimamente envolvida em ligação a ATP, ou se envolvida na ligação, uma posição tendo um aminoácido que não a sequência do tipo selvagem que não inibe a ligação a ATP;

[001449] Condição 2: uma posição que é polimórfica até um certo ponto em termos de frequência de ocorrência de aminoácido; e

[001450] Condição 3: uma posição que não é essencial para a formação de estrutura canônica.

[001451] Em regiões contidas em ambas as cadeias pesadas e cadeia leve da sequência de ATNLSA1-4_D12 e que satisfazem as condições descritas acima, aminoácidos nas regiões CDR1 e CDR2 que têm uma frequência de ocorrência de 2% ou mais na linhagem germinativa, bem como aminoácidos na região CDR3 que têm uma frequência de ocorrência de 1% ou mais na linhagem germinativa foram compreensivamente substituídos. Essas substituições foram combinadas para construir variantes múltiplas de ATNLSA1-4_D12.

[001452] Sítios de alteração na cadeia pesada (na Tabela, posições indicadas por “Kabat” de acordo com numeração Kabat), bem como aminoácidos antes da alteração (na tabela, aminoácidos referidos como “sequência natural”) nos sítios e aminoácidos após alteração (na tabela, aminoácido referido como “aminoácidos alterados”) são mostrados na Tabela 9.

[001453] Sítios de alteração na cadeia leve (na Tabela, posições indicadas por “Kabat” de acordo com numeração Kabat), bem como amino- ácidos antes da alteração (na tabela, aminoácidos referidos como “sequência natural”) nos sítios e aminoácidos após alteração (na tabela, aminoácidos referidos como “aminoácidos alterados”) são mostrados na Tabela 10. Tabela 10

[001454] Cada variante expressa e purificada através do método descrito no Exemplo 7-1 foi ensaiada quanto a esta ligação a ATP e adeno- sina através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo 7-6 usando Biacore. Com base no resultado do ensaio, a afinidade de cada variante com ATP foi calculada como um valor KD. Sítios na cadeia pesada, onde alteração não reduz a habilidade de ligação a ATP para menos de 1/5 da habilidade de ligação de ATNLSA1-4_D12 (especificamente, onde o valor KD é menor do que 42,5 μmol/l), e sítios na cadeia leve onde a habilidade de ligação a ATP é maior do que aquela de ATN- LSA1-4_D12 (especificamente, onde o valor KD é menor do que 8,5 μmol/l), foram avaliados ser plausíveis para alteração. Aminoácidos substituídos nesses sítios foram julgados ser apropriados para inclusão na biblioteca (resíduos flexíveis a serem introduzidos na biblioteca).

[001455] Com base no resultado de avaliação da habilidade de ligação a ATP de cada variante, a habilidade de ligação a ATP foi prevista ser reduzida pela coleta de cada sítio para constuir uma biblioteca. Desta maneira, substituições foram introduzidas em sítios próximos a posições que são esperadas estar envolvidas em ligação ATP, e várias variantes resultantes da combinação dessas substituições foram compreensivamente avaliadas para testar se é possível identificar alterações que são esperadas ter efeito de aumento da habilidade de ligação a ATP. Tais sítios de alteração (posições indicadas por “Kabat” de acordo com numeração Kabat na tabela) e aminoácidos antes da alteração (aminoáci- dos referidos como “sequência do tipo selvagem na tabela”) e aminoá- cidos após alteração (aminoácidos referidos como “aminoácidos altera-dos” na tabela) nos sítios são mostrados na Tabela 11.

[001456] Cada variante expressa e purificada através do método descrito no Exemplo 7-1 foi ensaiada quanto à sua ligação a ATP e adeno- sina através do mesmo método de ensaio usando Biacore conforme descrito no Exemplo 7-6. O resultado do ensaio mostrou que a ligação a ATP e adenosina era esperada ser aumentada por alterações nas posições 56 e 100b e similar de acordo com a numeração Kabat (por exemplo, alteração de aminoácido tal como Tyr56His e Asn100bLeu). Foi determinado que aminoácidos substituídos nos sítios poderiam ser incluídos em uma biblioteca (resíduos flexíveis a serem introduzidos em uma biblioteca).

[001457] Nas regiões de CDR de ATNLSA1-4_D12, repertórios de aminoácido contendo aminoácidos selecionados através da análise de variante descrita acima como sendo adequados para serem incluídos em uma biblioteca (resíduos de aminoácido flexíveis a serem introduzidos em uma biblioteca) e aminoácidos antes da alteração dos aminoá- cidos (especificamente, aminoácidos incluídos na sequência natural de ATNLSA1-4_D12), e sítios compreendendo tais repertórios foram projetados para construir uma biblioteca para preparação de anticorpos per- mutadores ATP/adenosina. A biblioteca foi construída de tal maneira que em um repertório de aminoácido a frequência de ocorrência de ami- noácido é a mesma para cada aminoácido (por exemplo, onde há dez tipos de aminoácidos em um repertório de aminoácido, cada aminoácido ocorre a 10%).

[001458] Sítios compreendendo repertórios de aminoácido na cadeia pesada (posições indicadas por “Kabat” de acordo com numeração Ka- bat na Tabela) e repertórios de aminoácido nos sítios são mostrados na Tabela 12. Sítios compreendendo repertórios de aminoácido na cadeia leve (posições indicadas por “Kabat” de acordo com numeração Kabat na Tabela) e repertórios de aminoácido nos sítios são mostrados na Tabela 13.

[001459] O resultado de análise de sequência sugere que a estrutura de ATNLSA1-4_D12 era derivada de linhagem germinativa VH3-21. Então, para o propósito de aperfeiçoamento da estabilidade do anticorpo, a sequência de estrutura principal de ATNLSA1-4_D12 foi restaurada para a sequência de linhagem germinativa VH3-21 através da introdução na sequência de estrutura principal de ATNLSA1-4_D12, alterações Gln01Glu, Gln05Val, Asp10Gly, Asn30Ser, Leu48Val e Asn58Tyr (números representam números Kabat). Variantes de ATNLSA1-4_D12 expressas e purificadas através do método descrito no Exemplo 7-1 foram medidas quanto à sua Tm através de DSC. Medição de DSC foi realizada através de um método conhecido daqueles versados na técnica. Tm da variante que resulta da adição dessas alterações a ATN- LSA1-4_D12 foi notadamente aperfeiçoada de 74,37° C a 81,44° C, e estabilização da estrutura foi observada. É algumas vezes preferido usar estruturas principais altamente estáveis para bibliotecas de anticorpo, e então uma sequência de estrutura principal a quais alterações descritas acima tinham sido adicionadas foi usada como a sequência de estrutura principal de uma biblioteca. A estrutura principal usada para a biblioteca é mostrada na Tabela 14. Os genes foram sintetizados para compreender as respectivas sequências em uma biblioteca projetada conforme descrito acima (DNA2.0) e a biblioteca de gene foi amplificada com primers que são capazes de amplificar VH e VL, respectivamente, usando uma coleção (biblioteca) dos respectivos genes como um modelo. As sequências de primers usadas para a amplificação de VL são mostradas nas SEQ ID NOs: 102 e 103, enquanto as sequências de primers usadas para a amplificação de VH são mostradas nas SEQ ID NOs: 104 e 105. A biblioteca de gene racio-nalmente projetada amplificada das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de anticorpo humano foi inserida em um vetor de fagemí- deo apropriado carregando ambas uma sequência CH1 derivada de IgG humana e uma sequência de região constante de cadeia leve derivada de IgG. O vetor de fagemídeo foi introduzido em E. coli através de ele- troporação para construir uma biblioteca racionalmente projetada que apresenta domínios Fab contendo uma região variável-região constante de anticorpo humano e a partir da qual anticorpos podem ser isolados, os quais são capazes de ligação a antígenos via adenosina ou ATP como um permutador. Tal biblioteca racionalmente projetada que é constituída com várias cadeias H e cadeias L que têm atividade de ligação à adenosina ou ATP é esperada ser útil como uma biblioteca contendo anticorpos humanos que, com a adenosina (ou ATP) encaixada entre anticorpo e antígeno conforme mostrado na figura 19, pode obter eficientemente anticorpos permutadores adenosina/ATP contra qualquer antígeno arbitrário. Ainda, conforme acima descrito, uma vez que ATNLSA1-4_D12 se liga não apenas à adenosina e ATP, mas também a ADP, ela foi prevista ter atividade de ligação a AMP e cAMP que são estruturalmente similares a ATP, ADP e adenosina. Isso sugere que tais bibliotecas são úteis para isolamento de anticorpos permutadores cuja atividade de ligação a antígenos alvo arbitrários é alterada dependendo da presença de qualquer uma ou mais moléculas pequenas de ATP, ADP, AMP, cAMP e adenosina. [001467] [Exemplo 9] Construção de uma biblioteca imune para obter anticorpos comutadores adenosina/ATP contendo repertórios de anticorpo anti-ATP/adenosina

[001460] Bibliotecas de exibição de fago múltiplas de anticorpos de coelho que apresentam domínios Fab compreendendo sequências de anticorpo de coelho foram construídas usando um mRNA modelo coletado de uma população de célula B selecionada de MACS e FACS conforme descrito no Exemplo 5-4, que expressa anticorpos de ligação a adenosina-PEG-biotina. O método de construção foi realizado com referência a Rader (Methods Mol. Biol. (2009) 525, 101-28).

[001461] Mais especificamente, cDNA foi preparado através de transcrição reversa usando como um modelo mRNA coletado e 600.000 cé-lulas das células B descritas acima que foram selecionadas de nove coelhos imunizados. Usando o cDNA como um modelo, a sequência de região variável de cadeia pesada e a sequência de região variável-região constante de cadeia leve foram amplificadas através de PCR usando os primers mostrados na Tabela 15 sob condições adequadas.

[001462] Uma combinação de uma biblioteca de genes de região variável de cadeia pesada de anticorpo de coelho e uma biblioteca de genes de região variável-região constante de cadeia leve de anticorpo foi inserida em um vetor de fagemídeo apropriado carregando uma sequência CH1 derivada de IgG de coelho. O vetor de fagemídeo foi introduzido em E. coli através de eletroporação para construir uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos de coelho (daqui em diante, uma biblioteca de anticorpo de coelhos imunizados com adenosina) que apresenta domínios Fab contendo uma região variável-região constante de anticorpo de coelho, e da qual podem ser isolados anticorpos que são ca-pazes de ligação a antígenos através de adenosina ou ATP como um permutador. Tal biblioteca imune de adenosina que é constituída por várias cadeias H e cadeias L que exibem propriedade de ligação à ade- nosina é esperada ser útil como uma biblioteca imune, com adenosina (ou ATP) intercalada entre anticorpo e antígenos conforme mostrado na figura 20, que pode isolar anticorpos permutadores adenosina/ATP contra qualquer antígeno arbitrário.

[001463] [Exemplo 10] Aquisição de anticorpos que se ligam a antíge- nos na presença de adenosina e ATP a partir de biblioteca de anticorpo usando técnicas de exibição de fago

[001464] (10-1) Aquisição de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas de biblioteca usando uma mistura de adenosina e ATP

[001465] Anticorpos que exibem atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina e/ou ATP foram obtidos da biblioteca de exibição de fago construída de anticorpos de coelhos imunizados com ade- nosina e a biblioteca de exibição de fago de anticorpos racionalmente projetados. Para obter anticorpos, anticorpos de exibição de fago que exibem a habilidade em se ligar a antígenos capturados por contas na presença de adenosina e ATP foram coletados, e então os fagos foram coletados em eluatos a partir das contas na ausência de adenosina e ATP.

[001466] Os fagos foram produzidos em E. coli contendo o vetor de fagemídeo construído para exibição de fago. Ao meio de cultura de E. coli onde produção de fago foi realizada, NaCl 2,5M/PEG 10% foi adicionado para precipitar fagos. A fração de fago precipitada foi diluída com TBS para preparar uma suspensão de biblioteca. Então, BSA foi adicionado em uma concentração final de 4% à suspensão de exibição de fago. Panning foi realizado usando contas magnéticas imobilizadas com antígeno. As contas magnéticas usadas eram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) e contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).

[001467] 500 pmol de antígeno marcado com biotina e uma concen tração final de ATP-Na 1M e adenosina foram cada um adicionados à suspensão de biblioteca de fago preparada. A suspensão de biblioteca de fago foi contatada com o antígeno, adenosina e ATP em temperatura ambiente por 60 minutos. As contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à suspensão de biblioteca de fago e o complexo an- tígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas uma vez com TBS dissolvido em ATP e adenosina. Então, as contas foram combinadas com 0,5 mld e 1 mg/ml de tripsina. Imediatamente após as contas em temperatura ambiente terem sido suspensas por 15 minutos, uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A suspensão de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada a 37° C com agitação suave por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, fagos foram coletados a partir do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido de biblioteca de fago.

[001468] A primeira rodada de panning foi realizada para coletar fagos que são capazes de ligação a antígeno na presença de adenosina e ATP, enquanto as segunda e subsequentes rodadas de panning foram realizadas para enriquecer fagos que são capazes de ligação a antígeno apenas na presença de adenosina e ATP. Especificamente, 40 pmol de antígeno marcado com biotina e uma concentração final de adenosina 1 mM e ATP foram cada um adicionados à suspensão de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, a biblioteca de fago foi contatada com antígeno, adenosina e ATP por 60 minutos em temperatura ambiente. Contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e o complexo de antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas com 1 ml de TBST dissolvido em adenosina e ATP (daqui em diante referido como (adenosina+ATP)/TBAT), adenosina e TBS dissolvido em adenosina e ATP (daqui em diante referido como (adenosina+ATP)/TBS). Então, as contas foram combinadas com 0,5 ml de TBS. Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente, uma suspen-são de fago foi coletada a partir das contas isoladas usando um suporte magnético. Após este tratamento ter sido repetido, as duas suspensões separadamente eluídas foram combinadas. A proteína pIII (proteína pIII derivada de fago auxiliar) que não exibe Fab foi clivada dos fagos através da adição de 5 μl de 100 mg/ml de tripsina à suspensão de fago coletada para eliminar a habilidade de fagos que não exibem Fab para infectar E. coli. Os fagos coletados da suspensão de fago tripsinizada foram adicionados a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada a 37° C com agitação suave por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados a partir do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma suspensão de biblioteca de fago. Panning foi realizado três vezes para isolar anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina e ATP.

[001469] (10-2) Aquisição de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de adenosina e ATP a partir de biblioteca de anticorpo usando um método de seleção negativo

[001470] Uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos construídos a partir de coelhos imunizados com adenosina ou uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos racionalmente projetados foi avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação a antígeno na pre-sença de adenosina e/ou ATP. Como uma primeira etapa de avaliação, a biblioteca de anticorpo de exibição de fago foi contatada com antígeno marcado com biotina-estreptavidina na ausência de adenosina e ATP para eliminar os anticorpos de exibição de fagos que têm atividade de ligação a antígeno mesmo na ausência de adenosina e ATP. Então, panning foi realizado da mesma maneira que na presença de adenosina e ATP para avaliar anticorpos que exibem atividade de ligação a antí- geno na presença de adenosina e ATP.

[001471] Os fagos foram produzidos em E. coli contendo o fagemídeo de exibição de fago construído. Ao meio de cultura de E. coli onde produção de fago ocorreu, NaCl 2,5M/PEG 10% foi adicionado para precipitar fagos. A fração de fago precipitada foi diluída com TBS para preparar uma suspensão de biblioteca. Então, BSA foi adicionado em uma concentração final de 4% à suspensão de biblioteca de fago. Panning foi realizado usando contas magnéticas imobilizadas com antígeno. As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) e contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).

[001472] Junto com 250 pmol de antígeno marcado com biotina, uma mistura de adenosina e ATP foi adicionada em uma concentração final de 1 mM à suspensão de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, a suspensão de biblioteca de fago foi contatada com o antígeno, ade- nosina e ATP por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à suspensão de biblioteca de fago e deixadas se ligar ao complexo de antígeno-fago em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas uma vez com (adenosina+ATP)/TBS. Então, as contas foram combinadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina. Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A suspensão de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada a 37°C com agitação suave por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados a partir do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido de biblioteca de fago.

[001473] A primeira rodada de panning foi realizada para coletar fagos que são capazes de ligação na presença de adenosina e ATP, enquanto as segunda e subsequentes rodadas de panning foram realizadas para enriquecer fagos que são capazes de ligação apenas na presença de adenosina e ATP. Especificamente, 250 pmol de antígeno biotinilado foram adicionados a contas Sera-Mag NeutrAvidin bloqueadas com BSA, e deixados se ligar em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas três vezes com TBS. A suspensão de biblioteca de fago submetida à bloqueio com BSA foi adicionada às contas lavadas e deixadas se ligar em temperatura ambiente por uma hora. Os fagos que não se ligaram aos antígenos ou contas foram coletados através de isolamento das contas usando um suporte magnético. Quarenta pmol de antígeno marcado com biotina e uma concentração final de 1 mM de adenosina e ATP foram cada um adicionados aos fagos coletados. Desta maneira, a biblioteca de fago foi contatada com o antígeno, ade- nosina e ATP por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à mistura do anticorpo marcado, adenosina, ATP e biblioteca de fago e deixadas se ligar ao complexo de antígeno-fago por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas com 1 ml de (adenosina+ATP)/TBST e (adenosina+ATP)/TBS. Então, 0,5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina foi adicionado à mistura. Após a suspensão misturada ter sido agitada em temperatura ambiente por 20 minutos, os fagos foram coletados das contas que tinham sido separadas usando um suporte magnético. Os fagos coletados foram adicionados a 10 ml de células de E. coli de li-nhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada a 37° C com agitação suave por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Panning foi realizado três vezes para isolar anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina e ATP.

[001474] (10-3) Aquisição de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de adenosina e ATP a partir da biblioteca de anticorpo usando um método de panning alternativo

[001475] Uma biblioteca de anticorpo de exibição de fago construída a partir de coelhos imunizados com adenosina ou uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos racionalmente projetados é avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina e/ou ATP. Como uma primeira etapa de avaliação, a biblioteca de anticorpo de exibição de fago é contatada com adenosina biotinilada e ATP-NeutrAvidina na presença de antígenos não marcados para coletar uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos que se ligam à adenosina e/ou ATP na presença do antígeno. Então, a biblioteca de anticorpo de exibição de fago é contatada com antígeno biotini- lado-estreptavidina na presença de adenosina e ATP para coletar anticorpos que se ligam ao antígeno na presença de adenosina e ATP. Desta maneira, avaliação é realizada quanto a anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina e ATP através da realização de panning na maneira alternativa descrita acima.

[001476] Fagos são produzidos em E. coli contendo o vetor de fage- mídeo construído para exibição de fago. Ao meio de cultura de E. coli onde produção de fago ocorre, NaCl 2,5 M/PEG 10% é adicionado aos fagos precipitados. A fração de fago precipitada é diluída com PBS para preparar uma suspensão de biblioteca. Então, BSA é adicionado a uma concentração final de 4% à suspensão de biblioteca de fago. Panning é realizado usando contas magnéticas imobilizadas com antígeno. As contas magnéticas usadas são contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).

[001477] Junto com 1000 pmol de antígeno não marcado, 250 pmol de ATP biotinilado, 2’-Adenosina-PEG-Biotina e 5’-Adenosina-PEG-Bi- otina são adicionados à suspensão de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, a suspensão de biblioteca de fago é contatada com o antígeno, adenosina e ATP em temperatura ambiente por 60 minutos. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA são adicionadas à suspensão de biblioteca de fago, e o complexo de fago com o antígeno e adenosina e/ou ATP é deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas são lavadas uma vez com TBS contendo 1000 pmol do antígeno. Então, as contas são combinadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina. Imediatamente após as contas serem suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma suspensão de fago é coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A suspensão de fago coletada é adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli é incubada a 37° C com agitação suave por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada é plaqueada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos são coletados a partir do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma suspensão de biblioteca de fago.

[001478] Uma segunda rodada de panning é realizada para enriquecer fagos que são capazes de se ligar ao antígeno biotinilado na presença de adenosina e ATP. Especificamente, 40 pmol de antígeno bio- tinilado e uma concentração final de 1 mM de adenosina e ATP são adicionados à solução de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, a suspensão de biblioteca de fago é contatada com o antígeno, bem como adenosina e ATP por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA são adicionadas à solução de biblioteca de fago e o complexo de fago com o antígeno bem como adenosina e/ou ATP é deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas são lavadas três vezes com TBST contendo adenosina e ATP em uma concentração final de 1 mMm e duas vezes com TBS contendo adenosina e aTP em uma con-centração final de 1 mM. Então, as contas são combinadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina. Imediatamente após as contas serem suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma solução de fago é coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A solução de fago coletada é adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (oD600=0,4 a 0,7). A E. coli é incubada a 37° C com agitação suave por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada é semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos são coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma solução de biblioteca de fago.

[001479] Em rodadas de número par subsequentes, panning é realizado da mesma maneira que a segunda rodada de panning. No entanto, nas quarta e subsequentes rodadas de panning, o número de lavagens de conta com (adenosina+ATP)/TBST e (adenosina+ATP)/TBS é aumentado para cinco vezes.

[001480] Uma terceira rodada de panning é realizada para também enriquecer fagos que são capazes de se ligar à adenosina biotinilada e ATP na presença do antígeno. Especificamente, junto com 250 pmol de ATP biotinilado, 2’-adenosina-PEG-Biotina e 5’-adenosina-PEG-Biotina, 1000 pmol de antígeno não marcado são adicionados à solução de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, a solução de biblioteca de fago é contatada com o antígeno, bem como adenosina e ATP por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA são adicionadas à solução de biblioteca de fago, e o complexo de fago com o antígeno bem como adenosina e/ou ATP é deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas são lavadas três vezes com TBST contendo 1000 pmol do antígeno e duas vezes com TBS contendo 1000 pmol do antígeno. Então, as contas são combinadas com 0,5 ml de uma solução de tripsina 1 mg/ml. Imediatamente após as contas serem suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma solução de fago é coletada a partir das contas isoladas usando um suporte magnético. A solução de fago coletada é adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli é incu-bada a 37° C com agitação suave por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada é semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos são coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma solução de biblioteca de fago.

[001481] Em rodadas de número ímpar subsequentes, panning é realizado da mesma maneira que a terceira rodada de panning. No entanto, nas quarta e subsequentes rodadas de panning, o número de lavagens de conta com TBST contendo o antígeno e TBS contendo o antígeno é aumentado para cinco vezes. Alternativamente, sem importar se ele é de número ímpar ou par, panning nas terceira e subsequentes rodadas é sempre realizado da mesma maneira que a terceira rodada de panning. No entanto, nas quarta e subsequentes rodadas de panning, o número de lavagens de conta com TBST contendo antígeno e TBS con-tendo antígeno é aumentado para cinco vezes.

[001482] (10-4) Avaliação de atividade de ligação na presença ou au sência de adenosina e/ou ATP através de ELISA de fago

[001483] Sobrenadantes de cultura contendo fago foram coletados de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) de colônias únicas de E. coli obtidas através do método descrito acima. Os sobrenadantes de cultura coletados foram tratados através de ultrafiltragem usando NucleoFast 96 (MACHERY-NAGEL). 100 μl dos sobrenadantes de cultura foram adicionados a cada cavidade de NucleFast 96 e foram centrifugados (4500 g por 45 minutos) para remover fluxo. Após adição de 100 μl de H2O, a NucleoFast 96 foi lavada através de centrifugação (4500 g por 30 minutos). Finalmente, 100 μl de TBS foram adicionados e NucleoFast 96 foi deixada descansar por cinco minutos em temperatura ambiente. Uma suspensão de fago foi coletada a partir do sobrenadante em cada cavidade da NucleoFast 96. Os fagos purificados, ao qual TBS ou (adenosina+ATP)/TBS foi adicionado, foram submetidos a ELISA através do procedimento que segue. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μl de TBS tendo antígeno marcado com biotina. Após o antígeno ser removido através da lavagem de cada cavidade da placa com TBST, as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de leite desnatado 2%/TBS por uma hora ou mais. Leite desnatado 2%/TBS foi removido e então fagos purificados, preparados, foram adicionados a cada cavidade. A placa foi deixada descansar a 37° C por uma hora para permitir ligação de fagos de exibição de anticorpo ao antígeno em cada cavidade na presença ou ausência de adenosina e/ou ATP. Após lavagem com TBST ou (adenosina+ATP)/TBST, anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS ou (adenosina+ATP)/TBS foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagens com TBST ou (adeno- sina+ATP)/TBST, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm. O resultado revelou que para três tipos de antígenos: IL-6 humana, receptor de IL-6 humana e HSA (albumina de soro bovino) (Human Serum Albumin), havia múltiplos tipos de anticorpos ligados na presença de moléculas pequenas. Anticorpos que se ligam na presença de ATP foram também obtidos da biblioteca de anticorpo puro humano. Entretanto, anticorpos comutadores para IL-6 humana, receptor de IL-6 humana e HSA poderiam ser obtidos com maior eficiência. O resultado de ELISA de fago é mostrado na Tabela 16.

[001484] (10-5) Avaliação quanto à habilid ade de igação d e anticor- pos permutadores cuja atividade de ligação a antígeno é alterada dependendo da presença de adenosina e ATP e análise de sequência

[001485] Os genes foram amplificados usando primers específicos (SEQ ID NOs: 111 e 112) de clones que tinham sido avaliados ter atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina ou ATP com base no resultado de ELISA de fago descrito em (10-4). As sequências de nucleotídeo dos genes foram analisadas e o resultado mostrou que an-ticorpos múltiplos que se ligam a antígenos, IL-6 humana, HSA e IL-6R humana e têm sequências diferentes umas das outras foram obtidos. As sequências de aminoácido de I6DL2C1-4_076 (anticorpo para IL-6 humana), HSDL3C5-4_0,15 (anticorpo para HSA) e 6RAD2C1-4_011 e 6RAD2C1-4_076 (anticorpos para IL-6R humana) são mostradas na Tabela 17.

[001486] (10-6) Identificação de moléculas pequenas requeridas para ligação a antígeno dos anticorpos obtidos

[001487] Cada um dos anticorpos obtidos I6DL2C1-4_076, HSDL3C5- 4_015, 6RAD2C1-4_011 e 6RAD2C1-4_076 foi submetido a ELISA. As moléculas pequenas usadas foram ATP 1 mM, adenosina e uma mistura das mesmas. Os antígenos usados era IL-6 humana marcada com biotina, IL-6R humana e HSA.

[001488] Primeiro, uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora ou mais com 100 μl de TBS contendo um antígeno marcado com biotina. Seguindo lavagem com TBST para remover o antígeno marcado com biotina não ligado da placa, cada cavidade foi bloqueada com 250 μl de leite desnatado 2%/TBS por uma hora ou mais. Depois de leite desnatado 2%/TBS ter sido removido de cada cavidade, 50 μl do fago exibindo anticorpo foram adicionados à placa. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de cada fago ao antígeno marcado com biotina em cada cavidade na presença ou ausência de ATP e/ou adenosina. Após lavagem com TBST com ou sem ATP e/ou adenosina, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amers- ham Pharmacia Biotech) diluído com TBS ou (adenosina e/ou ATP)/TBS foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com TBST com ou sem cada molécula pequena, a so-lução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição da absorbância a 450 nm (Figs. 25, 26 e 27).

[001489] [Exemplo 11] Atividade de ligação de anticorpos obtidos conforme descrito no Exemplo 2 à IL-6 humana na presença de metabolitos de aminoácido que não quinurenina

[001490] Anticorpo I6NMSC1-3_A11 obtido conforme descrito no Exemplo 2-4, que se liga à IL-6 humana na presença de moléculas pequenas, é um anticorpo que se liga à IL-6 humana na presença de qui- nurenina conforme descrito no Exemplo 3-2. Quinurenina é um metabo- lito de triptofano, que é convertido em ácido antranílico por quinureni- nase; em 3-hidroxiquinurenina por quinurenina 3-hidroxilase; e em ácido quinurênico por quinurenina aminotransferase (Stefan Lob e ouros, Nat. Rev. Cancer. (2009) 9 (6), 445-452). Metabolitos de aminoácido tais como metabolitos de triptofano foram avaliados quanto a serem apropriados como uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido canceroso da presente invenção, particularmente metabolitos es-pecíficos de célula cancerosa da presente invenção.

[001491] I6NMSC1-3_A11 descrito no Exemplo 3-2 que tem atividade de ligação a antígeno na presença de quinurenina, um anticorpo para IL-6 anti-humano conhecido CLB8-F1 e GC413 como um controle negativo foram submetidos à ELISA sob as sete condições descritas na Tabela 18. Entretanto, cada aminoácido e metabolitos do mesmo foram apropriadamente preparados nas concentrações mostradas na Tabela 18 usando os tampões indicados na Tabela 4. O antígeno usado era IL- 6 humana marcada com biotina.

[001492] Primeiro, uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora ou mais com 100 μl de PBS contendo um antígeno marcado com biotina. Após lavagem com tampão de lavagem para remover o antígeno não ligado da placa, cada cavidade foi bloqueada por uma hora ou mais com 250 μl de Tampão de Bloqueio. Após Tampão de Bloqueio ter sido removido de cada cavidade, as IgGs purificadas foram preparadas para 2,5 μg/ml em Tampão de Amostra contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 18 e cada uma foi separada em alíquota a 100 μl na placa. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de cada IgG ao antígeno em cada cavidade. Após lavagem com Tampão de Lavagem contendo aminoácidos ou metabolitos de aminoácido nas concentrações finais mostradas na Tabela 18, um anticorpo IgG anti-humano conjugado a HRP (BIOSOURCE) diluído com Tampão de Amostra contendo os mesmos aminoácidos e metabolitos de aminoácido foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com Tampão de Lavagem contendo cada aminoácido ou metabolito de ami- noácido, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm. As composições de tampões usadas são mostradas na Tabela 4.

[001493] O resultado da medição é mostrado na figura 21. A absor- bância para CLB8-F1 era constante sem importar o tipo e presença de moléculas pequenas. Entretanto, a absorbância para I6NMSC1-3_A11 foi notadamente menor sob condição 7 (na ausência de moléculas pequenas) comparado sob a condição 1 (solução de quinurenina). Ainda, a absorbância para I6NMSC1-3_A11 era alta sob condição 2 (solução de triptofano) e condição 5 (solução de 3-hidroxiquinurenina) bem como sob a condição 1. Isso mostra que I6NMSC1-3_A11 é um anticorpo que se liga à IL-6 humana como um antígeno não apenas na presença de quinurenina, mas também na presença de um aminoácido (triptofano) como um precursor de quinurenina ou na presença de um metabolito de quinurenina.

[001494] Esta constatação sugere que o mesmo método pode ser usado para obter anticorpos que se ligam a um antígeno de interesse não apenas na presença de um tipo único de metabolito de aminoácido, mas também na presença de tipos diferentes múltiplos de aminoácidos ou metabolitos de aminoácido.

[001495] [Exemplo 12] Aquisição de anticorpos que se ligam à IL-6 humana na presença de moléculas pequenas da biblioteca de anticorpo humana usando técnica de exibição de fago

[001496] (12-1) Aquisição de anticorpos que se ligam à IL-6 humana na presença de moléculas pequenas da biblioteca usando panning de conta ou um método de seleção negativo

[001497] Através do mesmo método descrito em 2-2 e 2-3, a biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros construídas conforme descrito no Exemplo 2-1 foi avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação a antígeno na presença de moléculas pequenas.

[001498] (12-2) Avaliação de atividade de ligação na presença de mo léculas pequenas através de ELISA de fago

[001499] Sobrenadantes de cultura contendo fagos foram obtidos de colônias únicas de E. coli obtidas através do mesmo método descrito no Exemplo 2-4. Os fagos foram submetidos à ELISA. Ao realizar ELISA de fago usando os 768 clones isolados, os clones “I6NMSC1-3_#03” e “I6NMSC1-3_#17”, que exibiram atividade de ligação à IL-6 humana como um antígeno na presença de coquetel de molécula pequena, foram recém-obtidos.

[001500] (12-3) Expressão e purificação de anticorpos que se ligam à IL-6 humana

[001501] Genes foram amplificados dos clones I6NMSC1-3_#03 e I6NMSC1-3_#17 que tinham sido avaliados ter atividade de ligação a antígeno na presença de SC através de ELISA de fago, usando primers específicos (SEQ ID NOs: 110 e 112); e as sequências de nucleotídeo foram analisadas. As sequências de cadeia pesada e cadeia leve de I6NMSC1-3_#03 são as sequências de SEQ ID NOs: 50 e 51, respectivamente. Entretanto, as sequências de cadeia pesada e cadeia leve de I6NMSC1-3_#17 são as sequências de SEQ ID NOs: 52 e 53, respectivamente. A sequência de gene codificando a região variável de I6NMSC1-3_#17 foi inserida em um plasmídeo de expressão animal para IgG1 humano/Lambda, enquanto a sequência de gene codificando a região variável de I6NMSC1-3_#03, um anticorpo para IL-6 anti-humano conhecido CLB8-F1 (as sequências de cadeia pesada e cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 32 e 33, respectivamente) ou um anticorpo glipicano-3 anti-humano (as sequências de cadeia pesada e cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 34 e 35, respectivamente) como um controle negativo foi inserida em um plasmídeo de expressão animal para IgG1 humana/kappa. Os anticorpos expressos foram purificados através do método descrito no Exemplo 3.

[001502] (12-4) Identificação de moléculas pequenas necessárias para a ligação de anticorpo I6NMSC1-3_#03 à IL-6 humana

[001503] I6NMSC1-3_#03 foi submetido a ELISA sob as nove condi ções descritas na Tabela 3. Entretanto, cada molécula pequena foi apropriadamente preparada nas concentrações mostradas na Tabela 3 usando os tampões indicados na Tabela 4. O antígeno usado era IL-6 humana marcada com biotina.

[001504] Primeiro, uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora ou mais com 100 μl de PBS contendo o antígeno marcado com biotina. Após lavagem com Tampão de lavagem para remover o antígeno não ligado da placa, cada cavidade foi bloqueada por uma hora ou mais com 250 μl de Tampão de Bloqueio. Após remoção do Tampão de Bloqueio de cada cavidade, as IgGs purificadas foram preparadas para 2,5 μg/ml em Tampão de Amostra contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 3 e cada uma foi separada em alíquota a 100 μl na placa. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de cada IgG ao antígeno em cada cavidade. Após lavagem com Tampão de Lavagem contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 3, um anticorpo IgG anti-humano conjugado a HRP (BIOSOURCE) diluído com Tampão de Amostra contendo as mesmas moléculas pequenas foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com Tampão de Lavagem contendo cada molécula pequena, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cro- mogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm. A composição do tampão usado é mostrada na Tabela 4.

[001505] O resultado da medição é mostrado na figura 22. O resultado mostrou que a absorbância para I6NMSC1-3_#07 era notadamente menor sob a condição 9 (sem moléculas pequenas) comparado com aquela sob a condição 8 (a solução de coquetel de molécula pequena completa). Similar ao resultado de ELISA de fago, esse resultado confirmou que I6NMSC1-3_#03 tem a propriedade que sua ligação a antígeno é alterada dependendo da presença ou ausência de moléculas pequenas. Ainda, a absorbância para I6NMSC1-3_#03 era comparável entre a condição 7 (100 μM de quinurenina) e condição 8; no entanto, a absorbân- cia era menor sob outras condições. Isso demonstrou que, tal como I6NMSC1-3_A11 descrito no Exemplo 2, I6NMSC1-3_03 era um anticorpo que se liga à IL-6 humana como um antígeno na presença de quinurenina. I6NMSC1-3_#03 tem uma sequência de aminoácido diferente de I6NMSC1-3_A11, que demonstra que o método descrito acima pode ser usado para isolar tipos diferentes de anticorpos que se ligam a antígeno na presença de moléculas pequenas.

[001506] (12-5) Identificação de moléculas pequenas necessárias para a ligação de anticorpo I6NMSC1-3_#17 à IL-6 humana

[001507] Três tipos de anticorpos: I6NMSC1-3_#17 obtido, CLB8-F1 controle e GC413 controle negativo foram submetidos a ELISA sob as nove condições descritas na Tabela 3. Cada molécula pequena foi preparada para uma concentração apropriada mostrada na Tabela 3 usando os tampões mostrados na Tabela 4. O antígeno usado era IL-6 humana marcada com biotina.

[001508] Primeiro, uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora ou mais com 100 μl de PBS contendo o antígeno marcado com biotina. Após lavagem com Tampão de lavagem para remover o antígeno não ligado da placa, cada cavidade foi bloqueada por uma hora ou mais com 250 μl de Tampão de Bloqueio. Após Tampão de Bloqueio ser removido de cada cavidade, as IgGs purificadas foram preparadas para 0,15 μg/ml em Tampão de Amostra contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 3, e cada uma foi separada em alíquotas a 100 μl na placa. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de cada IgG ao antígeno em cada cavidade. Após lavagem com Tampão de Lavagem contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 3, um anticorpo IgG anti-humano conjugado a HRP (BIOSOURCE) diluído com Tampão de Amostra contendo as mesmas moléculas pequenas foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Se-guindo lavagem com Tampão de Lavagem contendo cada molécula pequena, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavi-dade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm. A composição do tampão usada é mostrada na Tabela 4.

[001509] O resultado da medição é mostrado na figura 23. O resultado mostrou que a absorbância para CLB8-F1 era a mesma sem importar o tipo e presença ou ausência de molécula pequena, enquanto a absor- bância para I6NMSC1-3_#17 era notadamente menor sob a condição 9 (sem moléculas pequenas) comparado com aquela sob a condição 8 (a solução de coquetel de molécula pequena completa). Similar ao resultado de ELISA de fago, esse resultado confirmou que I6NMSC1-3_#17 tem a propriedade que sua ligação a antígeno é alterada dependendo da presença ou ausência de moléculas pequenas. Ainda, a absorbância para I6NMSC1-3_#17 sob condição 1 (ATP-Na 1 mM) e condição 5 (ácido succínico 1 mM) era comparável àquela sob a condição 8; no entanto, a absorbância era menor sob outras condições. Esse resultado sugere que I6NMSC1-3_#17 é um anticorpo que se liga à IL-6 humana como um antígeno na presença ou de ATP-Na ou ácido succínico. ATP é conhecido ser liberado de células cancerosas. Ácido succínico é também conhecido ser acumulado dentro e fora de células de uma maneira específica de câncer. O fenômeno que mesmo em ambientes aeróbicos células cancerosas metabolizam de uma maneira dependente de glicó- lise ao invés de através de fosforilação oxidativa é conhecido como efeito Warburg. Ambas a glicólise e a fosforilação oxidativa são cronicamente limitadas em cânceres tipo isquêmico devido à insuficiência crônica de fluxo sanguíneo e então tais cânceres adquirem energia em condições mais pobres. Cânceres tipos isquêmico são conhecidos realizar metabolismo de energia dependendo de respiração de fumarato, resultando em acúmulo de ácido succínico como um metabolito de fumarato (Cancer Res. (2009) 69 (11), 4918-4925).

[001510] Isso demonstra que ao usar tal método, é possível obter anticorpos que se ligam a antígenos na presença de uma molécula pequena ao invés de quinurenina. Também, isso mostrou que é possível obter anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas tais como ATP-Na e ácido succínico que compartilham uma característica comum que elas têm cargas negativas múltiplas, mas são estruturalmente diferentes umas das outras.

[001511] [Exemplo 13] Aquisição de anticorpos que se ligam à albumina de soro humano (daqui em diante também referida como HSA) na presença de moléculas pequenas através de técnicas de exibição de fago a partir da biblioteca de anticorpo humana

[001512] (13-1) Aquisição de anticorpos que se ligam à HSA na pre sença de moléculas pequenas de biblioteca através de panning de conta

[001513] A biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros construídas conforme descrito no Exemplo 2 foi avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação à HSA na presença de moléculas pequenas, especificamente, através de coleta de anticorpos exibindo fagos que na presença de moléculas pequenas exibem atividade de ligação à HSA capturada por contas. Fagos foram coletados a partir de uma suspensão de fago eluída das contas na ausência de moléculas pequenas. Neste método de preparação, HSA marcada com biotina foi usada como o antígeno.

[001514] Fagos produzidos em E. coli contendo o vetor de fagemídeo construído para exibição de fago foram purificados através de um método convencional. Então, uma suspensão de biblioteca de fago foi preparada através de diálise contra TBS. Em seguida, leite desnatado foi adicionado à suspensão de biblioteca de fago em uma concentração final de 3%. Panning foi realizado usando contas magnéticas imobilizadas com antígeno. As contas magnéticas usadas eram contas revestidas NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) e contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).

[001515] Para aquisição eficiente de anticorpos permutadores de molécula pequena que são dependentes de moléculas pequenas que ser-vem como um permutador em tecidos cancerosos, panning foi realizado para enriquecer anticorpos que se ligam a antígenos na presença de uma mistura de tais moléculas pequenas (adenosina, trifosfato de ade- nosina (5’-trifosfato de adenosina (ATP)), inosina, quinurenina, prosta- glandina E2 (PGE2), ácido succínico e ácido láctico (daqui em diante referido como coquetel de molécula pequena (SC)), mas não se ligam a antígeno na ausência de SC.

[001516] Especificamente, junto com 250 pmol do antígeno marcado com biotina, SC contendo sal de sódio de trifosfato de adenosina (ATP- Na), adenosina, inosina, ácido succínico e ácido láctido em uma concentração final de 1 mM, prostaglandina E2 (PGE2) em uma concentração final de 1 μM e quinurenina em uma concentração final de 100 μM, que tinha sido ajustada para ser de pH 7,4 com NaOH, foi adicionada e contatada com a suspensão de biblioteca de fago preparada por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com leite desnatado foram adicionadas à suspensão de biblioteca de fago e o complexo antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas uma vez com SC/TBS (TBS contendo SC). Então, as contas foram combinadas com 0,5 ml de uma solução de tripsina 1 mg/ml. Imediatamente após a contas terem sido suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A suspensão de fago coletada foi adici-onada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=04, a 0,7). A E. coli foi incubada a 37° C por uma hora sob agitação suave para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados a partir do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido de biblioteca de fago.

[001517] A primeira rodada de panning foi realizada para coletar fagos que são capazes de se ligar na presença de moléculas pequenas, enquanto as segundas e subsequentes rodadas de panning foram realizadas para enriquecer fagos que são capazes de ligação a antígeno na presença de moléculas pequenas. Especificamente, 40 pmol de antí- geno marcado com biotina, SC e NaOH foram adicionados à suspensão de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, a biblioteca de fago foi contatada com o antígeno e moléculas pequenas por 60 minutos em temperatura ambiente. Contas magnéticas bloqueadas com leite desnatado foram adicionadas e deixadas se ligar ao complexo de antígeno- fago por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas com 1 ml de SC/TBST e SC/TBS. Então, as contas foram combinadas com 0,5 ml de TBS. Imediatamente após as contas terem sido suspen-sas em temperatura ambiente, uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. Após repetir esse tratamento, as duas suspensões de fago separadamente eluídas foram combinadas. Então, as contas resultantes foram combinadas com 0,5 ml de TBS e agitadas em temperatura ambiente por cinco minutos. Uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A proteína pIII (proteína pIII derivada de fago auxiliar) que não exibe Fab foi clivada de fagos através da adição de 5 μl de 100 mg/ml de tripsina à suspensão de fago coletada para eliminar a habilidade de fagos que não exibem Fab em infectar E. coli. Os fagos coletados da suspensão de fago tripinizada foram adicionados a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação suave a 37° C por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Os dois tipos de E. coli infectadas obtidas através de duas rodadas de panning foram misturados em quantidade igual neste ponto de tempo. Então, fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma suspensão de biblioteca de fago. Panning foi realizado três vezes para obter anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno na presença de moléculas pequenas.

[001518] (13-2) Aquisição de anticorpos que se ligam à HSA na pre sença de moléculas pequenas da biblioteca usando um método de seleção negativo

[001519] A biblioteca de exibição de fago construída de anticorpos humanos puros foi avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação à HSA na presença de moléculas pequenas. Como uma primeira etapa de avaliação, uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros foi contatada com antígeno marcado com biotina-es- treptavidina na ausência de moléculas pequenas para eliminar anticorpos exibindo fagos que têm atividade de ligação à HSA mesmo na ausência de moléculas pequenas. Desta maneira, avaliação foi realizada para anticorpos que têm atividade de ligação à HSA na presença de moléculas pequenas. HSA marcada com biotina foi usada como o antí- geno.

[001520] Os fagos foram produzidos em E. coli contendo o vetor de fagemídeo construído para exibição de fago. Os fagos produzidos foram purificados através de um método convencional, e então uma suspensão de biblioteca de fago foi preparada através de diálise dos fagos contra TBS. Então, leite desnatado foi adicionado em uma concentração final de 3% à suspensão de biblioteca de fago. As contas magnéticas usadas eram contas revestidas NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) e contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin). Panning foi realizado usando HSA marcada com biotina imobilizada em contas magnéticas.

[001521] Junto com 250 pmol de HSA marcada com biotina, SC contendo ATP-Na, adenosina, inosina, ácido succínico e ácido láctico em uma concentração final de 1 mM, PGE2 em uma concentração final de 1 μM, e quinurenina em uma concentração final de 100 μM, que tinha sido ajustada para ser de pH 7,4 com NaOH, foram adicionados e contatados com a solução de biblioteca de fago preparada por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com leite desnatado foram adicionadas à solução de biblioteca de fago e deixadas se ligar ao complexo de fago com HSA marcada com biotina por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas uma vez com SC/TBS. Então, as contas foram combinadas com 0,5 ml de uma solução de tripsina 1 mg/ml. Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma suspensão de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A suspensão de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação suave a 37° C por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infetada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma solução de biblioteca de fago.

[001522] A primeira rodada de panning foi realizada para coletar gados que são capazes de se ligar na presença de moléculas pequenas, enquanto as segundas e subsequentes rodadas de panning foram realizadas para enriquecer fagos que são capazes de se ligar à HSA marcada com biotina na presença de moléculas pequenas. Especificamente, 250 pmol de HSA marcada com biotina foram adicionados a contas Sera-Mag NeutrAvidin bloqueadas com leite e deixados se ligar por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas três vezes com TBS; e uma solução de biblioteca de fago bloqueada com leite desnatado foi adicionada às contas, e deixada se ligar em temperatura ambiente por uma hora. As contas foram isoladas usando um suporte magnético para coletar fagos que não se ligaram à HSA marcada com biotina ou as contas. Quarenta pmol de HSA marcada com biotina, SC e NaOH foram adicionados aos fagos coletados. Desta maneira, a biblioteca de fago foi contatada com HSA marcada com biotina e moléculas pequenas em SC por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com leite desnatado foram adicionadas à mistura de HSA marcada com biotina, SC e biblioteca de fago, e o complexo de HSA marcada com biotina e fago foi deixado se ligar às contas magnéticas por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas com 1 ml de SC/TBST e SC/TBS. Então, 0,5 ml de uma solução de tripsina 1 mg/ml foi adicionado à mistura. Após a solução misturada ter sido agitada por 20 minutos em temperatura ambiente, os fagos foram coletados das contas separadas usando um suporte magnético. Os fagos coletados foram adicionados a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 e a fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação suave a 37° C por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Panning foi realizado três vezes para obter anticorpos que têm atividade de ligação à HSA marcada com biotina na presença de moléculas pequenas.

[001523] (13-3) Avaliação de atividade de ligação na presença de mo léculas pequenas através de ELISA de fago

[001524] Sobrenadantes de cultura contendo fagos foram coletados de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) de colônias únicas de E. coli obtidas através do método descrito acima. Os sobrenadantes de cultura coletados foram tratados através de ultrafiltragem usando NucleoFast 96 (MACHEREY-NAGEL). 100 μl dos sobrenadantes de cultura foram adicionados a cada cavidade e a NucleoFast 96 foi centrifugada (4500 g por 45 minutos) para remover fluxo. Cem μl de H2O foram adicionados a cada cavidade e novamente a NucleoFast 96 foi centrifugada (4500 g por 30 minutos) para lavagem. Após 100 μl de TBS terem sido adicionados, a NucleoFast 96 foi deixada descansar por cinco minutos em temperatura ambiente. Finalmente, solução de fago contida no sobrenadante de cada cavidade foi coletada.

[001525] Os fagos purificados, aos quais TBS ou SC/TBS foi adicionado, foram submetidos a ELISA através do procedimento que segue. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μl de TBS contendo HSA marcada com biotina. Após HSA marcada com biotina ter sido removida através de lavagem de cada cavidade da placa com TBST, as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de leite desnatado 2%/TBS por uma hora ou mais. Leite desnatado 2%/TBS foi removido e então fagos purificados, preparados, foram adicionados a cada cavidade. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de fagos de exibição de anticorpo à HSA marcada com biotina em cada cavidade na presença ou ausência de SC. Após lavagem com TBST ou SC/TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS ou SC/TBS foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com TBST ou SC/TBST, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi determinada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm.

[001526] O clone HSNMSC1-4+#22, que tinha atividade de ligação à HSA como antígeno na presença do coquetel de molécula pequena, foi obtido realizando ELISA de fago usando os 782 clones isolados.

[001527] (13-4) Expressão e purificação de anticorpos de ligação à HSA

[001528] Genes foram amplificados a partir do clone HSNMSC1- 4+#22 que tinha sido avaliado ter atividade de ligação com HSA marcada com biotina na presença de SC pelo ELISA de fago descrito em (13-3), usando primers específicos (SEQ ID NOs: 110 e 112). As sequências de nucleotídeo dos genes foram analisadas (as sequências de cadeia pesada e cadeia leve são representadas pelas SEQ ID NOs: 54 e 55, respectivamente). Genes codificando as regiões variáveis de HSN- MSC1-4+#22 foram inseridas em um plasmídeo de expressão animal para IgG1 humana/Lambda. Entretanto, genes codificando as regiões variáveis do anticorpo glipicano-3 anti-humano controle negativo GC413 (a cadeia pesada e a cadeia leve são representadas pelas SEQID NOs: 34 e 35, respectivamente) foram inseridos em um plasmídeo de expressão animal para IgG1 humana/Kappa. Os anticorpos expressos foram purificados através do método descrito no Exemplo 3.

[001529] (13-5) Identificação de moléculas pequenas necessárias para ligação dos anticorpos obtidos à HSA

[001530] Dois tipos de anticorpos obtidos, HSNMSC1-4_#22 e GC413, foram submetidos a ELISA sob as nove condições descritas na Tabela 3. Entretanto, cada molécula pequena foi apropriadamente preparada nas concentrações mostradas na Tabela 3 usando os tampões indicados na Tabela 19. HSA marcada com biotina foi usada como o antígeno.

[001531] Primeiro, uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora ou mais com 100 μl de PBS contendo HSA marcada com biotina. Após lavagem com Tampão de lavagem para remover HSA marcada com biotina não ligada da placa, cada cavidade foi bloqueada por uma hora ou mais com 250 μl de Tampão de Bloqueio. Após Tampão de Bloqueio ter sido removido de cada cavidade, a IgGs purificadas foram preparadas para 2,5 μg/ml em Tampão de Amostra contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 3 e cada uma foi separada em alíquotas a 100 μl na placa. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de cada IgG à HSA marcada com biotina em cada cavidade. Após lavagem com Tampão de Lavagem contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mos-tradas na Tabela 3, um anticorpo IgG anti-humano conjugado a HRP (BIOSOURCE) diluído com Tampão de Amostra contendo as mesmas moléculas pequenas foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com Tampão de Lavagem con-tendo cada molécula pequena, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm. A composição do tampão usado é mostrada na Tabela 19.

[001532] O resultado da medição é mostrado na figura 24. O resultado mostrou que a absorbância para HSNMSC1-4_#22 era notadamente menor sob a condição 9 (sem moléculas pequenas) comparado com aquela sob condição 8 (a solução de coquetel de molécula pequena completa). Similar ao ELISA de fago, esse resultado confirmou que HSNMSC1-4_#22 tem a propriedade que sua ligação a antígeno é alterada dependendo da presença ou ausência de moléculas pequenas. Entretanto, a absorbância para HSNMSC1-4_#22 era a mesma entre a condição 2 (adenosina 1 mM) e condição 8, mas ela era notadamente menor sob outras condições. Esse resultado demonstrou que HSN- MSC1-4_#22 é um anticorpo que se liga à HSA como um antígeno na presença de adenosina. Desta maneira, foi demonstrado que tal método pode ser usado para isolar anticorpos que se ligam a antígenos na pre-sença de moléculas pequenas que não quinurenina.

[001533] [Exemplo 14] Aquisição de anticorpos que se ligam a receptor de IL-6 humana (hIL-6R) na presença de moléculas pequenas de biblioteca de anticorpo humana usando técnicas de exibição de fago

[001534] (14-1) Aquisição de anticorpos que se ligam a hIL-6R na pre sença de moléculas pequenas da biblioteca de anticorpos humanos puros através de panning de conta

[001535] A biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros construída conforme descrito no Exemplo 2 foi avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação a hIL-6R na presença de moléculas pequenas, especificamente, através de coleta de anticorpos exibindo fago que na presença de moléculas pequenas exibem atividade de ligação a hIL-6R capturado por contas. Os fagos foram coletados de eluato de fago eluído das contas na ausência de moléculas pequenas. Neste método de preparação, hIL-6R marcado com biotina foi usado como o antígeno.

[001536] Fagos produzidos em E. coli contendo o vetor de fagemídeo construído para exibição de fago foram purificados através de um método convencional. Então, uma solução de biblioteca de fago foi preparada através de diálise dos fagos contra TBS. Em seguida, BSA foi adicionado em uma concentração final de 4% à solução de biblioteca de fago. Panning foi realizado usando contas magnéticas imobilizadas com antígeno. As contas magnéticas usadas eram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) e contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).

[001537] Para aquisição eficiente de anticorpos permutadores de molécula pequena que são dependentes de moléculas pequenas que podem servir como um permutador em tecidos cancerosos, panning descrito em (2-2) foi realizado para enriquecer anticorpos que se ligam a antígenos na presença de SC, mas não se ligam a antígenos na ausência de SC.

[001538] Especificamente, junto com 250 pmol de antígeno marcado com biotina, SC preparado conforme descrito em (2-2) foi adicionado e contatado com solução de biblioteca de fago preparada em temperatura ambiente por 60 minutos. Então, a solução de biblioteca de fago foi adicionada a contas magnéticas bloqueadas com BSA e o complexo de antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas uma vez com SC/TBS (SC contendo TBS). Então as contas foram combinadas com 0,5 ml de 1 mg/ml de solução de tripsina. Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, a solução de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação suave a 37° C por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para preparar um estoque líquido de biblioteca de fago.

[001539] Panning foi realizado conforme descrito em (2-2), exceto pela adição de 10 μl de 100 mg/ml de tripsina para clivar a proteína pIII (proteína pIII derivada de fago auxiliar) de fagos que não exibem Fab a fim de eliminar a habilidade dos fagos que não exibem Fab em infectar E. coli.

[001540] (14-2) Aquisição de anticorpos que se ligam a hIL-6R na pre sença de moléculas pequenas da biblioteca de anticorpo humano puro usando um método de seleção negativo

[001541] A biblioteca de exibição de fago construída de anticorpos humanos puros foi avaliada quanto a anticorpos que exibem atividade de ligação a hIL-6R na presença de moléculas pequenas. Como uma primeira etapa de avaliação, a biblioteca de exibição de fago de anticorpos humanos puros foi contatada com antígeno marcado com biotina-es- treptavidina na ausência de moléculas pequenas para eliminar anticorpos exibindo fago que têm atividade de ligação a hIL-6R mesmo na ausência de moléculas pequenas. Então panning foi realizado na presença de moléculas pequenas da mesma maneira para avaliar anticorpos que têm atividade de ligação a hIL-6R na presença de moléculas pequenas. O antígeno usado era hIL-6R marcado com biotina. Então uma solução de biblioteca de fago foi preparada através do método descrito em (2-3) usando hIl-6R marcado com biotina como um antígeno.

[001542] (14-3) Avaliação da atividade de ligação na presença de mo léculas pequenas através de ELISA de fago

[001543] Sobrenadantes de cultura contendo fagos foram coletados de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) de colônias únicas de E. coli obtidas como descrito em (14-2). Fagos purificados através do método descrito em (2-4) foram submetidos a ELISA através do procedimento que segue. Uma placa de micro- titulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μl de TBS contendo hIL-6R marcado com biotina. Após hIL-6R marcado com biotina ter sido removido através de lavagem de cada ca-vidade da placa com TBST, as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de leite desnatado 2%/TBS por uma hora ou mais. Leite desnatado 2%/TBS foi removido e então os fagos purificados, preparados, foram adicionados a cada cavidade. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de fagos exibindo anticorpo a hIL-6R marcado com biotina em cada cavidade na presença ou ausência de SC. Após lavagem com TBST ou SC/TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amerhsam Pharmacia Biotech) diluído com TBS ou SC/TBS foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com TBST ou SC/TBST, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A rea-ção cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então a cor desenvolvida foi avaliada através da medição da absorbância a 450 nm.

[001544] Os clones 6RNMSC1-2_F02 e 6RNMSC1-3_G02, que têm atividade de ligação com hIL-6R como um antígeno na presença de um coquetel de molécula pequena, foram obtidos realizando ELISA de fago usando 960 clones isolados.

[001545] (14-4) Expressão e purificação de anticorpos que se ligam a hIL-6R

[001546] Os genes foram amplificados usando primers específicos (SEQ ID NOs: 110 e 112) de clones 6RNMSC1-2_F02 e 6RNMSC1- 3_G02, que tinham sido avaliados ter atividade de ligação a hIL-6R marcado com biotina na presença de SC pelo ELISA de fago descrito em (14-3). As sequências de nucleotídeo dos genes foram analisadas (6RNMSC1-2_F02: as sequências de cadeia pesada e sequências de cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 86 e 87, respectivamente; 6RNMSC1-3_G02: as sequências de cadeia pesada e cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 88 e 89, respectivamente). Genes codificando as regiões variáveis de 6RNMSC1-2_F02 e 6RNMSC1-3_G02, e aqueles do anticorpo glipicano-3 anti-humano controle negativo GC413 (a cadeia pesada e a cadeia leve são SEQ ID NOs: 34 e 35, respectivamente) foram inseridos em um plasmídeo de expressão animal para IgG1 humana/Kappa. Os anticorpos expressos foram purificados através do método descrito no Exemplo 3.

[001547] (14-5) Identificação de moléculas pequenas necessárias para ligação dos anticorpos obtidos a hIL-6R

[001548] Três tipos de anticorpos obtidos: 6RNMSC1-2_F02 e 6RNMSC1-3_G02 e GC413 foram submetidos a ELISA sob as nove condições descritas na Tabela 3. Entretanto, cada molécula pequena foi apropriadamente preparada nas concentrações mostradas na Tabela 3 usando os tampões indicados na Tabela 19. O antígeno usado era hIL- 6R marcado com biotina.

[001549] Primeiro, uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora ou mais com 100 μl de PBS contendo hIL-6R marcado com biotina. Após lavagem com Tampão de Lavagem para remover hIL-6R marcado com biotina não ligado da placa, cada cavidade foi bloqueada por uma hora ou mais com 250 μl de Tampão de Bloqueio. Após o Tampão de Bloqueio ter sido removido de cada cavidade, as IgGs purificadas foram preparadas para 2,5 μg/ml em Tampão de Amostra contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 3 e cada uma foi separada em alíquotas a 100 μl na placa. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de cada IgG a hIL- 6R marcado com biotina em cada cavidade. Após lavagem com Tampão de Lavagem contendo moléculas pequenas nas concentrações finais mostradas na Tabela 3, um anticorpo IgG anti-humano conjugado a HRP (BIOSOURCE) diluído com Tampão de Amostra contendo as mesmas moléculas pequenas foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com Tampão de Lavagem contendo cada molécula pequena, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfú- rico. Então a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de ab- sorbância a 450 nm. A composição do tampão usado é mostrada na Tabela 19.

[001550] O resultado da medição é mostrado nas Figs. 28 e 29. Quando 6RNMSC1-2_F02 ou 6RNMSC1-3_G02 foi usado, a absorbân- cia foi notadamente menor sob a condição 9 (na ausência de moléculas pequenas) comparado com sob a condição 8 (a solução de coquetel de molécula pequena completa). Esse resultado confirmou que 6RNMSC1- 2_F02 e 6RNMSC1-3_G02 têm a propriedade que sua ligação a antí- geno é alterada dependendo da presença ou ausência de moléculas pequenas. Entretanto, quando 6RNMSC1-2_F02 foi usado, a absorbân- cia foi a mesma entre a condição 7 (100 μM de quinurenina) e condição 8, mas a absorbância foi notadamente menor sob outras condições, que mostra que 6RNMSC1-2_F02 é um anticorpo que se liga a hIL-6R como um antígeno na presença de quinurenina (figura 28). Ainda, quando 6RNMSC1-2_G02 foi usado, a absorbância era a mesma entre a condição 1 (ATP-Na 1 mM) e condição 8, mas a absorbância era notadamente menor sob outras condições, mostrando que 6RNMSC1-2_G02 é um anticorpo que se liga a hIL-6R como um antígeno na presença de ATP (figura 29). Foi então demonstrado que o método descrito acima pode ser usado para isolar de uma vez anticorpos múltiplos cuja atividade de ligação a antígeno é alterada na presença de uma molécula pequena diferente.

[001551] [Exemplo 15] Caracterizaçao de anticorpo 6RNMSC1-2_F02

[001552] (15-1) Avaliação ELISA de atividade de ligação a hIL-6R na presença de aminoácidos e metabolitos de aminoácido que não quinu- renina

[001553] O anticorpo 6RNMSC1-2_F02 obtido conforme descrito no Exemplo 14, que se liga a hIL-6R na presença de moléculas pequenas, é um anticorpo que se liga a hIL-6R na presença de quinurenina. Meta- bolitos de aminoácido tais como metabolitos de triptofano descritos no Exemplo 11 foram avaliados quanto a se eles são preferidos como uma modalidade não limitante de compostos específicos de tecido canceroso, particularmente metabolitos específicos de célula cancerosa, para uso na presente invenção.

[001554] 6RNMSC1-2_F02 descrito no Exemplo 14, que tem atividade de ligação a antígeno na presença de quinurenina, e GC413 controle negativo foram submetidos a ELISA sob as sete condições descritas na Tabela 18. Entretanto, cada molécula pequena foi apropriadamente preparada nas concentrações mostradas na Tabela 18 usando os tampões indicados na Tabela 4. O antígeno usado era hIL-6R marcado com biotina. ELISA foi realizada usando o método descrito no Exemplo 11.

[001555] O resultado da medição é mostrado na figura 30. Quando 6RNMSC1-2_F02 foi usado, a absorbância era notadamente menor sob a condição 7 (na ausência de moléculas pequenas) comparado com a condição 1 (solução de quinurenina). Similarmente, 6RNMSC1-2_F02 mostrou a mesma absorbância alta sob a condição 5 (solução de 3-hi- droxiquinurenina) como sob condição 1, sugerindo que ele é um anticorpo que se liga a hIL-6R como um antígeno não apenas na presença de quinurenina, mas também na presença de um metabolito de quinu- renina. Ainda, a absorbância para 6RNMSC1-2_F02 foi notadamente menor sob outras condições, sugerindo que 6RNMSC1-2_F02 é um anticorpo que não se liga a hIl-6R como um antígeno na presença de trip- tofano, um precursor de quinurenina. O nível de expressão de IDO, uma enzima que metaboliza triptofano para produzir quinurenina, é elevada em microambiente canceroso. Dessa maneira, anticorpos que se ligam a antígenos na presença de quinurenina ou seus metabolitos, mas não na presença de triptofano, são esperados ser importantes como anticorpos que se ligam a antígenos apenas em microambiente canceroso. Isso sugere que o mesmo método pode ser usado para obter anticorpos que se ligam a um antígeno de interesse não apenas na presença de um metabolito de aminoácido único, mas também na presença de me- tabolitos de aminoácido estruturalmente diferentes, múltiplos.

[001556] (15-2) Avaliação de quinurenina quanto ao seu efeito sobre ligação de receptor de IL-6 humana através de ressonância de plasmon de superfície

[001557] Biacore T200 (GE Healthcare) foi usado para analisar a interação de 6RNMSC1-2_F02 com receptor de IL-6 humana (IL-6R) em reação antígeno-anticorpo. Sensor chip CM5 (GE Healthcare) foi imobilizado com uma quantidade apropriada de proteína A (Invitrogen) através de acoplamento amina. O anticorpo de interesse foi capturado pelo chip para permitir interação com IL-6R como um antígeno. O tampão de processamento usado era 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4. A interação com o antígeno IL-6R foi ensaiada a 25° C. Os tampões usados para diluir IL-6R eram o próprio tampão de processamento e um tampão preparado através de adição de 100 μmol/l de quinurenina ao tampão de processamento e ainda um tampão preparado como um controle através da adição de 10 mmol/l de ATP ao tampão de processamento.

[001558] Uma solução de IL-6R e um tampão de processamento como um blank foram injetadas em uma taxa de fluxo de 10 μmol/min por um minuto para permitir interação de IL-6R com 6RNMSC1-2_F02 capturado no sensor chip. Então, o tampão de processamento foi injetado em uma taxa de fluxo de 10 μl/min por um minuto. Após observação de dissociação de IL-6R do anticorpo, 10 mmol/l de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados em uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 30 segundos para regenerar o sensor chip. A constante de dissociação KD (M) de 6RNMSC1- 2_F02 foi calculada para IL-6R com base na constante de taxa de associação ka (1/Ms) e constante de taxa de dissociação kd (1/s), ambas são parâmetros cinéticos calculados a partir do sensorgrama obtido pela medição. Cada parâmetro foi calculado usando o Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare).

[001559] Sensorgramas obtidos através desta medição para a interação entre 6RNMSC1-2_F02 e 1 μmol/l de IL-6R na presença de 100 μmoll/l de quinurenina e na presença ou ausência de 10 mmol/l de ATP são mostrados na figura 31. Conforme mostrado na figura 31, 6RNMSC1-2_F02 se liga a IL-6R na presença de 100 μmol/l de quinu- renina; no entanto, sua ligação a IL-6R não era detectável na ausência de quinurenina. Isso demonstra que 6RNMSC1-2_F02 tem a proprie-dade que ele se liga a IL-6R através de quinurenina como um permuta- dor. Entretanto, a constante de dissociação KD de 6RNMSC1-2_F02 era 1,5 μmol na presença de 100 μmol/l de quinurenina.

[001560] (15-3) Efeito de quinurenina como um permutador sobre dis sociação de anticorpos a partir de IL-6R

[001561] Biacore T200 (GE Healthcare) foi usado para avaliar se 6RNMSC1-2_F02 que se liga a IL-6R na presença de quinurenina se dissocia de uma maneira dependente da concentração de quinurenina na presença de quinurenina. Os tampões de processamento usados eram 20 mmol/l de ACES, 150 mmo/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4, e 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4, 100 μmol/l de quinurenina e ensaio foi realizado a 25° C. IL-6R foi imobilizado em Sensor chip CM5 através de acoplamento amina; e 6RNMSC1-2_F02 foi diluído para 5 μg/ml com 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4, contendo 100 μmol/l de quinurenina e ele foi interagido como um analito por 180 segundos. Então, a dissociação de IL-6R foi monitorada sob cada condição de tampão de processamento. A fim de comparar o grau de dissociação entre as respectivas condições de tampão de processamento, os valores foram normalizados considerando como 100 a quan-tidade de 6RNMSC1-2_F02 ligado a IL-6R na presença de 100 μmol/l de quinurenina e comparados. Um sensorgrama que representa a interação entre 6RNMSC1-2_F02 e IL-6R após normalização é mostrado na figura 32. O resultado mostrado na figura 32 demonstra que 6RNMSC1-2_F02 tem a propriedade que ele se liga a IL-6R na presença de quinurenina e então se dissocia rapidamente de IL-6R na ausência de quinurenina. Especificamente, a regulagem mediada por qui- nurenina sobre ligação do anticorpo a IL-6R foi demonstrada ser reversível.

[001562] (15-4) Avaliação do efeito de concentração de quinurenina sobre ligação a IL-6R

[001563] Em seguida, Biacore T200 (GE Healthcare) foi usado para avaliar o efeito de concentração de quinurenina sobre a reação antí- geno-anticorpo entre 6RNMSC1-2_F02 e IL-6R. O tampão de processamento usado era 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4. A reação antígeno-anticorpo entre 6RNMSC1-2_F02 e IL-6R humano foi avaliada a 25° C. IL-6R foi imobilizado em sensor chip CM5 através de acoplamento amina; e 6RNMSC1-2_F02 foi diluído para 1 μg/ml com 20 mmol/l de ACES, 150 mmol de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4, contendo várias con-centrações de quinurenina, e foi deixado interagir como um analito por 180 segundos para observar mudanças na quantidade de ligação. O resultado é mostrado na figura 3. Esse resultado demonstrou que quanto maior a concentração de quinurenina servindo como um permu- tador, maior a quantidade de 6RNMSC1-2_F02 ligado a IL-6R.

[001564] Entretanto, uma vez que IL-6R é imobilizada sobre um sensor chip neste sistema de ensaio, 6RNMSC1-2_F02 é pensado se ligar de uma maneira divalente. Em tal sistema de ensaio onde 6RNMSC1-2_F02 reconhece IL-6R de uma maneira divalente, a quantidade de 6RNMSC1-2_F02 ligado a IL-6R foi também observada au-mentar com uma concentração de quinurenina maior. Esse resultado demonstrou que 6RNMSC1-2_F02 tem a propriedade que ele se liga a IL-6R através de quinurenina como um permutador também em ligação divalente.

[001565] Esses resultados demonstraram que 6RNMSC1-2_F02 é um anticorpo que se liga a IL-6R na presença de quinurenina com quinure- nina como um permutador, mas é dissociado de IL-6R na ausência de quinurenina. Ainda, foi confirmado que é possível ter controle ON/OFF integral de 6RNMSC1-2_F02 de maneira que ele não demonstra atividade de ligação a IL-6R na ausência de quinurenina. A função permu- tadora era esperada ser obtida da maneira conforme mostrado na figura 2.

[001566] (15-5) Efeito de quinurenina sobre a atividade de ADCC de 6RNMSC1-2_F02

[001567] Os genes codificando as regiões variáveis de 6RNMSC1- 2_F02 determinados conforme descrito no Exemplo 14 foram inseridos em um plasmídeo de expressão animal para IgG1 humana/Kappa, que compreende uma região constante de cadeia pesada de anticorpo com-preendendo a sequência de SEQ ID NO: 90 e uma sequência de região constante kappa de cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 91. Os respectivos genes codificando as regiões variáveis de um anticorpo para IL-6R anti-humano conhecido, MRA (as sequências de cadeia pesada e cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 92 e 93, respectivamente), foram também inseridos no plasmídeo de expressão animal para IgG1 humana/Kappa, que tem as regiões constantes des-critas acima (SEQ ID NOs: 90 e 91). Os anticorpos foram expressos usando o método descrito abaixo. FreeStyle 293-F (Invitrogen) que era derivada de células de rim fetal humano foram suspensas em uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml do Meio de Expressão de FreeStyle 293 (Invitrogen) e separadas em alíquotas a 3 ml em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. O DNA de plasmídeo foi transfectado para células através de lipofecção. A partir do sobrenadante de cultura após quatro dias de cultura em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 8%, 90 rpm), anticorpos foram purificados através de um método conhecido daqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose® Fast Flow (Amersham Biosciences). Absorbância das soluções de anticorpo purificado foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. A partir dos valores obtidos através de medição, as concentrações de anticorpos purificados foram calculadas usando um coeficiente de extinção determinado através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

[001568] Anticorpo 6RNMSC1-2_F02 que tem uma atividade de liga-ção a antígeno na presença de quinurenina conforme descrito no Exemplo 14 foi avaliado quanto à ligação a hIL-6R solúvel. Como uma pri-meira etapa na avaliação da atividade de ADCC de 6RNMSC1-2_F02 para células expressando hIL-6R, 6RNMSC1-2_F02 foi avaliado quanto a se ele tem a habilidade em se ligar a hIL-6R tipo membrana expresso em células expressando hIL-6R. Especificamente, a ligação de 6RNMSC1-2_F02 a células da linhagem BaF/hIL-6R (WO2012/073992) foi ensaiada e analisada usando um citômetro de fluxo. Um número apropriado de células BaF/hIL-6R foi preparado e bloqueado com PBS contendo FBS 2% em gelo por uma hora ou mais. Sobrenadante foi removido das células bloqueadas através de centrifugação e 100 μl de 6RNMSC1-2_F02 ou o MRA de anticorpo controle (as sequências de cadeia pesada e cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 92 e 93, respectivamente) foram adicionados sob duas condições: na presença ou ausência de uma concentração final de quinurenina a 100 μM. Nesta etapa, os anticorpos foram contatados hIL-6R em membrana celular em gelo por 30 minutos. O complexo de anticorpo-célula foi lavado com Tampão de Lavagem contendo quinurenina ou com Tampão de Lavagem que não contém quinurenina. Então, na presença ou ausência de quinurenina, o complexo foi contatado com um anticorpo secundário (Beckman Coulter IMI1627) que reconhece a região constante de anticorpo. Depois de 30 minutos de incubação com o anticorpo em gelo, as células foram novamente lavadas com Tampão de Lavagem e então ressuspensas em PBS/FBS 2%. A ligação de 6RNMSC1-2_F02 às células preparadas foi ensaiada e analisada usando o Citômetro de Fluxo BD FACS cant II (BD).

[001569] O resultado do ensaio foi mostrado na figura 34. Com o anticorpo controle MRA, fluorescência era detectável sem importar a pre-sença ou ausência de quinurenina. Em contraste, para 6RNMSC1- 2_F02, mudança de fluorescência foi observada pela primeira vez na presença de 100 μM de quinurenina; no entanto, fluorescência não era detectável na ausência de quinurenina. Isso demonstra que 6RNMSC1- 2_F02 é um anticorpo que tem a habilidade de se ligar a hIL-6R expresso em membrana celular na presença de quinurenina.

[001570] #Em geral, anticorpos naturais se ligam em seu Fab diretamente a antígenos em célula alvo e seu Fc se liga a FCYR em células efetoras, resultando em indução de atividade citotóxica (atividade de ADCC) de células efetoras contra as células alvo. Neste contexto, se atividade de ADCC é exercida contra células expressando hIL-6R quando da ligação de 6RNMSC1-2_F02 a hIL-6R na presença de qui- nurenina foi avaliada através do método descrito abaixo.

[001571] 6RNMSC1-2_F02 variante com atividade efetora aumentada (as sequências de cadeia pesada e cadeia leve são mostradas nas SEQ ID NOs: 94 e 91, respectivamente) foi usado. Em várias concentrações de 6RNMSC1-2_F02, atividade de ADCC contra células expressando hIL-6R foi ensaiada na presença ou ausência de quinurenina de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 1. O resultado do ensaio é mostrado na figura 35.

[001572] O resultado do ensaio confirmou que na presença de quinu- renina, atividade de ADCC contra células expressando hIL-6R foi induzida por 6RNMSC1-2_F02 de uma maneira dependente da concentração de anticorpo. A constatação demonstra que a ligação a antígeno do anticorpo através de quinurenina induz atividade de ADCC contra células expressando antígeno e, em termos da função através de atividade antitumor tal como atividade de ADCC, anticorpos que se ligam a antí- genos na presença de moléculas pequenas como um permutador podem ser também regulados pela presença de moléculas pequenas servindo como um permutador.

[001573] Ainda, há uma diferença na concentração de quinurenina entre tecidos normais e tumorosos, e então é preferível que a atividade de ADCC de um anticorpo seja exercida contra células de tumor expressando antígeno apenas na concentração de quinurenina em tecidos tu- morosos, enquanto na concentração de quinurenina de tecido normal, a atividade de ADCC é prejudicada ou não exercida. Então, 6RNMSC1- 2_F02 foi avaliado quanto à atividade de ADCC contra células expressando hIL-6R em várias concentrações de quinurenina de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 2. O resultado do ensaio é mostrado na figura 36. O resultado do ensaio demonstrou que atividade de ADCC contra células expressando hIL-6R estava incluída com 6RNMSC1-2_F02 de uma maneira dependente da concentração de qui- nurenina. Ainda, em contraste com aproximadamente 10% de atividade de ADCC a 4 até 6 μM que é considerada ser a concentração de quinurenina em tecidos normais, a atividade de ADCC a 30 até 40 μM que é considerada ser a concentração de quinurenina em tecidos tumorosos foi cerca de 25%.

[001574] Com base nesses resultados, com 6RNMSC1-2_F02, a atividade de ADCC contra células expressando hIL-6R era fraca em tecidos normais onde a concentração de quinurenina é baixa; e em tecidos tumorosos onde a concentração é alta, a atividade de ADCC de 6RNMSC1-2_F02 contra células expressando hIL-6R era maior. Isso sugere que através da administração de um anticorpo que usa quinure- nina como um permutador, a citotoxidez para tecidos normais expressando um antígeno alvo pode ser reduzida sem prejudicar o efeito far-macêutico contra tecidos tumorosos expressando o antígeno alvo.

[001575] (15-6) Avaliação do anticorpo obtido quanto à sua atividade de ligação a hIL-6R em soro de camundongo através de ELISA de IgG

[001576] Anticorpo 6RNMSC1-2_F02 obtido conforme descrito no Exemplo 14, que se liga a hIL-6R na presença de moléculas pequenas, é um anticorpo que se liga a hIL-6R na presença de quinurenina. Até agora, 6RNMSC1-2_F02 tem sido avaliado quanto à sua habilidade de ligação a antígeno em tampões tais como PBS e TBS. Muitas moléculas pequenas desconhecidas incluindo aminoácido são consideradas existir em soro de camundongo, e não pode ser excluída a possibilidade que tais moléculas pequenas afetem a ligação a antígeno de 6RNMSC1- 2_F02. Desta maneira, 6RNMSC1-2_F02 foi avaliado quanto à sua habilidade de ligação a antígeno em soro de camundongo.

[001577] Conforme descrito no Exemplo 14, anticorpo 6RNMSC1- 2_F02 que tem atividade de ligação a antígeno na presença de quinu- renina e o anticorpo anti-hIL-6R MRA conhecido foram submetidos a ELISA sob as condições descritas na Tabela 20. O antígeno usado era hIL-6R marcado com biotina.

[001578] Primeiro, uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida em temperatura ambiente por uma hora ou mais com 100 μl de PBS contendo o antígeno marcado com biotina. Após lavagem com Tampão de Lavagem para remover antígeno não ligado da placa, cada cavidade foi bloqueada por uma hora ou mais com 250 μl de Tampão de Bloqueio. Após Tampão de Bloqueio ser removido de cada cavidade, cada uma das IgGs purificadas foi preparada para 2,5 μg/ml sob condição 2 mostrada na Tabela 20 e separadas em alíquotas a 100 μl na placa. A placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por uma hora para permitir ligação de cada IgG ao antígeno em cada cavidade. Após lavagem com Tampão de Lavagem contendo 100 μM de quinurenina, um anticorpo IgG anti-humano conjugado a HRP (BIOSOURCE) diluído com Tampão de Amostra contendo quinurenina foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com Tampão de Lavagem contendo quinurenina, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição da absorbância a 450 nm.

[001579] O resultado da medição é mostrado na figura 37. Com MRA, a absorbância era a mesma sem importar a presença ou ausência de quinurenina. Em contraste, quando 6RNMSC1-2_F02 foi usado, a ab- sorbância era notadamente menor sob a condição 1 (soro de camundongo sem quinurenina) comparado sob a condição 2 (soro de camundongo na presença de quinurenina) mostrada na Tabela 20. Isso sugere que 6RNMSC1-2_F02 é um anticorpo que se liga a hIL-6R como um antígeno na presença de quinurenina sem ser afetado pelas moléculas pequenas desconhecidas em soro de camundongo.

[001580] [Exemplo 16] Aquisição de anticorpos que se ligam a antíge- nos na ausência de adenosina ou ATP a partir de biblioteca de anticorpo usando técnicas de exibição de fago

[001581] (16-1) Aquisição de anticorpos cuja ligação a antígeno é ini bida na presença de moléculas pequenas a partir de uma biblioteca usando uma mistura de adenosina e ATP

[001582] Anticorpos que se ligam a antígenos alvo na presença de moléculas pequenas servindo como um permutador foram obtidos conforme descrito no Exemplo acima. No experimento descrito neste Exemplo, os presentes inventores tentaram obter anticorpos que se ligam a antígenos alvo na ausência de moléculas pequenas.

[001583] Anticorpos que exibem atividade de ligação a antígeno na ausência de adenosina e/ou ATP, mas cuja habilidade de ligação é prejudicada na presença de adenosina e/ou ATP foram obtidos a partir de uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos racionalmente projetados. Como uma primeira etapa para isolar anticorpos, uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos foi contatada com adenosina biotini- lada e ATP-NeutrAvidin para coletar uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos que se ligam à adenosina e/ou ATP. Então, a biblioteca de exibição de fago foi contatada com antígeno biotinilado-estreptavi- dina na ausência de adenosina e ATP para coletar anticorpos que se ligam a antígenos na ausência de adenosina e ATP. Panning foi realizado da maneira alternativa descrita acima para avaliar anticorpos que têm atividade de ligação a ambos antígeno e adenosina e/ou ATP. Na presença de adenosina e ATP, a ligação a antígeno de anticorpos com tais propriedades foi esperada ser inibida por ligação de adenosina e/ou ATP aos anticorpos.

[001584] Os fagos foram produzidos em E. coli contendo o vetor de fagemídeo construído para exibição de fago. Ao meio de cultura de E. coli onde produção de fago foi realizada, NaCl 2,5M/PEG 10% foi adicionado para precipitar os fagos. A fração de fago precipitado foi diluída com TBS para preparar uma solução de biblioteca de fago. Então, BSA foi adicionado em uma concentração final de 4% à solução de biblioteca de fago. Panning foi realizado usando contas magnéticas imobilizadas com antígeno. As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera-Mag SpeedBeads NeutrAvidin) e contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).

[001585] 500 pmol de ATP biotinilado, 2’-adenosina-PEG-Biotina e 5’- adenosina-PEG-Biotina foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, solução de biblioteca de fago foi conta-tada com adenosina e ATP por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à solução de biblioteca de fago e o complexo de fago com adenosina e/ou ATP foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas uma vez com TBS e então 0,5 ml de uma solução de tripsina 1 mg/ml foi adicionado às contas.

[001586] Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma solução de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação suave a 37° C por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, os fagos foram coletados do meio de cultura de E. coli semeada para preparar uma solução de biblioteca de fago.

[001587] A segunda rodada de panning foi realizada para enriquecer fagos capazes de se ligar ao antígeno biotinilado na ausência de ade- nosina e ATP. Especificamente, 250 pmol de antígeno biotinilado foram adicionados à solução de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, a solução de biblioteca de fago foi contatada com o antígeno por 60 minutos em temperatura ambiente. Então, contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à solução de biblioteca de fago e o complexo de antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas duas vezes com TBST e uma vez com TBS. Então, 0,5 ml de uma solução de tripsina 1 mg/ml foi adicionado às contas. Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma solução de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A solução de fago coletada foi adicionada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação suave a 37° C por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, fagos foram coletados a partir do meio de cultura da E. coli semeada para preparar uma solução de biblioteca de fago.

[001588] Em rodadas de número ímpar subsequentes, panning foi realizado da mesma maneira que a primeira rodada de panning. No en-tanto, o número de lavagens de conta com TBST e TBS foi aumentado para três vezes e duas vezes, respectivamente.

[001589] Em rodadas de número par subsequentes, panning foi realizado da mesma maneira que a segunda rodada de panning. No entanto, nas quarta e subsequentes rodadas de panning, o antígeno biotinilado foi reduzido para 40 pmol e o número de lavagens de conta com TBST e TBS foi aumentado para três vezes e duas vezes, respectivamente.

[001590] (16-2) Avaliação de atividade de ligação na presença de mo léculas pequenas de ELISA de fago

[001591] Sobrenadantes de cultura contendo fagos foram coletados de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) de colônias únicas de E. coli obtidas através do método descrito acima. Os sobrenadantes de cultura coletados foram ultrafiltrados usando NucleoFast 96 (MACHEREY-NAGEL). 100 μl dos sobrenadan- tes de cultura foram adicionados a cada cavidade e a NucleoFast 96 foi centrifugada (4500 g por 45 minutos) para remover fluxo, 100 μl de H2O foram adicionados a cada cavidade e novamente a NucleFast 96 foi la-vada através de centrifugação (4500 g por 30 minutos). Após 100 μl de TBS terem sido adicionados, a NucleoFast 96 foi deixada descansar em temperatura ambiente por cinco minutos. Finalmente, uma solução de fago foi coletada do sobrenadante em cada cavidade.

[001592] Fagos purificados, aos quais TBS ou ATP e adenosina/TBS tinham sido adicionados, foram submetidos à ELISA através do proce-dimento que segue. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μl de TBS contendo um antígeno marcado com biotina. Após o antígeno ter sido removido de cada cavidade da placa através de lavagem com TBST, as cavidades foram bloqueadas com 250 μl de leite desnatado 2%/TBS por uma hora ou mais. Leite desnatado 2%/TBS foi removido, e então os fagos purificados, preparados, foram adicionados a cada cavidade. A placa foi deixada descansar a 37° C por uma hora para permitir ligação de fagos exibindo anticorpo a antígenos em cada cavidade na presença ou au-sência de 10 mM de adenosina e ATP. Após lavagem com TBST ou 10 mM (ATP e adenosina)/TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS ou 10 mM (ATP e ade- nosina)/TBS foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com TBST ou 10 mM (ATP e adeno- sina)/TBST, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm.

[001593] ELISA de fago foi realizada usando 96 clones isolados para obter a partir da biblioteca de anticorpos racionalmente projetados clone “I6RLSA1-6_011”, que tinha uma atividade de ligação a antígeno à IL-6 humana na ausência de ATP e adenosina, clone “HSADSA1-6_020”, que tinha atividade de ligação a antígeno à albumina de soro humano (HSA) na ausência de ATP e adenosina, bem como clones “6RRLSA1- 6_037” e “6RRLSA1-6_045”, que tinham uma atividade de ligação a an- tígeno a receptor de IL-6 humano na ausência de ATP e adenosina (Figs. 38, 39 e 45).

[001594] (16-3) Análise de sequência de anticorpos para os quais ade- nosina e ATP servem como um permutador

[001595] Genes foram amplificados usando primers específicos (SEQ ID NOs: 111 e 112) de clones que tinham sido avaliados ter atividade de ligação a antígeno na ausência de adenosina e ATP com base no resultado de ELISA de fago descrito em (16-2). As sequências de nu- cleotídeo dos genes foram analisadas. Com base no resultado da análise, as sequências de aminoácido são mostradas na Tabela 21 abaixo. Tabela 21

[001596] [Exemplo 17] Aquisição de anticorpos que se ligam a antíge- nos na presença de adenosina e ATP a partir da biblioteca de anticorpo usando técnica de exibição de fago multivalente

[001597] (17-1) Aquisição de anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas de biblioteca usando exibição multivalente

[001598] Exibição multivalente de anticorpos em fago foi usada para obter anticorpos que têm uma atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina e/ou ATP a partir da biblioteca de exibição de fago de anticorpos racionalmente projetados. Na obtenção de anticorpos a partir de uma biblioteca, a probabilidade de aquisição aumenta quando a razão da habilidade de ligação a antígeno entre na presença e na au-sência de moléculas pequenas é maior. Desta maneira, panning com base no aumento da habilidade de ligação aparente foi realizado para coletar eficientemente anticorpos com habilidade de ligação na presença de moléculas pequenas. Mais especificamente, a habilidade de ligação aparente foi aumentada através do efeito de avidez (efeito de ligação a antígeno multivalente) ao permitir que fagos exibam anticorpos de uma maneira multivalente. Primeiro, uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos racionalmente projetados foi contatada com antíge- nos biotinilados na presença de adenosina e ATP para coletar uma biblioteca de exibição de fago de anticorpos que se ligam aos antígenos na presença de adenosina e ATP. Então, de acordo com o método descrito em Rondot (Nat. Biotechnol. (2001) 19, 75-78), E. coli foi infectada com a biblioteca de anticorpos de exibição de fago coletada e então infectada com fagos auxiliares que são deficientes no gene codificando pIII para preparar uma biblioteca de anticorpos de exibição de fago multivalente onde anticorpos são apresentados em todas as pIIIs. A biblioteca de exibição de fago multivalente de anticorpos foi contatada com antígeno biotinilado-estreptavidina na presença de adenosina e ATP. Após a biblioteca ter sido coletada, os fagos foram eluídos das contas na ausência de adenosina e ATP e coletados no eluatos. Este ciclo de preparação de fago e panning foi realizado várias vezes para avaliar anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno apenas na presença de adenosina e/ou ATP.

[001599] E. coli contendo o fagemídeo de exibição de fago construído foram infectadas com fago auxiliar M13KO7 e culturadas de um dia para o outro a 30° C para produzir uma biblioteca de anticorpos de exibição de fago monovalente. Após produção de fago, NaCl 2,5 M/PEG 10% foi adicionado ao meio de cultura de E. coli para precipitar fagos. A fração de fago precipitado foi diluída com TBS para preparar uma solução de biblioteca de fago. Então, BSA foi adicionado em uma concentração final e 4% à solução de biblioteca de fago. Panning foi realizado usando contas magnéticas imobilizadas com antígeno. As contas magnéticas usadas foram contas revestidas com NeutrAvidin (revestidas com Sera- Mag SpeedBeads NeutrAvidin) e contas revestidas com Estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin).

[001600] A solução de biblioteca de fago foi contatada com um antí- geno, adenosina e ATP em temperatura ambiente por 60 minutos através da adição de 500 pmol de IgA humana marcada com biotina-Fc (SEQ ID NO: 99) como o antígeno, e uma concentração final de ATP - Na 1 mM e adenosina à solução de biblioteca de fago. Contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas à solução de biblioteca de fago, e o complexo antígeno-fago foi deixado se ligar às contas magnéticas em temperatura ambiente por 15 minutos. As contas foram lavadas uma vez com TBS dissolvida com ATP e adenosina. Então, 0,5 ml de uma solução de tripsina 1 mg/ml foi adicionado às contas. Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente por 15 minutos, uma solução de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. A solução de fago coletada foi adicio-nada a 10 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação suave a 37° C por uma hora para ser infectada por fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, fago auxiliar M13KO7 ou M13KO7ΔpIII (referido como hiperfago) (PROGEN Biotechnik) foi deixado infectar o meio de cultura da E. coli semeada, e os fagos foram coletados do sobrenadante da cultura incubada de um dia para o outro a 30° C para preparar uma biblioteca de anticorpo de exibição de fago monovalente ou uma solução de biblioteca de anticorpo de exibição de fago, respectivamente.

[001601] A primeira rodada de panning foi realizada para coletar fagos que são capazes de ligação a antígeno na presença de adenosina e ATP, enquanto as segunda e subsequentes rodadas de panning do panning foram realizadas para enriquecer fagos que são capazes de ligação a antígeno apenas na presença de adenosina e ATP. Especificamente, 250 pmol do antígeno marcado com biotina e uma concentração final de 1 mM de adenosina e ATP foram cada um adicionados à solução de biblioteca de fago preparada. Desta maneira, a biblioteca de fago foi contatada com o antígeno, adenosina e ATP em temperatura ambiente por 60 minutos. Contas magnéticas bloqueadas com BSA foram adicionadas e deixadas se ligar ao complexo fago-antígeno por 15 minutos em temperatura ambiente. As contas foram lavadas com 1 ml de TBST dissolvido com adenosina e ATP (daqui em diante referido como (ade- nosina+ATP)/TBST e com TBS dissolvido com adenosina e ATP (daqui em diante referido como (adenosina+ATP)/TBS). Então, o 0,5 ml de TBS foi adicionado às contas. Imediatamente após as contas terem sido suspensas em temperatura ambiente, uma solução de fago foi coletada das contas isoladas usando um suporte magnético. Após esse tratamento ser repetido, as duas soluções de fago separadamente eluídas foram combinadas. A proteína pIII (proteína pIII derivada de fago auxiliar) que não exibe Fab foi clivada do fago através da adição de 5 μl de 100 mg/ml de tripsina à solução de fago coletada para eliminar a habilidade de infecção de E. coli dos fagos que não exibem Fab. Os fagos coletados da solução de fago tripnizada foram adicionados a 100 ml de células de E. coli de linhagem ER2738 na fase de crescimento logarítmica (OD600=0,4 a 0,7). A E. coli foi incubada com agitação suave a 37° C por uma hora para ser infectada com fago. A E. coli infectada foi semeada em uma placa de 225 mm x 225 mm. Então, da mesma maneira que a usada na primeira rodada de panning, os fagos foram coletados do meio de cultura da E. coli semeada para obter uma biblioteca de anticorpo de exibição de fago monovalente e uma solução de biblioteca de anticorpo de exibição de fago multivalente. Panning foi realizado três vezes para obter anticorpos que têm atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina e ATP. Entretanto, nas terceira e subsequentes etapas de panning, o antígeno biotinilado foi usado a 40 pmol.

[001602] (17-2) Avaliação de atividade de ligação na presença de ade- nosina e/ou ATP através de ELISA de fago

[001603] Sobrenadantes de cultura contendo fagos foram coletados de acordo com um método convencional (Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145) de colônias únicas de E. coli obtidas através do método descrito acima. Os sobrenadantes de cultura coletados foram ultrafiltrados usando NucleoFast 96 (MACHERY-NAGEL). 100 μl dos sobrenadantes de cultura foram adicionados a cada cavidade de NucleoFast 96 e centrifugados (4500 g por 45 minutos) para remover fluxo. Após 100 μl de H2O terem sido adicionados, a NucleoFast 96 foi lavada através de centrifugação (4500 g por 30 minutos). Finalmente, 100 μl de TBS foram adicionados e a NucleoFast 96 foi deixada descansar por cinco minutos em temperatura ambiente. Uma solução de fago contida no sobrena- dante em cada cavidade foi coletada.

[001604] Fagos purificados, aos quais TBS ou (adenosina+ATP)/TBS foi adicionado, foram submetidos a ELISA através do procedimento que segue. Uma placa de microtitulação StreptaWell 96 (Roche) foi revestida de um dia para o outro com 100 μl de TBS contendo um antígeno marcado com biotina. Após o antígeno ser removido de cada cavidade da placa através de lavagem com TBST, as cavidades foram bloquea-das com 250 μl de leite desnatado 2%/TBS por uma hora ou mais. Leite desnatado 2%/TBS foi removido e então os fagos purificados, preparados, foram adicionados a cada cavidade. A placa foi deixada descansar por uma hora para permitir ligação de fagos de exibição de anticorpo ao antígeno em cada cavidade na presença ou ausência de adenosina e ATP. Após lavagem com TBST ou (adenosina+ATP)/TBST, um anticorpo anti-M13 conjugado a HRP (Amersham Pharmacia Biotech) diluído com TBS ou (adenosina+ATP)/TBS foi adicionado a cada cavidade. A placa foi incubada por uma hora. Seguindo lavagem com TBST ou (adenosina+ATP)/TBST, a solução única de TMB (ZYMED) foi adicionada a cada cavidade. A reação cromogênica na solução de cada cavidade foi terminada através da adição de ácido sulfúrico. Então, a cor desenvolvida foi avaliada através da medição de absorbância a 450 nm. O resultado mostra que um número maior de anticorpos que têm atividade de ligação na presença de moléculas pequenas foi obtido a partir da biblioteca de anticorpo de exibição de fago multivalente (Figs. 40 e 41). Essa constatação sugere que anticorpos que têm atividade de lgia- cao na presença de moléculas pequenas podem ser obtidos mais efici-entemente usando o método de biblioteca de anticorpo de exibição de fago multivalente. O resultado do ELISA de fago é mostrado na Tabela 22 abaixo.

[001605] (17-3) Avaliação da habilidade de ligação de anticorpos que usam adenosina e ATP como um permutador e análise subsequente Genes foram amplificados usando primers específicos (SEQ ID Nos: 111 e 112) de clones que tinham sido avaliados ter atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina e ATP com se no resultado de ELISA de fago descrito em (17-2). As sequências de nucleotídeo dos genes foram avaliadas. Como resultado, o clone “2IADL3C5-4_048 (cadeia pesada, SEQ ID NO: 100; cadeia leve, SEQ ID NO: 101)” que exibe atividade de ligação a antígeno na presença de adenosina e ATP foi obtida (figura 42). [001616] [Exemplo 18] Caracterização de anticorpos dependentes de ATP/adenosina obtidos de biblioteca [001617] (18-1) Preparação de anticorpos dependentes de ATP/ade- nosina obtidos da biblioteca [001618] Genes foram amplificados usando primers específicos de clones 6RAD2C1-4_001, 6RAD2C1-4_005, 6RAD2C1-4_011, 6RAD2C1-4_026, 6RAD2C1-4_030, 6RAD2C1-4_042, 6RAD2C1- 4_076, 6RDL3C1-4_085 e 6RDL3C5-4_011, que foram obtidos conforme descrito no Exemplo 10 e foram avaliados ter atividade de ligação com hIl-6R marcada com biotina na presença de ATP ou adenosina; e suas sequências de nucleotídeo foram analisadas (Tabela 23).

[001606] As regiões variáveis de 6RAD2C1-4_001, 6RAD2C1-4_005, 6RAD2C1-4_011, 6RAD2C1-4_026, 6RAD2C1-4_030, 6RAD2C1- 4_042, 6RAD2C1-4_076, 6RDL3C1-4_085 e 6RDL3C5-4_011 foram inseridas em plasmídeo de expressão animal para IgG1 humana/Kappa que tem a região constante de cadeia pesada de anticorpo de SEQ ID NO: 90 e a sequência de região constante kappa de cadeia leve de SEQ ID NO: 91. Anticorpos foram expressos usando o método descrito abaixo. FreeStyle 293 (Invitrogen) que foi derivada de células de rim fetal humanas foram suspensas em uma densidade de célula de 1,33 x 106 células/ml no FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen) e separadas em alíquotas a 3 ml em cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. O DNA de plasmídeo foi transfectado nas células através de lipofecção. Dos sobrenadantes de cultura após quatro dias de cultura em uma incubadora de CO2 (37° C, CO2 8%, 90 rpm), anticorpos foram purificados através de um método conhecido daqueles versados na téc-nica usando rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences). Absorbância das soluções de anticorpo purificado foi medida a 280 nm usando um espectrofotômetro. Dos valores obtidos através da medição, concentrações de anticorpos purificados foram calculadas usando um coeficiente de extinção determinado através do método PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).

[001607] (18-2) Avaliação do efeito de várias moléculas pequenas so bre ligação ao receptor de IL-6 humana através de ressonância de plasmon de superfície

[001608] Biacore T200 (GE Healthcare) foi usado para avaliar o efeito de várias moléculas pequenas sobre a reação de antígeno-anticorpo de IL-6R com 9 anticorpos dependentes de ATP/adenosina (6RAD2C1- 4_001, 6RAD2C1-4_005, 6RAD2C1-4_011, 6RAD2C1-4_026, 6RAD2C1-4_030, 6RAD2C1-4_042, 6RAD2C1-4_076, 6RDL3C1- 4_085 e 6RDL3C5-4_011) obtidos da biblioteca. O tampão de processamento foi usado: 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, 0,05% (p/v) de Tween 20, pH 7,4. O ensaio foi realizado a 25° C. IL-6R foi imobilizado em sensor chip CM5 através de acoplamento amina: e os anticorpos foram deixados interagir como analito por 120 segundos, e mudanças na quantidade de ligação foram observadas. Para diluição dos anticorpos, o tampão de processamento ou o tampão de processamento contendo qualquer um de ATP, ADP, AMP, cAMP e adenosina (ADO) foi usado. A concentração final de cada molécula pequena e a concentração final de cada anticorpo foi ajustada para 1 mM e 1 μM, respectivamente. Entretanto, sob a condição de ATP 1 mM, ensaio foi realizado com uma série de concentrações de anticorpo em etapa. A constante de dissociação KD (mol/L) de cada clone para IL-6R foi calculada a partir de um gráfico de valor de equilíbrio contra concentração de anticorpo. Os parâmetros foram calculados usando o Biacore T200 Evaluation Software (GE Healthcare). A constante de dissociação KD de cada clone na presença de ATP 1 mM é mostrada na Tabela 24.

[001609] A quantidade de cada clone que se liga à IL-6R conforme determinado através deste ensaio na presença ou ausência de moléculas pequenas 1 mM é mostrada na figura 43. Conforme mostrado na figura 43, cada clone se liga a IL-6R na presença de ATP 1 mM, mas sua ligação a IL-6R não era detectável na ausência de ATP. Isso de-monstra que cada clone tem a propriedade que ele se liga a IL-6R através de ATP como um permutador. Em moléculas pequenas além de ATP, ligação de todos os clones foi observada na presença de ADP, e alguns clones foram mostrados se ligar na presença de AMP e cAMP. Ligação de IL-6R não era detectável na presença de ADO.

[001610] Isso demonstra que anticorpos que se ligam a antígenos alvo na presença de qualquer um ou mais de ATP, ADP, AMP e cAMP podem ser obtidos usando bibliotecas racioalmente projetadas. Conforme descrito neste Exemplo, panning foi realizado na presença de ambos ATP e ADO que se ligam ao anticorpo ATNLSA1-4_D12 usado como uma referência no projeto das bibliotecas de projeto. O resultado mostrou que anticorpos que se ligam fortemente a antígenos alvo foram isolados na presença de ATP que se lgia fortemente a ATNLSA1-4_D12, mas não na presença de ADO que se liga mais fracamente a ATNLSA1- 4_D12 do que ATP. Anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente de uma molécula pequena desejada sozinha podem ser obtidos isolando anticorpos de ligação a antígeno através de contato dos antígenos com bibliotecas na presença das moléculas pequenas sozinhas. Por exemplo, anticorpos que se ligam na presença de ADO podem ser eficientemente obtidos de bibliotecas através da realização de panning na presença de ADO sozinho.

[001611] (18-3) Efeito de ATP sobre a atividade de ADCC de anticor pos obtidos

[001612] Os anticorpos 6RAD2C1-4_030 e 6RAD2C1-4_011 obtidos foram avaliados através do método descrito abaixo para testar se atividade de ADCC contra células expressando hIL-6R é mediada por uma ligação a hIL-6R dos anticorpos na presença de trifosfato de adenosina (ATP). Essa avaliação foi realizada usando 6RAD2C1-4_030 variante com atividade efetora aumentada (região variável de cadeia pesada de anticorpo, SEQ ID NO: 119; região variável de cadeia leve de anticorpo, SEQ ID NO: 120; região constante de cadeia pesada de anticorpo, SEQ ID NO: 90, região constante de cadeia leve de anticorpo, SEQ ID NO: 91) e 6RAD2C1-4_011 variante com atividade efetora aumentada (região variável de cadeia pesada de anticorpo, SEQ ID NO: 82; região variável de cadeia leve de anticorpo, SEQ ID NO: 83; região constante de cadeia pesada de anticorpo, SEQ ID NO: 90; região constante de cadeia leve de anticorpo, SEQ ID NO: 91) preparados conforme descrito no Exemplo 18-1, bem como anticorpo para IL-6R anti-humano conhecido MRA (região variável de cadeia pesada de anticorpo, SEQ ID NO: 92; região variável de cadeia leve de anticorpo, SEQ ID NO: 92; região constante de cadeia pesada de anticorpo, SEQ ID NO: 90; região constante de cadeia leve de anticorpo, SEQ ID NO: 91) preparada conforme descrito no Exemplo 15-5. Em várias concentrações de anticorpo na presença ou ausência de ATP, 6RAD2C1-4_030, 6RAD2C1-4_011 e MRA foram avaliados quanto à atividade de ADCC para células expressando hIL-6R de acordo com o método descrito no Exemplo de Referência 3. O resultado do ensaio é mostrado na figura 44.

[001613] O resultado do ensaio confirmou atividade de ADCC dependente da concentração de anticorpo por 6RAD2C1-4_030 e 6RAD2C1- 4_011 na presença de ATP. Esta constatação mostra que atividade de ADCC é induzida contra células expressando antígeno por ligação antí- geno-anticorpo mediada não apenas por quinurenina, mas também ATP; e então é revelado que para anticorpos que se ligam a antígenos na presença de moléculas pequenas como um permutador, sua função de atividade antitumor tal como atividade de ADCC pode ser também regulada pela presença de moléculas pequenas servindo como um per- mutador.

[001614] Esses resultados sugerem indução forte de atividade de ADCC contra células expressando hIL-6R é esperada em tecidos de tumor onde concentração de ATP é alta, e indução fraca de atividade de ADCC em tecidos normais onde concentração de ATP é baixa. Com base no acima, através da administração de anticorpos para os quais ATP serve como um permutador, a citotoxidez contra tecidos normais expressando um antígeno alvo pode ser reduzida sem prejudicar o efeito farmacêutico sobre tecidos de tumor expressando o antígeno alvo.

[001615] [Exemplo de Referência 1] Atividade de ADCC de anticorpos usando células mononucleares de sangue periférico humanas como células efetoras

[001616] Anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente de quinurenina foram avaliados quanto à sua atividade de ADCC contra células expressando antígeno em concentrações de anticorpo diferentes de acordo com o método descrito abaixo. Células mononucle- ares de sangue periférico humanas (daqui em diante referidas como PBMC humana) foram usadas como células efetoras para medir a atividade de ADCC de cada anticorpo de teste como segue.

[001617] (1) Preparação de solução de PBMC humana

[001618] Seringas pré-cheias com 200 μl de 1000 unidades/ml de solução de heparina (Novo-Heparin 5000 unidades para Injeção; Novo Nordisk) foram usadas para coletar 50 ml de sangue periférico de voluntário saudáveis (adulto sexo masculino) associado a Chugai Pharma-ceutical Co. Ltd. O sangue periférico foi diluído duas vezes com PBS(-), e dividido em quatro partes iguais, cada uma delas foi transferida para um tubo de separação de leucócito pré-centrifugado Leucosep (Greiner Bio-One) contendo 15 ml de Ficoll-Plaque PLUS. Os tubos de separação contendo uma alíquota do sangue periférico foram centrifugados a 2150 rpm por dez minutos em temperatura ambiente. Então, as frações de célula mononuclear resultantes foram coletadas dos tubos. As células em cada fração foram lavadas uma vez com RPMI-1640 (nacalai tesque) suplementado com FBS 10% (daqui em diante referido como FBS 10%/RMPI) e então suspenso em uma densidade celualr de 1 x 107 células/ml em FBS/RMPI 10%. As suspensões celulares foram usadas como a solução de PBMC humana em experimentos subsequentes.

[001619] (2) Preparação de células alvo

[001620] 0,74 MBq de Cr-51 foi adicionado a 3 x 106 células de BaF/hIL-6R (Mihara e outros (Int. Immunopharmacol. (2005) 5, 1731-40) que são células Ba/F3 expressando receptor IL-6 humano. Então, as células foram incubadas em incubadora de CO2 5% a 37° C por 1 hora. Após lavagem 3 vezes com FBS 10%/RPMI, as células foram suspensas em uma densidade celular de 2 x 105 células/ml em FBS 10%/RPMI. A suspensão celular foi usada como as células alvo em experimentos subsequentes.

[001621] (3) Preparação de solução de quinurenina

[001622] L-Quinurenina (Sigma) foi diluída para 5 mM com PBS(-), e então sua concentração foi ajustada para 400 μM usando FBS 10%/RPMI. A solução foi usada como a solução de quinurenina em experimentos subsequentes.

[001623] (4) Ensaio de liberação de cromo (ADCC)

[001624] Atividade de ADCC foi avaliada com base em taxa de eliminação de cromo específica determinada através do ensaio de liberação de cromo. Primeiro, soluções de anticorpo preparadas em várias concentrações (0, 0,04, 0,4, 4 e 40 μg/ml) foram adicionadas a 50 μl de cada cavidade em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. Então, as células alvo preparadas conforme descrito em (2) foram semeadas a 50 μl (1 x 104 células/cavidade) nas cavidades. Ainda, a solução de qui- nurenina preparada conforme descrito em (3) foi adicionada a 50 μl às cavidades e a placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por 15 minutos. Então, a solução de PBMC humana preparada conforme descrito em (1) foi adicionada a 50 μl a cada cavidade (5 x 105 células/cavidade). A placa foi deixada descansar em incubadora de CO2 5% a 37° C por 4 horas, seguido por centrifugação. 100 μl de sobrenadante de cultura de cada cavidade da placa foram medidos quanto à radioatividade usando um contador gama. A taxa de liberação de cromo específica foi determinada com base na equação abaixo: Taxa de liberação de cromo (%) = (A-C) x 100/(B-C)

[001625] Nesta equação, “A” representa radioatividade média (cpm) de 100 μl de sobrenadante de cultura em cada cavidade. “B” representa radioatividade média (cpm) de 100 μl de sobrenadante de cultura em uma cavidade contendo células alvo, 50 μl de solução aquosa de NP- 40 4% (Nonidet P-40; Nacalai Tesques) e 100 μl de FBS 10%/RPMI. Ainda, “C” representa radioatividade média (cpm) de 100 μl de sobrena- dante de cultura em uma cavidade contendo células alvo, 150 μl de FBS 10%/RPMI ou 100 μl de FBS 100%/RPMI e 50 μl de solução de quinu- renina. O teste foi realizado em duplicata. A taxa de liberação de cromo específica média (%) que reflete a atividade de ADC de cada anticorpo de teste foi calculada com base no ensaio descrito acima.

[001626] [Exemplo de Referência 2] Atividade de ADCC de cada anticorpo de teste usando células mononucleares de sangue periférico humanas como células efetoras Anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente de quinurenina foram avaliados quanto à sua atividade de ADCC contra células expressando antígeno em várias concentrações de quinurenina de acordo com o método descrito abaixo. Usando células mononuclea- res de sangue periférico humanas como células efetoras, a atividade de ADCC de cada anticorpo de teste foi avaliada como segue. Solução de PBMC humana e células alvo foram preparadas através do mesmo método que aquele descrito no Exemplo de Referência 1.

[001641] (1) Preparação de soluções de quinurenina

[001642] L-quinurenina (Sigma) foi diluída para 5 mM com PBS(-), e então sua concentração foi ajustada para 400, 133, 44, 14,8 e 4,9 μM usando FBS 10%/RPMI. As soluções foram usadas como soluções de quinurenina em experimentos subsequentes.

[001643] (2) Ensaio de liberação de cromo (ADCC)

[001644] Atividade de ADCC foi avaliada com base em taxa de liberação de cromo específica determinada através do ensaio de liberação de cromo. Primeiro, uma solução de anticorpo preparada para 200 μg/ml foi adicionada a 50 μl a cada cavidade de uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. Então, as células alvo preparadas conforme acima descrito foram semeadas a 50 μl (1 x 104 células/cavidade) para as cavidades. Ainda, a solução de quinurenina preparada em cada concentração conforme descrito em (1) foi adicionada a 50 μl às cavidades, e a placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por 15 minutos. Então, solução de PBMC humana preparada conforme descrito acima foi adicionada a 50 μl a cada cavidade (5 x 105 células/cavidade). A placa foi deixada descansar em incubadora de CO2 5% a 37° C por 4 horas, seguido por centrifugação. 100 μl de sobrenadante de cultura de cada cavidade da placa foram medidos quanto à radioatividade usando um contador gama. A taxa de liberação de cromo específica foi determinada com base na equação descrita no Exemplo de Referência 1.

[001645] [Exemplo de Referência 3] Atividade de ADCC de anticorpos de teste usando linhagem de célula NK humana NK92 como células efe- toras

[001627] Anticorpos que se ligam a antígenos de uma maneira dependente de ATP foram avaliados quanto à sua atividade de ADCC contra células apresentando antígeno em várias concentrações de anticorpo de acordo com o método descrito abaixo. A atividade de ADCC de cada anticorpo de teste foi ensaiada usando como células efetoras NK92- CD16(V) resultantes de expressão forçada de FcgRIIIa humano em linhagem de célula NK humana NK92 como segue.

[001628] (1) Preparação de NK92-CD16(V)

[001629] NK92-CD16(V) foi suspensa em uma densidade de célula de 1 x 107 células/ml em RMPI/FBS 10%. A suspensão de célula foi usada como uma solução de NK92-CD16(V) em experimentos subsequentes.

[001630] (2) Preparação de células alvo

[001631] 0,74 MBq de Cr-51 foi adicionado a 3 x 106 células de CHO/hIL-6R que são células CHO expressando receptor de IL-6 humana. Então, as células foram incubadas em incubadora de CO2 5% a 37° C por 1 hora. Após lavagem 3 vezes com FBS 10%/RPMI, as células foram suspensas em uma densidade de célula de 2 x 105 células/ml em FBS 10%/RPMI. A suspensão de célula foi usada como células alvo em experimentos subsequentes.

[001632] (3) Preparação de solução de ATP

[001633] ATP (Sigma) foi diluída em 100 mM com FBS 10%/RPMI, e então sua concentração foi ajustada para 4 mM. A solução foi usada como uma solução de ATP em experimentos subsequentes.

[001634] (4) Ensaio de liberação de cromo (ADCC)

[001635] Atividade de ADCC foi avaliada com base na taxa de liberação de cromo específica determinada através de ensaio de liberação de cromo. Primeiro, soluções de anticorpo preparadas para várias concentrações (0, 0,04, 0,4, 4 ou 40 μg/ml) foram cada uma adicionadas a 50 μl a uma cavidade de uma placa de fundo redondo de 96 cavidades. Então, as células alvo preparadas conforme descrito em (2) foram semeadas a 50 μl (1 x 104 células/cavidade) para as cavidades. Ainda, a solução de ATP preparada conforme descrito em (3) foi adicionada a 50 μl às cavidades, e a placa foi deixada descansar em temperatura ambiente por 15 minutos. Então, a solução de NK92-CD16(V) preparada conforme descrito em (1) foi adicionada a 50 μl a cada cavidade (5 x 105 células/cavidade). A placa foi deixada descansar em incubadora de CO2 5% a 37° C por 4 horas, seguido por centrifugação. 100 μl de sobrena- dante de cultura de cada cavidade da placa foram medidos quanto à radioatividade usando um contador gama. A taxa de liberação de cromo específica foi determinada com base na equação descrita no Exemplo de Referência 1.

Claims (32)

1. Método para produção de um anticorpo que compreende um domínio de ligação ao antígeno que compreende regiões variáveis de cadeias pesada e leve do anticorpo, cuja atividade de ligação ao an- tígeno na presença de um composto específico para o tecido alvo é maior do que a atividade de ligação ao antígeno na ausência do referido composto, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) determinar a atividade de ligação ao antígeno de um domínio de ligação ao antígeno na ausência do referido composto específico para o tecido alvo; (b) determinar a atividade de ligação ao antígeno do referido domínio de ligação ao antígeno na presença do referido composto es-pecífico para o tecido alvo; (c) selecionar um domínio de ligação ao antígeno que tem uma menor atividade de ligação ao antígeno na ausência do referido composto específico para o tecido alvo do que na presença do referido composto; (d) ligar um polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação ao antígeno selecionado em (c) a um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que contém uma região Fc; (e) cultivar células nas quais foi introduzido um vetor ao qual o polinucleotídeo obtido em (d) está operativamente ligado; e (f) coletar anticorpos a partir de um meio de cultura das células cultivadas em (e), em que o referido composto específico para o tecido alvo é adenosina, adenosina trifosfato, adenosina difosfato, adenosina mono- fosfato, inosina, quinurenina ou ácido succínico.

2. Método para triagem de um anticorpo que compreende um domínio de ligação ao antígeno que compreende regiões variáveis de cadeias pesada e leve do anticorpo, cujo domínio de ligação ao antígeno tem menor atividade de ligação ao antígeno na ausência de um composto específico para o tecido alvo do que na presença do referido composto, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: (a) determinar a atividade de ligação ao antígeno de um do mínio de ligação ao antígeno na ausência do referido composto específico para o tecido alvo; (b) determinar a atividade de ligação ao antígeno do referido domínio de ligação ao antígeno na presença do referido composto es-pecífico para o tecido alvo; e (c) selecionar um domínio de ligação ao antígeno que tem uma menor atividade de ligação ao antígeno na ausência do referido composto específico para o tecido alvo do que na presença do referido composto; em que o referido composto específico para o tecido alvo é adenosina, adenosina trifosfato, adenosina difosfato, adenosina mono- fosfato, inosina, quinurenina ou ácido succínico.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) a (c) compreendem: (a) contatar o referido domínio de ligação ao antígeno ou uma biblioteca de domínios de ligação ao antígeno com um antígeno na presença do referido composto específico para o tecido alvo; (b) colocar o referido domínio de ligação ao antígeno ou domínios de ligação ao antígeno que se ligam ao antígeno na etapa (a) na ausência do referido composto; e (c) isolar um domínio de ligação ao antígeno que foi dissociado na etapa (b).

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a referida atividade de ligação ao antígeno na presença do referido composto específico para o tecido alvo em relação à atividade de ligação ao antígeno na ausência do composto é duas vezes ou mais.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a proporção da constante de dissociação (KD) contra o referido antígeno na ausência do referido composto específico para o tecido alvo para a KD na presença do referido composto (KD (na ausência do referido composto)/KD (na presença do referido composto)) é 2 ou maior.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido antígeno é uma molécula tipo membrana.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo possui uma atividade neutralizante.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo possui atividade citotóxica.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) a região Fc é uma região Fc contida na região constante das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8, (b) a região Fc compreende uma região Fc de ligação a FcyR alterada que tem uma atividade de ligação ao receptor Fcy maior do que a atividade de ligação ao receptor Fcy de uma região Fc de IgG humana nativa, ou (c) a região Fc é modificada de modo que haja uma proporção maior de região Fc ligada por uma cadeia de açúcar deficiente em fucose em uma composição de cadeia de açúcar ligada na posição 297, de acordo com a numeração EU, da região Fc ou de modo que haja uma proporção maior da região Fc com uma N-acetilglucosamina bipartida adicionada.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9(b), caracterizado pelo fato de que pelo menos um ou mais aminoácidos seleciona-dos dentre o grupo que consiste em aminoácidos nas posições 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 254, 255, 256, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 311, 313, 315, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 339, 376, 377, 378, 379, 380, 382, 385, 392, 396, 421, 427, 428, 429, 434, 436 e 440 de acordo com a numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc de ligação ao FcyR alterada são diferentes dos aminoácidos da região Fc de IgG humana nativa.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados dentre o grupo que consiste em: Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 221; Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido na posição 222; Phe, Trp, Glu ou Lys para o aminoácido na posição 223; Phe, Trp, Glu ou Tyr para o aminoácido na posição 224; Glu, Lys ou Trp para o aminoácido na posição 225; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 227; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 228; Ala, Glu, Gly ou Tyr para o aminoácido na posição 230; Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 231; Glu, Gly, Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 232; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 233; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 234; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 235; Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 236; Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 237; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 238; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 239; Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido na posição 240; Asp, Glu, Leu, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 241; Leu, Glu, Leu, Gln, Arg, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 243; His para o aminoácido na posição 244; Ala para o aminoácido na posição 245; Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido na posição 246; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Thr, Val ou Tyr para o ami- noácido na posição 247; Glu, His, Gln ou Tyr para o aminoácido na posição 249; Glu ou Gln para o aminoácido na posição 250; Phe para o aminoácido na posição 251; Phe, Met ou Tyr para o aminoácido na posição 254; Glu, Leu ou Tyr para o aminoácido na posição 255; Ala, Met ou Pro para o aminoácido na posição 256; Asp, Glu, His, Ser ou Tyr para o aminoácido na posição 258; Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido na posição 260; Ala, Glu, Phe, Ile ou Thr para o aminoácido na posição 262; Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido na posição 263; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 264; Ala, Leu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 265; Ala, Ile, Met ou Thr para o aminoácido na posição 266; Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 267; Asp, Glu, Phe, Gly, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Trp para o aminoácido na posição 268; Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 269; Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 270; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 271; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 272; Phe ou Ile para o aminoácido na posição 273; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 274; Leu ou Trp para o aminoácido na posição 275; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 276; Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido na posição 278; Ala para o aminoácido na posição 279; Ala, Gly, His, Lys, Leu, Pro, Gln, Trp ou Tyr para o aminoá- cido na posição 280; Asp, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 281; Glu, Gly, Lys, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 282; Ala, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Arg ou Tyr para o ami- noácido na posição 283; Asp, Glu, Leu, Asn, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 284; Asp, Glu, Lys, Gln, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 285; Glu, Gly, Pro ou Tyr para o aminoácido na posição 286; Asn, Asp, Glu ou Tyr para o aminoácido na posição 288; Asp, Gly, His, Leu, Asn, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoá- cido na posição 290; Asp, Glu, Gly, His, Ile, Gln ou Thr para o aminoácido na posição 291; Ala, Asp, Glu, Pro, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 292; Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 293; Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 294; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 295; Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr ou Val para o aminoácido na posição 296; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 297; Ala, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 298; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 299; Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Trp para o aminoácido na posição 300; Asp, Glu, His ou Tyr para o aminoácido na posição 301; Ile para o aminoácido na posição 302; Asp, Gly ou Tyr para o aminoácido na posição 303; Asp, His, Leu, Asn ou Thr para o aminoácido na posição 304; Glu, Ile, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 305; Ala, Asp, Asn, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 311; Phe para o aminoácido na posição 313; Leu para o aminoácido na posição 315; Glu ou Gln para o aminoácido na posição 317; His, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Thr, Val ou Tyr para o aminoá- cido na posição 318; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 320; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Pro, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 322; Ile para o aminoácido na posição 323; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 324; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 325; Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 326; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 327; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 328; Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 329; Cys, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 330; Asp, Phe, His, Ile, Leu, Met, Gln, Arg, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 331; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 332; Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Pro, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 333; Ala, Glu, Phe, Ile, Leu, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 334; Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 335; Glu, Lys ou Tyr para o aminoácido na posição 336; Glu, His ou Asn para o aminoácido na posição 337; Asp, Phe, Gly, Ile, Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 339; Ala ou Val para o aminoácido na posição 376; Gly ou Lys para o aminoácido na posição 377; Asp para o aminoácido na posição 378; Asn para o aminoácido na posição 379; Ala, Asn ou Ser para o aminoácido na posição 380; Ala ou Ile para o aminoácido na posição 382; Glu para o aminoácido na posição 385; Thr para o aminoácido na posição 392; Leu para o aminoácido na posição 396; Lys para o aminoácido na posição 421; Asn para o aminoácido na posição 427; Phe ou Leu para o aminoácido na posição 428; Met para o aminoácido na posição 429; Trp para o aminoácido na posição 434; Ile para o aminoácido na posição 436; e Gly, His, Ile, Leu ou Tyr para o aminoácido na posição 440 de acordo com a numeração EU na sequência de aminoáci- dos da região Fc de ligação a FcyR alterada.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 9(b), 9(c), 10 e 11, caracterizado pelo fato de que a atividade de liga-ção a FcRn da região Fc sob uma condição de faixa de pH ácido é aumentada comparado com a atividade de ligação a FcRn da região Fc da SEQ ID NO: 5, 6, 7 ou 8.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc que tem uma substituição de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados dentre o grupo que consiste nos aminoácidos nas posições 238, 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442 e 447, de acordo com a numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc compre-endida na região constante das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a região Fc compreende pelo menos um ou mais ami- noácidos selecionados dentre o grupo que consiste em: Leu para o aminoácido na posição 238; Leu para o aminoácido na posição 244; Arg para o aminoácido na posição 245; Pro para o aminoácido na posição 249; Gln or Glu para o aminoácido na posição 250; Arg, Asp, Glu ou Leu para o aminoácido na posição 251; Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 252; Ser or Thr para o aminoácido na posição 254; Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido na posição 255; Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 256; Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido na posição 257; Asp para o aminoácido na posição 258; Ser para o aminoácido na posição 260; Leu para o aminoácido na posição 262; Lys para o aminoácido na posição 270; Leu ou Arg para o aminoácido na posição 272; Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 279; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 283; Asn para o aminoácido na posição 285; Phe para o aminoácido na posição 286; Asn or Pro para o aminoácido na posição 288; Val para o aminoácido na posição 293, Ala, Glu, Gln ou Met para o aminoácido na posição 307; Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val ou Trp para o aminoácido na posição 311; Pro para o aminoácido na posição 309; Ala, Asp ou Pro para o aminoácido na posição 312; Ala or Leu para o aminoácido na posição 314; Lys para o aminoácido na posição 316; Pro para o aminoácido na posição 317; Asn or Thr para o aminoácido na posição 318; Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido na posição 332; Asn, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 339; Pro para o aminoácido na posição 341; Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 343; Arg para o aminoácido na posição 375; Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido na posição 376; Lys para o aminoácido na posição 377; Asp, Asn ou Val para o aminoácido na posição 378; Ala, Asn, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 380; Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 382; Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 385; Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 386; Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 387; Asn, Pro ou Ser para o aminoácido na posição 389; Asn para o aminoácido na posição 423; Asn para o aminoácido na posição 427; Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 428; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 430; His or Asn para o aminoácido na posição 431; Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro ou Ser para o aminoácido na posição 433; Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met ou Thr para o aminoácido na posição 436; Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 438; Lys para o aminoácido na posição 440; Lys para o aminoácido na posição 442; e Ile, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 308; conforme indicado pela numeração EU na sequência de ami- noácidos da região Fc compreendida na região constante das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno multiespecífico ou multiparatópico.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que: (a) um antígeno ligado por pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno é uma molécula tipo membrana expressa em uma membrana de célula de câncer e um antígeno ligado por pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno é uma molécula tipo membrana expressa em uma membrana celular efetora, ou (b) um antígeno ligado por pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno é uma molécula tipo membrana expressa em uma membrana de célula de câncer e um antígeno ligado por pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno é uma substância citotóxica.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16(a), caracterizado pelo fato de que a célula efetora é uma célula NK, um macrófago ou uma célula T.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16(a) ou 17, caracterizado pelo fato de que a molécula tipo membrana expressa em uma membrana celular efetora é um polipeptídeo constituinte de TCR, CD2, CD3, CD28, CD44, CD16, CD32, CD64 ou NKG2D.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o antígeno é uma molécula solúvel.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo possui uma atividade neutralizante.

22. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) a região Fc é uma região Fc compreendida na região constante das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8, (b) a atividade de ligação a FcRn da região Fc sob uma condição de faixa de pH ácido é aumentada comparado com a atividade de ligação a FcRn da região Fc compreendida na região constante das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8, ou (c) a atividade de ligação a FcRn da região Fc sob uma condição de faixa de pH neutro é aumentada comparado com a atividade de ligação a FcRn da região Fc compreendida na região constante das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22(b), caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc que tem uma substituição de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados dentre o grupo que consiste nos aminoácidos nas posições 238, 244, 245, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 270, 272, 279, 283, 285, 286, 288, 293, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 316, 317, 318, 332, 339, 340, 341, 343, 356, 360, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 385, 386, 387, 388, 389, 400, 413, 415, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 438, 439, 440, 442 e 447, de acordo com a numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc compreendida na região constante das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a região Fc compreende pelo menos um ou mais ami- noácidos selecionados dentre o grupo que consiste em: Leu para o aminoácido na posição 238; Leu para o aminoácido na posição 244; Arg para o aminoácido na posição 245; Pro para o aminoácido na posição 249; Gln or Glu para o aminoácido na posição 250; Arg, Asp, Glu ou Leu para o aminoácido na posição 251; Phe, Ser, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 252; Ser or Thr para o aminoácido na posição 254; Arg, Gly, Ile ou Leu para o aminoácido na posição 255; Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 256; Ala, Ile, Met, Asn, Ser ou Val para o aminoácido na posição 257; Asp para o aminoácido na posição 258; Ser para o aminoácido na posição 260; Leu para o aminoácido na posição 262; Lys para o aminoácido na posição 270; Leu ou Arg para o aminoácido na posição 272; Ala, Asp, Gly, His, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 279; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 283; Asn para o aminoácido na posição 285; Phe para o aminoácido na posição 286; Asn or Pro para o aminoácido na posição 288; Val para o aminoácido na posição 293, Ala, Glu, Gln ou Met para o aminoácido na posição 307; Ala, Glu, Ile, Lys, Leu, Met, Ser, Val ou Trp para o aminoácido na posição 311; Pro para o aminoácido na posição 309; Ala, Asp ou Pro para o aminoácido na posição 312; Ala or Leu para o aminoácido na posição 314; Lys para o aminoácido na posição 316; Pro para o aminoácido na posição 317; Asn or Thr para o aminoácido na posição 318; Phe, His, Lys, Leu, Met, Arg, Ser ou Trp para o aminoácido na posição 332; Asn, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 339; Pro para o aminoácido na posição 341; Glu, His, Lys, Gln, Arg, Thr ou Tyr para o aminoácido na posição 343; Arg para o aminoácido na posição 375; Gly, Ile, Met, Pro, Thr ou Val para o aminoácido na posição 376; Lys para o aminoácido na posição 377; Asp, Asn ou Val para o aminoácido na posição 378; Ala, Asn, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 380; Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 382; Ala, Arg, Asp, Gly, His, Lys, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 385; Arg, Asp, Ile, Lys, Met, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 386; Ala, Arg, His, Pro, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 387; Asn, Pro ou Ser para o aminoácido na posição 389; Asn para o aminoácido na posição 423; Asn para o aminoácido na posição 427; Leu, Met, Phe, Ser ou Thr para o aminoácido na posição 428; Ala, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val ou Tyr para o aminoácido na posição 430; His or Asn para o aminoácido na posição 431; Arg, Gln, His, Ile, Lys, Pro ou Ser para o aminoácido na posição 433; Ala, Gly, His, Phe, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; Arg, Asn, His, Ile, Leu, Lys, Met ou Thr para o aminoácido na posição 436; Lys, Leu, Thr ou Trp para o aminoácido na posição 438; Lys para o aminoácido na posição 440; Lys para o aminoácido na posição 442; e Ile, Pro ou Thr para o aminoácido na posição 308; conforme indicado pela numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc compreendida na região constante das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8.

25. Método, de acordo com a reivindicação 22(c), caracterizado pelo fato de que a região Fc é uma região Fc que tem uma substituição de pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados dentre o grupo que consiste nos aminoácidos nas posições 237, 248, 250, 252, 254, 255, 256, 257, 258, 265, 286, 289, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 314, 315, 317, 332, 334, 360, 376, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 424, 428, 433, 434 e 436 de acordo com a numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc compreendida na região constante das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a região Fc compreende pelo menos um ou mais aminoácidos selecionados dentre o grupo que consiste em: Met for the amino acid at position 237; Ile for the amino acid at position 248; Ala, Phe, Ile, Met, Gln, Ser, Val, Trp, or Tyr for the amino acid at position 250; Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 252; Thr para o aminoácido na posição 254; Glu para o aminoácido na posição 255; Asp, Asn, Glu ou Gln para o aminoácido na posição 256; Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr ou Val para o aminoá- cido na posição 257; His para o aminoácido na posição 258; Ala para o aminoácido na posição 265; Ala or Glu para o aminoácido na posição 286; His para o aminoácido na posição 289; Ala para o aminoácido na posição 297; Ala para o aminoácido na posição 303; Ala para o aminoácido na posição 305; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 307; Ala, Phe, Ile, Leu, Met, Pro, Gln ou Thr para o aminoácido na posição 308; Ala, Asp, Glu, Pro ou Arg para o aminoácido na posição 309; Ala, His ou Ile para o aminoácido na posição 311; Ala or His para o aminoácido na posição 312; Lys or Arg para o aminoácido na posição 314; Ala, Asp ou His para o aminoácido na posição 315; Ala para o aminoácido na posição 317; Val para o aminoácido na posição 332; Leu para o aminoácido na posição 334; His para o aminoácido na posição 360; Ala para o aminoácido na posição 376; Ala para o aminoácido na posição 380; Ala para o aminoácido na posição 382; Ala para o aminoácido na posição 384; Asp or His para o aminoácido na posição 385; Pro para o aminoácido na posição 386; Glu para o aminoácido na posição 387; Ala or Ser para o aminoácido na posição 389; Ala para o aminoácido na posição 424; Ala, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Ser, Thr, Val, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 428; Lys para o aminoácido na posição 433; Ala, Phe, His, Ser, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 434; e His, Ile, Leu, Phe, Thr ou Val para o aminoácido na posição 436, conforme indicado pela numeração EU, na sequência de aminoácidos da região Fc das SEQ ID NOs: 5, 6, 7 ou 8.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21, 22(b) e 23 a 26, caracterizado pelo fato de que a região Fc apresenta uma atividade de ligação maior a um receptor Fcy inibitório do que a um receptor Fcy ativador.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o receptor Fcy inibitório é FcyRIIb humano.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o receptor Fcy ativador é FcyRIa humano, FcyRIIa humano (R), FcyRIIa humano (H), FcyRIIIa humano (V) ou FcyRIIIa humano (F).

30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 238 ou 328 (numeração EU) da região Fc inclui um aminoácido que é diferente do aminoácido da região Fc da IgG humana nativa.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 238 indicado pela numeração EU na região Fc é Asp ou o aminoácido na posição 328 é Glu.

32. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um ou mais aminoá- cidos selecionados a partir do grupo que consiste em: Asp para o aminoácido na posição 233; Trp or Tyr para o aminoácido na posição 234; Ala, Asp, Glu, Leu, Met, Phe, Trp ou Tyr para o aminoácido na posição 237; Asp para o aminoácido na posição 239; Ala, Gln ou Val para o aminoácido na posição 267; Asn, Asp ou Glu para o aminoácido na posição 268; Gly para o aminoácido na posição 271; Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Leu, Met, Ser ou Thr para o amino- ácido na posição 326; Arg, Lys ou Met para o aminoácido na posição 330; Ile, Leu ou Met para o aminoácido na posição 323; e Asp para o aminoácido na posição 296, de acordo com a numeração EU, na sequência de aminoáci- dos da região Fc.