PT2208784E

PT2208784E - Inibidores da proliferação celular contendo um anticorpo anti-glipicano 3

Info

Publication number: PT2208784E
Application number: PT100033786T
Authority: PT
Inventors: Hiroyuki Aburatani; Tetsuo Nakamura; Masayuki Tsuchiya
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2002-06-21
Publication date: 2013-04-03
Also published as: EP1411118A4; AU2007201255B2; EP1780273A1; DK2208784T3; HK1079547A1; CN1688692A; PT1411118E; DK1411118T3; US20070172488A1; AU2007201255A1; EP1780273B1; JP2005225892A; HK1120522A1; WO2003000883A1; CA2451493A1; ES2353335T3; JP2008120828A; JP2007238632A; US8263077B2; JP4347402B2

Description

ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Inibidores da proliferação celular contendo um anticorpo anti-glipicano 3"

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a um inibidor do crescimento celular contendo um anticorpo anti-glipicano 3 como ingrediente activo.

ANTECEDENTES DO INVENTO A família de glipicanos tem sido referida como sendo uma nova família de proteoglicanos de sulfato de heparano que estão presentes à superfície das células. Até ao momento, foram referidos 5 tipos de glipicanos (glipicano 1, glipicano 2, glipicano 3, glipicano 4 e glipicano 5) como membros da família de glipicanos. Estes membros da família possuem proteínas centrais de tamanho uniforme (aproximadamente 60 kDa), partilham sequências de cisteínas específicas e bem conservadas e ligam-se às membranas celulares por meio de âncoras de glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) .

Um gene Daily (de "division abnormally delayed"; divisão anormalmente atrasada) foi identificado através do rastreio dos genes de uma variante de Drosophila melanogaster que apresenta um padrão de divisão celular anómala no desenvolvimento do sistema nervoso central. Sabe-se que o ADNc de Daily representa um quadro de leitura aberto (ORF de "open reading frame") que codifica um produto com uma sequência que apresenta homologia (24 a 26% de homologia) com um proteoglicano integral de membrana (GRIP) de um vertebrado que contém todas as características de um glipicano. Foi sugerido que o gene dally desempenha um papel na regulação do mecanismo do receptor dpp (decapentaplegia). Este facto sugere que o glipicano de um mamífero poderá regular a transdução de sinal entre TGF e BMP. Especificamente, foi sugerido que o glipicano poderá funcionar como um receptor comum para alguns dos factores de crescimento ligados à heparina (por exemplo, EGF, PDGF, BMP2 e FGF). 2 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ Ο glipicano 3 foi isolado como um transcrito sob regulação do desenvolvimento no intestino do rato (Filmus, J., Church, J.G. & Buick, R.n. (1988) Mol. Cell Biol. 8, 4243-4249) e depois foi identificado como OCT-5, um proteoglicano de sulfato de heparano ligado a GPI da família de glipicanos, que possui uma proteína central com um peso molecular de 69 kDa (Filmus, J., Shi, W., Wong, Z.-M. & Wong, M.J. (1995) Biochem. J. 311, 561-565). Também nos seres humanos, um gene que codifica o glipicano 3 foi isolado como MXR-7 a partir de uma linha de células humanas de cancro gástrico (Hermann Lage et al., Gene 188 (1997) 151-156). Foi referido que o glipicano 3 forma um complexo proteína-proteína com um factor de crescimento 2 do tipo insulina para regular a acção do factor de crescimento (Pilia, G. et al, (1996) Nat. Genet. 12, 241-247). Esta comunicação sugere que o glipicano 3 nem sempre interage com factores de crescimento que possuem a cadeia de sulfato de heparano.

Uma comunicação sugeriu que o glipicano 3 poderá ser utilizado como um marcador do cancro hepático (Hey-Chi Hsu et al., CÂNCER RESEARCH 57, 5179-5184 (1997)). Contudo, não existe qualquer resultado que indique uma relação clara entre o glipicano 3 e a proliferação das células de carcinomas.

Além disso, também foi sugerido que o glipicano poderá funcionar como um receptor para a endostatina, actuando eventualmente como um inibidor da vascularização (Molecular Cell (2001), 7, 811-822). Contudo, a relação entre esta função e a proliferação celular também não foi elucidada.

Como descrito acima, foi sugerido o envolvimento do glipicano 3 na proliferação celular. Contudo, o mecanismo de proliferação celular e mecanismos similares são desconhecidos, e a aplicação do glipicano 3 para a regulação da proliferação celular nunca foi tentada.

SUMÁRIO DO INVENTO

Um objectivo do presente invento consiste em disponibilizar um inibidor do crescimento celular contendo um anticorpo anti-glipicano 3 como ingrediente activo. 3 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

Em resultado de estudos intensivos, completámos o presente invento constatando que o anticorpo anti-glipicano 3 exerce uma actividade de inibição da proliferação celular por meio de uma actividade ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos) e de uma actividade CDC (citotoxicidade dependente de complemento). Além disso, é também previsto que os anticorpos anti-glipicano 3 exerçam uma actividade de inibição da proliferação celular através da inibição da acção de um factor de crescimento.

Adicionalmente, os anticorpos anti-glipicano 3 também podem exercer uma actividade de inibição da proliferação celular por meio da ligação a substâncias citotóxicas, como seja um isótopo radioactivo, um agente quimioterapêutico ou uma toxina derivada de bactérias. 0 presente invento é da forma que se segue: (1) Um anticorpo anti-glipicano 3 para utilização no tratamento de cancro seleccionado do grupo que consiste em cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro da mama, cancro da próstata, leucemia, linfoma e cancro pancreático. (2) Um anticorpo de acordo com (1) em que o cancro é cancro do pulmão. (3) Um anticorpo de acordo com (1) ou (2) em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. (4) Um anticorpo de acordo com (1) a (3), em que o anticorpo tem uma actividade citotóxica. (5) Um anticorpo de acordo com (4) em que a actividade citotóxica é citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). (6) Um anticorpo de acordo com (4) em que a actividade citotóxica é citotoxicidade dependente do complemento (CDC). (7) Utilização de um anticorpo anti-glipicano 3 no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento de cancro seleccionado do grupo que consiste em cancro do pulmão, 4 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ cancro do cólon, cancro da mama, cancro da próstata, leucemia, linfoma e cancro pancreático.

No invento, o anticorpo anti-glipicano 3 poderá actuar como um inibidor do crescimento celular. O anticorpo anti-glipicano 3 poderá ter actividade citotóxica. A actividade citotóxica poderá ser uma actividade citotóxica mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) ou uma actividade citotóxica dependente de complemento (CDC). 0 anticorpo anti-glipicano 3 poderá actuar como um inibidor do crescimento celular de qualquer um de (1) a (3), em que as células são células de carcinomas. As células poderão ser seleccionadas entre o grupo que consiste em células de células do cancro do pulmão, células do cancro do cólon, células do cancro da mama, células do cancro da próstata, células da leucemia, células de linfoma e células do cancro pancreático.

Numa concretização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Noutra concretização, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. O presente invento será descrito em pormenor abaixo.

Os exemplos de anticorpo anti-glipicano 3 do presente invento incluem um anticorpo conhecido, como seja um anticorpo humanizado, um anticorpo humano (WO 96/33735), um anticorpo quimérico (Publicação de patente JP (Kokai) N.° 4-228089 A (1992)) ou um anticorpo murino, assim como os anticorpos no presente invento. Além disso, o anticorpo poderá ser um anticorpo policlonal e é preferencialmente um anticorpo monoclonal. O anticorpo anti-glipicano 3 utilizado no presente invento poderá ter qualquer origem, poderá ser de qualquer tipo (monoclonal ou policlonal) e poderá encontrar-se sob qualquer forma, desde que seja capaz de inibir a proliferação celular. 5 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ 1. Anticorpo anti-glipicano 3 0 anticorpo anti-glipicano 3 utilizado no presente invento pode ser obtido através de um meio conhecido como um anticorpo policlonal ou monoclonal. Um anticorpo anti-glipicano 3 particularmente preferido utilizado no presente invento é um anticorpo monoclonal derivado de um mamífero. Os exemplos do anticorpo monoclonal derivado de um mamífero incluem um anticorpo produzido por um hibridoma e um anticorpo produzido por um hospedeiro transformado com um vector de expressão que contém o gene do anticorpo, utilizando técnicas de engenharia genética. Este anticorpo liga-se ao glipicano 3 de forma a inibir a proliferação celular.

Um exemplo de um anticorpo deste tipo é um anticorpo monoclonal produzido por um clone do hibridoma do presente invento. 2. Hibridoma produtor de anticorpos

Um hibridoma produtor de anticorpos monoclonais pode ser preparado utilizando técnicas conhecidas da forma que se segue. Isto é, o hibridoma pode ser preparado efectuando a imunização com o glipicano 3 na qualidade de imunogénio de acordo com um método de imunização Standard, provocando a fusão dos imunócitos obtidos desta forma com células parentais conhecidas por meio de um método de fusão celular Standard e, em seguida, efectuando o rastreio quanto a células produtoras de anticorpos monoclonais através de um método de rastreio Standard.

Especificamente, os anticorpos monoclonais podem ser preparados da seguinte forma. O glipicano 3 humano que será utilizado como imunogénio para conseguir anticorpos é primeiro obtido através de expressão do gene do glipicano 3 (MXR7) (sequência de aminoácidos) como descrito por Lage, H. et al (Gene 188 (1997), 151-156). Especificamente, a sequência génica que codifica o glipicano 3 é inserida num sistema vector de expressão conhecido, transforma-se uma célula hospedeira apropriada e, em seguida, a proteína glipicano 3 humana 6 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ visada é purificada por um método conhecido a partir das células do hospedeiro ou do sobrenadante da cultura.

Em seguida, esta proteína glipicano 3 purificada é utilizada como imunogénio. Em alternativa, o péptido parcial do glipicano 3 pode ser utilizado como antigénio de sensibilização. Nessa altura, o péptido parcial pode ser obtido por síntese química a partir da sequência de aminoácidos do glipicano 3 humano. 0 anticorpo anti-glipicano 3 inibe a actividade de proliferação celular com a acção ADCC, a acção CDC e a actividade de um factor de crescimento. Além disso, o anticorpo anti-glipicano 3 também pode inibir a proliferação celular através da ligação a uma substância citotóxica, como seja um radioisótopo, um agente quimioterapêutico ou uma toxina derivada de bactérias. Por este motivo, no presente invento, um epítopo numa molécula de glipicano 3 que é reconhecido pelo anticorpo anti-glipicano 3 não está limitado a um epítopo particular. 0 anticorpo anti-glipicano 3 poderá reconhecer qualquer epítopo desde que o epítopo esteja presente numa molécula de glipicano 3. Por conseguinte, para preparar o anticorpo anti-glipicano 3 do presente invento, é possível utilizar qualquer fragmento como antigénio desde que ele contenha o epítopo numa molécula de glipicano 3. 0 mamífero que será imunizado com um imunogénio não está especificamente limitado e é preferencialmente seleccionado considerando a compatibilidade com uma célula parental em termos de utilização numa fusão celular. Por exemplo, são geralmente utilizados roedores, como os ratinhos, os ratos, os hamsters ou os coelhos, ou macacos.

Os animais são imunizados com um imunogénio de acordo com um método conhecido. Por exemplo, a imunização é efectuada através de um método geral, em que um mamífero é injectado intraperitonealmente ou subcutaneamente com um imunogénio. Especificamente, um imunogénio é diluído ou suspenso num volume apropriado de PBS (solução salina tamponada com fosfato), de solução salina fisiológica ou similar, mistura-se um volume apropriado de um adjuvante comum, como seja o adjuvante completo de Freund, com o 7 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ produto se necessário, procede-se à emulsão e, em seguida, a solução é administrada várias vezes aos mamíferos a cada 4 a 21 dias. Adicionalmente, um veículo adequado também pode ser utilizado na imunização com um imunogénio.

Os mamíferos são imunizados como descrito acima e depois confirma-se a presença de um título acrescido do anticorpo desejado no soro. Subsequentemente, recolhem-se os imunócitos dos mamíferos, que são depois submetidos a fusão celular. Um imunócito preferido é, em particular, um esplenócito.

Como célula associada que será fundida com o imunócito descrito acima, utiliza-se uma célula de mieloma de mamífero. Os exemplos de linhas celulares de células de mieloma que são preferencialmente aqui utilizadas incluem várias linhas celulares conhecidas como P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. & Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270) , FO (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S19 4 (Trowbridge, I.S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) e R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133). A fusão celular dos imunócitos acima descritos com as células de mieloma pode ser efectuada de acordo com um método conhecido, por exemplo, o método de Kohler e Milstein et al (Kohler, G. & Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) .

Mais especificamente, a fusão celular acima referida é realizada numa solução de cultura de nutrição Standard na presença, por exemplo, de um acelerador da fusão celular. Como acelerador da fusão celular, utiliza-se, por exemplo, o polietilenoglicol (PEG), o vírus hemaglutinante do Japão (HJV) ou uma espécie idêntica. Se desejado, um adjuvante como o dimetilsulfóxido também pode ser utilizado, via adição, para melhorar adicionalmente a eficiência da fusão. É possível definir qualquer razão de imunócitos para células de mieloma para utilização neste invento. Por 8 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ exemplo, é preferível que o número de imunócitos seja 1 a 10 vezes superior ao número de células de mieloma. Como solução de cultura que será utilizada para a fusão celular acima referida, é possível utilizar, por exemplo, uma solução de cultura RPMI 1640 ou uma solução de cultura MEM, que são apropriadas para o crescimento da linha de células de mieloma acima referida, ou outras soluções de cultura Standard que são utilizadas para este tipo de cultura celular. Além disso, um fluido sérico, como seja o soro fetal de vitelo (FCS), pode ser utilizado em combinação. A fusão celular é efectuada por mistura de determinadas quantidades dos imunócitos e das células de mieloma acima referidos na solução de cultura acima mencionada, adição de uma solução de PEG (por exemplo, com um peso molecular médio de aproximadamente 1000 a 6000) (uma concentração qeral de 30 a 60% (p/v) ) pré-aquecida a cerca de 37°C e, em sequida, mistura da solução, de modo a formar as células fundidas visadas (hibridomas). Subsequentemente, adiciona-se consecutivamente uma solução de cultura apropriada e repete-se uma etapa de remoção do sobrenadante por centrifugação, para que os reagentes utilizados na fusão celular ou similares, que são desfavoráveis para o crescimento dos hibridomas, sejam removidos.

Os hibridomas assim obtidos são seleccionados através de cultura numa solução de cultura selectiva Standard, como seja uma solução de cultura HAT (uma solução de cultura contendo hipoxantina, aminopterina e timidina). O crescimento na solução de cultura HAT acima referida é prosseguido durante um período de tempo suficiente para que as células (células não fundidas) diferentes dos hibridomas visados morram (normalmente, vários dias a várias semanas). Em seguida, procede-se a um método de diluição limitante Standard, para que o rastreio e a monoclonagem dos hibridomas que produzem o anticorpo-alvo sejam realizados.

Além de um método por meio do qual se obtêm os hibridomas acima descritos através da imunização de animais não humanos com antigénios, também é possível obter anticorpos humanos desejados possuindo uma actividade de ligação ao glipicano 3 (ver Publicação de patente japonesa 9 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ (Kokoku) Ν.° 1-59878 Β (1989)) por meio da sensibilização in vitro de linfócitos humanos com glipicano 3 e da fusão dos linfócitos sensibilizados com células de mieloma derivadas de um ser humano que possuem um potencial de divisão permanente. Além disso, o glipicano 3 é administrado como antigénio a um animal transgénico que possui todos os repertórios do gene de um anticorpo humano para obter células produtoras de anticorpos anti-glipicano 3 e, em seguida, obtêm-se anticorpos humanos para o glipicano 3 a partir das células imortalizadas produtoras de anticorpos anti-glipicano 3 (ver Publicação de patente internacional N.os 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918 e WO 94/02602).

Os hibridomas assim preparados, que produzem anticorpos monoclonais, podem ser submetidos a subcultura numa solução de cultura Standard ou podem ser armazenados por um periodo longo em azoto liquido.

Um exemplo de um método utilizado para obter anticorpos monoclonais a partir dos hibridomas envolve o crescimento dos hibridomas e a obtenção dos anticorpos monoclonais no sobrenadante de cultura, de acordo com um método Standard. Outro método envolve a administração dos hibridomas a mamíferos compatíveis, de forma a originar a sua proliferação, e a obtenção dos anticorpos monoclonais na ascite. 0 primeiro método é adequado para obter anticorpos de elevada pureza. 0 último método, por outro lado, é apropriado para a produção em massa de anticorpos. 3. Anticorpo recombinante

Um anticorpo monoclonal que pode ser utilizado no presente invento é um anticorpo monoclonal recombinante, o qual é preparado por clonagem do gene do anticorpo proveniente do hibridoma, incorporação do gene num vector apropriado, introdução do vector num hospedeiro e depois produção dos anticorpos monoclonais recombinantes pelo hospedeiro por meio de técnicas de engenharia genética (ver, por exemplo, Vandamme, A.M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990) . Especificamente, o ARNm que codifica a região variável (V) de um anticorpo anti-glipicano 3 é isolado de um hibridoma que produz o anticorpo anti-glipicano 10 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ 3. Ο ARNm é isolado por um método conhecido, como seja o método de guanidina/ultracentrifugação (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) ou o método AGPC (Chomczynski, P et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), preparando-se, assim, o ARN total. 0 ARNm alvo é depois preparado utilizando um kit de purificação de ARNm (Pharmacia) ou similar. Adicionalmente, o ARNm também pode ser preparado directamente utilizando um kit de purificação de ARNm QuickPrep (Pharmacia). 0 ADNc da região V do anticorpo é sintetizado a partir do ARNm obtido desta forma, utilizando a transcriptase inversa. 0 ADNc é sintetizado utilizando um kit de síntese de ADNc de primeira cadeia com recurso a transcriptase inversa de AMV ("AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit" - SEIKAGAKU CORPORATION) ou similar. Adicionalmente, para sintetizar e amplificar o ADNc, é possível empregar, por exemplo, um kit "5'-Ampli FINDER RACE" (Clontech) e o método 5'-RACE com recurso a PCR (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) .

Um fragmento de ADN alvo é purificado a partir do produto de PCR obtido e depois é ligado a um ADN vector. Um vector recombinante é preparado a partir do produto e, em seguida, o vector é introduzido em Escherichia coli ou num hospedeiro similar, consecutivamente, e as colónias são seleccionadas, preparando-se, desta forma, um vector recombinante desejado. A sequência nucleotídica do ADN alvo é depois confirmada por um método conhecido, como seja o método de terminação da cadeia.

Após a obtenção de um ADN que codifica a região V do anticorpo anti-glipicano 3 visado, este ADN é incorporado num vector de expressão contendo um ADN que codifica a região constante (região C) do anticorpo pretendido.

Para produzir os anticorpos anti-glipicano 3 utilizados no presente invento, o gene do anticorpo é incorporado num vector de expressão, de maneira que o gene seja expresso sob regulação da região de controlo da expressão génica que 11 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ inclui, por exemplo, um amplificador e um promotor. Em seguida, uma célula hospedeira é transformada com o vector de expressão, fazendo com que o hospedeiro expresse o anticorpo. O gene do anticorpo pode ser expresso por incorporação de um ADN que codifica a cadeia pesada (cadeia H) do anticorpo e de um ADN que codifica a cadeia leve (cadeia L) do anticorpo separadamente em vectores de expressão, seguida da transformação simultânea de uma célula hospedeira com os vectores; ou por incorporação dos ADN que codificam a cadeia H e a cadeia L num único vector de expressão, seguida de transformação de uma célula hospedeira com o vector (ver WO 94/11523).

Além da célula hospedeira acima referida, também é possivel utilizar um animal transgénico para produzir um anticorpo recombinante. Por exemplo, um gene do anticorpo é inserido num gene que codifica uma proteína (por exemplo, a β-caseína de cabra) produzida unicamente no leite, sendo, assim, preparado como um gene fundido. Um fragmento de ADN contendo o gene fundido no qual o gene do anticorpo foi inserido é injectado num embrião de cabra e depois este embrião é introduzido numa cabra fêmea. Os anticorpos pretendidos podem ser obtidos a partir do leite produzido pela cabra transgénica ou pela descendência da cabra que aceitou o embrião. Além disso, para aumentar o volume de leite contendo o anticorpo desejado que é produzido pela cabra transgénica, é possível administrar hormonas à cabra transgénica (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702). 4. Anticorpo alterado

No presente invento, além do anticorpo mencionado acima, é possível utilizar anticorpos recombinantes provenientes de genes alterados artificialmente, como sejam os anticorpos quiméricos ou os anticorpos humanizados, para, por exemplo, reduzir a hetero-antigenicidade contra um ser humano. Estes anticorpos alterados podem ser produzidos utilizando um método conhecido. 12 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

Os anticorpos quiméricos podem ser obtidos por meio da ligação do ADN que codifica a região V do anticorpo acima a um ADN que codifica a região C de um anticorpo humano, incorporação do produto num vector de expressão e depois introdução do vector num hospedeiro para que o hospedeiro produza os anticorpos. Utilizando este método conhecido, é possível obter anticorpos quiméricos úteis no presente invento.

Os anticorpos humanizados, que também são designados por anticorpos humanos remodelados, são preparados através do enxerto da região CDR (região determinante de complementaridade) de um anticorpo de um mamífero diferente de um ser humano, como seja um ratinho, na região CDR de um anticorpo humano. A técnica de recombinação génica geral para realizar isto também é conhecida (ver Publicação do pedido de patente europeia N.° EP 125023 e WO 96/02576) .

Especificamente, a sequência de ADN é sintetizada pelo método de PCR, utilizando como iniciadores vários oligonucleótidos que foram preparados de forma a possuir uma parte que se sobrepõe às regiões terminais não só da região CDR do anticorpo de ratinho como também da região de estrutura (FR de "framework region") de um anticorpo humano (ver o método como descrito em WO 98/13388). A região de estrutura ligada à região CDR que possui um bom sítio de ligação ao antigénio é seleccionada. Os aminoácidos na região de estrutura da região variável do anticorpo poderão ser substituídos conforme necessário, de modo que a região CDR de um anticorpo humano remodelado forme um sítio de ligação ao antigénio apropriado (Sato, K. et al., Câncer Res. (1993) 53, 851-856).

As regiões de um anticorpo humano são utilizadas para as regiões C de um anticorpo quimérico e de um anticorpo humanizado. Por exemplo, para a cadeia H, é possível utilizar cyl, cy2, cy3 ou Cy4C e, para a cadeia L, CK ou CÀ. Além disso, para melhorar a estabilidade dos anticorpos ou a sua produção, a região C do anticorpo humano poderá ser modificada. 13 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

Um anticorpo quimérico consiste na região variável de um anticorpo derivado de um mamifero diferente de um ser humano e numa região constante derivada de um anticorpo humano. Entretanto, um anticorpo humanizado consiste na região CDR de um anticorpo derivado de um mamifero diferente de um ser humano e na região de estrutura e na região C derivadas de um anticorpo humano. Como a antigenicidade do anticorpo humanizado é concebida para ser baixa no corpo humano, ele é útil como ingrediente activo de um agente terapêutico do presente invento. 5. Anticorpo modificado

Desde que se ligue ao glipicano 3 e suprima a proliferação celular, o anticorpo utilizado no presente invento não está limitado à molécula completa e poderá ser um fragmento do anticorpo ou o seu produto modificado. Um anticorpo bivalente e um anticorpo monovalente estão ambos incluídos. Os exemplos de fragmentos do anticorpo incluem os fragmentos Fab, F(ab')2, Fv, Fab/c possuindo um fragmento Fab e um fragmento Fc completo e um fragmento Fv de cadeia simples (scFv) , em que o fragmento Fv da cadeia H ou da cadeia L está ligado com um adaptador apropriado. Especificamente, um fragmento do anticorpo é sintetizado por tratamento do anticorpo com uma enzima, como a papaína ou a pepsina, ou então os genes que codificam estes fragmentos do anticorpo são construídos, depois são introduzidos em vectores de expressão e, em seguida, os genes são expressos por células hospedeiras apropriadas (ver, por exemplo, Co., M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A.H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; e Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137). 0 fragmento scFv é obtido por ligação da região V da cadeia H e da região V da cadeia L dos anticorpos. No fragmento scFv, a região V da cadeia H e a região V da cadeia L estão unidas via um adaptador ou, de preferência, um adaptador peptídico (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. 14 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

Sei. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). A região V da cadeia H e a região V da cadeia L no fragmento scFv poderão ser derivadas de qualquer um dos anticorpos descritos neste fasciculo. Como adaptador peptídico para unir as regiões V, utiliza-se, por exemplo, qualquer péptido de cadeia simples compreendendo 12 a 19 resíduos de aminoácidos.

Um ADN que codifica um fragmento scFv pode ser obtido da forma que se segue. A amplificação é efectuada pelo método de PCR, utilizando como modelos o ADN total ou porções do ADN que codificam as sequências de aminoácidos desejadas (um ADN que codifica a cadeia H ou a região V da cadeia H do anticorpo acima, e um ADN que codifica a cadeia L ou a região V da cadeia L) e utilizando um par de iniciadores que especifica ambas as extremidades. A amplificação é depois adicionalmente efectuada através da utilização combinada de um ADN que codifica uma porção do adaptador peptídico e de um par de iniciadores que especifica que ambas as extremidades se liguem, respectivamente, à cadeia H e à cadeia L.

Adicionalmente, uma vez preparado um ADN que codifica um fragmento scFv, é possível obter vectores de expressão contendo os ADN, assim como hospedeiros transformados com os vectores de expressão de acordo com o método Standard. Além disso, por utilização do hospedeiro, um fragmento scFv pode ser obtido de acordo com o método Standard.

Estes fragmentos do anticorpo podem ser produzidos utilizando hospedeiros, por meio da obtenção dos seus genes de uma forma similar ao método acima e depois provocando a expressão dos genes. 0 "anticorpo" no presente invento também engloba estes fragmentos do anticorpo.

Como anticorpo modificado, é possível utilizar anticorpos anti-glipicano ligados a polietilenoglicol (PEG) ou a uma de várias moléculas, como seja uma substância citotóxica. O "anticorpo" no presente invento também engloba estes anticorpos modificados. Este anticorpo modificado pode ser obtido modificando quimicamente o anticorpo obtido. Adicionalmente, um método de modificação de anticorpos já foi estabelecido na arte. 15 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

Além disso, ο anticorpo utilizado no presente invento poderá ser um anticorpo biespecifico. 0 anticorpo biespecifico poderá ter sítios de ligação ao antigénio que reconhecem um epítopo diferente numa molécula de glipicano 3. Em alternativa, um sítio de ligação ao antigénio poderá reconhecer o glipicano 3 e o outro sitio de ligação ao antigénio poderá reconhecer uma substância citotóxica, como seja um agente quimioterapêutico, uma toxina derivada das células, uma substância radioactiva ou uma espécie similar. Neste caso, permite-se que a substância citotóxica actue directamente sobre uma célula que expressa o glipicano 3 para danificar especificamente células tumorais, de modo que a proliferação das células tumorais possa ser suprimida. Um anticorpo biespecifico pode ser preparado por união dos pares H-L de dois tipos de anticorpos, bem como pode ser obtido por fusão de hibridomas produtores de diferentes anticorpos monoclonais para preparar células fundidas que produzem anticorpos biespecificos. Adicionalmente, um anticorpo biespecifico também pode ser preparado por técnicas de engenharia genética. 6. Expressão e produção de um anticorpo recombinante ou de um anticorpo modificado

Os genes dos anticorpos construídos da forma descrita acima podem ser expressos e, assim, obtidos por um método conhecido. No caso de células de mamíferos, um gene pode ser expresso ligando, de forma operacional, um promotor útil que é normalmente utilizado ao gene do anticorpo que será expresso e ligando um sinal poli(A) a jusante da extremidade 3' deste. Um promotor/amplificador é, por exemplo, um promotor/amplificador imediato precoce de citomegalovírus humano.

Além disso, os exemplos de outros promotores/ amplificadores que podem ser utilizados no presente invento para a expressão dos anticorpos incluem um promotor/ amplificador de um vírus, como seja um retrovírus, um vírus polioma, um adenovírus ou um vírus símio 40 (SV40), ou um promotor/amplificador derivado de uma célula de mamífero, como o factor de alongamento humano la (HEFla). 16 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

Quando se utiliza um promotor/amplificador de SV40, a expressão do gene pode ser facilmente executada pelo método de Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108); quando se utiliza um promotor/amplificador de HEFla, a expressão do gene pode ser facilmente executada pelo método de Mizushima et al (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

No caso de Escherichia coli, um promotor útil que é normalmente utilizado, uma sequência sinal para a secreção do anticorpo e o gene do anticorpo que será expresso são ligados de forma operacional, de modo que o gene possa ser expresso. Os exemplos de promotores incluem um promotor lacz e um promotor araB. Quando se utiliza o promotor lacz, o gene do anticorpo pode ser expresso pelo método de Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427); quando se utiliza o promotor araB, o gene do anticorpo pode ser expresso pelo método de Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).

Como sequência sinal para a secreção do anticorpo, poderá utilizar-se uma sequência sinal pelB (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) quando o anticorpo é produzido no periplasma de Escherichia coli. Após o isolamento dos anticorpos produzidos no periplasma, a estrutura do anticorpo sofre o reenrolamento adequado e o anticorpo é utilizado.

Uma origem de replicação que pode ser utilizada é derivada de um vírus SV40, um vírus polioma, um adenovírus, um vírus do papiloma bovino (VPB) ou similar. Além disso, para amplificar o número de cópias do gene no sistema de uma célula hospedeira, o vector de expressão pode conter um gene da aminoglicósido-transferase (APH), um gene da timidina-quinase (TK), um gene da xantina-guanina-fosforribosil-transferase (Ecogpt) de Escherichia coli, um gene da di-hidrofolato-redutase (dhfr) ou similar como marca de selecção.

Para produzir os anticorpos utilizados no presente invento, é possível utilizar qualquer sistema de expressão como seja um sistema de células eucarióticas ou um sistema de células procarióticas. Os exemplos de células eucarióticas 17 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ incluem células animais, como sejam as células de um sistema de células de mamífero ou de um sistema de células de insecto estabelecidas, células de fungos filamentosos e células de leveduras. Os exemplos de células procarióticas incluem células bacterianas, como sejam as células de Escherichia coli.

Preferencialmente, os anticorpos utilizados no presente invento são expressos em células de mamífero, como sejam as células CHO, COS, de mieloma, BHK, Vero ou HeLa.

Em seguida, uma célula hospedeira transformada é crescida in vitro ou in vivo, para que a célula hospedeira produza um anticorpo-alvo. As células hospedeiras são crescidas de acordo com um método conhecido. Por exemplo, como solução de cultura, é possível utilizar DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM ou uma solução idêntica. Um fluido sérico, como seja o soro fetal de vitelo (FCS), pode ser utilizado em combinação. 7. Separação e purificação do anticorpo

Os anticorpos expressos e produzidos como descrito acima podem ser isolados a partir das células ou dos animais hospedeiros e purificados até um nível uniforme. O isolamento e a purificação dos anticorpos que serão utilizados no presente invento podem ser efectuados utilizando colunas de afinidade. Um exemplo de uma coluna que utiliza proteína A é a coluna Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia). Outros métodos de isolamento e de purificação Standard que são utilizados para as proteínas poderão ser utilizados, e não há qualquer limitação relativamente ao seu uso. Por exemplo, uma coluna de cromatografia diferente da coluna de afinidade acima referida, um filtro, a ultrafiltração, um método de precipitação por salificação, diálises e métodos idênticos poderão ser apropriadamente seleccionados e combinados para utilização, de modo que os anticorpos possam ser isolados e purificados (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 18 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ 8. Confirmação da actividade do anticorpo É possível empregar meios conhecidos para avaliar a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo utilizado no presente invento (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor.Laboratory, 1988) e a actividade de inibição da ligação ligando-receptor (Harada, A. et al., International Immunology (1993) 5, 681-690).

Na qualidade de métodos para medir a actividade de ligação ao antigénio do anticorpo anti-glipicano 3 utilizado no presente invento, um ensaio ELISA (ensaio imunossorvente ligado a enzima), um ensaio EIA (imunoensaio enzimático), um ensaio RIA (radioimunoensaio) ou a técnica de anticorpos fluorescentes podem ser usados. Por exemplo, quando se utiliza um imunoensaio enzimático, uma amostra contendo os anticorpos anti-glipicano 3, como seja o sobrenadante de cultura de células produtoras de anticorpos anti-glipicano 3, ou os anticorpos purificados são adicionados a uma placa revestida com glipicano 3. Adiciona-se um anticorpo secundário marcado com uma enzima, como a fosfatase alcalina. A placa é incubada e depois lavada, adiciona-se um substrato da enzima, como o ácido p-nitrofenilfosfórico, e depois mede-se a absorvância, de modo que a actividade de ligação ao antigénio possa ser avaliada.

Para confirmar a actividade do anticorpo utilizado no presente invento, a actividade de neutralização de um anticorpo anti-glipicano 3 é medida. 9. Actividade citotóxica

Os anticorpos utilizados no presente invento possuem uma actividade ADCC ou uma actividade CDC como actividade citotóxica. A actividade ADCC pode ser medida misturando as células efectoras, as células-alvo e os anticorpos anti-glipicano 3 e examinando depois o grau de ADCC. Como células efectoras, é possível utilizar, por exemplo, os esplenócitos de ratinho, o sangue periférico humano ou os monócitos isolados da medula óssea. Como células-alvo, por exemplo, é possível utilizar linhas de células humanas estabelecidas, como seja a linha de 19 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ células humanas de cancro hepático HuH-7. As células-alvo são previamente marcadas com 51Cr, adicionam-se os anticorpos anti-glipicano 3 às células e depois procede-se à incubação. Em seguida, adicionam-se as células efectoras, numa razão adequada de células efectoras para células-alvo, e procede-se à incubação. Após a incubação, o sobrenadante é recolhido, e a radioactividade no sobrenadante é contada para que a actividade ADCC possa ser medida. A actividade CDC pode ser medida por mistura das células-alvo marcadas referidas acima com os anticorpos anti-glipicano 3, adição de complementos, incubação, cultura e depois contagem da radioactividade no sobrenadante.

Os anticorpos necessitam de uma porção Fc para exercer uma actividade citotóxica. Quando o inibidor do crescimento celular do presente invento utiliza a actividade citotóxica de um anticorpo, é necessário que o anticorpo anti-glipicano 3 utilizado no presente invento contenha a porção Fc. 10. Inibição da vascularização 0 anticorpo anti-glipicano 3 do presente invento pode ser utilizado para inibir a vascularização. 11. Método de administração e preparação farmacêutica O inibidor do crescimento celular do presente invento destina-se a utilização para tratar ou melhorar um cancro, seleccionado do grupo que consiste em cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro da mama, cancro da próstata, leucemia, linfoma e cancro pancreático.

Os exemplos preferidos das células de carcinomas que são alvo do inibidor do crescimento celular do presente invento são as células do cancro do pulmão, as células do cancro do cólon, as células do cancro da mama, as células do cancro da próstata, as células da leucemia, as células de linfoma e as células do cancro pancreático. A dose eficaz é seleccionada dentro do intervalo compreendido entre 0,001 mg e 1000 mg por kg de peso corporal 20 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ e por administração. Em alternativa, é possível seleccionar uma dose no intervalo compreendido entre 0,01 e 100 000 mg/corpo por doente. Contudo, a dose do agente terapêutico contendo os anticorpos anti-glipicano 3 do presente invento não está limitada a estas doses.

Além disso, como momento de administração do agente terapêutico do presente invento, o agente pode ser administrado quer antes quer após o início dos sintomas clínicos de uma doença. O agente terapêutico contendo os anticorpos anti-glipicano 3 do presente invento como ingrediente activo pode ser formulado de acordo com métodos Standard (Remington's Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A.) e poderá conter um veículo e um aditivo farmaceuticamente aceitáveis juntos.

Os exemplos destes veículos e aditivos farmacêuticos incluem a água, um solvente orgânico farmaceuticamente aceitável, o colagénio, o poli(álcool vinílico), a polivinilpirrolidona, um polímero carboxivinílico, a carboximetilcelulose sódica, o poli(acrilato de sódio), o alginato de sódio, o dextrano solúvel em água, o carboximetilamido sódico, a pectina, a metilcelulose, a etilcelulose, a goma de xantano, a goma-arábica, a caseína, o ágar-ágar, o polietilenoglicol, a diglicerina, a glicerina, o propilenoglicol, a vaselina, a parafina, o álcool estearílico, o ácido esteárico, a albumina sérica humana (HSA), o manitol, o sorbitol, a lactose e um tensioactivo que é aceitável como aditivo farmacêutico.

Uma combinação apropriada dos aditivos acima referidos é seleccionada de modo prático de acordo com a forma farmacêutica do agente terapêutico do presente invento, embora não esteja limitada a ela. Por exemplo, o agente que pode ser utilizado como uma preparação farmacêutica para injecção pode ser preparado por dissolução dos anticorpos anti-glipicano 3 purificados num solvente, como solução salina fisiológica, um tampão ou uma solução de glucose, seguida de adição de um inibidor da adsorção, como Tween 80, Tween 20, gelatina ou albumina sérica humana, à solução. Em 21 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ alternativa, ο agente liofilizado poderá ser utilizado para preparar uma forma farmacêutica que é dissolvida para reconstituição antes da utilização. Como excipiente para a liofilização, é possível utilizar, por exemplo, um açúcar-álcool ou sacáridos como o manitol ou a glucose.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. glipicano 3 A Fig. glipicano 3 1 ilustra a actividade ADCC de anticorpos anti-(K6534) em células HuH-7. 2 ilustra a actividade CDC de anticorpos anti-(K6511) em células HuH-7. A Fig. 3 representa a expressão de glipicano em células HuH-7. A Fig. 4A ilustra os resultados da análise FACS da expressão de GPC-3 por linhas de células humanas de cancro do pulmão. Eles são os resultados de análises com anticorpos anti-glipicano 3 (K6534). A Fig. 4B apresenta os resultados da análise FACS da expressão de GPC-3 por linhas de células humanas de leucemia. Eles são os resultados de análises com anticorpos anti-glipicano 3 (K6534). A Fig. 4C ilustra os resultados da análise FACS da expressão de GPC-3 por linhas de células humanas de linfoma. Eles são os resultados de análises com anticorpos anti-glipicano 3 (K6534). A Fig. 4D representa os resultados da análise FACS da expressão de GPC-3 por linhas de células humanas de cancro do cólon. Eles são os resultados de análises com anticorpos anti-glipicano 3 (K6534). A Fig. 4E ilustra os resultados da análise FACS da expressão de GPC-3 por linhas de células humanas de cancro da mama. Eles são os resultados de análises com anticorpos anti-glipicano 3 (K6534). 22 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ A Fig. 4F apresenta os resultados da análise FACS da expressão de GPC-3 por linhas de células humanas de cancro da próstata. Eles são os resultados de análises com anticorpos anti-glipicano 3 (K6534). A Fig. 4G ilustra os resultados da análise FACS da expressão de GPC-3 pela linha de células humanas de cancro pancreático e pela linha de células humanas de cancro hepático. Eles são os resultados de análises com anticorpos anti-glipicano 3 (K6534).

MELHOR FORMA DE CONCRETIZAÇÃO DO INVENTO O presente invento será adicionalmente descrito em referência aos exemplos que se seguem. Contudo, o âmbito técnico do presente invento não está limitado por estes exemplos ou similares.

Exemplo 1. Preparação do anticorpo monoclonal contra o péptido sintético glipicano-3

Sintetizou-se um péptido possuindo uma sequência de aminoácidos (os aminoácidos 355 a 371) (RQYRSAYYPEDLFIDKK) da proteína glipicano-3 humana. 0 péptido sintético foi ligado a hemocianina de lapa (KLH) utilizando um agente de reticulação do tipo maleinimida-benzoíloxi-succínimida (MBS), preparando-se, assim, um imunogénio. Ratinhos (BALB/c, fêmeas, 6 semanas de idade) foram imunizados 3 vezes com o imunogénio, numa quantidade de 100 μg/ratinho. Os títulos do anticorpo no soro foram determinados. O método utilizado como método de análise dos títulos do anticorpo envolve a reacção dos soros diluídos com os péptidos (0,5 μρ) imobilizados numa placa, a reacção com anticorpos anti-ratinho marcados com HRP, a adição de um substrato e depois a medição da absorvância a 450 nm da cor desenvolvida (um método ELISA para péptidos em fase sólida). Após a confirmação dos títulos do anticorpo, os esplenócitos foram recolhidos e depois fundidos (Kõhler, G, Milstein, C. Nature, 256: 495 (1975)) com células de mieloma (P3/X63-Ag8), preparando-se os hibridomas. Os anticorpos monoclonais produzidos por cinco tipos de hibridomas foram depois purificados. A actividade de ligação ao péptido foi medida utilizando o método ELISA para 23 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ péptidos em fase sólida e, em seguida, seleccionaram-se anticorpos IgGl (aqui a seguir designados por K6534) e anticorpos IgG3 (aqui a seguir designados por K6511) possuindo uma actividade de ligação elevada.

Exemplo 2. Inibição da proliferação celular utilizando o anticorpo anti-glipicano 3 A actividade ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos) e a actividade CDC (citotoxicidade dependente de complemento) foram medidas de acordo com o método de Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E. Cologan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993. 1. Preparação da célula efectora O baço foi extraído de um ratinho CBA/N (8 semanas de idade, macho) e, em seguida, os esplenócitos foram isolados em meio RPMI 1640 (GIBCO). As células foram lavadas no mesmo meio contendo soro fetal de bovino a 10% (FBS, HyClone) e depois foram preparadas numa concentração de 5xl06/ml, produzindo-se, desta forma, as células efectoras. 2. Preparação da solução do complemento O complemento de coelho bebé (CEDARLANE) foi diluído 10 vezes em meio DMEM contendo FBS a 10% (GIBCO), preparando-se uma solução do complemento. 3. Preparação das células-alvo

Uma linha de células humanas de cancro hepático HuH-7 (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) N.° JCRB0403, Human Science Research Support Bank (Human Science Kenkyu Shien Bank)) foi crescida com 0,2 mCi de 51Cr-cromato de sódio (Amersham Pharmacia Biotech) em meio DMEM contendo FBS a 10% a 37°C durante 1 hora, procedendo-se, assim, à marcação radioactiva. Após a marcação radioactiva, as células foram lavadas 3 vezes com meio RPMI 1640 contendo FBS a 10% e depois foram preparadas numa concentração de 2xl05/ml, produzindo-se as células-alvo. 24 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

4. Medição da actividade ADCC

Adicionaram-se 50 μΐ de células-alvo e 50 μΐ de anticorpos anti-glipicano 3 (K6534) a uma placa de 96 poços de fundo em U (Beckton Dickinson) e deixou-se reagir em gelo durante 15 minutos. Adicionaram-se depois 100 μΐ de células efectoras e cultivou-se num incubador de dióxido de carbono durante 4 horas. A concentração final do anticorpo foi de 0 ou 10 μρ/ιηΐ. Após o crescimento, recolheram-se 100 μΐ do sobrenadante e mediu-se a radioactividade utilizando um contador gama (COBRA II AUTO-GAMMA, MODELO D5005, Packard Instrument Company). A actividade citotóxica (%) foi determinada utilizando a fórmula (A-C)/(B-C)xlOO. Nela, "A" representa a radioactividade (cpm) em cada amostra, "B" representa a radioactividade (cpm) numa amostra suplementada com NP-40 a 1% (Nacalai Tesque) e "C" representa a radioactividade (cpm) numa amostra contendo apenas células-alvo. A experiência foi efectuada em duplicado, e os valores médios foram calculados.

5. Medição da actividade CDC

Adicionaram-se 50 μΐ de células-alvo e 50 μΐ de anticorpos anti-glipicano 3 (K6511) a uma placa de 96 poços de fundo plano (Beckton Dickinson) e deixou-se reagir em gelo durante 15 minutos. Adicionaram-se depois 100 μΐ de uma solução do complemento, seguindo-se 4 horas de crescimento num incubador de dióxido de carbono. A concentração final do anticorpo foi de 0 ou 3 μρ/ιηΐ. Após o crescimento, recolheram-se 100 μΐ do sobrenadante e mediu-se a radioactividade utilizando um contador gama. A actividade citotóxica (%) foi determinada da forma utilizada em "4. Medição da actividade ADCC". A experiência foi realizada em duplicado, e os valores médios foram calculados. por A Figura 1 ilustra a actividade ADCC e a Figura 2 representa a actividade CDC. Estes resultados revelaram que os anticorpos anti-glipicano 3 exercem uma actividade ADCC e uma actividade CDC sobre uma linha de células humanas de cancro hepático HuH-7 e, por conseguinte, inibem a proliferação celular. 25 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

Exemplo 3. Medição do nível de expressão do glipicano em células HuH-7

Suspenderam-se aproximadamente 5xl05 células HuH-7 em 100 μΐ de FACS/PBS (preparado por dissolução de 1 g de albumina sérica de bovino (SIGMA) em 1 1 de CellWASH (Beckton Dickinson)). Em seguida, adicionaram-se os anticorpos anti-glipicano 3 (K6511) ou o anticorpo IgG2a de ratinho (Biogenesis) como anticorpo de controlo numa concentração de 25 μρ/ιηΐ, e permitiu-se que a solução repousasse em gelo durante 30 minutos. Após lavagem com FACS/PBS, o produto foi suspenso em 100 μΐ de FACS/PBS. Adicionaram-se 4 μΐ de Ig de cabra anti-ratinho marcado com FITC (isotiocianato de fluoresceina) (Becton Dickinson) e permitiu-se que a solução repousasse em gelo durante 30 minutos.

Após lavagem duas vezes com FACS/PBS, o produto foi suspenso em 1 ml de FACS/PBS. A intensidade de fluorescência das células foi medida utilizando um citómetro de fluxo (EPICS XL, BECKMAN COULTER). A Figura 3 ilustra o resultado da citometria de fluxo. O glipicano 3 foi expresso nas células HuH-7, sugerindo que os anticorpos anti-glipicano 3 se ligam ao glipicano 3 expresso nas células de forma a inibir a proliferação celular (Fig.3).

Exemplo 4. Análise da expressão de GPC3 num painel de células de carcinomas utilizando CMF A expressão do glipicano 3 (GPC3) por linhas de células cancerosas humanas (pulmão, cólon, recto, mama, próstata, leucemia, linfoma, mieloma, pâncreas e fígado) foi analisada ut i1i z ando CMF.

As células foram crescidas durante 2 dias e depois foram submetidas ao ensaio. As células que sofreram adesão foram recolhidas utilizando tripsina-EDTA (Cat. n.° 25300-054, Lote 14210, GIBCO), que havia sido diluído 10X com tampão de dissociação celular (Cat. n.° 13150-016, Lote 1098554, GIBCO). Permitiu-se que as células recolhidas reagissem em gelo com os anticorpos anti-glipicano 3 (K6534, 600 μg/ml) ou com os anticorpos IgG2a murinos como controlo negativo 26 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ (Biogenesis, M-IgG2a-i, Lote EA990719A, 1 mg/ml) (concentração final do anticorpo = 10 μg/ml). Após lavagem, permitiu-se que as células reagissem com anticorpo Ig anti-ratinho marcado com FITC (Cat. n.° 349031, BD PharMingen) em gelo (2 μΐ/teste). Após lavagem das células, a intensidade de fluorescência foi medida utilizando um citómetro de fluxo (EPICS XL, BECKMAN COULTER). Por consequência, a expressão de GPC3 foi confirmada nas linhas de células de cancro do pulmão (A549, NCI-H460, NCI-H23, NCI-H226, DMS114, EKVX, HOP-62 e NCI-H322 M) , nas linhas de células de leucemia (P30/OHK, BALL-1, THP-1 e P39/TSU), nas linhas de células de linfoma (MLMA, Ramos e U937), nas linhas de células de cancro do cólon (SW480, COL0205, LoVo e SW837), nas linhas de células de cancro da mama (MDA-MB-231, SK-BR-3 e MDA-MB-468), nas linhas de células de cancro da próstata (LNCaP e 22Rvl), na linha de células de cancro pancreático (MIAPaCa-2) e na linha de células de cancro hepático (fígado) (HepG2). Com base nestes resultados, conclui-se que o inibidor do crescimento celular do presente invento é útil no tratamento do cancro do pulmão, do cancro do cólon, do cancro da mama, do cancro da próstata, da leucemia, do linfoma, do cancro pancreático e similares.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

De acordo com o presente invento, é proporcionado um anticorpo anti-glipicano 3 para utilizar no tratamento de cancro seleccionado do grupo que consiste em cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro da mama, cancro da próstata, leucemia, linfoma e cancro pancreático.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> INIBIDORES DA PROLIFERAÇÃO CELULAR CONTENDO ANTICORPO ANTI-GLIPICANO 3

<130> N90727C <150> JP 2001-189443 <151> 2001-06-22 <160> 1 <170> Patentln version 3.5 27 ΕΡ 2 208 784/ΡΤ

<210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Péptido sintético baseado nos aminoácidos 355 a 371 da proteína glipicano-3 humana <400> 1

Arg Gin Tyr Arg Ser Ala Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys 15 10 15

Lys

Lisboa, 2013-03-26

Claims

ΕΡ 2 208 784/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo anti-glipicano 3 para utilização no tratamento de cancro seleccionado do grupo que consiste em cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro da mama, cancro da próstata, leucemia, linfoma e cancro pancreático.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, em que o cancro é cancro do pulmão.
3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.
4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o anticorpo tem uma actividade citotóxica.
5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, em que a actividade citotóxica é citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC).
6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, em que a actividade citotóxica é citotoxicidade dependente do complemento (CDC).
7. Utilização de um anticorpo anti-glipicano 3 no fabrico de um medicamento para utilização no tratamento de cancro seleccionado do grupo que consiste em cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro da mama, cancro da próstata, leucemia, linfoma e cancro pancreático. Lisboa, 2013-03-26