JP5801557B2 - 抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療 - Google Patents
抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5801557B2 JP5801557B2 JP2010544139A JP2010544139A JP5801557B2 JP 5801557 B2 JP5801557 B2 JP 5801557B2 JP 2010544139 A JP2010544139 A JP 2010544139A JP 2010544139 A JP2010544139 A JP 2010544139A JP 5801557 B2 JP5801557 B2 JP 5801557B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- amino acid
- acid sequence
- lgr7
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
Description
また、本発明者らはLGR7タンパク質に対するモノクローナル抗体を作成した。
さらに本発明者らは、抗LGR7抗体の抗体依存性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC)活性を測定したところ、抗LGR7抗体はLGR7発現細胞に対してADCC活性を有することを見出した。さらに、補体依存性の細胞傷害 (complement-dependent cell-mediated cytotoxicity; CDC)活性を測定したところ、抗LGR7抗体はLGR7発現細胞に対してCDC活性を有することも見出した。さらに、抗当該LGR7抗体を異種移植腫瘍モデルマウスに投与したところ、腫瘍縮小効果を示すことが明らかとなった。以上の知見により、本発明者らは、抗LGR7抗体が、原発性の、あるいは転移性の卵巣明細胞腺癌の診断、予防および治療に有効であることを見出して、本発明を完成させた。より具体的には、本発明者らは、抗LGR7抗体が、卵巣明細胞腺癌をはじめとする、LGR7が発現亢進している癌の、治療あるいは診断のためのツールとして有用であることを見出して本発明を完成した。
〔1〕LGR7タンパク質に結合し、かつLGR7タンパク質を発現する細胞に対して細胞増殖阻害活性を有する抗体。
〔2〕細胞増殖阻害活性が細胞傷害活性である〔1〕に記載の抗体。
〔3〕前記細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性である〔2〕に記載の抗体。
〔4〕前記細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性である〔2〕 に記載の抗体。
〔5〕細胞傷害性物質が結合した抗体である〔1〕〜〔4〕いずれかに記載の抗体。
〔6〕インターナライズ活性を有する抗体である〔5〕に記載の抗体。
〔7〕癌細胞の増殖を抑制する抗体である〔1〕から〔6〕のいずれかに記載の抗体。
〔8〕前記癌細胞が卵巣癌明細胞である〔7〕に記載の抗体。
〔9〕 以下(1)から(29)のいずれかに記載の抗体;
(1)CDR1として配列番号:5に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:6に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:7に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA6重鎖)、
(2)CDR1として配列番号:10に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:11に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:12に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA6軽鎖)、
(3)(1)に記載のH鎖、および(2)に記載のL鎖を含む抗体(22DA6)、
(4)CDR1として配列番号:15に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:16に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:17に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA7重鎖)、
(5)CDR1として配列番号:20に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:21に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:22に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA7軽鎖)、
(6)(4)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体(22DA7)、
(7)CDR1として配列番号:25に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:26に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:27に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA17重鎖)、
(8)CDR1として配列番号:30に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:31に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:32に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA17軽鎖)、
(9)(7)に記載のH鎖、および(8)に記載のL鎖を含む抗体(22DA17)、
(10)CDR1として配列番号:35に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:36に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:37に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA22重鎖)、
(11)CDR1として配列番号:40に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:41に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:42に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA22軽鎖)、
(12)(10)に記載のH鎖、および(11)に記載のL鎖を含む抗体(22DA22)、
(13)CDR1として配列番号:45に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:46に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:47に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA23重鎖)、
(14)CDR1として配列番号:50に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:51に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA23軽鎖)、
(15)(13)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体(22DA23)、
(16)CDR1として配列番号:55に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:56に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:57に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA24重鎖)、
(17)CDR1として配列番号:60に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:61に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:62に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA24軽鎖)、
(18)(16)に記載のH鎖、および(17)に記載のL鎖を含む抗体(22DA24)、
(19)CDR1として配列番号:65に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:66に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:67に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22SD7重鎖)、
(20)CDR1として配列番号:70に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:71に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:72に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22SD7軽鎖)、
(21)(19)に記載のH鎖、および(20)に記載のL鎖を含む抗体(22SD7)、
(22)CDR1として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:76に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:77に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22SD11重鎖)、
(23)CDR1として配列番号:80に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:82に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22SD11軽鎖)、
(24)(22)に記載のH鎖、および(23)に記載のL鎖を含む抗体(22SD11)、
(25)CDR1として配列番号:85に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:86に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:87に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22SD48重鎖)、
(26)CDR1として配列番号:90に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:91に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22SD48軽鎖)、
(27)(25)に記載のH鎖、および(26)に記載のL鎖を含む抗体(22SD48)、
(28)(1)〜(27)いずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(29)(1)〜(27)いずれかに記載の抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体。
〔10〕ヒト定常領域を有する抗体である〔1〕〜〔9〕のいずれかに記載の抗体。
〔11〕 キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である〔10〕に記載の抗体。
〔12〕フコースが欠損した抗体である〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載の抗体。
〔13〕〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
〔14〕〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
〔15〕〔1〕から〔12〕のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する抗癌剤。
〔16〕治療対象となる癌が卵巣癌である、〔15〕に記載の抗癌剤。
〔17〕前記卵巣癌が明細胞腺癌である〔16〕に記載の抗癌剤。
〔18〕LGR7タンパク質またはLGR7タンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法。
〔19〕LGR7タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法。
〔20〕LGR7タンパク質の検出がLGR7タンパク質に結合する抗体を用いて行なわれる〔19〕に記載の診断方法。
〔21〕以下の工程を含む癌の診断方法;
(a) 被検者から採取された試料を提供する工程、
(b) (a)の試料に含まれるLGR7タンパク質を、LGR7タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程。
〔22〕以下の工程を含む癌の診断方法;
(a) LGR7タンパク質への結合活性を有し、かつ放射性同位元素で標識された抗体を被検者に投与する工程、
(b) 前記放射性同位元素の集積を検出する工程。
〔23〕診断対象となる癌が卵巣癌である〔18〕から〔22〕のいずれかに記載の診断方法。
〔24〕前記卵巣癌が明細胞腺癌である〔23〕に記載の診断方法。
本発明においてLGR7は、7回膜貫通型のLGRファミリーメンバーであるタンパク質である。ヒトLGR7のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれNCBI登録番号NP_067647(配列番号:1)及びNM_021634(配列番号:2)に開示されている。また、本発明で用いられるLGR7はスプライシングバリアントや変異体であってもよい。本発明において、LGR7タンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、LGR7タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のLGR7タンパク質の機能を有していなくてもよい。断片の例として、LGR7タンパク質の細胞外領域を含む断片が挙げられる。LGR7タンパク質の細胞外領域は配列番号:1のアミノ酸配列において1-404番目、462−485番目、549−581番目、および648−661番目が相当する。又、膜貫通領域は配列番号:1のアミノ酸配列において405−427番目、439−461番目、486−508番目、529-548番目、582−604番目、625−647番目、および662−681番目が相当する。
本発明で用いられる抗LGR7抗体は、LGR7タンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは問われない。具体的には、非ヒト動物の抗体(例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体)、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体が使用できる。本発明においては、モノクローナル、あるいはポリクローナルを抗体として利用することができるが好ましくはモノクローナル抗体である。抗体のLGR7タンパク質への結合は特異的な結合であることが好ましい。又、本発明で用いられる抗LGR7抗体がヒトLGR7を認識する抗体である場合、ヒトLGR7を特異的に認識する抗体であってもよいし、他の動物由来のLGR7(例えば、マウスLGR7)を同時に認識する抗体であってもよい。
ヒトLGR7のアミノ酸配列に基づいて化学合成によって取得されたペプチド
LGR7遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによって取得されたペプチド
LGR7タンパク質をタンパク質分解酵素により分解することによって取得されたペプチド
−LGR7のような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる
−免疫抗原を精製する必要が無い
P3(P3x63Ag8.653)(J. Immunol.(1979)123, 1548-1550)
P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7)
NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976)6, 511-519)
MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell(1976)8, 405-415)
SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978)276, 269-270)
FO(de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol. Methods(1980)35, 1-21)
S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med.(1978)148, 313-323)
R210(Galfre, G. et al., Nature(1979)277, 131-133)等
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979)18, 5294-5299)
AGPC法(Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.(1987)162, 156-159)
(1) 得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をLGR7に接触させる工程、
(2) LGR7と抗体との結合を検出する工程、および
(3) LGR7に結合する抗体を選択する工程
(1)哺乳類細胞:CHO、COS、ミエローマ、BHK(baby hamster kidney)、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
(2)両生類細胞:アフリカツメガエル卵母細胞など
(3)昆虫細胞:sf9、sf21、Tn5など
酵母:サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces serevisiae)などのサッカロミセス(Saccharomyces )属、メタノール資化酵母(Pichia pastoris)などのPichia属
糸状菌:アスペスギルス・ニガー(Aspergillus niger)などのアスペルギルス(Aspergillus)属
アミノグリコシドトランスフェラーゼ(APH)遺伝子
チミジンキナーゼ(TK)遺伝子
大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Ecogpt)遺伝子
ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子等
従って、本発明で用いられる抗体の好ましい態様の一つとして、ヒト定常領域を有する抗体を挙げることができる。
パパイン消化:F(ab)2またはFab
ペプシン消化:F(ab’)2またはFab’
プラスミン消化:Facb
抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA配列、および
抗体のL鎖またはL鎖V領域をコードするDNA配列
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である(Hudson et al、J Immunol. Methods 1999;231:177-189)。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]
[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]
[VH]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VL]
[VL]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VH]
[VL]リンカー[VH]リンカー[VL]リンカー[VH]
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:101)
Ser・Gly・Gly・Gly(配列番号:102)
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:103)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:104)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:105)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:106)
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:107)
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:108)
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser(配列番号:101))n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly(配列番号:102))n
[nは1以上の整数である]
[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VH]ペプチドリンカー(15アミノ酸)[VL]
N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、
ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、
ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、
ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)、
ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、
エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、
エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)(スルホ−EGS)、
ジスクシンイミジル酒石酸塩(DST)、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩(スルホ−DST)、
ビス[2-(スクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(BSOCOES)、および
ビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)など
グリコシル化が修飾された抗体(WO99/54342など)、
糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体(WO00/61739、WO02/31140、WO2006/067913など))、
バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体(WO02/79255など)など。
本発明における細胞傷害活性としては、例えば抗体依存性細胞介在性細胞傷害(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity:ADCC)活性、補体依存性細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity:CDC)活性などを挙げることができる。本発明において、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。一方ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞(免疫細胞等)がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。
(1)エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地(Invitrogen社製)中で脾臓細胞が分離される。10%ウシ胎児血清(FBS、HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
(2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を10% FBS含有培地(Invitrogen社製)にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
(3)標的細胞の調製
LGR7タンパク質を発現する細胞を0.2 mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)とともに、10% FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。LGR7タンパク質を発現する細胞としては、LGR7タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、卵巣癌等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10% FBS含有RPMI1640培地にて3回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
インターナライズ活性を有する抗体は例えば上述の細胞傷害性物質を結合することにより抗癌剤などの医薬組成物として用いることができる。
(1)CDR1として配列番号:5に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:6に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:7に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA6重鎖)、
(2)CDR1として配列番号:10に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:11に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:12に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA6軽鎖)、
(3)(1)に記載のH鎖、および(2)に記載のL鎖を含む抗体(22DA6)、
(4)CDR1として配列番号:15に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:16に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:17に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA7重鎖)、
(5)CDR1として配列番号:20に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:21に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:22に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA7軽鎖)、
(6)(4)に記載のH鎖、および(5)に記載のL鎖を含む抗体(22DA7)、
(7)CDR1として配列番号:25に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:26に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:27に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA17重鎖)、
(8)CDR1として配列番号:30に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:31に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:32に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA17軽鎖)、
(9)(7)に記載のH鎖、および(8)に記載のL鎖を含む抗体(22DA17)、
(10)CDR1として配列番号:35に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:36に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:37に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA22重鎖)、
(11)CDR1として配列番号:40に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:41に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:42に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA22軽鎖)、
(12)(10)に記載のH鎖、および(11)に記載のL鎖を含む抗体(22DA22)、
(13)CDR1として配列番号:45に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:46に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:47に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA23重鎖)、
(14)CDR1として配列番号:50に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:51に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA23軽鎖)、
(15)(13)に記載のH鎖、および(14)に記載のL鎖を含む抗体(22DA23)、
(16)CDR1として配列番号:55に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:56に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:57に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22DA24重鎖)、
(17)CDR1として配列番号:60に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:61に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:62に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22DA24軽鎖)、
(18)(16)に記載のH鎖、および(17)に記載のL鎖を含む抗体(22DA24)、
(19)CDR1として配列番号:65に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:66に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:67に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22SD7重鎖)、
(20)CDR1として配列番号:70に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:71に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:72に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22SD7軽鎖)、
(21)(19)に記載のH鎖、および(20)に記載のL鎖を含む抗体(22SD7)、
(22)CDR1として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:76に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:77に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22SD11重鎖)、
(23)CDR1として配列番号:80に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:82に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22SD11軽鎖)、
(24)(22)に記載のH鎖、および(23)に記載のL鎖を含む抗体(22SD11)、
(25)CDR1として配列番号:85に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:86に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:87に記載のアミノ酸配列を有するH鎖を含む抗体(22SD48重鎖)、
(26)CDR1として配列番号:90に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:91に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体(22SD48軽鎖)、
(27)(25)に記載のH鎖、および(26)に記載のL鎖を含む抗体(22SD48)、
(28)(1)〜(27)いずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体、
(29)(1)〜(27)いずれかに記載の抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体
このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内(例えば、5アミノ酸以内)である。
疎水性アミノ酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、
親水性アミノ酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸(G、A、V、L、I、P)、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸(S、T、Y)、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸(C、M)、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸(D、N、E、Q)、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸(R、K、H)、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸(H、F、Y、W)
(括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)
具体的には、競合ELISAアッセイにおいてマイクロタイタープレートのウェルにコーティングするLGR7タンパク質のかわりにLGR7タンパク質を発現した細胞を用いる。候補の競合抗体の存在下、または非存在下でプレインキュベートした後にビオチンで標識した本発明の抗LGR7抗体を添加し、ストレプトアビジンフルオロセインコンジュゲートを使用することにより抗体間の競合が測定できる。フローサイトメトリーを利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合FACSアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の蛍光標識物質で標識することができる。
別の観点においては、本発明は、LGR7タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又、本発明はLGR7タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤に関する。本発明の細胞増殖抑制剤および抗癌剤は、癌を罹患している対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。LGR7の発現レベルは、脳以外の正常細胞で非常に低い一方、癌細胞では亢進していることから、抗LGR7抗体の投与によって、癌細胞特異的な細胞傷害作用が得られると考えられる。
本発明の医薬組成物(例えば、抗癌剤)において用いられる抗LGR7抗体は特に限定されず、如何なる抗LGR7抗体であってもよく、例えば上述の抗LGR7抗体を用いることができる。
本発明の医薬組成物が対象とする疾患が癌の場合、対象となる癌は特に限定されないが、卵巣癌であることが好ましく、卵巣癌明細胞腺癌が特に好ましい。癌は原発病巣および転移病巣のいずれであってもよい。
(a) 被検者から採取された試料を提供する工程、
(b) 採取された試料に含まれるLGR7タンパク質を、LGR7タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程。
単にLGR7タンパク質が存在するか否かの測定
LGR7タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
LGR7タンパク質の量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定など
一方、定量的な検出とは、LGR7タンパク質の濃度の測定、LGR7タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
(1) 被検者から採取された生体試料中のLGR7発現レベルを検出する工程、および
(2) (1)で検出されたLGR7の発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有することが示される工程。
ラジオイムノアッセイ(RIA)、
エンザイムイムノアッセイ(EIA)、
蛍光イムノアッセイ(FIA)、
発光イムノアッセイ(LIA)、
免疫沈降法(IP)、
免疫比濁法(TIA)、
ウエスタンブロット(WB)、
免疫組織化学(IHC)法、
免疫拡散法(SRID)。
すなわち、LGR7は、癌細胞において特異的に発現が増強している膜タンパク質であることから、抗LGR7抗体によって、癌細胞、あるいは癌組織を検出することができる。上記の免疫組織学的な解析によって、生体から採取された細胞や組織に含まれる癌細胞が検出される。
単にLGR7のmRNAが存在するか否かの測定、
LGR7のmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
LGR7のmRNAの量を他の試料(例えば、コントロール試料など)と比較する測定など
一方、定量的な検出とは、LGR7のmRNAの濃度の測定、LGR7のmRNAの量の測定などを挙げることができる。
診断される癌は、卵巣癌のうちの明細胞腺癌を挙げることができる。本発明においては、これらの癌の原発病巣、および転移病巣のいずれをも診断することができる。
mRNAを検出する方法は、公知である。具体的には、例えばノーザンブロッティング法、RT-PCR法、DNAアレイ法等を本発明に利用することができる。
上記した本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもできる。自動化することによって、短時間に多数の試料を検査することができる。
本発明の癌の診断用試薬と、LGR7の検出に用いられるその他の要素を組み合わせることによって、癌の診断のためのキットとすることができる。すなわち本発明は、LGR7に結合する抗体と、該抗体とLGR7との結合を検出する試薬を含み、さらにLGR7を含む生体試料からなる対照試料を含んでいてもよい、癌の診断のためのキットに関する。本発明のキットには、更に測定操作を説明するための指示書をキットに添付することもできる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
[実施例1] Affymetrix U133 Plus2.0 Arrayによるヒト LGR7 mRNA発現解析
東京大学医学部附属病院(日本)にて文書により同意を得たうえで採取、凍結保存した卵巣癌手術検体10例よりtotal RNAを抽出した。その際には、手術検体をOCTコンパウンドに包埋し、薄切したものをTRIZOL(Invitrogen社)に溶解した後、製品添付の方法に従ってtotal RNA抽出を行った。また同時にHE染色標本を作成し、癌部が含まれていることを確認した。卵巣癌10例の組織型の内訳は、明細胞腺癌4例、漿液性腺癌2例、類内膜腺癌3例、癌肉腫1例である。これらのtotal RNAを用いてAffymetrix U133 Plus2.0 Arrayにて発現解析を行い、卵巣明細胞腺癌に特異的に高発現を認める遺伝子を選出した。対象として正常組織(Clontech社)、卵巣癌細胞株(ATCC、JCRB、理研から購入)由来のtotalRNAを使用した。
LGR7は卵巣癌のうちでも明細胞腺癌に特異的に発現しており、この癌種に対するヒト LGR7を標的とした抗腫瘍剤が有効であることが期待される。
全長ヒトLGR7 cDNAはそれぞれNCBI登録番号NP_067647(配列番号:1(アミノ酸配列))及びNM_021634(配列番号:2(塩基配列))を基礎にしてHuman Uterus QUICK-CLONE cDNA (Clontech社)を用いてPCR法によって単離され、pGEM-T Easy (Promega社)にクローニングした後、N末端にHAタグの配列を付加した後に哺乳細胞発現用pMCN2iベクターにクローニングされた。
GeneGun Particle法によるマウスへの遺伝子導入によるDNA免疫が行われた。方法はBioRad社のマニュアルに従って実施された。1 mm Gold particle(BioRad社)とpMCN-LGR7 DNAを混合してチューブの内部にコーティングすることによりDNA免疫用の弾が作製された。6週令のMRL/lprマウスのメスに対して200-300 psiの圧力でHelios GeneGun(BioRad社)を用いてpMCN-LGR7 DNAがコーティングされた弾を腹部の皮膚に打ち込むことにより遺伝子導入した。皮膚に存在するケラチノサイト(keratinocyte)、ランゲルハンス細胞(Langerhans cell)、デンドリティック細胞(dermal dendritic cell)に導入された遺伝子はLGR7タンパク質を発現することにより、これらの細胞が抗原提示細胞(APC)となり免疫を惹起すると考えられる(Methods 31, 232-242(2003);Immunization with DNA through the skin)。DNA免疫は1週間間隔で6回行われた。最終免疫としてはLGR7を発現するBaF3細胞株HA-LGR/BaF3#48、100万個の細胞がPBSに希釈された後に尾静脈内に投与された。抗体価の測定はHA-LGR7/DG#24細胞を用いたFACS解析により実施された。免疫したマウスの血清について、HA-LGR7/DG#24細胞の細胞膜表面上に発現しているLGR7タンパク質との反応が比較された。反応性が一番高かったマウスに最終免疫して細胞融合に供された。最終免疫の3日後、当該脾臓細胞が摘出され、マウスミエローマ細胞P3-X63Ag8U1(P3U1、ATCCより購入)と2:1になるように混合された。細胞融合はPEG1500(ロシュ・ダイアグノスティック社)を徐々に加える事により行われ、ハイブリドーマ細胞が作製された。慎重にRPMI1640培地(GIBCO BRL社)を加えることによってPEG1500濃度が希釈された後、遠心操作によりPEG1500を除去した。次に、ハイブリドーマ細胞は10%FBS、1 × HAT media supplement(SIGMA社)、0.5 × BM-Condimed H1 Hybridoma cloning supplement(ロシュ・ダイアグノスティック社)を含むRPMI1640培地(以降、HAT培地)に懸濁され、200μL/ウェルとなるように96穴培養プレートに播種された。播種の際の細胞濃度は使用したP3U1細胞数に応じて希釈され、ハイブリドーマ細胞は96ウェル培養プレート中で37℃、5% CO2にてHAT培地中で約一週間培養された。培養上清中に抗体を分泌しているハイブリドーマのスクリーニングはフローサイトメトリーにより実施された。
LGR7タンパク質の1-555番目のアミノ酸を含む断片をPCRにより増幅してヒトのFc蛋白(塩基配列、配列番号:95、アミノ酸配列、配列番号:96)と融合蛋白として発現するようにベクターを構築した。できたベクターをDG44細胞に導入してsLGR7Fcの融合蛋白が発現できる細胞をネオマイシン耐性株として選抜した。得られた細胞株を大量に培養して培養上清を回収してsLGR7Fc蛋白を精製した。rProteinAカラムによりFc融合蛋白としてアフィニティー精製されたsLGR7Fc蛋白は蛋白免疫の抗原やハイブリドーマのスクリーニング抗原に供された。
アフィニティー精製sLGR7Fc蛋白は50μgをフロイント・コンプリートアジュバントと混合してマウス皮下に免疫した。さらに2回アフィニティー精製sLGR7Fc蛋白50μgとフロイント・インコンプリートアジュバントを混合したものを皮下にマウスの免疫することで抗体を誘導し、LGR7タンパク質との反応性が一番高かったマウスに25μgのsLGR7Fc蛋白を尾静脈より注射して3日後にマウスより脾臓を取り出してマウスミエローマ細胞株P3X63Ag8U.1と細胞融合に供して[実施例3]と同様にしてハイブリドーマを調製した。
得られたハイブリドーマを用い、ヒトLGR7/DG44細胞に対する結合がフローサイトメトリーにより評価された。FACSバッファー(2% FBS/PBS/0.05% NaN3)に懸濁したヒトLGR7発現細胞株はFACSバッファーを用いて1×106個/mLに希釈された後、Falcon353910丸底96ウェルプレートに50μL/ウェルで分注された。細胞の入ったウェルに適当な濃度に希釈したハイブリドーマの培養上清を加えて、氷上にて60分間反応させた。次に細胞はFACSバッファーにて1回洗浄された。細胞の入ったウェルに2次抗体としてGoat F(ab')2 フラグメント抗マウスIgG Fcγ-FITC(Beckman Coulter社)を添加した後、氷上にて30分間反応させた。反応後、遠心分離により上清が除かれた後に、FACS バッファー100μLに懸濁された細胞はフローサイトメトリーに供された。フローサイトメトリーにはFACS Calibur(ベクトンディッキンソン社)が用いられた。前方散乱光(forward scatter)及び側方散乱光(side scatter)のドットブロットにて生細胞集団にゲートが設定され、当該集団に含まれる細胞についてFL1のヒストグラムをとって結合活性が評価された。
抗ヒトLGR7モノクローナル抗体におけるLGR7強制発現DG44細胞に対するADCC活性をクロム放出法で調べた。ターゲット細胞はChromium-51を添加した培養液(CHO-S SFM II(Invitrogen社製))にて培養を数時間行った後、培養液を除去、培養液で細胞を洗浄した後に新しい培養液に懸濁された細胞が1ウェルあたり1×104個の細胞となるように96ウェル丸底プレートに添加された。続いて抗体を最終濃度1μg/mL、0.1μg/mLとなるように添加し、各ウェルにターゲット細胞に比べて約5倍量のエフェクター細胞(NK-92 (ATCC, CRL-2407)にマウスFc-gamma受容体3(NM_010188)の細胞外領域およびヒトgamma鎖(NM_004106)の膜貫通領域と細胞内領域を含むキメラタンパク質を強制発現させた組換え細胞(WO2008/093688))を添加した。プレートを5% CO2インキュベーター中で37℃にて4時間静置した。静置後プレートを遠心し、各ウェルより一定量の上清を回収してガンマカウンターWallac 1480を用いて放射活性を測定し以下の式を用いて特異的クロム遊離率(%)を求めた。
特異的クロム遊離率(%) = (A-C)×100/(B-C)
ここで、Aは各ウェルにおける放射活性、Bは終濃度1% Nonidet P-40で細胞溶解して培地へ放出される放射活性平均値、Cは培地のみ添加した場合における放射活性平均値である。
CDC活性は細胞傷害が生じた細胞への7-AADの取り込みの度合いを指標にすることによって測定された。
LGR7発現DG44細胞とモノクローナル抗体を10μg/mLの濃度で4℃にて30分間反応させた。次に、Baby Rabbit Complement(CEDARLANE LABORATORIES 社)が最終濃度10%となるように添加され、37℃で90分反応が継続された。7-AAD(Beckman Coulter社)が最終濃度1μg/mLで加えられた後に室温で10分静置された。その後、細胞はFACSバッファーで洗浄された後、細胞傷害が起きている細胞の割合がFACS Caliburにて解析された。%FL3の値は7-AADで染色された細胞傷害を受けている細胞の割合を示し、HA-LGR7を発現しているDG44細胞において図4に示すように複数の抗LGR7抗体が補体依存的細胞傷害(complement-dependent cytotoxicity(CDC))活性を示した。
ADCC活性及びCDC活性を示した22DA6、22DA7、22DA17、22DA22、22DA23、22DA24、22SD7、22SD11、22SD48の9種類のハイブリドーマについて抗体可変領域遺伝子の配列が決定された。抗体の遺伝子は、抗LGR7抗体を産生するそれぞれのハイブリドーマより抽出したTotal RNAを用いてRT-PCR法によって増幅された。Total RNAは、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社)を用いて1×107細胞のハイブリドーマより抽出された。1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社)を用いることによってRACEライブラリーが構築された。抗体遺伝子はマウスIgG1定常領域配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1(配列番号:97、 GGGCCAGTGGATAGACAGATG)、MHC-IgG2a(配列番号:98、CAGGGGCCAGTGGATAGACCGATG)、MHC-IgG2b(配列番号:99、 CAGGGGCCAGTGGATAGACTGATG)またはマウスκ鎖定常領域塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドkappa(配列番号:100、GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG)を用いることによって、当該ハイブリドーマが産生する抗体をコードする遺伝子の5’末端側遺伝子断片が増幅された。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応した。PCR溶液50μLは、5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、5μLの10×Universal Primer A Mix、0.2 mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix(以上、CLONTECH社製)、2.5μLの逆転写反応産物、10 pmoleの合成オリゴヌクレオチドMHC-IgG1, MHC-IgG2a, MHC-IgG2bまたはkappaを含有していた。PCR反応は、94℃の初期温度にて30秒間反応後、94℃にて5秒間、72℃にて3分間のサイクルを5回反復し、次に94℃にて5秒間、70℃にて10秒間、72℃にて3分間のサイクルを5回反復し、さらに94℃にて5秒間、68℃にて10秒間、72℃にて3分間のサイクルを25回反復することによって行われた。最後に反応産物は72℃で7分間加熱された。各PCR産物はQIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN社製)を用いて、アガロースゲルから精製された。その後、当該PCR産物はpGEM-T Easyベクター(Promega社製)へクローニングされ、その塩基配列が決定された。
22DA7のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:13、アミノ酸配列を配列番号:14、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:18、アミノ酸配列を配列番号:19に示す。又、22DA7の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:15、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:16、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:17、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:20、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:21、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:22に示す。
22DA17のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:23、アミノ酸配列を配列番号:24、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:28、アミノ酸配列を配列番号:29に示す。又、22DA17の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:25、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:26、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:27、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:30、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:31、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:32に示す。
22DA22のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:33、アミノ酸配列を配列番号:34、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:38、アミノ酸配列を配列番号:39に示す。又、22DA22の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:35、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:36、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:37、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:40、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:41、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:42に示す。
22DA23のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:43、アミノ酸配列を配列番号:44、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:48、アミノ酸配列を配列番号:49に示す。又、22DA23の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:45、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:46、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:47、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:50、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:51、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:52に示す。
22DA24のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:53、アミノ酸配列を配列番号:54、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:58、アミノ酸配列を配列番号:59に示す。又、22DA24の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:55、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:56、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:57、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:60、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:61、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:62に示す。
22SD7のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:63、アミノ酸配列を配列番号:64、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:68、アミノ酸配列を配列番号:69に示す。又、22SD7の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:65、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:66、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:67、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:70、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:71、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:72に示す。
22SD11のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:73、アミノ酸配列を配列番号:74、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:78、アミノ酸配列を配列番号:79に示す。又、22SD11の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:75、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:76、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:77、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:80、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:81、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:82に示す。
22SD48のH鎖可変領域の塩基配列を配列番号:83、アミノ酸配列を配列番号:84、L鎖可変領域の塩基配列を配列番号:88、アミノ酸配列を配列番号:89に示す。又、22SD48の重鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:85、重鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:86、重鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:87、軽鎖CDR1のアミノ酸配列を配列番号:90、軽鎖CDR2のアミノ酸配列を配列番号:91、軽鎖CDR3のアミノ酸配列を配列番号:92に示す。
抗体に毒素等を結合させて細胞内に抗体が標的細胞に結合したのちに細胞内に取り込まれ、コンジュゲートした毒素の作用により標的の細胞を殺すことを作用機序とした抗体医薬の開発のモデルとして、サポリンという毒素の結合された二次抗体、Mab-Zap(Advanced Targeting Systems社製)を用いてLGR7発現細胞に対する殺傷能を評価した。細胞はHA-LGR7を発現させたBaF3細胞を用いた。抗体をウェルあたり100 ng、Mab-Zapをウェルあたり100 ngを加えて3日間37℃ 5% CO2インキュベーターにて保温した後に、生細胞数を生細胞測定試薬SF(ナカライテスク社製)によるWST8アッセイにて解析した。結果を図5に示す。アイソタイプが同じコントロール抗体に比べて、明らかにMab-ZAPとともに作用させた細胞でWST8 assay に値が低く、解析した抗体のいずれにおいても殺細胞効果が確認できた。このことは毒素やラジオアイソトープで標識した抗体が細胞内に取り込まれ、取り込まれた細胞を殺すことができることを示している。
マウスLGR7(塩基配列、配列番号:93、アミノ酸配列、配列番号:94)を発現ベクターに組み込み、BaF3細胞に遺伝子導入して得られた強制発現細胞株HA-mLGR7/BaF3を用いてフローサイトメトリーによりマウスLGR7に対する交差性を調べた。図6に示されるように22DA17、22DA23がマウスのLGR7に対して交差性を示すことが明らかとなった。
Competition FACS 解析によりエピトープを分類した。Biotin Protein Labeling Kit(Roche社)を用いてマニュアルに従って抗体をビオチン化した。Competition FACS解析においては、あらかじめ過剰量の非標識抗体を反応させた後に、ビオチン化した抗体を反応させてさらにFITC標識ストレプトアビジンによりビオチン化された抗体を検出する方法である。同じエピトープを認識する抗体の場合には非標識抗体がエピトープをマスクすることによりビオチン化抗体が抗原にアクセスできず、FACS解析におけるピークが左側にシフトする。同じ抗体で非標識、ビオチン化抗体の順で反応させた場合には競合がかかるためにFITC標識抗マウス抗体を作用させたときに比べてシフトが左側に移動する。一方、違うエピトープを認識する抗体の場合には非標識抗体と競合せずに結合できるため左側へのシフトが少ない。いくつかの抗体をビオチン化して競合アッセイを実施したが、そのうちの一部を図7に示す。ビオチン化した抗体Bio-22DA17、Bio-22DA22を用いたcompetition FACS 解析の結果、22DA12、22DA22は他の抗体と違うエピトープを認識する抗体であることが明らかとなった。
抗体のADCC活性を増強する方法として、抗体の糖鎖を改変する方法が知られている。WO2006/067913等では、フコーストランスポーター遺伝子をノックアウトしたCHO細胞(CHO_FTKO)を用いて、α-1,6コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を生産することが記載されている。
実施例9のようにしてクローニングした抗ヒトLGR7モノクローナル抗体22DA23の抗体遺伝子はH鎖、L鎖の可変領域をそれぞれPCRで増幅してマウス抗体のH鎖C領域Cγ2a、L鎖C領域Cκと連結してマウスIgG2aキメラ分子として発現できるように哺乳動物細胞用発現ベクターに挿入した。得られたベクターはフコーストランスポーター欠損CHO細胞CHO_FTKO に遺伝子導入してネオマイシン耐性株を樹立した。
RPMI-1640/10% Ultra-low IgG FBS (Invitrogen社)/500μg/mL Geneticine/ペニシリン・ストレプトマイシン存在下で培養し、培養上清からマウスIgG2aキメラ抗体をProteinAカラムにてマニュアルに従って精製した。精製できた抗体22DA23-mIgG2a/FTPKOはマウスxenograft modelでの薬効試験に供された。
精製された22DA23-mIgG2a/FTPKO(FTKODA23)抗体はマウスにおける薬効試験に供された。7週齢のScidメスマウス(日本クレア社)にRMG-1 vivo継代腫瘍、約3mm四方1ピースを皮下に移植し、移植10日後に腫瘍体積、体重で群分けをして実験に供した。RMG-1 vivo継代腫瘍は RMG-1培養細胞を 1e7細胞/bodyで皮下移植したのち、42日後に腫瘍を摘出したものを使用した。マウス6匹を1群としてFTKODA23抗体を 2mg/kg, 10mg/kgで週一回投与した。コントロール群にはPBS(-) を投与した。移植後10日後に初回投与、17日後に2回目投与、24日後に3回目投与、31日後に4回目投与を実施した。腫瘍体積は週2回測定し、4回目の投与後の1週間後に最終測定を行い、腫瘍体積の推移をグラフにしたものを図8に示した。コントロール群と抗体投与群で腫瘍体積の大きさを比較した。TGI(Tumor Growth Inhibition) は10mg/kg の投与群で平均37%、2mg/kgの投与群で平均33%であり、腫瘍縮小効果が認められた。
Claims (17)
- LGR7タンパク質に結合し、かつインターナライズ活性を有する(1)から(10)のいずれかに記載の抗体;
(1)CDR1として配列番号:5に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:6に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:7に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、ならびにCDR1として配列番号:10に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:11に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:12に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(2)CDR1として配列番号:15に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:16に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:17に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、ならびにCDR1として配列番号:20に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:21に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:22に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(3)CDR1として配列番号:25に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:26に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:27に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、ならびにCDR1として配列番号:30に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:31に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:32に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(4)CDR1として配列番号:35に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:36に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:37に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、ならびにCDR1として配列番号:40に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:41に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:42に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(5)CDR1として配列番号:45に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:46に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:47に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、ならびにCDR1として配列番号:50に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:51に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:52に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(6)CDR1として配列番号:55に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:56に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:57に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、ならびにCDR1として配列番号:60に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:61に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:62に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(7)CDR1として配列番号:65に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:66に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:67に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、ならびにCDR1として配列番号:70に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:71に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:72に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(8)CDR1として配列番号:75に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:76に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:77に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、ならびにCDR1として配列番号:80に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:81に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:82に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(9)CDR1として配列番号:85に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:86に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:87に記載のアミノ酸配列を有するH鎖、ならびにCDR1として配列番号:90に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:91に記載のアミノ酸配列、およびCDR3として配列番号:92に記載のアミノ酸配列を有するL鎖を含む抗体、
(10)(1)〜(9)いずれかに記載の抗体が認識するエピトープへの結合に対して競合する抗体。 - LGR7タンパク質を発現する細胞に対して細胞傷害活性を有する請求項1に記載の抗体。
- 前記細胞傷害活性が抗体依存性細胞傷害活性である請求項2に記載の抗体。
- 前記細胞傷害活性が補体依存性細胞傷害活性である請求項2に記載の抗体。
- 細胞傷害性物質が結合した抗体である請求項1〜4のいずれかに記載の抗体。
- 癌細胞の増殖を抑制する抗体である請求項1〜5のいずれかに記載の抗体。
- ヒト定常領域を有する抗体である請求項1〜6のいずれかに記載の抗体。
- キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である請求項7に記載の抗体。
- フコースが欠損した抗体である請求項1〜8のいずれかに記載の抗体。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する医薬組成物。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する細胞増殖抑制剤。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の抗体を有効成分として含有する抗癌剤。
- 治療対象となる癌が卵巣癌である、請求項12に記載の抗癌剤。
- 前記卵巣癌が明細胞腺癌である請求項13に記載の抗癌剤。
- 以下の工程を含む明細胞腺癌細胞の検出方法;
(a) 被検者の卵巣から単離された試料を提供する工程、
(b) (a)の試料に含まれるLGR7タンパク質を発現する細胞を、LGR7タンパク質に結合する抗体を用いて検出する工程。 - 被験者に投与された、LGR7タンパク質への結合活性を有し、かつ放射性同位元素で標識された抗体に結合した放射性同位元素の卵巣への集積を検出する工程を含む明細胞腺癌細胞の検出方法。
- 以下の工程を含む明細胞腺癌細胞の検出に用いるための剤の製造における、LGR7タンパク質への結合活性を有する抗体の使用;
(a) LGR7タンパク質への結合活性を有し、かつ放射性同位元素で標識された抗体を含む前記剤を被検者に投与する工程、
(b) 前記放射性同位元素の卵巣への集積を検出する工程。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010544139A JP5801557B2 (ja) | 2008-12-26 | 2009-12-25 | 抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2008333149 | 2008-12-26 | ||
JP2008333149 | 2008-12-26 | ||
JP2010544139A JP5801557B2 (ja) | 2008-12-26 | 2009-12-25 | 抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療 |
PCT/JP2009/071524 WO2010074192A1 (ja) | 2008-12-26 | 2009-12-25 | 抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2010074192A1 JPWO2010074192A1 (ja) | 2012-06-21 |
JP5801557B2 true JP5801557B2 (ja) | 2015-10-28 |
Family
ID=42287797
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010544139A Active JP5801557B2 (ja) | 2008-12-26 | 2009-12-25 | 抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20120014870A1 (ja) |
EP (1) | EP2377891B1 (ja) |
JP (1) | JP5801557B2 (ja) |
KR (1) | KR20110099762A (ja) |
CN (1) | CN102395603A (ja) |
AU (1) | AU2009331178A1 (ja) |
BR (1) | BRPI0923652A2 (ja) |
CA (1) | CA2748990A1 (ja) |
MX (1) | MX2011006908A (ja) |
RU (1) | RU2011131071A (ja) |
SG (1) | SG172427A1 (ja) |
WO (1) | WO2010074192A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2014101707A (ru) * | 2011-06-22 | 2015-07-27 | Инсерм (Энститю Насьональ Де Ля Сантэ Э Де Ля Решерш Медикаль) | АНТИ-Axl АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ |
CN102636655B (zh) * | 2012-05-10 | 2014-07-23 | 苏州大学附属第一医院 | 一种荧光原位微量淋巴毒检测方法和试剂盒 |
WO2015044893A1 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Stora Enso Oyj | A composition comprising lignin and epoxy compound for coating and method for the manufacturing thereof and use thereof |
TW201619194A (zh) * | 2014-09-16 | 2016-06-01 | 歐把科學股份有限公司 | 特異性結合至人類vasa蛋白質的抗體、抗體製劑、經分離核酸分子、細胞及分離表現vasa蛋白質的細胞的方法 |
US10676723B2 (en) | 2015-05-11 | 2020-06-09 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
EP3559045A4 (en) * | 2016-12-23 | 2020-08-19 | REMD Biotherapeutics, Inc. | IMMUNOTHERAPY USING ANTIBODIES THAT BIND TO A TIMED DEATH LIGAND 1 (PD-L1) |
CN114230666B (zh) * | 2021-12-20 | 2022-09-02 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 | 一种t7 rna聚合酶的单克隆抗体及其制备方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002513156A (ja) * | 1998-04-24 | 2002-05-08 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | インターナライズする抗体を選択する方法 |
US20050107595A1 (en) * | 2001-06-20 | 2005-05-19 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
Family Cites Families (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58201994A (ja) | 1982-05-21 | 1983-11-25 | Hideaki Hagiwara | 抗原特異的ヒト免疫グロブリンの生産方法 |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
WO1992020791A1 (en) | 1990-07-10 | 1992-11-26 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
ES2108048T3 (es) | 1990-08-29 | 1997-12-16 | Genpharm Int | Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
DK0605522T3 (da) | 1991-09-23 | 2000-01-17 | Medical Res Council | Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer |
ATE297465T1 (de) | 1991-11-25 | 2005-06-15 | Enzon Inc | Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen |
ES2227512T3 (es) | 1991-12-02 | 2005-04-01 | Medical Research Council | Produccion de anticuerpos contra auto-antigenos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos fijados en un fago. |
CA2124967C (en) | 1991-12-17 | 2008-04-08 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
JP3507073B2 (ja) | 1992-03-24 | 2004-03-15 | ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド | 特異的結合対の成員の製造方法 |
CA2140638C (en) | 1992-07-24 | 2010-05-04 | Raju Kucherlapati | Generation of xenogeneic antibodies |
US5648267A (en) | 1992-11-13 | 1997-07-15 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same |
CA2161351C (en) | 1993-04-26 | 2010-12-21 | Nils Lonberg | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
GB9313509D0 (en) | 1993-06-30 | 1993-08-11 | Medical Res Council | Chemisynthetic libraries |
EP0731842A1 (en) | 1993-12-03 | 1996-09-18 | Medical Research Council | Recombinant binding proteins and peptides |
EP0770628B9 (en) | 1994-07-13 | 2007-02-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin-8 |
CA2219361C (en) | 1995-04-27 | 2012-02-28 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
EP0823941A4 (en) | 1995-04-28 | 2001-09-19 | Abgenix Inc | HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES |
DE69941330D1 (de) * | 1998-03-26 | 2009-10-08 | Univ R | Neue g-protein-gekoppelte rezeptoren aus säugetieren mit extrazellulären leucin-reicher region |
PT1071700E (pt) | 1998-04-20 | 2010-04-23 | Glycart Biotechnology Ag | Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos |
PT1914244E (pt) | 1999-04-09 | 2013-07-26 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico |
CA2967607A1 (en) * | 2000-10-04 | 2002-04-11 | Molecular Medicine Research Institute | Methods of modulating apoptosis by administration of relaxin agonists |
CA2785941C (en) | 2000-10-06 | 2017-01-10 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Antibody composition-producing cell |
WO2002079255A1 (en) | 2001-04-02 | 2002-10-10 | Idec Pharmaceuticals Corporation | RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII |
WO2003016487A2 (en) * | 2001-08-17 | 2003-02-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Mammalian relaxin receptors |
WO2003093827A2 (en) * | 2002-05-02 | 2003-11-13 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and drug screening for diseases associated with leucine-rich repeat-containing g-protein coupled receptor 7 (lgr7) |
JP3991280B2 (ja) | 2002-06-05 | 2007-10-17 | 中外製薬株式会社 | 抗体作製方法 |
US20090215711A1 (en) | 2004-04-30 | 2009-08-27 | Sagres Discovery, Inc. | Novel compositions and methods in cancer |
JPWO2006067847A1 (ja) | 2004-12-22 | 2008-06-12 | 中外製薬株式会社 | フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 |
WO2008093688A1 (ja) | 2007-01-30 | 2008-08-07 | Forerunner Pharma Research Co., Ltd. | キメラFcγレセプター及び該レセプターを用いたADCC活性測定方法 |
-
2009
- 2009-12-25 MX MX2011006908A patent/MX2011006908A/es unknown
- 2009-12-25 EP EP09834988.9A patent/EP2377891B1/en not_active Not-in-force
- 2009-12-25 KR KR1020117017401A patent/KR20110099762A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-12-25 US US13/140,351 patent/US20120014870A1/en not_active Abandoned
- 2009-12-25 BR BRPI0923652A patent/BRPI0923652A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2009-12-25 RU RU2011131071/10A patent/RU2011131071A/ru unknown
- 2009-12-25 WO PCT/JP2009/071524 patent/WO2010074192A1/ja active Application Filing
- 2009-12-25 AU AU2009331178A patent/AU2009331178A1/en not_active Abandoned
- 2009-12-25 SG SG2011047768A patent/SG172427A1/en unknown
- 2009-12-25 CN CN2009801576612A patent/CN102395603A/zh not_active Withdrawn
- 2009-12-25 JP JP2010544139A patent/JP5801557B2/ja active Active
- 2009-12-25 CA CA2748990A patent/CA2748990A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-02-05 US US16/782,728 patent/US20200157231A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002513156A (ja) * | 1998-04-24 | 2002-05-08 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | インターナライズする抗体を選択する方法 |
US20050107595A1 (en) * | 2001-06-20 | 2005-05-19 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6014020724; Reprod. Biol. Endocrinol. Vol.1,No.114, 20031124, P.1/13-13/13 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SG172427A1 (en) | 2011-07-28 |
CA2748990A1 (en) | 2010-07-01 |
CN102395603A (zh) | 2012-03-28 |
EP2377891A4 (en) | 2012-08-29 |
MX2011006908A (es) | 2011-10-06 |
JPWO2010074192A1 (ja) | 2012-06-21 |
US20120014870A1 (en) | 2012-01-19 |
RU2011131071A (ru) | 2013-02-10 |
WO2010074192A1 (ja) | 2010-07-01 |
EP2377891A1 (en) | 2011-10-19 |
EP2377891B1 (en) | 2018-11-21 |
BRPI0923652A2 (pt) | 2016-10-18 |
AU2009331178A1 (en) | 2011-08-11 |
KR20110099762A (ko) | 2011-09-08 |
US20200157231A1 (en) | 2020-05-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5986621B2 (ja) | 抗gpr49抗体を用いる癌の診断および治療 | |
JP6162864B2 (ja) | 抗Desmoglein3抗体を用いる癌の診断および治療 | |
JP5918540B2 (ja) | 抗dll3抗体 | |
JP6104794B2 (ja) | 抗itm2a抗体を用いる癌の診断および治療 | |
US20200157231A1 (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-lgr7 antibody | |
JP6009733B2 (ja) | 抗tm4sf20抗体を用いた癌の診断と治療 | |
WO2011105573A1 (ja) | 抗icam3抗体およびその用途 | |
JP5746018B2 (ja) | 抗tmprss11e抗体を用いた癌の診断と治療 | |
JP5618172B2 (ja) | 抗prg−3抗体を用いる癌の診断および治療 | |
AU2014201680A1 (en) | Diagnosis and treatment of cancer using anti-GPR49 antibody |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20121221 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130215 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130215 |
|
A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20130522 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140521 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140722 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150129 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150305 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20150316 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150819 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150827 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5801557 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |